BG62492B1 - Състави и методи за идентифициране и синтез насиалилтрансферази - Google Patents

Description

Област на техниката

Заявката е продължение на заявка сер. № 07/850 357, подадена на 9 март 1992.

Изобретението се отнася до сиалилтрансферазна генна фамилия, група гликозилтрансферази, отговорни за крайното сиалилиране на въглехидратните групи на гликопротеини, гликолипиди и олигозахариди, които съдържат консервативен участък на хомоложност в каталитичния домен.

Предшестващо състояние на техниката

Членове на сиалилтрансферазната генна фамилия са Ga^l, 3GalNAc α2,3 сиалилтрансфераза и Gaipi, 3(4)GlcNAc α2,3 сиалилтрансфераза. Изобретението се отнася още до нови форми и състави от същите и по-специално до средства и методи за идентифициране и продукция на членове на сиалилтрансферазната генна фамилия до хомогенност в значителни полезни количества. Изобретението се отнася също до приготвяне на изолирана дезоксирибонуклеинова киселина (ДНК), кодираща продукция на сиалилтрансферази, до методи за получаване на молекули ДНК, които кодират сиалилтрансферази, до експресия на човешки и бозайникови сиалилтрансферази, като се използва такава ДНК, както и до нови съединения, включително нови нуклеинови киселини, кодиращи сиалилтрансферази или фрагменти от тях. Изобретението се отнася също до производни на сиалилтрансфераза, поспециално производни, в които липсват цитоплазмената и/или трансмембранната части на протеина и тяхната продукция посредством рекомбинантни ДНК техники.

Сиалилтрансферазите са ензимна фамилия, която катализира преноса на сиалова киселина (SA) до крайните части на въглехидратните групи на гликолипиди и олигозахариди по следната най-обща реакция:

Цитидин 5 монофосфат - сиалова киселина (CMP -SA) +НО-акцептор -> СМР + SA-0-акцептор (Beryer,T.A.et.Adv. Enzymol. 52, 23-175 [1981]).

Сиалилтрансферазите най-напред са намерени в клетъчния апарат на Goldi, където те участват в посттранслационния път на гликозилиране. (Fleischer, B.J.Cell Biol. 89, 246-255 [1981]). Намерени са също в телесни течности като мляко от гърдата, коластрата и кръвта. Най-малко 10-12 различни сиалилтрансферази са необходими, за да се синтезират всички известни сиалилолигозахаридни последователности. Всяка от тях се различава по специфичността си спрямо последователността на олигозахаридния акцептор и аномерната връзка, образувана между сиаловата киселина и захарта, с която е свързана. Пречистени са четири сиалилтрансферази. (Beyer и сътр. Ibid., Weinstein, J. и сътр., J. Biol. Chem. 257, 13835-13844 [ 1982], Miagi, T.and Tsuiki, S. Eur. J.Biochem. 125, 253-261 [1982] и Joziasse, D.H. и сътр. J.Biol. Chem.260, 4941-4951 [1985]). По-специално пречистени са Gal31, 4GlcNAc α2-6 сиалилтрансфераза и Gaipi, 3(4) GlcNAc α2-3 сиалилтрансфераза от чернодробни мембрани на плъхове. (Weinstein и сътр. Ibid.).

Други гликозилтрансферази са изолирани като разтворими ензими в серум, мляко или коластра, включително сиалил-, фукозил-, галактозил-, N-ацетилглюкозаминил- и N-ацетилгалактозаминилтрансферази. (Beyer и сътр. Ibid.).

Изолирана е говежда и човешка β-Νацетилглюкозамид βΐ ,4-галактозилтрансфераза (Narimatsu, Н. и сътр. Proc.Nat.Acad.Sci. USA 83, 4720-4720-4724 [1986], Shaper, N.L. и сътр. Proc.Nat. Acad.Sci. USA 83, 1573-1577 [1986], Appert, H.E. и сътр., Biochem.Biophys.Res. Common 139, 163-168 [1986 и Humphreys-Beyer, M.G. и сътр.Proc.Nat.Acad.Sci. USA 83, 89188922 [1986]). Тези пречистени гликозилтрансферази се различават по размер, което може да се дължи на отстраняване на части от протеина, които не са съществени за неговата активност като домените на мембранно свързване.

Сравнението с установените аминокиселинни последователности на сДНК клонове, кодиращи гликозилтрансферазите, включително галактозилтрансферази, сиалилтрансфераза, фукозилтрансфераза и N-ацетилгалактозаминилтрансфераза показват, че тези ензими нямат всъщност никаква хомоложна последователност. Някои схващания относно структурното сходство на тази фамилия гликозилтран сферази се основават на извършени напоследък анализи на първичните структури на клонирани сиалилтрансферази (Weinstein, J. и сътр., Ibid.). Все пак всички те притежават къса NHj-цитоплазмена опашка, сигнално контактен домен от 16-20 аминокиселини и разгънат стем участък и след това голяма СООНкрайна каталитичен домен Weinstein, J. и сътр., J.Biol. Chem. 262, 17735-17743 [1987], Paulson, J.C. и сътр., J.Biol. Chem. 264, 17615-17618 [1989]. Сигнално контактните домени действат и като неразцепващи се сигнални пептиди и като мембранносвързващи участъци и ориентират каталитичните домени на тези гликозилтрансферази в лумена на апарата на Golgi. Вътре във фамилиите гликозилтрансферази трябва да се очакват обикновени аминокиселинни последователности, които разделят подобни акцепторни или донорни субстрати. Изненадващо малко хомоложни участъци са намерени в каталитичните домени на гликозилтрансферазите и не е намерена никаква значителна хомоложна последователност при някои друг протеин в GenBank (Chaper, N.L. и сътр., J.Biol.Chem. 216, 10420-10428 [1988], D'Agostaso, G. и сътр., Eur.J.Biochem. 183, 211217 [1989] и Weinstein, J. и сътр., J.Biol. Chem. 263, 17735-17743 [1987]). Това специално е изненадващо за Galal,3 GT и ClcNAc pi,4-GT, две галактозилтрансферази. Докато тези галактозилтрансферази изобщо не показват хомоложност, има общ хексапептид KDKKND за Galal,3-GT (говежди, 304-309) и RDKKNE за GlcNAcpl ,4-СТ(говежди, човешки, миши аминокиселини 346-351). (Joziasse и сътр., J. Biol. Chem. 264, 14290-14297 [1989]).

Сиаловите киселини са крайни захари от въглехидратните групи, намиращи се у гликопротеините и гликолипидите, и са широко разпространени в животинските тъкани (Momol, Т. и сътр. J.Biol. Chem.261, 16270-16273 [1986]). Силовите киселини играят важна роля в биологичните функции на въглехидратните структури поради тяхната крайна позиция. Например сиаловата киселина функционира като лиганда за свързването на вируса на инфлуенцата с клетката-гостоприемник (Paulson, J.C., The Receptors, vol.2,Conn, P.M., ed., p.131-219, Academric Press [1985]).

Дори промяната в свързването на сиаловата киселина е достатъчна да измени специфичността на гостоприемника (Roger, G.N.h

CbTp.Nature 304, 76-78 [1983]). Невралната клетъчна адхезионна молекула (NCAM) е предмет на регулирано с развитието полисиалилиране, за което се приема, че модулира NCAm медиирана клетъчна адхезия през време на развитието на нервната система (Rutishauser, U. и сътр., Science 240, 53-57 [1988] и Rutishauser, U., Adv.Exp.Med.Biol.265,179-180 [1990]). Напоследък за карбохидратната структура сиалил люисова X (SLe*) е показано, че функционира като лиганда за ендотелиалната левкоцитна адхезионна молекула (“E-Selectin”), която посредничи в свързването на неутрофилите с активираните ендотелиални клетки (Lowe и сътр.,1990, Phillips и сътр.,1990, Goelz и сътр., 1990, Walz и сътр., 1990, Brandley и сътр., 1990). Р-селектинът (зависещ от активираната гранула протеин на външната мембрана, CD62) за друг член на селектиновата фамилия (Stoolman, L.M., Cell 56,907-910 [1989]), също е показано, че разпознава SLe*, намиращи се в моноцитите и PMNs (Larsen и сътр., Proc. Natl.Acad.Sci. USA 87, 6674-6678 [1990], Momol и сътр., J.Biol. Chem. 261,16270-16273 [1986]], Polley и сътр., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 88, 6224-6228 [1991], Chan, K,F,J., J.Biol. Chem. 263, 568574 [1988], Beyer, T.A. и CbTp.,Adv.Enzymol., 52, 23-175 [ 1981 ]). В двата примера сиаловата киселина е ключов компонент във въглехидратната структура, за да функционира като лиганда. В допълнение към ролята при клетъчната адхезия е установено, че сиаловата киселина, съдържаща въглехидратни структури, играе роля пряко в диференциацията. Хематопоетичната клетъчна линия HL-60 може да бъде индуцирана към диференциация чрез третиране с гликолипида G_M3. За ганглиозидите също се смята, че участват в модулацията на растежния фактор - протеин киназната активност и в контрола на клетъчния цикъл.

Една такава сиалилтрансфераза е пречистена, както е описано в US 5 047 335. Доколкото са достъпни известни количества от “пречистена” сиалилтрансфераза, те са достъпни в много малки количества отчасти и поради това, че са мембранно свързани протеини на едноплазмения ретикулум и на апарата на Golgi. Значителната цена и трудностите за пречистване на тези сиалилтрансферази ги прави оскъден материал. Предмет на изобретението е да се изолира ДНК, кодираща сиалилтрансфераза, и да се произвеждат полезни количества от бозайникова, по-специално човешка сиалилтрансфераза, като се използват рекомбинантни ДНК техники. Друг предмет на изобретението е да се създаде средство за получаване на ДНК, кодираща други членове на сиалилтрансферазната генна фамилия от различни тъкани, както и от други видове. Друг предмет на изобретението е да се получат нови форми на сиалилтрансферази. Друг предмет на изобретението е да се създаде подобрено средство за катализиране на преноса на сиаловата киселина към крайните позиции при някои въглехидратни групи.

Същност на изобретението

Поставените с изобретението задачи се осъществяват с метод, състоящ се в идентифициране и клониране на гени, които кодират бозайникови сиалилтрансферази (дефинирани подолу) включително, но не ограничено само до свинска Gaipi, 3GalNAc α2,3 сиалилтрансфераза и Gaipi,3 (4)GlcNAc α,3 сиалилтрансфераза от плъх (различна от Gaipi ,4GlcNAc α2,6 сиалилтрансфераза от плъх), вмъкване на този ген в рекомбинантен ДНК вектор, трансформиране на подходящ гостоприемник с вектора, включващ този ген, експресия на бозайниковите сиалилтрансферазни гени в такъв гостоприемник и събиране на така получената бозайникова сиалилтрансфераза. Алтернативно може да се използва разнообразие от други рекомбинантни техники, за да се получи експресия на сиалилтрансфераза. Съгласно изобретението е възможно да се произведе бозайникова сиалилтрансфераза и/или производни на същата посредством рекомбинантни техники, както и да се осигури средство за продуциране на такива сиалилтрансферази. Сиалилтрансферазите са слабо разпространени протеини и трудни за пречистване. Изолирането и идентифицирането на сиалилтрансферазни гени е изключително трудно. тРНК са редки и клетъчни линии или други източници на големи количества тРНК са недостъпни. Изобретението за първи път установява сиалилтрансферазна генна фамилия, дефинирана чрез консервативен участък на хомоложност в каталитичния домен на ензимите.

Изобретението се отнася до състави и методи за получаване на бозайникова сиалилтрансфераза по пътя на рекомбинатна ДНК технология, включваща: 1) откриване и иден тифициране на цялостната ДНК последователност на ензимите и на 5'-граничещата област на същите, 2) конструиране на клониращ и експресионен носител, съдържащ посочената 5 ДНК последователност, позволяващ експресията на бозайниковия сиалилтрансферазен протеин, както и за сливане или на сигнални N-крайни техни конюгати и 3) жизнеспособни клетъчни култури и други системи за експресия, 10 генетически изменени по силата на това, че съдържат такива носители и са способни да продуцират бозайникова сиалилтрансфераза. Изобретението по-нататък се отнася до състави и методи за продукция на ДНК, кодираща 15 клетъчно продуциране на бозайникова сиалилтранфераза. Друг аспект на изобретението са нови съединения, включително дезоксирибонуклеотиди и рибонуклеотиди, които се използват за получаване на клонове, способни да 20 експресират сиалилтрансфераза.

Друг аспект на изобретението е сиалилтрансфераза, по същество чиста от всички природно срещащи се субстанции, с които тя обикновено се среща в кръвта и/или тъканите, нап25 ример сиалилтрансфераза, продуцирана по рекомбинантен път, би била освободена от такива онечиствания, обикновено срещащи се в тяхната in vivo физиологична среда. Като се има предвид методът за получаване, сиалил30 трансферазата може да съдържа асоциирани гликозилати с по-голямо или по-малко разклонение в зависимост от материала, изолиран от неговата in vivo физиологична среда, напр. кръв и/или тъкан. Изобретението по-нататък 35 се отнася до нови производни на сиалилтрансфераза, по-специално производни без сиалилтрансферазни крайни аминоостатъци, т.е. производни без късия NH₂ цитоплазмен домен или хидрофобната N-крайна сигналноконтактна 40 последователност, която съставя сиалилтрансферазния трансмембранен домен и стем участък.

Бозайниковата сиалилтрансфераза и нейните производни съгласно изобретението са 45 полезни за добавянето на сиалови киселини към въглехидратните групи, налични при гликопротеини и гликолипиди. В допълнение сиалилтрансферазата и нейните производни са ензимно полезни при прибавяне на сиалова 50 киселина към захарна верига, за да се продуцират въглехидрати, които функционират като определящ фактор в биологичното охарак теризиране. Такива сиалилтрансферазни ензими могат да се прилагат в мултиензимни системи за синтез на олигозахариди и производни (Ichikawa и сътр., J.Am.Chem.Soc 113, 4698 [1991] и Ichikawa и сътр., J.Am.Chem.Soc 113, 6300 [1991]).ДНК, особено консервативният участък на хомоложност в каталитичния домен, кодиращ сиалилтрансферазна генна фамилия съгласно изобретението, е полезна за осигуряване средство за клониране на гена, кодиращ други членове на сиалилтрансферазната генна фамилия. Друго използване на сиалилтрансферазата и ДНК, кодираща сиалилтрансфераза, са очевидни за специалистите от областта.

Описание на приложените фигури

Фигура 1 показва нуклеотидна и аминокиселинна последователност на Gaipi, 3GalNAc α2,3 сиалилтрансфераза (α2,3-Ο”) от свиня. Нуклеотидната последователност на а2,3-0 тРНК от свиня е определена посредством анализ на ДНК последователност на два препокриващи се клона XST1 и XST2. Очакваните аминокиселини на а2,3-0 полипептида са показани над ДНК последователността и са номерирани от първия остатък на N-края на аналогичния пречистен протеин. Предложената сигнално контактна последователност е отбелязана с празно квадратче. Потенциалните гликозилирани части с последователността Asn-XThr са отбелязани със звездичка (*). Последователността съответства на дългата форма на а2,3-сиалилтрансфераза, кодирана от препокриващите се клонове XST1 и λ5Τ2.

Фигура 2 показва нукелотидна и аминокиселинна последователност на Gaipi, 3(4)GlcNAc а2,3-сиалилтрансфераза (“α2,3-Ν”) от плъх. Нуклеотидната последователност на a2,3-N-mPHK от плъх е определена с анализ на ДНК последователност.

Очакваните аминокиселини на сиалилтрансферазния полипептид са посочени над ДНК последователността и са номерирани от първия остатък на зрелия протеин, както е определен от N-крайната протеинова последователност.

Фигура 3 - пречистване на а2,3-0 сиалилтрансфераза върху CDP-хексаноламин агароза (еулиране с КС1). Хомогенът от 2 kg свински черен дроб се зарежда върху колона CDPхексаноламин агароза и се елуира с линеен градиент КС1 (виж примерните изпълнения). Концентрацията на протеина и активността на сиалилтрансферазата се определят от отделните фракции, като се използва лактоза като акцепторен субстрат.Двата пика ензимна активност са отделени като обединение А и В, както е посочено.

Фигура 4 - пречистване на а2,3-0 сиалилтрансфераза върху CDP-хексаноламин агароза (колона III, CDP елуиране). Ензимните активности се определят като се използва специфичен ензимен акцепторен субстрат антифризен гликопротеиен (AFGP). В колони А и В елуирането на ензимната активност корелира предимно с 48 kDa и 45 kDa видове протеин съответно (виж SDS-PAGE). Тези два вида, форма А и форма В на а2,3-О-сиалилтрансферазата, имат специфична активност 8-10 единици/mg протеин. 48 kDA и 45 kDA видовете се пренасят върху PVDE мембрана и се анализират чрез ДНК крайната последователност.

Фигура 5 -NH₂ - крайна аминокиселина последователност на 48 kDa и 45 kDa α2,3-0 сиалилтрансферазен пептид. Шестнадесетте хидрофобни аминокиселини в близост до ΝΗ₂края на 48 kDa пептида, съдържащи се в сигнално контактния домен, са подчертани.

Фигура 6 - рестрикционна карта и стратегия на последователността на два а2,3-0 сиалилтрансферазни сДНК клона.

Фигура 7 - сравнение на структурите на домените и хомоложните участъци на две сиалилтрансферази. А, хоризонтална проекция на първичната последователност на 2,6 сиалилтрансфераза и сс2,3-0 сиалилтранфераза, показваща участък от 45 аминокиселини с 64% идентична последователност и 84% подобна последователност.

В, хомоложният домен, обхващащ свързването между екзони 2 и 3 на а2,6 сиалилтрансфераза и лежащ между каталитичните домени на двата ензима.

Фигура 8 - експресия на разтворима каталитично активна а2,3-0 сиалилтрансфераза. А: сДНК, управляваща експресията на разтворима форма на а2,3-0 сиалилтрансфераза, sp-ST, се конструира чрез заместване на див тип сиалилтрансферазен цитоплазмен домен и сигнално контактен домен с инсулин сигнален пептид. Предполага се, че sp-ST кодира 38 kDa, секретирайки протеинови видове, когато се трансфектират в клетките гостоприемници. В:

sp-ST се включва в експресионния вектор pSVL и се трансфектира в COS-1 клетки. 48 посттрансфектиране клетките се бележат пулсационно в продължение на 2 h в среда, съдържаща ТгапБЗбБ-белег и след това 5 h в среда без белег. Тази среда се събира, концентрира се 15-кратно и се анализира посредством SDSPAGE/флуорография. Анализират се допълнителни проби s-ST и моделно трансфектираната клетъчна среда се анализира. С: COS-1 клетки се трансфектират с липофектин (+sp-ST) или липофектин като такъв (контрола) по идентичен начин като 7В. След 48 h трансфектиране средата се събира, концентрира се 15-кратно и се изследва за сиалилтрансферазна активност със специфичен акцепторен субстрат AFGP (Sadler, J.E. и сътр. J.Biol.Chem 254, 4434-4443 [1979]).

