HU219260B - Recombinant polypeptid with sialyltransferase activity, dna molecule coding thereof and vectors - Google Patents

Abstract

A találmány tárgyát szialiltranszferázenzim-aktivitást kifejtőrekombináns polipeptid képezi, ahol a polipeptid- enzim egykatalitikus domént tartalmaz, azzal jellemezve, hogy a katalitikusdomén a Cys-Arg-Arg-Cys-Ala-Val-Val-Gly-Asn-Ser-Gly- Asn-Leu-Lys-Glu-Ser-Tyr-Tyr-Gly-Pro-Gln-Ile-Asp- Ser-His-- Asp-Phe-Val-Leu-Arg-Met-Asn-Lys-Ala-Pro- Thr-Glu-Gly-Phe-Glu-Ala-Asp-Val-Gly-Ser-Lys- Thr-Thr-His-His-- Phe-Val-Tyr-Pro-Glu; vagy Cys-Arg-Arg-Cys-Ile-Ile-Val-Gly-Asn-Gly-Gly- Val-Leu-Ala-Asn-Lys-Ser-Leu-Gly-Ser-Arg-Ile-Asp- Asp-Tyr-- Asp-Ile-Val-Leu-Arg-Leu-Asn-Ser-Ala-Pro- Val-Lys-Gly-Phe-Glu-Lys-Asp-Val-Gly-Ser-Lys-Thr- Thr-Leu-Arg-- Ile-Thr-Tyr-Pro-Glu; vagyPhe-Gln-Thr-Cys-Ala-Ile-Val-Gly-Asn-Ser-Gly- Val-Leu-Leu-Asn-Ser-Gly-Cys-Gly-Gln-Glu-Ile-Asp- Thr-His-- Ser-Phe-Val-Ile-Arg-Cys-Asn-Leu-Ala-Pro- Val-Gln-Glu-Tyr-Ala-Arg-Asp-Val-Gly-Leu-Lys- Thr-Asp-Leu-Val-- Thr-Met-Asn-Pro-Ser; aminosavsorrenddel rendelkezőkonzerválódott homológiarégiót, valamint ezek variánsait tartalmazza,ahol szialiltranszferáz enzim konzervált homológiarégiójában azaminosavak legalább 58%-a konzerválódott, és ahol a katalitikus doménlegalább egy olyan aminosavval rendelkezik, amelynek helye üres, vagyamely más aminosavval helyettesített, vagy amely a katalitikus doménbainzertált, és amelynél az enzim ?-galaktozid ?-2,6--szialiltranszferáz-aktivitása hiányzik. ŕ

Description

A találmány a glikoziltranszferázok egy csoportjával, a szialiltranszferázokkal kapcsolatos, mely katalitikus doménjében konzervatív homológiarégiót tartalmazó glikoproteinek, glikolipidek és oligoszacharidok szénhidrátcsoportjainak terminális szialilezéséért felelős. A szialiltranszferáz géncsalád a Gaipi, 3GalNAc a-2,3-szialiltranszferázt és a Gall,3(4)GlcNAc a-2,3-szialiltranszferázt foglalja magában. A találmány továbbá ezek új formáival és összetételeivel, és különösen a szialiltranszferáz géncsalád tagjainak identifikálására és homogén szignifikáns hasznos mennyiségeinek termelésére alkalmas eszközökkel és módszerekkel kapcsolatos. A találmány kapcsolatos a szialiltranszferázok termelését kódoló izolált dezoxiribonukleinsav (DNS) („szialiltranszferáz géncsaláddal”), a szialiltranszferáz molekulákat kódoló DNS kinyerésének módszereivel; az ilyen DNS-t hasznosító humán és emlős szialiltranszferázok expreszszálásával csakúgy, mint új vegyületekkel, ideértve szialiltranszferázokat vagy azok fragmentjeit kódoló új nukleinsavakat is. A találmány a szialiltranszferáz-származékokra, különösen a citoplazmikus és/vagy transzmembránprotein részekkel nem rendelkező származékokra, valamint azok rekombináns DN S-technikákkal való termelésére is vonatkozik.

A szialiltranszferázok az enzimek olyan családját alkotják, melyek a szialilsavnak (SA) a glikolipidek és oligoszacharidok szénhidrátcsoportjainak terminális részeire való átvitelét katalizálják a következő általános reakcióséma szerint:

Citidin 5 monofoszfát-szialinsav (CMP-SA)+HOakceptor

CMP+S A-O-akceptor [Beyer, T. A. et. Adv. Enzymol. 52, 23-175 (1981)].

A szialiltranszferázok, elsősorban a sejtek Golgi-készülékben találhatók, ahol a poszttranszlációs glikoziláció anyagcsereútjainak közreműködői. [Fleischer, B. J. Cell Bioi. 89, 246-255 (1981)]. Testfolyadékokban - tej, kolosztrum és vér - szintén megtalálhatók. Legalább 10-12 különböző szialiltranszferáz szükséges az összes ismert szialiloligoszacharid-szekvencia szintetizálásához. Ezek közül valamennyi megkülönböztethető enzimatikusan az akceptor oligoszacharidszekvenciára való specifikussága, valamint a szialinsav és a cukor (melyhez kapcsolódik) között létrejött anomerkötés specifikussága alapján. Négy szialiltranszferázt állítottak elő tiszta állapotban. [Beyer et al., Ibid; Weinstein, J. et al., J. Bioi. Chem. 257, 13835-13844 (1982); Miagi, T. and Tsuiki, S. Eur. J. Biochem. 125, 253-261 (1982); and Joziasse, D. H. et al., J. Bioi. Chem. 260, 4941-4951 (1985)]. Még specifíkusabban a Gaipi,4GlcNAc a-2-6-szialiltranszferázt és a Galpl,3(4)GlcNAc a-2-3-szialiltranszferázt tisztították patkánymájmembránból. (Weinstein et al., Ibid.)

Más glikoziltranszferázokat oldható enzimekként izoláltak szérumból, tejből vagy kolosztrumból, ideértve szialil-, íukozil-, galaktozil-, N-acetil-glükóz-aminilés N-acetil-galaktóz-aminil-transzferázokat. (Beyer et al., Ibid.) Szarvasmarha és humán β-Ν-acetil-glükózamid β-Ι^^Ν^οζίΙϋΉηβζίεΓέζΐ is izoláltak (Narimatsu, H. et al. Proc. Nat. Acad. Sci. Amerikai Egyesült Államok 83, 4720-4724 (1986); Shaper, N. L. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. Amerikai Egyesült Államok 83, 1573-1577 (1986); Appert, Η. E. et al., Biochem. Biophys. Rés. Common 139, 163-168 (1986); és Humpreys-Beyer, M. G. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. Amerikai Egyesült Államok 83, 8918-8922 (1986). Ezek a tisztított glikoziltranszferázok különböző méretűek, mely az aktivitáshoz nem nélkülözhetetlen fehérjerészek, mint például a membránkötő domének eltávolításának a következménye lehet.

A galaktoziltranszferázokat, szialiltranszferázt, fukoziltranszferázt és N-acetil-galaktóz-aminil-transzferázt magukban foglaló, glikoziltranszferázokat kódoló cDNS-klónok levezetett aminosavszekvenciáinak öszszehasonlítása felfedi, hogy ezen enzimek gyakorlatilag nem rendelkeznek szekvenciahomológiával. A klónozott szialiltranszferázok elsődleges szerkezetének nemrégiben elvégzett analízise (Weinstein, J. et al., Ibid) némi bepillantást ad arra vonatkozóan, hogy a glikoziltranszferázok ezen családja szerkezetileg milyen kapcsolatban áll. Valamennyinek van rövid NH₂ terminális citoplazmikus farokrésze, egy 16-20 aminosav hosszúságú jelrögzítő doménje és egy kiterjedt „nyél” régiója, melyeket a nagy COOH-terminális katalitikus dómén követ [Weinstein, J., J. Bioi. Chem 262, 17735-17743 (1987); Paulson, J. C. et al., J. BioL Chem. 264, 17615-17618 (1989). A jelrögzítő domének hasíthatatlan jelpeptidekként, valamint membránrögzítő régiókként működnek, és ezen glikoziltranszferázok katalitikus doménjeit a Golgi-készülék lumenébe orientálják. Közös aminosavszekvenciák lennének várhatók a glikoziltranszferázok családjain belül, melyek közös akceptor- vagy donorszubsztrátokkal rendelkeznek. Meglepetésre azonban a glikoziltranszferázok katalitikus doménjei között csak néhány homológ régiót találtak, és nem található szignifikáns homológia a „GenBank” bármely egyéb proteinjével sem [Sharper, N. L. et al., J. Bioi. Chem 216, 10420-10428 (1988), D’Agostaso, G. et al., Eur. J. Biochem, 183, 211-217 (1989) and Weinstein, J. et al., J. Bioi. Chem 263, 17735-17743 (1987)]. Ez különösen meglepő a Gál a-l,3-GT és a GlcNAc bétái,4-GT galaktoziltranszferázok esetében. Azonban, amíg ezek a galaktoziltranszferázok nem mutatnak általános homológiát, létezik egy közös hexapeptid KDKKND a Gál a-l,3-GT (szarvasmarha, 304-309) és RDKKNE a GlcNAc β-1,4GT (szarvasmarha-, humán, patkányaminosavak 346-351). [Joziasse et al., J. Bioi. Chem. 264, 14290-14297 (1989)].

A szialinsavak a glikoproteineken és a glikolipideken levő szénhidrátcsoportokon levő terminális cukrok, és széles körben elterjedtek az állati szövetekben [Momol et al., J. Bioi. Chem. 261, 16270-16273 (1986)]. A szialinsavak terminális elhelyezkedésük miatt fontos szerepet játszanak a szénhidrátszerkezetek biológiai funkcióiban. Például szialinsav szerepel ligandumként az influenzavírus egy gazdasejthez való kötődésekor [Paulson, J. C., The Receptors, Vol. 2. Conn, P. M. ed., pp. 131-219, Academic Press (1985)]. Sőt a szialinsavkötésben bekövetkező változás elegendő a

HU 219 260 Β gazdaspecifitás megváltoztatásához [Roger, G. N. et al., Natúré 304, 76-78 (1983)]. A neutrális sejtadhéziós molekula (NCAM) fejlődés által szabályozott poliszializációtól függ, melyről azt feltételezik, hogy az idegrendszer fejlődése alatt az NCAM által közvetített sejtadhéziót módosítja [Rutishauer, U. et al., Science 240, 53-37 (1988) és Rutishauer, U., Adv. Exp. Med. Bioi. 265,179-18 (1990)]. Nemrégiben egy szénhidrátszerkezetről a szialil Lewis X-ről (SLe*) kimutatták, hogy a neutrofilek aktivált endoteliális sejtekhez való kötődését közvetítő endoteliális leukocita adhéziós molekula („E-Selektin”) ligandumaként funkcionál (Lowe et al., 1990; Phillips et al., 1990; Goelz et al., 1990; Walz et al., 1990; Brandley et al., 1990). A P-szelektinről (a CD62 külső membránprotein trombocita aktiválásfuggő granuluma), a szelektincsalád egy másik tagjáról [Stoolman, L. M., Cell. 56, 907-910 (1989)] szintén kimutatták, hogy felismerik a monocitákon és PMN-eken található SLeX-et [Larsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Amerikai Egyesült Államok 87, 6674-6678 (1990); Momol etal., J. Bioi. Chem. 261, 16270-16273 (1986); Polley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Amerikai Egyesült Államok 88, 6224-6228 (1991); Chan. K. F. J., J. Bioi. Chem. 263, 568-574 (1988); Beyer, T. A. et al., Adv. Enzymol., 52, 23175 (1981)]. A szialinsav mindkét esetben a szénhidrátszerkezet ligandumként való működésének kulcskomponense. A sejtadhézióban játszott szerepen túl a szialinsavtartalmú szénhidrátszerkezetek a differenciálódásban is közvetlen szerepet játszanak. A HL-60 hematopoetikus sejtvonal differenciálódása G M3 glikolipidkezeléssel indukálható. A gangliozidokról szintén feltételezik, hogy szerepet játszanak a növekedési faktor fehéijekináz-aktivitások módosításában és a sejtciklus szabályozásában.

Egy ilyen szialiltranszferázt az 5,047,335 számú US szabadalomban leírtak szerint tisztítottak. Bár a „tisztított” szialiltranszferáz bizonyos mennyiségei elérhetőek, ezek igen kis mennyiségek, részben, mert ezek az anyagok az endoplazmás retikulum és a Golgi-készülék membránjaihoz kötött fehéijék. Ezen szialiltranszferázok tisztításának jelentős költség- és munkaigénye ritka anyaggá teszi ezeket. A találmány egyik célja a szialiltranszferázt kódoló DNS izolálása, valamint emlős, különösen humán szialiltranszferáz használható mennyiségeinek rekombináns DNS-technikát felhasználó termelése. További cél a különböző szövetekből, valamint más fajokból származó szialiltranszferáz géncsalád más tagjait kódoló DNS kinyerésére szolgáló eszközök biztosítása. A találmány egy további célja a szialiltranszferázok új formáinak előállítása. Megint más cél a szialinsav terminális pozíciókba való transzferálásának katalizálására szolgáló eszközök biztosítása bizonyos szénhidrátcsoportokon. A találmány ezen és más céljai egyértelműek lesznek a specifikációk egészéből.

A találmány összefoglalása

A találmány céljait egy olyan módszer kíséri, mely a következőkből áll: olyan gének azonosítása és klónozása, melyek emlős szialiltranszferázokat kódolnak (az alábbiakban határozzuk meg), ideértve a következőket az ezekre való korlátozás nélkül: Gaipi,3GaINAc 2,3-szialiltranszferáz és a patkány Gaipi,3(4) GlcNAc 2,3-szialiltranszferáz (más, mint a patkány Gaipi,4GlcNAc 2,6-szialiltranszferáz); a gént a rekombináns DNS-vektorba építjük be; egy alkalmas gazdát transzformálunk az ezen gént tartalmazó vektorral; az emlős szialiltranszferáz géneket az ilyen gazdában expresszáljuk, valamint a termelt emlős szialiltranszferázt kinyeijük. Másik lehetőségként számos egyéb rekombináns technika is alkalmazható a szialiltranszferázok expressziójának eléréséhez. Hasonlóképpen a találmány lehetővé teszi emlős szialiltranszferázok és/vagy ezek származékainak rekombináns technikákkal való termelését, valamint ilyen szialiltranszferázok termelésére való eszközöket biztosítanak. A szialiltranszferázok kis mennyiségben előforduló proteinek, és nehéz tisztítani ezeket. A szialiltranszferázok izolálása és azonosítása kiemelkedően nehéz feladat volt. Az mRNS ritka volt, a sejtvonalak vagy az mRNS nagy mennyiségeinek egyéb forrásai nem elérhetőek. Ez a találmány először létrehozott egy szialiltranszferáz géncsaládot, melyet az enzimek katalitikus doménjében levő konzerválódott homológiarégióval határoztunk meg.

A találmány szialiltranszferáz-enzimaktivitást kifejtő rekombináns polipeptidre, az azt kódoló DNS-molekulára, illetve expressziós vektorra vonatkozik. A találmány szerint rekombináns DNS-technikát alkalmazunk, mely a következőket foglalja magában:

1. az enzimek és 5’-szomszédos régiójuk teljes DNSszekvenciájának felfedezése és azonosítása;

2. az említett DNS-szekvenciát tartalmazó klónozó és expressziós hordozók megszerkesztése; az emlős szialiltranszferáz protein, valamint ezek fúziós vagy jel N-terminális konjugátumainak expresszióját lehetővé téve; és

3. valamint életképes sejttenyészetek és más expreszsziós rendszerek létrehozása, melyeket genetikailag megváltoztattunk azáltal, hogy tartalmaznak ilyen hordozókat, és képesek emlős szialiltranszferázt termelni.

A találmány a továbbiakban emlős szialiltranszferáz celluláris termelését kódoló DNS termelésére szolgáló összetételekre és módszerekre is irányul. A találmány egy megint más aspektusa olyan új vegyületekre vonatkozik, melyek magukban foglalják a dezoxiribonukleotidokat és ribonukleotidokat, melyeket a szialiltranszferáz expresszálására képes kiónok kinyerésére használunk. A találmány egy megint más aspektusában a szialiltranszferáz alapjában véve mentes az összes természetesen előforduló olyan anyagtól, melyek tipikusan előfordulnak a vérben és/vagy szövetekben, azaz a rekombináns eszközökkel termelt szialiltranszferáz mentes lesz azoktól a szennyeződésektől, melyek tipikusan megtalálhatók in vivő fiziológiai környezetében. Továbbá a termelés módszerétől függően a szialiltranszferáz tartalmazhat kisebb vagy nagyobb mértékű kapcsolt glikozilációt az in vivő fiziológiás környezetéből, azaz a vérből és/vagy nyert anyaggal összehasonlítva. A találmány továbbá új szialiltranszferáz-származékokra is irányul, különösen olyanokra, melyekből hiányzik a szialiltranszferáz aminoterminális maradék, azaz

HU 219 260 Β olyan származékok, melyekből hiányzik a rövid NH₂ citoplazmás dómén vagy a hidrofób N-terminális jelrögzítő szekvencia, mely a szialiltranszferáz transzmembrán domént és a törzsrégiót alkotja.

A találmány szilaliltranszferáza és ennek származékai hasznosak a szialinsav glikoperoteineken és glikolipideken jelen levő szénhidrátcsoportjaihoz való hozzáadásban. Továbbá a szialiltranszferáz és származékai enzimatikusan is hasznosak, mivel a szialinsav cukorláncokhoz való hozzáadásával olyan szénhidrátok hozhatók létre, melyek a biológiai felismerésben determinánsokként funkcionálhatnak. Az ilyen szialiltranszferázenzimek felhasználhatók a multienzim-rendszerekben oligoszacharidok és származékaik szintéziséhez [Ichikawa et al., J. Am. Chem. Soc. 113, 4698 (1991) és Ichikawa et al., J. Am. Chem. Soc. 113, 6300 (1991)]. Végül a találmány szialiltranszferáz családját kódoló DNS, különösen a katalitikus dómén konzerválódott homológia hasznos a szialiltranszferáz család más tagjait kódoló gén klónozására szolgáló eszközök biztosításában. A szialiltranzferázok és a szialiltranszferázt kódoló DNS egyéb alkalmazása egyértelmű lesz a tudomány e területén képzett szakember számára.

A rajzok rövid leírása

1. ábra

A sertés Gaipi, 3GalNAc a-2,3-szialiltranszferáz („a-2,3-0”) nukleotid- és aminosavszekvenciája. A sertés a-2,3-o mRNS nukleotidszekvenciáját két átfedő klón, a lambdaSTl és lambdaST2 DNS-szekvencia analíziséből határoztuk meg. Az a-2,3-o polipeptid feltételezett aminosavjait a DNS-szekvencia fölött mutatjuk be, és az analóg tisztított protein N-terminális első maradékától kezdtük számozni. A feltételezett jelrögzítő szekvenciát jelöltük (világos kocka). A potenciális glikozilációs helyeket az Asn-XThr szekvenciával egy csillaggal jelöltük. A szekvencia megfelel az cc-2,3szialiltranszferáz hosszú formájának, melyet az átfedő lambdaSTl és lambdaST2 kiónok kódolnak.

2. ábra

A patkány Gaipi,3(4)GlcNAc a-2,3-szialiltranszferáz („a-2,3-N”) nukleotid- és aminosavszekvenciája. A patkány a-2,3-N nukleotidszekvenciáját a DNS-szekvencia analíziséből határoztuk meg. A szialiltranszferáz polipeptid feltételezett aminosavjait a DNS-szekvencia fölött mutatjuk be, és az érett protein első maradékától számozzuk, ahogy az N-terminális proteinszekvenálással meghatároztuk.

3. ábra

Az a-2,3-0-szialiltranszferáz CDP-hexanolamin agarózon (K.C1 eluálás) való tisztítása. 2 kg sertésmáj homogenizátumát helyeztük CDP-hexanolamin agarózoszlopra, és KC1 lineáris gradiensével eluáltuk (lásd a kísérleti eljárásokat). A proteinkoncentrációkat és az akceptorszubsztrátként laktózt használó szialiltranszferáz-aktivitást meghatároztuk az egyes frakcióknál. Az enzimaktivitás két csúcsát A és B poolokba szeparáltuk, ahogy azt jelöltük.

4. ábra

Az a-2,3-0-szialiltranszferáz CDP-hexanolamin agarózon való (III oszlop, CDP elúció) tisztítása. Az enzimaktivitást a specifikus akceptorszubsztrát fagyásgátló glikoprotein (AFGP) használatával határoztuk meg. Az A és B oszlopokban az enzimaktivitás elúciója túlnyomórészt sorrendben a 48 kDa és 45 kDa proteintípusokkal állt korrelációban (lásd az illusztrációt, SDS-PAGE). Ez a két típus, az a-2,3-szialiltranszferáz A és B formája 8-10 egység/mg protein specifikus aktivitással rendelkezett. A 48 kDa és 45 kDa típusokat egy PVDF membránra lenyomatoltuk és NH₂-terminális szekvenálással analizáltuk.

5. ábra

A 48 kDa és a 45 kDa a-2,3-0-szialiltranszferáz peptidek NH₂-terminális aminosavszekvenciái. A feltételezett jelrögzítő domént tartalmazó, a 48 kDa peptid NH₂-terminusához közel levő 16 hidrofób aminosavat aláhúztuk.

