PL191189B1 - Sposób wytwarzania prolaktyny ludzkiej - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania prolaktyny ludzkiej, znamienny tym, że prowadzi się ekspresję genu kodującego ludzką prolaktynę za pomocą bakulowirusowego systemu ekspresyjnego Bac-to-Bac (Gibco), otrzymany rekombinant namnaża się w bakteryjnych komórkach E.coli, a po wydzieleniu bakmidowego DNA z komórek E.coli tranfekuje się nim komórki owadzie, po czym otrzymaną zawiesiną wirusa infekuje się zdrowe komórki w których prowadzi się ekspresję białek heterologicznych, a otrzymane białko oczyszcza się i poddaje analizie.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania prolaktyny ludzkiej przez rekombinanta bakulowirusa.

Prolaktyna ludzka jest hormonem peptydowym wytwarzanym przez przedni płat przysadki mózgowej, zarówno u kobiet jak i mężczyzn [1,2]. Należy do grupy trzech hormonów peptydowych o zbliżonym charakterze jeśli idzie o wielkość jak i charakter cząsteczki białkowej, do której należą również dwa inne powszechnie występujące hormony peptydowe a mianowicie: hormon wzrostu (GH), somatotropina oraz laktogen łożyskowy - somatomammotropinana.

Prolaktyna ludzka ma następującą sekwencję aminokwasową:

10 20 leu pro ile cys pro gly gly ala ala arg cys gin val thr leu arg asp leu phe asp

40 arg ala val val leu ser his tyr ile his asn leu ser ser glu met phe ser glu phe

60 asp lys arg tyr thr his gly arg gly phe ile thr lys ala ile asn ser cys his thr

80 ser ser leu ala thr pro glu asp lys glu gin ala gin gin met asn gin lys asp phe

100 leu ser leu ile val ser ile leu arg ser trp asn glu pro leu tyr his leu val thr

110 120 glu val arg gly met gin glu ala pro glu ala ile leu ser lys ala val glu ile glu

130 140 glu gin thr lys arg leu leu glu gly met glu leu ile val ser gin val his pro glu

150 160 thr lys glu asn glu ile tyr pro val trp ser gly leu pro ser leu gin met ala asp

170 180 glu glu ser arg leu ser ala tyr tyr asn leu leu his cys leu arg arg asp ser his

190 199 lys ile asp asn tyr leu lys leu leu lys cys arg ile ile his asn asn asn cys

Numery nad kolejnymi aminokwasami oznaczają numery reszt w łańcuchu peptydowym. Cząsteczka ta kodowana jest przez następującą sekwencję nukleotydową:

PL 191 189 Β1

ATG TTG CCC ATC TGT CCC GGC GGG GCT GCC CGA TGC CAG GTG ACC CTT CGA GAC CTG TTT GAC CGC GCC GTC GTC CTG TCC CAC TAC ATC CAT AAC CTC TCC TCA GAA ATG TTC AGC GAA TTC GAT AAA CGG TAT ACC CAT GGC CGG GGG TTC ATT ACC AAG GCC ATC AAC AGC TGC CAC ACT TCT TCC CTT GCC ACC CCC GAA GAC AAG GAG C AA GCC CAA CAG ATG AAT CAA AAA GAC TTT CTG AGC CTG ATA GYTC AGC ATA TTG CGA TCC TGG AAT GAG CCT CTG TAT CAT CTG GTC ACG GAA GTA CGT GGT ATG CAA GAA GCC CCG GAG GCT ATC CTA TCC AAA GCT GTA GAG ATT GAGT GAG CAA ACC AAA CGG CTT CTA GAG GGC ATG GAG CTG ATA GTC AGC CAG GTT CAT CCT GAA ACC AAA GAA AAT GAG ATC TAC CCT GTC TGG TCG GGA CTT CCA TCC CTG CAG ATG GCT GAT GAA GAG TCT CGC CTT TCT GCT TAT TAT AAC CTG CTC CAC TGC CTA CGC AGG GAT TCA CAT AAA ATC GAC AAT TAT CTC AAG CTC CTG AAG TGC CGA ATC ATC CAC AAC AAC AAC TGC TAA

