KR20140125293A - 아이케이 인자 및 아이케이 인자를 코딩하는 핵산의 약학적 용도 - Google Patents

아이케이 인자 및 아이케이 인자를 코딩하는 핵산의 약학적 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아이케이 인자 또는 그 단편이나, 이들을 코딩하는 핵산이 삽입되어 있는 유전자 전달체를 유효 성분으로 함유하는 관절염 치료 및/또는 예방을 위한 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 유효 성분인 아이케이 인자 또는 그 단편 및 이들을 코딩하는 핵산은 생체 유래의 성분으로서, 장기간 투여에도 불구하고 부작용이 없어 안정성이 확보될 수 있으며, 관절염 치료의 상위 레벨의 작용 기전에 관여하여 효율적으로 관절염을 치료할 수 있을 것으로 예측된다.

Description

아이케이 인자 및 아이케이 인자를 코딩하는 핵산의 약학적 용도{PHARMACEUTICAL USE OF IK FACTOR AND NUCLEIC ACIDS ENCODING IK FACTOR}
본 발명은 생체 유래의 펩타이드 및 이를 코딩하는 핵산의 약학적 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 아이케이 인자 또는 그 단편 및/또는 이들을 코딩하는 핵산의 약학적 용도에 관한 것이다.
관절염(arthritis)은 하나 이상의 관절의 염증으로 인하여 관절의 경직 및 관절 주변의 지속적인 통증을 수반하는 질병이다. 관절염은 크게 급성 관절염과 만성 관절염으로 구분될 수 있다. 통풍성 관절염, 다발성 관절염, 류마티스성 관절염, 뼈나 관절의 노화로 인한 변형성 관절염과 같은 만성 관절염은 관절 부위에 지속적인 통증을 유발한다.
만성 관절염 중에서도 류마티스성 관절염(Rheumatoid arthritis)은 다발성 관절염을 특징으로 하는 원인 불명의 만성 염증성 질환이다. 현재까지 류마티스성 관절염에 대한 정확한 원인은 밝혀지지 않았다. 하지만, 일반적으로는 유전적 소인, 세균이나 바이러스 감염 등이 류마티스성 관절염의 원인으로 생각되고 있으며, 호르몬도 류마티스성 관절염에 관여하는 것으로 추측되고 있다. 류마티스성 관절염은 단순히 관절에만 영향을 미치는 것이 아니라 신체의 다른 기관에도 악영향을 미친다. 따라서 류마티스성 관절염이 유발된 환자는 손이나 발을 사용할 수 없거나 걷지 못할 뿐만 아니라, 피곤함과 불쾌감을 빈번하게 느끼게 된다. 더욱이 류마티스 관절염으로 인하여 체중 감소, 수면 부족 등의 증상이 초래되고, 류마티스성 관절염이 지속되면 근육의 약화 등 신체적 활동을 제한하여 개인적, 사회적 활동에 큰 영향을 미칠 수 있다. 류마티스성 관절염에 의하여 신체적 활동이 제한되는 경우, 비만 가능성이 증가하고, 콜레스테롤 수치로 인한 심장병을 초래할 수 있으며, 우울증을 야기할 수 있다.
류마티스서 관절염은 1년에 남자는 1,000명당 0.2명, 여자는 1,000명당 0.4명꼴로 발생하며, 전 세계적으로 류마티스성 관절염의 유병율은 0.4-1.4%로 비교적 고른 분포를 보이고 있다. 더욱이 노인 인구가 점차로 증가하면서 류마티스성 관절염 치료제 시장은 급격하게 성장할 것으로 예측되고 있다.
현재까지 류마티스성 관절염을 치료하기 위한 약품으로는 비스테로이드 항염제(nonsteroidal anti-inflammatory drug, NSAID); 스테로이드; 항말라리아제, 하이드록시클로로퀴논(hydroxychloroquinone, HCQ), 설파살라진(sulfasalazine), 메토트렉세이트(methotrexate, MTX), 레플루노마이드(leflunomide)와 같은 비생물학적 항류마티스 약제(non-biologic disease-modifying antirheumatic drug, DMARD); 종양괴사인자(tumor necrosis factor, TNF) 억제제나 IL-6 억제제와 같은 생물학적 항류마티스 약제가 사용되고 있다.
생물학적 항류마티스 약제로서, 에타너셉트(etanercept), 아달리무맙(adalimumab), 인플릭시맙(infliximab), 골로무맵(golomumab), 세르토리주맵(certolizumab)과 같은 종양괴사인자(TNF) 억제제; 토실리주맵(Tocilizumab)과 같은 IL-6 억제제; B-세포 제거제인 단일클론항체인 리툭시맵(Rituximab); 항원 제시세포와 T-세포 사이의 면역 반응을 차단하는 아바타셉트(Abatacept); 소분자 억제제로서 JAK(Janue activated kinase)를 선택적으로 차단하는 토파시티닙(tofacitinib) 등이 개발되었다.
하지만, 이들 류마티스성 관절염 치료제들은 대부분 심각한 부작용을 유발한다. 예를 들어, 비스테로이드 항염제는 위장관 부작용을 야기하고 있으며, 선택적 COX-2 억제제를 비롯한 비스테로이드 항염제는 심각한 심혈관계 부작용을 유발할 수 있다. 그 외에도 비스테로이드 항염제는 신장 기능 저하, 간질성 신염, 급성신부전 등의 부작용이 있는 것으로 알려져 있다. 스테로이드는 장기간 복용할 경우 시상하부-뇌하수체-부신 위축이 야기되어 부신 기능 부전이 발생할 수 있으며, 녹내장, 백내장, 골괴사, 골다공증, 고혈압, 저칼륨혈증 등의 부작용이 발생할 수 있다. 특히 비스테로이드 항염제나 스테로이드는 단지 염증을 완화시켜주는 것에 불과하기 때문에 실제 관절염의 진행을 억제하지 못하고, 관절 손상의 예방 효과가 미비하다는 단점이 있다.
한편 현재 개발된 항류마티스 약제는 조기 류마티스성 관절염의 진행 속도를 억제할 수는 있으나, 류마티스성 관절염을 완치시키지는 못하며 일부 부작용도 보고되고 있다. 예를 들어, 비생물학적 항류마티스 약제는 시력 장애, 망막 병변, 피부 발진, 간기능 수치 이상, 오심(메스꺼움) 등의 부작용이 있다. 또한, 생물학적 항류마티스 약제 중에서 종양괴사인자 억제제들은 혈액 이상, 심부전, 간 기능 이상 및 기회 감염이 문제가 되고 있으며, IL-6 억제제는 간기능 이상, 백혈구 감소 등의 부작용이 발생할 수 있다. 그 이외의 생물학적 항류마티스 약제는 감염의 문제와 종양 발생 가능성, 위장관 천공 및 고지혈증 등의 부작용이 보고된 바 있다.
특히, 대부분의 생물학적 항류마티스 약제들은 피하 투여나 혈관 주사를 통한 투여만 가능하다는 치명적 단점이 있고, 시간이 경과하면서 인체의 면역원성이 약품에 대한 반응 감소를 유발한다. 또한 현재 개발된 생물학적 항류마티스 약제는 전반적인 면역 시스템을 억제하는 결과 기회 감염 및 암 억제 등에 취약점을 노출하고 있다. 아울러, 이들 생물학적 항류마티스 약제는 상당히 고가이기 때문에 환자들에게 상당한 경제적 부담을 초래한다. 특히 기존에 사용되었던 대표적인 생물학적 항류마티스 약제인 항체는 적지 않은 류마티스성 관절염 환자에게 반응하지 않는 문제점이 대두되고 있다.
본 발명은 전술한 종래 기술의 문제점을 해소하기 위하여 제안된 것으로, 본 발명의 목적은 장기간 투여에도 불구하고 생체에 대한 부작용 및 독성이 없어 안전성이 담보되는 관절염을 치료 및/또는 예방하기 위한 약학적 조성물을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 효능 회피가 없으며, 저렴하게 대량으로 제조할 수 있어서 환자의 부담을 줄일 수 있는 관절염을 치료 및/또는 예방하기 위한 약학적 조성물을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 후술하는 발명의 해결 수단, 발명의 효과 및 예시적인 실시 형태의 개시 내용에 따라 더욱 분명해질 것이다.
본 발명은 약학적 유효량의 아이케이 인자(IK factor) 또는 아이케이 인자의 단편을 함유하는, 관절염을 치료 또는 예방하는 약학적 조성물을 제공한다.
하나의 예시적인 실시형태에서, 상기 아이케이 인자의 단편은 서열식별번호:4의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 또는 서열식별번호:4의 부분 펩타이드를 포함한다.
예를 들어, 상기 아이케이 인자의 단편은 서열식별번호:2의 아미노산 서열의 382번째 세린, 489번째 티로신 및 492번째 티로신 중에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 및 이들 선택된 아미노산의 인접 아미노산으로 구성되는 10개 이상의 아미노산을 가지는 펩타이드로 구성될 수 있다.
예시적으로, 상기 아이케이 인자의 단편은 서열식별번호:2의 아미노산 서열의 382번째 세린, 489번째 티로신 및 492번째 티로신으로 구성되는 적어도 하나의 아미노산이 인산화되어 있다.
하나의 선택적인 실시형태에서, 상기 아이케이 인자의 단편은 서열식별번호:2의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드의 단편으로서, 서열식별번호:2의 아미노산 서열의 382번째 세린 및 489번째 티로신 중에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 및 이들 선택된 아미노산의 인접 아미노산으로 구성되는 10개 이상의 아미노산을 가지는 펩타이드로 구성될 수 있다.
구체적인 실시 형태에서, 상기 아이케이 인자의 단편은 상기 선택된 아미노산의 N-말단과 C-말단으로 각각 2개 이상의 인접 아미노산이 연결되어 있는 10개 이상의 아미노산을 가지는 펩타이드로 구성될 수 있다.
예시적인 실시예에서, 상기 아이케이 인자의 단편은 서열식별번호:4, 서열식별번호:47, 서열식별번호:49로 구성되는 군에서 적어도 하나 선택되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드로 구성될 수 있다.
상기 아이케이 인자 또는 상기 아이케이 인자의 단편을 함유하는 약학적 조성물은 류마티스성 관절염을 치료하는데 사용될 수 있다.
예시적인 실시 형태에서, 상기 아이케이 인자 또는 상기 아이케이 인자의 단편은 상기 약학적 조성물 중에 1.0 ng/mL ~ 10 ㎍/mL의 농도로 함유될 수 있다.
또한, 본 발명은 아이케이 인자(IK factor) 또는 아이케이 인자의 단편을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 유전자 전달체를 함유하는, 관절염을 치료 또는 예방하는 약학적 조성물을 제공한다.
예를 들어, 상기 아이케이 인자의 단편을 코딩하는 핵산은 서열식별번호:3의 뉴클레오티드 서열을 가지는 핵산 또는 서열식별번호:3의 부분 핵산을 포함한다.
예시적인 실시형태에서, 상기 아이케이 인자의 단편을 코딩하는 핵산은 서열식별번호:1의 뉴클레오티드 서열의 1144-1146번의 뉴클레오티드 세트, 1465-1467번째 뉴클레오티드 세트 및 1474-1476번째 뉴클레오티드 세트 중에서 선택되는 적어도 하나의 뉴클레오티드 세트와, 이들 선택된 뉴클레오티드 세트의 인접 뉴클레오티드로 구성되는 30개 이상의 뉴클레오티드를 가지는 핵산으로 구성될 수 있다.
예시적인 하나의 실시 형태에서, 상기 아이케이 인자의 단편을 코딩하는 핵산은 서열식별번호:1의 뉴클레오티드 서열의 1144-1146번의 뉴클레오티드 세트 및 1465-1467번째 뉴클레오티드 세트 중에서 선택되는 적어도 하나의 뉴클레오티드 세트와, 이들 선택된 뉴클레오티드 세트의 인접 뉴클레오티드로 구성되는 30개 이상의 뉴클레오티드를 가지는 핵산으로 구성될 수 있다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 상기 아이케이 인자의 단편을 코딩하는 핵산은 상기 선택된 뉴클레오티드 세트의 5' 말단과 3' 말단으로 각각 6개 이상의 인접 뉴클레오티드가 연결되어 있는 30개 이상의 뉴클레오티드를 가지는 핵산으로 구성될 수 있다.
예시적인 실시예에서, 상기 아이케이 인자의 단편을 코딩하는 핵산은 서열식별번호:4, 서열식별번호:47 및 서열식별번호:49로 구성되는 군에서 적어도 하나 선택되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산으로 구성된다.
예를 들어, 상기 아이케이 인자의 단편을 코딩하는 핵산은 서열식별번호:3, 서열식별번호:46 및 서열식별번호:48로 구성되는 군에서 적어도 하나 선택되는 뉴클레오티드 서열을 가지는 핵산으로 구성될 수 있다.
상기 아이케이 인자 또는 상기 아이케이 인자의 단편을 코딩하는 핵산은 류마티스성 관절염을 치료하는데 사용될 수 있다.
예시적인 실시형태에서, 상기 아이케이 인자 또는 상기 아이케이 인자의 단편을 코딩하는 핵산은 상기 약학적 조성물 중에 1.0 ng/mL ~ 10 ㎍/mL의 농도로 함유될 수 있다.
예를 들어, 상기 유전자 전달체는 네이키드 핵산 분자, 플라스미드, 바이러스 벡터 및 상기 플라스미드 또는 상기 바이러스 벡터를 함유하는 리포좀 또는 니오좀의 형태를 가질 수 있다.
이때, 예시적으로 상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 레트로 바이러스, 렌티바이러스, 바큘로바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 백시니아 바이러스로 구성되는 군에서 선택될 수 있다.
또한 본 발명은 관절염 치료를 위한 아이케이 인자 또는 그 단편, 아이케이 인자 또는 그 단편을 코딩하는 핵산, 및/또는 이들 핵산을 가지는 벡터 또는 유전자 전달체에 관한 것이다.
또한 본 발명은 아이케이 인자 또는 아이케이 인자의 단편, 아이케이 인자 또는 그 단편을 코딩하는 핵산, 및/또는 이들 핵산을 가지는 벡터 또는 유전자 전달체를 치료학적 유효량, 또는 약학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 관절염을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 아이케이 인자 또는 그 단편 및/또는 이들 펩타이드를 코딩하는 핵산은 관절염, 예를 들어 류마티스성 관절염과 관련한 상위 단계(upstream level)의 반응 기전에 관여하여, 류마티스성 관절염의 진행을 억제한다.
본 발명에 따라 유효 성분으로 사용되는 아이케이 인자 또는 그 단편 및/또는 이들을 코딩하는 핵산은 관절염에 영향을 주는 면역세포들의 활성을 전반적으로 조절하는 인체 내의 면역 밸런스 조절 물질이기 때문에 안전성이 담보될 수 있다.
특히, 아이케이 인자 또는 그 단편은 인체 내에서 생성되는 내재성 물질로서 면역원성이 낮을 뿐만 아니라, 면역 세포의 전체 population에는 크게 관여하지 않으므로, 장기간 투여에도 부작용은 없을 것으로 예측된다.
또한 예를 들어 단일클론항체로 개발되고 있는 기존의 류마티스 관절염 치료제와 비교하여 훨씬 저렴한 비용으로 제조가 가능하다. 아울러, 기존 관절염 치료제가 가지고 있는 효능 회피의 문제점을 해소할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 아이케이(IK) 인자를 코딩하는 전장 핵산과, 이 전장 핵산의 N-말단 뉴클레오티드를 제외하고 C-말단의 뉴클레오티드만으로 구성된 절단 핵산 단편(tIK 핵산 단편)의 위치를 개략적으로 도시한 모식도이다. 도 1에서 "HA"는 헤마글루티닌(haemagglutinin) 태그(tag)를 나타낸 것이다.
도 2의 가장 윗 부분은 본 발명의 예시적인 실시 형태에 따라 전장 아이케이 인자를 코딩하는 뉴클레오티드를 기준으로 일부 뉴클레오티드가 절단된 핵산 단편(tIK 핵산 단편)을 구성하는 뉴클레오티드의 위치를 개략적으로 도시한 모식도이다. 도 2의 나머지 부분은 변이 아이케이 인자의 제작과 관련하여 전장 아이케이 인자의 예시적인 아미노산 서열을 기준으로 아이케이 인자의 생리적 기능에 관여하는 것으로 예측되는 활성 부위의 아미노산의 위치와 치환된 아미노산의 종류를 개략적으로 도시한 모식도이다. 도 2에서 "HA"는 헤마글루티닌(haemagglutinin) 태그(tag)를 나타낸 것이다.
도 3은 아이케이 인자의 절단된 핵산 단편(tIK 핵산 단편)과, tIK 핵산 단편의 일부 뉴클레오티드를 다른 뉴클레오티드로 치환한 돌연변이 핵산 단편(S382A, Y489F, Y492F, Y489492F, S382AY489492F)의 발현에 의하여, MHC class Ⅱ의 transactivator인 CIITA의 발현을 억제하는 상위 조절 인자인 CNOT1, CDCA3 및 MAPK1의 발현을 억제하는 정도를 측정한 그래프이다. 도 3에서 *는 네거티브 컨트롤에 비하여 P < 0.05를 의미하며, #는 야생형 tIK가 발현된 것에 비하여 돌연변이 핵산 단편이 발현된 경우 P < 0.05를 의미한다.
도 4a는 관절염이 자연적으로 유도되는 IL-1 Receptor antagonist knock-out (IL1RaKO) 마우스와, IL1RaKO 마우스와 본 발명에 따라 일부 절단된 아이케이 인자(tIK)가 발현된 transgenic 마우스를 교배하여 제작된 마우스(tIK-IL1RaKO)에서 시간 경과에 따른 관절염 지수를 측정한 그래프이다. 도 4a에서 *는 네거티브 컨트롤에 비하여 P < 0.05를 의미하고, **는 네거티브 컨트롤에 비하여 P < 0.01을 의미하며, ***는 P < 0.001을 의미한다.
도 4b는 IL1RaKO 마우스와 tIK-IL1RaKO 마우스에서 시간 경과에 따른 관절염 발병율을 측정한 그래프이다.
도 5는 관절염이 자연적으로 유도되는 IL1RaKO 마우스와, 본 발명에 따라 제작된 tIK-IL1RaKO 마우스의 관절 부위를 촬영한 사진이다.
도 6a는 관절염이 자연적으로 유도되는 IL1RaKO 마우스와, 본 발명에 따라 제작된 tIK-IL1RaKO 마우스 유래의 관절 조직을 H&E 염색법을 이용하여 측정한 결과를 도시하고 있다. 좌측은 관절 조직에 대한 현미경 사진이고, 우측은 관절 조직에서의 염증 정도를 분석한 그래프이다. 도 6a에서 *는 네거티브 컨트롤에 비하여 P < 0.05를 의미한다.