6. ábra

A két a-2,3-0-szialiltranszferáz cDNS-klónok restrikciós térképe és szekvenálási stratégiája.

7. ábra

A két szialiltranszferáz dómén szerkezetének és homológ régióinak összehasonlítása. A) Az a-2,6-szialiltranszferáz és az a-2,3-0-szialiltranszferáz elsődleges szerkezetének felsorolása felfed egy 64%-os szekvenciaazonosságú és egy 84%-os szekvenciahasonlósági 45 aminosavból álló régiót. B) A homológ domének átfedik az a-2,3szialiltranszferáz 2 és 3 exonjai közötti kapcsolódást, és a két enzim katalitikus domének között fekszik.

8. ábra

Az oldható, katalitikusán aktív a-2,3-0-szialiltranszferáz expressziója. A) Az a-2,3-0-szialiltranszferáz oldható formájának az sp-ST expresszálást irányító cDNS-t úgy szerkesztettünk meg, hogy a vad típusú szialiltranszferáz citoplazmás domént és a jelrögzítő domént az inzulin jelpeptiddel helyettesítettük; az sp-ST-t úgy becsültük, hogy kódol egy 38 kDa szekretált proteintípust, ha gazdasejtekbe transzfektáljuk. B) Az sp-St-t a pSVL expressziós vektorba inzertáltuk, és a COS-1 sejtekbe transzfektáltuk; a transzfekció után 48 órával a sejteket impulzusjelöléssel láttuk el 2 órán keresztül Tran35Sjelölőt tartalmazó tápközegben, melyet egy 5 órás nyomon követési időszak követ a jelölőt nem tartalmazó tápközegben. Ezt a tápközeget összegyűjtjük, 15-szörösére koncentráljuk és SDS-PAGE/fluorográfiával analizáljuk. Az sp-ST és mock-transzfektált sejt tápközeg-ismétléses mintáit analizáltuk. C) A COS-1 sejteket lipofektinnel transzfektáltuk (+sp-ST) vagy csak lipofektinnel (mock) egy egyedüli módon (7B.); 48 órával a transzfekció után a tápközeget összegyűjtöttük 15-szörösére koncentráltuk és a szialiltranszferázaktivitásra vizsgáltuk specifikus AFGP akceptorszubsztráttal [Sadler, J. E. et al, J. Bioi. Chem. 254, 4434-4443 (1979)].

9. ábra

A Gál 2,3-N-szialiltranszferáz enzimből származó leghosszabban szekvenált triptikus peptid CID-spektruma. A peptid szekvenciája: Leu-Thr-Pro-Ala-Leu-AspSer-Leu-HIs-Cys*-Arg, MH+ = 1283,6. A Cys* karboximetil ciszteint képvisel. Az N-terminusnál levő nagy retenciójú ionokat a, b, c ionoknak és a C-ter4

HU 219 260 Β minusnál levő ionokat x, y, z fragmenteknek jelöltük [Biemann, K. (1990) Meth. Enzymol. 193: 886-887]. Az első ionok (a, x) a karbon- és a karbonilcsoport közötti hasítás termékei. Az y és a b ionok akkor jönnek létre, ha a peptidkötés hasítódik. A c és z ionok az aminocsoport és a karbon közötti hasítás következtében vannak jelen. Ezen fragmentek számozását mindig a megfelelő terminusnál kezdjük. Az oldallánc fragmentációja az aminosavak β- és lambda-karbonjai között fordul elő, az úgynevezett d (N-terminális) és w (Cterminális) ionokat hozva létre. A megfigyelt fragmentionokat a táblázatban szerepeltetjük. Az azonos ionsorozatokba tartozó ionokat sorokban listáztuk.

10. ábra

A Gál 2,3-N-szialiltranszferáz enzimből származó karbamilált triptikus peptid CID spektruma. A peptidszekvencia Leu-Asn-Ser-Ala-Pro-Val-Lys, MH+=771,4. A fragmentáció egyértelműen az N-terminusnál jelez modifikációt, és nem a lizinmaradék éta-amino-csoportjánál. Az m/z 669-nél (w7) levő bőséges ion megerősíti ebben a pepiidben egy N-terminális leucin jelenlétét. A csillaggal jelölt ionok mátrixszal kapcsolatos háttérionok [Falick et al., (1990) Rapid Commun. Mass Spectrom. 4: 318], A megfigyelt ffagmentionokat feltüntettük a táblázatban. Az azonos ionsorozatba tartozó ionokat sorokban tüntettük föl.

11. ábra

A Gaipi,3(4)GlcNAc a-2,3-szialiltranszferázból (ST3N) származó I és II peptidek felsorolása a korábban klónozott szialiltranszferázokkal együtt. A Galpl,4GlcNAc

2,6-szialiltranszferázt (ST6N) és a Gal(íl,3GalNAc a-2,3-sziali!transzferázt (ST30) üres sávokként ábrázoltuk. A tömött kocka a jelrögzítő szekvenciát jelöli. A satírozott kocka a két szialiltranszferáz között azonosított homológ régiót jelzi.

12. ábra

A három klónozott szialiltranszferáz közös konzervatív régiója. A három klónozott szialiltranszferáz a patkány Gaipi,3(4)GlcNAc a-2,3-szialiltranszferáz (ST3N), a sertés Galpl,3GalNAc a-2,3-szialiltranszferáz (ST30) és a patkány Gaipi,4GlcNAc a-2,6-szialiltranszferáz (ST6N). A régió 55 aminosavból áll a Galpl,3(4)GlcNAc a-2,3szialiltranszferáz 156 maradékától a 210 maradékáig. Az aminosav-azonosságokat kockákkal jeleztük.

13. ábra

Az amplifikált fragment feltételezett amonosavszekvenciája SM1, és a homológia korábban jellemzett konzervatív régiójának összehasonlítása. A homológiakonszenzus konzervatív régióját a klónozott és jellemzett szialiltranszferázok és az amplifikált SM1 fragment homológiája konzervatív régiójának összehasonlításából hoztuk létre. Az invariáns aminosavakat nagybetűkkel jelöltük, míg a konzervatív homológia régiójának több mint 50%-ában jelen levő aminosavakat kisbetűkkel jelöltük. Azokat a pozíciókat, ahol r vagy q van, b-nek jelöltük, azokat, ahol i vagy v van, x-nek jelöltük. Az aláhúzott aminosavak azokat a régiókat jelölik, melyeket a degenerált primerek tervezéséhez használtunk. A korábbi invariáns aminosavakban levő változásokat, melyeket az amplifikált ffagmentben találtunk, csillaggal jelöltük.

14. ábra

Az STX1 nukleotid és feltételezett aminosavszekvenciája. A leghosszabb nyílt leolvasási keret feltételezett aminosavszekvenciája a homológia SM1 konzervatív régióját kódolja (154-208 aminosavak), melyeket árnyékolt kockával jelöltünk. A feltételezett jelrögzítés (8-23 aminosav) szekvenciát bekereteztük, és a potenciális N-kötésű glikozilációs helyeket aláhúztuk.

A találmány részletes leírása

A találmány szerinti használatban a szialiltranszferáz vagy szialiltranszferáz-származékok a patkány Gaipi,4GlcNAc a2,6-szialiltranszferáztól eltérő szialiltranszferáz enzimekre utalnak, melyek a katalitikus doménben a homológia egy konzervált régióját tartalmazzák, és melyek enzimatikusan aktívak a szialilsav glikoproteinek, glikolipidek, oligoszacharidok és hasonlók cukorláncain terminális pozícióba való áthelyezésében. Az enzimatikusan funkcionáló szialiltranszferázokra példák azok, melyek képesek a CMP-szialilsavról a szialilsav akceptor oligoszacharidra való áthelyezésére, ahol az oligoszacharidakceptor az adott szialiltranszferáztól függően változik.

„A konzerválódott homológiarégió” a szialiltranszferázban levő aminosavak egy sorozatára utal, melyek alapjában véve azonosak egy másik szialiltranszferáz enzim azonos aminosavsorozatával, ha a két enzim szekvenciáját egymás mellé fektetjük. A találmány szialiltranszferáz géncsaládjában a konzerválódott homológiarégió a katalitikus doménben van, és legalább 7 szomszédos aminosavval túllóg, előnyösen legalább 20 aminosavval és legelőnyösebben legalább 55 aminosavval, melyek aminosavszekvenciája a 2. ábrán látható 156-210 maradékok vagy az 1. ábrán látható 142-196 maradékok aminosavszekvenciájával azonos. Ha a konzerválódott homológiarégiót azonosítottuk, a konzerválódott régió aminosavszekvencia-variánsai az alábbi három osztály valamelyikébe vagy akár többe is tartozhatnak: szubsztitúciós, inzertációs vagy deléciós variánsok. Ezeket a variánsokat közönségesen helyspecifikus mutagenezises nukleotidokkal állítjuk elő a szialiltranszferázt kódoló DNS-ben, így egy variáns konzerválódott homológiarégiót tartalmazó szialiltranszferázt kódoló DNS-t hozunk létre.

A szialiltranszferáz körébe beletartozik például a patkány Galpl,3)4)GlcNAc a-2,3-szialiltranszferáz („a-2,3-N”-ként utalunk rá), mely a NeuNAc a2,3Gaipi,3GlcNAc és a NeuAca2,3Gaipi,4GlcNAc szekvenciákat hozza létre, melyek gyakran terminálnak komplex N-kötésü oligoszacharidokat. A szialiltranszferázok körébe tartozó enzimre egy másik példa a sertés Galpl,3GalNAc a-2,3-szialiltranszferáz („a2,3-0”ként utalunk rá), mely a NeuAc a-2,3Gaipi,3GalNAcot hozza létre, mely a treoninhoz vagy szerinhez 0-kötéssel kapcsolódó cukorláncokon található, valamint terminális szekvenciaként bizonyos gangliozidokon.

A találmány szerinti használatban a szialiltranszferázok körébe olyan szialiltranaszferázok tartoznak, melyek a patkány és sertés szialiltranszferáz natív glikozilációjával és aminosavszekvenciájával rendelkeznek, ahogy azt az 1. és 2. ábrán bemutatjuk, más állatfajok5

HU 219 260 Β ból, mint például szarvasmarha, humán és hasonlókból származó analóg szialiltranszferázok, valamint más szövetekből, az ilyen szialiltranszferázok deglikozilált vagy nem glikozilált származékai, a szialiltranszferáz aminosavszekvencia-variánsai, valamint in vitro létrehozott kovalens szialiltranszferáz-származékok. A szialiltranszferáz összes formája tartalmaz egy konzervált homológiarégiót, és enzimatikusan aktív, vagy ha nem, legalább egy, az enzimatikusan aktív szialiltranszferázzal közös immun epitopot hordoz. A szialiltranszferáz aminosavszekvencia-variánsai az alábbi három osztály egyikébe vagy több osztályba is tartozhatnak: szubsztitúciós, inzertációs vagy deléciós variánsok. Ezeket a variánsokat általában nukleotidok helyspecifikus mutagenezisével állítjuk elő a szialiltranszferázt kódoló DNS-ben, így a variánst kódoló DNS termelésével, ezután pedig a DNS-t rekombináns sejttenyészetben expresszáljuk. Azonban a maximum 100-150 maradékból álló szialiltranszferáz-variáns fragmentek megfelelő módon előállíthatok in vitro szintézis segítségével. Az aminosavszekvencia-variánsokra jellemző a variáció előre meghatározott természete, mely tulajdonság megkülönbözteti ezeket a szialiltranszferáz-aminosavszekvencia természetesen előforduló allelikus vagy interspecifikus variációjától. A konzervatív homológiarégióinak variánsai tipikusan a természetesen előforduló analóggal minőségileg megegyező biológiai aktivitást mutatnak.

Míg az egy aminosav beépítésére alkalmas hely előre meghatározott, a mutáció per se nem kell előre meghatározott legyen. Például egy adott helyen végbemenő mutáció optimalizálása céljából random mutagenezis alkalmazható a célkodonnál vagy -régiónál, és az expresszált szialiltranszferáz-variánsok a kívánt aktivitás optimális kombinációjára szkrínelhetők. Egy ismert szekvenciát tartalmazó DNS előre meghatározott helyein történő mutációk létrehozására alkalmas technikák jól ismertek, például az M13 primer mutagenezis vagy a PCR-alapú mutagenezis.

Az aminosavhelyettesítések általában egy egyedüli maradékot érintenek, az inzerciók általában körülbelül 1-10 aminosavmaradék nagyságrendűek, és a deléciók körülbelül 1-30 maradékot érintenek. A deléciók vagy inverziók előnyösen szomszédos párokon mennek végbe, azaz 2 maradék deléciói vagy 2 maradék szubsztitúciói. Szubsztitúciók, deléciók, inzerciók vagy ezek tetszőleges kombinációi együttesen alkalmazhatók a végső termék létrehozása céljából. A különböző szialiltranszferázokat kódoló DNS-ben létrehozandó mutációknak nyilvánvalóan nem szabad a leolvasási kereten kívül elhelyezkedniük, és előnyösen nem képeznek komplementerrégiókat, melyek másodlagos mRNS-szerkezeteket hozhatnak létre (75,444A számú európai szabadalom).

A szubsztitúciós változatok azok, melyekben az 1. vagy a 2. ábrán szereplő szekvenciák legalább egy maradékát eltávolították, és egy eltérő maradékot inzertáltak a helyére. Az ilyen szubsztitúciókat általában az 1. táblázatban foglaltaknak megfelelően végeztük, ha a szialiltranszferáz tulajdonságainak végső módosítása kívánatos.

1. táblázat

Eredeti maradék	Helyettesítési példák
Alá	Ser
Arg	Lys
Asn	Gin; His
Asp	Glu
Cys	Ser
Gin	Asn
Glu	Asp
Gly	Pro
His	Asn; Gin
Ile	Leu; Val
Leu	Ile; Val
Lys	Arg; Gin; Glu
Met	Leu; Ile
Phe	Met; Leu; Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp; Phe
Val	He; Leu

A funkciókban vagy az immunológiai azonosságban alapvető változásokat okoz az 1. táblázatban felsoroltaknál kevésbé konzervatív szubsztitúciók szelektálása, azaz azon maradékok szelektálása, melyek jelentősebben eltérnek (a) a szubsztitúció környezetében levő polipeptid gerincszerkezetének, például lemez vagy hélix konformációjának, (b) a célhelyen levő molekula töltésének vagy hidrofobicitásának vagy (c) az oldallánc nagyságának fenntartására kifejtett hatásukban. Azok a szubsztitúciók, melyektől általában azt várjuk, hogy a szialiltranszferáz sajátságaiban a legnagyobb változásokat okozzák, azok, melyekben (a) hidrofilmaradék például szeril vagy treonil kerül hidrofób maradék, például leucil, izoleucil, fenil-alanil, valil vagy alanil helyére (vagy fordítva); (b) egy cisztein vagy prolin kerül bármely más maradék helyére (vagy fordítva); (c) egy elektropozitív oldallánccal rendelkező maradék, például lizil, arginil vagy hisztidil kerül egy elektronegatív maradék, például glutamil vagy aszpartil helyére (vagy fordítva); vagy (d) egy nagy oldalláncú maradék, például fenil-alanil kerül egy oldallánc nélküli például glicin helyére (vagy fordítva).

A szubsztitúciós vagy deléciós változatok egy nagy csoportja magában foglalja a szialiltranszferázok transzmembrán és/vagy citoplazmás régióit. A szialiltranszferáz citoplazmatikus doménje az aminosavmaradékok azon szekvenciája, mely az 1. és 2. ábrán bemutatott startkodonoknál kezdődik, és körülbelül 11 további maradékot tartalmaz. Patkányban és sertésben sorrendben a 10-28 és a 12-27 maradékokról feltételezik, hogy stoptranszfer-szekvenciaként szolgálnak. A patkányban

HU 219 260 Β és sertésben sorrendben a Phe-Val-Arg-Asn és ProMet-Arg-Lys-Lys-Ser-Thr-Leu-Lys maradékokkal bejuttatott konformációs sávok, és az előbbi maradékok elektropozitív jellege az alábbiakban leírt transzmembránrégióval együtt akadályozzák a szialiltranszferáz sejt membránon való átvitelét.

A transzmembrán régiója a sertésszekvenciában körülbelül a 12-27 maradékoknál helyezkedik el (ahol az Alá +1, ahogy az a 2. ábrán látható), és lokációja a patkányszekvenciában ezzel analóg. Ez a régió egy erősen hidrofób dómén, melynek mérete megfelelő a sejtmembrán lipoid kettős rétegének áthidalásához. Feltételezhetően a citoplazmatikus doménekkel együtt működik a Golgi-készülékhez vagy endoplazmás retikulumhoz való rögzítésében.

A citoplazmatikus vagy transzmembrán domének bármelyikének vagy mindegyikének deléciója vagy szubsztitúciója elősegíti a rekombináns kinyerését, annak sejt vagy membrán lipidaktivitás csökkentésével és vízoldhatóságának elősegítésével oly módon, hogy detergensekre nincs szükség a vizes oldatban tartásához. (Lásd például az 5.032.519 számú US szabadalmat, mely leírja az oldható β-galaktozid 2,G-termelését, és mely a hivatkozás révén specifikus részét képezi a szabadalomnak.) Az egyedül a citoplazmás domént érintő deléció a transzmembránszekvencia megőrzése mellett olyan termelését eredményezi, mely detergenssel vihető oldatba. A citoplazmás doméndeléciós sokkal nagyobb valószínűséggel inzertálódik a membránokba, lehetővé téve ezzel enzimatikus aktivitások megcélzását. Előnyösen a citoplazmás vagy transzmembrán doméneket vetjük alá deléciónak, a szubsztituáltak helyett (például az oldható termeléséhez a stoptranszfer-szekvenciához a patkány 2,3-N-ban levő 1-33 aminosavak). A citoplazmás és/vagy transzmembrán (C-T) deléciós vagy szubsztituált szialiltranszferáz közvetlenül szintetizálható rekombináns sejttenyészetben vagy egy jelszekvenciával (előnyösen egy gazdahomológ jel) való fúzióként. Például egy prokarióta expressziós vektor megszerkesztésekor a C-T doméneket deléciónak vetik alá a bakteriális alkalikus foszfatáznak (pp) vagy a hőstabil enterotoxin II vezetőnek kedvezve, és élesztőgombáknál a doméneket élesztőgomba invertáz a-faktor vagy savanyú foszfatázvezetőkre cserélik. Emlőssejt-expressziónál a C-T doméneket emlőssejt virális szekréciós vezető, például herpes simplex gD jelre cserélik. Amikor a szekréciós vezetőt a gazda „felismeri”, a gazda jelpeptidáz képes a C-terminálisán keresztül a C-T deléciós szialiltranszferázhoz fuzionált vezető polipeptid fúziójának hasítására. A C-T deléciónak alávetett szialiltranszferáz előnye, hogy a tenyésztápközegbe kiválasztható. Ez a változat vízoldható, és nem mutat számottevő aktivitást a sejtmembrán lipidjeivel, és így kinyerése a rekombináns sejttenyészetből jelentősen leegyszerűsödik.

Detergensek, mint például nemionos detergensek adagolása felhasználható a membránrögzítő szekvenciát tartalmazó proteinek oldékonnyá tételére, stabilizálására és/vagy biológiai aktivitásuk fokozására. A dezoxikolinsav például egy előnyben részesített detergens, de

Tween, NP-40 és Triton X-100 szintén használhatók, csakúgy, mint más detergensek. A detergens kiválasztását az alkalmazó megítélése határozza meg az adott környezeti tényezőkre és az adott polipeptid(ek)re alapozva.

Szubsztitúciós vagy deléciós mutagenezist alkalmaznak az N- vagy O-kötött glikozilációs helyek eliminálására. Alternatív módon a nem glikozilált szialiltranszferázt rekombináns prokarióta sejttenyészetben termelik. A cisztein vagy más labilis maradékok deléciói szintén kívánatosak lehetnek például a szialiltranszferáz oxidatív stabilitásának növelésekor. A potenciális proteolízishelyek, azaz dibázikus maradékok, mint Arg Arg deléciói vagy szubsztitúciói az egyik bázikus maradék deléciójával vagy glutaminil- vagy hisztidilmaradékokkal való helyettesítésével mennek végbe.

A szialiltranszferáz inzerciós aminosavszekvenciaváltozatai azok, amelyekben a cél szialiltranszferáz előre meghatározott helyére egy vagy több aminosavmaradék beépítése. Az inzerciós változatok legáltalánosabban heterológ proteineknek vagy polipeptideknek a szialiltranszferáz karboxil végéhez való fúziói révén keletkeznek.

A szialiltranszferázt kódoló DNS patkánytól vagy sertéstől különböző forrásokból nyerhető a) egy adott állat különböző szöveteiből - mint például máj vagy állkapocs alatti mirigyek - származó cDNS-könyvtár segítségével, b) a szialiltranszferáz vagy fragmentjei (általában 30 bp-nál nagyobbak) konzervatív homológiarégióit kódoló jelölt DNS-sel történő hibridizációs analízisével a cDNS-könyvtárban található homológ szekvenciák detektálása céljából való elvégzésével, c) a kiónok restrikciós enzimanalízissel való analízisével és a teljes hosszúságú kiónok azonosítása céljából végzett nukleinsavszekvenálással. Amennyiben teljes hosszúságú kiónok nincsenek jelen a könyvtárban, a különböző kiónok megfelelő fragmentjei nyerhetők ki, és a közös restrikciós helyeiknél ligálhatók a teljes hosszúságú klón öszszeállítása céljából.

