CN114828861A - 表达多特异性免疫细胞接合器的溶瘤病毒 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了表达一种或多种多特异性免疫细胞接合器，诸如BiKE、BiTE和/或MiTE的黏液瘤病毒，以及其在抑制和/或治疗对象的血液学癌症中的用途。本公开还提供了一种具有表达一种或多种多特异性免疫细胞接合器的黏液瘤病毒的白细胞，以及所述白细胞用于抑制和/或治疗对象的血液学癌症的用途。

Description

表达多特异性免疫细胞接合器的溶瘤病毒
交叉引用
本申请要求2019年10月10日提交的美国临时专利申请号62/913,655的权益，所述临时专利申请以引用的方式整体并入本文。
技术领域
本公开涉及黏液瘤病毒及其用于治疗癌症的用途，例如，用表达一种或多种多特异性免疫细胞接合器的黏液瘤病毒治疗血液学癌症。
背景技术
用于治疗各种类型癌症的当前疗法倾向于通过使癌细胞中毒或将其杀伤来起作用。遗憾的是，对癌细胞有毒的治疗通常也倾向于对健康细胞有毒。而且，有效的癌症治疗方法仍然难以实现。当前主流疗法诸如化学疗法和放射疗法可能具有狭窄的治疗窗口(例如，浓度足够高以达到疗效，但又足够低以避免毒性)。这些类型的疗法被认为是由于肿瘤细胞的类型不同而适用性有限并且可以施用这些疗法的窗口有限的钝工具。
发明内容
在一些方面，本文公开了一种黏液瘤病毒(MYXV)，其包含编码多特异性免疫细胞接合器的转基因。
在一些实施方案中，多特异性免疫细胞接合器包括双特异性自然杀伤细胞和嗜中性粒细胞接合器(BiKE)、双特异性T细胞接合器(BiTE)或膜整合T细胞接合器(MiTE)。在一些实施方案中，多特异性免疫细胞接合器与血液学癌细胞上存在的抗原结合。在一些实施方案中，血液学癌细胞是骨髓瘤细胞、白血病细胞或淋巴瘤细胞。在一些实施方案中，BiKE与自然杀伤细胞或嗜中性粒细胞上存在的抗原结合。在一些实施方案中，BiTE与T细胞上存在的抗原结合。在一些实施方案中，MiTE与T细胞上存在的抗原结合。在一些实施方案中，BiKE与CD16或CD138结合。在一些实施方案中，BiKE与CD16和CD138结合。在一些实施方案中，BiTE与CD3或CD138结合。在一些实施方案中，BiTE与CD3和CD138结合。在一些实施方案中，MiTE与CD3或CD138结合。在一些实施方案中，MiTE与CD3和CD138结合。在一些实施方案中，多特异性免疫细胞接合器包含一个或多个源自抗人CD抗体的单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，多特异性免疫细胞接合器包含一个或多个人源化单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，BiKE包含与SEQ ID NO:4-21中的任一个至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，BiTE包含与SEQ ID NO:6、7、10-15或32-39中的任一个至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，MiTE包含与SEQ ID NO:6、7、10-15或32-39中的任一个至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，转基因位于MYXV的基因组的M135基因与M136基因之间。在一些实施方案中，MYXV还包含报告基因。在一些实施方案中，报告基因编码荧光蛋白。在一些实施方案中，报告基因编码发光底物或酶。在一些实施方案中，MYXV还包含MYXV的基因组中的突变。在一些实施方案中，突变存在于选自以下的一个或多个基因中：M001R、M002R、M003.1R、M003.2R、M004.1R、M004R、M005R、M006R、M007R、M008.1R、M008R、M009L、M013、M036L、M063L、M11L、M128L、M131R、M135R、M136R、M141R、M148R、M151R、M152R、M153R、M154L、M156R、M-T2、M-T4、M-T5、M-T7和SOD。在一些实施方案中，突变是缺失。在一些实施方案中，所述缺失使M135R的至少一部分缺失。在一些实施方案中，MYXV存在于包含MYXV和药学上可接受的载体的组合物中。在一些实施方案中，在治疗血液学癌症的方法中将MYXV或组合物施用于有需要的对象。在一些实施方案中，对象是人。在一些实施方案中，MYXV能够感染具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞。在一些实施方案中，MYXV能够感染癌细胞。在一些实施方案中，血液学癌症是骨髓瘤、多发性骨髓瘤、白血病或淋巴瘤。在一些实施方案中，在用于治疗癌症的方法中将MYXV与白细胞一起施用于对象，其中该白细胞包含MYXV或与MYXV缔合。在一些实施方案中，该方法还包括将MYXV离体吸附到白细胞的表面上。在一些实施方案中，将MYXV吸附到白细胞的表面上包括在允许黏液瘤病毒与白细胞的表面结合的条件下将白细胞暴露于黏液瘤病毒。在一些实施方案中，吸附包括将白细胞暴露于MYXV至少五分钟。在一些实施方案中，吸附包括将白细胞暴露于MYXV约一小时。在一些实施方案中，吸附包括在约0.001与1000之间的感染复数(MOI)下将白细胞暴露于MYXV。在一些实施方案中，吸附包括在约0.1与10之间的感染复数(MOI)下将白细胞暴露于MYXV。在一些实施方案中，白细胞从外周血获得。在一些实施方案中，白细胞从骨髓获得。在一些实施方案中，白细胞是外周血单核细胞。在一些实施方案中，白细胞从对象的组织获得。在一些实施方案中，白细胞从相对于对象HLA匹配、HLA不匹配、单倍体相合或其组合的供体的组织获得。在一些实施方案中，白细胞被配制在药物组合物中。在一些实施方案中，白细胞全身施用。在一些实施方案中，白细胞肠胃外施用。在一些实施方案中，白细胞静脉内施用。
一些实施方案涉及一种黏液瘤病毒(MYXV)，其包含编码多特异性免疫细胞接合器的转基因。
一些实施方案涉及一种组合物，其包含本文所述的黏液瘤病毒和药学上可接受的载体。
一些实施方案涉及治疗有需要的对象的血液学癌症的方法，其包括向所述对象施用本文所述的黏液瘤病毒。
一些实施方案涉及治疗有需要的对象的血液学癌症的方法，其包括向所述对象施用白细胞，其中所述白细胞包含本文所述的黏液瘤病毒。
附图说明
本公开的某些实施方案的新颖特征在所附权利要求书中具体阐述。通过参考以下对其中利用到本发明的原理的说明性实施方式加以阐述的详细描述和附图，将会获得对本公开的特征和优点的更好理解，在这些附图中：
图1A-1F示出了MYXV-BiKE的构建。图1A示出了人CD138靶向的BiKE的结构示意图。图1B是MYXV基因组和表达BiKE和eGFP的盒的插入位点的示意图，这两种转基因在痘病毒合成早期/晚期启动子(sE/L)下表达。图1C示出了使用寡核苷酸引物对来自MYXV-BiKE克隆的基因组病毒DNA进行PCR分析，以确认BiKE盒的存在(子图(panel)1-4)和图1D正确插入(基因间区域M135-M136)。泳道1是来自MYXV-Lau的DNA，泳道2-4：MYXV-BiKE克隆，M代表已知大小的DNA梯。图1E示出了感染后24小时来自MYXV-BiKE感染的RK13细胞的细胞裂解物和上清液的蛋白质印迹分析。图1F示出了重组MYXV-BIKE相对于MYXV-GFP的单步生长分析。
图2A-2C示出了MYXV-huBiKE-GFP有效感染并诱导杀伤取自多发性骨髓瘤患者的血液样品中的癌细胞。图2A示出了模拟处理(即，不添加MYXV)的样品的多发性骨髓瘤(MM)细胞(CD138+)的感染(GFP+)、存活力(近红外-)、凋亡(膜联蛋白V+)和细胞杀伤(近红外+)。图2B示出了在三个不同的MOI下CD138+的MYXV-huBiKE-GFP感染。图2C示出了MYXV-huBiKE-GFP诱导的CD138+细胞中的凋亡和细胞死亡。
图3A和3B示出了在用MYXV-huBiKE-GFP处理之后，来自患者#3的原代人样品的未感染的多发性骨髓瘤(MM)细胞(即，GFP-)的杀伤。图3A示出了24小时之后模拟处理(即，不添加MYXV)的样品中未感染的MM细胞(即，CD138+GFP-)的存活力(近红外-)、凋亡(膜联蛋白V+)和细胞杀伤(近红外+)。箭头指示对GFP-细胞的门控。图3B示出了感染后24小时CD138+GFP-的未感染的MM细胞的凋亡和细胞死亡的百分比。
图4A-4D示出了MYXV-huBiKE-GFP有效感染并诱导了对来自患者#4的原代人样品的多发性骨髓瘤(MM)细胞的杀伤。图4A示出了在模拟处理(即不添加MYXV)24小时后MM细胞(CD138+)的存活力(近红外-)、感染(GFP+)、凋亡(膜联蛋白V+)和细胞杀伤(近红外+)。图4B示出了在三种不同MOI下CD138+的MYXV-huBiKE-GFP感染。图4C示出了由MYXV-huBiKE-GFP诱导的CD138+细胞的凋亡和细胞死亡。图4D示出了感染后24小时后的荧光显微照片。
图5A和图5B示出了在用MYXV-huBiKE-GFP处理后，对来自患者#4的原代人样品的未感染多发性骨髓瘤(MM)细胞(即GFP-)的杀伤。图5A示出了在24小时后在模拟处理(即不添加MYXV)的样品中未感染的MM细胞(即CD138+GFP-)的存活力(近红外-)、凋亡(膜联蛋白V+)和细胞杀伤(近红外+)。箭头指示对GFP-(未感染的)的门控。图5B示出了在用病毒处理后24小时，未感染的CD138+GFP-细胞的凋亡和细胞死亡的百分比。
图6展示了BiKE与人MM和NK细胞结合，而对于对照MM细胞或NK细胞(与从模拟感染的细胞或用缺乏BiKE的MYXV感染的细胞收获的上清液一起温育)未检测到结合。
图7展示了BiKE抗体能够诱导NK细胞介导的MM细胞杀伤，并且杀伤取决于来源上清液培养物的MOI。
图8A-D展示了通过荧光显微镜在24和48hpi时评估人血液学癌细胞对MYXV-BiKE感染的敏感性。图8A和图8B分别展示了在感染后24和48小时时THP-1细胞的感染。图8C和图8D分别展示了在感染后24和48小时时U266细胞的感染。
图9展示了通过流式细胞术评估的MYXV-BiKE对THP-1细胞的杀伤。
图10展示了通过流式细胞术评估的MYXV-BiKE对U266细胞的杀伤。
图11展示了通过流式细胞术评估的MYXV-BiKE对原代人多发性骨髓瘤细胞的杀伤。
图12提供了可以用于生成表达多特异性免疫细胞接合器的本公开的MYXV的质粒的图谱。
图13提供了可以用于生成表达多特异性免疫细胞接合器并且包含MYXV基因组中的基因破坏的本公开的MYXV的质粒的图谱。
图14A-14C示出了抗BOR的VK12598细胞系对MYXV易感。图14A示出了MYXV与VK12598细胞系的结合(Venus+)。图14B通过荧光显微镜检查示出了对VK12598细胞系的有效感染。图14C通过流式细胞术示出了对VK12598细胞系的有效感染。
图15A和图15B示出了多药抗性VK12653细胞系的MYXV结合和感染。图15A示出了MYXV与VK12653细胞系的结合(Venus+)。图15B通过荧光显微镜检查和流式细胞术示出了对VK12653细胞系的有效感染。
图16A-16C示出了采用黏液瘤病毒的离体疗法以治疗自体移植接受者中早先存在的多发性骨髓瘤癌症。图16A示出了蛋白质印迹，其提供了用VK12598细胞植入后四周的小鼠的M-峰(spike)(上子图)和四个实验队列(下子图)。
图16B示出了在具有低M-峰(0.1)的代表性模拟治疗的小鼠中MM细胞(CD138+B220-)的百分比以及在具有高M-峰(0.6)的代表性骨髓受体小鼠中MM(CD138+B220-)的百分比。图16C示出了用已经用MYXV-M135KO-GFP离体处理的骨髓治疗的小鼠的M-峰，其中在移植后第8天、29天和37天未检测到M-峰。
图17A示出了在用MYXV-WT-GFP、MYXV-M135KO-GFP和MYXV-BiKE-GFP感染后24和48小时时呈GFP阳性的THP-1细胞的百分比。
图17B示出了在用MYXV-WT-GFP、MYXV-M135KO-GFP和MYXV-BiKE-GFP感染后24和48小时时呈GFP阳性的U266细胞的百分比。
图18A图示了在24和48小时时通过MYXV-WT-GFP和MYXV-BiKE-GFP杀伤的经感染的U266细胞的百分比。
图18B图示了在24和48小时通过MYXV-WT-GFP和MYXV-BiKE-GFP杀伤的未感染的U266细胞的百分比。
图19提供了用MYXV-WT-GFP或MYXV-BiKE-GFP感染的培养物的死亡U266细胞与经感染的U266细胞的比率。
图20图示了在指定MOI下被MYXV-BiKE-GFP、MYXV-M135KO-GFP或野生型MYXV-GFP感染的原代CD138+MM细胞的比例。
图21定量了来自在MOI为10下在模拟感染或用MYXV-BiKE-GFP或野生型MYXV-GFP感染之后来自MM患者的原代人BM样品中CD138+的完整细胞的比例。
图22示出了在BiKE存在下(来自MYXV-BiKE-GFP感染的Vero细胞的上清液)或BiKE不存在下(cRPMI，完全培养基；或来自野生型MYXV-GFP感染的Vero细胞的上清液)与NK细胞或PBMC共温育48小时之后死亡的CD138+MM细胞的百分比。一式三份进行共培养，并且基于对根据近红外活/死染色死亡的U266细胞群体的比例的流式细胞术分析，对于每次感染获得p值。使用针对多重比较的Holm-Sidak的t检验确定显著性(*＝p<0.05；**＝p<0.01；***＝p<0.001)。
图23A提供了在与MYXV-GFP或MYXV-BiKE吸附的NK细胞(顶行)或NK耗尽的PBMC(-NK，底行)共温育之后展示CD138+MM细胞感染的点图。
图23B提供了在与MYXV-GFP或MYXV-BiKE吸附的NK细胞(顶行)或NK耗尽的PBMC(-NK，底行)共温育之后展示CD138+MM细胞杀伤的点图。
具体实施方式
本公开的多个方面涉及表达多特异性免疫细胞接合器的溶瘤病毒重组构建体及其用于治疗癌症诸如血液学癌症的用途。溶瘤病毒可以是黏液瘤病毒(MYXV或vMyx，在本文中可互换使用)，并且构建体中使用的多特异性免疫细胞接合器可以包括BiKE(双特异性自然杀伤细胞和嗜中性粒细胞接合器)转基因、BiTE(双特异性T细胞接合器)和膜整合T细胞接合器(MiTE)。本文所述的MYXV可以用于治疗血液学癌症，包括微小残留病变(minimalresidual disease，MRD)和耐药性MRD。
本文所述的MYXV可以是治疗血液学癌症，诸如复发性多发性骨髓瘤疾病和用于减少、基本上减少或消除难治性和耐药性MRD的更有效疗法。多发性骨髓瘤(MM)是一种血液学恶性肿瘤，其特征是恶性浆细胞的克隆扩增导致最终器官损伤，包括溶骨性病变、贫血、肾衰竭或高钙血症(Hari P.Recent advances in understanding multiplemyeloma.Hematol Oncol Stem Cell Ther.2017；In press)。MM的骨髓(BM)肿瘤微环境在支持和维持恶性MM细胞的分化、转移、增殖、存活和耐药性中起关键作用(Kawano Y,Moschetta M,Manier S,Glavey S,
Figure BDA0003690145670000081
GT,Roccaro AM等人,Targeting the bonemarrow microenvironment in multiple myeloma.Immunol Rev.2015；263(1))。针对符合移植条件的患者的自体干细胞移植联合化学疗法是MM的标准治疗方法(Landgren O,Lu SX和Hultcrantz M.MRD Testing in Multiple Myeloma:The Main Future Driver forModern Tailored Treatment.Semin Hematol.2018；55(1):44-50；Hoyos V和I.B.Theimmunotherapy era of myeloma:monoclonal antibodies,vaccines,and adoptive T-cell therapies.Blood.2016；128(13):1679-87)。然而，这些疗法的主要障碍是由于肿瘤克隆导致的疾病复发，该肿瘤克隆可以充当对治疗有抗性的MM细胞的储库，从而导致微小残留病变(MRD)。
尽管预后得以改善，但是对于大多数患者来说，MM仍然被认为是无法治愈的，并且在那些具有高风险特征的患者中观察到较差的存活率(Bustoros M,Mouhieddine TH,Detappe A和IM.G.Established and Novel Prognostic Biomarkers in MultipleMyeloma.Am Soc Clin Oncol Educ Book.2017；37:548-60)。溶瘤病毒，例如MYXV，是哺乳动物病毒，可以设计和选择该病毒选择性感染和杀伤转化的癌细胞的能力和激活宿主免疫系统的能力。本文所述的MYXV利用多特异性免疫细胞接合器，并且可以与宿主免疫系统组合作用，以靶向癌细胞。因此，本文所述的黏液瘤病毒可以帮助减少或消除难治性和耐药性的微小残留病变，并且可以更有效地用于治疗复发性MM疾病。
定义
除非另有说明，否则根据常规用法使用技术术语。分子生物学中常见术语的定义可以在Benjamin Lewin,Genes V,Oxford University Press出版,1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等(编著),The Encyclopedia of Molecular Biology,BlackwellScience Ltd.出版,1994(ISBN 0-632-02182-9)以及Robert A.Meyers(编著),MolecularBiology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,VCR Publishers,Inc.出版,1995(ISBN 1-56081-569-8)中找到。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。尽管在本公开的实践或测试中可以使用与本文所述的那些类似或等同的方法和材料，但是下文描述了合适的方法和材料。另外，材料、方法和实施例仅仅是说明性的，而不是限制性的。
提供以下术语和方法的解释是为了更好地描述本公开的化合物、组合物和方法，并指导本领域普通技术人员实施本公开内容。还应理解的是，本公开中使用的术语仅用于描述特定实施方案和实施例，而非旨在限制。
如本文所用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该/所述(the)”旨在还包括复数形式。
如本文所用，术语“和/或”是指并涵盖一个或多个相关联的所列项目的任何和所有可能的组合，以及当以替代(“或”)解释时缺少的组合。
如本文所用，“一个或多个”或至少一个可表示1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个，最多为任何数目。
如本文所用，术语“包含(comprise)”或“含有(comprising)”表示“包括”。因此，“包含A或B”表示包括A、B，或A和B。“包含(Comprise)”和该术语的变体，例如本文所用的“包含(comprising)、(comprises)和(comprised)”，表示可以结合使用各种另外的组分或步骤。
“有效量”或“治疗有效量”是指足以产生期望效果的本公开的化合物或组合物的量，该期望效果可以是治疗效果和/或有益效果。在该实例中，有效量可在技术人员的知识和专业范围内随着年龄、对象的一般状况、所治疗病况的严重程度、所施用的特定药剂、所治疗的持续时间、任何同时治疗的性质、所使用的药学上可接受的载体以及类似因素而变化。适当地，可以通过参考相关的文本和文献和/或通过实验来确定在任何单个情况下的有效量或治疗有效量。(例如，参见Remington,The Science and Practice of Pharmacy(最新版))。
如本文所用，术语“对象”和“患者”可互换使用，并且是指人和非人动物。本公开的术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠等)等。对象可以是人。对象可以是人患者。在一些实施方案中，本公开的对象是人对象。
如本文所用，术语“细胞”包括单个细胞以及多个细胞或细胞群。施用药剂或将药剂暴露于细胞可以包括体外、离体和体内施用或暴露。
“需要其的对象”或“有需要的对象”是已知患有或疑似患有癌症诸如血液学癌症的对象。
如本文所用，术语“癌症”是指恶性肿瘤，例如经历了特征性间变而失去分化、生长速率增加、侵入周围组织并能够转移的肿瘤。
残余癌是在对对象进行任何形式的治疗以减少或根除癌症后仍保留在对象中的癌症。转移性癌症是除衍生出转移性癌症的原始(原发性)癌症的起源部位以外的体内一个或多个部位(例如第二部位)的癌症。局部复发是癌症在与原始癌症相同的部位或附近(诸如在相同的组织中)复发。血液学癌症是影响血液、骨髓和/或淋巴系统的癌症。
血液学癌症的非限制性实例包括白血病、淋巴瘤和骨髓瘤，例如：多发性骨髓瘤(MM)；活动性多发性骨髓瘤；郁积型多发性骨髓瘤；浆细胞瘤；骨孤立性浆细胞瘤；髓外浆细胞瘤；轻链骨髓瘤；非分泌型骨髓瘤；免疫球蛋白G(IgG)骨髓瘤；免疫球蛋白A(IgA)骨髓瘤；免疫球蛋白M(IgM)骨髓瘤；免疫球蛋白D(IgD)骨髓瘤；免疫球蛋白E(IgE)骨髓瘤；超二倍体多发性骨髓瘤；非超二倍体多发性骨髓瘤；霍奇金淋巴瘤；非霍奇金淋巴瘤；急性淋巴母细胞性白血病；急性髓样白血病；原发性血小板增多症；真性红细胞增多症；原发性骨髓纤维化症；全身性肥大细胞增多症；慢性髓样白血病；慢性嗜中性粒细胞白血病；慢性嗜酸性粒细胞白血病；难治性贫血伴环形铁粒幼红细胞；难治性血细胞减少伴多系发育异常；难治性贫血伴1型胚细胞过多；难治性贫血伴2型胚细胞过多；骨髓增生异常综合征(MDS)伴分离性(5q)缺失；不可分类的MDS；慢性骨髓单核细胞性白血病(CML)；非典型慢性髓样白血病；青少年慢性骨髓单核细胞性白血病；不可分类的骨髓增生/骨髓增生异常综合征；B淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤；T淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤；弥漫性大B细胞淋巴瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；原发性纵隔B细胞淋巴瘤；伯基特淋巴瘤/白血病；滤泡型淋巴瘤；慢性淋巴细胞白血病(CLL)/小淋巴细胞淋巴瘤；B细胞幼淋巴细胞白血病；淋巴浆细胞性淋巴瘤/华氏巨球蛋白血症；外套细胞淋巴瘤；边缘带淋巴瘤；移植后淋巴组织增殖性疾病；HIV相关淋巴瘤；原发性渗出性淋巴瘤；血管内大B细胞淋巴瘤；原发性皮肤B细胞淋巴瘤；毛细胞白血病；未知意义的单克隆丙种球蛋白病；间变性大细胞淋巴瘤，血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤，肝脾性T细胞淋巴瘤，B细胞淋巴瘤，网状内皮组织增生，网状细胞增生症，粘膜相关淋巴组织淋巴瘤，B细胞慢性淋巴细胞性白血病，华氏巨球蛋白血症，淋巴瘤样肉芽肿病，结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤，浆细胞白血病，急性红细胞增多症和红细胞白血病，急性红细胞性骨髓增生症，急性红白血病，