Фигура 9-CID спектър на трипсинов пептид от Galct2,3-N сиалилтрансферазен ензим. Пептидната последователност е Leu-Thr-ProAla-Leu-Asp-Ser-Leu-His-Cys*-Arg,NH+ = 1283,6. Cys* означава карбоксиметилцистеин. Йони със запазен товар при N-края са отбелязани като a, b и с йони, а С-крайните йони са означени като х, у и ζ фрагменти (Biemann, К. (1990) Meth.Enzymol. 193: 886-887). Първите йони (а,х) са продукти на скъсване между а въглерода и карбонилната група. Йоните у и b се формират, когато пептидната връзка се скъса.

Йоните с и ζ се появяват, когато настъпи скъсване между аминогрупата и а въглерода. Количеството на тези фрагменти винаги се инициира при съответните краища. Фрагментирането на страничната верига се срещу между β и γ въглеродите на аминокиселините, като се получават така наречените diN-крайни) и w (С-крайни) йони. Наблюдаваните фрагментни йони са включени в таблицата. Йоните, принадлежащи към същата йонна серия, са изброени в редове.

Фигура 10-CID спектър на карбамилирани трипсинови пептиди от Gal α2,3-Ν сиалилтрансферазен ензим. Пептидната последователност е Leu-Asn-Ser-Ala-Pro-Val-Lys, МН+ = 771,4.

Фрагментирането ясно показва модифициране при N-крайната, а не при ε-аминогрупата на лизиновия остатък. Изобилен йон при N-крайния левцин в този пептид. Йоните, отбелязани със звездичка, са свързани с матрицата йони от пептидната верига (Falick и сътр.

(1990) Rapid Commun. Mass Spectrom. 4: 318). Наблюдаваните фрагментни йони са включени в таблицата. Йоните, принадлежащи към същата йонна серия са изброени в редове.

Фигура 11- хоризонтална проекция на пептиди 1 и 11, получени от Gal βΐ ,3(4)ClcNAc а2,3-сиалилалтрансфераза (ST3N) с предварително клонирана сиалилтрансфераза. Gal βΙ/ΰΙοΝΑϋ а.2,6-сиалилтрансфераза (ST6N) и Ga^l, 3GaiNAc а2,3-сиалилтрансфераза (ST30) са показани като отворени линии. Запълненият квадрат показва сигнално контактна последователност. Защрихованият квадрат показва участъка на хомоложност, установен между двете сиалилтрансферази.

Фигура 12- консервативен участък, разделен от трите клона сиалилтрансферази. Трите клона сиалилтрансферази са Gaip 1,3(4)GlcNAc а2,3-сиалилтрансфераза (ST3N) от плъх, свинска Gaipi, 3GalNAc а2,3-сиалилтрансфераза (ST3O) и Ga^l,4GalNAc а2,6-сиалилтрансфераза (ST6N) от плъх.

Участъкът се състои от 55 аминокиселини от остатък 156 до остатък 210 на Gaipi, 3(4) GlcNAc а2,3-сиалилтрансфераза (ST3N). Аминокиселинната идентичност е посочена чрез ограждане в квадрат.

Фигура 13- очаквана аминокиселинна последователност на усилващите фрагменти SM1 и сравнение с предварително охарактеризирания консервативен участък на хомоложност. Консенсусът консервативен участък на хомоложност се поражда от сравнението на консервативния участък на хомоложност на клонираната и охарактеризирана сиалилтрансфераза и усилващия фрагмент SM1. Инвариантните аминокиселини са отбелязани с букви отгоре, докато присъстващите аминокиселини повече от 50% в консервативния участък на хомоложност са с букви отдолу. Местата, където се намират г или q, са означени с Ь, местата, където се намира или i или ν, са означени с х. Подчертаните аминокиселини означават участъците, които се използват при конструиране на изродени праймери. Промените в по-рано получените инвариантни аминокиселини, намерени в усилващия фрагмент, са отбелязани със звездичка.

Фигура 14 - нуклеотидна и очаквана аминокиселинна последователност STX1. Очакваната аминокиселинна последователност на най-дългата отворена рамка на разчитане, ко дираща консервативния участък на хомоложhoctSMI (аминокиселини 154-208), са означени със заграждане. Предложената сигнално контактна последователност (аминокиселини 8-23) са оградени в квадрат и потенциално N-свързаните гликозилирани места са подчертани.

Подробно описание

Както е използван тук, терминът сиалилтрансфераза или производни на сиалилтрансфераза се отнася до сиалилтрансферазни ензими, освен Gaipi, 4GlcNAc α2,6 сиалилтрансфераза от плъх, които съдържат консервативен участък на хомоложност в каталитичния домен и са ензимно активни при пренасяне на сиалова киселина към крайните позиции на захарните вериги на гликопротеини, гликолипиди, олигозахариди и подобни. Примери за ензимно функционални сиалилтрансферази са тези, способни да пренасят сиалова киселина от СМР-сиалова киселина към олигозахаридния акцептор, където олигозахаридният акцептор варира в зависимост от конкретната сиалилтрансфераза.

“Консервативен участък на хомоложност” се отнася до серия аминокиселини в една сиалилтрансфераза, която е по същество идентична на същата серия аминокиселини в друг сиалилтрансферазен ензим, щом като са били подредени последователностите на двата ензима. В сиалилтрансферазната генна фамилия съгласно изобретението консервативният участък на хомолжност е в каталитичния домен и се простира върху най-малко около 7 свързани аминокиселини, за предпочитане при най-малко около 20 аминокиселини и най-вече върху най-малко 55 аминокиселини с аминокиселинна последователност на остатъците 156-210 от фиг.2 или остатъците 142-196 от фиг 1. Веднъж идентифициран консервативен участък на хомоложност, могат да се направят варианти на аминокиселинна последователност на консервативния участък, попадащи в един или повече от три класа: варианти, получени чрез заменяне, чрез включване или чрез изпускане (делеция). Тези варианти обикновено се получават чрез мутагенеза на специфично място в нуклеотидите в ДНК, кодираща сиалилтрарсфераза, при което продуцираната ДНК, кодираща сиалилтрансфераза, съдържа вариант на консервативния участък на хомоложност.

В обхвата на сиалитрансферазата се включват например Gaipi, 3(4)GlcNAc α2,3 сиалилтрансфераза от плъх (тук означена като “α2,3-Ν”), която формира NeuNAc α2,3 Gal P1.3G1CNAC и NeuAc <x2,3 Gaipi, 4GlcNAc последователности, които често завършват комплекса N-свързани олигозахариди. Други примери, включени в обхвата на сиалилтрансфераза. са свинска Gaipi,3GalNAc α2,3 сиалилтрансфераза (тук означена като (“а2,3-0”), която формира NeuAc a2,3Gaipi ,3GalNAc, намерена в захарни вериги 0-свързани към треонин или серин, както и като крайни секвенции на определени ганглиозиди.

В обхвата на сиалилтрансфераза, както е използван тук терминът, са включени сиалилтрансферазата с нативно гликозилиране и аминопоследователностите на сиалилтрансфераза от плъх и свинска сиалилтрансфераза, както изложено на фиг. 1 или 2, аналогична сиалилтрансфераза от други животински видове като говежда, човешка и подобни, както и от други тъкани, дегликозилирани или негликозилирани производни на такива сиалилтрансферази, варианти на аминокиселинна последователност и in vitro- породени ковалентни производни на сиал ил тра нсфераз и.

Всички тези форми на сиалилтрансфераза съдържат консервативния участък на хомоложност и са ензимно активни или ако не са, те носят поне един имунен епитоп заедно с ензимно активната сиалилтрансфераза.

Вариантите на аминокиселинна последователност на сиалилтрансферазата попадат в един или повече от трите класа: варианти, получени чрез заместване, чрез включване и чрез делеция. Тези варианти обикновено се приготвят чрез специфична по място мутагенеза на нуклеотиди в ДНК, кодираща сиалилтрансфераза, като се продуцира ДНК, кодираща варианта, и след това експресиране на ДНК в рекомбинантна клетъчна култура. Все пак вариантни сиалилтрансферазни фрагменти с до около 100-150 остатъка могат да се получат обикновено, като се използва in vitro синтеза. Вариантите на аминокиселинна последователност се охарактеризират чрез предварително определяне на природата на варианта, характеристика, която ги отделя от природносрещащи се алелни или междувидови вариации на аминокиселинна последователност на сиалилтрансфераза. Вариантите в консервативния участък на хомоложност типично показват същата качествена биологична активност, както природосрещащия се аналог.

Тъй като мястото на въвеждане на варианта аминокиселинна последователност е определено по-рано, мутацията per se не се нуждае от предварително определяне. Например с оглед да се оптимизира извършването на мутацията на дадено място може да се проведе ненасочена мутагенеза при кодона-мишена или участъка и експресираните варианти на сиалилтрансфераза се отсяват за оптималната комбинация на желана активност. Техниките за провеждане на мутации чрез заместване при порано определените места в ДНК, имащи позната последователност, са добре известни, например М13 иницирана мутагенеза или PCR базирана мутагенеза.

Аминокиселинните субституции обикновено са с прости остатъци, включванията са от порядъка на около 1 до 10 аминокиселинни остатъци и делецията е от порядъка на 1 до 30 остатъка. Делецията и включванията за предпочитане се извършват в съседни двойки, т.е. изпускане на 2 остатъка или включване на 2 остатъка. Заменяне, включване и делеция или каквато и да е комбинация от тях могат да се комбинират, за да се достигне крайната структура. Очевидно мутацията, която ще се извърши в ДНК, кодираща варианта сиалилтрансфераза, не трябва да измества секвенцията извън рамката на разчитане и за предпочитане не трябва да създава допълнителни участъци, които биха могли да продуцират вторична тРНК структура (ЕР 75 444А).

Варианти, получени чрез заменяне, са тези, в които най-малко един остатък от фиг.1 или 2 последователности е отстранен и на негово място е вмъкнат различен остатък. Такива заменяния най-общо се правят съгласно следващата таблица 1, когато това се желае за крайно модулиране характеристиката на сиалилтрансферазата.

	Таблица 1
Оригинален остатък	Примерно заместване
Ala	Ser
Arg	Lys
Asn	Gin,His
Asp	Glu

Cys	Ser
Gin	Asn
Glu	Asp
Gly	Pro
His	Asn,Gin
He	Leu,Val
Leu	lie,Val
Lys	Arg, Gin,Glu
Met	Leu,lie
Phe	Met, Leu, Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp.Phee
Val	He,Leu
Съществени промени във функцията или

имунологичната идентичност се правят чрез подбиране на заменянията, които да са помалко консервативни от тези в таблица 1, т.е. като се избират остатъци, които се различават по-значително по техния ефект на запазване (а) структурата на полипептидния скелет в областта на заместването, например листова или спирална конформация, б) натоварването или хидрофобността на молеуклата на мястото на мишената или в) големината на страничната верига. Заменянията, които найобщо се очаква да предизвикат най-големите промени в свойствата на сиалилтрансферазата са тези, при които:

а) хидрофилен остатък, напр.серил или треонил се замества с (или от) хидрофобен остатък, напр.левцил, изолевцил, фенилаланил, валил или аланил, б) цистеин или пролин се замества с (или от) всеки друг остатък, в) остатък, притежаващ електроположителна странична верига, напр.лизил, аргинил или хистидил, се замества с (или от) електроотринателен остатък, напр.глутамил или аспартил или г) остатък, притежаващ обемиста странична верига, напр.фенилаланин се замества с (или от) такъв, който няма странична верига, напр.глицин.

Главен клас варианти, получени чрез заменяне или делеция са тези, които включват трансмембранен и/или цитоплазмен участък на сиалилтрансфераза. Цитоплазменият домен на сиалилтрансфераза е последователността от аминокиселинни остатъци, започваща от стартовите кодони, показани на фиг.1 и 2, и продължаваща приблизително 11 допълнителни остатъци. Остатъците 10-28 и 12-27, съответ но от плъх и свиня, се счита, че служат като последователност, спираща преноса. Конформационните извивки, въведени чрез Phe-VaiArg-Asn и Pro-Met-Arg-Lys-Lys-Ser-Thr-Leu-Lys остатъците от плъх и свиня, съответно, и електроположителният характер на тези остатъци действа заедно с трансмембранния остатък, описан по-долу, препятстващо преноса на сиалилтрансфераза при клетъчната мембрана.

Трансмембранният участък на сиалилтрансферазата е разположен в последователността, отделена от свиня при остатъците 1227 (където Ala е +1, както е показано на фиг.2) и в последователността, получена от плъх в аналогично местоположение. Този участък е силно хидрофобен домен, който със свойствения си размер обхваща липидния двоен слой на клетъчната мембрана. Счита се, че функционира в съгласие с цитоплазмения домен за контакт на сиалилтрансфераза в апарата на Golgi или е едноплазмения ретикулум.

Делеция или заменяне на който и да е или на двата - цитоплазмения и трансмембранния домени, улеснява събирането на рекомбинантна сиалилтрансфераза чрез намаляване на нейния клетъчен или мембранен липиден афинитет и подобряване на нейната разтворимост във вода, така че да не са необходими детергенти, за да се поддържа сиалилтрансферазата във воден разтвор. (Виж напр. US 5 032 519, описващ производството на разтворима β-галактозид а2,С-сиалилтрансфераза, която тук е специално включена за сравнение). Делеция само на цитоплазмения домен, като в същото време се запазва трансмембранната последователност, води до продуциране на сиалилтрансфераза, която се солюбилизира с детергент. Сиалилтрансфераза с отпаднал цитоплазмен домен е по-подходящо да се вмъкне в мембрани, като при това се създава възможност да се насочи нейната ензимна активност. За предпочитане е цитоплазмените или трансмембранните домени да се изпускат, а не да се заменят (напр.аминокиселини 1-33 при α2,3-Ν сиалилтрансфераза от плъх, за да се спре трансфера на секвенция за продуциране на разтворима сиалилтрансфераза).

Цитоплазмената и/или трансмембранна (С-Т) сиалилтрансфераза, получена чрез делеция или заменяне, може да се синтезира директно в рекомбинантна клетъчна култура или като сливане със сигнална последователност, за предпочитане сигнал, хомоложен на гостоприемника. Например при конструиране на прокариотен експресионен вектор С-Т домените се изпускат с помощта на бактериална алкална фосфатаза 1рр или топлинно устойчиви ентеротоксин II лидери, а за дрожди домените се заместват с дрождена инвертаза, алфа фактор или киселофосфатазни лидери. При бозайникова клетъчна експресия С-Т домените се заместват с бозайникови клетъчни вирусни секторни лидери, например herpes simplex gD сигнал. Когато секреторният лидер е “разпознат” от гостоприемника, сигналната пептидаза на гостоприемника е способна да скъса свързването на лидерния полипептид, свързан при нейния С-край до С-Т изпусната сиалилтрансфераза. Предимството на С-Т изпуснатата сиалилтрансфераза е, че тя може да бъде секретиране в културална среда. Този вариант е водоразтворим и няма оценим афинитет към клетъчномембранните липиди, като по такъв начин значително се опростява събирането му от рекомбинантната клетъчна култура.

Прибавянето на детергент като нейонен детергент може да се използва за солюбилизиране, стабилизиране и/или за засилване биологичната активност на протеините, които съдържат мембранната контактна последователност. Например предпочитан детергент е дезоксихоловата киселина, но може да се използват и Tween, NP-40 и Triton Х-100, както и други детергенти. Изборът на детергент се определя по усмотрение на използващия го специалист, като се базира на специфичните условия на средата и природата на включения полипептид (и).

Мутагенеза посредством заменяне или делеция се използва, за да се елиминират N- или О-свързани гликозилирани места. Алтернативно негликозилирана сиалилтрансфераза се получава в рекомбинантна прокариотна клетъчна култура. Делеция на цистеин или друг лабилен остатък също може да бъде желано, например за увеличаване на окислителната стабилност на сиалилтрансферазата. Делеция или заменяне на потенциални протеолитични места, напр.дибазични остатъци като ArgArg, се извършват посредством делеция на единия от базичните остатъци или заменянето на единия от тях с глутаминилов или хистидилов остатък.

Варианти на включване на аминокиселинна последователност на сиалилтрансфера зата са тези, при които един или повече аминокиселинни остатъци са въведени на предварително определено място в мишената сиалилтрансфераза. Обичайно вариантите с включване са сливане на хетероложни протеини или полипептиди с амино или карбоксилния край на сиалилтрансферазата.

ДНК, кодираща сиалилтрансфераза, се получава от други източници освен от плъх или свиня чрез а) получаване на сДНК банка от различни тъкани като черен дроб или подчелюстни слюнчени жлези от даденото животно,

б) провеждане на хибридизационен анализ с белязана ДНК, кодираща консервативния участък на хомоложност на сиалилтрансфераза или фрагменти от същата (обикновено по-големи от 30 Ьр), с оглед да се открият клонове в сДНК банката, съдържаща хомоложни последователности и в) анализиране на клоновете посредством рестрикционен ензимен анализ и секвениране на нуклеиновата киселина, за да се идентифицира пълната дължина на клона. Ако в банката не присъстват клонове с пълна дължина, тогава подходящи фрагменти могат да се събират от различни клонове и да се свържат при рестрикционните места общи за клоновете, за да се съчлени клон с пълна дължина.

“По същество несъдържаща” или “по същество чиста”, когато се описва състоянието на сиалилтрансфераза. продуцирана съгласно изобретението, означава свободна от протеини или други материали нормално свързани със сиалилтрансферазата в нейната природно срещана in vivo физиологична среда, като например когато сиалилтрансферазата се получава от кръв и/или тъкан посредством екстракция и пречистване. Сиалилтрансферазата, получена по метода съгласно изобретението, е повече от или равна на 95% тегл. сиалилтрансфераза от общия протеин, съдържа проста наситена връзка (чрез синьо оцветяване по Coomasie) при електрофореза на полиакриламиден гел и има специфична активност най-малко около 500 nmol/ mg протеин/мин.