Hydrofobowa cząsteczka ludzkiej prolaktyny zsyntetyzowana jest w postaci prekursora, zbudowanego z 277 aminokwasów o masie 25,9 kDa [3,4], Sekwencja sygnalna tego prohormonu składa się z 28 aminokwasów (3 kDa), a ostateczna wielkość cząsteczki wynosi 199 aminokwasów (22,9 kDa), [5],

Hormon ten obecny jest w wielu płynach ustrojowych jak osocze, płyn owodniowy, mleko, nasienie, śluz czy płyn mózgowo-rdzeniowy. Prolaktyna bierze udział w wielu istotnych procesach w organizmie ludzkim a do najbardziej istotnych należą stymulacja i utrzymanie procesu laktacji.

Wszelkie zaburzenia w prawidłowym poziomie prolaktyny prowadzą do poważnych zaburzeń w prawidłowym funkcjonowaniu organizmu. Kontrola wydzielania prolaktyny jest procesem bardzo złożonym, w którym uczestniczą różne przekaźniki jak dopamina, hormon uwalniający tyreotropinę, kwas γ-aminomasłowy - GABA oraz estrogeny czy tyroksyna.

Otrzymywanie prolaktyny ludzkiej drogą izolacji ze źródeł naturalnych czyli tkanek ludzkich jest niesłychanie kosztowne, a aktywny hormon uzyskuje się w minimahiych ilościach. Z drugiej strony wszelkie testy medyczne określające poziom tego hormonu w organizmie człowieka wymagają użycia go w stanie czystym jako standardu i są podstawą do określenia wszelkich nieprawidłowości w jego występowaniu, stanowią więc poważną przesłankę określającą zaburzenia poziomu jego występowania i dystrybucji w organizmie ludzkim [6], Otrzymanie więc aktywnego hormonu - prolaktyny poprzez jego syntezę w sztucznie skonstruowanym pozaustrojowym systemie ekspresyjnym znajduje swoje praktyczne uzasadnienie jako ekonomiczna, tania metoda pozyskania peptydu biologicznie czynnego o ogromnym znaczeniu w diagnostyce.

Dotychczas ekspresję genu ludzkiej prolaktyny prowadzono jedynie w systemie bakteryjnym [7], Otrzymany w ten sposób produkt białkowy nie podlega modyfikacjom potranslacyjnym, a co za tym idzie różni się nieco od cząsteczki hormonu występującego w organizmach wyższych w warunkach fizjologicznych. W konsekwencji aktywność biologiczna cząsteczki takiego hormonu nie dorównuje aktywności hormomu naturalnego.

Nieoczekiwanie, okazało się że możliwe jest wytworzenie prolaktyny ludzkiej praktycznie nie różniącej się od cząsteczki hormonu występującego w organizmach wyższych w warunkach fizjologicznych dorównującej aktywności hormomu naturalnego, sposobem według wynalazku poprzez rekombinanta bakulowirusa.

PL 191 189 B1

Sposób wytwarzania prolaktyny ludzkiej, według wynalazku polega na tym, że prowadzi się ekspresję genu kodującego ludzką prolaktynę za pomocą bakulowirusowego systemu ekspresyjnego Bac-to-Bac (Gibco), otrzymany rekombinant namnaża się w bakteryjnych komórkach E.coli, a po wydzieleniu bakmidowego DNA z komórek E.coli tranfekuje się nim komórki owadzie, po czym otrzymaną zawiesiną wirusa infekuje się zdrowe komórki w których prowadzi się ekspresję białek heterologicznych, a otrzymane białko oczyszcza się i poddaje analizie.

