MXPA96006388A - Formas truncadas de la proteina inhibidora kappa b (i kappa b alfa), produccion recombinante de dicha proteina y sus usos - Google Patents

Abstract

Se proporcionan formas truncadas de la proteína inhibidora kappa B (IkBalfa),ácidos nucleicos que codifican para las formas truncadas, vectores de expresión y transporte, y usos terapéuticos y profilácticos derivados.

Description

FORMAS TRUNCA appa a , PRODUCCIÓN REC0M8INANTE DE DICHA PROTEINA Y SUS USOS DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a proteínas que inhiben la activación de factores de transcripción, en particular del factor de transcripción NFKB. La invención se refiere asimismo a la producción recombinante de estas proteínas, particular-mente in vivo, a ácidos nucleicos que codifican para estas proteínas, a vectores de expresión y transporte, y a usos profilácticos y terapéuticos de las mismas, en particular para el tratamiento del síndrome del distrés respiratorio del adulto (SDRA), asma, rechazo de aloinjertos, vasculitis y resteno-sis vascular, por medio de terapia génica, así como otros estados que responden habitualmente a la inhibición del NFKB.

Durante la inflamación, la expresión de un cierto número de genes diferentes se regula positivamente en las células epiteliales y endoteliales, incluyendo los que codifican para interleuquinas, factores de transcripción, moléculas de adhesión y componentes del sistema de coagulación. La transcripción de muchos de estos genes implica al factor de transcripción NFKB.

El factor de transcripción NFKB se expresa constitutiva-mente en el citoplasma de las células. La inducción de la transcripción génica por parte de proteínas del tipo NFKB es el resultado de la modificación post-traduccional que permite la translocación del factor de transcripción preformado del citoplasma al núcleo. Esta translocación está controlada por la fosforilación y degradación de una proteína inhibidora denominada I?B, la cual forma un complejo con NFKB, manteniéndolo en el citoplasma. La estimulación de la célula mediante REF: 23618 señales adecuadas conduce a la modificación de IKB, lo cual a su vez tiene como resultado su disociación de NFKB.

La unión de la proteína l?B a NFKB oculta la señal de localización nuclear (NLS) de esta última. Tras la estimula-ción de la célula con agentes específicos, que dependen del tipo celular y del estado de desarrollo, I?B se modifica en un modo tal que impide su unión a NFKB, produciéndose la disociación de NFKB de I?B. Se cree que las señales que causan esta modificación implican la producción de radicales oxígeno, o bien la activación de quinasas, y que conducen a la fosforila-ción de I?B en lugares específicos, particularmente en Ser 32 , Ser y Tyr4 . Como resultado, el NLS queda desenmascarado y el NFKB se transloca al núcleo, donde se une a secuencias específicas de DNA en las regiones que controlan la expresión génica. La unión de NFKB a estos lugares provoca la transcripción de genes involucrados en el proceso inflamatorio. El factor de transcripción NFKB se aisló en un principio de células B maduras, en las que se une a un motivo de secuencia decamérico en el estimulador de la cadena ligera K. Si bien en un principio se creyó que NFKB era específico de este tipo celular y de este estado del desarrollo celular, las proteínas del tipo NFKB han sido identificadas desde entonces en un gran número de tipos celulares y, como se ha discutido anteriormente, han demostrado estar implicadas de un modo más general en la inducción de la transcripción génica. La identi-ficación de lugares de unión a NFKB funcionalmente activos en varios genes inducibles ha apoyado esta conclusión. NFKB es una proteína heterodimérica que consiste en una subunidad de 50 kD (p50) y una subunidad de 65 kD (p65). Los DNAc de p50 y p65 han sido clonados y han demostrado ser homólogos en una región de 300 aminoácidos. La subunidad p50 muestra una homología significativa con los productos del proto-oncogén c-rel aislados de mamíferos y aves, así como con el producto génico de dorsal en Drosophila. Recientemente un miembro adicional de la familia NFKB, relB, ha sido clonado como un gen de respuesta inmediatamente temprana a partir de fibroblastos estimulados con suero. Tanto p50 como p65 son capaces de formar homodimeros, si bien con diferentes propiedades: mientras que los homodímeros de p50 tienen una fuerte afinidad de unión por el DNA pero no pueden trans-activar la transcripción, los homodímeros de p65 se unen sólo débilmente al DNA pero son capaces de producir trans-activación. p50 se sintetiza como la parte amino terminal de un precursor de 110 kD (pllO), el cual no posee activi-dad de dimerización ni de unión a DNA. La parte carboxi terminal contiene ocho repeticiones de anquirina, un motivo que se halla en diversas proteínas implicadas en el control y diferenciación del ciclo celular. La clonación de una especie de RNA más corta (2,6 kb) inducida paralelamente al RNA precursor de 4 kb de p50 ha puesto de manifiesto que, bien por corte y empalme alternativo o por uso de promotores diferentes, la parte C-terminal de la proteína de 110 kD también puede ser expresada independientemente.

Han sido identificados cinco miembros de la familia IKB: I?Ba, I?Bß, pl05/I?B?, pl00/I?B?, e IB?Be (Baeuerle and Balti-more, Cell 87, 13-20 (1996)). Todos los miembros de la familia del tipo I?B contienen múltiples repeticiones de anquirina, las cuales son esenciales en la inhibición de la activación de NFKB. Las tres proteínas del tipo I?Ba contienen cinco repeticiones de anquirina. Se ha clonado RL/IF-1, y ha demostrado ser expresada en hígado en regeneración en los 30 minutos tras la hepatectomía. Los estudios de mutagénesis por deleción han revelado que cuatro de las cinco repeticiones de anquirina en pp40 son esenciales para inhibir la actividad de unión a DNA y para la asociación con c-rel, así como que la región C-ter inal también es requerida. Estudios con anticuerpos mo-noespecíficos, realizados con el precursor de 110 kD p50, han demostrado que la parte C-terminal (la parte con actividad I?B) oculta la señal de localización celular (NLS) localizada en la región amino terminal de p50. Brown y col., en Science 267, 1485-1488 (1995) describieron un mutante de deleción de I?B, que carece de 54 aminoácidos del NH2~terminal, que no era ni proteolizado ni fosforilado por señales, y que continuaba inhibiendo completamente el NFKB. Schein an y col. y Auphan y col. han descrito que la inmunosupresión inducida por gluco-corticoides está mediada a través de la inducción de la sínte-sis de IKB (Science, 283-286 y 286-290 (1995)).

Es uno de los objetos de esta invención el proporcionar proteínas mutantes (muteínas) del tipo I?B que no son desactivadas in vivo y que por lo tanto continúan inhibiendo el NFKB e impidiendo o previniendo la inducción de inflamación. Esta invención proporciona por lo tanto una proteína biológicamente activa que imita la actividad de I?B mediante la inhibición de la activación mediada por el factor nuclear kappa B (NFKB) de la respuesta inflamatoria, estando seleccionada esta proteína del grupo que consiste en las formas truncadas ?( 290-317), ?(281-317), ?(267-317), ?(243-317) y ?(l-44) de I?Ba con la secuencia SEQ ID N0:1. Un aspecto preferido es la provisión de DNAc que codifican para las proteínas truncadas. Un aspecto mayormente preferido es la provisión de un DNAc que codifica para la proteína ?(l-44)I?Ba (SEQ ID NO:2). En otro aspecto, la invención se refiere a un método de tratamiento de alteraciones respiratorias, en particular del síndrome del distrés respiratorio del adulto (SDRA), rechazo de aloinjertos, asma, artritis inflamatoria, vasculitis y restenosis vascular, en un mamífero mediante la administración a un mamífero necesitado de dicho tratamiento de una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína seleccionada del grupo consistente en las formas truncadas ?(290-317), ?(281- 317), ?(267-317), ?(243-317) y ?(l-44) de I?Ba, mediante la administración in vivo o in vitro de un ácido nucleico que codifica para una proteína seleccionada del grupo consistente en las formas truncadas ?(290-317), ?(281-317), ?(267-317), ?(243-317) y ?(l-44) de I?B a una célula de mamífero y la expresión del mismo en la célula para suministrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína. En una forma prefe-rida, el ácido nucleico es el que codifica para la forma truncada ?(l-44) (SEQ ID NO: 2 ) .

Figura 1. La secuencia de aminoácidos de la muteína I?Ba truncada en el N-terminal de esta invención (SEQ ID NO: 1 (? 1-44)) y la secuencia de ácido nucleico de DNAc que codifica para esta muteína de I?Ba.

Figura 2. Inhibición con la muteína I?B de la activación por NFKB en células U20S. Figura 3. Resistencia de la uteína I?B a la proteólisis inducida por activación. Figura 4. Inhibición con la muteína I?B de la actividad del promotor gelB en un ensayo de co-transfección con el gen señalizador LacZ. Figura 5. Expresión basada en retrovirus en células endoteliales humanas. Figura 6. Inhibición de la expresión de CAM inducida por cito-quinas. Figura 7. Inhibición de la producción de quimioquinas. Figura 8. Terapia génica profiláctica in vivo. Se establecen las siguientes definiciones para ilustrar y definir el significado y el alcance de los diversos términos empleados aquí para describir la invención.

