NO340408B1 - Fremgangsmåte for å produsere humant alfa-galaktosidase A, og farmasøytisk preparat - Google Patents

Description

Denne oppfinnelse angår en fremgangsmåte for å produsere humant a-galaktosidase A og et farmasøytisk preparat for anvendelse i behandling av a-galaktosidase A-mangel.

Fabrys sykdom er en X-tilknyttet arvelig lysosomlagrings-sykdomkarakterisert vedsymptomer så som alvorlig nyresvekkelse, angiokeratomer og kardiovaskulære abnormiteter, innbefattende ventrikkelforstørrelse og mitralklaff-insuffisiens. Sykdommen påvirker også det perifere nervesystem og forårsaker anfall med plagsom, brennende smerte i ekstremitetene. Fabrys sykdom forår-sakes av en mangelfullhet ved enzymet a-galaktosidase A (a-gal A), som resulterer i blokkering av katabolismen av nøytrale glykosfingolipider og opp-hoping av enzymets substrat, keramidtriheksosid, i celler og i blodstrømmen.

På grunn av sykdommens X-tilknyttede arvemønster er hovedsakelig alle pasienter med Fabrys sykdom mannlige. Skjønt noen få alvorlig angrepne kvinnelige heterozygoter er blitt observert, er kvinnelige heterozygoter vanligvis enten asymptomatiske eller har forholdsvis svake symptomer som i stor grad er begrenset til en karakteristisk opasitet av hornhinnen. En atypisk variant av Fabrys sykdom, som oppviser lav rest- a-gal A-aktivitet og enten meget svake symptomer eller tilsynelatende ingen andre symptomer som er karakteristiske for Fabrys sykdom, samsvarer med hypertrofi av venstre ventrikkel og hjertesykdom (Nakano et al., New Engl. J. Med. 333:288-293, 1995). Det er blitt spekulert i at reduksjon i a-gal A kan være årsaken til slike hjerte-abnormiteter.

cDNA og genet som koder for humant a-gal A, er blitt isolert og sekvensert (Bishop et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83:4859, 1986; Kornreich et al., Nuc. Acids Res. 17:3301, 1988; Oeltjen et al., Mammalian Genome 6:335-338, 1995). Humant a-gal A uttrykkes som et 429-aminosyre-polypeptid hvorav de N-terminale 31 aminosyrer utgjør et signalpeptid. Det humane enzym er blitt uttrykt i kinesisk hamster-ovarieceller (CHO)

(Desnick, US-patentnr. 5 356 804; Ioannou et al., J. Cell Biol. 119:1137, 1992); insektceller (Calhoun et al., US-patent nr. 5 179 023); og COS-celler (Tsuji et al., Eur. J. Biochem. 165:275,1987). Pilotforsøk angående a-gal A-erstatningsterapier er blitt rapportert, hvor det er blitt anvendt protein fra humant vev (Måpes et al., Science 169:987 1970; Brady et al, N. Engl. J. Med. 289:9. 1973; Desnick et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 76:5326, 1979), men det er for tiden ingen effektiv behandling når det gjelder Fabrys sykdom.

EP 0307285 vedrører rekombinante eukaryotiske celler som produserer interleukin-2 som inneholder, med de midler som er nødvendig for deres ekspresjon, en DNA-sekvens som koder for dihydrofolat-reduktase og en DNA-sekvens som koder for en hybrid-forløper for interleukin-2, i hvilken peptidsignalet er det av en av de naturlig forløpere av humant veksthormon.

WO 9308292 vedrører en metode for den passende transformasjon av de somatiske cellene fra dyr for å innføre terapeutiske proteiner i dyret. Somatisk celletransformasjon er nyttig for medisinsk og veterinær håndtering av genetiske sykdommer, og andre terapeutiske eller dyreforbedringsformål. Kopier av en eksogen genetisk konstruksjon kan belegges på bærerpartikkel og akselereres inn i det indre av dyrets celler in situ.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører derfor en fremgangsmåte for å produsere humant a-Gal A, som omfatter (a) dyrking av en genmanipulert human celle modifisert for å overuttrykke og utskille humant a-Gal A i et medium, (b) samling av mediet som omfatter humant a-Gal A fra nevnte dyrkede celler, og (c) rensing av humant a-Gal A fra mediet ved (i) å sende mediet over en hydrofob interaksjonsharpiks og eluere humant a-Gal A fra harpiksen, og (ii) sende eluert humant a-Gal A over kolonner som inneholder en immobilsert heparinharpiks, hydroksyapatitt, en anionbytterharpiks og en størrelsesekslusjonsharpiks, og eluere renset humant a-Gal A fra den siste kolonnen, hvor renset humant a-Gal A er fri for proteinholdige lektinaffinitets-midler og a-Gal A substrat analoge midler.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører også et farmasøytisk preparat som omfatter et renset humant a-Gal A enzym glykosylert for anvendelse i enzymerstatningsterapi av en a-Gal A mangel, hvor preparatet er uten (i) proteinholdige lektinaffinitetsmidler og (ii) a-Gal A substrat analoge midler.

Det er blitt funnet at uttrykking av et DNA som koder for humant a-gal A i dyrkede humane celler, gir et polypeptid som er passende glykosylert, slik at det ikke bare er enzymatisk aktivt og kan virke på glykosfingolipid-substratet som opphopes ved Fabrys sykdom, men også effektivt internaliseres av celler via celle-overflatereseptorer som bringer det nøyaktig dit hvor det trenges ved denne sykdom; lysosom-delen av angrepne celler, spesielt endotelcellene som bekler pasientens blodkar innvendig. Denne oppdagelse, som er omtalt mer detaljert nedenfor, betyr at et individ som man mistenker har en a-gal A-mangelfullhet så som Fabrys sykdom, kan behandles med renset humant a-gal A fra dyrkede, genetisk modifiserte humane celler.

Når celler skal modifiseres genetisk for de formål å behandle Fabrys sykdom ved enzymerstatningsterapi, kan et DNA-molekyl som inneholder en a-gal A-cDNA- eller genom-DNA-sekvens, inngå i en ekspresjonskonstruksjon og innføres i primære eller sekundære humane celler (f.eks. fibroblaster, epitelceller innbefattende bryst- og intestinal-epitelceller, endotelceller, formede elementer i blodet innbefattende lymfocytter og benmargs-celler, gliaceller, hepatocytter, keratinocytter, muskelceller og nerveceller, eller forløperne til disse celletyper) ved hjelp av standardmetoder for transfektering, innbefattende, men ikke begrenset til, liposom-, polybren- eller DEAE dekstran-formidlet transfektering, elektroporering, kalsiumfosfatutfelning, mikroinjeksjon eller hastighetsdrevne mikroprosjektiler («biolistiner»). Man kan alternativt anvende et system som avgir DNA ved hjelp av virusvektor. Virus som er kjent for å være egnet til genoverføring, innbefatter adenovirus, adenotilknyttet virus, herpesvirus, kusmavirus, poliovirus, retrovirus, Sindbis-virus og koppevirus så som kanarikoppevirus («canary pox virus»). Man kan også anvende udødeliggjorte humane celler. Eksempler på udødeliggjorte humane cellelinjer egnet ved foreliggende metoder innbefatter, men er ikke begrenset til, Bowes melanomceller (ATCC aksesjonsnr. CRL 9607), Daudi-celler (ATCC aksesjonsnr. CCL 213), HeLa-celler og derivater av HeLa-celler (ATCC aksesjonsnr. CCL 2, CCL 2.1 og CCL 2.2), HL-60-celler (ATCC aksesjonsnr. CCL 240), HT1080-celler (ATCC aksesjonsnr. CCL 121), Jurkat-celler (ATCC adkomst nr. TIB 152), KB karsinomceller (ATCC aksesjonsnr. CCL 17), K-562 leukemiceller (ATCC aksesjonsnr. CCL 243), MCF-7 brystkreftceller (ATCC aksesjonsnr. BTH 22), MOLT-4-celler (ATCC aksesjonsnr. 1582), Namalwa-celler (ATCC aksesjonsnr. CRL 1432), Rajiceller (ATCC aksesjonsnr. CCL 86), RPMI 8226-celler (ATCC adkomst nr. CCL 155), U-937-celler (ATCC aksesjonsnr. CRL 1593), WI-38VA13-celler sublinje 2R4 (ATCC aksesjonsnr. CLL 75.1) og 2780AD ovariekarsinomceller (Van der Blick et al., Cancer Res. 48:5927-5932,1988) samt heterohybridomceller dannet ved fusjon av humane celler og celler fra en annen art. Sekundære humane fibro-blaststammer, så som WI-38 (ATCC aksesjonsnr. CCL 75) og MRC-5 (ATCC adkomst nr. CCL 171), kan også anvendes.

Etter genspleising av humane celler med et DNA-molekyl som koder for a-gal A (eller etter en annen passende genetisk modifikasjon, som beskrevet nedenfor), under dannelse av en celle som overuttrykker og utsondrer a-gal A, kan det dannes en klonal cellestamme som i det vesentlige består av mange genetisk identiske dyrkede primære humane celler, eller hvor cellene er udødeliggjorte, en kloncellelinje som i det vesentlige består av mange genetisk identiske udødeliggjorte humane celler. Cellene i kloncellestammen eller kloncellelinjen er fortrinnsvis fibroblaster.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen avhenger ikke av den eventuelt ikke-konsekvente tilgjengelighet av kilder til passende vev, og er således en kommersielt levedyktig metode til behandling av a-gal A-mangel. Den er forholdsvis risikofri sammenliknet med enzymerstatningsterapi med enzym fra humant vev, som kan være infisert med kjente eller ukjente virus og andre infiserende midler.

