PL196507B1 - Sposób wytwarzania oczyszczonej prolaktyny ludzkiej - Google Patents

Abstract

Sposób wytwarzania oczyszczonej prolaktyny ludzkiej, otrzymanej w wyniku ekspresji w komórkach eukariotycznych zrekombinowanej cząsteczki DNA kodującej to białko, znamienny tym, że do cząsteczki DNA przyłącza się fragment zawierający sekwencję mellitynową na N końcu cząsteczki, prowadzi się ekspresję genu kodującego ludzką prolaktynę za pomocą bakulowirusowego systemu ekspresyjnego, a wydzielone na zewnątrz komórki białka wytrąca się przez zmianę pH do wartości 8,5, a następnie wysala siarczanem amonu do 80% (wagowo i/lub objętościowo) stężenia i oczyszcza chromatografią powinowactwa aminokwasów histydynowych przyłączonych do oczyszczanego białka do atomów cynku związanych z fazą stałą w kolumnie chromatograficznej.

Description

A61K 38/24 (2006.01) C07K 14/59 (2006.01) (22) Data zgłoszenia: 01.03.2001

Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (54)

Sposób wytwarzania oczyszczonej prolaktyny ludzkiej

	(73) Uprawniony z patentu: Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, Warszawa,PL
	(72) Twórca(y) wynalazku:
(43) Zgłoszenie ogłoszono:	Joanna Michalik,Warszawa,PL
09.09.2002 BUP 19/02	Ewa Szołajska,Warszawa,PL Ludmiła I. Strokowskaja,Kijów,UA Aleksander A. Sołomko,Kijów,UA Nina C. Kalinina,Kijów,UA
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:	Irina M. Kikhno,Kijów,UA
31.01.2008 WUP 01/08	Anatolii D. Shved,Kijów,UA Elena Ju. Markelova,Kijów,UA (74) Pełnomocnik: Iwona Brodowska, Biuro Prawno-Patentowe s.c., LEX-PAT

⁽⁵⁷⁾ 1. Sposób wytwarzania oczyszczonej prolaktyny ludzkiej, otrzymanej w wyniku ekspresji w komórkach eukariotycznych zrekombinowanej cząsteczki DNA kodującej to białko, znamienny tym, że do cząsteczki DNA przyłącza się fragment zawierający sekwencję mellitynową na N końcu cząsteczki, prowadzi się ekspresję genu kodującego ludzką prolaktynę za pomocą bakulowirusowego systemu ekspresyjnego, a wydzielone na zewnątrz komórki białka wytrąca się przez zmianę pH do wartości 8,5, a następnie wysala siarczanem amonu do 80% (wagowo i/lub objętościowo) stężenia i oczyszcza chromatografią powinowactwa aminokwasów histydynowych przyłączonych do oczyszczanego białka do atomów cynku związanych z fazą stałą w kolumnie chromatograficznej.

PL 196 507 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania oczyszczonej prolaktyny ludzkiej przez rekombinanta bakulowirusa.

Prolaktyna ludzka jest hormonem peptydowym wytwarzanym przez przedni płat przysadki mózgowej, zarówno u kobiet jak i mężczyzn [Nicol C.S. (1980) Ontogeny and evolution of prolactins functions.Fed.Proc. Am. Soc.Exp. Biol.39, 2563-2566. =20; Shome B., Parlow A.F. (1977) Human pituitary prolactin (hPRL): the entire linear amino acid sequence. J. Clin. Endocrinol. Metab. 45, 1112-5]. Należy do grupy trzech hormonów peptydowych o zbliżonym charakterze jeśli idzie o wielkość jak i charakter cząsteczki białkowej, do której należą również dwa inne powszechnie występujące hormony peptydowe a mianowicie: hormon wzrostu (GH), somatotropina oraz laktogen łożyskowy - somatomammotropinana.