El término "tratamiento" significa cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, incluyendo: (i) la prevención de la enfermedad, esto es, el conseguir que los síntomas clínicos de la enfermedad no se desarrollen; (ii) la inhibi-ción de la enfermedad, esto es, el detener el desarrollo de los síntomas clínicos; y/o (iii) el alivio de la enfermedad, esto es, el conseguir la regresión de los síntomas clínicos. El término "cantidad efectiva" significa una dosis suficiente para proporcionar un tratamiento del estado de enférmedad a tratar. Ésta variará dependiendo del paciente, de la enfermedad y del tratamiento que se lleve a cabo. Tal y como se utilizan aquí, los términos "transformado" y "transfectado" significan la introducción de un polinucleótido, por ejemplo DNAc, que codifica para una muteína de I?B en una célula diana. "Unidos funcionalmente" se refiere a una yuxtaposición tal que la función normal de los componentes pueda ser llevada a cabo. De este modo, una secuencia codificante "unida funcionalmente" a secuencias de control se refiere a una configura-ción en la que la secuencia codificante puede expresarse bajo el control de estas secuencias. "Secuencias de control" se refiere a secuencias de DNA necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida funcionalmente en un organismo hospedador en particular. Las secuencias control adecuadas para células eucariotas son promotores, señales de poliadenilación y estimuladores. "Sistema de expresión" se refiere a secuencias de DNA que contienen una secuencia codificante deseada y secuencias de control unidas mediante una unión funcional, de modo que las células transformadas con tales secuencias sean capaces de producir las proteínas codificadas. Para llevar a cabo la transformación, el sistema de expresión puede ser incluido en un vector; sin embargo, el DNA de interés puede también integrarse a continuación en el cromosoma del hospedador. "Vector" significa una molécula de DNA formada por DNA de cadena sencilla, de cadena doble, circular o superenrrollado. El vector está compuesto por los siguientes elementos unidos funcionalmente a distancias apropiadas para permitir la expresión de genes funcionales: un promotor, una secuencia líder de RNAm en 5 ' , un lugar de inicio de la transcripción, un cásete de ácido nucleico, una región en 3' no traducida, y un lugar de poliadenilación. Uno o más de estos elementos pueden eli i-narse para aplicaciones específicas. El cásete de ácido nucleico puede incluir un sitio de restricción para la inserción de la secuencia de ácido nucleico a expresar. En un vector funcional, el cásete de ácido nucleico contiene la secuencia de ácido nucleico a expresar incluyendo lugares de iniciación y terminación de la traducción. Tal y como se utiliza aquí, el término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a un medio transportador que no interfiera con la efectividad de la actividad biológica de los ingredientes activos y que no sea tóxico para los hospedadores a los que se administrará. La presente invención se refiere, como se ha descrito anteriormente, a formas truncadas de la proteína inhibidora kappa B (I?Ba) seleccionadas del grupo que consiste en las formas truncadas ?(290-317), ?(281-317), ?(267-317), ?(243- 317) y ?(l-44) de I?Ba (SEQ ID NO : 1 ) . Una forma preferida es la forma truncada en el N-terminal ?(l-44) de la proteína inhibidora kappa B (designada como I?B-NT), que posee la se- cuencia descrita en la Figura 1. Estas proteínas I?B truncadas (IKB?290, IKB?281, I?B?267, I?B?243 e I?B-NT) son resistentes a la degradación proteolítica inducida por la inflamación, si bien conservan la capacidad de unirse a NFKB y de inhibir su actividad transcripcional . Estas propiedades permiten que la proteína I?B truncada recombinante funcione como un potente • inhibidor de la activación de NFKB, lo que indica que poseerá una actividad antiinflamatoria significativa. El DNAc que codifica para I?B-NT puede ser expresado en células endoteliales capilares pulmonares para tratar el síndrome del distrés respiratorio del adulto (SDRA), asma, vasculitis y artritis inflamatoria. Asimismo, los órganos transplantados o los injertos venosos pueden ser tratados con esta formulación para inhibir el rechazo de aloinjertos. El endotelio vascular puede ser tratado con una forma truncada vía un catéter tras PTCA para inhibir la restenosis. El mutante truncado IKB-NT (que codifica para los aminoácidos 45-317) presenta diversas ventajas significativas sobre otras moléculas IKB y proteínas I?B mutantes como inhibidores de la activación de NFKB. Este mutante truncado carece de los 44 aminoácidos NH -terminales de I?Ba, que regulan la degrada-ción dependiente de señal de esta proteína en respuesta a una gran diversidad de señales de activación celular. Las serinas en los residuos 32 y 36 están fosforiladas, las usinas en las posiciones 22 y 23 están ubiquitinadas (Scherer y col., PNAS (USA) 92, 11259-11263 (1995)), y la tirosina en la posición 42 (I bert y col., Cell 86, 787-798 (1996)) se fosforila en respuesta a señales de activación. Estos sucesos conducen a la separación de I?Ba de NFKB, lo que produce la activación de NFKB y la degradación de I?B . Por consiguiente, la deleción de la totalidad de los tres puntos de señalización críticos en el mutante truncado I?B-NT produce un inhibidor de NFKB que resiste la degradación proteolítica dependiente de activación. Adicionalmente, el mutante truncado será menos in unogénico cuando sea expresado en la terapia génica que un I?Ba mutante que contenga substituciones de aminoácidos. Adicionalmente, I?Bß debe ser fosforilado antes de que sea capaz de inhibir la activación de NFKB, mientras que I?Ba no fosforilado puede inhibir al NFKB (Kremer y col., J. Biol. Chem. 271, 16310-16316 (1996)). Las muteínas de I?B descritas aquí consisten en material proteico con una estructura química definida. Sin embargo, la estructura exacta depende de diversos factores, en particular de las modificaciones químicas que se sabe que ocurren en las proteínas. Por ejemplo, puesto que todas las proteínas contie-nen grupos amino y carboxilo ionizables, es obvio que el inhibidor puede ser obtenido en la forma de sal acida o básica, o bien en forma neutra. Es asimismo obvio que la secuencia ami-noacídica primaria puede ser incrementada por derivatización empleando moléculas de azúcares (glicosilación) , o mediante otras derivatizaciones químicas que impliquen una unión cova-lente o iónica al inhibidor de, por ejemplo, lípidos, fosfa-tos, grupos acetilo y similares, que a menudo se producen en asociación con sacáridos. Estas modificaciones pueden producirse in vitro o in vivo, teniendo lugar en este caso en la célula hospedadora mediante sistemas de procesamiento post-traduccional . Se entenderá que tales modificaciones, con inde-pendencia del modo en que se produzcan, se pretende que sean incluidas dentro de la definición de muteína de I?B, siempre y cuando su actividad no desaparezca. Es de esperar, obviamente, que tales modificaciones puedan aumentar o disminuir la actividad biológica de la molécula; asimismo, se pretende que tales moléculas químicamente modificadas sean incluidas dentro del ámbito de la invención. El DNAc que codifica para el I?B humano de longitud completa (aminoácidos 1-317) fue aislado de una biblioteca de DNAc preparada a partir de RNAm procedente de células endote-líales de vena umbilical humana (HUVEC) mediante amplificación por PCR empleando metodologías estándar. Este DNAc se ligó en un plásmido de expresión eucariota (pBJneo) tras digestión con las endonucleasas de restricción EcoRI y Xbal, para producir el plásmido pI?B-fl. Los mutantes truncados de I?B (que codi-fican para los aminoácidos 1-289, 1-280, 1-266, 1-242 y 45-317) fueron construidos por amplificación mediante PCR empleando el plásmido que codifica para el I?B humano de longitud completa como molde. El mutante de deteción preferido (I?B-NT) carece de al menos los primeros 44 aminoácidos amino-ter inales; es de esperar que los mutantes de deleción N-ter inal hasta des-Ser70, inicio de la primera repetición de anquirina, sean asimismo efectivos. Los métodos alternativos de clonación, amplificación, expresión y purificación resultarán obvios para el artesano experimentado. Los métodos representativos se describen en Sa brook, Fritsch, and Maniatis, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2i Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory (1989). Los productos de expresión, es decir, las muteínas de I?B, de esta invención son útiles para la prevención y el tratamiento de una variedad de estados de los mamíferos en los que están indicados productos antiinflamatorios. En particular, las muteínas de esta invención están indicadas para la profilaxis y el tratamiento terapéutico del síndrome del dis-trés respiratorio del adulto (SDRA), rechazo de aloinjertos, asma, artritis inflamatoria, vasculitis y restenosis vascular en humanos. Las muteínas de esta invención son asimismo útiles para la generación de anticuerpos contra I?B, y para su uso subsiguiente como herramientas de diagnóstico y escrutinio farmacéutico. Los vectores de expresión son útiles para la generación de células de mamífero carentes de NFKB para la evaluación de la respuesta inmune. Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden como ingrediente activo una proteína de la presente invención, o una sal derivada farmacéuticamente aceptable, mezclada con un transporta-dor no tóxico farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones pueden prepararse para administración parenteral (subcutánea, intramuscular o intravenosa), en particular en la forma de suspensiones o soluciones líquidas; para administración oral o bucal, en particular en forma de comprimidos o cápsulas para la administración pulmonar o intranasal, en particular en forma de polvos, gotas nasales o aerosoles nasales; y para administración rectal o transdérmica. Las composiciones pueden ser administradas de una forma conveniente en forma de dosis únicas, y pueden prepararse por cualquiera de los métodos bien conocidos en el campo farmacéutico, por ejemplo como se describe en Remington's Pharmaceuti-cal Sciences, 173 Ed. , Mack Publishing Company, Easton, PA., (1985) . La administración de los compuestos de la presente invención al paciente durante períodos de tiempo prolongados, por ejemplo para períodos de una semana a un año, puede llevarse a cabo mediante la administración única de un sistema de liberación controlada que contenga ingrediente activo suficiente para el período de liberación deseado. Pueden utilizarse para este propósito diversos sistemas de liberación controlada, tales como microcápsulas de tipo monolítico o reservorio, implantes depot, bombas osmóticas, vesículas, icelas, liposomas, parches transdérmicos, dispositivos iontoforéticos y formas de dosificación inyectable alternativas. La localización en el lugar en el que se desea la liberación del ingrediente activo es una característica adicional de algunos sistemas de liberación controlada, que pueden demostrar ser beneficiosos en el tratamiento de ciertas enfermedades.

