JPH08196293A - タンパク質の製造方法 - Google Patents
タンパク質の製造方法Info
- Publication number
- JPH08196293A JPH08196293A JP7009641A JP964195A JPH08196293A JP H08196293 A JPH08196293 A JP H08196293A JP 7009641 A JP7009641 A JP 7009641A JP 964195 A JP964195 A JP 964195A JP H08196293 A JPH08196293 A JP H08196293A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cell
- vector
- virus
- cells
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 ミッドカインタンパク質（ＭＫ）の新規な製
造方法の提供。 【構成】 ＭＫ構造遺伝子に対応するｃＤＮＡを搬送す
るベクターを選択してこれに挿入し、細胞培養物に導入
してＭＫを伝搬する発現系を作成し、培養細胞から単離
・精製する。
造方法の提供。 【構成】 ＭＫ構造遺伝子に対応するｃＤＮＡを搬送す
るベクターを選択してこれに挿入し、細胞培養物に導入
してＭＫを伝搬する発現系を作成し、培養細胞から単離
・精製する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、下記特性を有するミッ
ドカインタンパク質（ＭＫ）の新規な製造方法に関す
る。さらに本発明は、生体中の臓器・血管等の各組織の
損傷・破壊に対して修復・再生を促進する治療剤、創傷
治癒剤として有用なＭＫの製造法を提供するものであ
る。
ドカインタンパク質（ＭＫ）の新規な製造方法に関す
る。さらに本発明は、生体中の臓器・血管等の各組織の
損傷・破壊に対して修復・再生を促進する治療剤、創傷
治癒剤として有用なＭＫの製造法を提供するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術】ＭＫは、本発明者の村松喬が生化学、第
６５巻、１４９４頁〜１５０４頁（１９９３年）にも総
説しているように、分子量１３，０００の塩基性アミノ
酸に富むヘパリン結合性の成長・分化因子で、類似のＨ
Ｂ−ＧＡＭ（別名プレイオトロフィン）とともに新しい
成長因子ファミリーを形成している。ＭＫはＮＩＨ３Ｔ
３細胞の増殖促進活性の他にヒトやマウスの胎児（仔）
の神経細胞に対し突起伸長および生存維持活性を示す。
ＭＫの発現はマウスの胚形成において脳および他の組織
において一過性にみられ、成長とともに腎臓に限局す
る。ヒトでは正常組織の消化管や種々の癌組織で発現
し、またアルツハイマー病老人斑における蓄積など、生
理的役割のみならず、これらの疾患の発症または進行と
も関係があると考えられている。これまでの研究から、
ＭＫは臓器・組織の損傷・破壊の修復・再生にも関与し
ていることが示されており、ＦＧＦやＨＧＦなどと同
様、多くの機能を有するタンパク質であると考えられる
が、その作用の詳細は不明である。
６５巻、１４９４頁〜１５０４頁（１９９３年）にも総
説しているように、分子量１３，０００の塩基性アミノ
酸に富むヘパリン結合性の成長・分化因子で、類似のＨ
Ｂ−ＧＡＭ（別名プレイオトロフィン）とともに新しい
成長因子ファミリーを形成している。ＭＫはＮＩＨ３Ｔ
３細胞の増殖促進活性の他にヒトやマウスの胎児（仔）
の神経細胞に対し突起伸長および生存維持活性を示す。
ＭＫの発現はマウスの胚形成において脳および他の組織
において一過性にみられ、成長とともに腎臓に限局す
る。ヒトでは正常組織の消化管や種々の癌組織で発現
し、またアルツハイマー病老人斑における蓄積など、生
理的役割のみならず、これらの疾患の発症または進行と
も関係があると考えられている。これまでの研究から、
ＭＫは臓器・組織の損傷・破壊の修復・再生にも関与し
ていることが示されており、ＦＧＦやＨＧＦなどと同
様、多くの機能を有するタンパク質であると考えられる
が、その作用の詳細は不明である。
【０００３】これらの知見を得る過程で、本発明者らは
ＭＫを量的に生産することを企てた。村松が前記総説に
も示しているように、ＭＫｃＤＮＡには多形が存在し、
ＭＫ１、ＭＫ２、ＭＫ３の３つがこれまで見出された
が、友村らはＭＫ２−ｃＤＮＡをβ−アクチンとラウス
細胞ウイルスのプロモーター・エンハンサーの支配下に
置き、Ｌ細胞に導入して、パーマネントなトランスフェ
クタントを得、培養することにより培地中にＭＫを生産
・分泌させることに成功した（Tomomura,M., Kadomats
u,K., Muramatsu,H., Muramatsu,T. et al: Biochem. B
iophys. Res. Commun., 171,603-609,(1990) ）。村松
寿子らは、トランスフェクタントＬ細胞が生産するＭＫ
をフェニルセファロースカラムクロマトグラフィーとヘ
パリンセファロースカラムクロマトグラフィーを組み合
わせて単離・精製し、該Ｌ細胞の培地１ｌあたり約２０
０μｇのＭＫを得た（Muramatsu,H. & Muramatsu,T.: B
BRC, 177,652-658,(1991) ）。
ＭＫを量的に生産することを企てた。村松が前記総説に
も示しているように、ＭＫｃＤＮＡには多形が存在し、
ＭＫ１、ＭＫ２、ＭＫ３の３つがこれまで見出された
が、友村らはＭＫ２−ｃＤＮＡをβ−アクチンとラウス
細胞ウイルスのプロモーター・エンハンサーの支配下に
置き、Ｌ細胞に導入して、パーマネントなトランスフェ
クタントを得、培養することにより培地中にＭＫを生産
・分泌させることに成功した（Tomomura,M., Kadomats
u,K., Muramatsu,H., Muramatsu,T. et al: Biochem. B
