JP2732556B2

JP2732556B2 - 生物学的に活性なｈＮＧＦ

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Publication number: JP2732556B2
Application number: JP6172189A
Authority: JP
Inventors: ダブリュ．チャンハーディ; ダブリュ．バーネットジム; エイ．ベッカープレストン; バースズティン − ペッテグリューヘラ; ティー．ヌグイエンビン; ウオードキャロル
Original assignee: Syntex USA LLC
Current assignee: Syntex USA LLC
Priority date: 1988-11-22
Filing date: 1994-07-25
Publication date: 1998-03-30
Anticipated expiration: 2013-03-30
Also published as: NZ230096A; AU629840B2; ZA895661B; US5272063A; ATE167701T1; JPH02291270A; ES2118057T3; IE892425L; EP0370171B1; KR900008039A; AU3900989A; EP0370171A3; EP0859056A3; JPH09235299A; EP0859056A2; IE81110B1; JPH07247300A; JP2515399B2; KR100225052B1; DK175764B1

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、バクロウイルス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）
発現系を使用することによるヒト神経成長因子（ｈＮＧ
Ｆ）の発現のための組替えＤＮＡ分子の構築に関する。
ｈＮＧＦの製造は、スポドプテラ・フルジペルダ（Ｓ．
ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）宿主細胞内において該蛋白質の
発現のためのバクロウイルス系を用いて成功した。該組
替えｈＮＧＦは、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅ
ｒ’ｓＤｉｓｅａｓｅ）の治療において有用である。

【０００２】発明の背景哺乳類ＮＧＦ（マウスＮＧＦ）の１次構造は、Ａｎｇｅ
ｌｅｔｉおよびＢｒａｄｓｈａｗらのＰｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ６８：２４１７（１９７
１）により最初に明らかにされた。その前駆体、プレー
プローＮＧＦの１次構造は、マウスＮＧＦｃＤＮＡの
ヌクレオチド配列から推定されている（Ｓｃｏｔｔらの
Ｎａｔｕｒｅ３０２：５３８（１９８３）；Ｕｌｌｒ
ｉｃｈらのＮａｔｕｒｅ３０３：８２１（１９８
３））。

【０００３】高度に相同的なヒトＮＧＦ（ｈＮＧＦ）遺
伝子もまた同定されている（ＵｌｌｒｉｃｈのＳｙｍ
ｐ．ｏｎＱｕａｎ．Ｂｉｏｌ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇＨａｒｂｏｒ４８：４３５（１９８３））。その
マウスＮＧＦに対する相同性は、アミノ酸およびヌクレ
オチド配列の段階の各々において、９０％および８７％
である。ｈＮＧＦの希少さ故に、その生物学的活性につ
いては、ほとんど知られていない。

【０００４】バクロウイルス発現ベクターは、インビボ
またはインビトロのいずれかにおける昆虫細胞内での種
々の外来遺伝子の発現に用いられてきた（米国特許第
４，７４５，０５１号、１９８８年５月１７日発行参
照）。これらの発現ベクターは、高度に効率的であり、
かつ一時的に制御されるオートグラファ・カリフォルニ
カ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）
核ポリヘドロシス・ウイルス（ＡｃＮＰＶ）ポリヘドリ
ンプロモータにより、該プロモータの下流側に挿入され
た興味ある遺伝子を伴って協力を受けている。対応する
遺伝子産物は、該組換えバクロウイルスに感染されたス
ポドプテラ・フルジペルダから得られる。

【０００５】ｈＮＧＦのβ−サブユニットの単離および
Ｅ．ｃｏｌｉ中における異種蛋白質としての発現は、ヨ
ーロッパ特許出願第０，１２１，３３８号に記載されて
いる。組換え技術の使用により、ヒトβ−ＮＧＦは、他
の哺乳類蛋白質を本質的に含むことなく発現された。改
造されたアミノ末端を有する２種の遺伝子を用いて融合
蛋白質の発現をもたらすＥ．ｃｏｌｉ中でのｈＮＧＦの
発現は、ＩｗａｉらのＣｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌ
ｌ．３４：４７２４（１９８６）により記載されてい
る。

【０００６】ウイルス感染昆虫細胞中におけるポリペプ
チド製造のための組換え技術の使用は、ヨーロッパ特許
出願第０，２２８，０３６号に記載されている。バクロ
ウイルス発現系を用いた蛋白質、Ｂ型肝炎表面抗原の製
造方法は、公知である。遺伝子的に異なり、その一つが
関連する異種遺伝子を含む、少なくとも２種類のバクロ
ウイルス類に由来するヌクレオカプシド類の混合物を含
有する混合多面包接体（ＰＩＢ）の使用は、特許協力条
約出願ＷＯ８８／０２０３０に記載されている。記載
された共感染技術を用いて、異種蛋白質が発現される。

【０００７】これらの大きい哺乳類蛋白質の発現が可能
であるにもかかわらず、本発明まではバクロウイルス発
現系を用いたｈＮＧＦ等の小さい分子の発現の成功につ
いての情報は、ほとんど無い。この特定の発現系が、生
物学的活性を示す為の蛋白質前駆体の翻訳後蛋白質分解
を必要とする小さい蛋白質の産生に適しているか否かに
ついても疑問であった。

【０００８】我々は、ｈＮＧＦがバクロウイルス昆虫細
胞発現系を用いて収率良く成功裏に発現されるであろう
ことを予期せずに見出した。本発明は、ｈＮＧＦを生物
学的に活性な形態で発現し得るバクロウイルス系におい
て用いられる発現ベクターの構築を記述する。本発明に
従った組換えＤＮＡ技術によるｈＮＧＦの充分な量の産
生は、アルツハイマー病（ＡＤ）におけるＮＧＦの潜在
的な有用性を確認することを可能ならしめる。

【０００９】本発明の要約本発明の一実施態様は、昆虫細胞類内で機能し得る制御
因子に対して適切な方向をもって結合されたヒト神経成
長因子（ｈＮＧＦ）またはその誘導体の遺伝子を有する
バクロウイルス転移ベクターである。好ましくは、ｈＮ
ＧＦをコードする該遺伝子は、先行配列とバクロウイル
ス遺伝子のプロモータとが組込まれたキメラ遺伝子であ
る。

【００１０】本発明の他の実施態様において、昆虫細胞
内での生物学的に活性なｈＮＧＦおよびその誘導体の製
造方法が記述されている。該方法は、ｈＮＧＦの該遺伝
子をバクロウイルス転移ベクター中に挿入し、キメラ遺
伝子を形成することからなる。該キメラ遺伝子は、次い
でバクロウイルス内に組込まれ、次いで該組換えバクロ
ウイルスにより昆虫細胞の感染がなされる。該感染昆虫
細胞は、好ましくは低または無血清培地中にて育生さ
れ、そして該使用培養培地から生物学的に活性なｈＮＧ
Ｆが採取される。

【００１１】本発明の更に他の実施態様においては、該
生物学的に活性なｈＮＧＦは、アルツハイマー病の治療
において使用される医薬組成物として調製される。

【００１２】図面の概略的記載図１：ｈＮＧＦの成熟ベータサブユニットのアミノ酸配
列図２：ｐＡｃ３７３ｍｈＮＧＦプラスミドの構築図３：ｐＡｃＹＭｈＮＧＦプラスミドの構築図４：ウイルス感染細胞の上澄から精製されたｈＮＧＦ
の銀染色およびウエスタンブロット分析

【００１３】図５：ｐＡｃＹ２ＭｈＮＧＦ組換えバクロ
ウイルス感染細胞由来の培養液により処理されたＰＣ₁₂
細胞図６：軸索突起の成長により示される攻撃の比率図７：バクロウイルス産生ｈＮＧＦに帰因する生物学的
活性図８：ｈＮＧＦの投与を受けたラットにおける記憶の低
下および思考力の減退

【００１４】発明の詳細な記述本発明は、バクロウイルス発現系を用いて組換えｈＮＧ
Ｆおよびその誘導体を製造する手法を記述する。ｈＮＧ
Ｆ前駆体の配列をコードするＤＮＡをバクロウイルス発
現ベクター中に組込むことにより、生物学的に活性なｈ
ＧＮＦ分子が発現される。

【００１５】ｈＮＧＦの“誘導体”は、ｈＮＧＦと実質
的に同じ活性を有する分子を生ずるような様式、例えば
アミノ酸の付加、削除または置換によってｈＮＧＦとは
異なる分子を包含することを意味する。

【００１６】生物学的に活性なｈＮＧＦは、バクロウイ
ルスＤＮＡのポリヘドリンプロモータと先行配列とに連
結されたプレープローｈＮＧＦ遺伝子からなるキメラ遺
伝子を構築することにより、バクロウイルス発現系にお
いて発現され得る。バクロウイルスＤＮＡのプロモータ
および先行配列を有するプラスミドの例は、ｐＡｃＹＭ
１（Ｂｉｓｈｏｐ．Ｄ．Ｈ．のＪ．ｏｆＧｅｎ．Ｖｉ
ｏｌ．６８：１２３３（１９８７））、ｐＡＣ１０１
（米国特許第４，７４５，５０１号）、ｐＡＣ３７３
（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：８４０４（１９８５））、
およびｐＥＶ５１（Ｒｉｃｅ，Ｗ．Ｃ．のＪ．Ｖｉｒｏ
ｌ．６１：１７１２（１９８７））を含む。本発明の好
適な実施においては、該ｈＮＧＦ遺伝子は、プラスミド
ｐＡｃＹＭ１に挿入される。

【００１７】ｈＮＧＦの該コード配列は、例えば、既知
のＤＮＡ配列を利用し遺伝子の合成または当業者に知ら
れている標準的なクローニング技術の使用により、数種
の供給源から入手可能である。ｈＮＧＦコード配列を有
するｃＤＮＡクローンは、既知のｈＮＧＦ配列に基づい
て特異的に設計されたオリゴヌクレオチドハイブリダイ
ゼーションプローブを使用することにより同定され得
る。

【００１８】ｈＮＧＦコード配列を得た後、該配列は、
ｐＡｃＹＭ１等のバクロウイルスクローニングベクター
中に挿入される。該クローニングベクターは、該コード
配列の効率的な転写、翻訳および複写に要する適切な制
御機能を与えるように構築される。

【００１９】本発明の一面において、ｈＮＧＦをＳ．フ
ルジペルダ細胞中で産生する組換えＤＮＡ分子は、バク
ロウイルス転移ベクター中に挿入されたｈＮＧＦ前駆体
のＤＮＡコード配列を有している。転移ベクターは、興
味ある外来遺伝子が、ポリヘドリンプロモータの下流に
挿入され得るプラスミドを意味している。更に、該転移
ベクターは、天然型バクロウイルスゲノムと相同的な組
換えが可能となるのに充分な量のポリヘドリン遺伝子配
列を含み、かくして結果としてのウイルスは、興味ある
外来遺伝子を、該ウイルスポリヘドリンプロモータの制
御下に含有する。

【００２０】該バクロウイルスプロモータの使用によっ
て、該成熟ｈＮＧＦ前駆体が発現され、次いで成熟ｈＮ
ＧＦへ加工される。次いで、該成熟ｈＮＧＦは、該組換
えウイルスに感染した細胞から分泌される。

【００２１】本発明の好ましい実施において、前記相同
的組換えにおいて使用されるバクロウイルスは、ＡｃＮ
ＰＶと命名されたアウトグラファカリフォルニカ（Ａ
ｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）であ
る。他のバクロウイルス系は、例としてボンビクスモ
リ（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）およびヘリオティスゼ
ア（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓｚｅａ）から単離された昆虫
ウイルス等を含み、より一般的にはヨーロッパ特許公開
第０２２８０３６号に示されたものを含む。使用される
特定のバクロウイルス系は、行なわれる遺伝子操作の種
類により決定される。