도 6b는 관절염이 자연적으로 유도되는 IL1RaKO 마우스와, 본 발명에 따라 제작된 tIK-IL1RaKO 마우스 유래의 관절 조직을 safranin O 염색법을 이용하여 측정한 결과를 도시하고 있다. 좌측은 관절 조직에 대한 현미경 사진이고, 우측은 관절 조직에서의 연골 침식 정도를 분석한 그래프이다. 도 6b에서 *는 네거티브 컨트롤에 비하여 P < 0.05를 의미한다.
도 7은 관절염이 자연적으로 유도되는 IL1RaKO 마우스와, 본 발명에 따라 제작된 tIK-IL1RaKO 마우스에서 관절 부위의 골 손상 정도를 촬영한 사진이다.
도 8a는 관절염이 자연적으로 유도되는 IL1RaKO 마우스와, 본 발명에 따라 제작된 tIK-IL1RaKO 마우스의 관절 부위의 염증성 사이토카인의 mRNA 발현 정도를 측정한 그래프이다. 도 8a에서 *는 네거티브 컨트롤에 비하여 P < 0.05를, **는 P < 0.01을 의미한다.
도 8b는 관절염이 자연적으로 유도되는 IL1RaKO 마우스와, 본 발명에 따라 제작된 tIK-IL1RaKO 마우스의 관절 조직을 염색한 뒤 염증성 사이토카인의 발현 정도를 촬영한 사진이다.
도 9는 관절염이 자연적으로 유도되는 IL1RaKO 마우스와, 본 발명에 따라 제작된 tIK-IL1RaKO 마우스의 혈청 내 염증성 사이토카인의 mRNA 발현 정도를 측정한 그래프이다. 도 9에서 **는 네거티브 컨트롤에 비하여 P < 0.01을 의미한다.
도 10a는 관절염이 자연적으로 유도되는 IL-1 Receptor antagonist knock-out(IL1RaKO) 마우스와, 본 발명에 따라 제작된 마우스(tIK-IL1RaKO)의 비장 세포에서 병인 T세포의 분화 정도를 살펴보기 위하여, 병인 T세포인 Th1세포의 양을 측정한 플롯 및 그래프이다.
도 10b는 관절염이 자연적으로 유도되는 IL-1 Receptor antagonist knock-out(IL1RaKO) 마우스와, 본 발명에 따라 제작된 마우스(tIK-IL1RaKO)의 비장 세포에서 병인 T세포의 분화 정도를 살펴보기 위하여, 병인 T세포인 Th17세포의 양을 측정한 플롯 및 그래프이다 .
도 11은 관절염이 자연적으로 유도되는 IL-1 Receptor antagonist knock-out (IL1RaKO) 마우스와, 본 발명에 따라 제작된 마우스(tIK-IL1RaKO)의 비장세포에서 대식세포 활성인자의 양을 측정한 그래프이다. 도 11에서 *는 네거티브 컨트롤에 비하여 P < 0.05를 의미한다.
도 12a는 본 발명에 따라 아이케이 인자의 활성에 관여하는 아미노산을 포함하는 펩타이드를 대식세포에 transfection한 뒤, 세포에서 염증성 사이토카인의 발현 정도를 측정한 그래프이다. 도 12a에서 *는 네거티브 컨트롤에 비하여 P < 0.05를, **는 P < 0.01을 의미한다.
도 12b는 본 발명에 따라 아이케이 인자의 활성에 관여하는 아미노산을 포함하는 펩타이드를 대식세포에 transfection한 뒤, 세포 배양액에서 염증성 사이토카인의 발현 정도를 측정한 그래프이다. 도 12b에서 **는 네거티브 컨트롤에 비하여 P < 0.01를 ***는 P < 0.001을 의미한다.
도 13a는 본 발명에 따라 아이케이 인자의 활성에 관여하는 아미노산을 포함하는 펩타이드를 주입한 야생형 마우스의 비장 세포에서 Th0 세포의 분화 정도를 분석한 플롯 및 그래프이다.
도 13b는 본 발명에 따라 tIK의 활성에 관여하는 아미노산을 포함하는 펩타이드를 주입한 야생형 마우스의 비장 세포에서 Th1 세포의 분화 정도를 분석한 플롯 및 그래프이다.
도 13c는 본 발명에 따라 tIK의 활성에 관여하는 아미노산을 포함하는 펩타이드를 주입한 야생형 마우스의 비장 세포에서 Th17 세포의 분화 정도를 분석한 플롯 및 그래프이다.
도 14a는 본 발명에 따라 아이케이 인자 유래의 펩타이드를 자연 발생 관절염 모델인 IL1RaKO 마우스에 주입한 뒤, 시간 경과에 따른 관절염 지수를 측정한 그래프이고, 도 14b는 해당 마우스에서의 시간 경과에 따른 관절염 발병율을 측정한 그래프이다.
도 15a는 본 발명에 따라 아이케이 인자 유래의 펩타이드를 자연 발생 관절염 모델인 마우스에 주입한 뒤, 해당 마우스의 비장 세포에서 Th17 세포의 분화 정도를 분석한 플롯 및 그래프이다. 도 15a에서 *는 네거티브 컨트롤에 비하여 P < 0.05를 의미한다.
도 15b는 본 발명에 따라 아이케이 인자 유래의 펩타이드가 주입된 자연 발생 관절염 모델인 마우스의 관절 조직을 염색한 뒤 염증성 사이토카인의 발현 정도를 촬영한 사진이다.
도 16은 3' 말단에 Fc tag 서열이 첨가된 절단된 아이케이 유전자 단편(tIK)을 Baculovirus 발현 시스템을 이용하여 곤충 세포에 주입한 뒤, 아이케이 인자가 발현되었는지를 확인한 SDS-PAGE 측정 사진이다.
도 17은 5' 말단에 HA tag 서열이 첨가된 절단된 아이케이 유전자 단편(tIK를 코딩하는 유전자 단편)을 아데노-연관바이러스에 삽입한 재조합 아데노-연관바이러스(tIK-AAV)에서 아이케이 인자가 발현된 것을 보여주는 웨스턴-블롯팅 결과이다.
도 18a는 절단된 아이케이 유전자 단편(tIK를 코딩하는 유전자 단편)이 삽입된 아데노-연관바이러스 벡터를 자연 발생 관절염 모델인 IL1RaKO 마우스에 주입한 뒤 시간 경과에 따른 관절염 지수를 측정한 그래프이고, 도 18b는 해당 마우스에서의 시간 경과에 따른 관절염 발병율을 측정한 그래프이다.
도 19는 5' 말단에 HA tag 서열이 첨가된 절단된 아이케이 유전자 단편(tIK)이 삽입된 플라스미드를 CHO 세포에 주입하고, CHO 세포에서 아이케이 인자가 발현된 것을 보여주는 웨스턴-블롯팅 결과이다.
본 발명자들은 생체에서 발현되는 사이토카인의 일종인 아이케이 인자(IK factor)의 새로운 기능을 연구하여, 아이케이 인자 또는 그 단편 및/또는 이들을 코딩하는 핵산을 갖는 유전자 전달체가 예를 들어 류마티스성 관절염과 같은 관절염의 진행을 억제한다는 점을 규명하여 본 발명을 완성하였다. 이하, 첨부하는 도면을 참조하면서 본 발명을 상세하게 설명한다.
정의
본 명세서에서 용어 "아미노산"은 가장 넓은 의미로 사용되고, 자연-발생 L-아미노산 또는 잔기를 포함하는 것으로 의도된다. 자연-발생 아미노산에 대해 통상적으로 사용되는 1- 및 3-문자 약어가 본 명세서에 사용된다(문헌 [Lehninger, Biochemistry, 2d ed., pp. 71-92, (Worth Publishers: New York, 1975]). 아미노산은 D-아미노산뿐만 아니라 화학적으로-변형된 아미노산, 예컨대 아미노산 유사체, 단백질에 통상적으로 혼입되지 않는 자연-발생 아미노산, 예컨대 노르류신, 및 아미노산의 특징인 것으로 당업계에 공지된 특성을 갖는 화학적으로-합성된 화합물을 포함한다. 예를 들어, 천연 페닐알라닌(Phe) 또는 프롤린(Pro)과 동일한 펩티드 화합물의 입체형태 제한을 허용하는 페닐알라닌 또는 프롤린의 유사체 또는 모방체가 아미노산의 정의 내에 포함된다. 이러한 유사체 및 모방체는 본 명세서에서 아미노산의 "기능적 균등물"로서 지칭된다. 아미노산의 다른 예는 문헌 [Roberts and Vellaccio, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Eds. Gross and Meiehofer, Vol. 5, p. 341(Academic Press, Inc.: N.Y. 1983)]에 열거되어 있다.
예를 들어, 표준 고체-상 합성 기술에 의해 합성된 합성 펩티드는 유전자에 의해 코딩되는 아미노산으로 제한되지 않으며, 이에 따라 주어진 아미노산에 대해 보다 광범위하게 다양한 치환을 허용한다. 유전자 코드에 의해 코딩되지 않은 아미노산은 본 명세서에서 "아미노산 유사체"로서 지칭되며, 예를 들어 WO 90/01940에 기재되어 있다. 예를 들어, 아미노산 유사체는 Glu 및 Asp에 대한 2-아미노 아디프산 (Aad); Glu 및 Asp에 대한 2-아미노피멜산 (Apm); Met, Leu 및 다른 지방족 아미노산에 대한 2-아미노부티르산 (Abu); Met, Leu 및 다른 지방족 아미노산에 대한 2-아미노헵탄산 (Ahe); Gly에 대한 2-아미노부티르산 (Aib); Val, Leu 및 Ile에 대한 시클로헥실알라닌 (Cha); Arg 및 Lys에 대한 호모아르기닌 (Har); Lys, Arg 및 His에 대한 2,3-디아미노프로피온산 (Dap); Gly, Pro 및 Ala에 대한 N-에틸글리신 (EtGly); Gly, Pro 및 Ala에 대한 N-에틸글리신 (EtGly); Asn 및 Gln에 대한 N-에틸아스파라긴 (EtAsn); Lys에 대한 히드록시리신 (Hyl); Lys에 대한 알로히드록시리신 (AHyl); Pro, Ser 및 Thr에 대한 3-(및 4-)히드록시프롤린 (3Hyp, 4Hyp); Ile, Leu 및 Val에 대한 알로-이소류신(AIle); Arg에 대한 4-아미디노페닐알라닌; Gly, Pro 및 Ala에 대한 N-메틸글리신 (MeGly, 사르코신); Ile에 대한 N-메틸이소류신 (MeIle); Met 및 다른 지방족 아미노산에 대한 노르발린 (Nva); Met 및 다른 지방족 아미노산을 위한 노르류신 (Nle); Lys, Arg 및 His에 대한 오르니틴 (Orn); Thr, Asn및 Gln에 대한 시트룰린 (Cit) 및 메티오닌 술폭시드 (MSO); 및 Phe에 대한 N-메틸페닐알라닌 (MePhe), 트리메틸페닐알라닌, 할로-(F-, Cl-, Br- 또는 I-)페닐알라닌 또는 트리플루오릴페닐알라닌을 포함한다.
본 명세서에서 용어 "펩타이드"는 자연적으로 존재하는 것으로부터 분리하였거나, 재조합 기술(recombinant technique)에 의하여 또는 화학적으로 합성된 단백질, 단백질 단편 및 펩타이드를 모두 포함한다. 예를 들어 본 발명의 펩타이드는 적어도 5개, 바람직하게는 10개의 아미노산으로 구성되어 있다.
특정 실시양태에서, 화합물의 변이체, 예컨대 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 펩타이드 변이체가 제공된다. 본 명세서에서 "펩타이드 변이체(peptide variants)"란 하나 또는 그 이상의 아미노산이 펩타이드의 아미노산 서열에 치환(substitutions), 결실(deletions), 첨가(additions) 및/또는 삽입(insertions)되어 있으면서, 원래의 아미노산으로 구성된 펩타이드와 거의 동일한 생물학적 기능을 발휘하는 것을 말한다. 펩타이드 변이체는 원래의 펩타이드와 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성(identity)을 가지고 있어야 한다. 이러한 치환체로서 "보존성"이라고 알려진 아미노산 치환제가 포함될 수 있다. 변이체는 또한 비보존성(nonconservative) 변화를 포함할 수도 있다. 하나의 예시적인 실시양태에서, 변이체 폴리펩타이드의 서열은 5개 또는 그 이하의 아미노산이 치환, 결실, 부가 또는 삽입됨으로서 원래의 서열과 달라진다. 변이체들은 또한 펩타이드의 면역원성(immunogenicity), 2차 구조(secondary structure) 및 수치료성(hydropathic nature)에 최소한의 영향을 주는 아미노산들의 결실 또는 부가에 의해 변화될 수 있다.
달리 언급되지 않는 한, 본 명세서에서"보존성" 치환이란 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되었을 때에도 폴리펩타이드의 2차 구조 및 수치료성(hydropathic nature) 등의 특성에 큰 변화가 없는 것을 의미한다. 이러한 보존성 치환과 관련하여 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대 극성(polarity), 전하(charge), 수용성(solubility), 소수성(hydrophobicity), 친수성(hydrophilicity) 및/또는 양친화성(amphipathic nature) 등의 유사성을 기초로 하여 얻어질 수 있다.
예를 들어 아미노산은 공통적인 곁사슬 특성에 따라 ⅰ) 소수성(류신, 메티오닌, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신) ⅱ) 중성 친수성(시스테인, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민), ⅲ) 산성(아스파르트산, 글루탐산), ⅳ) 염기성(히스티딘, 리신, 아르기닌), ⅴ) 쇄 방향에 영향을 미치는 잔기 (글리신, 프롤린), ⅵ) 방향족 (트립토판, 티로신, 페닐알라닌)으로 분류될 수 있다. 보존적 치환은 이들 각각의 클래스 중 하나의 구성원을 동일한 클래스의 다른 구성원으로 교환하는 것을 수반할 것이다.
아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 리신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글리신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글리신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스 (hydropathic idex)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 이소류신 (+4.5); 발린 (+4.2); 류신 (+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글리신 (-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 티로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루탐산 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르트산 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).
단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 리신 (+3.0); 아스파르트산(+3.0ㅁ1); 글루탐산(+3.0ㅁ1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글리신 (0); 트레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5 ㅁ 1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 리신(-1.8); 이소류신 (-1.8); 티로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4). 친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
본 명세서에서 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 교환 가능하게 사용되며, 임의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하고 DNA(예컨대 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함한다. 핵산 분자의 구성단위인 "뉴클레오티드"는 디옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드, 및/또는 그 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제(polymerase)에 의해, 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 당 또는 뉴클레오티드가 변형된 유사체(analogue), 예컨대 메틸화 뉴클레오티드 및 그 유사체를 포함할 수 있다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
뉴클레오티드에서의 변이는 단백질에서 변이를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈, 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다. 또한, 뉴클레오티드에서의 변이가 단백질 자체에 변화를 가져올 수도 있다. 단백질의 아미노산에 변화를 가져오는 변이인 경우에도 본 발명의 단백질과 거의 동일한 활성을 나타내는 것이 얻어질 수 있다.
본 발명의 아이케이 인자 및 그 단편 및/또는 이들을 코딩하는 핵산이 가지는 특징, 예를 들어 관절염을 치료하는 효과를 갖는 범위에서, 본 발명의 펩타이드 및 핵산 분자는 서열목록에 기재된 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열에 한정되지 않는다는 것은 통상의 기술자라면 쉽게 인식할 것이다. 예를 들어, 본 발명의 펩타이드에 포함될 수 있는 생물학적 기능 균등물은 본 발명의 펩타이드와 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이를 가지는 펩타이드일 수 있다.
일반적으로, 본 명세서상에 언급되어 있는 펩타이드들(융합 단백질 포함) 및 폴리뉴클레오티드들은 분리된(isolated) 것이다. "분리된(isolated)" 펩타이드 또는 폴리뉴클레오티드란 원래의 환경으로부터 제거된 것이다. 예를 들어, 자연 상태로 존재하는 단백질은 그 상태에서 함께 존재하는 물질들 전부 혹은 일부를 제거함으로써 분리되는 것이다. 이러한 폴리펩타이드는 적어도 90% 이상의 순도를 지녀야 하며, 바람직하게는 95%, 더욱 바람직하게는 99% 이상의 순도를 가져야 한다. 폴리뉴클레오티드는 벡터 내에서 클로닝 시킴으로써 분리된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "벡터"는 숙주세포에 전달이 가능하며 바람직하게는 하나 이상의 목적 유전자 또는 서열의 발현이 가능하도록 만들어진 구조물을 의미한다. 예를 들면 벡터에는 바이러스 벡터(viral vectors), DNA 또는 RNA 발현 벡터(expression vectors), 플라스미드(plasmid), 코스미드(cosmid) 또는 파지벡터(phage vectors), CCA(cationic condensing agents)와 연결된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포좀(liposomes)으로 포장된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 프로듀서 세포(producer cells)와 같은 특정 진핵세포(eukaryotic cells) 등이 포함된다.
본 명세서에서 "발현 조절 서열(expression control sequence)"은 핵산의 전사(transcription)를 조절하는 핵산 서열을 의미한다. 발현 조절 서열에는 구조 프로모터(constitutive promoter) 또는 유도 프로모터(inducible promoter)와 같은 프로모터 또는 인핸서(enhancer) 등이 있다. 발현 조절 서열은 전사될 핵산 서열에 연결되어 있다.
본 명세서에서 용어 "작동가능하게 결합된(operatively linked)"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "약학적 유효량" 또는 "치료학적 유효량"이란, 유효 성분인 펩타이드 또는 그 단편 및/또는 이들을 코딩하는 핵산의 효능 또는 활성을 달성하는데 충분한 양을 의미한다. 예를 들어 본 발명에 따른 펩타이드 또는 이들 펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 유전자 전달체를 함유하는 약학적 조성물은 류마티스성 관절염을 비롯하여, 통풍성 관절염, 다발성 관절염, 변형성 관절염과 같은 만성 관절염을 치료 및/또는 예방하는데 적용될 수 있다.
펩타이드 , 핵산 및 벡터
아이케이 인자(IK factor)는 항원을 CD4 T세포에 제시할 수 있는 항원제시세포(APC; antigen presenting cell) 표면의 주조직적합성 복합체 Ⅱ(MHC Ⅱ; Major histocompatibility complex Ⅱ)의 발현을 억제하는 사이토카인이다. 아이케이 인자는 cAMP를 활성화시켜, 바이러스 감염에 의해 유도된 인터페론-감마(IFN-γ, interferon-γ)에 의해 발현되는 MHC class Ⅱ의 발현을 억제하는 것으로 알려져 있다.
