NO330687B1

NO330687B1 - Fremgangsmate for rensing av human alfa-galaktosidase A

Info

Publication number: NO330687B1
Application number: NO20090583A
Authority: NO
Inventors: Richard F Selden; Marianne Borowski; Francis P Gillespie; Carol M Kinoshita; Douglas A Treco; Melanie D Williams
Original assignee: Shire Human Genetic Therapies
Priority date: 1996-09-13
Filing date: 2009-02-06
Publication date: 2011-06-06
Also published as: PL332188A1; NO991225L; DE69732129D1; AU4424497A; IL184637A; JP2007289201A; NO328443B1; KR20050084473A; JP2012019793A; JP4313381B2; JP5590788B2; ES2234032T3; HU227189B1; CA2265464C; WO1998011206A2; EP2327775A2; JP2009102321A; DK1538202T3; JP2001504324A; NO991225D0

Abstract

S a m m e n d r a g En terapeutisk fremgangsmåte hvor et individ som man mistenker for å ha en ?-galaktosidase A-mangel, så som Fabrys sykdom, behandles enten med (1) humane celler som er blitt genetisk modifisert til å over-eksprimere og utsondre humant ?-gal A, eller (2) renset humant ?-gal A fra dyrkede, genetisk modifiserte humane celler.

Description

Denne oppfinnelse angår fremgangsmåte for rensing av human a-a-galaktosidase A.

Fabrys sykdom er en X-tilknyttet arvelig lysosomlagringssykdomkarakterisertved symptomer så som alvorlig nyresvekkelse, angiokeratomer og kardiovaskulære abnormiteter, innbefattende ventrikkelforstørrelse og mitralklaff-insuffisiens. Sykdommen påvirker også det perifere nervesystem og forårsaker anfall med plagsom, brennende smerte i ekstremitetene. Fabrys sykdom forår-sakes av en mangelfullhet ved enzymet a-galaktosidase A (a-gal A), som resulterer i blokkering av katabolismen av nøytrale glykosfingolipider og opp-hoping av enzymets substrat, keramidtriheksosid, i celler og i blodstrømmen.

På grunn av sykdommens X-tilknyttede arvemønster er hovedsakelig alle pasienter med Fabrys sykdom mannlige. Skjønt noen få alvorlig angrepne kvinnelige heterozygoter er blitt observert, er kvinnelige heterozygoter vanligvis enten asymptomatiske eller har forholdsvis svake symptomer som i stor grad er begrenset til en karakteristisk opasitet av hornhinnen. En atypisk variant av Fabrys sykdom, som oppviser lav rest- a-gal A-aktivitet og enten meget svake symptomer eller tilsynelatende ingen andre symptomer som er karakteristiske for Fabrys sykdom, samsvarer med hypertrofi av venstre ventrikkel og hjertesykdom (Nakano et al., New Engl. J. Med. 333:288-293, 1995). Det er blitt spekulert i at reduksjon i a-gal A kan være årsaken til slike hjerte-abnormiteter.

Talbot et al. Appl. Environ. Microbiol. 56:3505-10 1990, beskriver at Bacillus stearothermophilus utskiller p-mananase og a-galaktosidase enzymatiske aktiviteter med evne til å hydrolysere galaktomannan substrater. Ekspresjon av hemicellulaseaktivitetene i nær av av johannesbrød harpiks var sekvensiell med mannanase-aktivitetfør ekspresjon av a-galaktosidaseaktiviteten. Hemicellulaseaktivitetene ble renset til homogenisitet ved en kombinasjon av ammoniumsulfatfraksjonering, gel-filtrering, hydrofob interaksjonskromatografi og ione-bytte og kromatofokuserende teknikker. Renset P-D-mannanase er et dimerisk enzym (162 kilodaltons) bestående av subenheter med identisk molekylvekt (73 000). Den maksimale aktiviteten varierte ikke mellom pH 5.5 og 7.5. P-D-mannanaseaktiviteten utviste termostabilitet og beholdt nesten full aktivitet etter inkubasjon i 241 ved 70°C og pH 6.5. Enzymet utviste høy spesifisitet for galaktomannansubstrater uten detektert sekundær xylanase eller cellulaseaktivitet. Hydrolyse av johannesbrød harpiks ga korte oligosakkarider kompatible med en endo modus av substrat depolymerisasjon. Innledende ratehastigheter for mannanaseaktivitet utviste substratinhibisjon og ga estimater for Vmaxog Km på henholdsvis 455 + 60U/mg og 1.5 + 0,3 mg/ml ved 70°C og pH 6.5. a-galaktosidaseaktiviteten korresponderte med et trimerenzym (247 kilodaltons) med subenheter med identisk molekylvekt (82 000). a-galaktosidasen hadde maksimal aktivitet ved pH 7 til 7.5 og opprettholdt full aktivitet etter 24 t med inkubasjon ved 60°C. Enzymet hadde kun begrenset aktvitet på galaktomannansubstrater sammenlignet med hydrolyse av p-nitrofenyl a-D-galaktose. Kinetikken til p-nitrofenyl a-D-galaktose hydrolyse ga lineære reciproke plotter korresponderende med Vmaxog Km på henholdsvis 195 ± 10 U/mg og 0,25 ± 0,02 på mM, ved 60°C og pH 7.

Medin et al. Proe. Nati. Accad. Sei. USA 93:7917-7922 1996, beskriver at Fabry-sykdom er en X-koblet metabolsk forstyrrelse grunnet mangel på a-galaktosidase A (a-gal A; EC 3.2.1.22). Pasienter akkumulerer glykosfingolipider med terminale a-galaktosylresidier som kommer fra intracellulær syntese, sirkulerende metabolitter eller fra biodegradering av aldrende celler. Pasienter får deretter nyre, hjerte- eller cerebrovaskulær sykdom. En mulig tilnærming for å lindre denne for-styrrelsen er å målsøke korrigerende genoverføringsterapi til sirkulerende hemato-poietiske celler. En amfotropisk virus-produserende cellelinje er blitt utviklet som produserer et høyt titer (>106 i.p. per ml) rekombinant retrovirus konstruert for å transdusere og korrigere målcellene. Virus-produserende celler demonstrerer også ekspresjonen av store mengder av både intracellulær og utskilt a-gal A. For å undersøke anvendbarheten av denne terapeutiske vektoren ble hudfibroblaster fra Fabry-pasienter korrigert for den metabolske defekten ved injeksjon med dette rekombinante virus, og utskilt enzym ble observert. Videre ble det utskilte enzymet funnet å bli tatt opp av ukorrigerte celler på en mannose-6-fosfatreseptoravhengig måte. I beslektede eksperimenter ble udødeliggjorte B-cellelinjer fra Fabry-pasienter, dannet som et hematologisk leveringstestsystem, trandusert. Som med fibroblastene demonstrerte transduserte pasient B-cellelinjer både endogen enzymkorreksjon og en liten mengde sekresjon sammen med opptak av ukorrigerte celler.

Skelton et al. J Clin Microbiol. 28:1062-5 1990 beskriver at to hovedantigener av Bordetella pertussis, filamentøs hemagglutinin (FHA) og pertussis toksin (PT) ble effektivt renset fra kulturfiltrat ved utnyttelse av deres relative hydrofobisiteter og forskjeller i affinitet til sialittisk syre-inneholdende protein. Høye utbytter av FHA (40 til 80 mg/liter) og PT (8 til 16 mg/liter) ble først produsert ved dyrking av bakteriene i det modifiserte Cl mediumet. FHA og PT i kuturfiltratet ble adsorbert på butyl-sefarose ved hydrofob interaksjon ved hensiktsmessig høy ionestyrke. Eluering av antigenene ble oppnådd ved redusering av deres hydrofobisiteter med en buffer med lav ionestyrke. FHA ble deretter separert fra PT med en affinitetskolonne av fetuin-sefarose. Fraksjonen som gikk gjennom kolonnen inneholdt renset FHA og fetuin-bundet PT ble eluert med buffret MgCb. FHA og PT renset i disse trinnene var elektroforetisk og serologisk identiske med referanserensede FHA og PT prepare-ringer. Omtrent 16 til 32 mg renset FHA og 4 til 8 mg renset PT ble oppnådd fra 1 liter kulturfiltrat.

cDNA og genet som koder for humant a-gal A, er blitt isolert og sekvensert (Bishop et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83:4859, 1986; Kornreich et al., Nuc. Acids Res. 17:3301, 1988; Oeltjen et al., Mammalian Genome 6:335-338, 1995). Humant a-gal A uttrykkes som et 429-aminosyre-polypeptid hvorav de N-terminale 31 aminosyrer utgjør et signalpeptid. Det humane enzym er blitt uttrykt i kinesisk hamster-ovarieceller (CHO) (Desnick, US-patent nr. 5 356 804; loannou et al., J. Cell Biol. 119:1137, 1992); insektceller (Calhoun et al., US-patent nr. 5 179 023); og COS-celler (Tsuji et al., Eur. J. Biochem. 165:275,1987). Pilotforsøk angående a-gal A-erstatningsterapier er blitt rapportert, hvor det er blitt anvendt protein fra humant vev (Måpes et al., Science 169:987 1970; Brady et al., N. Engl. J. Med. 289:9. 1973; Desnick et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 76:5326, 1979), men det er for tiden ingen effektiv behandling når det gjelder Fabrys sykdom.

Det er blitt funnet at uttrykking av et DNA som koder for humant a-gal A i dyrkede humane celler, gir et polypeptid som er passende glykosylert, slik at det ikke bare er enzymatisk aktivt og kan virke på glykosfingolipid-substratet som opphopes ved Fabrys sykdom, men også effektivt internaliseres av celler via celle-overflatereseptorer som bringer det nøyaktig dit hvor det trenges ved denne sykdom; lysosom-delen av angrepne celler, spesielt endotelcellene som bekler pasientens blodkar innvendig. Denne oppdagelse, som er omtalt mer detaljert nedenfor, betyr at et individ som man mistenker har en a-gal A-mangelfulinet så som Fabrys sykdom, kan behandles enten med (1) humane celler som er blitt genetisk modifisert til å over-eksprimere og utsondre humant a-gal A, eller (2) renset humant a-gal A fra dyrkede, genetisk modifiserte humane celler.

Terapi ved hjelp av den første måte, dvs. med selve de modifiserte celler, innbefatter gen-manipulering av humane celler (f.eks. primærceller, sekundær-celler eller immortaliserte celler) in vitro eller ex vivo for å bevirke at de uttrykker og utsondrer høye nivåer av humant a-gal A, fulgt av implantering av cellene i pasienten, som beskrevet generelt i Seiden et al., WO 93/09222.

Når celler skal modifiseres genetisk for de formål å behandle Fabrys sykdom enten ved hjelp av genterapi eller enzymerstatningsterapi, kan et DNA-molekyl som inneholder en a-gal A-cDNA- eller genom-DNA-sekvens, inngå i en ekspresjonskonstruksjon og innføres i primære eller sekundære humane celler (f.eks. fibroblaster, epitelceller innbefattende bryst- og intestinal-epitelceller, endtelceller, formede elementer i blodet innbefattende lymfocytter og benmargsceller, gliaceller, hepatocytter, keratinocytter, muskelceller og nerveceller, eller forløperne til disse celletyper) ved hjelp av standardmetoder for transfektering, innbefattende, men ikke begrenset til, liposom-, polybren- eller DEAE dekstran-formidlet transfektering, elektroporering, kalsiumfosfatutfelning, mikroinjeksjon eller hastighetsdrevne mikroprosjektiler («biolistiner»). Man kan alternativt anvende et system som avgir DNA ved hjelp av virusvektor. Virus som er kjent for å være egnet til genoverføring, innbefatter adenovirus, adenotilknyttet virus, herpesvirus, kusmavirus, poliovirus, retrovirus, Sindbis-virus og koppevirus så som kanarikoppevirus («canary pox virus»). Primære eller sekundære celle-

kulturer er foretrukket men udødeliggjorte humane celler kan også anvendes. Eksempler på udødeliggjorte humane cellelinjer er Bowes melanomceller (ATCC adkomstnr. CRL 9607), Daudi-celler (ATCC adkomstnr. CCL 213), HeLa-celler og derivater av HeLa-celler (ATCC

adkomstnr. CCL 2, CCL 2.1 og CCL 2.2), HL-60-celler (ATCC adkomstnr. CCL 240), HT1080-celler (ATCC adkomstnr. CCL 121), Jurkat-celler (ATCC adkomst nr. TIB 152), KB karsinomceller (ATCC adkomstnr. CCL 17), K-562 leukemiceller (ATCC adkomstnr. CCL 243), MCF-7 brystkreftceller (ATCC adkomstnr. BTH 22), MOLT-4-celler (ATCC adkomstnr. 1582), Namalwa-celler (ATCC adkomstnr. CRL 1432), Rajiceller (ATCC adkomstnr. CCL 86), RPMI 8226-celler (ATCC adkomst nr. CCL 155), U-937-celler (ATCC adkomstnr. CRL 1593), WI-38VA13-celler sublinje 2R4 (ATCC adkomstnr. CLL 75.1) og 2780AD ovariekarsinomceller (Van der Blick et al., Cancer Res. 48:5927-5932, 1988) samt heterohybridomceller dannet ved fusjon av

humane celler og celler fra en annen art. Sekundære humane fibro-blaststammer, så som WI-38 (ATCC adkomstnr. CCL 75) og MRC-5 (ATCC adkomst nr. CCL 171), kan også anvendes.

