ES2671728T3

ES2671728T3 - Medicamento de combinación que comprende IL-12 y un agente para el bloqueo de moléculas inhibidoras de linfocitos T para terapia tumoral

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Publication number: ES2671728T3
Application number: ES12780684.2T
Authority: ES
Inventors: Burkhard. BECHER; Johannes. VOM BERG
Original assignee: Universitaet Zuerich
Current assignee: Universitaet Zuerich
Priority date: 2011-10-11
Filing date: 2012-10-10
Publication date: 2018-06-08
Anticipated expiration: 2032-10-10
Also published as: US20150017121A1; AU2012322999A1; EP3351261A1; ES2888249T3; JP2015505813A; JP2020200346A; JP2018197247A; JP7214238B2; EP2766035A1; CA2850575C; CA3101783C; JP2023025195A; JP6489353B2; AU2017206231A1; JP7110023B2; PL3351261T3; AU2017206231B2; WO2013053775A1; AU2012322999B2; EP3351261B1

Abstract

Un medicamento de combinación, que comprende - un polipéptido de IL-12, o un vector de expresión de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica dicho polipéptido de IL-12, y - un ligando no agonista de CTLA-4 seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo y una molécula de tipo anticuerpo, en donde dicho ligando no agonista de CTLA-4 es capaz de unirse a CTLA-4 con una constante de disociación de al menos 10-7 M-1, y en donde dicho ligando no agonista de CTLA-4 se proporciona como una forma de dosificación para una administración sistémica, para su uso en la terapia de una neoplasia maligna, en donde - dicho polipéptido de IL-12 o dicho vector de expresión de ácido nucleico se proporcionan mediante la administración en un tumor, en las proximidades de un tumor o en el nódulo linfático asociado a un tumor.

Description

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DESCRIPCION

Medicamento de combinación que comprende IL-12 y un agente para el bloqueo de moléculas inhibidoras de linfocitos T para terapia tumoral

La presente invención, tal como se define en las presentes reivindicaciones, se refiere a composiciones y a métodos para tratar cáncer, en particular, a inmunoterapia de neoplasias malignas tales como glioma, mediante la administración de una dosis eficaz de un polipéptido con actividad biológica de IL-12 y un ligando no agonista de una CTLA-4.

El glioblastoma multiforme (GBM) es el tumor astrocítico más maligno. El GBM presenta un patrón de crecimiento invasivo y destructor; es el tumor cerebral primario maligno más común y más agresivo en seres humanos, que representa el 20 % de todos los tumores intracraneales. En la mayoría de los países europeos y en América del Norte, la frecuencia de GBM está en el intervalo de 3-3,5 casos nuevos por 100.000 habitantes al año. La historia clínica de la enfermedad es normalmente corta (menos de 3 meses en más del 50 % de los casos) y los pacientes diagnosticados con GBM presentan una supervivencia media de 14-18 meses, a pesar de la cirugía invasiva, de la radiación y de la quimioterapia. La capacidad de los gliomas para resistir a regímenes de tratamiento convencionales es uno de los mayores retos de la neurooncología moderna.

La interleucina (IL)-12 es el prototipo de un grupo de citocinas heterodiméricas con propiedades predominantemente inflamatorias. La IL-12 polariza a los linfocitos T colaboradores que no se han expuesto previamente (naive) para que adopte un fenotipo TH1 y estimula a los linfocitos T citotóxicos y a las células NK. La IL-12 se une al receptor de IL-12 (IL-12R) que es un receptor heterodimérico formado por IL-12R-p1 e IL-12R-p2. El complejo del receptor se expresa principalmente por los linfocitos T, pero también se ha descubierto que otras subpoblaciones de linfocitos son sensibles a IL-12.

Se ha sugerido la aplicación terapéutica de IL-12 en diversas en diversas entidades tumorales. Los ensayos clínicos en pacientes de cáncer, sin embargo, se tuvieron que detener debido a que la aplicación sistémica provocó diversos acontecimientos adversos a dosis eficaces, incluyendo víctimas mortales. Aunque la investigación en los últimos años se ha centrado principalmente en diversas vías de administración de IL-12, aún permanecen abiertas cuestiones sobre el mecanismo exacto mediante el cual IL-12 ejerce sus propiedades supresoras de tumores.

CTLA-4 y PD-1 son ambos miembros de la extensa familia CD28/CTLA-4 de linfocitos T reguladores. PD-1 se expresa sobre la superficie de linfocitos B, macrófagos y linfocitos T activados. PD-1(CD279; Uniprot Q15116) tiene dos ligandos, PD-L1 (B7-H1, CD274) y PD-L2 (B7-DC, CD273), que son miembros de la familia b7.

CTLA-4 (N.° de ID de Uniprot P16410) se expresa sobre la superficie de linfocitos T colaboradores y transmite una señal inhibidora a los linfocitos T. CTLA-4 y CD28 se unen a CD80 (B7-1) y CD86 (B7-2) sobre las células presentadoras de antígeno. CTLA-4 transmite una señal inhibidora para linfocitos T, mientras que CD28 transmite una señal estimuladora. El tratamiento sistémico anti-CTLA-4 se ha aprobado para uso clínico y demuestra un beneficio clínico. Se está ensayando adicionalmente para otros diversos cánceres sólidos (Hodi et al., N Engl J Med 363, 711-723 (2010); Graziani et al., Pharmacol Res (2012) Ene;65(1):9-22). Está disponible un anticuerpo comercial contra CTLA-4 con el nombre genérico de ipilimumab (comercializado como Yervoy).

La glucoproteína inmunoglobulina G (IgG) es una molécula efectora principal de la respuesta inmunitaria humoral en el ser humano. Hay cuatro subgrupos distintos de IgG humana, denominados IgG1, IgG2, IgG3 y IgG4. Las cuatro subclases presentan más del 95 % de homología en las secuencias de aminoácidos de los dominios constantes de las cadenas pesadas, pero difieren con respecto a la estructura y a la flexibilidad de la región bisagra, especialmente en el número de enlaces disulfuro intercatenarios de cadenas pesadas en este dominio. Las diferencias estructurales entre las subclases de IgG también se reflejan en su susceptibilidad a enzimas proteolíticas, tales como papaína, plasmina, tripsina y pepsina.

Solo se conoce una isoforma de IgG4 humana. Al contrario de la IgG1, la IgG2 y la IgG3 humanas, la IgG4 humana no activa el complemento. Además, la IgG4 es menos susceptible a enzimas proteolíticas en comparación con la IgG2 y la IgG3.

El problema subyacente de la presente invención es la provisión de medios mejorados y de métodos para tratar el cáncer sólido, en particular, glioma.

En el trascurso de un estudio centrado en el potencial terapéutico clínico de IL-12 en GBM de etapa avanzada en un modelo de roedores relevante, sorprendentemente se descubrió que la combinación de IL-12 con un bloqueo de señales co-inhibidoras con anticuerpo anti-CTLA-4 lleva a la erradicación casi completa del tumor y a la cura incluso en etapas avanzadas de la enfermedad.

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un medicamento de combinación para su uso en la terapia de tumores sólidos, en particular, de tumores cerebrales, en particular, glioma, que comprende

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- un polipéptido de IL-12, o un vector de expresión de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica dicho polipéptido de IL-12, y

- un ligando no agonista de CTLA-4

en donde el polipéptido de IL-12 o el vector de expresión de ácido nucleico, se proporciona mediante la administración en un tumor, en las proximidades de un tumor, o en el nódulo linfático asociado con un tumor.

En el contexto de la presente invención, un polipéptido de IL-12 es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de p35 (ID de Uniprot 29459, SEQ iD 05) o un homólogo funcional del mismo, y que comprende la secuencia de p40 (ID de Uniprot 29460, SEQ ID 06) o un homólogo funcional del mismo. En una realización, el polipéptido de IL-12 tiene una secuencia de aminoácidos que comprende tanto secuencias de p35 como de p40 u homólogos de los mismos como parte de la misma cadena continua de aminoácidos. En otra realización, el polipéptido de IL-12 comprende dos cadenas de aminoácidos diferentes, una que comprende la secuencia de p35 y la otra que comprende la secuencia de p40. La terminología "polipéptido de IL-12" no excluye la presencia de secuencias que no son de IL-12, por ejemplo, secuencias de inmunoglobulina y fragmentos de la misma, fusionadas con las secuencias de IL-12 descritas en el presente documento.