【００２２】該ｈＮＧＦ遺伝子は、メチオニン開始コド
ンのひとつが利用可能となるようにバクロウイルス転移
ベクター中に挿入される。該ｈＮＧＦ遺伝子は、記述
（ＵｌｌｒｉｃｈらのＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒ
ｂｏｒＳｙｍｐｏｓｉａｏｎＱｕａｎｔ．Ｂｉｏ
ｌ．ＸＬＶＩＩＩ、ｐ４３５（１９８３））によると、
翻訳開始コドンとして使用されていると思われるメチオ
ニンを−１２１および−１１９位置に有している（１位
は、成熟ｈＮＧＦのＮ−末端セリン残基を示している。
第１図参照）。対照的には、最も良く研究されてきた神
経成長因子であるマウスＮＧＦの顎下腺ｃＤＮＡは、−
１２１位と−１１９位とに加えて−１８７位にメチオニ
ンを有している。ヒトまたはマウスにおいて、どのコド
ンが翻訳開始コドンとして機能しているかは明確でな
い。

【００２３】該マウスｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡを用
いた研究は、小麦胚抽出物を用いたインビトロでの翻訳
では、−１８７位のメチオニンにおいて翻訳が開始され
ることを示している（Ｅｄｗａｒｄｓらの、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：６８１０（１９８８））。こ
の観察と一致して、顎下腺においては−１８７位メチオ
ニンにて翻訳開始が起こり得ることを示すＮＧＦ前駆体
が、マウス顎下腺から単離されている（Ｓａｂｏｏｒｉ
およびＹｏｕｎｇの、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２５：
５５６５（１９８６））。しかしながら、マウスにおい
て、少なくとも３種類の異なったＮＧＦｍＲＮＡが産
せられることも示されている（ＳｅｌｂｙらのＭｏｌ．
ａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌ．７：３０５７
（１９８７））。この多様性は、別のスプライシングお
よび／または別のプロモータに由来する独立した開始に
よるものとして説明される。他のマウスＮＧＦｍＲＮ
Ａ類が−１８７位メチオニンを欠除していることから、
−１２１位または−１１９位のメチオニンにおいても翻
訳が開始され得ることが推論されている（Ｓｅｌｂｙら
の前出文献）。

【００２４】該マウスＮＧＦ遺伝子とは対照的に、ヒト
ＮＧＦ遺伝子構造は、そこまでは特徴付けられてはいな
い。従って、同様にどのメチオニンコドンが翻訳開始の
為に使用されているかについては明らかではない。我々
は、ここで（例３に示されるように）翻訳開始が、バク
ロウイルス発現系においては−１２１位メチオニン〔２
−ＭＥＴ位と命名される〕にて最も効率的に起こり、そ
の一方−１１９位メチオニン〔１−ＭＥＴ位と命名され
る〕での開始は、全く非効率的であることが示された。

【００２５】本発明のバクロウイルス発現系を用いた生
物学的に活性なｈＮＧＦの正しい発現および分泌は、プ
ローＮＧＦ配列の存在を必要とすることもまた観察され
た。プロー配列を除去する試み、すなわち（プレー）シ
グナル配列の成熟ｈＮＧＦ配列に対する直接的なスプラ
イシングは、ｈＮＧＦの分泌を生じなかった。

【００２６】本発明の好適な実施においては、ｈＮＧＦ
遺伝子が転移ベクター中に挿入され、キメラ遺伝子が形
成される。興味ある外来遺伝子を含む転移ベクターと天
然型バクロウイルスゲノムＤＮＡとによる細胞の共−感
染によって、ビリオンＤＮＡおよび該転移ベクターの間
の相同的組換えは、バクロウイルスポリヘドリン遺伝子
中に挿入されたキメラＮＧＦ遺伝子を含む組換えゲノム
を生ずる。組換えゲノムを含むウイルス類は、プラーク
精製によりクローン化され、発現ベクターとして使用さ
れる。該発現ベクターに感染された昆虫細胞類は、低ま
たは無血清培地中で育生され、ｈＮＧＦが該使用された
培養培地から採取される。

【００２７】更に特定的には、該ｈＮＧＦ遺伝子が組込
まれた転移ベクターは、該ｈＮＧＦ遺伝子を有するプラ
スミドの修飾により構築される。該プラスミドは、ｈＮ
ＧＦコード配列の上流および下流の両方に都合のよい制
限部位が組込まれるように修飾される。この修飾は、合
成アダプタの使用により達成される。例えば、所望の制
限部位を有する２種類のアダプタが合成される。第１の
アダプタ：

【化１】および

【化２】は、２つの可能な開始コドンのうちの第１のもの〔２−
ＭＥＴ位、−１２１位、図１参照〕のすぐ上流にＢａｍ
ＨＩ切断部位を有している。一方、第２のアダプタ：

【化３】および

【化４】は、第２のメチオニンコドン〔１−ＭＥＴ位、−１１９
位、図１参照〕の次に制限部位を置いている。更に、例
えば５′ｐＣＡＧＡＴＣＴＧ等の合成リンカーが、好適
な制限部位を導入するためにｈＮＧＦ遺伝子の下流に挿
入される。

【００２８】他の実施例において、該ｈＮＧＦ遺伝子を
有するプラスミドは、バクロウイルスポリヘドリン遺伝
子プロモータの直ぐ下流に挿入されてもよく、これによ
って転写開始のためにバクロウイルスポリヘドリンプロ
モータが使用される。

【００２９】メチオニン開始コドンを与える上記方法に
加え、ＮＧＦ遺伝子のプレープロ部分が、マウス顎下腺
ｃＤＮＡのものであり、一方成熟ＮＧＦをコードするＮ
ＧＦの部分がヒトＮＧＦ遺伝子配列（図１）であるよう
なハイブリッドまたはキメラ遺伝子を構築することも可
能である。このようなハイブリッドまたはキメラ遺伝子
は、該マウスプレープロＮＧＦ部分に存在する−１８７
位メチオニンにおける翻訳開始を可能的に許容し、一方
成熟ｈＮＧＦの発現をもたらす。このようなキメラ遺伝
子は、正確に折り重ねられたか、あるいは翻訳後に加工
されたことが示された。該バクロウイルス発現系を使用
して、このようなキメラ遺伝子は、生物学的に活性なｈ
ＮＧＦを生じた。

【００３０】上記した合成アダプタを用い、得られた転
移ベクターは、該ｈＮＧＦ遺伝子が利用可能な２つのメ
チオニン（ｍｅｔ）開始コドンの１つに隣接して位置す
るように構築される。該ｈＮＧＦの修飾配列は、例えば
ｐＡｃＹＭ１等の適当なバクロウイルス転移ベクターに
対し、該ｈＮＧＦ遺伝子が適切な方向となるように連結
される。得られるプラスミドは、バクロウイルスプロモ
ータを、可能なＮＧＦメチオニン開始コドンのひとつに
近隣して含んでいる。

【００３１】このように構築された組換えバクロウイル
ス転移ベクターは、例えば制限酵素切断部位についての
スクリーニングまたはこの分野で公知のＤＮＡ配列化技
術によって選択される。

【００３２】実施例中に記載された特定のベクターに加
え、これら特定のベクターの誘導体もまた特定的に包含
されている。誘導体類は、発現可能な形態の該ｈＮＧＦ
遺伝子の本質的な役割に対して明らかな影響を与えるこ
とのない、酵素制限部位等における修飾を含んでいる。

【００３３】一旦該ｈＮＧＦ転移プラスミドが選択され
た後は、該キメラｈＮＧＦ遺伝子を含むプラスミドは、
適当な昆虫宿主細胞中に該バクロウイルス性ＤＮＡと共
に共−トランスフェクトされ得る。このような宿主細胞
は、例えばＳ．フルジペルダ（好ましくは細胞株Ｓｆ
９、ＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ１７１１）、Ａ．カリフォ
ルニカ、ヘリオティスゼアラルバ等であり得る。トラン
スフェクションは、標準的な技術により実施される。こ
のような技術は、例えば、ウイルス性トランスフェクシ
ョン、ＤＥＡＥ−デクストラン誘導ピノサイトシス、リ
ン酸カルシウム沈殿、および最近においては、リポフェ
クション（リポ感染）を含む。本発明の好適な実施にお
いては、トランスフェクションは、ＦｅｌｇｎｅｒのＰ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：
７４１３（１９８７）に記載されているように、リポフ
ェクション技術を用いて実施される。

【００３４】トランスフェクションに続いて、該細胞
は、培地中で育生される。好ましくは３日または４日の
後に、該使用された上澄が採取され、宿主細胞の融合性
の単層上にプラーク形成される。組換えウイルスを示す
閉塞性負のプラークが摘み採られ、更にプラーク精製さ
れる。

【００３５】発現のために好適な昆虫宿主細胞、好まし
くはＳｆ９細胞は、次いで、組換えウイルスにより好適
には０．０１から１０プラーク形成単位／細胞をもって
感染され、引き続き好ましくは低または無血清培地で育
生される。培養液は、好適には３から７日後に採取さ
れ、標準的な同定試験、例えばＥＬＩＳＡおよびウエス
タンブロット分析等の免疫試験、またはＰＣ₁₂細胞分化
（Ｇｒｅｅｎｅ，Ｌ．Ａ．のＴｒｅｎｄｓＮｅｕｒｏ
ｓｃｉ７：９１（１９８６））等の生物学的試験が行
なわれる。

【００３６】プレープローＮＧＦ前駆体の加水分解処理
を増大させるため、上述した方法は、宿主細胞の他の組
換えウイルス類と共感染されることにより増強されても
よい。例えば、Ｓ．フルジペルダにおけるプレープロー
ｈＮＧＦの加水分解処理は、該Ｓ．フルジペルダ細胞の
ｈＮＧＦのベータサブユニットおよびｍＮＧＦのガンマ
サブユニットの遺伝子を含む組換えウイルス類による共
−感染によって増強され得る。ｈＮＧＦのベータサブユ
ニットと酵母ＫＥＸ２遺伝子を含む組換えウイルス類ま
たはｈＮＧＦのベータサブユニットとヒトカリクレイン
プロテアーゼの遺伝子を含む組換えウイルス類による共
−感染もまた有用である。

【００３７】本発明の該ｈＮＧＦは、使用された培養培
地から更に精製され得る。標準的な蛋白質精製技術、例
えば、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグ
ラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、大きさ排
除クロマトグラフィー、等電点フォーカシング等が採用
され得る。

【００３８】臨床的な使用のためには、ｈＮＧＦは医薬
品グレードのｈＮＧＦを得るために更に精製される。医
薬品剤型は、ｈＮＧＦの１投与単位が、アルツハイマー
病（ＡＤ）および他の神経性疾患の治療に有効であるよ
うに、有効量のｈＮＧＦを適当な製薬学的担体中に含ん
でなるであろう。

【００３９】痴呆の最も一般的な型態であるＡＤの病理
学は、多くの神経系が関与し複雑である。ＡＤ脳におい
て最も一致した神経病理学的な知見は、中枢コリン作働
性ニューロンの顕著な減損である（Ｈｙｍａｎらの、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ２２５：１１６８−１１７０（１９８
４）；Ｐｅａｒｓｏｎらの、ＢｒａｉｎＲｅｓｅａｒ
ｃｈ２８９：３９５（１９８３）；Ｗｈｉｔｅｈｏｕ
ｓｅらの、Ｓｃｉｅｎｃｅ２１５：１２３４（１９８
２））。この減損は、痴呆の程度に関連しており（Ｐｅ
ｒｒｙらの、ＢｒｉｔｉｓｈＭｅｄ．Ｊｏｕｒｎａｌ
２：１４５７（１９７８））、軸索突起プラークの数
に定量的な相関がある。コリン作働性ニューロン欠損
は、海馬回および皮質に向けて軸索突起を延ばす基底前
脳核（中央隔膜および神経核基底）の上昇経路を形成す
るニューロンに限定されて生ずる。これらの２つの領域
は、認識機能において特に重要である（Ｍａｎｎらの、
Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈｉ
ａｔｒｙ４９：３１０（１９８６））。これらのニュ
ーロンの減損は、皮質および海馬回の両者において顕著
な脳萎縮を生じ、ＡＤに特徴的な記憶欠損に対して主要
な寄与をするものと考えられている。