С термина “по същество подобна” или “по същество идентична”, както е използван тук, се отбелязва характеристика на полипептидната последователност или последователността на нуклеиновата киселина, където полипептидната последователност има най-малко 70% идентичност на последователността уравнена с контролна последователност, а последо вателността на нуклеиновите киселини е с наймалко 80% идентичност, сравнена с контролна последователност. Процентът на идентичност на последователността е изчислен, като се изключват малките отделяния или прибавяния, които общо са по-малко от 35% от контролната последователност. Контролната последователност може да бъде подклас от по-голяма последователност като тези, показани на фиг. 1 и 2, като все пак контролната последователност е дълга най-малко 18 нуклеотида в случая на полинуклеотиди и дълга поне 6 аминоостатька в случая на полипептиди.

Най-общо прокариотите се използват за клониране на ДНК последователности при конструиране на векторите, полезни съгласно изобретението. Например E.coli К12 щам 294(АТСС N° 31446) е особено полезен. Други микробни щамове, които могат да бъдат използвани, са E.coli В и E.coli X 1776 (АТСС + 31537). Тези примери са илюстриращи, но не ограничаващи.

Прокариотите се използват също и за експресия. Могат да се използват споменатите щамове, както и E.coli W 3110 (F-λ-, прототрофен, АТСС №27325), бацили като Bacillus subtilis и други ентеробактерии като Salmonella tvphimurium или Serratia marcescans и различни видове Pseudomonas.

Най-общо плазмиди вектори, съдържащи промотори и контролни последователности, които са получени от видове, съвместими с клетката-гостоприемник, се използват с тези гостоприемници. Векторът обикновено носи мястото на репликация, както и маркираната последователност, които могат да осигурят фенотипна селекция в трансформираните клетки. Например E.coli обикновено се трансформира като се използва pBR322, плазмид, получен от E.coli видове (Bolivar и сътр., Gene 2, 95 [1977]), pBR322 съдържа гени за ампицилинова и тетрациклинова резистентност и по такъв начин осигуряват лесно средства за идентифициране на трансформираните клетки. pBR322 плазмидът или друг микробен плазмид трябва също да съдържа или да се модифицира, за да съдържа промотори и други контролни елементи, обичайно използвани при конструирането на рекомбинантна ДНК.

За илюстрация промотори, подходящи за използване с прокариотни гостоприемници, включват β-лактамазна и лактозна промотор на система. (Chang и сътр., Nature, 275, 615 [1976] и Goeddel и сътр., Nature, 281, 544 [1979]), алкална фосфатазна, триптофанова (trp) промоторна система (Goeddel, D., Nucleic acids Res. 8, 4057 [1980]) и хибридни промотори като tac-промотор (de Boer, Н., PNAS (USA) 80, 21-25 [1983]). Подходящи са и други функционални бактериални промотори. Техните нуклеотидни последователности са известни, което дава възможност на специалистите операторно да ги свързват към ДНК, кодираща сиалилтрансфераза (Siebenlist и сътр., Cell 2 [1980]) като се използват линкери или адаптери, за да се осигурят изискваните места за рестрикция. Промоторите, използвани в бактериални системи, могат да съдържат също последователност на Shine-Dalgarno (S.D.) операторно свързана с ДНК, кодираща сиалилтрансфераза.

В допълнение към прокариотите могат да се използват също еукариотни микроби като дрождени култури. Най-общоизвестният еукариотен микроорганизъм е Saccharomyces cerevisiae или мая за хляб, въпреки че са достъпни много други щамове. За експресия в Saccharomyces общоизползван е например плазмидът YRp7, (Stinchomb и сътр., Nature 282,39 [1979], Kingsman и сътр., Gene 7, 141 [1979], Tschemper и сътр., Gene 10, 157 [1980]). Този плазмид предварително съдържа trpl ген, който осигурява селекционен маркер за мутанен щам от дрожди, на който липсва възможността да расте в триптофан, например АТСС № 44076 или РЕР4-1 (Jones, Genetics 85,12 [1977]). Наличието на trpl лезия като характеристика на геном от дрождена клетка-гостоприемник осигурява в ефективна околна среда откриване трансформация чрез растеж в отсъствие на триптофан.

Подходящи промоторни последователности за употреба с дрожден гостоприемник са промотори за 3-фосфоглицераткиназа (Hitzeman и сътр., J.Biol. Chem. 225, 2073 [1980]) или други гликолитични ензими (Hess и сътр., J.Adv. Enzyme Reg. 7, 149 [1968] и Holland, Biochemistry 17, 4900 [1978]) катоенолаза, глицералдехид-3-фосфатдехидрогеназа, хексокиназа, пируватдекатрбксилаза фосфофруктокиназа, глюкозо-6-фосфатизомераза,3-фосфоглицератмутаза, пируваткиназа, триозефосфатизомераза, фосфоглюкозоизомераза и глюкосиназа.

Други дрождени промотори, които са индуциращи промотори с допълнително предимство на транскрипция, контролирана от растежните условия, са промоторните участъци за алкохол дехидрогеназа 2, изоцитохром С, кисела фосфатаза, разграждащи ензими, свързани с азотния метаболизъм, металотионеин, глицералдехид-3-фосфатдехидрогеназа и ензим, отговорни за малтозното и галактозно оползотворяване. Подходящи вектори и промотори, използвани при дрождена експресия, са описани от R.Hitzemdn и сътр., ЕР 73 657А. Дрождени усилватели се използват също изгодно с дрождени промотори.

“Контролен участък” се отнася за специфични последователности при 5' и 3' краищата на еукариотните гени, които могат да се включат в контрола на транскрипцията или транслацията. Всъщност всички еукариотни гени притежават богат на АТ участък, разположен приблизително 25 до 30 бази обратно от мястото, където започва транскрипцията. Друга последователност, установена 70 до 80 бази обратно от старта на транскрипцията на много гени, е СХСААТ участъка, където X може да бъде всеки нуклеотид. При З'края повечето еукариотни гени е ААТААА последователността ,която може да бъде сигнална за прибавяне на poly А опашка към 3' края на транскрибираната тРНК.

Предпочитани промотори, контролиращи транскрипцията от вектори в гостоприемник от бозайникови клетки, могат да се получат от различни източници, например геномите на вируси като: полиома, Simian virus (SV40), аденовирус, ретровируси, хепатит-β вирус и цитомегаловирус или от хетероложни бозайникови промотори, напр. бета актинови промотори. Ранните и късните промотори на SV40 вируса се получават обикновено като SV40 рестрикционен фрагмент, който също съдържа SV40 вирусното начало на репликация (Fiers и сътр., Nature, 273,113 [1978]). Непосредственият ранен вирус на човешки цитомегаловиурс обичайно се получава като Hindlll Е рестрикционен фрагмент (Greenaway, P.J. и сътр., Gene 18 355-360 [1982]). Разбира се промотори от клетките-гостоприемник или родствени видове тук също са полезни.

Транскрипцията на ДНК, кодираща енцефалиназа от по-висши еукариоти, се усилва чрез включване на усилваща секвенция във вектора. Усилвателите са cis-действащи елементи на ДНК, обикновено от около 10-3000 Ьр, които действат върху промотора ,така че увеличават неговата транскрипция. Усилвателите са независими относно ориентация и позиция и са намерени 5'(Laimins, L. и сътр., PNAS 78, 993 [1981]) и 3' (Lusky, M.L. и сътр., Mol Cell Bio.3, 1108(1983]) спрямо транскрипционната единица, в интрона (banerij, J.L. и сътр., Cell 33, 729 [1983]), както и в самата кодираща последователност (Osborne, T.F. и сътр., Mol. Cell Bio. 4, 1293 [1984]). Известни са много усилващи последователности от бозайникови гени (глобин, еластаза, албумин, а-фетопротеин и инсулин). Обикновено обаче се използва усилвател от еукариотен клетъчен вирус. Примери са SV40 усилвател на последната част на началото на репликацията (Ьр 100-270), усилвател на ранния промотор на цитомегаловируса, усилвател от полиома на последната част на началото на репликацията и аденовирусни усилватели.

Експресионните вектори, използвани в еукариотни клетки-гостоприемници (дрождени, фунгални, насекомни, растителни, животински, човешки или нуклеотидни клетки от други многоклетъчни организми) също съдържат последователности, необходими за завършването на транскрипцията, която може да се засегне експресията на тРНК. Тези участъци се транскрибират като полиаденилатни сегменти в нетранслираната част на тРНК, кодираща сиалилтрансфераза.

3' нетранслираните участъци също включват места за завършване на транскрипцията.

Експресионните вектори могат да съдържат ген от селекцията, също завършващ с избираем маркер. Примери за подходящи избираеми маркери за животински клетки са дихидрофолатредуктаза (DHFR), орнитиндекарбоксилаза, биохимичен маркер за резистентност на много лекарства, аденозиндеаминаза, аспарагинсинтетаза, глутаминсинтетаза, тримидинкиназа или неомицин. Когато такива избираеми маркери се прехвърлят успешно в животинската клетка-гостоприемник, трансформираната бозайникова клетка-гостоприемник може да оживее, ако се постави под избрано налягане. Има две широко използвани различни категории на селективни режими. Първата категория се базира на клетъчния метаболизъм и на използването на мутантна клетъчна линия, която няма способността да расте независимо от добавената среда. Два примера са СНО DHFR-клетки и миши LTK-клетки. Тези клетки растат без прибавяне на такива хранителни вещества като тимидин или хипоксантин. Понеже на тези клетки им липсват известни гени, необходими за пълния нукелотиден път на синтеза, те не могат да преживяват, освен ако липсващият нуклеотиден синтезен път се осигурява в допълнителна среда. Алтернатива на добавянето на хранителна среда е да се въведе интактна DHFR или ТК ген в клетките, на които им липсват съответните гени, като по такъв начин се изменят изискванията за растежа им. Индивидуални клетки, които не са трансформирани с DHFR или ТК ген, не са способни да преживяват в среди без добавки.

Втората категория с доминантна селекция, която съответства на селекционната схема, използвана при всеки клетъчен тип и не изисква използването на мутантна клетъчна линия. При тези схеми обикновено се използва лекарство, за да се прекрати растежът на клетката-гостоприемник. От онези клетки, които имат нов ген, ще експресират протеин, който носи резистентност към лекарството и преживява селекцията. Примери за такава доминантна селекция са лекарствата неомицин (Southern, Р., Berg,Р., J.Molec.Appl.Genet, 1,327 [1982]), микрофенолна киселина (Mulligan, R.C., Berg, Р., Science 209, [1980]) или хидромицин (Sugden, В. и сътр., Mol. Cell Biol. 5,410-413 [1985]). При трите примера, дадени по-горе, си използват бактериални гени под еукариотен контрол, за да се придаде резистентност към подходящото лекарство G418 или неомицин (гентицин), xgpt (микрофенолна киселина) или хигромицин, съответно.

“Амплификация” отговаря на увеличението или репликацията на изолиран участък в клетъчната хормозомна ДНК. Амплификацията се постига, като се използва селекционно средство, напр.метотрексат (МТХ), който инактивира DHFR. Амплификацията или акумулацията на многобройни копия от DHFR ген има за резултат по-големи количества THFR, продуцирана въпреки по-големите количества МТХ. Амплификационен натиск се прилага без да се препятства присъствието на ендогенна RHFR чрез прибавяне на все поголеми количества МТХ към средата. Амплификация на желания ген може да бъде пос тигната чрез конрансфекция на бозайникова клетка-гостоприемник с плазмид, имащ ДНК, кодираща желания протеин и FHFR или амплификационен ген чрез коинтеграция се отнася като коамплификация. Изискването за дадена възможност на клетката да изисква повече DHFR се удовлетворява чрез репликация на селекционен ген, чрез селекциониране само на клетки, които могат да растат в присъствието на все по-големи концентрации МТХ. Доколкото генът, кодиращ желания хетероложен протеин, се контегрира със селекционния ген, репликацията на този ген често поражда репликация на гена, кодиращ желания протеин. Резултатът е, че увеличените копия на гена, напр. амплифицирания ген, кодиращ експресията на желания фетероложен протеин, експресира повече от желания хетероложен протеин.

Предпочитани подходящи клетки-гостоприемници за експресия на вектори съгласно изобретението, кодиращи сиалилтрансфераза в по-висши еукариоти са: CV1 линия от маймунски бъбреци, трансформирана чрез SV40 (COS7, ATCC CRL 1651), клетъчна линия от човешки бъбрек в ембрион (293) (Graham, F. L. и сътр., J. Gen. Virol. 36, 59 /1977/), бъбречни клетки от хамстерчета-кърмачета (ВНК, АТСС CCL 10), овариални клетки DHFR от китайски хамстер (СНО, Urlaub and Chasin, PNAS (USA) 77, 4216 /1980/), сертолиеви клетки от мишка (ТМ4, Mather, J. Р., Biol. Reprod. 23, 243 - 251 /1980/), бъбречни клетки от маймуна (CV1 ATCC CCL 70), бъбречни клетки от африканска зелена маймуна (VERO-76 АТСС CRL 1587), клетки от човешка цервикална карцинома (HELA АТСС CCL 2), бъбречни клетки от куче (MDCK АТСС CCL 34), чернодробни клетки от биволски плъх (BRL ЗА, АТСС CCL 75), човешки белодробни клетки (W138, АТСС CCL 75, човешки чернодробни клетки (Hep G2, НВ 8065), миши тумор на гръдната жлеза (ММТ 060562, АТСС CCL 51) и TRI клетки (Mather, J. Р. и сътр., Annals Ν. Y. Acad. Sci. 383, 44 - 46 /1982/), бакуловирусни клетки.

“Трансформация” означава въвеждане на ДНК в организма така, че ДНК се рециплира или като извънхромозомен елемент или като хромозомна интеграция. Освен ако не е посочено друго, използваният тук метод за трансформация на клетките на гостоприемника е методът на Graham, F. и Van der Eb, A.,

Virology 52, 456 - 457 /1973/). Могат да се използват и методи за вкарване на ДНК в клетките чрез ядрено инжектиране или чрез сливане на протопласти. Ако се използват прокариотни клетки или клетки, които съдържат здрава клетъчна стена, предпочитаният метод на трансформация е третиране с калций, като се използва калциев хлорид, както е описано от Cohen, F. N. и сътр., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110 /1972/).

За анализ, за да се потвърдят правилните последователности в конструирания плазмид, се използват лигирани смеси за трансформиране на E.coli К12 294 щам 294 (АТСС 31446), като подходящи са успешно трансформираните, избрани по ампицилинова или тетрациклинова резистентност. Приготвят се плазмиди от тези трансформанти, анализират се чрез рестрикция и/или се секвенират по метода на Messing и сътр., Nucleic Acids Res. 9, 309 /1981/ или по метода на Махат и сътр., Methods in Enzymology 65, 449 /1980/.

Клетките на гостоприемника могат да се трансформират с експресионни вектори съгласно изобретението и се култивират в обичайна хранителна среда, модифицирана за инициране на промоторите, като се избират трансформантите или амплифицираните гени. Условията на култивиране като температура, pH и подобни са тези, използвани по-рано при клетките-гостоприемници, избрани за експресия, и са добре познати.

“Трансфекция” се отнася до поемането на експресионен вектор от клетката-гостоприемник без значение дали в действителност се експресира някаква кодираща последователност. На специалистите са познати многобройни методи за трансфекция, например СаРО₄ и електропорация. Успешната трансформация най-общо се разпознава, когато в клеткатагостоприемник настъпи някаква индикация за операциите на този вектор.

С оглед да се улесни разбирането на следващите примери се описват някои често срещащи се методи и/или термини.

“Плазмиди” са означени с малка буква р, като преди нея и/или след нея има главни букви и/или цифри. Изходните плазмиди тук са или търговско достъпни, неограничено публично достъпни, или могат да се конструират от достъпни плазмиди съгласно публикувани методи. Освен това в областта са известни ек вивалентни на описаните плазмиди и те са ясни за обикновените специалисти.

“Смилане” на ДНК означава каталитично отцепване на ДНК с помощта на рестрикционен ензим, който действа само в определени последователности в ДНК. Различните рестрикционни ензими, използвани тук, са търговско достъпни и реакционните условия за тях, кофактори и други изисквания се използват, както са известни на специалистите. За аналитични цели обикновено 1 pg плазмид или ДНК фрагмент се използва с около 2 единици ензим в около 20 μΐ буферен разтвор. С цел изолиране на ДНК фрагменти за конструиране на плазмид обикновено 5 до 50 pg ДНК се смила с 20 до 250 единици ензим в по-голям обем. Подходящи буфери и субстратни количества за конкретните рестрикционни ензими са уточнени от производителя. Обикновено се използва време за инкубиране от около 1 h при 37°С, но може да се варира съгласно инструкциите на доставчика. След смилането реакционната смес се подлага на електрофореза директно върху полиакриламиден гел, за да се изолира желания фрагмент.

Разделянето на фрагментите по размер се осъществява, като се използва 8-процентен полиакриламиден гел, описан от Goeddel, D. и сътр., Nuleic Acids Res., 8, 4057 /1980/.

“Дефосфорилиране” означава отстраняване на крайните 5'-фосфати посредством третиране с бактериална алкална фосфатаза (ВАР). Тази процедура предпазва двата рестрикционно разделени края на ДНК фрагмента от “циркуларизирания” или образуващия затворена бримка, което налага включване на друг ДНК фрагмент на мястото на рестрикция. Процедурите и реактивите за дефосфорилиране са конвенционални (Maniatis, Т. и сътр., Molecular Cloning р. 133 - 134 /1982/). Реакциите с използване на ВАР се извършват в 50 mM Tris при 68°С, за да се подтисне активността на която и да е екзонуклеаза, която може да присъства в ензимния препарат. Реакцията протича за един час. След реакцията ДНК фрагментът се пречиства.

“Олигонуклеотиди” се отнася или до едноверижни полидеоксинуклеотиди или до две комплементарни полидеоксинуклеотидни вериги, които могат да се синтезират химически. Такива синтетични олигонуклеотиди имат 5'-фосфат и затова не се лигират с друг олигонуклеотид без прибавяне на фосфат с АТЗ в присъствието на киназа. Синтетичният олигонуклеотид се лигира с фрагмент, който не е бил дефосфорилиран.

