JPH06292569A - ヒトグルタミン酸脱炭酸酵素を産生する形質転換された動物細胞株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ヒトグルタミン酸脱炭酸酵素の発現が可能な
ベクターにより形質転換されたヒトグルタミン酸脱炭酸
酵素発現動物細胞株。 【効果】 本発明の形質転換動物細胞株によれば、イン
スリン依存型糖尿病の診断のための従来法において必要
とされた、新鮮ヒトまたはラット膵島抽出物の用時調製
および放射性同位元素の使用が不要となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒトグルタミン酸脱炭
酸酵素を産生する形質転換された細胞株とそれを用いる
ヒトグルタミン酸脱炭酸酵素に対する抗体の検出法に関
する。本発明を用いることによりインスリン依存型糖尿
病（Ｉ型糖尿病ともいう；以下、これを「ＩＤＤＭ」と
略記することがある）の発症を診断することができる。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】イン
スリン依存型糖尿病は、膵ランゲルハンス氏島（以下、
これを「膵島」または「膵ラ氏島」と略記することがあ
る）のインスリン分泌細胞が、自己の免疫系によって破
壊されることによって発症する自己免疫疾患と考えられ
ている。インスリン依存型糖尿病患者血清中には、その
発症前から種々の自己抗体が出現することが知られてお
り、それらの自己抗体がインスリン依存型糖尿病発症の
予知マーカーとして診断上極めて有用であることが確認
されている（L. Castano, G.S. Eisenbarth, Annual Re
view of Immunology, vol. 8, p.647-679, 1990)。

【０００３】膵ランゲルハンス氏島の分子量６４，００
０ダルトン（６４ＫＤ）のタンパクに対する抗体（以
下、これを「抗６４ＫＤ抗体」と略記することがある）
もそれらの一つであり、Ｉ型糖尿病発症前および発症早
期の患者血清中の７０〜８０％に検出される（S. Baekk
eskov, et al., J. Clin. Invest. vol. 79, p.926-93
4, 1987）。

【０００４】抗６４ＫＤ抗体を検出する現行法として
は、ラット単離膵島もしくはヒト単離膵島を、無菌下に
て放射性メチオニンを含む培地中で４〜６時間培養後可
溶化し、これをＩＤＤＭ患者血清と混合して膵島中の６
４ＫＤタンパクと患者血清中の抗６４ＫＤ抗体とを反応
させ、反応物をプロテインＡセファロース等にて免疫沈
降させ、沈降物を電気泳動後オートラジオグラフィ法で
解析するといった手法がとられている（M.R. Christie
et al., J.B.C., vol. 265, no. 1, p.376-381,1990)
。

【０００５】前記現行法は、 １．検出の都度新鮮な膵島材料を必要とすること、 ２．手法が煩雑であり、かつ熟練を要すること、 ３．放射性物質を必要とすること、 ４．結果が得られるまで一週間近くかかること、 など多くの問題点を含んでいる。したがって、Ｉ型糖尿
病の発症前および発症早期の診断が臨床上極めて重要で
あり、その目的のために抗６４ＫＤ抗体検出が有用であ
ることが明らかになっている現在、簡便迅速な抗６４Ｋ
Ｄ抗体検出法の出現が強く望まれている。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、前記問題点を
包含する従来の抗６４ＫＤ抗体検出法を改良するため提
供するものである。すなわち、従来法を用いる場合には
その都度必要となる、ラットまたはヒト単離膵島材料か
らの６４ＫＤタンパクの調製および放射性同位元素の使
用を必要とせずに、抗６４ＫＤ抗体を検出する方法を提
供することを目的とする。

【０００７】近年、この６４ＫＤタンパクが、γ−アミ
ノ酪酸（以下、これを「ＧＡＢＡ」と略記することがあ
る）合成酵素であるグルタミン酸脱炭酸酵素（以下、こ
れを「ＧＡＤ」と略記することがある）であるとの報告
がなされた（Nature, vol. 347, p.151-156, 1990)。し
たがって、抗６４ＫＤ抗体検出において常に必要とされ
た新鮮膵島材料からの６４ＫＤタンパクの調製を、膵島
起源のＧＡＤの調製に置き換えることにより、検出手法
を簡略化できることになる。そこで本発明者らは、ヒト
膵島起源のＧＡＤを安定的に確保するための手段として
遺伝子組み換え技術を応用することに着目し、鋭意努力
を重ねた結果、ほ乳動物細胞にヒト膵島起源ＧＡＤ遺伝
子を導入した形質転換細胞株の樹立に成功し、本発明を
完成するに至った。