Prolaktyna ludzka ma następującą sekwencję aminokwasową:

10 20 leu pro ile cys pro gly gly ala ala arg cys gin val thr leu arg asp leu phe asp

40 arg ala val val leu ser his tyr ile his asn leu ser ser glu met phe ser glu phe

60 asp lys arg tyr thr his gly arg gly phe ile thr lys ala ile asn ser cys his thr

80 ser ser leu ala thr pro glu asp lys glu gin ala gin gin met asn gin lys asp phe

100 leu ser leu ile val ser ile leu arg ser trp asn glu pro leu tyr his leu val thr

110 120 glu val arg gly met gin glu ala pro glu ala ile leu ser lys ala val glu ile glu

130 140 alu aln thr lvs ara leu leu alu alv met alu leu ile val ser aln val his oro alu

W ' W «Τ ' W ** ** * » wr

150 160 thr lys glu asn glu ile tyr pro val trp ser gly leu pro ser leu gin met ala asp

170 180 glu glu ser arg leu ser ala tyr tyr asn leu leu his cys leu arg arg asp ser his 190 199 lys ile asp asn tyr leu lys leu leu lys cys arg ile ile his asn asn asn cys

Numery nad kolejnymi aminokwasami oznaczają numery reszt w łańcuchu peptydowym. Cząsteczka ta kodowana jest przez następującą sekwencję nukleotydową:

ATG TTG CCC ATC TGT CCC GGC GGG GCT GCC CGA TGC CAG GTG ACC CTT CGA GAC CTG TTT GAC CGC GCC GTC GTC CTG TCC CAC TAC ATC CAT AAC CTC TCC TCA GAA ATG TTC AGC GAA TTC GAT AAA CGG TAT ACC CAT GGC CGG GGG TTC ATT ACC AAG GCC ATC AAC AGC TGC CAC ACT TCT TCC CTT GCC ACC CCC GAA GAC AAG GAG C AA GCC CAA CAG ATG AAT CAA AAA GAC TTT CTG AGC CTG ATA GYTC AGC ATA TTG CGA TCC TGG AAT GAG CCT CTG TAT CAT CTG GTC ACG GAA GTA CGT GGT ATG CAA GAA GCC CCG GAG GCT ATC CTA TCC AAA GCT GTA GAG ATT GAGT GAG CAA ACC AAA CGG CTT CTA GAG GGC ATG GAG CTG ATA GTC AGC CAG GTT CAT CCT GAA ACC AAA GAA AAT GAG ATC TAC CCT GTC TGG TCG GGA CTT CCA TCC CTG CAG ATG GCT GAT GAA GAG TCT CGC CTT TCT GCT TAT TAT AAC CTG CTC CAC TGC CTA CGC AGG GAT TCA CAT AAA ATC GAC AAT TAT CTC AAG CTC CTG AAG TGC CGA ATC ATC CAC AAC AAC AAC TGC TAA

PL 196 507 B1

Hydrofobowa cząsteczka ludzkiej prolaktyny zsyntetyzowana jest w postaci prekursora, zbudowanego z 277 aminokwasów o masie 25,9 kDa [Catt K., Myffat B., Niall H.D. (1967) Human growth hormone and placental lactogen: structural similarieties. Science 157, 321-326; Niall H. A.,Hogan M. L., Tregar G., Segre G.V, Hwang P., Friesen (1973) The chemistry of growth hormone and lactogenic hormone. Rec. Prog. Horm. Res. 29, 387-416.=20]. Sekwencja sygnalna tego prohormonu składa się z 28 aminokwasów (3 kDa), a ostateczna wielkość cząsteczki wynosi 199 aminokwasów (22,9 kDa), [Cooke N.E., Coit D., Shine J., Baxter J.D., Martial A. (1981) Human prolactin coding cDNA structural analysis and evolutionaly comparisons. J.Biol.Chem. 256,4007-4016.=20].

Hormon ten obecny jest w wielu płynach ustrojowych jak osocze, płyn owodniowy, mleko, nasienie, śluz czy płyn mózgowo-rdzeniowy. Prolaktyna bierze udział w wielu istotnych procesach w organizmie ludzkim, a do najbardziej istotnych należą stymulacja i utrzymanie procesu laktacji.

Wszelkie zaburzenia w prawidłowym poziomie prolaktyny prowadzą do poważnych zaburzeń w prawidłowym funkcjonowaniu organizmu. Kontrola wydzielania prolaktyny jest procesem bardzo złożonym, w którym uczestniczą różne przekaźniki jak dopamina, hormon uwalniający tyreotropinę, kwas γ-aminomasłowy - GABA oraz estrogeny czy tyroksyna.

