JPH02182185A - 癌胚抗原の族の分離された遺伝子を発現するトランスフエクシヨン体の細胞系 - Google Patents
癌胚抗原の族の分離された遺伝子を発現するトランスフエクシヨン体の細胞系Info
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Classifications
-
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
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- C07K—PEPTIDES
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- C07K16/3007—Carcino-embryonic Antigens
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、癌胚抗［（ＣＥＡ）族の分離された遺伝子を
発現する細胞系に関する。本発明は、また、このような
細胞系を使用してＣＥＡ族に対する特異性についてスク
リーニングする方法に関する。本発明は、さらに、前記
細胞を使用して特異的ＣＥＡ族の構成員に対して特異的
な抗体を発生する方法に関する。
発現する細胞系に関する。本発明は、また、このような
細胞系を使用してＣＥＡ族に対する特異性についてスク
リーニングする方法に関する。本発明は、さらに、前記
細胞を使用して特異的ＣＥＡ族の構成員に対して特異的
な抗体を発生する方法に関する。
癌腫抗原は、最初に、ゴールド（Ｇｏｌｄ）およびフリ
ートマン（Ｆｒｅｅｄｍａｎ）、ジャーナル・オブ・イ
クスペリメンタル・メディシン（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、
）、１２１，４３９−４６２（１９６５）に記載された
。ＣＥＡはほぼ２ｏｏ ｏｏｏの分子量をもち、５０
〜６０重量％が炭水化物である糖タンパク質として特性
付けられる。ＣＥＡは正常のヒト胎児の発育の間に存在
するが、正常の大人の腸管中に非常に低い濃度で存在す
る。それはある数の異なる腫瘍により産生され、そして
分泌される。
ートマン（Ｆｒｅｅｄｍａｎ）、ジャーナル・オブ・イ
クスペリメンタル・メディシン（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、
）、１２１，４３９−４６２（１９６５）に記載された
。ＣＥＡはほぼ２ｏｏ ｏｏｏの分子量をもち、５０
〜６０重量％が炭水化物である糖タンパク質として特性
付けられる。ＣＥＡは正常のヒト胎児の発育の間に存在
するが、正常の大人の腸管中に非常に低い濃度で存在す
る。それはある数の異なる腫瘍により産生され、そして
分泌される。
ＣＥＡは結腸直腸癌の患者の管理のための臨床的に有用
な腫瘍マーカーである。ＣＥＡは感受性イムノアッセイ
法を使用して測定することができる。ＣＥＡの外科前の
血清レベルが増加したとき、正常範囲への外科後の血清
ＣＥＡの低下は、典型的には、腫瘍の切除が成功したこ
とを示す。外科後のＣＥＡレベルが正常へに戻らないこ
とは、しばしば、腫瘍の切除が不完全であるか、あるい
は追加の腫瘍部位が患者において存在することを示す。
な腫瘍マーカーである。ＣＥＡは感受性イムノアッセイ
法を使用して測定することができる。ＣＥＡの外科前の
血清レベルが増加したとき、正常範囲への外科後の血清
ＣＥＡの低下は、典型的には、腫瘍の切除が成功したこ
とを示す。外科後のＣＥＡレベルが正常へに戻らないこ
とは、しばしば、腫瘍の切除が不完全であるか、あるい
は追加の腫瘍部位が患者において存在することを示す。
正常レベルへ戻った後、引き続く血清ＣＥＡレベルの急
速な上昇は、通常、転移の存在を示す。
速な上昇は、通常、転移の存在を示す。
正常レベルからの外科後のより遅い上昇は、最もしばし
ば、前に検出されなかった新しい一次腫瘍の存在を示す
と解釈される。こうして、結腸癌の患者の外科後の管理
は、ＣＥＡの測定により促進される。
ば、前に検出されなかった新しい一次腫瘍の存在を示す
と解釈される。こうして、結腸癌の患者の外科後の管理
は、ＣＥＡの測定により促進される。
ＣＥＡは抗原族の１員である。このため、現在利用可能
な方法によりＣＥＡのイムノアッセイは、ＣＥＡがいく
つかの潜在的に反応性の抗原のただつであるという事実
によって複雑となる。文献に少なくとも１６のＣＥＡ様
抗原が記載されてきている。これらのあるものは異なる
研究者らにより記載された同一の抗原であるように思わ
れるので、異なる抗原の実際の数はこの数より多少少な
い。それにもかかわらす、腫瘍により解放されるＣＥＡ
のイムノアッセイを潜在的に妨害し得る、交差反応性抗
原の複雑な列が存在する。ＣＥＡ様抗原の血清レベルは
、多くの隔置外の状態、例えば、炎症性肝臓の病気およ
びまた喫煙者において増大する。癌患者の状態の管理の
ためのイムノアッセイは、これらの他のＣＥＡ様抗原に
より妨害されないことが重要である。逆に、イムノアッ
セイにより抗原を区別できることが重要である。なぜな
ら、異なる腫瘍のタイプはＣＥＡの異なるタイプを優先
的に発現するこ七ができるという可能性があるからであ
る。そのような場合、異なるタイプのＣＥＡを信頼性を
もって測定できることのより、癌の異なるタイプを診断
し、あるいはより首尾よく処置する手段を提供すること
ができる。
な方法によりＣＥＡのイムノアッセイは、ＣＥＡがいく
つかの潜在的に反応性の抗原のただつであるという事実
によって複雑となる。文献に少なくとも１６のＣＥＡ様
抗原が記載されてきている。これらのあるものは異なる
研究者らにより記載された同一の抗原であるように思わ
れるので、異なる抗原の実際の数はこの数より多少少な
い。それにもかかわらす、腫瘍により解放されるＣＥＡ
のイムノアッセイを潜在的に妨害し得る、交差反応性抗
原の複雑な列が存在する。ＣＥＡ様抗原の血清レベルは
、多くの隔置外の状態、例えば、炎症性肝臓の病気およ
びまた喫煙者において増大する。癌患者の状態の管理の
ためのイムノアッセイは、これらの他のＣＥＡ様抗原に
より妨害されないことが重要である。逆に、イムノアッ
セイにより抗原を区別できることが重要である。なぜな
ら、異なる腫瘍のタイプはＣＥＡの異なるタイプを優先
的に発現するこ七ができるという可能性があるからであ
る。そのような場合、異なるタイプのＣＥＡを信頼性を
もって測定できることのより、癌の異なるタイプを診断
し、あるいはより首尾よく処置する手段を提供すること
ができる。
ｒＣＥＡ族」の構成員は、いくつかの抗原決定基を共有
する。これらの共通のエピトープは抗原の族の構成員の
区別において有用でなく、そしてそれらを認識する抗体
は腫瘍特異的ＣＥＡレベルの測定のためほとんど有用で
はない。
する。これらの共通のエピトープは抗原の族の構成員の
区別において有用でなく、そしてそれらを認識する抗体
は腫瘍特異的ＣＥＡレベルの測定のためほとんど有用で
はない。
米国特許第３，６６３，６８４号は、「癌腫抗原および
ヨウ素を使用する診断法」と題し、ＲＩＡにおいて使用
するためのＣＥＡの精製および放射性ヨウ素化に関する
。
ヨウ素を使用する診断法」と題し、ＲＩＡにおいて使用
するためのＣＥＡの精製および放射性ヨウ素化に関する
。
米国特許第３，６９７，６３８号は、ＣＥＡが抗原の混
合物（この場合において成分ＡおよびＢ）であることを
記載している。米国特許第３，６９７．６３８号は、各
成分を分離し、そして放射性ヨウ素化する方法およびそ
れらの特別のＲＩＡにおける使用を述べている。
合物（この場合において成分ＡおよびＢ）であることを
記載している。米国特許第３，６９７．６３８号は、各
成分を分離し、そして放射性ヨウ素化する方法およびそ
れらの特別のＲＩＡにおける使用を述べている。
米国特許第３，８５２，４１５号は、「癌腫抗原の決定
における血漿抽出物の代用物として、ラジオイムノアッ
セイにおいて使用する組成物」と題し、ＣＥＡ ＲＩ
Ａのための希釈剤として血漿の代用物として、ＥＤＴＡ
およびウシ血清アルブミンを含有する緩衝液の使用に関
する。
における血漿抽出物の代用物として、ラジオイムノアッ
セイにおいて使用する組成物」と題し、ＣＥＡ ＲＩ
Ａのための希釈剤として血漿の代用物として、ＥＤＴＡ
およびウシ血清アルブミンを含有する緩衝液の使用に関
する。
米国特許第３，８６７．３６３号は、「癌腫抗原」と題
し、ＣＥＡの成分ＡおよびＢの分離、それらの標識付け
およびＲＩＡにおけるそれらの使用に関する。
し、ＣＥＡの成分ＡおよびＢの分離、それらの標識付け
およびＲＩＡにおけるそれらの使用に関する。
米国特許第３，９２７．１９３号は、「放射性標識した
抗体の腫瘍の局在化」と題し、体全体の腫瘍の映像にお
ける放射性標識した抗ＣＥＡ抗体の使用に関する。
抗体の腫瘍の局在化」と題し、体全体の腫瘍の映像にお
ける放射性標識した抗ＣＥＡ抗体の使用に関する。
米国特許第３，９５６，２５８号は、「癌腫抗原」と題
し、ＣＥＡ成分成分上びＢの分離に関する。
し、ＣＥＡ成分成分上びＢの分離に関する。
米国特許第４，０８６，２１７号は、「癌腫抗原」と題
し、ＣＥＡ成分成分上びＢの分離に関する。
し、ＣＥＡ成分成分上びＢの分離に関する。
米国特許第４．１４０，７５３号は、「診断の方法およ
び試薬」と題し、ＣＥＡ−３ｌと呼ふＣＥＡ異性体の精
製およびＲＩＡにおけるその使用に関する。
び試薬」と題し、ＣＥＡ−３ｌと呼ふＣＥＡ異性体の精
製およびＲＩＡにおけるその使用に関する。
米国特許第４，１４５．３６６号は、「癌腫抗原の異性
体」と題し、抗［ＣＥＡ−５ｌに関する。
体」と題し、抗［ＣＥＡ−５ｌに関する。
米国特許第４，１８０．４９９号は、「癌腫抗原」と題
し、ＣＥＡ成分Ｂを産生する方法を記載している。
し、ＣＥＡ成分Ｂを産生する方法を記載している。
米国特許第４．２２８．２３６号は、「癌腫抗原を産生
ずる方法」と題し、ＣＥＡの産生のためのＬ Ｓ −１
７，４ＴまたはＬＳ−１８０の確立された細胞系または
それらのクローンまたは誘導体に関する。
ずる方法」と題し、ＣＥＡの産生のためのＬ Ｓ −１
７，４ＴまたはＬＳ−１８０の確立された細胞系または
それらのクローンまたは誘導体に関する。
米国特許第４．２７２，５０４号は、「癌腫抗原のアッ
セイのための抗体吸着した支持体の方法」と題し、ＣＥ
Ａのラジオイムノアッセイの２つの概念に関する。１つ
は、米国特許第４，２７２゜５０４号はｐＨ５において
６５〜８５℃に加熱することにより試料を予備処理して
、異質タンパク質を沈澱させ、そして排除することに関
する。第２に、それは分析物および標識したＣＥＡ ト
レサーを補足する手段として固相の抗体（ビーズまたは
管上）の使用に関する。
セイのための抗体吸着した支持体の方法」と題し、ＣＥ
Ａのラジオイムノアッセイの２つの概念に関する。１つ
は、米国特許第４，２７２゜５０４号はｐＨ５において
６５〜８５℃に加熱することにより試料を予備処理して
、異質タンパク質を沈澱させ、そして排除することに関
する。第２に、それは分析物および標識したＣＥＡ ト
レサーを補足する手段として固相の抗体（ビーズまたは
管上）の使用に関する。
米国特許第４，２９９，８１５号は、「癌腫抗原の決定
」と題し、ＣＥＡ試料を水で希釈し、そしてタンパク質
の沈澱が起こる温度以下の温度に加熱することによって
予備処理することに関する。
」と題し、ＣＥＡ試料を水で希釈し、そしてタンパク質
の沈澱が起こる温度以下の温度に加熱することによって
予備処理することに関する。
次いで、予備処理した試料をＲＩＡ、ＥＩＡＸＦＩＡま
たは化学発光のイムノアッセイを使用してイムノアッセ
イする。
たは化学発光のイムノアッセイを使用してイムノアッセ
イする。
米国特許第４，３４９．５２８号は、「高分子量の癌腫
抗原について特異的なモノクローナルハイブリドーマ抗
体」と題し、１８０ｋＤのＣＥＡと反応するが、他の分
子量の形態と反応しないモノクローナル抗体に関する。
抗原について特異的なモノクローナルハイブリドーマ抗
体」と題し、１８０ｋＤのＣＥＡと反応するが、他の分
子量の形態と反応しないモノクローナル抗体に関する。
米国特許第４，４６７．０３１号は、「癌腫抗原のため
の酵素−イムノアッセイ」と題し、ＣＥＡのだめのザン
ドイッチ酵素イムノアッセイに関し、ここで２つの抗Ｃ
ＥＡモノクローナル抗体の第１を固相に取り付け、そし
て第２モノクローナル抗体をペルオキシダーゼと接合す