Figure BDA0003690145670000121
病，急性成巨核细胞白血病，肥大细胞白血病，全骨髓增生，急性全骨髓增生伴骨髓纤维化，淋巴肉瘤细胞性白血病，干细胞白血病，不明细胞类型的慢性白血病，不明细胞类型的亚急性白血病，加速期慢性髓性白血病，急性早幼粒细胞白血病，急性嗜碱性粒细胞白血病，急性嗜酸性粒细胞白血病，急性单核细胞性白血病，急性髓母细胞性白血病伴成熟，急性髓样树突状细胞白血病，成人T细胞白血病/淋巴瘤，侵袭性NK细胞白血病，B细胞慢性淋巴细胞性白血病，B细胞白血病，慢性髓性白血病，慢性特发性骨髓纤维化，Kahler病，骨髓性白血病，孤立性骨髓瘤，血浆细胞白血病，血管中心性免疫增生性损害，淋巴样肉芽肿病，血管免疫母细胞性淋巴结病，T-γ淋巴组织增生性疾病，华氏巨球蛋白血症，α重链病，γ重链病和Franklin氏病。在一些实施方案中，血液癌症是多发性骨髓瘤。
如本文所用，术语“化学治疗剂”是指在以异常细胞生长为特征的疾病的治疗中具有治疗有效性的任何化学药剂。这样的疾病可以包括肿瘤、赘生物和癌症，以及以增生性生长为特征的疾病，诸如牛皮癣。在一些实施方案中，化学治疗剂是一种用于治疗癌症的药剂，诸如抗肿瘤药剂。在一些实施方案中，化学治疗剂是一种放射性化合物。本领域技术人员可容易地确定所使用的化学治疗剂(例如，参见Slapak和Kufe,Harrison's Principlesof Internal Medicine(第14版)中第86章Principles of Cancer Therapy；Perry等人,Abeloff,Clinical Oncology(第二版)中第17章Chemotherapy,2000年ChurchillLivingstone,Inc；Baltzer和Berkery(编著):Oncology Pocket Guide to Chemotherapy,第二版,St.Louis,Mosby-Year Book,1995年；Fischer Knobf和Durivage(编著):TheCancer Chemotherapy Handbook,第4版,St.Louis,Mosby-Year Book,1993年)。联合疗法是施用多于一种药剂来治疗癌症。例如，可以施用表达一种或多种多特异性免疫细胞接合器的黏液瘤病毒，并且可以同时施用或以任何顺序在时间上分开地施用一种或多种化学治疗剂。
如本文所用，“治疗”是指向患有疾病或病况的患者施用药物组合物。如本文所用，术语“抑制或治疗疾病”，诸如癌症，是指延迟或抑制疾病或病况的发展或进展。“治疗”是指在疾病或病理状况开始发展后改善其体征或症状的治疗性干预。关于疾病或病理状况，术语“改善”是指任何可观察到的治疗的有益作用。可以通过例如在易受感染对象中延迟疾病的临床症状发作、降低疾病的一些或全部临床症状的严重程度、减缓疾病的进展(诸如转移)、改善对象整体健康或生活质量或通过本领域公知的对特定疾病特异的其他参数来证明有益效果。“预防性”治疗是向未表现出疾病体征或仅表现出早期体征的对象施用的治疗，以降低发展成病理学例如转移性癌症的风险。
如本文所用，与本文所公开的治疗化合物结合使用的“药学上可接受的载体”可以是常规的。Remington’s Pharmaceutical Sciences,E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton,Pa,第19版(1995)描述了适用于药物递送治疗剂的组合物和制剂。
通常，载体的性质取决于所采用的特定施用方式。例如，肠胃外制剂通常包含可注射的流体，其包括药学上和生理学上可接受的流体如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等作为媒介物。对于固体组合物(例如，粉剂、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规的无毒固体载体可包括例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除生物学中性载体外，待施用的药物组合物还可含有少量无毒辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如，乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。
如本文所用，术语“药物”和“治疗剂”是指当适当地施用于对象或细胞时能够诱导期望的治疗或预防作用的化合物或组合物。
如本文所用，术语“具有复制能力的”是指能够在特定宿主细胞诸如人体血细胞(例如，血液学癌细胞、多发性骨髓瘤细胞或外周血单核细胞)内感染和复制的病毒，诸如黏液瘤病毒。
术语“免疫调节转基因”是指可引入病毒基因组并编码可以影响免疫系统功能(例如，影响炎症、先天性或适应性免疫信号传导、先天性或适应性免疫细胞激活(例如，靶细胞杀伤，细胞因子、趋化因子或其他炎症介质的产生)、先天性或适应性免疫细胞归巢(例如，趋化性、外渗和/或在位点积聚)，先天性或适应性免疫细胞增殖、先天性或适应性免疫细胞分化、抗体产生或其组合)的产物的基因序列。免疫调节转基因的实例包括但不限于BiTE、BiKE和MiTE。
黏液瘤病毒
黏液瘤病毒(MYXV)由于其独特的生物学特性潜在地非常适合作为针对血液学癌症，例如多发性骨髓瘤(MM)的治疗性病毒。MYXV是痘病毒科(poxviridae)家族和兔痘病毒(leporipoxvirus)属的成员(Chan WM,Rahman MM和McFadden G.Oncolytic myxomavirus:the path to clinic.Vaccine.2013；31(39):4252-8,Chan WM和McFaddenG.Oncolytic Poxviruses.Annu Rev Virol.2014；1(1):119-41)。MYXV和vMyx均是指如本文所述的黏液瘤病毒。
MYXV是一种可以靶向多种人和鼠癌症，例如，原发性癌症和建立的细胞系的新型溶瘤病毒(Stanford MM和McFadden G.Myxoma virus and oncolytic virotherapy:a newbiologic weapon in the war against cancer.Expert Opin Biol Ther.2007；7(9):1415-11425；Wang G,Barrett JW,Stanford M,Werden SJ,Johnston JB,Gao X等人,Infection of human cancer cells with myxoma virus requires Akt activation viainteraction with a viral ankyrin-repeat host range factor.Proc Natl Acad SciUSA.2006；103(12):4640-5；Bartee E,Chan WM,Moreb JS,Cogle CR和McFaddenG.Selective purging of human multiple myeloma cells from autologous stem celltransplantation grafts using oncolytic myxoma virus.Biol Blood MarrowTransplant.2012；18(10):1540-51；Chan WM,Rahman MM和McFadden G.Oncolytic myxomavirus:the path to clinic.Vaccine.2013；31(39):4252-8；Kim M,Madlambayan GJ,Rahman MM,Smallwood SE,Meacham AM,Hosaka K等人,Myxoma virus targets primaryhuman leukemic stem and progenitor cells while sparing normal hematopoiticstem and progenitor cells.Leukemia.2009；32:2313-7；Villa NY,Wasserfall CH,Meacham AM,Wise E,Chan W,Wingard JR等人,Myxoma virus suppresses proliferationof activated T lymphocytes yet permits oncolytic virus transfer to cancercells.Blood.2015；125(24):3778-88)。
在自然界中，MYXV是兔特异性的，并且通常不会在人、小鼠或任何其他家畜中引起感染或疾病。然而，由于与致癌作用相关的癌症通路突变的性质，来自小鼠和人类的癌细胞都可能表现出抵抗包括MYXV在内的一些病毒感染的能力受损(例如，受损的先天免疫途径)(Chan WM和McFadden G.Oncolytic Poxviruses.Annu Rev Virol.2014；1(1):119-41；Sypula J,‘Wang F,Ma Y,Bell J和McFadden G.Myxoma virus tropism in humantumors.Gene Ther and Mol Biol.2004；8:103-14)。
在一些实施方案中，本文提供了经修饰的黏液瘤病毒(MYXV)。MYXV可以是具有复制能力的属于痘病毒的兔痘病毒属物种的任何病毒。MYXV可以是MYXV的野生型菌株，也可以是MYXV的基因修饰菌株。在一些情况下，MYXV是Lausanne菌株。在一些情况下，MYXV是在南美森林兔(Sylvilagus brasiliensis)中传播的南美MYXV菌株。在一些情况下，MYXV是在丛毛棉尾兔(Sylvilagus bachmani)中传播的加利福尼亚州MYXV菌株。在一些情况下，MYXV为6918，是减毒的西班牙野生株，其包含在基因M009L、M036L、M135R和M148R中的修饰(基因库登录号EU552530，由基因库在2019年8月27日提供，在此通过引用并入)。在一些情况下，MYXV是6918VP60-T2(基因库登录号EU552531，由基因库在2019年8月27日提供，在此通过引用并入)。在一些情况下，MYXV是SG33，一种包含影响基因M151R、M152R、M153R、M154L、M156R、M008.1R、M008R、M007R、M006R、M005R、M004.1R、M004R、M003.2R、M003.1R、M002R和M001R的基因组缺失的菌株(法国微生物保藏中心(Collection Nationale de Culturesde Microorganismes，CNCM)登录号1-1594)。在一些情况下，MYXV是一种称为标准实验室菌株(SLS)的菌株。
在一些情况下，MYXV基因组包含与以下文献中公开的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，诸如在95％与98％、95％与99％之间，包括90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％核酸序列同一性：Cameron等人,“The complete DNA sequence ofMyxoma Virus,”Virology 264:298-318(1999)，其中所述文献以引用的方式整体并入。在一些情况下，MYXV包含以下文献中公开的序列：Cameron等人,“The complete DNAsequence of Myxoma Virus,”Virology 264:298-318(1999)。
大且遗传稳定的痘病毒基因组能够进行遗传操控，例如，生成具有一个或多个缺失和/或引入一种或多种免疫调节转基因，例如一种或多种多特异性免疫细胞接合器的病毒(Nayerossadat N,Maedeh T和Ali PA.Viral and nonviral delivery systems forgene delivery.Adv Biomed Res.2012；1:27)。
在一些实施方案中，本文提供了黏液瘤病毒(MYXV)和经修饰的MYXV。MYXV可以是具有复制能力的属于痘病毒的兔痘病毒属物种的任何病毒。MYXV可以是MYXV的野生型菌株，也可以是MYXV的基因修饰菌株。
可以使用本文所述和/或技术人员已知并且例如在以下中描述的分子生物学技术修饰黏液瘤病毒基因组以表达一种或多种多特异性免疫细胞接合器(例如，BiKE、BiTE和/或MiTE)：Sambrook等人((2001)Molecular Cloning:a Laboratory Manual,第3版,ColdSpring Harbour Laboratory Press)。技术人员将能够确定黏液瘤病毒基因组的哪些部分可以删除，使得该病毒仍然能够进行有效感染，例如，以提供具有复制能力的病毒。例如，病毒基因组中可被删除的非必需区域可通过比较已公布的病毒基因组序列与其他表征良好的病毒的基因组来推断(参见例如，C.Cameron,S.Hota-Mitchell,L.Chen,J.Barrett,J.-X.Cao,C.Macaulay,D.Willer,D.Evans和G.McFadden,Virology(1999)264:298-318))。
在一些实施方案中，所公开的MYXV重组构建体是溶瘤病毒候选物，其用于治疗复发性/难治性的原发性人类血液学恶性肿瘤，例如多发性骨髓瘤(MM)，并且用于靶向和减少或消除微小残留病变(MRD)。在一些实施方案中，MYXV包含一种或多种转基因。
在一些实施方案中，本公开的MYXV在MYXV基因组中包含一个或多个基因修饰、缺失和/或破坏。例如，本公开的MYXV可以在基因组中的一个或多个基因内或附近包含一个或多个插入、缺失或替代。插入、缺失或修饰可以包括基因敲除(例如，缺失一个或多个核苷酸，从而减少或消除基因编码的产物的功能，或插入一个或多个核苷酸，从而破坏基因编码的产物的表达和/或功能)。在一些实施方案中，插入、缺失或修饰不包括基因敲除(例如，可以在两个基因之间的基因间基因座处插入序列，而不破坏两个基因的表达)。修饰可以是例如替换本文公开的基因的一部分的转基因。
在一些实施方案中，本公开的MYXV在与病毒在宿主动物中引起疾病的能力有关的一个或多个基因内或附近包含一个或多个插入、缺失或置换。在一些实施方案中，本公开的MYXV在与宿主细胞向性相关的一个或多个基因内或附近包含一个或多个插入、缺失或置换。在一些实施方案中，本公开的MYXV在与病毒逃避先天免疫应答的能力有关的一个或多个基因内或附近包含一个或多个插入、缺失或置换。在一些实施方案中，本公开的MYXV在调节感染细胞中的免疫信号传导(例如，细胞因子受体信号传导)的一个或多个基因内或附近包含一个或多个插入、缺失或置换。在一些实施方案中，本公开的MYXV在调节经感染的细胞中的细胞死亡通路的一个或多个基因(例如，编码促进或抑制凋亡的基因，诸如M011L基因登录号GQ398535)内或附近包含一个或多个插入、缺失或置换。在一些实施方案中，本公开的MYXV在调节癌细胞中的病毒复制(例如，增加或降低癌细胞中病毒复制的速率)的一个或多个基因内或附近包含一个或多个插入、缺失或置换。
在一些实施方案中，与病毒在宿主动物中引起疾病的能力有关、与宿主细胞向性有关、与病毒逃避先天免疫应答的能力有关、可以调节感染细胞中的免疫信号传导、可以调节感染细胞中的细胞死亡通路、可以调节癌细胞中病毒复制或其组合的一个或多个基因包括M001R、M002R、M003.1R、M003.2R、M004.1R、M004R、M005R、M006R、M007R、M008.1R、M008R、M009L、M013、M036L、M063L、M011L、M128L、M131R、M135R、M136R、M141R、M148R、M151R、M152R、M153R、M154L、M156R、M-T2、M-T4、M-T5、M-T7和SOD中的任何一个或多个。
在一些实施方案中，本公开的MYXV包含MYXV基因的修饰。在一些情况下，该修饰是损害由MYXV基因编码的蛋白质的功能的缺失。在一些情况下，该修饰是部分缺失。例如，部分缺失可以是MYXV基因的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％缺失。在一些实施方案中，部分缺失可以是MYXV基因的至多10％、至多20％、至多30％、至多40％、至多50％、至多60％、至多70％、至多80％、至多90％或至多95％缺失。在其他情况下，该修饰是MYXV基因的完全缺失(例如，整个编码区的缺失、整个基因的缺失等)。在一些实施方案中，修饰是用本公开的一种或多种转基因(例如，多特异性免疫细胞接合器，诸如BiKE、BiTE和/或MiTE)替换MYXV基因。
在一些实施方案中，本公开的MYXV在与宿主细胞向性(例如，兔细胞向性)相关的一个或多个基因内或附近包含一个或多个插入、缺失或置换。在一些实施方案中，与兔细胞向性相关的一个或多个基因包括M11L、M063、M135R、M136R、M-T2、M-T4、M-T5、M-T7或其组合。在一些情况下，与兔细胞向性相关的一个或多个基因包括M135R、M136R或其组合。
在一些实施方案中，本公开的MYXV包含M135R基因的修饰。在一些实施方案中，MYXV包含M135R基因的部分缺失或完全缺失。M135R基因的缺失或破坏可以例如减弱本公开的MYXV在宿主动物中引起疾病的能力，而不损害MYXV表现出抗癌作用(例如，感染和杀伤癌细胞)的能力。
在一些情况下，修饰是损害由M135R基因编码的蛋白质的功能的缺失。在一些情况下，修饰是M135R基因的部分缺失(例如，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％缺失，至多10％、至多20％、至多30％、至多40％、至多50％、至多60％、至多70％、至多80％、至多90％、至多95％，约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％缺失)。在其他情况下，修饰是M135R基因的完全缺失(例如，M135基因的整个编码区的缺失、整个M135基因的缺失等)。在一些实施方案中，缺失是至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少7个、至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50、至少60、至少70、至少100、至少200或至少300个核酸的缺失。在一些实施方案中，缺失破坏启动子(例如，驱动M135R在野生型MYXV中的表达的启动子)。在一些实施方案中，缺失将终止密码子引入到M135R基因序列中，例如阻止全长M135R转录物和/或蛋白质的表达的提前终止密码子。
在一些实施方案中，MYXV包含损害M135R基因功能的M135R基因修饰(例如，插入破坏M135R基因的表达和/或功能的序列)。在一些实施方案中，插入是至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少7个、至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个、至少700个、至少800个、至少900个、至少1000个、至少1500或至少2000个核酸的插入。在一些实施方案中，插入改变M135R基因序列的阅读框，从而破坏M135R转录物和/或蛋白质的表达。
在一些情况下，突变是置换，例如，减弱由M135R基因编码的蛋白质的活性或表达水平的置换。在一些实施方案中，至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少7个、至少10个、至少20个、至少30个核酸被置换。在一些实施方案中，置换将终止密码子引入到M135R基因序列中，例如阻止全长M135R转录物和/或蛋白质的表达的提前终止密码子。在一些实施方案中，置换破坏启动子(例如，驱动M135R在野生型MYXV中的表达的启动子)。
在一些实施方案中，本文公开的修饰或突变使M135R基因和/或蛋白质的活性水平相对于野生型MYXV或编码功能性野生型M135R的MYXV减弱至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％。
在一些实施方案中，本文公开的修饰或突变使M135R基因和/或蛋白质的表达水平相对于野生型MYXV或编码功能性野生型M135R的MYXV减弱至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％。
在一些实施方案中，本文公开的MYXV具有相对于野生型MYXV或编码功能性野生型M135R的MYXV减弱至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％的M135R蛋白的活性水平。
在一些实施方案中，本文公开的MYXV具有相对于野生型MYXV或编码功能性野生型M135R的MYXV减弱至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％的M135R基因和/或蛋白质的表达水平。
在一些实施方案中，本公开的转基因替换MYXV基因组内的M135R基因，例如，用本公开的一种或多种转基因(例如，多特异性免疫细胞接合器，诸如BiKE、BiTE和/或MiTE)破坏或替换M135R基因。在一些实施方案中，本公开的转基因替换MYXV基因组内的M135R基因的一部分。在一些实施方案中，本公开的转基因插入在MYXV基因组内的M135R基因与M136R基因之间。在一些实施方案中，本公开的转基因插入在M135-136基因座中。对于MYXV，如本文所用的136可以是指MYXV的M136基因座。在一些实施方案中，M136是指MYXV的M136R。
在一些实施方案中，本公开的MYXV包含M153基因的修饰。M153基因产物是一种E3-泛素连接酶，其可以参与多种细胞受体和蛋白质的下调，例如人类细胞中MHC I类和CD4的降解。在一些实施方案中，本公开的MYXV具有减弱的M153蛋白活性和/或表达水平。在一些实施方案中，减弱的M153蛋白活性和/或表达水平可以增强免疫表位的呈递，例如病毒和/或癌症免疫肽的MHC依赖性呈递。通过感染的癌细胞增强免疫表位的呈递可以引发更强的免疫应答，包括抗癌T细胞应答，诸如抗癌CD8+T细胞应答。在一些实施方案中，减弱的M153蛋白活性和/或表达水平增加通过MHC-I进行的从M153KO病毒感染的肿瘤细胞的直接抗原呈递，并且增强由MYXV介导的免疫激活。
在一些实施方案中，MYXV包含M153基因的部分缺失或完全缺失。在一些情况下，修饰是损害由M153基因编码的蛋白质的功能的缺失。在一些情况下，修饰是M153基因的部分缺失(例如，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％缺失，至多10％、至多20％、至多30％、至多40％、至多50％、至多60％、至多70％、至多80％、至多90％、至多95％，约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％缺失)。在一些实施方案中，缺失是至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少7个、至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50、至少60、至少70、至少100、至少200或至少300个核酸的缺失。在一些实施方案中，缺失破坏启动子(例如，驱动M153在野生型MYXV中的表达的启动子)。在一些实施方案中，缺失将终止密码子引入到M153基因序列中，例如阻止全长M153转录物和/或蛋白质的表达的提前终止密码子。