Otrzymywanie prolaktyny ludzkiej drogą izolacji ze źródeł naturalnych czyli tkanek ludzkich jest niesłychanie kosztowne, a aktywny hormon uzyskuje się w minimalnych ilościach. Z drugiej strony wszelkie testy diagnostyczne określające poziom tego hormonu w organizmie człowieka wymagają użycia go w stanie czystym jako standardu i są podstawą do określenia wszelkich nieprawidłowości w jego występowaniu, stanowią więc poważną przesłankę określającą zaburzenia poziomu jego występowania i dystrybucji w organizmie ludzkim [Sinha Y. N., Selby F. W., Lewis U. J., Vanderlaan W. P, (1973) Ahomologous radioimmunoassay for human prolactin. J. Clin. Endocr. Metab. 36, 509-516. Gilbert M.S.]. Otrzymanie więc aktywnego hormonu - prolaktyny poprzez jego syntezę w sztucznie skonstruowanym pozaustrojowym systemie ekspresyjnym znajduje swoje praktyczne uzasadnienie jako ekonomiczna, tania metoda pozyskania peptydu biologicznie czynnego o ogromnym znaczeniu w diagnostyce.

Dotychczas ekspresję genu ludzkiej prolaktyny prowadzono jedynie w systemach bakteryjnych [Luckow V.A., Lee S.C., Barry G.F., Olins P.O. (1993) Efficient generation of infectious recombinant baculovirus by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome proparated in Escherichia coli. J.Virol. 67, 4566-4579]. Otrzymany w ten sposób produkt białkowy nie podlega modyfikacjom potranslacyjnym, a co za tym idzie różni się nieco (jest zubożony) w stosunku do cząsteczki hormonu występującego w organizmach wyższych w warunkach fizjologicznych. W konsekwencji aktywność biologiczna cząsteczki takiego hormonu nie dorównuje aktywności hormonu naturalnego.

Nieoczekiwanie, okazało się że sposobem według wynalazku możliwe jest łatwe wytworzenie i wydzielenie czystej prolaktyny ludzkiej praktycznie nie różniącej się od cząsteczki hormonu występującego w organizmach wyższych, a tym samym dorównującej aktywności hormonu naturalnego, w warunkach fizjologicznych, z wykorzystaniem eukariotycznego systemu ekspresyjnego, opartego o hodowle in vitro komórek owadzich zakażanych zrekombinowanym bakulowirusem.

Sposób wytwarzania oczyszczonej prolaktyny ludzkiej, otrzymanej w wyniku ekspresji w komórkach eukariotycznych zrekombinowanej cząsteczki DNA kodującej to białko, według wynalazku polega na tym, że do cząsteczki DNA przyłącza się fragment zawierający sekwencję mellitynową na N końcu cząsteczki, prowadzi się ekspresję genu kodującego ludzką prolaktynę za pomocą bakulowirusowego systemu ekspresyjnego, a wydzielone na zewnątrz komórki białka wytrąca się przez zmianę pH, a następnie wysala siarczanem amonu i oczyszcza.

W sposobie według wynalazku, jako zrekombinowaną cząsteczkę DNA kodującą wytwarzane białko - prolaktynę stosuje się cząsteczkę zawierającą sekwencje ją kodującą pomiędzy sekwencjami rozpoznawanymi przez restryktazy BamH l /Kpn I.

W sposobie według wynalazku pH medium w którym prowadzi się hodowlę podwyższa się po zakończeniu hodowli, a wytrącone tym sposobem białka zanieczyszczające osadza przez wirowanie.

W sposobie według wynalazku pH medium w którym prowadzi się hodowlę podwyższa się po zakończeniu hodowli do wartości pH 8,5 a wytrącone tym sposobem białka zanieczyszczające osadza przez wirowanie.

W sposobie według wynalazku białka zawarte w otrzymanym supernatancie wytrąca się przez dodanie do niego siarczanu amonu a następnie wiruje i odzyskuje frakcję białek wytrąconych.

PL 196 507 B1

W sposobie według wynalazku dodaje się siarczanu amonu do 80% (wagowo i/lub objętościowo) stężenia.