Una forma de formulación de liberación controlada contiene la proteína o su sal dispersada o encapsulada en un polímero no antigénico, no tóxico y de degradación lenta, tal como ácido copoli-( láctico/glicólico) , tal como se describe en el trabajo pionero de Kent, Lewis, Sanders y Tice, Patente Estadounidense N? 4,675,189. Los compuestos o, preferentemente, sus sales relativamente insolubles, pueden ser formulados asimismo en perlas con matriz de colesterol u otro lípido, o bien en implantes con matriz de silastó ero. Formulaciones adicionales de liberación lenta, de implante depot o inyectables resultarán evidentes al artesano experimentado. Ver por ejemplo Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems, J.R. Robinson ed. , Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978, y R.W. Baker, Controlled Reléase of Biologically Active Agents, John Wiley & Sons, Nueva York, 1987. Si bien es posible administrar una cantidad efectiva de muteína propiamente dicha al tejido diana, los problemas de degradación proteolítica y de baja eficiencia de transporte hacen más deseable la expresión in situ de la muteína de esta invención, preferentemente en el citoplasma, donde la activación de la transcripción mediada por NFKB puede ser inhibida evitando la migración de NFKB al núcleo. En una forma, esta invención proporciona una secuencia de DNAc heterólogo que se expresa constitutivamente en las célu-las diana, y que codifica para una muteína de I?B aquí descrita. La secuencia que codifica para la muteína de I?B está unida funcionalmente a una secuencia promotora heteróloga, de tal modo que la muteína se expresa continuamente. Los promoto-res típicos incluyen, pero no están limitados a, los promotores de CMV, SV40 y de choque térmico. En otra forma, la secuencia de DNAc que codifica para una muteína de esta invención está unida funcionalmente a una secuencia de un promotor inducible heterólogo, de modo que la expresión se desencadena vía un estímulo exógeno específico. Un estímulo exógeno adecuado puede ser proporcionado bien por la progresión natural de la cascada del complemento o por la introducción de un fármaco exógeno en la célula diana, o bien mediante un estímulo externo de tipo no químico, como por ejemplo irradiación. Son sistemas de promotores inducibles representativos las tecnologías de "interruptor génico" este-roideo descritas en la Patente Estadounidense N9 5,364,791 (Vegeto y col.), y el sistema sensible a tetraciclina descrito por Gossen y col. en PNAS 89, 5547-5551 (1992). Se contempla que esta invención puede ser puesta en práctica bien in vivo o ex vivo según convenga en función del estado a tratar, el régimen terapéutico empleado y el estado general de salud del paciente. Dependiendo del protocolo se-leccionado, existe una variedad de técnicas útiles para la introducción de DNAc en las células diana. Muchas de las técnicas son igualmente útiles en la transfección tanto in vivo como ex vivo; sin embargo, el artesano experimentado apreciará que ciertas técnicas son más adecuadas para una situación dada, y obrará en consecuencia. En general, las técnicas pueden dividirse en categorías físicas, químicas y biológicas, tal y como se discute a continuación.

Entre las técnicas de transfección biológica se incluye el uso de retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociados, po-xvirus y plásmidos bacterianos. Los vectores retrovirales derivan de retrovirus que se replican por integración aleatoria de su genoma en el del hospedador. Los vectores retrovirales pueden ser portadores de una carga útil genética superior a la de otros vectores virales. Sin embargo, los vectores retrovirales presentan problemas de seguridad inherentes, incluyendo virus contaminantes o genes retrovirales ya presentes en el paciente que pueden dar lugar a productos virales. Pueden capacitar al vector retroviral para recuperar su potencial de replicación y convertirse en un virus c ^letamente funcional. Los vectores retrovirales son útiles en el músculo, cerebro, y otras células que no proliferan. Los vectores retrovirales adecuados se describen en WO 92/07573. Los adenovirus son virus de DNA linear de cadena doble. Si bien los serotipos de adenovirus se asocian con infecciones respiratorias, existen varios serotipos no infecciosos. Los adenovirus presentan un genoma de tamaño intermedio que se replica en el núcleo celular. Los adenovirus penetran en las células a través de receptores, migrando a continuación su DNA al núcleo para ser expresado. Presentan afinidad por el epitelio respiratorio y pueden ser útiles para la terapia pulmonar y para problemas de las vías respiratorias. Pueden ser empleados asimismo para dirigirse hacia células epiteliales. Alcanzan títulos elevados, son relativamente estables y, puesto que son virus de DNA, pueden ser administrados en aerosol. El trabajo con estos virus es relativamente fácil, y, puesto que no se insertan en el cromosoma, no son de aplicación las consideraciones sobre la mutagénesis por inserción. Existen diversas limitaciones referentes al uso y desarrollo de vectores adenovirales . Puesto que el genoma de los adenovirus es li-near, son menos estables y tienen una mayor tendencia a los errores transcripcionales. Las líneas celulares empleadas para la producción de los vectores adenovirales rinden únicamente niveles bajos de vectores virales infecciosos, manteniéndose la persistencia del virus nativo de tipo salvaje. Además, los anticuerpos contra adenovirus pueden actuar contra estos adenovirus transformados. Los vectores adenovirales adecuados se describen en Rosenfeld y col., Science, 252, 432 (1991). Los virus adeno-asociados (AAV) pertenecen a la familia de los parvovirus y consisten en un DNA de cadena sencilla de aproximadamente 4 a 6 kb. Los vectores AAV son estables en las células hospedadoras, y no existen evidencias de que los AAV alteren la expresión génica de las células o causen reordenaciones genéticas. Los AAV están limitados por la cantidad mínima de material genético que pueden transportar. Únicamente pueden empaquetarse aproximadamente 5 kb de DNA en un vector AAV. Los vectores poxvirales consisten en virus de gran tamaño que presentan diversos sitios en los que pueden insertarse genes. Son termoestables y pueden conservarse a temperatura ambiente. Los estudios de seguridad indican que los vectores poxvirales son defectivos para la replicación y no pueden ser transmitidos de hospedador a hospedador o al ambiente. Del mismo modo que con otros virus, existen problemas de seguridad inherentes en cuanto a recombinación y formación de partículas infecciosas. Los poxvirus se internalizan por fagocitosis, por lo que se introducen en una población heteróloga de células. Los plásmidos son dobles hebras de DNA bacteriano que se replican, transcriben y traducen independientemente del genoma bacteriano. Los plásmidos procedentes de bacterias han sido considerados como vectores adecuados para el transporte de genes. Los genes de replicación pueden ser eliminados de un plásmido para evitar que éste sea transmitido a la progenie celular. Por ejemplo, cuando se inyecta en tejido muscular, el plásmido es incorporado por las células. No se integra en el cromosoma, si bien es transcrito y traducido independientemente. Los vectores químicos y físicos soslayan las consideraciones sobre seguridad asociadas a los vectores biológicos. Los métodos a emplear en la puesta en práctica de esta invención incluyen, pero no están limitados a: liposomas, lípidos y moléculas anfifílicas, receptores celulares, fosfato de calcio o transfección mediada por DEAE-dextrano, microinyección, electroporación y complejos polipéptido-DNA. Los liposomas son transportadores esféricos huecos compuestos por fosfolípidos. Cuando se inyectan por vía sistémi-ca, los liposomas se fusionan con las membranas celulares, o bien son incorporados por las células del hígado, bazo, pulmón y sistema reticuloendotelial . Para aumentar la especificidad de la diana, se han unido a la superficie del liposoma anticuerpos monoclonales o ligandos específicos de receptores celulares. El DNA en el interior del liposoma está protegido de la degradación. Adicionalmente, el uso de liposomas resuelve problemas relacionados con las restricciones de las barreras celulares. Los liposomas presentan la ventaja de ser biológicamente inertes y de no presentar riesgos de replicación como los virus. Un método alternativo es el transporte de genes dirigido a receptores celulares. Todas las células contienen receptores generales y únicos en su superficie que se unen a un cierto número de agentes o ligandos. Los ligandos que se unen al receptor son a menudo incorporados y pasan a formar parte de los procesos de transducción de señal para la activación de genes. Un gen unido a ligandos dirigidos a un receptor único es incorporado por células específicas, superando la resistencia de la superficie celular a la entrada, y soslayando la preocupación relativa a la entrada en tipos celulares no de-seados. La transfección mediada por fosfato calcico o por DEAE-dextrano es un método de transfección de uso generalizado. El DNA transfectado entra en el citoplasma de la célula por endocitosis. Dependiendo del tipo celular, hasta un 20% de una población de células en cultivo puede ser transfectada a la vez . La incorporación de DNA por células en cultivo está especialmente estimulada cuando el ácido nucleico se presenta en forma de un coprecipitado de DNA-fosfato calcico. Graham y van der Eb (1973), quienes desarrollaron el procedimiento de introducción de DNA de adenovirus y de SV40 en células adherentes, describen las concentraciones de calcio (125 mM) y de DNA (5-30 µg/ml) óptimas para la formación de coprecipitados de DNA-fosfato calcico a pH neutro (7,05). Adicionalmente, esta-blecieron los tiempos óptimos para la reacción de precipitación (20-30 minutos) y para la subsiguiente exposición de las células al precipitado (5-24 horas). Su trabajo estableció los fundamentos de la introducción de DNA clonado en numerosos tipos diferentes de células de mamífero, y condujo directamente a métodos fiables para la transformación estable de células y para la expresión transitoria de DNAs clonados. Se han descrito numerosas modificaciones menores del método, la mayoría relativas a permutaciones en el orden y en la forma de mezclar los ingredientes de la reacción de precipitación. Se han logrado aumentos en la eficiencia del procedimiento incorporando etapas adicionales, como el choque con glicerol y/o el tratamiento con cloroquina tras el protocolo de transfección. El tratamiento con butirato de sodio ha demostrado asimismo au-mentar la expresión en células humanas y de simios de plásmidos que contienen el estimulador de SV40. El DEAE-dextrano se utilizó inicialmente como un facilitador para introducir RNA de poliovirus y DNAs de SV40 y po-liomavirus en células. El procedimiento, con ligeras modifica-ciones, continúa siendo empleado de forma generalizada para la transfección de genomas virales y de plásmidos portadores de secuencias virales. A pesar de que el mecanismo de acción del DEAE-dextrano no es conocido, se cree que el polímero podría unirse al DNA e inhibir la acción de nucleasas, y/o unirse a células y promover la endocitosis de DNA. La transfección mediada por DEAE-dextrano difiere de la coprecipitación con fosfato calcico en tres aspectos importantes. En primer lugar, se emplea generalmente sólo para la expresión transitoria de genes clonados, y no para la trans-formación estable de células. En segundo lugar, funciona con gran eficiencia en líneas celulares tales como BSC-1, CV-1 y COS, pero los resultados no son satisfactorios con muchos otros tipos de células, quizá porque el polímero es tóxico. En tercer lugar, se emplean cantidades menores de DNA para la transfección con DEAE-dextrano que para la coprecipitación con fosfato calcico. Se logra una eficiencia máxima de transfección de 10 células de simio con 100-200 ng de DNA plasmídico superenrrollado; cantidades superiores de DNA (<2-3 µg) pueden resultar inhibidoras. En contraste con la transfección mediada por fosfato calcico, en la que se requieren grandes cantidades de DNA para promover la formación de un precipitado, nunca se emplea DNA transportador suplementario con el método de transfección del DEAE-dextrano. Se han descrito numerosas variantes de la transfección con DEAE-dextrano. Dos importantes variables afectan en gran medida la eficiencia del método: la concentración de DEAE-dextrano empleada y el tiempo en que las células están expuestas a la mezcla de DNA/DEAE-dextrano. Es posible emplear una concentración relativamente elevada de DEAE-dextrano (1 mg/ml) durante cortos períodos (de 30 minutos a 1,5 horas), o bien una concentración inferior (250 µg/ml) durante períodos más largos (hasta 8 horas). El primero de estos procedimientos de transfección es el más eficiente, si bien implica el control de las células para apreciar los primeros signos de estrés cuando se hallan expuestas al facilitador. Las condiciones de la segunda técnica son menos estrictas, por lo que es más fiable.

