JP2015505813A - 腫瘍療法のためのil−12とt細胞阻害分子遮断薬とを含む医薬組成物 - Google Patents
腫瘍療法のためのil−12とt細胞阻害分子遮断薬とを含む医薬組成物 Download PDFInfo
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Abstract
Description
ほとんどの欧州諸国および北米では、GBM罹患率は、年間10万人に3〜3.5人の新症例という範囲である。この疾患の臨床歴は通常短く(症例の50%超で3か月未満)、GBMと診断された患者は、侵襲的手術、放射線療法、および化学療法を行っても、生存期間中央値は14〜18か月である。神経膠腫の従来の治療計画に対する抵抗力は、現代の神経腫瘍学の最大の挑戦の1つである。
IL−12は、IL−12R−β1とIL−12R−β2により形成されるヘテロ二量体型受容体であるIL−12受容体(IL−12R)と結合する。この受容体複合体は主としてT細胞により発現されるが、他のリンパ球亜集団もIL−12に応答性があることが分かっている。
これら4つのサブクラスは、重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に95%を超える相同性を示すが、ヒンジ領域の構造および柔軟性に関して異なり、特に、このドメイン内の重鎖内ジスルフィド結合の数が異なる。IgGサブクラス間でのこれらの構造的な違いは、パパイン、プラスミン、トリプシンおよびペプシンなどのタンパク質分解酵素に対するそれらの感受性にも反映される。
IL−12ポリペプチドと、
非アゴニストCTLA−4リガンドおよび非アゴニストPD−1またはPD−L1またはPD−L2リガンドから選択されるT細胞阻害遮断薬と
を含む。
一実施形態では、IL−12ポリペプチドは、p35およびp40両方の配列またはそのホモログを含むアミノ酸配列を同じ連続するアミノ酸鎖の一部として有する。別の実施形態では、IL−12ポリペプチドは、2本の異なるアミノ酸鎖を含み、一方はp35配列を含み、他方はp40配列を含む。用語「IL−12ポリペプチド」は、本明細書に記載のIL−12配列に融合された非IL−12配列、例えば、免疫グロブリン配列およびそのフラグメントの存在を排除しない。
本発明の文脈において結晶性フラグメントは、IgG分子の第二および第三の定常ドメインを意味する。結晶性フラグメント領域(Fc領域)は、細胞表面受容体(Fc受容体)および補体系のタンパク質と相互作用する免疫グロブリン抗体のテール領域である。IgG抗体アイソタイプでは、Fc領域は、その抗体の2本の重鎖の第二および第三の定常ドメインに由来する、2つの同一のタンパク質フラグメントから構成される。
一実施形態では、本医薬組成物のIL−12ポリペプチド成分は、対流増加送達(convection enhanced delivery)(CED)またはその変形形態、例えば、US2011137289(A1)(参照により本明細書に組み入れる)に示されているデバイスによって投与される。
非アゴニストPD−L1(PD−L2)リガンドは、PD−L1(PD−L2)と、その生理学的リガンドのいずれか、特にPD−1との相互作用の生物学的作用を誘発することなく、末梢血に一般的な条件下でPD−L1(またはPD−L2)と選択的に結合する分子である。
阻害剤はまた、重鎖または軽鎖から単離された可変ドメインからなるシングルドメイン抗体であってもよい。さらに、抗体はまた、ラクダ科動物に見られる抗体などの、重鎖のみからなる重鎖抗体であってもよい。抗体様分子は、設計されたアンキリンリピートタンパク質(Molecular Partners, Zurich)などのリピートタンパク質であってもよい。
