JP5385613B2 - 改善された色素上皮由来因子変異体及びその使用 - Google Patents
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Description
多くの免疫原を使用して、複数の改変リン酸化部位を含むPEDF変異体に特異的に反応する抗体を作製できる。組換え完全長PEDF変異体又はその断片を、抗体の作製に使用できる。本明細書中に記載したPEDF変異体タンパク質配列に由来する合成ペプチドもまた、抗体作製のための免疫原として使用できる(本明細書中の以下の実施例8を参照されたし)。組換えタンパク質は真核細胞又は原核細胞中で発現でき、免疫原として精製及び使用できる。天然に折りたたまれたタンパク質又は変性したタンパク質を、必要に応じて抗体の作製のために使用できる。モノクロナール抗体又はポリクロナール抗体のどちらかを作ることができる。
本発明は、抗血管新生活性を有するPEDF変異体、その断片、類似体又は融合タンパク質の治療的有効量及び医薬として許容しうる担体を含む、医薬組成物を提供し、該PEDF変異体、その断片、類似体又は融合タンパク質は、複数の改変リン酸化部位を含む。
本発明は、疾患及び障害、特に新血管形成を伴う疾患又は障害の治療法を提供する。本治療法はこれらを必要とする患者に、活性成分としてのPEDF供給源の治療有効量及び医薬として許容しうる担体を含有する医薬組成物を投与することを含む。本発明に従ったPEDF供給源は、PEDF変異体ポリペプチド、即ち、抗血管新生PEDF変異体、その断片、類似体又は融合タンパク質、本発明のPEDFポリペプチド変異体をコードする単離ポリヌクレオチド配列、本発明のPEDFポリペプチド変異体をコードする単離ポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター、及び本発明のPEDFポリペプチド変異体をコードする単離ポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを形質移入された宿主細胞を含む。
材料及び方法
試薬及び抗体
組換えヒトCK2(大腸菌(E.coli)で発現)は、Calbiochem(Darmstadt,Germany)より購入した。PKAの触媒サブユニットは記載(Beavo J.A.,et al.Methods in Enzymol.38C:299−308,1974)のように精製した。内皮マイトジェン(ECGS)は、Biomedical Technologies Inc.(Stoughton,MA,USA)より購入した。組換えヒトbFGF(大腸菌(E.coli)で発現)、ポリ−L−リシン(70〜150kDa)及びブタ腸由来ヘパリンは、Sigma(St.Louis,MI)より購入した。マトリゲルは、BD Biosciences(MA,USA)より購入した。制限酵素は、Roche(Manhemin,Germany)より購入した。PfuDNAポリメラーゼは、Promega(WI,USA)より購入した。PEDFに対するポリクロナール抗体は、Weizmann Institute of Scienceの抗体ユニットにより調製した。完全長ヒトPEDF cDNAはDr.N.Bouck(Northwestern University,Chicago,IL,USA)により提供いただいた。
ヒトY−79網膜芽腫細胞を、2mMのL−グルタミン及び15%の胎児ウシ血清を添加したMEMで成長させた。HEK−293T細胞は、10%FCSを添加したDEME F−12で培養した。HUVECは20%FCS、25μg/mlECGSマイトジェン及び5U/mlヘパリンを添加したM−199で成長させた。
Ser24及びSer114の領域並びにその変異を含み(Maik−Rachline,G.,et al.Blood:299−308,2005、及びWO2006/054278、この内容は参照により組み込まれる)、プラスミドの同じ断片のSer227に様々な変異を含む、HindIII及びKpnI消化断片(1−362bp)によって、三重変異体を作製した。これにより、以下のような三重変異体がもたらされた。
EEE変異体、S24、114Eインサートを消化pcDNA3−S227Eベクターに連結
AAE変異体、S24、114Aインサートを消化pcDNA3−S227Eベクターに連結
AAA変異体、S24、114Aインサートを消化pcDNA3−S227Aベクターに連結
EEA変異体、S24、114Eインサートを消化pcDNA3−S227Aベクターに連結
rPEDF又は変異体を担持する多様なプラスミドを、HEK−293T細胞に、リポフェクトアミン(LipofectAMINE)試薬を使用して導入し、分泌されたタンパク質をNi+2カラム上で記載のように精製した(Maik−Rachline,G.,et al.Blood:299−308,2005)。