El polipéptido de IL-12 tiene una actividad biológica de IL-12. Una actividad biológica de IL-12 en el contexto de la presente invención es la estimulación de células NK o de linfocitos T por dicho polipéptido de IL-12, más notoriamente la estimulación de linfocitos T efectores que actúan a través de perforina.

En una realización del medicamento de combinación, dicho polipéptido de IL-12 comprende una secuencia de polipéptido al menos el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a la secuencia de p35 humana (SEQ ID 05) y una secuencia de polipéptido al menos el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a la secuencia de p40 humana (SEQ ID 06).

La identidad en el contexto de la presente invención es un único parámetro cuantitativo que representa el resultado de una comparación de secuencia posición por posición. Los métodos de comparación de secuencia son conocidos en la materia; el algoritmo BLAST públicamente disponible es un ejemplo.

En una realización, dicho polipéptido de IL-12 es una IL-12 humana recombinante. En una realización, dicho polipéptido de IL-12 es una IL-12 humana sintética. En una realización, dicho polipéptido de IL-12 es un péptido de fusión que comprende el fragmento cristalizable (región Fc) de una inmunoglobulina humana. De acuerdo con una realización, el polipéptido IL-12 comprende un fragmento cristalizable de inmunoglobulina G humana. Un fragmento cristalizable en el contexto de la presente invención se refiere al segundo y tercer dominio constante de la molécula IgG. La región cristalizable del fragmento (región Fc) es la región de la cola de un anticuerpo de inmunoglobulina que interactúa con los receptores de superficie celular (receptores Fc) y proteínas del sistema del complemento. En isotipos de anticuerpo IgG, la región Fc está compuesta de dos fragmentos de proteína idénticos, que provienen del segundo y tercer dominio constante de las dos cadenas pesadas de anticuerpo.

De acuerdo con una realización, el polipéptido IL-12 comprende un fragmento cristalizable de inmunoglobulina humana G4. De acuerdo con una realización, el polipéptido de IL-12 tiene o comprende la secuencia de la SEQ ID 01. De acuerdo con otra realización, el polipéptido de lL-12 comprende una secuencia al menos el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a la secuencia de la SEQ ID 01.

Las realizaciones en las que las cadenas del polipéptido de IL-12 están fusionadas a fragmentos Fc de inmunoglobulina muestran diferentes comportamientos farmacocinéticos en comparación con la citocina recombinante, que para algunas aplicaciones puede conferir un beneficio.

En una realización, el componente del polipéptido de IL-12 del medicamento de combinación se proporciona como una forma de dosificación para la administración o el suministro local (intratumoral). Tal forma de dosificación para la administración local (intratumoral) puede ser una forma de liberación lenta o una forma de liberación prolongada, a partir de la cual se libera dicha IL-12 durante una serie de horas a semanas. En una realización, el componente del polipéptido de IL-12 del medicamento de combinación se administra por administración mejorada por convección (CED, del inglés convection enhaced delivery) o una variación de la misma, por ejemplo, el dispositivo mostrado en el documento US2011137289 (A1).

En una realización, el polipéptido de IL-12 se administra sistémicamente junto con el bloqueo sistémico de CTLA-4. La IL-12 recombinante heterodimérica (peprotech) aplicada sistémicamente junto con el bloqueo sistémico de CTLA- 4 (i.p.) logró una mejora significativa en la supervivencia en comparación con cualquier agente administrado por sí mismo (véase la Fig. 11).

En el contexto de la presente invención, un ligando no agonista de CTLA-4 es una molécula que se une de manera selectiva a CTLA-4 en condiciones que prevalecen en la sangre periférica, sin desencadenar el efecto biológico de la interacción de CTLA-4 con cualquiera de los ligandos fisiológicos de CTLA-4, en particular, CD80 y/o CD86.

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Un ligando no agonista de CTLA-4 en el sentido de la invención se refiere a una molécula que es capaz de unirse a

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CTLA-4 con una constante de disociación de al menos 10 M , 10 M o 10 M y que inhibe la actividad biológica de su respectiva diana.

Un ligando no agonista del polipéptido puede ser un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una molécula de tipo anticuerpo o un oligopéptido, cualquiera de los cuales se une a y por lo tanto inhibe CTLA-4.

Un fragmento de anticuerpo puede ser un dominio Fab o un dominio Fv de un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo de cadena simple, que es una proteína de fusión que consiste en las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo conectado mediante un enlazador peptídico. El inhibidor también puede ser un anticuerpo de dominio único, que consiste en un dominio variable aislado de una cadena pesada o ligera. Adicionalmente, un anticuerpo también puede ser un anticuerpo de cadena pesada que consiste solo en cadenas pesadas tales como los anticuerpos hallados en camélidos. Una molécula de tipo anticuerpo puede ser una proteína de repetición, tal como una proteína de repetición de ankyrina diseñada (Molecular Partners, Zurich).

Un oligopéptido de acuerdo con el aspecto anterior de la invención puede ser un péptido que proviene del sitio de reconocimiento de un ligando fisiológico de CTLA-4. Tal ligando de oligopéptido compite con el ligando fisiológico por la unión a CTLA-4.

En particular, un ligando no agonista de CTLA-4 no lleva a una actividad atenuada de linfocitos T cuando se une a CTLA-4 en la superficie de un linfocito T. En determinadas realizaciones, la expresión "ligando no agonista de CTLA- 4" abarca tanto antagonistas de CTLA-4 como ligandos que son neutros ante la señalización de CTLA-4. En algunas realizaciones, los ligandos no agonistas de CTLA-4 usados en la presente invención son capaces, cuando se unen a CTLA-4, de bloquear de manera estérica la interacción de CTLA-4 con sus compañeros de unión CD80 y/o CD86.

En una realización, dicho ligando no agonista de CTLA-4 es una gamma inmunoglobulina que se une a CTLA-4, sin desencadenar la respuesta fisiológica de la interacción de CTLA-4 con sus compañeros de unión CD80 y/o CD86.

Los ejemplos no limitantes para un ligando de CTLA-4 son los anticuerpos aprobados clínicamente tremelimumab (CAS 745013-59-6) e ipilimumab (CAS N.° 477202-00-9; Yervoy).

El término "gamma inmunoglobulina" en este contexto pretende abarcar tanto moléculas de inmunoglobulinas completas como fragmentos funcionales de las mismas, en donde la función es la unión a CTLA-4, PD-1 o PD-L1 (PD-L2) tal como se describe anteriormente.

La terapia de combinación comprende dos formas de dosificación diferentes, en donde dicho polipéptido de IL-12 se proporciona como una forma de dosificación para la administración intratumoral o la administración local en las proximidades del tumor, y dicho ligando no agonista de CTLA-4 se proporciona como una forma de dosificación para la administración sistémica, particularmente mediante inyección intravenosa. Sin embargo, dicho ligando no agonista de CTLA-4 también se puede aplicar localmente del mismo modo que el polipéptido de IL-12. De acuerdo con otra realización, el polipéptido de IL-12 se aplica directamente al nódulo linfático que drena el tumor.

De acuerdo con otra realización, la terapia de combinación comprende una forma de dosificación mediante la cual dicho polipéptido de IL-12 se proporciona para la administración intracraneal, por ejemplo, mediante inyección.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un medicamento de combinación tal como se expone anteriormente, para su uso en un método de terapia de una neoplasia maligna, en particular, lesiones de cáncer sólido. En una realización, la neoplasia maligna es glioma. En una realización, la neoplasia maligna es un tumor cerebral secundario (metástasis cerebral de una lesión neoplásica que se origina fuera del cerebro). En una realización, la enfermedad es glioblastoma multiforme. En una realización, la neoplasia maligna es meningioma. En una realización, la neoplasia maligna es melanoma. En una realización, la neoplasia maligna es cáncer de páncreas. En una realización, la neoplasia maligna es cáncer de pulmón. En una realización, la neoplasia maligna es cáncer de próstata. En una realización, la neoplasia maligna es cáncer de vejiga.