る。
の酵素−イムノアッセイ」と題し、ＣＥＡのだめのザン
ドイッチ酵素イムノアッセイに関し、ここで２つの抗Ｃ
ＥＡモノクローナル抗体の第１を固相に取り付け、そし
て第２モノクローナル抗体をペルオキシダーゼと接合す
る。
米国特許第４，４８９．１６７号は、［癌の検出の方法
および組成物」と題し、ＣＥＡがアルファ酸糖タンパク
質（Ａ Ｇ）と抗原決定基を共有し、この糖タンパク質
はヒト血清の正常成分である。
および組成物」と題し、ＣＥＡがアルファ酸糖タンパク
質（Ａ Ｇ）と抗原決定基を共有し、この糖タンパク質
はヒト血清の正常成分である。
ここに記載する方法は、１つの抗体としてＡＧを認識す
る抗体およびＣＥＡを認識するが、ＡＧを認識しない他
の抗体を使用する、固相サンドイッチイムノアッセイに
関する。
る抗体およびＣＥＡを認識するが、ＡＧを認識しない他
の抗体を使用する、固相サンドイッチイムノアッセイに
関する。
米国特許第４，５７８，３４９号は、「癌腫抗原（ＣＥ
Ａ）のためのイムノアッセイ」と題し、ＣＥＡイムノア
ッセイにおける希釈剤として高い塩を含有する緩衝液を
使用することに関する。
Ａ）のためのイムノアッセイ」と題し、ＣＥＡイムノア
ッセイにおける希釈剤として高い塩を含有する緩衝液を
使用することに関する。
欧州特許（ＥＰ）１１３０７２−Ａ号は、血液試料を癌
腫抗原についてアッセイすること一シリカゲルと一緒の
インキュベーションによる妨害物質の除去後」と題し、
シリカゲルで予備処理することにより妨害物質を血漿試
料の血清から除去することに関する。
腫抗原についてアッセイすること一シリカゲルと一緒の
インキュベーションによる妨害物質の除去後」と題し、
シリカゲルで予備処理することにより妨害物質を血漿試
料の血清から除去することに関する。
欧州特許（ＥＰ）１０２００８−Ａ号は、「癌の診断の
癌胚抗厚−電気泳動しないで過塩素酸の抽出物から産生
された」と題し、電気泳動工程を使用しないで、過塩素
酸からＣＥＡを調製する手順に関する。
癌胚抗厚−電気泳動しないで過塩素酸の抽出物から産生
された」と題し、電気泳動工程を使用しないで、過塩素
酸からＣＥＡを調製する手順に関する。
欧州特許（ＥＰ）９２２２３−Ａ号は、「細胞質ゾルま
たは組織中の癌腫抗原の決定−後退の治療の抑制および
早期の認識」と題し、血清または血漿中ではなく、腫瘍
組織それ自体の細胞質ゾル中におけるＣＥＡのイムノア
ッセイに関する。
たは組織中の癌腫抗原の決定−後退の治療の抑制および
早期の認識」と題し、血清または血漿中ではなく、腫瘍
組織それ自体の細胞質ゾル中におけるＣＥＡのイムノア
ッセイに関する。
欧州特許（ＥＰ）８３１０３，７５９．６号は、「癌、
とくに乳癌における予測試験として細胞質ゾル−ＣＥＡ
−測定」と題し、欧州特許（Ｅ Ｐ）９２２２３−Ａ号
に類似する。
とくに乳癌における予測試験として細胞質ゾル−ＣＥＡ
−測定」と題し、欧州特許（Ｅ Ｐ）９２２２３−Ａ号
に類似する。
欧州特許（ＥＰ）８３３０３７５９号は、「癌腫抗原に
対して特異的なモノクローナル抗体」と題し、ｒｃＥＡ
特異的」モノクローナル抗体およびイムノアッセイにお
けるそれらの使用に関する。
対して特異的なモノクローナル抗体」と題し、ｒｃＥＡ
特異的」モノクローナル抗体およびイムノアッセイにお
けるそれらの使用に関する。
ＷＯ３４１０２９８３号は、［特異的ＣＥＡ族抗原、そ
れらに対して特異的な抗体およびそれらの使用法」と題
し、試料中の個々の成分の各々を選択的に測定するよう
に設計されたイムノアッセイにおける、ＣＥＡ−胎便（
ＭＡ）−およびＮＡＣ−特異的エピトープに対するモノ
クローナル抗体の使用に関する。
れらに対して特異的な抗体およびそれらの使用法」と題
し、試料中の個々の成分の各々を選択的に測定するよう
に設計されたイムノアッセイにおける、ＣＥＡ−胎便（
ＭＡ）−およびＮＡＣ−特異的エピトープに対するモノ
クローナル抗体の使用に関する。
以上のＣＥＡアッセイのすべては、選択する完全な抗原
で動物を免疫化することにより、発生したモノクローナ
ル抗体またはポリクローナル抗体を利用する。それらの
いずれも、種々の抗原の独特−次配列の検出のために、
配列特異的抗体をつくという考えを扱っていない。それ
らは、自然産生物の合成ペプチドまたは断片に対する抗
体を産生ずるために、−次アミノ酸配列を使用すること
を包含しない。それらは、ＣＥＡ族の構成員を区別する
ために一次アミノ酸配列を使用する概念を包含しない。
で動物を免疫化することにより、発生したモノクローナ
ル抗体またはポリクローナル抗体を利用する。それらの
いずれも、種々の抗原の独特−次配列の検出のために、
配列特異的抗体をつくという考えを扱っていない。それ
らは、自然産生物の合成ペプチドまたは断片に対する抗
体を産生ずるために、−次アミノ酸配列を使用すること
を包含しない。それらは、ＣＥＡ族の構成員を区別する
ために一次アミノ酸配列を使用する概念を包含しない。
それらのいずれも、−次配列を決定するために使用する
遺伝子を分離するために、ＤＮＡまたはＲＮＡのクロー
ンを使用することを包含しない。
遺伝子を分離するために、ＤＮＡまたはＲＮＡのクロー
ンを使用することを包含しない。
以前において、ＣＥＡ遺伝子族の構成員を発現する細胞
を発生させるためにＤＮＡまたはＲＮＡクローンを使用
すること、あるいは特定のモノクローナル抗体の発生ま
たはスクリーニングにおいてこれらの細胞を使用するこ
とを包含する教示は存在しない。
を発生させるためにＤＮＡまたはＲＮＡクローンを使用
すること、あるいは特定のモノクローナル抗体の発生ま
たはスクリーニングにおいてこれらの細胞を使用するこ
とを包含する教示は存在しない。
定義
核酸の略号
アミノ酸の略号
ｓｐ
ｓｎ
ｌｉｒ
ｅｒ
ｌｕ
１ｎ
Ｐｒ。
アデニン
グアニン
シトシン
チミジン
ウラシル
アスパラギン酸
アスパラギン
スレオニン
セリン
グルタミン酸
グルタミン
プロリン
Ｇｙｌ グリシン
Ａｌａ アラニン
Ｃｙｓ システィン
Ｖａｌ バリン
Ｍｅｔ メチオニン
ｌｉｅ イソロイシン
Ｔｙｒ チロシン
Ｐｈｅ フェニルアラニ
Ｔｒｐ トリプトファン
Ｌｙｓ リジン
Ｈｉｓ ヒスチジン
Ａｒｇ アルギニン
ヌクレオチド − 糖部分（ペントース）、ホスフェー
トおよび窒素の複素環族塩基を含有するＤＮＡまたはＲ
ＮＡのモノマー単位。この塩基グリコシドの炭素（ペン
トースの１″炭素）を経ては糖部分に結合しており、そ
して塩基と糖との組み合わせはヌクレオシドと呼ばれる
。この塩基はヌクレオチドを特徴づける。４つのＤＮＡ
塩基はアデニン（「Ａ」）、グアニン（「Ｇ」）、シト
シン（「Ｃ」）、およびチミジン（ｒＴ」）である。４
つのＲＮＡ塩基はＡ、Ｇ、Ｃおよびウラシル（ｒＵ」）
である。
トおよび窒素の複素環族塩基を含有するＤＮＡまたはＲ
ＮＡのモノマー単位。この塩基グリコシドの炭素（ペン
トースの１″炭素）を経ては糖部分に結合しており、そ
して塩基と糖との組み合わせはヌクレオシドと呼ばれる
。この塩基はヌクレオチドを特徴づける。４つのＤＮＡ
塩基はアデニン（「Ａ」）、グアニン（「Ｇ」）、シト
シン（「Ｃ」）、およびチミジン（ｒＴ」）である。４
つのＲＮＡ塩基はＡ、Ｇ、Ｃおよびウラシル（ｒＵ」）
である。
ＤＮＡ配列 −隣接するペントースの３′および５′炭
素の間のホスホジエステル結合によりお互いに結合した
、ヌクレオチドの直線の列である。
素の間のホスホジエステル結合によりお互いに結合した
、ヌクレオチドの直線の列である。
機能的同等体 −この分野においてよく知られているよ
うに、ＤＮＡ配列において、あるヌクレオチドは、発現
産生体の配列に影響を及ぼさないで、置換することがで
きる。このペプチドに関すると、この用語は、特定の用
途において機能をもたない１種または２種以上のアミノ
酸が欠失されているか、あるいは他のものにより置換さ
れることができることを意味する。
うに、ＤＮＡ配列において、あるヌクレオチドは、発現
産生体の配列に影響を及ぼさないで、置換することがで
きる。このペプチドに関すると、この用語は、特定の用
途において機能をもたない１種または２種以上のアミノ
酸が欠失されているか、あるいは他のものにより置換さ
れることができることを意味する。
コドン − ｍＲＮＡによりアミノ酸をエンコードする
３ヌクレオチド（トリップレット）のＤＮＡ配列、翻訳
開始シグナルまたは翻訳停止シグナルをエンコードする
。例えば、ヌクレオチドのトリップレットＴＴＡＸＴＴ
Ｇ、ＣＴＴ、ＣＴＣ。
３ヌクレオチド（トリップレット）のＤＮＡ配列、翻訳
開始シグナルまたは翻訳停止シグナルをエンコードする
。例えば、ヌクレオチドのトリップレットＴＴＡＸＴＴ
Ｇ、ＣＴＴ、ＣＴＣ。
ＣＴＡおよびＣＴＣはアミノ酸のロイシン（ｒＬｅｕＪ
）をエンコードし、ＴＡＧ、ＴＡＡおよびＴＧＡは翻訳
停止シグナルであり、そしてＡＴＧは翻訳開始シグナル
である。
）をエンコードし、ＴＡＧ、ＴＡＡおよびＴＧＡは翻訳
停止シグナルであり、そしてＡＴＧは翻訳開始シグナル
である。
リーディングフレーム −アミノ酸配列へのｍＲＮＡの
翻訳の間のコドンの群。翻訳の間、適切なリーディング
フレームを維持しなくてはならない。例えば、配列ＧＣ
ＴＧＧＴＴＧＴＡＡＧは３つのＲＦまたは相で翻訳され
ることができ、それらの各々は、隣接するアミノ酸のア
ルファーアミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合
によりお互いに接続された異なるアミノ酸配列ＧＣＴ
ＧＧＴ ＴＧＴ ＡＡＧ −ＡｌａＧｌｙ−Ｃ
ｙｓ−Ｌｙｓ Ｇ ＣＴＧ ＧＴＴ ＧＴＡ ＡＧ −Ｌｅ
ｕＶａｔ−Ｖａｌ ＧＣＴＧＧ ＴＴＧ ＴＡＡ Ｇ −Ｔｒｐ−
Ｌｅｕ−（停止） を与える。
翻訳の間のコドンの群。翻訳の間、適切なリーディング
フレームを維持しなくてはならない。例えば、配列ＧＣ
ＴＧＧＴＴＧＴＡＡＧは３つのＲＦまたは相で翻訳され
ることができ、それらの各々は、隣接するアミノ酸のア
ルファーアミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合
によりお互いに接続された異なるアミノ酸配列ＧＣＴ
ＧＧＴ ＴＧＴ ＡＡＧ −ＡｌａＧｌｙ−Ｃ
ｙｓ−Ｌｙｓ Ｇ ＣＴＧ ＧＴＴ ＧＴＡ ＡＧ −Ｌｅ
ｕＶａｔ−Ｖａｌ ＧＣＴＧＧ ＴＴＧ ＴＡＡ Ｇ −Ｔｒｐ−
Ｌｅｕ−（停止） を与える。
ポリペプチド − 隣接するアミノ酸のアルファアミノ
基およびカルボキシ基の間のペプチド結合によりお互い
に接続されたアミノ酸の線状の配列。
基およびカルボキシ基の間のペプチド結合によりお互い
に接続されたアミノ酸の線状の配列。
ゲノム − 細胞またはウィルスの完全なりＮＡ。それ
は、なかでも、細胞またはウィルスのポリペプチドの遺
伝情報を指定する構造遺伝子、ならびにそのオペレータ
ー、プロモーターおよびリポソームおよび、例えば、シ
ャインーダルガルノ（Ｓｈ １ｎｅ−Ｄａ Ｉｇａｒｎ
ｏ）配列を包含する相互作用配列を包含する。
は、なかでも、細胞またはウィルスのポリペプチドの遺
伝情報を指定する構造遺伝子、ならびにそのオペレータ
ー、プロモーターおよびリポソームおよび、例えば、シ
ャインーダルガルノ（Ｓｈ １ｎｅ−Ｄａ Ｉｇａｒｎ
ｏ）配列を包含する相互作用配列を包含する。
構造遺伝子 −その鋳型またはメツセンジャＲＮ Ａ
（ｒ ｎＩ ＲＮ、Ａ 」）を通して、特定のポリペプ
チドに特徴あるアミノ酸の配列をエンコードするＤＮＡ
配列。
（ｒ ｎＩ ＲＮ、Ａ 」）を通して、特定のポリペプ
チドに特徴あるアミノ酸の配列をエンコードするＤＮＡ
配列。
転写 −構造遺伝子からｍＲＮＡを産生するプロセス。
翻訳 −ｍ ＲＮ Ａからポリペプチドを産生ずるプロ
セス。
セス。
発現 −ポリペプチドを産生ずるために構造遺伝子がな
したプロセス。それは転写と翻訳との組み合わせである
。
したプロセス。それは転写と翻訳との組み合わせである
。
プラスミド −プラスミドが宿主細胞中で複製するよう
な完全な［レプリコンＪからなる非染色体二本鎖ＤＮＡ
配列。プラスミドが単細胞の有機体内に配置されたとき
、その有機体の特性は、プラスミドのＤＮＡの結果、変
化または形質転換され得る。例えば、テトラサイクリン
耐性（ＴｅｔＲ）のための遺伝子を有するプラスミドは
、前にテトラサイクリンに対して感受性である細胞をそ
れに対して耐性の細胞に形質転換する。プラスミドによ
り形質転換された細胞は「形質転換体」と呼ばれる。
な完全な［レプリコンＪからなる非染色体二本鎖ＤＮＡ