Som beskrevet ovenfor, kan individer med a-gal A-mangelfullhet behandles med renset a-gal A (dvs. enzymerstatningsterapi). Primære, sekundære eller immortaliserte humane celler som er genetisk modifisert til å over-uttrykke humant a-gal A, vil også være nyttige for proteinfremstilling in vitro, ved fremstilling av protein som kan renses for enzymerstatningsterapi. Sekundære eller immortaliserte humane celler kan velges blant dem som er beskrevet ovenfor, og kan modifiseres genetisk ved transfeksjons- eller transduksjons-metodene som også er beskrevet ovenfor. Etter genetisk modifikasjon dyrkes cellene under betingelser som muliggjør over-ekspresjon og utsondring av a-gal A. Proteinet isoleres fra de dyrkede celler ved oppsamling av mediet hvor cellene er dyrket og/eller lysering av cellene for frigjøring av innholdet i dem, og deretter anvendelse av standard-proteinrensingsteknikker. En slik teknikk innbefatter at dyrkningsmediet, eller hvilken som helst prøve som inneholder humant a-gal A, ledes over en hydrofob interaksjonsharpiks så som Butyl Sepharose® eller en annen harpiks med en funksjonell del som innbefatter en butylgruppe. Leding av prøven over en slik harpiks kan utgjøre det første kromatografitrinn. Hvis ytterligere rensing trenges, kan det a-gal A-holdige materiale som er eluert fra den hydrofobe interaksjonsharpiks, ledes over en kolonne inneholdende en andre harpiks, så som en immobilisert heparinharpiks så som Heparin Sepharose®, hydroksyapatitt, en anionbytterharpiks så som Q Sepharose® eller en størrelses-utelukkelsesharpiks så som Superdex® 200. Renseprotokollen vil fortrinnsvis innbefatte anvendelse av hver av ovennevnte typer harpikser.

Tidligere metoder for fremstilling av a-gal A med forholdsvis høy renhet var avhengig av anvendelse av affinitetskromatografi, med anvendelse av en kombinasjon av lektinaffinitetskromatografi (concanavalin A (Con A) Sepharose) og affinitetskromatografi basert på binding av a-gal A til substrat-analogen N-6-aminoheksanoyl-a-D-galaktosylamin koplet til en Sepharose-matriks (Bishop et al., J. Biol. Chem. 256:1307- 1316, 1981). Anvendelse av proteinholdige lektin-affinitetsharpikser og substrat-analoge harpikser er typisk forbundet med kontinuerlig utluting av affinitetsmidlet fra den faste bærer (jf. Marikar et al., Anal. Biochem. 201:306-310, 1992), noe som resulterer i forurensing av det rensede produkt med affinitetsmidlet enten fritt i løsning eller bundet til eluert protein. Slike forurensninger gjør produktet uegnet for anvendelse i farmasøytiske preparater. Bundne substrat-analoger og lektiner kan også ha hovedsakelig negative virkninger på de enzymatiske, funksjonelle og strukturelle egenskaper hos proteiner. Videre er slike affinitetsharpikser typisk kostbare å fremstille, noe som gjør anvendelsen av slike harpikser mindre egnet for produksjon i kommersiell målestokk enn mer konvensjonelle kromatografiharpikser. Utviklingen av en renseprotokoll ved anvendelse av konvensjonelle kromatografiharpikser som er lett tilgjengelige når det gjelder tilførsel og kvalitet egnet for kommersiell anvendelse i stor målestokk, er en betydelig fordel ved foreliggende oppfinnelse.

Et individ som man mistenker har en a-gal A-mangel, kan behandles ved administrering av farmasøytisk akseptabelt, renset humant a-gal A ved hjelp av hvilken som helst standardmetode, innbefattende, men ikke begrenset til, intravenøs, subkutan eller intramuskulær injeksjon, eller som faststoff-implantat. Det rensede protein kan utformes i et terapeutisk preparat bestående av en vandig løsning inneholdende en fysiologisk akseptable eksipiens, f.eks. en bærer så som humant serumalbumin, ved pH 6,5 eller lavere.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således en måte til oppnåelse av store mengder av hensiktsmessig glykosylert og derfor terapeutisk egnet humant a-gal A. Dette gjør enzymerstatningsterapi ved a-gal-mangel kommersielt levedyktig, samt relativt risikofritt sammenliknet med terapi med enzym fra humant eller animalsk vev.

Fagfolk på området vil være klar over at den humane a-gal A-DNA-sekvens (enten cDNA eller genom-DNA) eller sekvenser som er forskjellige fra denne enten på grunn av stumme kodonforandringer eller kodonforandringer som gir konservative aminosyresubstitusjoner, kan anvendes til genetisk modifisering av dyrkede humane celler slik at de vil over-uttrykke og utsondre enzymet. Det er også mulig at visse mutasjoner i a-gal A-DNA-sekvensen vil kode for polypeptider som bibeholder eller oppviser forbedret a-gal A-enzymatisk aktivitet (noe som vil være åpenbart ved ekspresjon av det mutante DNA-molekyl i dyrkede celler, rensing av det kodede polypeptid og måling av den katalytiske aktivitet, som beskrevet i det foreliggende). Man vil for eksempel vente at konservative aminosyresubstitusjoner har liten eller ingen virkning på den biologiske aktivitet, spesielt hvis de representerer mindre enn 10% av det totale antall rester i proteinet. Konservative substitusjoner innbefatter typisk substitusjoner i følgende grupper: glycin, alanin; valin, isoleucin, leucin; asparaginsyre, glutaminsyre; asparagin, glutamin; serin, treonin; lysin, arginin; og fenylalanin, tyrosin.

Cellenes dannelse av a-gal A kan maksimeres ved hjelp av visse genetiske manipulasjoner. For eksempel kan DNA-molekylet som koder for a-gal A, også kode for et heterologt signalpeptid, så som signalpeptidet for humant veksthormon (hGH), erytropoietin, Faktor VIII, Faktor IX, glukagon, lavdensitets-lipoprotein-(LDL)-reseptoren eller et annet lysosomalt enzym enn a-gal A. Signalpeptidet er fortrinnsvis hGH-signalpeptidet (SEKV ID NR. 21) og er i den N-terminale ende av det kodede protein. DNA-sekvensen som koder for signalpeptidet, kan inneholde et intron så som det første intron i hGH-genet, som resulterer i en DNA-sekvens så som SEKV ID NR. 27 (se også fig. 10). Videre kan DNA-molekylet også inneholde en 3' ikke-translatert sekvens (UTS) som har en lengde på minst 6 nukleotider (i motsetning til a-gal A-mRNA som finnes hos mennesker, og som ikke har noen 3' UTS, idet det nødvendige polyadenyleringssete er inne i kodings-sekvensen). UTS befinner seg umiddelbart 3' i forhold til terminerings-kodonet i kodesekvensen og innbefatter et polyadenyleringssete. Den har fortrinnsvis en lengde på minst 6 nukleotider, mer foretrukket minst 12, og mest foretrukket minst 30, og i alle tilfeller inneholder den sekvensen AATAAA eller en beslektet sekvens som tjener til befordring av polyadenylering. Et DNA-molekyl som beskrevet, dvs. som koder for et hGH-signalpeptid knyttet til a-gal A og inneholdende en 3' UTS som innbefatter et polyadenyleringssete, og som fortrinnsvis innbefatter ekspresjons-kontrollsekvenser, kan anvendes for utførelse av oppfinnelsen.

Andre trekk og fordeler ved oppfinnelsen vil bli åpenbare ut fra den detaljerte beskrivelse som følger, samt kravene.

Betegnelsen «genetisk modifisert» anvendt i det foreliggende ved henvisning til celler, er ment å innbefatte celler som uttrykker et spesielt genprodukt etter innføring av et DNA-molekyl som koder for genproduktet, og/eller regulerende elementer som regulerer ekspresjonen av en kodingssekvens. Innføring av DNA-molekylet kan utføres ved gen-målsøking (dvs. innføring av et DNA-molekyl i et spesielt genom-sete); videre muliggjør homolog rekombinasjon erstatning av selve det defekte gen (det defekte a-gal A-gen eller en del av det kan erstattes i en Fabry-pasients egne celler med hele genet eller en del derav).

Betegnelsen «a-gal A» anvendt i det foreliggende betyr a-gal A uten signalpeptid, dvs. SEKV ID NR. 26 (fig. 9). Det er en viss indikasjon på at restene 371-398 eller 373-398 i SEKV ID NR. 26 (fig. 9) kan fjernes i lysosomet; imidlertid antas det at fjerning av dette antatte propeptid ikke påvirker enzymets aktivitet. Dette tyder på at hvilken som helst del av det antatte propeptid kan utelates uten at det påvirker aktiviteten. Således dekker betegnelsen «a-gal A» som anvendt i det foreliggende, også et protein med en sekvens som svarer til SEKV ID NR. 26, bortsett fra at det mangler opp til 28 rester i den C-terminale ende av denne sekvens.

Med «a-gal A-mangel» menes hvilken som helst mangel i mengden eller aktiviteten av dette enzym hos en pasient. Mangelen kan bevirke alvorlige symptomer som typisk observeres hos mannlige pasienter som lider av Fabrys sykdom, eller den kan være bare partiell og gi forholdsvis svake symptomer, slik som det kan sees hos heterozygote kvinnelige bærere av det defekte gen.

Anvendt i det foreliggende innbefatter betegnelsen «primærcelle» celler som finnes i en suspensjon av celler isolert fra en virveldyr-vevskilde (før utplating av dem, dvs. festing til et vevskulturunderlag så som en skål eller kolbe), celler som finnes i et eksplantat fra vev, begge de foregående typer celler utplatet første gang, samt cellesuspensjoner tilveiebrakt fra disse utplatede celler.

«Sekundære cellen) angir celler i alle etterfølgende trinn ved dyrkningen. Det vil si at første gang en utplatet primærcelle fjernes fra dyrkningsunderlaget og gjenutplates (gjennomgår en runde [«is passaged»]), omtales den som en sekundær celle, og likeså alle celler i etterfølgende runder («passages»).

En «cellestamme» består av sekundære celler som har gjennomgått én eller flere runder; oppviser et endelig antall middelpopulasjons-doblinger i kultur; oppviser egenskapene ved en kontakt-inhibert, forankringsavhengig vekst (bortsett fra celler som er formert i suspensjonskultur); og er ikke immortalisert.

Med «immortalisert celle» menes en celle fra en etablert cellelinje som oppviser et tilsynelatende ubegrenset livsforløp i kultur.

Med «signalpeptid» menes en peptidsekvens som styrer et nylig syntetisert polypeptid som det er festet til, til det endoplasmatiske retikulum for ytterligere post-translasjonell bearbeidelse og/eller fordeling.

Betegnelsen «heterologt signalpeptid» anvendt i det foreliggende i forbindelse med a-gal A angir et signalpeptid som ikke er det humane a-gal A-signalpeptid (dvs. det som er kodet for av nukleotidene 36-128 i SEKV ID NR. 18). Det er typisk signalpeptidet i et eller annet pattedyrprotein som ikke er a-gal A.