도 1에 예시적으로 도시된 것과 같이, 아이케이 인자(IK factor)를 코딩하는 전장-핵산은 N-말단(5' 말단) 영역에 Nuclear Localization Signal Sequence(NLS)와 trimeric coiled-coil motif를 지니고 있다. 또한 아이케이 인자를 코딩하는 전장 핵산의 C-말단(3' 말단) 영역에는 주로 핵단백질에서 발견되는 Arg(R)-Asp(D)와 Arg(R)-Glu(E) 서열이 반복되어 있는 RED domain과 3개의 NLS를 가지고 있다. 예시적으로 아이케이 인자를 코딩하는 전장-핵산은 서열식별번호:1로 표시되는 1,674개의 뉴클레오티드로 구성되는 폴리뉴클레오티드이다. 아이케이 인자는 서열식별번호:1의 마지막의 전사 종결 코돈을 제외하고 발현되어, 서열식별번호:2의 557개의 아미노산으로 구성될 수 있다. 다만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 본 발명에서 사용될 수 있는 아이케이 인자 및 이를 코딩하는 아이케이 핵산이 서열목록에 기재된 것으로 제한되지 않는다는 점을 인식할 것이다.
관절은 뼈와 뼈 사이에 활막, 연골, 뼈, 활액 등이 유기적으로 연결되어 있으며, 사이토카인을 통하여 서로 영향을 미치는 복합 조직이다. 관절 내에 만성 염증, 조직 괴사, 세포침윤, 신생혈관 생성, 관절 파괴 등의 현상은 류마티스 관절염의 주요한 병인으로 알려져 있다. 류마티스 관절염의 병인에 있어서 필수적인 병리 소견으로 알려져 있는 판누스라고 불리는 활막 조직은 관절 주위의 조직을 침범하여 골흡수가 유발된다. 판누스에는 항원제시세포와 T세포가 매우 높은 밀도로 관찰되는데, 이들 세포의 상호작용으로 인하여 T세포에 의해 유도되는 면역 반응의 시작과 확대가 일어나는 것으로 알려져 있다. 실제 류마티스 관절염 환자의 판누스에는 MHC class Ⅱ를 발현하는 항원제시세포가 많이 관찰되고, 같은 부위에 HLA-DR-양성 세포와 T세포가 위치한다. 따라서 류마티스 관절염을 치료를 위해서는 MHC class Ⅱ를 발현하는 항원제시세포와 T세포 사이의 상호작용을 억제하는 것이 효과적일 수 있다.
특히, 류마티스성 관절염의 병소인 활막 내에는 IL-17+ T세포 및 기능적으로 활성화된 IL-17이 존재한다. IL-17은 류마티스성 관절염 환자의 혈청에서 높게 검출되는데, 그 중에서도 IL-17A는 류마티스 관절염 환자의 활막세포 내 IL-1β와 IL-6의 발현을 유도한다. 관절염과 관련해서 IL-17은 연골세포와 조골세포 내 기질 생산을 억제하여 관절의 손상을 일으키고, 조직 재생이 결핍되게 한다. 또한 IL-17은 matrix metalloproteinases(MMPs)의 발현과 기능을 활성화시키고 종양괴사인자(TNF)와 함께 마우스 모델 내 비가역적인 연골손상을 일으킨다. 염증 반응에서 Th17세포와 활막세포와의 국소적인 상호작용을 통해 활막세포 내 MMP의 분비 및 IL-1β와 IL-6의 발현이 촉진된다. 골 파괴와 관련하여 IL-17은 조골세포 상에 receptor activator of NF-κB ligand (RANKL)의 발현을 증가시켜 파골세포(osteoclasts)내 RANK 신호를 증폭시킨다. 특히 RANKL을 발현하는 Th17세포는 파골세포 분화 과정에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에 따르면, 아이케이 인자 또는 그 단편을 코딩하는 핵산은 관절염의 진행을 억제, 예방할 수 있다. 특히 이들 핵산은 류마티스성 관절염과 관련한 사이토카인의 분비를 억제하고, 면역 세포의 분화를 차단한다.
또한 본 발명의 예시적인 실시 형태에서, 아이케이 인자의 단편, 예를 들어 N-말단이 절단된 단편(본 명세서에서 "tIK 인자" 또는 "tIK"로 약칭될 수 있다)을 코딩하는 핵산 단편(tIK 핵산 단편)은 적절한 발현 시스템에서 발현될 수 있다. 이들 핵산 단편이 발현되어, 관절염의 주요 증상의 하나인 염증 면역 반응에 관여하는 class Ⅱ MHC(MHC Ⅱ)의 발현을 억제한다. 구체적으로 본 발명의 예시적인 실시예에 따르면, 일부 뉴클레오티드가 절단된 tIK 핵산 단편 및/또는 그 중 일부 뉴클레오티드를 치환한 돌연변이 tIK 핵산 단편이 MHC Ⅱ의 발현에 관여하는 CIITA(class Ⅱ, major histocompatibility complex, transactivator)의 발현을 억제하는 상위 조절 인자인 CDCA3(Cell division cycle-associated protein 3), CNOT1(CCR4-NOT transcription complex subunit 1) 및 MAPK1(Mitogen-activated protein kinase 1)의 발현을 증가시킨다(도 3 참조). 또한 일부 뉴클레오티드가 치환된 돌연변이 tIK는 이러한 효과가 반감될 수 있는 것으로 보아 아이케이 인자 중의 특정 부위가 MHC Ⅱ의 상위 조절 인자의 발현에 관여하는 생리적 활성 부위라는 점을 확인하였다.
본 발명의 예시적인 실시형태에 따르면, 관절염이 자연적으로 유발되는 마우스(IL1RaKO)에 비하여, 아이케이 인자의 단편, 예를 들어 N-말단이 절단된 단편인 tIK를 발현하도록 유도된 전이 마우스(본 명세서에서 "tIK-IL1RaKO")에서 관절염의 유발 정도가 크게 감소하였다(도 4a, 도 4b 및 도 5 참조). 아울러, tIK-IL1RaKO 마우스의 관절 조직에서 염증의 유발 정도나 연골 손상 정도는 IK1RaKO 마우스의 관절 조직에서 훨씬 줄었으며(도 6a 및 도 6b 참조), 골 손상 정도도 크게 감소하였다(도 7 참조).
특히, tIK-IL1RaKO 마우스는 IL1RaKO 마우스에 비하여 관절 조직 및 혈청에서 관절염과 관련한 사이토카인의 분비가 크게 감소되어 있다. 구체적으로 절단된 아이케이 인자(tIK 인자)가 발현되도록 유도된 전이 마우스(tIK-IL1RaKO)는 자연적으로 관절염이 유발된 마우스(IL-1 antagonist-receptor knockout mouse, IL1RaKO 마우스)와 비교해서 관절 부위는 물론(도 8a 및 도 8b 참조), 혈청 내에서도 염증을 유발하는 사이토카인의 발현이 크게 감소한다(도 9 참조).
본 발명의 예시적인 실시예에서 아이케이 인자의 단편을 코딩하는 핵산은 적절한 발현 시스템을 통해 발현되어 관절염과 관련된 염증성 면역 반응에 관여하는 사이토카인인 인터류킨-1 베타(Interleukin-1 beta, IL-1β), 인터류킨-6(Interleukin-6, IL-6), 인터류킨-17(IL-7) 및 CCL2(Chemokine (C-C motif) ligand 2)로도 알려져 있는 monocyte chemotactic protein-1(MCP-1)의 발현을 억제한다. 이러한 결과는 아이케이 인자 또는 그 단편을 코딩하는 핵산을 적절한 벡터나 유전자 전달체를 통하여 인체에 주입하면 관절염의 진행을 억제할 수 있으며 특히 systemic 면역 반응에도 영향을 미칠 수 있다는 것을 의미한다. 뿐만 아니라, 아이케이 인자가 발현되도록 유도된 전이 마우스(tIK-IL1RaKO)는 자연적으로 관절염이 유발된 마우스(IL1RaKO) 마우스와 비교해서 관절염 병인 T세포의 분화를 억제하며(도 10a, 10b 참조), 대식세포의 활성인자에도 영향을 미친다(도 11 참조).
또한, 본 발명의 예시적인 실시형태에서 활성 부위를 포함하는 상대적으로 작은 크기의 아이케이 인자 단편, 예를 들어 활성 부위 및 이에 인접한 아미노산 10개 전후의 펩타이드도 관절염의 진행을 억제할 수 있다. 이들 펩타이드는 대식세포에서의 염증성 사이토카인인 종양괴사인자-알파(TNF-α), IL-6, IL-17의 발현을 억제하며(도 12a, 12b 참조 및 도 15b 참조), 관절염에 관여하는 병인 세포인 Th1세포 및 Th17세포의 분화를 또한 억제한다(도 13a 내지 도 13c 참조). 이들 펩타이드는 또한 자연발생 관절염 유발 마우스인 IL1RaKO 마우스에서 관절염을 억제할 뿐만 아니라(도 14a 및 14b 참조), 관절염 유발 마우스에서의 Th17세포의 분화를 억제한다(도 15a 참조).
예시적인 실시 형태에서 아이케이 인자 또는 그 단편을 코딩하는 핵산은 적절한 발현 시스템 또는 유전자 전달체를 이용하여 주입될 수 있는데, 관절염의 진행을 방지하거나, 유발된 관절염을 치료할 수 있다(도 19a 및 도 19b 참조).
전술한 것과 같이, 류마티스성 관절염과 관련해서 Th17세포의 분화에 따라 분비되는 IL-17이 중요한 역할을 수행한다. 본 발명에 따라 아이케이 인자 또는 그 단편 및/또는 이들을 코딩하는 핵산이 류마티스 관절염의 근본 원인으로 주목받고 있는 Th17세포의 분화를 억제한다는 점에서, 기존의 관절염 치료제와 비교해서 훨씬 효율적인 치료가 가능하다.
뿐만 아니라, 단일클론항체로 대표되는 대부분의 생물의약품은 인체에 주입하였을 경우에 면역 반응이 유발될 수 있다는 점과, 제조 과정이 복잡하기 때문에 상당히 고가로 판매된다. 이에 반하여, 본 발명에서 그 효능이 확인된 아이케이 인자는 인체에 내재하는 사이토카인이라는 점에서 면역 반응을 유발할 가능성이 거의 없어 안전하며, 상대적으로 저가로 제조가 가능하다.
따라서 본 발명은 관절염을 치료하기 위한 아이케이 인자 또는 그 단편에 관한 것이다. 관절염을 치료하기 위한 유효 성분으로서 바람직하게는 전장 아이케이 인자의 일부 아미노산이 절단된 아이케이 인자의 단편이며, 더욱 바람직하게는 전장 아이케이 인자의 N-말단의 아미노산이 절단된 단편이다.
예시적으로, 전장 아이케이 인자는 서열식별번호:2의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드일 수 있다. 아이케이 인자의 단편의 예시적인 형태로서 서열식별번호:2의 전장 아이케이 인자 중에서 N-말단을 구성하는 315개의 아미노산이 절단되어 있으며, C-말단의 242개의 아미노산을 가지는 서열식별번호:4의 아미노산 서열을 가지는 절단된 아이케이 인자(truncated IK, tIK)와 같은 펩타이드 또는 서열식별번호:4의 부분 펩타이드일 수 있다. 아이케이 인자의 단편의 일예로서, 전장 아이케이 인자를 구성하는 아미노산 중에서 N-말단이 절단된 펩타이드 단편은 상대적으로 크기가 작기 때문에 제조가 용이할 뿐만 아니라, 생체 내(in vivo) 및/또는 생체 외(ex vivo)에서 전장 아이케이 인자에 비하여 생물학적 기능을 발휘하는데 유리할 수 있다.
본 발명의 예시적인 실시예에 따르면, 서열식별번호:2의 펩타이드에서 382번째(서열식별번호:4의 펩타이드에서 67번째) 아미노산인 세린(S382), 489번째(서열식별번호:4의 펩타이드에서 174번째)아미노산인 티로신(Y489) 및/또는 492번째(서열식별번호:4의 펩타이드에서 177번째) 아미노산인 티로신(Y492)이 아이케이 인자 및/또는 그 단편의 생물학적 활성에 관여한다. 특히, 서열식별번호:2의 펩타이드에서 382번째 아미노산인 세린(S382) 및/또는 489번째 아미노산인 티로신(Y489)은 아이케이 인자 및/또는 아이케이 인자의 단편의 활성 부위인 것으로 예측된다.
따라서 서열식별번호:4의 아미노산 서열을 가지는 아이케이 인자의 단편 외에도, 이들 활성 부위의 아미노산을 포함하는 상대적으로 짧은 길이의 아이케이 인자의 단편이 사용될 수 있다. 예시적으로, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 아이케이 인자의 단편은 서열식별번호:2의 펩타이드에서 382번째 아미노산인 세린(S382), 489번째 아미노산인 티로신(Y489) 및 492번째 아미노산인 티로신(Y489) 중에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산과, 이들 선택된 아미노산의 인접 아미노산으로 구성되는 10개 이상, 예를 들어 100개 이상 또는 200개 이상의 아미노산으로 구성되는 펩타이드를 포함한다. 예시적인 실시 형태에서 아이케이 인자의 단편은 서열식별번호:2의 펩타이드에서 82번째 아미노산인 세린(S382), 489번째 아미노산인 티로신(Y489) 및 492번째 아미노산인 티로신(Y489) 중에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산과, 이들 선택된 아미노산의 인접 아미노산으로 구성되는 10개 이상 100개 이하, 바람직하게는 10개 이상 50개 이하, 더욱 바람직하게는 10개 이상 30개 이하의 아미노산으로 구성되는 펩타이드를 포함한다. 이들 선택된 아미노산들 중 적어도 하나의 아미노산은 인산화와 같이 변형된 아미노산일 수 있다.
예시적으로 본 발명에 따라 사용될 수 있는 아이케이 인자의 단편은 서열식별번호:2의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 또는 그 부분 펩타이드이다. 예시적인 실시 형태에서, 아이케이 인자의 단편은 서열식별번호:2의 펩타이드에서 382번째 아미노산인 세린 및 489번째 아미노산인 티로신 중에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 및 이들 선택된 아미노산의 인접 아미노산으로 구성되는 10개 이상, 예를 들어 10개 이상 100개 이하, 바람직하게는 10개 이상 50개 이하, 더욱 바람직하게는 10개 이상 30개 이하의 아미노산을 가지는 펩타이드이다.
예시적으로, 아이케이 인자의 단편으로 사용될 수 있는 펩타이드는, 서열식별번호:2의 펩타이드에서 382번째 아미노산인 세린(S382), 489번째 아미노산인 티로신(Y489) 및 492번째 아미노산인 티로신(Y492)과 같은 활성 아미노산이 펩타이드의 N-말단이나 C-말단에 위치하지 않을 수 있다. 활성 아미노산인 이들 선택된 아미노산이 펩타이드의 중간에 배열될 수 있도록, 이들 선택된 활성 아미노산의 N-말단과 C-말단으로 각각 2개 이상의 인접 아미노산이 연결되는 펩타이드가 사용될 수 있다. 예시적으로 활성 아미노산의 N-말단과 C-말단으로 각각 2 ~ 8개, 바람직하게는 3 ~ 7개 이상의 인접 아미노산이 연결될 수 있다. 예를 들어 활성 아미노산의 N-말단과 C-말단으로 각각 2 ~ 100개, 예컨대 3 ~ 70개, 바람직하게는 3 ~ 30개, 더욱 바람직하게는 3 ~ 20개의 인접 아미노산이 연결될 수 있다.
하나의 예시적인 실시형태에서, 아이케이 인자의 단편은 서열식별번호:2의 펩타이드에서 377번째 아미노산인 글루탐산 - 391번째 아미노산인 아스파르트산으로 구성되는 서열식별번호:47의 펩타이드 및/또는 484번째의 아미노산인 아스파르트산 - 496번째의 아미노산인 리신으로 구성되는 서열식별번호:49의 펩타이드를 또한 포함한다.
예시적인 실시예에 따라 서열식별번호:2의 전장 아이케이 인자가 557개의 아미노산으로 구성되며, 아이케이 인자의 N-말단이 절단되어 있는 서열식별번호:4의 아이케이 인자의 단편이 242개의 아미노산으로 구성된다. 이 점을 고려해 볼 때, 본 발명에 따른 아이케이 인자의 단편은 서열식별번호:2의 아미노산 중에서 최대 약 300~500개 정도의 아미노산으로 구성될 수 있다. 하지만, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 아이케이 인자의 단편이 이에 한정되지는 않는다.
또한, 예를 들어, 아이케이 인자 및/또는 아이케이 인자의 단편 중에서 S382, Y489 및 Y492와 같은 활성 아미노산을 제외하고, 나머지 아미노산들은 예를 들어 보존적 치환에 의하여 다른 아미노산으로 치환될 수 있으며, 필요한 경우에 일부 아미노산이 결실, 첨가 및/또는 삽입될 수 있다.
아이케이 인자 또는 그 단편인 펩타이드는 재조합 방법(recombinant means) 또는 화학적 합성을 통해 제조함으로써 분리될 수 있다. 예시적으로 본 명세서에 언급된 핵산 서열에 의해 발현되는(expressed) 펩타이드는 알려져 있는 많은 발현 벡터들 중 어느 것을 이용하든지 간에 공지의 방법으로 손쉽게 제조될 수 있다. 발현은 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 발현벡터로 형질전환된 적절한 숙주 세포(host cell) 내에서 실현될 수 있다. 적절한 숙주 세포에는 원핵세포들(prokaryotes), 효모(yeast) 및 진핵세포들(eukaryotes)이 포함된다. 대장균, 효모 또는 포유동물 세포주(Cos 또는 CHO 등의)를 숙주세포로 이용하는 것이 바람직하다. 단백질의 정제를 위해서는 먼저 수용성의 숙주/벡터 시스템에서 얻은, 배양액으로 분비된 재조합 단백질을 포함하는 상등액을 시판되는 필터를 이용하여 농축시킨다. 다음 단계로 상기에서 얻은 농축액을 친화 매트릭스(affinity matrix) 또는 이온교환수지(ion exchange resin) 등의 적절한 정제 매트릭스(purification matrix)를 이용하여 정제한다. 마지막으로 한 단계 또는 여러 단계의 역상(reverse phase) HPLC 를 수행함으로써 순수한 단백질을 얻을 수 있다.
100개 이하, 일반적으로는 50개 이하의 아미노산으로 구성된 단편이나 변이체들은 합성에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 이러한 폴리펩타이드들은 상용화되어 있는 고상 기법(solid-phase techniques), 즉 성장하는 아미노산 사슬에 순차적으로 아미노산을 부가시키는 메리필드 고상법(Merrifield solid-phase synthesis method)으로 합성할 수 있다(Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2146-2149). 폴리펩타이드의 자동 합성을 위한 장비는 공급사로부터 구입할 수 있으며, 공급자의 매뉴얼에 따라 조작이 가능하다.