在其他情况下，修饰是M153基因的完全缺失(例如，M153基因的整个编码区的缺失、整个M153基因的缺失等)。在一些实施方案中，MYXV包含损害M153基因的功能的M153基因的修饰(例如，插入破坏M153基因的表达和/或功能的序列)。在一些实施方案中，插入是至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少7个、至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个、至少700个、至少800个、至少900个、至少1000个、至少1500或至少2000个核酸的插入。在一些实施方案中，插入改变M153基因序列的阅读框，从而破坏M153转录物和/或蛋白质的表达。
在一些情况下，突变是置换，例如，减弱由M153基因编码的蛋白质的活性或表达水平的置换。在一些实施方案中，至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少7个、至少10个、至少20个、至少30个核酸被置换。在一些实施方案中，置换将终止密码子引入到M153基因序列中，例如阻止全长M153转录物和/或蛋白质的表达的提前终止密码子。在一些实施方案中，置换破坏启动子(例如，驱动M153在野生型MYXV中的表达的启动子)。
在一些实施方案中，本文公开的修饰或突变使M153基因和/或蛋白质的活性水平相对于野生型MYXV或编码功能性野生型M153的MYXV减弱至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％。
在一些实施方案中，本文公开的修饰或突变使M153基因和/或蛋白质的表达水平相对于野生型MYXV或编码功能性野生型M153的MYXV减弱至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％。
在一些实施方案中，本文公开的MYXV具有相对于野生型MYXV或编码功能性野生型M153的MYXV减弱至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％的M153蛋白的活性水平。
在一些实施方案中，本文公开的MYXV具有相对于野生型MYXV或编码功能性野生型M153的MYXV减弱至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％的M153基因和/或蛋白质的表达水平。
在一些实施方案中，本公开的转基因替换MYXV基因组内的M153基因，例如，用本公开的一种或多种多特异性免疫细胞接合器，诸如BiKE、MiTE和/或BiTE破坏或替换M153基因。在一些实施方案中，本公开的转基因替换MYXV基因组内的M153基因的一部分(例如，以BiKE、MiTE和/或BiTE替换M153基因的一部分)。
转基因
在一些实施方案中，本文提供了包含转基因的黏液瘤病毒(MYXV)重组构建体。在癌症和肿瘤微环境的情况下，一系列免疫调节因子可影响癌细胞与免疫系统之间的相互作用。可以将一种或多种免疫调节转基因引入MYXV基因组中，例如以促进更有效地治疗或减轻癌症的免疫应答。在一些实施方案中，一种或多种MYXV内源性基因被消融，并且一种或多种免疫调节转基因被引入病毒基因组。在一些实施方案中，转基因编码多特异性免疫细胞接合器，诸如BiKE、BiTE和/或MiTE。
多特异性免疫细胞接合器可以具有特异性结合至少一个抗原或表位的能力。在一些实施方案中，本公开的多特异性免疫细胞可以结合一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个靶抗原或表位。在一些实施方案中，本公开的多特异性免疫细胞可以结合至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个或更多个靶抗原或表位。
在一些实施方案中，膜整合免疫细胞接合器，诸如MiTE，与一个靶抗原或表位结合。例如，本公开的膜整合免疫细胞接合器可以在易受本公开的MYXV感染的癌细胞的表面上表达，并且膜整合免疫细胞接合器可以与免疫细胞，诸如T细胞、嗜中性粒细胞或NK细胞结合。
在一些实施方案中，本公开的多特异性免疫细胞接合器可以与由癌细胞(例如，如本文公开的血液学癌症的细胞)表达的抗原或表位结合。在一些实施方案中，本公开的多特异性免疫细胞接合器可以与癌细胞的表面上表达的抗原或表位结合。在一些实施方案中，抗原或表位是野生型抗原或表位(例如，未突变)。在一些实施方案中，抗原或表位是野生型抗原或表位(例如，在癌性突变过程中出现的新表位)。在一些实施方案中，抗原或表位是癌基因。在一些实施方案中，抗原或表位是突变的肿瘤抑制基因。可以被本公开的多特异性免疫细胞接合器结合的由癌细胞表达的抗原或表位的非限制性实例包括CD138、CD19、CD20、CD22、CD70、CD79a、CD79b、EpCAM、Her2、Her2/neu、EGFR、CEA、CD33和MCSP。在一些实施方案中，本公开的多特异性免疫细胞接合器结合CD138。
在一些实施方案中，本公开的多特异性免疫细胞接合器可以与由免疫细胞表达的抗原或表位结合。在一些实施方案中，本公开的多特异性免疫细胞接合器可以与免疫细胞的表面上表达的抗原或表位结合。在一些实施方案中，与由免疫细胞表达的抗原或表位结合的本公开的多特异性免疫细胞接合器可以促进免疫细胞中信号传导通路的激活。在一些实施方案中，与由免疫细胞表达的抗原或表位结合的本公开的多特异性免疫细胞接合器可以促进免疫细胞的激活。在一些实施方案中，与由免疫细胞表达的抗原或表位结合的本公开的多特异性免疫细胞接合器可以促进免疫细胞进行的溶细胞杀伤(例如，癌细胞的杀伤)。在一些实施方案中，与由免疫细胞表达的抗原或表位结合的本公开的多特异性免疫细胞接合器可以促进通过免疫细胞进行的促炎细胞因子的产生。在一些实施方案中，与由免疫细胞表达的抗原或表位结合的本公开的多特异性免疫细胞接合器可以促进通过CD3进行的信号传导。
可以被本公开的多特异性免疫细胞接合器结合的免疫细胞亚群的非限制性实例包括淋巴细胞、T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、α-βT细胞、γ-δT细胞、T调节细胞(Treg)、细胞毒性T淋巴细胞、Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞、Th9细胞、幼稚T细胞、记忆T细胞、效应T细胞、效应记忆T细胞(TEM)、中枢记忆T细胞(TCM)、驻留记忆T细胞(TRM)、滤泡辅助T细胞(TFH)、幼稚T细胞、自然杀伤T细胞(NKT)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、自然杀伤细胞(NK)、先天淋巴细胞(ILC)、ILC1细胞、ILC2细胞、ILC3细胞、淋巴组织诱导(LTi)细胞、B细胞、B1细胞、B1a细胞、B1b细胞、B2细胞、浆细胞、B调节细胞、记忆B细胞、边缘区B细胞、滤泡B细胞、生发中心B细胞、抗原呈递细胞(APC)、单核细胞、巨噬细胞、M1巨噬细胞、M2巨噬细胞、组织相关巨噬细胞、树突细胞、浆细胞样树突细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞及其组合。在一些实施方案中，本公开的多特异性免疫细胞接合器结合T细胞。在一些实施方案中，本公开的多特异性免疫细胞接合器结合NK细胞。在一些实施方案中，本公开的多特异性免疫细胞接合器结合嗜中性粒细胞。
可以被本发明的多特异性免疫细胞接合器结合的由免疫细胞表达的抗原的非限制性实例包括CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD11b、CD13、CD15、CD16、CD25、CD32、CD33、CD27、CD28、CD40、CD56、CD69、CD80、CD83、CD86、CD94、CD122、CD127、CD134、MHC-II、CD195、CD282、CD284、CD314、CD336、CD337、KLRG1和TIGIT。在一些实施方案中，本公开的多特异性免疫细胞接合器结合CD3。在一些实施方案中，本公开的多特异性免疫细胞接合器结合CD16。
在一些实施方案中，本公开的MYXV包含BiKE(双特异性自然杀伤细胞和嗜中性粒细胞接合器)转基因。在一些实施方案中，BiKE转基因包含源自一种或多种抗体的序列(例如，一个或多个重链可变结构域、一个或多个轻链可变结构域、一个或多个互补决定区(CDR)或其组合)。在一些实施方案中，BiKE转基因包含源自一种或多种哺乳动物抗体的序列。在一些实施方案中，BiKE转基因包含源自一种或多种小鼠抗体的序列。在一些实施方案中，BiKE转基因包含源自一种或多种人源化抗体(huBiKE)，诸如全人抗体的序列。在一些实施方案中，BiKE转基因编码分泌的产物。在一些实施方案中，BiKE转基因编码位于细胞表面的产物(例如，包含跨膜结构域)。在一些实施方案中，BiKE基因包含或编码来自如表1中提供的SEQ ID NO：6-21中的任一个或多个的序列。SEQ ID NO：6-7提供了来自对CD138具有特异性的抗体的可变区的序列。SEQ ID NO：8-9提供了来自对CD16具有特异性的抗体的可变区的序列。SEQ ID NO：10-15提供了来自如通过Kabat方法鉴定的对CD138具有特异性的抗体的CDR的序列。SEQ ID NO：16-21提供了来自如通过Kabat方法鉴定的对CD16具有特异性的抗体的CDR的序列。
在一些实施方案中，BiKE包含这样的序列：该序列包含以下氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成：与SEQ ID NO:6-21中的任一个具有至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的MYXV编码BiKE，该BiKE包含SEQ ID NO:6-21中的任一个的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，本公开的MYXV包含BiTE(双特异性T细胞接合器)转基因。在一些实施方案中，BiTE转基因包含源自一种或多种抗体的序列(例如，一个或多个重链可变结构域、一个或多个轻链可变结构域、一个或多个互补决定区(CDR)或其组合)。在一些实施方案中，BiTE转基因包含源自一种或多种哺乳动物抗体的序列。在一些实施方案中，BiTE转基因包含源自一种或多种小鼠抗体的序列。在一些实施方案中，BiTE转基因包含源自一种或多种人源化抗体(huBiTE)，诸如全人抗体的序列。在一些实施方案中，BiTE转基因编码分泌的产物。在一些实施方案中，BiTE转基因编码位于细胞表面的产物(例如，包含跨膜结构域)。
在一些实施方案中，BiTE基因包含来自SEQ ID NO:6、7、10-15、32、33或34-63中的任一个或多个的序列，如表1中提供的。在一些实施方案中，BiTE包含这样的序列：该序列包含以下氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成：与SEQ ID NO:6、7、10-15、32、33或34-63中的任一个具有至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的MYXV编码BiTE，该BiTE包含SEQ ID NO:6、7、10-15、32、33或34-63中的任一个的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。
SEQ ID NO:6-7提供来自对CD138具有特异性的抗体的可变区的序列。SEQ ID NO:10-15提供来自对CD138具有特异性的抗体的CDR的序列，如通过Kabat方法鉴定的。SEQ IDNO:32-33提供来自对CD3具有特异性的抗体的可变区的序列。SEQ ID NO:34-39提供来自对CD3具有特异性的抗体的CDR的序列，如通过Kabat方法鉴定的。SEQ ID NO:40-45提供来自对CD80具有特异性的抗体的可变区的序列。SEQ ID NO:46-63提供来自对CD80具有特异性的抗体的CDR的序列，如通过Kabat方法鉴定的。
在一些实施方案中，本公开的MYXV包含MiTE(膜整合T细胞接合器)转基因。在一些实施方案中，MiTE转基因编码位于细胞表面的产物(例如，包含跨膜结构域)。在一些实施方案中，MiTE转基因包含源自一种或多种抗体的序列(例如，一个或多个重链可变结构域、一个或多个轻链可变结构域、一个或多个互补决定区(CDR)或其组合)。在一些实施方案中，MiTE转基因包含源自一种或多种哺乳动物抗体的序列。在一些实施方案中，MiTE转基因包含源自一种或多种小鼠抗体的序列。在一些实施方案中，MiTE转基因包含源自一种或多种人源化抗体(huMiTE)，诸如全人抗体的序列。
在一些实施方案中，MiTE基因包含来自SEQ ID NO:6、7、10-15、32、33或34-63中的任一个或多个的序列，如表1中提供的。在一些实施方案中，MiTE包含这样的序列：该序列包含以下氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成：与SEQ ID NO:6、7、10-15、32、33或34-63中的任一个具有至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的MYXV编码MiTE，该MiTE包含SEQ ID NO:6、7、10-15、32、33或34-63中的任一个的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。
SEQ ID NO:6-7提供来自对CD138具有特异性的抗体的可变区的序列。SEQ ID NO:10-15提供来自对CD138具有特异性的抗体的CDR的序列，如通过Kabat方法鉴定的。SEQ IDNO:32-33提供来自对CD3具有特异性的抗体的可变区的序列。SEQ ID NO:34-39提供来自对CD3具有特异性的抗体的CDR的序列，如通过Kabat方法鉴定的。SEQ ID NO:40-45提供来自对CD80具有特异性的抗体的可变区的序列。SEQ ID NO:46-63提供来自对CD80具有特异性的抗体的CDR的序列，如通过Kabat方法鉴定的。
Figure BDA0003690145670000281
Figure BDA0003690145670000291
Figure BDA0003690145670000301
Figure BDA0003690145670000311
Figure BDA0003690145670000321
Figure BDA0003690145670000331
抗体或其抗原结合片段的序列，包括重链可变结构域序列、轻链可变结构域序列或CDR序列，可以与本文公开的氨基酸或核酸序列(例如，在表1中)具有至少70％同源性、至少71％同源性、至少72％同源性、至少73％同源性、至少74％同源性、至少75％同源性、至少76％同源性、至少77％同源性、至少78％同源性、至少79％同源性、至少80％同源性、至少81％同源性、至少82％同源性、至少83％同源性、至少84％同源性、至少85％同源性、至少86％同源性、至少87％同源性、至少88％同源性、至少89％同源性、至少90％同源性、至少91％同源性、至少92％同源性、至少93％同源性、至少94％同源性、至少95％同源性、至少96％同源性、至少97％同源性、至少98％同源性、至少99％同源性、至少99.1％同源性、至少99.2％同源性、至少99.3％同源性、至少99.4％同源性、至少99.5％同源性，至少99.6％同源性、至少99.7％同源性、至少99.8％同源性、至少99.9％同源性、至少99.91％同源性、至少99.92％同源性、至少99.93％同源性、至少99.94％同源性、至少99.95％同源性、至少99.96％同源性、至少99.97％同源性、至少99.98％同源性或至少99.99％同源性。
双特异性自然杀伤细胞和嗜中性粒细胞接合器(BiKE，例如CD138-CD16 BiKE)是可以引入到MYXV基因组中的免疫调节转基因的实例。BiKE(CD138-CD16)可以例如通过结合NK细胞和嗜中性粒细胞表面上的CD16以及结合多发性骨髓瘤(MM)细胞表面上的CD138来引导自然杀伤(NK)细胞和嗜中性粒细胞攻击肿瘤靶标。这可以导致NK/嗜中性粒细胞激活，诱导靶标癌细胞凋亡以及响应于恶性靶标而产生细胞因子和趋化因子(Gleason MK,Verneris MR,Todhunter DA,Zhang B,McCullar V,Zhou SX等人,Bispecific andtrispecific killer cell engagers directly activate human NK cells throughCD16 signaling and induce cytotoxicity and cytokine production.Mol CancerTher 2012；11(12):2674-84)。
双特异性T细胞接合器(BiTE，例如CD138-CD3 BiTE)是可以引入到MYXV基因组中的免疫调节转基因的实例。BiTE(CD138-CD3)可以例如通过结合T细胞表面上的CD3以及结合多MM细胞表面上的CD138来引导T细胞攻击肿瘤靶标。这可以导致T细胞激活，诱导靶癌细胞凋亡或裂解以及响应于恶性靶标而产生细胞因子和趋化因子。
膜整合T细胞接合器(MiTE，例如抗CD3 MiTE)是可以引入到MYXV基因组中的免疫调节转基因的实例。MiTE可以例如通过在对本公开的MYXV敏感的癌细胞上选择性表达MiTE以及结合T细胞表面上的CD3来引导T细胞攻击肿瘤靶标。这可以导致T细胞激活，诱导靶癌细胞凋亡或裂解以及响应于恶性靶标而产生细胞因子和趋化因子。MiTE可以包含跨膜序列。MiTE可以包含在本公开公开时已知的跨膜序列。跨膜序列的实例包括但不限于表2中提供的那些。
表2：跨膜序列的实例
Figure BDA0003690145670000341
Figure BDA0003690145670000351
在一些实施方案中，本文公开了重组MYXV构建体，其装备有一种或多种多特异性免疫细胞接合器以靶向血液癌症，包括MM。在本公开中，表达转基因BiKE、BiTE或MiTE的MYXV选择性地感染和杀伤癌细胞，包括例如来自患有对标准疗法有抗性的难治性疾病患者的癌细胞。此外，已经证明这些病毒构建体可以通过促进免疫细胞杀伤癌细胞来损害MM细胞的存活力。值得注意的是，可以观察到两种MM细胞杀伤：对经病毒感染的MM细胞的直接细胞毒性杀伤，加上对未感染的MM细胞的“脱靶”杀伤。不希望受理论的束缚，对未感染的MM细胞的杀伤可以通过患者样品中驻留的MYXV激活的免疫细胞和/或通过引导免疫细胞(例如，对于BiTE和MiTE的T细胞，对于BiKE的嗜中性粒细胞和自然杀伤细胞)攻击癌细胞来介导。
本公开的序列与本文公开的氨基酸或核酸序列可具有至少70％同源性、至少71％同源性、至少72％同源性、至少73％同源性、至少74％同源性、至少75％同源性、至少76％同源性、至少77％同源性、至少78％同源性、至少79％同源性、至少80％同源性、至少81％同源性、至少82％同源性、至少83％同源性、至少84％同源性、至少85％同源性、至少86％同源性、至少87％同源性、至少88％同源性、至少89％同源性、至少90％同源性、至少91％同源性、至少92％同源性、至少93％同源性、至少94％同源性、至少95％同源性、至少96％同源性、至少97％同源性、至少98％同源性、至少99％同源性、至少99.1％同源性、至少99.2％同源性、至少99.3％同源性、至少99.4％同源性、至少99.5％同源性、至少99.6％同源性、至少99.7％同源性、至少99.8％同源性、至少99.9％同源性、至少99.91％同源性、至少99.92同源性、至少99.93％同源性、至少99.94％同源性、至少99.95％同源性、至少99.96％同源性、至少99.97％同源性、至少99.98％同源性或至少99.99％同源性。
本公开的转基因(例如，BiKE，BiTE或MiTE转基因)可以编码抗原结合蛋白，例如来自抗体的一个或多个可变区或互补决定区(CDR)。在一些实施方案中，本公开的转基因(例如，BiKE，BiTE或MiTE)包含源自一种或多种抗体的一个或多个单链可变片段(scFv)。scFv(单链可变片段)是一种融合蛋白，其可以包含通过肽接头连接的抗体的VH和VL结构域。例如，BiKE，BiTE或MiTE转基因可以包含两个scFv以允许两个靶标的结合。在一些实施方案中，BiKE、BiTE或MiTE包含三个、四个、五个或更多个scFv。在一些实施方案中，BiKE、BiTE或MiTE包含一个scFv。
在一些实施方案中，BiKE、BiTE或MiTE包含抗原结合蛋白的一个拷贝。在一些实施方案中，BiKE、BiTE或MiTE包含抗原结合蛋白的两个、三个、四个、五个或更多个拷贝。
可以基于抗体可变区或CDR对抗原结合蛋白进行工程改造。抗体的可变区(V)介导抗原结合并限定特定抗体对抗原的特异性。可变区包含称为构架区的相对不变的序列和在具有不同结合特异性的抗体之间的序列差异相当大的高变区。在高变区内有主要决定抗体的结合特异性的氨基酸残基。包含这些残基的序列称为互补决定区(CDR)。抗体的一个抗原结合位点包含六个CDR，三个在轻链的高变区，三个在重链的高变区。轻链中的CDR标记为L1、L2和L3，而重链中的CDR标记为H1、H2和H3。CDR也可以被分别指定为LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3。每个CDR对抗原结合的贡献在抗体之间不同。CDR的长度可以不同。例如，CDR的长度通常为5至14个残基，但是存在短至0个残基或长至25个残基或更长的CDR。可以使用多种方法来预测或指定CDR序列，例如Kabat方法、Chothia方法、IMGT方法、paratome方法、Martin方法和AHo方法。例如，因为序列插入和缺失的编号不同，所以这些CDR预测方法可以使用不同的编号系统。
抗原结合蛋白可以包含抗体或其抗原结合片段的一部分，例如完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的非限制性实例包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fab缀合物的二聚体和三聚体、Fv、scFv、微抗体、双链抗体、三链抗体和四链抗体，以及线性抗体。Fab和Fab'是抗原结合片段，其可以包含通过二硫键与轻链的VL和CL结构域连接的重链的VH和CH1结构域。F(ab')2可以包含通过二硫键连接的两个Fab或Fab'。Fv可以包含通过非共价相互作用保持在一起的VH和VL结构域。scFv(单链可变片段)是一种融合蛋白，其可以包含通过肽接头连接的VH和VL结构域。对VH和VL结构域的取向以及接头长度的操控可用于创建不同形式的分子，这些分子可以是单体、二聚体(双链抗体)、三聚体(三链抗体)或四聚体(四链抗体)。抗原结合蛋白可以包含非基于抗体的蛋白或其抗原结合片段，例如DARPin。