Betegnelsen «første kromatografitrinn» angir den første påføring av en prøve på en kromatografikolonne (alle trinn knyttet til fremstillingen av prøven er utelukket).

Det vises nå til tegningene.

Fig. 1 er en presentasjon av proben på 210 bp som ble anvendt til isolering av a-gal A fra et humant fibroblast-cDNA-bibliotek (SEKV ID NR. 19). Sekvensen er fra ekson 7 i a-gal A-genet. Proben ble isolert fra human genom-DNA ved hjelp av polymerasekjedereaksjonen (PCR). Områdene som er understreket på figuren, svarer til sekvensene i amplifikasj ons-primerne. Fig. 2 er en representasjon av sekvensen av DNA-fragmentet som fullfører 5'-enden av a-gal A-cDNA-klonet (SEKV ID NR. 20). Dette fragment ble amplifisert fra human genom-DNA ved hjelp av PCR. De understrekede områder svarer til sekvensene for amplifikasj ons-primerne. Posisjonene for Ncol- og SacII-restriksjonsendonukleasesetene, som ble anvendt til subkloning som beskrevet i eksempel IA, er også vist. Fig. 3 er en representasjon av sekvensen av a-gal A-cDNA, innbefattende sekvensen som koder for signalpeptidet (SEKV ID NR. 18). Fig. 4 er et skjematisk kart over pXAG-16, en a-gal A-ekspresjons-konstruksjon som innbefatter CMV-(cytomegalovirus)-promotoren og -intronet, den hGH-signalpeptid-kodende sekvens og første intron, cDNA for a-gal A (dvs. som mangler a-gal A-signalpeptidsekvensen) og hGH 3' UTS. Fig. 5 er et skjematisk kart over pXAG-29, en a-gal A-ekspresjonskonstruksjon som innbefatter kollagen-Ia2-promotoren, et P-aktin-intron, den hGH-signalpeptid-kodende sekvens og første intron, cDNA for a-gal A (dvs. som mangler a-gal A-signalpeptidsekvensen) og hGH 3' UTS. Fig. 6 er et kromatogram over a-gal A-rensetrinnet med anvendelse av Butyl Sepharose®-harpiks. Absorbansen ved 280 nm (ren linje) og a-gal A-aktivitet (prikket linje) for utvalgte fraksjoner er vist. Fig. 7 er et linjediagram som viser internalisering i Fabry-fibroblaster av humant a-gal A fremstilt i henhold til oppfinnelsen. Den intracellulære a-gal A-aktivitet og totalprotein-konsentrasjon ble målt etter inkubering av cellene med økende konsentrasjoner av humant a-gal A fremstilt i henhold til oppfinnelsen. Effektene av de potensielle internaliserings-inhibitorer mannose-6-fosfat (M6P; åpne romber) og mannan (åpne sirkler) er vist. Fig. 8 er et skjematisk diagram over forsøks-mønsteret utformet for undersøkelse av Fabry-fibroblaster etter internalisering av a-gal A. a-gal A-aktiviteten hos Fabry-cellene måles etter eksponering for enten normale eller a-gal A-overuttrykkende humane fibroblaster dyrket i Transwell®-innskudd. «M6P» = mannose-6-fosfat; «Untrf HF» = ikke-transfekterte humane fibroblaster; «BRS11» = en transfektert, a-gal A-overuttrykkende fibroblaststamme. Fig. 9 er en presentasjon av den humane a-gal A-aminosyresekvens (SEKV ID NR. 26). Fig. 10 er en presentasjon av DNA-sekvensen som koder for hGH-signalpeptidet og som inneholder det første hGH-intron (understreket) (SEKV ID NR. 27). Fig. 11 er en presentasjon av DNA-sekvensen som koder for hGH-signal-peptidet uten intronet (SEKV ID NR. 22). Fig. 12 er en presentasjon av aminosyresekvensen hos hGH-signalpeptidet (SEKV ID NR. 21). Fig. 13 er en presentasjon av cDNA-sekvensen som koder for humant a-gal A (uten signalpeptid) (SEKV ID NR. 25).

Lysosomal-enzymer så som a-gal A siktes inn mot lysosom-delen av en celle ved vekselvirkning med mannose-6-fosfat-(M6P)-reseptoren, som bindes til M6P-rester som finnes i oligosakkarid-delene av enzymer med kurs mot lysosom-delen (S. Kornfeld og I. Mellman, Ann. Rev. Cell Biol. 5:483-525, 1989). Den primære vekselvirkning skjer i Golgi, hvor enzymer bundet til Golgi M6P-reseptorer utskilles for transport til lysosomene. En sekundær type vekselvirkning antas å finne sted mellom ekstracellulært a-gal A og M6P-reseptorer på celleoverflaten. Ekstracellulære substanser internalisert av celler transporteres gjennom cytoplasma i endocytiske vesikler, som smelter sammen med primære lysosomer og tømmer sitt innhold i lysosomene. Ved denne prosess innlemmes også celleoverflate-M6P-reseptorer i endocytiske vesikler og transporteres til lysosomer.

Ethvert a-gal A som finnes i det ekstracellulære miljø kan, hvis det bærer M6P-rester, bindes til celleoverflate-M6P-reseptorene og derved transporteres inn i lysosom- delen sammen med reseptorene. Straks enzymet er i lysosom-delen som resultat av denne fjerningsvei, kan det utføre sin hensiktsmessige funksjon. Således finnes det en mekanisme for at en celle skal kunne ta opp eksogent dannet enzym selv om den genetisk har utilstrekkelig dannelse av sitt eget a-gal A, under forutsetning av (a) at enzymet er passende glykosylert og (b) den mangelfulle celle bærer M6P-reseptorer.

Ved Fabrys sykdom er det vist at vaskulære endotelceller i nyre og hjerte oppviser alvorlige histopatologiske abnormiteter og bidrar til den kliniske patologi ved sykdommen; disse celler, som bærer M6P-reseptorer, er et spesielt mål for den her patentsøkte oppfinnelse, a-gal A dannet i henhold til oppfinnelsen kan avgis systemisk til de angrepne celler ved vanlige farmakologiske administreringsmåter. Et a-gal A hvor M6P er tilstede i de N-bundne oligosakkarider er derfor av stor betydning for terapi i henhold til oppfinnelsen.

Videre er graden ved hvilken de N-bundne oligosakkarider i a-gal A modifiseres ved sialylering også av stor betydning. Ved fravær av passende sialylering vil a-gal A hurtig bli klaret fra sirkulasjonen på grunn av binding ved hepatiske asialoglykoprotein-reseptorer, fulgt av internalisering og nedbryting av hepatocytter (Ashwell og Harford, Ann. Rev. Biochem. 51:531-554, 1982). Dette reduserer mengden av a-gal A som er tilgjengelig i sirkulasjonen for binding til M6P-reseptorer på celler som bidrar til den kliniske patologi ved Fabrys sykdom, så som de vaskulære endotelceller i nyre og hjerte. Søkerne har overraskende funnet at a-gal A som utsondres av stabilt transfekterte humane celler, har glykosyleringsegenskaper som er egnet for behandling av Fabrys sykdom enten med genterapi eller ved hjelp av vanlig farmasøytisk administrering av det rensede utsondrede protein. Dette er i motsetning til situasjonen med det best undersøkte lysosomal-enzym, glukocerebrosidase, hvor avgivelse av enzymet renset fra human placenta eller utsondret fra transfekterte CHO-celler til de klinisk relevante celler i kroppen fordrer kompleks enzymatisk modifisering av enzymet etter rensing (cf. Beutler, New Engl. J. Med. 325:1354-1360, 1991).

Terapien kan utføres ved at det i pasienten innføres en terapeutisk effektiv mengde renset humant a-gal A fra dyrkede humane celler som er genetisk modifisert for over-eksprimering og utsondring av enzymet. Teknikker for utførelse av de nødvendige genetiske modifikasjoner er omtalt nedenfor, og likeså metodene for rensing, utforming og behandling.

Eksempel I. Fremstilling og anvendelse av konstruksjoner utformet for avgivelse og ekspresjon av a- gal A

To ekspresjonsplasmider, pXAG-16 og pXAG-28, ble konstruert. Disse plasmider inneholder human a-gal A-cDNA som koder for de 398 aminosyrer i a-gal A-enzymet (uten a-gal A-signalpeptidet); den humane veksthormon-(hGH)-signalpeptid-genom-DNA-sekvens, som er avbrutt av det første intron i hGH-genet; og den ikke-translaterte 3'-sekvens (UTS) i hGH-genet, som inneholder et signal for polyadenylering. Plasmid pXAG-16 har den umiddelbart tidlige humane cytomegalovirus-(CMV IE)-promotor og første intron (flankert av ikke-kodende ekson-sekvenser), mens pXAG-28 drives av kollagen-Ia2-promotoren og også inneholder P-aktin-genets 5' UTS, som inneholder det første intron i P-aktin-genet.

A. Kloning av den komplette a- gal A- cDNA og konstruksjon av a- gal A-ekspresjonsplasmidet pXAG- 16

Den humane a-gal cDNA ble klonet fra et human-fibroblast-cDNA-bibliotek som ble konstruert som følger. Poly-A<+->mRNA ble isolert fra total-RNA, og cDNA-syntese ble utført under anvendelse av reagenser for lambda-ZapII®-systemet i henhold til fabrikantens instruksjoner (Stratagene Inc., LaJolla, CA). Kort angitt ble «førstekjede»-cDNA dannet ved reversert transkripsjon i nærvær av en oligo-dT-primer inneholdende et internt Xhol-restriksjonsendonuklease-sete. Etter behandling med RNase H, ble cDNA «nick»-translatert med DNA-polymerase I under dannelse av dobbeltkjedet cDNA. Denne cDNA ble gjort stump-endet med T4-DNA-polymerase, og ligert til EcoRI-adaptorer. Produktene fra denne ligering ble behandlet med T4-DNA-kinase og kuttet med Xhol. cDNA ble fraksjonert ved hjelp av Sephacryl-400®-kromatografi. Fraksjoner med stor og middels størrelse ble blandet og cDNA'ene ligert til EcoRI- og Xhol-kuttede Lambda ZapII-armer. Produktene fra denne ligering ble deretter pakket og titrert. Det primære bibliotek hadde en titer på 1,2 x IO7 pfu/ml og en gjennomsnittlig innskuddsstørrelse på 925 bp.