Etter genetisk oppbygging av humane celler med et DNA-molekyl som

koder for a-gal A (eller etter en annen passende genetisk modifikasjon, som beskrevet nedenfor), under dannelse av en celle som over-eksprimerer og utsondrer a-gal A, kan det dannes en kloncellestamme som i det vesentlige består av mange genetisk identiske dyrkede primære humane celler, eller hvor cellene er udødeliggjorte, en kloncellelinje som i det vesentlige består av mange genetisk identiske udødeliggjorte humane celler. Cellene i kloncellestammen eller kloncellelinjen er fortrinnsvis fibroblaster.

De genetisk modifiserte celler kan så prepareres og innføres i pasienten ved hjelp av hensiktsmessige metoder, f.eks. som beskrevet i Seiden et al., WO 93/09222.

Som beskrevet ovenfor, kan individer med a-gal A-mangelfullhet også behandles med renset a-gal A (dvs. enzymerstatningsterapi). Primære, sekundære eller immortaliserte humane celler som er genetisk modifisert til å over-eksprimere humant a-gal A, vil også være nyttige for proteinfremstilling in vitro, ved fremstilling av protein som kan renses for enzymerstatningsterapi. Sekundære eller immortaliserte humane celler kan velges blant dem som er beskrevet ovenfor, og kan modifiseres genetisk ved transfeksjons- eller transduksjons-metodene som også er beskrevet ovenfor. Etter genetisk modifikasjon dyrkes cellene under betingelser som muliggjør over-ekspresjon og utsondring av a-gal A. Proteinet isoleres fra de dyrkede celler ved oppsamling av mediet hvor cellene er dyrket og/eller lysering av cellene for frigjøring av innholdet i dem, og deretter anvendelse av standard-proteinrensingsteknikker. Én slik teknikk innbefatter at

dyrkningsmediet, eller hvilken som helst prøve som inneholder humant a-gal A, ledes over en hydrofob vekselvirkningsharpiks så som Butyl Sepharose® eller en annen harpiks med en funksjonell del som innbefatter en butylgruppe. Leding av prøven over en slik harpiks kan utgjøre det første kromatografitrinn. Hvis ytter-

ligere rensing trenges, kan det a-gal A-holdige materiale som er eluert fra den hydrofobe vekselvirkningsharpiks, ledes over en kolonne inneholdende en andre harpiks, så som en immobilisert heparinharpiks så som Heparin Sepharose®,

hydroksyapatitt, en anionbytterharpiks så som Q Sepharose® eller en størrelses-utelukkelsesharpiks så som Superdex® 200. Renseprotokollen vil fortrinnsvis innbefatte anvendelse av hver av ovennevnte typer harpikser. Alternativt kan man anvende én eller flere av sistnevnte harpikser før eller i stedet for den hydrofobe vekselvirkningsharpiks.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en fremgangsmåte for rensing av human a-gal A fra en prøve, kjennetegnet ved at den omfatter føring av nevnte prøve over en hydrofob interaksjonsharpiks omfattende en butylgruppe som en funksjonell del. Ifølge foreliggende oppfinnelse blir prøven oppnådd fra en dyrket human celle eller fra kulturmediet til en dyrket human celle. Videre ifølge oppfinnelsen uttrykker den dyrkede humane cellen et DNA kodende for et polypeptid omfattende human a-gal A koblet til et heterologt signalpeptid. Videre er den dyrkede humane cellen fortrinnsvis fibroblast.

Ifølge den foreliggende oppfinnelsen er den dyrkede humane cellen valgt fra gruppen bestående av en epitelcelle, en endotelcelle, en benmargscelle, en glialcell, en hepatocytt, en keratinocytt, en myocytt, et neuron eller en forløper av disse celletypene. Videre ifølge foreliggende oppfinnelse er den dyrkede humane cellen et medlem av en kloncellelinje valgt fra gruppen bestående av en Bowes melanomcelle, en Daudi celle, en HeLa celle, en HL-60 celle, en HT1080 celle, en Jurkat celle, en KB karsinom celle, en K-562 leukemi celle, en MCF-7 brystcancercelle, en MOLT-4 celle, en Namalwa celle, en Raji celle, en RPMI 8226 celle, en U-937 celle, en WI-38-VA13 sublinje 2R4 celle og en 2780AD ovariekarsinomcelle.

Ifølge den foreliggende oppfinnelsen er signalpeptidet hGH signalpeptidet bestående av aminosyresekvensen SEKV ID NR:21.

Fremgangsmåten ifølge krav 1, omfatter videre før føring av prøven over den hydrofobe interaksjonsharpiksen omfattende en butylgruppe som en funksjonell del, følgende trinn: tilveiebringing av en human celle som uttrykker et DNA kodende for et polypeptid omfattende human a-gal A koblet til et heterologt signalpeptid;

dyrking av cellen; og

oppnåelse fra cellen, eller mediet hvor cellen er dyrket, en prøve inneholdende a-gal A. Idet signalpeptidet er hGh signalpeptidet bestående av aminosyresekvensen SEKV ID NR:21.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er fremgangsmåte ifølge krav 1, videre kjennetegnet ved at den omfatter at det hydrofobe interaksjonsharpikstrinnet er et første kromatografitrinn. Idet prøven blir oppnådd fra en dyrket human celle eller fra kulturmediumet til en dyrket human celle. Idet den dyrkede humane cellen uttrykker et DNA kodende for et polypeptid omfattende human a-gal A koblet til et heterologt signalpeptid. Idet den dyrkede humane cellen er en fibroblast. Den dyrkede humane cellen er videre ifølge oppfinnelsen valgt fra gruppen bestående av en epitelcelle, en endotelcelle, en benmargscelle, en gliacelle, en hepatocytt, en keratinocytt, en myocytt, et neuron eller en forløper av disse celletypene. Videre er den dyrkede humane cellen et medlem av en kloncellelinje valgt fra gruppen bestående av en Bowes melanomcelle, en Daudi celle, en HeLa celle, en HL-60 celle, en HT1080 celle, en Jurkat celle, en KB karsinomcell, en K-562 leukemicelle, en MCF-7 brystcancercelle, en MOLT-4 celle, en Namalwa celle, en Raji celle, en RPMI 8226 celle, en U-937 celle, en WI-38VA13 sublinje 2R4 celle og en 2780AD ovariekarsinomcelle.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er signalpeptidet hGH signalpeptidet bestående av aminosyresekvensen SEKV ID:21. Idet den videre omfatter føring av prøven over en immobilisert heparin harpiks. Idet den immobiliserte heparin harpiksen omfatter heparin koblet til en kryss-bindende agarose. Idet den videre omfatter føring av prøven over en hydroksyapatitt kolonne. Idet hydroksyapatittkolonnen omfatter et sfærisk, makroporøst kompleks av kalsiumfosfat. Videre omfattende føring av prøven over en anion bytteharpiks. Idet anion bytteharpiksen omfatter en kvarternær ammonium sterk anion utveksler koblet til kryss-bundet agarose. Videre omfattende føring av prøven over en størrelseseksklusjonsharpiks. Idet størrelseseksklusjonsharpiksen omfatter en sfærisk kompositt av kryss-bundet agarose og dekstran.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre at fremgangsmåten ifølge krav 10 omfatter føring av prøven over en hydrofob interaksjonsharpiks og deretter over en immobiliert heparinharpiks, hydroksyhepatitt, en anion bytteharpiks eller en størrelseseksklusjonsharpiks. Idet den videre omfatter følgende trinn før føring av prøven over den hydrofobe interaksjonsharpiksen: tilveiebringing av en human celle som uttrykker et DNA kodende for et polypeptid omfattende human a-gal A koblet til et heterologt signalpeptid;

dyrking av cellen; og

oppnåelse fra cellen, eller mediet hvor cellen blir dyrket, en prøve inneholdende a-gal A. Idet signalpeptidet er hGH signalpeptidet bestående av aminosyresekvensen SEKV ID NR: 21. Idet fremgangsmåten videre omfatter trinnet av å føre prøven over en andre harpiks valgt fra gruppen bestående av en immobilisert heparinharpiks, hydroksyapatitt, en anion bytteharpiks og en størrelseseksklusjonsharpiks.

Tidligere metoder for fremstilling av a-gal A med forholdsvis høy renhet var avhengig av anvendelse av affinitetskromatografi, med anvendelse av en kombinasjon av lektinaffinitetskromatografi (concanavalin A (Con A) Sepharose) og affinitetskromatografi basert på binding av a-gal A til substrat-analogen N-6-aminoheksanoyl-a-D-galaktosylamin koplet til en Sepharose-matriks (Bishop et al., J. Biol. Chem. 256:1307-1316, 1981). Anvendelse av proteinholdige lektin-affinitetsharpikser og substrat-analoge harpikser er typisk forbundet med kontinuerlig utluting av affinitetsmidlet fra den faste bærer (jf- Marikar et al., Anal. Biochem. 201:306-310, 1992), noe som resulterer i forurensing av det rensede produkt med affinitetsmidlet enten fritt i løsning eller bundet til eluert protein. Slike forurensninger gjør produktet uegnet for anvendelse i farmasøytiske preparater. Bundne substrat-analoger og lektiner kan også ha hovedsakelig negative virkninger på de enzymatiske, funksjonelle og strukturelle egenskaper hos proteiner. Videre er slike affinitetsharpikser typisk kostbare å fremstille, noe som gjør anvendelsen av slike harpikser mindre egnet for produksjon i kommersiell målestokk enn mer konvensjonelle kromatografiharpikser. Utviklingen av en renseprotokoll ved anvendelse av konvensjonelle kromatografiharpikser som er lett tilgjengelige når det gjelder tilførsel og kvalitet egnet for kommersiell anvendelse i stor målestokk, er en betydelig fordel ved foreliggende oppfinnelse .

Et individ som man mistenker har en a-gal A-mangel, kan behandles ved administrering av farmasøytisk akseptabelt, renset humant a-gal A ved hjelp av hvilken som helst standardmetode, innbefattende som eksempel intravenøs, subkutan eller intramuskulær injeksjon, eller som faststoff-implantat. Det rensede protein kan utformes i et terapeutisk preparat bestående av en vandig løsning inneholdende en fysiologisk akseptable eksipiens, f.eks. en bærer så som humant serumalbumin, ved pH 6,5 eller lavere.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således en måte til oppnåelse av store mengder av hensiktsmessig glykosylert og derfor terapeutisk egnet humant a-gal A. Dette gjør enzymerstatningsterapi ved a-gal-mangel kommersielt leve-dyktig, samt relativt risikofritt sammenliknet med terapi med enzym fra humant eller animalsk vev.

Fagfolk på området vil være klar over at den humane a-gal A-DNA-sekvens (enten cDNA eller genom-DNA) eller sekvenser som er forskjellige fra denne enten på grunn av stumme kodonforandringer eller kodonforandringer som gir konservative aminosyresubstitusjoner, kan anvendes til genetisk modifisering av dyrkede humane celler slik at de vil over-eksprimere og utsondre enzymet. Det er også mulig at visse mutasjoner i a-gal A-DNA-sekvensen vil kode for polypeptider som bibeholder eller oppviser forbedret a-gal A-enzymatisk aktivitet (noe som vil være åpenbart ved ekspresjon av det mutante DNA-molekyl i dyrkede celler, rensing av det kodede polypeptid og måling av den katalytiske aktivitet, som beskrevet i det foreliggende). Man vil for eksempel vente at konservative aminosyresubstitusjoner har liten eller ingen virkning på den biologiske aktivitet, spesielt hvis de representerer mindre enn 10% av det totale antall rester i proteinet. Konservative substitusjoner innbefatter typisk substitusjoner i følgende grupper: glycin, alanin; valin, isoleucin, leucin; asparaginsyre, glutaminsyre; asparagin, glutamin; serin, treonin; lysin, arginin; og fenylalanin, tyrosin.