A találmány által termelt szialiltranszferáz állapotának leírásakor használatos „lényegében mentes... ” vagy „lényegében tiszta” kifejezések azt jelentik, hogy proteintől vagy olyan anyagoktól mentes, melyek általában a szialiltranszferázzal kapcsolatosak, annak természetes in vivő fiziológiai környezetében, mint például amikor a szialiltranszferázt vérből és/vagy szövetekből nyerik extrakcióval és tisztítással. A találmány módszerével termelt szialiltranszferáz nagyobb vagy egyenértékű volt 95% teljes proteinre vonatkoztatott szialiltranszferáznál; egyedüli telített sávot alkotott (Comassie kékkel festve) poliakrilamid gélelektroforézisben; és specifikus aktivitása legalább 500 nmol/mg protein/perc volt.

Az „alapvető hasonlóság” vagy „alapvető azonosság” kifejezések a polipeptidszekvencia vagy nukleinsavszekvencia olyan tulajdonságának leírására szolgálnak a jelen értelmezésben, ahol a polipeptidszekvenciája legalább 70%-ban azonos egy referenciaszekvenciával, és a nukleinsavszekvencia legalább 80%-ban azonos egy referenciaszekvenciával. A szekvenciaazonossági % kiszámításakor a kis deléciók és addíciók figyelmen kívül hagyásával történik, melyek összességé7

HU 219 260 Β ben nem érik el a referenciaszekvencia 30%-át. A referenciaszekvencia részét képezheti egy nagyobb szekvenciának, ahogy az az 1. és 2. ábrán bemutatásra került, azonban a referenciaszekvencia legalább 18 nukleotid hosszúságú polinukleotidok és legalább 6 aminosavmaradék hosszúságú polipeptidek esetében.

Általában prokariótákat használunk a találmányban használt vektorok létrehozásánál a DNS-szekvenciák klónozására. Például az E. coli K12 294-es törzse (ATCC No: 31446) különösen előnyös. Egyéb felhasználható mikrobatörzsek között szerepel az E. coli B (ATOC 15144) és E. coli X1776 (ATCC No: 31537). Ezek a példák bemutatására és nem korlátozására szolgálnak.

Prokariótákat is felhasználhatunk az expresszáláshoz. Az előbb említett törzsek éppúgy felhasználhatók, mint az E. coli W3110 (F~, lambda-, prototróf, ATCC No: 27325) törzse, bacilusok, mint például a Bacillus subtilis és más Enterobacteriaceae családba tartozó baktériumok, mint például Salmonella typhimurium vagy Serratia marcescens és különböző Pseudomonas fajok.

Általában a gazdasejttel kompatibilis fajokból származó promotereket és ellenőrző szekvenciákat tartalmazó plazmidvektorok használatosak ezekkel a gazdákkal. A vektor rendszerint egy replikációs helyet „éppúgy tartalmaz, mint markerszekvenciákat, melyek lehetővé teszik a transzformált sejtek fenotipikus szelekcióját. Az E. coli transzformálására például tipikusan a pBR322-t használtuk, mely egy E. coli-ból nyert plazmid [Bolivár et al., Gene 2, 95 (1977)]. A pBR322 ampicillin- és tetracyclinrezisztencia géneket tartalmaz, és így a transzformált sejtek azonosításának egyszerű lehetőségét biztosítja. A pBR322 plazmid vagy más mikrobiális plazmidoknak szintén tartalmazniuk kell promotert és a rekombináns DNS szerkesztésében általánosan használt ellenőrző részeket, vagy úgy kell módosítani ezeket, hogy tartalmazzák azokat.

A prokarióta gazdákhoz használt megfelelő promoterek például magukban foglalják a β-laktamáz és laktóz promoterrendszereket [Chang et al., Natúré, 275, 615 (1976); és Goeddel et al., Natúré 281, 544 (1979)], az alkalikus foszfatázt, a triptofán (trp) promoterrendszert [Goedder, D. Nucleic Acids Rés. 8, 4057 (1980) és hibrid promotereket, mint például a tac promoter (de Boer, H. PNAS (Amerikai Egyesült Államok) 80, 21-25 (1983)]. Azonban más funkcionális bakteriális promoterek is megfelelőek. Ezek nukleotidszekvenciái általában ismertek, ezáltal a képzett szakember számára lehetővé teszik, hogy működőképesen ligálják azokat a szialiltranszferázt kódoló DNS-hez [Sielbenlist ef al., Cell. 2 (1980)] kötőket vagy adaptereket használva bármely szükséges restrikciós hely előállításához. A bakteriális rendszerekben használatos promoterek szintén tartalmaznak egy, a szialiltranszferázt kódoló DNS-hez működőképesen kapcsolódó Shine-Delgamo (S. D.) szekvenciát.

A prokariótákon kívül eukarióta mikrobák (például) élesztőgomba-tenyészetek is használhatók. A Saccharomyces cerevisiae vagy közönséges sütőélesztő a legáltalánosabban használt eukarióta mikroorganizmus, bár egy sor egyéb törzs is könnyen hozzáférhető. A Saccharomycesben való expresszáláshoz általánosan használt például az YRp7 plazmid [Stinchomb et al., Natúré 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7, 141 (1979); Tschemper et al., Gene 10, 157 (1980). Ez a plazmid már tartalmazza a trpl gént, mely egy szelekciós markért biztosít a triptofánon való szaporodás képességével nem rendelkező mutáns törzsekhez, mint például az ATCC No: 44076 vagy a PEP4-1 (Jones, Genetics, 85, 12 (1977)].

Az élesztőgomba-gazdákhoz való használathoz megfelelő promoterszekvenciák közé tartoznak a 3-foszfoglicerát-kináz promoterek [Hitzeman et al., J. Bioi. Chem. 255, 2073 (1980)], vagy más glikolitikus enzimek [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968) és Holland, Biochemistry 17, 4900 (1978)], mint például enoláz, glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz, hexokináz, piruvát-dekarboxiláz, foszfofruktokináz, glükóz6-foszfát-izomeráz, 3-foszfoglicerát-mutáz, piruvátkináz, triózfoszfát-izomeráz, foszfoglükóz-izomeráz és glükokináz.

Más élesztőpromoterek, melyek indukálható promoterek, azzal a további előnyös tulajdonsággal rendelkeznek, hogy a transzkripciót szaporodási körülmények szabályozzák, ilyenek a következők: alkohol-dehidrogenáz 2, izocitokróm C, savanyú foszfatáz, a nitrogénanyagcseréhez kapcsolódó lebontóenzimek, metallothionein, glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenáz és a maltóz és galaktóz hasznosításért felelős enzimek promoterrégiói. Az élesztőben történő expresszáláshoz használható megfelelő vektorokat és promotereket részletesebben leírják R. Hitzeman et al., a 73,657 A számú Európai Szabadalmi Közleményben. Élesztőgomba-erősítők használata az élesztőgomba-promoterekkel szintén előnyös.

A „szabályozórégió” az eukarióta gének 5’- és 3’végein levő specifikus szekvenciákra vonatkozik, melyek akár a transzkripció, akár a transzláció szabályozásában részt vehetnek. Úgy tűnik, hogy minden eukarióta gén rendelkezik egy AT-gazdag régióval, mely a transzkripció iniciációs helyétől körülbelül 25-30 bázistávolságra upstream irányban helyezkedik el. Egy másik szekvencia, mely a transzkripciós starthelytől 70-80 bázistávolságra upstream irányban helyezkedik el sok génben, a CXCAAT régió, ahol X bármely nukleotid lehet. A legtöbb eukarióta gén 3’-végén található egy AAT AAA szekvencia, mely a pofi A farok mellett az átíródott mRNS 3’-végének jele lehet.

Az emlős gazdasejtekben a vektorokról történő transzkripciót irányító előnyben részesített promoterek különböző forrásokból nyerhetők, például a következő vírusok genomjából: polyoma, Majomvírus 40 (SV40), adenovírus, retrovírusok, hepatitis-β és legelőnyösebben cytomegalovírus vagy heterológ emlőspromoterekből, például β-aktív promoterből. Az SV40 vírus korai és késői promoterei megfelelően előállíthatok az SV40 vírus replikációs fragmentjeként, mely szintén tartalmazza az SV40 virális replikációs origóját [Fiers et al., Natúré, 273, 113 (1978)]. A humán cytomegalovírus

HU 219 260 Β azonnali korai promotere megfelelően előállítható Hind III E restrikciós ífagmentként [Greenaway, P. J. et al., Gene, 18, 355-360, (1982)]. Természetesen a gazdasejtből vagy rokon fajokból származó promoterek szintén használhatók.

Az enkefalinázt kódoló DNS magasabbrendű eukarióták általi transzkripcióját fokozza egy erősítőszekvenciának a vektorba való inzertálása. Az erősítő cisz-ható DNS-elemek, általában 10-300 bp hosszúságúak, melyek a promoter működését a transzkripció növelésének irányába befolyásolják. Az erősítők viszonylag irányultság- és elhelyezkedésfüggetlenek, mivel a transzkripciós egységtől 5’- (Laimins, L. et al., PNAS 78, 993 (1981) és 3’- [Lusky, M. L. et al., Mól. Cell. Bioi. 3, 1108, (1983)] irányban találták, az intronon belül [Baneqi, J. L. et al., Cell. 33, 729, (1983)], valamint megtalálták a kódolószekvencián belül is [Osbome, T. F. et al., Mól. Cell. Bioi. 4, 1293 (1984)]. Jelenleg az emlősgének sok erősítőszekvenciája ismert (globin, elasztáz, albumin, α-fetoprotein és inzulin). Tipikusan azonban egy, az eukarióta sejt vírusából származó erősítőt használnak. A példák magukban foglalják az SV40 erősítőjét a replikációs origó késői oldalán (100-270 bázispár), a cytomegalovirus korai erősítőjét és az adenovírus-erősítőket.

Az eukarióta gazdasejtekben (élesztő, gomba, rovar, növény, állat, ember vagy egyéb soksejtű organizmus maggal rendelkező sejtjei) használt expressziős vektorok szintén tartalmaznak a transzkripció terminációjához szükséges szekvenciákat, melyek befolyásolhatják az mRNS-expressziót. Ezek a régiók poliadenilált szegmensekként íródnak át a szialiltranszferázt kódoló mRNS nem transziáit részében. A nem transziáit 3’-régiók szintén tartalmaznak transzkripciós terminációs helyeket.

Az expressziős vektorok tartalmazhatnak egy szelekciós gént, melyet szelektálható markemek is neveznek. Az emlőssejtekhez megfelelő szelektálható markerek például a következők: dihidrofolát-reduktáz (DHFR), omitin-dekarboxiláz, többszörös drogrezisztencia biokémiai marker, adenozin deamináz, aszparagin-szintetáz, glutamin-szintetáz, timidin-kináz vagy neomicin. Amikor ilyen szelektálható markereket sikeresen emlős gazdasejtbe transzformáinak, a transzformált emlős gazdasejt túléli, ha szelekciós nyomásnak teszik ki. A szelektív rendszereknek két különböző, széleskörűen alkalmazott csoportja van. Az első csoport a sejtek anyagcseréjére és olyan mutáns sejtvonalak használatára alapul, melyekből hiányzik a kiegészített tápközegektől független szaporodás képessége. Két példa erre a CHO DHFR-sejtek és az egér-LTK-sejtek. Ezek a sejtek nem képesek szaporodni tímidin vagy hipoxantin tápközeghez való adagolása nélkül. Mivel ezekből a sejtekből hiányoznak bizonyos, a teljes nukleotidszintézis anyagcsereútjához szükséges gének, nem képesek túlélésre anélkül, hogy a hiányzó nukleotidszintézis anyagcsereutak termékeit egy kiegészített táptalajban biztosítanánk számukra. A tápközeg-kiegészítés egy alternatívája az intakt DHFR vagy TK gén bevitele az adott gént nem tartalmazó sejtekben, ezáltal megváltoztatva azok szaporodásához szükséges (környezeti) igényét. Azok az (egyedülálló) sejtek, melyek nem lettek a DHFR vagy TK génnel transzformálva, nem képesek túlélésre a kiegészítetten tápközegekben.

A második csoport a domináns szelekció, mely egy olyan szelekciós sémára utal, mely tetszőleges sejttípusnál alkalmazható, és nem szükséges hozzá mutáns sejtvonalak használata. Ezen szelekciós sémák tipikusan egy drogot használnak, mely megakadályozza a gazdasejt szaporodását. Azon sejtek, melyek egy új gént tartalmaznak, expresszálhatnak egy drogrezisztenciát hordozó proteint, és túlélhetik a szelekciót. Ilyen domináns szelekciós példák a következő drogokat használják: neomycin [Southern, P. and Berg, P., J. Molec. Appl. Génét. 1, 327 (1982)], mikofenolsav [Mulligan, R. C. and Berg, P., Science, 209, 1422, (1980)] vagy higromycin [Sugden, B. et al., Mól. Cell. Bioi. 5, 410-413 (1985)]. A fenti három példa eukariotikus szabályozás alatt álló bakteriális géneket alkalmaz a megfelelő drog, a G418 vagy a neomycin (genticin), xgpt (mikofenolsav) vagy higromycin elleni rezisztencia hordozására.

Az „amplifikáció” egy, a sejt kromoszomális DNS-én belül található izolált régió növekedésére vagy replikációjára vonatkozik. Az amplifikáció szelekciós ágens használatával, például methotrexát-éval (MTX), mely a DHFR-t inaktiválja, érhető el. Az amplifikáció vagy a DHFR gén többszörös kópiáinak felhalmozódása a DHFR nagyobb mennyiségeinek termelődését eredményezi az MTX nagyobb mennyiségeinek jelenléte ellenére. Az amplifikációs nyomást az endogén DHFR jelenléte ellenére alkalmazzák az MTX egyre növekvő mennyiségeinek a tápközeghez történő adagolása formájában. A kívánt gén amplifikációját egy emlős gazdasejtnek a kívánt fehéijét és a DHFR-t kódoló DNS-t tartalmazó plazmiddal történő kotranszfektálásával érhető el, vagy a kointegrációval létrehozott génamplifikációra utalunk koamplifikációként. Az olyan sejtekre való szelektálással - melyek még nagyobb MTX-koncentráció jelenlétében tudnak csak szaporodni - biztosíthatjuk, hogy a sejt több DHFR-t igényeljen, ezt a szükségletet fedezi a szelekciós gén replikációja. Amíg egy kívánt heterológ proteint kódoló gén kointegrálódik a szelekciós génnek, ezen gén replikációja gyakran eredményezi a kívánt proteint kódoló gén replikációját. Azt az eredményt kapjuk, hogy a kívánt heterológ proteint kódoló gén megnövekedett kópiája, azaz egy amplifikált gén a kívánt heterológ proteinből még többet expresszál.

A magasabbrendű eukariótákban a szialiltranszferázt kódoló vektorok expresszálásához az előnyben részesített megfelelő gazdasejtek a következőket foglalják magukba: SV40-nel (COS-7, ATCC CRL 1651) transzformált majomvese CV1 vonal; humán embrionális vesevonal (293) [Graham, F. L. et al., J. Gén. Virol. 36, 59 (1977)]; fiatal hörcsögvesesejtek (BHK, ATCC CCL 10); kínai hörcsög óvárium-sejtek-DHFR [CHO, Urlaub and Chasin, PNAS (Amerikai Egyesült Államok) 77, 4216 (1980)]; egér sertoli sejtek (TM4, Mather, J. P. Bioi. Repród. 23, 243-251 (1980); ma9

HU 219 260 Β jomvesesejtek (CV1 ATCC CCL 70); afrikai zöldmajom-vesesejtek (VERO-76, ATCC CRL 1587); humán cervikális karcinómasejtek (HELA, ATCC CLL 2); nyúlvesesejtek (MDCK, ATCC CCL 34); buffalopatkánymájsejtek (BRL 3A, ATCC CRL 1442); humán tüdősejtek (W138, ATCC CCL 75); humán májsejtek (Heep G2, HB 8065); egéremlőtumor (MMT 060562, ATCC CCL51); és TRI-sejtek (Mather, J.P. et al., Annals N. Y. Acad. Sci. 383, 44-46 (1982); baculovírussejtek.

A „transzformáció” a DNS egy organizmusba oly módon való bejuttatását jelenti, hogy a DNS replikálható vagy egy extrakromoszomális elemként vagy kromoszomális integrációval. Hacsak másként nem jeleztük, az itt alkalmazott gazdasejtek transzformációjára szolgáló módszer Graham, F. és Van dér Eb, A., [Virology 52, 456-457 (1973)] módszere. Azonban a DNS-sejtekbe való bejuttatására más módszerek is, például a nukleáris injektálás vagy a protoplasztfüzió is alkalmazható. Ha prokarióta sejteket vagy jelentős sejtfalszerkezeteket tartalmazó sejteket használunk, a transzfekció előnyben részesített módszere a kalcium-kloridot felhasználó kalciumos kezelés, melyet Cohen, F. N. et al., proc. Natl. Acad. Sci. Amerikai Egyesült Államok 69, 2110 (1972) írtak le.

A megszerkesztett plazmidok helyes szekvenciájának megerősítését szolgáló analízishez a ligációs keverékeket az E. coli KI 2 294-es törzsének (ATCC 31446) transzformálására használjuk, és a sikeres transzformánsokat ampicillin- vagy tetraciklinrezisztenciával szelektáljuk ahol lehetséges. A transzformánsokból származó plazmidokat előállítjuk, restrikciós és/vagy Messing et al., Nucleic Accids Rés. 9, 309 (1981) vagy Maxam et al., Methods in Enzymology 65, 449 (1980) módszerével való szekvenálással analizáljuk.

A gazdasejtek a találmány expressziós vektoraival transzformálhatok és tenyészthetők hagyományos nutrien tápközegben, melyet úgy módosítunk, hogy megfelelő legyen a promoterek indukálásához, a transzformánsok szelektálásához vagy a gének amplifikálásához. A tenyésztés körülményei, mint például a hőmérséklet, pH és a hasonlók, olyanok, mint amiket korábban használtunk az expresszióhoz szelektált gazdasejtek esetében, egyértelmű lesz a tudomány e területén átlagosan képzett szakember számára.

A „transzfekció” egy expressziós vektor gazdasejt általi felvételére vonatkozik attól függetlenül, hogy expresszálódik-e bármilyen kódolószekvencia. A tudomány e területén átlagosan képzett szakemberek számára számos transzfekciós módszer ismert, például cApo₄ és az elektroporáció. A sikeres transzfekció általában akkor ismerhető föl, ha a vektor működésének bármilyenjele a gazdasejtben megjelenik.

A következő példák megértésének könnyítéséhez bizonyos gyakran előforduló módszereket és/vagy fogalmakat leírunk.

A „plazmidokat” kisbetűs p jelöli, melyet nagybetűk vagy számok előznek meg és/vagy követnek. A kiindulási plazmidok vagy beszerezhetők a kereskedelemben, vagy nyilvánosan beszerezhetők korlátlan módon, vagy beszerezhető plazmidokból előállíthatok publikált eljárásokkal összhangban. Továbbá az itt leírt plazmidokkal egyenértékű plazmidok ismertek a tudomány e területén, és egyértelműek lesznek a tudomány e területén átlagosan képzett szakember számára.

A DNS „emésztése” a DNS katalitikus hasítására utal olyan restrikciós enzimek felhasználásával, melyek a DNS csupán bizonyos szekvenciáinál hatnak. A találmányban használt különböző restrikciós enzimek beszerezhetők a kereskedelemben, ezek reakciókörülményei, a kofaktorok és egyéb szükségletek a tudomány e területén átlagosan képzett szakemberek számára ismert módon kerültek alkalmazásra. Analitikai célokra tipikusan 1 pg plazmidot vagy DNS-fragmentet használunk körülbelül 2 egység enzimmel körülbelül 20 pl pufferoldatban. A DNS-ffagmentek plazmidszerkezetekhez való izolálásához tipikusan 5-50 pg DNS-t emésztetünk 20-250 egység enzimmel nagyobb térfogatban. A megfelelő pufferek és szubsztrátok mennyiségeit az egyes restrikciós enzimek esetében a gyártók részletezik. Általában körülbelül 1 óra az inkubációs idő és 37 °C az inkubációs hőmérséklet, de ez változhat a szállítók javaslataitól függően. Az emésztés után a reakciót közvetlenül poliakrilamidgélen elektroforézisnek vetjük alá a kívánt fragment izolálása céljából.

A hasított fragmentek méretszeparálását a Goeddel,

D. et al., Nucleic Acids Rés., 8, 4057 (1980) által leírt 8%-os poliakrilamidgélen végezzük.

A „defoszforiláció” a bakteriális alkalikus foszfatázzal (BAP) való terminális 5’-foszfatázok eltávolítására utal. Ez az eljárás kivédi a DNS-ffagment két restrikciósán hasított végének „cirkularizációját” vagy egy zárt hurok képződését, mely megakadályozná egy másik DNS-ffagment restrikciós helyen való inzertációját. A defoszforilációhoz hagyományosak az eljárások és a reagensek [Maniatis, T. et al., Molecular Cloning pp. 133-134 (1982)]. A BAP-ot használó reakciókat 50 mM Tris-ben végezzük el 68 °C hőmérsékleten az enzimkészítményben esetleg jelen levő exonukleázok aktivitásának gátlása céljából. A reakciót 1 órán keresztül futtatjuk. A reakciót követően a DNS-fragmentet géltisztítjuk.