配列。プラスミドが単細胞の有機体内に配置されたとき
、その有機体の特性は、プラスミドのＤＮＡの結果、変
化または形質転換され得る。例えば、テトラサイクリン
耐性（ＴｅｔＲ）のための遺伝子を有するプラスミドは
、前にテトラサイクリンに対して感受性である細胞をそ
れに対して耐性の細胞に形質転換する。プラスミドによ
り形質転換された細胞は「形質転換体」と呼ばれる。
７アージまたなバクテリオファージ − それらの多く
はタンパク質のエンベロープまたはコート（ｃｏａｔ）
（ｒカプシドタンパク質」）中にカプセル化されたＤＮ
Ａ配列から成る。
はタンパク質のエンベロープまたはコート（ｃｏａｔ）
（ｒカプシドタンパク質」）中にカプセル化されたＤＮ
Ａ配列から成る。
クローニングビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）宿主細胞中で
複製することができるプラスミド、７アージＤＮＡまた
は他のＤＮＡ配列、これは、ＤＮＡの必須の生物学的機
能、例えば、複製、コトタンバク質の産生またはプラス
ミドまたは結合部位の損失、を付随的に損失しないで、
決定可能な方法でこのようなりＮＡ配列を切断すること
ができる、１つまたは小さい数の部位によって特徴つけ
られ、そして形質転換された細胞、テトラサイクリン耐
性またはアンピシリン耐性の細胞の同定における使用に
適当なマーカーを含有する。
複製することができるプラスミド、７アージＤＮＡまた
は他のＤＮＡ配列、これは、ＤＮＡの必須の生物学的機
能、例えば、複製、コトタンバク質の産生またはプラス
ミドまたは結合部位の損失、を付随的に損失しないで、
決定可能な方法でこのようなりＮＡ配列を切断すること
ができる、１つまたは小さい数の部位によって特徴つけ
られ、そして形質転換された細胞、テトラサイクリン耐
性またはアンピシリン耐性の細胞の同定における使用に
適当なマーカーを含有する。
クローニングビヒクルはしばしばベクターと呼ばれる。
クローニング −無性生殖により１つの有機体またはＤ
ＮＡ配列から誘導される、このような有機体またはＤＮ
Ａ配列の１集団を得るプロセス。
ＮＡ配列から誘導される、このような有機体またはＤＮ
Ａ配列の１集団を得るプロセス。
組み換え体ＤＮＡ分子または雑種ＤＮＡ生きている細胞
の外側で末端対末端で接合されており、そしである細胞
に感染しかつその中で維持されうる能力を有する、異な
るゲノムからのＤＮＡのセグメントから成る分子。
の外側で末端対末端で接合されており、そしである細胞
に感染しかつその中で維持されうる能力を有する、異な
るゲノムからのＤＮＡのセグメントから成る分子。
ｃＤＮＡ発現ベクター −真核細胞中のｃＤＮＡ配列の
発現を促進するヌクレオチドの配列をまた含有する、原
核細胞のクローニングビヒクル。
発現を促進するヌクレオチドの配列をまた含有する、原
核細胞のクローニングビヒクル。
１に
れらのヌクレオチドは、真核細胞のプロモータ、別のき
り継ぎ部位およびポリアデニル化シグナルとして機能す
る配列を包含する。
り継ぎ部位およびポリアデニル化シグナルとして機能す
る配列を包含する。
形質転換／トランスフェクション − ＤＮＡまたはＲ
ＮＡは、遺伝子の発現を可能とするような方法で、細胞
中に導入される。「感染した」は、ここでは、ウィルス
のベクターによりＲＮＡまたはＤＮＡを宿主中に導入す
ることに関する。
ＮＡは、遺伝子の発現を可能とするような方法で、細胞
中に導入される。「感染した」は、ここでは、ウィルス
のベクターによりＲＮＡまたはＤＮＡを宿主中に導入す
ることに関する。
ＣＥＡ抗原族（ＣＥＡ遺伝子族） 一部分的ｃＤＮＡ
ＬＶ−７（ＣＥＡ−（ａ））に対して相同性のヌクレ
オチド配列を共有し、そしてこれらの類似性の結果、そ
れらの抗原エピトープのサブセットを共有する、遺伝子
（遺伝子族）およびそれらの産生体（抗原族）の組。Ｃ
ＥＡ抗原族の例は、ＣＥＡ （−ＣＥＡ−（ｂ））、ト
ランスメンブレン（ｔ ｒａｎｓｍｅｎｂｒａｎｅ）Ｃ
ＥＡ（ＴＭ ＣＥＡ）＝ＣＥＡ−（ｃ）および正常交
差反応性抗原（ＮＣＡ）（＝ＣＥＡ−（ｄ））を包含す
る。
ＬＶ−７（ＣＥＡ−（ａ））に対して相同性のヌクレ
オチド配列を共有し、そしてこれらの類似性の結果、そ
れらの抗原エピトープのサブセットを共有する、遺伝子
（遺伝子族）およびそれらの産生体（抗原族）の組。Ｃ
ＥＡ抗原族の例は、ＣＥＡ （−ＣＥＡ−（ｂ））、ト
ランスメンブレン（ｔ ｒａｎｓｍｅｎｂｒａｎｅ）Ｃ
ＥＡ（ＴＭ ＣＥＡ）＝ＣＥＡ−（ｃ）および正常交
差反応性抗原（ＮＣＡ）（＝ＣＥＡ−（ｄ））を包含す
る。
本発明は、細胞表面においてＣＥＡ族の抗原を発現する
、ヒト以外の哺乳動物、例えは、マウス、ハムスターお
よびラット、の細胞系を提供する。
、ヒト以外の哺乳動物、例えは、マウス、ハムスターお
よびラット、の細胞系を提供する。
本発明は、また、本発明の細胞系を使用して発生した、
特定のＣＥＡ族の構成員に対する抗体（ポリクローナル
およびモノクローナル）に関する。
特定のＣＥＡ族の構成員に対する抗体（ポリクローナル
およびモノクローナル）に関する。
なおさらに、本発明は、また、前述の抗体、あるいは他
の方法により産生されたＣＥＡ抗原に対して向けられた
他の抗体を、ＣＥＡ遺伝子族（抗原族）の異なる構成員
（例えば、ＣＥＡ−（ｂ）、ＣＥＡ−（Ｃ）、ＣＥＡ−
（ｄ） 、ＣＥＡ−（ｅ）、ＣＥＡ−（ｆ）またはＣＥ
Ａ−（ｇ））に対する特異性について試験する一般的方
法に関する。この試験は、個々の細胞系の間接的免疫蛍
光アッセイおよび蛍光活性化細胞分別装置（ｃｅｌｌｓ
ｏ ｒ’ｔ ｅ ｒ）（ＦＡＣ３）の分析により実施
することができる。
の方法により産生されたＣＥＡ抗原に対して向けられた
他の抗体を、ＣＥＡ遺伝子族（抗原族）の異なる構成員
（例えば、ＣＥＡ−（ｂ）、ＣＥＡ−（Ｃ）、ＣＥＡ−
（ｄ） 、ＣＥＡ−（ｅ）、ＣＥＡ−（ｆ）またはＣＥ
Ａ−（ｇ））に対する特異性について試験する一般的方
法に関する。この試験は、個々の細胞系の間接的免疫蛍
光アッセイおよび蛍光活性化細胞分別装置（ｃｅｌｌｓ
ｏ ｒ’ｔ ｅ ｒ）（ＦＡＣ３）の分析により実施
することができる。
ゲノム遺伝子のだめの一次トランスフェクション体細胞
系は、適当なヒト以外の哺乳動物細胞、例えば、マウス
細胞中へのヒトＤＮＡの遺伝子トランスフェクションに
より得られる。二次トランスフェクション体は、問題の
タンパク質の遺伝情報を指定する遺伝子以外の、任意の
ヒトＤＮＡ配列の事実上の不存在により特徴づけられ、
次いで、適当なヒト以外の哺乳動物細胞中への一次トラ
ンス７エクシヨン体の遺伝子トランスフェクションによ
り得ることができる。高度に発現される二次トランスフ
ェクション体のそれ以上の分泌は、増幅について選択さ
れなかった二次系統の２０倍以上程度に多いＣＥＡ族の
抗原を発現する、実質的に相同性の高い発現のクローニ
ングされた細胞系に導くことが出来る［Ｍ、Ｅ、カマル
ク（Ｋａｍａ ｒ ｃ ｋ）ら、ブロシーデインダス・
オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（
Ｐｒ。
系は、適当なヒト以外の哺乳動物細胞、例えば、マウス
細胞中へのヒトＤＮＡの遺伝子トランスフェクションに
より得られる。二次トランスフェクション体は、問題の
タンパク質の遺伝情報を指定する遺伝子以外の、任意の
ヒトＤＮＡ配列の事実上の不存在により特徴づけられ、
次いで、適当なヒト以外の哺乳動物細胞中への一次トラ
ンス７エクシヨン体の遺伝子トランスフェクションによ
り得ることができる。高度に発現される二次トランスフ
ェクション体のそれ以上の分泌は、増幅について選択さ
れなかった二次系統の２０倍以上程度に多いＣＥＡ族の
抗原を発現する、実質的に相同性の高い発現のクローニ
ングされた細胞系に導くことが出来る［Ｍ、Ｅ、カマル
ク（Ｋａｍａ ｒ ｃ ｋ）ら、ブロシーデインダス・
オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（
Ｐｒ。
ｃ、Ｎａｔ １．Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、）ＵＳＡ、８ま
、５３５０−５３５４．１９８７年８月］り抗原の族、
例えば、ＣＥＡにおいて、解読配列が高度に相同性の場
合において、同一のｃ ＤＮＡ断片を使用して族のすべ
ての構成員を分離することができる。例えば、ＣＥＡ−
（ａ） 、これは部公的ｃＤＮＡである、を使用してＣ
ＥＡ族の構成員ＣＥＡ−（ｂ） 、ＣＥＡ−（ｃ） 、
ＣＥＡ（ｄ） 、ＣＥＡ−（ｅ）およびＣＥＡ−（ｆ）
のための完全なｃＤＮＡを分離した。次いで、完全なｃ
ＤＮＡ （ＣＥＡ−（ｂ））［モレキュラー・アンド・
セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１１、Ｂｉｏｌ
、）、Ｖｏｌ、７、Ｎｏ、９、Ｓｅｐ、１９８７．３３
２１−３２３０］ 、ＣＥＡ−（Ｃ） 、ＣＥＡ−（ｄ
） 、ＣＥＡ−Ｃｅ）およびＣＥＡ−（ｆ）をｃＤＮＡ
発現ベクター中にクローニングし、そしてヒト以外の哺
乳動物、例えば、マウスの細胞中にクローニングするこ
とができる。表面上でＣＥＡ族の抗原を発現する細胞系
は、間接的免疫蛍光およびＦＡＣ５分析を使用して検出
、選択およびクローニングすることができる。
、５３５０−５３５４．１９８７年８月］り抗原の族、
例えば、ＣＥＡにおいて、解読配列が高度に相同性の場
合において、同一のｃ ＤＮＡ断片を使用して族のすべ
ての構成員を分離することができる。例えば、ＣＥＡ−
（ａ） 、これは部公的ｃＤＮＡである、を使用してＣ
ＥＡ族の構成員ＣＥＡ−（ｂ） 、ＣＥＡ−（ｃ） 、
ＣＥＡ（ｄ） 、ＣＥＡ−（ｅ）およびＣＥＡ−（ｆ）
のための完全なｃＤＮＡを分離した。次いで、完全なｃ
ＤＮＡ （ＣＥＡ−（ｂ））［モレキュラー・アンド・
セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１１、Ｂｉｏｌ
、）、Ｖｏｌ、７、Ｎｏ、９、Ｓｅｐ、１９８７．３３
２１−３２３０］ 、ＣＥＡ−（Ｃ） 、ＣＥＡ−（ｄ
） 、ＣＥＡ−Ｃｅ）およびＣＥＡ−（ｆ）をｃＤＮＡ
発現ベクター中にクローニングし、そしてヒト以外の哺
乳動物、例えば、マウスの細胞中にクローニングするこ
とができる。表面上でＣＥＡ族の抗原を発現する細胞系
は、間接的免疫蛍光およびＦＡＣ５分析を使用して検出
、選択およびクローニングすることができる。
親の出願において、次のＣＥＡを記載する：ＣＥＡ−（
ａ） 部分的ＣＥＡ ＣＥＡ−（ｂ） 完全な解読ＣＥＡＣＥＡ−（Ｃ）
ＴＭ−１ ＣＥＡ−（ｄ） ＮＣＡ この出願と同時に提出した出願において、次のＣＥＡを
記載する： ＣＥＡ−（ｅ） ＴＭ−２ ＣＥＡ−（ｆ） ＴＭ−３ ＣＥＡ−Ｃｇ） ＴＭ−４゜ ＣＥ Ａ −（ａ ） 〜ＣＥ Ａ −（ｇ ）につい
ての配列を下に記載する： 訃、２ｒ′″ ５δゝ Φ 〉 ０１ 叡 ← ・ の 胃 ＜−−１ 〇 Ｌ ＋＃ ３δ昇 ５Ｇ ′″ Ｖ！１ 謙δ− ２・１蓄 ごごｎ ｇ５エ Ｆ くト ＃・１ド くＨ 詳；“ ３．５３ −１７１Ｍ Ｑく 呂、訃η！ ３．２８ ｅ） ＬＩＬＮ ミニ２二５よＳ 騒；力 ３５； ＜Ｆ−１ ７，３己＃ Ｌｌ ）Ｍ ５之Ｓ く←１ 一−Ｌｌ＜Ｍ ５Ｃ営 ５、！− ５王吊 ＩＬｔＯ ま・馳陳 Ｑ ＩＬ ＬＪ ＞１ （ｈｌ−ＬＪ 〜 Ｌ）１− 寸 く←へ Ｌｌ ＞ へ ＜ ← Ｎ ５＝； ５ピ＝ くく〜 ０ ０ ＬＶ＋ １儀＜＞１ の （Ｍ Ｎ ３５日 円０５ 富”３（２０ ５、！’耳 Ｌｉ＆−（’Ｊ 詳（Ｇ ３″、８ 詳 目“コ く リ Ｌ）ＯＬＪ Ｈ賃留 く ３７脅 ＜＜１ Ｃ叙＜ ｔ−ｔｎ Ｆ Ｕ −− ＜＞Ｆ− ミ、２丼 ９．５５で く一哨 り＜１ １５話 くＰ＋の り ＞ 哨 トｗ ｌｊ ）の ３：；： ＴＴＴ Ｃ（ＣＡＧＡ ＴＴＴ ＣＡＧ ＧＡ
Ａ ＡＣＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＣＴＴ ＴＴＡ
ＡＧＣＴＡＴ ＣＣＡ ＣＴＣＴＴＡ ＣＡ
Ｇ ＣＡＡ ＴＴＴＧＡＴ ＡＡＡ ＡＴＡ
τＡＣＴＴＴ ＴＧＴ ＧＡＡ ＣＡＡ Ａ
ＡＡ ＴＴＧ ＡＧＡ ＣＡＴ ＴＴＡ Ｃ
ＡＴ ＴＴＴ ＡＴＣＣＣＴ ＡＴＧ ＴＧＧ
ＴＣＧ ＣＴＣＣＡＧ ＡＣＴ ＴＧＧ ＧＡＡ ＡＣ
Ｔ ＡＴＴ ＣＡＴ ＧＡＡ ＴＡＴ ＴＴＡ ＴＡＴ
ＴＧＴ ＡＴＧ２つ （内容に変更なし） ＣＡＧＣＣＧＴＧＣＴＣＧＡＡＧＣＧＴＴＣＣＴＧＧＡ