在一些实施方案中，本公开的转基因可以编码接头序列(例如，由转基因编码的蛋白质的不同结构域之间的接头序列)。在一些实施方案中，接头用于连接抗体可变区以形成scFv。在一些实施方案中，接头用于连接两个scFv以形成BiKE，BiTE或MiTE。接头序列的长度可以是例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸残基。在一些实施方案中，接头的长度是至少1、至少3、至少5、至少7、至少9、至少11、或至少15个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度是至多5、至多7、至多9个、至多11、至多15、至多20、至多25或至多50个氨基酸。
柔性接头可具有包含几段甘氨酸和丝氨酸残基的序列。甘氨酸和丝氨酸残基的小尺寸提供了柔性，并使得连接的功能结构域具有移动性。丝氨酸或苏氨酸的掺入可通过与水分子形成氢键来维持接头在水溶液中的稳定性，从而减少接头与蛋白质部分之间的不利的相互作用。柔性接头还可以包含额外的氨基酸(例如苏氨酸和丙氨酸)以保持柔性，以及极性氨基酸(例如赖氨酸和谷氨酰胺)以提高溶解度。刚性接头可以具有例如α螺旋结构。α-螺旋刚性接头可以充当蛋白质结构域之间的间隔区。接头可以包含表3中的任何序列或其重复序列(例如，SEQ ID NO:22-31中的任一个的2、3、4、5、6、7、8、9或10个重复序列)。SEQID NO:22-27提供柔性接头。SEQ ID NO:28-31提供刚性接头。
Figure BDA0003690145670000381
在一些实施方案中，本公开的MYXV编码一个多特异性免疫细胞接合器。在一些实施方案中，本公开的MYXV编码两个多特异性免疫细胞接合器。在一些实施方案中，本公开的MYXV编码三个多特异性免疫细胞接合器。在一些实施方案中，本公开的MYXV编码四个多特异性免疫细胞接合器。在一些实施方案中，本公开的MYXV编码五个多特异性免疫细胞接合器。
在一些实施方案中，本公开的MYXV可以包含一种或多种额外的转基因(例如，一种或多种不是多特异性免疫细胞接合器的转基因)。
在一些实施方案中，本公开的MYXV可包含一种或多种报告转基因(例如，除了BiKE，BiTE和BiTE中的一种或多种之外的一种或多种报告转基因)。报告转基因(或报告基因)可用于在体外、离体或在体内监测或定量MYXV。在一些实施方案中，报告转基因可以用于鉴定被本公开的MYXV感染的细胞。例如，本公开的MYXV可以表达荧光转基因，并且可以通过荧光(例如，荧光显微镜检查或流式细胞术)鉴定经感染的细胞。在一些实施方案中，报告转基因可以用于定量被本公开的MYXV感染的细胞。例如，本公开的MYXV可以表达荧光转基因，并且可以通过荧光定量经感染的细胞(例如，通过荧光显微镜检查或流式细胞术定量感染细胞的数量或比例)。在一些实施方案中，报告转基因可以用于定量被本公开的MYXV感染的细胞中的病毒复制或病毒载量。例如，本公开的MYXV可以表达荧光转基因，并且可以通过荧光定量经感染的细胞(例如，通过荧光显微镜检查或流式细胞术定量细胞的平均荧光强度)。在一些实施方案中，本公开的MYXV可以表达报告基因，该报告基因可用于定量体内病毒载量或病毒复制(例如，使用体内成像系统(IVIS)成像)。
本公开的报告转基因可以被组成型表达(例如，在组成型启动子的控制下)。本公开的报告转基因可以被有条件地表达(例如，在条件启动子(例如，仅在复制周期的某些阶段有活性或活性更高的启动子)的控制下表达)。
报告转基因的非限制性实例包括荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白(GFP)、TdTomato、蓝绿色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、红色荧光蛋白(RFP)、Verde荧光蛋白(VFP)、点燃荧光蛋白(KFP)、mCherry、mTangerine、mRaspberry、mPlum、DsRed等)以及参与发光的酶和底物(例如萤光素和/或萤光素酶)。
在一些实施方案中，本公开的MYXV不包含或编码报告转基因(例如，不编码任何荧光蛋白或发光蛋白)。
除了表达一种或多种特异性免疫细胞接合器之外，本公开的MYXV可以被修饰以携带一种或多种可以增强MYXV治疗的抗癌作用的其他基因。此类基因可以是涉及触发凋亡的基因，或者涉及使被感染细胞靶向免疫破坏的基因，例如恢复细胞对干扰素的反应性或导致刺激抗体反应的细胞表面标志物(例如细菌细胞表面抗原)的表达的基因。可以修饰本公开的MYXV以表达一种或多种涉及停止赘生性或癌细胞的增殖和生长的基因，从而防止或减少癌细胞的分裂。在一些实施方案中，本公开的MYXV可以被修饰为包含治疗性基因，例如参与化学治疗剂合成的基因。在一些实施方案中，本公开的MYXV可包含增加特定物种的细胞中的病毒复制(例如，为了加强杀伤和抑制人类癌细胞而在人类癌细胞中复制增加)的转基因。
治疗方法
在一些实施方案中，本文提供了利用本公开的黏液瘤病毒(MYXV)治疗对象的血液学癌症的方法。血液学癌症可以是包括微小残留病变(MRD)和/或耐药MRD的血液学癌症。
如以下实施例中所公开的，体外研究证明了本公开的MYXV构建体从标准疗法失败的患者中显著消除难治性原发性人类多发性骨髓瘤(MM)细胞的能力。用MYXV进行的研究表明，它可以是一种高度特异性的抗癌剂，对许多人类和鼠类癌症具有向性。
本公开的治疗(例如，利用MYXV-BiKE、MYXV-BiTE或MYXV-MiTE的治疗)可以包括许多新颖和有利的方面。例如，这些病毒构建体选择性地靶向并直接消除已被每种病毒直接感染的耐药性原代人MM细胞(例如，表达病毒报告基因(诸如GFP+或TdTomato+)的CD138+细胞)。在一些实施方案中，包含转基因的本公开的MYXV不仅可以通过直接杀伤病毒感染的细胞来消除污染的血液学癌细胞，而且还可以通过增强对未感染的癌细胞的“脱靶”杀伤(例如，通过BiTE、MiTE或BiKE而引导接合癌细胞的免疫细胞)来消除疾病。在一些实施方案中，与其他病毒(例如，非武装病毒或缺乏多特异性免疫细胞接合器转基因的病毒)相比，包含转基因的本公开的MYXV可以引发对未感染的癌细胞的杀伤增加。在一些实施方案中，本公开的MYXV可以表现出增强的对未感染的MM细胞(例如，对病毒报告基因(诸如GFP-或TdTomato-)呈阴性的CD138+细胞)的“脱靶”杀伤。不希望受任何特定理论的束缚，病毒增强的对未感染细胞的杀伤可以通过被多特异性免疫细胞接合器引导以接合癌细胞的免疫细胞介导。
在一些实施方案中，表达本公开的多特异性免疫细胞接合器(例如，BiKE、MiTE或BiTE)的本公开的MYXV可以增加对经感染的癌细胞的杀伤(例如，“中靶”杀伤)。例如，相对于不表达多特异性免疫细胞接合器的MYXV或相对于未感染的癌细胞，可以例如通过表达多特异性免疫细胞接合器的经工程改造的MYXV来增加对经感染的癌细胞的杀伤。本公开的MYXV可以使对经感染的癌细胞的杀伤增加例如至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少75％、至少2倍、至少3倍、至少5倍或至少10倍，例如，如通过活/死染色测定确定的。MYXV可以相对于非癌细胞优先感染和优先杀伤癌细胞。
在一些实施方案中，表达本公开的多特异性免疫细胞接合器(例如，BiKE、MiTE或BiTE)的本公开的MYXV可以增加对未感染的癌细胞的杀伤(例如，“脱靶”杀伤)。例如，相对于不表达多特异性免疫细胞接合器的MYXV或相对于未感染的癌细胞，可以例如通过表达多特异性免疫细胞接合器的MYXV来增加对未感染的癌细胞的杀伤。本公开的MYXV可以使对未感染的癌细胞的杀伤增加例如至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少75％、至少2倍、至少3倍、至少5倍或至少10倍，例如，如通过活/死染色测定确定的。例如，对未感染的癌细胞的增加的杀伤可以例如通过针对癌细胞的免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞、嗜中性粒细胞或本文公开的其他免疫细胞)来介导。
使用表达多特异性免疫细胞接合器(例如，BiKE、BiTE或MiTE)的MYXV来治疗血液学恶性肿瘤(例如，血液学恶性肿瘤的难治性和/或微小残留病变(MRD))与包括化学疗法和干细胞移植在内的当前疗法以及与其他候选溶瘤病毒相比具有多种优势。MYXV具有有限的向性，其例如可以使病毒感染人类癌细胞，但不允许病毒感染非癌性人类细胞。与大多数由人类病原体改造而来的病毒不同，MYXV不会引起人类疾病，使得即使对于免疫系统受损的患者也是安全的。人群中缺乏预先存在的抗MYXV适应性免疫可以是有利的，例如，使得病毒感染和杀伤癌细胞而不会像从人类病原体改造的病毒一样被迅速清除。
在本文公开的离体治疗方法中，MYXV与细胞(例如，骨髓(BM)细胞和/或外周血单核细胞(PBMC))的温育可以是快速的，例如，仅需要1小时的病毒离体温育，然后即可将细胞重新输注回癌症患者。
因此，本公开的多个方面提供了一种用于抑制和/或治疗有需要的对象的血液学癌症的方法。在某些实施方案中，方法包括向对象诸如人对象施用本公开的表达一种或多种多特异性免疫细胞接合器诸如BiKE、BiTE或MiTE的MYXV，从而治疗和/或抑制有需要的对象的血液学癌症。对象可以是哺乳动物。对象可以是人。
在一些实施方案中，MYXV包括MYXV-BiTE。在一些实施方案中，MYXV包括MYXV-MiTE。在一些实施方案中，MYXV包括MYXV-BiKE。在一些实施方案中，MYXV包括BiTE和MiTE。在一些实施方案中，MYXV包括BiTE和BiKE。在一些实施方案中，MYXV包括MiTE和BiKE。在一些实施方案中，MYXV包括MiTE、BiTE和BiKE。MiTE、BiTE或BiKE可以包含来自人、小鼠、哺乳动物或其组合的序列，并且可以包含本文公开的任何序列。
在一些实施方案中，本公开的MYXV包含报告转基因(例如，荧光蛋白或发光底物或酶)。在一些实施方案中，本公开的MYXV包含BiKE、BiTE和MiTE中的一种或多种，并且还包含报告转基因。在一些实施方案中，本公开的MYXV包含BiKE、BiTE和MiTE中的一种或多种，并且不包含报告转基因。
在一些实施方案中，本公开的MYXV包含病毒基因组中一个或多个基因的修饰、插入、缺失或破坏。例如，本公开的MYXV可以包含以下中的任一个或多个中或其附近的修饰、插入、缺失或破坏：M001R、M002R、M003.1R、M003.2R、M004.1R、M004R、M005R、M006R、M007R、M008.1R、M008R、M009L、M013、M036L、M063L、M11L、M128L、M131R、M135R、M136R、M141R、M148R、M151R、M152R、M153R、M154L、M156R、M-T2、M-T4、M-T5、M-T7和SOD基因。在一些实施方案中，本公开的MYXV中病毒基因的缺失或破坏可以降低病毒在宿主动物中引起疾病的能力、调节宿主细胞向性、减少非癌细胞中的先天免疫逃避、调节感染细胞中的免疫信号传导、调节感染细胞中的细胞死亡通路、增加癌细胞中的病毒复制或其组合。在一些实施方案中，本公开的MYXV包含M153基因中的修饰、插入、缺失或破坏。
在一些实施方案中，本公开的MYXV包含SOD基因中的修饰、插入、缺失或破坏。在一些实施方案中，本公开的MYXV包含SOD基因中的缺失或破坏。
在一些实施方案中，本公开的MYXV包含与宿主细胞向性(例如，兔细胞向性)相关的一个或多个基因内或附近的一个或多个插入、缺失或置换。在一些实施方案中，与兔细胞向性相关的一个或多个基因包括M011L、M063、M135R、M136R、M-T2、M-T4、M-T5、M-T7或其组合。在一些情况下，与兔细胞向性相关的一个或多个基因包括M135R、M136R或其组合。
在一些实施方案中，本公开的MYXV包含在M135R基因中的修饰、插入、缺失或破坏。在一些实施方案中，本公开的MYXV包含在M135R基因中的缺失或破坏。M135R基因的缺失或破坏可以例如减弱本公开的MYXV在宿主动物中引起疾病的能力，而不损害MYXV表现出抗癌作用(例如，感染和杀伤癌细胞、引发抗肿瘤免疫应答或其组合)的能力。
MYXV可以感染具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞(例如，人类细胞)。如本文所用，具有“先天性抗病毒应答缺陷”可以指当暴露于病毒或被病毒侵袭时不能诱导一种或多种抗病毒防御机制的细胞。例如，先天性抗病毒应答缺陷可包括不能抑制病毒复制、不能产生抗病毒细胞因子(例如干扰素)、不能应答抗病毒细胞因子(例如诱导干扰素应答通路)、不能诱导凋亡、不能通过先天免疫受体(例如模式识别受体)触发识别，或其组合。
先天性抗病毒应答缺陷可能是由多种因素引起的，例如，恶性转化、突变、感染、基因缺陷或环境应激。
在一些实施方案中，不将本公开的MYXV施用给具有由基因缺陷、环境应激或感染(例如，先前存在的不同病原体感染)引起的先天性抗病毒应答缺陷的对象。
在一些实施方案中，将本公开的MYXV施用给具有由恶性转化(例如，癌症)引起的先天性抗病毒应答缺陷的对象。具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞可以是癌细胞，例如，与正常细胞(例如，非癌细胞)相比，在暴露于病毒或被病毒感染后具有降低的抗病毒应答或具有先天性抗病毒应答缺陷的癌细胞。这可以包括例如对干扰素(例如，I型干扰素)无应答的癌细胞，和/或具有减少的或有缺陷的凋亡应答或诱导凋亡通路的癌细胞。在该方法的一些实施方案中，本公开的MYXV能够感染具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞。在一些实施方案中，该细胞是哺乳动物癌细胞。在一些实施方案中，该细胞是人类癌细胞，例如人类血液学癌细胞。
在一些实施方案中，本公开的MYXV用于治疗癌症。本文提供的用于多发性骨髓瘤的实例可扩展地适用于其他血液学癌症。可以根据所公开的方法治疗的癌症类型包括但不限于血液学癌症，例如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤，例如：多发性骨髓瘤(MM)；活动性多发性骨髓瘤；郁积型多发性骨髓瘤；浆细胞瘤；骨孤立性浆细胞瘤；髓外浆细胞瘤；轻链骨髓瘤；非分泌型骨髓瘤；免疫球蛋白G(IgG)骨髓瘤；免疫球蛋白A(IgA)骨髓瘤；免疫球蛋白M(IgM)骨髓瘤；免疫球蛋白D(IgD)骨髓瘤；免疫球蛋白E(IgE)骨髓瘤；超二倍体多发性骨髓瘤；非超二倍体多发性骨髓瘤；霍奇金淋巴瘤；非霍奇金淋巴瘤；急性淋巴母细胞性白血病；急性髓样白血病；原发性血小板增多症；真性红细胞增多症；原发性骨髓纤维化症；全身性肥大细胞增多症；慢性髓样白血病；慢性嗜中性粒细胞白血病；慢性嗜酸性粒细胞白血病；难治性贫血伴环形铁粒幼红细胞；难治性血细胞减少伴多系发育异常；难治性贫血伴1型胚细胞过多；难治性贫血伴2型胚细胞过多；骨髓增生异常综合征(MDS)伴分离性(5q)缺失；不可分类的MDS；慢性骨髓单核细胞性白血病(CML)；非典型慢性髓样白血病；青少年慢性骨髓单核细胞性白血病；不可分类的骨髓增生/骨髓增生异常综合征；B淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤；T淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤；弥漫性大B细胞淋巴瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；原发性纵隔B细胞淋巴瘤；伯基特淋巴瘤/白血病；滤泡型淋巴瘤；慢性淋巴细胞白血病(CLL)/小淋巴细胞淋巴瘤；B细胞幼淋巴细胞白血病；淋巴浆细胞性淋巴瘤/华氏巨球蛋白血症；外套细胞淋巴瘤；边缘带淋巴瘤；移植后淋巴组织增殖性疾病；HIV相关淋巴瘤；原发性渗出性淋巴瘤；血管内大B细胞淋巴瘤；原发性皮肤B细胞淋巴瘤；毛细胞白血病；和未知意义的单克隆丙种球蛋白病；间变性大细胞淋巴瘤，血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤，肝脾性T细胞淋巴瘤，B细胞淋巴瘤，网状内皮组织增生，网状细胞增生症，粘膜相关淋巴组织淋巴瘤，B细胞慢性淋巴细胞性白血病，华氏巨球蛋白血症，淋巴瘤样肉芽肿病，结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤，浆细胞白血病，急性红细胞增多症和红细胞白血病，急性红细胞性骨髓增生症，急性红白血病，
Figure BDA0003690145670000451
病，急性成巨核细胞白血病，肥大细胞白血病，全骨髓增生，急性全骨髓增生伴骨髓纤维化，淋巴肉瘤细胞性白血病，干细胞白血病，不明细胞类型的慢性白血病，不明细胞类型的亚急性白血病，加速期慢性髓性白血病，急性早幼粒细胞白血病，急性嗜碱性粒细胞白血病，急性嗜酸性粒细胞白血病，急性单核细胞性白血病，急性髓母细胞性白血病伴成熟，急性髓样树突状细胞白血病，成人T细胞白血病/淋巴瘤，侵袭性NK细胞白血病，B细胞慢性淋巴细胞性白血病，B细胞白血病，慢性髓性白血病，慢性特发性骨髓纤维化，Kahler病，骨髓性白血病，孤立性骨髓瘤，血浆细胞白血病，血管中心性免疫增生性损害，淋巴样肉芽肿病，血管免疫母细胞性淋巴结病，T-γ淋巴组织增生性疾病，华氏巨球蛋白血症，α重链病，γ重链病和Franklin氏病。在一些实施方案中，血液学癌症是多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，癌症是血液学癌症。在某些实施方案中，癌症包括多发性骨髓瘤。
在一些实施方案中，本文提供了治疗血液学癌症(例如，抑制、缓解、稳定、减轻血液学癌症或延迟血液学癌症的进展)的方法。在一些实施方案中，该方法包括将本公开的MYXV施用于有需要的对象以治疗血液学癌症。在一些实施方案中，该方法还包括选择患有或疑似患有血液学癌症的对象，例如人类对象。
可以以有效治疗血液学癌症的量施用本公开的MYXV。该量可足以减少对象中癌细胞的数量(例如对象血液中癌细胞的浓度)。
施用于对象的有效量可以根据许多因素而变化，诸如MYXV的药效学特性、施用方式、对象的年龄、健康和体重、疾病状态的性质和程度、治疗频率和并行治疗(如果有的化)的类型以及病毒的毒力和效价。
MYXV最初可以以合适的量施用，该量可以视需要根据对象的临床反应进行调整。病毒的有效量可凭经验确定，取决于可以安全施用的MYXV的最大量，以及产生期望结果的病毒的最小量。
为了在全身施用病毒时产生与通过在疾病部位注射病毒所获得的相同的临床效果，可能需要施用明显更高量的病毒。但是，适当的剂量水平应该是可以达到预期结果的最小剂量。
待施用的病毒的浓度将根据待施用的MYXV的特定菌株的毒力和所靶向的细胞的性质而变化。在一个实施方案中，将小于约3x10^10转化灶形成单位(“ffu”)或蚀斑形成单位(“pfu”)(也称为“感染单位”)的剂量施用于人类对象，在各种实施方案中，可以以单一剂量施用约10^2至约10^9pfu、约10^2至约10^7pfu、约10^3至约10^6pfu或约10^4至约10^5pfu。
在一些实施方案中，向对象施用一定转化灶形成单位(FFU)或蚀斑形成单位(PFU)剂量的本公开的MYXV。
在一些实施方案中，向对象施用的MYXV的剂量为至少1×10^2、2×10^2、3×10^2、4×10^2、5×10^2、6×10^2、7×10^2、8×10^2、9×10^2、1×10^3、2×10^3、3×10^3、4×10^3、5×10^3、6×10^3、7×10^3、8×10^3、9×10^3、1×10^4、2×10^4、3×10^4、4×10^4、5×10^4、6×10^4、7×10^4、8×10^4、9×10^4、1×10^5、2×10^5、3×10^5、4×10^5、5×10^5、6×10^5、7×10^5、8×10^5、9×10^5、1×10^6、2×10^6、3×10^6、4×10^6、5×10^6、6×10^6、7×10^6、8×10^6、9×10^6、1×10^7、2×10^7、3×10^7、4×10^7、5×10^7、6×10^7、7×10^7、8×10^7、9×10^7、1×10^8、2×10^8、3×10^8、4×10^8、5×10^8、6×10^8、7×10^8、8×10^8、9×10^8、1×10^9、2×10^9、3×10^9、4×10^9、5×10^9、6×10^9、7×10^9、8×10^9、9×10^9、1×10^10、2×10^10、3×10^10、4×10^10、5×10^10、6×10^10、7×10^10、8×10^10、9×10^10、1×10^11、2×10^11、3×10^11、4×10^11、5×10^11、6×10^11、7×10^11、8×10^11、9×10^11、1×10^12、2×10^12、3×10^12、4×10^12、5×10^12、6×10^12、7×10^12、8×10^12、9×10^12、1×10^13、2×10^13、3×10^13、4×10^13、5×10^13、6×10^13、7×10^13、8×10^13、9×10^13、1×10^14、2×10^14、3×10^14、4×10^14、5×10^14、6×10^14、7×10^14、8×10^14、9×10^14、1×10^15、2×10^15、3×10^15、4×10^15、5×10^15、6×10^15、7×10^15、8×10^15、9×10^15、1×10^16、2×10^16、3×10^16、4×10^16、5×10^16、6×10^16、7×10^16、8×10^16、9×10^16、1×10^17、2×10^17、3×10^17、4×10^17、5×10^17、6×10^17、7×10^17、8×10^17、9×10^17、1×10^18、2×10^18、3×10^18、4×10^18、5×10^18、6×10^18、7×10^18、8×10^18、9×10^18、1×10^19、2×10^19、3×10^19、4×10^19、5×10^19、6×10^19、7×10^19、8×10^19、9×10^19、1×10^20、2×10^20、3×10^20、4×10^20、5×10^20、6×10^20、7×10^20、8×10^20或9×10^20FFU或PFU的本公开的MYXV。