En 210 bp probe fra ekson 7 i det humane a-gal A-gen (fig. 1, SEKV ID NR. 19) ble anvendt til isolering av cDNA. Selve proben ble isolert fra genom-DNA ved polymerasekjedereaksjonen (PCR) under anvendelse av følgende oligonukleo-tider: 5'-CTGGGCTGTAGCTATGATAAAC-3' (Oligo 1; SEKV ID NR. 1) og 5'- TCTAGCTGAAGCAAAACAGTG-3' (Oligo 2; SEKV ID NR. 2). PCR-produktet ble deretter anvendt til screening av fibroblast-cDNA-biblioteket, og positive kloner ble isolert og ytterligerekarakterisert. En positiv klon, fag 3 A, ble underkastet den lambda-ZapII®-system-utskjærende protokoll (Stratagene, Inc., La Jolla, CA), i henhold til fabrikantens instruksjoner. Denne metode ga plasmid pBSAG3A, som inneholder a-gal A-cDNA-sekvensen i pBluescriptSK™-plasmidskjelettet. DNA-sekvensering viste at dette plasmid ikke inneholdt den komplette 5'-ende av cDNA-sekvensen. 5'-enden ble derfor rekonstruert under anvendelse av et PCR-fragment amplifisert fra human genom-DNA. For utførelse av dette ble et 268 bp genom-DNA-fragment (fig. 2, SEKV ID NR. 20) amplifisert under anvendelse av følgende oligonukleotider: 5'-ATTGGTCCGCCCCTGAGGT-3' (Oligo 3; SEKV ID NR. 3) og 5'-TGATGCAGGAATCTGGCTCT-3' (Oligo 4; SEKV ID NR. 4). Dette fragment ble subklonet i et «TA»-klonende plasmid (Invitrogen Corp., San Diego, CA) under dannelse av plasmid pTAAGEI. Plasmid pBSAG3A, som inneholder hovedandelen av a-gal A-cDNA-sekvensen, og pTAAGEI, som inneholder 5'-enden av a-gal A-cDNA, ble begge kuttet med SacII og Ncol. Posisjonene for de aktuelle SacU- og Ncol-seter i det amplifiserte DNA-fragment er vist på fig. 2. SacII-NcoI-fragmentet på 0,2 kg fra pTAAGEI ble isolert og ligert til ekvivalent kuttet pBSAG3A. Dette plasmid, pAGAL, inneholder den komplette a-gal A-cDNA-sekvens, innbefattende sekvensen som koder for a-gal A-signalpeptidet. cDNA ble fullstendig sekvensert (vist på fig. 3 innbefattende a-gal A-signalpeptidet; SEKV ID NR. 18) og funnet å være identisk med den publiserte sekvens for den humane a-gal A-cDNA (Genbank-sekvens HUMGALA).

Plasmidet pXAG-16 ble konstruert via flere mellomprodukter, som følger. Først ble pAGAL kuttet med SacII og Xhol og gjort stump-endet. Deretter ble endene av det komplette a-gal A-cDNA ligert til Xbal-linkere og subklonet i Xbal-kuttet pEF-BOS (Mizushima et al., Nucl. Acids Res. 18:5322, 1990) under dannelse av pXAG-1. Denne konstruksjon inneholder den humane granulocytt-kolonistimulerende faktor (G-CSF) 3' UTS og den humane forlengelsesfaktor-la-(EF-la)-promoter som flankerer cDNA som koder for a-gal A pluss a-gal A-signal-peptidet, slik at 5'-enden av a-gal A-cDNA koples til EF-la-promotoren. For frem-bringelse av en konstruksjon med CMV IE-promotoren og første intron ble a-gal A-cDNA og G-CSF 3 UTS fjernet fra pXAG-1 som et to-kb Xbal-BamHI-fragment. Fragmentet ble gjort stump-endet, ligert til BamHI-linkere og innført i BamHI-kuttet pCMVflpNeo (som ble konstruert som beskrevet nedenfor). Orienteringen var slik at 5'-enden av a-gal A-cDNA ble koplet til CMV IE-promotor-området.

pCMVflpNeo ble frembrakt som følger. Et CMV IE-gen-promotorfragment ble amplifisert med PCR under anvendelse av CMV-genom-DNA som templat og oligonukleotidene: 5' -TTTTGGATCCCTCGAGGACATTGATTATTGACTAG-3'

(SEKV ID NR. 23) og 5'-TTTTGGATCCCGTGTCAAGGACGGTGAC-3' (SEKV ID

NR. 24). Det resulterende produkt (et 1,6 kb fragment) ble kuttet med BamHI, hvorved man fikk et CMV-promotor-holdig fragment med kohesive BamHI-kuttede ender. Neo-ekspresjonsenheten ble isolert fra plasmid pMClneopA (Stratagene Inc., La Jolla, CA) som et 1,1 kb XhoI-BamHI-fragment. Det CMV-promotor-holdige fragment og neo-fragmentet ble innført i et BamHI-, Xhol-kuttet plasmid (pUC12). Spesielt inneholder pCMVflpNeo CMV IE-promotor-området, som begynner ved nukleotid 546 og slutter ved nukleotid 2105 (av Genbank-sekvens HS5MIEP), og neomycinresistens-genet som drives av Herpes Simplex-virus-(HSV)-thymidinkinase-promotoren (TKneo-genet) umiddelbart 5' i forhold til CMV IE-promotorfragmentet. Retningen for transkripsjon av neo-genet er den samme som transkripsjonsretningen for CMV-promotorfragmentet. Denne mellomkonstruksjon ble kalt pXAG-4.

For addering av hGH 3' UTS ble GCSF 3' UTS fjernet fra pXAG-4 som et Xbal-Smal-fragment, og endene av pXAG-4 ble gjort stumpe. hGH 3' UTS ble fjernet fra pXGH5 (Seiden et al., Mol. Cellular Biol. 6:3173-3179,1986) som et 0,6 kb Smal-EcoRI-fragment. Etter at dette fragment var gjort stump-endet, ble det ligert i pXAG-4 umiddelbart etter det stump-endede Xbal-sete på pXAG-4. Dette mellomprodukt ble kalt pXAG-7. TKneo-fragmentet ble fjernet fra dette plasmid som et HindUI-Clal-fragment, og plasmidets ender ble gjort stumpe ved «ifylling» med Klenow-fragmentet av DNA-polymerase I. Et neomycinresistens-gen drevet ved SV40-tidligpromotoren ble ligert inn som et stumpende-Clal-BsmBI-fragment fra et nedbrytningsprodukt av pcDNeo (Chen et al., Mol. Cellular Biol. 7:2745-2752, 1987), idet neo-transkripsjonsenheten ble anbrakt i samme orientering som a-gal A-transkripsjonsenheten. Dette mellomprodukt ble kalt pXAG-13.

For komplettering av pXAG-16, som har den hGH-signalpeptid-kodende sekvens på 26 aminosyrer og første intron av hGH-genet, ble et 2,0 kb EcoRI-BamHI-fragment av pXAG-13 først fjernet. Dette fragment innbefattet a-gal A-cDNA og hGH 3' UTS. Dette store fragment ble erstattet med 3 fragmenter. Det første fragment besto av et 0,3 kb PCR- produkt av pXGH5, som inneholder den hGH-signalpeptid-kodende sekvens og innbefatter første-hGH-intronsekvensen, fra et syntetisk BamHJ-sete med beliggenhet like oppstrøms for Kozak-konsensus-sekvensen til enden av den hGH-signalpeptid-kodende sekvens. Følgende oligonukleotider ble anvendt til amplifisering av dette fragment (fragment 1): 5' -TTTTGGATCCACCATGGCTA-3' (Oligo HGH101; SEKV ID NR. 5) og 5' -TTTTGCCGGCACTGCCCTCTTGAA-3' (Oligo HGH102; SEKV ID NR. 6).

Det annet fragment besto av et 0,27 kb PCR-produkt inneholdende sekvenser svarende til starten av cDNA som koder for a-gal A-enzymet på 398 aminosyrer (dvs. som mangler a-gal A-signalpeptidet) til Nhel-setet. Følgende oligonukleotider ble anvendt til amplifisering av dette fragment (fragment 2): 5'-TTTTCAGCTGGACAATGGATTGGC-3' (Oligo AG10; SEKV ID NR. 7) og 5' -TTTTGCTAGCTGGCGAATCC-3' (Oligo AG11; SEKV ID NR. 8). Det tredje fragment besto av Nhel-EcoRI-fragmentet av pXAG-7 inneholdende den gjenværende a-gal A-sekvens samt hGH 3' UTS (fragment 3).

Fragment 1 (kuttet med BamHI og Nael), fragment 2 (kuttet med PvuII og Nhel) og fragment 3 ble blandet med 6,5 kb BamHI-EcoRI-fragmentet av pXAG-13 inneholdende neo-genet og CMV IE-promotoren og ligert sammen under dannelse av plasmid pXAG-16 (fig-4).

B. Konstruering av a- gal A- ekspresionsplasmidet pXAG- 28

Den humane kollagen-Ia2-promotor ble isolert for anvendelse i a-gal A-ekspresjonskonstruksjonen pXAG-28 som følger. Et 408 bp PCR-fragment av human genom-DNA inneholdende en del av den humane kollagen-Ia2-promotor ble isolert under anvendelse av følgende oligonukleotider:

Dette fragment ble anvendt til screening av et human-leukocytt-bibliotek i EMBL3 (Clontech Inc., Palo Alto, CA). Én positiv klon (fag 7H) inneholdende et 3,8 kb EcoRI-fragment ble isolert og klonet i pBSIISK+ (Stratagene Inc., La Jolla, CA) ved EcoRI-setet (under frembringelse av pBS/7H.2). Et Avrll-sete ble innført i pBSUSK+ ved digerering med Spel, som spalter i pBSUSK+-polylinkeren, «ifylling» med Klenow-fragmentet av DNA-polymerase I, og innføring av oligonuk-leotidet 5'-CTAGTCCTAGGA-3' (SEKV ID NR. 11). Denne variant av pBSUSK+ ble kuttet med BamHI og Avrll og ligert til 121 bp BamHI-Avrll-fragmentet av det opprinnelige 408 bp kollagen-Ia2-promotor-PCR-fragment beskrevet ovenfor, under dannelse av pBS/121COL.6.