【００４０】これらの神経化学的欠損に基づき、種々の
ＡＤの治療方法が行なわれ、最近において最も有力なも
のは、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤である経口フ
ィソスチグミン（ｐｈｙｓｏｓｔｉｇｍｉｎｅ）であ
る。フィソスチグミンの経皮投与は、ある種のＡＤ患者
において認識機能の改善を示した（Ｍｏｈｓらの、Ａ
ｍ．Ｊ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ１４２：２８（１９８
５）、Ｄａｖｉｓらの、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＪ．
Ｍｅｄ．３０８：７２１（１９８３）；Ｃｈｒｉｓｔ
ｉｅらの、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ１３８：
４６（１９８１））が、その臨床的使用は、その半減期
の短かさ故に限定されている。向神経性因子である神経
成長因子の、特にコリン作働性ニューロン退化の防止お
よび神経再生成の増強（Ｈｅｆｔｉの、Ａｎｎ．Ｎｅｕ
ｒｏｌ．１３：１０９（１９８３））の両者のための
使用は、最近ＡＤ治療の新たな手がかりとして示唆され
ている。ＨｅｆｔｉのＡｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２０：
２７５（１９８６）も参照。

【００４１】ＮＧＦの役割は、第１には、脊椎末梢交感
および神経綾−誘導知覚神経の特異的な機能の発達およ
び維持を制御することに帰する（Ｌｅｖ−Ｍｏｎｔａｌ
ｃｉｎｉおよびＡｎｇｅｌｅｔｉのＰｈｙｓｉｏｌ．Ｒ
ｅｖ．４８：５３４（１９８６））。より最近におい
ては、ＮＧＦは、基底前脳における上昇コリン作働性ニ
ューロンの栄養作用を有することも確立された。

【００４２】ＮＧＦ、そのＲＮＡ転写物およびレセプタ
ー類は、これらの前脳コリン作働性ニューロンにより刺
激を受ける海馬回および皮質領域に高水準で存在してい
る（Ｋｏｒｃｈｉｎｇらの、ＥＭＢＯＪ．４：１３
８９（１９８５）；Ｒｉｏｐｅｌｌｅらの、Ｐｒｏｃ．
Ｓｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ１１：１０５６（１９８
５）；Ｒａｉｖｉｃｈらの、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２
０：２３（１９８６），Ｓｈｅｌｔｏｎらの、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：２７
１４（１９８６））。コリン作働性ニューロン上のＮＧ
Ｆレセプターの刺激は、線条および基底前脳核における
コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）活性の
増大を生じる（ＭｏｂｌｅｙらのＭｏｌ．Ｂｒａｉｎ
Ｒｅｓ．３８７：５３（１９８６）；Ｓｃｉｅｎｃｅ
２２９：２８４（１９８５））。

【００４３】ＮＧＦが基底前脳神経に対して栄養作用を
有することについての最も得心のゆく証拠は、多分：
（ａ）ラットにおける中隔海馬回経路に対する損傷に続
き、内因性ＮＧＦの劇的な増大があること（Ｇａｓｓｅ
ｒらの、ＢｒａｉｎＲｅｓ．３７６：３５１（１９８
６））および、（ｂ）ＮＧＦは、縁の切断に続く隔膜コ
リン作働性ニューロンの生存を促し、かつ認識損傷をな
くすこと（Ｇａｇｅらの、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏ
ｌ．２６９：１４７（１９８６）；ＨｅｆｔｉのＪ．
Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．６：２１５５（１９８６）；Ｗｉ
ｌｌｉａｍｓらの、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ８３：９２３１（１９８６））である。
これらの観察に基づくと、ＡＤにおいて観察されるコリ
ン作働性ニューロンの減失は、これらのニューロンを維
持するために充分な量のＮＧＦを合成することについて
の脳標的組織の失敗の結果であろう可能性がある。選択
的には、それは、コリン作働性ニューロンのＮＧＦに対
する応答における異常性、すなわちレセプターの異常性
を反映するであろう。ＡＤの病理学において異常なＮＧ
Ｆ応答が関与していないとしても、ＮＧＦは、コリン作
働性ニューロンの悪化を遅れさせ、または防止し、およ
び／または残るニューロンのＣｈＡＴ活性の増大におい
て、なお有用である。

【００４４】ＡＤ治療に対して有効な医薬組成物は、特
異的な最終的用途に依存する種々の経路のいずれかによ
って投与される。最も好ましい経路は、用途および関与
する患者に依存するであろう。

【００４５】正確な投与量および投与回数は、治療され
る患者の要求および苦悩の程度に依存するであろう。効
果的な医薬組成物を得るための蛋白質の製剤化方法は、
当業者に知られている。

【００４６】好ましくは、該組成物は殺菌溶液であろ
う。好ましくは、それはカニューレにより脳内に腔内的
な連続注入により投与されるであろう。該カニューレ
は、好ましくは小型ポンプに連結され得る。このような
小型ポンプは、皮下に挿入され得て、かつ薬剤の多量の
貯蔵（数週間または数ケ月間に充分な）を保持し得る。
治療は、好ましくは数週または数ケ月の長期間に亘る。
好ましい投与量の割合は、脳内に１日あたり０．１から
１００μｇｈＮＧＦの範囲が予想され、より好ましく
は２．５−５μｇ／日である。考えられるところでは、
該組成物は別法として脊髄中に投与され得る。この投与
経路によると、より多量の投与量が必要であろう。

【００４７】本発明は、ｈＮＧＦの高収率を与える点に
おいて特に優れており、かくしてその性質の適切な評価
を可能としている。収率は、好ましくは培養液について
５μｇ／ｍｌの程度、好適には１０μｇ／ｍｌである。

【００４８】以下の例は、記述的なものであって、本発
明を制限するものではない。別途特定されない限り、遺
伝子操作において用いたすべての酵素は、商業的な供給
者より得られたもので、実質的に製造者の指示に基づい
て使用された。クローン化処理は、特に記さない限り、
Ｍａｎｉａｔｉｓらの、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎ
ｉｎｇ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８２により記述されているよう
にして実質的に行なわれた。

【００４９】

【実施例】

【００５０】例１ヒトベータ神経成長因子遺伝子の単離ヒト白血球ゲノムライブラリー（クローニングベクタ
ー：ラムダＥＭＢＬ−３を用いて構築されている）は、
ＣｌｏｎｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ．
（パロアルト（ＰａｌｏＡｌｔｏ）、カリフォルニア
州）から購入した。約１．５×１０⁶ｐ．ｆ．ｕ．の組
換えファージが、Ｅ．ｃｏｌｉＬＥ３９２細胞〔Ｓｉ
ｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．のＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｗｉ
ｔｈＧｅｎｅＦｕｓｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎ
ｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｘｉ−ｘｉ
ｉ頁（１９８４）〕を０．０１倍の感染をもって感染さ
せるために用いられた。３７℃にて２０分間の吸収の後
に、感染細胞は、０．７％の軟質寒天で希釈され、１２
の新鮮なルリアブロス（ＬｕｒｉａＢｒｏｔｈ（Ｌ
Ｂ））プレート（１５０ｍｍ）上に塗布された。３７℃
にて６時間の後、該プレートは培養器から取出され、一
夜冷蔵された。次いで、該ファージローンは、２片のニ
トロセルロースフィルター（ＢＡ８５／２００．４５
ｍｍ、ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒａｎｄＳｃｈｕｅｌ
ｌ）により順次覆われた。次いで該ニトロセルロースフ
ィルターは、アルカリ変性され（０．５ＭＮａＯＨ、
１．５ＭＮａＣｌにより１５分間）、中性化され（０．
５ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０および１．５ＭＮａＣ
ｌにて１５分間）、洗浄され（６×ＳＳＣ（塩、クエン
酸ナトリウム）にて１５分間）、そして８０℃にて２分
間焼成された。ハイブリダイゼーションに先立ち、該フ
ィルターは、プレーハイブリダイゼーション溶液（６×
ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５×デンハルト溶液、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、１００ｍμ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、１００
ｍμ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡおよび０．０５％Ｎａピロリン
酸塩）により６５℃にて１６時間処理された。³²Ｐ標識
（ニック−トランスレーションによる、比活性３×１０
⁸ｃｐｍ／μｇ）マウスベーターＮＧＦｃＤＮＡ
（Ｗ．Ｒｕｔｔｅｒ博士からの寄贈、Ｎａｔｕｒｅ３
０２：５３８（１９８３））が、次いで該ニトロセルロ
ースフィルターに添加され、そしてハイブリダイゼーシ
ョン（６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、２％脱脂乳、１ｍ
ＭＥＤＴＡ、０．０５％Ｎａピロリン酸塩、１００μｇ
／ｍｌ硫酸デクストラン）が６５℃にて１６時間行なわ
れた。次いで、該フィルターは、２×ＳＳＣ、０．１％
ＳＤＳにて２回、０．６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにて
１回（それぞれ１０分間）洗浄された。該フィルター
は、空気乾燥され、そして−７０℃にてＸ−線フィルム
に曝された。

【００５１】正のハイブリダイゼーション信号を与えた
ファージプラークを摘採り、サブクローニングおよびハ
イブリダイゼーションの２種の付加的なラウンドに供し
た。ハイブリダイゼーションの第３のラウンドの間に、
ヒトＮＧＦ遺伝子

【化５】に対して相補的な末端標識合成オリゴヌクレオチド（２
８量体）もハイブリダイゼーションプローブとして用い
られた。正のファージから調製されたＤＮＡ類は、制限
酵素消化およびニック−トランスレーションによるマウ
スベーターＮＧＦｃＤＮＡまたは前述した合成オリゴヌ
クレオチドのいずれかをプローブとして使用するサザン
ブロット分析により特徴付けがなされた。予想された大
きさ（ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩ断片
について、それぞれ１．８、５．７および４．４ｋｂ）
のハイブリッド化断片を生ずるファージが選択された。
プレープロヒトベーターＮＧＦサブユニットの全コード
配列を含む１．８ｋｂＢｇｌＩＩ断片は、該ファージ
ＤＮＡから切取られ、ｐＵＣ８（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅ
ｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ガイテルス
ブルグ、メリーランド、米国）プラスミドベクター中に
転移された（互換性のＢａｍＨＩ部位を介して）。結果
としてのプラスミドは、ｐｈＮＧＦ＃５と命名した。

【００５２】例２ｐＡＣ３７３ｍｈＮＧＦの調製ｐＡＣ３７３ｍｈＮＧＦの構築は、多段階工程であった
（図２）。概略的には、該構築は、キメラＮＧＦ遺伝子
のベクターｐＵＣ８中への最初の組立てに関し、ここで
該ＮＧＦキメラの５′末端は、マウス顎下腺ＮＧＦｃ
ＤＮＡからなり、該キメラの３′末端は、ヒトＮＧＦの
成熟配列をコードするヒトゲノムＤＮＡの断片からな
る。

【００５３】ポリヘドロン遺伝子プロモータの直下流に
特異的なＢａｍＨＩ部位を有し、ポリヘドリン構造遺伝
子内部に特異的なＫｐｍＩ部位を有するバクロウイルス
トランスフェクションプラスミドｐＡＣ３７３（Ｓｍｉ
ｔｈ，Ｇ．Ｅ．のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ．８２：８４０４（１９８５））は、アダ
プタをＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩ制限部位に連結するこ
とにより、該ＮＧＦキメラを受け入れるために修飾さ
れ、該アダプタは、特異的なＳｍａＩおよびＰｓｔＩ制
限部位を含んでいた。次いで、該キメラマウス／ヒトＮ
ＧＦ遺伝子は、該ｐＵＣ８ベクターからＳｍａＩからＰ
ｓｔＩまでの断片として切取られ、そして該ＳｍａＩお
よびＰｓｔＩ制限部位を介して修飾ｐＡＣ３７３ベクタ
ー中に挿入された。