TM El policatión Polybrene permite la introducción eficiente y estable de DNAs de bajo peso molecular (por ejemplo DNAs plasmídicos) en líneas celulares que son relativamente resistentes a la transfección por otros métodos. Se ha empleado Polybrene como un facilitador de la transfección de DNA en células que han demostrado ser relativamente resistentes a la transfección empleando la coprecipitación con fosfato calcico. El método funciona eficientemente para la transformación estable de células CHO con DNA plasmídico, con un rendimiento de aproximadamente 15 veces más transformantes que con la coprecipitación de DNA-fosfato calcico. Sin embargo, no existen diferencias entre los dos métodos en cuanto a la eficacia de transformación de DNA de elevado peso molecular. Se desconoce si la transfección mediada por Polybrene puede emplearse para la expresión transitoria de DNA clonado, o si puede adaptarse para la transformación estable de otras líneas celulares distintas a la CHO. La fusión de protoplastos es un método alternativo de introducción del DNAc de esta invención en las células diana. En este método, protoplastos derivados de bacterias portadoras de un elevado número de copias del plásmido de interés se mezclan directamente con células de mamífero en cultivo. Tras la fusión de las membranas celulares (normalmente con polietilenglicol), el contenido de las bacterias se trasvasa al cito-plasma de las células de mamífero, y el DNA es transferido al núcleo. La fusión de protoplastos no es tan eficaz como la transfección para muchas de las lineas celulares que se emplean habitualmente en los ensayos de expresión transitoria, pero es útil en líneas celulares en las que la endocitosis del DNA ocurre con una baja eficiencia. La fusión de protoplastos rinde con frecuencia copias múltiples del DNA integradas en tándem en el cromosoma del hospedador. El DNA clonado puede ser introducido en las células de mamífero mediante la fusión de protoplastos preparados a partir de bacterias portadoras del DNA plasmídico de interés con células en cultivo. Las bacterias se hacen crecer en presencia de cloranfenicol para amplificar el DNA plasmídico y a continuación se tratan con lisozima para eliminar la pared celular. Los protoplastos resultantes se centrifugan sobre una monocapa de células de mamífero, y la mezcla resultante se trata con polietilenglicol (PEG) para promover la fusión. Durante este proceso, los DNAs bacteriano y plasmídico se transfieren a la célula de mamífero. A continuación se elimina el PEG y las células se incuban en medio de cultivo tisular fresco conteniendo kanamicina para inhibir el crecimiento de cualquier bacteria superviviente. La fusión de protoplastos se ha empleado tanto para la expresión transitoria de los genes clonados como para el establecimiento de líneas estables de células de mamífero. La fusión de protoplastos ha sido empleada para introducir de forma estable genes de inmunoglobulinas en células B, y genes de globina en células eritroleucémicas de ratón. La ventaja de este método es su elevada eficiencia. Sin embargo, las manipulaciones consumen mucho tiempo y normalmente la cotransformación no es posible. Así, el gen de interés debe siempre se transportado en un plásmido que contiene el marcador de selección deseado.