Cellenes dannelse av a-gal A kan maksimeres ved hjelp av visse genetiske manipulasjoner. For eksempel kan DNA-molekylet som koder for a-gal A, også kode for et heterologt signalpeptid, så som signalpeptidet for humant veksthormon (hGH), erytropoietin, Faktor VIII, Faktor IX, glukagon, lavdensitets-lipoprotein-(LDL)-reseptoren eller et annet lysosomalt enzym enn a-gal A. Signalpeptidet er fortrinnsvis hGH-signalpeptidet (SEKV ID NR. 21) og er i den N-terminale ende av det kodede protein. DNA-sekvensen som koder for signalpeptidet, kan inneholde et intron så som det første intron i hGH-genet, som resulterer i en DNA-sekvens så som SEKV ID NR. 27 (se også fig. 10). Videre kan DNA-molekylet også inneholde en 3' ikke-translatert sekvens (UTS) som har en lengde på minst 6 nukleotider (i motsetning til a-gal A-mRNA som finnes hos mennesker, og som ikke har noen 3' UTS, idet det nødvendige polyadenyleringssete er inne i kodings-sekvensen). UTS befinner seg umiddelbart 3' i forhold til terminerings-kodonet i kodesekvensen og innbefatter et polyadenyleringssete. Den har fortrinnsvis en lengde på minst 6 nukleotider, mer foretrukket minst 12, og mest foretrukket minst 30, og i alle tilfeller inneholder den sekvensen AATAAA eller en beslektet sekvens som tjener til befordring av polyadenylering. Et DNA-molekyl som beskrevet, dvs. som koder for et hGH-signalpeptid knyttet til a-gal A og inneholdende en 3' UTS som innbefatter et polyadenyleringssete, og som fortrinnsvis innbefatter ekspresjons-kontrollsekvenser, er også innenfor oppfinnelsen. Innenfor opp-finnelsens ramme er dessuten et DNA-molekyl som koder for et protein som innbefatter signalpeptidet for hGH knyttet til a-gal A eller hvilket som helst annet heterologt polypeptid (dvs. hvilket som helst annet polypeptid enn hGH eller en analog til hGH). Det heterologe polypeptid er typisk et pattedyr-protein, f.eks. hvilket som helst medisinsk ønskelig humant polypeptid.

Andre trekk og fordeler ved oppfinnelsen vil bli åpenbare ut fra den detaljerte beskrivelse som følger, samt kravene.

Betegnelsen «genetisk modifisert» anvendt i det foreliggende ved henvisning til celler, er ment å innbefatte celler som eksprimerer et spesielt genprodukt etter innføring av et DNA-molekyl som koder for genproduktet, og/eller regulerende elementer som regulerer ekspresjonen av en kodingssekvens. Innføring av DNA-molekylet kan utføres ved gen-målsøking (dvs. innføring av et DNA-molekyl i et spesielt genom-sete); videre muliggjør homolog rekombinasjon erstatning av selve det defekte gen (det defekte a-gal A-gen eller en del av det kan erstattes i en Fabry-pasients egne celler med hele genet eller en del derav).

Betegnelsen «a-gal A» anvendt i det foreliggende betyr a-gal A uten signalpeptid, dvs. SEKV ID NR. 26 (fig. 9). Det er en viss indikasjon på at restene 371-398 eller 373-398 i SEKV ID NR. 26 (fig. 9) kan fjernes i lysosomet; imidlertid antas det at fjerning av dette antatte propeptid ikke påvirker enzymets aktivitet. Dette tyder på at hvilken som helst del av det antatte propeptid kan utelates uten at det påvirker aktiviteten. Således dekker betegnelsen «a-gal A» som anvendt i det foreliggende, også et protein med en sekvens som svarer til SEKV ID NR. 26, bortsett fra at det mangler opp til 28 rester i den C-terminale ende av denne sekvens.

Med «a-gal A-mangel» menes hvilken som helst mangel i mengden eller aktiviteten av dette enzym hos en pasient. Mangelen kan bevirke alvorlige symptomer som typisk observeres hos mannlige pasienter som lider av Fabrys sykdom, eller den kan være bare partiell og gi forholdsvis svake symptomer, slik som det kan sees hos heterozygote kvinnelige bærere av det defekte gen.

Anvendt i det foreliggende innbefatter betegnelsen «primærcelle» celler som finnes i en suspensjon av celler isolert fra en virveldyr-vevskilde (før utplating av dem, dvs. festing til et vevskulturunderlag så som en skål eller kolbe), celler som finnes i et eksplantat fra vev, begge de foregående typer celler utplatet første gang, samt cellesuspensjoner tilveiebrakt fra disse utplatede celler.

«Sekundære celler» angir celler i alle etterfølgende trinn ved dyrkningen. Det vil si at første gang en utplatet primærcelle fjernes fra dyrkningsunderlaget og gjen-utplates (gjennomgår en runde [«is passaged»]), omtales den som en sekundær celle, og likeså alle celler i etterfølgende runder («passages»).

En «cellestamme» består av sekundære celler som har gjennomgått én eller flere runder; oppviser et endelig antall middelpopulasjons-doblinger i kultur; oppviser egenskapene ved en kontakt-inhibert, forankringsavhengig vekst (bortsett fra celler som er formert i suspensjonskultur); og er ikke immortalisert.

Med «immortalisert celle» menes en celle fra en etablert cellelinje som oppviser et tilsynelatende ubegrenset livsforløp i kultur.

Med «signalpeptid» menes en peptidsekvens som styrer et nylig syntetisert polypeptid som det er festet til, til det endoplasmatiske retikulum for ytterligere post-translasjonell bearbeidelse og/eller fordeling.

Betegnelsen «heterologt signalpeptid» anvendt i det foreliggende i forbindelse med a-gal A angir et signalpeptid som ikke er det humane a-gal A-signalpeptid (dvs. det som er kodet for av nukleotidene 36-128 i SEKV ID NR. 18). Det er typisk signalpeptidet i et eller annet pattedyrprotein som ikke er a-gal A.

Betegnelsen «første kromatografitrinn» angir den første påføring av en prøve på en kromatografikolonne (alle trinn knyttet til fremstillingen av prøven er utelukket).

Det vises nå til tegningene.

Fig. 1 er en presentasjon av proben på 210 bp som ble anvendt til isolering av a-gal A fra et humant fibroblast-cDNA-bibliotek (SEKV ID NR. 19). Sekvensen er fra ekson 7 i a-gal A-genet. Proben ble isolert fra human genom-DNA ved hjelp av polymerasekjedereaksjonen (PCR). Områdene som er understreket på figuren, svarer til sekvensene i amplifikasjons-primerne. Fig. 2 er en representasjon av sekvensen av DNA-fragmentet som fullfører 5'-enden av a-gal A-cDNA-klonet (SEKV ID NR. 20). Dette fragment ble amplifisert fra human genom-DNA ved hjelp av PCR. De understrekede områder svarer til sekvensene for amplifikasjons-primerne. Posisjonene for Ncol- og Sacll-restrik-sjonsendonukleasesetene, som ble anvendt til subkloning som beskrevet i eksempel IA, er også vist. Fig. 3 er en representasjon av sekvensen av a-gal A-cDNA, innbefattende sekvensen som koder for signalpeptidet (SEKV ID NR. 18). Fig. 4 er et skjematisk kart over pXAG-16, en a-gal A-ekspresjonskonstruksjon som innbefatter CMV-(cytomegalovirus)-promotoren og -intronet, den hGH-signalpeptid-kodende sekvens og første intron, cDNA for a-gal A (dvs. som mangler a-gal A-signalpeptidsekvensen) og hGH 3' UTS. Fig. 5 er et skjematisk kart over pXAG-29, en a-gal A-ekspresjonskonstruksjon som innbefatter kollagen-la2-promotoren, et p-aktin-intron, den hGH-signalpeptid-kodende sekvens og første intron, cDNA for a-gal A (dvs. som mangler a-gal A-signalpeptidsekvensen) og hGH 3' UTS. Fig. 6 er et kromatogram over a-gal A-rensetrinnet med anvendelse av Butyl Sepharose®-harpiks. Absorbansen ved 280 nm (ren linje) og a-gal A-aktivitet (prikket linje) for utvalgte fraksjoner er vist. Fig. 7 er et linjediagram som viser internalisering i Fabry-fibroblaster av humant a-gal A fremstilt i henhold til oppfinnelsen. Den intracellulære a-gal A-aktivitet og totalprotein-konsentrasjon ble målt etter inkubering av cellene med økende konsentrasjoner av humant a-gal A fremstilt i henhold til oppfinnelsen. Effektene av de potensielle internaliserings-inhibitorer mannose-6-fosfat (M6P; åpne romber) og mannan (åpne sirkler) er vist. Fig. 8 er et skjematisk diagram over forsøks-mønsteret utformet for under-søkelse av Fabry-fibroblaster etter internalisering av a-gal A. a-gal A-aktiviteten hos Fabry-cellene måles etter eksponering for enten normale eller a-gal A-overeksprimerende humane fibroblaster dyrket i Transwell®-innskudd. «M6P» = mannose-6-fosfat; «Untrf HF» = ikke-transfekterte humane fibroblaster; «BRS11» = en transfektert, a-gal A-overeksprimerende fibroblaststamme. Fig. 9 er en presentasjon av den humane a-gal A-aminosyresekvens (SEKV ID NR. 26). Fig. 10 er en presentasjon av DNA-sekvensen som koder for hGH-signalpeptidet og som inneholder det første hGH-intron (understreket) (SEKV ID NR. 27). Fig. 11 er en presentasjon av DNA-sekvensen som koder for hGH-signalpeptidet uten intronet (SEKV ID NR. 22). Fig. 12 er en presentasjon av aminosyresekvensen hos hGH-signalpeptidet (SEKV ID NR. 21). Fig. 13 er en presentasjon av cDNA-sekvensen som koder for humant a-gal A (uten signalpeptid) (SEKV ID NR. 25).

Lysosomal-enzymer så som a-gal A siktes inn mot lysosom-delen av en celle ved vekselvirkning med mannose-6-fosfat-(M6P)-reseptoren, som bindes til M6P-rester som finnes i oligosakkarid-delene av enzymer med kurs mot lysosom-delen (S. Kornfeld og I. Mellman, Ann. Rev. Cell Biol. 5:483-525, 1989). Den primære vekselvirkning skjer i Golgi, hvor enzymer bundet til Golgi M6P-reseptorer utskilles for transport til lysosomene. En sekundær type vekselvirkning antas å finne sted mellom ekstracellulært a-gal A og M6P-reseptorer på celleoverflaten. Ekstracellulære substanser internalisert av celler transporteres gjennom cytoplasma i endocytiske vesikler, som smelter sammen med primære lysosomer og tømmer sitt innhold i lysosomene. Ved denne prosess innlemmes også celleoverflate-M6P-reseptorer i endocytiske vesikler og transporteres til lysosomer.

Et hvert a-gal A som finnes i det ekstracellulære miljø kan, hvis det bærer M6P-rester, bindes til celleoverflate-M6P-reseptorene og derved transporteres inn i lysosom-delen sammen med reseptorene. Straks enzymet er i lysosom-delen som resultat av denne fjerningsvei, kan det utføre sin hensiktsmessige funksjon. Således finnes det en mekanisme for at en celle skal kunne ta opp eksogent dannet enzym selv om den genetisk har utilstrekkelig dannelse av sitt eget a-gal A, under forutsetning av (a) at enzymet er passende glykosylert og (b) den mangelfulle celle bærer M6P-reseptorer.

Ved Fabrys sykdom er det vist at vaskulære endotelceller i nyre og hjerte oppviser alvorlige histopatologiske abnormiteter og bidrar til den kliniske patologi ved sykdommen, a-gal A dannet i fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen kan avgis enten lokalt eller systemisk til de angrepne celler, ved genterapi (dvs. ved genetisk modifiserte celler som eksprimerer og utsondrer det glykosylerte enzym i pasienten), eller ved vanlige farmakologiske administreringsmåter. Et a-gal A hvor M6P er tilstede i de N-bundne oligosakkarider er derfor av stor betydning for terapi.

Videre er graden ved hvilken de N-bundne oligosakkarider i a-gal A modifiseres ved sialylering også av stor betydning. Ved fravær av passende sialylering vil a-gal A hurtig bli klaret fra sirkulasjonen på grunn av binding ved hepatiske asialoglykoprotein-reseptorer, fulgt av internalisering og nedbryting av hepatocytter (Ashwell og Harford, Ann. Rev. Biochem. 51:531-554, 1982). Dette reduserer mengden av a-gal A som er tilgjengelig i sirkulasjonen for binding til M6P-reseptorer på celler som bidrar til den kliniske patologi ved Fabrys sykdom, så som de vaskulære endotelceller i nyre og hjerte, a-gal A som utsondres av stabilt transfekterte humane celler, har glykosyleringsegenskaper som er egnet for behandling av Fabrys sykdom enten med genterapi eller ved hjelp av vanlig farmasøytisk administrering av det rensede utsondrede protein. Dette er i motsetning til situasjonen med det best undersøkte lysosomal-enzym, glukocerebrosidase, hvor avgivelse av enzymet renset fra human placenta eller utsondret fra transfekterte CHO-celler til de klinisk relevante celler i kroppen fordrer kompleks enzymatisk modifisering av enzymet etter rensing (cf. Beutler, New Engl. J. Med. 325:1354-1360, 1991).