Az oligonukleotid vagy egyszálú polidezoxinukleotidra vagy két komplementer polidezoxinukleotidszálra vonatkozik, melyek kémiailag szintetizálhatok. Az ilyen szintetikus oligonukleotidok nem rendelkeznek 5’-foszfáttal, és így nem kötődnek más oligonukleotidhoz anélkül, hogy egy ATP-vel foszfátot adnánk hozzá kináz jelenlétében. Egy szintetikus oligonukleotid kötődni fog egy olyan fragmenthez, melyet nem defoszforiláltunk.

A „ligálás” olyan eljárásra utal, melynek során foszfodiészter kötések jönnek létre két kétszálú nukleinsavfragment között (Maniatis, T. et al., Id p. 146). Hacsak másként nem biztosítjuk, a ligálás elvégezhető ismert pufferekkel és körülmények között 10 egység T4 DNS ligázt („ligáz”) használva 0,5 pl megközelítően ekvimoláris mennyiségű ligálandó DNS-fragmentenként. A kívánt kódoló- és szabályozószekvenciákat

HU 219 260 Β tartalmazó megfelelő vektorok megszerkesztéséhez standard ligálási technikát használunk. Az izolált plazmidokat vagy DNS-fragmenteket hasítjuk, farokkal ellátjuk, és újra ligáljuk a kívánt formában az igényelt plazmid létrehozásához.

A „feltöltés” vagy a „tompa végűvé tétel” olyan eljárásra utal, mellyel a restrikciós enzimmel hasított nukleinsav egyszálú végét a kohéziós terminusban kétszálúvá tesszük. Ez eltávolítja a kohéziós terminust, és tompa véget hoz létre. Ez az eljárás egy sokoldalú eszköz egy restrikciós hasítású vég - mely kohéziós lehet a csupán egy vagy csak néhány restrikciós enzimmel létrehozott végek esetében - bármely tompa végűén hasító restrikciós endonukleázzal kompatibilis terminussá való alakításában vagy más feltöltött kohéziós terminusokkal. Tipikusan a tompa végűvé tételt úgy érjük el, hogy 2-15 pg cél-DNS-t inkubálunk 10 mM MgCl₂, 1 mM ditiotreitol, 50 mM NaCl, 10 mM Tris (pH 7,5) puffer elegyével körülbelül 37 °C hőmérsékleten 8 egység DNS-polimeráz I Klenow-fragmentjének, valamint a négy dezoxinukleotid-trifoszfát 250 μΜ mennyiségeinek jelenlétében. Általában az inkubációt 30 perc elteltével leállítjuk fenolos és kloroformos extrakcióval és etanolos kicsapatással.

A leírt szekvenciáknak megfelelő polinukleotidok vagy az azokkal komplementer részek felhasználhatók hibridizációs próbákként a megfelelő csíravonalgének azonosításához és/vagy izolálásához. Az ilyen polinukleotidok felhasználhatók hibridizációs próbákként a cDNS- és a genomkönyvtárak szkrínelésére, cDNS-ek és a találmány szialiltranszferáz-szekvenciáival szerkezetileg és/vagy evolúcionárisan kapcsolatos polipeptideket kódoló gének izolálására. Másik lehetőségként az ilyen polinukleotidok a csíravonalgén-szekvenciák vagy a polimeráz láncreakció (PCR) révén rokon szekvenciák amplifikációs primereiként szerepelhetnek.

A további szialiltranszferáz cDNS-típusok azonosítására és izolálására használt hibridizációs próbákat az

1. és a 2. ábrán bemutatott nukleotid- és levezetett aminosavszekvenciákra alapozva tervezzük meg. A hibridizációs próbák, melyeket tipikusan egy radioizotóp beépítésével jelölünk meg, tartalmazhatnak egy vagy több olyan degenerált oligonukleotidcsoportot, melyek kódolják a konzervatív régió egészét vagy csak egy részét, mely konzervatív régió megfelel a sertés a-2,3O-szialiltranszferázban levő (1. ábra) 134-189 aminosavmaradékok között áthidaló 55 maradék szegmentnek. Különösen a heptapeptid motívum, az -Asp-ValGly-Ser-Lys-Thr-Thr, konzerválódott erősen, és a hibridizációs próbák tartalmaznak ezen motívumot vagy ezen motívum olyan variánsait kódoló degenerált oligonukleotidokat, melyekben egy vagy két aminosav módosult oly módon, hogy a heptapeptid 4 vagy 5 aminosavja megmarad. A heptapeptid motívum egyedüli vagy kettős aminosav szubsztitúciós variánsait kódoló degenerált oligonukleotidpróbák hasznosak lehetnek rokon szialiltranszferáz cDNS-típusok szkrínelésében. A degenerált oligonukleotidokon túl a klónozott polinukleotidok fragmentjei, mint amiket az 1. és a 2. ábrán bemutattunk, szintén alkalmazhatók próbákként; előnyben részesítjük, ha az ilyen próbák átívelik a heptapeptid motívumot, és ahol kívánatos, a konzervált 55 aminosavmaradék szegmentet fent leírtuk.

A szialiltranszferázt kódoló genom vagy cDNS kiónok klónkönyvtárakból izolálhatok hibridizációs próbák felhasználásával, melyeket az 1. és a 2. ábrán bemutatott szialiltranszferáz-nukleotidszekvenciák alapján terveztünk meg. Ahol egy cDNS-klón kívánatos, ott előnyben részesítjük a szialiltranszferázt expresszáló sejtből származó cDNS-t tartalmazó ki ónkönyvtárakat.

Másik lehetőségként az 1. vagy a 2. ábrán bemutatott szekvenciák egészének vagy egy részének megfelelő szintetikus polinukleotidszekvenciák megszerkeszthetők oligonukleotidok kémiai szintézisével is. Továbbá az 1. és 2. ábrán leírt szekvenciaadatokra alapozva primereket felhasználó polimeráz láncreakció (PCR) alkalmazható a genom-DNS-ből, az mRNS-poolokból vagy a cDNSklón-könyvtárakból származó DNS-fragmentek amlifikálására. A PCR-módszert a 4,683,195 és a 4,683,202 számú US szabadalmi leírások írják le. Továbbá az 1. és a

2. ábra szekvenciaadataira alapozott prímért és egy második, nem ezen szekvenciaadatokra épülő prímért használó PCR-módszer is alkalmazható. Például egy, a poliadenilációs szegmenttel homológ vagy komplementer második primer is használható.

Nyilvánvaló lesz a tudomány e területén képzett szakember számára, hogy a nukleotid szubsztitúciók, a deléciók és az addíciók beépülhetnek a találmány polinukleotidjaiba. Azonban az ilyen nukleotidszubsztitúciók, -deléciók és -addíciók nem lenne szabad, hogy alapvetően tönkretegyék a polinukleotid azon képességét, hogy az 1. és 2. ábrán bemutatott egyik polinukleotidszekvenciához hibridizáljanak olyan körülmények között, mely megfelelő szigorúságú ahhoz, hogy specifikus hibridizációt eredményezzen.

Az 1. és a 2. ábrán bemutatott nukleotid- és aminosavszekvenciák képessé teszik a tudomány e területén képzett szakembert arra, hogy a kódolt polipeptidszekvencia egészének vagy egy részének megfelelő polipeptideket hozzon létre. Az ilyen polipeptidek prokarióta vagy eukarióta gazdasejtekben termeltethetők a teljes hosszúságú szialiltranszferáz(oka)t vagy fragmentjeit, vagy analógjait kódoló polinukleotidok expresszálásával. Másik lehetőségként az ilyen polipeptidek kémiai módszerekkel szintetizálhatok, vagy in vitro transzlációs rendszerekkel termeltethetők a transzláció irányítására polinukleotid templátot használva. A rekombináns gazdákban való heterológ proteinek expresszálására szolgáló módszerek, a polipeptidek kémiai szintézise és az in vitro transzláció jól ismertek a tudomány e területén, és részletes leírásra kerültek az alábbi művekben: Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), 2nd ed., Cold Spring Harbor, N. Y. és Berger and Kimmel, Methods in Enzymology Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, CA.

A szialiltranszferázok fragmentjei előállíthatók a tudomány e területén képzett szakemberek által. A fragmentek előnyben részesített amino- és karboxiterminusai vagy analógjai a struktúr- és/vagy funkcionális

HU 219 260 Β domének határaihoz közel találhatók, például egy enzimaktív helyhez közel. Az alapjában véve egy vagy több funkcionális domént tartalmazó fragmentek heterológ polipeptidszekvenciákhoz füzionáltathatók, ahol a kapott fúziós protein mutatja a funkcionális tulajdonságo(ka)t, mint például egy enzimaktivitást, melyet a fragment biztosít. Másik lehetőségként a deléciós polipeptidek, ahol egy vagy több funkcionális domént elhagytunk, tulajonságveszítést mutatnak, melyet normálisan a hiányzó fragment biztosított.

A baculovírus eukariótagén-expresszió az egyik leghatékonyabb eszköz a klónozott génekből történő funkcionálisan aktív protein nagy mennyiségeinek előállítására [Summers, M. és Luckow, V. (1988), Bio/Technology 6: 47], melyet a hivatkozás révén beépítettünk a találmányba. A találmány szialiltranszferáz polipeptidjei klónozott polinukleotidokból is előállíthatok a baculovírus expressziós rendszerben való expresszió révén (Invitrogen Corporation, San Diego, CA).

A tipikus szialiltranszferázt és rekombináns expressziós termékét az alábbi protokollt használva állíthatjuk elő:

1. Sertésmáj-szialiltranszferázt tisztítottunk egyértelmű homogenitásig.

2. A sertés-szialiltranszferáz N-terminális aminosavszekvenciáját meghatároztuk.

3. Az NH₂ terminális szekvenciához közel levő 18 aminosavnak megfelelő oligonukleotidpróbákat kémiailag szintetizáltuk.

4. cDNS-könyvtárakat szerkesztettünk meg lambdagt 10-ben a következőket használva: a) sertésállkapocs alatti mirigyéből származó véletlenszerűen príméit poliA+-ban gazdag mRNS-t, b) patkánymájból származó oligo dT príméit poliA+-ban gazdag mRNS-t, és c) patkányagyból származó oligo dT príméit poliA+-ban gazdag mRNS-t.

5. A szialiltranszferáz aminosavszekvenciáihoz való kodonokkal komplementer radiojelölt szintetikus dezoxiribonukleotid-poolt használtunk az alábbiakban leírt módon, mint például:

a) 5’-ACC CTG AAG CTG CGC ACC CTG CTG GTG CTG TTC ATC TTC CTG ACC TCC TTCTT-3’

b) 5’-GAC GTC GGG AGC AAG ACC

ACC-3’

6. A véletlenszerűen príméit sertésállkapocs alatti könyvtárat a polinukleotidkináz és ³²p-ATPvel jelölt hosszú és rövid, kémiailag szintetizált oligonukleotidpróbákkal szkríneltük. A kettős pozitív plakkokat tisztítottuk, és az inzerteket szekvenáltuk.

7. Egy ³²P jelölésű inzertet használtunk az oligo dT primelésű sertésállkapocs alatti könyvtárainak újraszkrínelésére.

8. A sertés-szialiltranszferáz teljes olvasási keretét két átfedőklónból nyertük. A patkánymájból és -agyból származó cDNS tartalmazta a konzervatív homológiarégiót, ahogy azt a kapott klón DNS-szekvencia-analízisével meghatároztuk.

9. A sertés-szialiltranszferázt kódoló teljes hosszúságú cDNS-t egy plazmidban levő két átfedőklónból hoztuk létre és szekvenáltuk. Észre kell venni, hogy az 1. és a 2. ábra DNS-szekvenciáinak leírása lehetővé teszi a szialiltranszferáz cDNS konzervatív homológiarégiójából származó próbák előállítását, így jelentősen egyszerűsítve és megnövelve az ezen vagy más fajokból, vagy ezekből vagy más fajok szöveteiből származó cDNS- vagy genomkönyvtárak „próbálását”, lehetővé téve, hogy kihagyjuk a szialiltranszferáz tisztítását, szekvenálását és a próba-poolok előállítását.

10. A sertés- és patkány-szialiltranszferázt kódoló teljes hosszúságú cDNS-t ezután egy expressziós hordozóba juttattuk be, melyet egy megfelelő gazdasejt transzformálására használtunk, melyet ezután a kívánt szialiltranszferáz termelése céljából tenyésztettünk.

11. A korábban leírt eljárásnak megfelelően előállított, biológiailag aktív érett szialiltranszferáz rendelkezhet alternatív formákkal, ahogy azt a 4. és 5. ábrán bemutattuk, mely a 45 kDa és 48 kDa molekulatömegű megvalósulásokat eredményezi.

A találmány polinukleotidjai és rekombinánsan előállított szialiltranszferáz polipeptidjei és fragmentjei vagy aminosav helyettesített variánsai előállíthatok az 1., 2., 3., 5., 7. és 8. ábrán biztosított szekvenciaadatok alapján, vagy a találmány módszereivel izolált új szialiltranszferáz-cDNS-ekből nyert szekvenciaadatokra alapozva. A polipeptidek és rekombinánsan előállított szialiltranszferáz polipepetidek előállítását a tudomány által ismert és Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989), Cold Spring Harbor, N. Y. és Berger és Kimmel, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc. San Diego, CA. által leírtak szerint végeztük (az említett hivatkozások részét képezik a találmánynak). A polinukleotidszekvenciák gazdákban expresszálhatók, miután a szekvenciákat „működőképesen hozzákötöttük” (azaz úgy pozícionáltuk, hogy biztosítsák a funkcióját) egy expressziós szabályozószekvenciához oly módon, hogy a polinukleotidszekvencia transzkripciója a transzkripció megfelelő körülményei alatt forduljon elő.

A „specifikus hibridizáció” a találmány szerinti használatban egy próbapolinukleotid (például a találmány egy polinukleotidja, mely szubsztitúciókat, deléciókat és/vagy addíciókat tartalmazhat) és egy specifikus polinukleotid (például egy komplementerszekvenciával rendelkező polinukleotid) közötti hibridek képződését jelenti, ahol a próbák előnyben részesítik a specifikus célhoz való hibridizálódást oly módon, hogy például egy egyszeri sáv azonosítható az eukarióta sejtekből előállított RNS Northem-blot analízisével, mely sejtek tartalmazzák a cél-RNS-t és/vagy egy egyedüli fő PCR-terméket nyerünk, ha a próbapolinukleotidot használjuk PCR-primerként. Néhány esetben egy célszekvencia lehet jelen egynél több célpolinukleotid-típusban (azaz egy adott célszekvencia előfordulhat egy szialiltranszferáz géncsalád több tagjában, vagy alternatív módon kapcsolt RNS-ek íródnak át ugyanezen génből). Egyértelmű, hogy az optimális hibridizációs körülmények attól függően változnak, hogy milyen a szek12

HU 219 260 Β vencia összetétele, és a próbá(k) és cél(ok) hosszúsága és a módszert alkalmazó választott kísérleti módszerétől. Különböző útmutatók használhatók a megfelelő hibridizációs körülmények szelektálására (lásd, Maniatis et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual (1989), 2nd ed., Cold Spring Harbor, N. Y. és Berger and Kimmel, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc. San Diego CA., melyek a hivatkozás révén részét képezik a találmánynak.

Az „antisense polinukleotidok” olyan polinukleotidok, melyek 1) az 1. és a 2. ábrán bemutatott szekvenciák és/vagy a találmány módszerével izolált új szialiltranszferáz-cDNS-ekből nyert szekvenciák egészével vagy egy részével komplementerek és 2) melyek specifikusan hibridizálódnak egy komplementer célszekvenciához. Az ilyen komplementer antisense polinukleotidok magukban foglalhatnak nukleotid-szubsztitúciókat, -addíciókat, -deléciókat vagy -transzpozíciókat oly módon, hogy a fontos célszekvenciához (az 1. és 2. ábrának megfelelő) specifikus hibridizálódás megmaradjon a polinukleotid funkcionális tulajdonságaként. A komplementer antisense polinukleotidok magukban foglalnak oldható antisense RNS- vagy DNS-oligonukleotidokat, melyek specifikusan hibridizálódnak egyes szialiltranszferáz-mRNS-típusokhoz vagy egy szialiltranszferáz-mRNS-család több tagjához, és megakadályozzák az mRNS-típusok transzkripcióját és/vagy a kódolt polipeptid transzlációját [Ching et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Amerikai Egyesült Államok 86:10006-10010 (1989); Broder et al., Ann. Int. Med. 113: 604-618 (1990); Loreau et al., FEBS Letters 174 : 53 - 56 (1990); Holcenberg et al., W091/11535; U. S. S. N. 07/530,165 („New humán CRIPTO gene”); WO91/09865; WO91/04753; WO90/13641 és EP 386563, melyek mindegyike része a találmánynak a hivatkozás révén.] Az antisense polinukleotid így gátolja a kódolt polinukleotid(ok) termelését. Ebből a szempontból azok az antisense polinukleotidok, melyek gátolják a transzkripciót és/vagy egy vagy több szialiltranszferáz transzlációját megváltoztathatják egy sejt kapacitását és/vagy specifitását a polipeptidek glikozilálásával kapcsolatban.

Az antisense polinukleotid egy heterológ expressziós kazettából is termelhető egy transzfektáns sejtben vagy transzgenikus sejtben, mint amilyenek a transzgenikus pluripotens vérképző törzssejtek, melyeket egy egyén vérképző törzssejt populációja egészének vagy egy részének helyreállítására használunk. Másik lehetőségként az antisense polinukleotidok tartalmazhatnak oldható oligonukleotidokat, melyeket a külső környezethez adunk hozzá, vagy tenyésztápközegben in vitro, vagy a keringési rendszerbe vagy az intersticiális folyadékba in vivő. A külső környezetben jelen levő oldható antisense polinukleotidokról kimutatták, hogy bejuthatnak a citoplazmába, és gátolják specifikus mRNS-típusok transzlációját. Néhány megvalósulásban az antisense polinukleotidok tartalmaznak metilfoszfonát-egységeket, alternatív módon foszforortiolátok vagy O-metil-ribonukleotidok használhatók és kiméra oligonukleotidok szintén használhatók [Dagle et al., (1990) Nucleic Acids Rés. 18 : 4751], Néhány alkalmazásban az antisense oligonukleotidok tartalmazhatnak poliamid nukleinsavakat [Nielsen et al., (1991) Science 254: 1497], Az antisense polinukleotidokkal kapcsolatos általános módszerekhez lásd Antisense RNA and DNS (1988), D. A. Méltón, ed. Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor, N. Y.

Az egy vagy több szekvenciával komplementer antisense polinukieotidokat felhasználják rokon mRNS-típusok transzlációjának gátlására, így csökkenést okoznak a megfelelő kódolt polipeptid mennyiségében. Az ilyen antisense polinukleotidok terápiás funkciót biztosíthatnak egy vagy több szialiltranszferáz in vivő képződésének gátlásával.

Egy szialiltranszferáz transzgén egy vagy több integrált kópiáját magában foglaló transzgenikus állat hozható létre. A szialiltranszferáz transzgének olyan polinukleotidok, melyek egy funkcionális promoterhez működőképesen kapcsolódó szialiltranszferáz proteint vagy ffagmentet kódoló polinukleotidszekvenciát tartalmaznak, melynek kötődik egy szelektálható markerszekvenciához, mint amilyen a G-418 rezisztenciagén.

Genetikai manipulációt alkalmazva lehetőség van transzgenikus modellrendszerek és/vagy teljes sejtrendszerek kifejlesztésére, melyek egy szialiltranszferáz transzgént tartalmaznak például drogok szkrínelésére és a droghatékonyság értékelésére szolgáló modellrendszerekhez való felhasználásban. Továbbá az ilyen modellrendszerek eszközt biztosítanak a szialiltranszferáz metabolizmus alapjául szolgáló biokémia meghatározására, mely így az ésszerű drogtervezéshez és a kísérleti teszteléshez biztosít alapot.

Transzgenikus állatok létrehozására irányul a megközelítés, ha mutációt okozunk a kívánt génen homológ rekombinációval embrionikus törzs (ES) sejtvonalban in vitro, melyet a módosított ES sejtvonalgazda blasztocisztába való mikroinjektálása követ, majd pedig egy mostohaanyában történő inkubálás [lásd Frohman and Martin (1989) Cell. 56:145], Másik lehetőségként a mutált gén vagy egy részletének egy egysejtű embrióba való mikroinjektálási technikáját egy mostohaanyában való inkubálás követheti. Különböző transzgenikus állatok alkalmazhatók, különösen azok, melyek egy természetesen előforduló szialiltranszferáz proteint vagy ennek egy ffagmentjét expresszálják. Másik lehetőségként kívánságra olyan transzgenikus állatok is létrehozhatók, melyek a mutáció révén megváltoztatott (például mutagenizált) szialiltranszferáz protein(eke)t kódoló transzgéneket hordoznak, mely proteinek rendelkezhetnek vagy nem rendelkeznek enzimatikus aktivitással. A transzgenikus állatok előállítására szolgáló további módszerek ismertek a tudomány e területén.