La electroporación implica la aplicación de pulsos eléctricos breves y de elevado voltaje a células de mamífero, lo que provoca la formación de poros con un diámetro de nanómetros en la membrana plasmática. El DNA es incorporado directa-mente al citoplasma celular bien a través de dichos poros o bien como consecuencia de la redistribución de los componentes de la membrana que acompaña al cierre de los poros. La electroporación puede ser considerablemente eficiente y puede ser empleada tanto para la expresión transitoria de genes clonados como para el establecimiento de líneas celulares con copias integradas del gen de interés. A diferencia de la transfección mediada por fosfato calcico o por fusión de protoplastos, la electroporación da lugar con frecuencia a células portadoras de una, o como máximo unas pocas, copias integradas del DNA foráneo. El procedimiento ha sido empleado tanto para la expresión transitoria como para la transformación estable, si bien la eficacia de la transfección varía ampliamente. Es esencial realizar una serie de experimentos preliminares para determi-nar las condiciones que conducen a unos niveles aceptables de expresión transitoria o de transformación estable de una línea celular en particular. La eficacia de la transfección por electroporación está influenciada por diversos factores. 1) La intensidad del campo eléctrico aplicado. A voltajes bajos, la membrana plasmática de las células en cultivo no resulta alterada lo suficiente como para permitir el paso de moléculas de DNA; a voltajes superiores, las células resultan dañadas irreversiblemente. Para la mayoría de las líneas de células de mamífero, el máxi-mo nivel de expresión transitoria (medido por ensayos de actividad CAT, por ejemplo) se alcanza cuando se aplican voltajes de entre 250 V/cm y 750 V/cm. Típicamente, entre un 20% y un 50% de las células sobreviven al tratamiento. 2) La duración del pulso eléctrico. Normalmente, se aplica un único pulso eléctrico a través de las células. Algunos aparatos de electroporación permiten al experimentador controlar la duración y la forma del pulso; en otros, las características del pulso vienen determinadas únicamente por la capacitancia de la fuen-te de energía. Los datos disponibles indican que la duración óptima del pulso eléctrico requerido para la electroporación es de 20-100 milisegundos. La eficiencia de la expresión transitoria aumenta si las células se incuban durante 1-2 minutos en la cámara de electroporación tras la exposición al pulso eléctrico. 3) La temperatura. Algunos investigadores han informado que se obtienen niveles máximos de expresión transitoria cuando las células son mantenidas a temperatura ambiente durante la electroporación; otros han obtenido mejores resultados cuando las células son mantenidas a 0 9C. Estas discre-pancias pueden derivarse de las diferencias en las respuestas de diversos tipos de células de mamífero al paso de la corriente eléctrica, o bien a la cantidad de calor generado durante la electroporación cuando se aplican voltajes elevados (>1000 V/cm) y/o pulsos eléctricos de elevada duración (>100 milisegundos). 4) Conformación y concentración del DNA. Si bien pueden transíectarse por electroporación tanto el DNA linear como el circular, se obtienen niveles superiores tanto de expresión transitoria como de transformación estable cuando se emplea DNA linear. Se han obtenido transfecciones eficien-tes con concentraciones de DNA que van desde 1 µg/ml a 40 µg/ml. 5) Composición iónica del medio. La eficacia de la transfección es varias veces superior cuando las células están suspendidas en soluciones salinas tamponadas (por ejemplo, solución tamponada HEPES salina), en lugar de en soluciones tamponadas de substancias no iónicas tales como anitol o sacarosa. La electroporación presenta una ventaja importante: funciona bien con líneas celulares refractarias a otras técnicas, como la coprecipitación de DNA-fosfato calcico. Sin érabargo, es necesaria la realización de un trabajo previo considerable para definir las condiciones óptimas particulares para la línea celular en estudio. Se encuentran disponibles comercialmente diversos aparatos de electroporación, y los fabricantes suministran protocolos detallados para su uso. Otro método importante de introducción de DNA en células es la unión del DNA a proteínas modificadas químicamente. Estas proteínas modificadas tienen la capacidad de unir DNA a través de un péptido sintético de polilisina unido químicamente, y se unen a receptores específicos en las células diana. Una vez estos complejos han sido incorporados por endocitosis mediada por receptores específicos, los genes codificados en el DNA pueden ser expresados en la célula diana. Se han realizado experimentos con complejos de transferri-na/polilisina/DNA, así como con complejos conteniendo asialo-glicoproteína/polilisina/DNA. Los ligandos naturales unidos químicamente de forma covalente se emplean: (1) para dirigir específicamente el DNA a diferentes tejidos; (2) para permitir un proceso de incorporación más eficiente. Estos métodos presentan limitaciones debido a que requieren modificaciones in vitro de los ligandos empleando métodos químicos o enzímáticos con el objetivo de obtener un compuesto capaz de unir DNA. Alternativamente puede emplearse la tecnología de proteínas de unión a DNA de Ledley y col., como se describe en WO 94/25608. Los liposomas han sido objeto de intensivos estudios en relación con su utilidad como vehículos de transporte in vitro e in vivo. La mayoría de tales procedimientos implican la encapsulación de DNA o RNA en liposomas, seguido de la fusión de los liposomas con la membrana celular. Sin embargo, se ha descubierto asimismo un método de transfección en el que se forma un complejo de DNA con un lípido catiónico sintético o con una molécula anfifílica catiónica sintética, y el complejo es introducido en las células por fusión. Un método preferido de administración de un ácido nuclei-co que codifica para una muteína de I?B de esta invención es mediante transfección empleando un vector no viral, preferentemente una molécula anfifílica catiónica (por ejemplo, DOTMA), como se describe en la Patente Estadounidense N9 4,897,355, WO 95/14381, WO 96/01840, WO 96/01841 y Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 93, 3176-3181 (1996), incorporándose dichos descubrimientos aquí como referencia. Este método de transfección de DNA puede ser empleado como parte de un protocolo terapéutico para el tratamiento de problemas inflamatorios. El tratamiento puede realizarse bien retirando células del paciente afectado, transfectando in vitro con el gen apropiado y reinyectando las células transfectadas con éxito; o bien administrando sistémicamente el DNA adecuado directamente al paciente afectado mediante un vehícu-lo adecuado que permita que la transfección se produzca in vivo. El protocolo in vitro se realiza del siguiente modo adaptado a partir de la literatura (Anderson, Science 226, 401-409 (1984); Williams y col., Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 83, 2655-2670 (1986)). Una cantidad adecuada de células tisu-lares (de 10 millones a 10 mil millones) es extraída del paciente. Las células tisulares pueden proceder de diversos órganos como por ejemplo hígado, bazo, sangre o piel, si bien con mayor probabilidad de médula ósea. Las células se preparan para cultivo de tejidos por tripsinización del tejido o por otros medios necesarios, se hacen crecer en un medio adecuado durante un período de tiempo apropiado (por ejemplo, de 1 día a 2 semanas), y se transfectan a continuación mediante la adición de un complejo de liposomas DNA/DOTMA adecuado para el problema genético en particular que se esté tratando, y con una composición consistente con el método descrito anteriormente. Las células se incuban durante un período de tiempo adecuado, aproximadamente de 4 a 72 horas, y las células transfectadas con éxito se lavan y se reinyectan de nuevo al individuo sometido a tratamiento. El protocolo de transfección in vivo puede ser realizado siguiendo el trabajo de Nicolau y col., Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 80, 1068-1072 (1983). Los complejos de DNA y liposomas, o bien complejos de DNA con doble recubrimiento, o bien com-piejos con doble recubrimiento modificados covalentemente, se preparan como se describe en Eppstein y col. ( supra ) . Los complejos modificados covalentemente pueden contener unidos anticuerpos, proteínas, hormonas, carbohidratos u otras modificaciones químicas, con el objetivo de dirigirlos a las célu-las de interés. Por ejemplo, los complejos pueden contener un anticuerpo para células endoteliales con la intención de dirigir los complejos a las células endoteliales; o pueden contener anticuerpos para una subpoblación en particular de células de médula ósea con la intención de dirigir los complejos a estas células. La administración al individuo afectado puede ser endovenosa (EV), subcutánea (SC), intraperitoneal (IP), intramuscular (IM), tópica o mediante aerosol sobre la nariz o pulmones. El protocolo terapéutico puede implicar bien un tratamiento único, o bien el complejo puede ser administrado tantas veces como sea preciso. La dosis EV puede administrarse en bolus o por infusión lenta. Se presentan los siguientes ejemplos que permitirán a los expertos en el campo entender y poner en práctica más ciaramente la presente invención. No deben ser considerados como limitantes del ámbito de la invención, sino sólo como ejemplos ilustrativos y representativos de la misma. EJEMPLO 1 Construcción de los plásmidos I?B El DNAc que codifica para I?B humano de longitud completa (aminoácidos 1-317) se aisló de una biblioteca de DNAc obtenida de células endoteliales de vena umbilical humana (Stratagene, La Jolla, CA) mediante amplificación por PCR. La amplificación por PCR se realizó de conformidad con las condi-ciones indicadas por el fabricante (GeneAmp kit, Perkin El er, Norwalk, CT), empleando los siguientes oligonucleótidos cebadores (subrayados los sitios de restricción de endonucleasas ) : Directo 5' ccgcgtctagacagctcgtccgcgccatgttcc 3' (SEQ ID NO: 3) Reverso 5 ' ccaccaaattcatacaaatccatsttctttcaqcc 3 ' (SEQ ID NO: 4) Cada uno de los treinta ciclos de amplificación se realizó a 94 se durante 1 min (desnaturalización), 55 ?C durante 1,5 min ( anillamiento) , y 72 ?c durante 2 minutos (extensión). Este DNAc se ligó en el plásmido de expresión eucariota pBJneo (Lin y col., Science 249, 677-679 (1990)) tras- digestión con las endonucleasas de restricción EcoRI y Xbal, para producir el plásmido pI?B-fl. El mutante truncado I?B-NT (que codifica para los aminoácidos 46-317) se construyó por amplificación mediante PCR empleando como molde el plásmido que codifica para I?B humano de longitud completa. Las reacciones de PCR se realizaron (como se ha descrito anteriormente) utilizando los siguientes oligonucleótidos cebadores (subrayados los sitios de restricción de endonucleasas): Directo 5' ggctctagaatggtcaaggagctgcaggag 3' (SEQ ID NO: 5) Reverso 5 ' ccgccgaattcatacaagtccatgttctttcagcc 3 ' (SEQ ID NO: 6) El fragmento de 885 pb amplificado por PCR se digirió con los enzimas de restricción Xbal y EcoRI y se subclonó en el plásmido de expresión eucariota pBJneo para producir el plásmido pI?B-NT. Otros mutantes truncados de I?B con deleciones en el extremo carboxi se prepararon de un modo similar a como se ha descrito para I?B de longitud completa. Se empleó el mismo cebador directo con los siguientes cebadores reversos para la amplificación por PCR: I?B truncado Cebador I?B 1-289 cgcgaattcatagctctcctcatcctcactctc (SEQ ID NO: 7) I?B 1-280 cgcgaattccagcatctgaaggttttctagtgtc (SEQ ID NO: 8) I?B 1-266 cgcgaattcctgtatccgggtgcttgggcggcc (SEQ ID NO: 9) I?B 1-242 cgcgaattcatcagccccacacttcaacaggag (SEQ ID NO: 10) EJEMPLO 2 Construcción de los plásmidos de control y señalizadores La región promotora de la colagenasa B humana (nucleótidos -670 a +7) se amplificó por PCR a partir de DNA genómico humano. El DNA genómico humano se obtuvo a partir de una línea de células B humanas transformadas con el EBV empleando un kit disponible comercialmente (Turbogen, Invitro-gen) . La región promotora de la colagenasa B humana contiene un sitio de reconocimiento de NFKB (Sato y col., Oncogene 8:395 (1993)). La amplificación por PCR se realizó de conformidad con las instrucciones del fabricante como se ha descrito anteriormente, empleando los siguientes oligonucleótidos cebadores: 5' gcgaagcttctagaggctgctactgtcccctttactg 3' (SEQ ID NO: 11) 5' cgcgcatgccctccttgacaggcaagtgctgctc 3' (SEQ ID NO: 12) El DNA amplificado se digirió con las endonucleasas de restricción HindIII y Sphl y se ligó en el plásmido pSDK-LacZ (también llamado pSDK-LacZpA) que codifica para la ß-galactosidasa (Logan y col., Development 117, 905-916 (1993)), designándose este plásmido como pGelB. Los plásmidos 3X NF?B/LacZ (pNF?B/LacZ) humano, murino y murino mutante se prepararon por ligación de los siguientes oligonucleótidos en los sitios HindIII y Salí del plásmido pSDKLacZ-TK, que contiene el promotor mínimo de la timidina quinasa que dirige la expresión del gen señalizador LacZ: 3X NFKB humano: 5 ' age TTG GGG ATT TCC GAT CGG GAC TTT CCG ATC GGG GAT TTC CGA C CCC TAA AGG CTA GCC CCT AAA GGC TAG CCC CTA AAG GCA GCT 3' (SEQ ID NO: 13) 3x NFKB murino: 5 ' AGC TTG GGA CTT TCC GAT CGG GAC TTT CCG ATC GGG ACT TTC CGAC CCT GAA AGG CTA GCC CTG AAA GGC TAG CCC TGA AAG GCA GCT 3' (SEQ ID NO: 14) 3x NFKB murino mutante: 5 ' AGC TTC TCA CTT TCC GAT CCT CAC TTT CCG ATC CTC ACT TTC CGAG AGT GAA AGG CTA GGA GTG AAA GGC TAG GAG TGA AAG GCA GCT 3' (SEQ ID NO: 15) Se han subrayado los elementos de reconocimiento de NFKB.