예를 들어 미생물에서 발현되는 본 명세서에 기재된 펩타이드는 숙주 세포의 주변 세포질로 분비되고 그로부터 회수될 수 있다. 전형적으로, 단백질 회수는 일반적으로 삼투압 충격, 초음파처리 또는 용해와 같은 수단에 의해 미생물을 분쇄하는 것을 포함한다. 세포가 파괴되면, 세포 잔해 또는 전세포를 원심분리 또는 여과에 의해 제거할 수 있다. 단백질은 예를 들어 친화성 수지 크로마토그래피에 의해 추가로 정제할 수 있다. 대안적으로, 단백질을 배양 배지로 옮기고, 그로부터 분리할 수 있다. 세포를 배양물로부터 제거하고, 배양 상등액을 여과하고 농축하여 생산된 단백질을 추가로 정제할 수 있다. 발현된 폴리펩티드는 통상적으로 공지된 방법, 예컨대 면역친화성 또는 이온-교환 칼럼 상의 분별 증류; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 또는 양이온 교환수지, 예컨대 DEAE 상의 크로마토그래피; 크로마토포커싱; SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 예를 들어 세파덱스 G-75를 사용하는 겔 여과; 소수성 친화도 수지, 매트릭스 상에 고정화된 적합한 항원을 사용하는 리간드 친화도 및 웨스턴 블롯 검정을 이용하여 추가로 분리 및 확인될 수 있다.
아울러, 생산된 펩타이드는 추가의 검정 및 용도를 위해 실질적으로 균질한 제제를 수득하기 위해 정제될 수 있다. 당업계에 공지된 표준 단백질 정제 방법이 이용될 수 있다. 하기 절차는 적합한 정제 절차의 예이다: 면역친화성 또는 이온-교환 칼럼 상의 분별 증류, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 또는 양이온-교환 수지, 예컨대 DEAE 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, 및 예를 들어 세파덱스 G-75를 사용하는 겔 여과.
또한, 본 발명은 관절염을 치료하기 위한 아이케이 인자 또는 그 단편을 코딩하는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 펩타이드에서와 유사하게, 바람직하게는 전장 아이케이를 코딩하는 핵산의 일부 뉴클레오티드가 절단된 아이케이 핵산 단편이 바람직하고, 특히 바람직하게는 5' 말단의 뉴클레오티드가 절단된 아이케이 핵산 단편이다.
예시적으로 전장 아이케이 인자를 코딩하는 핵산은 서열식별번호:1의 뉴클레오티드 서열을 가지는 핵산일 수 있다. 예시적으로 아이케이 인자의 부분 단편을 코딩하는 핵산은, 서열식별번호:1의 핵산 중에서 5' 말단을 구성하는 945개의 뉴클레오티드가 절단된 서열식별번호:3의 뉴클레오티드 서열을 가지는 절단된 아이케이 인자를 코딩하는 핵산(tIK 핵산 단편) 또는 서열식별번호:3의 일부 뉴클레오티드로 구성되는 핵산일 수 있다.
서열식별번호:2의 펩타이드에서 382번째 아미노산인 세린(S382), 489번째 아미노산인 티로신(Y489) 및 492번째 아미노산인 티로신(Y492)은 각각 서열식별번호:1의 1144-1146(서열식별번호:3의 199-201)번째의 뉴클레오티드 세트, 서열식별번호:1의 1465-1467(서열식별번호:3의 520-522)번째의 뉴클레오티드 세트, 서열식별번호:1의 1474-1476(서열식별번호:3의 529-531)번째의 뉴클레오티드 세트에 의해 발현될 수 있다.
따라서 서열식별번호:3의 뉴클레오티드 서열을 가지는 아이케이 단편 핵산 이외에도, 상대적으로 짧은 길이의 뉴클레오티드로 구성되는 아이케이 단편 핵산이 또한 사용될 수 있다. 예시적으로 본 발명에 따른 아이케이 단편 핵산은, 서열식별번호:1의 1144-1146(서열식별번호:3의 199-201)번째의 뉴클레오티드 세트, 서열식별번호:1의 1465-1467(서열식별번호:3의 520-522)번째의 뉴클레오티드 세트, 서열식별번호:1의 1474-1476(서열식별번호:3의 529-531)번째의 뉴클레오티드 세트와, 이들 선택된 뉴클레오티드 세트에 인접한 30개 이상, 예를 들어 300개 이상 또는 600개 이상의 뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 예시적인 실시 형태에서 아이케이 인자의 단편을 코딩하는 핵산은, 서열식별번호:1의 1144-1146번째의 뉴클레오티드 세트, 서열식별번호:1의 1465-1467번째의 뉴클레오티드 세트, 서열식별번호:1의 1474-1476번째의 뉴클레오티드 세트와, 이들 선택된 뉴클레오티드 세트의 인접 뉴클레오티드로 구성되는 30개 이상 300개 이하, 바람직하게는 30개 이상 150개 이하, 더욱 바람직하게는 30개 이상 90개 이하의 뉴클레오티드로 구성되는 핵산을 포함한다.
예시적으로, 아이케이 단편 핵산은 서열식별번호:1의 뉴클레오티드 서열을 가지는 핵산 또는 그 부분 단편이다. 예시적인 실시형태에서 아이케이 인자의 부분 단편을 코딩하는 핵산은 서열식별번호:1의 뉴클레오티드 서열의 1144-1146번의 뉴클레오티드 세트 및 1465-1467번째 뉴클레오티드 세트 중에서 선택되는 적어도 하나의 뉴클레오티드 세트와, 이들 선택된 뉴클레오티드 세트의 인접 뉴클레오티드로 구성되는 30개 이상, 예를 들어 30개 이상 300개 이하, 바람직하게는 30개 이상 150개 이하, 더욱 바람직하게는 30개 이상 90개 이하의 뉴클레오티드를 가지는 핵산이다.
선택된 뉴클레오티드 세트가 폴리뉴클레오티드의 중간에 배열될 수 있도록, 이들 선택된 뉴클레오티드 세트의 5' 말단과 3' 말단으로 각각 6개 이상의 인접 뉴클레오티드가 연결될 수 있다. 예시적으로 선택된 뉴클레오티드 세트의 5' 말단과 3' 말단으로 각각 6 ~ 24개, 바람직하게는 9 ~ 21개 이상의 인접 뉴클레오티드가 연결될 수 있다. 예를 들어 선택된 뉴클레오티드 세트의 5' 말단과 3' 말단으로 각각 6-300개, 예컨대 9 ~ 210개, 바람직하게는 9 ~ 90개, 더욱 바람직하게는 9 ~ 60개의 인접 뉴클레오티드가 연결될 수 있다.
하나의 예시적인 실시형태에서, 아이케이 인자의 단편을 코딩하는 핵산은 서열식별번호:46의 뉴클레오티드 서열을 가지는 핵산 및/또는 서열식별번호:48의 뉴클레오티드 서열을 가지는 핵산일 수 있다. 예시적으로, 아이케이 인자의 단편을 코딩하는 핵산은 서열식별번호:1의 뉴클레오티드 중에서 최대 약 900 ~ 1500개 정도의 뉴클레오티드로 구성될 수 있지만, 본 발명이 이에 한정되지 않는다. 서열식별번호:2의 아미노산 중에서 382번째 아미노산인 세린(S382), 489번째 아미노산인 티로신(Y489) 및/또는 492번째 아미노산인 티로신(Y492)을 각각 코딩하는 서열식별번호:1의 1144-1146번째의 뉴클레오티드 세트, 1465-1467번째의 뉴클레오티드 세트 및/또는 1474-1476번째의 뉴클레오티드는 각각 세린과 티로신을 코딩하는 다른 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
본 발명에 따라 아이케이 인자 또는 그 단편을 코딩하는 핵산은 적절한 벡터 안에 포함될 수 있다. 벡터는 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 연결된 발현조절서열(expression control sequence)을 포함한다. 본 발명의 예시적인 실시형태에서, 벡터는 목적하는 다른 분자들을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하기도 한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 다른 폴리뉴클레오티드와 결합하여 융합 단백질을 코딩하기도 한다.
예시적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드들은 포유동물 세포내로 들어가서 발현되도록 조성되어 있다. 이러한 조성은 치료 목적에 사용하는 데에 특히 유용하다. 폴리뉴클레오티드를 숙주세포 내에서 발현시키는 데에는 많은 방법이 있으며 적절한 어느 방법도 사용 가능하다. 예를 들어 하나의 폴리뉴클레오티드는 아데노바이러스(adenovirus), 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 레트로 바이러스(retrovirus), 백시니아(vaccinia), 렌티바이러스(lentivirus) 바큘로바이러스(baculovirus) 또는 다른 폭스 바이러스(e.q., avian pox virus) 등의 바이러스 벡터에 삽입이 가능하다. DNA를 이러한 벡터에 삽입시키는 기술에 관해서는 이미 잘 알려져 있다. 레트로 바이러스 벡터에는 형질도입된 세포들의 확인 또는 선택을 쉽게 해 주는 선택 마커(selectable marker)에 대한 유전자 및/또는 특정한 타겟 세포에 대한 수용체 역할을 하는 리간드(ligand)를 코딩하는 유전자와 같은 타겟팅 부위(targeting moiety)를 부가적으로 삽입시킬 수 있다. 타겟팅은 또한 항체를 이용한 공지의 방법에 의해서도 이루어질 수 있다.
입수 가능하고 당업계에 공지된 다수의 벡터를 본 발명의 목적에 사용할 수 있다. 적절한 벡터의 선택은 주로 벡터에 삽입되는 핵산의 크기 및 벡터로 형질전환되는 특정한 숙주 세포에 따라 달라질 것이다. 각각의 벡터는 그의 기능(이종 폴리뉴클레오티드의 증폭 또는 발현, 또는 둘 다) 및 벡터가 존재하는 특정한 숙주 세포와의 상용성에 따라 다양한 성분을 함유한다. 벡터 성분은 일반적으로 복제 기점(특히 벡터가 원핵세포에 삽입되는 경우), 선택 마커 유전자, 프로모터, 리보솜 결합 부위 (RBS), 신호 서열, 이종 핵산 삽입물 및 전사 종결 서열을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
예를 들어, 본 발명의 재조합 벡터는 단백질의 발현에 영향을 미칠 수 있는 발현 조절 서열, 예를 들어, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서, 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 등을 포함할 수 있다. 폴리아데닐화 시그널은 전사체의 안정성을 증가시키거나 세포질 수송을 용이하게 한다. 인핸서 서열은 프로모터에서 다양한 부위에 위치하여 인핸서 서열이 없을 때의 프로모터에 의한 전사 활성과 비교하여, 전사 활성을 증가시키는 핵산 염기서열이다. 신호서열로서, 숙주가 에스케리키아(Escherichia) 속 균인 경우에는 PhoA 신호서열, OmpA 신호서열 등이, 숙주가 바실러스(Bacillus)속 균인 경우에는 α-아밀라아제 신호서열, 서브틸리신 신호서열 등이, 숙주가 효모인 경우에는 MF-α 신호서열, SUC2 신호서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 신호서열, a-인터페론 신호서열, 항체 분자 신호서열 등을 이용할 수 있으나, 본 발명이 이에 제한되지 않는다.
벡터의 한 유형은 추가의 DNA 절편이 그 내부에 라이게이션될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 파지 벡터이다. 또 다른 유형의 벡터는 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터는 그것이 도입된 숙주 세포 내에서 자율 복제가 가능하다(예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입시에 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 벡터가 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터가 본 명세서에서 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히, "재조합 벡터")로서 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다.
본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET 등), 파지 (예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1, λGEM.TM.-11 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시형태에서, 핵산은 바이러스 발현 시스템(백시니아 또는 다른 폭스 바이러스, 레트로 바이러스, 렌티바이러스, 바큘로바이러스, 아데노바이러스 또는 아데노-연관바이러스)을 이용하여 숙주 세포로 삽입된다. 예시적으로, 바이러스 벡터에는 HIV, SIV, 설치류 레트로 바이러스(murine retroviruses), 기본 백혈병 바이러스(gibbon ape leukemia virus), AAVs(adeno-associate viruses) 및 아데노바이러스(adenoviruses) 등에서 유래된 레트로 바이러스 벡터가 포함되나 여기에 한정되는 것은 아니다(Miller et al., 1990, Mol. Cell Biol. 10:4239; J. Kolberg 1992, NIH Res. 4:43; Cornetta et al., 1991, Hum. Gene Ther. 2:215). 설치류 백혈병 바이러스(murine leukemia virus, MuLV), 기본 백혈병 바이러스(gibbon ape leukemia virus, GaLV), 에코트로픽 레트로바이러스(ecotropic retroviruses), SIV(simian immunodeficiency virus), HIV(human immunodeficiency virus) 등에서 유래된 레트로 바이러스 벡터들이 널리 사용되고 있다(Buchscher et al., 1992, J. Virol, 66(5):2731-2739; Johann et al., 1992, J. Virol. 66(5):1635-1640; Sommerfelt et al., 1990, Virol. 176:58-59; Wilson et al., 1989, J. Virol. 63:2374-2378; Miller et al., 1991, J. Virol. 65:2220-2224; Rosenberg and Fauci 1993 in Fundermental Immunology, Third Edition, W. E. Paul(ed.) Raven Press, Ltd., New York and the references therein; Miller et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10:4239; R. Kolberg 1992, J. NIH Res. 4:43;Cornetta et al., 1991, Hum. Gene Ther.2:215).
구성적 또는 유도성 프로모터는 당업자에 의해 확인될 수 있는 특정한 상황의 필요에 따라 본 발명에 사용될 수 있다. 다양한 가능한 숙주 세포에 의해 인식되는 다수의 프로모터가 널리 공지되어 있다. 선택된 프로모터는 제한 효소 소화를 통해 공급원 DNA로부터 프로모터를 제거하고 단리된 프로모터 서열을 선택 벡터 내로 삽입함으로써 본원에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 시스트론 DNA에 작동가능하게 연결될 수 있다. 천연 프로모터 서열 및 다수의 이종 프로모터를 둘 다 사용하여 표적 유전자의 증폭 및/또는 발현을 지시할 수 있다. 그러나, 이종 프로모터는 일반적으로 천연 표적 폴리펩티드 프로모터와 비교하여 발현된 표적 유전자의 보다 큰 전사 및 보다 높은 수율을 허용하게 하기 때문에 바람직하다.
한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
또한, 본 발명의 재조합 벡터가 복제 가능한 발현 벡터인 경우, 복제가 개시되는 특정 핵산 서열인 복제원점(replication origin)을 포함할 수 있다. 또한, 재조합 벡터는 선택마커(selection marker)를 포함할 수 있다. 선택마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 본 발명의 벡터는 선택표지로서, 해당 기술분야에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다. 선택제(selective agent)로 처리된 환경에서 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하므로 형질전환된 세포를 선별 가능하다. 선택마커의 대표적인 예로써, 영양 요구 마커(auxotrophic marker)인 ura4, leu1, his3 등을 들 수 있으나 상기 예에 의해 본 발명에서 사용될 수 있는 선택마커의 종류가 제한되는 것은 아니다.
발현 벡터에 서브클론된 서열을 증폭시키는 여러 가지 시험관내 증폭 기법들(in vitroamplification techniques)이 알려져 있다. 이러한 기법에는 PCR(polymerase chain reaction), LCR(ligase chain reaction), Qβ-복제효소 증폭(replicase amplification) 및 다른 RNA 중합효소를 이용한 기법들이 있다(Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning-A Laboratory Manual(2nd Ed) 1-3; U.S. Patent No. 4,683,202; PCR protocols A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds. Academic Press Inc. San Diego, CA 1990. Improved methods of cloning in vitro amplified nucleic acids are described in U.S. Patent No. 5,426,039).
본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 펩타이드의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있고, 가장 바람직하게는 6x His이다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열 때문에, 숙주에서 발현된 단백질은 친화성 크로마토그래피를 통하여 신속하고, 용이하게 정제된다. 필요한 경우에 이들 펩타이드의 세포외 분비를 촉진할 수 있도록 Fc 절편을 코딩하는 서열이 융합될 수도 있다.
본 발명의 예시적인 실시형태에 따르면, 아이케이 인자 또는 그 부분 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 포함되어 있는 벡터에 의해 발현된 펩타이드는 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다. 예컨대, 글루타티온-S-트랜스퍼라제가 융합된 경우에는 이 효소의 기질인 글루타티온을 이용할 수 있고, 6x His이 이용된 경우에는 Ni-NTA His-결합 레진 컬럼 (Novagen, USA)을 이용하여 소망하는 펩타이드를 신속하고 용이하게 얻을 수 있다.
전술한 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있다. 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 이스트 (Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포(예컨대 SF9 세포) 및 사람 세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 벡터는 세포를 세포내외(in vivo , ex vivo) 또는 시험관 내(in vitro)에서 유전적으로 변형시키는데 이용될 수 있다. 세포를 유전적으로 변형시키는 방법으로는 세포를 바이러스 벡터로 감염 또는 형질도입 시키는 방법, 인산칼슘 침전법(calcium phosphate precipitation), 수용체 세포(recipient cells)를 DNA를 포함하는 세균 프로토플라스트(bacterial protoplasts)와 융합시키는 방법, 수용체 세포에 DNA를 포함하고 있는 리포좀(liposome) 또는 미세소구(microspheres)를 처리하는 방법, 엔도사이토시스(DEAE dextran, receptor-mediated endocytosis), 일렉트로포레이션(electroporation), 마이크로인젝션(micro-injection), 유전자 밤바드먼트 등을 포함한 여러 가지 방법이 알려져 있다.
약학적 조성물 및 투여
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 전술한 아이케이 인자 또는 그 단편의 치료학적 유효량; 및 필요에 따라 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 관절염 치료를 위한 약학적 조성물에 관한 것이다. 이 경우 아이케이 인자 또는 그 단편인 펩타이드는 피험자에게 직접 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 아이케이 인자 또는 그 단편을 코딩하는 핵산 분자를 가지는 유전자 전달체; 및 필요에 따라 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 관절염 치료를 위한 약학적 조성물에 관한 것이다. 유전자 전달체를 사용하는 것은 이른바 유전자 치료를 목적으로 하는 것이다.
따라서 본 발명은 전술한 아이케이 인자 또는 그 단편인 펩타이드 및/또는 아이케이 인자 또는 그 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 유전자 전달체를 유효 성분으로 함유하는 약학적 조성물 또는 이러한 유효 성분을 피험자에게 투여하는 단계를 가지는 관절염 치료 방법에 관한 것이다. 이때 유효 성분은 약학적 조성물 중에 1.0 ng/mL ~ 10 ㎍/mL의 농도로 함유될 수 있다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 화합물 및 치료상 불활성 담체, 희석제 또는 부형제를 함유하는 제약 조성물 또는 의약, 뿐만 아니라 이러한 조성물 및 의약을 제조하기 위해 본 발명의 화합물을 사용하는 방법을 제공한다. 한 예에서, 화합물은 생리학상 허용되는 담체, 즉 생약 투여 형태로 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성인 담체와 함께, 주위 온도, 적절한 pH에서, 원하는 정도의 순도로 혼합됨으로써 제제화될 수 있다. 제제의 pH는 주로 화합물의 특정한 용도 및 농도에 따라 달라지지만, 바람직하게는 약 3 내지 약 8의 범위이다. 한 예에서, 화합물은 pH 5에서 아세테이트 완충제 중에서 제제화된다. 또 다른 실시양태에서, 화합물은 멸균된다. 화합물은 예를 들어 고체 또는 무정형 조성물, 동결건조 제제 또는 수용액으로서 저장될 수 있다.