iophys. Res. Commun., 171,603-609,(1990) ）。村松
寿子らは、トランスフェクタントＬ細胞が生産するＭＫ
をフェニルセファロースカラムクロマトグラフィーとヘ
パリンセファロースカラムクロマトグラフィーを組み合
わせて単離・精製し、該Ｌ細胞の培地１ｌあたり約２０
０μｇのＭＫを得た（Muramatsu,H. & Muramatsu,T.: B
BRC, 177,652-658,(1991) ）。
【０００４】また本発明者は丸田との共同で、Ｅ．ｃｏ
ｌｉで、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳ
Ｔ）との融合タンパク質としてＭＫを製造し、融合部位
をトロンビン切断することによりＭＫを得た（Maruta,
H., Muramatsu,T., Muramatsu,H., et al: Growth Fact
ors, 8,119-134,(1993)）。
ｌｉで、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳ
Ｔ）との融合タンパク質としてＭＫを製造し、融合部位
をトロンビン切断することによりＭＫを得た（Maruta,
H., Muramatsu,T., Muramatsu,H., et al: Growth Fact
ors, 8,119-134,(1993)）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】生体中で多様な生理
的、病理的な機能を担っているＭＫの役割を明らかにす
るために、またＭＫの高次構造の解明のために、更には
ＭＫを含む治療剤を提供するためには、より収率、収量
の高いＭＫの発現・生産系を開発する必要がある。
的、病理的な機能を担っているＭＫの役割を明らかにす
るために、またＭＫの高次構造の解明のために、更には
ＭＫを含む治療剤を提供するためには、より収率、収量
の高いＭＫの発現・生産系を開発する必要がある。
【０００６】均一なタンパク質原末を安定して、大量に
得るために、前記の本発明者らのように、遺伝子組み換
え技術により、培養哺乳動物細胞などのような真核生物
細胞や大腸菌などを宿主として、遺伝子組み換え体が作
られる。しかしながら一般に前者においては、目的とす
るタンパク質（の遺伝子）によってその発現量が比較的
に低い場合がある。一方大腸菌では分子内の正しいＳ−
Ｓ結合が形成され難いことがあり、目的とするタンパク
質の収量が低いことがある。
得るために、前記の本発明者らのように、遺伝子組み換
え技術により、培養哺乳動物細胞などのような真核生物
細胞や大腸菌などを宿主として、遺伝子組み換え体が作
られる。しかしながら一般に前者においては、目的とす
るタンパク質（の遺伝子）によってその発現量が比較的
に低い場合がある。一方大腸菌では分子内の正しいＳ−
Ｓ結合が形成され難いことがあり、目的とするタンパク
質の収量が低いことがある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】この方策としては、目的
とするタンパク質の遺伝子を改変することが考えられ
る。今ひとつの方法は、遺伝子組み換え体の発現系の選
択であり、より高発現系の探索とその系の利用により生
産量を増大させることができると考えられる。
とするタンパク質の遺伝子を改変することが考えられ
る。今ひとつの方法は、遺伝子組み換え体の発現系の選
択であり、より高発現系の探索とその系の利用により生
産量を増大させることができると考えられる。
【０００８】近年、タンパク質の発現系として昆虫ウイ
ルスやファージを利用する系が検討されている。そこで
本発明者らは、昆虫発現系でのＭＫのタンパク発現を鋭
意研究した結果、前記の２つの発現系に比べて収量が多
く、あるいは同等の薬理活性を持つＭＫを生産する発現
系を構築し、ＭＫを安定して製造する方法を確立するこ
とにより本発明を完成した。
ルスやファージを利用する系が検討されている。そこで
本発明者らは、昆虫発現系でのＭＫのタンパク発現を鋭
意研究した結果、前記の２つの発現系に比べて収量が多
く、あるいは同等の薬理活性を持つＭＫを生産する発現
系を構築し、ＭＫを安定して製造する方法を確立するこ
とにより本発明を完成した。
【０００９】即ち、本発明者らはバキュロウイルス（ｂ
ａｃｕｌｏ ｖｉｒｕｓ）類、中でも核多角体病ウイル
ス、特にカイコ多角体ウイルスやＡｕｔｏｇｒａｐｈａ
ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｖｉｒｕｓ（オートグラフ
ァーカリフォルニカ多角体ウイルス）などの昆虫ウイル
スにＭＫ遺伝子を組み込んだ。トランスファーベクター
の構築、トランスファーベクターとウイルスＤＮＡの昆
虫細胞への導入、ならびに組みかえ型ウイルスの単離の
ため、まずマウスＭＫ（ＭＫ−２、前記論文のTomomur
a,M. et al: BBRC, 171,603-609,(1990) ）のコーディ
ング領域の開始メチオニンコドンの５’上流配列および
３’ＰｏｌｙＡ+ 配列をＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａ
ｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）を用いて除去した。
ＰＣＲで作成したＤＮＡ断片をＡｕｔｏｇｒａｐｈａｃ
ａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅ
ｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ（多核体病ウイルス）のポリ
ヘドリンプロモーターをもつトランスファーベクター
（ｐＶＬ１３９３）のＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩ部位に
サブクローニングした。