Las lesiones cancerosas son propensas a expandirse en el tejido próximo, así como en distintas localizaciones en el cuerpo, dependiendo de su origen. El 20-40 % de todos los cánceres desarrollan metástasis cerebral; entre ellos, el cáncer de mama y de piel (melanoma) son las fuentes más comunes de metástasis cerebral (Sofietti et al., J Neurol 249, 1357-1369 (2002)). De manera similar a los tumores cerebrales malignos primarios, las metástasis cerebrales tienen un pronóstico malo a pesar del tratamiento y son rápidamente letales. Los linfocitos T son la población de células efectoras cruciales para el rechazo del tumor mediado por IL-12 en el cerebro. El tratamiento de combinación de IL-12 junto con anti-CTLA-4, anti-PD-1, anti-PD-L1 o anti-PD-L2 se dirige especialmente a los linfocitos T para activarlos y repolarizarlos. Dado que la metástasis cerebral crece en el mismo compartimento inmunológico que los tumores cerebrales primarios, los pacientes que padecen tumores cerebrales secundarios también se benefician del tratamiento de combinación.

En una realización, el medicamento de combinación comprende un polipéptido de IL-12 que tiene una actividad

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biológica de IL-12 proporcionada como una proteína de fusión que comprende el aminoácido de la p40 humana, la secuencia de aminoácidos de la p35 humana y el fragmento cristalizable de la IgG4 humana, formulando dicho polipéptido de IL-12 como una forma de dosificación para la administración intratumoral. De acuerdo con esta realización, el medicamento de combinación comprende adicionalmente una inmunoglobulina G generada contra CTLA-4 como un ligando no agonista de CTLA-4 formulado como una forma de dosificación para administración sistémica. De acuerdo con esta realización, el medicamento de combinación se proporciona para el tratamiento de neoplasias malignas, en particular, de glioma, glioblastoma multiforme, meningioma, melanoma, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de próstata o cáncer de vejiga.

De acuerdo con una alternativa de la invención, una terapia de combinación comprende un vector de expresión de ácido nucleico de IL-12 que codifica un polipéptido de IL-12 codificado que tiene una actividad biológica de IL-12 y un ligando no agonista de CTLA-4.

El ligando de CTLA-4 puede estar realizado por polipéptidos, en particular, por anticuerpos, tal como se expone anteriormente. Un ejemplo no limitante para un polipéptido de IL-12 codificado es un fragmento cristalizable de inmunoglobulina G fusionado a las cadenas de polipéptidos constituyentes de IL-12, IL-12 humana o un equivalente funcional de las mismas. Un ejemplo no limitante es una construcción de fusión que tiene los polipéptidos constituyentes de IL-12 enlazados por una secuencia de aminoácidos corta tal como se representa en la Fig. 1, cuya secuencia de aminoácidos se da como SEQ ID 01 y la secuencia codificante de ácido nucleico se da como SEQ ID 07.

La ventaja de usar proteínas de fusión de citocinas y el fragmento cristalizable de las inmunoglobulinas en lugar de la citocina recombinante es una farmacocinética mejorada (Belladonna et al. J Immunol 168, 5448-5454 (2002); Schmidt, Curr Opin Drug Discov Devel 12, 284-295 (2009); Eisenring et al., Nat Immunol 11, 1030-1038 (2010)).

El vector de expresión de ácido nucleico de IL-12 de acuerdo con este aspecto de la invención puede, a modo de ejemplo no limitante, ser un plásmido de expresión de ADN "desnudo" que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de IL-12 bajo el control de una secuencia promotora operable en una célula tumoral humana, para la administración en el tumor, por ejemplo, mediante inyección intracraneal. El vector de expresión de ácido nucleico de IL-12 puede ser de manera similar un vector vírico, por ejemplo, un virus adenoasociado, un adenovirus, un lentivirus o un virus herpes.

Tal vector de expresión de ácido nucleico de IL-12 se puede proporcionar como una forma de dosificación para la administración intratumoral en combinación con un ligando proteico no agonista de CTLA-4 y/o un ligando no agonista de PD-1 tal como se expone anteriormente. De manera similar, el alcance de la presente invención abarca el uso de tal vector de expresión de ácido nucleico de IL-12, en combinación con un ligando no agonista de CTLA-4, en un método para preparar un medicamento de combinación para su uso en terapia de neoplasia maligna, en particular, glioma, glioblastoma multiforme, meningioma, melanoma, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de próstata o cáncer de vejiga. Asimismo, se proporciona un método para tratar a un paciente que padece de neoplasia maligna, en particular, glioma u otro tumor de tejido sólido, que comprende la administración de un vector de expresión de ácido nucleico de IL-12 que tiene una actividad biológica de IL-12, y un ligando no agonista de CTLA-4 y/o un ligando no agonista de PD-1 para dicho paciente.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1a muestra la estructura y secuencia de la proteína de fusión dada en la SEQ ID 01. Las subunidades p40 y p35 de IL-12 se representan como rectángulos. Estas subunidades se conectan mediante un enlazador (G4S)3. Las subunidades CH2, CH3 y los seis últimos aminoácidos de CH1 del fragmento cristalizable de la inmunoglobulina se muestran como círculos oblongos.

Fig. 1b muestra la proteína de fusión dada en la SEQ ID 01, la imagen de la izquierda muestra una inmunotransferencia usando condiciones reductoras, desarrollada con un anticuerpo policlonal anti-Fc humano acoplado con HRP, la imagen de la derecha muestra una tinción de plata de la proteína de fusión en condiciones no reductoras (DTT -) y en condiciones reductoras (DTT+)

Fig. 1c muestra la producción de IFN-y en monocitos de sangre periférica humana (PBMC) tal como se evalúa mediante el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Las células se estimularon bien con IL- 12 humana recombinante heterodimérica comercialmente disponible (rhIL-12) o con la proteína de fusión purificada dada SEQ ID 01 (hIL-12Fc) en presencia de un anticuerpo dirigido contra CD3 (estimulación de linfocitos T policlonales). Sin estímulo: sin estimulación de IL-12 ni estimulación de anti-CD3 (control de valores iniciales). El experimento se realizó por triplicado, las barras de error denotan datos de e.e.m. representativos de tres experimentos independientes

Fig. 2 muestra la inmunohistoquímica de secciones tumorales fijadas con formalina obtenidas a partir de ratones singénicos C57/BI6 5 semanas tras la exposición con 2x104 células GI261 IL-12Fc o GI261 Fc y teñidas con anticuerpo contra F4/80, tinción de contraste de hematoxilina (ejemplos representativos, n=6 ratones

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por grupo). La barra de escala indica 2 mm, la punta de la flecha indica el tumor residual GI261 IL-12Fc (SEQ ID 02).

muestra la obtención de imágenes de bioluminiscencia no invasiva (BLI) de glioma de ratones en ratones C57/BI6 singénicos (n = 5-6 ratones por grupo) tras la implantación de 2x104células Gl261 que expresan de manera constitutiva luciferasa de photinuspyralis y que libera una proteína de fusión de IL-12 y el fragmento cristalizable de inmunoglobulina G3 de ratón (GI261 IL-12Fc, (SEQ ID 02)) o solo Fc como control (GI261 Fc). Panel superior: Cuantificación de crecimiento tumoral que se correlaciona con el flujo de fotones (f/s) en la región de interés (RDI) frente a los días tras la inyección de las células de glioma modificadas. Panel inferior: Análisis de supervivencia de Kaplan-Meier. Los datos son representativos de 2 experimentos independientes.