在一些实施方案中，向对象施用的MYXV的剂量至多为1×10^2、2×10^2、3×10^2、4×10^2、5×10^2、6×10^2、7×10^2、8×10^2、9×10^2、1×10^3、2×10^3、3×10^3、4×10^3、5×10^3、6×10^3、7×10^3、8×10^3、9×10^3、1×10^4、2×10^4、3×10^4、4×10^4、5×10^4、6×10^4、7×10^4、8×10^4、9×10^4、1×10^5、2×10^5、3×10^5、4×10^5、5×10^5、6×10^5、7×10^5、8×10^5、9×10^5、1×10^6、2×10^6、3×10^6、4×10^6、5×10^6、6×10^6、7×10^6、8×10^6、9×10^6、1×10^7、2×10^7、3×10^7、4×10^7、5×10^7、6×10^7、7×10^7、8×10^7、9×10^7、1×10^8、2×10^8、3×10^8、4×10^8、5×10^8、6×10^8、7×10^8、8×10^8、9×10^8、1×10^9、2×10^9、3×10^9、4×10^9、5×10^9、6×10^9、7×10^9、8×10^9、9×10^9、1×10^10、2×10^10、3×10^10、4×10^10、5×10^10、6×10^10、7×10^10、8×10^10、9×10^10、1×10^11、2×10^11、3×10^11、4×10^11、5×10^11、6×10^11、7×10^11、8×10^11、9×10^11、1×10^12、2×10^12、3×10^12、4×10^12、5×10^12、6×10^12、7×10^12、8×10^12、9×10^12、1×10^13、2×10^13、3×10^13、4×10^13、5×10^13、6×10^13、7×10^13、8×10^13、9×10^13、1×10^14、2×10^14、3×10^14、4×10^14、5×10^14、6×10^14、7×10^14、8×10^14、9×10^14、1×10^15、2×10^15、3×10^15、4×10^15、5×10^15、6×10^15、7×10^15、8×10^15、9×10^15、1×10^16、2×10^16、3×10^16、4×10^16、5×10^16、6×10^16、7×10^16、8×10^16、9×10^16、1×10^17、2×10^17、3×10^17、4×10^17、5×10^17、6×10^17、7×10^17、8×10^17、9×10^17、1×10^18、2×10^18、3×10^18、4×10^18、5×10^18、6×10^18、7×10^18、8×10^18、9×10^18、1×10^19、2×10^19、3×10^19、4×10^19、5×10^19、6×10^19、7×10^19、8×10^19、9×10^19、1×10^20、2×10^20、3×10^20、4×10^20、5×10^20、6×10^20、7×10^20、8×10^20或9×10^20FFU或PFU的本公开的MYXV。
在一些实施方案中，向对象施用每千克体重一定转化灶形成单位(FFU)或蚀斑形成单位(PFU)剂量的本公开的MYXV。
在一些实施方案中，向对象施用的MYXV的剂量为每千克对象体重至少1×10^2、2×10^2、3×10^2、4×10^2、5×10^2、6×10^2、7×10^2、8×10^2、9×10^2、1×10^3、2×10^3、3×10^3、4×10^3、5×10^3、6×10^3、7×10^3、8×10^3、9×10^3、1×10^4、2×10^4、3×10^4、4×10^4、5×10^4、6×10^4、7×10^4、8×10^4、9×10^4、1×10^5、2×10^5、3×10^5、4×10^5、5×10^5、6×10^5、7×10^5、8×10^5、9×10^5、1×10^6、2×10^6、3×10^6、4×10^6、5×10^6、6×10^6、7×10^6、8×10^6、9×10^6、1×10^7、2×10^7、3×10^7、4×10^7、5×10^7、6×10^7、7×10^7、8×10^7、9×10^7、1×10^8、2×10^8、3×10^8、4×10^8、5×10^8、6×10^8、7×10^8、8×10^8、9×10^8、1×10^9、2×10^9、3×10^9、4×10^9、5×10^9、6×10^9、7×10^9、8×10^9、9×10^9、1×10^10、2×10^10、3×10^10、4×10^10、5×10^10、6×10^10、7×10^10、8×10^10、9×10^10、1×10^11、2×10^11、3×10^11、4×10^11、5×10^11、6×10^11、7×10^11、8×10^11、9×10^11、1×10^12、2×10^12、3×10^12、4×10^12、5×10^12、6×10^12、7×10^12、8×10^12、9×10^12、1×10^13、2×10^13、3×10^13、4×10^13、5×10^13、6×10^13、7×10^13、8×10^13、9×10^13、1×10^14、2×10^14、3×10^14、4×10^14、5×10^14、6×10^14、7×10^14、8×10^14、9×10^14、1×10^15、2×10^15、3×10^15、4×10^15、5×10^15、6×10^15、7×10^15、8×10^15、9×10^15、1×10^16、2×10^16、3×10^16、4×10^16、5×10^16、6×10^16、7×10^16、8×10^16、9×10^16、1×10^17、2×10^17、3×10^17、4×10^17、5×10^17、6×10^17、7×10^17、8×10^17、9×10^17、1×10^18、2×10^18、3×10^18、4×10^18、5×10^18、6×10^18、7×10^18、8×10^18、9×10^18、1×10^19、2×10^19、3×10^19、4×10^19、5×10^19、6×10^19、7×10^19、8×10^19、9×10^19、1×10^20、2×10^20、3×10^20、4×10^20、5×10^20、6×10^20、7×10^20、8×10^20或9×10^20FFU或PFU的本公开的MYXV。
在一些实施方案中，向对象施用的MYXV的剂量为每千克对象体重至多1×10^2、2×10^2、3×10^2、4×10^2、5×10^2、6×10^2、7×10^2、8×10^2、9×10^2、1×10^3、2×10^3、3×10^3、4×10^3、5×10^3、6×10^3、7×10^3、8×10^3、9×10^3、1×10^4、2×10^4、3×10^4、4×10^4、5×10^4、6×10^4、7×10^4、8×10^4、9×10^4、1×10^5、2×10^5、3×10^5、4×10^5、5×10^5、6×10^5、7×10^5、8×10^5、9×10^5、1×10^6、2×10^6、3×10^6、4×10^6、5×10^6、6×10^6、7×10^6、8×10^6、9×10^6、1×10^7、2×10^7、3×10^7、4×10^7、5×10^7、6×10^7、7×10^7、8×10^7、9×10^7、1×10^8、2×10^8、3×10^8、4×10^8、5×10^8、6×10^8、7×10^8、8×10^8、9×10^8、1×10^9、2×10^9、3×10^9、4×10^9、5×10^9、6×10^9、7×10^9、8×10^9、9×10^9、1×10^10、2×10^10、3×10^10、4×10^10、5×10^10、6×10^10、7×10^10、8×10^10、9×10^10、1×10^11、2×10^11、3×10^11、4×10^11、5×10^11、6×10^11、7×10^11、8×10^11、9×10^11、1×10^12、2×10^12、3×10^12、4×10^12、5×10^12、6×10^12、7×10^12、8×10^12、9×10^12、1×10^13、2×10^13、3×10^13、4×10^13、5×10^13、6×10^13、7×10^13、8×10^13、9×10^13、1×10^14、2×10^14、3×10^14、4×10^14、5×10^14、6×10^14、7×10^14、8×10^14、9×10^14、1×10^15、2×10^15、3×10^15、4×10^15、5×10^15、6×10^15、7×10^15、8×10^15、9×10^15、1×10^16、2×10^16、3×10^16、4×10^16、5×10^16、6×10^16、7×10^16、8×10^16、9×10^16、1×10^17、2×10^17、3×10^17、4×10^17、5×10^17、6×10^17、7×10^17、8×10^17、9×10^17、1×10^18、2×10^18、3×10^18、4×10^18、5×10^18、6×10^18、7×10^18、8×10^18、9×10^18、1×10^19、2×10^19、3×10^19、4×10^19、5×10^19、6×10^19、7×10^19、8×10^19、9×10^19、1×10^20、2×10^20、3×10^20、4×10^20、5×10^20、6×10^20、7×10^20、8×10^20或9×10^20FFU或PFU的本公开的MYXV。
本公开的MYXV可以以任何期望的间隔施用。在一些实施方案中，MYXV可以每小时施用。在一些实施方案中，MYXV可以约每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、22、24、26、28、30、32、36、40、44或48小时施用。在一些实施方案中，MYXV可以每天两次、每天一次、一周五次、一周四次、一周三次、一周两次、一周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每五周一次、每六周一次、每八周一次、每两个月一次、每十二周一次、每三个月一次、每四个月一次、每六个月一次、一年一次或以更小频率施用。
可以通过各种形式和途径以治疗有效量向对象施用本公开的MYXV，所述形式和途径包括例如全身、口服、局部、肠胃外、静脉内注射、静脉内输注、瘤内注射、皮下注射、肌内注射、皮内注射、腹膜内注射、脑内注射、蛛网膜下注射、脊柱内注射、胸骨内注射、关节内注射、内皮施用、局部施用、鼻内施用、肺内施用、动脉内施用、鞘内施用、吸入、病灶内施用、皮内施用、硬膜外施用、通过上皮或粘膜与皮肤衬层(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜)吸收、囊内施用、囊下施用、心内施用、经气管施用、表皮下施用、蛛网膜下施用、囊下施用、脊柱内施用或胸骨内施用。
在一些实施方案中，将病毒进行全身施用。在一些实施方案中，通过在疾病部位进行注射来施用病毒。在一些实施方案中，将病毒进行口服施用。在一些实施方案中，将病毒进行肠胃外施用。
本公开的MYXV(例如，表达一种或多种多特异性免疫细胞接合器，诸如BiKE、BiTE和/或MiTE)可以作为单一疗法施用或可以与一种或多种其他疗法联合施用。在一些实施方案中，本公开的MYXV与化学疗法、免疫疗法、细胞疗法、放射疗法、干细胞移植(诸如自体干细胞移植)或其组合联合施用。例如，可以在另一种治疗之前或之后施用表达一种或多种多特异性免疫细胞接合器(诸如BiKE、BiTE和/或MiTE)的MYXV，所述另一种治疗诸如施用放射疗法或常规化学治疗药物和/或干细胞移植，诸如自体干细胞移植或同种异体干细胞移植(例如，HLA匹配、HLA不匹配或单倍体相合移植)。
在一些实施方案中，本公开的MYXV可以与免疫检查点调节剂组合。免疫检查点调节剂的实例包括但不限于PD-L1抑制剂，诸如来自AstraZeneca的德瓦鲁单抗(durvalumab)(Imfinzi)、来自Genentech的阿特珠单抗(atezolizumab)(MPDL3280A)、来自EMD Serono/Pfizer的阿维鲁单抗(avelumab)、来自CytomX Therapeutics的CX-072、来自NovartisPharmaceuticals的FAZ053、来自3D Medicine/Alphamab的KN035、来自Eli Lilly的LY3300054或来自EMD Serono的M7824(抗PD-L1/TGFβtrap)；PD-L2抑制剂，诸如GlaxoSmithKline的AMP-224(Amplimmune)和rHIgM12B7；PD-1抑制剂，诸如来自Bristol-Myers Squibb的纳武单抗(nivolumab)(Opdivo)、来自Merck的派姆单抗(pembrolizumab)(Keytruda)、来自Agenus的AGEN 2034、来自BeiGene的BGB-A317、来自Boehringer-Ingelheim Pharmaceutical的Bl-754091、来自CBT Pharmaceuticals的CBT-501(genolimzumab)、来自Incyte的INCSHR1210、来自Janssen Research&Development的JNJ-63723283、来自MedImmune的MEDI0680、来自MacroGenics的MGA 012、来自NovartisPharmaceuticals的PDR001、来自Pfizer的PF-06801591、来自RegeneronPharmaceuticals/Sanofi的REGN2810(SAR439684)或来自TESARO的TSR-042；CTLA-4抑制剂，诸如来自Bristol Meyers Squibb的伊匹木单抗(也称为
Figure BDA0003690145670000521
MDX-010、BMS-734016和MDX-101)、来自Pfizer的曲美木单抗(tremelimumab)(CP-675,206、ticilimumab)或来自Agenus的AGEN1884；LAG3抑制剂，诸如来自Bristol-Myers Squibb的BMS-986016、来自Novartis Pharmaceuticals的IMP701、来自Novartis Pharmaceuticals的LAG525，或来自Regeneron Pharmaceuticals的REGN3767；B7-H3抑制剂，诸如来自MacroGenics的恩波妥珠单抗(enoblituzumab)(MGA271)；KIR抑制剂，诸如来自Innate Pharma的Lirilumab(IPH2101；BMS-986015)；CD137抑制剂，诸如乌瑞芦单抗(urelumab)(BMS-663513、Bristol-Myers Squibb)、PF-05082566(抗4-1BB、PF-2566、Pfizer)或XmAb-5592(Xencor)；以及PS抑制剂，诸如巴维昔单抗(Bavituximab)。在一些实施方案中，MYXV与对诸如TIM3、CD52、CD30、CD20、CD33、CD27、OX40、GITR、ICOS、BTLA(CD272)、CD160、2B4、LAIR1、TIGHT、LIGIT、DR3、CD226、CD2或SLAM有作用或具有特异性的抗体或其抗原结合片段、RNAi分子或小分子组合。
本公开的MYXV可以使用标准技术来制备。例如，可以如下制备病毒：用将要使用的MYXV菌株感染培养的兔细胞或允许永生化的人类或灵长类细胞，使感染继续进展，使得病毒在培养的细胞中复制并通过用于破坏细胞表面的标准方法将其释放，从而释放病毒颗粒以进行收获。一旦收获，病毒效价可通过感染兔细胞的汇合菌台并进行噬菌斑测定来确定(参见Mossman等人,(1996)Virology 215:17-30，其通过引用整体并入本文)。
MYXV的细胞递送
在一些实施方案中，本文进一步公开了一种新型的递送策略，其中首先将本公开的MYXV吸附至细胞，然后将该细胞施用于对象。该方法可以通过带有病毒的“载体”细胞将本公开的MYXV递送至疾病部位。在一些实施方案中，病毒的这种细胞辅助式递送具有减少或消除肿瘤负荷并增加对象存活率的能力。
通过载体细胞递送MYXV代表了血液学癌症的新的潜在治疗方案。在一些实施方案中，将本公开的MYXV吸附至白细胞(例如，来自骨髓和/或外周血的白细胞)，并将白细胞输注到对象中。在将白细胞输注到患有癌症的接受者之前，离体地用MYXV预加载白细胞可以用于多发性骨髓瘤(MM)和本文公开的任何其他血液学癌症。在一些实施方案中，在将白细胞输注到患有癌症的接受者之前，离体地用MYXV预加载白细胞可以有效治疗任何适合将白细胞定位和浸润到远处肿瘤部位中的癌症。
在一些实施方案中，组合的“白细胞/MYXV”疗法导致肿瘤床中癌细胞死亡增加以增强抗肿瘤免疫原性。例如，在一些实施方案中，将本公开的MYXV(例如，表达一种或多种多特异性免疫细胞接合器，诸如BiKE、BiTE和/或MiTE的MYXV)通过离体预吸附或预感染病毒的白细胞迁移递送至癌症部位，诸如含有微小残留病变(MRD)的骨髓。这种全身性递送方法有时被称为“离体病毒疗法”或EVV(例如，EV2)，因为该病毒在输注至患者中之前首先被递送至白细胞。
在一些实施方案中，MYXV的细胞介导的递送增加了直接杀伤感染的血液学癌症细胞的水平，并且尽管不受理论的束缚充当宿主免疫系统的活化剂，这可以导致癌症的长期消退。这可以提供一种治疗已证明用当前治疗难以治疗的骨骼和/或淋巴结中的血液学癌症的新方法。
因此，在某些实施方案中，本公开的方法包括向患有癌症的对象施用包含吸附的本公开的MYXV(例如，表达一种或多种多特异性免疫细胞接合器，诸如BiKE、BiTE和/或MiTE的MYXV)的白细胞，从而治疗和/或抑制对象的癌症。可以通过在允许MYXV与白细胞的表面结合的条件下将白细胞暴露于MYXV来吸附本公开的MYXV。
在一些实施方案中，将本公开的MYXV吸附至白细胞(例如，来自骨髓和/或外周血的白细胞)，并将白细胞输注到对象中。白细胞可以来自骨髓(例如，来自骨髓穿刺或骨髓活检)。白细胞可以来自血液(例如，外周血单核细胞)。在一些实施方案中，白细胞获自对象，例如患有癌症的对象，用MYXV吸附并将其再输注到该对象中(例如，作为自体细胞移植物)。在一些实施方案中，白细胞获自一个或多个同种异体供体(例如，HLA匹配的、HLA不匹配的或单倍体相合供体)。在一些实施方案中，白细胞获自HLA匹配的同胞。
在吸附本公开的MYXV之前或之后，白细胞可以通过例如红细胞裂解、密度梯度离心法(例如，Ficoll-Paque)、白细胞去除术，包含抗体或其衍生物的技术(例如，通过荧光活化细胞分选或磁性活化细胞分选的阳性或阴性选择)或其任意组合进行分选或纯化。在一些实施方案中，在吸附本公开的MYXV之前或之后，对白细胞进行分选或纯化以富集癌细胞(例如，表达与癌症相关的标志物的细胞，例如，对于多发性骨髓瘤细胞而言的CD138)。在一些实施方案中，在吸附本公开的MYXV之前或之后，对白细胞进行分选或纯化以富集非癌细胞。在一些实施方案中，在吸附本公开的MYXV之前或之后，对细胞进行分选或纯化以富集细胞的一个或多个细胞亚群(例如，单核细胞、淋巴细胞、B细胞、浆细胞、T细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、NK细胞、NKT细胞、肥大细胞、先天淋巴样细胞、普通髓样前体细胞、普通淋巴样前体细胞、成髓细胞、成单核细胞、前单核细胞、淋巴母细胞、原淋巴细胞、成血细胞、成巨核细胞、原巨核细胞、干细胞、原B细胞、前B细胞、其前体或其任意组合)。在一些实施方案中，将本公开的MYXV吸附到白细胞，并且富集白细胞中包含MYXV的细胞(例如，结合和/或内化有MYXV)。
可以在吸附本公开的MYXV之前或之后储存(例如，冷冻保存)白细胞。在一些实施方案中，可以将白细胞冷冻保存，然后在输注到对象中之前解冻。
在一些实施方案中，该方法包括将本公开的MYXV吸附到白细胞(例如，外周血单核细胞、骨髓细胞或其纯化/富集的亚群)的表面上。在一些实施方案中，将黏液瘤病毒吸附到白细胞的表面上包括在允许MYXV结合到单核外周血细胞和/或骨髓细胞的表面的条件下，将白细胞暴露于MYXV。在一些实施方案中，该方法包括用本公开的MYXV感染白细胞。在一些实施方案中，用本公开的MYXV感染白细胞包括在允许MYXV内化进入白细胞的至少一部分的条件下将白细胞暴露于MYXV。将白细胞暴露于MYXV可以包括任何合适的试剂或条件(例如，无菌细胞培养基、培养基补充剂和适当的温育条件，以允许白细胞吸附和/或感染，并维持白细胞的存活力)。
MYXV和白细胞可以在使病毒吸附到白细胞的任何比率下相互暴露。在一些实施方案中，将黏液瘤病毒吸附到白细胞的表面上包括在以下感染复数(MOI)下将白细胞暴露于MYXV：约0.000001、0.00001、0.0001、0.0001、0.001、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、1x10^4、1x10^5、1x10^6、1x10^9、1x10^10、1x10^11、1x10^12、1x10^13、1x10^14或1x10^15个病毒/白细胞。
在一些实施方案中，将黏液瘤病毒吸附到白细胞的表面上包括在以下感染复数(MOI)下将白细胞暴露于MYXV：至少0.000001、至少0.00001、至少0.0001、至少0.0001、至少0.001、至少0.01、至少0.02、至少0.03、至少0.04、至少0.05、至少0.06、至少0.07、至少0.08、至少0.09、至少0.1、至少0.2、至少0.3、至少0.4、至少0.5、至少0.6、至少0.7、至少0.8、至少0.9、至少1、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少2000、至少3000、至少4000、至少5000、至少6000、至少7000、至少8000、至少9000、至少1x10^4、至少1x10^5、至少1x10^6、至少1x10^9、至少1x10^10、至少1x10^11、至少1x10^12、至少1x10^13、至少1x10^14或至少1x10^15个病毒/白细胞。
在一些实施方案中，将黏液瘤病毒吸附到白细胞的表面上包括在以下感染复数(MOI)下将白细胞暴露于MYXV：至多0.000001、至多0.00001、至多0.0001、至多0.0001、至多0.001、至多0.01、至多0.02、至多0.03、至多0.04、至多0.05、至多0.06、至多0.07、至多0.08、至多0.09、至多0.1、至多0.2、至多0.3、至多0.4、至多0.5、至多0.6、至多0.7、至多0.8、至多0.9、至多1、至多1.1、至多1.2、至多1.3、至多1.4、至多1.5、至多1.6、至多1.7、至多1.8、至多1.9、至多2、至多3、至多4、至多5、至多6、至多7、至多8、至多9、至多10、至多11、至多12、至多13、至多14、至多15、至多16、至多17、至多18、至多19、至多20、至多25、至多30、至多35、至多40、至多45、至多50、至多60、至多70、至多80、至多90、至多100、至多150、至多200、至多250、至多300、至多400、至多500、至多600、至多700、至多800、至多900、至多1000、至多2000、至多3000、至多4000、至多5000、至多6000、至多7000、至多8000、至多9000、至多1x10^4、至多1x10^5、至多1x10^6、至多1x10^9、至多1x10^10、至多1x10^11、至多1x10^12、至多1x10^13、至多1x10^14或至多1x10^15个病毒/白细胞。
在一些实施方案中，将黏液瘤病毒吸附到白细胞表面上包括在以下感染复数(MOI)下将白细胞暴露于MYXV：例如0.000001至1×10^15、0.0001至1×10^6、0.001至1×10^4、0.001至1000、0.001至100、0.001至10、0.001至1、0.001至0.1、0.001至0.01、0.01至1×10^4、0.01至1000、0.01至100、0.01至10、0.01至1、0.01至0.1、0.1至1×10^4、0.1至1000、0.1至100、0.1至10、0.1至1、1至1×10^4、1至1000、1至100或1至10个病毒/白细胞。
在一些实施方案中，将黏液瘤病毒吸附到白细胞表面上包括以约0.1至10的感染复数(MOI)将白细胞暴露于MYXV。在一些实施方案中，将黏液瘤病毒吸附到白细胞表面上括以约0.01至100的感染复数(MOI)将白细胞暴露于MYXV。在一些实施方案中，将黏液瘤病毒吸附到白细胞表面上包括以0.001至1000的感染复数(MOI)将白细胞暴露于MYXV。