ａｃｕｌｏ ｖｉｒｕｓ）類、中でも核多角体病ウイル
ス、特にカイコ多角体ウイルスやＡｕｔｏｇｒａｐｈａ
ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｖｉｒｕｓ（オートグラフ
ァーカリフォルニカ多角体ウイルス）などの昆虫ウイル
スにＭＫ遺伝子を組み込んだ。トランスファーベクター
の構築、トランスファーベクターとウイルスＤＮＡの昆
虫細胞への導入、ならびに組みかえ型ウイルスの単離の
ため、まずマウスＭＫ（ＭＫ−２、前記論文のTomomur
a,M. et al: BBRC, 171,603-609,(1990) ）のコーディ
ング領域の開始メチオニンコドンの５’上流配列および
３’ＰｏｌｙＡ+ 配列をＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａ
ｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）を用いて除去した。
ＰＣＲで作成したＤＮＡ断片をＡｕｔｏｇｒａｐｈａｃ
ａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅ
ｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ（多核体病ウイルス）のポリ
ヘドリンプロモーターをもつトランスファーベクター
（ｐＶＬ１３９３）のＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩ部位に
サブクローニングした。
【００１０】このようにして作製したトランスファーベ
クター、たとえば１μｇとバキュロウイルス致死欠損変
異株ＤＮＡ（ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ）、たとえば２０ｎ
ｇをリポフェクチン法によりＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆ
ｒｕｇｉｐｅｒｄａ ｃｅｌｌｓ（Ｓｆ−２１）にトラ
ンスフェクトし、２７℃、３日間培養後の培養上清に出
現した組みかえ型ウイルスをプラーク法により単離し
た。
クター、たとえば１μｇとバキュロウイルス致死欠損変
異株ＤＮＡ（ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ）、たとえば２０ｎ
ｇをリポフェクチン法によりＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆ
ｒｕｇｉｐｅｒｄａ ｃｅｌｌｓ（Ｓｆ−２１）にトラ
ンスフェクトし、２７℃、３日間培養後の培養上清に出
現した組みかえ型ウイルスをプラーク法により単離し
た。
【００１１】ついで、ＭＫタンパク質の発現および精製
を行う。即ち組みかえ型ウイルスをＳｆ−２１またはＴ
ｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ由来のＨｉｇｈ Ｆｉｖ
ｅｃｅｌｌに感染させ、２７℃で３日間、培養した。プ
ロテアーゼ阻害剤として０．５ｍＭ ｐ−クロロメルク
リベンゼンスルホン酸を添加し、さらに１日間培養を行
った。それから培養上清を回収し、７０００ｒｐｍ、１
０分間４℃にて遠心して細胞を除去後、上清をさらに３
５０００ｒｐｍ３０分４℃にて超遠心し、ウイルスを除
いた。
を行う。即ち組みかえ型ウイルスをＳｆ−２１またはＴ
ｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ由来のＨｉｇｈ Ｆｉｖ
ｅｃｅｌｌに感染させ、２７℃で３日間、培養した。プ
ロテアーゼ阻害剤として０．５ｍＭ ｐ−クロロメルク
リベンゼンスルホン酸を添加し、さらに１日間培養を行
った。それから培養上清を回収し、７０００ｒｐｍ、１
０分間４℃にて遠心して細胞を除去後、上清をさらに３
５０００ｒｐｍ３０分４℃にて超遠心し、ウイルスを除
いた。
【００１２】それから、得られた超遠心上清（５００ｍ
ｌ〜１ｌ）を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（以下Ｐ
Ｂ）ｐＨ６．８、０．２Ｍ ＮａＣｌで平衡化したヘパ
リンセファロースカラムにかけ、段階溶出法により分画
した。
ｌ〜１ｌ）を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（以下Ｐ
Ｂ）ｐＨ６．８、０．２Ｍ ＮａＣｌで平衡化したヘパ
リンセファロースカラムにかけ、段階溶出法により分画
した。
【００１３】段階溶出条件はたとえば、カラムはＨｉ−
Ｔｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ（１ｍｌ）を用い、たとえば
流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎで、緩衝液として５０ｍＭＰ
Ｂ ｐＨ６．８＋０．２ＭＮａＣｌ ４０ｍｌ、同ＰＢ
＋０．５ＭＮａｃｌ ４０ｍｌ、同ＰＢ ＋０．７Ｍ
Ｎａｃｌ ４０ｍｌ、同ＰＢ ＋１ ＭＮａｃｌ ２
０ｍｌ、同ＰＢ ＋２ ＭＮａｃｌ ２０ｍｌを順次
用いて溶出し、１ｍｌずつ分画した。
Ｔｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ（１ｍｌ）を用い、たとえば
流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎで、緩衝液として５０ｍＭＰ
Ｂ ｐＨ６．８＋０．２ＭＮａＣｌ ４０ｍｌ、同ＰＢ
＋０．５ＭＮａｃｌ ４０ｍｌ、同ＰＢ ＋０．７Ｍ
Ｎａｃｌ ４０ｍｌ、同ＰＢ ＋１ ＭＮａｃｌ ２
０ｍｌ、同ＰＢ ＋２ ＭＮａｃｌ ２０ｍｌを順次
用いて溶出し、１ｍｌずつ分画した。
【００１４】上記のヘパリンセファロースカラムクロマ
トグラフィーにより、ＭＫは１ＭＮａＣｌを含む画分