“Лигиране” се отнася до процеса на образуване на фосфодиестерни връзки между два двойноверижни фрагмента от нуклеинова киселина (Maniatis, Т. и сътр., Id., р. 146). Ако не е посочено друго, лигирането може да се осъществи като се използват известни буфери и условия с 10 единици Т4 ДНК лигаза за 0,5 pg от приблизително еквимоларни количества ДНК фрагменти за лигиране. За конструиране на подходящи вектори, съдържащи желаната кодираща и контролна последователност, се използват стандартни техники за лигиране. Изолираните плазмиди или ДНК фрагменти се прилепват, зашиват или лигират отново във форма, желана за формата на искания плазмид.

“Запълнени” или “слепи краища” се отнася до процедури, при които едноверижният край в лепливия край на отстранената с рестрикционен ензим нуклеинова киселина се превръща в двойна верига. Това елиминира лепливите краища и образува сляп край. Този процес, обратно, е инструмент за превръщане на рестрикционно срязания край, който може да бъде леплив с края, създаден само с един или няколко други рестрикционни ензима, в край, съвместим с всяка сляпо-срязваща рестрикционна ендонуклеаза или друг запълнен леплив край. Обикновено завършването със сляп край се извършва посредством инкубиране на 2 - 15 pg от ДНК мишената в 10 mM MgCl₂, 1 т.М дитиотреитол, 50 mM NaCl, 10 тМ Tris (pH 7,5) буфер при около 37°С в присъствие на 8 единици фрагмент на ДНК полимераза I на Klenow и 250 pm от всяка от четирите деоксинуклеозидтрифосфат. Инкубацията обикновено завършва след 30 min чрез фенолна или хлороформена екстракция и утаяване с етанол.

Полинуклеозидите, съответстващи на или комплементарни на части от описаните последователности, могат да се използват като хибридизационни проби, за да се идентифицират и/или да се изолират съответните последователности на зародишни гени. Такива полинуклеотиди могат да се използват като хибридизационни проби за отсяване на сДНК и геномни банки за изолиране на сДНК-и и гени, кодиращи полипептиди, които са структурно и/или еволюционно свързани със сиалилтрансферазната последователност съгласно изобретението. Алтернативно такива полинуклеотиди могат да послужат като праймери за амплификация на гениите последователности от зародишната линия или родствени последователности посредством полимеразна верижна реакция (PCR).

Хибридизационните проби, използвани за идентифициране на допълнителни сДНК видове сиалилтрансфераза, са описани на база нуклеотида и очакваните аминокиселинни последователности са показани на фиг. 1 и 2. Хибридизационните проби, които обичайно са маркирани чрез включване на радиоизотопи, могат да се състоят от един или повече обединения на изродени олигонуклеотиди, които кодират изцяло или част от консервативния участък, съответстващ на 55 сегментни остатъка, простиращи се от аминокиселинния остатък 134 до аминокиселинния остатък 189 у а 2,3-0 сиалилтрансфераза от свиня (фиг. 1). В частност хептапептидният мотив -Asp-Val-Gly-Ser-Lys-ThrThr- е високо консервативен и хибридизационните проби, съдържащи изродените олигонуклеотиди, кодиращи този мотив, или варианти на този мотив, където една или две аминокиселини се модифицират така, че да останат наймалко около 4 или 5 аминокиселини от хептапептида. Проби от изродени олигонуклеотиди, кодиращи варианти на хептапептидния мотив посредством единично или двойно аминокиселинно заменяне, също са полезни за отсяване на родствени сДНК видове сиалилтрансфераза. В допълнение към изродените олигонуклеотиди, като проби могат да се използват фрагменти от клонирани полинуклеотиди като тези, посочени на фиг. 1 и 2. Предпочита се такава проба да обхваща хептапептидния мотив и ако се желае и консервативните 55 аминокиселинни сегментни остатъка, описани по-горе.

Геномни или сДНК клонове, кодиращи сиалилтрансфераза, могат да се изолират от клонове банка, като се използват хибридизационни проби, създадени на база сиалилтрансферазна нуклеотидна последователност като тази, посочена на фиг. 1 и 2. Където се желае сДНК клон, се предпочита клонът банка, съдържащ сДНК, получена от клетка, експресираща сиалилтрансфераза(и). Алтернативно, синтетични полинуклеотидни последователности, съответстващи на всички или на част от последователностите, показани на фиг. 1 и 2, могат да се конструират посредством химически синтези на олигонуклеотиди. Освен това могат да се използват полимеразни верижни реакции (PCR), като се използват праймери, базирани на данните за последователността, описани на фиг. 1 и 2, за да се амплифицират ДНК фрагменти от геномна ДНК, тРНК обединявания или от сДНК клон от банка. US 4 683 195 и 4 683 202 описва PCR метода. В допълнение могат да се използват PCR методите, използващи един праймер, който се базира на данните за последователността, описани на фиг. 1 и 2 и втори праймер, който не се базира на данните за тази последователност. Например, може да се използва втори праймер, който е хомоложен на или комплементарен на полиаденилирания сегмент.

За специалистите от областта е очевидно, че съгласно изобретението в полинуклеотидите могат да се включат нуклеотидните замени, делеция и инсерция. Обаче тези нуклеотидни замени, делеция и инсерция не трябва съществено да нарушават способността на полинуклеотида да хибридизира до една от полинуклеотидните последователности, показани на фиг. 1 и 2, при условията на хибридизация, които са достатъчно строги, за да се достигне до специфична хибридизация.

Нуклеотидната и аминокиселинна последователности, показани на фиг. 1 и 2, позволяват на специалистите да произвеждат полипептиди, съответстващи изцяло или отчасти на кодираните полипептидни последователности. Такива полипептиди могат да се продуцират в прокариотни или еукариотни клетки-гостоприемници чрез експресия на полинуклеотиди, кодиращи пълната дължина на сиалилтрансферазата (те) или фрагменти или техни аналози. Алтернативно такива полипептиди могат да се синтезират посредством химически методи или да се продуцират посредством in vivo транслационни системи, като се използва полинуклеотидна матрица за директна транслация. Методите за експресия на хетероложни протеини в рекомбинантни гостоприемници, химична синтеза на полипептида и in vivo транслацията са добре известни на специалистите в областта и са описани по-подробно от Maniatis и сътр., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), 2nd Ed., Cold Spring Harbor, Ν. Y. и Berger and Kimmel, Methods in Enzymology, V. 152,

Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, CA.

От специалистите могат да се получат фрагменти на сиалилтрансфераза. Предпочитани амино- и карбокси-краища на фрагменти или аналози се срещат близо до границите на структурни и/или функционални домени, например близо до ензимноактивно място. Фрагменти, съдържащи по същество един или повече функционални домени, могат да се сливат с хетероложни полипептидни последователности, като в резултат се получава слят протеин, показващ функционални свойства, като ензимна активност, придадена му от фрагмента. Алтернативно полипептиди от делеция, където един или повече функционални домени са били изпуснати, показват загуба на свойството, нормално придавано му от липсващия фрагмент.

Бакуловирусната еукариотна генна експресия е едно от най-ефикасните средства за създаване на големи количества функционално активен протеин от клонирани гени (Summers,

М. и Lucov, V. (1988) Bio/Technology 6: 47, който е посочен тук за сравнение). Сиалилтрансферазните полипептиди съгласно изобретението могат да се произведат от клонирани полинуклеотиди чрез експресия в бакувирусна експресионна система (Invitrogen Corporation, San Diego, СА).

Типична сиалилтрансфераза и нейният рекомбинантен експресионен продукт се получава съгласно следния протокол:

1. Сиалилтрансфераза от свински черен дроб се пречиства до видима хомогенност.

2. Определя се N-крайната аминокиселинна последователност на сиалилтрансферазата от свиня.

3. Химически се синтезират олигонуклеотидни сонди, отговарящи на 18 аминокиселини близо до NH₂ крайната последователност.

4. Конструират се сДНК банки в Agtl 0, като се използва а) произволно иницирана poly А⁺ обогатена тРНК от свинска подчелюстна жлеза, б) oligo dT иницирана poly А⁺ обогатена тРНК от дроб на плъх и в) oligo dT poly А⁺ обогатено тРНК от мозък на плъх.

5. Използват се обединени радиобелязани синтетични деоксиолигонуклеотиди, комплементарни на кодоните за аминокиселинните последователности на сиалилтрансфераза, описани по-долу, като:

а) 5' ACC CTG AAG CTG CGC АСС

CTG CTG GTG CTG ТТС ATC ТТС CTG АСС ТСС ТТС ТТ 3'

б) 5' GAC GTC GGG AGC AAG АСС АСС 3'

6. Произволно иницирана банка от свинска подчелюстна жлеза се отсява, като се използват химически синтезираните дълги и къси маркирани проби олигонуклеотид с помощта на полинуклеотидкиназа и ³²р-АТР. Двойно положителните плаки се пречистват и секвенират чрез инсерция.

7. Използва се една ³²р маркирана инсерция за повторно смилане на oligo dT иницирани банки от свинска подчелюстна жлеза.

8. Пълната рамка на разчитане за свинска сиалилтрансфераза се получава от два препокриващи се клона сДНК от черен дроб и мозък на плъх съдържа консервативната област на хомоложност, както е определена чрез анализ на ДНК последователността на получения клон.

9. сДНК с пълна дължина, кодираща свинска сиалилтрансфераза, се конструира от два препокриващи се клона в плазмида и се секвенират. Трябва да се оцени, че описанието на ДНК последователностите на фиг. 1 и 2 позволява да се приготвят сонди от консервативната област на хомоложност на сиалилтрансферазната сДНК, като с това значително се опростява и увеличава ефективността на приготвяне на сонди сДНК или геномни банки от тези или други видове, както и други тъкани от тези или други видове, при което има възможност да се избегне пречистване, секвениране и приготвяне на пробни набори за сиалилтрансфераза.

10. Пълната дължина на сДНК, кодираща сиалилтрансфераза от свиня и плъх, след това се зашива върху експресионен преносител, който се използва за трансформиране на подходяща клетка-гостоприемник, която след това се отглежда в култура, продуцираща желаната сиалилтрансфераза.

11. Биологичноактивната зряла сиалилтрансфераза, произведена съгласно горните процедури, може да има алтернативни форми, както е показано на фиг. 4 и 5, получени в две изпълнения с 45 kDa и 48 kDa молекулно тегло.

Полинуклеотидите съгласно изобретението и рекомбинантно получените сиалилтрансферазни полипептиди и фрагменти или вариан ти на същите със заменени аминокиселини могат да се получат на база данните на фиг. 1, 2, 3, 5, 7 и 8 или на база данните за последователността, получена от нови сиалилтрансферазни сДНК-и, изолирани по методите съгласно изобретението. Продукцията на полинуклеотиди и рекомбинантно получени сиалилтрансферазни полипептиди се осъществява по известни в областта методи, описани от Maniatis и сътр., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd. Ed., (1989), Cold Spring Harbor, Ν. Y. и Berger и Kimmel, Methods in Enzymology, V. 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, СА, които са включени тук за сравнение. Полинуклеотидните последователности могат да се експресират в гостоприемника, след като последователността е била “оперативно свързана” към (т.е. поставена на място да осигури функционирането на) експресионна контролна последователност, така че транскрипцията на полинуклеотидната последователност да настъпи при подходящи условия за транскрипция.

“Специфична хибридизация”, както е дефинирана в описанието се отнася до формиране на хибриди между сонда, полинуклеотид (напр. полинуклеотид съгласно изобретението, който може да включва заменяне, изпускане и/или инсертиране) и специфичен полинуклеотид мишена (напр. полинуклеотид с комплементарна последователност), при което сондата за предпочитане хибридизира със специфичната мишена, така че, например, може да се идентифицира единична ивица по метода Nothem-блот на РНК, по-получена от еукариотни клетки, които съдържат РНК мишена и/или единичен главен PCR продукт, получен, когато сондата нуклеотид се използва като PCR праймер. В някои случаи последователността мишена може да се намира в повече от един вид полинуклеотид мишена (напр. специфична последователност мишена може да се среща в много членове на сиалилтрансферазната генна фамилия или в алтернативно свързани РНК-и транскрибирани от същия ген). Очевидно е, че оптималните условия на хибридизация ще варират в зависимост от състава на последователността и дължината (те) на пробата (е) и мишената (те) и избрания експериментален метод от практикуващия специалист. Могат да се използват различни принципи, за да се изберат подходящи условия за хибридизация (виж, Maniatis и сътр., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd. Ed., (1989), Cold Spring Harbor, Ν. Y. и Berger и Kimmel, Methods in Enzymology, V. 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, СА, които са включени тук за сравнение.

“Безсмислени полинуклеотиди” са полинуклеотиди, които са 1) комплементарни на всички или на част от последователностите, показани на фиг. 1 и 2, и/или последователностите, получени от нови сиалилтрансферазни сДНК-и изолати по методи съгласно изобретението и 2) които специфично хибридизират с комплементарни последователност мишена. Такива комплементарни безсмислени полинуклеотиди могат да включват нуклеотидно заменяне, инсертиране, делеция, или транспозициониране, стига да се запази специфичната хибридизация със съответната последователност мишена (напр. съответстващи на фиг. 1 и

2) като функционално свойство на полинуклеотида. Комплементарни безсмислени полинуклеотиди са разтворими безсмислени РНК или ДНК олигонуклеотиди, които могат да хибридизират специфично с индивидуални сиалилтрансферазни шРНК видове или с много членове на сиалилтрансферазната тРНК фамилия и предотвратява транскрипцията на тРНК видове и/или транслацията на кодирания полипептид (Cling и сътр., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10006 - 10010 1989), Broder и сътр., Ann. Int. Med. 113: 604 - 618 (1990), Loreau и сътр., FEBS Letters 274: 53 - 56 (1990), Holzenberg и сътр., WO 91/11535, U.S.S.N. 07/ 530, 165 (“New human CRIPTO gene”), WO 91/09865, WO 91/04753, WO 90/13641 и EP 386563, всеки от които е включен тук за сравнение). Безсмислените полинуклеотиди, следователно, инхибират продукцията на кодирания полипептид(и). В това отношение безсмислените полинуклеотиди, които инхибират транскрипцията и/или транслацията на една или повече сиалилтрансферази може да променят капацитета и/или специфичността на клетката към гликозилатни полипепти.

Безсмислените полинуклеотиди могат да се получат от хетероложна експресионна касета в трансфектираната или трансгенна клетка като трансгенна плурипотентна хематопоетична базална клетка, използвана за реконструиране на цялата или част от хематопоетичната клетъчна популация на индивида. Алтер нативно, безсмислените полинуклеотиди могат да бъдат разтворими олигонуклеотиди, които се разпределят към външната среда, или в културалната среда in vitro или в циркулаторната система или интерстициална течност in vivo. За разтворимите безсмислени полинуклеотиди, намиращи се във външната среда, е показано, че получават достъп до цитоплазмата и инхибират транслацията на специфичните тРНК видове. В някои изпълнения безсмислени полинуклеотиди съдържат метилфосфонатни остатъци, алтернативно могат да се използват фосфоротиолати или О-метилрибонуклеотиди, а могат да се използват също и химерни олигонуклеотиди (Dagle и сътр. (1990) Nucleic Acids Res. 18: 4751). За някои приложения безсмислените олигонуклеотиди могат да съдържат полиамид нуклеинови киселини (Nielsen и сътр., (1991) Science 254: 1497). За най-общите методи относно безсмислените полинуклеотиди виж Antisense RNA and DNA, (1988), D. A. Melton, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

Безсмислените полинуклеотиди, комплементарни на една или повече последователности, се използват за инхибиране транслацията на близки тРНК видове, като с това да се извърши намаляване на количеството на съответно кодирания полипептид. Такива безсмислени полинуклеотиди могат да осигурят терапевтична функция чрез инхибиране формирането на една или повече сиалилтрансферази in vivo.

Могат да се конструират трансгенни животни, притежаващи едно или повече интегрирани копия на сиалилтрансферазни трансгени. Сиалилтрансферазните трансгени са полинуклеотиди, съдържащи полинуклеотидна последователност, която кодира сиалилтрансферазен протеин или фрагмент, операторно свързан с функционален промотор и свързан с избрана маркирана последователност като G-418 резистентен ген.

Възможно е, като се използва генетична манипулация, да се развие трансгенна моделна система и/или цяла клетъчна система, съдържаща сиалилтрансферазен трансген за употреба, например като моделна система за скрининг за лекарства и оценка на ефективността на лекарства. Освен това такава моделна система осигурява инструмент за определяне на неизяснената биохимия на сиалилтрансферазния метаболизъм, и с това се осигурява база за рационален лекарствен дизайн и експериментално изпитване.

Един подход за създаване на трансгенни животни е да се насочи мутацията към желания ген чрез хомоложна рекомбинация в ембрионална базална клетъчна линия (ES) in vitro, последвано от микроинжектиране на модифицирана ES клетъчна линия в гостоприемника бластоцист и след това инкубация в приемна майка (виж Frohman и Martin (1989) Cell 56: 145). Алтернативно може да се използва техниката на микроинжектирането на мутирания ген или на части от него в едноклетъчен ембрион с последваща инкубация в използваната приемна майка. Могат да се прилагат различни начини за използване на трансгенни животни, по-специално трансгенни животни, които експресират природносрещащ се сиалилтрансферазен протеин или фрагменти от него. Алтернативно по желание могат да се конструират трансгенни животни, съдържащи трансгени, които кодират променен чрез мутация (напр. мутагенизиран) сиалилтрансферазен протеин (и), който може или не може да има ензимна активност. Методите за произвеждане на трансгенни животни са известни на специалистите.

Алтернативно може да се използва насочена по място мутагенеза и/или генна конверсия, за да се мутира in vivo сиалилтрансферазен генен алел, било ендогенен или трансфектиран, така че мутираният алел кодира вариантна сиалилтрансфераза.

Алтернативно може да се използва хомоложна рекомбинация, за да се вмъкне сиалилтрансферазна последователност в геномгостоприемник на специфично място, например на съответния локус на сиалилтрансферазен гостоприемник. При един тип на хомоложна рекомбинация се заменят една или повече последователности, например сиалилтрансферазен алел-гостоприемник (или част от него; се заменя с мутирана сиалилтрансферазна последователност (или части от нея). Освен това към такива методи на генно заместване може да се използва хомоложна рекомбинация, за да се насочи полинуклеотид, кодиращ сиалилтрансфераза (или фрагменти от нея) към специфично място, различно от локуса на сиалилтрансферазата-гостоприемник. Хомоложна рекомбинация може да се използва, за да се произведе трансгенно нечовешко животно и/ или клетки, които включват в себе си мутирани сиалилтрансферазни алели. Може да се използва генно насочване, за да се разруши и инактивира един или повече сиалилтрансферазен ген. Тези така наречени трансгенати “нокаут” са описани в литературата за други гени (WO 91 10741, Kuhn и сътр. (1991) Science 708: 707).