Teknikker for utførelse av de nødvendige genetiske modifikasjoner er omtalt nedenfor, og likeså metodene for rensing, utforming og behandling.

Eksempel I. Fremstilling og anvendelse av konstruksjoner utformet for avgivelse og ekspresjon av a- gal A

To ekspresjonsplasmider, pXAG-16 og pXAG-28, ble konstruert. Disse plasmider inneholder human a-gal A-cDNA som koder for de 398 aminosyrer i a-gal A-enzymet (uten a-gal A-signalpeptidet); den humane veksthormon-(hGH)-signalpeptid-genom-DNA-sekvens, som er avbrutt av det første intron i hGH-genet; og den ikke-translaterte 3-sekvens (UTS) i hGH-genet, som inneholder et signal for polyadenylering. Plasmid pXAG-16 har den umiddelbart tidlige humane cytomegalovirus-(CMV IE)-promotor og første intron (flankert av ikke-kodende ekson-sekvenser), mens pXAG-28 drives av kollagen-la2-promotoren og også inneholder p-aktin-genets 5' UTS, som inneholder det første intron i p-aktin-genet.

A. Kloning av den komplette a- gal A- cDNA og konstruksjon av a- gal A-ekspresionsplasmidet pXAG- 16

Den humane a-gal cDNA ble klonet fra et human-fibroblast-cDNA-bibliotek som ble konstruert som følger. Poly-A<+->mRNA ble isolert fra total-RNA, og cDNA-syntese ble utført under anvendelse av reagenser for lambda-Zapll®-systemet i henhold til fabrikantens instruksjoner (Stratagene Inc., LaJolla, CA). Kort angitt ble «førstekjede»-cDNA dannet ved reversert transkripsjon i nærvær av en oligo-dT-primer inneholdende et internt Xhol-restriksjonsendonuklease-sete. Etter behandling med RNase H, ble cDNA «nick»-translatert med DNA-polymerase I under dannelse av dobbeltkjedet cDNA. Denne cDNA ble gjort stump-endet med T4-DNA-polymerase, og ligert til EcoRI-adaptorer. Produktene fra denne ligering ble behandlet med T4-DNA-kinase og digerert med Xhol. cDNA ble fraksjonert ved hjelp av Sephacryl-400®-kromatografi. Fraksjoner med stor og middels størrelse ble blandet og cDNA'ene ligert til EcoRI- og Xhol-digererte Lambda Zapll-armer. Produktene fra denne ligering ble deretter pakket og titrert. Det primære bibliotek hadde en titer på 1,2 x 107 pfu/ml og en gjennomsnittlig innskuddsstørrelse på

925 bp.

En 210 bp probe fra ekson 7 i det humane a-gal A-gen (fig. 1, SEKV ID NR.

19) ble anvendt til isolering av cDNA. Selve proben ble isolert fra genom-DNA ved polymerasekjedereaksjonen (PCR) under anvendelse av følgende oligonukleo-tider: 5-CTGGGCTGTAGCTATGATAAAC-3' (Oligo 1; SEKV ID NR. 1)og 5'-TCTAGCTGAAGCAAAACAGTG-3' (Oligo 2; SEKV ID NR. 2). PCR-produktet ble deretter anvendt til screening av fibroblast-cDNA-biblioteket, og positive kloner ble isolert og ytterligerekarakterisert. Én positiv klon, fag 3A, ble underkastet den lambda-Zapll®-system-utskjærende protokoll (Stratagene, Inc., La Jolla, CA), i henhold til fabrikantens instruksjoner. Denne metode ga plasmid pBSAG3A, som inneholder a-gal A-cDNA-sekvensen i pBliescriptSK™-plasmidskjelettet. DNA-sekvensering viste at dette plasmid ikke inneholdt den komplette 5'-ende av cDNA-sekvensen. 5'-enden ble derfor rekonstruert under anvendelse av et PCR-fragment amplifisert fra human genom-DNA. For utførelse av dette ble et 268 bp genom-DNA-fragment (fig. 2, SEKV ID NR. 20) amplifisert under anvendelse av følgende oligonukleotider: 5-ATTGGTCCGCCCCTGAGGT-3' (Oligo 3; SEKV ID NR. 3) og 5'-TGATGCAGGAATCTGGCTCT-3' (Oligo 4; SEKV ID NR. 4). Dette fragment ble subklonet i et «TA»-klonende plasmid (Invitrogen Corp., San Diego, CA) under dannelse av plasmid pTAAGEI. Plasmid pBSAG3A, som inneholder hovedandelen av a-gal A-cDNA-sekvensen, og pTAAGEI, som inneholder 5'-enden av a-gal A-cDNA, ble begge digerert med Sadl og Ncol. Posisjonene for de aktuelle Sadl- og Ncol-seter i det amplifiserte DNA-fragment er vist på fig. 2. Sacll-Ncol-fragmentet på 0,2 kg fra pTAAGEI ble isolert og ligert til ekvivalent digerert pBSAG3A. Dette plasmid, pAGAL, inneholder den komplette a-gal A-cDNA-sekvens, innbefattende sekvensen som koder for a-gal A-signalpeptidet. cDNA ble fullstendig sekvensert (vist på fig. 3 innbefattende a-gal A-signalpep-tidet; SEKV ID NR. 18) og funnet å være identisk med den publiserte sekvens for den humane a-gal A-cDNA (Genbank-sekvens HUM GALA).

Plasmidet pXAG-16 ble konstruert via flere mellomprodukter, som følger. Først ble pAGAL digerert med Sadl og Xhol og gjort stump-endet. Deretter ble endene av det komplette a-gal A-cDNA ligert til Xbal-linkere og subklonet i Xbal-digerert pEF-BOS (Mizushima et al., Nucl. Acids Res. 18:5322, 1990) under dannelse av pXAG-1. Denne konstruksjon inneholder den humane granulocytt-kolonistimulerende faktor (G-CSF) 3' UTS og den humane forlengelsesfaktoMa-(EF-la)-promoter som flankerer cDNA som koder for a-gal A pluss a-gal A-signalpeptidet, slik at 5'-enden av a-gal A-cDNA koples til EF-1a-promotoren. For frembringelse av en konstruksjon med CMV IE-promotoren og første intron ble a-gal A-cDNA og G-CSF 3 UTS fjernet fra pXAG-1 som et to-kb Xbal-BamHI-fragment. Fragmentet ble gjort stump-endet, ligert til BamHI-linkere og innført i BamHI-digerert pCMVflpNeo (som ble konstruert som beskrevet nedenfor). Orienteringen var slik at 5'-enden av a-gal A-cDNA ble koplet til CMV IE-promotor-området.

pCMVflpNeo ble frembrakt som følger. Et CMV IE-gen-promotorfragment ble amplifisert med PCR under anvendelse av CMV-genom-DNA som templat og oligonukleotidene:<5->TTTTGGATCCCTCGAGGACATTGATTATTGACTAG-3'

(SEKV ID NR. 23) og 5-TTTTGGATCCCGTGTCAAGGACGGTGAC-3' (SEKV ID

NR. 24). Det resulterende produkt (et 1,6 kb fragment) ble digerert med BamHI, hvorved man fikk et CMV-promotor-holdig fragment med kohesive BamHI-digererte ender. Neo-ekspresjonsenheten ble isolert fra plasmid pMCIneopA (Stratagene Inc., La Jolla, CA) som et 1,1 kb Xhol-BamHI-fragment. Det CMV-promotor-holdige fragment og neo-fragmentet ble innført i et BamHI-, Xhol-digerert plasmid (pUC12). Spesielt inneholder pCMVflpNeo CMV IE-promotor-området, som begynner ved nukleotid 546 og slutter ved nukleotid 2105 (av Genbank-sekvens HS5MIEP), og neomycinresistens-genet som drives av Herpes Simplex-virus-(HSV)-thymidinkinase-promotoren (TKneo-genet) umiddelbart 5' i forhold til CMV IE-promotorfragmentet. Retningen for transkripsjon av neo-genet er den samme som transkripsjonsretningen for CMV-promotorfragmentet. Denne mellomkonstruksjon ble kalt pXAG-4.

For addering av hGH 3' UTS ble GCSF 3' UTS fjernet fra pXAG-4 som et

Xbal-Smal-fragment, og endene av pXAG-4 ble gjort stumpe. hGH 3' UTS ble fjernet fra pXGH5 (Seiden et al., Mol. Cellular Biol. 6:3173-3179, 1986) som et 0,6 kb Smal-EcoRI-fragment. Etter at dette fragment var gjort stump-endet, ble det ligert i pXAG-4 umiddelbart etter det stump-endede Xbal-sete på pXAG-4. Dette mellomprodukt ble kalt pXAG-7. TKneo-fragmentet ble fjernet fra dette plasmid som et Hindlll-Clal-fragment, og plasmidets ender ble gjort stumpe ved «ifylling» med Klenow-fragmentet av DNA-polymerase I. Et neomycinresistens-gen drevet ved SV40-tidligpromotoren ble ligert inn som et stumpende-Clal-BsmBI-fragment fra et nedbrytningsprodukt av pcDNeo (Chen et al., Mol. Cellular Biol. 7:2745-2752, 1987), idet neo-transkripsjonsenheten ble anbrakt i samme orientering som a-gal A-transkripsjonsenheten. Dette mellomprodukt ble kalt pXAG-13.

For komplettering av pXAG-16, som har den hGH-signalpeptid-kodende sekvens på 26 aminosyrer og første intron av hGH-genet, ble et 2,0 kb EcoRI-BamHI-fragment av pXAG-13 først fjernet. Dette fragment innbefattet a-gal A-cDNA og hGH 3' UTS. Dette store fragment ble erstattet med 3 fragmenter. Det første fragment besto av et 0,3 kb PCR-produkt av pXGH5, som inneholder den hGH-signalpeptid-kodende sekvens og innbefatter første-hGH-intronsekvensen, fra et syntetisk BamHI-sete med beliggenhet like oppstrøms for Kozak-konsensus-sekvensen til enden av den hGH-signalpeptid-kodende sekvens. Følgende oligonukleotider ble anvendt til amplifisering av dette fragment (fragment 1): 5-TTTTGGATCCACCATGGCTA-3' (Oligo HGH101; SEKV ID NR. 5)og 5-TTTTGCCGGCACTGCCCTCTTGAA-3' (Oligo HGH102; SEKV ID NR. 6).

Det annet fragment besto av et 0,27 kb PCR-produkt inneholdende sekvenser svarende til starten av cDNA som koder for a-gal A-enzymet på 398 aminosyrer (dvs. som mangler a-gal A-signalpeptidet) til Nhel-setet. Følgende oligonukleotider ble anvendt til amplifisering av dette fragment (fragment 2): 5-TTTTCAGCTGGACAATGGATTGGC-3' (Oligo AG10; SEKV ID NR. 7) og 5-TTTTGCTAGCTGGCGAATCC-3' (Oligo AG11; SEKV ID NR. 8). Det tredje fragment besto av Nhel-EcoRI-fragmentet av pXAG-7 inneholdende den gjenværende a-gal A-sekvens samt hGH 3' UTS (fragment 3).

Fragment 1 (digerert med BamHI og Nael), fragment 2 (digerert med Pvull og Nhel) og fragment 3 ble blandet med 6,5 kb BamHI-EcoRI-fragmentet av pXAG-13 inneholdende neo-genet og CMV IE-promotoren og ligert sammen under dannelse av plasmid pXAG-16 (fig. 4).

B. Konstruering av a- gal A- ekspresionsplasmidet pXAG- 28

Den humane kollagen-la2-promotor ble isolert for anvendelse i a-gal A-ekspresjonskonstruksjonsn pXAG-28 som følger. Et 408 bp PCR-fragment av human genom-DNA inneholdende en del av den humane kollagen-la2-promotor ble isolert under anvendelse av følgende oligonukleotider: 5-TTTTGGATCCGTGTCCCATAGTGTTTCCAA-3' (Oligo 72; SEKV ID NR. 9)og 5'-TTTTGGATCCGCAGTCGTGGCCAGTACC-3' (Oligo 73; SEKV ID NR. 10).