特定の実施形態では、用語「非アゴニストCTLA−4リガンド」または「非アゴニストPD−1リガンド」とは、CTLA−4またはPD−1のアンタゴニストとCTLA−4またはPD−1シグナル伝達に対してニュートラルであるリガンドの両方を包含する。
いくつかの実施形態では、本発明において使用される非アゴニストCTLA−4リガンドは、CTLA−4と結合した際に、CTLA−4とその結合相手CD80および/またはCD86との相互作用を立体的に遮断することができ、本発明において使用される非アゴニストPD−1リガンドは、PD−1と結合した際に、PD−1と、その結合相手PD−L1および/またはPD−L2との相互作用を立体的に遮断することができる。
一実施形態では、前記疾患は多形性膠芽腫である。一実施形態では、前記悪性腫瘍性疾患は髄膜腫である。一実施形態では、前記悪性腫瘍性疾患は黒色腫である。一実施形態では、前記悪性腫瘍性疾患は膵臓癌である。一実施形態では、前記悪性腫瘍性疾患は肺癌である。一実施形態では、前記悪性腫瘍性疾患は前立腺癌である。一実施形態では、前記悪性腫瘍性疾患は膀胱癌である。
T細胞は、IL−12を介した脳の腫瘍排除に重要なエフェクター細胞集団である。IL−12と抗CTLA−4、抗PD−1、抗PD−L1または抗PD−L2との併用処置は、特にT細胞に働きかけてそれらを活性化し、再分極させる。脳転移は原発性脳腫瘍と同じ免疫コンパートメントで増殖するので、二次脳腫瘍に罹患している患者もこの併用処置から利益を受ける。
この実施形態によれば、医薬組成物は、全身送達用の剤形として調剤された、非アゴニストCTLA−4リガンドおよび/または非アゴニストPD−1リガンドとしての、CTLA−4またはPD−1に対して作製された免疫グロブリンGをさらに含む。この実施形態によれば、医薬組成物は、悪性腫瘍性疾患、特に、神経膠腫、多形性膠芽腫、髄膜腫、黒色腫、膵臓癌、肺癌、前立腺癌または膀胱癌の処置のために提供される。
非アゴニストCTLA−4リガンドおよび
非アゴニストPD−1またはPD−L1またはPD−L2リガンド
から選択されるT細胞阻害遮断薬とを含む。
1つの限定されない例が、図1に示されるように短いアミノ酸配列により連結されたIL−12の構成ポリペプチドを有する融合構築物であり、そのアミノ酸配列は配列番号01として示され、コード核酸配列は配列番号07として示される。
a.ヒトp35の配列(配列番号05)と少なくとも95%同一のポリペプチド配列、および
b.ヒトp40の配列(配列番号06)と少なくとも95%同一のポリペプチド配列、および
c.ヒト免疫グロブリンGサブグループ4結晶性フラグメント
を含むポリペプチドペプチドが提供される。
同様に、悪性腫瘍性疾患、特に神経膠腫、または他の固形組織腫瘍に罹患している患者を処置するための方法が提供され、前記患者へのIL−12の生物活性を有するIL−12核酸発現ベクターと非アゴニストCTLA−4リガンドおよび/または非アゴニストPD−1リガンドの投与を含む。
方法
動物
C57BL/6マウスはJanvierから入手した;b2m−/−、Ia(b)−/−、Il12rb2−/−、Rag1−/−、Rag2−/−Il2rg−/−、Prf1−/−およびIfng−/−マウスはJackson Laboratoriesから入手した。Il15ra−/−マウスはS.Bulfone−Pausにより提供された。動物は全て、所内にて、特定病原体不在条件下、12時間明/暗周期で、食物と水を自由に与えて維持した。動物実験は全て、スイス連邦獣医局(Swiss Cantonary veterinary office)(16/2009)により承認されたものである。
C57/Bl6ネズミ神経膠腫(Gl261)細胞(チューリッヒ大学実験免疫学のA.Fontanaにより厚意により提供された)をpGl3−ctrl(Promega)およびpGK−Puro(ミュンヘン工科大学のT.Buchにより厚意により提供された)でトランスフェクトした。線状化した構築物を、エッペンドルフ・マルチポレーターを用いて10:1の比でエレクトポレーションにより導入した後、0.8μg/mlのピューロマイシン(Sigma−Aldrich)で選択し、ルシフェラーゼ安定Gl261細胞を作出した。単一のクローンを限界希釈により単離し、頭蓋内腫瘍接種によりin vivoで継代培養し、4週間後に腫瘍を分離し、0.8μg/mlのピューロマイシンで再選択した。