W sposobie według wynalazku ekspresję genu kodującego ludzką prolaktynę za pomocą bakulowirusowego systemu ekspresyjnego Bac-to-Bac (Gibco), korzystnie prowadzi się przez specyficznie zlokalizowaną transpozycję kasety ekspresyjnej w postaci pełnej sekwencji nukleotydowej dla białka ludzkiej prolaktyny umieszczonej między miejscami restrykcyjnymi enzymów, pod promotorem poliedryny, z donora plazmidowego do wektora przenoszącego - bakmidu.

Rekombinant taki namnaża się w bakteryjnych komórkach E.coli zrekombinowanym bakmidowym DNA. Po wydzieleniu tego DNA z komórek E.coli tranfekuje się nim komórki owadzie, następnie otrzymaną zawiesiną wirusa infekuje się zdrowe komórki w których następuje ekspresja białek heterologicznych, które oczyszcza się i poddaje analizie. Do ekspresji prolaktyny wybiera się według screeningu jeden z trzech przygotowanych konstruktów, w wektorach plazmidowych, zapewniający otrzymanie najwyższej wydajności produktu uwolnionego do medium i nie zawierającego sekwencji His-Tag.

Wektorem plazmidowym stosowanym w sposobie według wynalazku może być niewielki plazmid pFast Bac wielkości 4855 par zasad. Sekwencja prolaktyny umieszczona między enzymami restrykcyjnymi Bam H I/Kpn I wbudowana w miejsce wielokrotnego klonowania plazmidu pFast Bac pozwala na otrzymanie rekombinanta pFast Prol, w którym prawidłowość insercji sekwencji kodującej prolaktynę sprawdza się analizą restrykcyjną lub analizą PCR. Dalszy etap procedury polega na transpozycji zrekombinowanego DNA plazmidowego do kompetetnych komórek bakteryjnych DH 10 Bac, zawierających DNA bakmidowe, które jest zmodyfikowanym DNA bakulowirusa AcMNPV, w postaci naturalnej, dużym, dwuniciowym, kolistym genomem, bardzo trudnym do rutynowych manipulacji inżynierii genetycznej. Drugim ważnym elementem obecnym w komórkach DH 10 Bac jest plazmid pomocniczy (helper plasmid).

Bakmid zawiera niskokopiowy replikon mini-F, marker oporności na kanamycynę, fragment DNA kodujący peptyd Lac Za. Koniec genu Lac Za sąsiaduje z niewielką sekwencją będącą miejscem przyłączenia bakteryjnego transpozonu Tn 7 (mini att Tn 7), który nie przerywa ramki odczytu peptydu Lac Za. Tak skonstruowany bakmid namnaża się w kompetentnych komórkach DH 10 Bac jako wielki plazmid, pozwalający zachować oporność na kanamycynę oraz uzupełnić delecję genu Lac Z na chromosomie bakteryjnym, co skutkuje wytwarzaniem niebieskich kolonii bakteryjnych w obecności substratów chromogennych jak X-gal oraz induktora IPTG. Rekombinanty bakmidowe tworzone są poprzez transpozycję elementu mini Tn 7 z plazmidu pFast Bac do bakmidu, gdy transpozycja elementem Tn 7 możliwa jest dzięki obecności plazmidu pomocniczego.

Poniżej przedstawiono przykład wykonania wynalazku.