に、均一標品として溶出された。
トグラフィーにより、ＭＫは１ＭＮａＣｌを含む画分
に、均一標品として溶出された。
【００１５】このようにして得られたＭＫ標品を逆相Ｈ
ＰＬＣにより脱塩精製し、アミノ酸配列自動分析装置
（ＡＢＩ４７３Ａ）を用い、ＰＴＨアミノ酸を同定した
ところ、既に本発明者らが報告したＭＫと同一のアミノ
酸配列であることが明らかとなった。
ＰＬＣにより脱塩精製し、アミノ酸配列自動分析装置
（ＡＢＩ４７３Ａ）を用い、ＰＴＨアミノ酸を同定した
ところ、既に本発明者らが報告したＭＫと同一のアミノ
酸配列であることが明らかとなった。
【００１６】上記の製造方法により取得できたＭＫの生
物活性を、神経細胞の突起伸長および生存維持活性を測
定することにより検定した。即ち培養用プラスチックシ
ャーレに精製したＭＫ（１０μｇ／ｍｌ）またはコント
ロールとしてポリＬ−リジン（１０μｇ／ｍｌ）を加
え、室温で２時間コーティングした。一方胎生１７日目
のラット大脳皮質を０．２５％トリプシン、０．０１％
ＤＮａｓｅＩで３７℃、３０ｍｉｎ間消化し、細胞分散
液を調製した後、０．１％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地
（５ｍｇ／ｍｌ Ｄ−グルコース、１０μｇ／ｍｌ イ
ンスリン、１０μｇ／ｍｌ トランスフェリン、３０ｐ
Ｍ 亜セレン酸ナトリウムを含む）中で、上記シャーレ
に播種した（０．４−０．５×１０6 ｃｅｌｌｓ／３５
ｍｍシャーレ）。
物活性を、神経細胞の突起伸長および生存維持活性を測
定することにより検定した。即ち培養用プラスチックシ
ャーレに精製したＭＫ（１０μｇ／ｍｌ）またはコント
ロールとしてポリＬ−リジン（１０μｇ／ｍｌ）を加
え、室温で２時間コーティングした。一方胎生１７日目
のラット大脳皮質を０．２５％トリプシン、０．０１％
ＤＮａｓｅＩで３７℃、３０ｍｉｎ間消化し、細胞分散
液を調製した後、０．１％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地
（５ｍｇ／ｍｌ Ｄ−グルコース、１０μｇ／ｍｌ イ
ンスリン、１０μｇ／ｍｌ トランスフェリン、３０ｐ
Ｍ 亜セレン酸ナトリウムを含む）中で、上記シャーレ
に播種した（０．４−０．５×１０6 ｃｅｌｌｓ／３５
ｍｍシャーレ）。
【００１７】結果は本製造方法により得たＭＫは、既に
本発明者らがトランスフェクタントＬ細胞で生産したＭ
Ｋと同等の活性を有することが明らかとなった。大腸菌
を用いて遺伝子工学的に製造したＭＫが、場合によって
上記と神経栄養活性を持っていたり、持たなかったりす
る不安定な製法であることと比べて、本製造方法による
ＭＫの生産方法はすぐれたものと考えられる。またトラ
ンスフェクタントＬ細胞での製造方法に比べ、格段に収
率も向上しており、ＭＫ原末を大量に必要とする下記の
研究および医薬、診断薬の原料として供給でき、本製造
方法は価値あるものと考えられる。
本発明者らがトランスフェクタントＬ細胞で生産したＭ
Ｋと同等の活性を有することが明らかとなった。大腸菌
を用いて遺伝子工学的に製造したＭＫが、場合によって
上記と神経栄養活性を持っていたり、持たなかったりす
る不安定な製法であることと比べて、本製造方法による
ＭＫの生産方法はすぐれたものと考えられる。またトラ
ンスフェクタントＬ細胞での製造方法に比べ、格段に収
率も向上しており、ＭＫ原末を大量に必要とする下記の
研究および医薬、診断薬の原料として供給でき、本製造
方法は価値あるものと考えられる。
【００１８】
【発明の効果】本発明により、ＭＫを大量発現し、原末
として量的に提供することが可能となり臓器・組織の損
傷・破壊の修復・再生促進剤、創傷治癒剤等の医薬活性
物質として使用が可能となる。また下記のような研究の
実施にＭＫを提供することにより、細胞生物学的な研究
成果を加速的に手にすることができよう。
として量的に提供することが可能となり臓器・組織の損
傷・破壊の修復・再生促進剤、創傷治癒剤等の医薬活性
物質として使用が可能となる。また下記のような研究の
実施にＭＫを提供することにより、細胞生物学的な研究
成果を加速的に手にすることができよう。
【００１９】即ち、 １．抗体作製による組織化学的検索。 ２．個体の形態形成におけるＭＫの役割の探索。 ３．神経栄養因子としての役割の探索。 ４．がん細胞の増殖における役割の探索。 ５．ＭＫ受容体およびジグナル伝達機構の解明。 ６．阻害剤の開発。等々の如く、ＭＫは発生生物学、神
経生物学、がん研究など基礎および臨床医学的研究に広
範に利用されうると考えられる。特にＷｉｌｍｓ腫瘍や
消化器がんでの機能やアルツハイマー老人斑における蓄
積の意味が解明されれば、これらの病態の改善または治
療薬の開発にも役立つものと期待される。
経生物学、がん研究など基礎および臨床医学的研究に広
範に利用されうると考えられる。特にＷｉｌｍｓ腫瘍や
消化器がんでの機能やアルツハイマー老人斑における蓄
積の意味が解明されれば、これらの病態の改善または治
療薬の開発にも役立つものと期待される。
【００２０】
【実施例】以下に、本発明をより詳細に実施例、実験例
をもって説明するが、本発明はこれに限定されるもので
はない。 ［実施例１］トランスファーベクターの構築 マウスＭＫ（ＭＫ−２，前記論文のＴｏｍｏｍｕｒａ，
Ｍ．ｅｔ ａｌ：ＢＢＲＣ，１７１，６０３−６０９
（１９９０））のコーディング領域の開始メチオニンコ
ドンの５´上流配列および３´ｐｏｌｙＡ+ 配列をポリ
メラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）法を用いて除
去した。ＰＣＲで作製したＤＮＴ断片をＡｕｔｏｇｒａ
ｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐ
ｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ（多核体病ウイル