次に、細胞にpCEP4−mIgG3、pCEP4−mIl−12mIgG3(配列番号09)およびpCEP4−mIl−23mIgG3(配列番号08)(Eisenring et al,2010)をエレクトポレーションにより導入し、0.8μg/mlピューロマイシンおよび0.23mg/mlハイグロマイシン(Sigma−Aldrich)でバルク選択を行った。
サイトカイン生産はELISA(OptEIA Il−12/23p40、BD Pharmingen)およびrt−PCR(IgG3fw:ACACACAGCCTGGACGC(配列番号03) IgG3rev:CATTTGAACTCCTTGCCCCT(配列番号04))によって検出した。Gl261細胞および誘導細胞株は、37℃および10%CO2にて、上記で示した選択抗生物質の存在下、10%ウシ胎児血清(FCS)を添加したダルベッコの改変イーグル培地(Gibco、Invitrogen)で維持した。B16−F10ネズミ黒色腫細胞はATCCから購入した。
IL−12Fc(配列番号02)は、標準プロトコールに従った、45μgのベクターDNA(pCEP4−mIL−12IgG3、配列番号09)/15cm組織培養プレートを用いたリン酸カルシウム媒介トランスフェクション後の293T細胞において発現された。トランスフェクション3日後および6日後に上清を採取し、濾過除菌し、PBS中に1:1希釈した。タンパク質を、精製装置(AktaPrime)を用い、0.1MグリシンpH2で溶出するプロテインGカラム(1ml、HiTrap、GE Healthcare)にて精製し、PBS pH7.4中で一晩透析した。
IL−12Fc(配列番号02)の濃度および純度は、ELISA(OptEIA Il−12/23p40、BD Pharmingen)およびSDS−PAGEとその後の銀染色および免疫ブロット法により測定した。IL−12Fcは、ラット抗マウスIL−12p40抗体(C17.8、BioExpress)およびヤギ抗ラットHRP結合抗体(Jackson)で検出した。ヒトIL−12Fc(配列番号01、07)の発現にも同じ手順を用いた。
ヒトIL−12Fc(配列番号01)の濃度および純度は、ELISA(ヒトIL−12(p70)、Mabtech、#2455−1H−6)およびSDS−PAGEとその後の銀染色および免疫ブロット法により測定した。ヒトIgG4タグは、HRP結合ヤギ抗ヒトIgG抗体(#A0170、Sigma)で検出した。ヒトIL−12Fc(配列番号01)の機能的特性決定のために、チューリッヒ大学の倫理ガイドラインに従って取得したPBMCを、96ウェルプレートの、10%ウシ胎児血清(FCS)を添加したRPMI培地中に100,000細胞/ウェルで播種し、組換えヒトIL−12(Peprotech)またはヒトIL−12Fc(配列番号01)のいずれかで刺激した。
両サイトカインを、ヒトIL−12p70EL ISA(Mabtech、#2455−1H−6)から導き出された濃度に従って互いにノーマライズした。PBMCを、1μg/mlのマウスIgG2a抗ヒトCD3抗体(OKT3、Bio−X−cell)の存在下で刺激した。5%CO2および37℃で2日間培養した後、上清を採取し、抗ヒトIFN−γELISA(Mabtech、#3420−1H−6)を行った。
簡単に述べると、6〜10週齢のマウスにフルニキシン(Biokema、5mg/kg体重)をi.p.注射した後、誘導室にて3〜5%イソフルラン(Minrad)で麻酔した。電気ヘアトリマーで頭の毛を剃った。定位フレーム(David Kopf Instruments)に固定した後、動物の頭皮を10%ヨウ素溶液で消毒し、正中に沿って皮膚を切開した。