【００５４】ｐｍＮＧＦと称されるプラスミドは、カリ
フォルニア州９４３０５、スタンフォード、スタンフォ
ード大学薬学部、神経生物学科のＥｒｉｃＳｈｏｏｔ
ｅｒ博士から得た。プラスミドｐｍＮＧＦは、Ｓｃｏｔ
ｔらのＮａｔｕｒｅ３０２：５３８（１９８３）に記載
されたマウスＮＧＦ前駆体（プレプロマウスＮＧＦ）を
コードするマウス顎下腺ｃＤＮＡのＳｍａＩからＰｓｔ
Ｉまでの９６１塩基対断片からなり、ベクターｐＧＥＭ
１（Ｐｒｏｍｅｇａ、ミドルトン、ウイスコンシン、米
国）中に、ＳｍａＩおよびＰｓｔＩ制限部位を介してサ
ブクローン化されている。

【００５５】１０マイクログラムのｐｍＮＧＦを、制限
エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ（ＢｅｔｈｅｓｄａＲ
ｅｓｅａｒｃｈＬｅｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用い、
供給者の勧める条件を用いて消化した。ＥｃｏＲＩ切断
ＤＮＡを、次いでＰｓｔＩ（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓ
ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて供給
者の勧めに従って切断した。該消化ＤＮＡ断片を、０．
７％アガロースゲル上での電気泳動により分離し、約
１，０００の塩基対断片を該ゲルからＤｒｅｔｚｅｎら
のＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１２：２９５（１９
８１）によるＤＥＡＥニトロセルロース法で回収した。
回収された約０．５マイクログラムのＥｃｏＲＩからＰ
ｓｔＩまでの断片を、制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩ
Ｉ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，ウォルサ
ム、マサチューセッツ、米国）により供給者の勧める条
件を用いて更に消化した。該消化ＤＮＡを、フェノール
抽出し、エタノール沈殿させ、乾燥させそして無菌の蒸
留水中にマイクロリットル中５０ナノグラムの濃度で懸
濁させた。

【００５６】２分の１マイクログラムのプラスミドｐＵ
Ｃ８を、ＢａｍＨＩ（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒ
ｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により供給者の勧め
る条件を用いて消化した。該ＢａｍＨＩ切断ＤＮＡを、
更に制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩにより切断し
た。該切断ＤＮＡを、フェノール抽出し、そしてエタノ
ールを沈殿させた。該ＸｈｏＩＩ切断されたｐｍＮＧＦ
のＥｃｏＲＩからＰｓｔＩまでの断片を、ＢａｍＨＩお
よびＥｃｏＲＩ切断ｐＵＣ８と、１２５ナノグラムのＥ
ｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ切断ｐＵＣ８、約１２５ナノ
グラムのＸｈｏＩＩ切断されたｐｍＮＧＦのＥｃｏＲＩ
からＰｓｔＩまでの断片、１．２５マイクロモルのトリ
ス−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、０．２５マイクロモルのＭｇ
Ｃｌ₂、０．５０マイクロモルの還元ジチオスレイトー
ル、２．５ナノモルのＡＴＰ、および１単位のＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含有する２５マイクロリッ
トルの反応混合物中で連結した。該反応混合物は、１５
℃にて１６時間熟成された。

【００５７】該連結混合物を、適切なＥ．ｃｏｌｉＴ
Ｇ１宿主細胞（Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｗ．のＮｕｃｌ．Ａ
ｃｉｄｓＲｅｓ．１３：８７４９（１９８５））中に
形質転換させ、そしてｍｌあたり５０マイクログラムの
アンピシリン、ｍｌあたり５０マイクログラムの５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドリルベーターＤ−ガラ
クトピラノシド、およびｍｌあたり０．０５マイクロモ
ルのイソプロピルベーターＤ−チオガラクトピラノシド
を含むＬ寒天平板（１０ｇｍのトリプトン、５ｇｍの酵
母抽出物、１０ｇｍのＮａＣｌ、１５ｇｍのバクト−ア
ガー（ｂａｃｔｏ−ａｇａｒ）をリットルあたり含む）
上に塗布した。３７℃にて一夜育生した後、１２の無色
のコロニーを無作為に摘採り、各々をｍｌあたり５０マ
イクログラムのアンピシリンを含む１．５ｍｌのＬブロ
ス中に接種した。卓上シェイカー上で３７℃にて５時間
育生した後、微少溶菌ＤＮＡを各培養物からＢｉｒｎｂ
ｏｉｍおよびＤｏｌｙのＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ７：１５１３（１９７９）の方法に
より調製した。ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩによる切断
の後、これらの微少溶菌プラスミドＤＮＡ調製物のうち
の４つが、約５８０塩基対の予想された断片（該Ｘｈｏ
ＩＩ生成ＤＮＡ末端は、この場合、ＢａｍＨＩ生成ＤＮ
Ａ末端に連結されたときにＢａｍＨＩ部位を再生成する
ような配列を有する）を生じた。これらのプラスミドの
一つをｐｍＮＧＦ＃２と命名し、更に構築に使用した。

【００５８】ｈＮＧＦの成熟部分をコードするヒトゲノ
ムＤＮＡのＸｈｏＩＩ断片を、ｐｍＮＧＦ＃２のＢａｍ
ＨＩ部位に導入するために、該ベクターｐｍＮＧＦ＃２
をＢａｍＨＩにより切断し、自己連結の防止のためにア
ルカリホスファターゼにより処理した。１マイクログラ
ムのｐｍＮＧＦ＃２を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨ
Ｉにより消化した。該切断ＤＮＡをフェノール抽出し、
そしてエタノール沈殿させた。次いで、該乾燥ＤＮＡペ
レットを、１０マイクロリットルの殺菌蒸留水中に再懸
濁した。該ＢａｍＨＩ切断ｐｍＮＧＦ＃２を、次いで１
マイクログラムのＢａｍＨＩ切断ｐｍＮＧＦ＃２、０．
３１５マイクロモルのホウ酸ナトリウム、ｐＨ１０．４
および１単位のウシ腸管アルカリホスファターゼ（Ｓｉ
ｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌｓ）を含む２１マイクロリット
ルの反応混合物中で、アルカリホスファターゼを用い、
３７℃にて１時間の熟成によって処理した。１時間の後
にＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を最終濃度５ミリモルまで加
え、該混合物を６８℃で１５分間熟成した。次いで、該
混合物をフェノール抽出し、エタノール沈殿させ、乾燥
させ、そして殺菌蒸留水中に再懸濁した。

【００５９】１０マイクログラムのｐｈＮＧＦ＃５（例
１に記載されている）を制限エンドヌクレアーゼＸｈｏ
ＩＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ−Ｂｉｏｂａｂｓ）を用
い、供給者の勧める条件に従って消化した。次いで、該
ＸｈｏＩＩ切断ｐｈＮＧＦ＃５ＤＮＡをＰｖｕＩＩ（Ｂ
ｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ）を用い、供給者の勧めに従って消化を行なっ
た。該プラスミドのｐＵＣ８ベクター部分に由来する該
ＸｈｏＩＩ断片は、ＸｈｏＩＩ断片から誘導された所望
の１，００４塩基対のｈＮＧＦゲノムＤＮＡとほぼ同様
な大きさであった。該ｐＵＣ８誘導断片は、ＰｖｕＩＩ
部位を含んでおり、従って、ＰｖｕＩＩ部位を含んでい
ないｈＮＧＦゲノムＤＮＡ誘導断片に比較して大きさに
おいて減少された。該消化ＤＮＡ断片を０．７％アガロ
ースゲル上での電気泳動により分離し、約１，０００塩
基対の断片を、該ゲルからＤｒｅｔｚｅｎらによるＡｎ
ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１２：２９５（１９８１）の
ＤＥＡＥニトロセルロース法により回収した。

【００６０】該回収された１，０００塩基対ＸｈｏＩＩ
ｈＮＧＦゲノムＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩおよびアルカ
リホスファターゼ処理ｐｍＮＧＦ＃２に対し、１２０ナ
ノグラムのＢａｍＨＩ切断アルカリホスファターゼ処理
ｐｍＮＧＦ＃２、２５０ナノグラムの１，０００の塩基
対ＸｈｏＩＩｈＮＧＦゲノムＤＮＡ、１マイクロモルの
トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、０．２０マイクロモルの
ＭｇＣｌ₂、０．４０マイクロモルの還元ジチオスレイ
トール、２ナノモルのＡＴＰ、および１単位のＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを含む２０マイクロリットルの反応混合物中
で連結した。該反応混合物を１５℃にて１６時間熟成し
た。

【００６１】該２０マイクロリットルの連結混合物を、
適切なＥ．ｃｏｌｉＴＧ１宿主細胞中に形質転換し、
ｍｌあたり５０マイクログラムのアンピシリンを含むＬ
寒天平板上に塗布した。３７℃にて一夜育生した後、１
７０の無作為に選択した単離コロニーを別々に直径８２
ｍｍのニトロセルロースフィルタ（ＢＡ８５型、Ｓｃｈ
ｌｅｉｃｈｅｒａｎｄＳｃｈｕｅｌｌ）上に線条に
付けた。

【００６２】ＧｒｕｎｓｔｅｉｎおよびＨｏｇｎｅｓｓ
のコロニーハイブリダイゼーション法をＭａｎｉａｔｉ
ｓ（３１２−３１５頁）に記載されているように、ＮＧ
Ｆの成熟型部分をコードするヒトゲノムＤＮＡと相同な
２８量体合成オリゴヌクレオチド

【化６】を、³²Ｐ５′末端標識の後にプローブとして用いて行
なった。１７０の試験コロニーのうち４４が２８量体プ
ローブとハイブリッド化した。明確にハイブリッド化し
たコロニーのうち２４を別々にｍｌあたり５０マイクロ
グラムのアンピシリンを含むＬブロス１．５ｍｌ中に接
種した。卓上シェーカー上で３７℃にて５時間の育生の
後、微少溶菌ＤＮＡを各培養物からＢｉｒｎｂｏｉｍお
よびＤｏｌｙの方法（前出文献）により調製した。Ｅｃ
ｏＲＩによる切断の後、微少溶菌プラスミド調製物は、
約７００塩基対の予想された断片を生成した。これらの
プラスミドをｐｍＮＧＦ＃５、ｐｍｈＮＧＦ＃９および
ｐｍｈＮＧＦ＃２１と命名した。

【００６３】プラスミドｐｍｈＮＧＦ＃９のＤＮＡ配列
分析は、それがマウスｃＤＮＡとヒトゲノムＤＮＡとの
所望の結合を有していることを示した。１０マイクログ
ラムのプラスミドｐｍｈＮＧＦ＃９ＤＮＡを、制限エ
ンドヌクレアーゼＳｍａＩ（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓ
ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用い、供給
者の勧める条件により切断した。エタノール沈殿および
減圧下での乾燥後、該ＳｍａＩ切断ＤＮＡを更に制限エ
ンドヌクレアーゼＰｓｔＩ（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅ
ａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用い、供給者
の勧める条件により切断した。約１，５８０塩基対断片
が０．７％アガロースゲルでの電気泳動により分離さ
れ、該ＤＮＡをＤｒｅｔｚｅｎらのＡｎａｌ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．１１２：２９５（１９８１）のＤＥＡＥ−ニト
ロセルロース法により回収した。

【００６４】バクロウイルスクローニングベクタープラ
スミドｐＡＣ３７３を含むポリヘドリンプロモータを
１，５８０塩基対ＳｍａＩからＰｓｔＩマウス／ヒトキ
メラＮＧＦＤＮＡを受容するために、ｐＡＣ３７３の
特異的なＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩ部位の間にＳｍａＩ
およびＰｓｔＩ部位を含むアダプタを挿入することによ
り修飾した。該合成３５量体オリゴヌクレオチド