W sposobie wedł ug wynalazku dalsze oczyszczanie biał ka prolaktyny ludzkiej prowadzi się za pomocą chromatografii afinitywnej.

W sposobie wedł ug wynalazku stosuje się chromatografię powinowactwa aminokwasów histydynowych przyłączonych do oczyszczanego białka do atomów kobaltu lub cynku związanych z fazą stałą w kolumnie chromatograficznej.

Celem uzyskania stabilnego produktu uwalnianego do podłoża inkubacyjnego, gen ludzkiej prolaktyny zrekombinowano in vitro z plazmidem pMelBacB zawierającym mellitynową sekwencję sekrecyjną umożliwiającą wydajne usuwanie produktu z komórki. Zastosowanie plazmidu pMelBacB umożliwia zachowanie prawidłowej ramki odczytu genu prolaktyny, przy zastosowaniu w procesie transformacji miejsc restrykcyjnych BamH/Kpn. Do procesu rekombinacji używano DNA wektora plazmidowego zawierającego sekwencję mellitynową oraz DNA Bac-N-Blue. Bac-N-Blue DNA jest formą liniową genomowego DNA wirusowego z delecją obszaru koniecznego do replikacji, która to delecja może być uzupełniona poprzez utworzenie rekombinanta, między dwoma formami DNA: Bac-N-Blue oraz pMelBacC PRL.

Wydajność prolaktyny wytworzonej sposobem według wynalazku wynosiła około 30 mg/l medium.

Otrzymany produkt wykazywał aktywność biologiczną w teście proliferacyjnym in vitro z komórkami Nb2 oraz w teście in vivo wykonanym na skrawkach gruczołu mlecznego królika.

Aktywność produktu porównywalna była w obu testach do ludzkiej prolaktyny izolowanej z tkanek człowieka, służącej jako wzorzec.

Celem łatwiejszego oczyszczania produktu z medium skonstruowano rekombinant bacmidowy zawierający sekwencję mellitynową na N końcu cząsteczki prolaktyny oraz sekwencję polihistydynową na C końcu prolaktyny. Sposób postępowania przy otrzymaniu tego konstruktu był następujący: matrycę stanowił plazmid pMeIPRL B. Primerami były: 42 mer reverse CCC GGT ACC TCA ATG ATG ATG ATG ATG ATG GCA GTT GTT GTT - sekwencja komplementarna do 3' końca sekwencji kodującej prolaktynę, sześciu reszt histydynowych, kodonu STOP, oraz miejsca restrykcyjnego dla Kpn l i trzech nukleotydów oskrzydlają cych oraz 19 mer, baculovirus forward PCR priming site (lnvitrogen): TTT TAC TGT TTT CGT AAC AGT TTT GW ten sposób otrzymać można produkt uwalniany do medium, który po zatężeniu siarczanem amonu do 80% wysycenia, obecny jest w osadzie i może być łatwo przeprowadzony w formę rozpuszczalną, podlegającą dalszemu oczyszczeniu.

Wydajne czyszczenie prolaktyny następuje przy zmianie pH medium z 6,2, w którym prowadzi się hodowlę do pH 8,5, uzyskując wytrącenie ponad 30% białek towarzyszących prolaktynie.

Stabilność produktu w medium inkubacyjnym wynosi 10-12 miesięcy w temp 4°C bez używania inhibitorów proteaz.

Wydajności prolaktyny w medium bezalbuminowym, przy wydłużeniu czasu pozyskiwania produktu z 96 do 120 godzin są niższe.

W sposobie według wynalazku pełną sekwencję nukleotydową genu kodującego prolaktynę ludzką namnaża się w reakcji PCR z DNA genomowego człowieka, na matrycy opisanej w literaturze [Sinha Y. N., Selby F. W., Lewis U. J., Vanderlaan W. P. (1973) Ahomologous radioimmunoassay for human prolactin. J. Clin. Endocr. Metab. 36, 509-516. Gilbert M.S.]. Do reakcji PCR używa się parę primerów, które wprowadzają dodatkowo sekwencje rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne, ograniczające sekwencję właściwego genu. Następnie przy użyciu plazmidu pMelBacC do namnożonego genu wprowadza się na końcu 5'sekwencję mellitynową. Zastosowane primery wprowadzają dodatkowo miejsca dla enzymów restrykcyjnych Bam H l (w górę od miejsca startu transkrypcji)

5'- CGGGAT CCC ATG TTG CCC ATC TGT CCC GGC - 3' i Kpn l (w 3' - koń cu sekwencji genu prolaktyny)

5'- GGG GTA CCA ATT CGA AGC AAG CAA TGG AAC G - 3'.