plPEDFをヒトのクエン酸血漿(1L)から、9〜20%PEG切断、その後DEAE−セファセル(Sephacel)カラム(2.9×40cm)及びヘパリン−アガロースカラムによって先に記載のように(Maik−Rachline,G.,et al.Blood:299−308,2005)精製した。
リン酸化分析試料(40μl)はrPEDF、plPEDF又はrPEDF変異体(50μg/ml)のどれかを含んだ。CK2用:成分はCK2(4μg/ml)、グリセロール(2%)、NaCl(20mM)、β−メルカプトエタノール(0.1mM)、MgCl2(20mM)、[γ32P]−ATP(10μM)、ポリ−L−リシン(200nM)及びTris−HCl(50mM pH7.4)である。PKA用:PKAの純粋触媒サブユニット(2.5μg/ml)、MgCl2(10mM)、ヘパリン(50mg/ml)、[γ32P]−ATP(10μM)及びTris−HCl(50mM pH6.5)。反応は、30℃で45分間続けた。その後、煮沸したサンプルバッファーを加え、試料を10%SDS−PAGEに供した。
血清飢餓HUVECを多様なrPEDF変異体(10nM)を用いて15分処理した。刺激した後で、細胞を収穫し、タンパク質をSDS−PAGEにより分離し、リン酸化ERK及び一般的ERKを、ウェスタンブロットにより適切な抗体を使用し、記載のように検出した(Aebersold,D.M.,et al.Mol.Cell.Biol.24:10,000−10,015,2004)。
増殖は、先に記載したように(Oliver,M.H.,et al.,J.Cell Sci.92:513−518,1989)メチレンブルー試験によって測定した。簡潔にいえば、HUVECをゼラチンで被覆した24ウェル組織培養プレート(20×103細胞/ウェル)中の2.5%FCSを添加したM−199(0.5ml/ウェル)に播種した。様々なPEDFを、播種後直ちに四重に加え(すべて10nMで)、加湿インキュベーターで48時間インキュベートした。その後、細胞を4%緩衝化ホルムアルデヒド溶液で2時間固定化し、0.1Mホウ酸ナトリウムバッファーpH8.5で2回洗浄し、0.1Mホウ酸バッファー溶液に溶解した1%メチレンブルーを用いて20分染色した。過剰な染料を洗い流し、細胞結合染料を200μl/ウェルの0.1MのHClで溶出した。吸光度を595nmで、Wallac1420マルチラベルカウンターで読み取った。データをマイクロソフトのエクセルで、2.5%FCS培地における細胞増殖を対照として使用し、分析した。
ヒトY−79網膜芽腫細胞(ATCCより入手)を神経突起伸長に関して、先に記載したように(Becerra,S.P.,et al.,J.Biol.Chem.268:23148−23156,1993)試験した。Y−79細胞の懸濁液(2.5×105細胞/ml)の1mlをrPEDF又は様々なrPDF変異体(20nM)と共に2mMのL−グルタミン、抗生物質及び0.1%ITSを添加したMEM中でインキュベートした。培養7日後、細胞をポリ−D−リシン被覆プレートに移し、細胞の神経突起伸長を、様々な期間において顕微鏡により観察した。
氷上に保ったマトリゲル(0.5ml/マウス)を、表示の濃度のbFGFと、PEDF(20nM)と共に又はPEDFなしで混合し、記載のように8週齢のヌードマウスの脇腹に皮下注射した(Passaniti,A.,et al.,Lab.Invest.67:519−528,1992)。注射後マトリゲルは急速にプラグを形成した。7日目にマウスを屠殺し、マウスの皮膚を慎重に引き外し、無傷のプラグを露出させた。プラグを取り出し、固定し(4%ホルムアルデヒド)、パラフィンに包埋し、切片化した。切片を、ヘマトキシリン−エオジン(H&E)を使用して染色した。マトリゲルに染み込んだ内皮細胞/微細血管を、マッソントリクローム染色によって確認した。
PEDFのCK2によるリン酸化変異体はPKAの基質ではない。
CK2のリン酸化とPKAのリン酸化との相互作用が研究されてきた。第一段階として、各リン酸化が他のプロテインキナーゼに関する気質として働くPEDFの能力を変化させるかどうかを調べた。この目的のために、リン酸化セリンの負の電荷を、負に帯電したグルタミン酸残基で置換することによって模倣し、同時にセリンの非リン酸化状態をアラニンによって模倣したが、これはリン酸受容体として機能しなかった。CK2リン酸化変異体S24、114E(EE)を、PKAの純粋触媒サブユニット及びγ32P−ATPと共にインキュベートすることによってPKAによるリン酸化に供した。PKAによるリン酸化は多くの場合pH依存性なので、実験は異なるpHにおいて実施した。
PEDFの三重変異体の特性解析