【００６５】

【化７】（ＳｍａＩ、ＰｓｔＩおよび他の制限酵素部位を含む）
を蒸留水中にマイクロリットルあたり１００ピコモルの
濃度で再懸濁した。２００ピコモルの該３５量体を、該
３５量体に加えて１．４マイクロモルのトリス−ＨＣ
ｌ、ｐＨ７．６、０．２マイクロモルのＭｇＣｌ₂、
０．１マイクロモルのジチオスレイトール、１ナノモル
のＡＴＰ、および７．５単位のＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含む２０マイクロリッ
トルの反応混合物中で３７℃にて１時間熟成することに
よってリン酸化した。該酵素を６５℃にて１０分間加熱
することにより不活性化した。相補的２７量体オリゴヌ
クレオチド

【化８】を同様な方法で処理した。

【００６６】各リン酸化反応混合物（リン酸化オリゴヌ
クレオチドを各々５０ピコモル含む）の５ミリリットル
分別物を合せ、自己−相補的オリゴヌクレオチドを、７
０℃にて４分間熟成することにより互いにアニール化さ
せ、次いで３７℃にて３０分間、最終的には２３℃にて
６０分間熟成した。

【００６７】３マイクログラムのプラスミドｐＡＣ３７
３を制限エンドヌクレアーゼＫｐｎＩ（Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に
より切断した。該ＫｐｎＩ切断ｐＡＣ３７３を更に制限
エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩにより切断した。該Ｋｐ
ｎＩおよびＢａｍＨＩ切断ＤＮＡをフェノール抽出し、
エタノール沈殿させ、減圧乾燥し、そして殺菌蒸留水中
にマイクロリットルあたり１２０ナノグラムの濃度で再
懸濁させた。該切断ｐＡＣ３７３ベクターＤＮＡを、次
いでアニール化オリゴヌクレオチドに対して１２０ナノ
グラムのＫｐｎおよびＢａｍＨＩ切断ｐＡＣ３７３ＤＮ
Ａ、１．０ピコモルのアニール化オリゴヌクレオチド、
１マイクロモルのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、０．２
マイクロモルのＭｇＣｌ₂、０．４マイクロモルの還元
ジチオスレイトール、２ナノモルのＡＴＰ、および１単
位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含有する２０マイクロリッ
トルの反応混合物中で連結した。該連結混合物を１５℃
にて１６時間熟成した。

【００６８】次いで、２０マイクロリットルの連結混合
物を、適切なＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１宿主細胞（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ，Ｔ．らのＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎ
ｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．Ｃ
ｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ：ニューヨーク）中に形質転換し、ｍｌあたり５
０マイクログラムのアンピシリンを含むＬＢ寒天平板上
に塗布した。

【００６９】３７℃にて一夜育生後、１２コロニーを任
意に選択し、それぞれをｍｌあたり５０マイクログラム
のアンピシリンを含む１．５ｍｌのＬブロスに接種し
た。卓上シェーカー上で３７℃にて５時間育生後、各培
養物からＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙの方法（前出
文献）により微少溶菌ＤＮＡを調製した。

【００７０】ＰｓｔＩおよびＸｈｏＩ（ｐＡＣ３７３中
の特異的制限部位）による切断後、予想された約２，０
００塩基対の大きさのＤＮＡ断片が、微少溶菌プラスミ
ドＤＮＡ調製物の一つを除くすべてから得られた。Ｐｓ
ｔＩ制限部位を獲得したすべてのプラスミドは、Ｘｈｏ
ＩおよびＳｍａＩによる切断から決定されるようにＳｍ
ａＩ制限部位もまた獲得していることが分かった。ｐＡ
Ｃ３７３ＳＳＢＸＰ−８と命名されたこれらのプラス
ミドの一つを最終的なプラスミド構築のために使用し
た。

【００７１】１マイクログラムのプラスミドｐＡＣ３７
３ＳＳＢＸＰ−８を制限エンドヌクレアーゼＳｍａＩ
により供給者が勧める条件を用いて消化した。エタノー
ル沈殿の後、該乾燥ＳｍａＩ切断ＤＮＡペレットを殺菌
蒸留水中に再懸濁し、更にＰｓｔＩ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ
ＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によ
り供給者の勧めに従って切断した。該ＳｍａＩおよびＰ
ｓｔＩ切断ｐＡＣ３７３ＳＳＢＸＰ−８ＤＮＡをフ
ェノール抽出し、エタノール沈殿させ、そして乾燥ＤＮ
Ａペレットをマイクロリットルあたり１００ナノグラム
の濃度として殺菌蒸留水中に再懸濁した。次いで、該切
断ｐＡＣ３７３ＳＳＢＸＰ−８ベクターを、先に単離
したマウス／ヒトＮＧＦキメラを含むｐｍｈＮＧＦ＃９
の約１，５８０塩基対のＳｍａＩからＰｓｔＩ断片に、
１００ナノグラムのＳｍａＩおよびＰｓｔＩ切断ｐＡＣ
３７３ＳＳＢＸＰ−８、２５０ナノグラムの約１，５
８０塩基対のｐｍｈＮＧＦ＃９のＳｍａＩからＰｓｔＩ
断片、１．０マイクロモルのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．
８、０．２０マイクロモルのＭｇＣｌ₂、０．４０マイ
クロモルの還元ジチオスレイトール、２．０ナノモルの
ＡＴＰ、および１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含む２
０マイクロリットルの反応混合物中で連結した。該反応
混合物を１５℃にて１６時間熟成した。

【００７２】該連結混合物を適切なＥ．ｃｏｌｉＨＢ
１０１宿主細胞中に形質転換し、ｍｌあたり５０マイ
クログラムのアンピシリンを含むＬ寒天平板上に塗布し
た。３７℃にて一夜育生後、１２コロニーを任意に摘採
り、各々をｍｌあたり５０マイクログラムのアンピシリ
ンを含む１．５ｍｌのＬブロス中に接種した。卓上シェ
ーカー上での３７℃における５時間の育生後、各培養物
から微少溶菌ＤＮＡをＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙ
の方法（前出文献）により調製した。ＥｃｏＲＩによる
切断後、これらの微少溶菌プラスミドＤＮＡ調製物のう
ちの２つが予想された３，４００塩基対断片を生じた。

【００７３】ｐＡＣ３７３ｍｈＮＧＦと命名したこれら
のプラスミドの一つを、バクロウイルスゲノムＤＮＡと
共に、下記例４に記載の方法によりスポドプテラフル
ジペルダＳｆ９細胞の共−トランスフェクションのため
に使用した。得られた組換えウイルスを、Ｓｆ９昆虫細
胞の感染に使用し、次いで下記例５に記載の方法により
ｈＮＧＦを発現した。

【００７４】例３ｐＡｃＹＭｈＮＧＦプラスミドの調製ｐＡｃＹＭｈＮＧＦプラスミドの構築は、多段階工程で
あった（図３）。第１に、プラスミドのｐｈＮＧＦ＃５
（例１に記載）を、ベーターＮＧＦコード配列の上流お
よび下流の両方に都合の良い制限酵素部位を組込むため
に修飾した。上流側のＢａｍＨＩ切断部位を与えるた
め、２つのオリゴヌクレオチドアダプタを合成した。第
１のアダプタ：

【化９】および

【化１０】は、２つの可能な開始コドンの第１のもの〔２−ＭＥＴ
位、−１２１〕から直ぐ上流側にＢａｍＨＩ切断部位を
有している。一方、第２のアダプタ：

【化１１】および

【化１２】は、第２のメチオニンコドン〔１−ＭＥＴ位、−１１
９〕の次に制限部位が位置している。

【００７５】該３５量体オリゴヌクレオチド

【化１３】を、マイクロリットルあたり１００ピコモルの濃度で蒸
留水中に再懸濁した。１００ピコモルの３５量体を、
１．４マイクロモルのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、
０．２マイクロモルのＭｇＣｌ₂、０．１マイクロモル
のジチオスレイトール、１ナノモルのＡＴＰおよび７．
５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）を含む２０マイクロリットルの反応混合物中
で、３７℃にて１時間熟成することによりリン酸化し
た。次いで、６５℃にて１０分間加熱することにより該
酵素を不活性化した。３９量体オリゴヌクレオチド

【化１４】を同様な方法で処理した。

【００７６】各リン酸化反応混合物の５マイクロリット
ルの分別物（各リン酸化オリゴヌクレオチド２５ピコモ
ルを含む）を合し、自己相補的オリゴヌクレオチドを７
０℃にて４分間の熟成、次いで３７℃にて３０分間、最
終的に２３℃にて６０分間の熟成により相互にアニール
化させた。

【００７７】ｐｈＮＧＦ＃５のプラスミドＤＮＡは、ｄ
ａｍ^-Ｅ．ｃｏｌｉ宿主ＧＭ４８（ｄａｍ３^-、ｄｃｍ
６、ｇａｌ、ａｒａ、ｌａｃ、ｔｈｒ、ｌｅｕ、ｔｈ
ｉ、ｔｏｎＡ、ｔｓｘ）および制限エンドヌクレアーゼ
ＢｃｌＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）
により供給者の勧めに従って切断された５マイクログラ
ムの該ＤＮＡから調製した。エタノール沈殿後、該Ｂｃ
ｌＩ切断ＤＮＡペレットを減圧下に乾燥した。該乾燥Ｄ
ＮＡペレットを、殺菌水中に再懸濁し、そしてエンドヌ
クレアーゼＳｍａＩにより切断した。該ＳｍａＩおよび
ＢｃｌＩ切断ｐｈＮＧＦ＃５ＤＮＡをフェノール抽出
し、エタノール沈殿させ、減圧下に乾燥させ、そして殺
菌蒸留水中に再懸濁した。次いで、該切断ｐｈＮＧＦ＃
５ベクターＤＮＡを、１００ナノグラム（０．０３８ピ
コモル）のＢｃｌＩおよびＳｍａＩ切断ｐｈＮＧＦ＃５
ＤＮＡ、２．５ピコモルのアニール化オリゴヌクレオチ
ド、１マイクロモルのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、
０．２マイクロモルのＭｇＣｌ₂、０．４マイクロモル
の還元ジチオスレイトール、２ナノモルのＡＴＰ、およ
び１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含む２０マイクロリ
ットルの反応混合物中でアニール化オリゴヌクレオチド
に連結した。該連結混合物を１５℃にて１６時間熟成し
た。

【００７８】次いで、該２０マイクロリットルの連結混
合物を、適切なＥ．ｃｏｌｉＧＭ４８宿主細胞中に形
質転換し、ｍｌあたり５０マイクログラムのアンピシリ
ンを含むＬＢ寒天平板上に塗布した。３７℃にて一夜育
生後、１２コロニーを任意に摘採り、それぞれをｍｌあ
たり５０マイクログラムのアンピシリンを含む１．５ｍ
ｌのＬブロス中に接種した。卓上シェーカー上で３７℃
にて５時間育生後、各培養物から微少溶菌ＤＮＡをＢｉ
ｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙの方法（前出文献）により
調製した。ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩにより切断した
後、これらの微少溶菌ＤＮＡは、予想された１５００塩
基対断片を生成した。ｐｈＮＧＦ２Ｍと命名された、こ
れらのプラスミドのひとつを、Ｓａｎｇｅｒの方法（Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７４：
５４６３（１９７７））によるＤＮＡ配列決定に付し、
所望の配列を有していることが分かった。

【００７９】プラスミドｐｈＮＧＦ１Ｍを、合成オリゴ
ヌクレオチド

【化１５】および

【化１６】を用いて同様な方法で構築した。ＢａｍＨＩおよびＳａ
ｌＩによる切断の後、クローンｐｈＮＧＦ１ｍの微少溶
菌プラスミド調製物は、予想された１５００塩基対の断
片を生じた。