Следващите примери илюстрират найдобрия познат досега начин за прилагане на изобретението, без да го ограничават. Всички литературни цитати са вмъкнати тук за справка.

Пример 1

Пречистване на сиалилтрансфераза от свиня

Пречистване на две форми на сс2,3-О сиалилтрансфераза а2,3-О сиалилтрансферазата се пречиства, като се използва комбинация от две процедури, описани по-рано (Sadler J. Е. и сътр., J. Biol. Chem. 254, 4434 - 4443 (1979) и Conradt Н. S. и сътр., Sialic Acids 1988 Proceedings of the Japanese-German Symposium on Sialic Acids (Shauerand Yamakawa, eds.) p. 104 - 105, Verlag Wissenschaft and Bilding, Kiel /1988/). Ензимът се пречиства из екстракт от свински черен дроб, направен с Triton Х-100, чрез афинитетна хроматография на три последователни колони от CDP-хексаноламин агароза. Профилът на елуиране от първия и третия етап на пречистване е показан на фиг. 3 и 4, съответно фиг. 3 показва, че се наблюдават два пика сиалилтрансферазна активност в профила на елуиране от първата афинитетна колона. Тези два пика се разделят посредством обединяване на посочените фракции в обединения А и В,като тези две обединения са обогатени на две форми на а2,3-О силилтрансфераза с различни молекулни тегла.

Вторият етап на афинитетно пречистване на всяко обединение има за резултат отстраняване на по-голямата част от онечистванията от а2,6- сиалилтрансфераза, които също се намират в свински черен дроб (Sadler, J. Е. и сътр., J. Biol. Chem. 254, 4434 - 4443 /1979/). След третия етап на афинитетна хроматография фракциите от колоната се анализират и за отделни фракции се установява, че са обогатени с форми а2,3 сиалилтрансфераза с молекулно тегло 48 kDa (фиг. 4А, фракции 4 -

6) или на 45 kDa (фиг. 4В, фракции 2-6). Тези два протеина се означават респективно като форма А и форма В. Специфичната активност за пиковите фракции от двете колони е S - 10 единици/mg протеин. Силната ивица (-44 kDa), видима при фракции 6, фиг. 4, колона А не е а2,3 сиалилтрансфераза, а представлява едно от главните онечиствания в двете обединени части А и В след предходната колона, тъй като липсва ензимна активност в крайния етап на афинитетната хроматография.

Сиалилтрансферазната активност се изпитва с лактоза и/или антифризен гликопротеин с ниско молекулно тегло като субстрат. (Sadler, J. Е. и сътр., J. Biol. Chem. 254, 4434 4443 /1979/). Ензимът от свински черен дроб се пречиства, като се следват описаните методи (Sadler, J. Е. и сътр., J. Biol. Chem. 254, 4434 - 4443 /1979/ и Conradt Н. S. и сътр., Sialic Acids 1988 Proceedings of the Japanese German Symposium on Sialic Acids (Shauer and Yamakawa, eds.) p. 104 - 105, Verlag Wissenschaft and Bilding, Kiel /1988/) c някои модификации. Накратко, 2 kg черен дроб се хомогенизира в буфер и мембраните се приготвят, както е описано (Sadler, J. Е. и сътр., J. Biol. Chem. 254, 4434 - 4443 /1979/). Мембраните се екстрахират три пъти с буфер Conradt Н. S. и сътр., Sialic Acids 1988 Proceedings of the JapaneseGerman Symposium on Sialic Acids (Shauer and Yamakawa, eds.) p. 104 - 105, Verlag Wissenschaft and Bilding, Kiel /1988/ и екстрактът се пропуска през 1,5 1 колона CDP-хексаноламинагароза (колона 1) (16 umol/ml). След промиване на колоната с 3L буфер В, колоната се елуира с линеен градиент 0,05 до 1,0 М КС1 (2.5 1 х 2,5 1) в буфер В. Фракциите, съдържащи сс2,3 сиалилтрансфераза, се обединяват в две обединения А и В, представляващи главната част и провлачения край на пика, съответно (виж фиг. 3). Обединените фракции се диализират спрямо буфер В и се подлагат на друг етап афинитетна хроматография на CDPхексаноламинагароза (колони ПА и ПВ). 150 ml колона се използва за обединените фракции А и 30 ml колона за обединените фракции В. Двата препарата, получени от колона I (от общо 4 kg черен дроб), се зареждат на същата колона в етап II. Елуирането на а2,3 сиалилтрансферазата се осъществява с градиент 0 2.0 тМ СТР (750 ml, обединени фракции А, 150 ml обединени фракции В) в буфер В. Фракциите с а2,3 сиалилтрансферазна активност се обезсоляват на G50 Sephadex, екви либриран в буфер, и активните фракции се нанасят на 1,0 ml колони с CDP-хексаноламинагароза (част III), като се елуират с градиентна стъпка от 0,1 до 1,0 тМ СТР (20 стъпки, 1,0 ml всяка) в буфер В (виж фиг. 2). Активните фракции се обединяват и общият добив от двете колони е 2,5 единици при специфична активност 8-10 единици/mg протеин.

Сиалилтрансферазните пептиди 48 kDa и 45 kDa (виж фиг. 4) се разделят повторно на SDS-полиакриламиден гел (Leammli, U.K., Nature 227, 680 - 685 /1970/), електроелуират се на PVDF мембрана (Immobilon Transfer, Millipore) и се оцветяват с Coomasie брилянт блу (Sigma). Ивиците сиалилтрансфераза се изрязват и свързаните пептиди се анализират за NHj-крайна аминокиселинна последователност посредством разпадане по Edman, като се използва Applied Biosystems 475А прибор за определяне последователността на аминокиселините.

Фракциите, обогатени на формите 48 kDa (форма А) и 45 kDa (форма В) сиалилтрансфераза, се подлагат на електрофореза върху полиакриламиден гел (PAGE), пренасят се към PVDF мембрана и се анализират чрез секвениране на NH₂-kpaa. Двадесет и два аминокиселинни остатъка се получават от всяка секвенция за всеки от пептидите (фиг. 5). ИН₂-крайната последователност на форма А съдържа хидрофобен интервал от аминокиселини, който съвпада с очакваното от (Sadler, J. Е. и сътр., J. Biol. Chem. 254, 4434 - 4443 /1979/) и Wescott и сътр., (J. Biol. Chem. 260, 13109 - 13121), че по-малката форма произлиза от по-голямата форма чрез протеолитично разцепване на хидрофобен пептид. За този участък се предполага, че има значение за свойствата на детергентно и мембранно свързване, уникални за форма А.

Пример 2 сДНК сиалилтрансфераза от свиня

Poly А⁺ РНК се използва като матрица за конструиране на едноверижна сДНК, като се използва набор, доставен от Invitrogen. сДНК служи като матрица за полимеразната верижна реакция (PCR), като се използват реактиви и протоколи, доставени от Perkin Elmer Cetus. Използваните специфични условия са 92°С за 1 min, 50°С за 2 min и 72°С за 2 min за стадия денатуриране, хибридизация и полимеризация. PCR реакциите започват с 30 Ьр, олигонуклеотидите, съответстващи на последователности, граничещи с 120 Ьр, делеция при 3' края на ST1. Продуктите от реакцията на амплификация се разделят върху 2 % агарозен гел. Двете специфични ивици, различаващи се при 120 Ьр, съответстващи на ST1 и ST2 клонове се идентифицират чрез оцветяване с брометан. Ивиците се елуират от гела (Qiaex набор, Qiagen), субклонират се до ТА вектор (Invitrogen) и се секвенират както по-горе за недвусмислено идентифициране.

Изолиране на РНК и конструиране на сДНК банка

Пресни субмандибуларни слюнчени жлези от свиня (<30 min след смъртта) се замразяват и транспортират в сух лед - EtOH. Общото количество РНК се изолира, като се следва процедурата на Chomczynski и Sacchi (Ansi. Bichem. 162, 156 - 159 /1987/). Poly A⁺ РНК се пречиства посредством oligo dT-целулозна хроматография (Pharmacia). Двойноверижна сДНК се синтезира посредством обратна транскрипция на poly А⁺ РНК, като се използват произволни хексамери като праймери с набор Pharmacia за синтез на сДНК и методиката, препоръчана от доставчика. EcoRI адаптери се лигират с EcoRI смлени IgtlO и се опаковат in vitro (ProMega). сДНК банката се нанася на плака за отсяване чрез инфектиране с E.coli С600 с опакованата смес.

Изолиране и секвениране на сДНК клоновете

Всички процедури се извършват съгласно Maniatis и сътр. (в Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Ν, Y. /1982/) освен ако не е посочено друго. 53 Ьр олигонуклеотидна проба (5’ACCCTGAAGCTGCG CACCCTGCTGGTGCTGTTCATCTTCCTG АС СТССТТСТТЗ'), отговаряща на 18 аминокиселини близо до NHj-крайната последователност на пречистения 48 kDa сиалилтрансферазен пептид (виж фиг. 5), се бележи в края с ³²р до специфична активност 10⁷ cpm/pmol. 500,00 плаки се отсяват чрез нуклеотидна хибридизация в следния предхибридизационен/ хибридизационен разтвор: 5xSSC, 50 mM NaH₂PO₄ pH 6,7, 20 % формамид, 5х разтвор на Denhardtq 0,1 % mg/ml ДНК от сперма на сьомга при 37°С (Wood, W., Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, p. 443). Нитроцелулозните филтри (Schleicher и Schuel 0,45 m пори) се промиват в 0,2 х SSC,

0,1 % SDS при 420 за 40 min. Получава се един силно хибридизиран клон AST 1, който съдържа отворена рамка на разчитане, която кодира аминокиселинна последователност, съответстваща на 48 kDa и 45 kDa пречистени сиалилтрансферазни пептиди. Втори клон AST2 се изолира чрез нуклеотидна хибридизация, като се използва проба от 3' края на AST1 като рестрикционен фрагмент. Тази проба 0,5 kb Pvu II-EcoRI рестрикционен фрагмент се маркира, като се използва набор за произволно инициране и [a-³²p]dCTP (Amersham).

EcoRI рестрикционните фрагменти, съответстващи на сДНК включвания на фагови ДНК-и се субклонират в pUC вектори (Pharmacia). Субклоновете се секвенират, като се използва Т7 набор от Pharmacia. Данните за последователността се анализират на компютър, като се използва DNASTAR, (DNASTAR Inc., WI, USA).

Изпробвани са няколко стратегии на клониране с оглед да се клонира сДНК за а.2,3 сиалилтрансфераза на база информацията за аминокиселинна последователност, представена на фиг. 5. При първия подход се приготвят праймери за полимеразна верижна реакция, за да се извърши изследване, обхващащо NH₂ крайните последователности на видовете 48 и 45 kDa протеин, приемайки, че те са съседни в интактния ензим. В ретроспекция този подход е неуспешен поради неточност в аминокиселинната последователност, получена за 45 kDa видовете (виж фиг. 5 и 6). Други неуспешни опити да се получи положителен клон са свързани с използване на къси (16-20 Ьр) изродени олигозахаридни като проби за отсяване на сДНК от свинска подчелюстна слюнчена жлеза. Успешен е подходът при използване на неизроден 53 Ьр олигонуклеотид, конструиран от 17 аминокиселини участък на NH₂ - края на форма А. 53 Ьр пробата се използва за отсяване на 500,000 плаки на IgtlO от свинска субмандибуларна слюнчена жлеза сДНК банка. Получава се единичен 1,6 kb клон, IST1, който има консенсус ATG стартов кодон (Kozak, М., Cell 49, 283 - 292 /1986/ и Kozak, М., Nuc. Acids Res. 12, 857 - 872 /1984/), отворена рамка на разчитане, кодираща NH₂ - крайните аминокиселинни последователности на двете форми А и В на а2,3 сиалилтрансфераза и без стоп кодон в рамката. Фактът, че NH₂ крайните аминокиселинни последователности от двете форми на сс2,3 сиалилтрансфераза се намират в транслираната отворена рамка на разчитане на AST1 означава, че ASTI клонът кодира част от а2,3 сиалилтрансферазата.

3’ рестрикционният фрагмент на AST1 се използва като проба за получаване на втори препокриващ клон AST2 от същата банка (фиг. 6). AST2 допълва отворената рамка на разчитане, произлизаща от AST1. Заедно тези две сДНК-и кодират проста отворена рамка на разчитане (909 - 1029, виж по-долу), 600 Ьр 5' нетранслиран участък и 1000 Ьр 3’ нетранслиран участък. Нуклеотидната последователност, както и транслираната аминокиселинна последователност за 1029 Ьр отворената рамка на разчитане, е показана на фиг. 7. Има добро съгласуване между очакваната аминокиселинна последователност в транслираната отворена рамка на разчитане на AST1 и аминокиселинната последователност, получена чрез директен анализ на пречистените протеини.

Последователностите на препокриващите се участъци на ASTI и AST2 са идентични по целите им дължини с изключение на 120 Ьр празнина в ASTI. Уникалната отворена рамка на разчитане продължава от двете страни на това прекъсване в AST1 (фиг. 6). За да се определи дали едната или и двете от двете сДНК форми представляват истинската тРНК, се извършва PCR анализ, като се използват праймери, граничещи с тази празнина върху сДНК матрица, получена чрез обратна транскрипция на poly А⁺ РНК от свински слюнчени жлези. Разширените PCR фрагменти, съответстващи на AST1 и AST2, се откриват при този подход (данните не са показани). PCR продуктите се субклонират и секвенират, за да се потвърди тяхната идентичност, като е намерено, че и двата са идентични на съответните участъци в AST1 и AST2. По такъв начин резултатите и от директното сДНК клониране и PCR амплификацията навеждат на мисълта, че има две тРНК спецификации за а2,3 сиалилтрансфераза в свинска субмандибуларна слюнчена жлеза, които се различават по присъствието или отсъствието на 120 Ьр включване в отворената рамка на разчитане.

Очакваната големина на сиалилтрансферазния (1029 Ьр отворена рамка на разчитане) протеин е 39 kDa, с 4 възможни N-свързани гликозилирани места (виж фиг. 7) (Bouse, Е., Biochem. J. 209, 331 - 336 /1983/). Използ ването на 3 от тези места води до получаване на протеин с очакван размер от приблизително 48 kDa, наблюдаван за форма А на пречистена сиалилтрансфераза. Макар че крайната аминопоследователност съдържа два ATG кодона в непосредствена близост, само първият е в строг консенсус с мястото на започване на транслацията (Uozak, М. Cell 49, 283 - 292 /1986/ и Koozak, М., Nuc. Acids Res. 12, 857 - 872 /1984/). Kyte-Doolittle хидропатичен анализ (J. Mol. Biol. 157, 105 - 132 /1982/) показва един потенциално мембранно свързан участък, който се състои от 16 хидрофобни остатъка, разположени на 11 остатъка от амино-края (фиг. 7). Тази структурна характеристика подсказва, че а2,3 сиалилтрансфераза като други гликозилтрансферази, които са изследвани, има тип II мембранна ориентация и че този единичен хидрофобен участък може да служи като неразцепващ се амино-краен сигнално контактен домен (Paulsoon, J. С. and Colley, К. J., J. Biol. Chem. 264, 17615 - 17618 /1989/).

Отворената рамка на разчитане, кодирана чрез λΞΤΙ и XST2 съдържа цялостната ΝΗ₂ крайна аминокиселинна последователност, получена и от форма А и от форма В на сс2,3-О сиалилтрансфераза. Както е показано на фиг. 6, в ΝΗ₂ крайната секвенция на форма А са намерени 8 аминокиселини от предполагаемото стартово място на транслацията на отворената рамка на разчитане, а съответната ΝΗ₂ - крайна последователност на форма В е намерена 27 аминокиселинни остатъка по-нататък към СООН края на протеина. Тъй като форма В на а2,3сиалилтрансферазата е изцяло каталитично активна (Rearick, J. I. и сътр., J. Bil. Chem. 254, 4444 - 4451 /1979/), протеиновата последователност между предполагаемия инициатор метионин на ензима с пълна дължина и аминокрая на форма В, вероятно не се изисква за ензимна активност. Така участъкът на протеолитична чувствителност на «2,3-0 сиалилтрансфераза, който е между сигнално контактния домен и каталитичния домен изглежда, че е базален участък, както е дефиниран за по-рано изследваните гликозилтрансферази (Weinstein, J. и сътр., J. Biol. Chem. 262, 17735 - 17743 /1987/ и Paulson, J. С. и Coolley, К. J., J. Biol. Chem.264, 17615 - 17618 /1989/).

Двадесет mg от общата РНК от тъкан на свиня или плъх се подлага на електрофореза на 1,0 % агарозен гел, съдържащ 2,2 М фор малдехид (26) и се прехвърля на нитроцелулозни филтри (Schleicher и Schuell), както е описано. Нитроцелулозните филтри се хибридизират с ³²р-маркирани сДНК проби и се промиват, както е описано по-рано.

Пример 3

Експресия на разтворима сиалилтрансфераза от свиня

Секретеруем химерен протеин се приготвя между предполагаемия каталитичен домен на а2.3-О сиалилтрансфераза и инсулинова сигнална последователност чрез сливане на С-крайния 890 Ьр на клон AST2 с N-крайната част на вектора pGIR-199 (Hsueh и сътр., J. Biol. Chem. 261, 4940 - 4947 /1986/) при Sac I място, съдържащ в рамката на разчитане и двата вектора. Химерната sp-ST се смила с рестрикционните ензими Nhe I и Sma I, изолира се фрагментът 1,0 kb и се субклонира в pSVL (Pharmacia) и смила с Nba I и Sma I, като слепва местата, съдържащи се в полилинкера. Получената конструкция се нарича pSVLspST и се използва като вектор за преходна експресия на разтворима форма на а2,3-О сиалилтрансфераза в COS-1 клетки. Суперспиралната ДНК, pSVL sp-ST, се трансфектира в C0S-1 клетки, като се използва липофектин съгласно процедурата, препоръчана от доставчика. (60 mm културални блюда, съдържащи 50 % слети клетки, се трансфектират с 5 pg ДНК, 20 ml липофектин). След 48 h трансфекция COS-1 клетъчната среда се събира и концентрира 15 кратно на Centricn 30 филтри (Amicon) и се анализира за а2,3-О сиалилтрансферазна активност. а2,3-О сиалилтрансферазната активност се определя, като се използва антифризен гликопротеинов акцептор, както е описано по-рано (Sadler и сътр., J.Biol. Chem 254, 4434 - 4443 /1979/).