muestra la obtención de imágenes de bioluminiscencia no invasiva (BLI) de glioma de ratones en animales de TS y diferentes ratones mutantes (n = 5-7 ratones por grupo) tras la implantación de 2x104 células Gl261 que expresan de manera constitutiva luciferasa de photinuspyralis y que libera una proteína de fusión de IL-12 y el fragmento cristalizable de inmunoglobulina G3 de ratón (GI261 IL-12Fc, (SEQ ID 02)). Panel superior: Cuantificación del crecimiento tumoral mediante obtención de imágenes por BLI frente a los días tras la inyección de las células de glioma modificadas. Panel inferior: Análisis de supervivencia de Kaplan-Meier. A) se implantaron GI261 IL-12Fc en ratones que carecen de linfocitos T y de linfocitos B (Rag1-/-) o de células NK (II-5ra'-') o que carecen tanto de linfocitos T como de linfocitos B y de células NK y de células de tipo inductor de tejido linfoide (Rag2-/- II2rg-/-). B) se implantaron GI261 IL- 12Fc en ratones deficientes para el MHCII (Ia(b)~'~) y el MHCI (p2m'/').(n=5-8 ratones/grupo), que carecen de linfocitos T CD4 o CD8 positivos, respectivamente. Los datos son representativos de 2 experimentos independientes.

muestra la formación de linfocitos T de memoria en animales de ts supervivientes que se han expuesto previamente a células 2x104 GI261 IL-12Fc (SEQ ID 02). Se muestran los ejemplos de bioluminiscencia emitida a partir de los cerebros de animales de ts supervivientes que se han vuelto a exponer a células Gl261 Fc en comparación con los animales de ts sin exposición previa (panel superior, días 1, 7 y 21 tas la reexposición). Además, se muestra la bioluminiscencia de los tumores en fotones por segundo (f/s) en la región de interés (RDI) frente a los días tras la inyección de las células de glioma modificadas (panel inferior). Se observó un rechazo rápido de los tumores de control en los animales de ts supervivientes. Mientras que la luminiscencia medida el día 1 sugirió una metástasis idéntica en los dos grupos, solo los ratones sin exposición previa presentaron una señal medible el día 7 en adelante, lo que sugiere una respuesta de memoria anti-glioma de eliminación rápida y eficaz ahora independiente de citocinas proinflamatorias expresadas ectópicamente(es decir, iL- 12Fc, (SEQ ID 02)).(n=4-6 ratones/grupo). Los datos son representativos de 2 experimentos independientes.

muestra la obtención de imágenes de bioluminiscencia no invasiva (BLI) de glioma de ratones en diferentes ratones mutantes (n = 4-8 ratones por grupo) tras la implantación de 2x104 células Gl261 Fc que expresan de manera constitutiva luciferasa de photinuspyralis y que libera una proteína de fusión de IL-12 y el fragmento cristalizable de inmunoglobulina G3 de ratón (GI261 IL-12Fc (SEQ ID 02)). A) animales de ts (círculos blancos) y IFNy-/- (círculos negros) B) animales de ts (círculos blancos) y Perforina-/- (círculos negros). Se muestra la cuantificación de crecimiento tumoral que se correlaciona con el flujo de fotones (f/s) en la región de interés (RDI) frente a los días tras la inyección de las células de glioma modificadas (panel superior). Panel inferior: Análisis de supervivencia de Kaplan-Meier. Los datos son representativos de 2 experimentos independientes.

muestra el crecimiento tumoral en ratones de ts inoculados con 2x104 células GI261 Fc. El tratamiento comenzó el día 21 (flechas). Se implantaron en los animales portadores de glioma las minibombas osmóticas que administran IL-12Fc (SEQ ID 02) (o PBS). Los animales recibieron inyecciones por vía i.p. de anticuerpos que bloquean aCTLA-4 o de PBS comenzando el día 22, seguido de inyecciones tal como se indica en la figura. Gráfico superior: cuantificación del flujo de protones en la RDI de animales de ts portadores de tumor que recibieron el tratamiento indicado. Gráfico inferior: análisis de supervivencia de Kaplan-Meier de los animales anteriores; PBS/PBS frente a IL-12Fc/aCTLA-4 p=0,0045, PBS/PBS frente a IL-12Fc/PBS p=0,3435, PBS/ aCTLA4 frente a IL-12Fc/aCTLA-4 p=0,0101; Test de Log-rank (Mantel- Cox). Datos representativos de tres experimentos independientes con 2-5 animales por grupo

muestra la inmunohistoquímica de secciones tumorales obtenidas de ratones singénicos C57/BI6 tras la exposición a células Gl261 Fc el día 21 y tras la administración local de IL-12Fc (SEQ ID 02) en combinación con el bloqueo sistémico de CTLA-4 tal como se describe en el Ejemplo 5. Las secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina. La barra de escala indica 2 mm.

muestra el crecimiento tumoral en ratones de ts inoculados con 2x104 células GI261 Fc. El tratamiento comenzó el día 21 (flechas). Se implantaron en los animales portadores de glioma las minibombas osmóticas que administran IL-12Fc (SEQ ID 02). Los animales recibieron inyecciones por vía i.p. de

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anticuerpos que bloquean aPD-1 o anticuerpos de isotipo de control comenzando el día 22, seguido de inyecciones tal como se indica en la figura. Gráfico superior: cuantificación del flujo de protones en la RDI de animales de ts portadores de tumor que recibieron el tratamiento indicado. Gráfico inferior: análisis de supervivencia de Kaplan-Meier de los animales anteriores; PBS/isotipo frente a IL-12Fc/aPD-1 p=0,0064, Test de Log-rank (Mantel-Cox). Datos representativos de un experimento con 5-6 animales por grupo.

Fig. 10 muestra el crecimiento en ratones de ts inoculados con células 50 B16-F10. El tratamiento comenzó el día 5 (flecha). Se implantaron en los animales portadores de glioma las minibombas osmóticas que administran IL-12Fc (SEQ ID 02). Los animales recibieron inyecciones por vía i.p. de anticuerpos que bloquean aCTLA-4 o de PBS comenzando el día 6, seguido de inyecciones tal como se indica en la figura. Análisis de supervivencia de Kaplan-Meier PBS/PBS frente a IL-12Fc/aCTLA-4 p=0,0028, Test de Log- rank (Mantel-Cox). Datos representativos de un experimento con 6 animales por grupo.

Fig. 11 muestra la administración sistémica de IL-12 heterodimérica recombinante en combinación con el bloqueo de CTLA4. Se inyectaron 2x104 células GI261 Fc en el cuerpo estriado derecho de ratones de ts y se siguió el tumor durante 90 días. Tratamiento sistémico: en el día 21 (flecha), los animales portadores de tumor se trataron inicialmente con 20 pg de IgG2b de ratón aCTLA-4 (9D9) (triángulos rellenos de gris claro, n=8), 200 ng de IL-12 heterodimérica recombinante (rIL-12) (triángulos rellenos de gris oscuro, n=9) o una combinación de ambos (triángulos rellenos de negro, n=9) por inyección intraperitoneal (i.p.). El grupo de control recibió solución salina tamponada con fosfato (PBS) (triángulos sin relleno, n=7). El tratamiento se mantuvo con 100 pg de aCTLA-4 o 100 ng de rIL-12 o una combinación de ambos 3 veces / semana hasta el final del experimento. Gráfico superior: cuantificación del flujo de protones en la RDI de animales de ts portadores de tumor que recibieron el tratamiento indicado. Gráfico inferior: análisis de supervivencia de Kaplan-Meier de los animales anteriores; Se usó un test Log-rank (Mantel-Cox) para calcular los p-valores indicados; datos agrupados de dos experimentos independientes.