ＧＣＣＣＡＡＧＣＴＣＴＣＣＴＣＣＡＣＡＧＧＴＧＡＡ
ＧＡＣＡＧＧＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＣ；ＡＣＡＣＣＡＴ
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ａ） 部分的ＣＥＡ ＣＥＡ−（ｂ） 完全な解読ＣＥＡＣＥＡ−（Ｃ）
ＴＭ−１ ＣＥＡ−（ｄ） ＮＣＡ この出願と同時に提出した出願において、次のＣＥＡを
記載する： ＣＥＡ−（ｅ） ＴＭ−２ ＣＥＡ−（ｆ） ＴＭ−３ ＣＥＡ−Ｃｇ） ＴＭ−４゜ ＣＥ Ａ −（ａ ） 〜ＣＥ Ａ −（ｇ ）につい
ての配列を下に記載する： 訃、２ｒ′″ ５δゝ Φ 〉 ０１ 叡 ← ・ の 胃 ＜−−１ 〇 Ｌ ＋＃ ３δ昇 ５Ｇ ′″ Ｖ！１ 謙δ− ２・１蓄 ごごｎ ｇ５エ Ｆ くト ＃・１ド くＨ 詳；“ ３．５３ −１７１Ｍ Ｑく 呂、訃η！ ３．２８ ｅ） ＬＩＬＮ ミニ２二５よＳ 騒；力 ３５； ＜Ｆ−１ ７，３己＃ Ｌｌ ）Ｍ ５之Ｓ く←１ 一−Ｌｌ＜Ｍ ５Ｃ営 ５、！− ５王吊 ＩＬｔＯ ま・馳陳 Ｑ ＩＬ ＬＪ ＞１ （ｈｌ−ＬＪ 〜 Ｌ）１− 寸 く←へ Ｌｌ ＞ へ ＜ ← Ｎ ５＝； ５ピ＝ くく〜 ０ ０ ＬＶ＋ １儀＜＞１ の （Ｍ Ｎ ３５日 円０５ 富”３（２０ ５、！’耳 Ｌｉ＆−（’Ｊ 詳（Ｇ ３″、８ 詳 目“コ く リ Ｌ）ＯＬＪ Ｈ賃留 く ３７脅 ＜＜１ Ｃ叙＜ ｔ−ｔｎ Ｆ Ｕ −− ＜＞Ｆ− ミ、２丼 ９．５５で く一哨 り＜１ １５話 くＰ＋の り ＞ 哨 トｗ ｌｊ ）の ３：；： ＴＴＴ Ｃ（ＣＡＧＡ ＴＴＴ ＣＡＧ ＧＡ
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浄書（内容に変更なし） ＴＡＴＡＣＣＴＧＣＣＡＣＧＣＣＡＡＴＡＡＣＴＣＡＧ
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ＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ本発明の細
胞系は、遺伝子のトランスフェクションにより得られる
。遺伝子のトランスフェクションは、ＤＮＡを培養した
細胞の核中に導入し、そして適当な選択系を使用して、
遺伝子物質の一部としてトランスフェクションされたＤ
ＮＡを保持しかつ発現するする細胞を得る方法である［
Ｆ。
Ｈ，ルドル（Ｒｄ ｄ ｌ ｅ） 、Ｍ、Ｅ、カマル（
Ｋａｍｒ ｃ ｋ） 、Ａ、マクレランド（ＭｃＣｌｅ
ｌｌａｎｄ）およびり、ターン（Ｋｕｈｎ）、「哺乳動
物の遺伝子のクローニングにおけるＤＮＡ仲介遺伝子の
転移（ＤＮＡ ＭｅｄｉａｔｅｃｌＧｅｎｅ Ｔｒ
ａｎｓｆｅｒ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅ
ｎｅ Ｃｌｏｎｉｇ）Ｊ、遺伝子工学（Ｇｅｎｅｔｉ
ｃ Ｅｎｇｅｎｅｅｒｉｎｇ）、Ｖｏｌ、５．３１９
−３８８ （１９８４）］。
Ｋａｍｒ ｃ ｋ） 、Ａ、マクレランド（ＭｃＣｌｅ
ｌｌａｎｄ）およびり、ターン（Ｋｕｈｎ）、「哺乳動
物の遺伝子のクローニングにおけるＤＮＡ仲介遺伝子の
転移（ＤＮＡ ＭｅｄｉａｔｅｃｌＧｅｎｅ Ｔｒ
ａｎｓｆｅｒ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅ
ｎｅ Ｃｌｏｎｉｇ）Ｊ、遺伝子工学（Ｇｅｎｅｔｉ
ｃ Ｅｎｇｅｎｅｅｒｉｎｇ）、Ｖｏｌ、５．３１９
−３８８ （１９８４）］。
とくに、本発明による細胞系の調製は、次のものを包含
する： （１）、ヒトＤＮＡ、例えば、Ｌ ｏ Ｖ ｏ細胞（Ａ
ＴＣＣＮｏ、ＣＣＬ２２９）ＤＮＡを選択可能なマーカ
ー、例えば、Ｈ５Ｖ ｔｋ 遺伝子とともに受容体
細胞中に同時ｉ・ランスフェクションする。［・ランス
フェクション法および受容体細胞は、好ましくは、数千
の独立のトランスフェクション体の分離を可能とすべき
であり、例えば、Ｌ ｔ ｋ−細胞を受容体としてを使
用するリン酸力ルンウム沈澱法。
する： （１）、ヒトＤＮＡ、例えば、Ｌ ｏ Ｖ ｏ細胞（Ａ
ＴＣＣＮｏ、ＣＣＬ２２９）ＤＮＡを選択可能なマーカ
ー、例えば、Ｈ５Ｖ ｔｋ 遺伝子とともに受容体
細胞中に同時ｉ・ランスフェクションする。［・ランス
フェクション法および受容体細胞は、好ましくは、数千
の独立のトランスフェクション体の分離を可能とすべき
であり、例えば、Ｌ ｔ ｋ−細胞を受容体としてを使
用するリン酸力ルンウム沈澱法。
（２）ＣＥＡ族の抗原をそれらの表面上で発現する一次
トランスフェクンヨン体細胞の、例えば、蛍光活性化細
胞分別装置による、選択。このような細胞は抗原特異的
試薬、例えば、抗ＣＥＡ抗原のモノクローナル抗体また
はポリクローナル抗体により検出することかできる。
トランスフェクンヨン体細胞の、例えば、蛍光活性化細
胞分別装置による、選択。このような細胞は抗原特異的
試薬、例えば、抗ＣＥＡ抗原のモノクローナル抗体また
はポリクローナル抗体により検出することかできる。
（３）−次トランスフェクション体のＤＮＡを上の（１
）におけるような受容体細胞中に同時トランスフェクシ
ョンし、そして上の（２）におけるような発現する細胞
を選択して二次トランスフェクション体を得る。
）におけるような受容体細胞中に同時トランスフェクシ
ョンし、そして上の（２）におけるような発現する細胞
を選択して二次トランスフェクション体を得る。
（４）二次集団中の細胞の最高１％の細胞の分別および
実質的に相同性の高い発現の集団からのサブクローニン
グによる、より高い発現のレベルをもつトランスフェク
ション体の選択。
実質的に相同性の高い発現の集団からのサブクローニン
グによる、より高い発現のレベルをもつトランスフェク
ション体の選択。
次トランスフェクンヨンにおいて使用するヒトＤＮＡは
、本質的に完全なヒトゲノムを含有する源からの任意の
ヒトＤＮＡであることができるが、好ましくはＣＥＡ族
の抗原を発現することが知られている源細胞系からのヒ
トＤＮＡであろう。
、本質的に完全なヒトゲノムを含有する源からの任意の
ヒトＤＮＡであることができるが、好ましくはＣＥＡ族
の抗原を発現することが知られている源細胞系からのヒ
トＤＮＡであろう。
ＣＥＡの場合において、ＬｏＶｏ細胞はＣＥＡを発現す
ることか知られている。
ることか知られている。
（５） あるいは、トランスフェクションはｃＤＮＡ発
現ベクター中にクローニングしたＣＥＡ族の抗原のだめ
の完全なｃＤＮＡを使用して起こすことができる。この
発現ベクターは、また、哺乳動物の選択可能マーカーを
含有する。本発明において使用する非制限的な例は、次
のものを包含する：ｐＭＶ（ＡＴＣＣＮｏ、３７１９０
）およびｐＭＶＢｎ ｅ ｏ ［Ｇ、Ｎ、パバラキス（
Ｐａｖａｌｋｉｓ）ら、哺乳動物細胞の遺伝子転移ベク
ター（Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔ。
現ベクター中にクローニングしたＣＥＡ族の抗原のだめ
の完全なｃＤＮＡを使用して起こすことができる。この
発現ベクターは、また、哺乳動物の選択可能マーカーを
含有する。本発明において使用する非制限的な例は、次
のものを包含する：ｐＭＶ（ＡＴＣＣＮｏ、３７１９０
）およびｐＭＶＢｎ ｅ ｏ ［Ｇ、Ｎ、パバラキス（
Ｐａｖａｌｋｉｓ）ら、哺乳動物細胞の遺伝子転移ベク
ター（Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔ。
ｒ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅ１ｌｓ）
、コールド・スプリング・ハーバ−（ＧｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ） 、 （１９８７）］
。
、コールド・スプリング・ハーバ−（ＧｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ） 、 （１９８７）］
。
受容体細胞中へのトランスフェクションおよび引き続く
選択は、好ましくは、数百の独立のトランスフェクショ
ン体の分離を可能とすべきである。
選択は、好ましくは、数百の独立のトランスフェクショ
ン体の分離を可能とすべきである。
（６）（２）に記載するようなトランスフェクション体
を発現するｃＤＮＡの選択。
を発現するｃＤＮＡの選択。
受容体ヒ１へ以外の哺乳動物細胞は、同様に、広く変化
することができる。ただし、それらはトランスフェクシ
ョン体を選択するためのある性質を示し、効率よいトラ
ンスフェクションを行い、そしてそれら自体問題の表面
タンパク質を発現しないことを条件とする。本質的には
、すべての組織培養細胞系は、首尾よいトランスフェク
ション体を分離するために使用できる選択可能なマーカ
ーを有するように発生させることができる。例えは、抗
生物質Ｇ４１８に対する耐性を与えるバクテリアのネオ
マイシン耐性遺伝子（アミノグリコシド３′−ポスホト
ランスフェラーゼＩＴ）を使用して、Ｇ４１８に対して
感受性の細胞をトランスフェクションすることかできる
。ある細胞のタイプは普通のリン酸カルシウム法を使用
するとき非効率的な受容体であることがあるが、別の方
法、例えば、エレクトロポレーションまたはプロトプラ
ストの融合を利用することができる。数千の独立のトラ
ンスフェクション体を達成することができるかぎり、任
意の細胞のタイプ全受容体の役割において使用すること
ができる。ヒト抗原の場合において、あるヒト細胞のタ
イプおよび同様な細胞を使用することはできない。なぜ
なら、それらは通常所望の細胞表面タンパク質を発現す
るからである。
することができる。ただし、それらはトランスフェクシ
ョン体を選択するためのある性質を示し、効率よいトラ
ンスフェクションを行い、そしてそれら自体問題の表面
タンパク質を発現しないことを条件とする。本質的には
、すべての組織培養細胞系は、首尾よいトランスフェク
ション体を分離するために使用できる選択可能なマーカ
ーを有するように発生させることができる。例えは、抗
生物質Ｇ４１８に対する耐性を与えるバクテリアのネオ
マイシン耐性遺伝子（アミノグリコシド３′−ポスホト
ランスフェラーゼＩＴ）を使用して、Ｇ４１８に対して
感受性の細胞をトランスフェクションすることかできる
。ある細胞のタイプは普通のリン酸カルシウム法を使用
するとき非効率的な受容体であることがあるが、別の方
法、例えば、エレクトロポレーションまたはプロトプラ
ストの融合を利用することができる。数千の独立のトラ
ンスフェクション体を達成することができるかぎり、任
意の細胞のタイプ全受容体の役割において使用すること
ができる。ヒト抗原の場合において、あるヒト細胞のタ
イプおよび同様な細胞を使用することはできない。なぜ
なら、それらは通常所望の細胞表面タンパク質を発現す
るからである。
不スミ腫瘍から誘導されたＬｔｋ−細胞（ＮＣＴＣクロ
ーン９２９；ＡＴＣＣＮｏ、ＣＣＬｌ）は、受容体細胞
としてとくに有用である。それらは、さらに、細胞のチ
ミジンキナーゼ遺伝子における非復帰突然変異のため、
チミジンキナーゼ活性に欠けるように選択することがで
きる。ＨＡＴ培地はｔｋ活性のための強力な区画を提供
し、これは単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（ｔ
ｋ）遺伝子のトランスフェクションによりＬ ｔ ｋ（
ＣＣＬＩ ｔｋ−）に容易に回復させることかできる
。こうして、安定にトランスフェクションされるように
なった細胞についての、よく特徴づけられた、効率よい
、便利な選択は、これらの細胞の使用により提供される
。Ｌ ｔ ｋ−細胞は、リン酸カルシウムの１−ランス
フェクションの手順のために最も効率よい受容体細胞の
１つである。３００中で１細胞程度に高い頻度を得るこ
とができる。少なくとも数千の独立のトランス７工クン
ヨン体が遺伝子の有効なゲノムのトランスフェクション
に要求されるので、効率的にトランスフェクションする
受容体細胞を使用することが好ましい。Ｌｔ ｋ−細胞
はＣＥＡ族の抗原のいずれも発現しない。Ｉ・ランスフ
ェクション体の選択は間接の免疫蛍光アッセイを包含す
るので、これは受容体細胞の必須の性質であることかで
きる。Ｌｔｋ−細胞における反復ＤＮＡはヒト反復配列
と交差交雑しない。したがって、Ｌｔｋ−細胞における
ｈｍＤＮＡは反復配列のプローブにより検出することが