조성물은 우수한 의료 행위와 일치하는 방식으로 제제화, 투약 및 투여된다. 이와 관련하여 고려할 인자는 치료할 특정한 장애, 치료할 특정한 환자, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의료진에게 공지된 다른 인자를 포함한다.
필요한 경우, 지속-방출 제제를 제조할 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 화합물을 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드, L-글루탐산 및 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.
한 예에서, 용량당 비경구 투여되는 본 발명의 화합물의 제약 유효량은 하루에 환자 체중을 기준으로 약 0.01-100 mg/kg, 대안적으로 약 0.1 내지 20 mg/kg의 범위일 것이며, 사용되는 화합물의 전형적인 초기 범위는 0.3 내지 15 mg/kg/일이다. 또 다른 실시양태에서, 경구 단위 투여 형태, 예컨대 정제 및 캡슐은 바람직하게는 본 발명의 화합물의 약 5-100 mg을 함유한다.
본 발명에 따라 유효 성분으로 사용되는 화합물은 임의의 적합한 수단, 예를 들어 경구, 국소 (협측 및 설하 포함), 직장, 질, 경피, 비경구, 피하, 복강내, 폐내, 피내, 경막내 및 경막외 및 비강내, 및 원하는 경우에 국부 치료, 병변내 투여를 위한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다.
본 발명의 유효 성분인 화합물은 임의의 편리한 투여 형태, 예를 들어 정제, 분말, 캡슐, 용액, 분산액, 현탁액, 시럽, 분무제, 좌제, 겔, 에멀젼, 패치 등으로 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 제약 제제에 통상적인 성분, 예를 들어 희석제, 담체, pH 조정제, 감미제, 벌킹제 및 추가의 활성제를 함유할 수 있다.
전형적인 제제는 본 발명의 화합물과 담체 또는 부형제를 혼합하여 제조된다. 적합한 담체 및 부형제는 당업자에게 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Ansel, Howard C., et al., Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems. Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins, 2004; Gennaro, Alfonso R., et al. Remington: The Science and Practice of Pharmacy. Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins, 2000; 및 Rowe, Raymond C. Handbook of Pharmaceutical Excipients. Chicago, Pharmaceutical Press, 2005]에 상세히 기재되어 있다.
예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 제제는 또한 하나 이상의 완충제, 안정화제, 계면활성제, 습윤제, 윤활제, 유화제, 현탁화제, 보존제, 항산화제, 불투명화제, 활택제, 가공 보조제, 착색제, 감미제, 향료, 향미제, 희석제, 및 약물 (즉, 본 발명의 화합물 또는 그의 제약 조성물)의 멋진 외양을 제공하거나 제약 제품 (즉, 의약)의 제조에 도움이 되는 다른 공지된 첨가제를 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
생성된 조성물은 건조시키고, 과립화되고, 스테아르산마그네슘과 혼합되고, 통상의 장비를 이용하여 정제 형태로 압축된다. 에어로졸 제제의 예는, 예를 들어 5-400 mg의 본 발명 화합물을 적합한 완충 용액, 예를 들어 포스페이트 완충제에 용해시키고, 원하는 경우에 등장화제, 예를 들어 염화나트륨과 같은 염을 첨가함으로써 제조될 수 있다. 용액을 예를 들어 0.2 마이크로미터 필터를 사용하여 여과함으로써 불순물 및 오염물을 제거할 수 있다.
따라서 한 실시양태는 화합물 또는 그의 입체이성질체 또는 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 약학적 조성물을 포함한다. 추가 실시양태는 화합물 또는 그의 입체이성질체 또는 약학적으로 허용되는 염을 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 포함하는 약학적 조성물을 포함한다.
상술한 본 발명의 유전자 치료제는 목적의 핵산분자를 포함하는 유전자 전달체를 유효성분으로 포함한다. 유전자 전달체는 목적의 핵산분자를 운반 및 발현시키기 위하여 제작된 것으로서, 운반 객체인 목적의 핵산분자에 대한 상세한 내용은 위에 기재된 내용과의 중복기재를 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
유전자 전달체를 제조하기 위해, 목적의 핵산분자는 적합한 발현 컨스트럭트 (expression construct) 내에 존재하는 것이 바람직하다. 상기 발현 컨스트럭트에서, 목적의 핵산분자는 프로모터에 작동적으로 연결되는 것이 바람직하다. 본 명세서에서, 용어 "작동적으로 결합된"은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다. 본 발명에 있어서, 목적의 핵산 분자에 결합된 프로모터는, 바람직하게는 동물세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포에서 작동하여 목적의 핵산분자의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, CMV (cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터, 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, 암세포 특이적 프로모터 (예컨대, TERT 프로모터, PSA 프로모터, PSMA 프로모터, CEA 프로모터, E2F 프로모터 및 AFP 프로모터) 및 조직 특이적 프로모터 (예컨대, 알부민 프로모터)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 본 발명에 이용되는 발현 컨스트럭트는 폴리아데닐화 서열을 포함한다(예: 소성장 호르몬 터미네이터 및 SV40 유래 폴리아데닐화 서열).
유전자 전달체는 다양한 형태로 제작할 수 있는 데, 예시적으로 (ⅰ) 네이키드(naked) (재조합) DNA 분자, (ⅱ) 플라스미드, (ⅲ) 바이러스 벡터, 그리고, (ⅳ) 상기 네이키드 (재조합) DNA 분자 또는 플라스미드를 내포하는 리포좀 또는 니오좀의 형태로 제작할 수 있다. DNA가 네이키드 상태인 경우((Ulmer et al., 1993, Science 259:1745-1749; Cohen, 1993, Science 259:1691-1692), DNA는 생분해성 구슬(biodegradable beads)에 코팅됨으로써 세포내로 더욱 효율적으로 전달될 수 있다.
목적의 핵산 분자는 통상적인 유전자 치료에 이용되는 모든 유전자 전달 시스템에 적용될 수 있으며, 바람직하게는 플라스미드, 아데노바이러스(Lockett LJ, et al., Clin. Cancer Res. 3:2075-2080, 1997), 아데노-연관 바이러스 (Adeno-associated viruses: AAV, Lashford LS., et al., Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 레트로 바이러스 (Gunzburg WH, et al., Retroviral vectors. Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 렌티바이러스 (Wang G. et al.,J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999)), 헤르페스 심플렉스 바이러스 (Chamber R., et al., Proc. Natl.Acad. Sci USA 92:1411-1415, 1995), 백시니아 바이러스 (Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657, 1999), 바큘로바이러스 (King LA. and Possee RD., The Baculovirus Expression System, Springer, 1992), 리포좀 (Methods in Molecular Biology, Vol 199, S.C. Basu and M. Basu (Eds.), Human Press 2002) 또는 니오좀에 적용될 수 있다.
상술한 유전자 전달체를 세포내로 도입하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 본 발명에서, 유전자 전달체가 바이러스 벡터에 기초하여 제작된 경우에는, 당업계에 공지된 바이러스 감염 방법에 따라 실시된다. 바이러스 벡터를 이용한 숙주 세포의 감염은 상술한 인용문헌에 기재되어 있다.
본 발명에서 유전자 전달 시스템이 네이키드(naked) 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479, 1980); 및 Harland와 Weintraub, J. Cell Biol. 101:1094-1099, 1985)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al.,Virology, 52:456, 1973); 및 Chen과 Okayama, Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752, 1987), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J.,1:841, 1982; 및 Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718(1986)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87, 1980); Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190, 1982; 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176, 1987)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190, 1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572, 1990)) 방법에 의해 유전자를 세포내로 이입시킬 수 있다.
이하, 예시적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명이 하기 실시예에 기재된 발명으로 한정되지 않는다.
실시예 1 : 아이케이 인자 단편의 CIITA 상위 조절 인자 발현 측정
1) IK 인자의 활성 부위 선별
컴퓨터 프로그램을 사용하여 아이케이 인자의 활성 부위를 선별(screening)하였다. 웹사이트 http://scansite.mit.edu/motifscan_seq.phtml에서 제공하는 in silico program 'scanlite'에서 서열식별번호:3의 아이케이 인자의 절단된 단편(tIK) 아미노산 서열을 입력, 설정하여 선별하였다. 모든 모티프(motif) 분석 데이터는 SWISS-PROT 데이터베이스를 바탕으로 하였다. 하기 표 1에서 아이케이 인자의 활성 부위를 선별한 결과를 표시하고 있다. 표 1에서 score는 tIK의 해당 부위가 인산화효소(kinase)와 실제 상호작용할 가능성을 수치화한 것이고, percnetile은 SWISS-PROT 데이터베이스의 인산화효소 모티프들 중에서 tIK와 연관성을 가는 인산화효소 모티프가 상위 몇%에 해당하는지를 나타내는 수치이다. S382 부위와 Y482 부위는 high/medium/low stringency의 모든 선별 조건에서 제시된 모티프 후보이며, Y489 부위는 medium/low stringency 조건에서 제시된 모티프 후보이다.
아이케이 인자의 활성 부위 선별
Score percentile Motif Motif group site 서열
0.482 0.416% Aurora A
(AuroA)		 Baso_ST_kina S382 EKKRH S YFEKPKV
0.392 0.273% PKC epsion
(PKC-epsion)		 Baso_ST_kina S382 EKKRH S YFEKPKV
0.323 0.177% (PKA_kin)b Baso_ST_kina S382 EKKRH S YFEKPKV
0.408 0.163% Grb2 SH2
(Grb2_SH2)		 SH2c Y492 TQEEYSE Y MNNKEAL
0.574 0.378% InsR_Kind Y_Kine Y489 DFDTQEE Y SEYMNNK
0.484 0.638% Src_Kinf Y_Kine Y489 DFDTQEE Y SEYMNNK
a: Basophilic serine/threonine kinase; b: Protein Kinase A; c: Src homology 2 group; d: Insulin Receptor Kinase; e: Tyrosine kinase group; f: Src Kinase
2) 일부 뉴클레오티드가 절단된 핵산 단편의 설계
도 2에 개략적으로 도시한 것과 같이, 1)에서의 선별 결과를 토대로 tIK 핵산 단편 및 활성 부위의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환한 돌연변이를 갖는 변이 tIK 핵산 단편을 설계하였다. tIK 핵산 단편으로서 서열식별번호:3의 유전자 단편을 사용하였으며, kinase 모티프로서 tIK의 기능에 중요한 역할을 할 것으로 예측되는 아미노산(S382, Y489, Y492)을 구조적으로 유사한 아미노산으로 대체한 포인트 돌연변이 핵산 단편을 제작하였다.
서열식별번호:2의 아미노산 중에서 382번째 아미노산인 세린을 코딩하는 뉴클레오티드(서열식별번호:1의 뉴클레오티드 중에서 1144-1146번째 뉴클레오티드인 AGC)를 알라닌을 코딩하는 뉴클레오티드(GCC)로 치환한 돌연변이 유전자 단편(S382A)을 제작하였다. 또한, 서열식별번호:2의 아미노산 중에서 489번째 아미노산인 티로신을 코딩하는 뉴클레오티드(서열식별번호:1의 뉴클레오티드 중에서 1465-1467번째 뉴클레오티드인 TAC)를 페닐알라닌을 코딩하는 뉴클레오티드(TTC)로 치환한 돌연변이 유전자 단편(Y489F)과, 서열식별번호:2의 아미노산 중에서 492번째 아미노산인 티로신을 코딩하는 뉴클레오티드(서열식별번호:1의 뉴클레오티드 중에서1474-1475번째 뉴클레오티드인 TAC)를 페닐알라닌을 코딩하는 뉴클레오티드(TTC)로 치환한 이중 돌연변이 유전자 단편(Y492F)을 제작하였다.
동시에 서열식별번호:2의 아미노산 중에서 489번째 및 492번째 티로신을 코딩하는 뉴클레오티드를 페닐알라닌을 코딩하는 뉴클레오티드로 치환한 돌연변이 유전자 단편(Y489492F)과, 서열식별번호:2의 아미노산 중에서 382번째 세린, 489번째 및 492번째 티로신을 각각 알라닌과 페닐알라닌을 코딩하는 뉴클레오티드로 치환한 삼중 돌연변이 유전자 단편(S382AY489492F)을 제작하였다. 발현되는 단백질의 탐지, 분리 및 정제 등을 위하여 각각의 유전자 단편의 5' 말단에 HA-tag sequence(hemagglutinin sequence; 서열식별번호:54)를 첨가하였다. 본 실시예에서 사용된 tIK 핵산 단편과, 돌연변이 핵산 단편의 뉴클레오티드 서열은 하기 표 2에 표시되어 있다.
아이케이 핵산 단편 및 돌연변이 핵산 단편
단편 뉴클레오티드 서열 아미노산 서열 비고
tIK 서열식별번호:3 서열식별번호:4
S382A 서열식별번호:5 서열식별번호:6 Ser→Ala
Y489F 서열식별번호:7 서열식별번호:8 Tyr→Phe
Y492F 서열식별번호:9 서열식별번호:10 Tyr→Phe
Y489492F 서열식별번호:11 서열식별번호:12 Tyr→Phe
S382AY489492F 서열식별번호:13 서열식별번호:14 Ser→Ala; Tyr→Phe
tIK 단편 및 돌연변이 핵산 단편은 fusion PCR 법을 이용하여 증폭시킨 insert를 pcDNA 3.1 vector에 삽입하여 제작하였다. S382A 돌연변이의 경우, HA tag부터 tIK 핵산의 5' 부분과 상보적인 정방향 프라이머와, 382번째 serine을 alanine으로 치환 할 수 있도록 alanine을 coding할 수 있는 nucleotide 서열을 지니는 역방향 프라이머 세트를 제작하여 PCR에 이용하였다. 이 프라이머 세트를 이용하여 tIK 유전자를 template로 사용하여 HA tag부터 382번 alanine(Ala)에 이르는 첫 번째 절편을 증폭하였다. 이어서 382번째 serine을 alanine으로 치환할 수 있도록 alanine을 coding할 수 있는 nucleotide를 포함하는 정방향 프라이머와 tIK 유전자의 3'말단 부분에 상보적인 역방향 프라이머 세트를 제작하여 382번 alanine부터 tIK 핵산 말단에 이르는 두 번째 절편을 증폭하였다. PCR을 통해 얻은 두 가지 절편을 500 ㎕ micro tube에 각각 1㎕씩 넣은 후 HA tag부터 tIK 유전자의 앞부분에 상보적인 정방향 프라이머와 tIK 유전자의 말단 부분에 상보적인 역방향 프라이머를 1 ㎕씩 첨가 후 polymerase buffer와 dNTP, polymerase, distilled water를 첨가하여 fusion PCR을 진행하였다. PCR을 통해 얻은 증폭절편의 말단을 제한효소로 자른 뒤 pcDNA 3.1에 삽입하고 transformation함으로써 아미노산이 치환된 insert가 삽입된 플라스미드를 selection할 수 있었으며, 아미노산의 치환여부는 sequencing을 통해 최종적으로 확인하였다. 다른 돌연변이도 위와 같은 방법으로 제작하였다. 하기 표 3은 본 실시예에 따라 tIK 핵산 단편 및 돌연변이 tIK 핵산 단편의 증폭을 위해 사용된 프라이머 세트를 표시하고 있다.
tIK 핵산 단편 및 돌연변이 핵산 단편 증폭에 사용된 프라이머 세트
plasmid
(HA tagged)		 제 1 절편 프라이머 제 2 절편 프라이머
tIK - 정방향 : 서열식별번호:15a
- 역방향 : 서열식별번호:16b
S382A - 정방향 : 서열식별번호:17*
- 역방향 : 서열식별번호:19		 - 정방향 : 서열식별번호:20
- 역방향 : 서열식별번호:16
Y489F - 정방향 : 서열식별번호:18c
- 역방향 : 서열식별번호:21		 - 정방향 : 서열식별번호:22
- 역방향 : 서열식별번호:16
Y492F - 정방향 : 서열식별번호:17
- 역방향 : 서열식별번호:23		 - 정방향 : 서열식별번호:24
- 역방향 : 서열식별번호:16
Y489492F - 정방향 : 서열식별번호:18c
- 역방향 : 서열식별번호:25		 - 정방향 : 서열식별번호:26
- 역방향 : 서열식별번호:16
S382Y489492F S67A 절편과 Y174_177F 절편을 template로 함.
정방향 프라이머로 서열식별번호:18c을, 역방향 프라이머로 서열식별번호:16을 사용하여 세 곳이 mutation된 insert를 얻었음.
a: EcoRⅠ 인식 부위 포함; b: XhoⅠ 인식부위 포함; c: HindⅢ 인식부위 포함
MHC class Ⅱ의 발현을 촉진하는 class Ⅱ transactivator인 CIITA의 발현을 조절하는 상위 조절인자들의 mRNA 발현 정도를 통해 tIK 및 돌연변이 핵산의 기능을 확인하였다. CIITA의 발현을 조절하는 상위 조절인자로서 CNOT1(CCR4-NOT transcription complex subunit 1), CDCA3(Cell division cycle-associated protein 3), 및 MAPK1(Mitogen-activated protein kinase 1)을 선정하였다. 내재성 tIK를 가지고 있지 않은 human Raji B세포에 tIK가 삽입된 플라스미드를 transfection하는 경우, control vector를 transfection한 그룹에 비해 CIITA의 발현을 억제하는 인자들(CNOT1, CDCA3, MAPK1)의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다. tIK 핵산 단편은 CIITA를 억제하는 인자들을 증가시킴으로써 최종적으로 MHC class II의 발현 억제에 영향을 미치는 것이라고 생각되었다. 이와 같은 결과를 바탕으로 kinase motif를 다른 아미노산으로 치환한 tIK 돌연변이 핵산 단편에서도 이와 같은 현상이 나타나는지를 확인하였다.