ス）のポリヘドリンプロモーターを持つトランスファー
ベクター（ＰＶＬ１３９３）のＢａｍＨＩおよびＰｓｔ
Ｉ部位にサブクローニングした。図１に操作を示す。 ［実施例２］トランスファーベクターとＢａｃｕｌｏ
Ｇｏｌｄ ＤＮＡのｓｆ−２１細胞へのコトランスフェ
クション 実施例１で作製したトランスファーベクター１μｇとバ
キュロウイルス致死欠損変異株ＤＮＡ（Ｂａｃｕｌｏ
Ｇｏｌｄ ＤＮＡ）２０ｎｇをリポフェクチン法によ
り、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ｃ
ｅｌｌｓ（ｓｆ−２１）にトランスフェクトした。
をもって説明するが、本発明はこれに限定されるもので
はない。 ［実施例１］トランスファーベクターの構築 マウスＭＫ（ＭＫ−２，前記論文のＴｏｍｏｍｕｒａ，
Ｍ．ｅｔ ａｌ：ＢＢＲＣ，１７１，６０３−６０９
（１９９０））のコーディング領域の開始メチオニンコ
ドンの５´上流配列および３´ｐｏｌｙＡ+ 配列をポリ
メラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）法を用いて除
去した。ＰＣＲで作製したＤＮＴ断片をＡｕｔｏｇｒａ
ｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐ
ｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ（多核体病ウイル
ス）のポリヘドリンプロモーターを持つトランスファー
ベクター（ＰＶＬ１３９３）のＢａｍＨＩおよびＰｓｔ
Ｉ部位にサブクローニングした。図１に操作を示す。 ［実施例２］トランスファーベクターとＢａｃｕｌｏ
Ｇｏｌｄ ＤＮＡのｓｆ−２１細胞へのコトランスフェ
クション 実施例１で作製したトランスファーベクター１μｇとバ
キュロウイルス致死欠損変異株ＤＮＡ（Ｂａｃｕｌｏ
Ｇｏｌｄ ＤＮＡ）２０ｎｇをリポフェクチン法によ
り、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ｃ
ｅｌｌｓ（ｓｆ−２１）にトランスフェクトした。
【００２１】即ち３５ｍｍの培養ディシュあたり１×１
０6 個の細胞を１０％ＦＣＳを含むＴＭＮ−ＦＨに浮遊
させた。１時間静置し、細胞を付着させた。培養液を除
き、血清抜き培養液（Ｅｘ Ｃｅｌｌ ４００）２ｍｌ
で３回洗浄した。ついで、次の組成のＤＮＡ溶液を１６
μｌ、細胞に滴下した後、２７℃で３日間培養した。Ｄ
ＮＡ溶液は、トランスファーベクターＰＶＬ１３９３
（１μｇ／μｌ）１μｌとＢａｃｕｌｏ Ｇｏｌｄ（Ｐ
ｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製、２０ｎｇ／μｌ）１μｌと水
６μｌを含む計８μｌのチューブＡ、およびリポフェク
チン溶液（ＢＲＬ社製）４μｌと水４μｌを含む計８μ
ｌのチューブＢとを混ぜ合わせ、室温で１５分静置した
ものを用いた。 ［実施例３］組み換え型ウイルスのプラーク法による単
離 ３５ｍｍディシュ中に０．７×１０6 個浮遊させたｓｆ
−２１細胞に、１００μｌの希釈培養液（×１，×１
０，×１００倍）を加え室温で３０分静置し組み換え型
ウイルスを感染させ、ついで培地を除き、１％アガロー
ス（３７℃）を静かに２ｍｌ加え、室温で１時間静置し
固まらせ、更に１ｍｌの培地を加えた後、２７℃で３〜
４日間置いた。
０6 個の細胞を１０％ＦＣＳを含むＴＭＮ−ＦＨに浮遊
させた。１時間静置し、細胞を付着させた。培養液を除
き、血清抜き培養液（Ｅｘ Ｃｅｌｌ ４００）２ｍｌ
で３回洗浄した。ついで、次の組成のＤＮＡ溶液を１６
μｌ、細胞に滴下した後、２７℃で３日間培養した。Ｄ
ＮＡ溶液は、トランスファーベクターＰＶＬ１３９３
（１μｇ／μｌ）１μｌとＢａｃｕｌｏ Ｇｏｌｄ（Ｐ
ｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製、２０ｎｇ／μｌ）１μｌと水
６μｌを含む計８μｌのチューブＡ、およびリポフェク
チン溶液（ＢＲＬ社製）４μｌと水４μｌを含む計８μ
ｌのチューブＢとを混ぜ合わせ、室温で１５分静置した
ものを用いた。 ［実施例３］組み換え型ウイルスのプラーク法による単
離 ３５ｍｍディシュ中に０．７×１０6 個浮遊させたｓｆ
−２１細胞に、１００μｌの希釈培養液（×１，×１
０，×１００倍）を加え室温で３０分静置し組み換え型
ウイルスを感染させ、ついで培地を除き、１％アガロー
ス（３７℃）を静かに２ｍｌ加え、室温で１時間静置し
固まらせ、更に１ｍｌの培地を加えた後、２７℃で３〜
４日間置いた。
【００２２】ついでＸ−Ｇａｌ（２ｍｇ／ｍｌ）溶液、
０．１％ニュートラルレッド溶液それぞれ１００μｌを
添加し、２７℃で一夜放置後プラークをピックアップし
た。 ［実施例４］ウイルス溶液の第１増殖・増幅 ｓｆ−２１細胞を３５ｍｍの培養ディシュあたり０．８
×１０6 個、１０％ＦＣＳを含むＴＭＮ−ＦＨ２ｍｌに
浮遊させた。１時間室温で放置した後、シングルプラー
クからウイルス溶液を１００μｌとり加え、室温で３０
分間感染のため静置した。ついで培地を換え、２７℃で
３〜４日間培養した。 ［実施例５］ウイルス溶液の第２増殖・増幅 ｓｆ−２１細胞を３５ｍｍの溶媒ディシュあたり１×１
０6 個、１０％ＦＣＳを含むＴＭＮ−ＦＨ２ｍｌに浮遊
させた。１時間室温で放置した後、ウイルス第１増殖・
増幅培養上清を１００μｌとり加え、室温で３０分間感
染のため静置した。ついで培地を換え、２７℃で３〜４
日間培養した。 ［実施例６］ウイルス溶液の第３増殖・増幅 ｓｆ−２１細胞を２５ｃｍ2 のフラスコあたり１．２×
１０6 個、１０％ＦＣＳを含むＴＭＮ−ＦＨ７ｍｌに浮
遊させた。これと同様のフラスコを７個同時に、室温で
１時間放置した後、ウイルス第２増殖・増幅培養上清を
１００μｌとり加え、室温で３０分間感染のため静置し
た。ついで培地を換え、２７℃で５〜６日間培養した。