Másik lehetőségként helyirányította mutagenezis és/vagy génkonverzió használható egy génallél in vivő mutáltatásához, akár endogén, akár transzfektált, úgyhogy a mutáltatott alléi egy variáns szialiltranszferázt kódol.

Másik lehetőségként homológ rekombináció használható egy szialiltranszferáz-szekvencia gazdagenom13

HU 219 260 Β jának egy specifikus helynél való inzertálására, például egy megfelelő gazda szialiltranszferáz lokuszára. A homológ rekombináció egy másik típusában egy vagy több gazdaszekvenciát helyettesítünk. Például egy gazda szialiltranszferáz alléit (vagy annak egy részét) helyettesítjük egy mutált szialiltranszferáz-szekvenciával (vagy annak egy részével). Az ilyen génhelyettesítési módszereken túl homológ rekombináció alkalmazható egy szialiltranszferázt (vagy annak egy részét) kódoló polinukleotid egy, a gazda szialiltranszferáz lokuszától eltérő specifikus helyére való eljuttatáshoz. Homológ rekombináció használható transzgenikus, nem humán állatok és/vagy sejtek termelésére, melyek magukban foglalják a mutáltatott szialiltranszferáz alléleket. A génbejuttatás felhasználható egy vagy több endogén szialiltranszferáz gén szétszakítására vagy inaktívvá tételére; ezeket az úgynevezett „kiütött” transzgenikus géneket leírták a tudomány e területén más génekkel kapcsolatban [WO91/10741; Kuhn et al., (1991) Science 708: 707].

A következő példák csupán illusztratív jelleggel mutatják be a találmány ismert eljárásait, és nem a találmány korlátozásaként kell értelmezni őket. Az összes irodalmi hivatkozás határozottan részét képezi a találmánynak.

1. példa

A sertés-szialiltranszferáz tisztítása

Az a-2,3-O-szialiltranszferáz két formájának tisztítása

Az a-2,3-O-szialiltranszferázt a korábban leírt két eljárás kombinációját használva tisztítottuk [Sadler, J.

E. et al., J. Bioi. Chem. 254, 4434-4443 (1979) és Conradt, H. S. et al., in Sialic Acids 1988 Proceedings of the Japanese-German Symposium on Sialic Acids (Schauer and Yamakawa, eds.) pp. 104-105 Verlag Wissenschaft and Bildung, Kiél (1988)]. Az enzimet egy sertésmáj Triton X-100 extraktumból tisztítottuk affinitáskromatográfiával CDP-hexanolamin-agaróz három egymást követő oszlopán. Az első és a harmadik tisztítási lépés elúciós profilját sorrendben a 3. és a 4. ábra mutatja. A 3. ábra azt mutatja, hogy két szialiltranszferáz-aktivitási csúcsot figyeltünk meg az első affinitási oszlop elúciós profiljában. Ezt a két csúcsot az A és B jelzésű poolok frakcióinak kombinálásával szeparáltuk, azt találtuk, hogy ez a két pool később feldúsult az a-2,3-O-szialiltranszferáz két eltérő molekulatömegű formájával.

Az egyes poolokon végzett affinitást tisztítás második körében a sertésmájban jelen levő szennyező a-2,6 szialiltranszferáz legnagyobb mennyiségét eltávolítottuk [Sadler, J. E. et al., J. Bioi. Chem. 254,4434-4443 (1979)]. Az affinitást kromatográfia harmadik lépése után az oszlopfrakciókat analizáltuk, és az egyes frakciók, úgy tűnik, feldúsultak az a-2,3-szialiltranszferáz 48 kDa (4A. ábra 4-6 frakciók) vagy 45 kDa (4B. ábra, 2-6 frakciók) molekulatömegű formáiban. Ezt a két proteintípust jelöltük sorrendben A és B formának. A csúcsfrakciók specifikus aktivitása mindkét oszlopnál 8-10 egység/mg protein volt. A 4. ábra A oszlopának 6-os frakciójában látható erős sáv (körülbelül kDa) nem a-2,3-szialiltranszferáz, mivel ez képviseli az A és a B poolokban is a szennyeződések fő részét a korábbi oszlop után, mivel a végső affinitáskromatográfiai lépésnél hiányzott az enzimatikus aktivitás.

A szialiltranszferáz-aktivitást laktóz és/vagy alacsony molekulatömegű fagyásgátló glikoproteinnel (szubsztrátként) vizsgáltuk [Sadler, J. E. et al., J. Bioi. Chem. 254, 4434-4443, (1979)]. Az enzimet sertésmájból a leírt módszereket követve tisztítottuk [Sadler, J. E. et al., J. Bioi. Chem. 254, 4424-4443, (1979)] és Conradt, H. S. et al., in Sialic Acids 1988 Proceedings of the Japanese-German Symposium on Sialic Acids (Schauer and Yamakawa, eds.) pp. 104-10, Verlag Wissenschaft and Bildung, Kiél (1988) bizonyos módosításokkal. Röviden 2 kg májat homogenizáltunk pufferben, és a membránokat a leírtak szerint állítottuk elő [Sadler, J. E. et al., J. Bioi. Chem 254, 4434-4443, (1979)]. A membránokat háromszor extraháltuk pufferrel [Conradt, H. S. et al., in Sialic Acids 1988 Proceedings of the Japanese-German Symposium on Sialic Acids (Schauer and Yamakawa, eds.) pp. 104-10, Verlag Wissenschaft and Bildung, Kiél (1988)], és az extraktumot egy 1,5 1 CDP-hexanolamin-agarózoszlopon (1 oszlop) (16 pmol/ml) engedtük át. Miután az oszlopot 3 1 B pufferrel mostuk, az oszlopot B pufferben 0,05-1,0 KC1 (2,5 1x2,5 1) lineáris gradiensével eluáltuk. Az a-2,3-szialiltranszferázt tartalmazó frakciókat az A és B poolokba gyűjtöttük össze, melyek sorrendben a csúcs fő részét és az elhúzódó végeket képviselték. A poolokat B pufferrel szemben dializáltuk, és CDP-hexanolamin-agarózon való affinitáskromatográfia egy újabb körének vetettük alá (IIA oszlop és IIB). Az A poolhoz egy 150 ml-es oszlopot használtunk, a B poolhoz egy 30 ml-est; az I oszlopból származó két készítményt (összesen 4 kg májból) helyeztünk ugyanarra az oszlopra a II. lépésben. Az a-2,3-szialiltranszferázt 0-2,0 mM CTP (750 ml, A pool, 150 ml B pool) gradiensével eluáltuk B pufferben. Az a-2,3-szialiltranszferáz-aktivitással rendelkező frakciókat sótalanítottuk G50 Sephadexen, pufferben ekvilibráltuk, és az aktív frakciókat 1,0 ml CDP-hexanolamin-agarózoszlopokra helyeztük (III. lépés), melyet 0,1-1,0 mM CTP fokozatos gradienseivel eluáltunk (20 lépés, mindegyik 1,0 ml) B pufferben (lásd a 2. ábrát). Az aktív frakciókat összegyűjtöttük, és a két oszlopból származó vegyített hozam 2,5 egység volt, 8-10 egység/mg protein specifikus aktivitással.

A 48 kDa és 45 kDa szialiltranszferáz peptideket (lásd a 4. ábrát) SDS-poliakrilamidgéleken feloldottuk [Leammli, U. K. Natúré, 227, 680-685 (1970)], PVDF membránra elektroeluáltuk (Immobilon Transfer, Millipore), és Comassie Brilliant Blue-val (Sigma) megfestettük. A szialiltranszferázsávokat kimetszettük, és a kötött peptideket Edman-degradációval végzett NH₂-terminális aminosavszekvencia-analízisnek vetettük alá Applied Biosystems 475A proteinszekvenálót használva.

A szialiltranszferáz 48 kDa (A forma) és 45 kDa (B forma) formáiban gazdag frakciókat poliakrilamidgélelektroforézisnek vetettük alá (PAGE), PVDF membránra lenyomatoltuk, és NH₂-terminális szekvenálással

HU 219 260 Β analizáltuk. Az egyes peptidekből 22 aminosavmaradékból álló szekvenciát nyertünk (5. ábra). Az A forma NH₂-terminális szekvenciája tartalmazott egy hidrofób aminosavszakaszt, mely megegyezik Sadler et al. [J. Bioi. Chem. 254, 4434-4443 (1979)] és Wescott et al. [J. Bioi. Chem. 260, 13109-13121] becslésével, miszerint a kisebb forma a nagyobb formából származik egy hidrofób peptid proteolitikus hasításával. Úgy becsültük, hogy ez a régió a felelős a detergens és a membránkötő egyedüli tulajdonságokért az A forma esetében.

2. példa

A sertés-szialiltranszferáz-cDNS

PoliA+ RNS-t használtunk templátként az egyszálú cDNS megszerkesztéséhez az Invitrogen által adott kittet használva. A cDFNS templátként szolgált a polimeráz láncreakcióban (PCR), melynek során a Perkin-Elmer Cetus által biztosított reagenseket és eljárásokat alkalmaztuk. Az alkalmazott specifikus körülmények a következők voltak: 92 °C hőmérséklet 1 percig; 50 °C hőmérséklet 2 percig; és 72 °C hőmérséklet 2 percig sorrendben a denaturáláshoz, az anneáláshoz és a polimerizációs állapotokhoz. A PCR-reakciókat 30 bp oligonukleotidokkal primeltük, melyek megfeleltek az ST1 3’-végén levő 120 bp deléciót szegélyező szekvenciáknak. Az amplifikációs reakció termékeit 2%-os agarózgélen szeparáltuk; két specifikus 120 bp-ban eltérő sávot - melyek megfeleltek az ST1 és ST2 kiónoknak - azonosítottunk etidium-bromidos festéssel. Ezeket a sávokat eluáltuk a gélből (Qiaex kit, Qiagen), a TA vektorba szubklónoztuk (Invitrogen), és a fentiek szerint szekvenáltuk az egyértelmű azonosításhoz.

RNS-izolálás és cDNS-könyvtár-szerkesztés

Friss sertésállkapocs alatti mirigyet (<30 minimális elpusztulás után) megfagyasztottunk, és szárazjégEtOH-ban szállítottuk. A teljes RNS-t izoláltuk Chomczynski és Sacchi eljárásának megfelelően [Annál. Biochem. 162, 156-159 (1987)]. A poliA+ RNS-t oligo dT-cellulóz kromatográfiával tisztítottuk (Pharmacia). Kétszálú cDNS-t szintetizáltunk poliA+ RNS reverz transzkripciójával random hexamerek használva primerekként egy Pharmacia cDNS-szintézises kitet és a szállító által javasolt eljárást használva. EcoRI adaptereket ligáltunk az EcoRI-gyel emésztett Igtl 0-hez, és in vitro csomagoltuk (ProMega). A cDNS-könyvtárat szélesztettük a szkríneléshez, melyet az E. coli C600 csomagolt keverék fertőzésével értünk el.

A cDNS kiónok izolálása és szekvenálása

Az összes eljárást a Maniatis et al. [in Molecular

Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1982)] leírásának megfelelően, hacsak másképp nem jeleztük. A tisztított 48 kDa szialiltranszferáz peptid (lásd az 5. ábrát) NH₂-terminális szekvenciához közel levő 18 aminosavnak megfelelő 53 bázispár hosszúságú oligonukleotidpróbát (5’-ACCCTGAAGCTGCGCACCCTGCTGGTGCTGTTCATCTTCCTGACCTCCTTCTT-3’) ³²P-vel végjelöltük, hogy specifikus aktivitása 10⁷ cpm/pmole legyen. 500,00 plakkot szkríneltünk nukleotidhibridizációval a következő prehibridizációs/hibridizációs oldatban: 5 χ SSC, 50 mM NaH₂PO₄, pH 6,7, 20% formamid, 5 χ Denhardt-féle oldat, 0,1% SDS, 0,1 mg/ml lazacsperma-DNS, 37 °C hőmérsékleten (Wood, W. in Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, pp. 443). Nitrocellulóz szűrőket (Schleicher and Schuell 0,45 m pórus) mostunk 0,2xSSC-ben és 0,1% SDS-ben 42 °C hőmérsékleten 40 percig. Egy erősen hibridizálódó kiónt, a lambdaSTl-et kaptuk, mely tartalmaz egy olyan nyílt leolvasási keretet, mely a 48 kDa és 45 kDa tisztított szialiltranszferáz pepiidnek megfelelő aminosavszekvenciát kódolt. Nukleotidhibridizációval egy második kiónt, a lambdaST2-t izoláltuk, egy restrikciós fragmentpróbát használva, mely a lambdaSTl 3’-végéről származik. Ezt a próbát egy 0,5 kb PvuII-EcoRI restrikciós fragmentet, random prímelő kitet és [a-³²P]dCTP-t (Amersham) használva jelöltük meg.

A fág-DNS-ek cDNS-inzertjeinek megfelelő EcoRI restrikciós fragmenteket szubklónoztuk a pUC vektorokba (Pharmacia). A szubklónokat T7 kitet használva szekvenáltuk (Pharmacia). A szekvenciaadatokat számítógéppel analizáltuk DNASTAR-t (DNASTAR Inc., WI, Amerikai Egyesült Államok) használva.

Számos klónozási stratégiát kipróbáltunk a cDNS a-2,3-szialiltranszferázba való klónozásához, az 5. ábrán bemutatott aminosavszekvencia-információkra alapozva. Első kísérletünkben a polimerázlánc reakciós primereket állítottuk elő arra való kísérletként, hogy egy, a 48 kDa és 45 kDa proteintípusok NH₂-terminális szekvenciáit áthidaló próbát hozzunk létre, feltételezve, hogy ezek szomszédosak voltak az intakt enzimben. Utólag ez a kísérlet nem sikerült a 45 kDa típus esetében kapott aminosavszekvencia pontatlanságai miatt (lásd az 5. és 6. ábrát). Más nem sikerült, egy pozitív klón nyerésére irányuló kísérletekben rövid (16-20 bp) degenerált oligonukleotidokat használtunk próbákként a sertésállkapocs alatti mirigy cDNS-szkrínelésére. A végül sikeresnek bizonyult megközelítés során egy nem degenerált 53 bp hosszúságú oligonukleotidpróbát használtunk, melyet az A forma NH₂-terminusának 17 aminosavat tartalmazó régiójából terveztünk. Az 53 bp hosszúságú próbát egy IgtlO sertésállkapocs alatti nyálmirigy cDNS-könyvtár 500 000 plakkjának szkrinelésére használtuk. Egy egyedüli 1,6 kb hosszúságú kiónt nyertünk, az ISTl-et, mely rendelkezett egy konszenzus ATG startkodonnal [Kozák, M., Cell. 49, 283-292 (1986) és Kozák, M. Nuc. Acids Rés. 12, 857-872 (1984)], egy, az a-2,3-szialiltranszferáz A és B formájának NH₂-termináIis aminosavszekvenciáit kódoló nyílt leolvasási kerettel, de kereten belüli stopkodonnal nem. A tény, hogy az NH₂-terminális aminosavszekvenciák az a-2,3-szialiltranszferáz mindkét formájából jelen voltak a lambdaSTl transziáit, nyílt leolvasási keretében azt jelzi, hogy a lambdaSTl klón kódolja az a-2,3szialiltranszferáz egy részét. A lambdaSTl 3'-restrikciós fragmentjét próbaként használtuk egy második átfedőklón, a lambdaST2, kinyerésére ugyanezen könyvtárból (6. ábra). A lambdaST2 kiegészíti a lambdaSTlben induló nyílt leolvasási keretet. A két cDNS együtt egy egyedüli nyílt leolvasási keretet kódol (909-1029,

HU 219 260 Β lásd lent), egy 600 bp hosszúságú 5’-nem transziáit régiót és egy 1000 bp hosszúságú nem transziáit régiót. Az 1029 bp hosszúságú nyílt leolvasási keret nukleotidszekvenciája, valamint a transziáit aminosavszekvenciája a 7. ábrán látható. Jó egyezés volt a lambdaSTl transziáit nyílt leolvasási keretében levő származtatott aminosavszekvencia és a tisztított proteinek közvetlen analízissel kapott aminosavszekvenciái között.

A lambdaSTl és a lambda ST2 átfedő régióinak szekvenciája azonos teljes hosszúságukban, egy egyedüli 120 bp hosszúságú rést kivéve, a lambdaStl esetében. Az egyedülálló nyílt leolvasási keret a lambdaSTl ezen megszakításának mind a két oldalán folytatódik tovább (6. ábra). Annak meghatározásához, hogy az egyik vagy mindkét cDNS forma a valódi mRNS-t képviseli-e az ezen rést áthidaló primereket felhasználó PCR-analízist végeztünk egy cDNS-templáton, melyet a sertésnyálmirigyből származó poliA+ RNS reverz transzkripciójával állítottunk elő. A lambdaSTl és a lambdaST2-nek megfelelő amplifikált PCR-fragmenteket ezzel a megközelítéssel detektáltuk (az adatokat nem mutatjuk be). A PCR-termékeket szubklónoztuk és szekvenáltuk azonosságuk megerősítése céljából, és mindkettőt azonosnak találtuk a lambdaSTl-ben és a lambdaST2-ben levő megfelelő régiókkal. így mind a direkt cDNS-klónozás és a PCR-amplifikáció eredményei azt sugallják, hogy két mRNS-típus van az a-2,3-szialiltranszferázra sertésállkapocs alatti mirigyben, mely egy 120 bp hosszúságú, a nyílt leolvasási keretben levő inzertáció jelenlétében vagy hiányában tér el.

A szialiltranszferáz (1029 bp hosszúságú nyílt leolvasási keret) protein becsült mérete 39 kDa, 4 potenciális N-kötésű glikozilációs hellyel (lásd a 7. ábrát) [Bouse, E., Biochem. J. 209, 331-336 (1983)]. Ezen helyekből 3 hasznosítása olyan proteint eredményezne, melynek becsült mérete körülbelül 48 kDa lenne, amit a tisztított szialiltranszferáz A formájánál figyeltünk meg. Bár az aminoterminális szekvencia két ATG kodont tartalmaz szoros közelségben, csak az első fekszik egy erős konszenzustranszlációs iniciációs helyen belül [Kozák, M., Cell. 49, 283-292 (1986) és Kozák, M., Nuc. Acids Rés. 12, 857-872 (1984)]. Egy Kyte-Doolittle hidropatiás analízis [J. Mól. Bioi. 157, 105-132 (1982)] felfed egy 16 hidrofób maradékot tartalmazó és az aminoterminustól 11 maradékra elhelyezkedő potenciális membránáthidaló régiót (7. ábra). Ez a szerkezeti tulajdonság azt sugallja, hogy az a-2,3-szialiltranszferáz a többi tanulmányozott glikoziltranszferázhoz hasonlóan II típusú membránorientációval rendelkezik, és ez az egyedüli hidrofób régió nem hasítható, aminoterminális jel/rögzítő doménként szolgálhat [Paulson, J. C. and Colley, K. J., J. Bioi. Chem. 264, 17615-17618 (1989)].

A lambdaSTl és lambdaST2 által kódolt nyílt leolvasási keret tartalmazza a teljes NH2-terminális aminosavszekvenciát, melyet az a-2,3-O-szialiltranszferáz A és B formájából nyertünk. Ahogy a 6. ábrában bemutatjuk, az A forma NH₂-terminális szekvencia a nyílt leolvasási keret transzlációjának feltételezett starthelyétől 8 aminosavra található, és a B forma megfelelő NH₂-terminális szekvenciáját 27 aminosavmaradék távolságra találtuk a protein COOH-terminusa felé. Mivel az a-2,3-szialiltranszferáz B formája teljes mértékben katalitikusán aktív [Rearick, J. I. et al., J. Bioi. Chem. 254: 4444-4451 (1979)], a teljes hosszúságú enzim feltételezett iniciátor metioninja és a B forma aminoterminusa közötti proteinszekvenciára feltehetően nincs szükség az enzimaktivitáshoz. így az a-2,3-O-szialiltranszferáz proteolitikusan érzékeny régiója, mely a jelrögzítő dómén és a katalitikus dómén között helyezkedik el, törzsrégiónak tűnik, ahogy korábban a tanulmányozott glikoziltranszferázoknál meghatározták [Weinstein, J. et al., J. Bioi. Chem. 262, 17735-17743 (1987) és Paulson, J. C. and Colley, K. J. J. Bioi. Chem. 264, 17615-17618(1989)].

A sertés- vagy patkányszövetekből származó teljes RNS 20 mg mennyiségét elektroforézisnek vetettük alá egy 1,0%-os agarózgélen, mely 2,2 M formaldehidet (26) tartalmazott majd nitrocellulóz szűrőkre vittük át (Schleicher and Schuell) a leírtak szerint. A nitrocellulóz szűrőket ³²P-jelölésű cDNS-próbákkal hibridizáltattuk és a korábban leírtak szerint mostuk.