【０００８】本発明の形質転換細胞株は、ヒト膵島起源
ＧＡＤ遺伝子を動物細胞用発現ベクターに組み込み、こ
れをチャイニーズハムスター卵母細胞（以下、これを
「ＣＨＯ細胞」と略記することがある）に導入して得ら
れるものである。本細胞株は、ヒトグルタミン酸脱炭酸
酵素産生能を有し、培養した本細胞株の可溶化分画はＩ
型糖尿病患者血清と反応するＧＡＤを含んでいるので、
これを用いて抗６４ＫＤ抗体を検出することができる。
以下、本発明をさらに具体的に説明する。

【０００９】（形質転換細胞株の樹立）ヒト膵島起源Ｇ
ＡＤを発現する形質転換細胞株は、以下に述べる方法に
よって樹立することができる。

【００１０】（１）ヒト膵ラ氏島由来ＧＡＤ遺伝子の取
得 ヒト膵ラ氏島よりＲＮＡ分画を抽出精製し、逆転写酵素
によりｃＤＮＡを作製する。このｃＤＮＡを鋳型とし、
ヒトＧＡＤ遺伝子配列に対して特異的なプライマーを用
い、ポリメラーゼチェイン反応（以下、これを「ＰＣ
Ｒ」と略記することがある）法にてヒトＧＡＤ遺伝子を
増幅し、これを大腸菌等で増殖可能なプラスミドベクタ
ー、例えば、ブルースクリプトII〔ストラタジーン（ST
RATAGENE）社製〕、ｐＵＣ１８／ｐＵＣ１９（ファルマ
シアＬＫＢバイオテクノロジー社より入手可能）、ｐＧ
ＥＭ−３／ｐＧＥＭ−４（プロメガ社より入手可能）等
に組み込む。これを通常の形質導入法により大腸菌に導
入し、培養後、該菌体から常法によりヒト膵ラ氏島由来
ＧＡＤ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを得ることができ
る。

【００１１】また、前記方法にて作製したｃＤＮＡをフ
ァージベクター、例えばλgt 11 （ストラタジーン社
製）にパッケージしたライブラリーを作製し、ＧＡＤ遺
伝子の一部をプローブとしてライブラリーをスクリーニ
ングすること等によっても、ヒト膵ラ氏島由来ＧＡＤ遺
伝子を含むベクターを取得することができる。

【００１２】（２）動物細胞用発現ベクターへのヒトＧ
ＡＤ遺伝子の導入 前記の方法により得られたヒトＧＡＤ遺伝子は、適当な
制限酵素によりベクターから切り出し、制限酵素サイト
を含むリンカーＤＮＡ、および連結酵素、制限酵素、そ
の他分子生物学で一般に用いられている各種酵素を組み
合わせて用いることにより、各種動物細胞用発現ベクタ
ーに導入することができる。

【００１３】例えば、ブルースクリプトIIに組み込んだ
ヒト膵ラ氏島由来のＧＡＤ遺伝子を、制限酵素ＢａｍＨ
ＩおよびＳａｌＩでベクターＤＮＡから切り出し、あら
かじめ同じ制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで処理し
た動物細胞用の発現ベクター、ｐＤＯＬ（大腸菌内でも
プラスミドとして増殖可能ないわゆるシャトルベクタ
ー；A.J. Korman, J.D. Franz, J.L. Strominger and
R.C. Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 8
4, p.2150-2154, 1987; Massachusetts Institutesof T
echnology, Dr. R.C. Mulligan より入手）に連結する
ことにより、ヒトＧＡＤ遺伝子を動物細胞用発現ベクタ
ーに導入できる。更に、例えば、ブルースクリプトIIに
組み込んだヒト膵ラ氏島由来のＧＡＤ遺伝子を、制限酵
素ＮｏｔＩおよびＡｐａＩでベクターＤＮＡから切り出
し、あらかじめ同じ制限酵素ＮｏｔＩおよびＡｐａＩで
処理した動物細胞用の発現ベクター、ｐＲＣ／ＣＭＶ
（シャトルベクター、インビトロジェン社より入手可
能）に連結することによっても、ヒトＧＡＤ遺伝子を動
物細胞用発現ベクターに導入できる。