てきる。Ｉ−ランス７工クンヨン体全発生する１つの目
的は遺伝子の分子クローニングであるので、受容体細胞
はこの基準を満足するヒト以外の種であることが重要で
ある。
ーン９２９；ＡＴＣＣＮｏ、ＣＣＬｌ）は、受容体細胞
としてとくに有用である。それらは、さらに、細胞のチ
ミジンキナーゼ遺伝子における非復帰突然変異のため、
チミジンキナーゼ活性に欠けるように選択することがで
きる。ＨＡＴ培地はｔｋ活性のための強力な区画を提供
し、これは単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（ｔ
ｋ）遺伝子のトランスフェクションによりＬ ｔ ｋ（
ＣＣＬＩ ｔｋ−）に容易に回復させることかできる
。こうして、安定にトランスフェクションされるように
なった細胞についての、よく特徴づけられた、効率よい
、便利な選択は、これらの細胞の使用により提供される
。Ｌ ｔ ｋ−細胞は、リン酸カルシウムの１−ランス
フェクションの手順のために最も効率よい受容体細胞の
１つである。３００中で１細胞程度に高い頻度を得るこ
とができる。少なくとも数千の独立のトランス７工クン
ヨン体が遺伝子の有効なゲノムのトランスフェクション
に要求されるので、効率的にトランスフェクションする
受容体細胞を使用することが好ましい。Ｌｔ ｋ−細胞
はＣＥＡ族の抗原のいずれも発現しない。Ｉ・ランスフ
ェクション体の選択は間接の免疫蛍光アッセイを包含す
るので、これは受容体細胞の必須の性質であることかで
きる。Ｌｔｋ−細胞における反復ＤＮＡはヒト反復配列
と交差交雑しない。したがって、Ｌｔｋ−細胞における
ｈｍＤＮＡは反復配列のプローブにより検出することが
てきる。Ｉ−ランス７工クンヨン体全発生する１つの目
的は遺伝子の分子クローニングであるので、受容体細胞
はこの基準を満足するヒト以外の種であることが重要で
ある。
ゲノムの一次、ゲノムの二次およびｃＤＮＡのトランス
フェクション体は免疫原として使用して、ＣＥＡ族の構
成員に対する抗体、とくにモノクローナル抗体を産生ず
ることができる。トランスフェクション体は、例えば、
ＬｏＶｏ結腸癌細胞より、特異的な免疫原をを提供する
。なぜなら、ヒト腫瘍細胞系はｌより多いＣＥＡ族の抗
原発現するからである。また、ヒト表面タンパク質を発
現する哺乳動物細胞の種および免疫化された動物の種は
、異質タンパク質のみに対して特別に向けられた免疫原
の応答を生成する同一の、例えば、マウスであることが
できる。このようにして産生された抗体および他の方法
により産生された抗体は、ある数の方法、例えば、間接
の免疫蛍光アッセイおよびＦＡＣ３分析により、特定の
ＣＥＡ族の抗原に結合する能力について選択されるであ
ろう。これはＣＥＡ族の抗原について抗体の各々の特異
性を描写する働きをし、そして診断および治療のアプロ
ーチのための候補の抗体の同定に導く重要な情報を提供
するであろう。
フェクション体は免疫原として使用して、ＣＥＡ族の構
成員に対する抗体、とくにモノクローナル抗体を産生ず
ることができる。トランスフェクション体は、例えば、
ＬｏＶｏ結腸癌細胞より、特異的な免疫原をを提供する
。なぜなら、ヒト腫瘍細胞系はｌより多いＣＥＡ族の抗
原発現するからである。また、ヒト表面タンパク質を発
現する哺乳動物細胞の種および免疫化された動物の種は
、異質タンパク質のみに対して特別に向けられた免疫原
の応答を生成する同一の、例えば、マウスであることが
できる。このようにして産生された抗体および他の方法
により産生された抗体は、ある数の方法、例えば、間接
の免疫蛍光アッセイおよびＦＡＣ３分析により、特定の
ＣＥＡ族の抗原に結合する能力について選択されるであ
ろう。これはＣＥＡ族の抗原について抗体の各々の特異
性を描写する働きをし、そして診断および治療のアプロ
ーチのための候補の抗体の同定に導く重要な情報を提供
するであろう。
本発明は、また、ＣＥＡ族に対するモノクローナル抗体
を体細胞の交雑技術により産生ずる方法を提供する。一
般に、本発明のモノクローナル抗体は、ＣＥＡ族の抗原
を発現するヒト以外の吐乳動物細胞（前述のように遺伝
子のトランスフェクションにより調製された）で、ある
いはこのような細胞系から精製されたＣＥ／Ａ族の抗Ｗ
、（例えば、本発明の細胞を親和クロマトグラフィーに
より精製することにより）で能力宿主動物を免疫化し、
ＣＥＡ族の抗原に対する抗体を産生ずる、このような宿
主動物からのリンパ球を骨髄腫細胞と融合してハイブリ
ドーマを形成し、所望の抗体を分泌するハイブリドーマ
のクローンを分離し、そして分泌されたモノクローナル
抗体を収穫することによって、産生される。交雑に参加
するリンパ球は、免疫化された動物、例えは、マウスま
たはラットから取り出した普通の牌細胞である。好まし
くは、リンパ球および骨髄腫細胞の両者は不ズミ由来で
あり、酵素のハイポキサンチングアニンホスホリボシル
１〜ランスフエラーゼに欠けるネズミ骨髄腫細胞はとく
に有用である。体細胞の交雑によりモノクローナル抗体
の産生についての論評および所見については、次の文献
を参照することかできる：リンパ球のハイブリドーマ（
Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ）、メル
ケルス（ｍｅＩｃｈｅｒｓ）ら、スプリンゲルーフエル
ラグ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）にューヨーク
１９７８）ネイチャー （Ｎａ ｔ ｕ ｒ ｅ）、
６６．４９５ （１９７７）；メディカル・ラボラトリ
−・サイエンス（Ｍｅｄ、Ｌａｂ、Ｓｃ ｉ、）、３６
．３２９ （１９７９）；およびサイエンス（Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ）、２０８．６９２（＋９８０）。
を体細胞の交雑技術により産生ずる方法を提供する。一
般に、本発明のモノクローナル抗体は、ＣＥＡ族の抗原
を発現するヒト以外の吐乳動物細胞（前述のように遺伝
子のトランスフェクションにより調製された）で、ある
いはこのような細胞系から精製されたＣＥ／Ａ族の抗Ｗ
、（例えば、本発明の細胞を親和クロマトグラフィーに
より精製することにより）で能力宿主動物を免疫化し、
ＣＥＡ族の抗原に対する抗体を産生ずる、このような宿
主動物からのリンパ球を骨髄腫細胞と融合してハイブリ
ドーマを形成し、所望の抗体を分泌するハイブリドーマ
のクローンを分離し、そして分泌されたモノクローナル
抗体を収穫することによって、産生される。交雑に参加
するリンパ球は、免疫化された動物、例えは、マウスま
たはラットから取り出した普通の牌細胞である。好まし
くは、リンパ球および骨髄腫細胞の両者は不ズミ由来で
あり、酵素のハイポキサンチングアニンホスホリボシル
１〜ランスフエラーゼに欠けるネズミ骨髄腫細胞はとく
に有用である。体細胞の交雑によりモノクローナル抗体
の産生についての論評および所見については、次の文献
を参照することかできる：リンパ球のハイブリドーマ（
Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ）、メル
ケルス（ｍｅＩｃｈｅｒｓ）ら、スプリンゲルーフエル
ラグ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）にューヨーク
１９７８）ネイチャー （Ｎａ ｔ ｕ ｒ ｅ）、
６６．４９５ （１９７７）；メディカル・ラボラトリ
−・サイエンス（Ｍｅｄ、Ｌａｂ、Ｓｃ ｉ、）、３６
．３２９ （１９７９）；およびサイエンス（Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ）、２０８．６９２（＋９８０）。
所望の抗体を分泌する形成した／１イブリドーマは、通
常融合した細胞ハイブリドーマについて選択的な培地上
でクローニングし、そして適当な培地により抗体を分泌
する分離した／・イブリドーマハイブリドーマを決定す
ることにより分離される。
常融合した細胞ハイブリドーマについて選択的な培地上
でクローニングし、そして適当な培地により抗体を分泌
する分離した／・イブリドーマハイブリドーマを決定す
ることにより分離される。
その後、ハイブリドーマの細胞系の相同性は、好ましく
は、それらの所望の抗体分泌について選択したハイブリ
ドーマをスクリーニングすることによって確証される。
は、それらの所望の抗体分泌について選択したハイブリ
ドーマをスクリーニングすることによって確証される。
分泌されるモノクローナル抗体の収穫は普通の技術によ
り実施される。抗体の増殖は、ハイブリドーマを生体外
または生体内で培養することにより、例えば、動物、例
えば、マウス中にハイブリドーマを導入し、そして抗体
に富んだ腹水を取り出すことにより達成することができ
る。
り実施される。抗体の増殖は、ハイブリドーマを生体外
または生体内で培養することにより、例えば、動物、例
えば、マウス中にハイブリドーマを導入し、そして抗体
に富んだ腹水を取り出すことにより達成することができ
る。
ＣＥＡ族の抗原に対する抗体を産生ずるリンパ球は、種
々の部位から、通常リンマ節または肺臓から得ることが
できる。通常、分泌されるリンパ球は免疫化された動物
からの肺細胞である。免疫化は、宿主動物、例えば、マ
ウス、ラットまたはヤキに、種々の部位の１または２以
上において、受容体発現ヒト以外の哺乳動物細胞、好ま
しくは高い発現性の細胞を注射することにより達成する
ことかできる。その後、それ以上の注射は、同または異
なる部位において、規則的または不規則的な間隔で、杭
受容体抗体が生体内で産生されることか明らかになるま
で、実施する。
々の部位から、通常リンマ節または肺臓から得ることが
できる。通常、分泌されるリンパ球は免疫化された動物
からの肺細胞である。免疫化は、宿主動物、例えば、マ
ウス、ラットまたはヤキに、種々の部位の１または２以
上において、受容体発現ヒト以外の哺乳動物細胞、好ま
しくは高い発現性の細胞を注射することにより達成する
ことかできる。その後、それ以上の注射は、同または異
なる部位において、規則的または不規則的な間隔で、杭
受容体抗体が生体内で産生されることか明らかになるま
で、実施する。
骨髄腫細胞、すなわち、−次骨髄腫瘍からの悪性細胞は
、未知の特異性をもつ免疫グロブリンを産生じ、そして
生体外で増殖する能力を有する。
、未知の特異性をもつ免疫グロブリンを産生じ、そして
生体外で増殖する能力を有する。
対照的に、既知の特異性をもつ免疫グロブリンの分泌に
より特徴づけられる個々のリンパ球、すなわち、既知の
抗原またはハプテンを結合できる抗体は、生体外の培養
で不安定である。ハイブリドーマ、すなわち、単一のリ
ンパ球と単一の骨髄腫細胞との融合により形成した雑種
細胞は、リンパ球親細胞の所望の免疫学的特異性および
骨髄腫親細胞の所望の生体外安定性を保持する。種々の
動物由来の骨髄腫細胞、例えば、マウスまたはラットか
らの骨髄腫細胞を本発明に従い使用することができるが
、同一動物種から、好ましくはこのような動物種の同一
系統から誘導されるリンパ球および骨髄腫細胞を融合す
ることが好ましい。ネズミリンパ球および骨髄腫細胞は
、とくにＢＡＬＢ／Ｃ系統からのそれらは、最も普通に
使用される。
より特徴づけられる個々のリンパ球、すなわち、既知の
抗原またはハプテンを結合できる抗体は、生体外の培養
で不安定である。ハイブリドーマ、すなわち、単一のリ
ンパ球と単一の骨髄腫細胞との融合により形成した雑種
細胞は、リンパ球親細胞の所望の免疫学的特異性および
骨髄腫親細胞の所望の生体外安定性を保持する。種々の
動物由来の骨髄腫細胞、例えば、マウスまたはラットか
らの骨髄腫細胞を本発明に従い使用することができるが
、同一動物種から、好ましくはこのような動物種の同一
系統から誘導されるリンパ球および骨髄腫細胞を融合す
ることが好ましい。ネズミリンパ球および骨髄腫細胞は
、とくにＢＡＬＢ／Ｃ系統からのそれらは、最も普通に
使用される。
骨髄腫細胞は分泌型または非分泌型であることかでき、
前者は細胞遊離の免疫グロブリンまたはその断片の取り
囲む培地中への分泌により特徴づけられる。非分泌細胞
系は好ましい、なぜなら、得られるハイブリドーマは、
親リンパ球により産生される唯一の特異的免疫グロブリ
ン（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡまたはＩｇＤのク
ラス）の分泌の特色をなすからである。そのうえ、特定