3. példa

Az oldható sertés-szialiltranszferáz expressziója

Egy szekretálható kiméraproteint készítettünk el az a-2,3-O-szialiltranszferáz feltételezett katalitikus doménje és az inzulin jelszekvencia közé úgy, hogy a lambdaST2 klón 890 bp hosszúságú C-terminusát fuzionáltattuk a pGIR-199 vektor N-terminális végéhez [Hsueh et al., J. Bioi. Chem. 261, 4940-4947 (1986)] egy SacI helynél, melyet a két vektor nyílt leolvasási kerete tartalmaz. Ezt a kimérát, az sp-ST-t a Nhel és Smal restrikciós enzimekkel emésztettük, az 1,0 kb hosszúságú fragmentet izoláltuk, és szubklónoztuk a pSVL-be (Pharmacia), majd Xbal és Smal-gyel emésztettük, mely a polilinkerben levő helyeket hasítja. A kapott szerkezetet pSVL-spST-nek jelöltük, és az a-2,3O-szialiltranszferáz egy oldható formájának tranziens expresszálásához használtuk vektorként COS-1 sejtekben. A szupercsavarodású DNS-t, pSVL-spST-t COS-1 sejtekbe transzfektáltuk lipofektint használva a szállítók által javasolt eljárásnak megfelelően. (60 ml tenyészedény 50%-os konfluenciasejteket tartalmazott, melyeket 5 pg DNS-sel és 20 ml lipofektin reagenssel transzfektáltuk.) 48 órával a transzfekció után a COS -1 sejt tápközeget összegyűjtöttük, és 15-szörösére koncentráltuk Centricon 30 szűrőn (Amicon) az a-2,3O-szialiltranszferáz-aktivitás vizsgálata céljából. Az a-2,3-O-szialiltranszferáz-aktivitást fagyásgátló glükoprotein akceptort használva határoztuk meg a korábban leírtak szerint [Sadler et al., J. Bioi. Chem. 254, 4434-4443 (1979)].

órával a pSVL-spST-vel való transzfekció után a COS-sejteket (60 ml tenyészedény) metmentes tápközeggel (DMSM, 5 magzati boíjúszérum) (Gibco) mostuk, és ugyanezen tápközegben tenyésztettük 1 órán keresztül. A sejteket pulzálójelöléssel láttuk el ³⁵S-met Express jelölő 150 mCi/150 pmóllal (NEN) 15 ml

HU 219 260 Β metmentes tápközegben 2 órán keresztül. Ezeket a sejteket ezután PBS-sel mostuk, és 5 órán keresztül nyomon követtük ³⁵S-met jelölés nélküli tápközegben. A szekretált proteineket tartalmazó tápközeget ezután összegyűjtöttük, 15-szörösére koncentráltuk, és SDS-PAGE eljárásnak vetettük alá, és fluorográfiával analizáltuk.

Ahogy korábban megállapítottuk, az a-2,3O-szialiltranszferáz B formája enzimatikusan aktív, és a teljes hosszúságú membránkötött enzim proteolitikus hasítási terméke. Ezért arra számítunk, hogy egy oldható kiméraprotein megtartaná az a-2,3-O-szialiltranszferáz-aktivitást, ha tartalmazná a B forma teljes szekvenciáját. Egy ilyen oldható protein létrehozásához a B peptidszekvencia NH₂-terminusától upstream elhelyezkedő restrikciós helyet választottunk a lambdaST2 cDNS pGIR-199 inzulin jelszekvenciát kódoló vektorral való fúzió helyeként. Ahogy a 9A. ábrán látható, ez a szerkezet egy fúziós proteint kódol, melyet mi jelpeptid -ST (sp-ST)-nek jelölünk, mely tartalmazza az inzulin jelszekvenciát és ezt követi a pGIR-kötő által kódolt 9 aminosav, és az a-2,3-O-szialiltranszferáz teljes feltételezett katalitikus doménje. Az sp-ST szerkezettől azt vártuk, hogy egy 38 kDa hosszúságú szekretálható protein szintézisét irányítja, ha gazda emlőssejtekbe transzfektáljuk. Hasonló stratégiát alkalmaztak sikeresen a glikoziltranszferázol oldható formáinak termeléséhez [Paulson, J. C. and Colley, K. J. J. Bioi. Chem. 264, 17615-17618 (1989); Colley, K. J. et al., J. Bioi. Chem. 264, 17619-17622 (1989); Larsen, R. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Amerikai Egyesült Államok 87 6674-6678 (1990)].

Az sp-ST szerkezetet a pSVL expressziós vektorba helyeztük, és tranziensen COS-1 sejtekbe transzfektáltuk. 48 óra elteltével a transzfektált sejteket 2 óráig inkubáltuk Trans³⁵S-jelölőt tartalmazó tápközegben, melyet egy 5 órás nyomon követési periódus követett a jelölőt nem tartalmazó tépközegben; ezt a tápközeget összegyűjtöttük, 15-szörösére koncentráltuk, és SDS-PAGE/fluorográfiával analizáltuk. A 9B. ábra azt mutatja, hogy a tápközeg tartalmaz egy kiemelkedő 38 kDa hosszúságú típust, ez az sp-ST protein várt mérete. Párhuzamos transzfektált tenyészetekben a tápközeget összegyűjtöttük a transzfekció után 48 órával, koncentráltuk, és az a-2,3-O-szialiltranszferáz-aktivitásra vizsgáltuk. Ahogy a 9C. ábrán látható, az sp-STvel transzfektált sejtek tápközege milliegység/ml szialiltranszferázt tartalmazott, míg a mock-kal transzfektált sejtek tápközege nem mutatott jelentős aktivitást.

4. példa

A patkánymáj-szialiltranszferáz tisztítása és szekvenálása

Más az endoplazmás retikulum és a Golgi-készülék membránproteinjeivel előforduló glikoziltranszferázokhoz hasonlóan a szialiltranszferáz kis mennyiségben előforduló proteinek és tisztításuk nehéz, magyarázatot adva arra, hogy eddig miért csak két tagját klónozták ennek a családnak. A Galpl,3(4)GlcNAc a-2,3-szialiltranszferázt („cc2,3-N”) először 800 000-szeresére tisztították a patkánymájból 1982-ben (Weinstein et al.,) körülbelül 10 pg/ng szövetmennyiséget eredményezve [Weinstein, J„ J. Bioi. Chem. 257, 13835-13844 (1982) és Weinstein, J. et al., J. Bioi. Chem 13845-13853 (1982)}. Bár számos kísérlet történt az aminosavszekvencia-információ nyerése céljából, valamint az enzimmel szembeni antitest hagyományos módszerekkel való kiváltása céljából, ezek a kísérletek nem jártak sikerrel a hígított protein kinyerhető kis mennyiségei miatt. Másik lehetőségként a tömegspektrofotometria játszott növekvő szerepet a biológiailag fontos makromolekulák szerkezeti megvilágításában. Az új ionizációs módszerek és eszközök kifejlesztése kibővítette az elérhető tömegspektrumot és a detektálási érzékenységet. A HPTMS-t (high performance tandem mass spectrometry) a proteinszekvenálás hatékony technikájaként vezették be [Mathews, W. R. et al., J. Bioi. Chem. 262:7537-7545 (1987)], valamint a transzláció utáni és kémiai módosítások meghatározásához [Dever, T. E. et al., J. Bioi. Chem. 264 20518-20525 (1989); Settineri, C. A. et al., Biomed. Environ. Mass Specctrom. 19, 665-676 (1990); és DeWolf Jr., W. E. et al., Biochem. 27, 9099-9101 (1988)]. Ezért tömegspektrometriát alkalmaztunk a szialiltranszferáz aminosavszekvenciájának biztosításához.

Redukció és karboximetilálás

Megközelítően 13 pg Galfll,3(4)GlcNAc a-2,3 szialiltranszferázt (a-2,3N) tároltunk 350 ml 30 mM nátrium-kakodilát (pH 6,5), 100 mM NaCl, 0,1% Tritan CF-54 és 50% glicerin elegyében. Tris HCl-t (pH 8,0), quanidin HCl-t és dítiotreitolt adtunk sorrendben 0,2 M, 6 M és 7 mM végső koncentrációban. A redukciót 60 °C hőmérséklet argonatmoszférában 1,5 órán keresztül valósítottuk meg. Nátrium-jód-acetátot (1,32 mg) adtunk 0,2 M-os Tris-HCl-puffer 2,5 ml mennyiségében a keverékhez. Az alkilációt szobahőmérsékleten, argonatmoszférában, sötétben, 1,5 órán keresztül végeztük.

Dialízis

A redukált és karboximetilált a-2,3N-t 4 liter 50 mM N-etil-morfolin-acetát-pufferrel (pH 8,1) szemben dializáltuk egy Bethesda Research Labs („BRL”) Microdialysis Rendszert használva BRL által gyártott dialízismembránt használva, a molekulatömeg áteresztőmérete a 12-14 kDa tartományba esik. Amikor a dialízis befejeződött, 10% SDS-t adtunk a dialízises üregekhez, ami megközelítően 0,1%-os végső SDS-koncentrációt eredményezett. Az üregek tartalmát összegyűjtöttük és megszárítottuk SpeedVac Koncentrátort (Savant) használva. Az SDS eltávolítása céljából Konigsberg precipitációját végeztük el [Konigsberg, W. H., Henderson. L., Methods in Enzymology 91, 254-259 (1993)]. Tripszines emésztés

A kicsapatott a-2,3N-t emésztési pufferben oldottuk fel (100 mM Tris-HCl, 2 M urea, 1 mM CaCl₂, pH 8,0), mely megközelítően 2 mg/ml proteinkoncentrációt eredményezett. Az a-2,4N-t 10%-os tripszinnek (w/w) emésztettük (Boehringer-Mannheim, a szekvenálási fokozat, 1 mM HCl-ben oldva) 37 °C hőmérsékleten. Az emésztés után 7 órával a tripszin egy másik azonos

HU 219 260 Β mennyiségét adtuk az elegyhez, mely megközelítően 13%-os végső tripszinkoncentrációt eredményezett. Az emésztést 18 óra elteltével állítottuk le. A kapott tripszines emésztést reverz fázisú HPLC-vel szeparáltuk (ABI C18 oszlop, l,0x 100 mm) ABI 140A szolvens hordozórendszert használva. Az A szolvens 0,1% TFA volt vízben. A B szolvens 0,08% TFA volt 70%-os acetonitril/30% víz elegyében. A rendszer 50 ml/perc átfolyási sebességgel működött. Az injektálás után 10 perccel a B szolvens százalékát 0%-ról 50%-ra emeltük 90 percen keresztül, majd 30 percen keresztül 100%-ra. A peptideket egy ABI 783A abszorbanciadetektort használva detektáltuk, mely 215 nm-en működött. A frakciók egy részét észteresítettük HCI/n-hexanol keverékét használva.

Tömegspektrometria

LSIMS (Liquid Secondary Ion Mass Spectrometry) kísérletet végeztünk egy Kratos MSS kettős fókuszáló tömegspektrométert használva, melyet egy LSIMSforrással és egy erős terű mágnessel kapcsoltunk össze. Az egyes összegyűjtött frakciók megközelítően 1/5-ét az LSIMS analízishez használtuk. Folyadékmátrixként 1 TFA-val savasított glicerol-tioglicerol 1:1 keverékének 1 pl mennyiségét használtuk. A mintákat összegyűjtöttük a próbacsúcsokból. A legnagyobb mennyiségben levő molekuláris ionokat választottuk az összeütközések által indukált disszociációs (CID) analízishez. Ezeket a kísérleteket egy Kratos Concept IIHH négyszektoros tömegspektrométeren végeztük, melyet felszereltünk egy elektrooptikális sokcsatornás elrendező detektorral, mely a szekvencia-tömegspektrum 4%-os szegmenseit tudja mérni egy időben. Az ütközési energiát 4 keV-ra állítottuk, az ütközési gáz hélium volt, és nyomását úgy állítottuk be, hogy a választott prekurzor ionmennyiségét kezdeti mennyiségének 30%-ára csökkentse. Az egyes megmaradt mintákat felhelyeztük, és a fent említett mátrix 1 ml mennyiségét adtuk hozzá. A nagy energiájú CID-adatokat számítógépes analízis segítsége nélkül interpretáltuk.

A tandem tömegspektrometria egy hatékony módszer a proteinszekvenáláshoz, előnyöket mutatva a hagyományos Edman-technikával szemben. Ezzel a módszerrel akár ekvimoláris keverékeket is lehet szekvenálni. A tömegspektrometriás analízishez a HPLC-ről származó első néhány peptidfrakciót észterifikáltuk hidrofobitásuk növelése céljából, így fokoztuk a porlasztási hatékonyságot [Falick, A. M. and Maltby, D. A. Anal. Biochem. 182, 165-169 (1989)]. Az egyes frakciók LSIMS-analízise felfedett többszörös molekuláris iont, azt jelezve, hogy mindegyikben egynél több peptid volt jelen. A legnagyobb mennyiségben levő 30 molekulás ionokat választottuk a CID analízishez. Ezekben a kísérletekben a kérdéses ion 12C izotópcsúcsát választottuk az első tömegspektrométerben. A két tömegspektrométer közé helyezett ütközősejtekben héliummal való ütközés indukálta disszociációból származó ilyen típus fragmentjeit detektáltuk a második tömegspektrométer végén. A magas energiájú ütközéssel indukált disszociációs (CID) analízises fragmentáció főként a peptidgerinc mentén fordul elő. A többszörös hasítás, azaz az aminosav-oldalláncok fragmentációját is megfigyeltük. A peptidlánc mentén előforduló fragmentáció olyan ionsorozatokat eredményez, melyek aminosavmaradék-tömegükben térnek el, így a megfelelő aminosavszekvencia levezethető. A fragmentáció magas energiájú módja további információt szolgáltat az aminosavak azonosságáról, így megerősíti a nyert szekvenciákat, és lehetővé teszi az izobár Leu/Ile aminosavpár közötti megkülönböztetést [Johnson, R. S. et al., Anal. Chem. 59, 2621-2625 (1987)]. Az oldallánc-fragmentáció leginkább akkor figyelhető meg, ha egy bázikus aminosav, azaz Arg, Lys vagy His található a szekvenciában [Johnson, R. S. et al., Int. J. Mass Spectrom. Ion Proc. 86, 137-154 (1988)], Általában a bázikus aminosavmaradékok előnyben részesített protonációja az Nterminusnál vagy ahhoz közel előnyben részesített töltésvisszatartást okoz a molekula ezen végén. A C-terminusnál vagy ahhoz közel bázikus aminosavakat tartalmazó peptidek leginkább C-terminális ffagmenteket fognak mutatni. így a tripszin előnyösen használható a kezdőemésztéshez. A nagy energiájú CID-adatok interpretációja valójában 14 szekvenciát eredményezett (lásd a 2. táblázatot és a 9. ábrát).

A CID-spektrumok analízise felfedte, hogy a tripszines emésztés alatt néhány mellékreakció fordul elő. Két tripszinautolízises terméket azonosítottunk az m/z 659,3-nál és a 1153,6-nál (9. ábra). A hosszú inkubációs idő miatt és egy megfelelő tisztogató hiányában néhány tipikus peptid karbamilálódik az N-terminális végen. Míg az ilyen mellékreakciók eleve megakadályoznák az Edman-degradációt, az N-terminális modifikációk még hasznosak is lehetnek a tömegspektrometriás szekvenálásnál. Valójában ezen módosított peptidek CID-analízise segítséget nyújtott néhány fent említett szekvencia megerősítésében, egy esetben lehetőséget adva arra, hogy megkülönböztessük az N-terminális leucint az izoleucintól (10. ábra).

5. példa

Patkánymáj-szialiltranszferáz

Egy specifikus cDNS-próba PCR-amplifikációja

Az a-2,3N-ből származó 14 peptidből 11 aminosav szekvenciájára alapozva 22 degenerált oligonukleotidpoolt szintetizáltunk a sense és antisense szálakból (Genosys). A kezdeti kísérleteket arra a megfigyelésre alapozva terveztük, hogy a 11 és az 1 peptidek homológok a korábban klónozott szialiltranszferáz központjához közel elhelyezkedő régióval, a Gaipi,4GlcNAc a-2,6-szialiltranszferázzal [Weinstein, J. et al., J. Bioi. Chem. 257, 13835-13844 (1982)] és az a-2,3-O-val, melyet fent leírtunk (11. ábra). A PCR-kísérletek két csoportját vagy a sense prímért all pepiidhez, vagy az antisense prímért az 1 pepiidhez használva végeztük el, ezzel együtt más peptidekhez oligonukleotid primeijeit is felhasználtuk és patkánymáj teljes RNS-ből szintetizált első szálú cDNS-t használtunk templátként. Egy templát olvasztási lépéssel kezdve (5 perc 94 °C hőmérséklet) az amplifikációt GeneAmpTM DNS-amplifikációs reagens kitet AmpliTaqTM DNS polimerázzal (Perkin-Elmer Cetus) használtunk 1 perc 94 °C hőmér18

HU 219 260 Β séklet, 1 perc 37 °C hőmérséklet és 2 perc 72 °C hőmérséklet 35 ciklusán keresztül, és egy végső extenziós lépéssel befejezve (15 perc 72 °C hőmérsékleten). Ezekből a PCR-reakciókból számos cDNS-ffagmentet hoztunk létre. Feltételezve, hogy a 11 és 1 peptidek amino- 5 savak folyamatos szakaszát képviselik, PCR-kísérletek egy további sorozatát végeztük el egy beágyazott primer stratégiát használva [Mullis, K. B. and Faloona, F., Methods Enzymol. 155, 335-350 (1987)] a specifikus cDNS-fragmentek azonosítása céljából. Ezzel a megkö- 10 zelítéssel egy specifikus cDNS-fragmentet, a llsense14antisense (lls-14as) fragmentet azonosítottuk.

A lls-14as cDNS-fragmentet a Bluescript plazmidba (Stratagene) szubklónoztuk, és univerzális primereket (Stratagene) és Sequenase Version 2,0 kitet (USB) hasz- 15 nálva szekvenáltuk.

A szialiltranszferáz klónozása

Egy cDNS-könyvtárat szerkesztettünk meg patkánymáj poli(A)+ RNS-ből, a Pharmaciatól származó cDNS szintézises kittet használva [Gubler, U: and 20 Hoffinan, B. J., Gene 25, 263-269 (1983)]. Az oligo (dT) primer cDNS-t szintetizáltuk és EcoRI-NotI kötőkhöz ligáltuk. A cDNS-eket ezután EcoRI-gyel hasított IgtlO DNS-hez ligáltuk (Promega). Miután in vitro egy DNS-csomagoló-extraktummal becsomagoltuk 25 (Stratagene), a fágot az E. coli C600 hfl-gazdatörzsre (Promega) szélesztettük. Megközelítően 1 millió plakkot szkríneltünk a 1 Is-Mas próbával [Gubler, U. and Hoffinan, B. J. Gene, 25, 263-269 (1983)]. Két pozitív fágot (18-1 és 9-1) plakktisztítottunk, és a Blue- 30 script plazmidvektorba (Strategene) szubklónoztuk szekvenálás céljából.

A cDNS-klónok izolálása

A Dayhoff Protein adatbázist használtuk a peptidszekvenciák homológiára való szkríneléséhez ismert pro- 35 teineket használva. Ez a kutatás adta az a-2,3N és más klónozott szialiltranszferázok közötti homológia első bizonyítékát. Ebből az analízisből azt találtuk, hogy a 11 peptid (2. táblázat) homológ a patkány és a humán βgalaktozid a-2,6-szialiltranszferázokban jelen levő szekvenciákkal [ez a két enzim 88%-ban konzervált, Gu, T. J. et al., FEBS 275 83-86 (1990) és Láncé, P., et al., Biochem. Biophys. Rés. Commun. 164, 225-232 (1989)]. Amikor ezt a kísérletet kiterjesztettük, úgyhogy tartalmazza a sertés a-2,3-0 szekvenciát, egy további peptidet, az 1 peptidet (2. táblázat) homológnak találtuk mindkét klónozott szialiltranszferázban jelen levő szekvenciákkal. Ezen peptidek felsorakoztatása a korábban klónozott szialiltranszferázokban jelen levő szekvenciákkal azt sugallta, hogy ez a két peptid aminosavak folyamatos szakaszát képviseli, melyet az argininmaradéknál hasítottunk a tripszines emésztés alatt (11. ábra).

Az a felismerés adta klónozási stratégiánk alapját (11. ábra), hogy a 11 és 1 peptidek homológiát mutatnak két másik klónozott szialiltranszferáz központjában levő konzervatív homológiarégióként azonosított szekvenciával. Feltételezzük, hogy a 11 és 1 peptidek a protein központjához közel helyezkedhetnek el, így a PCRkísérleteket úgy terveztük, hogy hosszú cDNS-próbát hozzon létre. A 14 szialiltranszferáz peptid aminosavszekvenciájára alapozva a sense és antisense degenerált oligonukleotid primereket szintetizáltuk a PCR-kísérletekben való alkalmazáshoz. Ezekben a kísérletekben a 11 sense és 1 antisense prímért más primerekkel párosítottuk az a-2,3-N hosszú cDNS-ffagmentjeinek amplifikálására irányuló törekvésünk során. Ezekben a kísérletekben számos cDNS-fragmentet amplifikáltunk. Feltételezve, hogy a 11 és 1 peptidek aminosavak egy folyamatos szakaszát képviselik, a 11 és 1 primereket ezután egy beágyazott primer stratégiában [Mullis, K. B. and Faloona, F., Methods Enzymol. 755, 335-350 (1987)] a specifikus cDNS-fragmentek azonosítása céljából all sense és 14 antisense primereket használva amplifikált fragment közel ugyanolyan méretű volt, mint az 1 sense és 14 antisense primereket használva amplifikált fragment, azt sugallva, hogy a termelt ftagment a primerek által specifikus anneálás eredménye és nem egy mesterségesen létrehozott termék.