구체적으로 tIK 돌연변이체인 S382A, Y489F, Y492F, Y489492F, S382AY489492F 단편이 각각 삽입된 플라스미드를 Raji B 세포에 electrophoration을 통해 transfection한 후 세포에서 RNA를 분리하여 cDNA를 제조하였다. tIK 핵산 단편이 삽입된 플라스미드를 또한 사용하였으며, 이들 핵산 단편이 삽입되지 않은 pcDNA 3.1 플라스미드를 각각 transfection하여 얻은 cDNA를 control 그룹으로 사용하였다. 제조한 cDNA를 이용해 quantitative real-time PCR을 수행하였으며, 측정된 결과 값 (Ct 값)은 2(-ΔΔ Ct ) method를 이용하여 pcDNA 3.1 플라스미드를 transfection한 그룹의 결과를 기준으로 하는 상대적인 값으로 계산하였다. CIITA의 발현을 조절하는 인자들(CDCA3, CNOT1, MAPK1)의 cDNA를 template로 사용하였으며, 이들 인자의 발현을 확인하기 위하여 사용된 프라이머 서열은 표 4에 표시되어 있다.
CIITA 조절 인자 정방향 프라이머 역방향 프라이머
CDCA3 서열식별번호:27 서열식별번호:28
CNOT1 서열식별번호:29 서열식별번호:30
MAPK1 서열식별번호:31 서열식별번호:32
본 실시예에 따라 CIITA의 발현을 조절하는 인자들의 발현을 측정한 결과는 도 3에 도시되어 있다. Negative Control vector인 pcDNA 3.1을 transfection한 그룹을 기준으로 하였을 때, tIK가 transfection된 그룹에서는 CIITA의 발현을 억제하는 인자인 CDCA3, CNOT1, MAPK1이 모두 증가되어 있는 것을 확인할 수 있다. 또한 Y492F, Y489492F, S382AY489492F는 돌연변이는 해당 서열 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되어, positive control인 tIK에 비하여 CIITA의 발현을 억제하는 인자의 발현이 감소하였다. 특히, S382와 Y489F 돌연변이는 tIK 발현으로 인해 증가했던 CIITA 발현 억제 유전자의 발현을 크게 감소시켰다. 따라서 전장 아이케이 유전자에서 382번째 및 492번째 아미노산이 특히 아이케이의 생리적 기능을 담당하는 활성 부위로 작용할 수 있다는 점을 확인하였다.
실시예 2 : IL -1 Receptor antagonist knock - out mice 및 IK Transgenic mice를 활용한 동물 모델 개발
관절염 유도 물질에 대한 감수성을 높이기 위해 면역학적으로 감수성이 높으며, 자발적으로 관절염이 생성되는 동물모델인 IL-1 receptor antagonist knock out mice (IL1RaKO, Balb/c 유래)와, 서열식별번호:3의 뉴클레오티드 서열을 가지는 절단된 아이케이 인자를 코딩하는 핵산(tIK 핵산 단편)을 발현시킬 수 있는 tIK-Transgenic mice (tIK, Balb/c 유래)를 cross-breeding시켜서 새로운 자가 면역 관절염 유발 동물 마우스(tIK-IL1RaKO) 모델을 개발하였다. Truncated IK(tIK)를 발현하는 transgenic mice를 제작하기 위하여 서열식별번호:3의 핵산이 삽입되어 있는 tIK-pcDNA 3.1 클론을 Balb/c female로부터 얻은 수정란에 micro-injection하였다. 이를 가임신기의 Balb/c female mouse의 자궁에 이식하여 착상시킨 후 3주 후 새끼를 얻었다. Cross-breeding을 통해 얻은 mice의 유전자를 얻기 위해 생후 3주 후에 꼬리를 0.3 mm로 자른 후 tail lysis buffer (pH8.0 Tris buffer 50mM, EDTA 50mM, 0.5% SDS in distilled water, 20mg/ml proteinase K)를 넣어 55℃ 항온수조에서 18시간 incubatoin하여 tail lysate를 얻었다.
이를 vacutainer에 옮기고 phenol/chloroform/isoamylalcohol(25:24:1)를 넣고 50회 inverting 후 원심분리(2000 rpm, 5 min, 실온)하여 genomic DNA를 제외한 나머지 debris를 제거하였다. 여기에 chloroform을 넣어 다시 한 번 inverting하고 원심분리(2000 rpm, 5 min, 실온)를 함으로써 genomic DNA층만을 분리하였다. 분리 후 얻은 투명한 상층액을 새로운 micro tube에 옮기고, 여기에 100% 에탄올을 첨가한 후 inverting 하여 하얀 실타래 모양의 genomic DNA를 얻었다. 이를 파이펫 팁으로 건져 올린 후 75% 에탄올을 이용하여 세척하고 10분 동안 air dry한 후 distilled water에 녹였다. tIK 핵산 단편이 삽입된 transgenic mouse에서 유래한 녹인 genomic DNA를 template로, tIK genotyping용 프라이머 세트(정방향 프라이머는 서열식별번호:33; 역방향 프라이머는 서열식별번호:34)를 이용하여 PCR 법으로 증폭하였다. 한편, IL1RaKO genotyping용 프라이머 세트(정방향 프라이머는 서열식별번호:35, 역방향 프라이머는 서열식별번호:36 및 37)를 이용하여 PCR 법으로 증폭한 후 두 가지 증폭 산물을 1% Agarose에 전기영동하여 증폭 정도를 비교하였다. 전기영동 결과를 토대로 두 가지 증폭 산물이 모두 확인된 경우를 cross-breeding을 통해 얻은 tIK-IL1RaKO double positive transgenic mice로 구분하였다.
실시예 3 : 자가면역 관절염 동물 모델을 이용하여 IK 의 효능 분석
실시예 2의 Cross-breeding을 통해 얻은 새로운 자가면역 관절염 동물모델인 tIK-IL1RaKO mice와 IL1RaKO mice를 대상으로 관절염의 유발 정도를 관찰하였다. 자연적인 상태에서 관절염이 유발 되는 정도를 비교하기 위하여, 4주령의 tIK-IL1RaKO mice 10수와 IL1RaKO mice 10수를 케이지에서 동일한 조건에서 사육하였다. 사육하는 동안 매 일주일마다 관절염의 정도를 마우스 발목 부위의 부종 정도로 확인하여 점수화하였다. 상세한 점수 개수 방법은 다음과 같다. 관절염 평가는 Rosoliniec 등에 의한 평균 관절염 지수(mean arthritic index)에 기준하여 기록하였으며, 한쪽 발목의 최대 점수를 4점으로 하고 mice의 네 개 발이 16점을 초과하지 않는 범위에서 1주일에 3회씩 모니터링을 지속적으로 진행하였다. 또한 모니터링 시기별로 관절염이 발생하는 정도를 %로 나타내어 발병률로 나타냈다. 도 4a는 관절염 지수를 측정한 그래프이고, 도 4b는 관절염의 발병률을 측정한 그래프이다. 또한 도 5는 각 군의 마우스에서 관찰된 관절 사진을 촬영한 사진이다. 도시된 것과 같이 tIK-IL1RaKO 마우스 그룹은 IL1RaKO 마우스 그룹에 비하여 유의미하게 낮은 관절염 지수를 나타냈으며, 발병율 역시 60% 이상 낮은 관절염 유발 정도를 보여주었다. 또한 마우스 발목 부위의 염증의 정도도 tIK-IL1RaKO 그룹이 IL1RaKO 그룹에 비해 상당히 완화되어 있는 것을 확인하였다.
실시예 4 : 마우스의 관절 부위 병인 상태 확인
관절염이 유도된 마우스 관절의 병인상태를 확인하기 위하여 관절염 자연 발생 그룹의 모니터링 16주차에 각 그룹(tIK-IL1RaKO 그룹; IL1RaKO 그룹)의 마우스를 부검하여 관절 부위를 얻었다. 관절 부위를 10% 중성 포르말린에 고정하고, 탈회 용액에 7시간 동안 침지하여 탈회하였다. 탈회된 관절 부위를 16시간에 걸쳐 수세하고, 탈수, 청명, 침투 과정을 거쳐 파라핀 블록(paraffin block)을 제조하였다. 절편 기기를 사용하여 파라핀 블록을 절단하여 7 ㎛ 절편을 만들고 슬라이드에 붙인 후 헤마톡실린과 에오진(hematoxylin & eosin, H&E) 염색을 하였다. H&E 염색의 과정은 다음과 같다. 파라핀 절편에서 파라핀을 제거(deparaffinization)한 후 함수 과정을 진행하고, 헤마톡실린으로 핵을 염색하였다. 이를 세척한 뒤, 에오진을 이용하여 세포질을 염색하였다. 이를 다시 탈수, 투명, 봉입 과정을 거쳐 최종적으로 발목 부분의 tarsal bone의 구조적 상태 및 다양한 면역세포들의 침윤을 광학현미경으로 확인하였다. 결과는 도 6a에 도시되어 있다. tIK-IL1RaKO 마우스 유래의 관절 조직은, IL1RaKO 마우스 유래의 관절 조직보다 tarsal bone의 구조적 변화가 작고 면역세포의 침윤이 덜 일어났다. 이를 통해 윤활관절부위의 염증(synovial inflammation)이 tIK-IL1RaKO 그룹에서 낮게 발생하였음을 확인할 수 있었다.
또한 safranin O 염색법을 통해 연골부위의 침식 정도(cartilage erosion)를 확인하였다. Safranin O 염색은 조직 절편의 deparaffinization 과정에 이어 함수 처리, 헤마톡실린 염색, safranin O 염색, fast green 염색, 탈수, 투명, 봉입의 과정을 거쳐 진행하였다. 결과는 도 6b에 도시되어 있다. 연골의 침식 정도는 염색된 부위의 색채 변화를 통해서 확인할 수 있는데, IL1RaKO 유래의 관절 조직은 연골이 상당부분 파괴되어 있으나 tIK-IL1RaKO 유래의 관절의 조직에서는 연골부분이 양호하게 유지되어 있음을 확인하였다.
실시예 5: 관절염에 의한 골 손상 정도 분석
관절염이 유도된 마우스에서 염증으로 인하여 손상된 뼈 부분을 IL1RaKO 그룹과 tIK-IL1RaKO 그룹에서 비교분석하기 위하여 관절염 자연발생 그룹의 모니터링 16주차에 각 그룹별 마우스를 부검하여 관절 부위를 얻었다. 조직을 10% 중성 포르말린에 18시간 고정 후 skyscan1172 장비를 이용하여 micro-CT를 촬영하였다. 50kV, 200uA의 X-ray source를 이용하고, 0,5mm의 필터를 사용하여 15μm의 픽셀 해상도로 조직의 단면영상을 촬영하였다. IL1RaKO 마우스 유래의 관절은 염증으로 인해 뼈가 많이 손상되고 구조적 변형이 관찰되었으나, tIK-IL1RaKO 마우스 유래의 관절의 경우 뼈의 손상이 거의 없는 본래의 구조를 유지하고 있었다(도 7). 이를 통해 아이케이의 발현이 관절염에 의한 뼈의 파괴를 억제하는 데에도 관여한다는 것을 확인하였다.
실시예 6 : 관절부위 염증 사이토카인의 발현 확인
(1) mRNA 발현 확인
관절염이 유도된 마우스 관절에서의 염증 사이토카인 발현정도를 확인하기 위하여 관절염 자연발생 그룹의 모니터링 16주차에 각 그룹의 마우스를 부검하여 관절 부위를 얻었다. 관절 부위를 LN2에 마쇄한 후 Trizol reagent 400 ㎕에 넣어 RNA isolation을 진행하였다. Chloroform을 넣고 강하게 vortex한 후 5분 동안 상온에서 incubation하였다. 원심분리(12500 rpm, 15 min, 4℃) 후 상층액을 새로운 micro tube로 옮겼다. 이후 상층액에 isopropanol과 glycoblue를 넣고 5분 동안 상온에서 incubation하였다. 원심분리(12500 rpm, 10 min, 4℃) 후 상층액을 제거하였다. 상층액 제거 후 남은 pellet을 70% 에탄올로 세척하고, 원심분리(9500 rpm, 5 min, 4℃)한 뒤, pellet을 air dry 하고 DEPC-water로 녹여주었다. 분리된 RNA는 QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen)을 이용하여 cDNA로 제조하였다. 제조한 cDNA를 이용해 quantitative real-time PCR을 수행하였다(cDNA 1 ㎕, primer set 각 1 ㎕, 2XSYBR green mix 12.5 ㎕, Distilled water 9.5 ㎕, 40cycle).
그룹별 측정된 결과 값(Ct 값)은 2(-ΔΔ Ct ) method를 이용하여 wild type mice 그룹의 결과를 기준으로 하는 상대적인 값으로 계산하였다. cDNA를 template로 하여 관절염 발병 시 발현이 증가되는 것으로 알려져 있는 염증성 사이토카인 (IL-1β, IL-6, IL-17A)의 발현을 측정하였다. cDNA를 template로 하여 염증성 사이토카인(IL-1β, IL-6, IL-17A)을 증폭하기 위해 사용한 프라이머 서열이 표 5에 표시되어 있으며, 측정 결과는 도 8a에 도시되어 있다.
염증성 사이토카인 정방향 프라이머 역방향 프라이머
IL-1β 서열식별번호:38 서열식별번호:39
IL-6 서열식별번호:40 서열식별번호:41
IL-17A 서열식별번호:42 서열식별번호:43
관절부위 염증유발에 관여하는 염증성 사이토카인(IL-1β, IL-6)은 tIK-IL1RaKO mice의 관절에 비해 IL1RaKO mice의 관절에서 보다 높은 발현 양상을 나타냈다. 또한 연골세포와 조골세포 내 기질 생산을 억제시켜 관절 손상을 유발하여, 조직재생을 결핍시키는 주요 인자인 IL-17은 tIK-IL1RaKO 마우스 유래의 관절 조직에 현저히 낮게 발현되었다. 이러한 결과를 통해 아이케이 유래의 핵산 단편이 관절염이 유도될 때 발현하는 염증성 사이토카인의 발현을 조절할 수 있으며, 이에 따라 관절염 수치를 낮출 수 있다는 점을 확인하였다.
(2) 조직 염색을 이용한 사이토카인 발현 확인
관절염이 유도된 마우스 관절의 병인상태를 확인하기 위하여 관절염 자연 발생 그룹의 모니터링 16주차에 각 그룹(tIK-IL-1RaKO 그룹; IL-1RaKO 그룹)의 마우스를 부검하여 관절 부위를 얻었다. 관절 부위를 10% 중성 포르말린에 고정 후 탈회 용액에 7시간 동안 침지하여 탈회하였다. 탈회된 관절 부위를 16시간에 걸쳐 수세하고, 탈수, 청명, 침투 과정을 거쳐 파라핀 블록(paraffin block)을 제조하였다. 절편 기기를 사용하여 파라핀 블록을 절단하여 7 ㎛ 절편을 만들고 슬라이드에 붙인 후 염증성 사이토카인(IL-17, IL-1β, TNFα) 염색을 진행하였다. 파라핀 절편을 deparaffinization한 후 함수 과정을 진행하였다. IL-17, IL-1β, TNFα에 대한 1차 항체를 16시간 붙인 뒤, biotin이 label되어 있는 2차 항체를 붙였다. ABC reagent로 incubation 후 peroxidase substrate solution으로 발색시킨 후 이를 수세하여 관절 synovial 부위를 중심으로 염증성 사이토카인의 발현을 확인 후 현미경으로 관찰하였다. 결과는 도 8b에 도시되어 있다. tIK-IL1RaKO 마우스 유래의 관절 조직은, IL1RaKO 마우스 유래의 관절 조직보다 synovial 부위 내 면역세포의 침윤이 덜 일어났으며, 특히 IL-17의 발현이 낮게 나타났다. 이를 통해 윤활관절부위의 염증(synovial inflammation)이 tIK-IL1RaKO 그룹에서 낮게 발생했음을 확인할 수 있었다.
실시예 7 : 혈청 내 염증 사이토카인의 발현 확인
관절염이 유도된 마우스의 혈액 내 염증 사이토카인의 발현을 확인하기 위하여 관절염 자연발생 그룹의 모니터링 16주차에 각 그룹의 마우스를 부검하여 심장채혈을 통해 혈액을 얻었다. 얻은 혈액을 원심분리 (4000 rpm, 15 min, 4℃)하여 혈청만을 분리해냈고, 이를 이용하여 ELISA 방법으로 혈청 내 염증 사이토카인의 발현을 확인하였다.
MCP-1 ELISA kit(R&D system)을 예로 들어 설명하면, anti-MCP-1 primary antibody가 pre-coating 되어 있는 plate에 kit에서 제공하는 standard를 serial dilution하여 넣고, serum 원액을 넣은 후 상온에서 2시간 incubation하였다. Incubation이 끝나면 well에 넣어주었던 모든 sample을 제거하고 0.05% PBST(Phosphate Buffered Saline Tween-20)로 4번 washing하였다. Well 내 anti-MCP-1 antibody에 binding한 MCP-1에 binding할 수 있는 conjugate 용액을 넣고 상온에서 2시간 incubation하였다. Incubation후에 substrate solution을 넣고 conjugate와 반응하여 발색되는 것을 모니터링 하였다. Standard의 발색 범위 내에 측정하고자 하는 serum sample의 발색정도가 들어오면 stop solution (2N H2SO4)을 넣고 ELISA reader기를 이용하여 450 nm 파장대에서 흡광도를 측정하였다. 이를 바탕으로 standard 농도에 대한 흡광도를 기준으로 하여 샘플의 흡광도가 나타내는 MCP-1의 농도를 구할 수 있었으며, MCP-1 이외의 다른 사이토카인도 위와 같은 방법을 이용하여 농도를 측정하였다. MCP-1 사이토카인을 증폭시키기 위하여 서열식별번호:44의 정방향 프라이머와, 서열식별번호:45의 역방향 프라이머를 사용하였으며, 나머지 사이토카인은 실시예 6과 동일한 프라이머를 사용하여 증폭하였다.
분석 결과는 도 9에 도시되어 있다. 실시예 6에서 관절 부위 염증성 사이토카인의 mRNA 발현에서 나타난 결과와 유사하게, IL1RaKO mice보다 tIK-IL1RaKO mice의 혈청에서 chemokine의 일종인 MCP-1, 병인 T 세포의 분화에 관여하는 것으로 알려져 있는 IL-6, 및 관절염 발병의 주요 인자인 IL-17의 발현이 유의미하게 낮은 양상을 나타내는 것을 확인하였다. 이를 통해 tIK가 systemic한 면역반응에도 영향을 미쳐 관절염 수치를 낮추는데 기여할 수 있을 것으로 예상되었다.
실시예 8 : 병인 T- helper 세포의 발현 측정
면역 세포 중 하나인 T 세포는 면역 체계의 교란을 유발하는 중요한 세포임이 밝혀져 있다. 활성화된 T 세포는, 각각 작동 T 세포 (effector T cell) 인 Th1, Th2, Th17, regulatory T 세포로 분화한다. 어느 쪽으로의 분화 경로가 촉진되는지의 여부에 따라 질병의 발생 및 경과가 결정된다. Th1세포와 Th17 세포는 각각 IFN-γ와 IL-17을 분비하며, 당뇨, 류마티스성 관절염, 크론병과 같은 염증성 장 질환의 병인의 중심축을 이루는 것으로 알려져 있다.