【００１４】（３）形質転換細胞の取得 ヒト膵ラ氏島由来ＧＡＤを組み込んだ動物細胞用発現ベ
クターＤＮＡの調製は、このベクター（大腸菌内でもプ
ラスミドとして増殖可能）を大腸菌に導入し、培養後、
該菌体よりＧＡＤ遺伝子を組み込んだベクターＤＮＡを
回収することにより行うことができる。例えば、前記の
ヒト膵ラ氏島由来ＧＡＤを組み込んだｐＤＯＬベクター
ＤＮＡ（以下、これを「ｐＤＯＬ−ＨＩＧＡＤ」と略記
することがある）をコンピテント大腸菌ＸＬ−１ Blue
(ストラタジーン社製）に導入し、この大腸菌を培養
後、該菌体よりジェイ・サンブルックらの文献（J. Sam
brook,E.F. Fritsch, T. Maniatis, "Molecular Clonin
g: A LABORATRY MANUAL, SECOND EDITION", Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press, 1989; 以下、この文献を
「モレキュラー・クローニング」と記す）第１章記載の
アルカリ溶解法等により、ｐＤＯＬ−ＨＩＧＡＤを取得
することができる。

【００１５】次に、ＧＡＤを組み込んだ動物細胞用発現
ベクターＤＮＡを、それ自体既知の通常用いられる形質
導入法、例えば、リン酸カルシウム法、電気穿孔法、リ
ポソームを用いる方法等により種々の動物細胞に導入す
ることができる（「モレキュラー・クローニング」第１
６章参照）。用い得る動物細胞としては、例えばＣＨＯ
細胞（理化学研究所細胞バンクより入手可能）、ＢＨＫ
−２１細胞〔シリアン・ハムスター腎細胞；アメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）より
入手可能〕、ＣＯＳ−７細胞（アフリカン・グリーンモ
ンキー腎細胞；理化学研究所ジーンバンクより入手可
能）等を挙げることができる。

【００１６】前記ヒト膵ラ氏島由来のＧＡＤを組み込ん
だｐＤＯＬベクターＤＮＡ（ｐＤＯＬ−ＨＩＧＡＤ）の
ＣＨＯ細胞への形質導入は、ウシ胎児胸腺ＤＮＡをｐＤ
ＯＬ−ＨＩＧＡＤのキャリアーＤＮＡ（形質転換効率を
上げるために用いる；「モレキュラー・クローニング」
第１６章参照）として用い、リン酸カルシウム法により
行うことができる。形質導入した後は、適当な選択マー
カーを用いて目的の遺伝子を取り込んだ細胞のみを選択
的に増殖させることにより、目的とする形質転換動物細
胞株を得ることができる。例えば、ｐＤＯＬ−ＨＩＧＡ
Ｄを導入したＣＨＯ細胞は、抗生物質Ｇ４１８（シグマ
社より入手可能）により選択的に増殖する。ｐＤＯＬ−
ＨＩＧＡＤを導入したＣＨＯ細胞の場合、形質導入２日
後より４００μg/mlのＧ４１８で選択を開始し、２〜３
週間後コロニーを分離することができる。

【００１７】（形質転換細胞株におけるＧＡＤ発現の確
認）得られた形質転換細胞株がヒトＧＡＤタンパクを発
現していることは、以下の方法（ウエスタン・ブロッテ
ィング法）によって確認できる。すなわち、よく生育し
た上記形質転換細胞を、界面活性剤、例えば１％のトリ
トン（Triton）Ｘ−１１４を含む緩衝液に可溶化し、こ
れをドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法にて電気泳
動後、メンブレンに転写する。このメンブレンを、ＧＡ
Ｄに特異的な抗体、例えばＫ−２（ケミコン社製）、Ｇ
ＡＤ６（デベロップメント・スタディーズ・ハイブリド
ーマ・バンク、デパートメント・オブ・バイオロジー、
ユニバーシティ・オブ・アイオワより入手可能）等を用
いて染色し、該当する分子量の位置にＧＡＤ特異的バン
ドを見いだすことにより、得られた形質転換細胞株がＧ
ＡＤタンパクを発現していることが確認できる。