Przykład

Pełną sekwencję nukleotydową genu kodującego prolaktynę ludzką namnożono w reakcji PCR na matrycy opisanej uprzednio [6]. Do reakcji PCR użyto odpowiedniej pary primerów, gwarantujących otrzymanie właściwych miejsc restrykcyjnych, ograniczających sekwencję właściwego genu. Zastosowane primery wprowadziły dodatkowo miejsca dla enzymów restrykcyjnych Bani H I (w górę od miejsca startu transkrypcji) 5'-CGGGAT CCC ATG TTG CCC ATC TGT CCC GGC - 3' i Kpn I (w 3' - końcu sekwencji genu prolaktyny) 5'- GGG GTA CCA ATT CGA AGC AAG CAA TGG AAC G - 3'. Po strawieniu mieszaniną enzymów restrykcyjnych Bam H I i Kpn I produkt reakcji o wielkości 0,8 kb oczyszczono i wyizolowano. Wydzielony produkt wklonowany został następnie do plazmidu pFastBac tworząc zrekombinowany plazmid pFast-Prol. Otrzymana sekwencja genu prolaktyny ludzkiej jest następująca:

PL 191 189 B1

ATG TTG CCC ATC TGT CCC GGC GGG GCT GCC CGA TGC CAG GTG ACC CTT CGA GAC CTG TTT GAC CGC GCC GTC GTC CTG TCC CAC TAC ATC CAT AAC CTC TCC TCA GAA ATG TTC AGC GAA TTC GAT AAA CGG TAT ACC CAT GGC CGG GGG TTC ATT ACC AAG GCC ATC AAC AGC TGC CAC ACT TCT TCC CTT GCC ACC CCC GAA GAC AAG GAG C AA GCC CAA CAG ATG AAT CAA AAA GAC TTT CTG AGC CTG ATA GTC AGC ATA TTG CGA TCC TGG AAT GAG CCT CTG TAT CAT CTG GTC ACG GAA GTA CGT GGT ATG CAA GAA GCC CCG GAG GCT ATC CTA TCC AAA GCT GTA GAG ATT GAG GAG CAA ACC AAA CGG CTT CTA GAG GGC ATG GAG CTG ATA GTC AGC CAG GTT CAT CCT GAA ACC AAA GAA AAT GAG ATC TAC CCT GTC TGG TCG GGA CTT CCA TCC CTG CAG ATG GCT GAT GAA GAG TCT CGC CTT TCT GCT TAT TAT AAC CTG CTC CAC TGC CTA CGC AGG GAT TCA CAT AAA ATC GAC AAT TAT CTC AAG CTC CTG AAG TGC CGA ATC ATC CAC AAC AAC AAC TGC TAA

a. Transpozvcja

Transpozycja otrzymanego kontsruktu do Bacmidu przeprowadzona była według następującego schematu:

pg (w 5 μΙ) DNA zrekombinowanego donora plazmidowego wprowadzano delikatnie do komórek kompetentnych DH 10 Bac zawieszonych w 100 μl medium LB, umieszczonych w 15 ml probówkach polipropylenowych. Po zakończeniu inkubacji w lodzie przez 30 min mieszaninę poddawano następnie szokowi cieplnemu w 42°C przez 45 sekund. Po schłodzeniu mieszaniny w lodzie przez 2 min dodawano następnie medium S.O.C. i inkubowano w 37°C przez 4 - 6 godzin z zachowaniem stałego mieszania. Po przygotowaniu serii rozcieńczeń w medium S.O.C. (10-1, 10-2, 10-3), rozprowadzano po 100 μΙ zawiesiny z każdego rozcieńczenia na płytkach zawierających gentamycynę (7 ug/ml), kanamycynę (50 ug/ml), tetracyklinę 10 ug/ml) oraz Bluo-gal (100 ug/ml) oraz IPTG (40 ug/ml).

Inkubację w celu wizualizacji właściwych kolonii prowadzono przez minimum 24 godziny.

b. Izolacia zrekombinowanego DNA bakmidowego.