Po strawieniu mieszaniną enzymów restrykcyjnych BamH l i Kpn l produkt reakcji o wielkości

0,8 kb oczyszczono i wyizolowano. Wydzielony produkt wklonowany został następnie do plazmidu pFastBac tworząc zrekombinowany plazmid pFast-Prol. Otrzymana sekwencja genu prolaktyny ludzkiej jest następująca:

PL 196 507 B1

ATG TTG CCC ATC JGT CCC GGC GGG GCT GCC CGA TGC CAG GTG ACC CTT CGA GAC CTG TTT GAC CGC GCC GTC GTC CTG TCC CAC TAC ATC CAT AAC CTC TCC TCA GAA ATG TTC AGC GAA TTC GAT AAA CGG TAT ACC CAT GGC CGG GGG TTC ATT ACC AAG GCC ATC AAC AGC TGC CAC

ΔΡΤ TPT TPP PTT ΠΡΡ ΔΡΡ PPP ΩΔΔ ΩΔΡ ΔΔΩ CAC P ΔΔ CPP ΡΔΔ /''AfC • łw a i WI w V i a ł «w >-*/ W l IW /-W~\

ATG AAT CAA AAA GAC TTT CTG AGC CTG ATA GTC AGC ATA TTG CGA TCC TGG AAT GAG CCT CTG TAT CAT CTG GTC ACG GAA GTA CGT GGT ATG CAA GAA GCC CCG GAG GCT ATC CTA TCC AAA GCT GTA GAG ATT GAG GAG CAA ACC AAA CGG CTT CTA GAG GGC ATG GAG CTG ATA GTC AGC CAG GTT CAT CCT GAA ACC AAA GAA AAT GAG ATC TAC CCT GTC TGG TCG GGA CTT CCA TCC CTG CAG ATG GCT GAT GAA GAG TCT CGC CTT TCT GCT TAT TAT AAC CTG CTC CAC TGC CTA CGC AGG GAT TCA CAT AAA ATC GAC AAT TAT CTC AAG CTC CTG AAG TGC CGA ATC ATC CAC AAC AAC AAC TGC TAA

W sposobie według wynalazku ekspresję genu kodującego ludzką prolaktynę za pomocą bakulowirusowego systemu ekspresyjnego Bac-N-Blue (Gibco), korzystnie prowadzi się przez specyficznie zlokalizowaną transpozycję kasety ekspresyjnej w postaci pełnej sekwencji nukleotydowej dla białka ludzkiej prolaktyny umieszczonej między miejscami restrykcyjnymi enzymów, pod promotorem poliedryny, z donora plazmidowego do wektora przenoszącego - bakmidu.

Rekombinant taki namnaża się w bakteryjnych komórkach E.coli z wtransformowanym zrekombinowanym bakmidowym DNA. Po wydzieleniu tego DNA z komórek E.coli transfekuje się nim komórki owadzie, następnie otrzymaną zawiesiną wirusa infekuje się zdrowe komórki w których następuje ekspresja białek heterologicznych, które oczyszcza się i poddaje analizie. Do ekspresji prolaktyny wybiera się w drodze selekcji jeden z trzech przygotowanych rekombinantów plazmidowych, zapewniający otrzymanie najwyższej wydajności produktu uwolnionego do medium i nie zawierającego sekwencji His-Tag.