След 48 h трансфекция с pSVL-spST COS-1 клетките (60 mm културални блюда) се промиват с met, несъдържаща среда (DMEM, 5 % серум от телешки зародиш) (Gibco), и се култивира в същата среда в продължение на 1 h. Клетките се маркират пулсационно с 150 mCi/150 pmol 35 S-met Express маркер, (NEN) в 1,5 ml met, несъдържаща среда, в продължение на 2 h. Тези клетки след това се промиват с PBS и престояват в продължение на 5 h в среда без ’-’S-met белег. Средата, съдържаща секретираните протеини, след това се събира, концентрира се 15 кратно и се подла га на SDS-PAGE и анализира посредством флуорография.

Както е посочено по-горе, форма В на а2,3-О сиалилтрансфераза е ензимноактивен протеолитично отцепен продукт от цялата дължина, мембранно-свързан ензим. Поради това може да се очаква, че разтворим химерен протеин трябва да съдържа а2,3-О сиалилтрансферазна активност, ако той включва цялата последователност на В формата. За да се създаде такъв разтворим протеин рестрикционната част, обратна на NH₂ - края на пептидната последователност, се избира като място за сливане на λΞΤ2 сДНК с вектора, кодиращ сигналната инсулинова последователност pGIR199.

Както е илюстрирано на фиг. 9а, тази конструкция кодира слетия протеин, тук наречен сигнален пептид - ST (sp-ST), който се състои от инсулинова сигнална последователност, последвана от 9 аминокиселини, кодирани посредством pGIR линкер и целия предполагаем каталитичен домен на сс2,3-О сиалилтрансфераза. Очаква се sp-ST конструкцията да насочи синтезата към 38 kDa, секретируем протеин, когато се трансфектира в бозайникови клетки-гостоприемник. Подобна стратегия за продукция на разтворими форми на гликозилтрансферази е успешно използвана (Paulson, J. С. и Colley, К. J., J. Biol. Chem. 264, 17615 17618 /1989/, Larsen, R. D. и сътр., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6674 - 6678 /1990/).

sp-ST конструкцията се премества в pSVL експресионен вектор и се трансфектира преходно в COS-1 клетки. След 48 h трансфектираните клетки се инкубират в продължение на 2 h в среда, съдържаща Trans³⁵S-Mapkep, и след това престояват 5 h в среда без маркер. Тази среда се събира, концентрира се 15 кратно и се анализира посредством SDS-PAGE/флуорография. Фиг. 9Ь показва, че средата, съдържа видове с 38 kDa, което е очакваният размер на sp-ST протеина. При паралелни трансфектирани култури средата се събира след 48 h трансфекция, концентрира се и се изследва за а2,3-О сиалилтрансферазна активност. Както е илюстрирано на фиг. 9с, средата от клетки, трансфектирани с sp-ST, съдържа милиединици/ml сиалилтрансфераза, докато средата от контролните трансфектирани клетки няма никаква съществена активност.

Пример 4

Пречистване и секвениране на сиалилтрансфераза от черен дроб на плъх

Подобно на други гликозилтрансферази, които са налични в мембранни протеини на ендоплазмения ретикулум и на Golgi апарата, сиалилтрансферазите са слабо разпространени протеини и трудни за пречистване, което обяснява защо само два члена на тази фамилия са клонирани. Gaipi,3(4)GlcNAc α2,3 сиалилтрансфераза (“α2,3Ν”) е първата пречистена 800,000 кратно от черен дроб на плъх в 1982 от Weinstein и сътр., получена от около 10 pg/ng тъкан, Weinstein и сътр., J. Biol. Chem. 257, 13835 -

13844 /1982/ и Weinstein и сътр., J. Biol. Chem.

13845 - 13853 /1982/). Макар, че са направени няколко опита за получаване на аминокиселинна последователност, информационна или произвеждаща антитяло срещу ензима, като се използват общоприети методи, те пропадат, поради малките количества разреден протеин, който би могъл да се получи. Като алтернатива масспектрометрията има засилена роля за структурното изясняване на биологично важни макромолекули. Развитието на нови йонизационни методи и инструменти разширяват достъпната граница на масата и чувствителността на откриване. Високо разрешителна тандемна масспектрометрия сега е установена като мощна техника за секвениране на протеини (Methews, W. R. и сътр., J. Biol. Chem. 262, 7537 - 7545 /1987/), както и за определяне на пост-транслационни и химически модификации (Dever, Т. Е. и сътр., J. Biol. Chem. 264, 20518 - 20525 /1989/, Settineri, С. А. и сътр., Biomed. Environ. Mass Spectrom. 19, 665 - 676 /1990/ и DeWolf Jr., W. Е. и сътр., Biochem. 27, 90993 9101 /1988/). Поради това масспектрометрията се използва за установяване на аминокиселинната последователност на сиалилтрансфераза.

Редукция и карбоксиметилиране

Приблизително 13 pg Gaipi,3(4)GlcNAc а2,3-сиалил-трансфераза (α2,3-Ν) се съхранява в 350 ml 30 mM натриев какодилат (pH = 6,5), 100 гиМ натриев хлорид, 0,1% Triton CF-54 и 50% глицерол. ТрисНС1 (pH = 8,0), гуанидинНС! и дитиотреитол се прибавят към крайни концентрации 0,2 М и 7 mM, съответно. Редукцията се провежда при 60°С под аргон в продължение на 1,5 h. Към сместа се прибавя натриев йодоацетат (1,32 mg) в 2,5 ml 0,2 М ТрисНС! буфер. Алкилирането се провежда при стайна температура под аргон на тъмно, в продължение на 1,5 h.

Диализа. Редуцираната и карбоксиметилирана α2,3Ν се диабизира срещу 4 1 50 mM буфер N-етилморфолинацетат (рН = 8,1), като се използва Bathesda Research Labs (“BRL”) микродиализна система с BRL диализна мембрана с молекулно тегло до 12-14 kDa. Когато завърши диализата, се прибавя 10% SDS към диализирания продукт, получен с крайна SDS концентрация приблизително 0,1%. Съдържанието на диализирания продукт се събира и суши, като се използва Speed Vac Concentrator (Savant). За да се отстрани SDS, се провежда утаяване по Konigsberg (Konigsberg, W.H., Henderson, L., Methods in Enzymology 91, 254259 [1993]).

Смилане c трипсин. Утаената α2,3Ν се разтваря в буфер за смилане (100 mM Трие НС12М карбамид, 1 mM СаС12, pH = 8,0), като се получава протеин с концентрация приблизително 2 mg/ml. 2,3N се смила с 10% трипсин (т/т) (Boehringer-Mannheim, степен на секвенция, разтворен в 1 mM НС1) при 37°С. След 7 h смилане към сместа се прибавя друга аликвотна част трипсин до получаване на крайна трипсинова концентрация приблизително 13%. Смилането завършва след 18 h. Полученият смлян с трипсин продукт се отделя посредством HPLC с обърната фаза (АВ1 С18 колона, 1,0 х 100 mm), като се използва ABI 140А подаваща разтворител система. Разтворител А е 0,1% TFA във вода. Разтворител В е 0,08% TFA в 70% ацетонитрил/30% вода. Системата работи при скорост на изтичане 50 ml/min. Десет минути след инжектирането процентното съдържание на разтворител В се увеличава от 0 до 50% за 90 min, след това до 100% за 30 min. Пептидите се откриват, като се използва АВ1 783А абсорбционен детектор, работещ при 215 nm. Някои от фракциите се естерифицират, като се използва смес от НС1/н-хексанол.

Масспектрометрия. Експерименти с течна вторична йонна масспектрометрия (LSIMS) се провеждат, като се използва Kratos MS50S двойно фокусиран масспектрометър, снабден с LSIMS източник и високо магнитно поле. Приблизително една пета от всяка събрана фракция се зарежда за LSIMS анализи. Като течна матрица се използва 1 μΐ смес от глицерол-тиоглицерол 1:1, подкислен с 1% TFA. Образците се събират повторно от крайната проба. Най-разпространените молекулни йони се избират за анализ посредством колизионна индуцирана дисоциация (CID). Тези експерименти се осъществяват на Kratos Concept IIHH четирисекторен масспектрометър, снабден с електрооптична многоканална система-детектор, която може да запише едновременно 4% секвентни сегмента в масовата област. Колизионната енергия започва при 4 keV, колизионният газ е хелий и неговото налягане се нагласява за намаляване изобилието на избрания йон-предшественик до 30% от неговата начална стойност. Остатъците от всички проби се събират и се прибавя 1 ml от гореспоменатата матрица. Данните от високоенергетичната CID се интерпретират без помощта на компютърен анализ.

Тандемната масспектрометрия е мощен метод за протеиново секвениране, с предимства пред общоприетата техника на Edman. По този метод е възможно секвениране дори на еквимоларни смеси. За масспектрометричен анализ първите няколко пептидни фракции от HPLC се естерифицират, за да се увеличи тяхната хидрофобност, като по този начин се подобрява тяхното резултатно разпръскване (Falick, А.М. и Maltby, D.A., Anal. Biochem. 182, 165-69 [1989]). LSIMS анализът на всяка фракция, показваща многобройни молекулни йони, посочва присъствието на повече от един пептид във всяка. Най-разпространените 30 молекулни йони се избират за CID анализ. В тези експерименти 12С изотопният пик на интересуващия ни йон се избира в първия масспектрометър. Само фрагментите от тези видове, получени от дисоциацията, причинена от колизията с хелия в колизионната клетка, разположена между двата масспектрометъра, се регистрират в края на втория масспектрометър. Фрагментирането чрез анализ посредством високо енергетична колизионно индуцирана дисоциация (CID) се случва главно по продължението на пептидния скелет. Наблюдават се също многобройни скъсвания, т.е. фрагментиране на аминокиселинните вериги. Фрагментирането по продължение на пептидната верига води до получаване на йонна серия, която се различава по теглото на аминокиселинните остатъци, така че може да се очаква съответната аминокиселинна последователност. Високоенергетичният начин на фрагментиране осигурява допълнителна информация за аминокиселинната идентичност, потвърждавайки по този начин получените последователности и позволявайки диференциацията между изобарната Leu/Пе аминокиселинна двойка (Johnson, R.S. и сътр., Annal. Chem. 59, 2621 2625 [1987]). Фрагментирането на странична верига може да се наблюдава главно където има базична аминокиселина, т.е. Arg, Lys или His в последователността (Johnson, R.S. и сътр., Int. J. Mass Spectrom. Ion Proc. 86, 137-154 [1988]). Изгодно протониране на базични аминокиселинни остатъци при или близо до N-края води до получаване на предпочитано задържане на товар в този край на молекулата. Пептиди, съдържащи базични аминокиселини при или близо до С-края, ще показват главно С-крайни фрагменти. Така трипсинът има предимство за начално смилане. Интерпретиране на данните от високоенергетичната CID накрая дават 14 последователности (виж таблица 2 и фиг. 9).

Анализът на CID спектъра показва, че по време на смилането с трипсин настъпват някои странични реакции. Два трипсинови автолизни продукта са идентифицирани при m/z

659,3 и 1153,6 (фиг. 9). Поради дългото време на инкубация и липсата на собствен акцептор, някои трипсинови пептиди се карбамилират при техните N-краища. Тъй като такива странични реакции биха направили невъзможно разграждането по Edman, N-крайните модификации могат дори да бъдат полезни при секвениране с помощта на масспектрометрия. Фактически CID анализът на тези модифицирани пептиди е полезен за потвърждаване на някои от посочените последователности, наведнъж осигуряващ начини за диференцииране между N-крайния левцин или изолевцин (фиг. 10).

Пример 5.

Сиалилтрансфераза от черен дроб на плъх PCR развиване на специфична сДНК проба.

Като се имат предвид аминокиселинните последователности на единадесет от четиринадесетте пептида, получени от α2,3Ν, са синтезирани двадесет и два олигонуклеотидни изродени сбора от смислени и безсмислени вериги (Genosys). Първоначалните PCR експерименти се основават на наблюдението, че пептид 11 и пептид 1 са хомоложни на участъка, разположен близо до центъра на по-рано клонираната сиалилтрансфераза, Galpl, 4GlcNAc а2,6-си алилтрансфераза (Weinstein, J. и сътр., J. Biol. Chem. 257, 13835-13844 [1982]) и α2,3-0, описана по-горе (фиг. 11). Осъществяват се две групи PCR експерименти, като се използва или смислен праймер за пептид 11 или безсмислен праймер за пептид 1, сдвоени с олигонуклеотидни праймери с другите пептиди и първата верига сДНК, синтезирана от черен дроб на плъх цялостна РНК като матрица.

Започвайки с етапа на стапяне на матрицата (5 min при 94°С), развиването се провежда, като се използва GeneAmpTM ДНК набор реагинт за развиване с AmpliTagTM ДНК полимераза (Perkin Elmer Cetus), посредством 35 пъти повтаряне на цикъла, 1 min при 94°С, 1 min при 37°С и 2 min при 72°С и завършва с етап на крайно продължаване (15 min при 72°С). Различни сДНК фрагменти се пораждат от тези PCR реакции. Допускайки, че пептид 11 и 1 представлява непрекъснат интервал от аминокиселини, допълнителна серия PCR експерименти се провеждат, като се използва стратегията на гнездов праймер (Mullis, К.В. и Faloona, F., Methods Enzymool. 155, 335-350 [1987]), за да се идентифицират специфични сДНК фрагменти. Като се използва този подход, се идентифицира специфичен сДНК фрагмент, 11 смислен-14безсмислен (11s14as). 1 ls-14as сДНК фрагментът се субклонира в Bluescript плазмид (Stratagene) и се секвенира, като се използват универсални праймери (Stratagene) и 2,0 набор Sequenase Version (USB).

Клониране на сиалилтрансфераза сДНК банка се конструира от poly (А)⁺ РНК от черен дроб на плъх, като се използва сДНК синтезен набор от Parmacia (Gubler, U. и Hoffman, В. J. Gene 25, 263-269 [1983]). Олиго (dT) иницираната сДНК се синтезира и лигира към EcoRI-Notl линкери. След това сДНК-ите се лигира в EcoRI слепена IgtlO ДНК (Promega). След опаковане in vitro с ДНК пакетиращ екстракт (Stratagene), с фагите се покрива в блюда гостоприемника Е. coli С600 hfl(Promega). Отсяват се приблизително един милион плаки с lls-14as сДНК проба (Gubler, U. и Hoffman, B.J. Gene 25, 263-269 [1983]). Два положителни фага (18-1 и 9-1) се пречистват и субклонират в Bluescript плазмиден вектор (Stratagene) за секвениране.

Изолиране на сДНК клонове

За скриниране на пептидните секвенции за хомоложност с известни протеини се използва база данни Dayhoff Protein. Това търсене осигурява първото доказателство за хомоложност между α2,3-Ν и други клонирани сиалилтрансферази. От този анализ е намерено, че 5 пептидът 11 (таблица 2) е хомоложен на наличната последователност на β-галактозид а2,6сиалилтрансферази както от плъх, така и от човек (тези два ензима са 88% консервативни, Gu, T.J. и сътр., FEBS 275, 83-86 [1990] и Lance, 10 Р. и сътр., Biochem. Biophis. Res. Commun. 164,

225-232 [1989]). Когато в този анализ се включи и последователността 2,3-0 от свиня, друг пептид, пептид 1 (таблица 2) е хомоложен на последователността в двете клонирани сиалилтрансферази. Сравняването на тези пептиди с наличните секвенции в по-рано клониранитесиалилтрансферази показва, че тези два пептида притежават непрекъсната верига аминокиселини, които се късат при аргининовия остатък по време на трипсиновото смилане (фиг.11).

Таблица 2

Аминокиселинна последователност на пептиди, получени от Ga^l ,3(4)GlcNAc а2,3-сиалилтрансфераза

Пептид 1	Аминокиселинна Място на остатъка
последователност в Gal Leu As n Ser Ala Pro Vai Lys	a2,3-ST (Фиг.4 180-1.92
2	MetAlaAlafleLys	340-344
3	GluProProGluIleArg	264-269
4	G1 vLvsAsd Asn Leu lie Lys	130-136
5	LeuProAlaGluLeu AlaThrLys	69-76
6	AlalleLeuSerValThrLys	137-143
7	HeLeuAsnProTyr	270-274
8	LeuThrProAlaLeuAspSerLeuHisCysArg	147-157
9	ValSerAlaSerAspGlyPheTrpLys	247-255
10	VallleThrAspLeuSerSerGIylle	366-374
1 1	lie Asp Asp Tyr Asp UeVal lie Arg	17 7δ16£
12	GluPheValProProPheGlylleLys	121-129
13	LeuGlyPheLeuLeuLys	59-64
14	Asp Ser LeuPheValLeuAlaGlyPh,eLys	222-231

Подчертаните последователности показват хомоложност с други известни сиалилтрансферазни ензими (25,26) 45

Аминокиселината в курсив е единствената разлика от аминокиселинната последователност, очаквана от нуклеотидната последователност на Gal ct2,3-ST сДНК.

Знанието, че пептид 11 и пептид 1 по- 50 казват хомология спрямо последователността, по-рано идентифицирана като консервативен участък на хомоложност в центъра на две други клонирани сиалилтрансферази, е основата на стратегията за клониране съгласно изобретението (фиг.11). Допуска се, че пептид 11 и пептид 1 трябва да бъдат близо до центъра на протеина, по такъв начин PCR експериментите са предназначени да произвеждат дълга сДНК проба. На база аминокиселинните последователности на 14 сиалилтрансферазни пептида, изродените олигонуклеотидни прайме ри както смислени, така и безсмислени, се синтезират за употреба в PCR експериментите. В тези експерименти смисленият праймер 11 и безсмисленият 1 се сдвояват с други праймери в опит да се развият дълги сДНК фрагменти на α2,3-Ν. Някои сДНК фрагменти се амплифицират при тези експерименти. Допускайки, че пептид 11 и пептид 1 представляват непрекъсната верига аминокиселини, праймер 11 и праймер 1 след това се използват в стратегията на гнездовия праймер (Millis, К.В. и Faloona, F., Methoods Enzymool. 155, 335-350 [1987]), за да се идентифицират специфични сДНК фрагменти. Фрагментът се амплифицира, като се използват смислен праймер 11 и безсмислен 14 са близо до същото място, както амплифицираният фрагмент, като се използва смислен праймер 1 и безсмислен праймер 14, което показва, че полученият фрагмент е в резултат на специфично осъществена хибридизация посредством праймери и не е артефакт.