본 실시예에서는 아이케이 유래의 핵산 단편에 의하여 관절염이 억제될 때, 병인 T hepler 세포의 발현 양상이 관여하는지를 확인하였다. 관절염 자연발생 그룹의 모니터링 16주차에 각 그룹의 마우스를 부검하여 비장을 얻었다. Serum free RPMI media가 담긴 100 mm petri dish에 100 ㎛ strainer를 넣고, strainer 위에 비장을 올린 후 주사기 바늘을 이용하여 비장을 찢어주면서 비장의 면역세포들이 stainer를 통해 media가 있는 dish로 빠져나갈 수 있도록 하였다. 비장을 모두 갈아낸 후, media 상에 퍼져있는 세포를 튜브에 모아 1500rpm, 4℃, 5분 동안 원심분리하여 pellet만을 얻어냈다. Pellet에 Red blood cell lysis buffer를 넣고 4℃에서 5분 동안 incubation하였다. 다시 1500rpm, 4℃, 5분 동안 원심분리하여 적혈구를 제거하여 최종적으로 비장세포를 얻어냈다. 비장세포를 FBS가 포함되어 있는 RPMI media로 부유시킨 후 1X106 개의 세포만을 취하여 병인 Th17 세포의 양을 flow cytometry로 분석하기 위한 염색 과정을 진행하였다. 그룹별로 얻은 비장세포에 PMA(100ng/ml)와 ionomycin (200ng/ml)을 넣고 37℃ 배양기에서 4시간 incubation하고, 세포 내 IL-17을 염색하기 위한 golgi stop 시약을 첨가해주었다. PMA와 ionomycin을 통해 자극된 세포를 차가운 PBS로 washing하고 병인 Th17 세포의 표면분자인 CD4에 대한 항체 (PE-Cy5 conjugated)를 넣어 4℃에서 30분간 반응시켰다. 그 후 차가운 PBS로 washing하고, 세포 내 IL-17을 염색하기 위해 세포 내로 항체가 투과할 수 있도록 세포의 permeability를 증가시킨 후 IL-17에 대한 항체 (PE conjugated)를 넣어 실온에서 30분간 반응시켰다. 반응이 모두 끝난 후에 fixative 용액을 이용하여 washing하고 최종적으로 1% paraformaldehyde 용액으로 염색된 세포를 고정시켜 flow cytometry 분석에 이용하였다.
IFN-γ를 분비하는 Th1세포는 IL1RaKO 마우스에서 6.09%로 나타났으나 tIK-IL1RaKO 마우스의 경우 3.24%로 IL1RaKO에 비해 낮은 양상을 나타냈다(도 10a). IL-17을 분비하는 Th17세포의 경우도 마찬가지로 IL1RaKO 마우스에서 1.78%로 나타났으나 tIK-IL1RaKO 마우스의 경우 1.2%로 IL1RaKO에 비해 병인 Th17세포 발현이 1.5배 감소한 양상이 나타났다(도 10b).
이러한 분석 결과는, 실시예 6과 실시예 7에서 마우스의 관절 부위와 혈청에서 확인하였던 Th17 세포의 분화에 관여하는 것으로 알려져 있는 염증성 사이토카인의 발현 분석 결과와 일치한다. 따라서 관절염이 유발되었을 때, 아이케이 유래의 핵산 단편이 염증 반응에 크게 기여하는 병인 Th17세포 및 Th1세포의 발현을 억제함으로써 관절염의 염증반응을 억제할 수 있는 가능성을 확인할 수 있었다.
실시예 9 : 대식세포 활성 인자 발현 분석
류마티스 관절염에서 활성화된 대식세포는 염증성 사이토카인을 분비하고 다양한 면역세포들과의 상호작용을 통해 관절부위 염증 반응을 시작하고 유지한다. 대식세포는 T세포에 항원을 제시하여 T세포의 활성을 유도할 뿐 아니라, 다양한 사이토카인을 분비하여 T 세포와 함께 파골세포의 활성화도 유도한다. 대식세포는 관절염의 염증 반응 유지에 중요한 역할을 하므로, 본 실시예에서는 아이케이에 의한 관절염 억제 현상에 대식세포가 관여하는지의 여부를 확인하였다.
자연발생 관절염 모니터링 16주차에 IL1RaKO 그룹 마우스와 tIK-IL1RaKO 그룹의 비장을 얻어 실시예 8과 같은 절차를 통하여 비장세포를 얻었다. 얻어진 비장세포에 대식세포 인자인 CD11b에 대한 항체(APC conjugated)와 병인대식세포 인자인 F4/80에 대한 항체 (PE-cy7 conjugated), 대식세포의 활성인자인 CD86에 대한 항체 (FITC conjugated)를 이용하여 비장세포를 염색하였다. 염색된 세포를 1% paraformaldehyde 용액으로 고정시켜 flow cytometry 분석에 이용하였다. 도 11에 도시된 것과 같이, tIK-IL1RaKO 유래의 비장세포에서는 대식세포 활성인자의 발현이 IL1RaKO에 비해 감소되어 있었다. 따라서 아이케이의 발현은 병인 Th17세포뿐만 아니라 대식세포의 활성억제에도 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 10 : 활성 펩타이드의 합성 및 대식세포 활성 억제 확인
tIK에 비하여 발현 및 정제가 용이한 짧은 길이의 아이케이 인자의 부분 단편인 활성 펩타이드를 제작하여 관절염 모델에 적용하는 경우에 기능을 발휘하는지를 확인하였다. 실시예 1을 통하여 아이케이 인자의 기능에 주요한 역할을 담당할 것으로 예상되는 2개의 아미노산(S382, Y489)을 포함하는 펩타이드를 합성하였다. S382를 포함하는 14개 아미노산으로 구성되는 펩타이드(서열식별번호:47, S 펩타이드), Y489를 포함하는 13개 아미노산으로 구성되는 펩타이드(서열식별번호:49, Y 펩타이드)를 합성하였다. S382와 Y489에는 각각 인산기로 치환될 수 있도록 합성하였다. 각각의 활성 펩타이드는 Fmoc solid phase 합성방법을 통해 합성되었다. Coupling-wash-deprotection-wash 과정을 반복하여 남아있는 시약을 제거하였으며, multi-channel automated synthesizer인 COMDEL 기기를 사용하였다. 이러한 합성을 통해 각각의 활성 펩타이드의 C-말단에서 N-말단을 향해 펩타이드를 합성하였으며, 모든 반응이 종결된 후 합성된 펩타이드를 reagent K를 이용하여 resin에서 분리하였다. 분리된 펩타이드를 차가운 디에틸에테르를 첨가하여 침전시키고, 다시 한 번 디에틸에테르를 이용하셔 세척한 뒤 vacuum 상태에서 건조하였다. mass spectrometer를 사용하여 합성된 펩타이드의 분자량을 측정하였으며, 예상한 분자량과 동일한 경우 정제를 진행하였다. Reverse-HPLC, C18 column, 220nm wavelength 정제조건에서 정제를 진행하였다.
정제된 S 펩타이드와 Y 펩타이드를 리포다당(lipopolysaccharide, LPS)의 자극 조건에서 대식세포의 활성화 정도를 확인하였다. J774a.1 대식세포주에 S 펩타이드와 Y 펩타이드를 각각 500 ng/mL의 농도로 동시에 transfection 후 LPS (O111:B4)를 처리하여 염증성 사이토카인의 발현을 확인하였다. LPS 처리 후 24시간째에 얻은 대식세포에서, 활성 펩타이드를 처리한 그룹에서 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-6)의 mRNA 발현이 낮게 나타났다(도 12a). 세포 배양액을 이용한 측정에서도 tIK active peptide가 주어진 조건에서 대조군에 비해 염증성 사이토카인이 낮게 발현되었다(도 12b). 따라서 활성 펩타이드가 관절염과 관련된 염증성 사이토카인의 발현을 억제한다는 점을 확인하였다.
실시예 11 : 활성 펩타이드에 의한 병인 T helper 세포 분화 억제 확인
아이케이 인자 활성 펩타이드가 병인 T helper 세포의 분화에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 야생형 마우스의 비장을 이용하여 실시예 6에서 제시된 방법을 통하여 비장세포를 얻었다. 비장세포에서 naive CD4 T 세포만을 선택적으로 분리하고, S 펩타이드와 Y 펩타이드(100 ng/mL or 500 ng/mL)를 1시간 동안 전-처리하였다. 병인 T helper 세포로 분화할 수 있는 각종 사이토카인 및 중화항체를 포함하는 배양액을 첨가해주었으며, condition 배양액을 첨가할 때 다시 S 펩타이드와 Y 펩타이드를 동일한 농도(100 ng/mL or 500 ng/mL)로 첨가하였다. Th0 세포로의 분화를 위해 anti-CD3, anti-CD28, IL-2를 첨가한 배양액을 세포에 첨가하였다. Th1 세포로의 분화를 위해 anti-CD3, anti-CD28, IL-2, IL-12, anti-IL-4를 첨가한 배양액을 첨가해주었다. 또한, Th17 세포로의 분화를 위해서는 anti-CD3, anti-CD28, IL-6, TGF-β, anti-IL-4, anti-IFNγ를 첨가한 배양액을 세포에 첨가해주었다. 배양 2일 후 같은 조건으로 T helper 세포로 분화할 수 있도록 각종 사이토카인과 중화항체가 포함된 배양액을 첨가해준 후 2일 후에 병인 T helper 세포를 flow cytometry로 분석하기 위하여 염색하였다.
먼저 배양된 세포에 phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA, 50 ng/mL)와 ionomycin(200 ng/mL)을 첨가하였다. 37℃ 배양기에서 4시간 incubation하면서, 세포 내 IL-17을 염색하기 위한 golgi stop (monensin)을 첨가하였다. Incubation 후 세포를 차가운 PBS로 세척하였다. 세포 내 cytokine (IL-17, IFNγ)을 염색하기 위해 세포 내로 항체가 투과할 수 있도록 세포의 투과도를 증가시킨 후 IL-17, IFNγ에 대한 항체를 넣고 ice에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 fixative 용액을 이용하여 세척하고, 최종적으로 1% paraformaldehyde 용액으로 염색된 세포를 고정시켜 flow cytometry 분석에 이용하였다.
도 13a 및 도 13b에 도시된 것과 같이, 활성 펩타이드를 처리하면, Th0 세포 분화 조건 및 Th1 세포의 분화조건에서 CD4+IFNγ+T 세포의 분화가 감소하는 경향을 나타냈다. 또한 도 13c에 도시된 것과 같이, 활성 펩타이드의 처리에 의하여 CD4+IL-17+T 세포의 분화가 억제되었다. 이러한 결과는 아이케이 인자의 활성 부위 아미노산을 가지는 짧은 활성 펩타이드가 염증 질환에서의 병인 T helper 세포로 작용하는 Th1 세포, Th17 세포로의 분화를 억제할 수 있음을 의미한다.
실시예 12 : 활성 펩타이드의 주입을 통한 관절염 억제
아이케이 인자의 활성 펩타이드인 S 펩타이드와 Y 펩타이드의 관절염 억제 효과를 알아보기 위하여, 이들 펩타이드를 자연 발생 관절염 모델인 IL1RaKO 마우스에 주입하였다. 각각의 그룹에 7마리의 IL1RaKO 마우스를 이용하였으며, 활성 펩타이드로서 S 펩타이드와 Y 펩타이드를 동시에 10 mg/kg (S peptide 5 mg/kg, Y peptide 5 mg/kg)의 농도로 복강 주사하여 주입하였다. 대조군에는 동일한 부피의 인산환충식염수(phosphate buffered saline, PBS)를 복강 주사하였다. 펩타이드는 2~3 일 간격으로 주입하였으며, Peptide 주입 시마다 마우스의 몸무게, 관절염 발병 여부 및 지수를 기록하였다. 펩타이드 주입 후 7주째 마우스의 관절염 지수는 PBS를 주입한 대조군에 비하여 낮은 수치를 나타냈으며(도 14a), 펩타이드 주입 그룹에서 관절염 발병률이 낮았다(도 14b).
실시예 13 : 활성 펩타이드 주입후 관절염 모델에서 병인 세포 분석
(1) flow cytometry 분석
아이케이 인자의 활성 펩타이드 주입에 의하여, 관절염 염증 반응의 시작과 유지에 관여하는 주요 인자인 Th17세포의 분포를 측정하였다. 실시예 12에 따라, 활성 펩타이드 주입 8주차에 마우스를 부검하여 그룹별 마우스의 비장을 얻었다. 비장을 갈아 비장세포를 얻은 후 PMA(50 ng/mL)와 ionomycin (200 ng/mL)을 첨가하였다. 37℃ 배양기에서 4시간 incubation하면서, 세포 내 IL-17을 염색하기 위한 golgi stop (monensin)을 첨가하였다. Incubation 후 세포를 차가운 PBS로 세척하고 병인 Th17 세포의 표면분자인 CD4에 대한 항체(APC conjugated)를 넣어 4℃에서 30분간 반응시켰다. 반응이 완료되면, 세포를 세척하고, 세포 내 IL-17을 염색하기 위해 세포 내로 항체가 투과할 수 있도록 세포의 투과도를 증가시킨 후 IL-17에 대한 항체(PE conjugated)를 넣고 실온에서 30분간 반응시켰다. 반응시킨 후 fixative 용액을 이용하여 세척하고 최종적으로 1% paraformaldehyde 용액으로 염색된 세포를 고정시켜 flow cytometry 분석에 이용하였다.
펩타이드 주입 그룹과 PBS 주입 그룹에서 관절염이 유발된 마우스의 비장세포 내에서 병인 Th17세포의 분석결과를 보면 활성 펩타이드를 주입한 IL1RaKO의 비장에서 Th17 세포가 적게 나타남을 알 수 있다(도 15a). 이는 아이케이 인자의 활성 펩타이드가 관절염 병인에 주요한 역할을 하는 Th17세포의 분화 및 증식을 억제하는 효과를 갖는다는 것을 의미한다.
(2) 조직 염색을 이용한 사이토카인 발현 확인
아이케이 활성 펩타이드 주입 후, 관절 synovial부위에서의 염증성 사이토카인의 발현을 확인하였다. 실시예 12에 따라, 활성 펩타이드 주입 8주차에 마우스를 부검하여 관절 부위를 얻었다. 관절 부위를 10% neutral formalin에 고정하고 탈회 용액에 7시간 동안 침지하여 탈회하였다. 탈회된 관절 부위를 16시간에 걸쳐 수세하고, 탈수, 청명, 침투 과정을 거쳐 파라핀 블록(paraffin block)을 제조하였다. 절편 기기를 사용하여 파라핀 블록을 절단하여 7 ㎛ 절편을 만들고 슬라이드에 붙인 후 염증성 사이토카인(IL-17, IL-1β, TNFα) 염색을 진행하였다. 파라핀 절편을 deparaffinization한 후 함수 과정을 진행하였다. 여기에 IL-17, IL-1β, TNFα에 대한 1차 항체를 16시간 붙인 후 biotin이 label되어 있는 2차 항체를 붙였다. ABC reagent로 incubation 후 peroxidase substrate solution으로 발색시킨 후 이를 수세하여 관절 synovial 부위를 중심으로 염증성 사이토카인의 발현을 확인 후 현미경으로 관찰하였다. 결과는 도 15b에 도시되어 있다. 활성 펩타이드를 주입한 마우스의 경우 관절 부위의 염증성 사이토카인의 발현이 낮고, 염증세포의 침윤이 현저히 감소되어 있는 것을 확인하였다.
실시예 14 : Baculovirus expression system 을 이용한 tIK 발현 및 정제
아이케이 단편(tIK) 단백질의 대량 발현을 위해 Fc가 tagging되어 있는 tIK 플라스미드를 baculovirus에 transfection한 후, 곤충세포(SF9 세포)에서 발현하였다. tIK 서열의 3' 말단으로 thrombin 인식 부위를 코딩하는 핵산(서열식별번호:50)과 Fc 태그 서열(서열식별번호:51)을 연결하였다. Virus seed를 만든 후, 1차(100 mm dish scale), 2차(T75 flask scale), 3차(1L 삼각플라스크)에 걸쳐 점차 많은 수의 곤충세포에 tIK-Fc를 발현하는 baculovirus를 infection하였다. 최종적으로 3차 바이러스 infection 후 3일차에 tIK-Fc가 secretion 되어 있는 1L 부피의 세포 배양액을 얻었다. 세포 배양액 내에 존재하는 tIK-Fc 단백질은 immunoprecipitation방법을 이용하여 정제하였다. Sepharose column에 rProtein A resin을 넣고 배양액을 주입하면, 배양액 내 함유된 tIK-Fc 단백질의 Fc 부분이 resin과 결합함으로써 column에 남게 되는 특성을 이용하였다. tIK-Fc 단백질의 발현(약 55 kDa)은 Commassie blue 염색법을 통해 일차적으로 확인하였다(결과 미도시). 순수한 tIK-Fc 단백질을 얻기 위해 rProtein A와 Fc 영역 사이의 비-공유결합을 끊어서 resin으로부터 tIK와 Fc region 결합체를 분리하고자 하였다. 비-공유결합을 끊기 위해서 Elute buffer (0.1M Glycine buffer, pH2.8)를 이용하여 용출시킨 뒤 Neutralization buffer (1M Tris-HCl, pH8.0)로 Neutralization과정을 거쳐 단백질의 구조 변성을 방지하였다. Column 세척 과정은 washing buffer (0.15M NaCl-20mM Na2HPO4, pH8.0)를 이용하였다. Affinity chromatography를 통해 총 7개의 fraction으로 분리된 용액을 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과, 단백질이 용출된 것을 확인 할 수 있었다. 단백질의 크기를 확인한 결과 tIK-Fc protein이 결합된 크기인 55 kDa을 확인하였다. 이를 통해 Fc region과 fusion protein이 결합체를 분리할 수 있음을 확인하였다(도 16).