Dette fragment ble anvendt til screening av et human-leukocytt-bibliotek i EMBL3 (Clontech Inc., Palo Alto, CA). Én positiv klon (fag 7H) inneholdende et 3,8 kb EcoRI-fragment ble isolert og klonet i pBSIISK+ (Stratagene Inc., La Jolla, CA) ved EcoRI-setet (under frembringelse av pBS/7H.2). Et Avrll-sete ble innført i pBSIISK+ ved digerering med Spel, som spalter i pBSIISK+-polylinkeren, «ifylling» med Klenow-fragmentet av DNA-polymerase I, og innføring av oligonuk-leotidet 5-CTAGTCCTAGGA-3' (SEKV ID NR. 11). Denne variant av pBSIISK+ ble digerert med BamHI og Avrll og ligert til 121 bp BamHI-Avrll-fragmentet av det opprinnelige 408 bp kollagen-la2-promotor-PCR-fragment beskrevet ovenfor, under dannelse avPBS/121COL.6.

Plasmidet pBS/121COL.6 ble digerert med Xbal, som spalter i pBSIISK+-polylinkersekvensen, «ifylt» med Klenow-fragmentet av DNA-polymerase I og digerert med Avrll. 3,8 kb BamHI-Avrll-fragmentet av pBS/7H.2 ble isolert og BamHI-setet gjort stump-endet ved behandling med Klenow-enzym. Fragmentet ble deretter digerert med Avrll og ligert til den Avrll-digererte vektor, hvorved kollagenpromotorplasmidet pBS/121bpCOL7H.18 ble dannet.

Deretter ble kollagenpromotoren koplet til 5' UTS av det humane p-aktin-gen, som inneholder det første intron i det humane p-aktin-gen. For isolering av denne sekvens ble et 2 kb PCR-fragment isolert fra human genom-DNA under anvendelse av følgende oligonukleotider: 5-TTTTGAGCACAGAGCCTCGCCT-3' (Oligo BA1, SEKV ID NR. 12) og 5-TTTTGGATCCGGTGAGCTGCGAGAATAGCC-3' (Oligo BA2; SEKV ID

NR. 13).

Dette fragment ble digerert med BamHI og BsiHKAI under frigjøring av et 0,8 kb fragment inneholdende p-aktin 5' UTS og intronet. Et 3,6 kb Sall-Srfl-fragment ble deretter isolert fra kollagenpromotorplasmidet pBS/121bpCOL7H.18 som følger. pBS/121bpCOL7H.18 ble delvis digerert med BamHI (BamHI-setet ligger i 5-enden av kollagen-la2-promotorfragmentet), gjort stump-endet ved behandling med Klenow-fragmentet, og ligert til en Sall-linker (5-GGTCGACC-3'), hvorved et Sall-sete ble anbrakt oppstrøms for kollagen-la2-promotoren. Dette plasmid ble deretter digerert med Sali og Srfl (Srfl-setet ligger 110 bp oppstrøms for kollagen-la2-promotor-CAP-setet), og 3,6 kb-fragmentet ble isolert. Fragmentene på 0,8 og 3,6 kb ble kombinert med Sali- og BamHI-digerert pBSIISK- (Stratagene Inc., La Jolla, CA), og et fragment som besto av følgende fire oligonukleo-tider, ble smeltet sammen (under dannelse av et fragment med en stump ende og en BsiHKAI-ende): 5-GGGCCCCCAGCCCCAGCCCTCCCATTGGTGGAGGCCCTTTTGGAGG-CACCCTAGGGCCAGGAAACTTTTGCCGTAT-3' (Oligo COL-1; SEKV ID

NR. 14),

5-AAATAGGGCAGATCCGGGCTTTATTATTTTAGCACCACGGCCGCCGAG-ACCGCGTCCGCCCCGCGAGCA-3' (Oligo COL-2; SEKV ID NR. 15),

5-TGCCCTATTTATACGGCAAAAGTTTCCTGGCCCTAGGGTGCCTCCAAAA-GGGCCTCCACCAATGGGAGGGCTGGGGCTGGGGGCCC-3' (Oligo COL-3; SEKV ID NR. 16)og 5-CGCGGGGCGGACGCGGTCTCGGCGGCCGTGGTGC-TAAAATAATAAAGCCCGGATC-3' (Oligo COL-4; SEKV ID NR. 17).

Disse fire oligonukleotider svarer, når de er sammensmeltet, til området som begynner ved Srfl-setet på kollagen-promotoren og fortsetter gjennom BsiHKAI-setet i p-aktin-promotoren. Det resulterende plasmid ble betegnet pCOL/p-aktin.

For fullførelse av konstruksjonen av pXAG-28 ble Sall-BamHI-fragmentet av pCOL/p-aktin inneholdende kollagen-la2-promotoren og p-aktin 5' UTS isolert. Dette fragment ble ligert til to fragmenter fra pXAG-16 (se eksempel 1A og fig. 4): (1) 6,0 kb BamHI-fragmentet (inneholdende neo-genet, plasmidskjelettet, cDNA som koder for a-gal A-enzymet med 398 aminosyrer, og hGH 3' UTS); og (2) BamHI-Xhol-fragmentet på 0,3 kb (som inneholder SV40-poly A-sekvensen fra pcDneo). pXAG-28 inneholder den humane kollagen-la2-promotor koblet til den humane p-aktin 5'-UTS, hGH-signalpeptidet (som er avbrutt av hGH-første-

intronet), cDNA som koder for a-gal A-enzymet, samt hGH 3' UTS. Et kart over den fullstendige ekspresjonskonstruksjon pXAG-28 er vist på fig. 5.

C. Transfektering og selektering av fibroblaster elektroporert med a- gal A-ekspresionsplasmider

For eksprimering av a-gal A i fibroblaster ble sekundære fibroblaster dyrket og transfektert i henhold til publiserte metoder (Seiden et al., WO 93/09222).

Plasmidene pXAG-13, pXAG-16 og pXAG-28 ble transfektert ved

elektroporering i humane forhud-fibroblaster under dannelse av stabilt trans-fekterte kloncellestammer, og de resulterende a-gal A-ekspresjonsnivåer ble kontrollert som beskrevet i eksempel ID. Sekresjon av a-gal A hos normale forhud-fibro-blaster er i området 2-10 enheter pr. 10<6>celler pr. 24 timer. I mot-setning til dette oppviste de transfekterte fibroblaster middel-ekspresjonsnivåer som vist i tabell 1:

Disse data viser at alle de tre ekspresjonskonstruksjoner kan øke a-gal A-ekspresjonen mange ganger i forhold til hos ikke-transfekterte fibroblaster. Ekspresjon hos fibroblaster som er stabilt transfektert med pXAG-13, og som koder for a-gal A bundet til a-gal A-signalpeptidet, var hovedsakelig lavere enn ekspresjon ved fibroblaster transfektert med pXAG-16, som bare er annerledes ved at signalpeptidet er hGH-signalpeptidet, hvis kodingssekvens er avbrutt av det første intron i hGH-genet.

Hver gang de transfekterte celler gjennomgikk en runde, ble den utsondrede a-gal A-aktivitet bestemt, cellene ble tellet og celletettheten beregnet. Basert på antallet høstede celler og tiden som fikk gå for sekresjon av a-gal A, ble den spesifikke ekspresjonshastighet for a-gal A bestemt og er angitt i tabeller 2 og 3 som utsondrede enheter (av a-gal A) pr. 10<6>celler pr. 24 timers tidsrom. Celle-stammer som var ønskelige for genterapi eller for anvendelse ved dannelse av materiale for rensing av a-gal A, skulle oppvise stabil vekst og ekspresjon over flere gjennomgåtte runder. Data fra cellestammene vist i tabeller 2 og 3, som var stabilt transfektert med a-gal A-ekspresjonskonstruksjonen pXAG-16, illustrerer det faktum at a-gal A-ekspresjon holdes stabilt i løpet av serier av gjennomgåtte runder.

D. Kvantifisering av a- gal A- ekspresion

Aktiviteten av a-gal A-aktivitet ble målt ved anvendelse av det vannløselige substrat 4-metylumbelliferyl-a-D-galaktopyranosid (4-MUF-gal; Research Products, Inc.) ved en modifisering av protokollen beskrevet av loannou et al. (J. Cell Biol. 119:1137-1150,1992). Substratet ble oppløst i substratbuffer (0,1 M citratfosfat, pH 4,6) til en konsentrasjon på 1,69 mg/ml (5 mM). Det ble typisk tilsatt 10 uJ dyrkningssupernatant til 75uJ av substratløsningen. Rørene ble tildekket og fikk inkuberes i et 37°C vannbad i 60 minutter. Ved slutten av inkuberingstidsrommet ble 2 ml glycin-karbonat-buffer (130 mM glycin, 83 mM natriumkarbonat, pH 10,6) anvendt til å stoppe reaksjonen. Den relative fluorescens av hver prøve ble målt under anvendelse av et fluorometer av typen TK0100 (Hoefer Scientific Instruments) som har en fastsatt eksitasjonsbølgelenge på 365 nm og påviser en fastsatt emisjonsbølgelengde på 460 nm. Avlesningene av prøvene ble sammenliknet med standarder tillaget av en 1 u.M forrådsløsning av metylumbelliferon (Sigma Chemical Co.), og mengden hydrolysert substrat ble beregnet. Aktiviteten av a-gal A er uttrykt i enheter; én enhet a-gal A-aktivitet er ekvivalent med ett nanomol substrat hydrolysert pr. time ved 37°C. Celle-ekspresjonsdataene ble generelt uttrykt som enheter av a-gal A-aktivitet utsondret pr. 10<6>celler pr. 24 timer. Denne analyse ble også anvendt til måling av mengden a-gal A-aktivitet i cellelysater og i prøver fra forskjellige a-gal-rensetrinn, som omtalt nedenfor.

Eksempel II. Rensing av a- gal A fra det kondisjonerte medium av stabilt transfekterte humancellestammer

Eksempler 11 A-I IE illustrerer at a-gal A kan renses til nær homogenitet fra det kondisjonerte medium av dyrkede humancellestammer som er blitt stabilt transfektert for produksjon av enzymet.

A. Anvendelse av Butyl Sepharose®- kromatografi som et første trinn ved rensing av a- gal A

Kaldt kondisjonert medium (1,34 liter) ble klaret ved sentrifugering og filtrert gjennom et 0,45^m celluloseacetatfilter under anvendelse av glassfiber-forfiltre. Under omrøring ble pH i det kalde, filtrerte medium justert til 5,6 ved dråpevis tilsetting av 1 N HCI, og ammoniumsulfat ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 0,66 M ved dråpevis tilsetting av en forrådsløsning (romtemperatur) av 3,9 M ultrarent ammoniumsulfat. Mediet ble omrørt i ytterligere 5 minutter ved 4°C, filtrert som før og påsatt på en hurtigstrømningskolonne av typen Butyl Sepharose® 4 (81 ml kolonnevolum, 2,5 x 16,5 cm; Pharmacia, Uppsala, Sverige) som var blitt ekvilibrert i 10 mM MES-Tris, pH 5,6, inneholdende 0,66 M ammoniumsulfat (buffer A). Kromatografien ble utført ved 4°C på et Gradi-Frac™-system (Pharmacia, Uppsala, Sverige) utstyrt med «in-line»-UV (280 nm) og ledingsevne-monitorer for bedømmelse av henholdsvis totalprotein- og saltkonsentrasjon. Etter prøve-påføring ved en strømningshastighet på 10 ml/min, ble kolonnen vasket med 10 kolonnevolum av buffer A. a-gal A ble eluert fra Butyl Sepharose®-kolonnen med en 14 kolonnevolum lineær gradient fra buffer A (inneholdende ammoniumsulfat) til 10 mM MES-Tris, pH 5,6 (intet ammoniumsulfat). Fraksjonene ble analysert med hensyn til a-gal A-aktivitet ved hjelp av 4-MUF-gal-analysen, og de som inneholdt vesentlige mengder enzymaktivitet, ble blandet. Som det vil sees av fig. 6 og rense-oppsummeringen (tabell 3), fjerner dette trinn ca. 99% av det forurensende protein (før-kolonne-prøve = 8,14 g totalprotein; etterkolonne-prøve = 0,0638 g totalprotein).