【００８０】ｐＡｃＹＭ１（前出文献）中へのクローニ
ングのためのＢａｍＨＩ適合性下流制限部位を得るため
に、ＢｇｌＩＩリンカーをｈＮＧＦＤＮＡの下流の２
つのＡｐａＩ部位の間に導入した。該８量体オリゴヌク
レオチド５′ＣＡＧＡＴＣＴＧ３′を、１８８ピコモル
の該８量体、１．４マイクロモルのトリス−ＨＣｌ、ｐ
Ｈ７．６、０．２マイクロモルのＭｇＣｌ₂、０．１マ
イクロモルの還元ジチオスレイトール、１ナノモルのＡ
ＴＰ、および７．５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含む２０マイクロリットル
の反応混合物中で、３７℃にて１時間熟成することによ
りリン酸化した。該酵素を６５℃にて１０分間加熱する
ことにより不活性化した。１．６マイクログラムのプラ
スミドｐｈＮＧＦ２Ｍを制限エンドヌクレアーゼＡｐａ
Ｉ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）によ
り、供給者の勧める条件に従って消化した。フェノール
抽出、エタノール沈殿および乾燥の後、該ＡｐａＩ切断
ＤＮＡをマイクロリットルあたり２００ナノグラムの濃
度で殺菌蒸留水中に再懸濁した。ＡｐａＩ切断ＤＮＡの
３′突出部を、次にＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ
Ｉのクレナウ断片および４種類のｄＮＴＰのすべてを用
いて熟成することにより、除去（平滑−末端化）した。
１．４マイクログラムのＡｐａＩ切断ｐｈＮＧＦ２Ｍ
を、該ＡｐａＩ切断ＤＮＡ、１．２５マイクロモルのＮ
ａＣｌ、０．２５マイクロモルのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ
７．５、０．２５マイクロモルのＭｇＣｌ₂それぞれ５
ナノモルのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、およびｄＣ
ＴＰ、ならびに１単位のＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラ
ーゼＩのクレナウ断片（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａ
ｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からなる２５マイ
クロリットルの反応混合物中で２３℃にて１０分間熟成
した。

【００８１】熟成後、０．５マイクロモルのＥＤＴＡ、
ｐＨ８．０を添加し、得られた混合物をフェノール抽出
し、エタノール沈殿させ、乾燥させ、そしてマイクロリ
ットルあたり１００ナノグラムのＤＮＡ濃度で再懸濁し
た。該ＡｐａＩ切断平滑末端化ｐｈＮＧＦ２Ｍベクター
ＤＮＡを、次いで、１００ナノグラムのＡｐａＩ切断平
滑末端化ｐｈＮＧＦ２Ｍ、２８ピコモルのリン酸化８量
体リンカー、１マイクロモルのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ
７．８、０．２マイクロモルのＭｇＣｌ₂、０．４マイ
クロモルの還元ジチオスレイトール、２ナノモルのＡＴ
Ｐ、および１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂｅｔｈｅ
ｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ）を含む２０マイクロリットルの反応混合物中で、該
８量体ＢｇｌＩＩリンカーと連結させた。

【００８２】該連結混合物を２３℃にて１６時間熟成し
た。次いで、該ＤＮＡリガーゼを６５℃にて１０分間熟
成することによって不活性化した。該連結ＤＮＡを、引
続き制限エンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩ（Ｂｅｔｈｅｓ
ｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
により供給者の勧める条件で切断した。フェノール抽
出、エタノール沈殿および乾燥の後、該ＤＮＡをマイク
ロリットルあたり１０ナノグラムの濃度で殺菌蒸留水中
に再懸濁し、そして該ＤＮＡを１００ナノグラムのＤＮ
Ａ、１マイクロモルのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、
０．２マイクロモルのＭｇＣｌ₂、０．４マイクロモル
の還元ジチオスレイトール、２ナノモルのＡＴＰ、およ
び１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含む反応混合物中で
再連結した。該連結混合物を、２３℃にて１６時間熟成
した。次いで、２０マイクロリットルの該連結混合物を
適切なＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１宿主細胞中に形質転換
し、そしてｍｌあたり５０マイクログラムのアンピシリ
ンを含むＬＢ寒天平板上に塗布した。

【００８３】３７℃にて一夜育生後、６コロニーを任意
に摘採り、それぞれをｍｌあたり５０マイクログラムの
アンピシリンを含む１．５ｍｌのＬブロス中に接種し
た。卓上シェーカー上で３７℃にて５時間育生後、各培
養物から微少溶菌ＤＮＡをＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏ
ｌｙの方法（前出文献）により調製した。ＢａｍＨＩお
よびＢｇｌＩＩによる切断の後、ｐｈＮＧＦ２Ｍの連
結に由来する微少溶菌プラスミドＤＮＡ調製物のうち２
つは、予想された約７８０塩基対の断片を生じた。

【００８４】プラスミドｐｈＮＧＦ１ｍを、同様な方法
で構築し、７８０塩基対のＢａｍＨＩからＢｇｌＩＩ断
片を精製した。約２マイクログラムのプラスミドｐｈＮ
ＧＦ２ＭＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨ
ＩおよびＢｇｌＩＩにより切断した。該消化ＤＮＡ断片
を０．７％アガロースゲル上での電気泳動により分離
し、約７８０塩基対断片を、ＤｒｅｔｚｅｎらのＤＥＡ
Ｅニトロセルロース法、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
１１２：２９５によってゲルから回収した。該回収ＤＮ
Ａを、マイクロリットルあたり３０ナノグラムの濃度で
殺菌蒸留水中に再懸濁した。

【００８５】バクロウイルス転移プラスミドｐＡｃＹＭ
１（Ｍａｔｓｕｕｒａ，ＹのＪ．ｏｆＧｅｍ．Ｖｉｒ
ｏｌ．６８：１２３３（１９８７））を含む９マイクロ
グラムのポリヘドリンプロモータを、制限エンドヌクレ
アーゼＢａｍＨＩを用い、供給者の勧める条件を使用し
て切断した。フェノール抽出、エタノール沈殿および乾
燥の後、該ＢａｍＨＩ切断ｐＡｃＹＭ１を殺菌蒸留水中
に再懸濁し、９マイクログラムのＢａｍＨＩ切断ｐＡｃ
ＹＭ１、０．３１５マイクロモルのホウ酸ナトリウム、
ｐＨ１０．４、および１単位のウシ腸アルカリホスファ
ターゼ（Ｓｉｇｍａ）を含む２１マイクロリットルの反
応混合物中で、３７℃にて１時間、アルカリホスファタ
ーゼ処理をした。１時間後に、ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を
５ミリモルの最終濃度まで加え、該混合物を６８℃にて
１５分間熟成した。次いで、該混合物をフェノール抽出
し、エタノール沈殿させ、乾燥し、そして殺菌蒸留水中
に再懸濁した。

【００８６】次いで、先に精製したｐｈＮＧＦ２Ｍの約
７８０塩基対ＢａｍＨＩからＢｇｌＩＩ断片を、１００
ナノグラムのＢａｍＨＩ切断リン酸化ｐＡｃＹＭ１、２
２５ナノグラムのｐｈＮＧＦ２ｍのＢａｍＨＩからＢｇ
ｌＩＩまで（７８０塩基対断片）、１マイクロモルのト
リス−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、０．２マイクロモルのＭｇ
Ｃｌ₂、０．４マイクロモルの還元ジチオスレイトー
ル、２ナノモルのＡＴＰ、１単位のＴ４ＤＮＡリガー
ゼを含む２０マイクロリットルの反混合物中で、Ｂａｍ
ＨＩ切断アルカリホスファターゼ処理ｐＡｃＹＭ１と連
結した。該連結混合物を１５℃にて１６時間熟成した。

【００８７】次いで、２０マイクロリットルの該連結混
合物を適切なＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１宿主細胞中に形
質転換し、ｍｌあたり５０マイクログラムのアンピシリ
ンを含むＬＢ寒天平板上に塗布した。３７℃にて一夜育
生後、１２コロニーを任意に摘採り、それぞれをｍｌあ
たり５０マイクロモルのアンピシリンを含む１．５ｍｌ
のＬブロス中に接種した。卓上シェーカーで３７℃にて
５時間育生後、それぞれの培養物からＢｉｒｎｂｏｉｍ
およびＤｏｌｙの方法（前出文献）により、微少溶菌Ｄ
ＮＡを調製した。制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩおよ
びＸｈｏＩによる切断後、これらの微少溶菌プラスミド
ＤＮＡ調製物のうちの２つは、予想された数および大き
さの制限断片を生じた。ｐＡｃＹＭ２ＭｈＮＧＦと命名
したこれらのプラスミドのひとつを、バクロウイルスゲ
ノムＤＮＡと共にスポドプテラフルジペルダＳｆ９細
胞の共−トランスフェクションに使用した。プラスミド
ｐＡｃＹ１ＭｈＮＧＦは、ｐｈＮＧＦ１ＭのＢａｍＨＩ
からＢｇｌＩＩまでの断片とｐＡｃＹＭ１とを用いて同
様な方法で構築した。

【００８８】例４ｈＮＧＦ組換えバクロウイルスの調製ｐＡｃＹ１ＭｈＮＧＦまたはｐＡｃＹ２ＭｈＮＧＦを、
バクロウイルス（ＡｃＮＰＶ）性ＤＮＡと共にスポドプ
テラフルジペルダ細胞（Ｓｆ９）中に、Ｆｅｌｇｎｅ
ｒ（前出文献）により記載されたリポフェクション法を
用いて共−トランスフェクトした。

【００８９】ｐＡｃＹＭ１誘導ｈＮＧＦプラスミドの種
々の量（１から１０マイクログラム）および１マイクロ
グラムのＡｃＮＰＶＤＮＡ（１．５ｍｌ）を、同量の
“ＤＯＴＭＡ”リピド溶液（ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＭＤ）（６６μｇ／ｍｌをＨ
ＥＰＥＳ−緩衝溶液中に含む）と混合した。次いでリポ
ソームにカプセル化されたＤＮＡをＴ−２５フラスコ中
のＳｆ９細胞に加え、１．５時間熟成し、次いで３ｍｌ
の新鮮な培地を加えた。４時間後に元の培地を廃棄し、
新鮮な培地をつぎ足した。２７℃にて３または４日間熟
成後、上澄溶液を採取し、Ｓｆ９細胞の融合性単層にお
いて測定した。閉塞体を示さない（光顕微鏡的に測定し
た）プラークを摘採り、ポリヘドリン−負の組換えウイ
ルスを得るためにＳｆ９細胞上で２回、再プラーク化を
行なった。高力価ウイルス（１０ ⁷から１０⁸ｐ．ｆ．
ｕ．／ｍｌ）株を調製した。

【００９０】例５組換えウイルス感染細胞上澄中のヒトベータＮＧＦの免
疫測定３５ｍｍの組織培養皿中の昆虫細胞〔アメリカンタイ
プカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、ロックヴ
ィル、ＭＤから入手した（アキアワヨトウ卵巣（Ｆａｌ
ｌＡｒｍｙｗｏｒｍＯｖａｒｙ）スポドプテラフ
ルジペルダ（Ｓｆ９）ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１７１１）〕
を、組換えウイルスから誘導されたｐＡｃＹ１ＭｈＮＧ
ＦまたはｐＡｃＹ２ＭｈＮＧＦのいずれかで別々に１０
０ｐ．ｆ．ｕ．／細胞の倍々によって感染させた。１時
間の後、感染ウイルスを除去し、２ｍｌの新鮮Ｇｒａｃ
ｅ培地（ＪＲＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｏｏｄｌａｎ
ｄ，ＣＡ）（胎仔性ウシ血清を含まない）を添加した。
７２時間後、培養上澄を回収し、１０倍に濃縮した。該
濃縮試料を、抗−マウスＮＧＦ抗体を使用して、ＥＬＩ
ＳＡまたはウェスタンブロット分析のいずれかに供し
た。ウェスタンブロット（図４）およびＥＬＩＳＡの両
方の結果は、ｐＡｃＹ１ＭｈＮＧＦが検出可能な量のｈ
ＮＧＦを産生しない一方、ｐＡｃＹ２ＭｈＮＧＦ誘導組
換えウイルスは、約１マイクログラム／ｍｌのｈＮＧＦ
を培地中に分泌することを示した。