【００１８】（ヒト血清中の抗ＧＡＤ抗体検出）ヒト血
清中の抗ＧＡＤ抗体を、前記方法にて得られた形質転換
細胞株を用い、以下の方法によって検出することができ
る。すなわち、界面活性剤、例えば、トリトンＸ−１１
４を含む緩衝液でヒトＧＡＤを発現する形質転換細胞を
可溶化し、該可溶化液にヒト血清を加え、一定時間イン
キュベーションする。血清中に抗ＧＡＤ抗体が存在すれ
ば、形質転換細胞中で発現されたＧＡＤとヒト血清中の
抗ＧＡＤ抗体とが結合するので、この結合物を、例えば
プロテインＡセファロース等で沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ用サンプル緩衝液等に可溶化し、遠心後、その上清
をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかける。これを前記の方法と同様
の手法によりメンブレンに転写し、ＧＡＤと特異的に反
応する抗体、例えばＧＡＤ６で処理する。その後種々の
方法を用いて、このＧＡＤ６抗体を検出することによ
り、ヒト血清中の抗ＧＡＤ抗体の存在を確認することが
できる。ＧＡＤ６抗体を検出する際、例えばアマシャム
（Amersham) 社製ＥＣＬウエスタン・ブロッティング検
出システム（ECL Western blotting detection system)
を用いれば、放射性同位元素を用いることなく抗ＧＡＤ
抗体、すなわち抗６４ＫＤ抗体の存在を知ることができ
る。

【００１９】更に、より直接的には、一般的に用いられ
ている免疫組織化学的検出方法を用い得る〔「染色法の
すべて」ｐ１５５−ｐ１６５（免疫組織化学）、医歯薬
出版１９８８年〕。すなわち、前記方法で得られた形質
転換細胞を培養し、これをスライドグラス上に塗沫す
る。これを固定剤、例えばパラホルムアルデヒドや冷ア
セトンにて処理する。固定された細胞上に１次抗体とし
てヒト血清を重層し、一定時間インキュベーションす
る。次に、緩衝液にて洗浄後、２次抗体として、標識し
た抗ヒトイムノグロブリン抗体、例えばペルオキシダー
ゼ標識抗ヒトイムノグロブリン抗体や蛍光標識抗ヒトイ
ムノグロブリン抗体と一定時間インキュベーションす
る。インキュベーション後、緩衝液、例えばＰＢＳにて
洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトイムノグロブリン
抗体を用いた場合は、発色剤、例えばジアミノベンチヂ
ンを用い染色する。また、蛍光標識抗ヒトイムノグロブ
リン抗体を用いた場合は、蛍光顕微鏡下で観察する。こ
れらの染色像により、抗ＧＡＤ抗体、すなわち抗６４Ｋ
Ｄ抗体の存在を知ることができる。

【００２０】

【実施例】以下に、実施例を用いて本発明をさらに具体
的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものでは
ない。

【００２１】（実施例１） １）ヒトＧＡＤ発現形質転換細胞株の作製 Chirgwin等の方法（Biochemistry, vol. 18, No. 24,
p.5294-5299, 1979) に従い、ヒト膵ラ氏島細胞より全
ＲＮＡ画分を抽出した。得られた全ＲＮＡを鋳型とし、
モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（Bethesda R
esearch Laboratories社製）により一本鎖ｃＤＮＡを合
成した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、Karlsen 等の
発表（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.88, p.8337-8
341, 1991)したヒトＧＡＤ６５型遺伝子配列をもとに設
定したプライマーを用い、Innis 等の方法（"PCR Proto
cols", Academic Press, Inc., 1990)に従ってＰＣＲ法
を行い、ヒト膵ラ氏島由来ＧＡＤ６５型ｃＤＮＡ（ＨＩ
ＧＡＤ６５ ｃＤＮＡ）を得た。これをプラスミドベク
ター、ブルースクリプトIIＳＫ⁺ （ストラタジーン社
製）に組み込んだ（操作の詳細については図１参照）。

【００２２】このＨＩＧＡＤが組込まれたプラスミドベ
クター、ブルースクリプトIIＳＫ⁺（以下、これを「pBl
uescript −ＨＩＧＡＤ」と略記することがある）ＤＮ
Ａを用いて大腸菌ＸＬ−１ Blue ( ストラタジーン社
製）を形質転換し、アンピシリンで選択培養して、培養
物からアルカリ溶解法によりプラスミド（pBluescript
−ＨＩＧＡＤ）ＤＮＡを得た。このプラスミド（pBlues
cript −ＨＩＧＡＤ）ＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩお
よびＳａｌＩで消化することによりＨＩＧＡＤ６５ ｃ
ＤＮＡを切り出し、これを動物細胞用発現ベクター、プ
ラスミドｐＤＯＬと連結した（操作の詳細については図
２参照）。