のヌクレオチド合成において欠乏される骨髄腫細胞はと
くに好ましい。なぜなら、このような環境は非融合リン
パ球および骨髄腫細胞からのノ＼イブリドーマの分離の
容易な手段を提供するからである。骨髄腫細胞がヌクレ
オチド形成の唯一の源として欠乏する、ヌクレオチド合
成酵素のＩ：めの１または２以上の基質を含有する培地
上で増殖するとき、ハイブリドーマは生存しかつ増殖す
るであろう。なぜなら、欠乏する酵素はリンパ球から保
持された遺伝子の特徴により提供されるであろうからで
ある。しかしながら、酵素の欠乏のために非融合骨髄腫
細胞は死に、そして非融合リンパ球はそれらの固有の生
体外の不安定性のために死ぬ。
前者は細胞遊離の免疫グロブリンまたはその断片の取り
囲む培地中への分泌により特徴づけられる。非分泌細胞
系は好ましい、なぜなら、得られるハイブリドーマは、
親リンパ球により産生される唯一の特異的免疫グロブリ
ン（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡまたはＩｇＤのク
ラス）の分泌の特色をなすからである。そのうえ、特定
のヌクレオチド合成において欠乏される骨髄腫細胞はと
くに好ましい。なぜなら、このような環境は非融合リン
パ球および骨髄腫細胞からのノ＼イブリドーマの分離の
容易な手段を提供するからである。骨髄腫細胞がヌクレ
オチド形成の唯一の源として欠乏する、ヌクレオチド合
成酵素のＩ：めの１または２以上の基質を含有する培地
上で増殖するとき、ハイブリドーマは生存しかつ増殖す
るであろう。なぜなら、欠乏する酵素はリンパ球から保
持された遺伝子の特徴により提供されるであろうからで
ある。しかしながら、酵素の欠乏のために非融合骨髄腫
細胞は死に、そして非融合リンパ球はそれらの固有の生
体外の不安定性のために死ぬ。
好ましい骨髄腫細胞系は、酵素ハイポキサンチングアニ
ンホスホリルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）に欠乏
し、そしてヌクレオチド合成のためのハイポキサンチン
、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培地上で生
存することができないものである［例えば、このような
培地はＨＡＴ培地と呼ばれる一合成（Ｓｙｎ ｔ ｈｅ
ｓ ｉ ｓ）、１４５．７０９ （１９６４）］。本
発明の方法において有用な特定の骨髄腫細胞は、従来こ
の分野において知られている。
ンホスホリルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）に欠乏
し、そしてヌクレオチド合成のためのハイポキサンチン
、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培地上で生
存することができないものである［例えば、このような
培地はＨＡＴ培地と呼ばれる一合成（Ｓｙｎ ｔ ｈｅ
ｓ ｉ ｓ）、１４５．７０９ （１９６４）］。本
発明の方法において有用な特定の骨髄腫細胞は、従来こ
の分野において知られている。
リンパ球および骨髄腫細胞を融合してハイブリドーマを
形成することは、普通の手段により、通常、融合剤、例
えば、センダイ（ｓｅｎｄａｉ）ウィルスまたはポリエ
ーテルグリコール（ＰＥＧ）の存在下に細胞を混合する
ことにより達成される。
形成することは、普通の手段により、通常、融合剤、例
えば、センダイ（ｓｅｎｄａｉ）ウィルスまたはポリエ
ーテルグリコール（ＰＥＧ）の存在下に細胞を混合する
ことにより達成される。
ＰＥＧは好ましい融合剤であり、そして純度および生体
外適用のだめの適当性が広く変化する、商業的ロフトで
入手可能である。ＰＥＧの融合剤についての最適な分子
量は確立されておらず、約１００〜４０００ （ＰＥＧ
１００Ｏなどとして商業的に入手可能である）は普通に
使用される。
外適用のだめの適当性が広く変化する、商業的ロフトで
入手可能である。ＰＥＧの融合剤についての最適な分子
量は確立されておらず、約１００〜４０００ （ＰＥＧ
１００Ｏなどとして商業的に入手可能である）は普通に
使用される。
融合の機構は、一般に、未知であり、そして存在する約
１０’正常細胞につき１つの形成されるハイブリドーマ
の効率を生成する。リンパ球対骨髄腫細胞の数の比は、
通常ｌより多く、より通常５以上である。リンパ球のス
クリーニングされない集団は融合のために骨髄腫細胞に
利用可能とされるので、得られるハイブリドーマは種々
の抗体の分泌の分布を発現する。所望の抗体を分泌する
ハイブリドーマのクローン、すなわち、共通の単細胞由
来を有する細胞の集団は、普通の技術により分離される
。共通の技術は、ハイブリドーマを含有する得られる体
積の大部分が１より多くを含有しない、希釈された多数
の体積に、融合混合物を分割することを包含する。好ま
しくは、個々の体積は選択的培地、例えば、前述のＨＡ
Ｔ培地からなり、ここでハイブリドーマが生存する。別
の培地のアリコートを、適当なインキュベーション後、
取り出し、そして所望の抗体についてアッセイする。こ
のスクリーニング工程において、多くの方法、例えば、
均質または不均質のタイプのラジオイムノアッセイまた
は非アイソトープイムノアッセイのようなイムノアッセ
イが普通に用いられる。次いで、所望の抗体について陽
性の培地を、通常、スクリーニングし、例えば、それ以
上の制限希釈工程によりスクリーニングして、モノクロ
ーナル分離および所望のハイブリドーマの安定性を確実
にする。
１０’正常細胞につき１つの形成されるハイブリドーマ
の効率を生成する。リンパ球対骨髄腫細胞の数の比は、
通常ｌより多く、より通常５以上である。リンパ球のス
クリーニングされない集団は融合のために骨髄腫細胞に
利用可能とされるので、得られるハイブリドーマは種々
の抗体の分泌の分布を発現する。所望の抗体を分泌する
ハイブリドーマのクローン、すなわち、共通の単細胞由
来を有する細胞の集団は、普通の技術により分離される
。共通の技術は、ハイブリドーマを含有する得られる体
積の大部分が１より多くを含有しない、希釈された多数
の体積に、融合混合物を分割することを包含する。好ま
しくは、個々の体積は選択的培地、例えば、前述のＨＡ
Ｔ培地からなり、ここでハイブリドーマが生存する。別
の培地のアリコートを、適当なインキュベーション後、
取り出し、そして所望の抗体についてアッセイする。こ
のスクリーニング工程において、多くの方法、例えば、
均質または不均質のタイプのラジオイムノアッセイまた
は非アイソトープイムノアッセイのようなイムノアッセ
イが普通に用いられる。次いで、所望の抗体について陽
性の培地を、通常、スクリーニングし、例えば、それ以
上の制限希釈工程によりスクリーニングして、モノクロ
ーナル分離および所望のハイブリドーマの安定性を確実
にする。
所望のモノクローナル抗体はいくつかの異なる方法によ
り収穫することができる。１つの方法において、ハイブ
リドーマのクローンを適当な時間生体外で培養し、そし
て培地のアリコートを抜き出してモノクローナル抗体に
富んだ分画を得る。
り収穫することができる。１つの方法において、ハイブ
リドーマのクローンを適当な時間生体外で培養し、そし
て培地のアリコートを抜き出してモノクローナル抗体に
富んだ分画を得る。
あるいは、ハイブリドーマのクローンを宿主動物、通常
マウスに注射または移植して、生体外で腫瘍を増殖し、
そして腹水中に大量のモノクローナル抗体を蓄積し、そ
してこれは適当に取り出して抗体に富んだ分画を得るこ
とができる。
マウスに注射または移植して、生体外で腫瘍を増殖し、
そして腹水中に大量のモノクローナル抗体を蓄積し、そ
してこれは適当に取り出して抗体に富んだ分画を得るこ
とができる。
本発明の細胞系は、また、ＣＥＡ抗原族の異なる構成員
を認識するとき、それらの特異性についてモノクローナ
ル抗体またはポリクローナル抗体をスクリーニングする
ことができる。例えば、細胞系は抗体とともにインキュ
ベーションし、そしてこのような細胞に結合する抗体を
普通の免疫学的方法により、例えば、ＲＩＡ、ＥＬＩＳ
Ａおよび間接の免疫蛍光アッセイにより検出することが
できる。
を認識するとき、それらの特異性についてモノクローナ
ル抗体またはポリクローナル抗体をスクリーニングする
ことができる。例えば、細胞系は抗体とともにインキュ
ベーションし、そしてこのような細胞に結合する抗体を
普通の免疫学的方法により、例えば、ＲＩＡ、ＥＬＩＳ
Ａおよび間接の免疫蛍光アッセイにより検出することが
できる。
次の実施例によって、本発明をさらに説明する。
犬貫を
実施例１： 遺伝子のトランスフェクション遺伝子のト
ランスフェクションの方法は、単純ヘルペスウィルスの
チミジンキナーゼ（ＨＣＶｔｋ）とのリン酸カルシウム
の共沈により、ヒトゲノムＤ、ＮＡをマウスｔ ｋ−細
胞（チミジンキナゼ欠乏マウスＬ細胞）中に導入しかつ
安定に組み込むことを包含するか、あるいはリン酸カル
シウム沈澱により、Ｌｔｋ−細胞中に選択可能なマーカ
ーを含有する真核細胞の発現ベクターを導入しかつ安定
に組み込むことを包含する。トランスフエクションした
細胞を問題の表面分子について特異的な蛍光グローブで
着色し、そして陽性の細胞を蛍光活性化細胞分別装置（
ＦＡＣ３）で全体の集団から濃縮した。
ランスフェクションの方法は、単純ヘルペスウィルスの
チミジンキナーゼ（ＨＣＶｔｋ）とのリン酸カルシウム
の共沈により、ヒトゲノムＤ、ＮＡをマウスｔ ｋ−細
胞（チミジンキナゼ欠乏マウスＬ細胞）中に導入しかつ
安定に組み込むことを包含するか、あるいはリン酸カル
シウム沈澱により、Ｌｔｋ−細胞中に選択可能なマーカ
ーを含有する真核細胞の発現ベクターを導入しかつ安定
に組み込むことを包含する。トランスフエクションした
細胞を問題の表面分子について特異的な蛍光グローブで
着色し、そして陽性の細胞を蛍光活性化細胞分別装置（
ＦＡＣ３）で全体の集団から濃縮した。
詳しくは、マウスＬｔｋ−細胞をゲノムＤＮＡおよびＨ
３Ｖ ｔ ｋ遺伝子と、標準のリン酸カルシウム法およ
びＨＡＴ培地を使用して同時トランスフェクションした
［グラハム（Ｇｒａｈａｍ）およびファン・デル・ニブ
（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ）、ウィルス学（Ｖｉ ｒ
ｏ １．） 、５２．４５６−４６７ （１９７３）］
。
３Ｖ ｔ ｋ遺伝子と、標準のリン酸カルシウム法およ
びＨＡＴ培地を使用して同時トランスフェクションした
［グラハム（Ｇｒａｈａｍ）およびファン・デル・ニブ
（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ）、ウィルス学（Ｖｉ ｒ
ｏ １．） 、５２．４５６−４６７ （１９７３）］
。
実施例２＋ ＣＥＡ族の構成員を発現する細胞のり
分離されたＣＥＡ族の構成員を発現する細胞を検出する
ために、間接の免疫蛍光アッセイを使用した。１〜５Ｘ
１０６の細胞を組織培養から、二価のカチオンのキレー
ト剤のエチレンジアミノテトう酢酸（ＥＤＴＡ）を含有
するリン酸塩緩衝液を使用して、取り出した。次いで、
これらの細胞をＣＥＡ抗原を認識するウサギポリクロー
ナル抗体またはマウスモノクローナル抗体と４°Ｃにお
いて３０〜６０分間反応させた。細胞を順次に蛍光を付
与したヤギまたはウサギ抗マウスＩｇＧとともに４°Ｃ
において６０分間インキュベーションした。無菌の細胞
の分別はベクトン・ディキンリン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄ
ｉｃｋｉ、ｎ５ｏｎ）蛍光活性化細胞分別装置を使用し
て実施した。分別した細胞を拡張し、分析が少なくとも
９５％の陽性の細胞を示すまで、再分別した。単細胞の
クローニングを使用して、表面抗原の発現について１０
０％陽性であることを示したクローナル細胞系を確立し
ｊ二。
ために、間接の免疫蛍光アッセイを使用した。１〜５Ｘ
１０６の細胞を組織培養から、二価のカチオンのキレー
ト剤のエチレンジアミノテトう酢酸（ＥＤＴＡ）を含有
するリン酸塩緩衝液を使用して、取り出した。次いで、
これらの細胞をＣＥＡ抗原を認識するウサギポリクロー
ナル抗体またはマウスモノクローナル抗体と４°Ｃにお
いて３０〜６０分間反応させた。細胞を順次に蛍光を付
与したヤギまたはウサギ抗マウスＩｇＧとともに４°Ｃ
において６０分間インキュベーションした。無菌の細胞