在一些实施方案中，使白细胞接触或吸附本公开的MYXV约5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、60分钟、65分钟、70分钟、75分钟、80分钟、85分钟、90分钟、95分钟、100分钟、105分钟、110分钟、115分钟、120分钟、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时、5.5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、18小时、20小时、22小时或24小时的时间段。
在一些实施方案中，使白细胞接触或吸附本公开的MYXV至少5分钟、至少10分钟、至少15分钟、至少20分钟、至少25分钟、至少30分钟、至少35分钟、至少40分钟、至少45分钟、至少50分钟、至少55分钟、至少60分钟、至少65分钟、至少70分钟、至少75分钟、至少80分钟、至少85分钟、至少90分钟、至少95分钟、至少100分钟、至少105分钟、至少110分钟、至少115分钟、至少120分钟、至少2.5小时、至少3小时、至少3.5小时、至少4小时、至少4.5小时、至少5小时、至少5.5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少9小时、至少10小时、至少11小时、至少12小时、至少13小时、至少14小时、至少15小时、至少16小时、至少18小时、至少20小时、至少22小时、至少24小时或更长的时间段。
在一些实施方案中，使白细胞接触或吸附本公开的MYXV至多5分钟、至多10分钟、至多15分钟、至多20分钟、至多25分钟、至多30分钟、至多35分钟、至多40分钟、至多45分钟、至多50分钟、至多55分钟、至多60分钟、至多65分钟、至多70分钟、至多75分钟、至多80分钟、至多85分钟、至多90分钟、至多95分钟、至多100分钟、至多105分钟、至多110分钟、至多115分钟、至多120分钟、至多2.5小时、至多3小时、至多3.5小时、至多4小时、至多4.5小时、至多5小时、至多5.5小时、至多6小时、至多7小时、至多8小时、至多9小时、至多10小时、至多11小时、至多12小时、至多13小时、至多14小时、至多15小时、至多16小时、至多18小时、至多20小时、至多22小时、至多24小时或更短的时间段。
在一些实施方案中，使BM或PBMC细胞离体接触或吸附MYXV构建体约1小时。
其他离体方法
如本文所公开的，MYXV能够选择性地感染具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞，并可用作细胞中这种缺陷的指标。因此，可以使用本公开的方法测定从对象中取出的细胞的先天性抗病毒应答的缺陷。当与其他指标结合时，这种确定可以指示对象可能正患有特定的疾病状态，例如癌症。可以使用已知的活检方法从包括人类对象的对象中取出细胞。活检方法将取决于待测试的细胞的位置和类型。可以培养细胞并例如通过向培养基中添加活MYXV使其暴露于MYXV。使用已知在暴露于MYXV后会感染的阳性对照细胞培养物，可以改变感染复数(MOI)，以确定给定细胞类型、密度和培养技术的最佳MOI。
添加到培养细胞中的MYXV的量可以根据细胞类型、培养方法和病毒菌株而变化。
可以通过本领域技术人员已知的各种方法来确定MYXV对培养细胞的感染性，包括MYXV引起细胞死亡的能力。还可能涉及向细胞培养物中添加试剂，以完成与病毒表达产物的酶促或化学反应。病毒表达产物可以从已经插入MYXV基因组中的报告基因表达。
在一个实施方案中，可以修饰MYXV以增强检测感染状态的简易性。例如，MYXV可以经遗传修饰以表达可以通过相差显微镜检查、荧光显微镜检查或放射成像容易检测的标志物。标志物可以是可参与比色反应或放射性标记反应的表达的荧光蛋白或表达的酶。在一个实施方案中，标志物可以是破坏或抑制被测试细胞的特定功能的基因产物。
药物组合物
本公开的MYXV或包含本公开的MYXV的细胞可以被配制为药物组合物中的成分。因此，在一些实施方案中，本公开提供了一种药物组合物，其包含表达一种或多种多特异性免疫细胞接合器诸如BiKE、BiTE和/或MiTE的黏液瘤病毒，以及药学上可接受的稀释剂或赋形剂。组合物可以包含药学上可接受浓度的盐、缓冲剂、防腐剂和各种相容的载体。
药物组合物可以包含另外的治疗剂，诸如另外的抗癌剂。在一个实施方案中，组合物包含化学治疗剂。例如，化学治疗剂可以是基本上任何对对象的癌细胞或赘生性细胞表现出作用并且不抑制或减弱表达一种或多种多特异性免疫细胞接合器的MYXV的肿瘤杀伤作用的药剂。例如，化学治疗剂可以是基本上是任何对对象的癌细胞或赘生性细胞表现出作用并且不抑制或减少对表达一种或多种多特异性免疫细胞接合器的MYXV的肿瘤杀伤作用的药剂。例如，化学治疗剂可以是但不限于蒽环类抗生素、烷基化剂、烷基磺酸盐、氮丙啶、乙烯亚胺、甲基三聚氰胺、氮芥、亚硝基脲、抗生素、抗代谢药、叶酸类似物、嘌呤类似物、嘧啶类似物、酶、鬼臼毒素、含铂试剂或细胞因子。化学治疗剂可以是已知对癌或赘生性的特定细胞类型有效的化学治疗剂。
药学上可接受的稀释剂的比例和身份可以通过例如选择的施用途径、与活病毒的相容性和标准药学实践来确定。在一些实施方案中，药物组合物将与不显著损害表达一种或多种多特异性免疫细胞接合器诸如BiKE、BiTE和/或MiTE的MYXV的生物学特性的组分一起配制。药物组合物可通过已知的制备适于施用于对象的药学上可接受的组合物的方法来制备，使得有效量的一种或多种活性物质与药学上可接受的媒介物在混合物中结合。合适的媒介物在例如Remington's Pharmaceutical Sciences(Remington's PharmaceuticalSciences，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，USA 1995)中记载。在此基础上，该组合物可包括MYXV的溶液或包含MYXV的细胞与一种或多种药学上可接受的媒介物或稀释剂的溶液，并被包含在具有合适pH值并与生理流体等渗的缓冲溶液中。
如本文公开的，取决于所选择的施用途径，药物组合物可以以多种形式施用于对象。本公开的组合物可以经口服或肠胃外施用。肠胃外施用包括静脉内、瘤内、腹膜内、皮下、肌内、经上皮、鼻内、肺内、鞘内、直肠和局部施用方式。肠胃外施用可以通过在选定的时间段内连续输注(例如，静脉内输注)。
药物组合物可以例如与惰性稀释剂或载体一起口服施用，或者可以将其封装在硬壳或软壳明胶胶囊中，或者可以将其压制成片剂。对于口服治疗性施用，表达一种或多种多特异性免疫细胞接合器(诸如BiKE、BiTE和/或MiTE)的MYXV可以掺入赋形剂，并且以可摄入片剂、颊含片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、悬浮液、糖浆剂、薄片剂等形式使用。
本公开的MYXV的溶液或包含本公开的MYXV的细胞的溶液可以在生理上合适的缓冲液中制备。在正常的储存和使用条件下，这些制剂可含有防止微生物生长但不会使活病毒灭活的防腐剂。用于选择和制备合适制剂的常规程序和成分记载于例如Remington'sPharmaceutical Sciences和1999年出版的The United States Pharmacopeia:TheNational Formulary(USP 24NF19)中。所使用的药物组合物的剂量取决于所治疗的特定病况、病况的严重程度、个体对象参数(包括年龄、身体情况、体型和体重)、治疗持续时间、同时治疗(如果有的话)的性质、具体的施用途径和健康从业者的知识和专业技能范围内的其他类似因素。在某些实施方案中，可将治疗性病毒冷冻干燥以在室温下储存。
试剂盒
本公开的多个方面涉及一种表达一种或多种多特异性免疫细胞接合器诸如BiKE、BiTE和/或MiTE的MYXV，以及包括其的试剂盒。表达一种或多种多特异性免疫细胞接合器诸如BiKE、BiTE和/或MiTE的MYXV或包含MYXV的药物组合物可以包装为试剂盒，例如，包含MYXV的使用说明书的试剂盒。试剂盒可以包括本文公开的任何MYXV，其例如表达一种或多种多特异性免疫细胞接合器诸如BiKE、BiTE和/或MiTE，一种或多种报告转基因，一种或多种非免疫调节转基因或其组合。在一些实施方案中，试剂盒包括MYXV-BiTE、MYXV-BiKE、MYXV-MiTE或其组合。试剂盒可以包含一种或多种药学上可接受的缓冲液、稀释剂、载体、赋形剂或媒介物，例如，用于将MYXV配制为剂型以施用于接受者对象。
在一些实施方案中，本文公开了一种试剂盒，其包括本公开的MYXV(例如，表达多特异性免疫细胞接合器，诸如BiKE、BiTE和/或MiTE的MYXV)和用于细胞递送如本文公开的MYXV的材料。试剂盒可以包括例如多个细胞，诸如来自骨髓和/或外周血的白细胞。相对于将成为MYXV和细胞的接受者的对象，白细胞可以是自体的、同种异体的、单倍体相合的、HLA匹配的或HLA不匹配的。在一些实施方案中，多个细胞被本公开的MYXV预吸附或已经暴露于本公开的MYXV。试剂盒可以包括用于将MYXV吸附到多个细胞和/或将MYXV吸附的细胞施用于接受者的说明书。试剂盒可以包括一种或多种药学上可接受的缓冲液、稀释剂、载体、赋形剂或媒介物，例如，用于将MYXV吸附到多个细胞、去除未结合的MYXV、将MYXV吸附的细胞配制为剂型以施用于接受者对象，或其任何组合。
在一些实施方案中，试剂盒包括本公开的MYXV和多个细胞。在一些实施方案中，试剂盒包括本公开的MYXV和用于将MYXV吸附到多个细胞和/或将MYXV吸附的细胞施用于接受者的说明书。在一些实施方案中，试剂盒包括本公开的MYXV和一种或多种药学上可接受的缓冲液、稀释剂、载体、赋形剂或媒介物。在一些实施方案中，试剂盒包括本公开的MYXV、多个细胞和用于将MYXV吸附到多个细胞和/或将MYXV吸附的细胞施用于接受者的说明书。在一些实施方案中，试剂盒包括本公开的MYXV、多个细胞和一种或多种药学上可接受的缓冲液、稀释剂、载体、赋形剂或媒介物。在一些实施方案中，试剂盒包括本公开的MYXV、用于将MYXV吸附到多个细胞和/或将MYXV吸附的细胞施用于接受者的说明书以及一种或多种药学上可接受的缓冲液、稀释剂、载体、赋形剂或媒介物。在一些实施方案中，试剂盒包括多个细胞、用于将MYXV吸附到多个细胞和/或将MYXV吸附的细胞施用于接受者的说明书以及一种或多种药学上可接受的缓冲液、稀释剂、载体、赋形剂或媒介物。在一些实施方案中，试剂盒包括本公开的MYXV、多个细胞、用于将MYXV吸附到多个细胞和/或将MYXV吸附的细胞施用于接受者的说明书以及一种或多种药学上可接受的缓冲液、稀释剂、载体、赋形剂或媒介物。
实施例
实施例1：表达BiKE的重组MYXV构建体的设计和构建
此实施例展示了表达双特异性自然杀伤细胞和嗜中性粒细胞接合器(BiKE)的黏液瘤病毒的设计和构建。BiKE可以含有与在NK细胞和/或嗜中性粒细胞的表面上表达的抗原(例如，CD16)特异性结合的一个结构域，以及与靶细胞上表达的抗原(例如，对于多发性骨髓瘤细胞的CD138)特异性结合的一个结构域。这些分子经设计以在NK细胞或嗜中性粒细胞与肿瘤细胞之间形成抗原特异性免疫突触，以便触发增强的NK/嗜中性粒细胞介导的肿瘤靶标杀伤。从MYXV表达BiKE构建体(例如，分泌的构建体)可以加强NK和嗜中性粒细胞杀伤肿瘤微环境中的MM细胞的能力，并且病毒表达的BiKE技术也可以应用于存在癌症特异性细胞表面标记物的任何其他癌症。
BiKE被设计成包含两个源自抗体的通过短肽接头连接的单链可变片段(scFv)。一个scFv臂结合NK细胞和嗜中性粒细胞的表面上的CD16，而另一个结合所选的靶抗原(在这种情况下是CD138，多发性骨髓瘤(MM)细胞的标志)。
抗CD16 scFv人Ab序列(重链和轻链可变结构域)从公开可用的来源(AY345160.1和AY345161.2；基因库)获得。抗CD138 scFv序列从公开可用的来源(基因库)获得。为了形成scFv，抗CD16可变区通过(G4S1)3接头连接，并且抗CD138可变区通过(G4S1)3接头连接。抗CD16和抗CD138 scFv通过(G4S1)2柔性接头相互连接。BiKE从N至C末端排列，VL(CD138)-VH(CD138)-VH(CD16)-VL(CD16)，并且在N末端处包含来自小鼠Ig重链的信号肽，并且在C末端处包含V5标签(图1A和SEQ ID NO:6)。BiKE构建体针对人类密码子使用进行了优化并由Genscript合成。
MYXV-BiKE-GFP是通过在野生型(wt)MYXV菌株Laussane(MYXV-Lau)基因组中的M135基因与M136基因之间的基因间位置处插入BiKE表达盒来构建的，该盒含有带有C末端V5-标签并在痘病毒合成早期/晚期启动子(sE/L)的控制下的BiKE编码序列(GenScript)。将增强的绿色荧光蛋白(eGFP)的表达盒插入紧靠BiKE表达盒的下游，并且其表达也由痘病毒合成的早期/晚期启动子驱动(图1B)。由于可以通过GFP表达的实时成像来监测MYXV感染，因此eGFP可以用作体外和体内MYXV复制的荧光标志物。
为了产生MYXV-BiKE构建体，首先使用Gateway System(ThermoFisherScientific)构建重组质粒。通过PCR扩增上游和下游杂交序列，以通过与合适的pDONR载体的Gateway BP重组来产生入门克隆。通过以依次方式将三个入门克隆与目的载体重组来构建最终的重组质粒。通过用MYXV-Lau感染RK13细胞，然后转染适当的重组质粒，将BiKE和eGFP表达盒插入MYXV基因组中。进行了多轮转化灶纯化，以获得重组病毒的纯原种，并使用以下适当的引物集通过PCR确认了特异性：
BiKE_CD16_F TCAGCAAGGACACATCCTCTAA(SEQ ID NO：1)
BiKE_CD16_R TAAGGATCCTCATTGGACTGC(SEQ ID NO:2)
还使用适当的引物集通过PCR确认了纯度(图1C-D)。
在细胞裂解物和上清液两者中，通过使用对V5标签(Invitrogen)具有特异性的小鼠单克隆抗体Ab，通过检测来自MYXV-BiKE感染的RK13细胞的裂解物中56kDa带的存在，通过蛋白质印迹法确认了BiKE表达(图1E)。新构建体MYXV-BiKE在RK13细胞中的复制能力类似于亲本病毒MYXV-GFP(图1F)。
SEQ ID NO：3提供了编码BiKE的转基因的核苷酸序列。SEQ ID NO：4提供了编码BiKE的转基因的氨基酸序列。在SEQ ID NO：4中，N末端信号序列带有下划线，接头为粗体，C末端V5标签为斜体。在一些实施方案中，成熟形式的BiKE不包含信号序列和/或V5标签。例如，在一些实施方案中，本公开的成熟BiKE包含SEQ ID NO:5的序列。
DNA BiKE序列：ATGAAGAGCCAGACCCAGGTGTTCATCTTCCTGCTGCTGTGCGTGAGCGGCGCCCACGGCGACATCCAGATGACCCAGAGCACCAGCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGACAGGGTGACCATCAGCTGCAGCGCCAGCCAGGGCATCAACAACTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGCACCGTGGAGCTGCTGATCTACTACACCAGCACCCTGCAGAGCGGCGTGCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTACAGCCTGACCATCAGCAACCTGGAGCCCGAGGACATCGGCACCTACTACTGCCAGCAGTACAGCAAGCTGCCCAGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGTGGCGGTGGCTCCGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTAGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCAGCGAGCTGATGATGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCACCGGCTACACCTTCAGCAACTACTGGATCGAGTGGGTGAAGCAGAGGCCCGGCCACGGCCTGGAGTGGATCGGCGAGATCCTGCCCGGCACCGGCAGGACCATCTACAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCTTCACCGCCGACATCAGCAGCAACACCGTGCAGATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGGGACTACTACGGCAACTTCTACTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGAGCAGCGGTGGCGGTGGCTCCGGCGGTGGTGGGTCGCAGGTTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGGACTTCTGGTATGGGTGTAGGCTGGATTCGTCAGCCTTCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGCTGGCACACATTTGGTGGGATGATGACAAGCGCTATAATCCAGCCCTGAAGAGCCGACTGACAATCTCCAAGGATACCTCCAGCAACCAGGTATTCCTCAAAATCGCCAGTGTGGACACTGCAGATACTGCCACATACTACTGTGCTCAAATAAACCCCGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCCGGTGGCGGTGGCTCCGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGACACTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTTTGATGGTGATAGTTTTATGAACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATACTACATCCAATCTAGAATCTGGGATCCCAGCCAGGTTTAGTGCCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATACTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAAGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACGTAA(SEQ ID NO:3).
蛋白质BiKE序列：
MKSQTQVFIFLLLCVSGAHGDIQMTQSTSSLSASLGDRVTISCSASQGINNYLNWYQQKPDGTVELLIYYTSTLQSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIGTYYCQQYSKLPRTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSSQVQLQQSGSELMMPGASVKISCKATGYTFSNYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGTGRTIYNEKFKGKATFTADISSNTVQMQLSSLTSEDSAVYYCARRDYYGNFYYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLRTSGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDDKRYNPALKSRLTISKDTSSNQVFLKIASVDTADTATYYCAQINPAWFAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDTVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSFMNWYQQKPGQPPKLLIYTTSNLESGIPARFSASGSGTDFTLNIHPVEEEDTATYYCQQSNEDPYTFGGGTKLEIKGKPIPNPLLGLDST(SEQ ID NO:4)。
缺乏信号肽和V5标签的蛋白质BiKE序列：
DIQMTQSTSSLSASLGDRVTISCSASQGINNYLNWYQQKPDGTVELLIYYTSTLQSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIGTYYCQQYSKLPRTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSSQVQLQQSGSELMMPGASVKISCKATGYTFSNYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGTGRTIYNEKFKGKATFTADISSNTVQMQLSSLTSEDSAVYYCARRDYYGNFYYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLRTSGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDDKRYNPALKSRLTISKDTSSNQVFLKIASVDTADTATYYCAQINPAWFAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDTVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSFMNWYQQKPGQPPKLLIYTTSNLESGIPARFSASGSGTDFTLNIHPVEEEDTATYYCQQSNEDPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:5)。
实施例2：使用经多发性骨髓瘤(MM)细胞污染的人类原代患者样品进行的体外研究
为了评估用来自药物难治性患者的多发性骨髓瘤(MM)细胞污染的原代患者样品对MYXV感染的敏感性，使用Ficoll-paque plus梯度将来自3名具有不同水平的MM细胞(CD138+)的患者的原代未操控外周血(PB)经受纯化以分离单核细胞并消除大部分红细胞(RBC)。患者被称为患者#2、3和4。
表4.原代MM细胞(CD138+)的百分比
患者# ％MM细胞
2 <1.0
3 2.3
4 15.0
然后对这些在悬浮液中的原代细胞进行模拟处理(即，不添加病毒)，或在37℃下与MYXV-BiKE-GFP一起温育1小时以使病毒吸附。实验在不同的感染复数(MOI)下进行，包括MOI＝10、1和0.1，如图2-5和表4-5所示。此后，将模拟处理或MYXV处理的细胞在37℃下温育过夜(～24小时)以使病毒感染。对于患者#3，使用流式细胞术确定MOI＝10、1.0和0.1下的病毒感染(即，使用MYXV-BiKE)的百分比以及MM细胞的存活力、凋亡和细胞死亡的百分比(图2A-C)。除此之外，使用流式细胞术评估暴露于病毒的患者样品中未感染的MM细胞的存活力、凋亡和细胞死亡的百分比(图3A-B)。这允许测量细胞中未直接被病毒感染(例如，不表达任何病毒特异性荧光蛋白)但以“脱靶”方式杀伤(例如，通过来自同一患者样品的MYXV激活或BiKE激活的白细胞)的MM细胞死亡。