La orientación de las secuencias insertadas se confirmó por análisis de la secuencia de DNA. EJEMPLO 3 Método de transfección y ensayo Se cultivaron células U20S (línea celular de osteosarco-ma, Número de Acceso de la ATCC HTB 96) en medio de McCoy 5A (Gibco/BRL Gaithersburg, MD) conteniendo un 10% de suero bovi-no fetal y penicilina/estreptomicina en incubadores a 37 se con un 5% de CO2. Las células se recogieron en fase de crecimiento logarítmico (70% de confluencia) por tratamiento con PBS conteniendo EDTA 2 mM. Tras la centrifugación y lavado, las células se resuspendieron en tampón PBS conteniendo Hepes (1,3 g/100 mi) a pH 7,0, 50 µg/ml de plásmido, y 107 célu-las/ml. La suspensión celular se incubó a 4 dc durante 30 minutos, y a continuación se electroporó a temperatura ambiente con un electroporador BioRad (Hercules, CA) con los párametros ajustados a 250 mV y 960 µF. A continuación se diluyeron las células por adición de 6 mi de medio de cultivo de tejidos y se cultivaron en microplacas Costar. El medio de cultivo se cambió tras 20 horas. Diez horas antes de la estimulación, el medio se reemplazó con medio OptiMEM (Gibco/BRL). Dieciocho horas antes del ensayo, se añadió 12-miristato 13-acetato de forbol (PMA) a la microplaca hasta una concentración final de 25 ng/ml. Tras lavar con medio PBS frío, las células se recogieron por raspado en 0,25 mi de PBS. Tras el lavado, las células se resuspendieron en 60 µl de una solución conteniendo sacarosa 0,25 M, Tris-HCl 10 mM pH 7,4, EDTA 10 mM. Las células se usaron mediante tres ciclos de congelación empleando un baño de hielo seco/etanol y descongelación a 37 se. Tras centrifugación para eliminar los núcleos y los restos celulares, el sobrenadante se recogió para efectuar el ensayo. La cantidad de proteína en el lisado celular se midió empleando el kit de determinación de proteína de Pierce (Rockford IL), siguiendo las instrucciones del fabricante. La actividad ß-galactosidasa en el lisado celular se midió empleando 4-metil-umbeliferil-ß- D-galactósido (MUG, Sigma #M1633) como substrato. Los ensayos se realizaron en microplacas de 96 pocilios, de conformidad con las instrucciones del fabricante. La cantidad de substrato hidrolizado tras la incubación con un lisado celular que contenía 5 µg de proteína (de 1 a 10 µl) se midió fluorométrica-mente empleando un fluorímetro CytoFluorlI (Millipore, Be-dford, MA). EJEMPLO 4 Inhibición de la activación de NFKB Este Ejemplo demuestra que I?B-NT inhibe la activación de NFKB en células U20S. Las células se co-transfectaron, siguiendo el Ejemplo 3, con plásmidos que codifican para formas completas o truncadas de I?Ba (pI?B-fl y pI?B-NT del Ejemplo 1), y con plásmidos con la secuencia señalizadora LacZ y el lugar de reconocimiento de NFKB humano (pNF?B/LacZ del Ejemplo 2). La cantidad de actividad LacZ dependiente de NFKB se midió en células no estimuladas y en células estimuladas con PMA. Como controles se utilizaron células transfectadas con pGelB, con el plásmido conteniendo el sitio de reconocimiento de NFKB mutado (Ejemplo 2), o con pCMV-LacZ ( sin respuesta a I?B), en lugar de con pNF?B/LacZ. La cantidad de actividad ß-galactosidasa medida se normalizó respecto a la cantidad de proteína en el lisado celular; los resultados se presentan en la Figura 2.

Se puede observar que las Lv-.ulas pGelB responden a la activación con PMA; tanto I?B-fl como I?-NT reducen esta respuesta significativamente. De un modo similar, la respuesta de las células designadas como 3X NFKB (pNF?B/LacZ) resulta sig-nificativamente atenuada por I?B-NT. La mayor inhibición observada con I?B-NT respecto a I?B-fl se atribuye a la resistencia a la degradación del primero. En ausencia de un sitio de reconocimiento para NFKB, no se produce expresión de LacZ y no se detecta actividad ß-gal. Se ha descrito que la expresión de CMV-LacZ es independiente de I?B. EJEMPLO 5 Este ejemplo demuestra que las muteínas I?B son resistentes a la proteólisis inducida por activación. La cantidad de proteína I?Ba completa o truncada en células U20S 0, 5 ó 15 minutos tras la activación se cuantificó por transferencia e inmunodetección con anticuerpos monoclonales anti-I?Ba. Las células U20S se transfectaron de forma transitoria con plásmidos que codifican para formas completas o truncadas de I?B. Se prepararon a continuación usados celulares y las proteínas se separaron por electroforesis en geles del poliacrilamida al 15% antes de la transferencia e inmunodetección. Para cada muestra, se electroporaron 10 células U20S con 50 µg de los plásmidos del Ejemplo 1. Se cultivaron en medio OptiMEM tras 36 horas, y después de 72 horas se estimularon con 50 ng/ml de TNF-a (Genzyme) durante 0, 5 ó 15 minutos. Las células se usaron seguidamente a 4 9C en tampón de lisis conteniendo Hepes 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, glicerol 10%, Tritón X-100 1%, EDTA 1 mM, MgCl2 1,5 mM, NaF 100 mM, pirofos-fato sódico 10 mM, PMSF 1 mM, ortovanadato sódico 1 mM, apro-tinina 10 µg/ml, leupeptina 10 µg/ml. Los usados se centrifu-garon para eliminar los restos celulares y los núcleos, y se cargaron 150 µg de proteína en cada carril de un gel SDS-PAGE al 15%. La transferencia e inmunodetección se llevó a cabo mediante el método ECL de conformidad con las instrucciones del fabricante. Se empleó anticuerpo anti-l?Ba/MAD-3 (Santa Cruz Biotechnology #SD-203) como primer anticuerpo para I?Ba completo y truncado en el carboxi terminal, y #SC-271 para I?B-NT. LOS resultados se muestran en la Figura 3. EJEMPLO 6 Este Ejemplo demuestra que los I?B truncados inhiben la actividad del promotor gelB. Se co-transfectaron células U20S con plásmidos conteniendo el gen señalizador LacZ (pGelB) y con formas completas o truncadas de I?Ba. Se midió a continuación la cantidad de actividad ß-galactosidasa en células no estimuladas o activadas con PMA. Los resultados se muestran en la Figura 4. Todos los I?B truncados inhiben la actividad NFKB, siendo I?B-NT el más activo. EJEMPLO 7 Construcción de vectores retrovirales episomales y producción de virus Se construyeron vectores de expresión retrovirales episomales conteniendo el I?B completo (pWZRneo-I?B) o truncado (pWZRneo-I?B-NT) , siguiendo el método de Kinsella y Nolan (Human Gene Therapy 7, 1405-1413 (1996)). El vector episomal se modificó del modo siguiente: LZRA-LacZ(A) se cortó con BspHl para generar un fragmento de 7,5 kb que contenía las secuencias de EBV EBNA-1 y ori. Se cortó pWZLneo con BspHl para eliminar las secuencias ampR y generar un fragmento de 5,48 kb. Los fragmentos de 7,5 y 5,48 kb se ligaron para generar un vector retroviral episomal híbrido de EBV conteniendo la resistencia a neomicina (pWZRneo). Cada vector se transfectó en la línea celular de empaquetamiento anfotrófica de título elevado 0 NX-A, como lo describen Kinsella y Nolan, supra, para generar tres líneas celulares productoras de retrovirus: 0-I?B/WT, 0-I?B/NT y 0-vector. EJEMPLO 8 Expresión basada en retrovirus de muteínas I?Ba en células endoteliales humanas Este Ejemplo demuestra que las muteínas I?B expresadas en células endoteliales humanas empleando un promotor retroviral son resistentes a la proteólisis inducida por activación. Se adquirieron células endoteliales microvasculares de pulmón humano (HLMVEC) a Clonetics, y se cultivaron en medio DMEM/F12 conteniendo un 5% de suero bovino fetal y 10 ng/ml de FGF en incubadores a 37 5C y con un 6,5% de C02. Se sobreexpresaron las muteínas I?B en HLMVEC mediante transfección retroviral como sigue. Se recogió el sobrenadante de un cultivo retroviral a partir de cada linea celular productora, y se transduje-ron HLMVEC cultivadas en frascos T-75 con 10 mi de sobrenadante de cultivo retroviral 0-I?B/WT, 0-I?B/NT o 0-vector, suplementado con 12 µg/ml de DEAE dextrano + 10 ng/ml de FGF. El medio de cultivo se cambió tras 16 horas y las células se expandieron en cultivo durante 1 semana post-infección antes de realizar los análisis. Se cuantificó mediante transferencia e inmunodetección la expresión de proteína I?Ba completa y truncada en HLMVEC transducidas ± activación. Se cultivaron HLMVEC transducidas en frascos T-75 hasta su confluencia y se incubaron seis horas con medio fresco ± 0,1 ng/ml de IL-1 y TNFa. Los usados celulares y la transferencia e inmunodetección se realizaron como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 5. Se empleó anticuerpo policlonal anti-I?Ba MAD-3 (Santa Cruz Biotechnology #SC-203) para detectar I?Ba completo, y SC-271 para I?B-NT.