の分別はベクトン・ディキンリン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄ
ｉｃｋｉ、ｎ５ｏｎ）蛍光活性化細胞分別装置を使用し
て実施した。分別した細胞を拡張し、分析が少なくとも
９５％の陽性の細胞を示すまで、再分別した。単細胞の
クローニングを使用して、表面抗原の発現について１０
０％陽性であることを示したクローナル細胞系を確立し
ｊ二。
マウスＬ細胞トランスフェクション体の分離は、前述し
たように間接の免疫蛍光アッセイを使用して開始した。
たように間接の免疫蛍光アッセイを使用して開始した。
ゲノム遺伝子のトランスフェクションのため、Ｌ細胞の
プールをＬｏＶｏ ＤＮＡとトランスフェクションし
、そして現れる２０，０００の独立の細胞のクローンを
調製用細胞分別にかける。細胞分別の反復したラウンド
後、細胞の１００％は陽性であり、免疫蛍光アッセイに
おける特異的蛍光を示した。単細胞のクローニングを使
用して、特異的免疫蛍光の高い（ＺＨ）または低い（Ｚ
Ｌ）レベルを表す、クローニングされた細胞系を分離
した。これらのクローンからの陽性の細胞を回収し、そ
してＺ Ｌ １およびＺ Ｈ２都市機別した。ＤＮＡは
系統の各々から抽出され、そしてサザンブロッテイング
およびＨｅＬａ ＤＮＡプローブへの交雑により分析
した。この実施例により、細胞の各々はヒトＤＮＡを含
有し、そして２つの独立のクローンは単一の親コロニー
からの誘導体を表したことが実証された。−次トランス
フェクション体について期待したように、細胞系の各々
は大量のヒトＤＮＡを含有し、その量はヒト反復配列の
プローブでブロービングしたとき、交雑の密度に基づい
て、数百キロ塩基であると推定された。
プールをＬｏＶｏ ＤＮＡとトランスフェクションし
、そして現れる２０，０００の独立の細胞のクローンを
調製用細胞分別にかける。細胞分別の反復したラウンド
後、細胞の１００％は陽性であり、免疫蛍光アッセイに
おける特異的蛍光を示した。単細胞のクローニングを使
用して、特異的免疫蛍光の高い（ＺＨ）または低い（Ｚ
Ｌ）レベルを表す、クローニングされた細胞系を分離
した。これらのクローンからの陽性の細胞を回収し、そ
してＺ Ｌ １およびＺ Ｈ２都市機別した。ＤＮＡは
系統の各々から抽出され、そしてサザンブロッテイング
およびＨｅＬａ ＤＮＡプローブへの交雑により分析
した。この実施例により、細胞の各々はヒトＤＮＡを含
有し、そして２つの独立のクローンは単一の親コロニー
からの誘導体を表したことが実証された。−次トランス
フェクション体について期待したように、細胞系の各々
は大量のヒトＤＮＡを含有し、その量はヒト反復配列の
プローブでブロービングしたとき、交雑の密度に基づい
て、数百キロ塩基であると推定された。
二次トランスフェクション体を得るために、次トランス
フェクション体からのＤＮＡをＬｔ’に細胞中に同時ト
ランスフェクションし、そして細胞分別を前述したよう
に実施した。２３．１５．２３．２５．２３．３２およ
び２３．４４と表示する合計４つのクローナル細胞系胞
系を得た。高い発現の細胞系を、発現の均質なレベルが
得られるまで、二次プールの反復したラウンドの分別に
より分離し、次いでスクリーニングした。この系統、２
３．４１と表示する（１９８８年６月１日に受託Ｎｏ、
ＣＲＬ ９７３１でＡＴＣＣに受託された）は、免疫
蛍光の強さのに基づいて記載して、他の細胞のクローン
のほぼ２０倍のレベルの免疫蛍光を発現することが発見
された。これらのゲノムトランスフェクション体は、Ｃ
ＥＡ−（Ｃ）、ＣＥＡ−（ｄ）（ＴＭ−Ｉ ＣＥＡ）
、ＣＥＡ（ｅ）（ＴＭ−２ＣＥＡ） 、ＣＥＡ−（ｆ）
（ＴＭ−３ＣＥＡ）およびＣＥＡ−（ｇ）（ＴＭ−４Ｃ
ＥＡ）、トランスメンブレンＣＥＡを含有し、かつ発現
する。
フェクション体からのＤＮＡをＬｔ’に細胞中に同時ト
ランスフェクションし、そして細胞分別を前述したよう
に実施した。２３．１５．２３．２５．２３．３２およ
び２３．４４と表示する合計４つのクローナル細胞系胞
系を得た。高い発現の細胞系を、発現の均質なレベルが
得られるまで、二次プールの反復したラウンドの分別に
より分離し、次いでスクリーニングした。この系統、２
３．４１と表示する（１９８８年６月１日に受託Ｎｏ、
ＣＲＬ ９７３１でＡＴＣＣに受託された）は、免疫
蛍光の強さのに基づいて記載して、他の細胞のクローン
のほぼ２０倍のレベルの免疫蛍光を発現することが発見
された。これらのゲノムトランスフェクション体は、Ｃ
ＥＡ−（Ｃ）、ＣＥＡ−（ｄ）（ＴＭ−Ｉ ＣＥＡ）
、ＣＥＡ（ｅ）（ＴＭ−２ＣＥＡ） 、ＣＥＡ−（ｆ）
（ＴＭ−３ＣＥＡ）およびＣＥＡ−（ｇ）（ＴＭ−４Ｃ
ＥＡ）、トランスメンブレンＣＥＡを含有し、かつ発現
する。
ＣＥＡ −（ｂ） 、 ＣＥＡ −（ｃ） 、 Ｃ
ＥＡ（ｄ）およびＣＥＡ−（ｅ）の各々の遺伝情報を指
定するｃＤＮＡを発現するマウスＬ細胞の分離は、前述
の間接の免疫蛍光結合アッセイを使用して開始した。ｐ
ＭＶＢｎｅｏ （ｐＭＶＢｎｅｏはｐＳＶ２ｎｅｏ、Ａ
、ＴＣＣＮｏ、３７１４９から誘導された）から誘導さ
れた発現ベクターＭＴＩ−１中で各ｃ Ｄ Ｎ Ａでト
ランスフェクションし、そして１０００〜５０００の独
立のトランスフェクションの事象を発現するし細胞のプ
ールを、細胞分別分析にかけた。ＣＥＡ−（ｃ）および
ＣＥＡ−（ｅ）を発現するＬ細胞はトランスフェクショ
ンした細胞の１００％でトランスメンブレンＣＥＡを発
現し、そしてスクリーニングした。この産生された細胞
系１６．６ （ＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ９７３５．１９８
８年６月２日にＡＴＣＣに受託された）はＣＥＡ−（ｃ
）すなわちＴＭ−ＩＣＥＡのｃＤＮＡを発現し、そして
細胞系２２゜７ （ＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ９７３０．１
９８８年６月１日にＡＴＣＣに受託された）はＣＥＡ（
ｅ）すなわち交互にきり継ぎされたＴＭ−２ＣＥＡのｃ
ＤＮＡを発現した。発現ベクター中でＣＥＡ−（ｂ）お
よびＣＥＡ−（ｄ）でトランスフェクションしたＬ細胞
は、細胞の１〜２％で検出可能な表面抗原を発現した。
ＥＡ（ｄ）およびＣＥＡ−（ｅ）の各々の遺伝情報を指
定するｃＤＮＡを発現するマウスＬ細胞の分離は、前述
の間接の免疫蛍光結合アッセイを使用して開始した。ｐ
ＭＶＢｎｅｏ （ｐＭＶＢｎｅｏはｐＳＶ２ｎｅｏ、Ａ
、ＴＣＣＮｏ、３７１４９から誘導された）から誘導さ
れた発現ベクターＭＴＩ−１中で各ｃ Ｄ Ｎ Ａでト
ランスフェクションし、そして１０００〜５０００の独
立のトランスフェクションの事象を発現するし細胞のプ
ールを、細胞分別分析にかけた。ＣＥＡ−（ｃ）および
ＣＥＡ−（ｅ）を発現するＬ細胞はトランスフェクショ
ンした細胞の１００％でトランスメンブレンＣＥＡを発
現し、そしてスクリーニングした。この産生された細胞
系１６．６ （ＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ９７３５．１９８
８年６月２日にＡＴＣＣに受託された）はＣＥＡ−（ｃ
）すなわちＴＭ−ＩＣＥＡのｃＤＮＡを発現し、そして
細胞系２２゜７ （ＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ９７３０．１
９８８年６月１日にＡＴＣＣに受託された）はＣＥＡ（
ｅ）すなわち交互にきり継ぎされたＴＭ−２ＣＥＡのｃ
ＤＮＡを発現した。発現ベクター中でＣＥＡ−（ｂ）お
よびＣＥＡ−（ｄ）でトランスフェクションしたＬ細胞
は、細胞の１〜２％で検出可能な表面抗原を発現した。
これらの抗原陽性細胞は、蛍光活性化細胞分別装置によ
り分別し、そしてスクリーニングした。この産生された
細胞系ＩＬＶ７−１．２ （ＡＴＣＣＮｏ、９７３３．
１９８８年６月１日にＡＴＣＣに受託された）はＣＥＡ
−（ｂ）またはＣＥＡのｃＤＮＡを発現し、そして細胞
系ＢＴ−２０，４（ＡＴＣＣＮｏ。
り分別し、そしてスクリーニングした。この産生された
細胞系ＩＬＶ７−１．２ （ＡＴＣＣＮｏ、９７３３．
１９８８年６月１日にＡＴＣＣに受託された）はＣＥＡ
−（ｂ）またはＣＥＡのｃＤＮＡを発現し、そして細胞
系ＢＴ−２０，４（ＡＴＣＣＮｏ。
９７３２．１９８８年６月１日ｉ： Ａ Ｔ ＣＣに受
託された）はＣＥＡ−（ｄ）またはＮＣＡのｃＤＮＡを
発現した。
託された）はＣＥＡ−（ｄ）またはＮＣＡのｃＤＮＡを
発現した。
同一の方法において、ＣＥＡ−（ｆ）およびＣＥＡ−（
ｇ）のｃＤＮＡを発現する細胞系はこれらのタンパク質
の遺伝情報を指定する完全なｃＤＮＡから産生される。
ｇ）のｃＤＮＡを発現する細胞系はこれらのタンパク質
の遺伝情報を指定する完全なｃＤＮＡから産生される。
実施例５： 真核細胞中の発現のためのベクターΔ鼻疲
制２エンドヌクレアーゼを使用して、真核細胞のプロモ
ーターから下流３′の領域における真核細胞発現ベクタ
ーを消化する。この実施例において、マウスのメタロチ
オネインを含有する発現ベクターｐＭＴＩ−１（これは
メタロチオネインプロモーターに対して３′に導入され
た独特Ｅｃ。
ーターから下流３′の領域における真核細胞発現ベクタ
ーを消化する。この実施例において、マウスのメタロチ
オネインを含有する発現ベクターｐＭＴＩ−１（これは
メタロチオネインプロモーターに対して３′に導入され
た独特Ｅｃ。
Ｒ■部位をもつｐＭＶＢｎｅｏから誘導された）を、制
限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲｒで消化ｔ−る。この実
施例においてＣＥＡ遺伝子族の１構成員、ＣＥＡ−（ｂ
） 、についての完全なｃＤＮＡを、また、ＥｃｏＲＩ
を使用する制限エンドヌクレアーゼの消化により分離す
る。このインサートを発現ベクター中に結合し、そして
得られる結合混合物を使用してＨＢＩＯｌ （ＡＴＣＣ
Ｎｏ。
限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲｒで消化ｔ−る。この実
施例においてＣＥＡ遺伝子族の１構成員、ＣＥＡ−（ｂ
） 、についての完全なｃＤＮＡを、また、ＥｃｏＲＩ
を使用する制限エンドヌクレアーゼの消化により分離す
る。このインサートを発現ベクター中に結合し、そして
得られる結合混合物を使用してＨＢＩＯｌ （ＡＴＣＣ
Ｎｏ。
３３６９４）バクテリアを形質転換する。形質転換した
バクテリアのアルカリ性ミニリゼイトの調製物をＥｃｏ
ＲＩ消化により分析してｃＤＮＡインサートの存在を検
出し、そしてＫｐｎｌおよび５ｃａｌを使用して発現ベ
クター中のｃ Ｄ Ｎ Ａの正しい向きを決定する。適
当なインサートの向きをもつプラスミドＤＮＡは、真核
細胞のトランスフェクションのために使用する。
バクテリアのアルカリ性ミニリゼイトの調製物をＥｃｏ
ＲＩ消化により分析してｃＤＮＡインサートの存在を検
出し、そしてＫｐｎｌおよび５ｃａｌを使用して発現ベ
クター中のｃ Ｄ Ｎ Ａの正しい向きを決定する。適
当なインサートの向きをもつプラスミドＤＮＡは、真核
細胞のトランスフェクションのために使用する。
ＣＥＡ抗原族の構成員と反応するモノクローナル抗体の
パネルを、間接の免疫蛍光アッセイにより、細胞系ＩＬ
Ｖ７−１．２および２３．４１およびＢＴ−２０，４お
よびＣＥＡに対して向けられた商業的に入手可能な抗体
、すなわち、ＤＡＫＯ（Ｃａｔ、 Ｎｏ、４１１５、Ｄ
ａｋｏ Ｃａｒｐ、、米国カリフォルニア州すンタバ
ルバラ）、ＺＹＭＥＤ （Ｃａｔ、Ｎｏ ０３−６５
５１、ＺｙｍｅｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国カリ
フォルニア州すンフランシスコ）およびＨｙｂｒｉｔｅ
ｃｈ（Ｃａｔ、Ｎｏ、００６２、ＨｙｂｒｉｔｅｃｈＩ
ｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄｓ米国カリフォルニア州ラジョ
リア）を包含する抗体のパネルを使用しう反応性につい
て試験する。それらを飽和量で使用して、ここに記載す
る免疫蛍光アッセイにより細胞系を標識する。蛍光活性
化細胞分別装置による免疫蛍光分析により、上の抗体の
すへての３つはこれらの細胞系と反応したことか示され
た。
パネルを、間接の免疫蛍光アッセイにより、細胞系ＩＬ
Ｖ７−１．２および２３．４１およびＢＴ−２０，４お
よびＣＥＡに対して向けられた商業的に入手可能な抗体
、すなわち、ＤＡＫＯ（Ｃａｔ、 Ｎｏ、４１１５、Ｄ