【００２３】ＨＩＧＡＤ６５ ｃＤＮＡを組み込んだプ
ラスミドｐＤＯＬ（ｐＤＯＬ−ＨＩＧＡＤ） ＤＮＡを
用いて大腸菌ＸＬ−１ Blue(ストラタジーン社製）を形
質転換し、カナマイシンで選択培養し、培養物からのア
ルカリ溶解法によるプラスミドＤＮＡの少量調製および
ＨＩＧＡＤ６５ ｃＤＮＡの確認を行った。更にトリト
ンＸ−１００溶解法により、約２．５mgのリコンビナン
ト・プラスミドｐＤＯＬ−ＨＩＧＡＤ ＤＮＡを調製し
た。

【００２４】上記リコンビナント・プラスミドｐＤＯＬ
−ＨＩＧＡＤ ＤＮＡ０．２μg 、２．０μg または２
０μg をウシ胎児胸腺ＤＮＡ（４０μg ）と共にリン酸
カルシウム法にてＣＨＯ細胞（２×１０⁵ 細胞／10cmデ
ィッシュ）へ形質導入した。

【００２５】形質導入の６時間後、培地〔１Ｌ中に１０
０mg ストレプトマイシン、５万単位 ペニシリンＧ、
２ｇ 重炭酸ナトリウム、１０％非働化ウシ胎児血清を
含むダルベッコのＭＥＭ培地（ギブコ社製）〕を交換
し、２日後より４００μg/mlのＧ４１８で選択を開始
し、２週間後にクローニングシリンダーを用いて独立し
たコロニーを分離した。かくして得られた各コロニーに
ついて、以下に述べる方法でＧＡＤタンパクの発現を確
認しつつ、更に２回クローニングを繰り返し、２株のヒ
トＧＡＤ産生形質転換ＣＨＯ細胞株を得た。

【００２６】各コロニーにおけるＧＡＤタンパクの発現
は、ＧＡＤ６５を特異的に認識するモノクローナル抗体
ＧＡＤ６を用いて試験した。すなわち、上記で得られた
形質転換ＣＨＯ細胞を３５mmディッシュにコンフルエン
トになるまで培養後、培地を除去し、１．５mlの冷ＰＢ
Ｓ（１５０mM NaCl を含む１０mMリン酸緩衝液、pH７．
０）で細胞を２回洗浄した。洗浄後、０．０５％のトリ
プシン、０．０５％のＥＤＴＡ（エチレンジアミン４酢
酸）を含むＰＢＳ３００μl にて細胞をディッシュより
剥離し、１．５mlの培地（Ｇ４１８を含む）を加え、遠
心後、細胞を回収した。

【００２７】回収した細胞ペレットに８０μl のライジ
ング緩衝液〔２０mM Tris-HCl ( pH７．４) 、１５０mM
NaCl 、０．５mMメチオニン、１０mMベンズアミジン、
１％トラジロール、５mM EDTA 、０．１mM p−クロルメ
ルクリベンゼンスルホン酸、１％トリトンＸ−１１４〕
を加えて細胞を溶解し、氷上にて２時間インキュベート
した。次に、これを４℃、１５，０００rpm にて３０分
遠心し、遠心上清１容量に対し２×レムリー緩衝液〔１
２５mM Tris-HCl ( pH６．８) 、４％ＳＤＳ、２０％グ
リセロール、１０％２−メルカプトエタノール、０．０
０２％ブロモフェノールブルー〕１容量を加え、室温で
１時間インキュベートした後、ドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ）を含む１０％ポリアクリルアミドゲル上で電
気泳動を行った。電気泳動後ゲルをメンブレンに転写
し、ＧＡＤ特異的マウスモノクローナル抗体を用いて、
ウエスタン・ブロッティングを行った。

【００２８】上記ＳＤＳを含むポリアクリルアミドゲル
電気泳動は、「モレキュラー・クローニング」第１８章
に記載の方法に準じて行い、ウエスタン・ブロッティン
グについては、アマシャム社製「ＥＣＬウエスタン・ブ
ロッティング検出システム」キット（製品番号２１０
６）を用い、同プロトコールブックに従って行った。な
お、１次抗体はＧＡＤ６マウスモノクローナル抗体（マ
ウス腹水）を１，０００倍希釈にて用い、２次抗体はア
マシャム社製のヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体（ペ
ルオキシダーゼ標識）を１０，０００倍希釈にて用い
た。