Клонирането и характеризирането на 11 смислен-14безсмислен фрагмент показва, че пептид 11 и 1 наистина са непрекъснати. Сравнението на последователността на сДНК фрагмента с двете клонирани сиалилтрансферази (Weinstein, J. и сътр., J. Biol. Chem. 262, 1773517743 [1987]) показва, че хомоложността произтича от пептид 1 и продължава с осемнадесет аминокиселини. Поради хомоложността вероятно 11 смислен-14безсмислен фрагмент се амплифицира от сиалилтрансферазна шРНК. Последователността също показва, че сДНК фрагментът не е фрагмент на Gaipi, 4GlcNAc ос2,6-сиалилтрансфераза, която е изобилна в черен дроб от плъх (Weinstein, J. и сътр., J. Biol. Chem. 257, 13835-13844 [1982]).

Фрагментът 11 смислен-14безсмислен се използва за отсяване на oligo dT инициираната сДНК банка от черен дроб на плъх, чиито два положителни клона са получени от 1 милион отсети плаки. Охарактеризирането на положителните клонове показва, че клон ST3N-1 съдържа 2,1 КЬ включване, докато клон ST3N2 е значително по-къс, само 1,5 КЬ на дължина. Northern анализът показва, че Gala2,3-ST mРНК е 2,5 Kb (виж по-долу), като се предполага, че клон ST3N-1 може да съдържа цялата кодираща последователност на Gal a2,3-ST.

Първична структура на a2,3N сиалилтрансфераза

Анализът на секвенциите показва, че клон ST3N-1 съдържа пълната отворена рамка на разчитане на сиалилтрансферазата (фиг.2). Тя се състои от 82 Ьр 5'-нетранслиран участък, отворена четяща рамка 1122 Ьр по дължина, 3'-нетранслиран участък от приблизително 1 КЬ и poly (А) опашка. Отворената четяща рамка на клон ST3N-1 кодира протеин с 374 аминокиселини с очаквано молекулно тегло от 42,033. С изключение на разлика от една аминокиселина отворената четяща рамка кодира всички 14 пептидни последователности, получени от масспектрометричния анализ на пречистената сиалилтрансфераза. Това потвърждава, че сДНК на клона ST3N-1 е действително е тази на сиалилтрансферазата. Както се наблюдава за други клонирани сиалилтрансферази (Paulson, J.C. и Colley, K.J., J. Biol. Chem. 264, 17615-17618 [1989]), очаквано е a2,3-N да има къса N-крайна цитоплазмена опашка, единствена сигнална контактна последователност приблизително от 20 остатъка и дълъг С-краен участък, който съдържа каталитичния домен на ензима.

Пример 6.

Експресия на разтворима сиалилтрансфераза от плъх

За да се произведе разтворима форма на сиалилтрансфераза за ензимно охарактеризиране слят протеин, съдържащ каталитичния домен на ензима и способна да се отцепи инсулинова сигнална последователност, се конструират в бозайников експресионен вектор pSVL (Pharmacia). По-специално каталитичният домен на сиалилтрансферазата се амплифицира чрез PCR, като се използва 5' праймер при позиция + 182 (фиг. 11) в посока на трансмембранния домен и 3' праймер, разположен в 3' UTR в обратна посока на мястото за полиаденилиране. PCR реакциите се провеждат, както е описано по-горе, при температура на осъществяване на хибридизация при 55°С. PCR продуктът се субклонира в BamHI-EcoRI сайтовете на pGIR-199 (подарък на К. Drickamer), като се получава сливане на сиалилтрансферазата в рамка с наличната инсулинова сигнална последователност в pGIR вектора (Huseh,

Е.С. и сътр., J. Biool. Chem. 261, 4940-4947 [1986]). Полученият слят протеин се включва в Xba I-Sma I сайтовете на експресионния вектор pSVL, като се получава експресионен плазмид pBD122.

За преходна експресия в COS-1 клетки експресионният плазмид pBD122 (20 mg) се трансфектира в COS-1 клетки върху 100 mm блюда, като се използва липофектин, както се препоръчва от производителя (BRL). След 48 h клетъчната културална среда се събира и концентрира, като се използва Centricon 10 микроконцентратор. Концентрираната среда се анализира за сиалилтрансферазна активност, като се използват олигозахариди като акцепторни субстрати. Преминаването на сиаловата киселина към олигозахарида се регистрира, като се използва йонообменна хроматография (Sadler, J.E. и сътр., J. Biol. Chem. 254, 59345941 [1979] и Paulson J.С. и сътр., J. Biol. Chem. 264, 10931-10934 [1989]).

За демонстрация на това, че клонът ST3N-1 трябва да кодира α2,3-Ν сиалилтрансфераза, той се експресира в COS-1 клетки. Аминокиселинната последователност на клона ST3N-1 показва, че протеинът съдържа ΝΗ₂крайна сигнално контактна последователност, която се очаква да закрепи ензима за апарата на Golgi в клетката (Paulson, J.C. и Colley, KJ., J. Biol. Chem. 264, 17615-17618 [1989]). За улесняване на функционалния анализ на ензима се произвежда разтворимата форма на ензима, която, когато се експресира, би била секретирана от клетката. Слят протеин се конструира като се използва способна да се отцепи инсулинова сигнална последователност, която да смени сигнално-контактната последователност при NHj-края на сиалилтрансферазата. Когато експресионният плазмид pBD122 се експресира в COS-1 клетките, ензимът се секретира от клетките и показва сиалилтрансферазна активност.

Ензимните свойства на α2,3-Ν сиалилтрансфераза първо се характеризират с пречистен протеин (Weinstein, J. и сътр., J. Biol. Chem. 257, 13845-13853 [1982]). Намерено е, че сиалилтрансферазата използва β-галактозидни акцептори, съдържащи или Ga^l, 3GlcNAc или Ga^l, 4GlcNAc последователности, формиращи NeuAca2,3Gaipi,3GlcNAc и NeuAca2,3 Ga^l,4GlcNAc последователности, често срещани да завършват комплекса от типа N-свързани олигозахариди. Ензимът, секретиран от клетките, които са трансфектирани с експресионния плазмид pBD122, е способен да използва β-галактозидни акцептори, съдържащи или Gal31,3GlcNAc или Ga^l,4GlcNAc последователности (таблица 2). Клетки, трансфектирани с родителския вектор, не секретират такава сиалилтрансферазна активност. Секретираният ензим е способен също така да сиалилира asialo-al кисел гликопротеин. Тези данни са в съгласие с ензимните свойства на пречистения a2,3-N.

Пример 7.

Експресия на 2,3-N сиалилтрансфераза в Baculoovirus

Крайният тетразахарид сиалил Люис* (SLe*: SAa2,3Ga^l,4GlcNAc[al,3Fuc]) се идентифицира като лиганда на Р-селектин и Еселектин и синтетичен олигозахарид, съдържащ SLe* структурата, е кандидат за блокиране взаимодействията на селектиновия лиганд. Пълната химическа синтеза на SLe* е технически и икономически трудна, но използването на специфични гликозилтрансферази за прикрепване на крайна сиалова киселина и фукозни остатъци към химически синтезирано ядро на захарида ще направи синтезата на свободна SLe* осъществима. Генът, кодиращ a2,3N сиалилтрансфераза, се клонира от сДНК банка от черен дроб на плъх и показва специфична сс2,3 (Ga$l,3/4GlcNAc) сиалилтрансферазна активност, когато се експресира в трансфектирани COS-1 клетки (Wen и сътр., ръкопис в подготовка). Част от сДНК клона, кодиращ ензимната част на полипептида, но с липсващ хидрофобен сигнал/мембранно контактен домен, се слива с пре-инсулинова сигнална последователност, за да се формира сДНК, кодираща разтворим, секретиран а2,3 NST протеин. Тази сДНК се клонира в Baculovirus пренасящ вектор и се използва за трансфекция на Sf-9 клетки от инсекти в присъствие на див тип Baculovirus ДНК.

Рекомбинантен вирус, съдържащ α2,3-Ν сиалилтрансферазна сДНК, се изолира и пречиства и се използва за инфектиране на Sf-9 клетки. Инфектираните клетки секретират а2,3 NST в големи количества в средата и този протеин се пречиства чрез йонообменна хроматография.

Sf-9 клетките са закупени от АТСС. ДНК векторите pGIR199 и pBlueBac са получени от J.C. Paulson and Invitrogeen (San Diego, СА), съответно. Sf-9 клетките се отглеждат на клетъчна култура при клетъчна плътност между 0,3 и 1,5 милиона клетки на милилитър в среда за инсекти на Graces (допълнена с 0,33% лакталбуминов хидролизат и 0,33% дрожден екстракт), получен от Gibco (Grand Island, NY), плюс 10% топлинно инактивиран серум от телешки зародиши (JRH Biosciences, Lenexa, KS). Тази среда е означена като GCMS + 10% FCS.

Разтворима форма на α2,3-Ν сиалилтрансфераза се приготвя по следния начин. сДНК, представляваща цяла α2,3-Ν сиалилтрансферазна шРНК се използва като матрица за PCR при използване на два олигонуклеотида като усилватели, които хибридизират (5') точно при С-крайната позиция на комбинацията сигнал/ контакт участък на ензима и (3') в посока, обратна на poly (А) допълнителна част в 3' нетранслирания участък. Двата олигонуклеотида кодират BamHI местата при техните 5' краища, давайки възможност на PCR продуктите да бъдат клонирани при BamHI сайта на pGIR199, слети в рамка с преинсулинова сигнална последователност. Граничещите с Nhel места се използват да се освободи генното сливане и този сДНК фрагмент се клонира в Baculovirus пренасящ вектор pBluebac, под контрола на Baculovirus полихедринов промотор. Всички рекомбинантни ДНК манипулации се осъществяват при условията, препоръчани за ензима от производителя. Векторът pBluebac съдържа Е. coli β-галактозидазен ген под контрола на различен Baculovirus промотор и вируси, които са били подложени на рекомбинация и уловеният ДНК вектор може да превърне хромофора Xgal в син продукт.

Създаването на рекомбинантен Baculovirus е осъществено, като се използва МахВас експресионна система (Invitrogen), като се следват точно протоколите, препоръчани от производителя. Плазмид и див тип вирус ДНК се смесват и се използват за трансфекция на Sf-9 клетки по калциевофосфатния метод. Вирусът се произвежда посредством трансфектирани клетки и разпръскване в културалната среда. Рекомбинантният вирус се идентифицира при изследване на плаките посредством синьооцветен продукт, получен под действието на βгалактозидаза върху X-gal, включен в плаковата среда при концентрация 150 pg/ml, и пречистен от дивия тип вирус посредством повтаряно разреждане/плакообразуване. Пречистеният вирус се амплифицира в 500 ml чрез инфектиране на пресни Sf-9 клетки. Някои клонове се анализират за способност да причиняват секреция на а2,3-И-сиалилтрансфераза в инфектираната клетъчна среда чрез тестване на аликвотна част от средата директно в радиоактивния сиалилтрансферазен анализ, описан по-долу.

За да се отгледа голямо количество вируси, 3 х 10⁶ Sf-9 клетки в 25 cm² колба за тъканна култура в 5 ml GCMS+10% FCS се инфектират с единична синя плака, свободна от див тип вирус, и оставена да расте в продължение на 5-7 дни при 27°С. Полученият 5 ml вирусен шок се избистря чрез центрофугиране и следващо амплифициране. Sf-9 клетките в логаритмичната растежна фаза (0,5-1,5 х 10⁶ клетки/ml) се инфектират при концентрация от 1 х 10⁷ клетки за ml при мултиплициране на инфекцията (moi) на 1, като се допуска, че вирусният тигър в 5 ml щок е 1 х 10⁸ плакообразуващи единици (pfu) за милилитьр. Клетките се разреждат обратно десетократно в GCMS + 10% FCS и се оставят да нараснат в продължение на 5-7 дни при 27°С. Полученият вирус се избистря и вирусният титьр се определя чрез плаков анализ и общо е по-висок от 10’ pfu/ml. За експресиране на α2,3-Ν сиалилтрансфераза 2,5 х 10’ Sf-9 клетки в логаритмична фаза на растеж се поставят в блюда върху всички пластове на Ten Try Cell Factor (Nunc, Naperville, IL), означени CF-10. Всеки CF-10 има общо растежно пространство 6000 cm² и клетките се инфектират с рекомбинантен Baculoovirus при moi = 5 в обем от 300 ml. След инкубация в продължение на 1 h се прибавя 1 1 Ехсе11-400 (JRH Biosciences), свободна от серум среда и клетките се инкубират при 27°С в продължение на 72 h. Средата се събира, избистря и филтрира през 0,2 цт филтър. Прибавя се прасна среда (Ехсе11-400 заедно с 2% серум от телешки зародиш) и клетките се инкубират при 27°С в продължение на още 48 h и тогава средата се събира, избистря и филтрира.

α2,3-Ν сиалилтрансферазната активност се анализира, като се използва модификация на публикуван анализ (Sadler и сътр., 1979). В 30 ц1 обем, 14 ц1 проби се смесват с 3,5 ц1 .iakTo-N-тетраоза (Ga$ 1,3ϋ1εΝΑεβ 1,3Gal31,4Glc) и 12,5 ц1 анализна смес, описана по-долу. Пробите се размесват за кратко, центрофугира се на дъното на реакционната епруветка и се инкубира при 37°С в продължение на 10 min. Реакционната смес след това незабавно се разрежда в 1 ml 5 mM фосфатен буфер, pH 6 и се нанася на 0,5 ml йонообменна колона. Колоната се пуска и се събира 1 ml елуат в сцинтилаци онна епруветка и се извършва преброяване. Единицата се дефинира като количество ензим, необходимо за преминаване на 1 микромол сиалова киселина към акцептора за минута.

Пробата се състои или от чиста супернатанта или от супернатанта, разредена така, че кинетиката на реакцията се запазва в линеен порядък, приблизително 10000 срт продукция от колоната. Анализната смес се получава чрез сушене на 0,65 ml (50 μθ) [¹⁴С] -СМР-сиалова киселина (NEN, Boston, МА) и ресуспендиране в 0,65 ml вода, съдържаща 2,3 mg СРМ-сиалова киселина. Към полученото се прибавя 0,96 1М разтвор на натриев какодилатен буфер, pH 6, 0,48 ml 20% Triton CF-54, 0,29 ml 50 mg за милилитър разтвор на говежди серумен албумин (всичко получено от Sigma, St. Louis, МО) и вода до общ обем 8 ml. Определя се специфичната активност на анализната смес и се разделя на аликвотни части и се съхранява при 20°С. Използваната йонообменна смола е AG1Х8, 200-400 меша фосфатна форма (Biorad, Richmond, СА).

Концентриране и пречистване на α2,3-Ν сиалилтрансфераза

Среди (1-3 1), съдържащи cc2,3-NST, се филтрират и концентрират до приблизително 250 ml в Amicon CH2PRS спирална патронна система, снабдена със S1Y10 патрони. Комплектът се подлага на диафилтрация, за да се обезсоли концентрираната супернатанта с три обема 10 тМ какодилова киселина, 25 тМ натриев хлорид, 25% глицерол, pH 5,3 (буфер А). Пробите след това се пропускат през колона (2,5 х 17 cm) S-Sepharose Fast Flow (Pharmacia), еквилибрирана c буфер А при скорост на изтичане 2 ml/min. След като всички проби се пропуснат, колоната с промива с буфер А, докато OD_2g0 изтичащия поток от колоната се върне на изходния (1,6 обема на колоната). а2,3 NST след това се елуира от колоната с 50 тМ какодилова киселина, 1 М натриев хлорид, 25% глицерол, pH 6,5. Фракциите, съдържащи cc2,3-NST, се обединяват и диализират една нощ срещу 1 L 50 тМ какодилова киселина, 0,5 М натриев хлорид, 50% глицерол, pH 6,0 и след това се съхраняват при -80°С.

Пример 8.

Тъканно разпределение на a2,3-N сиалилтрансфераза от плъх

За да се охарактеризира тъканното разпределение на клонирана a2,3-N сиалилтранс фераза от плъх, се изолира общата РНК от различни тъкани на плъх и се приготвят проби с ³²р-белязана сДНК на сиалилтрансферазата. Хибридизирането до тРНК от -2,5 КЬ се наблюдава във всички изпитвани тъкани. Както се наблюдава за двете клонирани сиалилтрансферази, a2,3-N сиалилтрансферазата показва диференцирана експресия в тъканите на плъх. Най-високото ниво на a2,3-N сиалилтрансферазна тРНК се открива в мозъка. Черният дроб, бъбреците, дебелото черво, сърцето, яйчниците и белият дроб експресират междинни нива, докато в субмандибуларната слюнчена жлеза, далака и тънките черва се откриват ниски нива на тРНК. Обратно, най-високо ниво на Ga^l ,4ClcNAc а2,6-сиалилтрансферазна тРНК (4,7 и 4,3 КЬ, 41,46) се открива в черния дроб на плъх и в субмандибуларната слюнчена жлеза, докато ниски нива на mPHK-та се откриват в сърцето, яйчниците и мозъка.

Пример 9.

Консервативен участък на хомоложност в каталитичния домен

Консервативният участък на сиалилтрансферазната фамилия - сравнение на първичните структури на трите клонирани сиалилтрансферази показва участък на обширна хомоложност (фиг. 12). Този участък се състои от 55 аминокиселини от остатък 156 до остатък 210 на a.2,З-N сиалилтрансфераза с 42% идентични аминокиселини и 58% консервативни аминокиселини между всичките три ензима. Последователностите на трите сиалилтрансферази нямат никаква значителна хомоложност извън този участък. Тъй като този участък на хомоложност е разположен близо до центъра на каталитичния домен на ензимите, той може да представлява консервативна структура, необходима за ензимната активност на тези сиалилтрансферази.

Клонирани са три члена на сиалилтрансферазната фамилия на гликозилтрансферази. Макар че 85% от последователностите на всичките три клонирани сиалилтрансферази нямат никаква значителна хомоложност, участъкът от 55 аминокиселини в центъра на всяка молекула е много силно консервативен, предлагайки протеинов мотив в сиалилтрансферазната фамилия. Протеиновият мотив е силно консервативна група от аминокиселини в специфичния участък. Други аминокиселинни ос30 татъци вън от този участък са обикновено слабо консервативни, така че има ниска хомоложност в протеините, съдържащи същия мотив. С тази дефиниция консервативният участък, дефиниран посредством първичните структури на трите клонирани сиалилтрансферази, е мотив в сиалилтрансферазната фамилия.