Plasmidet pBS/121COL.6 ble kuttet med Xbal, som spalter i pBSIISK+-polylinkersekvensen, «ifylt» med Klenow-fragmentet av DNA-polymerase I og kuttet med Avrll. 3,8 kb BamHI-Avrll-fragmentet av pBS/7H.2 ble isolert og BamHI-setet gjort stump-endet ved behandling med Klenow-enzym. Fragmentet ble deretter kuttet med Avrll og ligert til den Avrll-kuttede vektor, hvorved kollagenpromotor-plasmidet pBS/121bpCOL7H.18 ble dannet.

Deretter ble kollagenpromotoren koplet til 5' UTS av det humane P-aktin-gen, som inneholder det første intron i det humane P-aktin-gen. For isolering av denne sekvens ble et 2 kb PCR-fragment isolert fra human genom-DNA under anvendelse av følgende oligonukleotider: 5'-TTTTGAGCACAGAGCCTCGCCT-3' (Oligo BAI, SEKV ID NR. 12) og 5' -TTTTGGATCCGGTGAGCTGCGAGAATAGCC-3' (Oligo BA2; SEKV ID NR. 13).

Dette fragment ble kuttet med BamHI og BsiHKAI under frigjøring av et 0,8 kb fragment inneholdende P-aktin 5' UTS og intronet. Et 3,6 kb Sall-Srfl-fragment ble deretter isolert fra kollagenpromotorplasmidet pBS/121bpCOL7H.18 som følger. pBS/121bpCOL7H.18 ble delvis kuttet med BamHI (BamHI-setet ligger i 5'-enden av kollagen-Ia2-promotorfragmentet), gjort stump-endet ved behandling med Klenow-fragmentet, og ligert til en Sall-linker (5'-GGTCGACC-3'), hvorved et Sall-sete ble anbrakt oppstrøms for kollagen-Ia2-promotoren. Dette plasmid ble deretter kuttet med Sali og Srfl (Srfl-setet ligger 110 bp oppstrøms for kollagen-Ia2-promotor-CAP-setet), og 3,6 kb-fragmentet ble isolert. Fragmentene på 0,8 og 3,6 kb ble kombinert med Sali- og BamHI-kuttet pBSIISK- (Stratagene Inc., La Jolla, CA), og et fragment som besto av følgende fire oligonukleo-tider, ble smeltet sammen (under dannelse av et fragment med en stump ende og en BsiHKAI-ende):

Disse fire oligonukleotider svarer, når de er sammensmeltet, til området som begynner ved Srfl-setet på kollagen-promotoren og fortsetter gjennom BsiHKAI-setet i P-aktin-promotoren. Det resulterende plasmid ble betegnet pCOL/p-aktin.

For fullførelse av konstruksjonen av pXAG-28 ble Sall-BamHI-fragmentet av pCOL/p-aktin inneholdende kollagen-Ia2-promotoren og P-aktin 5' UTS isolert. Dette fragment ble ligert til to fragmenter fra pXAG-16 (se eksempel IA og fig. 4): (1) 6,0 kb BamHI-fragmentet (inneholdende neo-genet, plasmidskjelettet, cDNA som koder for a-gal A-enzymet med 398 aminosyrer, og hGH 3' UTS); og (2) BamHI-XhoI-fragmentet på 0,3 kb (som inneholder SV40-poly A-sekvensen fra pcDneo). pXAG-28 inneholder den humane kollagen-Ia2-promotor koblet til den humane P-aktin 5'-UTS, hGH-signalpeptidet (som er avbrutt av hGH-første-intronet), cDNA som koder for a-gal A-enzymet, samt hGH 3' UTS. Et kart over den fullstendige ekspresjonskonstruksjon pXAG-28 er vist på fig. 5.

C. Transfektering og selektering av fibroblaster elektroporert med a- gal A-ekspresi onsplasmider

For å uttrykke a-gal A i fibroblaster ble sekundære fibroblaster dyrket og transfektert i henhold til publiserte metoder (Seiden et al., WO 93/09222).

Plasmidene pXAG-13, pXAG-16 og pXAG-28 ble transfektert ved elektroporering i humane forhud-fibroblaster under dannelse av stabilt transfekterte kloncellestammer, og de resulterende a-gal A-ekspresjonsnivåer ble kontrollert som beskrevet i eksempel ID. Sekresjon av a-gal A hos normale forhud-fibroblaster er i området 2-10 enheter pr. IO<6>celler pr. 24 timer. I mot-setning til dette oppviste de transfekterte fibroblaster middel-ekspresjonsnivåer som vist i tabell 1:

pXAG-28: 141 +/- 131 IO<6>celler/dag

N = 38 klonstammer

(område 20-616 E/10<6>celler/dag)

Disse data viser at alle de tre ekspresjonskonstruksjoner kan øke a-gal A-ekspresjonen mange ganger i forhold til hos ikke-transfekterte fibroblaster. Ekspresjon hos fibroblaster som er stabilt transfektert med pXAG-13, og som koder for a-gal A bundet til a-gal A-signalpeptidet, var hovedsakelig lavere enn ekspresjon ved fibroblaster transfektert med pXAG-16, som bare er annerledes ved at signalpeptidet er hGH-signalpeptidet, hvis kodingssekvens er avbrutt av det første intron i hGH-genet.

Hver gang de transfekterte celler gjennomgikk en runde, ble den utsondrede a-gal A-aktivitet bestemt, cellene ble tellet og celletettheten beregnet. Basert på antallet høstede celler og tiden som fikk gå for sekresjon av a-gal A, ble den spesifikke ekspresjonshastighet for a-gal A bestemt og er angitt i tabeller 2 og 3 som utsondrede enheter (av a-gal A) pr. IO<6>celler pr. 24 timers tidsrom. Celle-stammer som var ønskelige for genterapi eller for anvendelse ved dannelse av materiale for rensing av a-gal A, skulle oppvise stabil vekst og ekspresjon over flere gjennomgåtte runder. Data fra cellestammene vist i tabeller 2 og 3, som var stabilt transfektert med a-gal A-ekspresjonskonstruksjonen pXAG-16, illustrerer det faktum at a-gal A-ekspresjon holdes stabilt i løpet av serier av gjennomgåtte runder.

D. Kvantifisering av a- gal A- ekspresjon

Aktiviteten av a-gal A-aktivitet ble målt ved anvendelse av det vannløselige substrat 4-metylumbelliferyl-a-D-galaktopyranosid (4-MUF-gal; Research Products, Inc.) ved en modifisering av protokollen beskrevet av Ioannou et al. (J. Cell Biol. 119:1137-1150, 1992). Substratet ble oppløst i substratbuffer (0,1 M citratfosfat, pH 4,6) til en konsentrasjon på 1,69 mg/ml (5 mM). Det ble typisk tilsatt 10 ul dyrkningssupernatant til 75 ul av substratløsningen. Rørene ble tildekket og fikk inkuberes i et 37°C vannbad i 60 minutter. Ved slutten av inkuberingstidsrommet ble 2 ml glycin-karbonat-buffer (130 mM glycin, 83 mM natriumkarbonat, pH 10,6) anvendt til å stoppe reaksjonen. Den relative fluorescens av hver prøve ble målt under anvendelse av et fluorometer av typen TKOIOO (Hoefer Scientific Instruments) som har en fastsatt eksitasjonsbølgelenge på 365 nm og påviser en fastsatt emisjonsbølgelengde på 460 nm. Avlesningene av prøvene ble sammenliknet med standarder tillaget av en 1 nM forråds løsning av metylumbelliferon (Sigma Chemical Co.), og mengden hydrolysert substrat ble beregnet. Aktiviteten av a-gal A er uttrykt i enheter; én enhet a-gal A-aktivitet er ekvivalent med ett nanomol substrat hydrolysert pr. time ved 37°C. Celle-ekspresjonsdataene ble generelt uttrykt som enheter av a-gal A-aktivitet utsondret pr. IO<6>celler pr. 24 timer. Denne analyse ble også anvendt til måling av mengden a-gal A-aktivitet i cellelysater og i prøver fra forskjellige a-gal-rensetrinn, som omtalt nedenfor.

Eksempel II. Rensing av a- gal A fra det kondisjonerte medium av stabilt transfek-

terte humancellestammer

Eksempler UA-IIE illustrerer at a-gal A kan renses til nær homogenitet fra det kondisjonerte medium av dyrkede humancellestammer som er blitt stabilt transfektert for produksjon av enzymet.

A. Anvendelse av Butyl Sepharose®- kromatografi som et første trinn ved rensing av a- gal A

Kaldt kondisjonert medium (1,34 liter) ble klaret ved sentrifugering og filtrert gjennom et 0,45 nm celluloseacetatfilter under anvendelse av glassfiber-forfiltre. Under omrøring ble pH i det kalde, filtrerte medium justert til 5,6 ved dråpevis tilsetting av 1 N HC1, og ammoniumsulfat ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 0,66 M ved dråpevis tilsetting av en forrådsløsning (romtemperatur) av 3,9 M ultrarent ammoniumsulfat. Mediet ble omrørt i ytterligere 5 minutter ved 4°C, filtrert som før og påsatt på en hurtigstrømningskolonne av typen Butyl Sepharose® 4 (81 ml kolonnevolum, 2,5 x 16,5 cm; Pharmacia, Uppsala, Sverige) som var blitt ekvilibrert i 10 mM MES-Tris, pH 5,6, inneholdende 0,66 M ammoniumsulfat (buffer A). Kromatografien ble utført ved 4°C på et Gradi-Frac™-system (Pharmacia, Uppsala, Sverige) utstyrt med «in-line»-UV (280 nm) og ledingsevne-monitorer for bedømmelse av henholdsvis totalprotein- og saltkonsentrasjon. Etter prøve-påføring ved en strømningshastighet på 10 ml/min, ble kolonnen vasket med 10 kolonnevolum av buffer A. a-gal A ble eluert fra Butyl Sepharose®-kolonnen med en

14 kolonnevolum lineær gradient fra buffer A (inneholdende ammoniumsulfat) til 10 mM MES-Tris, pH 5,6 (intet ammoniumsulfat). Fraksjonene ble analysert med hensyn til a-gal A-aktivitet ved hjelp av 4-MUF-gal-analysen, og de som inneholdt vesentlige mengder enzymaktivitet, ble blandet. Som det vil sees av fig. 6 og rense-oppsummeringen (tabell 3), fjerner dette trinn ca. 99% av det forurensende protein (før-kolonne-prøve = 8,14 g totalprotein; etterkolonne-prøve = 0,0638 g totalprotein).