B. Anvendelse av Heparin Sepharose®- kromatografi som et trinn for rensing av a- gal A

Toppfraksjonene fra Butyl Sepharose®-kolonnen ble dialysert ved 4°C mot (4 liter) 10 mM MES-Tris, pH 5,6 (utskiftet én gang). Dialysatet ledingsevne ble justert til 1,0 mMHO ved 4°C ved tilsetting av H2O eller NaCI etter behov. Deretter ble prøven påsatt på en hurtigstrømnings-kolonne av typen Heparin Sepharose® (Pharmacia, Uppsala, Sverige; 29 ml kolonnevolum, 2,5 x 6 cm) som var blitt ekvilibrert i 10 mM MES-Tris, pH 5,6, inneholdende 9 mM NaCI (buffer B). Dette ble utført ved 4°C ved en strømningshastighet på 10 ml/min. «ln-line»-UV- (280 nm) og ledingsevne-monitorer målte totalprotein- og saltkonsentrasjon. Etter at prøven var påsatt, ble kolonnen vasket med 10 kolonnevolum av buffer B, fulgt av en 3 kolonnevolum lineær gradient til 8% buffer C/92% buffer B (hvor buffer C er 10 mM MES-Tris, pH 5,6, inneholdende 250 mM NaCI) og en 10 kolonnevolum vaskeløsning med 8% buffer C. Dette ble fulgt av eluering av a-gal A med en 1,5 kolonnevolum lineær gradient til 29% buffer C og en påfølgende 10 kolonnevolum lineær gradient til 35% buffer C. Fraksjonene ble analysert med hensyn til a-gal A-aktivitet, og de som inneholdt vesentlige mengder aktivitet, ble blandet.

C. Anvendelse av hvdroksvapatitt- kromatografi som et trinn for rensing av a-gal A

Heparinblandingen ble filtrert og påsatt direkte på en kolonne av Ceramic Hydroxyapatite HC (40 um; American International Chemical, Natick, MA; 12 ml kolonnevolum, 1,5 x 6,8 cm) som var blitt ekvilibrert i 1 mM natriumfosfat, pH 6,0 (buffer D). Kromatografien ble utført ved romtemperatur på et hybrid GradiFrac™/FPLC®-system (Pharmacia, Uppsala, Sverige) utstyrt med «in-line»-UV (280 nm) og ledingsevne-monitorer. Etter at prøven var påsatt (5 ml/min), ble kolonnen vasket med 10 kolonnevolum av buffer D. a-gal A ble eluert med en 7 kolonnevolum lineær gradient til 42% buffer E/58% buffer D (hvor buffer E er 250 mM natriumfosfat, pH 6,0), fulgt av en 10 kolonnevolum gradient til 52% buffer E. Fraksjonene ble analysert med hensyn til a-gal A-aktivitet, og fraksjonene som inneholdt vesentlig aktivitet, ble blandet.

D. Anvendelse av Q Sepharose® anionbytter- kromatografi som et trinn for rensing av a- gal A

Hydroksyapatitt-blandingen ble fortynnet omtrent 1,5 ganger med H2O til en slutt-ledningsevne på 3,4-3,6 mMHO ved romtemperatur. Etter filtrering ble prøven påsatt på en kolonne av Q Sepharose® HP (Pharmacia, Uppsala, Sverige; 5,1 ml kolonnevolum, 1,5 x 2,9 cm) ekvilibrert i 10% buffer G/90% buffer F, hvor buffer F er 25 M natriumfosfat, pH 6,0, og buffer G er 25 mM natriumfosfat, pH 6,0, 250 mM NaCI. Kromatograferingen ble utført ved romtemperatur på Gradi-Frac™/-FPLC®-hybridsystemet (Pharmacia, Uppsala, Sverige), og totalprotein- og saltkonsentrasjon ble kontrollert ved hjelp av «in-line»-monitorene. Prøven ble påsatt ved en strømningshastighet på 5 ml/min, og deretter ble følgende trinn utført: (1) en vasking med 5 kolonnevolum 10% buffer G, (2) en vasking med 7 kolonnevolum 12% buffer G, (3) en lineær gradient (3 kolonnevolum) til 50% buffer G, (4) en lineær gradient (10 kolonnevolum) til 53% buffer G, (5) en lineær gradient (3 kolonnevolum) til 100% buffer G, (6) en vasking med 10 kolonnevolum 100% buffer G. a-gal A ble hovedsakelig eluert i løpet av trinnene 3 og 4. Fraksjoner som inneholdt vesentlig aktivitet, ble blandet («Q-blandingen»).

E. Anvendelse av Superdex®- 200 gelfiltreringskromatografi som et trinn for rensing av a- gal A

Q-blandingen ble konsentrert ca. 5 ganger under anvendelse av sentrifuge-konsentrator-enheter av typen Centriprep®-10 (Amicon, Beverly, MA) og påsatt på en kolonne av Superdex® 200 (Pharmacia, Uppsala, Sverige; 189 ml kolonnevolum, 1,6 x 94 cm). Kolonnen ble ekvilibrert og eluert med 25 mM natriumfosfat, pH 6,0, inneholdende 150 mM NaCI. Kromatograferingen ble utført på et FPLC®-system (Pharmacia, Uppsala, Sverige) ved romtemperatur under anvendelse av en «in-line» UV-monitor (280 nm) til å følge elueringen av proteinet. Volumet av prøven som ble påsatt på kolonnen, var < 2 ml, strømningshastigheten var 0,5 ml pr. min og fraksjonsstørrelsen var 2 ml. Det ble utført multiple kolonnekjøringer; fraksjonene ble analysert med hensyn til a-gal A-aktivitet, og fraksjoner som inneholdt vesentlige aktivitetsmengder, ble blandet.

De blandede fraksjoner fra Superdex® 200-kolonnen ble konsentrert under anvendelse av Centriprep-10-enheter, delt i porsjoner, hurtigfrosset og oppbevart ved -80°C i korte tidsrom. En oppsummering av dette eksempel på a-gal A-rensing er vist i tabell 3. Slutt-utbyttet av a-gal A var 59% av aktiviteten av utgangsmaterialet, og den spesifikke aktivitet av det rensede produkt var 2,93 x 106 enheter pr. mg protein. Det resulterende produkt viste et høyt nivå av renhet etter elektroforese under reduserende betingelser på 4-15% SDS-polyakrylamidgel, som deretter ble sølvfarget.

Eksempel III. Utforming og oppbevaring av renset a- gal A

Grundig renset a-gal A er ikke stabilt i lengre tidsrom ved lagring som fortynnet løsning av renset protein (< 1 mg protein pr. ml). Det ble derfor oppfunnet en utformning for forbedring av stabiliteten under langvarig lagrig, dvs. lagring som varte i fra flere uker til minst flere måneder. Det rensede enzym ble konsentrert til minst 1 mg/ml med anvendelse av en sentrifuge-konsentrator (i enzymbuffer bestående av 25 mM natriumfosfat (pH 6,0) og 150 mM NaCI). Humant serumalbumin (HSA; Buminate®, Baxter-Hyland) ble tilsatt til en slutt-konsentrasjon på 2,5 mg/ml. Proteinløsningen ble deretter sterilfiltrert under anvendelse av et 0,2 urn celluloseacetatfilter (Schleicher og Schuell) knyttet til en sprøyte, a-gal A-løsningen ble fordelt i sterile, pyrogenfrie medisinglass, forseglet med Teflon-deksel, hurtigfrosset og lagret ved -20°C.

Stabiliteten av a-gal A-aktiviteten ble vurdert over et tidsrom på 3 måneder under anvendelse av 4-MUF-gal-analysen. Dataene vist i tabell 5 viser at det ikke var noe tap av enzymaktivitet i løpet av testperioden. Den sure pH i preparatet (< 6,5) er avgjørende for stabiliteten av det grundig rensede enzym.

Tabell 5: Stabilitet av utformet a-gal A ved -20°C

Prøve Spesifikk aktivitet (enheter pr. mg

totalprotein)

tidO 2,24 x 10e+/-0,33x 10e

ukel 2,40 x 10b+/-0,25x 10b

uke 2 2,42 x 10e+/-0,21 x 10e

uke 3 2,37 x 10<e>+/-0,05x 10e

måned 1 2,39 x 10e +/- 0,16 x 10e

måned 2 2,31 x 10<6>+/- 0,26 x 10<6>

måned 3 2,29 x 10e +/- 0,17 x 10e

Eksempel IV. a- gal A dannet av humane cellestammer er egnet for behandling av a-gal A- mangel

De strukturelle og funksjonelle egenskaper hos renset a-gal A ifølge fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen ble undersøkt for å påvise at DNA-molekylene beskrevet i det foreliggende og de tilsvarende eksprimerte glykoproteiner dannet av transfekterte humane cellestammer kan anvendes ved henholdsvis gen-eller enzym-erstatningsterapier.

A. Størrelse av a- gal A dannet av stabilt transfekterte humane celler i kultur

Molekylmassen av a-gal A ble vurdert ved hjelp av MALDI-TOF-masse-spektrometri. Disse resultater viser at dimerens molekylmasse er 102 353 Da, mens monomerens molekylmasse er 51 002 Da. Den ventede molekylmasse for monomeren, basert på aminosyresammensetningen, er 45 400 Da. Man kan derfor trekke den slutning av karbohydrat-innholdet i enzymet utgjør opp til 5 600 Da av molekylvekten.

Resultatene av standard-aminosyreanalyse utført for det rensede protein er i overensstemmelse med den konklusjon at proteinet dannet av transfekterte humane celler er identisk med proteinet renset fra humant vev på aminosyre-nivået.

B. N- Terminal bearbeiding av a- gal A dannet av stabilt transfekterte humane celler

Den humane a-gal A-cDNA-nukleotidsekvens koder for 429 aminosyrer. De 31 N-terminale aminosyrer utgjør en signalpeptid-sekvens, som spaltes etter hvert som proteinet som er under utvikling, går gjennom membranen i det endoplasmatiske retikulum (LeDonne et al., Arch. Biochem. Biophys. 224:186, 1983; Lemansky et al., J. Biol. Chem. 262:2062, 1987). For å bekrefte at a-gal A var tilbørlig bearbeidet ved tilknytting til en heterolog signalpeptid-sekvens (for eksempel den humane veksthormon-signalsekvens) og eksprimert i transfekterte humane fibroblaster, ble ti N-terminale aminosyrer i det utsondrede protein mikrosekvensert. Prøver ble kjørt i elektroforese ved hjelp av SDS-PAGE og overført til ProBlott® (ABI, Foster City, CA) under anvendelse av et buffersystem av 10 mM CAPS (pH 11,0), 10% metanol. Proteinet på ProBlott® ble visualisert ved hjelp av Coomassie-farging, og et bånd med passende størrelse (50 kDa) ble utskåret. N-terminal sekvens ble oppnådd ved anvendelse av en puls-væskefase-aminosyre-sekvensanalysator av typen Applied Biosystems som utfører automatisert Edman-nedbryting. Den oppnådde N-terminale sekvens, LDNGLARTPT (SEKV ID NR. 28), er i overensstemmelse med riktig spalting av signalpeptidet, og er tilpasset den N-terminale sekvens som er forutsett for det utsondrede protein.

C. C- Terminal aminosyre av a- gal A dannet av stabilt transfekterte humane celler

Den C-terminale aminosyrerest av utsondret a-gal A fremstilt i henhold til oppfinnelsen ble identifisert under anvendelse av en automatisk C-terminal-sekvensanalysator av typen Hewlett Packard. Resultatene viste en leucinrest i den C-terminale ende, noe som er i overensstemmelse med den C-terminale aminosyre forutsett ved DNA-sekvensen.

D. Karbohvdrat- modifisering av a- gal A dannet av stabilt transfekterte humane celler

Glykosyleringsmønsteret for a-gal A fremstilt i henhold til oppfinnelsen ble også vurdert. Riktig glykosylering er viktig for optimal in vivo-aktivitet av a-gal A; a-gal A eksprimert i ikke-glykosyleringssystemer er inaktivt eller ustabilt (Hantzo-polous et al., Gene 57:159, 1987). Glykosylering er også viktig for internalisering av a-gal A i de ønskede målceller, og påvirker sirkulasjons-halveringstiden for enzymet in vivo. På hver subenhet av a-gal A er fire seter tilgjengelig for addisjon av asparagin-tilknyttede karbohydratkjeder, blant hvilke bare tre er opptatt (Desnick et al., i The Metabolic and Molecular Bases oflnherited Disease,

s. 2741-2780, McGraw Hill, New York, 1995).

En prøve av a-gal A dannet av stabilt transfekterte celler ble behandlet med neuraminidase, som isoleres fra A. urafaciens, (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) for fjerning av sialinsyre. Denne reaksjon ble utført ved behandling av 5 fag a-gal A over natten med 10 mE neuraminidase ved romtemperatur i et totalt volum på 10 uJ acetatbufret saltoppløsning (ABS, 20 mM natriumacetat, pH 5,2, 150 mM NaCI).

Renset a-gal A dannet av stabilt transfekterte celler ble også defosforylert under anvendelse av alkalisk fosfatase (intestinal alkalisk kalve-fosfatase, Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) ved behandling av 5 ug a-gal A over natten ved romtemperatur med 15 E alkalisk fosfatase i ABS (pH øket til 7,5 med 1 M Tris).