本発明の発明者らは、循環血液から精製したPEDF(plPEDF)がCK2部位にリン酸塩を含み、更にそれほどではないがPKA部位にも含むことを先に示した(Maik−Rachline,G.et al.前掲;及び本明細書中の上記図1)。更に、本明細書中の上記の結果は、3つのPEDF部位が、まずPKAにより、次いでCK2により同時にリン酸化できることを示す(図1)。その発見を考慮すると、これら両方のキナーゼによるPEDFの同時リン酸化の効果を特性解析することが重要になった。したがって、一連の3部位変異体は、CK2及びPKAによるリン酸化部位、Ser24、114及び227を、以下のようにAla又はGluに置換することによって構築された:S24E114E227E(EEE)は、CK2部位及びPKA部位においてリン酸化を模倣する、S24E114E227A(EEA)は、CK2部位においてリン酸化を模倣するがPKA部位においては模倣しない、S24A114A227E(AAE)は、PKA部位においてリン酸化を模倣するがCK2部位においては模倣しない、S24A114A227A(AAA)は、CK2部位もPKA部位もリン酸化されないPEDFを模倣する(図2A)。関連部位において負の電荷を有する均一な分子集団を提供し、その結果リン酸化効果の正確な検出を可能にするので、部分的にリン酸化されたplPEDFではなく、Glu変異体を使用することが重要であった。非リン酸化分子の均一な集団を得られるので、リン酸化SerがAla残基に変異することは同様に重要であった。これは、S24、114E又はS24、114AのPKA部位並びにS227E及びS227Aの変異体におけるCK2部位に起こる、その分子の特性に部分的な影響を与えられるわずかなリン酸化とは異なる(Maik−Rachline,G.,et al.,前掲)。その変異体を、HEK293T細胞に完全長のヒトPEDFcDNA又は該変異体を形質移入することによって発現させ、Ni+2カラムで精製した。
ERK活性化に関するPEDF変異体の効果
PEDFの受容体はいまだ特定されていないが、この因子が、細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK)/マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)カスケードを含む多様な細胞内シグナル伝達プロセスを刺激できることが示された。PEDFの様々な三重変異体を更に特性解析するために、そのHUVECにおけるERK活性化効果を試験した。したがって、様々な変異体を血清飢餓HUVECに加え、ERKの活性を抗リン酸化ERK及び抗一般的ERK抗体を使用して確定した。
細胞増殖に関するPEDFの効果
PEDFが子宮内膜癌細胞の細胞増殖を阻害し、内皮細胞のアポトーシスを誘導することは先に示した。この実験のねらいは、HUVECの増殖に関するPEDF及びそのリン酸化変異体の効果を確定することであった。この目的のために、HUVECを24ウェル組織培養プレートに播種し、2.5%FCSを添加し、様々なPEDFを添加した又はPEDFなしの培地に48時間維持し、その後メチレンブルー試験(Oliver,M.H.,et al.J.Cell Sci.92:513−518,1989)によって増殖率を分析した。その条件の下で、rPEDFはHUVECの増殖を阻害し、中程度に伸長した(22%、図3C)が、血漿から精製したPEDF(plPEDF)の阻害効果は更に多く表れた(33%)。観察されたHUVECの増殖の阻害は、細胞がS24、114E変異体を用いて処理された場合、plPEDFによって観察された阻害と実に似ており、循環血漿中のPEDFのCK2部位は良好にリン酸化されることを再び示した(上記を参照されたし)。興味深いことに、細胞を、EEE変異体を用いて処理した場合、阻害のレベルはかなり上昇する(57%)のに対して、EEA変異体を用いて処理した細胞はS24,114E変異体を用いて処理した細胞と非常に似たふるまいをする(それぞれ27%及び33%)。一方、PKAリン酸化変異体のS227E及びAAEは、HUVECの増殖にほとんど効果がない。更に非リン酸化変異体、S24,114A及びS227Aを用いて処理した細胞は、rPEDFを用いて処理した細胞と同様の増殖のレベルを示したが、AAA変異体はHUVECの増殖についてわずかの効果のみ有した。したがって、その結果はHUVECの増殖の阻害はPEDFのリン酸化状態に依存することを示す。特に細胞増殖はCK2部位がリン酸化されたPEDFによって阻害され、この阻害はPKA部位の負の電荷をCK2部位の負の電荷に加えることで非常に増加する。
PEDF誘導性神経栄養活性に関する三重変異の効果