2. táblázat

A Gaipi,3(4)GlcNAc a-2,3-szialiltranszferázból származó peptidek aminosavszekvenciája

Peptid	Aminosavszekvencia	A maradék helyzete a Gál a-2,3-ST-ben (4. ábra)
1.	LeuAsnSerAlaProValLys	186-192
2.	MetAlaAlalleLys	340-344
3.	GluProProGluIleArg	264-269
4.	GlyLysAspAsnLeuIleLys	130-136
5.	LeuProAlaGluLeuAlaThrLys	69-76
6.	AlalleLeuSerValThrLys	137-143
7.	IleLeuAsnProTyr	270-274
8.	LeuThrProAlaLeuAspSerLeuNisCysArg	147-157
9.	ValSerAlaSerAspGlyPheTipLys	247-255
10.	ValIleThrAspLeuSerSerGlyZle	366-374
11.	IleAspAspTyrAspIleValIleArg	177-185
12.	GluPheValProProPheGlylleLys	121-129

HU 219 260 Β

2. táblázat (folytatás)

Peptid	Aminosavszekvencia	A maradék helyzete a Gál a-2,3-ST-bcn (4. ábra)
13.	LeuGlyPheLeuLeuLys	59-64
14.	AspSerLeuPheValLeuAlaGlyPheLys	222-231

Az aláhúzott szekvenciák homológiát mutatnak más ismert szialiltranszferáz enzimekkel (25, 26).

A dőlt betűvel irt aminosav az egyetlen, mely eltér a Gál a-2, 3-ST cDNS nukleotidszekvcnciájából származtatott aminosavszekvenciától.

All sense-14 antisense fragment klónozása és jellemzése azt mutatta, hogy all és az 1 peptidek valóban folyamatosak. A cDNS-fragment szekvenciája és a két klónozott szialiltranszferáz összehasonlításával [Weinstein, J. et al., J. Bioi. Chem. 262, 17735-17743 (1987)] azt találtuk, hogy a homológia az 1 pepiidnél kezdődik és folyamatos 18 aminosavig. A homológia miatt úgy véljük, hogy a 1 Is-Has cDNS-fragmentet amplifikáltuk a szialiltranszferáz mRNS-ből. A szekvencia szintén azt jelezte, hogy a cDNS-fragment nem a Gaipi,4GlcNAc a-2,6-szialiltranszferáz fragmentje, mely nagy mennyiségű a patkánymájban [Weinstein, J. et al., J. Bioi. Chem. 257, 13835-13844 (1982)].

All sense-14 antisense fragmentet egy oligo dT príméit patkánymáj cDNS-könyvtár szkrínelésére használtuk, melyből két pozitív kiónt nyertünk az 1 millió szkrínelt plakkból. A pozitív kiónok szkrínelése felfedte, hogy az ST3N-1 klón egy 2,1 Kb inzertet tartalmaz, míg az ST3N-2 klón jelentősen rövidebb, csupán

1,5 Kb hosszúságú. A Northem-analízis azt jelezte, hogy a Gál 2,3-ST mRNS 2,5 Kb (lásd lent) azt sugallva, hogy az ST3N-1 klón tartalmazhatja a Gál a-2,3ST teljes kódaolószekvenciáját.

Az a-2,3-N-szialiltranszferáz elsődleges szerkezete

A szekvenciaanalízis felfedte, hogy az ST3N-1 klón tartalmazta a szialiltranszferáz teljes nyílt leolvasási keretét (2. ábra). Tartalmaz egy 82 bp 5’-nem transziáit régiót, egy 1122 bp hosszúságú nyílt leolvasási keretet, egy megközelítően 1 kb hosszúságú 3’-nem transziáit régiót és egy poli(A) farkat. Az ST3N-1 nyílt leolvasási keret egy 374 aminosavból álló proteint kódol, melynek becsült molekulatömege 42,033 kDa. Egy egyedüli aminosaveltéréssel a nyílt leolvasási keret az összes 14 peptidszekvenciát kódolja, melyet a tisztított szialiltranszferáz tömegspektrometriás analízise során nyertünk. Ez megerősíti azt, hogy az ST3N-1 klón cDNS-e valóban a szialiltranszferázé. Ahogy más klónozott glikoziltranszferázok esetében is megfigyelték [Paulson, J. C. and Colley, K. J., J. Bioi Chem. 264, 17615-17618 (1989)], úgy becsüljük, hogy az a-2,3-N rendelkezik egy rövid N-terminális citoplazmás farokkal, egy körülbelül 20 maradékból álló jelrögzítő szekvenciával, és egy nagy C-terminális régióval, mely tartalmazza az enzim katalitikus doménjét.

6. példa

Oldható patkány-szialiltranszferáz expressziója

A szialiltranszferáz enzimatikus jellemzéséhez szükséges oldható formájú szialiltranszferáz termelése céljából egy, az enzim katalitikus doménjét és az inzulin által hasítható jelszekvenciát tartalmazó fúziós proteint szerkesztettünk a pSVL (Pharmacia) emlős expressziós vektorban. Specifikusan a szialiltranszferáz katalitikus doménjét PCR-technika alkalmazásával amplifikáltuk egy, a +182 pozícióban (11. ábra) a transzmembrán doméntól down stream irányban található 5’-primert, és egy, a poliadenilációs helytől upstream irányban, a 3’UTR-ben elhelyezkedő 3’-prímért használva. A PCRreakciókat a fentiekben leírt módon végeztük 55 °C anneálási hőmérsékleten. A PCR-terméket a pGIR-199 (fenntartja ilyen számon a University of Califomia, Los Angeles) BamHI-EcoRI helyeire szubklónoztuk, mely a szialiltranszferáz fúzióját eredményezte a pGIR vektorban lévő inzulin jelszekvenciába [Huseh, E. C. et al., J. Bioi. Chem. 261, 4940-4947 (1986)]. A létrejött fúziós proteint a pSVL expressziós vektor Xbal-Smal helyeire inzertáltuk a pBD122 expressziós plazmid létrehozása céljából.

A COS-1 sejtekben való tranziens expresszálás céljából a pBD122 expressziós plazmidot (20 mg) COS-1 sejtekbe transzfektáltuk 100 mm-es lemezeken, lipofektint használva a gyártó (BRL) ajánlásának megfelelően. 48 óra elteltével a sejt tenyészközegét összegyűjtöttük, és Centricon 10 mikrokoncentrátor segítségével koncentráltuk. A koncentrált tápközeget szialiltranszferáz-aktivitásra vizsgáltuk, akceptorszubsztrátként oligoszacharidokat használva. A szialinsav oligoszacharidra való átvitelét ioncserélő kromatográfia [Sadler, J. E. et al., J. Bioi. Chem. 254, 5934-5941 (1979) és Paulson, J. C. et al., J. Bioi. Chem. 264, 10931-10934 (1989)] felhasználásával követtük nyomon.

Az ST3N-1 klón a-2,3-N-szialiltranszferáz kódolásának bemutatása céljából megvalósítottuk a klón COS-1 sejtekben való expresszálását. Az ST3N-1 klón aminosavszekvenciája felfedte, hogy a protein tartalmaz egy NH2 terminális jelrögzítő szekvenciát, melyről feltételezik, hogy az enzimet a Golgiapparátushoz rögzíti a sejtben [Paulson, J. C. és Colley, K. J„ J. Bioi. Chem. 264, 17615-17618 (1989)]. Az enzim funkcionális analízise céljából termelni szerettük volna az enzim egy oldható formáját, mely expresszálódása esetén kiválasztódik a sejtből. A fúziós proteint a szialiltranszferáz NH2-terminusánál lévő jelrögzítő szekvencia hasítható inzulin jelszekvenciával való helyettesítésével hoztuk létre. Amikor a pBD122 expressziós plazmid COS-1 sejtekben expresszálódott, az enzim szekretálódott a sejtekből, és szialiltranszferáz-aktivitást mutatott. Az a-2,3N-szialiltranszferáz enzimatikus sajátságait első ízben jellemeztük tisztított protein felhasználásával [Weinstein, J. et al., J. Bioi. Chem. 257, 13845-13853

HU 219 260 Β (1982)]. Úgy találtuk, hogy a szialiltranszferáz βgalaktozid akceptorokat hasznosít, melyek vagy a Ga^l,3GlcNAc vagy a Ga$l,4GlcNAc szekvenciákat tartalmazzák, a NeuAca2,3Ga^l,3GlcNAc és a NeuAca2,3Ga^l,4GlcNAc szekvenciákat alkotva, melyek gyakran komplex típusú N-kötött oligoszacharidokat terminálnak. A pBD122 expressziős plazmiddal transzformált sejtekből szekretált enzim képes volt a β-galaktozidáz akceptorok hasznosítására akár a Ga^l,3GlcNAc, akár a Ga^l,4GlcNAc szekvenciát (2. táblázat) tartalmazták; a szülői vektorral transzfektált sejtek nem szekretáltak ilyen szialiltranszferázaktivitású anyagot. A szekretált enzim a szialo-αΐ sav glikoprotein szialilezésére szintén képes. Ezek az adatok megegyeznek a tisztított a-2,3-N enzimatikus sajátságaival.

7. példa

Az a-2,3-N-szialiltranszferáz expressziója baculovírusban

A szialil Lewis X [SLe^x:

SAa2,3Ga$l,4GlcNAc(al,3Fuc)] terminális tetraszacharidot a P-szelektin és E-szelektin ligandumaként azonosították, és egy SLe^x szerkezetet tartalmazó szintetikus oligoszacharid a szelektinligandum kölcsönhatások blokkolásának egy jelöltje. Az SLe^x teljes kémiai szintézise technikai és gazdaságossági szempontból nehézkes, de specifikus glikoziltranszferázok alkalmazása a terminális szialinsav és fukóz maradékoknak a kémiailag szintetizált mag szacharidhoz való kapcsolása céljából lehetségessé teszi a szabad SLe^x szintézisét. Az 2,3-N-szialiltranszferázt kódoló gént a patkánymáj cDNS-könyvtárból klónoztuk és bemutattuk, hogy transzfektált COS-1 sejtekben való expresszálásakor specifikus a-2,3 (Ga$l,3/4GlcNAc) szialiltranszferázaktivitással rendelkezik (Wen et al. kézirat előkészületben). A cDNS-klónnak a polipeptid enzimatikus, de hidrofób jel/membrán rögzítődoménnel nem rendelkező egységét kódoló részét a preinzulin jelszekvenciához fuzionáltuk, létrehozva ezzel egy oldható szekretált a-2,3 NST proteint kódoló cDNS-t. Ezt a cDNS-t egy baculovírus transzfervektorba klónoztuk, és Sf-9 rovarsejtek transzfektálására használtuk vad típusú baculovírus-DNS jelenlétében. Az a-2,3-N-szialiltranszferáz cDNS-t tartalmazó rekombináns vírust izoláltuk, tisztítottuk, és Sf-9 sejtek fertőzésére használtuk. A fertőzött sejtek az a-2,3 NST nagy mennyiségeit szekretálták a tápközegbe, és ezt a fehéijét ioncserélő kromatográfiával tisztítottuk.

Az Sf-9 rovarsejteket az ATCC-ről szereztük be, ahol ilyen elnevezéssel tartják fenn. A pGIR199 és pBlueBac DNS-vektorok sorrendben J. C. Paulsontól (fenntartja a University of Califomia, Los Angeles), és az Invitrogéntől (San Diego, CA) származnak. Az Sf-9 sejteket körkörösen rázatott kultúrában szaporítottuk 0,3 és 1,5 millió sejt/milliter sejtsűrűségi értékek között (0,33% laktalbumin-hidrolizátummal és 0,33% yeastoláttal kiegészített) Graces Insect tápközegben, melyet a Gibcotól (Grand Island, N. Y.) szereztünk be, és amely még 10% hőinaktivált magzati boíjúszérumot (JRH Biosciences, Lenexa, KS) is tartalmazott. Ezt a tápközeget GCMS+10% FCS-nek neveztük.

Az a-2,3-N-szialiltranszferáz egy oldható formáját a következő módon állítottuk elő. A teljes a-2,3-N-szialiltranszferáz mRNS-t képviselő cDNS-t használtuk PCR-templátként. Amplimerként két oligonukleotidot alkalmaztunk, melyek közvetlenül az enzim jel/rögzítő régiói kombinációjától C-terminális pozícióban (5’) és a 3’-telítetlen régióban található poliAaddíciós helytől upstream irányban (3’) hibridizálódnak. Mindkét oligonukleotid BamHI-helyet kódol 5’-végén, lehetővé téve ezzel a PCR-termékek pGIR199 BamHI-helyére történő klónozását preinzulin jelszekvencia keretébe fuzionálva. Szomszédos Nhel helyeket használtunk a génfúzió felszabadítására, és ezt a cDNS-fragmentet a pBluebac baculovírus transzfervektorba klónoztuk a baculovírus polihedrin promoter szabályozása alá. Minden rekombináns DNS-manipulációt a gyártók leírásában ajánlott körülmények között végeztünk el. A Bluebac vektor tartalmazza az E. coli β-galaktozidáz gént különböző baculovírus promoterek szabályozása alatt, és azok a vírusok, amelyek rekombinálódtak, és felvették a DNS-vektort, az X-gal kromofort képesek kék színű termékké alakítani.

A rekombináns baculovírus létrehozása a MaxBac expressziős rendszer (Invitrogén) felhasználásával történt, a gyártó által megadott leírás pontos betartásával. Röviden a plazmid és a vad típusú vírus DNS-t összekevertük, és Sf-9 sejtek transzfektálására használtuk a kalcium-foszfát-módszer segítségével. A transzfektált sejtek vírust termeltek, és azt a tenyésztápközegbe juttatták. A rekombináns vírust plakkvizsgálattal azonosítottuk a galaktozidáz működése következtében, a 150 pg/ml mennyiségben a plakk tápközeghez adagolt X-gal-ból, termelt kék színanyag alapján és a vad típusú vírustól ismételt hígítás/plakk képzés segítségével tisztítottuk meg. A tisztított vírust friss SF-9 sejtek fertőzésével 500 ml-re szaporítottuk fel. Az alábbiakban leírt radioaktív szialiltranszferáz vizsgálati módszernek a tápközegek azonos mennyiségeinek vizsgálatára történő közvetlen felhasználása segítségével számos kiónt analizáltunk azon tulajdonságra, hogy képes-e kiváltani az a-2,3-N-szialiltranszferáz-szekrécióját a fertőzött sejt tápközegében.

A vírus nagy mennyiségeinek felszaporítása céljából egy 25 cm²-es szövettenyésztésre szolgáló palackban 5 ml GCMS+10% FCS tápközegben lévő 3xl0⁶ Sf-9 sejtet fertőztünk egy vad típusú vírustól mentes különálló kék piákkal, és 27 °C-on 5-7 napig szaporítottuk. Az így nyert 5 ml vírustenyészetet centrifúgálással tisztítottuk és tovább szaporítottuk. Logaritmikus szaporodási fázisban lévő Sf-9 sejteket (0,5-1,5 xlO⁶ sejt/ml) fertőztünk 1 χ 10⁷ sejt/ml koncentráció mellett 1-es fertőzési multiplicitást (moi) értéknél, feltéve, hogy a vírustiter az 5 ml-es tenyészetben 1 χ 10⁸ plakkképző egység (pfú)/milliliter volt. A sejteket GCMS+ +10% FCS tápközegben tízszeres értékre visszahígítottuk, és 27 °C-on 5-7 napig szaporítottuk. Az így kapott vírust tisztítottuk, és a vírustitert plakkvizsgálattal meghatároztuk, és az általában 10⁹ pfú/ml értéknél nagyobb a

HU 219 260 Β volt. Az a-2,3-N-szialiltranszferáz expresszálása céljából 2,5 χ 10⁹ logaritmikus szaporodási fázisban lévő sejtet juttattunk egy CF-10-nek nevezett „tíztálcás sejtfaktor” (Ten Tray Cell Factor, Nunc, Naperville, IL) valamennyi rétegére. Egy CF-10 teljes szaporítási felülete 6000 cm². A sejteket rekombináns baculovírussal fertőztük moi=5 mellett 300 ml térfogatban. 1 órás inkubálás után 1 liter Excell-400-at (JRH Bioscience), egy szérummentes tápközeget adtunk a sejtekhez, és 27 °C hőmérsékleten 72 óráig inkubáltuk. A tápközeget összegyűjtöttük, tisztítottuk, és 0,2 pm-es szűrőegységen átszűrtük. 2% magzati boíjúszérummal kiegészített friss tápközeget (Excell 400) adtunk hozzá, és a sejteket 27 °C hőmérsékleten további 48 óráig inkubáltuk, ezt követően a tápközeget összegyűjtöttük, tisztítottuk és szűrtük.

Az a-2,3-N-szialiltranszferáz-aktivitást a közzétett vizsgálati módszer (Sadler et al., 1979) módosított változatával vizsgáltuk. Harminc pl térfogatba 14 pl mintát kevertünk össze 3,5 μΐ lakto-N-tetraózzal (Gaipi,3GlcNActl,3Gaipi,4Glc) és egy vizsgálati elegy 12,5 μΐ mennyiségével az alábbiakban leírtak szerint. A mintákat rövid ideig kevertük, lecentrifugáltuk a reakciócső aljára, és 37 °C hőmérsékleten 10 percig inkubáltuk. Ezt követően a reakcióelegyet azonnal hígítottuk 1 ml 5 mM-os foszfátpufferben, pH=6,0 és 0,5 ml-es ioncserélő oszlopra vittük. Az oszlopon átmosódott anyag 1 ml mennyiségét szcintillációs csőben fogtuk fel és számláltuk. Az egységet az egy pmol szalicilsavnak az akceptorra való egy perc alatt történő átviteléhez szükséges enzim mennyiségeként definiáltuk.

A minta vagy a tiszta felülúszóból állt, vagy a felülúszót oly mértékben hígítottuk, hogy a reakció kinetikáját lineáris tartományban tartsuk (körülbelül 10 000 cpm kibocsátás az oszlopról). A vizsgálati elegy a [¹⁴C]CMP-szialinsav (NEN, Boston, MA) 0,65 ml mennyiségének (50 pCi) beszárításával és 0,65 ml 2,3 mg CMP szialinsavat tartalmazó, vízben való újraszuszpendálásával készült. Ehhez 0,96 ml 1 M-os nátrium-kakodilátpuffert, pH=6; 0,48 ml 20%-os Triton CF-54-et; 50 mg/ml-es szarvasmarha-szérumalbumin-oldat 0,29 ml mennyiségét (valamennyit a Sigmától St. Louis, MO, szereztük be) adtuk, és vízzel 8 ml végtérfogatra töltöttük fel. A vizsgálati elegy specifikus aktivitását meghatároztuk, egyenlő részekre osztottuk és -20 °C hőmérsékleten tároltuk.

Az a-2,3-N-szialiltranszferáz koncentrálása és tisztítása. Az a-2,3 NST-t tartalmazó tápközeget (1-3 liter) egy S1Y10 jelű töltettel felszerelt Amicon CH₂PRS speciális szűrőrendszert alkalmazva szűrtük, és körülbelül 250 ml térfogatúra koncentráltuk. A rendszert ezután diafiltrációs üzemmódban használtuk a koncentrált felülúszó, három térfogatnyi mM kakodilsav, 25 mM NaCl, 25% glicerin, pH=5,3 (A puffer) segítségével történő sómentesítésre. Ezt követően a mintákat egy A pufferrel 2 ml/perc átfolyási sebesség mellett equilibrált SSepharose Fást Flow (Pharmacia) oszlopra (2,5 χ 17 cm) vittük. Az összes minta felvitele után az oszlopot A pufferrel mostuk, míg az oszlopról származó effluens OD₂₈₀ értéke vissza nem tért az alapvonalra (1,6 oszloptérfogat). Az a-2,3 NST-t ezután 50 mM kakodilsawal, 1 M NaCl-dal és 25% glicerinnel (pH=6,5) eluáltuk az oszlopról. Az a-2,3 NST-t tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük és egy éjszakán keresztül dializáltuk 1 liter 50 mM kakodilsawal, 0,5 M NaCl-dal, 50% glicerinnel (pH=6,0) szemben, ezt követően -80 °C hőmérsékleten tároltuk.

8. példa

A patkány a-2,3-N-sziaIiltranszferáz szöveti elterjedése A klónozott patkány a-2,3-N-szialiltranszferáz szöveti elterjedésének jellemzése céljából az összes RNS-t izoláltuk a különböző patkányszövetekből és ³²P-jelölt szialiltranszferáz cDNS-próbáknak vetettük alá. Egy körülbelül 2,5 Kb nagyságú mRNS-hez való hibridizálódást valamennyi vizsgált szövetnél megfigyeltünk. Ahogy azt a két klónozott szialiltranszferáznál megfigyeltük, az a-2,3-N-szialiltranszferáz különböző expressziót mutat a patkány szöveteiben. Az a-2,3-N-szialiltranszferáz mRNS legmagasabb szintjét az agyban mutattuk ki. A máj, vese, kólón, szív, petefészek és tüdő a hírvivő köztes szintjeit tartalmazta, míg alacsony mRNS-szinteket találtunk az állkapocs alatti mirigyben, a lépben és a bélben. Ezzel ellentétben a Galpl,4GlcNAc a-2,6-szialiltranszferáz mRNS legmagasabb szintjét a patkánymájban és az állkapocs alatti mirigyben, míg alacsony szintjeit a szívben, a petefészekben és az agyban találtuk.