B. Anvendelse av Heparin Sepharose®- kromatografi som et trinn for rensing av a- gal A

Toppfraksjonene fra Butyl Sepharose®-kolonnen ble dialysert ved 4°C mot (4 liter) 10 mM MES-Tris, pH 5,6 (utskiftet én gang). Dialysatet ledingsevne ble justert til 1,0 mMHO ved 4°C ved tilsetting av H2O eller NaCl etter behov. Deretter ble prøven påsatt på en hurtigstrømnings-kolonne av typen Heparin Sepharose® (Pharmacia, Uppsala, Sverige; 29 ml kolonnevolum, 2,5 x 6 cm) som var blitt ekvilibrert i 10 mM MES-Tris, pH 5,6, inneholdende 9 mM NaCl (buffer B). Dette ble utført ved 4°C ved en strømningshastighet på 10 ml/min. «In-line»-UV- (280 nm) og ledingsevne-monitorer målte totalprotein- og saltkonsentrasjon. Etter at prøven var påsatt, ble kolonnen vasket med 10 kolonnevolum av buffer B, fulgt av en 3 kolonnevolum lineær gradient til 8% buffer C/92% buffer B (hvor buffer C er 10 mM MES-Tris, pH 5,6, inneholdende 250 mM NaCl) og en 10 kolonnevolum vaskeløsning med 8% buffer C. Dette ble fulgt av eluering av a-gal A med en 1,5 kolonnevolum lineær gradient til 29% buffer C og en påfølgende 10 kolonnevolum lineær gradient til 35% buffer C. Fraksjonene ble analysert med hensyn til a-gal A-aktivitet, og de som inneholdt vesentlige mengder aktivitet, ble blandet.

C. Anvendelse av hydroksvapatitt- kromatografi som et trinn for rensing av a- gal A

Heparinblandingen ble filtrert og påsatt direkte på en kolonne av Ceramic Hydroxyapatite HC (40 nm; American International Chemical, Natick, MA; 12 ml kolonnevolum, 1,5 x 6,8 cm) som var blitt ekvilibrert i 1 mM natriumfosfat, pH 6,0 (buffer D). Kromatografien ble utført ved romtemperatur på et hybrid GradiFrac™/FPLC®-system (Pharmacia, Uppsala, Sverige) utstyrt med «in-line»-UV (280 nm) og ledingsevne-monitorer. Etter at prøven var påsatt (5 ml/min), ble kolonnen vasket med 10 kolonnevolum av buffer D. a-gal A ble eluert med en 7 kolonnevolum lineær gradient til 42% buffer E/58% buffer D (hvor buffer E er 250 mM natriumfosfat, pH 6,0), fulgt av en 10 kolonnevolum gradient til 52% buffer E. Fraksjonene ble analysert med hensyn til a-gal A-aktivitet, og fraksjonene som inneholdt vesentlig aktivitet, ble blandet.

D. Anvendelse av O Sepharose® anionbytter- kromatografi som et trinn for rensing av a- gal A

Hydroksyapatitt-blandingen ble fortynnet omtrent 1,5 ganger med H2O til en slutt-ledningsevne på 3,4-3,6 mMHO ved romtemperatur. Etter filtrering ble prøven påsatt på en kolonne av Q Sepharose® HP (Pharmacia, Uppsala, Sverige; 5,1 ml kolonnevolum, 1,5 x 2,9 cm) ekvilibrert i 10% buffer G/90% buffer F, hvor buffer F er 25 M natriumfosfat, pH 6,0, og buffer G er 25 mM natriumfosfat, pH 6,0, 250 mM NaCl. Kromatograferingen ble utført ved romtemperatur på Gradi-Frac™/-FPLC®-hybridsystemet (Pharmacia, Uppsala, Sverige), og totalprotein- og saltkonsentrasjon ble kontrollert ved hjelp av «in-line»- monitorene. Prøven ble påsatt ved en strømningshastighet på 5 ml/min, og deretter ble følgende trinn utført: (1) en vasking med 5 kolonnevolum 10% buffer G, (2) en vasking med 7 kolonnevolum 12% buffer G, (3) en lineær gradient (3 kolonnevolum) til 50% buffer G, (4) en lineær gradient (10 kolonnevolum) til 53% buffer G, (5) en lineær gradient (3 kolonnevolum) til 100% buffer G, (6) en vasking med 10 kolonnevolum 100% buffer G. a-gal A ble hovedsakelig eluert i løpet av trinnene 3 og 4. Fraksjoner som inneholdt vesentlig aktivitet, ble blandet («Q-blandingen»).

E. Anvendelse av Superdex®- 200 gelfiltreringskromatografi som et trinn for rensing av a- gal A

Q-blandingen ble konsentrert ca. 5 ganger under anvendelse av sentrifuge-konsentrator-enheter av typen Centriprep®-10 (Amicon, Beverly, MA) og påsatt på en kolonne av Superdex® 200 (Pharmacia, Uppsala, Sverige; 189 ml kolonne-volum, 1,6 x 94 cm). Kolonnen ble ekvilibrert og eluert med 25 mM natriumfosfat, pH 6,0, inneholdende 150 mM NaCl. Kromatograferingen ble utført på et FPLC®-system (Pharmacia, Uppsala, Sverige) ved romtemperatur under anvendelse av en «in-line» UV-monitor (280 nm) til å følge elueringen av proteinet. Volumet av prøven som ble påsatt på kolonnen, var < 2 ml, strømningshastigheten var 0,5 ml pr. min og fraksjonsstørrelsen var 2 ml. Det ble utført multiple kolonnekjøringer; fraksjonene ble analysert med hensyn til a-gal A-aktivitet, og fraksjoner som inneholdt vesentlige aktivitetsmengder, ble blandet.

De blandede fraksjoner fra Superdex® 200-kolonnen ble konsentrert under anvendelse av Centriprep-10-enheter, delt i porsjoner, hurtigfrosset og oppbevart ved - 80°C i korte tidsrom. En oppsummering av dette eksempel på a-gal A-rensing er vist i tabell 3. Slutt-utbyttet av a-gal A var 59% av aktiviteten av utgangsmaterialet, og den spesifikke aktivitet av det rensede produkt var 2,93 x IO<6>enheter pr. mg protein. Det resulterende produkt viste et høyt nivå av renhet etter elektroforese under reduserende betingelser på 4-15% SDS-polyakrylamidgel, som deretter ble sølvfarget.

Eksempel HL Utforming og oppbevaring av renset a- gal A

Grundig renset a-gal A er ikke stabilt i lengre tidsrom ved lagring som fortynnet løsning av renset protein (< 1 mg protein pr. ml). Det ble derfor oppfunnet en utforming for forbedring av stabiliteten under langvarig lagring, dvs. lagring som varte i fra flere uker til minst flere måneder. Det rensede enzym ble konsentrert til minst 1 mg/ml med anvendelse av en sentrifuge-konsentrator (i enzymbuffer bestående av 25 mM natriumfosfat (pH 6,0) og 150 mM NaCl). Humant serumalbumin (HSA; Buminate®, Baxter-Hyland) ble tilsatt til en slutt-konsentrasjon på 2,5 mg/ml. Proteinløsningen ble deretter sterilfiltrert under anvendelse av et 0,2 nm celluloseacetatfilter (Schleicher og Schuell) knyttet til en sprøyte, a-gal A-løsningen ble fordelt i sterile, pyrogenfrie medisinglass, forseglet med Teflon-deksel, hurtigfrosset og lagret ved -20°C.

Stabiliteten av a-gal A-aktiviteten ble vurdert over et tidsrom på 3 måneder under anvendelse av 4-MUF-gal-analysen. Dataene vist i tabell 5 viser at det ikke var noe tap av enzymaktivitet i løpet av testperioden. Den sure pH i preparatet (< 6,5) er avgjørende for stabiliteten av det grundig rensede enzym.

Eksempel IV. a- gal A dannet av humane cellestammer er egnetfor behandling av a- gal A-mangel

De strukturelle og funksjonelle egenskaper hos renset a-gal A fremstilt i henhold til oppfinnelsen ble undersøkt for å påvise at DNA-molekylene beskrevet i det foreliggende og de tilsvarende uttrykte glykoproteiner dannet av transfekterte humane cellestammer kan anvendes ved henholdsvis gen- eller enzym-erstatningsterapier.

A. Størrelse av a- gal A dannet av stabilt transfekterte humane celler i kultur

Molekylmassen av a-gal A ble vurdert ved hjelp av MALDI-TOF-masse-spektrometri. Disse resultater viser at dimerens molekylmasse er 102 353 Da, mens monomerens molekylmasse er 51 002 Da. Den ventede molekylmasse for monomeren, basert på aminosyresammensetningen, er 45 400 Da. Man kan derfor trekke den slutning av karbohydrat-innholdet i enzymet utgjør opp til 5 600 Da av molekylvekten.

Resultatene av standard-aminosyreanalyse utført for det rensede protein er i overensstemmelse med den konklusjon at proteinet dannet av transfekterte humane celler er identisk med proteinet renset fra humant vev på aminosyre-nivået.

B. N- Terminal bearbeiding av a- gal A dannet av stabilt transfekterte humane celler

Den humane a-gal A-cDNA-nukleotidsekvens koder for 429 aminosyrer. De 31 N-terminale aminosyrer utgjør en signalpeptid-sekvens, som spaltes etter hvert som proteinet som er under utvikling, går gjennom membranen i det endoplasma-tiske retikulum

(LeDonne et al., Arch. Biochem. Biophys. 224:186, 1983; Lemansky et al., J. Biol. Chem. 262:2062, 1987). For å bekrefte at a-gal A var tilbørlig bearbeidet ved tilknytting til en heterolog signalpeptid-sekvens (for eksempel den humane veksthormon-signalsekvens) og uttrykt i transfekterte humane fibroblaster, ble ti N-terminale aminosyrer i det utsondrede protein mikrosekvensert. Prøver ble kjørt i elektroforese ved hjelp av SDS-PAGE og overført til ProBlott® (ABI, Foster City, CA) under anvendelse av et buffersystem av 10 mM CAPS (pH 11,0), 10% metanol. Proteinet på ProBlott® ble visualisert ved hjelp av Coomassie-farging, og et bånd med passende størrelse (50 kDa) ble utskåret. N-terminal sekvens ble oppnådd ved anvendelse av en puls-væskefase-aminosyre-sekvensanalysator av typen Applied Biosystems som utfører automatisert Edman-nedbryting. Den oppnådde N-terminale sekvens, LDNGLARTPT (SEKV ID NR. 28), er i overensstemmelse med riktig spalting av signalpeptidet, og er tilpasset den N-terminale sekvens som er forutsett for det utsondrede protein.