本発明者らは、CK2によるリン酸化がPEDFの神経栄養効果を有意に減少するが、PEDFのPKAによるリン酸化はPEDFの神経栄養効果に全く又は非常にわずかしか影響しないことを示した(Maik−Rachline,G.,et al.前掲)。本研究のねらいは、PEDFのPKA及びCK2部位へのリン酸塩の同時取り込みがPEDF変異体の能力を調節し、培養ヒト網膜芽腫Y−79細胞の分化を誘導するかどうかを調べることにあった。驚いたことに、EEE変異体を用いて処理した細胞(図4)が神経突起の伸長を示し、大型の凝集体を形成したが、EEA変異体は非常に小型の小さなコロナ様構造の形成を誘導し、その細胞からはどのような芽も突き出ず、S24、114E変異体を用いて処理した細胞と似た様式であった。Y−79細胞をPKAリン酸化部位変異体の227E及びAAEを用いて処理すると、異なる細胞表現型がもたらされ、コロニーは小型であったがそれらのプロセスは明確に観察された。その発見はCK2によるリン酸化はPEDFの神経栄養効果を有意に減少させるが、CK2によるリン酸化の上あるPKA部位にリン酸塩を加えると、PEDFの神経栄養活性が保存される。これはPKA部位のみがリン酸化されたPEDFの最小効果にかかわらず起こる。
インビボにおけるPEDF誘導性抗血管新生活性に関する三重のアミノ酸置換の効果
更なる調査のために、PEDFの機能に関するCK2及びPKAの両方によるリン酸化の効果、PEDFの抗血管新生活性に関する三重変異体の影響を、マトリゲルプラグアッセイを使用して確定した。
EEE三重変異体はDU145腫瘍異種移植片の成長を阻害する
EEE変異体は、マトリゲルプラグアッセイにおいて最も高いレベルの抗血管新生活性を示し、腫瘍異種移植片モデルに関するインビボのその効果を次に試験した。このねらいのために、DU145ヒト前立腺癌細胞懸濁液(100μl生理食塩水中に5×106細胞)を、5週齢のメスの胸腺欠損ヌードマウス(CD−1)の脇腹に皮下注射した。腫瘍を約1週間成長させ、その後マウスを腫瘍の大きさに関係なく無作為に2群に分けた。1群にEEE変異体で8μg/注射を皮下注射した(n=3)。他方の群は対照として使用し、PBSを皮下注射した(n=2)。腫瘍体積を、キャリパーを使用して、長さ×幅×奥行きを乗じることによって算出した。全ての処理を1週間に3回施し、腫瘍体積を週に2回観測した。結果を、各群の腫瘍体積対初めの大きさの増加倍率の平均によって表した。スチューデントt検定を使用して、処理群と対照群との腫瘍体積の平均増加倍率の差の統計的有意性を分析した(*P<0.05)。図8A〜Bに示したように、EEE変異体を用いたDU145異種移植片の処理により、腫瘍体積は有意に減少した。
抗CK2及び抗PKAリン酸化PEDFポリクロナール抗体の作製
抗リン酸化Ser24(α−pSer24;CK2部位)PEDFポリクロナール抗体を、アミノ酸配列:配列番号15に記述のLGHSSCQNPAS(リン酸化)PPEEGを有するヒトPEDFのアミノ酸14〜29に相当する、合成16mer−ペプチドに対してウサギ内で作製した。抗リン酸化Ser227(α−pSer227;PKA部位)PEDFポリクロナール抗体を、アミノ酸配列:配列番号16に記述のTKFDSRKTS(リン酸化)LEDFYLを有するヒトPEDFのアミノ酸219〜233に相当する合成15−merペプチドに対して作製した。更に抗PEDF(α−PEDF)ポリクロナール抗体を、アミノ酸配列:配列番号17に記述のKSLQEMKLQSLFDSPDFを有するヒトPEDFのアミノ酸327〜343に相当する17−merペプチドに対して作製した。ポリクロナール抗体の調製方法は、当分野では公知である(Harlow and Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual CSH Pressを参照されたし、その内容は、本明細書中に記述したことと同様に参照により組み込まれる)。
Claims (20)
- 色素上皮由来因子(PEDF)の抗血管新生変異体或いはその抗血管新生類似体、抗血管新生断片又は抗血管新生融合タンパク質であって、前記変異体は、24位、114位及び227位の位置での3つの改変リン酸化部位を有することのみにより配列番号1のヒトPEDFと異なっており、前記位置は、配列番号1にしたがって付番され、負に帯電したアミノ酸残基であり、前記類似体、断片又は融合タンパク質は、前記3つの改変リン酸化部位を含むことにより配列番号1のヒトPEDFと異なっており、前記類似体は、配列番号1と少なくとも95%の同一性を有する、上記変異体、類似体、断片又は融合タンパク質。
- 神経栄養活性を有する、請求項1に記載のPEDFの抗血管新生変異体、その類似体、融合タンパク質又は断片。
- 配列番号2に記載のアミノ酸配列又はその断片を含む、請求項1に記載のPEDFの抗血管新生変異体、その類似体、融合タンパク質。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載される色素上皮由来因子(PEDF)の抗血管新生変異体或いはその類似体、断片又は融合タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチド。