Ejemplos

Métodos

Animales

Los ratones C57BL/6 se obtuvieron de Janvier; los ratones b2m-/-, Ia(b)-/-, II2rb2-/-, Rag1-/-, Rag2-/-II2rg-/-, Prf1-/- e Ifng- /- se obtuvieron de Jackson Laboratories. Los ratones II5ra'/' se proporcionaron por S. Bulfone-Paus. Todos los animales se mantuvieron enjaulados en condiciones específicas libres de patógenos con un ciclo de 12 horas de luz/oscuridad y con comida y agua a voluntad. Todos los experimentos con animales se aprobaron por la oficina veterinaria cantonal de Suiza (16/2009).

Líneas de células tumorales de ratón

Las células de glioma de murino C57/BI6 (GI261) (generosamente proporcionadas por A. Fontana, Inmunología Experimental, Universidad de Zurich) se transfectaron con pGI3-ctrl (Promega) y pGK-Puro (generosamente proporcionadas por T. Buch, Universidad Técnica, Munich). Las construcciones linealizadas se electroporaron en una proporción de 10:1 usando un multiporador de eppendorf, después se seleccionaron con 0,8 pg/ml de puromicina (Sigma-Aldrich) para generar células GI261 estables para luciferasa. Se aisló un único clon mediante dilución limitante y se pasó in vivo mediante inoculación de tumor intracraneal, seguido por la disociación del tumor tras 4 semanas y la reselección en 0,8 pg/ml de puromicina. Posteriormente, Las células se electroporaron con pCEP4-mIgG3, pCEP4-mll-12mlgG3 (SEQ ID 09) y pCEP4-mII-23mIgG3 (SEQ ID 08) (Eisenring et al, 2010) y se seleccionó la carga con 0,8 pg/ml de puromicina y 0,23 mg/ml de higromicina (Sigma-Aldrich). La producción de citocina se detectó mediante ELISA (OptEIA 11-12/23p40, BD Pharmingen) y rt-PCR (IgG3fw: ACACACAGCCTGGACGC (SEQ ID 03) IgG3rev: CATTTGAACTCCTTGCCCCT (SEQ ID 04)). las células GI261 y las líneas celulares derivadas se mantuvieron en medio Eagle modificado de Dulbecco (Gibco, Invitrogen) complementado con suero de ternera fetal al 10 % (FCS, del inglés fetal calf serum) en presencia de antibióticos de selección tal como se indica anteriormente a 37 °C y CO2 al 10 %. Las células de melanoma murino B16-F10 se obtuvieron de ATCC.

Expresión y purificación de IL-12Fc

La IL-12Fc (SEQ ID 02) se expresó en células 293T tras la transfección mediada por fosfato de calcio de acuerdo con los protocolos estándar con 45 pg de ADN vectorial (pCEP4-mIL-12IgG3, SEQ ID 09)/placa de cultivo tisular de 15 cm. El sobrenadante se recolectó 3 días y 6 días tras la transfección, se hizo un filtrado estéril y se diluyó a 1:1 en PBS. La proteína se purificó usando un purificador (ÁktaPrime) sobre una columna de proteína G (1 ml, HiTrap, GE Healthcare) eluida con 0,1 M de glicina a pH 2 y se dializó toda la noche en PBS a pH 7,4. La concentración y la pureza de IL-12Fc (SEQ ID 02) se midió mediante ELISA (OptEIA II-12/23p40, bD Pharmingen) y SDS-PAGE seguido por tinción de plata e inmunotransferencia. La IL-12Fc se detectó con un anticuerpo anti-IL12p40 de ratón en rata (C17.8, BioExpress) y un anticuerpo anti-rata en cabra acoplado a HRP (Jackson). Se usó el mismo

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procedimiento para la expresión de IL-12Fc humana (SEQ ID 01,07).

Caracterización de IL-12Fc humana

La concentración y la pureza de la IL-12Fc humana (SEQ ID 01) se midió mediante ELISA (IL-12 (p70 ) humana, Mabtech, n.° 2455-1H-6) y SDS-PAGE seguido por tinción de plata e inmunotransferencia. El marcador de IgG4 humana se detectó con un anticuerpo anti-IgG humana en cabra acoplado a HRP (n.° A0170, Sigma). Para la caracterización funcional de la IL-12Fc (SEQ ID 01), las PBMC, adquiridas de acuerdo con las directrices éticas de la Universidad de Zurich, se colocaron en placas a 100.000 células por pocillo en medio RPMI complementado con suero de ternera fetal (FCS) al 10 % en placas de 96 pocillos y se estimularon bien con IL-12 humana recombinante (Peprotech) o IL-12Fc humana (SEQ ID 01). Ambas citocinas se normalizaron entre sí de acuerdo con las concentraciones derivadas del ELISA de IL-12p70 humana (Mabtech, n.° 2455-1H-6). Las PBMC se estimularon en presencia de 1 pg/ml de un anticuerpo de IgG2a anti-CD3 humano en ratón (OKT3, Bio-X-cell). Tras dos días de cultivo en CO2 al 5 % y a 37 °C, el sobrenadante se cultivó y se sometió a un ELISA de anti-IFN-Y humano (Mabtech, n.° 3420-1H-6).

Inoculación de glioma ortotópico

En resumen, los ratones de 6-10 semanas de edad se inyectaron por vía i.p. con Fluniximin (Biokema, 5 mg/kg de peso corporal) antes de anestesiarlos con isoflurano al 3-5 % (Minrad) en una cámara de inducción. Se afeitaron sus cabezas con una maquinilla eléctrica. Tras montarlos en un marco estereotáctico (David Kopf instruments), se desinfectó el cuero cabelludo de los animales con solución de yodo al 10 % y se realizó una incisión en la piel a lo largo de la línea media. La anestesia en el marco estereotáctico se mantuvo al 3 % de isoflurano administrada a través de un adaptador nasal (David Kopf Instruments). Posteriormente, se montó una jeringa de extremo romo (Hamilton, 75N, 26s/2"/2, 5pl) sobre una bomba de microinyección sobre el brazo manipulador y se colocó a 1,5 mm lateral y a 1 mm frontal del bregma. La aguja se bajó al orificio de la fresa perforado manualmente a una profundidad de 4 mm por debajo de la superficie de la duramadre y se retrajo 1 mm para formar un pequeño reservorio. Usando la bomba de microinyección (UMP-3, World Precision Instruments Inc.) se inyectaron 2x104 células en un volumen de 2 pl a 1 pl/min. Tras dejar la aguja en el lugar durante 2 minutos, se retrajo a 1 mm/min. El orificio de la fresa se cerró con cera para huesos (Aesculap, Braun) y la herida del cuero cabelludo se selló con adhesivo tisular (Indermil, Henkel).

Obtención de imágenes bioluminiscentes in vivo

Los ratones que portan el tumor se pesaron cuidadosamente, se anestesiaron con isoflurano (2-3 %) y se inyectaron con D-Luciferina (150 mg/kg de peso corporal, CaliperLifesciences). Los animales se transfirieron a la cámara oscura de un sistema de obtención de imágenes Xenogen IVIS 100 (CaliperLifesciences), la anestesia se mantuvo al 2 % de isoflurano a través de conos nasales. La luminiscencia se registró 10 minutos después de la inyección. Los datos se analizaron posteriormente usando el programa informático Living Image 2.5 (CaliperLifesciences). Una región circular de interés (RDI; 1,46cm 0) se definió alrededor de la cabeza de los animales y el flujo de protones de esta región se leyó y se representó gráficamente.