Los resultados se muestran en la Figura 5. EJEMPLO 9 La muteína I?Ba inhibe los mediadores de la inflamación in vitro Este Ejemplo demuestra que la expresión estable de l?B truncados inhibe la inducción de moléculas de adhesión celular (ICAM, VCAM y e-selectina), así como las quimioquinas MCP-1 e IL-8 en células endoteliales microvasculares de pulmón humano (HLMVEC) activadas por citoquinas. Se cuantificaron ICAM, VCAM y e-selectina mediante un ELISA empleando anticuerpos monoclonales (R&D Systems, a-ICAM BBA-3, a-VCAM BBA5 y a-ELAM BBA2 ) del modo siguiente. Se cultivaron HLMVEC transducidas con construcciones retrovirales conteniendo control neo-vector 0-vector, o I?B 0-NT truncado en el N-terminal, en microplacas de 96 pocilios ± IL-l/TNF (0,1 ng/ml) durante seis horas. Las células se lavaron con PBS y se fijaron con formalina tampona-da al 4% durante 10 min, se lavaron 3 veces con PBS conteniendo BSA (albúmina sérica bovina) al 0,5% (PBSB) y se bloquearon con PBSB conteniendo suero de cabra normal al 10%. Se añadieron por triplicado anticuerpos monoclonales a los pocilios a 0,1 µg/ml durante 90 minutos, seguido de IgG de cabra anti-ratón conjugada con HRP durante 30 min. La inmunorreactividad se detectó empleando el substrato IPD y la variación en la DO se evaluó espectrométricamente (Molecular Dynamics). La expresión se presenta como el porcentaje de la respuesta máxima detectada en células control HLMVEC 0-vector estimuladas con citoquinas. Los resultados se muestran en la Figura 6. La expresión y secreción de IL-8 y MCP-1 se midió en medio condicionado derivado de células HLMVEC/0-vector o HLMVEC/0-NT cultivadas en placas de 24 pocilios ± IL-l/TNF (0,1 ng/ml). El medio condicionado se recogió a las 24 y 48 horas, y se detectaron los niveles de MCP-1 e IL-8 mediante ELISA (R&D Systems), siguiendo exactamente el protocolo descrito por el fabricante. Los resultados se muestran en la Figura 7. EJEMPLO 10 La muteína I?B-NT inhibe la inflamación in vivo Este Ejemplo demuestra que la aplicación tópica de I?B-NT inhibe la inflamación aguda inducida por complejo inmune en el pulmón de rata. Se construyeron plásmidos conteniendo un promotor de CMV y secuencias de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina que regulaban la expresión de I?Ba-NT o del gen señalizador cloranfenicol acetil transferasa (CAT). Se instilaron 100 µg del plásmido purificado a través de la tráquea en pulmones de rata empleando tubos PÍO conectados a una aguja de calibre 30. Veinticuatro horas después de la instilación del DNA plasmídico se indujo la inflamación del pulmón mediante la formación de un complejo inmune de IgG como se describe en Mulligan y col. (J. Clin. Invest. 88, 1396-1406). De forma resumida, se instilaron 300 µl de agua conteniendo 3 mg de BSA-IgG de conejo a través de la tráquea de ratas anestesiadas, seguido inmediatamente de una inyección endovenosa de 0,5 mi de PBS conteniendo 1 mg de BSA (vena caudal). El complejo inmune se formó en los pulmones, y la inflamación aguda se detectó 4-24 horas después por medición del influjo celular en el líquido de lavado bronquial (BAL) en los pulmones. Tras el sacrificio del animal, se instilaron los pulmones con 10 mi de PBS para lavar las células del BAL, y se cuanti-ficó el influjo celular contando el número total de células en alícuotas de 100 µl empleando un contador de células Coulter Cell Counter. En la Figura 8 se presentan los resultados a las 24 horas, en la que se puede observar que el recuento celular en BAL en los ratones tratados fue un orden de magnitud infe-rior al de los controles. La presente invención ha sido descrita en relación con las formas específicas derivadas, si bien debe entenderse por los expertos en el campo que pueden realizarse diversos cam-bios, y que pueden emplearse equivalentes en substitución, sin abandonar la verdadera esencia y ámbito de la invención. Adicionalmente, numerosas modificaciones pueden ser realizadas para adaptar una situación, material, composición de materia, proceso, etapa o etapas de proceso en particular al objetivo, esencia y ámbito de la presente invención. Se pretende que todas estas modificaciones entren dentro del ámbito de las reivindicaciones adjuntas. Todas las patentes y publicaciones citadas anteriormente son por este medio incorporadas por referencia.