【００９１】例６無血清培地中でのｈＮＧＦの産生無血清培地（ＸＬ−４００）は、ＪＲＳｃｉｅｎｔｉ
ｆｉｃＩｎｃ．ＷｏｏｄｌａｎｄＣＡから購入し
た。２７℃のＸＬ−４００培地中に繁殖したＳｆ９細胞
を、１００ｍｌシェーカーフラスコ中で懸濁状態で育生
した。細胞密度を新鮮培地で希釈しつつ３×１０⁵から
１×１０⁶細胞／ｍｌに保持した。対数相において倍増
する時間は、約２４時間であった。細胞密度５×１０⁵
から２．４×１０⁶細胞／ｍｌのＳｆ９細胞を、組換え
ウイルスにより、感染の種々の倍率（ＭＯＩ）（０．０
１から１０ｐ．ｆ．ｕ．／細胞まで）をもって感染させ
た。

【００９２】培養上澄を、感染後３、５および６日にお
いて採取した。０．２２μｍ膜フィルタ系（Ｃｏｒｎｉ
ｎｇｇｌａｓｓｗａｒｅ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）を
通してロ過した後、ロ液中に存在するｈＮＧＦの量をＥ
ＬＩＳＡ法により測定した。ＸＬ−４００培地において
は、組換えｈＮＧＦは、Ｓｆ９細胞が密度２．４×１０
⁶細胞／ｍｌかつＭＯＩ０．０１において感染された場
合、感染後３日目に最適に産生された（約６μｇ／ｍ
ｌ）。

【００９３】例７ＥＬＩＳＡによる分析Ｉｍｍｕｌｏｎ−２平底９６穴プレート（Ｄｙｎａｔｅ
ｃｈＬａｂｓＩｎｃ．カタログ番号０１１−０１０
−３４５０）を、抗−マウス−ベータ（２．５Ｓ）ＮＧ
Ｆ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ、カタロ
グ番号１００８２１８）により、１μｇ／ｍおよび０．
１５ｍｌ／穴の濃度で、少なくとも２時間被覆した。
（ＮＧＦは、コーティング緩衝液（Ｎａ₂ＣＯ₃／Ｎａ
ＨＣＯ₃、５０ｍＭ；Ｎａアジド０．１％ｗ／ｖ：ｐＨ
９．６）により希釈した。）次いで、該プレートを洗浄
緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０；２００
ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＣａＣｌ₂、０．１％（ｗ／
ｖ）トライトンＸ−１００、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｎａ
−アジド）により洗浄した。次に、該プレートをＢＳＡ
（洗浄緩衝液中に１％ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ，ＲＩＡ級、
カタログ番号Ａ−７８８８）により室温下で少なくとも
３０分間ブロックし、再び洗浄緩衝液により洗浄した。
標準曲線は、各々の商業的な検定に包含される：蒸留水
中に１００μｇ／ｍｌの濃度をもって再構成され、５μ
ｌ／チューブの分別物として−６０℃で保存された２．
５ＳマウスＮＧＦ（Ｓｉｇｍａ、製品番号Ｎ６００９）
を、解凍し、４９５μｌの試料緩衝液（２０μｇ／ｍｌ
のアプロチニンが添加されたブロック用緩衝液、Ｕｎｉ
ｔｅｄＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣ
ｏ．カタログ番号１１３８８）により希釈した。この標
準（最終ＮＧＦ濃度１μｇ／ｍｌ）は、４℃において少
なくとも１０日間安定である。

【００９４】該ｍＮＧＦ標準を、試料緩衝液により倍々
に一連に希釈し、ＥＬＩＳＡプレート（０．１ｍｌ／
穴；一対で）上に加えた。培養液についても、試料緩衝
液中に一連に稀釈（１／２から１／６４，０００）し、
プレート上に加えた（この場合も０．１ｍｌ／穴）。４
℃において一夜熟成の後、該穴を反復洗浄した。ＮＧＦ
（２．５Ｓ）−ベーターｇａｌ共役物（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，カタログ番号１００８２３
４、ブロック用緩衝液中に０．０１２５単位／ｍｌ）
を、各穴に加えた。３７℃にて４時間熟成後、該プレー
トを再度洗浄した。０．２ｍｌの新たに調製した基質溶
液（基質緩衝液中に２ｍｇ／ｍｌのクロロフェノールレ
ッド−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド：１００ｍＭの
ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０；１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍ
ＭのＭｇＣｌ₂；０．１％（ｗ／ｖ）Ｎａアジド、１％
（ｗ／ｖ）のアルブミン）を各穴に加え、更に３７℃に
て２時間熟成した。次いで、ＥＬＩＳＡプレートをＴｉ
ｔｅｒｔｅｋＭｕｌｔｉｓｋａｎマイクロタイタープ
レート読取装置により、５７０ｎｍのＭｕｌｔｉｓｋａ
ｎ干渉フィルターを用いて読んだ。

【００９５】例８バクロウイルス産生ｈＮＧＦの生物活性組換えｐＡｃＹ１ＭｈＮＧＦまたはｐＡｃＹ２ＭｈＮＧ
Ｆウイルスにより産生される物質の生物活性を、インビ
トロにおいてＰＣ₁₂フエオクロモサイトマ細胞株（ｐｈ
ｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅ）
（Ｇｒｅｅｎｅ，Ｌ．Ａ．の、ＴｒｅｎｄｓＮｅｕｒ
ｏｓｃｉ．７：９１（１９８６））上で試験した。ＰＣ
₁₂細胞を、５％の限定的に添加された仔ウシ血清および
５％のウマ血清が添加されたダルベツコの修飾イーグル
培地（ＤＭＥＭ）中で育生し、穴（１６ｍｍ）あたり約
５０，０００細胞の密度で播種した。細胞を、組換えバ
クロウイルス感染細胞、またはマウスＮＧＦ（Ｓｉｇｍ
ａ）由来のいずれかの培養液の一回の添加により処理し
た。細胞を、添加後１４日まで観察した。

【００９６】ｐＡｃＹ２ＭｈＮＧＦ組換えバクロウイル
ス感染細胞由来の培養液（２５μｌ／ｍｌ培地）により
処理されたＰＣ₁₂細胞は、急速な分化を起こした（図
５）。神経軸索の出芽に示される攻撃の比は、ｍｌの培
地あたり２５および１００ｎｇにおけるマウスＮＧＦ
（２４−３６時間）より実質的により速い（１２時間以
内）（図６）。ＰＣ₁₂細胞の速い分化を誘導する能力
は、バクロウイルス産生ｈＮＧＦの本来の性質であるよ
うに見える。他方、分化の持続時間は、濃度依存性であ
る。感染Ｓｆ９細胞液の濃縮調製物により処理されたＰ
Ｃ₁₂細胞は、実験の継続期間中（１４日間）分化が続い
た。一方、バクロウイルス産生ｈＮＧＦのより希釈され
た調製物（０．１×）により処理されたＰＣ₁₂細胞は、
５日後にそれらの分化の表現型が逆転した。

【００９７】興味深いことに、ｐＡｃＹ１ＭｈＮＧＦ組
換えウイルス感染細胞上澄により処理されたＰＣ₁₂細胞
は、分化の徴候を示さなかった。この観察は、ウェスタ
ンブロットおよびＥＬＩＳＡの負の結果と一致する（例
５）。バクロウイルス産生ｈＮＧＦによる生物学的活性
は、抗−マウスＮＧＦ抗体により中和され得る（図
７）。

【００９８】例９ＰＣ₁₂細胞のＮＧＦ−誘導分化の中和ＰＣ₁₂細胞を、次の変更を伴って例８に記載されたよう
に塗布した：ＮＧＦを培養培地に添加するのに先立っ
て、抗−マウスＮＧＦ抗血清（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉ
ｖｅＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｃ．、生血清の１：５０
０および１：１０００希釈）を該ＰＣ₁₂細胞に添加し
た。次いでマウスＮＧＦ（Ｓｉｇｍａ）または組換えヒ
トＮＧＦをＰＣ₁₂細胞培養物に加え、それらの細胞分化
に対する効果を１４日間の期間観察した。ヒト（２５μ
ｌの培養液）およびマウス（１００ｎｇ）のＮＧＦの両
者によるＰＣ₁₂細胞のＮＧＦ誘導分化は、抗ＮＧＦ抗血
清の生血清１：５００および１：１０００希釈により中
和された。

【００９９】例１０ヒト神経芽ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるｈＮＧＦの生物
学的活性ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞〔Ｂｉｅｄｌｅｒらの、Ｃａｎｃｅ
ｒＲｅｓ．３３：２６４３（１９７３）、同文献３
８：３７５１（１９７８）〕の培養物を、７５ｃｍ²Ｃ
ｏｒｎｉｎｇＴ−７５フラスコ中において、ダルベッ
コ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）および１０％の胎孔性
ウシ血清（ＪＲＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が添加された
ハム（Ｈａｍ）のＦ−１２（ＪＲＳｃｉｅｎｔｉｆｉ
ｃ，Ｗｏｏｄｌａｎｄ，ＣＡ）の１：１混合物中で３７
℃にて維持した。細胞を、フラスコあたり４ｍｌのＤＭ
ＥＭ中の０．０２％ＥＤＴＡを加え、次いで激しく振と
うすることにより、移送および採取のために分離した。
細胞を、１：５の分配比で通過させた。いずれの場合に
も培養物中に抗菌剤を使用しなかった。負の対照上澄、
１００ｎｇ／ｍｌの濃度のＮＧＦ（２．５ＳマウスＮＧ
Ｆ、Ｓｉｇｍａ）またはヒトＮＧＦ（２５μｌ／ｍｌ）
に対する細胞の曝露の後、該細胞を分化の徴候について
２４時間毎に観察した。培養継続のために培地を２日毎
に交換し、かつＮＧＦを充足した。アフィジコリン（Ａ
ｐｈｉｄｉｃｏｌｉｎ）を、処理の第２週に１０μｇ／
ｍｌで培地に加えた。

【０１００】ＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽細胞株に対する
ヒトＮＧＦ（２５μｌ／ｍｌ）の添加は、急速な分化
（細胞からの軸索突起の伸長）を誘導したが、負の対照
培養液上澄のＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞への投与（２５μｌ／
ｍｌ）の後には何らの効果も観察されなかった。２４時
間の早期に始まったＮＧＦによる分化の急速な攻撃は、
同じ細胞系に対するマウスＮＧＦ（Ｓｉｇｍａ）の添加
の後に観察されたより遅い攻撃（５日）（Ｊｅｎｓｅ
ｎ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１２０：５６（１９８７））と
は対照的であった。アフィジコリンは、分化細胞に対し
ては何らの効果も持たないが、アルファＤＮＡポリメラ
ーゼの可逆的な阻害剤であり、従って有糸分裂する細胞
を殺すであろう。ＮＧＦによる分化が誘導されなかった
僅かな有糸分裂的に活性な細胞は、静止すなわち分化細
胞に生成するため、第２週における細胞のアフィジコリ
ンによる処理が必要である。

【０１０１】例１１同じバクロウイルスにおいてｈＮＧＦ遺伝子および処理
酵素をコードする他の遺伝子を含む組換えウイルス類に
よる感染ｈＮＧＦ遺伝子およびＮＧＦのガンマサブユニットまた
は酵母ＫＥＸ２エンドペプチダーゼ等の処理酵素をコー
ドする他の遺伝子を高水準で共発現するように特異的に
加工された転移ベクターの発展は、成熟ＮＧＦの多量産
生への別の到達手段である。これは、ベータＮＧＦ遺伝
子をポリヘドリンプロモータの下流に挿入し、かつガン
マＮＧＦまたはＫＥＸ２遺伝子をポリヘドリンプロモー
タの第２の複写物、他のバクロウイルスプロモータ、例
えばｐ１０後方プロモータ、または設計された合成プロ
モータ等の制御下に挿入することにより達成され得る。
次いで、組換えウイルスを、例４に記載されているよう
に創生し、例５に記載されているようにＳｆ９細胞の感
染に使用される。