Tratamiento de los gliomas establecidos

El d21 tras la implantación de las células de glioma, los animales que portan el tumor se distribuyeron de manera uniforme entre los grupos experimentales basándose en su flujo de fotones en RDI. Los animales con un flujo en la RDI de menos de 1x105 f/s se consideraron como no aceptores y se excluyeron. 40-48 horas antes de la implantación (2 días antes del comienzo del tratamiento), las bombas osmóticas (Modelo 2004, 0,25 pl/h; Alzet) se rellenaron con IL-12Fc de murino (SEQ ID 02, 8,33 ng/pl en PBS) o solo PBS y se cebaron a 37 °C en PBS. Inmediatamente antes de la cirugía, se inyectó a los ratones con Fluniximin por vía i.p. (Biokema, 5 mg/kg de peso corporal). Se anestesió a los ratones con isoflurano al 3-5 %, se desinfectó el cuerpo cabelludo y se realizó una incisión en la línea media. Se localizó el orificio de la fresa anterior de la inyección de glioma, se retiró la cera para hueso y el periostio y se colocó la bomba en una bolsa de piel formada en la espalda del animal. La cánula de infusión se bajó a través del orificio de la fresa 3 mm hacia el centro putativo del tumor. La cánula se conectó a la bomba (kit de infusión cerebral III 1-3 mm, Alzet) mediante un tubo de silicona y se mantuvo en su lugar con adhesivo de cianoacrilato. La piel se suturó con un hilo de nylon 4-0. Después de la cirugía, los ratones se trataron durante 3 días con Borgal al 0,1 % (v/v) (Intervet) en el agua que bebían. Las bombas se explantaron el día 49. Se inyectaron por vía i.p. cinco dosis de anticuerpos de IgG2b de ratón anti-CTLA-4 de ratón (clon 9D9, bio-X-cell; Peggs et al.; J Exp Med 206, 1717-1725 (2009)) o un volumen equivalente de PBS los días 22 (200 pg), 26 (100 pg), 29 (100 pg), 35 (100 pg) y 42 (100 pg).

Como alternativa, los animales recibieron IgG2a de rata anti-PD-1 de ratón (clon RMP1-14, bio-X-cell) o anticuerpos de control de isotipo IgG2a de rata (clon 2A3, bio-X-cell) para el experimento representado en la figura 9. Las pautas de dosificación y la vía de aplicación fue idéntica con el experimento representado en la figura 7. Para el tratamiento de tumores cerebrales derivados de B16-F10, se implantaron las bombas el día 5 tras la inyección, se inyectaron por vía i.p. anticuerpos IgG2b de ratón anti-CTLA-4 de ratón (clon 9D9, bio-X-cell; Peggs et al.; J Exp Med 206, 1717-

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Los animales que portaban tumores se controlaron mediante BLI, se revisaron los síntomas neurológicos y se pesaron semanalmente hasta el día 21 tras la inoculación de glioma. Los animales de GI261 Fc que presentaron un flujo en la RDI de menos de 1x105 f/s en el día 21 se consideraron como no aceptores o aceptores lentos del tumor y se excluyeron del análisis de supervivencia (5-10 %). Desde el día 21 en adelante, los animales se revisaron diariamente. Los animales que presentaban síntomas tales como apatía, una postura encorvada grave y/o pérdida de peso de más del 20 % del peso máximo se sacrificaron. Los ratones que portaban el tumor B16-F10 se puntuaron diariamente comenzando desde el día 5 hasta el final del experimento de acuerdo con el mismo esquema.

Histología

Para la histología, los animales se sacrificaron con CO2, se perfundieron por vía transcardíaca con PBS enfriado en hielo y se decapitaron. Se aislaron cuidadosamente los cerebros completos, se fijaron en formalina al 4 %, se embebieron en parafina y se generaron secciones de 3 jim para la tinción de HE y/o inmunohistoquímica para detectar F4/80 (BM8; BMA biomedicals). Los anticuerpos primarios se detectaron con anticuerpos secundarios acoplados con peroxidasa de rábano picante. La tinción se visualizó con 3,3'-Diaminobenzidina (DAB) como sustrato de HRP. Las imágenes se generaron usando un microscopio de luz Olympus BX41 equipado con una cámara Olympus ColorViewIllu y un programa informático de adquisición de imágenes Olympus cellAB. Las vistas generales de las secciones de cerebros completos se recortaron usando Adobe Photoshop Cs3.

Análisis estadístico

Para el análisis estadístico de las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier, se usó un test Log-rank (Mantel-Cox) para calcular los p-valores indicados en las respectivas figuras. Los p-valores de menos de 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. El análisis se realizó con GraphPad Prism versión 5.0a para Mac OSX (GraphPad Software Inc).

Ejemplo 1: La expresión intratumoral de IL-12Fc promueve la eliminación de los gliomas experimentales

Los presentes inventores han diseñado y clonado una proteína de fusión que consiste en la subunidad p40 de la IL- 12 humana unida mediante un enlazador peptídico flexible a la subunidad p35. Esta construcción de cadena simple se fusionó entonces a la región constante de la cadena pesada de la IgG4. (Fig. 1A). Los presentes inventores denominaron esta proteína de fusión de cadena simple humana IL-12Fc (SEQ ID 01). Los presentes inventores expresaron esta proteína en células embrionarias de riñón humano HEK293 y detectaron una forma dímera así como una forma monómera en condiciones naturales. En condiciones reductoras solo se detectó la forma monómera (Fig. 1B). La IL-12Fc (SEQ ID 01) tiene propiedades funcionales similares a la IL-12 heterodímera comercialmente disponible (obtenido de Peprotech). Para determinar si la IL-12Fc (SEQ ID 01) podría ser adecuada para superar el entorno inmunosupresor local inducido por gliomas y para arrojar luz sobre los mecanismos efectores implicados, los inventores expresaron una versión de murino (Belladonna et al. J Immunol 168, 5448-5454 (2002), IL-12Fc (SEQ ID 02)) de esta citocina en células Gl261 de glioma de ratón. Para medir el crecimiento tumoral intracraneal de manera no invasiva mediante obtención de imágenes de bioluminiscencia (BLI, del inglés bioluminiscence imaging), los presentes inventores generaron en primer lugar una línea de Gl261 que expresa de manera constitutiva luciferasa de Photinus pyralis. Los presentes inventores denominaron a esta línea celular Gl261-luc. A continuación, los presentes inventores modificaron esta línea celular para liberar de manera continua una proteína de fusión de IL-12 y el fragmento cristalizable de inmunoglobulina G3 de ratón (IL-12Fc; SEQ ID 02, 09) o Fc (SEQ ID 08) solo como un control (denominados 'GI261 IL-12Fc' y 'GI261 Fc', respectivamente). La secuencia de proteína de murino elegida de la construcción de fusión es homóloga a la variante humana (SEQ ID 01) y consiste en las subunidades p40 y p35 de la IL-12 que están conectadas a través de un enlazador (G4S)3 y las subunidades CH2, CH3 y los seis últimos aminoácidos de CH1 de IgG3, mientras que CH1 y CH2 están conectadas por una región bisagra. Los vectores para la expresión del fragmento de control y la construcción de fusión de IL-12 se representan en la SEQ ID 08 y 09, respectivamente. La intención de usar proteínas de fusión en lugar de la citocina recombinante fue ver si presentarían una farmacocinética mejorada. Los presentes inventores confirmaron la secreción de IL-12Fc (SEQ ID 02) mediante ELISA para las subunidades p40 y p70. Los presentes inventores confirmaron adicionalmente la expresión de la cola Fc mediante RT-PCR. Cuando se implantó por vía intracraneal en el cuerpo estriado derecho, las lecturas de bioluminiscencia y el volumen tumoral tal como se evalúan mediante métodos estereológicos presentaron una fuerte correlación (datos no mostrados).

A continuación, los presentes inventores implantaron GI261 IL-12Fc y Fc en el cuerpo estriado derecho de ratones C57BI/6 y tras el crecimiento tumoral a través de obtención no invasiva de imágenes por bioluminiscencia (BLI). Tras un aumento inicial en la luminiscencia, todos los grupos presentaron una bajada alrededor del día 14 tras la inyección. Los animales que portan tumores que expresan Fc presentaron un fuerte aumento en BLI y pronto alcanzaron los criterios de exclusión, a veces incluso antes del día 35 tras la inyección. En contraste, las lecturas de BLI para animales que se habían inyectado con tumores de Gl261 que expresa IL-12Fc cayeron a niveles cerca del

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límite de detección en el día 21 en adelante (datos no mostrados). De acuerdo con esta observación, los presentes inventores solo pudieron detectar un tumor residual en algunos animales en este grupo, mientras que los animales inyectados con Fc de control presentaron una fuerte formación de tumor cuando se analizaron histológicamente (Fig. 2). Cuando los presentes inventores siguieron animales a los que habían implantado células GI261 IL-12Fc o GI261 Fc durante hasta 90 días, los presentes inventores observaron rechazo del tumor en una alta proporción de ratones que llevan tumores que secretan IL-12Fc tras un establecimiento inicial (Fig. 3).