ウイルスを含む培養液７０ｍｌを集め、小分けして−８
０℃で保存した。 ［実施例７］ＭＫの発現・分画 Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞を２２５ｃｍ2 のフラスコあた
り、１．８×１０7 個、Ｅｘ Ｃｅｌｌ ４００ ４５
ｍｌに浮遊させた。これと同様のフラスコを１２個同時
に、室温で１時間放置した後、ウイルス第３増殖・増幅
培養上清を１８０μｌとり加え、２７℃で３日間培養し
た。ついで２５ｍＭ ｐ−クロロマーキュリーベンゼン
スルホン酸６００μｌ（最終濃度０．５ｍＭ）を加え、
２７℃で１日培養した。培養液を集め、４℃で１０分
間、５，０００ｇ（７０００ｒｐｍ）で超遠心分離し、
上清をとり、更に４℃で３５分間、３５，０００ｒｐｍ
で遠心分離し、ウイルス粒子を除いた。上清約５００ｍ
ｌをとり、ヘパリンセファロースを充てんしたＨｉ Ｔ
ｒａｐカラムにアプライした。この担体は前もって０．
２Ｍ食塩を含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で平衡
化しておく。ついで同じ緩衝液でカラムも洗い、順次、
０．５Ｍ，０．７Ｍ，１．０Ｍそして２．０ＭＮａＣｌ
を含む緩衝液で、濃度段階勾配クロマトグラフィーを行
い、ＭＫを溶出した。
０．１％ニュートラルレッド溶液それぞれ１００μｌを
添加し、２７℃で一夜放置後プラークをピックアップし
た。 ［実施例４］ウイルス溶液の第１増殖・増幅 ｓｆ−２１細胞を３５ｍｍの培養ディシュあたり０．８
×１０6 個、１０％ＦＣＳを含むＴＭＮ−ＦＨ２ｍｌに
浮遊させた。１時間室温で放置した後、シングルプラー
クからウイルス溶液を１００μｌとり加え、室温で３０
分間感染のため静置した。ついで培地を換え、２７℃で
３〜４日間培養した。 ［実施例５］ウイルス溶液の第２増殖・増幅 ｓｆ−２１細胞を３５ｍｍの溶媒ディシュあたり１×１
０6 個、１０％ＦＣＳを含むＴＭＮ−ＦＨ２ｍｌに浮遊
させた。１時間室温で放置した後、ウイルス第１増殖・
増幅培養上清を１００μｌとり加え、室温で３０分間感
染のため静置した。ついで培地を換え、２７℃で３〜４
日間培養した。 ［実施例６］ウイルス溶液の第３増殖・増幅 ｓｆ−２１細胞を２５ｃｍ2 のフラスコあたり１．２×
１０6 個、１０％ＦＣＳを含むＴＭＮ−ＦＨ７ｍｌに浮
遊させた。これと同様のフラスコを７個同時に、室温で
１時間放置した後、ウイルス第２増殖・増幅培養上清を
１００μｌとり加え、室温で３０分間感染のため静置し
た。ついで培地を換え、２７℃で５〜６日間培養した。
ウイルスを含む培養液７０ｍｌを集め、小分けして−８
０℃で保存した。 ［実施例７］ＭＫの発現・分画 Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞を２２５ｃｍ2 のフラスコあた
り、１．８×１０7 個、Ｅｘ Ｃｅｌｌ ４００ ４５
ｍｌに浮遊させた。これと同様のフラスコを１２個同時
に、室温で１時間放置した後、ウイルス第３増殖・増幅
培養上清を１８０μｌとり加え、２７℃で３日間培養し
た。ついで２５ｍＭ ｐ−クロロマーキュリーベンゼン
スルホン酸６００μｌ（最終濃度０．５ｍＭ）を加え、
２７℃で１日培養した。培養液を集め、４℃で１０分
間、５，０００ｇ（７０００ｒｐｍ）で超遠心分離し、
上清をとり、更に４℃で３５分間、３５，０００ｒｐｍ
で遠心分離し、ウイルス粒子を除いた。上清約５００ｍ
ｌをとり、ヘパリンセファロースを充てんしたＨｉ Ｔ
ｒａｐカラムにアプライした。この担体は前もって０．
２Ｍ食塩を含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で平衡
化しておく。ついで同じ緩衝液でカラムも洗い、順次、
０．５Ｍ，０．７Ｍ，１．０Ｍそして２．０ＭＮａＣｌ
を含む緩衝液で、濃度段階勾配クロマトグラフィーを行
い、ＭＫを溶出した。
【００２３】各分画の２８０ｎｍの紫外吸収を測定し、
ＭＫの溶出分画を調べたところ、１．０Ｍ ＮａＣｌで
溶出したフラクションにＭＫが溶出した。ＭＫの収量は
５００ｍｌの培養液あたり１．０ｍｇであり、２ｍｇ／
ｌであった。図２に結果を示す。 ［実施例８］精製ＭＫの分子量の測定・同定 ｈｉｇｈ ｆｉｖｅ細胞培養上清および精製ＭＫのＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を行
った。結果を図３に示す。精製ＭＫは銀染色像およびウ
ェスタンブロットで分子量約１７，０００の単一バンド
を示した。予測より高分子量側に泳動されるのは塩基性
タンパク質の多数の陽イオン電荷によるものと考えられ
る。 ［実施例９］精製ＭＫのアミノ酸配列の決定 精製タンパク質をＲＰ−ＨＰＬＣで脱塩した。ＭＫは
０．１％ＴＦＡ中アセトニトリルの直線濃度勾配により
溶出した。適当量（１．２ｎｍｏｌ）をガス−フェーズ
タンパクシークエンサー（ＡＢＩ４７３Ａ）に充てんし
て、アミノ酸配列を決定した。図４にＭＫのＮ末端近傍
のアミノ酸配列を示す。既に本発明者らが報告したアミ
ノ酸配列と同一のものであることがわかった。 ［実験例］神経細胞の突起伸長および生存維持活性の測
定 神経系細胞を培養するためのプラスチックシャーレに精
製したＭＫ（１０μｇ／ｍｌ）またはコントロールとし
てポリ−Ｌ−リジン（１０μｇ／ｍｌ）を加え、室温で
２時間コーティングした。ついで下記のように調製した
大脳皮質細胞を３５ｍｍシャーレあたり０．４〜０．５
×１０6 個播種した。即ち胎生１７日目のラット大脳皮
質をとり０．２５％トリプシン、０．０１％Ｄ Ｎａｓ
ｅＩで３７℃、３０分間消化し、０．１％ＦＣＳを含む
ＤＭＥＭ培養液（５ｍｇ／ｍｌＤ−グルコース、１０μ
ｇ／ｍｌインスリン、１０μｇ／ｍｌトランスフェリ
ン、３０ｐＭ亜セレン酸ナトリウムを含む）中，細胞分
散浮遊液を調製し、シャーレにまいた。そして、３７℃
で５％ＣＯ2 インキュベーター内で、この大脳皮質神経