【０１０２】例１２記憶障害試験におけるｎＮＧＦ一般論この試験においては、損傷は、ＡＤ患者に見られる記憶
および認識能力の傷害の見地からコリン作用性機能不全
の模倣を試みる。ｈＮＧＦ治療は、傷害の程度を著しく
減少した。方法雄のＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＷｉｓｔｅｒラット
（２８０−３００ｇ）を、音、温度および湿度が制御さ
れ、１２時間の明／暗サイクルが維持された住居に個別
に収容した。最初の１０日間は、研究動物は、飼に自由
に近づけた。１１日以降は、動物の給飼をすべての動物
がそれらの元の体重の８０％となるまで減少させた。こ
の体重は、訓練中を通して維持された。装置−Ｙ迷路を
動物の前訓練のために用い、各ゴールアームは、高さ１
３ｃｍ×幅１３ｃｍ×長さ４７ｃｍであった。これらの
アームは、進入路（高さ１３ｃｍ×幅１３ｃｍ×長さ４
０ｃｍ）からギロチン様とびらにより分離されていた。

【０１０３】訓練方法−訓練および試験方法は、基本的
にはＲａｍｌｒｅｚおよびＳｔｅｉｎの方法（Ｂｅｈａ
ｖ．ＢｒａｉｎＲｅｓ．１３：５３−６１（１９８
２）に従った。概略的には、動物を異なる実験グループ
（ｎ＝５−９）に無作為に配分し、３日間の前訓練にお
いて実験者およびＹ迷路に馴ませた。次いで、動物は、
５日間無作為変更訓練にあてられた。ラットを進入路の
基部に置いた後、該動物は、放たれ、アームの一方の進
入することが許された。一旦ゴールアームに入ると、該
動物は飼の報酬（４５ｍｇのＮｏｙｅｓフードペレッ
ト）を得た。ペレットを食べた後、該動物は進入路に戻
され、放たれて、次の無作為に選ばれ、再び該ラットが
飼の報酬を得るゴールアームに進入することが許され
た。該動物は、合計１０回の左／右無作為変更の一連を
経験させられた。この強制的な訓練期に続き、動物を、
迷路中で自由に変更するように、すべてがある基準水
準：３日間連続しての８０％の正しい変更挙動に達する
まで訓練した。

【０１０４】外科−ラットをキシラジン（Ｈａｖｅｒ）
／ケトアミン（Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ）２００：２０
ｍｇ／Ｋｇｉ．ｍ．により麻酔し、立体配置フレーム
（ＫｏｐｆＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に置いた。頭蓋
骨を露出し、浄化し、各々のＭｅｙｎｅｒｔの中核基底
（ＮＢＭ）の上部に２つの穴を穿った（座標は、Ｐａｘ
ｉｎｏおよびＷａｔｓｏｎ（ＴｈｅＲａｔＢｒａｉ
ｎｉｎＳｔｅｒｅｏｔａｘｉｃＣｏｏｒｄｉｎａ
ｔｅ，第２版、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ）に従ってブレグマから測定し、額角／後端
−０．４ｍｍ、横方向±２．６ｍｍであった）。該穴の
下の脳膜を貫通させ、イボテン酸（５ｍｇ／ｍｌ）で満
たしておいたハミルトンシリンジの先端を脳膜に対して
−６．５ｍｍおよび−７．５ｍｍ内方に下げた。１．０
μｌのイボテン酸を、ＮＢＭ中に１分間にわたって注入
した。

【０１０５】更に、第３の穴を側部脳室上部の頭蓋に穿
ち（額角／後端−０．８ｍｍ、横方向１．４ｍｍ）、ス
テンレス鋼カニューレを脳膜から４ｍｍ脳室中に植え付
けた。該カニューレは、２３ｇのステンレス鋼針から組
立てられ、ポリエチレンチューブを介してあらかじめ満
たされた殺菌Ａｌｚｅｔ（Ａｌｚａ、ＰａｌｏＡｌｔ
ｏ、カリフォルニア、米国）モデルの２ｍｌ小型浸透性
ポンプ（流速２．４μｌ／時）に連結された。該ポンプ
は、肩甲骨間に皮下的に設置した。次いで、傷を縫合
し、該動物の回復を待った。小型ポンプは、異なる治療
グループに応じて：ａ）ｈＮＧＦが、０．１μｇ／ｍｌのラット血清を含む
殺菌食塩水中に最終濃度０．１、１．０または１０．０
μｇ／ｍｌ溶解される、すなわち、ラットは、４週間の
治療期間に、０．２、２．０または２０．０μｇのｈＮ
ＧＦを受けるか；またはｂ）０．１ｍｇ／ｍｌのラット血清を含む食塩水により
満たされた。

【０１０６】処理手段実験グループは、対照動物（ｎ＝６）、傷害のみ（ｎ＝
９）、０．１μｇ／ｍｌのｈＮＧＦを有する傷害（ｎ＝
９）、１．０μｇ／ｍｌのｈＮＧＦを有する傷害（ｎ＝
９）、および１０．０μｇ／ｍｌのｈＮＧＦを有する傷
害（ｎ＝９）から成っている。該動物は、空間的変更の
仕事において訓練され、外科的に処置され、次いで３週
間の治療期間が与えられた。治療期間の後に、該ラット
を、Ｙ−迷路中で再試験し、それらの挙動的成績を、２
０日の期間にわたって評価した。統計的分析−Ｃｏｃｈ
ｒａｎ−Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｓｚｅｌテストを、治
療の全体的な効果に加えて治療間の対的な差異に対して
意味のある試験を得るために使用した。

【０１０７】結果実験グループにおける傷害後の死亡率は、４０％で、最
終的グループの数は、対照（６）、傷害のみ（６）、
０．１μｇ／ｍｌのｈＮＧＦを有する傷害（５）、１．
０μｇ／ｍｌのｈＮＧＦを有する傷害（６）、１０．０
μｇ／ｍｌのｈＮＧＦを有する傷害（６）であった。空
間的変更挙動におけるイボテン酸傷害およびｈＮＧＦの
効果を測定するために、３種類の行動基準を検討した：
（ｉ）傷害後、基準に至る日数、（ｉｉ）１日あたりの
変更誤りの平均数、および（ｉｉｉ）１日あたりの忍耐
的誤りの平均数。

【０１０８】図８に示されるように、横軸方向のイボテ
ン酸傷害動物は、対照動物に比べて確立された水準まで
到達するために著しく長くかかる（ｐ＜０．０１）。こ
の効果は、ｈＮＧＦの１．０および１０．０μｇ／ｍｌ
の投与により部分的に改善される。傷害のみの動物と、
傷害を有するが、１．０μｇ／ｍｌｈＮＧＦ（ｐ＜０．
０１）および１０．０μｇ／ｍｌｈＮＧＦ（ｐ＜０．０
１）により治療された動物との間には、顕著な差異があ
った。傷害のみのラットと、傷害を有し、０．１μｇ／
ｍｌのｈＮＧＦを投与されたものとの間には顕著な差は
なかった。

【０１０９】横軸方向の傷害は、また、ラットに対照ラ
ットと比べた場合、顕著な日変更の誤り（ｐ＜０．０
１）を招き、かつ対象動物に比べて顕著な忍耐的誤り
（ｐ＜０．０１）を招く。ｈＮＧＦ治療は、ＮＢＭに対
する横軸方向のイボテン酸傷害に続いて観察される損傷
に限定された。傷害が治療された、および傷害が１．０
μｇ／ｍｌ（ｐ＜０．０１）ならびに１０．０μｇ／ｍ
ｌ（ｐ＜０．０１）の投与をもってｈＮＧＦで治療され
た動物の間には、変更の誤り（図８）の平均数と、忍耐
的誤りの平均数とにおいて著しい差異があった。傷害が
治療された、および傷害が０．１μｇ／ｍｌｈＮＧＦで
治療された動物の間には、９日までは、変更および忍耐
的誤りの平均数において顕著な差はなかったが、１０日
以後においてはこれらのグループ間に著しい差異（ｐ＜
０．０１）があった。要約すると、ラットにおけるＭｅ
ｙｎｅｒｔ中核基底の横軸方向のイボテン酸傷害は、学
習した空間的変更挙動を著しく損なう。この損傷は、組
換えｈＮＧＦにより著しく改善され、ｒｈＮＧＦは、中
枢コリン作働性機能傷害を改善することが示唆される。

【０１１０】例１３例１２に示される試験において、何らの毒性効果も観察
されなかった。上記の記載および例は、好ましい実施態
様を含めて本発明を全て開示している。分子遺伝学およ
び関連する科学における当業者には自明であるような、
ここに記載した方法の変更は、記載された特許請求の範
囲に包含されるものと理解される。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】ｈＮＧＦの成熟ベータサブユニットのアミノ
酸配列を示す図である。クローン化されたマウスプレー
プローＮＧＦｃＤＮＡと、Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ｓｙｍ
ｐ．ｏｎＱｕａｎｔＢｉｏｌ．，ＣｏｌｄＳｐｒ
ｉｎｇＨａｒｂｏｒ４８：４３５（１９８３）によ
り発行されたヒト配列との比較であり、ここでｍはマウ
ス配列、ｈはヒト配列を示し、ＩＶＳは、ヒト遺伝子中
の介在配列の位置を示している。

【図１Ｂ】図１Ａの続きで、ｈＮＧＦの成熟ベータサブ
ユニットのアミノ酸配列を示す図である。

【図２】ｐＡｃ３７３ｍｈＮＧＦプラスミドの構築を示
すフローチャートである。

【図３】ｐＡｃＹＭｈＮＧＦプラスミドの構築を示すフ
ローチャートである。

【図４】ウイルス感染細胞の上澄から精製されたｈＮＧ
Ｆの銀染色およひウェスタンブロット分析の結果を示す
泳動図である。

【図５】ｐＡｃＹ２ＭｈＮＧＦ組換えバクロウイルス感
染細胞由来の培養液により処理された細胞の状態を示
す、つまり生物の構造を示す写真である。

【図６】軸索突起の成長により示される攻撃の比率を示
すグラフである。

【図７】バクロウイルス産生ｈＮＧＦに帰因する生物学
的活性を示すグラフである。

【図８】ラットにおける記憶の低下および思考力の減退
を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者プレストンエイ．ベッカーアメリカ合衆国カリフォルニア州サニーベイル，グロスビークアベニュー 1644 (72)発明者ヘラバースズティン − ペッテグリューアメリカ合衆国カリフォルニア州パロアルト，ウイルキーコート 4125 (72)発明者ビンティー．ヌグイエンアメリカ合衆国カリフォルニア州サンジョセ，ホワイトサンズドライブ 3191 (72)発明者キャロルウオードアメリカ合衆国カリフォルニア州ラホンダ，レッドウッドドライブ 119

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】以下のアミノ酸配列を有する生物学的に
活性な組換えヒトβ神経成長因子（ｈＮＧＦ）およびｈ
ＮＧＦと実質的に同じ活性を有する、アミノ酸の付加、
挿入、欠失または置換を含む誘導体であって、バクロウ
イルス発現系により得ることができ、かつ天然の供給源
から得られるｈＮＧＦに通常伴う不純物を含有しないこ
とを特徴とする組換えヒトβ神経成長因子。
【請求項２】さらに、ＰＣ_１２細胞の急速な分化を誘
導する能力を有することを特徴とする、請求項１の生物
学的に活性な組換えヒトβ神経成長因子。
【請求項３】請求項１の生物学的に活性なｈＮＧＦま
たはその誘導体および医薬として許容される担体からな
るヒトの神経系疾患治療用医薬組成物。
【請求項４】神経系疾患がアルツハイマー病である請
求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】患者に対して０．１〜１００μｇ／日を
提供するのに十分なｈＮＧＦまたはその誘導体を含有す
る請求項３または４のいずれか一つに記載の医薬組成
物。