LISTADO DÉ SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: F. HOFFMANN-LA ROCHE AG (B) CALLE: Grenzacherstrasse 124 (C) CIUDAD: Basilea (D) ESTADO: BS (E) PAÍS: Suiza (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): CH-4070 (G) TELÉFONO: 061 - 688 42 56 (H) TELEFAX: 061 - 688 13 95 (I) TELEX: 962292 / 965542 hlr ch (ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Formas truncadas de la pro- t.eína inhibidora kappa B (I?B), producción recombinante, y usos derivados. (iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 15 (iv) FORMA LEGIBLE POR COMPUTADOR: (A) MEDIO: Disquete (B) COMPUTADOR: Macintosh Apple (C) SISTEMA OPERATIVO: Sistema 7.1 (Macintosh) (D) SOFTWARE: Word 5.0 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:l: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 317 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADENA: (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (m) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 1 : . Met Phe Gln Ala Ala Glu Arg Pro Gln Glu Trp Ala Met Glu Gly Pro 1 5 10 15 Arg Asp Gly Leu Lys Lys Glu Arg Leu Leu Asp Asp Arg His Asp Ser 20 25 30 Gly Leu Asp Ser Met Lys Asp Glu Glu Tyr Glu Gln Met Val Lys Glu 35 40 45 Leu Gln Glu He Arg Leu Glu Pro Gln Glu Val Pro Arg Gly Ser Glu 50 55 60 Pro Trp Lys Gln Gln Leu Thr Glu Asp Gly Asp Ser Phe Leu His Leu 65 70 75 80 Ala He He His Glu Glu Lys Ala Leu Thr Met Glu Val He Arg Gln 85 90 95 Val Lys Gly Asp Leu Ala Phe Leu Asn Phe Gln Asn ?sn Leu Gln Glr. 100 105 110 Thr Pro Leu His Leu Ala Val He Thr Asn Gln Pro Glu He Ala Glu 115 120 125 Ala Leu Leu Gly Ala Gly Cys Asp Pro Glu Leu Arg Asp Phe Arg Gly 130 135 140 Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Cys Glu Gln Gly Cys Leu Ala Ser Val 145 150 155 160 Gly Val Leu Thr Gln Ser Cys Thr Thr Pro His Leu His Ser He Leu 165 170 175 Lys Ala Thr Asn Tyr Asn Gly His Thr Cys Leu His Leu Ala Ser He 180 185 190 His Gly Tyr Leu Gly He Val Glu Leu Leu Val Ser Leu Gly Ala Asp 195 200 205 Val Asn Ala Gln Glu Pro Cys Asn Gly Arg Thr Ala Leu His Leu Ala 210 215 220 Val Asp Leu G n Asn Pro Asp Leu Val Ser Leu Leu Leu Lys Cys Gly 225 230 235 240 Ala Asp Val Asn Arg Val Thr Tyr Gln Gly Tyr Ser Pro Tyr Gln Leu 245 250 255 Thr Trp Gly Arg Pro Ser Thr Arg He Gln Gln Gln Leu Gly Gln Leu 260 265 270 Thr Leu Glu Asn Leu Gln Met Leu Pro Glu Ser Glu Asp Glu Glu Ser 275 280 285 Tyr Asp Thr Glu Ser Glu Phe Thr Glu Phe Thr Glu Asp Glu Leu Pro 290 295 300 Tyr Asp Asp Cys Val Phe Gly Gly Gln Arg Leu Thr Leu 305 310 315 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 819 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: única (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNAc (Üi) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2: A7GGTCAAGG AGCTGCAGGA GATCCGCCTC GAGCCGCAGG AGGTGCCGCG CGGCTCGGAG 60 CCCTGGAAGC AGCAGCTCAC CGAGGACGGG GACTCGTTCC TGCACTTGGC CATCATCCAT 120 GAAGAAAAGG CACTGACCAT GGAAGTGATC CGCCAGGTGA AGGGAGACCT GGCCTTCCTC ISO AACTTCCAGA AC.AACCTGCA GCAGACTCCA CTCCACTTGG CTGTGATCAC CAACCAGCCA 240 GAAATTGCTG AGGCACTTCT GGGAGCTGGC TGTGATCCTG AGCTCCGAGA CTTTCGAGGA 300 AATACCCCCC TACACCTTGC CTGTGAGCAG GGCTGCCTGG CCAGCGTGGG AGTCCTGACT 360 CAGTCCTGCA CCACCCCGCA CCTCCACTCC ATCCTGAAGG CTACCAACTA CAATGGCCAC 420 ACGTGTCTAC ACTTAGCCTC TATCCATGGC TACCTGGGCA TCGTGGAACT TTTGGTGTCC 480 TTGGGTGCTG ATGTCAATGC TCAGGAGCCC TGTAATGGCC GGACTGCCCT TCACCTCGCA 540 GTGGACCTGC AAAATCCTGA CCTGGTGTAC CTCCTGTTGA AGTGTGGGGC TGATGTCAAC 600 AGAGTTACCT ACCAGGGCTA TTCTCCCTAC CAGCTCACCT GGGGCCGCCC AAGCACCCGG 660 ATACAGCAGC AGCTGGGCCA GCTGACACTA GAAAACCTTC AGATGCTGCC AGAGAGTGAG 720 GATGAGGAGA GCTATGACAC AGAGTCAGAG TTCACGGAGT TCACAGAGGA CGAGCTGCCC 780 TATGATGACT GTGTGTTTGG AGGCCAGCGT CTGACGTTA 819 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: única (D) TOPOLOGÍA: linear (ü) TIPO DE MOLÉCULA: DNAc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3: CCGCGTCTAG ACAGCTCGTC CGCGCCATGT TCC 33 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 35 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: única (D) TOPOLOGÍA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNAc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4: CCGCCGAATT CATACAAGTC CATGTTCTTT CAGCC 35 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: única (D) TOPOLOGÍA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNAc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5: GGCTCTAGAA TGGTCAAGGA GCTGCAGGAG 30 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 35 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: única (D) TOPOLOGÍA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNAc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6: CCGCCGAATT CATACAAGTC CATGTTCTTT CkGCC 35 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: única (D) TOPOLOGÍA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNAc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7: CGCGAATTCA TAGCTCTCCT CATCCTCACT CTC 33 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 34 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: única (D) TOPOLOGÍA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNAc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8: CGCGAATTCC AGCATCTGAA GGTTTTCTAG TGTC 34 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: única (D) TOPOLOGÍA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNAc (Üi) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9: CGCGAATTCC TGTATCCGGG TGCTTGGGCG GCC 33 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: única (D) TOPOLOGÍA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNAc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10: CGCGAATTCA TCAGCCCCAC ACTTCAACAG GAG 33 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 37 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: única (D) TOPOLOGÍA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNAc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11: GCGAAGCTTC TAGAGGCTGC TACTGTCCCC TTTACTG 37 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 34 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: única (D) TOPOLOGÍA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNAc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12: CGCGCATGCC CTCCTTGACA GGCAAGTGCT GCTC 34 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 88 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: única (D) TOPOLOGÍA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNAc (Üi) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13: AGCTTGGGGA TTTCCGATCG GGACTTTCCG ATCGGGGATT TCCGACCCCT60 AAAGGCTAGC CCCTAAAGGC TAGCCCCTAA AGGCAGCT 88 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 88 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: única (D) TOPOLOGÍA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNAc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14: AGCTTGGGAC TTTCCGATCG GGACTTTCCG ATCGGGACTT TCCGACCCTG60 AAAGGCTAGC CCTGAAAGGC TAGCCCTGAA AGGCAGCT 88 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 88 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: única (D) TOPOLOGÍA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNAc (iü) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15: AGCTTCTCAC TTTCCGATCC TCACTTTCCG ATCCTCACTT TCCGAGAGTG60 AAAGGCTAGG AGTGAAAGGC TAGGAGTGAA AGGCAGCT 88 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (22)

1. Reivindicaciones 1. Una proteína biológicamente activa que imite la actividad de I B inhibiendo la activación mediada por el factor nuclear kappa B (NFKB) de la respuesta inflamatoria, carac--terizada porque dicha proteína una forma truncada de I Ba.
2. 2. Una proteína biológicamente activa de la reivindicación 1 seleccionada del grupo consistente en ?(290-317), ?(281-317), ?(267-317), ?(243-317) y ?(l-44) de I?Ba con la secuencia SEQ ID NO : l .
3. 3 . Una proteína biológicamente activa de la reivindicación 1 como se define por SEQ ID NO : l ?( l-44 ) .
4. 4. Una secuencia de ácido nucleico que codif ica para una proteína de las reivindicaciones 1 a 3 .
5. 5 . Una secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 4 definida por SEQ ID NO : 2.
6. 6 . Un vector de expresión , caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 4 ó 5 unida funcionalmente a elementos reguladores necesarios para la expresión de dicha secuencia .
7. 7 . Un vector de la reivindicación 6 , caracterizado porque comprende adicionalmente un promotor inducible .
8. 8 . Un vector de las reivindicaciones 6 y 7 caracterizado porque es un plásmido .
9. 9 . Un vector de la reivindicac ión 8, caracterizado porque es el .plásmido pI?B-NT .
10. 10. Un anticuerpo contra una proteína de las reivindicaciones 1 a 3.
11. 11. Un proceso para la preparación de una proteína biológicamente activa de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque comprende: a) la transformación de una célula hospedadora con un vector de las reivindicaciones 6 a 9 b) el cultivo de la célula hospedadora bajo condiciones para la amplificación del vector y la expresión de la proteína; y c) recuperación de la proteína del medio de cultivo.
12. 12. Una proteína biológicamente activa de las reivindícaciones 1 a 3 como agente terapéuticamente activo.
13. 13. Una proteína biológicamente activa de las reivindicaciones 1 a 3 como agente terapéuticamente activo para el tratamiento del síndrome de distrés respiratorio del adulto, rechazo de aloinjertos, asma, artritis inflamatoria, vasculi-tis y restenosis.
14. 14. Un vector de expresión de las reivindicaciones 6 a 9 como agente terapéuticamente activo.
15. 15. Un vector de expresión de las reivindicaciones 6 a 9 como agente terapéuticamente activo para el tratamiento del síndrome de distrés respiratorio del adulto, rechazo de aloinjertos, asma, artritis inflamatoria, vasculitis y restenosis.
16. 16. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una proteína de las reivindicaciones 1 a 3 y un material transportador farmacéuticamente aceptable.
17. 17. El uso de una proteína biológicamente activa de las reivindicaciones 1 a 3 para la preparación de composiciones farmacéuticas .
18. 18. El uso de una proteína biológicamente activa de las reivindicaciones 1 a 3 para la preparación de composiciones farmacéuticas para el tratamiento del síndrome de distrés respiratorio del adulto, rechazo de aloinjertos, asma, artritis inflamatoria, vasculitis y restenosis.
19. 19. El uso de un vector de expresión de las reivindica-ciones 6 a 9 para la preparación de una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de las reivindicaciones 1 a 3.
20. 20. El uso de una secuencia de ácido nucleico de las reivindicaciones 4 y 5 para la producción de proteínas de las reivindicaciones 1 a 3.
21. 21. El uso de una secuencia de ácido nucleico de las reivindicaciones 4 y 5 para la producción de vectores de expresión de las reivindicaciones 6 a 9.
22. 22. Una proteina biológicamente activa de las reivindicaciones 1 a 3 siempre que esté preparada por un proceso como se reivindica en la reivindicación 11.