C. C- Terminal aminosyre av a- gal A dannet av stabilt transfekterte humane celler

Den C-terminale aminosyrerest av utsondret a-gal A fremstilt i henhold til oppfinnelsen ble identifisert under anvendelse av en automatisk C-terminal-sekvensanalysator av typen Hewlett Packard. Resultatene viste en leucinrest i den C-terminale ende, noe som er i overensstemmelse med den C-terminale aminosyre forutsett ved DNA-sekvensen.

D. Karbohydrat- modifisering av a- gal A dannet av stabilt transfekterte humane celler

Glykosyleringsmønsteret for a-gal A fremstilt i henhold til oppfinnelsen ble også vurdert. Riktig glykosylering er viktig for optimal in vivo-aktivitet av a-gal A;

a-gal A uttrykt i ikke-glykosyleringssystemer er inaktivt eller ustabilt (Hantzo-polous et al., Gene 57:159, 1987). Glykosylering er også viktig for internalisering av a-gal A i de ønskede målceller, og påvirker sirkulasjons-halveringstiden for enzymet in vivo. På hver subenhet av a-gal A er fire seter tilgjengelig for addisjon av asparagin-tilknyttede karbohydratkjeder, blant hvilke bare tre er opptatt (Desnick et al., i The Metabolic and Molecular Bases oflnheritedDisease, s. 2741-2780, McGraw Hill, New York, 1995).

En prøve av a-gal A dannet av stabilt transfekterte celler ble behandlet med neuraminidase, som isoleres fra A. urafaciens, (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) for fjerning av sialinsyre. Denne reaksjon ble utført ved behandling av 5 ng a-gal A over natten med 10 mE neuraminidase ved romtemperatur i et totalt volum på 10 ni acetatbufret saltoppløsning (ABS, 20 mM natriumacetat, pH 5,2, 150 mM NaCl).

Renset a-gal A dannet av stabilt transfekterte celler ble også defosforylert under anvendelse av alkalisk fosfatase (intestinal alkalisk kalve-fosfatase, Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) ved behandling av 5 ng a-gal A over natten ved romtemperatur med 15 E alkalisk fosfatase i ABS (pH øket til 7,5 med 1 M Tris).

Prøvene ble analysert ved hjelp av Western blot med et a-gal A-spesifikt antistoff. Det anvendte antistoff var et polyklonalt kanin-antipeptid-antistoff, som ble fremstilt under anvendelse av et peptid som representerte aminosyrene 68-81 i a-gal A som immunogen. Etter overføring av proteinet til PVDF (Millipore, Bedford, MA), ble membranen undersøkt med en 1:2000 fortynning av antiserumet i 2,5% blotto (ikke-fet tørrmelk i 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,05% Tween-20). Dette ble fulgt av påvisning med geit-antikanin-IgG konjugert til pepperrot-peroksidase (Organon Teknika/Cappel, Durham, NC; 1:5000 fortynning) og reagenser i ECK-kjemiluminescens-settet (Amersham, Arlington Heights,

IN).

Behandling av a-gal A med neuraminidase resulterer i en liten skifting i molekylmasse (omtrent 1500-2000 Da eller 4-6 sialinsyrer pr. monomer), noe som tyder på at det er omfattende modifikasjon av a-gal A med sialinsyre. For referanse har plasmaformen av a-gal A 5-6 sialinsyre-rester pr. monomer, og placentaformen har 0,5-1,0 sialinsyrerester pr. monomer (Bishop et al., J. Biol. Chem. 256:1307, 1981).

En annen metode som ble anvendt for undersøkelse av sialinsyre- og mannose-6-fosfat-modifikasj onene av a-gal A, var isoelektrisk fokusering (IEF), hvor prøvene separeres på basis av sitt isoelektriske punkt (pl) eller nettoladning. Således er det ventet at fjerning av ladede rester så som sialinsyre eller fosfat fra a-gal A vil forandre proteinets mobilitet i IEF-systemet.

For utførelse av IEF-forsøket ble prøver av a-gal A fremstilt ifølge oppfinnelsen behandlet med nauraminidase og alkalisk fosfatase, blandet 1:1 med 2X Novex-prøvebuffer (med 8 M urea, pH 3,0-7,0), og påsatt på en 6 M urea IEF-gel (5,5% polyakrylamid) laget under anvendelse av Pharmalyte® (Pharmacia, Uppsala, Sverige; pH 3,0-6,5; Pharmalyte® 4-6,5 og 2,5-5,5, 0,25 ml av hver pr. gel). Standarder for isolektrisk punkt (Bio-Rad) ble også medtatt. Etter elektroforese ble gelen overført til PVDF, og Western blot-analyse ble utført som beskrevet ovenfor.

a-gal A dannet av stabilt transfekterte humane fibroblaster besto av tre hoved-isoformer med et pl-område på ca. 4,4-4,65. Disse verdier er lik pFene for plasma- og miltformene av a-gal A (Bishop et al., J. Biol. Chem. 256:1307, 1981). Neuramidase-behandling av enzymet økte pl for alle tre isoformer, noe som viste at alle i en viss grad ble modifisert av sialinsyre. Disse data tyder på at a-gal A dannet av stabilt transfekterte humane celler skulle ha en ønskelig plasma-halveringstid, noe som viser at dette materiale er godt egnet for farmakologisk anvendelse. Videre økte behandling av neuraminidase-behandlet a-gal A med alkalisk fosfatase ytterligere pl for en del av proteinet til ca. 5,0-5,1, noe som viser at enzymet bærer én eller flere mannose-6-fosfat-rester. Denne modifisering er betydelig ved at den er nødvendig for effektiv internalisering av a-gal A i målcellene.

E. Spesifikk aktivitet av a- gal A renset fra stabilt transfekterte fibroblaster

Potensen eller den spesifikke aktivitet av renset a-gal A beregnes ved måling av både den katalytiske aktivitet av enzymet (med 4-MUF-gal-analysen) og proteinkonsentrasjonen. Proteinkonsentrasjonen kan bestemmes ved hjelp av hvilken som helst standardmetode, så som med BCA-systemet (Pierce) eller ved måling av absorbansen ved 280 nm og under anvendelse av mg/ml-ekstinksjons-koeffisienten på 2,3 (bestemt ut fra aminosyreanalyse) til beregning av verdien. Ved anvendelse av disse teknikker er den spesifikke aktivitet for a-gal A renset fra det kondisjonerte medium for transfekterte humane fibroblaster 2,2-2,9 x IO6 enheter pr. mg protein, noe som er sammenliknbart med den spesifikke aktivitet av a-gal A som er renset fra humant vev (Bishop et al., J. Biol. Chem. 256:1301, 1981).

F. Mannose- eller mannose- 6- fosfat- formidlet internalisering av a- gal A

For at a-gal A dannet av stabilt transfekterte celler skal kunne være et effektivt terapeutisk middel ved a-gal A-mangler, må enzymet internaliseres av de angrepne celler, a-gal A er ikke aktivt ved fysiologiske pH-nivåer, og det er usannsynlig at det er effektivt i blod- eller interstitial-fluidene. Det metaboliserer opphopede lipidsubstrater optimalt bare når det er internalisert i det sure miljø i lysosomet. Denne internalisering formidles ved binding av a-gal A til mannose-6-fosfat-(M6P)-reseptorer, som uttrykkes på celleoverflaten og avgir enzymet til lysosomet via den endocytiske vei. M6P-reseptoren uttrykkes over alt, de fleste somatiske celler uttrykker den i en viss grad. Mannose-reseptoren, som er spesifikk for eksponerte mannoserester på glykoproteiner, er mindre frem-tredende. Sistnevnte reseptorer finnes generelt bare på makrofager og makro-fagliknende celler, og gir et ytterligere hjelpemiddel for a-gal A-inngang i disse celletyper.

For påvisning av M6P-formidlet internalisering av a-gal A ble hud-fibroblaster fra en pasient med Fabrys sykdom (NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository) ble dyrket over natten i nærvær av økende konsentrasjoner av renset a-gal A ifølge oppfinnelsen. En del av prøvene inneholdt 5 mM løselig M6P, som kompetitivt inhiberer binding til, og som et resultat, internalisering av, mannose-6-fosfat-reseptoren. Andre prøver inneholdt 30 ng/ml mannan, som inhiberer binding til, og som et resultat, internalisering av, mannosereseptoren. Etter inkubering ble cellene vasket og høstet ved skraping i lysebuffer (10 mM Tris, pH 7,2, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 2 mM Pefabloc™

(Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) og 1% NP-40). De lyserte prøver ble deretter analysert med hensyn til proteinkonsentrasjon og a-gal A-aktivitet. Resultatene er uttrykt som enheter a-gal A-aktivitet pr. mg celleprotein. Fabry-cellene internaliserte a-gal A på en doseavhengig måte (fig. 7). Denne internalisering ble inhibert med mannose-6-fosfat, men det var ingen inhibering med mannan. Internalisering av a-gal A i Fabry-fibroblaster formidles derfor ved mannose-6-fosfat-reseptoren, men ikke ved mannose-reseptoren.

a-gal A blir også internalisert in vitro av endotelceller, viktige målceller for behandlingen av Fabrys sykdom. Humane navlevene-endotelceller (HUVECer) ble dyrket over natten med 7500 enheter a-gal A; noen av brønnene inneholdt M6P. Etter

inkuberingstidsrommet ble cellene høstet og analysert med hensyn til a-gal A som beskrevet ovenfor. Cellene som var inkubert med a-gal A, hadde bare enzymnivåer som var nesten 10 ganger over nivåene for kontroll-celler (ingen inkubering med a-gal A). M6P inhiberte den intracellulære opphoping av a-gal A, noe som tyder på at internaliseringen av a-gal A ved hjelp av HUVECer formidles ved M6P-reseptoren. Således internaliseres det humane a-gal A ved hjelp av klinisk aktuelle celler.