Wektorem plazmidowym stosowanym w sposobie według wynalazku może być niewielki plazmid pFast Bac wielkości 4855 par zasad. Sekwencja prolaktyny umieszczona między sekwencjami rozponawanymi przez enzymy restrykcyjne BamH l/ Kpn l wbudowana w miejsce wielokrotnego klonowania plazmidu pFast Bac pozwala na otrzymanie rekombinanta pFast Prol, w którym prawidłowość insercji sekwencji kodującej prolaktynę sprawdza się analizą restrykcyjną lub analizą PCR. Dalszy etap procedury polega na transpozycji zrekombinowanego DNA plazmidowego do kompetentnych komórek bakteryjnych DH 10 Bac, zawierających DNA bakmidowe, które jest zmodyfikowanym DNA bakulowirusa AcMNPV, w postaci naturalnej, dużym, dwuniciowym, kolistym genomem, bardzo trudnym do rutynowych manipulacji inżynierii genetycznej. Drugim ważnym elementem obecnym w komórkach DH 10 Bac jest plazmid pomocniczy (helper plasmid).

Bakmid zawiera niskokopiowy replikon mini-F, marker oporności na kanamycynę, fragment

DNA kodujący peptyd Lac Za. Koniec genu Lac Za sąsiaduje z niewielką sekwencją będącą miejscem przyłączenia bakteryjnego transpozonu Tn 7 (mini att Tn 7), który nie przerywa ramki odczytu peptydu Lac Za. Tak skonstruowany bakmid namnaża się w kompetentnych komórkach DH 10 Bac jako wielki plazmid, pozwalający zachować oporność na kanamycynę oraz uzupełnić delecję genu Lac Z na chromosomie bakteryjnym, co skutkuje wytwarzaniem niebieskich kolonii bakteryjnych w obecności substratów chromogennych jak X-gal oraz induktora IPTG. Rekombinanty bakmidowe tworzone są poprzez transpozycję elementu mini Tn 7 z plazmidu pFast Bac do bakmidu, gdy transpozycja elementem Tn 7 możliwa jest dzięki obecności plazmidu pomocniczego.

Poniżej przedstawiono przykład wykonania wynalazku.

P r z y k ł a d. Pełną sekwencję nukleotydową genu kodującego prolaktynę ludzką namnożono w reakcji PCR na matrycy opisanej uprzednio [Sinha Y. N., Selby F, W., Lewis U. J., Vanderlaan W. P.

PL 196 507 B1 (1973) Ahomologous radioimmunoassay for human prolactin. J. Clin. Endocr. Metab. 36, 509-516. Gilbert M.S.]. Do reakcji PCR użyto odpowiedniej pary primerów, gwarantujących otrzymanie właściwych miejsc restrykcyjnych, ograniczających sekwencję właściwego genu. Następnie przy użyciu plazmidu pMelBacC do namnożonego genu wprowadzono na końcu 5'sekwencję mellitynową. Do tak namnożonego genu wprowadzono na końcu 5'sekwencję mellitynową. Zastosowane primery wprowadziły dodatkowo miejsca dla enzymów restrykcyjnych Bam H l (w górę od miejsca startu transkrypcji) 5'- CGGGAT CCC ATG TTG CCC ATC TGT CCC GGC - 3' i Kpn l (w 3' - końcu sekwencji genu prolaktyny) 5'- GGG GTA CCA ATT CGA AGC AAG CAA TGG AAC G -3'. Po strawieniu mieszaniną enzymów restrykcyjnych BamH l i Kpn l produkt reakcji o wielkości 0,8 kb oczyszczono i wyizolowano. Wydzielony produkt wklonowany został następnie do plazmidu pFastBac tworząc zrekombinowany plazmid pFast-Prol. Otrzymana sekwencja genu prolaktyny ludzkiej jest następująca:

ATG TTG CCC ATC TGT CCC GGC GGG GCT GCC CGA TGC CAG GTG ACC

CTT CGA GAC CTG TTT GAC CGC GCC GTC GTC CTG TCC CAC TAC ATC

CAT AAC CTC TCC TCA GAA ATG TTC AGC GAA TTC GAT AAA CGG TAT

ACC CAT GGC CGG GGG TTC ATT ACC AAG GCC ATC AAC AGC TGC CAC

AGT TCT TCC CTT GCC ACC CCC GAA GAC AAG GAG C AA GCC GAA CAG ATG AAT CAA AAA GAC TTT CTG AGC CTG ATA GTC AGC ATA TTG CGA TCC TGG AAT GAG CCT CTG TAT CAT CTG GTC ACG GAA GTA CGT GGT ATG CAA GAA GCC CCG GAG GCT ATC CTA TCC AAA GCT GTA GAG ATT GAG GAG CAA ACC AAA CGG CTT CTA GAG GGC ATG GAG CTG ATA GTC AGC CAG GTT CAT CCT GAA ACC AAA GAA AAT GAG ATC TAC CCT GTC TGG TCG GGA CTT CCA TCC CTG CAG ATG GCT GAT GAA GAG TCT CGC CTT TCT GCT TAT TAT AAC CTG CTC CAC TGC CTA CGC AGG GAT TCA CAT AAA ATC GAC AAT TAT CTC AAG CTC CTG AAG TGC CGA ATC ATC CAC AAC AAC AAC TGC TAA

a. Transpozycja

Transpozycja otrzymanego konstruktu do Bacmidu przeprowadzona była według następującego schematu:

μg (w 5 μί) DNA zrekombinowanego donora plazmidowego wprowadzano delikatnie do komórek kompetentnych DH 10Bac zawieszonych w 100 μί medium LB, umieszczonych w 15 ml probówkach polipropylenowych. Po zakończeniu inkubacji w lodzie przez 30 min. mieszaninę poddawano następnie szokowi cieplnemu w 42°C przez 45 sekund. Po schłodzeniu mieszaniny w lodzie przez 2 min. dodawano następnie medium S.O.C. i inkubowano w 37°C przez 4 - 6 godzin z zachowaniem stałego mieszania. Po przygotowaniu serii rozcieńczeń w medium S.O.C. (10^-1, 10^-2, 10^-3), rozprowadzano po 100 μί zawiesiny z każdego rozcieńczenia na płytkach zawierających gentamycynę (7 μg/ml), kanamycynę (50 μg/mί), tetracyklinę (10 μg/mί) oraz Bluo-gal (100 μg/mί) oraz IPTG (40 μg/mί).

Inkubację w celu wizualizacji właściwych kolonii prowadzono przez minimum 24 godz.

b. Izolacja zrekombinowanego DNA bakmidowego.

Spośród białych kolonii rekombinantów i wyselekcjonowaniu 10 z nich, przepikowano je na nową szalkę. Po potwierdzeniu prawidłowego fenotypu kolonii, komórki bakterii zostały namnożone w hodowli płynnej w medium LB w obecności antybiotyków w podłożu. Komórki zebrane z 1,5 ml hodowli wirowano, a po usunięciu supernatantu lizowano w roztworze 15 mM buforu Tris-HCI, pH 8,0 z dodatkiem EDTA i RNazy. Po dodaniu roztworu NaOH i 1% SDS oraz dokładnym wymieszaniu inkubowano przez 5 min. w temperaturze pokojowej. DNA genomowe wytrąca się octanem potasu w pH 5,5 w lodzie. Po odwirowaniu, supernatant wytrąca się izopropanolem a uzyskany osad jest właściwym preparatem DNA, który może być przechowywany w postaci zamrożonej lub służyć do infekcji wybranych linii zdrowych komórek owadzich.

PL 196 507 B1

Claims (2)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania oczyszczonej prolaktyny ludzkiej, otrzymanej w wyniku ekspresji w komórkach eukariotycznych zrekombinowanej cząsteczki DNA kodującej to białko, znamienny tym, że do cząsteczki DNA przyłącza się fragment zawierający sekwencję mellitynową na N końcu cząsteczki, prowadzi się ekspresję genu kodującego ludzką prolaktynę za pomocą bakulowirusowego systemu ekspresyjnego, a wydzielone na zewnątrz komórki białka wytrąca się przez zmianę pH do wartości 8,5, a następnie wysala siarczanem amonu do 80% (wagowo i/lub objętościowo) stężenia i oczyszcza chromatografią powinowactwa aminokwasów histydynowych przyłączonych do oczyszczanego białka do atomów cynku związanych z fazą stałą w kolumnie chromatograficznej.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako zrekombinowaną in vitro cząsteczkę DNA kodującą prolaktynę stosuje się cząsteczkę zawierającą sekwencje ją kodującą pomiędzy sekwencjami rozpoznawanymi przez restryktazy BamH I /Kpn I.