Prøvene ble analysert ved hjelp av Western blot med et a-gal A-spesifikt antistoff. Det anvendte antistoff var et polyklonalt kanin-antipeptid-antistoff, som ble fremstilt under anvendelse av et peptid som representerte aminosyrene 68-81 i a-gal A som immunogen. Etter overføring av proteinet til PVDF (Millipore, Bedford, MA), ble membranen undersøkt med en 1:2000 fortynning av antiserumet i 2,5% blotto (ikke-fet tørrmelk i 20 mM Tris-HCI, pH 7,5, 0,05% Tween-20). Dette ble fulgt av påvisning med geit-antikanin-IgG konjugert til pepperrot-peroksidase (Organon Teknika/Cappel, Durham, NC; 1:5000 fortynning) og reagenser i ECK-kjemiluminescens-settet (Amersham, Arlington Heights, IN).

Behandling av a-gal A med neuraminidase resulterer i en liten skifting i molekylmasse (omtrent 1500-2000 Da eller 4-6 sialinsyrer pr. monomer), noe som tyder på at det er omfattende modifikasjon av a-gal A med sialinsyre. For referanse har plasmaformen av a-gal A 5-6 sialinsyre-rester pr. monomer, og placentaformen har 0,5-1,0 sialinsyrerester pr. monomer (Bishop et al., J. Biol. Chem. 256:1307, 1981).

En annen metode som ble anvendt for undersøkelse av sialinsyre- og mannose-6-fosfat-modifikasjonene av a-gal A, var isoelektrisk fokusering (IEF), hvor prøvene separeres på basis av sitt isoelektriske punkt (pl) eller nettoladning. Således er det ventet at fjerning av ladede rester så som sialinsyre eller fosfat fra a-gal A vil forandre proteinets mobilitet i IEF-systemet.

For utførelse av IEF-forsøket ble prøver av a-gal A fremstilt ifølge oppfinnelsen behandlet med nauraminidase og alkalisk fosfatase, blandet 1:1 med 2X Novex-prøvebuffer (med 8 M urea, pH 3,0-7,0), og påsatt på en 6 M urea IEF-gel (5,5% polyakrylamid) laget under anvendelse av Pharmalyte® (Pharmacia, Uppsala, Sverige; pH 3,0-6,5; Pharmalyte® 4-6,5 og 2,5-5,5, 0,25 ml av hver pr. gel). Standarder for isolektrisk punkt (Bio-Rad) ble også medtatt. Etter elektroforese ble gelen overført til PVDF, og Western blot-analyse ble utført som beskrevet ovenfor.

a-gal A dannet av stabilt transfekterte humane fibroblaster besto av tre hoved-isoformer med et pl-område på ca. 4,4-4,65. Disse verdier er lik pl'ene for plasma-og miltformene av a-gal A (Bishop et al., J. Biol. Chem. 256:1307, 1981). Neuramidase-behandling av enzymet økte pl for alle tre isoformer, noe som viste at alle i en viss grad ble modifisert av sialinsyre. Disse data tyder på at a-gal A dannet

av stabilt transfekterte humane celler skulle ha en ønskelig plasma-halveringstid, noe som viser at dette materiale er godt egnet for farmakologisk anvendelse. Videre økte behandling av neuraminidase-behandlet a-gal A med alkalisk fosfatase ytterligere pl for en del av proteinet til ca. 5,0-5,1, noe som viser at enzymet bærer én eller flere mannose-6-fosfat-rester. Denne modifisering er betydelig ved at den er nødvendig for effektiv internalisering av a-gal A i målcellene.

E. Spesifikk aktivitet av a- gal A renset fra stabilt transfekterte fibroblaster

Potensen eller den spesifikke aktivitet av renset a-gal A beregnes ved måling av både den katalytiske aktivitet av enzymet (med 4-MUF-gal-analysen) og proteinkonsentrasjonen. Proteinkonsentrasjonen kan bestemmes ved hjelp av hvilken som helst standardmetode, så som med BCA-systemet (Pierce) eller ved måling av absorbansen ved 280 nm og under anvendelse av mg/ml-ekstinksjons-koeffisienten på 2,3 (bestemt ut fra aminosyreanalyse) til beregning av verdien. Ved anvendelse av disse teknikker er den spesifikke aktivitet for a-gal A renset fra det kondisjonerte medium for transfekterte humane fibroblaster 2,2-2,9 x 10<6>enheter pr. mg protein, noe som er sammenliknbart med den spesifikke aktivitet av a-gal A som er renset fra humant vev (Bishop et al., J. Biol. Chem. 256:1301, 1981).

F. Mannose- eller mannose- 6- fosfat- formidlet internalisering av a- gal A

For at a-gal A dannet av stabilt transfekterte celler skal kunne være et effektivt terapeutisk middel ved a-gal A-mangler, må enzymet internaliseres av de angrepne celler, a-gal A er ikke aktivt ved fysiologiske pH-nivåer, og det er usannsynlig at det er effektivt i blod- eller interstitial-fluidene. Det metaboliserer opphopede lipidsubstrater optimalt bare når det er internalisert i det sure miljø i lysosomet. Denne internalisering formidles ved binding av a-gal A til mannose-6-fosfat-(M6P)-reseptorer, som eksprimeres på celleoverflaten og avgir enzymet til lysosomet via den endocytiske vei. M6P-reseptoren eksprimeres over alt, de fleste somatiske celler eksprimerer den i en viss grad. Mannose-reseptoren, som er spesifikk for eksponerte mannoserester på glykoproteiner, er mindre frem-tredende. Sistnevnte reseptorer finnes generelt bare på makrofager og makro-fagliknende celler, og gir et ytterligere hjelpemiddel for a-gal A-inngang i disse celletyper.

For påvisning av M6P-formidlet internalisering av a-gal A ble hud-fibroblaster fra en pasient med Fabrys sykdom (NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository) ble dyrket over natten i nærvær av økende konsentrasjoner av renset a-gal Ai. En del av prøvene inneholdt 5 mM løselig M6P, som kompetitivt inhiberer binding til, og som et resultat, internalisering av, mannose-6-fosfat-reseptoren. Andre prøver inneholdt 30fag/ml mannan, som inhiberer binding til, og som et resultat, internalisering av, mannosereseptoren. Etter inkubering ble cellene vasket og høstet ved skraping i lysebuffer (10 mM Tris, pH 7,2,100 mM NaCI, 5 mM EDTA, 2 mM Pefabloc™ (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) og 1% NP-40). De lyserte prøver ble deretter analysert med hensyn til proteinkonsentrasjon og a-gal A-aktivitet. Resultatene er uttrykt som enheter a-gal A-aktivitet pr. mg celleprotein. Fabry-cellene internaliserte a-gal A på en doseavhengig måte (fig. 7). Denne internalisering ble inhibert med mannose-6-fosfat, men det var ingen inhibering med mannan. Internalisering av a-gal A i Fabry-fibroblaster formidles derfor ved mannose-6-fosfat-reseptoren, men ikke ved mannose-reseptoren.

a-gal A blir også internalisert in vitro av endotelceller, viktige målceller for behandlingen av Fabrys sykdom. Humane navlevene-endotelceller (HUVECer) ble dyrket over natten med 7500 enheter a-gal A; noen av brønnene inneholdt M6P.

Etter inkuberingstidsrommet ble cellene høstet og analysert med hensyn til a-gal A som beskrevet ovenfor. Cellene som var inkubert med a-gal A, hadde bare enzymnivåer som var nesten 10 ganger over nivåene for kontroll-celler (ingen inkubering med a-gal A). M6P inhiberte den intracellulære opphoping av a-gal A, noe som tyder på at internaliseringen av a-gal A ved hjelp av HUVECer formidles ved M6P-reseptoren. Således internaliseres det humane a-gal A ifølge oppfinnelsen ved hjelp av klinisk aktuelle celler.

Få dyrkede humancellelinjer er kjent for å eksprimere mannose-reseptoren. Imidlertid kan en musemakrofag-liknende cellelinje (J774.E) som bærer mannose-reseptorer, men få, hvis noen, mannose-6-fosfat-reseptorer, anvendes til bestemmelse av om hvorvidt renset a-gal A ifølge fremgagsmåte ifølge oppfinnelsen internaliseres via mannosereseptoren (Diment et al., J. Leukocyte Biol. 42:485-490, 1987). J774. E-celler ble dyrket over natten i nærvær av 10 000 enheter/ml a-gal A. Utvalgte prøver inneholdt også 2 mM M6P, og andre inneholdt 100 fag/ml mannan. Cellene ble vasket og høstet som beskrevet ovenfor, og totalproteinet og a-gal A-aktiviteten for hver prøve ble bestemt. Resultatene er vist i tabell 5. M6P inhiberer ikke opptaket av a-gal A hos disse celler, mens mannan reduserer de opphopede a-gal A-nivåer med 75%. Således kan a-gal A internaliseres ved hjelp av mannosereseptoren i celletyper som eksprimerer denne spesielle celleoverflate-reseptor.

Disse forsøk viser at a-gal A dannet av stabilt transfekterte humane celler kan internaliseres av celler via mannose- eller mannose-6-fosfat-reseptoren.

G. Korrigering av Fabry- fibroblaster med humane fibroblaster som eksprimerer g- gal A

For genterapi må et implantat av autologe celler som danner a-gal A, danne enzymet i en form som er hensiktsmessig modifisert for «korrigering» av a-gal A-mangelen hos målceller. For vurdering av effekten av a-gal A-dannelse av transfekterte humane fibroblaster, på Fabry-celler, ble fibroblaster høstet fra pasienter med Fabrys sykdom (NIGMS Human Genetics Mutant Cell Repository) dyrket sammen med en a-gal A-dannende cellestamme (BRS-11) i Transwells®

(Costar, Cambridge, MA). Forsøksskjemaet er vist på fig. 8. Fabryceller ble dyrket i 12-brønns-vevskulturskåler, og noen av dem inneholdt innskudd (Transwells®, 0,4fam porestørrelse) med en overflate på hvilken celler kan dyrkes. Vekstmatriksen i innskuddet er porøs og gir mulighet for at makromolekyler kan passere fra det øvre til det nedre miljø. Ett sett av innskudd inneholdt fibroblaster fra normal human forhud (HF), som utsondrer minimale nivåer av a-gal A, mens et annet sett inneholdt den stabilt transfekterte humane fibroblaststamme, BRS-11, som utsondrer store mengder a-gal A. I brønnene som er sam-dyrket med a-gal A-dannende celler, kan a-gal A kommer inn i mediet som Fabry-cellene finnes i, og potensielt internaliseres av Fabry-cellene.

Dataene i tabell 7 viser at Fabry-celler internaliserte det utsondrede a-gal A. De intracellulære nivåer av a-gal A ble kontrollert i tre dager. Cellene som ble dyrket alene (intet innskudd) eller i nærvær av ikke-transfekterte forhud-fibro-blaster (HF-innskudd), hadde meget lave intracellulære nivåer av a-gal A-aktivitet. Fabry-cellene som var dyrket med de a-gal A-dannende (BRS-11-innskudd) celler, oppviste imidlertid enzymnivåer i likhet med nivåene hos normale celler ved slutten av dag 2 (normale fibroblaster har 25-80 enheter a-gal A pr. mg protein). At korrigeringen skyldes a-gal A opptatt via M6P-reseptoren, vises ved dens inhibering med mannose-6-fosfat (BRS-11-innskudd + M6P).

H. Anvendelse av andre celletyper

Andre celletyper kan anvendes ved fremgangsmåten beskrevet i det foreliggende. Cellene kan fås fra mange forskjellige vev og innbefatter alle celletyper som kan holdes i kultur. For eksempel innbefatter primære og sekundære celler som kan transfekteres ved hjelp av foreliggende metode, humane fibroblaster, keratinocytter, epitelceller (f.eks. bryst- eller intestinal-epitelceller), endotelceller, gliaceller, nerveceller, formede elementer i blodet (f.eks. lymfocytter og benmargsceller), muskelceller, samt forløpere for disse somatiske celletyper. Fibroblaster er spesielt aktuelle. Primære celler tas fortrinnsvis fra individet som de transfekterte primære og sekundære celler skal administreres til, slik at de ikke skal forkastes av pasientens immunsystem. Hvis man imidlertid er tilstrekkelig oppmerksom på å unngå eller undertrykke immun-forkastelse (som beskrevet nedenfor), kan det også anvendes celler fra en annen human donor enn pasienten. Dette vil muliggjøre anvendelse av celler fra en standardisert, anerkjent, stabilt transfektert cellelinje for alle pasienter.