실시예 15 : tIK 유전자 전달을 위한 재조합 아데노 -연관바이러스( rAAV ) 벡터 시스템 확립
아데노-연관바이러스(AAV)는 레트로 바이러스와는 달리 질병을 일으키지 않고, 인체세포의 제 19번 염색체에 선택적으로 통합되므로 만성질환의 유전자 치료벡터로 활용되고 있다. 이러한 특성을 이용하여 본 실시예에서는 서열식별번호:3으로 표시되는 tIK 핵산 단편을 AAV의 inverted terminal repeat(ITR)로 둘러싼 형태로 만드는 유전자 클로닝 단계를 거쳐, tIK 핵산 단편을 세포 내로 전달할 수 있는 rAAV2-tIK 벡터 시스템을 확립하였다. GFP 발현이 가능한 rAAV viral vector인 pSP72-XP7-scAAV2-CMV-GFP를 발현 vector로 이용하였다. tIK 핵산 단편의 5' 말단에 HA 태그 서열(서열식별번호:54)을 연결하고, tIK 핵산 단편의 양쪽 말단에 상보적인 프라이머(정방향 프라이머는 서열식별번호:55; 역방향 프라이머는 서열식별번호:56)를 이용하여 PCR을 진행하였다. 이를 통해 얻은 증폭 절편의 말단을 제한효소로 자른 뒤, 발현 vector에 삽입하여 tIK-HA-sp72-XP7-scAAV2 재조합 발현 벡터를 제조하였다. 제조된 재조합 발현 벡터를 대장균에 transformation한 뒤, tIK 증폭 절편이 삽입된 플라스미드를 선택할 수 있었다. 아데노-연관바이러스에 연결된 tIK 유전자를 폴리에틸렌이민(polyethylenimine, PEI)을 이용한 transfection으로 293T 세포에 주입하였다. PEI를 이용하여 tIK를 발현하는 것으로 확인된 바이러스를 다시 293T 세포에 감염시키고 웨스턴 블롯팅을 이용하여 발현을 확인하였다(도 17).
실시예 16 : AAV2 - tIK 주입을 통한 관절염 억제 확인
실시예 15에서 제작한 rAAV2-tIK를 in vivo 질환 모델에 적용하여, tIK 핵산의 발현에 따른 관절염의 치료 효과를 확인하였다. AAV2-tIK와 AAV2-GFP 바이러스를 각각 1 x 1011 vg/100 ul의 농도로 자연발생 관절염을 나타내는 IL1RaKO의 꼬리를 통해 정맥 주사하였다. 2주 간격으로 rAAV2-tIK와 rAAV-GFP를 주입하였고, 일주일에 1회 마우스 관절상태와 발병률을 측정하였다. rAAV2-tIK를 주입한 IL1RaKO에서 rAAV2-GFP를 주입한 IL1RaKO보다 낮은 관절염 발병률과 관절염 지수를 나타냈으며(도 18a), 관절염의 발병율이 낮았다(도 18b). 이를 통해 virus vector 시스템을 이용하여 아이케이 핵산을 전달하여, 관절염의 발병률 및 관절염 지수를 낮출 수 있다는 가능성을 확인하였다.
실시예 17 : CHO cell line 에서 tIK 발현 시스템 구축
Chinese hamster ovary (CHO) 세포는 유전자 주입 시 그 발현 효율이 높으며, 유전자 재조합 단백질 의약품 생산용 동물 세포주로 많이 이용되고 있다. CHO cell에서의 tIK 발현 효율을 확인하기 위하여, 5' 말단에 HA 태그 서열(서열식별번호:54)이 연결되어 있는 tIK 플라스미드(tIK-PcDNA3.1)를 CHO 세포에 주입하였다. tIK의 증폭을 위해서 서열식별번호:55의 정방향 프라이머와 서열식별번호:57의 역방향 프라이머를 사용하였다. CHO 세포에서 tIK의 발현을 웨스턴 블롯팅으로 확인하였다(도 19)
<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION CELLINBIO Co.,Ltd <120> PHARMACEUTICAL USE OF IK FACTOR AND NUCLEIC ACIDS ENCODING IK FACTOR <130> 1922 <150> 10-2013-0041771 <151> 2013-04-16 <160> 57 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1674 <212> DNA <213> IK factor <400> 1 atgccagaac gagatagtga gcccttctct aaccctttgg ctccagatgg ccacgatgtg 60 gatgatcctc attccttcca ccaatcaaaa cttaccaatg aagacttcag gaaacttctt 120 atgaccccaa gagctgcacc tacttctgcg ccaccttcta agtcacgtca ccatgagatg 180 ccaagggagt acaatgagga tgaagaccca gctgcacgaa ggaggaaaaa gaaaagttat 240 tatgccaagc ttcgccagca agaaattgag agagagagag aactcgcaga gaaataccgg 300 gaccgtgcca aggaacggag agatggtgtg aacaaagact atgaggaaac tgagctgata 360 agtaccacag ccaactacag ggctgtgggc cccactgctg aggcggacaa atcagcagca 420 gagaagagaa gacagttgat tcaggagtcc aaattcttgg gtggtgatat ggaacacacc 480 catttggtga aaggtttgga ttttgcgttg cttcaaaagg tgcgcgctga gattgccagc 540 aaagagaagg aggaagagga actcatggaa aagccccaaa aggaaaccaa gaaagatgag 600 gatcctgaga acaaaattga atttaaaaca cgccttggcc ggaatgtgta tcggatgctt 660 ttcaagagta aatcatatga gcgaaatgag ctgttcttac caggacgtat ggcctatgta 720 gtagacctgg atgatgagta cgcagacaca gatatcccca ccactctcat acgcagcaaa 780 gctgattgcc ccactatgga ggcccagact acactgacta caaatgacat tgttattagc 840 aagctcaccc agattttgtc atacctgagg caggggaccc gaaacaagaa gctcaagaag 900 aaggataaag gaaaactgga agagaagaaa cctcctgagg ctgacatgaa catttttgaa 960 gacattgggg attacgttcc ttctacaacc aagacacctc gggacaagga acgtgagaga 1020 taccgggaac gtgaacgtga tcgggaacgg gacagagaca gggagcgaga cagggagcga 1080 gaccgtgaga gggagagaga gcgagaccgg gaacgggaac gagaggagga aaagaaaagg 1140 cacagctact ttgagaagcc aaaagtggat gatgagccca tggatgttga caaaggacct 1200 ggatctgcaa aagagttgat caagtccatc aatgaaaaat tcgctgggtc tgctggctgg 1260 gaaggcactg aatcgttgaa gaagccagaa gataagaagc agctgggcga tttctttggc 1320 atgtccaaca gttacgcaga atgctatcca gccacgatgg atgacatggc tgtagatagt 1380 gatgaagagg tagattatag caaaatggac cagggtaaca agaagggtcc cttaggccgc 1440 tgggacttcg 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agagataccg ggaacgtgaa cgtgatcggg aacgggacag agacagggag 120 cgagacaggg agcgagaccg tgagagggag agagagcgag accgggaacg ggaacgagag 180 gaggaaaaga aaaggcacgc ctactttgag aagccaaaag tggatgatga gcccatggat 240 gttgacaaag gacctggatc tgcaaaagag ttgatcaagt ccatcaatga aaaattcgct 300 gggtctgctg gctgggaagg cactgaatcg ttgaagaagc cagaagataa gaagcagctg 360 ggcgatttct ttggcatgtc caacagttac gcagaatgct atccagccac gatggatgac 420 atggctgtag atagtgatga agaggtagat tatagcaaaa tggaccaggg taacaagaag 480 ggtcccttag gccgctggga cttcgatact caggaggaat tcagcgagtt catgaacaac 540 aaggaggctc tgcccaaggc tgcattccag tatggcatca agatgtctga aggacggaaa 600 accagacgat tcaaagaaac caatgataag gcagagcttg atcgacagtg gaagaaaata 660 agtgcaatca ttgagaagag gaagaggatg gaagcagatg gggtcgaagt gaaaagacca 720 aagtac 726 <210> 14 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated IK factor <400> 14 Met Asn Ile Phe Glu Asp Ile Gly Asp Tyr Val Pro Ser Thr Thr Lys 1 5 10 15 Thr Pro Arg Asp Lys Glu Arg Glu Arg Tyr Arg Glu Arg Glu Arg Asp 20 25 30 Arg Glu Arg Asp Arg Asp Arg Glu Arg Asp Arg Glu Arg Asp Arg Glu 35 40 45 Arg Glu Arg Glu Arg Asp Arg Glu Arg Glu Arg Glu Glu Glu Lys Lys 50 55 60 Arg His Ala Tyr Phe Glu Lys Pro Lys Val Asp Asp Glu Pro Met Asp 65 70 75 80 Val Asp Lys Gly Pro Gly Ser Ala Lys Glu Leu Ile Lys Ser Ile Asn 85 90 95 Glu Lys Phe Ala Gly Ser Ala Gly Trp Glu Gly Thr Glu Ser Leu Lys 100 105 110 Lys Pro Glu Asp Lys Lys Gln Leu Gly Asp Phe Phe Gly Met Ser Asn 115 120 125 Ser Tyr Ala Glu Cys Tyr Pro Ala Thr Met Asp Asp Met Ala Val Asp 130 135 140 Ser Asp Glu Glu Val Asp Tyr Ser Lys Met Asp Gln Gly Asn Lys Lys 145 150 155 160 Gly Pro Leu Gly Arg Trp Asp Phe Asp Thr Gln Glu Glu Phe Ser Glu 165 170 175 Phe Met Asn Asn Lys Glu Ala Leu Pro Lys Ala Ala Phe Gln Tyr Gly 180 185 190 Ile Lys Met Ser Glu Gly Arg Lys Thr Arg Arg Phe Lys Glu Thr Asn 195 200 205 Asp Lys Ala Glu Leu Asp Arg Gln Trp Lys Lys Ile Ser Ala Ile Ile 210 215 220 Glu Lys Arg Lys Arg Met Glu Ala Asp Gly Val Glu Val Lys Arg Pro 225 230 235 240 Lys Tyr <210> 15 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for truncated IK factor <400> 15 ggtggaattc atgtatcctt atgatgttcc tgattatgct atgatgaaca tttttg 56 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for truncated IK factor <400> 16 ctagactcga ggtactttgg tcttttcact tcg 33 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for mutated IK factor <400> 17 ggtggaattc atgtatcctt atgatgttcc 30 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for mutated IK factor <400> 18 ggtgaagctt atgtatcctt atgatgttcc 30 <210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for mutated IK factor <400> 19 ggcttctcaa agtaggcgtg ccttttcttt tcc 33 <210> 20 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for mutated IK factor <400> 20 ggaaaagaaa aggcacgcct actttgagaa gcc 33 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for mutated IK factor <400> 21 ctcgctgaat tcctcctgag tatcg 25 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for mutated IK factor <400> 22 cgatactcag gaggaattca gcgag 25 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for mutated IK factor <400> 23 cctccttgtt gttcatgaac tcgct 25 <210> 24 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for mutated IK factor <400> 24 ggaatacagc gagttcatga acaacaagg 29 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for mutated IK factor <400> 25 gttcatgaac tcgctgaatt cc 22 <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for mutated IK factor <400> 26 caggaggaat tcagcgagtt catgaac 27 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for CDCA3 <400> 27 tggtattgca cggacaccta 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for CDCA3 <400> 28 gttccaaggt ggcatctgtt 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for CNOT1 <400> 29 cgagccaagt gctatcacaa 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for CNOT1 <400> 30 tgctcaggtg cattgagttc 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for MAPK1 <400> 31 ccagaccatg atcacacagg 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for MAPK1 <400> 32 ctggaaagat gggcctgtta 20 <210> 33 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for truncated IK genotyping <400> 33 ccctattgac gtcaatgacg gtaaatgcgg 30 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for truncated IK genotyping <400> 34 ccgtccttca gacatcttga tgccatactg 30 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for RaKO genotyping <400> 35 tcagggttga cagcgacagc a 21 <210> 36 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for RaKO genotyping <400> 36 gactgccttg ggaaaagcgc ctcc 24 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for RaKO genotyping <400> 37 gggtccccag cagatttcca 20 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for IL-1 beta <400> 38 tgtaatgaaa gacggcacac c 21 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for IL-1 beta <400> 39 tcttctttgg gtattgcttg g 21 <210> 40 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for IL-6 <400> 40 gagaaaagag ttgtgcaatg gc 22 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for IL-6 <400> 41 ccagtttggt agcatccatc a 21 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for IL-17 alpha <400> 42 tccagaaggc cctcagacta 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for IL-17 alpha <400> 43 agcatcttct cgaccctgaa 20 <210> 44 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for MCP-1 <400> 44 catccacgtg ttggctca 18 <210> 45 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for MCP-1 <400> 45 gatcatcttg ctggtgaatg agt 23 <210> 46 <211> 42 <212> DNA <213> Fragment of IK factor <400> 46 gaaaagaaaa ggcacagcta ctttgagaag ccaaaagtgg at 42 <210> 47 <211> 14 <212> PRT <213> Fragment of IK factor <400> 47 Glu Lys Lys Arg His Ser Tyr Phe Glu Lys Pro Lys Val Asp 1 5 10 <210> 48 <211> 39 <212> DNA <213> Fragment of IK factor <400> 48 gatactcagg aggaatacag cgagtacatg aacaacaag 39 <210> 49 <211> 13 <212> PRT <213> Fragment of IK factor <400> 49 Asp Thr Gln Glu Glu Tyr Ser Glu Tyr Met Asn Asn Lys 1 5 10 <210> 50 <211> 15 <212> DNA <213> Thrombin recognized sequence <400> 50 ctggttccgc gtggt 15 <210> 51 <211> 702 <212> DNA <213> Fc tagging sequence <400> 51 tccgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 60 ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 120 cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 180 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 240 cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 300 aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 360 accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 420 cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 480 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 540 cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac tgtggacaag 600 agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 660 cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga 702 <210> 52 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for truncated IK factor <400> 52 gctgggcggc cgcgtacttt ggtcttttca cttcga 36 <210> 53 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for truncated IK factor <400> 53 gaggcggatc ccaacatttt tgaagacatt ggg 33 <210> 54 <211> 27 <212> DNA <213> HA tagging sequence <400> 54 tatccttatg atgttcctga ttatgct 27 <210> 55 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for truncated IK factor <400> 55 ggtggaattc atgtatcctt atgatgttcc 30 <210> 56 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for truncated IK factor <400> 56 ctagaaagct tgtactttgg tcttttcac 29 <210> 57 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for truncated IK factor <400> 57 ctagactcga ggtactttgg tcttttcact tcg 33

Claims (20)

  1. 약학적 유효량의 아이케이 인자(IK factor) 또는 아이케이 인자의 단편을 함유하는 관절염을 치료 또는 예방하는 약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 아이케이 인자의 단편은 서열식별번호:4의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 또는 서열식별번호:4의 부분 펩타이드를 포함하는 약학적 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 아이케이 인자의 단편은 서열식별번호:2의 아미노산 서열의 382번째 세린, 489번째 티로신 및 492번째 티로신 중에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 및 이들 선택된 아미노산의 인접 아미노산으로 구성되는 10개 이상의 아미노산을 가지는 펩타이드로 구성되는 약학적 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 아이케이 인자의 단편은 서열식별번호:2의 아미노산 서열의 382번째 세린, 489번째 티로신 및 492번째 티로신으로 구성되는 적어도 하나의 아미노산은 인산화되어 있는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  5. 제 3항에 있어서, 상기 아이케이 인자의 단편은 서열식별번호:2의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드의 단편으로서, 서열식별번호:2의 아미노산 서열의 382번째 세린 및 489번째 티로신 중에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 및 이들 선택된 아미노산의 인접 아미노산으로 구성되는 10개 이상의 아미노산을 가지는 펩타이드로 구성되는 약학적 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 아이케이 인자의 단편은 상기 선택된 아미노산의 N-말단과 C-말단으로 각각 2개 이상의 인접 아미노산이 연결되어 있는 10개 이상의 아미노산을 가지는 펩타이드로 구성되는 약학적 조성물.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 아이케이 인자의 단편은 서열식별번호:4, 서열식별번호:47 및 서열식별번호:49로 구성되는 군에서 적어도 하나 선택되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드로 구성되는 약학적 조성물.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 류마티스성 관절염을 치료하는데 사용되는 약학적 조성물.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 아이케이 인자 또는 상기 아이케이 인자의 단편은 약학적 조성물 중에 1.0 ng/mL ~ 10 ㎍/mL의 농도로 함유되어 있는 약학적 조성물.
  10. 아이케이 인자(IK factor) 또는 아이케이 인자의 단편을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 유전자 전달체를 함유하는, 관절염을 치료 또는 예방하는 약학적 조성물.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 아이케이 인자의 단편을 코딩하는 핵산은 서열식별번호:3의 뉴클레오티드 서열을 가지는 핵산 또는 서열식별번호:3의 부분 핵산을 포함하는 약학적 조성물.
  12. 제 10항에 있어서, 상기 아이케이 인자의 단편을 코딩하는 핵산은 서열식별번호:1의 뉴클레오티드 서열의 1144-1146번의 뉴클레오티드 세트, 1465-1467번째 뉴클레오티드 세트 및 1474-1476번째 뉴클레오티드 세트 중에서 선택되는 적어도 하나의 뉴클레오티드 세트와, 이들 선택된 뉴클레오티드 세트의 인접 뉴클레오티드로 구성되는 30개 이상의 뉴클레오티드를 가지는 핵산으로 구성되는 약학적 조성물.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 아이케이 인자의 단편을 코딩하는 핵산은 서열식별번호:1의 뉴클레오티드 서열의 1144-1146번의 뉴클레오티드 세트 및 1465-1467번째 뉴클레오티드 세트 중에서 선택되는 적어도 하나의 뉴클레오티드 세트와, 이들 선택된 뉴클레오티드 세트의 인접 뉴클레오티드로 구성되는 30개 이상의 뉴클레오티드를 가지는 핵산으로 구성되는 약학적 조성물.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 아이케이 인자의 단편을 코딩하는 핵산은 상기 선택된 뉴클레오티드 세트의 5' 말단과 3' 말단으로 각각 6개 이상의 인접 뉴클레오티드가 연결되어 있는 30개 이상의 뉴클레오티드를 가지는 핵산으로 구성되는 약학적 조성물.
  15. 제 10항 내지 제 14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 아이케이 인자의 단편을 코딩하는 핵산은 서열식별번호:4, 서열식별번호:47 및 서열식별번호:49로 구성되는 군에서 적어도 하나 선택되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산으로 구성되는 약학적 조성물.
  16. 제 10항 내지 제 14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 아이케이 인자의 단편을 코딩하는 핵산은 서열식별번호:3, 서열식별번호:46 및 서열식별번호:48로 구성되는 군에서 적어도 하나 선택되는 뉴클레오티드 서열을 가지는 핵산으로 구성되는 약학적 조성물.
  17. 제 10항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 류마티스성 관절염을 치료하는데 사용되는 약학적 조성물.
  18. 제 10항에 있어서, 상기 아이케이 인자 또는 상기 아이케이 인자의 단편을 코딩하는 핵산은 상기 약학적 조성물 중에 1.0 ng/mL ~ 10 ㎍/mL의 농도로 함유되어 있는 약학적 조성물.
  19. 제 10항에 있어서, 상기 유전자 전달체는 네이키드 핵산 분자, 플라스미드, 바이러스 벡터 및 상기 플라스미드 또는 상기 바이러스 벡터를 함유하는 리포좀 또는 니오좀의 형태를 가지는 약학적 조성물.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 레트로 바이러스, 렌티바이러스, 바큘로바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 백시니아 바이러스로 구성되는 군에서 선택되는 약학적 조성물.
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