ａｋｏ Ｃａｒｐ、、米国カリフォルニア州すンタバ
ルバラ）、ＺＹＭＥＤ （Ｃａｔ、Ｎｏ ０３−６５
５１、ＺｙｍｅｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国カリ
フォルニア州すンフランシスコ）およびＨｙｂｒｉｔｅ
ｃｈ（Ｃａｔ、Ｎｏ、００６２、ＨｙｂｒｉｔｅｃｈＩ
ｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄｓ米国カリフォルニア州ラジョ
リア）を包含する抗体のパネルを使用しう反応性につい
て試験する。それらを飽和量で使用して、ここに記載す
る免疫蛍光アッセイにより細胞系を標識する。蛍光活性
化細胞分別装置による免疫蛍光分析により、上の抗体の
すへての３つはこれらの細胞系と反応したことか示され
た。
これはＣＥＡ抗原族の個々の構成員についての特異性を
これらの抗体が欠くことを示した。
これらの抗体が欠くことを示した。
実施例７・ これらの細胞系を使用する抗体の産生
トランスフェクション体の細胞系２３．４１１を使用し
て、Ｃ３Ｈ／ＨｅｊＸＢａｌｂ／ｃＪマウスを免疫化す
る。ｌＸｌ０’の生きている細胞をこれらのマウスに週
２回２か月間腹腔内に注射した。これらのマウスの４匹
の肺臓を最後の細胞の注射後３日に取り出し、そして６
１５ハイブリドーマをハイブリドーマの親系統ｐ３Ｘ６
３Ａｇ８．６４３ （ＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ１５８０）
との融合後産生した。これらのハイブリドーマからの上
澄み液を、免疫蛍光により、細胞系２３．４１１とのそ
れらの反応性についてアッセイした。引き続いて、２３
．４１１について陽性のハイブリドーマをＬ細胞の親と
のそれらの反応性について試験し、そしてＬ細胞に対す
る抗体を産生するハイブリドーマを廃棄した。細胞系２
３゜４１１に対して向けられた上澄み液抗体を産生ずる
ハイブリドーマをスクリーニングし、そしてそれらの反
応性について再び試験した。ＣＴｌｌ０９．９ａＣ３と
表示するハイブリドーマが産生され、これは２３．４１
１と反応するが、Ｌ細胞の親と反応しないことが実証さ
れた。
て、Ｃ３Ｈ／ＨｅｊＸＢａｌｂ／ｃＪマウスを免疫化す
る。ｌＸｌ０’の生きている細胞をこれらのマウスに週
２回２か月間腹腔内に注射した。これらのマウスの４匹
の肺臓を最後の細胞の注射後３日に取り出し、そして６
１５ハイブリドーマをハイブリドーマの親系統ｐ３Ｘ６
３Ａｇ８．６４３ （ＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ１５８０）
との融合後産生した。これらのハイブリドーマからの上
澄み液を、免疫蛍光により、細胞系２３．４１１とのそ
れらの反応性についてアッセイした。引き続いて、２３
．４１１について陽性のハイブリドーマをＬ細胞の親と
のそれらの反応性について試験し、そしてＬ細胞に対す
る抗体を産生するハイブリドーマを廃棄した。細胞系２
３゜４１１に対して向けられた上澄み液抗体を産生ずる
ハイブリドーマをスクリーニングし、そしてそれらの反
応性について再び試験した。ＣＴｌｌ０９．９ａＣ３と
表示するハイブリドーマが産生され、これは２３．４１
１と反応するが、Ｌ細胞の親と反応しないことが実証さ
れた。
この明細書および特許請求の範囲は例示を目的とし、そ
して限定を目的とせず、そして種々の変更および変化は
本発明の精神および範囲を逸脱しないで可能であること
が明らかであろう。
して限定を目的とせず、そして種々の変更および変化は
本発明の精神および範囲を逸脱しないで可能であること
が明らかであろう。
本発明の主な特徴および態様は、次の通りである。
ｉ ＣＥＡ族の細胞表面抗原を発現することを特徴とす
るヒト以外の細胞系。
るヒト以外の細胞系。
２、ヒト以外の哺乳動物細胞中へのヒトＤＮＡの遺伝子
トランスフェクションにより調製された一次トランスフ
ェクション体であることを特徴とする、上記第１項記載
の細胞系。
トランスフェクションにより調製された一次トランスフ
ェクション体であることを特徴とする、上記第１項記載
の細胞系。
３、ヒｌ−Ｄ Ｎ ＡはＬｏＶｏ細胞ゲノムＤＮＡであ
り、そしてヒト以外の吐乳動物細胞はマウスＬｔｋ−細
胞である、上記第２項記載の細胞系。
り、そしてヒト以外の吐乳動物細胞はマウスＬｔｋ−細
胞である、上記第２項記載の細胞系。
４、ヒト以外の哺乳動物細胞中へのヒトＤＮＡの遺伝子
トランスフェクションにより調製された二次トランスフ
ェクション体であることを特徴とする、上記第１項記載
の細胞系。
トランスフェクションにより調製された二次トランスフ
ェクション体であることを特徴とする、上記第１項記載
の細胞系。
５、−次トランスフェクション体のＤＮＡはマウスＬｔ
ｋ−細胞中へのＬｏＶｏ細胞ゲノムＤＮＡの遺伝子のト
ランスフェクションにより調製されたトランスフェクシ
ョン体からのものであり、そして二次トランスフェクシ
ョン体のヒト以外の吐乳動物細胞はまたマウスＬｔｋ−
細胞である、上記第４項記載の細胞系。
ｋ−細胞中へのＬｏＶｏ細胞ゲノムＤＮＡの遺伝子のト
ランスフェクションにより調製されたトランスフェクシ
ョン体からのものであり、そして二次トランスフェクシ
ョン体のヒト以外の吐乳動物細胞はまたマウスＬｔｋ−
細胞である、上記第４項記載の細胞系。
６、二次トランスフェクション体から誘導された実質的
に均質な高い発現のクローニングされた細胞系であり、
前記クローニングされた細胞系は二次トランスフェクシ
ョン体より約２０倍以上のヒトＣＥＡ族の抗原を発現す
ることを特徴とする上記第４項記載の細胞系。
に均質な高い発現のクローニングされた細胞系であり、
前記クローニングされた細胞系は二次トランスフェクシ
ョン体より約２０倍以上のヒトＣＥＡ族の抗原を発現す
ることを特徴とする上記第４項記載の細胞系。
７、ＣＥＡ族の抗原を暗号解読するｃ Ｄ Ｎ Ａのｉ
・ランスフェクションにより調製され、前記ｃＤＮＡは
ヒト以外の哺乳動物細胞におけるｃＤＮＡ発現ベクター
中にクローニングされており、好ましくは前記ｃＤＮＡ
はＣＥＡ−（ｂ） 、ＣＥＡ（ｃ） 、ＣＥＡ （ｄ
） 、ＣＥＡ −（ｅ） 、ＣＥＡ−（ｆ）およびＣＥ
Ａ−（ｇ）から成る群より選択される、上記第１項記載
の細胞系。
・ランスフェクションにより調製され、前記ｃＤＮＡは
ヒト以外の哺乳動物細胞におけるｃＤＮＡ発現ベクター
中にクローニングされており、好ましくは前記ｃＤＮＡ
はＣＥＡ−（ｂ） 、ＣＥＡ（ｃ） 、ＣＥＡ （ｄ
） 、ＣＥＡ −（ｅ） 、ＣＥＡ−（ｆ）およびＣＥ
Ａ−（ｇ）から成る群より選択される、上記第１項記載
の細胞系。
８、ＣＲＬ ９７３１．ＣＲＬ ９７３０、ＣＲＬ
９７３３またはＣＲＬ ９７３２と表示される、
上記第７項記載の細胞系。
９７３３またはＣＲＬ ９７３２と表示される、
上記第７項記載の細胞系。
９、前記細胞系はマウス細胞系である、上記第１〜８項
のいずれかに記載の細胞。
のいずれかに記載の細胞。
１０、ＣＥＡ族の抗原に対するモノクローナル抗体であ
って、前記モノクローナル抗体は、工程（Ａ）能力宿主
動物を（１）前記抗原を発現する上記第１〜９項のいず
れかに記載の細胞系からのヒト以外の吐乳動物細胞また
は（１１）前記細胞から精製した前記抗原で免疫化し、
（Ｂ）前記受容体に対する抗原を産生ずる宿主動物から
分離したリンパ球を骨髄腫細胞と融合し、（Ｃ）前記抗
原に対する千ツクローナル抗体を分泌するハイブリドー
マクローンを分離し、そして（Ｄ）分泌されたモノクロ
ーナル抗体を収穫するからなる方法によって調製された
ことを特徴とする、ＣＥＡ族の抗原に対するモノクロー
ナル抗体。
って、前記モノクローナル抗体は、工程（Ａ）能力宿主
動物を（１）前記抗原を発現する上記第１〜９項のいず
れかに記載の細胞系からのヒト以外の吐乳動物細胞また
は（１１）前記細胞から精製した前記抗原で免疫化し、
（Ｂ）前記受容体に対する抗原を産生ずる宿主動物から
分離したリンパ球を骨髄腫細胞と融合し、（Ｃ）前記抗
原に対する千ツクローナル抗体を分泌するハイブリドー
マクローンを分離し、そして（Ｄ）分泌されたモノクロ
ーナル抗体を収穫するからなる方法によって調製された
ことを特徴とする、ＣＥＡ族の抗原に対するモノクロー
ナル抗体。
手続補正書
（方式）
％式％
１、事件の表示
平成１年特許願第１５０６６７号
２、発明の名称
３、補正をする者
事件との関係
Claims (1)
- ＣＥＡ族の細胞表面抗原を発現することを特徴とするヒ
ト以外の細胞系。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US207576 | 1980-11-17 | ||
| US20757688A | 1988-06-16 | 1988-06-16 | |
| US24992288A | 1988-09-27 | 1988-09-27 | |
| US249922 | 1988-09-27 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02182185A true JPH02182185A (ja) | 1990-07-16 |
Family
ID=26902374
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15066789A Pending JPH02182185A (ja) | 1988-06-16 | 1989-06-15 | 癌胚抗原の族の分離された遺伝子を発現するトランスフエクシヨン体の細胞系 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0346702A3 (ja) |
| JP (1) | JPH02182185A (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6159751A (en) * | 1990-10-25 | 2000-12-12 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Development of DNA probes and immunological reagents of human tumor associated antigens |
| AU660001B2 (en) * | 1990-10-25 | 1995-06-08 | Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The | Development of DNA probes and immunological reagents of human tumor associated antigens |
| US5851764A (en) * | 1990-10-25 | 1998-12-22 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Human prostate tumor inducing gene-1 and uses thereof |
| CA2082605C (en) | 1991-12-30 | 2005-02-01 | James J. Elting | Monitoring of nca-bt in blood samples of breast cancer patients |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3787864T2 (de) * | 1986-08-13 | 1994-02-10 | Miles Inc | Karzinoembryonisches Antigen kodierende cDNS. |
-
1989
- 1989-06-02 EP EP19890109980 patent/EP0346702A3/en not_active Withdrawn
- 1989-06-15 JP JP15066789A patent/JPH02182185A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0346702A3 (en) | 1991-08-28 |
| EP0346702A2 (en) | 1989-12-20 |
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