首先使用荧光显微镜检查评估来自患者#4的细胞中使用MYXV-BiKE-GFP的感染水平(图4D)。使用流式细胞术确定感染、存活和凋亡MM细胞的百分比(图4A-C)。此外，使用流式细胞术评估那些暴露于病毒但未感染的骨髓瘤细胞的存活力、凋亡和细胞死亡的百分比(图5A-B)。
CD138被用作多发性骨髓瘤(MM)细胞的标记物。GFP被用作MYXV感染的细胞的标记物。膜联蛋白-V被用作凋亡细胞的标记物。近红外染色被用作死亡细胞的标记物。
表4&5总结了来自患者#3和#4的数据。因为患者2中CD138+MM细胞的量低于1％，所以不能确定此患者的MM细胞感染和细胞死亡的百分比。表5中所示的凋亡和MM细胞杀伤数据通过对CD138+(MM)细胞进行门控生成，并且数据指示MYXV-BiKE可以有效地感染和杀伤源自药物难治性患者的原代人外周血样品内的MM细胞。对于患者#3，MYXV-BiKE在所有所测试的不同MOI下都增加了对MM细胞的杀伤(图2A-C和表5)。例如，在MOI为10下，50.1％的感染表达huBiKE的MYXV的细胞被杀伤，并且6.51％的模拟处理的细胞被杀伤。对于患者#4，MYXV-BiKE在病毒感染后也杀伤经感染的MM细胞(图4A-C和表5)。例如，在MOI为10下，35.9％的感染表达BiKE的MYXV的细胞被杀伤，并且4.85％的模拟处理的细胞被杀伤。
表5.暴露于MYXV-BiKE之后24小时人原代MM细胞(CD138+)的感染、凋亡和细胞死亡的百分比。MOI＝感染复数。Mock＝模拟处理。通过GFP阳性确定％感染。膜联蛋白V+指示膜联蛋白V阳性(凋亡或死亡)。膜联蛋白V-指示膜联蛋白V阴性(非凋亡或死亡)。近红外+指示近红外+(死亡)。
Figure BDA0003690145670000681
Figure BDA0003690145670000691
表6中所示的数据通过对未感染的MM细胞(即，CD138+GFP-)的杀伤进行门控生成。与模拟处理的细胞相比，在所有MOI下，MYXV-BiKE对未感染的MM细胞的这种“脱靶”杀伤更高(对于患者#3，图3A-B和表6，并且对于患者#4，图5A-B和表6)。例如，在将MYXV-BiKE以MOI为10添加到培养物中的实验中，来自患者4的96.12％的未感染的细胞被杀伤，与之相比，模拟处理的细胞为5.41％。
表6.培养物暴露于MYXV-BiKE之后24小时未感染的(GFP阴性)人原代MM细胞(CD138+)的存活力、凋亡和细胞死亡的百分比。MOI＝感染复数。Mock＝模拟处理。膜联蛋白V+指示膜联蛋白V阳性(凋亡或死亡)。膜联蛋白V-指示膜联蛋白V阴性(非凋亡或死亡)。近红外+指示近红外+(死亡)。
Figure BDA0003690145670000692
实施例3：BiKE与人多发性骨髓瘤细胞和人自然杀伤细胞特异性结合
此实施例展示了本公开的BiKE与人多发性骨髓瘤(MM)细胞和人自然杀伤(NK)细胞特异性结合。
将实施例1中所述的MYXV-BiKE在RK13细胞中繁殖。收获来自MYXV-BiKE感染的RK13细胞的含有分泌的BiKE的上清液。作为对照，还从模拟感染或用野生型MYXV感染的RK13细胞收获上清液。
将收获的上清液添加到人NK细胞或人MM(U266)细胞的培养物中。为了检测与细胞结合的BiKE，用对BiKE的C末端处的V5标签具有特异性的PE缀合的单克隆抗体对细胞进行染色、洗涤并通过流式细胞术分析。
图6展示了BiKE与人MM和NK细胞结合，而对于对照MM细胞或NK细胞(与从模拟感染或野生型MYXV感染的细胞收获的上清液一起温育)未检测到结合。
实施例4：BiKE增加对与人自然杀伤细胞共培养的人多发性骨髓瘤细胞的杀伤
此实施例展示了本公开的BiKE增加对与人自然杀伤(NK)细胞共培养的人多发性骨髓瘤(MM)细胞的杀伤。
在1、5或10的感染复数(MOI)下，将RK13细胞用实施例1中所述的MYXV-BiKE感染。收获来自MYXV-BiKE感染的RK13细胞的含有分泌的BiKE的上清液。作为对照，还从模拟感染的RK13细胞收获上清液。
将收获的上清液添加到含有原代人NK细胞和人MM(U266)细胞的共培养物中。在温育24小时之后，对细胞进行染色以鉴定MM细胞(CD138+)和死亡细胞(近红外染色)，然后通过流式细胞术分析。
图7展示了BiKE抗体能够诱导NK细胞介导的MM细胞杀伤，并且杀伤取决于来源上清液培养物的MOI。
对于在来自模拟感染的细胞的上清液中温育的共培养物，10.6％的细胞是CD138+近红外-，并且0.74％的细胞是CD138+、近红外+。对于在来自在MOI为1下用MYXV-BIKE感染的细胞的上清液中温育的共培养物，5.17％的细胞是CD138+近红外-，并且1.71％的细胞是CD138+、近红外+。对于在来自在MOI为5下用MYXV-BIKE感染的细胞的上清液中温育的共培养物，2.99％的细胞是CD138+近红外-，并且4.42％的细胞是CD138+、近红外+。对于在来自在MOI为10下用MYXV-BIKE感染的细胞的上清液中温育的共培养物，0.024％的细胞是CD138+近红外-，并且7.09％的细胞是CD138+、近红外+。
使用从Vero细胞收获的BiKE进行更大的共培养实验，其中将NK效应细胞与NK耗尽的PBMC效应细胞进行比较，并且与BiKE一起温育48小时。
首先使用Ficoll-Paque PLUS梯度从健康患者的原代人外周血分离PBMC。使用MACS人NK细胞分离试剂盒和LS磁性柱从这些PBMC分离NK细胞，以耗尽磁性标记的细胞。然后，在存在或不存在BiKE的情况下，将NK细胞或PBMC与人MM靶细胞(U266细胞)共温育，并且确定BiKE对于存活力的影响。在完全培养基、0.5XMYXV-GFP上清液(250μL完全培养基+250μL来自在MOI 5下用MYXV-GFP感染48小时的Vero细胞的无血清RPMI上清液)、0.25XMYXV-BIKE-GFP上清液(375μL完全培养基+125μL来自在MOI5下用MYXV-BIKE-GFP感染48小时的Vero细胞的无血清RPMI上清液)或0.5X MYXV-BIKE-GFP上清液(类似地制备)的存在下，将1x10^6NK细胞或PBMC与2x10^5个U266细胞一起温育。将所有样品在37℃下在24孔板中温育。在处理后48小时，然后用近红外活/死染色标记细胞。随后在每种条件下，用100μL染色缓冲液中的1μL人抗CD138抗体(以鉴定MM细胞)和1μL抗V5抗体(以检测BIKE构建体上的V5标签)标记细胞，并且在4℃下避光温育15分钟。然后将所有样品使用100μL Cytofix固定，然后在4℃下温育15分钟(避光)，之后重悬浮在270μL染色缓冲液中以用于流式细胞术分析。
图22示出了治疗后48小时死亡的CD138+细胞的百分比。一式三份进行共培养，并且基于对根据近红外活/死染色死亡的U266细胞群体的比例的流式细胞术分析，对于每次感染获得p值。使用针对多重比较的Holm-Sidak的t检验确定显著性(*＝p<0.05；**＝p<0.01；***＝p<0.001)。数据显示BiKE可以增强NK细胞对MM细胞的杀伤。例如，与0.5X MYXV-GFP上清液一起温育的培养物相比，对于与0.5X MYXV-GFP上清液一起温育的样品，与NK细胞的共培养物中对MM细胞的杀伤显著更高。
实施例5：MYXV-BiKE感染并杀伤体外人血液学癌细胞
为了评估人血液学癌细胞对MYXV-BiKE的敏感性，用MYXV-BiKE感染人急性髓样白血病(AML)和多发性骨髓瘤(MM)细胞系。将THP-1细胞用作AML细胞的实例。将U266细胞用作MM细胞的实例。将U266细胞维持在补充有20％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺和100U/ml青霉素-链霉素的RPMI 1640中。将THP-1细胞维持在补充有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺和100U/ml青霉素-链霉素的RPMI 1640中。
在感染复数(MOI)为0.1、1或10下，将细胞模拟感染，或用MYXV-BiKE-GFP、MYXV-M135KO-GFP或野生型(WT)MYXV-GFP感染。将细胞在37℃下感染1小时以使病毒吸附，然后温育至感染后24或48小时(hpi)。
通过荧光显微镜检查评估在24和48hpi时的感染。以5X放大倍率拍摄图像，曝光时间为338.00ms，并且增益为2.5。图8A和图8B分别展示了在感染后24和48小时时THP-1细胞的感染。图8C和图8D分别展示了在感染后24和48小时时U266细胞的感染。
还通过流式细胞术定量感染率，评估感染细胞的群体的GFP表达。图17A示出了在感染后24和48小时时呈GFP阳性的THP-1细胞的百分比。图17B示出了在感染后24和48小时时呈GFP阳性的U266细胞的百分比。
通过流式细胞术使用近红外活/死染色评估感染后24和48小时时的细胞杀伤。图9展示了对THP-1细胞的杀伤。图10展示了对U266细胞的杀伤。
通过对GFP+细胞(用于直接杀伤感染细胞，或中靶杀伤)和GFP阴性细胞(用于间接杀伤未感染的细胞，或脱靶杀伤)进行门控来进一步表征细胞杀伤。图18A图示了在24和48小时时杀伤的经感染的U266细胞的百分比。图18B图示了在24和48小时时杀伤的未感染的U266细胞的百分比。图19提供了死亡U266细胞与经感染的U266细胞的比率。
这些数据证明，MYXV-BiKE可以感染人血液学癌细胞、在人血液学癌细胞中复制和杀伤人血液学癌细胞，并且在一些情况下可以引发与缺乏BiKE的MYXV相比增强的杀伤。不希望受理论的束缚，在存在可以被BiKE构建体接合的效应免疫细胞的条件下，可进一步增强由MYXV-BiKE诱导的杀伤，例如，如实施例4所展示。
实施例6：MYXV-BiKE杀伤来自骨髓的原代人多发性骨髓瘤细胞
此实施例展示了MYXV-BiKE杀伤来自人患者的骨髓样品中的多发性骨髓瘤(MM)细胞。
通过骨髓活检从多发性骨髓瘤患者获得原代骨髓样品，并且使用Ficoll-paqueplus梯度进行纯化以分离单核细胞。然后将单核细胞重悬浮在在每种条件下的380μL完全培养基中，置于24孔板中。
然后对这些在悬浮液中的原代细胞进行模拟处理(即，不添加病毒)，或在37℃下与MYXV-BiKE-GFP、MYXV-M135KO-GFP或野生型MYXV-GFP一起温育1小时以使病毒吸附。实验在不同的感染复数(MOI)下进行，包括MOI＝10、1和0.1。在1小时温育之后，将120μL完全培养基添加到每个孔中，并且将板在37℃下温育过夜(～24小时)以使得病毒感染发生进展。
在感染后24小时，然后用近红外活/死染色标记细胞。随后在每种条件下，用100μL染色缓冲液中的1μL人抗CD138抗体标记原代细胞，并且在4℃下避光温育15分钟。然后将所有样品使用100μL Cytofix固定，然后在4℃下避光温育15分钟，之后重悬浮在270μL染色缓冲液中以用于流式细胞术分析。
通过流式细胞术评估杀伤的MM细胞的百分比。将CD138用作多发性骨髓瘤(MM)细胞的标记物。图20图示了在指定MOI下被MYXV-BiKE-GFP、MYXV-M135KO-GFP或野生型MYXV-GFP感染的CD138+MM细胞的比例。图11展示了MYXV-BiKE对MM细胞的杀伤。图21定量了对于从四位对象获得的样品，在MOI为10下在模拟感染或用MYXV-BiKE-GFP或野生型MYXV-GFP感染之后CD138+的完整细胞的比例。
这些数据证明了MYXV-BiKE可以感染和杀伤原代人血液学癌细胞。在一些情况下，观察到MYXV-BiKE引发与不表达BiKE的MYXV相比增强的杀伤。
实施例7：表达双特异性T细胞接合器(BiTE)、双特异性自然杀伤细胞和嗜中性粒细胞接合器(BiKE)和/或膜整合T细胞接合器(MiTE)的重组MYXV构建体的设计和构建。
此实施例展示了表达一种或多种多特异性免疫细胞接合器(例如，双特异性T细胞接合器(BiTE)、双特异性自然杀伤细胞和嗜中性粒细胞接合器(BiKE)和/或膜整合T细胞接合器(MiTE))的重组MYXV构建体的设计和构建。
生成编码对免疫细胞具有结合特异性并且对靶抗原具有结合特异性的多特异性蛋白质的DNA序列。例如，包含来自与CD138或CD3结合的抗体的轻链可变结构域和重链可变结构域的单链可变片段(scFv)可以用于赋予对免疫细胞的结合特异性。包含来自与CD138、CD19、EpCAM、Her2/neu、EGFR、CEA、EpHA2、CD33或MCSP结合的抗体的轻链可变结构域和重链可变结构域的scFv可以用于赋予对靶抗原(例如，由感兴趣的癌细胞表达的靶抗原)的结合特异性。肽接头可以任选地用于连接每个scFv的重链可变片段和轻链可变片段，并且将scFv连接在一起以形成多特异性蛋白质。在一些情况下，该蛋白质可以包含信号序列以促进多特异性免疫细胞接合器的分泌。在一些情况下，该蛋白质可以包含用于锚定在质膜中的跨膜结构域。在一些情况下，该蛋白质可以包含用于检测和/或纯化蛋白质的表位标签(例如，V5标签)。
生成用于将多特异性免疫细胞接合器整合到黏液瘤病毒基因组中的质粒。多特异性免疫细胞接合器(例如，BiTE、BiKE和/或MiTE)可以在仅允许在病毒感染的细胞中表达的痘病毒合成早期/晚期启动子(sE/L)下表达。除了多特异性免疫细胞接合器转基因之外，报告基因，例如绿色荧光蛋白(GFP)或TdTomato，也可以任选地在痘病毒启动子下表达，以快速选择和纯化表达转基因的重组病毒。额外的报告基因，例如萤火虫荧光素酶(F-Luc)可以允许实时监测活体动物中的病毒复制。转基因和报告基因可以插入在黏液瘤病毒基因组的ORF M135与M136之间，以维持亲本野生型MYXV骨架。转基因也可以插入在基因敲除病毒背景中。在这种情况下，选择M135基因座用于构建具有M135敲除的转基因表达盒。最终的重组质粒盒含有：转基因、一个或多个报告基因和来自重组将在其中发生的MYXV的基因序列。
通过Gateway技术(Multisite Gateway Pro)完成重组质粒的构建，该技术允许通过在细菌中重组从多个DNA片段构建单个质粒。生成四个包含不同元件的入门克隆，以制作最终的重组盒。它们是：a)元件1，黏液瘤病毒M135区；b)元件2，具有痘病毒Syn E/L启动子序列和V5标签的多特异性免疫细胞接合器；c)元件3，痘病毒晚期p11启动子下的报告基因TdTomato；d)元件4，痘病毒Syn E/L启动子下的萤火虫萤光素酶，连同黏液瘤病毒M136基因序列。为了制备M135KO病毒骨架，元件1被来自M134 ORF的部分序列和来自M135 ORF的50nt替换。为了构建最终的重组质粒盒，所有这四个元件都通过使用标准协议的LR重组反应与Gateway目的载体重组。最终的重组质粒是：(i)pDEST M135-136-FLuc-ENGAGER-TdTomato和(ii)pDEST M135KO-Fluc-ENGAGER-TdTomato，分别如图12和图13所图示。
在制备重组病毒之前的这个阶段，在将质粒转染到RK13细胞中之后，可以通过蛋白质印迹分析(例如，对于V5表位标签)确认多特异性免疫细胞接合器的表达。
将编码转基因和选择标记物的最终重组质粒连同侧翼序列一起转染到用感染野生型MYXV Lausanne的RK13细胞中。基于选择标记物的表达，分离和连续纯化重组病毒。再次通过蛋白质印迹分析和功能测定确认多特异性免疫细胞接合器的表达。在野生型病毒背景和敲除背景(在此实施例中，具有M135的敲除)上生成包含多特异性免疫细胞接合器的病毒。
可以测试表达多特异性免疫细胞接合器的MYXV构建体的复制能力，并且例如通过感染RK13细胞与野生型MYXV进行比较。
该技术可以适用于通过使用交替的侧翼序列在本文公开的其他基因座处生成敲除和/或敲入。例如，包含M153而非M135的缺失或破坏并表达一种或多种多特异性免疫细胞接合器的MYXV例如可以通过使用用于插入在M153基因中的适当侧翼序列来生成。
实施例8：表达多特异性免疫细胞接合器的MYXV增强对血液学癌细胞的杀伤
此实施例展示了评估表达多特异性免疫细胞接合器的本公开的MYXV杀伤原代人血液学癌细胞的能力。原代血液和骨髓样品从患有血液学癌症的患者获得。使用Ficoll-paque plus梯度对样品进行纯化，以分离单核细胞并消除大部分红细胞(RBC)。
然后对这些在悬浮液中的原代细胞进行模拟处理(即，不添加病毒)，或在37℃下与本公开的MYXV一起温育1小时以使病毒吸附。实验在不同的感染复数(MOI)下进行，包括MOI＝10、1和0.1。此后，将模拟处理或MYXV处理的细胞在37℃下温育过夜(～24小时)以使病毒感染。
使用流式细胞术确定病毒感染的百分比和癌细胞的存活力、凋亡和细胞死亡的百分比。还确定暴露于病毒的患者样品中未感染的癌细胞的百分比，从而能够测量细胞中未直接感染病毒(即，不表达任何病毒特异性荧光蛋白)但以“脱靶”方式被杀伤(例如，被来自同一患者样品的通过多特异性免疫细胞接合器引导至癌细胞的白细胞杀伤)的癌细胞死亡。
表达多特异性免疫细胞接合器(例如，MYXV-BiTE、MYXV-BiKE、MYXV-MiTE)的本公开的MYXV有效地感染癌细胞。表达多特异性免疫细胞接合器(例如，MYXV-BiTE、MYXV-BiKE、MYXV-MiTE)的本公开的MYXV直接杀伤它们感染的癌细胞，并且通过多特异性免疫细胞接合器促进对未感染的癌细胞的杀伤。
实施例9：多特异性免疫细胞接合器与人癌细胞和人免疫细胞特异性结合
此实施例展示了本公开的多特异性免疫细胞接合器与人癌细胞和人免疫细胞特异性结合。
将实施例7中所述的MYXV-BiKE、MYXV-BiTE和/或MYXV-MiTE在RK13细胞中繁殖。BiKE特异性结合CD16和CD138。BiTE特异性结合CD3和CD138。MiTE特异性结合CD3和CD138。还可以生成还结合本文公开的其他合适靶标的构建体。收获来自MYXV-BiKE感染的RK13细胞的含有分泌的BiKE的上清液。收获来自MYXV-BiTE感染的RK13细胞的含有分泌的BiTE的上清液。收获来自MYXV-BiTE感染的RK13细胞的含有分泌的MiTE的上清液。作为对照，还收获来自模拟感染或用野生型MYXV感染的RK13细胞的上清液。
将收获的上清液添加到人免疫细胞，例如人T细胞、人NK细胞或人多发性骨髓瘤(例如，U266)细胞的培养物中。
为了检测与细胞结合的BiKE、BiTE或MiTE，用对BiKE/BiTE/MiTE的C末端处的V5标签具有特异性的PE缀合的单克隆抗体对细胞进行染色、洗涤并通过流式细胞术分析。
对CD16具有结合特异性并且对CD138具有结合特异性的BiKE表现出与NK细胞和多发性骨髓瘤细胞的结合。
对CD3具有结合特异性并且对CD138具有结合特异性的BiTE表现出与T细胞和多发性骨髓瘤细胞的结合。
对CD3具有结合特异性并且对CD138具有结合特异性的MiTE表现出与T细胞和多发性骨髓瘤细胞的结合。
实施例10：多特异性免疫细胞接合器增加对与人免疫细胞共培养的人癌细胞的杀伤
此实施例展示了本公开的多特异性免疫细胞接合器可以增加对与人免疫细胞共培养的人癌细胞的杀伤。
在感染复数(MOI)为1、5或10下，将RK13细胞用实施例7中所述的MYXV-BiKE、MYXV-BiTE或MYXV-MiTE感染。BiKE特异性结合CD16和CD138。BiTE特异性结合CD3和CD138。MiTE特异性结合CD3和CD138。收获来自MYXV-BiKE感染的RK13细胞的含有分泌的BiKE的上清液、来自MYXV-BiTE感染的RK13细胞的含有分泌的BiTE的上清液和来自MYXV-MiTE感染的RK13细胞的含有分泌的MiTE的上清液。作为对照，还收获来自模拟感染的RK13细胞的上清液。
将收获的上清液添加到含有(i)原代人NK细胞和人多发性骨髓瘤MM(U266)细胞或(ii)原代人T细胞和MM(U266)细胞的共培养物中。在温育24小时之后，对细胞进行染色以鉴定MM细胞(CD138+)和死亡细胞(近红外染色)，然后通过流式细胞术分析。
BiKE、BiTE和MiTE通过募集NK细胞和T细胞来增加对MM细胞的杀伤。
实施例11：用黏液瘤病毒(MYXV)对多发性骨髓瘤(MM)进行溶瘤病毒疗法：鉴定适于从原代人类样品中消除污染的癌细胞的MYXV构建体。
进行实验以鉴定适于从原代人类细胞样品中消除污染的难治性癌细胞的MYXV构建体和实验条件。骨髓或外周血样品获自患有血液学癌症(例如，骨髓瘤、白血病或淋巴瘤)的对象。分离出单核细胞(例如，通过Ficoll-Paque)。在各种条件(例如，MOI、温育时间)下，用本公开的MYXV构建体(例如，表达一种或多种多特异性免疫细胞接合器和/或包含一个或多个缺失)处理包含癌细胞的单核细胞的样品，并且如本文所公开的(例如，通过流式细胞术、荧光显微镜检查和/或细胞毒性测定)来确定MYXV构建体杀伤癌细胞的能力。
经鉴定的构建体和/或实验条件可以用于治疗对象。例如，被鉴定为合适的MYXV构建体可以直接施用给对象(例如，通过注射或静脉内输注)，或者可以通过吸附有MYXV的白细胞施用。
实施例12：用黏液瘤病毒(MYXV)进行溶瘤病毒疗法
鉴定对象患有血液学癌症(例如，骨髓瘤、白血病或淋巴瘤)。血液学癌症可以任选地是包括微小残留病变(MRD)和/或耐药性MRD的血液学癌症。
任选地，进行研究以鉴定消除取自对象的样品(例如，外周血或骨髓样品)中的癌细胞的本公开的MYXV构建体(例如，表达一种或多种多特异性免疫细胞接合器和/或包含一个或多个缺失)。
向对象施用MYXV(例如，通过注射或输注施用)。MYXV感染对象中的癌细胞并表达多特异性免疫细胞接合器，从而导致癌细胞杀伤和抗癌免疫应答。
实施例13：通过吸附有MYXV的白细胞的自体移植，用黏液瘤病毒(MYXV)进行溶瘤病毒疗法
通过吸附有MYXV的白细胞的自体移植，将MYXV施用于患有血液学癌症的对象。
从患有血液学癌症(例如，骨髓瘤、白血病或淋巴瘤)的对象获得骨髓或外周血样品，并且分离出单核细胞(例如，通过Ficoll-Paque)。可以将癌细胞与非癌细胞分离(例如，通过FACS或MACS)。将本公开的MYXV吸附至白细胞(例如，以约0.1至10的MOI吸附约1个小时)。通过静脉内输注将吸附有MYXV的白细胞施用回对象。MYXV感染对象中的癌细胞并表达多特异性免疫细胞接合器，从而导致癌细胞杀伤和抗癌免疫应答。
实施例14：通过吸附有MYXV的白细胞的同种异体移植，用黏液瘤病毒(MYXV)进行溶瘤病毒疗法
通过吸附有MYXV的白细胞的同种异体移植，将MYXV施用于患有血液学癌症(例如，骨髓瘤、白血病或淋巴瘤)的对象。从供体(例如，HLA匹配的、HLA不匹配的、单倍体相合的或同胞的供体，或其组合)获得骨髓或外周血样品。分离出单核细胞(例如，通过Ficoll-Paque)。任选地，纯化或富集细胞中的特定白细胞亚群(例如，通过FACS或MACS)。将本公开的MYXV吸附至白细胞(例如，以约0.1至10的MOI吸附约1小时)。通过静脉内输注将吸附有MYXV的白细胞施用回对象。MYXV感染对象中的癌细胞并表达多特异性免疫细胞接合器，从而导致癌细胞杀伤和抗癌免疫应答。
实施例15：吸附有MYXV的原代人PBMC将MYXV转移到易感MM细胞