Протеиновите мотиви често се включват в катализа и лигандното свързване (Hodgman, Т.С., Comput. Applic. Biosci. 5,1-13 [1989], Bairoch, A. Prosite: A Dictionary of Protein Sites and Patterns, 5th edn., University of Geneva [1990] и Sternberg, M.J.E., Nature 349, 111 [1991]. Трите клона на сиалилтрансферазата катализират преминаването на сиаловата киселина от CMP-NeuAc в 2,3 или 2,6 свързването на крайна галактоза, като се формират следните последователности:

NeuAcct2,3 Gaip,3(4)GlcNAc- (ST3N) NeuAca2,3 Galpl ,3GlcNAc- (ST3O) NeuAca2,3 Galpl,4GlcNAc- (ST6N) И трите ензима участват с обща функция. Повече от 50% от остатъците в консервативния участък са или натоварени или полярни аминокиселини в съответствие с намирането им на повърхността на ензимите. Шест от натоварените остатъци в този участък са идентични и в трите сиалилтрансферази. Удивително е, че има седем аминокиселинни остатъка в един интервал на консервативния участък, идентични в трите клона на сиалилтрансферазата - Dsp. Val.Gly.Ser.Lys.Thr.Thr. (фиг. 12).

Пример 10.

Клониране на нова сиалилтрансфераза, като се използва консервативният участък на хомоложност

Консервативният участък на хомоложност се използва, за да се клонират други членове на сиалилтрансферазната генна фамилия.

PCR клониране с изродени олигонуклеотиди

Синтезират се два изродени олигонуклеотида, съответстващи на 5' и 3' краищата на консервативния участък на хомоложност (фиг. 13) (Genosys). Последователността на 5' и 3’ праймерите е

5’GGAAGCTTTGSCRNMGSTGYRYCRTCGT и

5’CCGGATCCGGTRGTYTTNSNSCCACRTC (N = A + G + T + C, S = G + С, R = A + G, M = A + C,Y = C + T) съответно. Провеждат се PCR експерименти, като се използва 100 pmol от всеки праймер и първата верига сДНК се синтезира от мозък на новороден плъх като матрица. Амплификацията се извършва на 30 цикъла при 94°С в продължение на 1 min, 37°С в продължение на 1 min и 72°С в продължение на 2 min. PCR продуктите се смилат с BamHI и Hind III и на тези места на Bluescript KS се субклонират (Stratagene, 11099 North Torrey Pines Road, La Jollia, CA 92037). Субклоновете се охарактеризират чрез секвениране с ТЗ праймер. Амплифицираният фрагмент от един от тези субклонове, SM1, се използва по-долу, за да се отсее SM1 съдържащия ген, който кодира сиалилтрансфераза.

Клониране на SM1 съдържащ ген

Произволно иницирана сДНК от мозък на новороден плъх се лигира с EcoRI-Notl линкери, след което се лигира с EcoRl смлян XgtlO. Получената банка се опакова, като се използва Stratagene Gigapack II опаковащ екстракт, и се поставя върху блюда с E.coli С600 hfl. Отсяват се приблизително 10⁶ плаки с клонирания SMI PCR фрагмент. Четири клона STX1-4 се пречистват и субклонират в Notl мястото на Bluescript (Stratagene) за по-нататъшен анализ.

Northern анализ. Общата РНК от тъкани на плъх се получава, като се използва киселинно фенолна процедура, както е описано по-рано (Chomoznsyi, Р. и сътр., Anal. Biochem 162, 136-159 [1987]. РНК проби от новородени се изолират от плъхчета на четири дни от раждането. РНК се подлага на електрофореза в 1 % агарозен гел, съдържащ формалдехид, премества се в нитроцелулоза и се хибридизира, като се следват стандартните процедури (Kriegler,

M. Gene transfer and expression, Stockton Press,

N. Y., N.Y. [1990]). Northern-блотовете се изследват c пречистен c гел радиобелязан 900bp EcoRl фрагмент, изолиран от STX1.

Конструиране на разтворима форма на STX

Пресечена форма на STX, на която липсват първите 31 аминокиселини на затворената рамка на разчитане, се получава посредством PCR развиване с 5' праймер, съдържащ в рамката Ban HI част и 3' праймер, разположен 50Ьр по посока на stp кодона. Амплифицирането се извършва на 30 цикъла при 94°С в продължение на 1 min, 45°С в продължение на 1 min и 72°С в продължение на 2 min. Векторът за сливане pGIR201 се конструира чрез включ ване на BcII/Bam HI фрагмент, изолиран от pRIT5 (Pharmacia LKB Biotech, Inc., 1025 Atlantic Avenue, Suite 101, Alsmeda, CA 94501), кодиращ протеин A IgG, свързващ домен c Bam Hl сайта на pGIR201 (подарък от Dr. K. Drickamer, Columbia University). Амплифицираният фрагмент се субклонира в Bam HI сайта на pGIR201protA, при което STX се слива с инсулин сигналната последователност и протеин А, присъстващ във вектора. Nhe фрагментът, съдържащ слятия протеин, се субклонира в плазмид pSVL, като се получава експресионен плазмид АХ78.

Експресия на разтворима форма на STX Експресионният плазмид АХ78 (10 ug) се трансфектира в COS-1 клетки в 10 cm блюда. Два дни след трансфекцията културалната среда се събира и инкубира с IgG сефароза (Pharmacia) в продължение на 1 h при стайна температура. Топчетата се изследват за сиалилтрансферазна активност, като се използват олигозахариди, антифризен гликопротеин, смесени ганглиозиди и третирани с невраминидаза мозъчни мембрани от новороден плъх като акцепторни субстрати. Преминаването на сиалова киселина към тези акцептори се измерва, като се използва йонообменна (Weinstein, J. и сътр., J. Biol. Chem 257, 13835-13844 [1982]), изключване по размер (Id.) и низходяща хартиена хроматография (McCoy, R.D. и сътр., J. Biol. Chem. 260, 12695-12699 [1985]).

Идентични трансфекции се осъществяват при опити с пулсационно маркиране. След 36 h период на експресия, блюдата се инкубират при 37°С с 2,5 ml DMEM-метион. След 1 h към средата се прибавя 250иС1³⁵8-трансмаркер (Amersham, 2636 S. Clairebrook, Arlington Heights, IL 60005) и блюдата се инкубират в продължение на още 3 h. В края на това време блюдата се промиват и инкубират една нощ с DMEM. Белязаният слят протеин се изолира чрез инкубиране с IgG сефароза (Pharmacia). След свързването зърната се промиват, кипят се в буфер Laemalli и освободеният протеин се анализира чрез SDS-PAGE/флуорография.

PCR развитие на консервативния участък на хомоложност, родствен на този, намерен в охарактеризираните сиалилтрансферази.

Докато 70% от аминокиселините на консервативния участък на хомоложност на охарактеризираните сиалилтрансферази са консервативни, най-дългите непрекъснати участъци на консервативност са намерени в аминокиселинната последователност в краищата на консервативния участък на хомоложност (фиг. 13). Аминокиселинната последователност близо до С-края на консервативния участък на хомоложност е намерено, че съдържа непрекъснат интервал от седем инвариантни остатъка. Строгата консервативност на тази аминокиселинна последователност е взета под внимание при конструирането на съответния несложен олигонуклеотид с 256 кратна изроденост, като са обхванати всички наблюдавани вариации в употребата на кодона. Конструкцията на олигонуклеотида, съответстващ на N-края на консервативния участък на хомоложност, е потрудна. Аминокиселините в този участък проявяват повече вариабилност, отколкото тези, намерени при обратния край на консервативния участък на хомоложност. Конструкцията на олигонуклеотида след това се затруднява от големия кодонен свръхизлишък на аминокиселини. За да се преодолеят тези фактори олигонуклеотидът от 5' края на консервативния участък на хомоложност се синтезира с 1026 кратна изроденост. Когато тази степен на сложност е близо до прага на изроденост, позволена в PC R експериментите, получените праймери обясняват всички нуклеотидни последователности, намерени че кодират този участък от консервативния участък на хомоложност.

Развитието на невроните е сложен процес, през време на който гликозилтрансферазата се подлага на динамична регулация, което е видно от драматичните промени, намерени в клетъчната повърхност на експресирания карбохидрат. На това основание мозък на новороден плъх се избира като суровина за изолиране на нови сиалилтрансферази. Като се използва сДНК от мозък на новороден плъх като матрица за PCR опитите с изродените праймери, получени в амплификацията на 150Ьр ивица, съвместим с известния размер на консервативния участък на хомоложност. Субклонирането и секвенирането показва, че ивицата е смес от два ДНК фрагмента. На тридесет изолата се охарактеризира 56% кодиран х консервативен участък на хомоложност. Останалите клонове обхващат уникалния консервативен участък на хомоложност SM1. Малко неочаквано SM1 съдържа пет изменения в аминокиселините, които са намерени, че са инвариантни в трите по-рано клонирани сиалилтрансферази. Докато тези изменения намаляват общия брой на инвариантните остатъци, новата информационна последователност, осигурена от охарактеризирането на SM1, повишава общата консервативност на консенсусната последователност.

Очакваната аминокиселинна последователност на SM1 не показва склонност към някакъв индивидуален консервативен участък на хомоложност. На същите места (аминокиселини 1,2, 53, 54) SM1 е подобен на =с2,6 консервативния участък на хомоложност. В други позиции (аминокиселини 8, 9, 54, 55) SM1 отразява последователностите, намерени в <х2,3 консервативен участък на хомоложност. Тъй като консервативният участък на хомоложност е 85% консервативен, този баланс на подобие има за резултат, че SM1 има приблизително 45% хомоложност спрямо другите членове на сиалилтрансферазната генна фамилия.

Първична структура на SM1 съдържащия ген

Анализът на секвенциите на 1,5кЬ клон STX1 показва непрекъсната отворена рамка на разчитане от 375 аминокиселини, които кодират SM1 консервативния участък на хомоложност, охарактеризиран в по-ранните PCR експерименти (фиг. 14). Очакваната аминокиселинна последователност на STX1 предполага, че този протеин е от тип II трансмембранен протеин, както се наблюдава за всеки от другите клонирани гликозилтрансферази. Очакваната аминокиселинна последователност на STX1 показва наличие на хидрофобен участък от осем остатъка от аминокрая на протеина, който служи като сигнално контактен домен. Консервативният участък на хомоложност е локализиран близо до центъра на протеина. Целият размер на STX протеина и съответните позиции на двата хидрофобни участъка и консервативния участък на хомоложност строго наподобява характеристиките на първичната последователност на клонираните сиалилтрансферази. Макар че STX не показва никаква хомоложност към клонирани сиалилтрансферази, освен консервативния участък на хомоложност, обявеното структурно сходство на тези гени изяснява, че STX представлява най-новият член на тази генна фамилия.

Ензимно охарактеризиране на STX

Природно срещащи се разтворими форми на сиалилтрансферази могат да се намерят в различни секреции и телесни течности (Paulson, J.C. и сътр., J. Biol. Chem. 252, 2356-2367 [1977] и Hudgin, R.L. и сътр., Can. J. Biochem. 49, 829-837 [1971]). Тези разтворими форми, получени при протеолитично смилане, късат базалния участък на сиалилтрансферазата, освобождавайки каталитичния домен от трансмембранния контакт. Разтворимите сиалилтрансферази могат да се конструират рекомбинантно чрез заместване на ендогенния сигнално контактен домен с отцепваща се сигнална последователност (Colley, K.J. и сътр., J. Biol. Chem. 264 17619-17622 [1989]). С оглед да се улесни функционалният анализ на STX, разтворима форма на протеина се произвежда чрез заместване на първите 31 аминокиселини с отцепваща се инсулин сигнална последователност и протеин A IgG свързващ домен. IgG свързващият домен се включва в конструкцията, за да подпомогне откриването на разтворимия STX протеин. Подобни сливания с ST3N активно секретират от експресионните клетки, свързани с IgG сефароза и са ензимно активни. Когато експресионният плазмид, съдържащ протеин А/STX сливане (АХ78), се експресира в COS-1 клетките, се изолира 85kd протеин. Големината на слетия протеин е приблизително 15kd по-голяма, отколкото очакваното молекулно тегло на полипептида, което предполага, че част от STX потенциалните Nсвързани гликозилирани части са били използвани.

Свързаният слят протеин се изследва за сиалилтрансферазна активност, като се използват различни акцепторни субстрати. Активността не се открива като се използва β-галактозиден акцептор, съдържащ Gaipi,3(4)GlcNAc последователности. Не се открива и преминаване на сиалова киселина към О-свързаните олигозахариди на антифризния гликопротеин. Експресията на STX в мозъчна тъкан предполага, че генът може да се включи в гликолипидната биосинтеза. Обаче смесени ганглиозиди, изолирани от мозък на възрастно говедо, не успяват да послужат като акцепторен субстрат. Мозъчни мембрани от новородено, третирани с неуроамидаза, са единственият субстрат, показващ дори несигурна способност да послужи като акцептор. Инкубирането на третираните мембрани с STX слят протеин води до получаване на 50% увеличение на активността спрямо фона.

Растежна и тъканна специфична експресия на STX

С оглед да се определи характера на експресията и сигналния размер на STX гена, Northern блотове се изследват с 900bp EcoRI 5 фрагмент, изолиран от STX1. От различни изследвани тъкани хибридизация на 5,5 kb сигнал се наблюдава само в РНК от мозък на новороден плъх. Не се наблюдава никаква кръстосана хибридизация на съответния консервативен 10 участък на хомоложност. Ограничителната експресия на STX е отклонение от диференцираните тъканно специфични експресии, намерени с охарактеризирани сиалилтрансферази. Тъй като всеки от тези гени е независимо регулиран, 15 което води до различен характер на специфична експресия, общо, всяка сиалилтрансфераза се експресира различно в различните тъкани (Paulson, J.C. и сътр., J. Biol. Chem. 264, 1093110934 [1989]). Обратно, STX се експресира само в мозък на новородено. Експресията не е генерализиран ембрионен феномен, тъй като сигнал не е открит в бъбреци на новородено.

Claims (16)

1. Патентни претенции

   1. Рекомбинантен ензим, проявяващ сиалилтрансферазна ензимна активност, който включва каталитичен домен, който от своя страна включва консервативна област на хомоложност, съдържаща аминокиселинната последователност:

   Cys-Arg-Arg-Cys-Ala-Val-Val-Gly-Asn-Ser-Gly-Asn-Leu-Lys-GluSe’r-Tyr-Tyr- Gly-Pro-Gln-Ile-Asp-Ser-His-Asp-Phe-Val-Leu-Arg-Met-AsnLys-Ala-Pro-Thr-Glu-Gly-Phe-Glu-Ala-Asp-Val-Gly-Scr-Lys-Thr-Thr-HisHis-Phe-Val-Tyr-Pro-Glu;

   Cys-Arg-Arg-Cys-Ile-lle-Val-Gly-Asn-Glv-Gly-Val-Lcu-Ala-Asn-Lys-Ser-LeuGly-Ser-Arg-lle-Asp-Asp-Tyr-Asp-Ile-Val-Leu-Arc-Leu-Asn-Ser-Ala-Pro-Val-Lys-GlyPhe-Glu-Lys-Asp-Val-Gly-Ser-Lys-Thr-Thr-Leu-A'g-Ile-Thr-Tyr-Pro-Glu, u

   Phe-Gln-Thr-Cys-Ala-lle-Val-Gly-Asn-Ser-Gly-Val-Leu-Leu-Asn-Ser-GlyCys-Gly-Gln-Glu-Ile-Asp-Thr-His-Ser-Phe-Val-Ee-Arg-Cys-Asn-Leu-Ala-Pro-ValGln-Glu-Tyr-Ala-Arg-Asp-Val-Gly-Leu-Lys-Thr-Asp-Leu-Val-Thr-Met-Asn-ProSer;

   и нейни варианти, при което приблизително 58% от аминокиселините на консервативната област на хомоложност на посочения сиалилтрансферазен ензим са запазени, посо- 40 ченият каталитичен домен притежава най-малко една аминокиселина, която е заместена, делетирана или инсертирана в посочения каталитичен домен, като посоченият ензим не проявява бета галактозидазна -2,6 сиалилтрансфе- 45 разна активност.
2. 2. Рекомбинантен полипептиден ензим съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че посоченият полипептиден ензим включва също и трансмембранен домен. 5θ
3. 3. Рекомбинантен полипептиден ензим съгласно претенция 2, характеризиращ се с то ва. че посоченият полипептиден ензим включва също и цитоплазматичен домен.
4. 4. Сиалилтрансфераза, несъдържаща по същество вещества, които се съдържат в in vivo физиологична среда, като посочената сиалилтрансфераза притежава аминокиселинна последователност, посочена на фиг. 14.
5. 5. ДНК молекула, кодираща рекомбинантния сиалилтрансферазен ензим, съгласно претенция 1.
6. 6. ДНК молекула, кодираща рекомбинантния сиалилтрансферазен ензим, съгласно претенция 2.
7. 7. ДНК молекула, кодираща рекомбинантния сиалилтрансферазен ензим, съгласно претенция 3.
8. 8. Рекомбинантен експресионен вектор, включващ ДНК, съгласно претенция 5.
9. 9. Състав, характеризиращ се с това, че съдържа клетка, трансформирана с рекомбинантния експресионен вектор от претенция 8. 5
10. 10. Рекомбинантен експресионен вектор, включващ ДНК, съгласно претенция 6.
11. 11. Състав, характеризиращ се с това, че съдържа клетка, трансформирана с рекомбинантния експресионен вектор от претенция 10. 10
12. 12. Рекомбинантен експресионен вектор, включващ ДНК, съгласно претенция 7.
13. 13. Състав, характеризиращ се с това, че съдържа клетка, трансформирана с рекомбинантния експресионен вектор от претенция 12.
14. 14. ДНК молекула, кодираща сиалилтрансфераза, която притежава аминокиселинна последователност, посочена на фигура 14.
15. 15. Рекомбинантен експресионен вектор, включващ ДНК, съгласно претенция 14.
16. 16. Състав, характеризиращ се с това, че съдържа клетка, трансформирана с рекомбинантния експресионен вектор от претенция 15.