- 配列番号7又はその断片を含む、請求項4に記載の単離ポリヌクレオチド。
- 請求項4又は5に記載のPEDFの抗血管新生変異体或いはその類似体、断片又は融合タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項6に記載の、PEDFの抗血管新生変異体或いはその類似体、断片又は融合タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主細胞。
- 活性成分としての請求項1〜3までのいずれか一項に記載のPEDFの抗血管新生変異体、その類似体、融合タンパク質又は断片と、医薬として許容しうる担体とを含む医薬組成物。
- 活性成分としての請求項4又は5に記載の、PEDFの抗血管新生変異体或いはその類似体、融合タンパク質又は断片をコードする単離ポリヌクレオチドと、医薬として許容しうる担体とを含む医薬組成物。
- 活性成分としての請求項6に記載の、PEDFの抗血管新生変異体、その類似体、融合タンパク質又は断片をコードする単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、医薬として許容しうる担体とを含む医薬組成物。
- 活性成分としての請求項7に記載の、PEDFの抗血管新生変異体、その類似体、融合タンパク質又は断片をコードする単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主細胞と、医薬として許容しうる担体とを含む医薬組成物。
- 新血管形成を随伴する疾患及び障害を治療するための、請求項8〜11までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記新血管形成を随伴する疾患又は障害が、癌、眼疾患及び抗血管新生因子を用いて治療される障害からなる群より選択される、請求項12に記載の医薬組成物。
- 前記疾患又は障害が、非上皮性悪性腫瘍、上皮性悪性腫瘍、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング(Ewing’s)腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛腫、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス(Wilms’)腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、カポジ肉腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、希突起膠腫、髄膜腫、黒色腫及び神経芽細胞腫からなる群より選択される癌である、請求項13に記載の医薬組成物。
- 前記眼疾患が、血管新生緑内障、糖尿病性網膜症、網膜芽腫、水晶体後部線維増殖症、ブドウ膜炎、未熟児網膜症、黄斑変性症、角膜移植片新血管形成、網膜腫瘍及び脈絡膜腫瘍からなる群より選択される、請求項13に記載の医薬組成物。
- 前記抗血管新生因子により治療される障害が、血管腫、関節炎、乾癬、血管線維腫、動脈硬化性プラーク、血友病関節及び肥厚性瘢痕からなる群より選択される、請求項13に記載の医薬組成物。
- 前記PEDFの変異体、その類似体、融合タンパク質又は断片が、神経栄養活性を有する、神経変性症状を治療するための、請求項8〜11までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記神経変性症状が、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、重症筋無力症、運動神経障害、ギランバレー症候群、自己免疫性神経障害、ランバートイートン筋無力症候群、腫瘍随伴性神経疾患、腫瘍随伴性小脳委縮症、非腫瘍随伴性スティフマン症候群、進行性小脳委縮症、ラスムッセン脳炎、筋委縮性側索硬化症、シデナム舞踏病、トゥレット症候群、自己免疫性腺性内分泌障害、免疫不全性神経障害、後天性神経性筋硬直症、先天性多発性関節拘縮症、視神経炎及びスティフマン症候群からなる群より選択される、請求項17に記載の医薬組成物。
- 請求項1〜3までのいずれか一項に記載の、PEDFの抗血管新生変異体或いはその断片又は類似体をコードする単離ポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、前記変異体、断片又は類似体の発現を促進する条件下で培養すること及び前記変異体、断片又は類似体を回収することを含む、PEDFの抗血管新生変異体の作製方法。
- 前記宿主細胞が真核細胞である、請求項19に記載の方法。
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