I. Administrering av a- gal A- eksprimerende celler

Cellene beskrevet ovenfor kan innføres i et individ via forskjellige standardiserte administreringsmåter slik at de for eksempel vil holde til i nyre-subkap-selen, et subkutant rom, sentralnervesystemet, mellomkapselrommet («the intra-thecal space»), leveren, intraperiotonealhulen, eller i en muskel. Cellene kan også injuseres intravenøst eller intra-arterielt slik at de sirkulerer i individets blodstrøm. Straks de transfekterte celler er implantert i individet, vil de danne og utsondre det terapeutiske produkt, glykosylert humant a-gal A.

Antallet genetisk modifiserte celler som vil bli innført i individet, vil variere, men kan bestemmes av fagfolk på området. Hver pasients alder, vekt, kjønn og generelle fysiske tilstand, samt fordelingsvolumet, halveringstiden og biotilgjengeligheten av enzymet og produktiviteten av de genetisk modifiserte celler in vivo vil være blant de primære hensyn ved bestemmelse av dosering og administreringsmåte. Det vil typisk bli anvendt mellom én million og én billion celler, med ekspresjonsnivåer i området fra 100 til 100 000 enheter pr. 10<6>celler pr. dag. Hvis nødvendig, kan fremgangsmåten gjentas eller modifiseres til det ønskede resultat, for eksempel befrielse fra symptomene som er forbundet med Fabrys sykdom, oppnås.

Som beskrevet ovenfor, vil de anvendte celler vanligvis være pasient-spesifikke, dvs. tatt fra individet som de transfekterte primære eller sekundære celler skal administreres til, slik at de ikke skal forkastes av pasientens immunsystem. Hvis imidlertid disse forhold ikke er mulige eller ønskelige, kan celler fås fra et annet individ, genetisk modifisert som beskrevet i det foreliggende, og implanteres i pasienten som lider av a-gal A-mangel.

Anvendelse av celler fra et annet individ enn mottakeren kan fordre administrering av et immunundertrykkende middel, forandring av histokompatibilitetsantigener eller anvendelse av en barriere-innretning til forhindring av forkastelse av de implanterte celler. Barriere-innretningen vil være laget av et materiale (f.eks. en membran så som XM-50 fra Amicon, Beverly, MA) som muliggjør at det utsondrede produkt kan passere inn i mottakerens sirkulasjon eller vev, men som forhindrer kontakt mellom de implanterte celler og mottakerens immunsystem, og således forhindres en immunrespons overfor (og eventulle forkastelse av) cellene hos mottakeren. For ytterligere veiledning angående genterapi, se Seiden et al. (WO 93/09222).

Cellene kan alternativt være innleiret i en matriks eller et gelmateriale, så som beskrevet i sam-eid US-patentsøknad 08/548/002, som beskriver anvendelse av hybridmatriksimplantater, eller i Jain et al. (PCT-patentsøknad WO 95/19430), som beskriver makroinnkapsling av sekretoriske celler i et hydrofilt gelmateriale (som begge er medtatt i det foreliggende som referanse).

J. Farmasøytisk preparat for konvensjonell administrering av a- gal A- protein

a-gal A-proteinet som er eksprimert og utsondret av stabilt transfekterte (eller på annen måte genetisk modifiserte) humane celler og renset som beskrevet i det foreliggende, kan administreres til individer som danner utilstrekkelig eller mangelfullt a-gal A-protein. Proteinet kan administreres i en farmasøytisk akseptabel bærer, ved en pH på under 6,5, f.eks. i et preparat som beskrevet i eksempel III. Eksempler på eksipienser som kan innarbeides med preparatet, er buffere så som citratbuffer, fosfatbuffer, acetatbuffer og bikarbonatbuffer, amino-syrer, urea, alkoholer, askorbinsyre, fosfolipider, proteiner så som serumalbumin og gelatin, EDTA, natriumklorid, liposomer, polyvinylpyrrolidon, mannitol, sorbitol, glycerol, propylenglykol og polyetylenglykol (f.eks. PEG-4000, PEG-6000). Administreringsmåten kan for eksempel være intravenøs, intra-arteriell, subkutan, intraperitoneal, intracerebral, intramuskulær, intrapulmonær eller transmukosal. Administreringsmåten og mengden av avgitt protein vil bestemmes av faktorer som er godt innenfor fagfolks evne å bedømme. Videre er fagfolk på området klar over at administreringsmåten og doseringen av et terapeutisk protein kan varieres for en gitt pasient til det er oppnådd et terapeutisk doseringsnivå. Det vil typisk bli administrert doser av a-gal A på 0,01-100 mg pr. kg kroppsvekt. Det er ventet at regelmessig gjentatte doser av proteinet vil være nødvendig i hele pasientens liv.

K. Behandling av andre tilstander forårsaket av enzymmangler

Det er sannsynlig at andre tilstander forårsaket av mangler ved andre lysosomlagringsenzymer enn a-gal A vil påvirkes ved behandling med lignende metoder som beskrevet i det foreliggende. I disse tilfeller vil DNA som koder for a-gal A i ekspresjonskonstruksjonene beskrevet i det foreliggende, bli erstattet med DNA som koder for en funksjonell form av det mangelfulle enzym. Eksempler på enzymmangelsyndromer som er blitt identifisert, og som kan påvirkes ved behandling som beskrevet i det foreliggende, er vist i tabell 8. Informasjonen i denne tabell er tatt fra E. Neufeld (Ann. Rev. Biochem. 60:257-280, 1991).

V. Andre utførelsesformer

I det foreliggende er behandlingsmetoder hvor det anvendes celler som eksprimerer et spesielt genprodukt etter transfektering, dvs. etter innføring av en konstruksjon som koder for genproduktet og har regulerende elementer som regulerer ekspresjonen av kodingssekvensen. Disse metoder kan også utføres under anvendelse av celler som er blitt genetisk modifisert ved hjelp av andre metoder, innbefattende innsikting av gener og gen-aktivering (se Treco et al. (WO 95/31560,; se også Seiden et al. WO 93/09222).

hGH-signalpeptidet kan anvendes med andre heterologe proteiner enn

a-gal A, under øking av nivået for ekspresjon og utsondring av det heterologe protein. Eksempler på slike proteiner innbefatter a-1-antitrypsin, antitrombin III, apolipoprotein E, apolipoprotein A-1, blodkoagulasjonsfaktorer V, VII, VIII, IX, X og XIII, benvekstfaktor-2, benvekstfaktor-7, kalsitonin, katalytiske antistoffer, DNAse, erytropoietin, FSH-p, globiner, glukagon, glykocerebrosidase, G-CSF, GM-CSF, veksthormon, immunrespons-modifiserende midler, immunglobuliner, insulin, insulintropin, insulinliknende vekstfaktorer, interferon-p, interferon-p-nervevekst-faktorer, interleukin-1, interleukin-2, interleukin-3, interleukin-4, interleukin-6, interleukin-11, interleukin-12, IL-2-reseptor, IL-1-reseptor-antagonister, lavdensitets-lipoprotein-reseptor, M-CSF, paratyroid-hormon, proteinkinase C, løselig CD4, superoksid-dismutase, vevsplasminogen-aktivator, TGF-p, tumornekrosefaktor, TSHp, tyrosinhydroksylase og urokinase.

Claims

1. Fremgangsmåte for rensing av human a-gal A fra en prøve,karakterisert vedat den omfatter føring av nevnte prøve over en hydrofob interaksjonsharpiks omfattende en butylgruppe som en funksjonell del.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat prøven blir oppnådd fra en dyrket human celle eller fra kulturmediet til en dyrket human celle.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2,karakterisert vedat den dyrkede humane cellen uttrykker et DNA kodende for et polypeptid omfattende human a-gal A koblet til et heterologt signalpeptid.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 2 eller 3,karakterisert vedat den dyrkede humane cellen er fibroblast.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 2 eller 3,karakterisert vedat den dyrkede humane cellen er valgt fra gruppen bestående av en epitelcelle, en endotelcelle, en benmargscelle, en glialcell, en hepatocytt, en keratinocytt, en myocytt, et neuron eller en forløper av disse celletypene.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 2 eller 3,karakterisert vedat den dyrkede humane cellen er et medlem av en kloncellelinje valgt fra gruppen bestående av en Bowes melanomcelle, en Daudi celle, en HeLa celle, en HL-60 celle, en HT1080 celle, en Jurkat celle, en KB karsinom celle, en K-562 leukemi celle, en MCF-7 brystcancercelle, en MOLT-4 celle, en Namalwa celle, en Raji celle, en RPMI 8226 celle, en U-937 celle, en WI-38-VA13 sublinje 2R4 celle og en 2780AD ovariekarsinomcelle.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 3,karakterisert vedat signalpeptidet er hGH signalpeptidet bestående av aminosyresekvensen SEKV ID NR:21.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat den videre omfatter før føring av prøven over den hydrofobe interaksjonsharpiksen omfattende en butylgruppe som en funksjonell del, følgende trinn: tilveiebringing av en human celle som uttrykker et DNA kodende for et polypeptid omfattende human a-gal A koblet til et heterologt signalpeptid; dyrking av cellen; og oppnåelse fra cellen, eller mediet hvor cellen er dyrket, en prøve inneholdende a-gal A.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8,karakterisert veda t signalpeptidet er hGh signalpeptidet bestående av aminosyresekvensen SEKV ID NR:21.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter det hydrofobe interaksjonsharpikstrinnet som et første kromatografitrinn.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10,karakterisert vedat prøven blir oppnådd fra en dyrket human celle eller fra kulturmediumet til en dyrket human celle.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11,karakterisert veda t den dyrkede humane cellen uttrykker et DNA kodende for et polypeptid omfattende human a-gal A koblet til et heterologt signalpeptid.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 11 eller 12,karakterisert veda t den dyrkede humane cellen er en fibroblast.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 11 eller 12,karakterisert veda t den dyrkede humane cellen er valgt fra gruppen bestående av en epitelcelle, en endotelcelle, en benmargscelle, en gliacelle, en hepatocytt, en keratinocytt, en myocytt, et neuron eller en forløper av disse celletypene.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 11 eller 12,karakterisert veda t den dyrkede humane cellen er et medlem av en kloncellelinje valgt fra gruppen bestående av en Bowes melanomcelle, en Daudi celle, en HeLa celle, en HL-60 celle, en HT1080 celle, en Jurkat celle, en KB karsinomcell, en K-562 leukemicelle, en MCF-7 brystcancercelle, en MOLT-4 celle, en Namalwa celle, en Raji celle, en RPMI 8226 celle, en U-937 celle, en WI-38VA13 sublinje 2R4 celle og en 2780AD ovariekarsinomcelle.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 12,karakterisert veda t signalpeptidet er hGH signalpeptidet bestående av aminosyresekvensen SEKV ID:21.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 10,karakterisert vedat den videre omfatter føring av prøven over en immobilisert heparin harpiks.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 17,karakterisert vedat den immobiliserte heparin harpiksen omfatter heparin koblet til en kryss-bindende agarose.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 17,karakterisert vedat den videre omfatter føring av prøven over en hydroksyapatitt kolonne.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 19,karakterisert vedat hydroksyapatitt kolonnen omfatter et sfærisk, makroporøst kompleks av kalsiumfosfat.

21. Fremgangsmåte ifølge krav 19,karakterisert vedat den videre omfatter føring av prøven over en anion bytteharpiks.

22. Fremgangsmåte ifølge krav 21,karakterisert veda t anion bytteharpiksen omfatter en kvarternær ammonium sterk anion utveksler koblet til kryss-bundet agarose.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 21,karakterisert vedat den videre omfatter føring av prøven over en størrelseseksklusjonsharpiks.

24. Fremgangsmåte ifølge krav 23,karakterisert vedat størrelseseksklusjonsharpiksen omfatter en sfærisk kompositt av kryss-bundet agarose og dekstran.

25. Fremgangsmåte ifølge krav 10,karakterisert vedat den omfatter føring av prøven over en hydrofob interaksjonsharpiks og deretter over en immobiliert heparinharpiks, hydroksyhepatitt, en anion bytteharpiks eller en størrelseseksklusjonsharpiks.

26. Fremgangsmåte ifølge krav 10,karakterisert vedat den videre omfatter følgende trinn før føring av prøven over den hydrofobe interaksjonsharpiksen: tilveiebringing av en human celle som uttrykker et DNA kodende for et polypeptid omfattende human a-gal A koblet til et heterologt signalpeptid; dyrking av cellen; og oppnåelse fra cellen, eller mediet hvor cellen blir dyrket, en prøve inneholdende a-gal A.

27. Fremgangsmåte ifølge krav 26,karakterisert vedat signalpeptidet er hGH signalpeptidet bestående av aminosyresekvensen SEKV ID NR: 21.

28. Fremgangsmåte ifølge krav 10,karakterisert vedat den videre omfatter trinnet av å føre prøven over en andre harpiks valgt fra gruppen bestående av en immobilisert heparinharpiks, hydroksyapatitt, en anion bytteharpiks og en størrelseseksklusjonsharpiks.