Spośród białych kolonii rekombinantów i wyselekcjonowaniu 10 z nich, przepikowano je na nową szalkę. Po potwierdzeniu prawidłowego fenotypu kolonii, komórki bakterii zostały namnożone w hodowli płynnej w medium LB w obecności antybiotyków w podłożu. Komórki zebrane z 1,5 ml hodowli wirowano, a po usunięciu supernatantu lizowano w roztworze 15 mM buforu Tris-HCl, pH 8,0 z dodatkiem EDTA i RNazy. Po dodaniu rotworu NaOH i 1% SDS oraz dokładnym wymieszaniu inkubowano przez 5 min w temperaturze pokojowej. DNA genomowe wytrąca się octanem potasu w pH 5,5 w lodzie. Po odwirowaniu, supernatant wytrąca się izopropanolem a uzyskany osad jest właściwym preparatem DNA, który może być przechowywany w postaci zamrożonej lub służyć do infekcji wybranych linii zdrowych komórek owadzich.

PL 191 189 B1

Literatura

1. Nicol C.S. (1980) Ontogeny and evolution of prolactins functions.Fee.Proc. Am. Soc.Exp. Biol.39, 2563 - 2566. = 20.

2. Shome B.. Partów A.F. (1977) Humań pituitary prolactin ((iPRL·^ the entire linear amino aoid sequesoe. J. Ciis. Esdcorisci. Meiab. 45, 1112 - 5.

3. Catt K.. My^ B.. Niall H.D. (1996) Humań growth fioomoos ans piaaorsal l aatogen: sSiuto toral simiiarieties. Soiesoe 157, 321 - 326.

4. Niall H. A.,Hceas M. L., Treear G., Seere G.V, Hwasg P., Frieses (1973) The ohemisiry of erowih hormose asd laotoeesio hormose. Reo. Próg. Horm. Res. 29, 387 -416. = 20.

5. Cooke N.E., Coii D., Shise J., Baxtór J.D., Martial A. (1981) Humas prolaotis oodise oDNA struotural asalysis asd evolutiosaly oomparisoss. J.Biol.Chem. 256, 4007 - 4016. = 20

6. Sisha Y. N., Selby F. W., Lewis U. J., Vasderlaas W. P. (1973) Ahomoloeous radioimmusoassay for humas prolaotis. J. Clis. Esdoor. Meiab. 36, 509 - 516. Gilbert M.S.

7. Lowry P.Y., Castro M.G., Woods R.J., Savva D., (1991) Expressios asd partia! purifioaiios of humas prolaotis is Esoheriohia ooli., Ist.J.Bioohem. 23,107 - 114.

8. Luokow V.A., Lee S.C., Barry G.F., Oliss P.O. (1993) EUUioiest eeseratios of isfeotious reoombisast baoulovirus b site-speoifio trassposos-mediated issertios of foreies eeses isto a baoulovirus eesome proparated is Esoheriohia ooli. J.Virol. 67, 4566 - 4579.

Claims (2)

1. Sposób wytwarzasia prolaktysy ludzkiej, znamienny tym, że prowadzi się ekspresję eesu kodująoeeo ludzką prolaktysę za pomooą bakulowirusoweeo sysiemu ekspresyjseeo Bao-to-Bao (Giboo), oirzymasy rekombisast samsaża się w bakteryjsyoh komórkaoh E.coli, a po wydzielesiu bakmidoweeo DNA z komórek E.coli trasfekuje się sim komórki owadzie, po ozym oirzymasą zawiesisą wirusa isfekuje się zdrowe komórki w któryoh prowadzi się ekspresję białek heieroloeiozsyoh, a otrzymase białko oozyszoza się i poddaje asalizie.

2. Sposób wedłue zasirz. 1, znamienny tym, że ekspresję eesu kodująoeeo ludzką prolakiysę za pomooą bakulowirusoweeo sysiemu ekspresyjseeo Bao-to-Bao (Giboo), prowadzi się przez speoyfiozsie zlokalizowasą trasspozyoję kaseiy ekspresyjsej w posiaoi pełsej sekwesoji sukleoiydowej dla białka ludzkiej prolaktysy umieszozosej między miejsoami resirykoyjsymi eszymów pod promotorem poliedrysy, z dosora plazmidoweeo do wektora przesosząoeeo - bakmidu.