首先使用Ficoll-Paque PLUS梯度从健康患者的原代人外周血分离PBMC。使用MACS人NK细胞分离试剂盒和LS磁性柱从这些PBMC分离NK细胞，以耗尽磁性标记的细胞。保留并单独使用耗尽NK细胞的部分。将1x10^6个NK细胞或耗尽NK细胞的PBMC与MYXV(MYXV-GFP或MYXV-BIKE-GFP)在每种条件下的380μL完全培养基中在37℃下在24孔板中温育1小时，以使病毒吸附。温育1h之后，使用500μL 1X PBS+10％FBS将原代细胞洗涤三次，以去除未结合的病毒。
然后将原代细胞重悬浮在含有2x10^5个U266细胞(CD138+MM细胞)的500μL完全培养基中。共温育24小时之后，用近红外活/死标记细胞。随后在每种条件下，用100μL染色缓冲液中的1μL人抗CD138抗体标记细胞，并且在4℃下避光温育15分钟。然后将所有样品使用100μL Cytofix固定并且在4℃下避光温育15分钟，之后重悬浮在270μL染色缓冲液中以用于流式细胞术分析。
图23A提供了在与MYXV-GFP或MYXV-BiKE吸附的NK细胞(顶行)或NK耗尽的PBMC(-NK，底行)共温育之后展示CD138+MM细胞感染的点图。这些数据证明了病毒吸附的NK细胞或PBMC可以将本公开的MYXV递送至人血液学癌细胞，然后MYXV可以感染所述细胞。
图23B提供了在与MYXV-GFP或MYXV-BiKE吸附的NK细胞(顶行)或NK耗尽的PBMC(-NK，底行)共温育之后展示CD138+MM细胞杀伤的点图。这些数据证明了病毒吸附的NK细胞或PBMC可以将本公开的MYXV递送至人血液学癌细胞，然后MYXV可以感染并杀伤所述细胞。
实施例16：在患微小残留病变(MRD)的Vk*MYC免疫功能正常的小鼠模型中，离体MYXV病毒疗法与自体移植联合用于在体内靶向和消除耐药性弥散性MM。
将两种源自C57BL/6的VK*MYC细胞系用于体内实验：耐硼替佐米(耐BOR)的VK12598，和多重耐药性VK12653系。首先，评估了这两种VK*MYC细胞系对MYXV结合和感染的敏感性。
MYXV与VK12598和VK12653的结合，体外研究：对于结合实验，以感染复数(MOI)为10使用MYXV-M093L-Venus病毒(在M093L的氨基末端包含荧光蛋白Venus的融合体)。简而言之，从BM(或从刚解冻的BM)中新鲜分离VK12598或VK12653，并在4℃下与MYXV-M093L-Venus温育1小时，以使病毒结合。通过将吸附有病毒的细胞洗涤两次来去除未结合的病毒。使用流式细胞术定量病毒粒体结合的水平。为了分析病毒感染，将细胞与报告基因MYXV-GFP(E/L)/TdTomato(L)以MOI＝10在37℃下温育1小时，以使病毒吸附。将细胞在37℃下温育过夜，以使病毒感染。MYXV有效结合两种细胞系(图14A和图15A)。除此之外，MYXV有效感染两种细胞系(图14B-C和图15B)。
使用VK12598细胞系的体内研究：在第一个体内实验中，将C57BL/6小鼠预先接种VK12598细胞(例如，每只小鼠1×106个细胞)。MM细胞植入后四周，对小鼠进行采血并测量M-峰。根据M-峰的水平(例如0，低＝0.1、中＝0.2、高＝0.6)将小鼠分开(图16A，上子图)。然后按以下方式处理小鼠：无C57BL/6BM移植(队列I)，仅C57BL/6BM细胞(队列II)，仅MYXV-M135KO-GFP(队列III)，用MYXV-M135KO-GFP离体处理的C57BL/6BM(队列IV)(图16A，下子图)。图16B示出了来自具有低M-峰(0.1)的队列I的代表性小鼠中的MM(CD138+B220-)的百分比和来自具有高M-峰(0.6)的队列II的代表性小鼠中的MM(CD138+B220-)的百分比。图16C示出了来自队列IV的唯一幸存者的M-峰，其表现出MM的完全消退，并且在移植后第8天、第29天和第37天未检测到M-峰带。这些数据表明，移植离体MYXV处理的骨髓可以诱导MM消退。总之，这些数据可以表明，此第一个实验中的队列治疗在疾病进展中开始得太晚，而在此模型中应该更早地开始病毒疗法(例如，在MM植入后不到1周而不是MM植入后4周)。尽管即使在此较晚的干预时间也可能发生MM消退，但更早开始病毒治疗(例如，在离死亡或终点不太近的小鼠队列中)可以改善对病毒技术的评价。
在另外的试验中，将MYXV与其他治疗剂(例如SMAC模拟物LC161)组合进行测试。植入VK12598癌细胞，在1-4周对M-峰进行定量，然后用环磷酰胺治疗小鼠以诱导短暂的完全应答(CR)，这可以持续1个月。在环磷酰胺治疗后一周或两周时，向小鼠移植BM+MYXV或PBMC+MYXV(例如，如本文公开的表达免疫细胞接合器的MYXV)，以便测试病毒疗法是否可以延长或完成通过环磷酰胺引起的部分消退。在这种情况下，研究了MYXV消除MM微小残留病变(MRD)的能力，所述疾病由在功能上抵抗这种化学疗法的疾病定义。还研究了MYXV作为单一疗法或联合疗法消除多重耐药性VK12653细胞系的能力。
尽管已经着重基于特定实施方案描述了本公开，但是对于本领域普通技术人员明显是，可以使用特定实施方案的变型，并且意图是除了本文具体描述之外，还可以以其他方式实践本公开。结合本发明的特定方面、实施方案或实施例描述的特征、特性、化合物或实例应理解为可应用于本发明的任何其他方面、实施方案或实施例。因此，本公开包括在由以下权利要求限定的本公开的精神和范围内所涵盖的所有修改。因此，发明人要求保护落入这些权利要求的范围和精神之内的所有内容。
实施方案
实施方案1.一种黏液瘤病毒(MYXV)，其包含编码多特异性免疫细胞接合器的转基因。
实施方案2.如实施方案1所述的黏液瘤病毒，其中所述多特异性免疫细胞接合器是双特异性天然杀伤细胞和嗜中性粒细胞接合器(BiKE)。
实施方案3.如实施方案2所述的黏液瘤病毒，其中所述BiKE与自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞或其组合上存在的抗原结合。
实施方案4.如实施方案2或实施方案3所述的黏液瘤病毒，其中所述BiKE与血液学癌细胞上存在的抗原结合。
实施方案5.如实施方案2-4中任一项所述的黏液瘤病毒，其中所述BiKE与骨髓瘤细胞上存在的抗原结合。
实施方案6.如实施方案2-5中任一项所述的黏液瘤病毒，其中所述BiKE与白血病细胞上存在的抗原结合。
实施方案7.如实施方案2-6中任一项所述的黏液瘤病毒，其中所述BiKE与淋巴瘤细胞上存在的抗原结合。
实施方案8.如实施方案2-7中任一项所述的黏液瘤病毒，其中所述BiKE与CD16结合。
实施方案9.如实施方案2-8中任一项所述的黏液瘤病毒，其中所述BiKE与CD138结合。
实施方案10.如实施方案2-9中任一项所述的黏液瘤病毒，其中所述BiKE包含一个或多个单链可变片段(scFv)。
实施方案11.如实施方案2-9中任一项所述的黏液瘤病毒，其中所述BiKE包含一个或多个人源化单链可变片段(scFv)。
实施方案12.如实施方案2-11中任一项所述的黏液瘤病毒，其中所述BiKE包含与SEQ ID NO:4-21中的任一个至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的序列。
实施方案13.如实施方案2-12中任一项所述的黏液瘤病毒，其中所述BiKE在黏液瘤病毒基因组的M135与M136开放阅读框之间。
实施方案14.如实施方案1-13中任一项所述的黏液瘤病毒，其还包含报告基因。
实施方案15.如实施方案14所述的黏液瘤病毒，其中所述报告基因是荧光蛋白。
实施方案16.如实施方案14所述的黏液瘤病毒，其中所述报告基因是发光底物或酶。
实施方案17.如实施方案1-16中任一项所述的黏液瘤病毒，其还包含所述黏液瘤病毒基因组中的缺失。
实施方案18.如实施方案17所述的黏液瘤病毒，其中所述黏液瘤病毒包含选自以下的一个或多个基因的缺失或破坏：M001R、M002R、M003.1R、M003.2R、M004.1R、M004R、M005R、M006R、M007R、M008.1R、M008R、M009L、M013、M036L、M063L、M11L、M128L、M131R、M135R、M136R、M141R、M148R、M151R、M152R、M153R、M154L、M156R、M-T2、M-T4、M-T5、M-T7和SOD。
实施方案19.如实施方案17所述的黏液瘤病毒，其中所述黏液瘤病毒包含M135的缺失。
实施方案20.如实施方案1所述的黏液瘤病毒，其中所述多特异性免疫细胞接合器是双特异性T细胞接合器(BiTE)。
实施方案21.如实施方案20所述的黏液瘤病毒，其中所述BiTE与T细胞上存在的抗原结合。
实施方案22.如实施方案20或实施方案21所述的黏液瘤病毒，其中所述BiTE与血液学癌细胞上存在的抗原结合。
实施方案23.如实施方案20-22中任一项所述的黏液瘤病毒，其中所述BiTE与骨髓瘤细胞上存在的抗原结合。
实施方案24.如实施方案20-23中任一项所述的黏液瘤病毒，其中所述BiTE与白血病细胞上存在的抗原结合。
实施方案25.如实施方案20-24中任一项所述的黏液瘤病毒，其中所述BiTE与淋巴瘤细胞上存在的抗原结合。
实施方案26.如实施方案20-25中任一项所述的黏液瘤病毒，其中所述BiTE与CD3结合。
实施方案27.如实施方案20-26中任一项所述的黏液瘤病毒，其中所述BiTE与CD138结合。
实施方案28.如实施方案20-27中任一项所述的黏液瘤病毒，其中所述BiTE包含一个或多个单链可变片段(scFv)。
实施方案29.如实施方案20-28中任一项所述的黏液瘤病毒，其中所述BiTE包含一个或多个人源化单链可变片段(scFv)。
实施方案30.如实施方案20-29中任一项所述的黏液瘤病毒，其中所述BiTE包含与SEQ ID NO:6、7、10-15或32-39中的任一个至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同相同的序列。
实施方案31.如实施方案20-30中任一项所述的黏液瘤病毒，其中所述BiTE在黏液瘤病毒基因组的M135与M136开放阅读框之间。
实施方案32.如实施方案20-31中任一项所述的黏液瘤病毒，其还包含报告基因。
实施方案33.如实施方案32所述的黏液瘤病毒，其中所述报告基因是荧光蛋白。
实施方案34.如实施方案32所述的黏液瘤病毒，其中所述报告基因是发光底物或酶。
实施方案35.如实施方案20-34中任一项所述的黏液瘤病毒，其还包含所述黏液瘤病毒基因组中的缺失。
实施方案36.如实施方案20-34中任一项所述的黏液瘤病毒，其中所述黏液瘤病毒包含选自以下的一个或多个基因的缺失或破坏：M001R、M002R、M003.1R、M003.2R、M004.1R、M004R、M005R、M006R、M007R、M008.1R、M008R、M009L、M013、M036L、M063L、M11L、M128L、M131R、M135R、M136R、M141R、M148R、M151R、M152R、M153R、M154L、M156R、M-T2、M-T4、M-T5、M-T7和SOD。
实施方案37.如实施方案20-34中任一项所述的黏液瘤病毒，其中所述黏液瘤病毒包含M135的缺失。
实施方案38.如实施方案1所述的黏液瘤病毒，其中所述多特异性免疫细胞接合器是膜整合T细胞接合器(MiTE)。
实施方案39.如实施方案38所述的黏液瘤病毒，其中所述MiTE与T细胞上存在的抗原结合。
实施方案40.如实施方案38或实施方案39所述的黏液瘤病毒，其中所述MiTE与血液学癌细胞上存在的抗原结合。
实施方案41.如实施方案38-40中任一项所述的黏液瘤病毒，其中所述MiTE与骨髓瘤细胞上存在的抗原结合。
实施方案42.如实施方案38-41中任一项所述的黏液瘤病毒，其中所述MiTE与白血病细胞上存在的抗原结合。
实施方案43.如实施方案38-42中任一项所述的黏液瘤病毒，其中所述MiTE与淋巴瘤细胞上存在的抗原结合。
实施方案44.如实施方案38-43中任一项所述的黏液瘤病毒，其中所述MiTE与CD3结合。
实施方案45.如实施方案38-44中任一项所述的黏液瘤病毒，其中所述MiTE与CD138结合。
实施方案46.如实施方案38-45中任一项所述的黏液瘤病毒，其中所述MiTE包含一个或多个单链可变片段(scFv)。
实施方案47.如实施方案38-45中任一项所述的黏液瘤病毒，其中所述MiTE包含一个或多个人源化单链可变片段(scFv)。
实施方案48.如实施方案38-47中任一项所述的黏液瘤病毒，其中所述MiTE包含与SEQ ID NO:6、7、10-15或32-39中的任一个至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的序列。
实施方案49.如实施方案38-48中任一项所述的黏液瘤病毒，其中所述MiTE在黏液瘤病毒基因组的M135与M136开放阅读框之间。
实施方案50.如实施方案38-49中任一项所述的黏液瘤病毒，其还包含报告基因。
实施方案51.如实施方案50所述的黏液瘤病毒，其中所述报告基因是荧光蛋白。
实施方案52.如实施方案50所述的黏液瘤病毒，其中所述报告基因是发光底物或酶。
实施方案53.如实施方案38-52中任一项所述的黏液瘤病毒，其还包含所述黏液瘤病毒基因组中的缺失。
实施方案54.如实施方案38-53中任一项所述的黏液瘤病毒，其中所述黏液瘤病毒包含选自以下的一个或多个基因的缺失或破坏：M001R、M002R、M003.1R、M003.2R、M004.1R、M004R、M005R、M006R、M007R、M008.1R、M008R、M009L、M013、M036L、M063L、M11L、M128L、M131R、M135R、M136R、M141R、M148R、M151R、M152R、M153R、M154L、M156R、M-T2、M-T4、M-T5、M-T7和SOD。
实施方案55.如实施方案38-53中任一项所述的黏液瘤病毒，其中所述黏液瘤病毒包含M135的缺失。
实施方案56.一种组合物，其包含如实施方案1-55中任一项所述的黏液瘤病毒和药学上可接受的载体。
实施方案57.一种治疗有需要的对象的血液学癌症的方法，其包括向所述对象施用如实施方案1-56中任一项所述的黏液瘤病毒。
实施方案58.如根据实施方案57所述的方法，其中所述对象是人。
实施方案59.如实施方案57或实施方案58所述的方法，其中所述黏液瘤病毒能够感染具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞。
实施方案60.如实施方案57-59中任一项所述的方法，其中所述黏液瘤病毒能够感染癌细胞。
实施方案61.如实施方案57-60中任一项所述的方法，其中所述血液学癌症是骨髓瘤、白血病或淋巴瘤。
实施方案62.如实施方案57-60中任一项所述的方法，其中所述血液学癌症是多发性骨髓瘤。
实施方案63.一种治疗有需要的对象的血液学癌症的方法，其包括向所述对象施用白细胞，其中所述白细胞包含如实施方案1-56中任一项所述的黏液瘤病毒。
实施方案64.如实施方案63所述的方法，其还包括将所述黏液瘤病毒离体吸附到所述白细胞的表面上。
实施方案65.如实施方案64所述的方法，其中将所述黏液瘤病毒吸附到所述白细胞的所述表面上包括在允许所述黏液瘤病毒与所述白细胞的所述表面结合的条件下将所述白细胞暴露于所述黏液瘤病毒。
实施方案66.如实施方案64或实施方案65所述的方法，其中将所述黏液瘤病毒暴露于所述白细胞至少五分钟。
实施方案67.如实施方案64或实施方案65所述的方法，其中将所述黏液瘤病毒暴露于所述白细胞约一小时。
实施方案68.如实施方案64-67中任一项所述的方法，其中在约0.001与1000之间的感染复数(MOI)下将所述黏液瘤病毒暴露于所述白细胞。
实施方案69.如实施方案64-67中任一项所述的方法，其中在约0.1与10之间的感染复数(MOI)下将所述黏液瘤病毒暴露于所述白细胞。
实施方案70.如实施方案63-69中任一项所述的方法，其中所述白细胞从外周血获得。
实施方案71.如实施方案63-69中任一项所述的方法，其中所述白细胞从骨髓获得。
实施方案72.如实施方案63-69中任一项所述的方法，其中所述白细胞是外周血单核细胞。
实施方案73.如实施方案63-72中任一项所述的方法，其中所述白细胞从所述对象获得。
实施方案74.如实施方案63-73中任一项所述的方法，其中所述白细胞从相对于所述对象HLA匹配、HLA不匹配、单倍体相合或其组合的供体获得。
实施方案75.如实施方案63-74中任一项所述的方法，其中所述白细胞在药物组合物中施用。
实施方案76.如实施方案63-75中任一项所述的方法，其中所述白细胞全身施用。
实施方案77.如实施方案63-76中任一项所述的方法，其中所述白细胞肠胃外施用。
实施方案78.如实施方案63-77中任一项所述的方法，其中所述白细胞经输注施用。

Claims (50)

1.一种黏液瘤病毒(MYXV)，其包含编码多特异性免疫细胞接合器的转基因。
2.如权利要求1所述的MYXV，其中所述多特异性免疫细胞接合器包括双特异性自然杀伤细胞和嗜中性粒细胞接合器(BiKE)、双特异性T细胞接合器(BiTE)或膜整合T细胞接合器(MiTE)。
3.如权利要求1或2所述的MYXV，其中所述多特异性免疫细胞接合器与血液学癌细胞上存在的抗原结合。
4.如权利要求3所述的MYXV，其中所述血液学癌细胞是骨髓瘤细胞、白血病细胞或淋巴瘤细胞。
5.如权利要求2所述的MYXV，其中所述BiKE与自然杀伤细胞或嗜中性粒细胞上存在的抗原结合。
6.如权利要求2所述的MYXV，其中所述BiTE与T细胞上存在的抗原结合。
7.如权利要求2所述的MYXV，其中所述MiTE与T细胞上存在的抗原结合。
8.如权利要求2-7中任一项所述的MYXV，其中所述BiKE与CD16或CD138结合。
9.如权利要求2-8中任一项所述的MYXV，其中所述BiKE与CD16和CD138结合。
10.如权利要求2-8中任一项所述的MYXV，其中所述BiTE与CD3或CD138结合。
11.如权利要求2-8中任一项所述的MYXV，其中所述BiTE与CD3和CD138结合。
12.如权利要求2-8中任一项所述的MYXV，其中MiTE与CD3或CD138结合。
13.如权利要求2-8中任一项所述的MYXV，其中MiTE与CD3和CD138结合。
14.如权利要求1-13中任一项所述的MYXV，其中所述多特异性免疫细胞接合器包含一个或多个源自抗人CD抗体的单链可变片段(scFv)。
15.如权利要求1-13中任一项所述的MYXV，其中所述多特异性免疫细胞接合器包含一个或多个人源化单链可变片段(scFv)。
16.如权利要求2-15中任一项所述的MYXV，其中所述BiKE包含与SEQ ID NO:4-21中的任一个至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的序列。
17.如权利要求2-15中任一项所述的MYXV，其中所述BiTE包含与SEQ ID NO:6、7、10-15或32-39中的任一个至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的序列。
18.如权利要求2-15中任一项所述的MYXV，其中所述MiTE包含与SEQ ID NO:6、7、10-15或32-39中的任一个至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的序列。
19.如权利要求1-18中任一项所述的MYXV，其中所述转基因位于所述MYXV的基因组的M135基因与M136基因之间。
20.如权利要求1-19中任一项所述的MYXV，其还包含报告基因。
21.如权利要求20所述的MYXV，其中所述报告基因编码荧光蛋白。
22.如权利要求20所述的MYXV，其中所述报告基因编码发光底物或酶。
23.如权利要求1-22中任一项所述的MYXV，其还包含所述MYXV的基因组中的突变。
24.如权利要求23所述的MYXV，其中所述突变存在于选自以下的一个或多个基因中：M001R、M002R、M003.1R、M003.2R、M004.1R、M004R、M005R、M006R、M007R、M008.1R、M008R、M009L、M013、M036L、M063L、M11L、M128L、M131R、M135R、M136R、M141R、M148R、M151R、M152R、M153R、M154L、M156R、M-T2、M-T4、M-T5、M-T7和SOD。
25.如权利要求23或24所述的MYXV，其中所述突变是缺失。
26.如权利要求25所述的MYXV，其中所述缺失使M135R的至少一部分缺失。
27.如权利要求1-26中任一项所述的MYXV，其中如通过体外流式细胞术测定确定的，与缺乏所述转基因的MYXV相比，所述MYXV使对经感染的癌细胞的杀伤增加至少5％。
28.如权利要求1-27中任一项所述的MYXV，其中如通过体外流式细胞术测定确定的，与缺乏所述转基因的MYXV相比，所述MYXV使对未感染的癌细胞的杀伤增加至少5％。
29.一种组合物，其包含如权利要求1-28中任一项所述的MYXV和药学上可接受的载体。
30.一种治疗有需要的对象的血液学癌症的方法，其包括向所述对象施用如权利要求1-28中任一项所述的MYXV或如权利要求29所述的组合物。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述对象是人。
32.如权利要求30或31所述的方法，其中所述MYXV能够感染具有先天性抗病毒应答缺陷的细胞。
33.如权利要求30-32中任一项所述的方法，其中所述MYXV能够感染癌细胞。
34.如权利要求30-33中任一项所述的方法，其中所述血液学癌症是骨髓瘤、多发性骨髓瘤、白血病或淋巴瘤。
35.一种治疗有需要的对象的血液学癌症的方法，其包括向所述对象施用白细胞，其中所述白细胞包含如权利要求1-28中任一项所述的MYXV或与如权利要求1-28中任一项所述的MYXV缔合。
36.如权利要求35所述的方法，其还包括将所述MYXV离体吸附到所述白细胞的表面上。
37.如权利要求36所述的方法，其中将所述MYXV吸附到所述白细胞的所述表面上包括在允许所述MYXV与所述白细胞的所述表面结合的条件下将所述白细胞暴露于所述MYXV。
38.如权利要求36或37所述的方法，其中所述吸附包括将所述白细胞暴露于所述MYXV至少五分钟。
39.如权利要求36或37所述的方法，其中吸附包括将所述白细胞暴露于所述MYXV约一小时。
40.如权利要求36-39中任一项所述的方法，其中所述吸附包括在约0.001与1000之间的感染复数(MOI)下将所述白细胞暴露于所述MYXV。
41.如权利要求36-39中任一项所述的方法，其中所述吸附包括在约0.1与10之间的感染复数(MOI)下将所述白细胞暴露于所述MYXV。
42.如权利要求36-41中任一项所述的方法，其中所述白细胞从外周血获得。
43.如权利要求36-42中任一项所述的方法，其中所述白细胞从骨髓获得。
44.如权利要求36-42中任一项所述的方法，其中所述白细胞是外周血单核细胞。
45.如权利要求36-44中任一项所述的方法，其中所述白细胞从所述对象的组织获得。
46.如权利要求36-44中任一项所述的方法，其中所述白细胞从相对于所述对象HLA匹配、HLA不匹配、单倍体相合或其组合的供体的组织获得。
47.如权利要求36-46中任一项所述的方法，其中所述白细胞被配制在药物组合物中。
48.如权利要求36-47中任一项所述的方法，其中所述白细胞全身施用。
49.如权利要求36-47中任一项所述的方法，其中所述白细胞肠胃外施用。
50.如权利要求36-47中任一项所述的方法，其中所述白细胞静脉内施用。
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