Få dyrkede humancellelinjer er kjent for å uttrykke mannose-reseptoren. Imidlertid kan en musemakrofag-liknende cellelinje (J774.E) som bærer mannose-reseptorer, men få, hvis noen, mannose-6-fosfat-reseptorer, anvendes til bestemmelse av om hvorvidt renset a-gal A ifølge oppfinnelsen internaliseres via mannosereseptoren (Diment et al., J. Leukocyte Biol. 42:485-490, 1987). J774.E-celler ble dyrket over natten i nærvær av

10 000 enheter/ml a-gal A. Utvalgte prøver inneholdt også 2 mM M6P, og andre inneholdt 100 ng/ml mannan. Cellene ble vasket og høstet som beskrevet ovenfor, og totalproteinet og a-gal A-aktiviteten for hver prøve ble bestemt. Resultatene er vist i tabell 5. M6P inhiberer ikke opptaket av a-gal A hos disse celler, mens mannan reduserer de opphopede a-gal A-nivåer med 75%. Således kan a-gal A internaliseres ved hjelp av mannosereseptoren i celletyper som uttrykker denne spesielle celleoverflate-reseptor.

Disse forsøk viser at a-gal A dannet av stabilt transfekterte humane celler kan internaliseres av celler via mannose- eller mannose-6-fosfat-reseptoren.

G. Korrigering av Fabry- fibroblaster med humane fibroblaster som uttrykker a- Gal

A

For genterapi må et implantat av autologe celler som danner a-gal A, danne enzymet i en form som er hensiktsmessig modifisert for «korrigering» av a-gal A-mangelen hos målceller. For vurdering av effekten av a-gal A-dannelse av transfekterte humane fibroblaster, på Fabry-celler, ble fibroblaster høstet fra pasienter med Fabrys sykdom (NIGMS Human Genetics Mutant Cell Repository) dyrket sammen med en a-gal A-dannende cellestamme (BRS-11) i Transwells® (Costar, Cambridge, MA). Forsøksskjemaet er vist på fig. 8. Fabryceller ble dyrket i 12-brønns-vevskulturskåler, og noen av dem inneholdt innskudd (Transwells®, 0,4 nm porestørrelse) med en overflate på hvilken celler kan dyrkes. Vekstmatriksen i innskuddet er porøs og gir mulighet for at makromolekyler kan passere fra det øvre til det nedre miljø. Ett sett av innskudd inneholdt fibroblaster fra normal human forhud (HF), som utsondrer minimale nivåer av a-gal A, mens et annet sett inneholdt den stabilt transfekterte humane fibroblaststamme, BRS-11, som utsondrer store mengder a-gal A. I brønnene som er samdyrket med a-gal A-dannende celler, kan a-gal A kommer inn i mediet som Fabry-cellene finnes i, og potensielt internaliseres av Fabry-cellene.

Dataene i tabell 7 viser at Fabry-celler internaliserte det utsondrede a-gal A. De intracellulære nivåer av a-gal A ble kontrollert i tre dager. Cellene som ble dyrket alene (intet innskudd) eller i nærvær av ikke-transfekterte forhud-fibroblaster (HF-innskudd), hadde meget lave intracellulære nivåer av a-gal A-aktivitet. Fabry-cellene som var dyrket med de a-gal A-dannende (BRS-11-innskudd) celler, oppviste imidlertid enzymnivåer i likhet med nivåene hos normale celler ved slutten av dag 2 (normale fibroblaster har 25-80 enheter a-gal A pr. mg protein). At korrigeringen skyldes a-gal A opptatt via M6P-reseptoren, vises ved dens inhibering med mannose-6-fosfat (BRS-11-innskudd + M6P).

H. Anvendelse av andre celletyper

Andre celletyper kan anvendes ved fremgangsmåten beskrevet i det foreliggende. Cellene kan fås fra mange forskjellige vev og innbefatter alle celletyper som kan holdes i kultur. For eksempel innbefatter primære og sekundære celler som kan transfekteres ved hjelp av foreliggende metode, humane fibroblaster, keratinocytter, epitel celler (f. eks. bryst-eller intestinal-epitelceller), endotelceller, gliaceller, nerveceller, formede elementer i blodet (f. eks. lymfocytter og benmargsceller), muskelceller, samt forløpere for disse somatiske celletyper. Fibroblaster er spesielt aktuelle. Primære celler tas fortrinnsvis fra individet som de transfekterte primære og sekundære celler skal administreres til, slik at de ikke skal forkastes av pasientens immunsystem. Hvis man imidlertid er tilstrekkelig oppmerksom på å unngå eller undertrykke immun-forkastelse (som beskrevet nedenfor), kan det også anvendes celler fra en annen human donor enn pasienten. Dette vil muliggjøre anvendelse av celler fra en standardisert, anerkjent, stabilt transfektert cellelinje for alle pasienter.

I. Farmasøytisk preparat for konvensjonell administrering av a- gal A- protein

a-gal A-proteinet som er uttrykt og utsondret av stabilt transfekterte (eller på annen måte genetisk modifiserte) humane celler og renset som beskrevet i det foreliggende, kan administreres til individer som danner utilstrekkelig eller mangelfullt a-gal A-protein. Proteinet kan administreres i en farmasøytisk akseptabel bærer, ved en pH på under 6,5, f. eks. i et preparat som beskrevet i eksempel in. Eksempler på eksipienser som kan innarbeides med preparatet, er buffere så som citratbuffer, fosfatbuffer, acetatbuffer og bikarbonatbuffer, amino-syrer, urea, alkoholer, askorbinsyre, fosfolipider, proteiner så som serumalbumin og gelatin, EDTA, natriumklorid, liposomer, polyvinylpyrrolidon, mannitol, sorbitol, glycerol, propylenglykol og polyetylenglykol (f.eks. PEG-4000, PEG-6000). Administreringsmåten kan for eksempel være intravenøs, intra-arteriell, subkutan, intraperitoneal, intracerebral, intramuskulær, intrapulmonær eller transmukosal. Administreringsmåten og mengden av avgitt protein vil bestemmes av faktorer som er godt innenfor fagfolks evne å bedømme. Videre er fagfolk på området klar over at administreringsmåten og doseringen av et terapeutisk protein kan varieres for en gitt

pasient til det er oppnådd et terapeutisk doseringsnivå. Det vil typisk bli administrert doser av a-gal A på 0,01-100 mg pr. kg kroppsvekt. Det er ventet at regelmessig gjentatte doser av proteinet vil være nødvendig i hele pasientens liv.

Claims (21)

1. Fremgangsmåte for å produsere humant a-Gal A, karakterisert vedat den omfatter (a) dyrking av en genmanipulert human celle modifisert for å overuttrykke og utskille humant a-Gal A i et medium, (b) samling av mediet som omfatter humant a-Gal A fra nevnte dyrkede celler, og (c) rensing av humant a-Gal A fra mediet ved (i) å sende mediet over en hydrofob interaksjonsharpiks og eluere humant a-Gal A fra harpiksen, og (ii) sende eluert humant a-Gal A over kolonner som inneholder en immobilsert heparinharpiks, hydroksyapatitt, en anionbytterharpiks og en størrelsesekslusjonsharpiks, og eluere renset humant a-Gal A fra den siste kolonnen, hvor renset humant a-Gal A er fri for proteinholdige lektinaffinitetsmidler og a-Gal A substrat analoge midler.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor cellen er blitt transfektert med et DNA molekyl som koder for humant a-Gal A.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor cellen er blitt tranfektert med et DNA molekyl som omfatter et regulatorisk element som kontrollerer ekspresjonen av den kodende sekvensen for a-Gal A.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor cellen er blitt modifisert ved genaktivering for å uttrykke humant a-Gal A.

5. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-4, hvor cellen er en fibroblast.

6. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-4, hvor cellen er en primær celle.

7. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-4, hvor cellen er en sekundær celle.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 5, hvor renset humant a-Gal A har en spesifikk aktivitet på 2,2-2,9 x 106 enheter/mg protein.

9. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav, hvor det å sende mediet over en hydrofob interaksjonsharpiks utgjør det første kromatografitrinn under rensing.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor den funksjonelle del av den hydrofobe interaksjonsharpiks omfatter en butylgruppe.

11. Farmasøytisk preparat som omfatter et renset humant a-Gal A enzym glykosylert for anvendelse i enzymerstatningsterapi av en a-Gal A mangel, hvor preparatet er uten (i) proteinholdige lektinaffinitetsmidler og (ii) a-Gal A substrat analoge midler.

12. Farmasøytisk preparat for anvendelse ifølge krav 11, hvor nevnte enzym er modifisert ved sialylering.

13. Farmasøytisk preparat for anvendelse ifølge krav 11 eller 12, hvor nevnte enzym inneholder mannose-6-fosfat i dets N-koblede oligosakkarider.

14. Farmasøytisk preparat for anvendelse ifølge 11, hvor humant a-Gal A er internalisert ved hjelp av celler via mannose eller mannose-6-fosfat reseptoren.

15. Farmasøytisk preparat for anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 11-14, som ytterligere omfatter en farmasøytisk aksepterbar bærer, hvor preparatet har en pH under 6,5.

16. Farmasøytisk preparat for anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 11-15, som ytterligere omfatter en farmasøytisk aksepterbar eksipiens.

17. Farmasøytisk preparat for anvendelse ifølge krav 16, hvor eksipiensen er valgt fra en buffer, en aminosyre, urea, en alkohol, askorbinsyre, et fosfolipid, et protein, EDTA, natriumklorid, liposomer, polyvinolpyrollidon, mannitol, sorbitol, glycerol, propylenglykol og polyetylenglykol (PEG).

18. Farmasøytisk preparat for anvendelse ifølge krav 17, hvor bufferen er valgt fra sitratbuffer, fosfatbuffer, acetatbuffer og bikarbonatbuffer.

19. Farmasøytisk preparat for anvendelse ifølge krav 17, hvor proteinet er valgt fra serumalbumin og gelatin.

20. Farmasøytisk preparat for anvendelse ifølge krav 17, hvor PEG er valgt fra PEG-4000 og PEG-6000.

21. Farmasøytisk preparat for anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 11-20, hvor det humane a-Gal A enzym administreres i en dose på 0,01-100 mg/kg kroppsvekt.