Ejemplo 2: Los linfocitos T son el tipo principal de células efectoras del rechazo de glioma mediado por IL- 12Fc.

Para confirmar que la secreción de IL-12Fc por GI261 IL-12Fc actúa sobre el hospedador en lugar de en las propias células tumorales, los presentes inventores observaron que el crecimiento de GI261 IL-12Fc y GI261 Fc es el mismo en ratones que carecen del receptor para IL-12. El crecimiento desenfrenado de Gl261 IL-12 en animales IL-12r@2-/- demuestra que IL-12Fc actúa específicamente sobre un tipo celular en el ratón receptor (datos no mostrados). Los linfocitos T y las células NK están entre los leucocitos más sensibles a IL-12. Para ensayar de manera sistemática la relevancia funcional del influjo mediado por IL-12Fc de estas células, los presentes inventores expusieron a una serie de ratones mutantes a GI261 IL-12Fc intracraneal. Los presentes inventores implantaron células GI261 IL-12Fc en ratones que carecen de linfocitos T y de linfocitos B (Rag1'/_) o de células NK convencionales (II-15ra"A) o en ratones que carecen tanto de linfocitos T como de linfocitos B, de células NK y de células de tipo inductor de tejido linfoide (Rag2-/- II2rg-/-) (Fig. 4A). Tras una fase de retraso inicial hasta el día 14 tras la inyección, todos los grupos presentaron un fuerte aumento en luminiscencia hasta el día 28, reflejando un fuerte crecimiento tumoral. Entre los días 28 y 42, la mayoría de los animales sucumbieron a los tumores. Solo los ratones de ts y II-15ra-/- fueron capaces de controlar el tumor y presentaron una supervivencia prolongada en comparación con los animales Rag2-/- II2rg-/- y Rag1-/-. Aunque los linfocitos T o los linfocitos B parecieron ser cruciales para el rechazo de glioma mediado por IL-12Fc, la capacidad de los ratones II-15ra-/- para rechazar Gl261 IL-12 indica que las células NK eran en gran medida prescindibles.

A continuación, los presentes inventores investigaron la contribución de los linfocitos T CD4 y CD8 positivos usando ratones deficientes en el MHCII (Ia(b)-A) y en el MHCI (@2m-/-). Al contrario que los ratones de ts, los ratones Ia(b)-/- que carecen de linfocitos T CD4 no pudieron controlar los tumores GI261 IL-12Fc, y los ratones @2m-/- sucumbieron al glioma poco después (Fig.4B). La supervivencia en ambos grupos mutantes se acortó en comparación con el grupo de tipo silvestre. Estos datos demuestran claramente que el rechazo del tumor mediado por IL-12Fc depende de la actividad de los linfocitos T, incluyendo los linfocitos T colaboradores y los CTL.

Ejemplo 3: La respuesta de memoria antitumoral es independiente de IL-12Fc expresado ectópicamente.

Para investigar adicionalmente el carácter del control tumoral dependiente de linfocitos T, los presentes inventores probaron a los animales de ts supervivientes que se habían expuesto previamente a células Gl261 IL-12Fc para la formación de linfocitos T de memoria (Fig. 5). Los animales se trataron tal como se describe en la Fig. 3 / ejemplo 1. Al contrario de la exposición primaria, los presentes inventores inyectaron en este caso células Gl261 Fc en el hemisferio contralateral de los animales de supervivientes o de los ts sin exposición previa. Los presentes inventores observaron un rechazo rápido de los tumores de control en días. Mientras que la luminiscencia medida el día 1 sugirió una metástasis idéntica en los dos grupos, solo los ratones sin exposición previa presentaron una señal medible el día 7 en adelante, lo que sugiere una respuesta de memoria anti-glioma de eliminación rápida y eficaz ahora independiente de citocinas proinflamatorias expresadas ectópicamente.

Ejemplo 4: Los CTL son las principales células efectoras del rechazo de glioma mediado por IL-12Fc.

Está bien establecido que la IL-12 polariza los linfocitos T sin exposición previa para adoptar un fenotipo de Th1 (Trinchieri, Nat Rev Immunol 3, 133-146 (2003)). Para arrojar más luz a los fundamentos mecánicos que subyacen al rechazo inducido por IL-12 de glioma experimental, los presentes inventores expusieron ratones deficientes en la citocina IFN-y distintiva de TH1 (Ifng-A) con células Gl261 que expresan IL-12Fc (Fig. 6A). Los animales se trataron tal como se describe en la Fig. 3/ Ejemplo 1. Para su sorpresa, los presentes inventores observaron un rechazo tumoral similar al de animales de ts, lo que sugiere que el mecanismo de rechazo es independiente de IFN-y. Por el contrario, IL-12 también estimula la actividad citotóxica de los CTL. Cuando los presentes inventores analizaron el papel de la perforina, una molécula citolítica expresada principalmente en los CTL CD8+ y en células NK, los presentes inventores observaron una clara diferencia en las curvas de supervivencia. (Fig. 6B). La perforina es una molécula citolítica que se expresa principalmente por los CTL CD8+ y por las células NK, pero también por los linfocitos T CD4+. Para investigar adicionalmente el mecanismo de rechazo de glioma inducido por IL-12Fc, se expusieron ratones deficientes en perforina (prfr1-/-) con células Gl261 que expresan IL-12Fc. Al contrario de Ifng-/-, los animales deficientes en perforina (prfrTA) no fueron capaces de controlar el tumor. Esto sostiene la noción de que los CTL son las principales células efectoras del rechazo de glioma mediado por IL-12Fc. Se observó una clara diferencia en las curvas de supervivencia del ts y de prf1 _/“.

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Ejemplo 5: La administración local de IL-12Fc en combinación con el bloqueo sistémico de CTLA-4 es eficaz contra los gliomas experimentales de etapa avanzada.

Para reforzar adicionalmente y prolongar el fenotipo activado de los linfocitos T, los presentes inventores bloquearon la molécula coinhibidora CTLA-4 mediante anticuerpos neutralizantes en el siguiente conjunto de experimentos. La IL-12 se administró localmente a ratones con tumores en etapas avanzadas. Se administró el tratamiento a animales que se habían expuesto a GI261 Fc 21 días antes y que ya presentaban fuertes señales de bioluminiscencia, lo que indica una etapa avanzada de crecimiento de glioma. Tratamiento local: En el día 21, se implantaron en los animales portadores de glioma las minibombas osmóticas que administran 50 ng de IL-12Fc/día (o PBS). Tras 28 días (día 49 tras la inyección tumoral) se explantaron las bombas vacías de los animales que sobrevivieron. Tratamiento sistémico: En el día 22, los animales portadores de tumor recibieron por vía i.p. 200 pg de IgG2b de ratón aCTLA-4 (9D9) o PBS. El tratamiento se mantuvo con 100 pg de aCTLA-4 los días 26, 29, 35 y 42 (Fig. 7). Ni IL-12Fc ni el anti-CTLA-4 solos confirieron ninguna ventaja significativa en la supervivencia. Increíblemente, la combinación de la administración local de IL-12Fc directamente en el sitio del tumor en combinación con el bloqueo sistémico de CTLA- 4 llevó a una remisión completa del tumor (Fig. 8). 90 días tras la inoculación, la evaluación histológica del tejido cerebral de los animales que sobrevivieron no mostró ningún signo de desmielinización o infiltrados. La administración local de IL-12Fc en combinación con el bloqueo sistémico de PD-1 también llevó a un aumento significativo en los animales que sobrevivieron, la frecuencia, sin embargo, fue menor que con el bloqueo sistémico de CTLA-4 (Fig. 9). La terapia de combinación descrita anteriormente (Fig. 7) confiere una ventaja significativa en la supervivencia incluso en el caso de crecimiento intracraneal de células de melanoma murino singénico B16-F10 (Fig. 10). Este no es un modelo perfecto para tumores cerebrales secundarios dado que se salta diversas etapas de formación de metástasis. Incluso en esta situación más agresiva, el tratamiento de combinación prolonga la supervivencia.