【００２９】かくして得られた２株のヒトＧＡＤ発現形
質転換ＣＨＯ細胞株を、それぞれＨＩＧＡＤ₆₅ＣＨＯ−
１およびＨＩＧＡＤ₆₅ＣＨＯ−２と命名した。これら細
胞株のＧＡＤタンパク発現をウエスタン・ブロッティン
グにより検出した結果を図３に示す。なお、上記ヒトＧ
ＡＤ発現形質転換ＣＨＯ細胞株ＨＩＧＡＤ₆₅ＣＨＯ−１
およびＨＩＧＡＤ₆₅ＣＨＯ−２は、平成５年３月１１日
付で工業技術院生命工学工業技術研究所に、それぞれ受
託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１３５２４およびＦＥＲＭＰ−
１３５２５として寄託されている。

【００３０】（実施例２） ヒト血清中の抗ＧＡＤ６５型抗体の検出 実施例１で得たＨＩＧＡＤ₆₅ＣＨＯ−２を実施例１に記
載の方法に従って培養し、細胞を回収した。回収した細
胞を、１．８×１０⁶ /ml になるようライジング緩衝液
に溶解し、氷上にて２時間インキュベートした。インキ
ュベーション後、４℃、１５，０００rpm にて３０分遠
心し、上清を採取した。

【００３１】この上清１９０μl に５μl のヒト血清を
加え、氷上にて一晩インキュベートした。これに１００
μl の２０％プロテインＡセファロース４Ｂを加え、ロ
ーテーターにて回転下、４℃にて１時間反応させた。反
応後、４℃、１５，０００rpm にて９０秒遠心し、上清
を吸引除去した。この沈殿に８００μl の洗浄緩衝液
〔２０mM Tris-HCl ( pH７．４) 、１５０mM NaCl 、１
０mM ベンズアミジン、０．５％トリトンＸ−１１４〕
を加えてよく攪拌し、４℃、１５，０００rpm にて９０
秒遠心して洗浄した。この洗浄操作を更に２回繰り返
し、最後に沈殿に５００μl の冷蒸留水を加えてよく攪
拌し、４℃、１５，０００rpm にて９０秒遠心した。

【００３２】上清を吸引除去し、沈殿に３０μl のサン
プル緩衝液〔８０mM Tris-HCl ( pH６．８) 、３％ Ｓ
ＤＳ、１５％ グリセロール、５％ ２−メルカプトエ
タノー、０．００６％ ブロモフェノールブルー〕を加
えてよく攪拌し、室温にて１時間インキュベートした。
インキュベート後、室温にて１５，０００rpm で９０秒
遠心し、実施例１の方法に従って上清をＳＤＳポリアク
リルアミド電気泳動した。

【００３３】電気泳動後、実施例１の方法に従ってウエ
スタン・ブロッティングを行い、ヒト血清中の抗ＧＡＤ
抗体を検出した。その結果、１１例のＩＤＤＭ患者中９
例が陽性（陽性率８１．８％）を示し、また、インスリ
ン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）患者４例および健常者
５例は陰性を示し、本方法の有用性が示された。図４に
検出結果の代表例を示す。

【００３４】

【発明の効果】本発明のヒトＧＡＤ発現形質転換細胞に
より、インスリン依存型糖尿病の診断のための従来の抗
６４ＫＤ抗体検出において必要とされた、新鮮ヒトまた
はラット膵島抽出物の用時調製および放射性同位元素の
使用が不要となった。

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒト膵ラ氏島由来ＧＡＤ遺伝子の取得操作図。

【図２】ヒト膵ラ氏島由来ＧＡＤ遺伝子のベクタープラ
スミドｐＤＯＬへの導入操作図。

【図３】ウエスタン・ブロッティングによる本発明の細
胞株のヒトＧＡＤタンパク発現の検出例。

【図４】ウエスタン・ブロッティングによるヒト血清中
の抗ＧＡＤ抗体（抗６４ＫＤ抗体）の検出例。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 渡部 素生 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社筑波総合研究所内 (72)発明者 斎藤 和子 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社筑波総合研究所内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトグルタミン酸脱炭酸酵素の発現が可
   能なベクターにより形質転換されたヒトグルタミン酸脱
   炭酸酵素発現動物細胞株。
2. 【請求項２】 該形質転換された動物細胞株が、チャイ
   ニーズハムスター卵母細胞株である請求項１記載の動物
   細胞株。
3. 【請求項３】 請求項１または２のいずれかに記載の動
   物細胞株を用いるヒトグルタミン酸脱炭酸酵素に対する
   抗体の検出法。