9. példa

A konzervatív homológra régiója a katalitikus doménben

A szialiltranszferázok családjának konzervatív régiója.

A három klónozott szialiltranszferáz elsődleges szerkezetének összehasonlítása egy kiterjedt homológiát mutató régiót fedett fel (12. ábra). Ez a régió 55 aminosavat tartalmaz, az a-2,3-N-szialiltranszferáz 156. maradékától a 210. maradékáig terjed, és aminosavjai 42%ban azonosak, 58%-ban pedig konzervatívak (nagyon hasonlóak) mindhárom enzimben. A három szialiltranszferáz szekvenciái nem mutatnak egymással szignifikáns homológiát ezen a régión kívül. Mivel ez a homológ régió az enzimek katalitikus doménje központjának közelében helyezkedik el, az ezen szialiltranszferázok enzimatikus aktivitásához szükséges konzervatív szerkezetet képviselhet.

A glikoziltranszferázok szialiltranszferáz családjának három tagját klónoztuk. Bár a három szialiltranszferáz szekvenciájának 85%-a nem mutat szignifikáns homológiát, egy, a mindhárom molekula centrumában megtalálható 55 aminosavból álló régió erősen konzervatív, ezáltal ismétlődő proteinmotívumot sugallva a szialiltranszferáz családban. A proteinmotívum az aminosavak egy jól konzervált csoportja egy specifikus régióban. Más aminosavmaradékok ezen a régión kívül általában alig konzervatívak, így kicsi az általános homológia az azonos motívumot tartalmazó proteinek között. Ezen definíció szerint a három klónozott szialiltranszferáz elsődleges szerkezete által meghatározott konzervatív régió a szialiltranszferáz család egy motívuma. Fehéijemotívumok gyakran szerepelnek a katalízisben és ligandum22

HU 219 260 Β kötésben [Hodgman, T. C. Comput. Applic. Biosci. 5, 1-13 (1989); Bairoch, A. Prosite: A Dictionary of Protein Sites and Pattems, 5th edn., University of Genova (1990); és Stemberg, M. J. E., Natúré 349, 111 (1991)]. Mindhárom klónozott szialiltranszferáz katalizálja a szialinsav átvitelét CMP-NeuAc-ról a terminális galaktóz a2,3 vagy a2,6 kötésében a következő szekvenciákat létrehozva:

NeuAca2, 3 Galpl, 3 (4) GlcNAc- (ST3N)

NeuAca2,3 Ga$l,3GlcNAc- (ST3O)

NeuAca2,3 Gaipi,4GlcNAc- (ST6N)

Mindhárom enzimnek közös a funkciója. A konzervatív régió maradékainak több mint 50%-a vagy töltéssel rendelkező, vagy poláros aminosav, és egyaránt az enzimek felszínén helyezkednek el. Az ebben a régióban található töltéssel rendelkező maradékok közül 6 mindhárom szialiltranszferázban azonos. Nagyon szembetűnő, hogy a konzervatív régióban van hét egymás mellett elhelyezkedő aminosav, melyek mindhárom szialiltranszferázban azonosak

-Asp.Val.Gly.Ser.Lys.Thr.Thr (12. ábra).

10. példa

Egy új szialiltranszferáz klónozása a konzerválódott homológiarégió felhasználásával

A konzervatív homológiarégiót felhasználtuk a szialiltranszferáz géncsalád más tagjának a klónozásához. PCR-klónozás degenerált oligonukleotidokkal

Két, a konzervatív homológiarégió 5’- és 3’-végeinek megfelelő degenerált oligonukleotidot (13. ábra) szintetizáltunk (Genosys). Az 5’- és 3’-primerek szekvenciái sorrendben a következők voltak: 5’-GGAAGCTTTGSCRNMGSTGYRYCRTCGT ÉS 5’-CCGGATCCGGTRGTYTTNSNSCCACRTC (N=A + G + T + C, S = G + C, R=A + G, M = A + C, Y=C+T). PCR-kísérleteket végeztünk a primerek 100 pmol-jait és újszülött patkányagyból szintetizált első szál cDNS-t mint templátot használva. Az amplifikációt 30 ciklusban végeztük a következő körülmények között: 94 °C hőmérséklet 1 percig, 37 °C hőmérséklet 1 percig, és 72 °C hőmérséklet 2 percig. A PCRtermékeket BamHI és Hindlll enzimekkel emésztettük, és a Bluescript KS (Stratagene, 11099 North Torrey Pnes Road, La Jolla, Ca 92037) ezen helyeire szubklónoztuk. A szubklónokat T3 printerrel történő szekvenálással jellemeztük. Ezen szubklónok egyikének, az SMlnwk, amplifikált fragmentjét használtuk az alábbiakban egy szialiltranszferázt kódoló SMl-et tartalmazó génre való szkrínelésre.

Az SMl-et tartalmazó gén klónozása

Random módon príméit újszülött patkányagy cDNS-ét ligáltuk EcoRI-NotI kötőkkel, majd ezt követően EcoRI-gyel emésztett lambdagtlO-be ligáltuk. A létrehozott könyvtárat Strategen Gigapack II pakolókivonat felhasználásával pakoltuk és E. coli C600 hfl (ATCC 23704) törzsre szélesztettük. Hozzávetőleg 10⁶ plakkot szkríneltünk a klónozott SM1 PCR-fragmenttel. Négy kiónt, STX1-4, megtisztítottunk és a Bluescript (Stratagene) NotI helyére szubklónoztuk további analízis céljából.

Northem-analízis

Egy korábban leírt [Chomoznsyi, P., et al., Anal. Biochem. 162,136-159 (1987)] savanyú fenolos eljárását alkalmazva készítettünk elő patkányszövetekből származó teljes RNS-t. Újszülött RNS-mintákat izoláltunk a patkánykölykökből születésüket követő 4 órán belül. Az RNS-t formaldehidet tartalmazó 1%-os agarózgélen elektroforézisnek vetettük alá, nitrocellulózra vittük, és a standard eljárásnak megfelelően [Kriegler,

M. Gene transfer and expression, Stockton Press, N. Y.,

N. Y. (1990)] hibridizáltuk. A Northem-lenyomatokat STXl-ből izolált tisztított radiojelölt, 900 bp hosszúságú EcoRI fragment próbával teszteltük.

Az STX egy oldható formájának megszerkesztése

Az STX egy megrövidített formáját, melyből a nyílt leolvasási keret első 31 aminosavja hiányzik, készítettük el PCR amplifikációval egy kereten belüli BamHIhelyet tartalmazó 5’ és egy, az stp kodontól 50 bp távolságra downstream található 3’-primer felhasználásával. Az amplifikációt 30 ciklusban végeztük a következő körülmények mellett: 94 °C hőmérséklet, 1 perc; 45 °C hőmérséklet 1 perc és 72 °C hőmérséklet 2 perc. A pGIR201 protA fúziós vektort a pRIT5-ből (Pharmacia LKB Biotech, Inc., 1025 Atlantic Avenue, Suite 101, Alameda, CA 94501) izolált a protein A IgG kötődoménjét kódoló BcII/BamHI fragmentnek a pGIR201 (Dr. K. Drickamer ajándéka, fenntartja a Columbia University, Washington DC) BamHI helyére történő inzertálásával hoztuk létre. Az amplifikált ffagmentet a pGIR201 protA BamHI helyére szubklónoztuk, melynek eredményeként az STX az inzulin jelszekvenciához és a vektorban jelen levő protein A-hoz fuzionált. Egy, a fúziós proteint tartalmazó Nhe fragmentet szubklónoztuk a pSVL plazmidba, mely az AX78 expreszsziós plazmid létrehozását eredményezte.

Az STX oldható formájának expressziója

Az AX78 expressziós plazmidot (10 pg) COS-1 sejtekbe transzfektáltuk 10 cm-es lemezeken. A transzfekció után két nappal a tenyésztápközeget összegyűjtöttük, és IgG sepharózzal (Pharmacia) inkubáltuk 1 óráig szobahőmérsékleten. A gyöngyöket szialiltranszferázaktivitásra vizsgáltuk; oligoszacharidokat fagyásgátló glikoproteint és akceptorként kevert gangliozidokat és neuraminidáz-kezelt újszülött patkányagy-membránokat használva. A szilainsav ezen akceptorokra való átvitelét ioncserével [Weinstein, J., et al., J. Bioi. Chem. 257, 13835-13844 (1982)], méretexklúzióval (Id) és leszálló papírkromatográfiával [McCoy, R.D., et al, J. Bioi. Chem. 260, 12695-12699 (1985)] mértük.

Azonos transzfekciókat végeztünk az impulzuskövető jelölőkísérletekhez. Egy 36 órás expressziós periódust követően a lemezeket 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk

2,5 ml DMEM-methioninnal. 1 óra után 250 pCI³⁵Stranslabelt (Amersham, 2636 S. Clairebrook, Arlington Heights, IL 60005) adtunk a tápközeghez, és a lemezeket további 3 óráig inkubáltuk. Ezen idő elteltével a lemezeket mostuk és egy éjszakán keresztül inkubáltuk komplett DMEM-mel. A jelölt fúziós proteineket IgG sepharose-zal (Pharmacia) való inkubálás segítségével izoláltuk. A kötődést követően a gyöngyöket mostuk, Lae23

HU 219 260 Β malli-mintapufferben főztük, és a felszabadult proteineket SDS-PAGE/fluorográfia segítségével analizáltuk.

Egy, a jellemzett szialiltranszferázokkal rokonságot mutató konzervatív homológiarégió PCR amplifikációja.

Míg a jelzett szialiltranszferázok konzerválódott homológiarégiójában jelen lévő aminosavaknak körülbelül 70%-a konzerválódott, a legnagyobb folyamatos konzerválódott régiók a konzerválódott homológiarégiók végein lévő aminosavszekvenciákban találhatók (13. ábra). A konzerválódott homológiarégió C-terminális végéhez közeli aminosavszekvenciáról megállapítottuk, hogy hét változatlan maradékból álló folyamatos szakaszt tartalmaz. Ezen aminosavszekvencia erős konzerválódottsága lehetővé tette egy viszonylag alacsony komplexitású, a kodonhasználatban megfigyelt valamennyi variációt jelölő, 256-szoros degenerációval rendelkező oligonukleotid tervezését. A konzerválódott homológiarégió N-terminális végének megfelelő oligonukleotid tervezése sokkal bonyolultabb volt. Az ezen régióban jelen lévő aminosavak több változatosságot mutatnak mint azok, melyek a konzerválódott homológiarégió ellenkező végén találhatók. Az oligonukleotidtervezést tovább komplikálta az aminosavak nagyfokú kodonredundanciája. Ezen tényezők kompenzálása céljából az oligonukleotidot a konzerválódott homológiarégió 5’-végétől kiindulva 1026-szoros degenerációval szintetizáltuk. Bár a komplexitás ezen foka közel van a PCR-kísérletekben megengedhető degenerációs küszöbhöz, a keletkezett primer számításba veszi az ezen konzerválódott homológiarégiót kódoló összes nukleotidszekvenciát.

A neutrális fejlődés egy összetett folyamat, mely során a glikoziltranszferázok dinamikus szabályozás alatt állnak, ahogy az nyilvánvaló a sejtfelület szénhidrátexpressziójának drámai változásaiból. Ezért az újszülött patkányagyat választottuk az új szialiltranszferázok izolálására tett erőfeszítések forrásául. Templátként újszülött patkányagy-cDNS-t használva, a degenerált primerekkel végzett PCR-kísérletek egy 150 bp nagyságú sáv amplifíkációjához vezettek, melynek mérete megegyezik a konzervatív homológiarégió ismert méretével. A szubklónozás és szekvenálás felfedte, hogy a sáv két DNS-fragment keveréke volt. A harminc jellemzett izolátum 56%-a az α konzerválódott homológiarégiót kódolta; a fennmaradó kiónok pedig egy egyedi konzerválódott homológiarégiót, az SMl-et kódolták. Némileg meglepően az SM1 öt változást tartalmaz azokban az aminosavakban, melyeket a korábban klónozott három szialiltranszferázban változatlannak találtunk. Míg ezek a változások csökkentik a változatlan maradékok teljes számát, az SM1 jellemzéséből nyert új szekvenciainformáció emeli a megegyező szekvencia általános konzervatív jellegét. Az SM1 megjósolt aminosavszekvenciája nem mutat eltolódást egyik egyedi konzervatív homológiarégió felé sem. Bizonyos pozíciókban (1., 2., 53., 54. aminosavak) az SM1 a-2,6 konzervatív homológiarégióra hasonlít; más pozíciókban (8., 9., 54., 55. aminosavak) az SM1 az a-2,3 konzervatív homológiarégió szekvenciáit tükrözi vissza. Míg a konzervatív homológiarégió 85%-ban konzervált, a hasonlóság ezen mérlege azt eredményezi, hogy az SM1 megközelítően 45%-ban homológ a szialiltranszferáz géncsalád más tagjaival.

Az SMl-et tartalmazó gén elsődleges szerkezete

Az 1,5 kb hosszúságú STX1 klónszekvencia analízise azonosította a korábbi PCR-kísérletekben (14. ábra) jellemzett SM1 konzervatív homológiarégiót kódoló folyamatos 375 aminosavból álló nyílt leolvasási keretet. Az STX1 származtatott aminosavszekvenciája azt sugallja, hogy ez a protein II típusú transzmembránprotein, ahogy azt a glikoziltranszferázok más kiónjai esetén is megfigyeltük. Az STX1 becsült aminosavszekvenciája jelzi a protein aminoterminusából származó 8 maradék hosszúságú hidrofób régió jelenlétét, mely jelközvetítő doménként szolgálhat. A konzervált homológiarégió a protein centrumához közel helyezkedik el. Az STX protein teljes mérete és a hidrofób és a konzervatív homológiarégiók relatív elhelyezkedése erősen emlékeztet a klónozott szialiltranszferázok elsődleges szekvenciajellemzőire. Bár az STX a konzervatív homológiarégión kívül nem mutat homológiát a klónozott szialiltranszferázokkal, az ezen gének kifejezett szerkezeti hasonlóságai világossá teszik, hogy az STX ezen géncsalád legújabb tagját képviseli.

Az STX enzimatikus jellemzése

A szialiltranszferázok természetesen előforduló oldható formái a testfolyadékokban és különböző szekrétumokban találhatók [Paulson, J. C., et al., J. Bioi. Chem. 252, 2356-2367 (1977) és Hudgin, R. L., et al., Can. J. Biochem. 49, 829-837 (1971)]. Ezek az oldható formák proteolitikus emésztés eredményei, melyek a szialiltranszferáz törzs régióját hasítják, felszabadítva a katalitikus domént a transzmembránrögzítőről. Az oldható szialiltranszferázok rekombináns úton is megszerkeszthetők az endogén jelrögzítő dómén hasítható jelszekvenciával való helyettesítésével [Colley, K. J., et al., J. Bioi. Chem., 264, 17619-17622 (1989)]. Az STX funkcionális analízisének elősegítése érdekében a protein egy oldható formáját hoztuk létre az első 31 aminosav hasítható inzulin jelszekvenciával és az A protein IgG-kötő doménnel való helyettesítésével. Az IgG-kötő domént beépítettük a szerkezetbe, az oldható STX protein detektálásának elősegítése céljából. Az ST3N-nel való hasonló fúziók aktívan szekretálhatók expresszálósejtekből, melyeket az IgG sepharose köt, és enzimatikusan aktívak. Amikor az A protein/STX fúziót (AX78) tartalmazó expressziós plazmid expresszálódott a COS-1 sejtekben, egy 85 kd hosszúságú proteint izoláltunk. A fúziós protein mérete megközelítően 15 kdnal nagyobb a polipeptid becsült molekulatömegénél, azt sugallva, hogy az STX potenciális N-kötésű glikozilációs helyeinek egy része hasznosult.

A kötött fúziós proteint szialiltranszferáz-aktivitásra vizsgáltuk számos akceptorszubsztrátot használva. Nem észleltünk aktivitást a Galpl,3(4)GlcNAc szekvenciát tartalmazó β-galoktozidot használva; hasonlóképpen nem detektáltuk a szialinsav fagyásgátló glikoprotein O-kötésű oligoszacharidjaihoz való transzferálást sem. Az STX agyszövetben való expressziója azt su24

HU 219 260 Β gallja, hogy a gén részt vesz a glikolipid bioszintézisben; azonban a felnőttszarvasmarha-agyból izolált kevert gangliozidok nem szolgálnak akceptorszubsztrátként. A neutroamidázzal kezelt újszülöttagymembránok voltak az egyedüli szubsztrátok, melyek csak igen csekély képességet mutattak arra, hogy akceptorként szolgáljanak. A kezelt membránok STX fúziós proteinnel való inkubálása 50%-os aktivitást eredményezett a háttérhez képest.

Az STX fejlődési és szövetspecifikus expressziója

Az STX expressziós mintájának és hírvivő méretének meghatározásához Northem-lenyomatokat próbáltattunk egy STXl-ből izolált 900 bp hosszúságú EcoRI fragmenttel. A különböző vizsgált szövetek közül egy

5,5 kb hosszúságú hírvivő hibridizációját csupán újszülött-patkányagy-RNS-ben figyeltük meg. Nem figyeltünk meg a konzervatív homológiarégióval kapcsolatos kereszthibridizációt. Az STX korlátozott expressziója kiindulás a differenciált szövet specifikus expresszióból, melyet a jellemzett szialiltranszferázok esetében találtunk. Míg ezen gének mindegyike függetlenül szabályozott a szövetspecifikus expresszió eltérő mintáit eredményezve, általában az egyes szialiltranszferázok változatos módon expresszálódnak eltérő szövetekben [Paulson, J. C., etal., J. Bioi. Chem. 264, 10931-10934 (1989)]. Ezzel szemben az STX csak az újszülöttagyban expresszálódik, az expresszió nem tűnik általánosított embrionális jelenségnek, mivel a hírvivőt nem detektáltuk az újszülött veséjében.

Claims (8)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Szialiltranszferáz-enzimaktivitást kifejtő rekombináns polipeptid, ahol a polipeptidenzim egy katalitikus domént tartalmaz, azzal jellemezve, hogy a katalitikus dómén a

   Cys-Arg-Arg-Cys-Ala-Val-Val-Gly-Asn-Ser-GlyAsn-Leu-Lys-Glu-Ser-Tyr-Tyr-Gly-Pro-Gln-Ile-AspSer-His-Asp-Phe-Val-Leu-Arg-Met-Asn-Lys-Ala-ProThr-Glu-Gly-Phe-Glu-Ala-Asp-Val-Gly-Ser-Lys-ThrThr-His-His-Phe-Val-Tyr-Pro-Glu; vagy

   Cys-Arg-Arg-Cys-Ile-Ile-Val-Gly-Asn-GlyGly-Val-Leu-Ala-Asn-Lys-Ser-Leu-Gly-Ser-Arg-IleAsp-Asp-Tyr-Asp-Ile-Val-Leu-Arg-Leu-Asn-Ser-AlaPro-Val-Lys-Gly-Phe-Glu-Lys-Asp-Val-Gly-Ser-LysThr-Thr-Leu-Arg-Ile-Thr-Tyr-Pro-Glu; vagy

   Phe-Gln-Thr-Cys-Ala-Ile-Val-Gly-Asn-Ser-GlyVal-Leu-Leu-Asn-Ser-Gly-Cys-Gly-Gln-Glu-Ile-AspThr-His-Ser-Phe-Val-Ile-Arg-Cys-Asn-Leu-Ala-ProVal-Gln-Glu-Tyr-Ala-Arg-Asp-Val-Gly-Leu-LysThr-Asp-Leu-Val-Thr-Met-Asn-Pro-Ser;

   aminosavsorrenddel rendelkező konzerválódott homológiarégiót, valamint ezek variánsait tartalmazza, ahol szialiltranszferáz enzim konzerválódott homológiarégiójában, az aminosavak legalább 58%-a konzerválódott, és ahol a katalitikus dómén legalább egy olyan aminosavval rendelkezik, amelynek helye üres, vagy amely más aminosavval helyettesített, vagy amely a katalitikus doménba inzertált, és amelynél az enzim β-galaktozid a-2,6-szialiltranszferáz-aktivitása hiányzik.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti rekombináns polipeptid enzim, azzal jellemezve, hogy a polipeptid enzim tartalmaz egy további transzmembrán domént.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti rekombináns polipeptid enzim, azzal jellemezve, hogy a polipeptid enzim tartalmaz egy további citoplazmás domént.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti rekombináns polipeptid enzim, azzal jellemezve, hogy az lényegében in vivő fiziológiai környezetben található alkotórészektől mentes, és ahol a szialiltranszferáz a 14. ábrán látható aminosavszekvenciával rendelkezik.
5. 5. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns polipeptid enzimet kódoló DNS-molekula.
6. 6. Az 14. ábra által bemutatott aminosavsorrenddel rendelkező szialiltranszferázt kódoló DNS-molekula.
7. 7. Az 5. vagy 6. igénypont szerinti DNS-molekulát tartalmazó rekombináns expressziós vektor.
8. 8. A 7. igénypont szerinti expressziós vektorral transzformált sejtet tartalmazó készítmény.