El tratamiento preventivo de tumores en modelos preclínicos puede permitir el estudio de mecanismos inmunológicos y las interacciones entre células tumorales y el microentorno del tumor. Sin embargo, la terapia preventiva es de relevancia clínica limitada en la traducción para tratar pacientes con cáncer. Por lo tanto, los presentes inventores decidieron elegir un punto temporal excepcionalmente tardío para la intervención en un modelo de enfermedad progresiva y agresiva. Para imitar de cerca una situación clínica, los presentes inventores permitieron que el tumor progresase hasta un tamaño que es altamente probable que cause síntomas neurológicos en seres humanos. En el presente caso, la monoterapia con IL-12 aplicada localmente (intratumoral) tuvo un efecto de supervivencia mínimo aunque significativo. Los presentes inventores ya observaron un efecto sinérgico débil cuando combinaron el tratamiento sistémico de IL-12 con el bloqueo sistémico de CTLA-4. Cuando la infusión local de IL-12 se combinó con el bloqueo sistémico de CTLA-4, el efecto anti-glioma fue sorprendente.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Universitaet Zuerich

<120> Medicamento de combinación que comprende IL-12 y un agente para el bloqueo de moléculas inhibidoras de linfocitos T para terapia tumoral

<130> uz117wo

<160>9

<170> PatentIn versión 3.5

<210>1 <211>775 <212> PRT <213> artificial

<220>

<223> fusión entre la IL-12 humana e IgG4 Fc <400> 1

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

REIVINDICACIONES

1. Un medicamento de combinación, que comprende

- un polipéptido de IL-12, o un vector de expresión de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica dicho polipéptido de IL-12, y

- un ligando no agonista de CTLA-4 seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento de

anticuerpo y una molécula de tipo anticuerpo, en donde dicho ligando no agonista de CTLA-4 es capaz de unirse

a CTLA-4 con una constante de disociación de al menos 10"7 M"1, y en donde dicho ligando no agonista de

CTLA-4 se proporciona como una forma de dosificación para una administración sistémica,

para su uso en la terapia de una neoplasia maligna, en donde

- dicho polipéptido de IL-12 o dicho vector de expresión de ácido nucleico se proporcionan mediante la administración en un tumor, en las proximidades de un tumor o en el nódulo linfático asociado a un tumor.
2. Un medicamento de combinación para su uso en la terapia de una neoplasia maligna, de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido de IL-12 comprende

a. una secuencia de polipéptido al menos el 95 % idéntica a la secuencia de la p35 humana (SEQ ID 05), y

b. una secuencia de polipéptido al menos el 95 % idéntica a la secuencia de la p40 humana (SEQ ID 06).
3. Un medicamento de combinación para su uso en la terapia de una neoplasia maligna, de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dicho polipéptido de IL-12 comprende un fragmento cristalizable de inmunoglobulina G.
4. Un medicamento de combinación para su uso en la terapia de una neoplasia maligna de acuerdo con las reivindicaciones 2 o 3, en donde dicho polipéptido de IL-12 comprende un fragmento cristalizable de inmunoglobulina G humana, subgrupo 4.
5. Un medicamento de combinación para su uso en la terapia de una neoplasia maligna, de acuerdo con la reivindicación 4, en donde dicho polipéptido de IL-12 comprende

a. un fragmento cristalizable de inmunoglobulina G y una secuencia de IL-12 humana recombinante o sintética, o

b. una secuencia al menos el 95 % idéntica a la SEQ ID 01.
6. Un medicamento de combinación para su uso en la terapia de una neoplasia maligna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho ligando no agonista de CTLA-4 es una gamma inmunoglobulina que se une a CTLA-4.
7. Un medicamento de combinación para su uso en la terapia de una neoplasia maligna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho polipéptido de IL-12 se proporciona como una forma de dosificación para inyección intratumoral.
8. Un medicamento de combinación para su uso en la terapia de una neoplasia maligna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho ligando no agonista de CTLA-4 se proporciona como una forma de dosificación para inyección intravenosa o aplicación local.
9. Un medicamento de combinación de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en un método de terapia de glioma, glioblastoma multiforme, meningioma, cáncer cerebral secundario, metástasis cerebrales, melanoma, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de próstata o cáncer de vejiga.
10. Un medicamento de combinación de acuerdo con la reivindicación 1, en donde

- dicho polipéptido de IL-12 es una proteína de fusión que comprende el aminoácido de p40 humana, la secuencia de aminoácidos de la p35 humana y el fragmento cristalizable de la IgG4 humana,

- dicho polipéptido de IL-12 se proporciona como una forma de dosificación para administración intratumoral, y en donde

- dicho ligando no agonista de CTLA-4 es una inmunoglobulina G proporcionada como una forma de dosificación para una administración sistémica,

para su uso en el tratamiento de neoplasia maligna, en particular, glioma, glioblastoma multiforme, meningioma, cáncer cerebral secundario, metástasis cerebrales, melanoma, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de próstata o cáncer de vejiga.
11. Un medicamento de combinación para su uso en la terapia de una neoplasia maligna de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho vector de expresión de ácido nucleico es un adenovirus, un virus

adenoasociado, un lentivirus o un herpesvirus.

imagen1

imagen2

imagen3

GI261 Fe GI261 iL-12

F¡g. 3

imagen4

imagen5

días tras la inyección días tras la ¡nyecc¡ón

imagen6

fracción de supervivencia

Q CÜ5 ^ 3 ^3

imagen7

flujo medio en RDI (f/s)

tmmdh paM^p

9, o, o

S oa ro

imagen8

tr'Bld

stoz-so-oe

^8908/21-3

-e- ts + GI2S1 IL-12 B -0- ts + G1261 1L-12

RAG2^- fí-2Ry^ * Gt261 IL-12 • * GÉ261 IL-12

-*■ P.AGÍ4- + G1261 IL-12 • ¡a(b}^'^ GI281 IL-12

• \i-15Ra-f- + GI261 IL-12

sin

imagen9

días tras la inyección días tras la inyección

fracción de supervivencia

0 0 0 0 0—*

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imagen12

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si-oz-so-oe

fr8908Z3l-3

imagen13

GI261 Fe

PBS/PBS

PBS/ctCTLA4

II-12FC/PBS

ll-12Fc/oCTLA4

aCTIAt li>

tH 2Fc í.t

1.0*1008

1.0*10°6

2 1,0*10M

días tras la inyección

1.0-

0;8-

0,6

0,4
0.2

0,0-

dias tras la inyección

Fig. 8

GI261 Fe d 91 tras el

GÍ261 Fe d 21

tratamiento con

IL-12Fc/aCTLA-4

fracción de supervivencia flujo medio en RDI

3 GI261 Fe -A- PBS/iso

-ér PBS/aPD-1 IL-12Fc/iso -ér IL-12Fc/aPD-1 ................. aPD-1 i.p.

imagen14

imagen15

PBS/PBS frente a IL-12Fc/aPD-1 P = 0,0064

fracción de supervivencia

B16-F10 -ér PBS/PBS

-áb- PBS/aCTLA-4 IL-12FC/PBS -ár IL-12Fc/aCTLA-4

aCTLA-4 i.p. ' ' '

imagen16

PBS/PBS frente a IL-12Fc/aCTLA-4 P = 0,0028

imagen17

días

tras

nyeccion

días

tras

inyección

PBS frente a rl!_-12/aCTLA-4 P = 0,0028

PBS frente a rlL-12 P - 0,0146

GI261 Fe

PBS

~tr

ctCTLA-4

rlL-12

rlL-12/oCTLA-4