細胞を６日間培養し、ＭＫの神経突起の進展活性と細胞
生存維持活性を調べたところ、ポリ−Ｌ−リジン同等以
上の効果を持つことが明らかにされた。
ＭＫの溶出分画を調べたところ、１．０Ｍ ＮａＣｌで
溶出したフラクションにＭＫが溶出した。ＭＫの収量は
５００ｍｌの培養液あたり１．０ｍｇであり、２ｍｇ／
ｌであった。図２に結果を示す。 ［実施例８］精製ＭＫの分子量の測定・同定 ｈｉｇｈ ｆｉｖｅ細胞培養上清および精製ＭＫのＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を行
った。結果を図３に示す。精製ＭＫは銀染色像およびウ
ェスタンブロットで分子量約１７，０００の単一バンド
を示した。予測より高分子量側に泳動されるのは塩基性
タンパク質の多数の陽イオン電荷によるものと考えられ
る。 ［実施例９］精製ＭＫのアミノ酸配列の決定 精製タンパク質をＲＰ−ＨＰＬＣで脱塩した。ＭＫは
０．１％ＴＦＡ中アセトニトリルの直線濃度勾配により
溶出した。適当量（１．２ｎｍｏｌ）をガス−フェーズ
タンパクシークエンサー（ＡＢＩ４７３Ａ）に充てんし
て、アミノ酸配列を決定した。図４にＭＫのＮ末端近傍
のアミノ酸配列を示す。既に本発明者らが報告したアミ
ノ酸配列と同一のものであることがわかった。 ［実験例］神経細胞の突起伸長および生存維持活性の測
定 神経系細胞を培養するためのプラスチックシャーレに精
製したＭＫ（１０μｇ／ｍｌ）またはコントロールとし
てポリ−Ｌ−リジン（１０μｇ／ｍｌ）を加え、室温で
２時間コーティングした。ついで下記のように調製した
大脳皮質細胞を３５ｍｍシャーレあたり０．４〜０．５
×１０6 個播種した。即ち胎生１７日目のラット大脳皮
質をとり０．２５％トリプシン、０．０１％Ｄ Ｎａｓ
ｅＩで３７℃、３０分間消化し、０．１％ＦＣＳを含む
ＤＭＥＭ培養液（５ｍｇ／ｍｌＤ−グルコース、１０μ
ｇ／ｍｌインスリン、１０μｇ／ｍｌトランスフェリ
ン、３０ｐＭ亜セレン酸ナトリウムを含む）中，細胞分
散浮遊液を調製し、シャーレにまいた。そして、３７℃
で５％ＣＯ2 インキュベーター内で、この大脳皮質神経
細胞を６日間培養し、ＭＫの神経突起の進展活性と細胞
生存維持活性を調べたところ、ポリ−Ｌ−リジン同等以
上の効果を持つことが明らかにされた。
【図１】ＭＫのｂａｃｕｌｏ ｖｉｒｕｓベクター発現
系の構築と、レコンビナントウイルスのｈｉｇｈ ｆｉ
ｖｅ細胞への感染、そして感染細胞の培養によりＭＫを
生産する流れを示す図である。
系の構築と、レコンビナントウイルスのｈｉｇｈ ｆｉ
ｖｅ細胞への感染、そして感染細胞の培養によりＭＫを
生産する流れを示す図である。
【図２】ＭＫを含む抽出液をヘパリン−セファロースカ
ラムにのせ、各濃度のＮａＣｌを含む緩衝液で段階ごと
に溶出させ、クロマトグラフィーを行い、１．０ＭのＮ
ａＣｌ濃度の緩衝液でＭＫが溶出されることを示す図で
ある。破線はＮａＣｌ濃度を示す。
ラムにのせ、各濃度のＮａＣｌを含む緩衝液で段階ごと
に溶出させ、クロマトグラフィーを行い、１．０ＭのＮ
ａＣｌ濃度の緩衝液でＭＫが溶出されることを示す図で
ある。破線はＮａＣｌ濃度を示す。
【図３】ｈｉｇｈ ｆｉｖｅ細胞培養上清および精製Ｍ
Ｋの、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の銀染色像およびウェス
タンブロットを示す図である。
Ｋの、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の銀染色像およびウェス
タンブロットを示す図である。
【図４】精製ＭＫのＮ末端近傍のアミノ酸配列を示す図
である。予測されたアミノ酸配列位置でシグナルペプチ
ドが切断されたことがわかる。
である。予測されたアミノ酸配列位置でシグナルペプチ
ドが切断されたことがわかる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＳ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 村松 喬 愛知県名古屋市天白区天白町大字島田字黒 石3785−3391 シティコーポしまだＢ− 205 (72)発明者 粟屋 昭 神奈川県横浜市戸塚区矢部町4978
Claims (10)
- 【請求項１】 遺伝子産生ミッドカインタンパク質（以
下ＭＫ）を製造する方法において、ＭＫ遺伝子に対応す
るヌクレオチド配列をもつｃＤＮＡを搬送するベクター
を選択し、該ＤＮＡを該ベクターに挿入し、該ベクター
を細胞培養物に導入して、ＭＫを伝搬する発現系を作成
し、該細胞を培養させ、該細胞からＭＫを担体を用い分
画し、ついでＭＫを単離・精製することからなることを
特徴とするＭＫの製造方法。 - 【請求項２】 該ベクターがウイルスである請求項１に
記載の方法。 - 【請求項３】 該ウイルスがバキュロウイルスである請
求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 該ウイルスがＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃ
ａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルスである請求項
１に記載の方法。 - 【請求項５】 該ウイルスがポリヘドリン遺伝子プロモ
ーター特性を持つ請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 該ｃＤＮＡがポリヘドリン遺伝子のプロ
モーターをもち、そして該クローン化ｃＤＮＡを該プロ
モーターの下流に挿入する請求項１に記載の方法。 - 【請求項７】 該細胞培養物の細胞が昆虫細胞である請
求項１に記載の方法。 - 【請求項８】 該細胞がＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕ
ｇｉｐｅｒｄａ細胞である請求項１に記載の方法。 - 【請求項９】 該細胞がＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎ
ｉ Ｈｉｇｈ ｆｉｖｅ細胞である請求項１に記載の方
法。 - 【請求項１０】 遺伝子産生ＭＫを発現するタンパク質
発現系において、搬送用ベクターと細胞培養物からなる
タンパク質発現系。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7009641A JPH08196293A (ja) | 1995-01-25 | 1995-01-25 | タンパク質の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7009641A JPH08196293A (ja) | 1995-01-25 | 1995-01-25 | タンパク質の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08196293A true JPH08196293A (ja) | 1996-08-06 |
Family
ID=11725856
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7009641A Pending JPH08196293A (ja) | 1995-01-25 | 1995-01-25 | タンパク質の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08196293A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015044830A (ja) * | 1996-09-13 | 2015-03-12 | シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド | α−ガラクトシダーゼＡ欠損症の治療 |
-
1995
- 1995-01-25 JP JP7009641A patent/JPH08196293A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015044830A (ja) * | 1996-09-13 | 2015-03-12 | シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド | α−ガラクトシダーゼＡ欠損症の治療 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2085134C (en) | Gdf-1 | |
| KR100393508B1 (ko) | 인간 인터루킨 4의 안타고니스트 또는 부분적 아고니스트로서의 신규hIL-4 변이단백질 | |
| JPH11513883A (ja) | ヒト血管内皮増殖因子２ | |
| JPH02104284A (ja) | エリトロポエチンを発現するヒトｃＤＮＡまたはヒトｇＤＮＡのクローニング方法 | |
| JPH07500968A (ja) | 組み換え型骨形態形成蛋白ヘテロダイマー、組成物および使用法 | |
| JP2001509029A (ja) | ヒトタンパク質 | |
| CS91791A3 (en) | Epithelium or epithelium precursors | |
| JPH04505607A (ja) | 骨誘導タンパク | |
| WO1994001557A1 (en) | Bone formation-inducing protein | |
| JP2732556B2 (ja) | 生物学的に活性なｈＮＧＦ | |
| US5316933A (en) | Recombinant natural killer cell activator | |
| PT92603B (pt) | Processo de producao de factor de crescimento transformante, quimerico,beta | |
| JPH11506917A (ja) | 線維芽細胞増殖因子１１ | |
| JP2000504206A (ja) | 新規形態のアンフィレグリン、その製造方法および使用方法、ならびにそれを含む組成物 | |
| WO1998022505A1 (fr) | Polypeptides solubles | |
| US20030215792A1 (en) | Nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence coding for a chemokine, a neuropeptide precursor, or at least on neuropeptide | |
| JPH08196293A (ja) | タンパク質の製造方法 | |
| JPH11507504A (ja) | 線維芽細胞増殖因子１３ | |
| JP3072628B2 (ja) | ヒト肝実質細胞増殖因子をコードする染色体ｄｎａ | |
| JPH11506919A (ja) | 繊維芽細胞増殖因子１５ | |
| US5270303A (en) | Chondromodulin-II protein | |
| JP2001517064A (ja) | トランスフォーミング増殖因子アルファｈｉ | |
| JPH11507502A (ja) | ヒトクリプチン増殖因子 | |
| JP3292873B2 (ja) | 組換肝実質細胞増殖因子 | |
| JP3318323B2 (ja) | 組換肝実質細胞増殖因子 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040331 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20040804 |