定位フレーム上での麻酔は、ノーズアダプター(David Kopf Instruments)から送達される3%イソフルランで維持した。次に、鈍端シリンジ(Hamilton、75N、26s/2”/2、5μl)をマイクロインジェクションポンプの操作アームに取り付け、プレグマの側位1.5mm、前位1mmに置いた。針を、手動で開けた穿頭孔の中を硬膜表面から4mmの深さに下ろし、1mm後退させて小さなリザーバーを作った。
マイクロインジェクションポンプ(UMP−3、World Precision Instruments Inc.)を用い、2×104細胞を、容量2μl、1μl/分で注入した。針をその場に2分間残した後、1mm/分で後退させた。穿頭孔をボーンワックス(Aesculap、Braun)で塞ぎ、頭皮の創傷を組織グルー(Indermil、Henkel)で封止した。
腫瘍担持マウスを注意深く秤量し、イソフルラン(2〜3%)で麻酔し、D−ルシフェリン(150mg/kg体重、CaliperLifesciences)を注射した。動物をXenogen IVIS 100(CaliperLifesciences)イメージングシステムの暗室に移し、麻酔を、ノーズコーンを介した2%イソフルランで維持した。注射10分後、発光を記録した。次に、データを、Living Image 2.5ソフトウエア(CaliperLifesciences)を用いて分析した。動物の頭の周りに円形の関心領域(ROI;1.46cmφ)を規定し、この領域の光子束を読み取り、プロットした。
神経膠腫細胞の移植後21日目に、腫瘍担持動物をそれらのROI光子束に基づいて実験群に均等に分配した。ROI光子束が1×105 p/s未満の動物を非担持個体とみなして除外した。移植40〜48時間前(処置開始の2日前)に、浸透圧ポンプ(モデル 2004、0.25μl/h;Alzet)にマウスIL−12Fc(配列番号02、PBS中8.33ng/μl)またはPBS単独を充填し、PBS中、37℃でプライミングした。
手術直前に、マウスにフルニキシンのi.p.注射を行った(Biokema、5mg/kg体重)。マウスを3〜5%イソフルランで麻酔し、頭皮を消毒し、正中切開を行った。従前の神経膠腫注射の穿頭孔を探し当て、ボーンワックスおよび骨膜を除去し、動物の背部に形成した皮膚嚢にポンプを入れた。注入カニューレを穿頭孔から腫瘍の推定中心へ3mm下ろした。このカニューレをシリコンチューブでポンプ(脳注入キットIII 1〜3mm、Alzet)に接続し、シアノアクリレート接着剤で適正な位置に保持した。皮膚を4−0ナイロン糸で縫合した。
手術後、マウスを飲用水中0.1%(v/v)Borgal(Intervet)で3日間処置した。49日目にポンプを取り出した。5種類の用量の抗マウス−CTLA−4マウス−IgG2b抗体(クローン9D9、bio−X−cell;Peggs et al.; J Exp Med 206, 1717−1725 (2009))または等量のPBSを22日目(200μg)、26日目(100μg)、29日目(100μg)、35日目(100μg)および42日目(100μg)にi.p.注射した。
確立されたB16−F10由来脳腫瘍の処置のために、注射5日後にポンプを移植し、抗マウス−CTLA−4マウス−IgG2b抗体(クローン9D9、bio−X−cell;Peggs et al.; J Exp Med 206, 1717−1725 (2009))または等量のPBSを6日目(200μg)、11日目(100μg)、13日目(100μg)および19日目(100μg)にi.p.注射した。
腫瘍担持動物を、神経膠腫の接種後21日目まで、BLIによりモニタリングし、神経学的症状を確認し、毎週秤量した。21日目に1×105 p/s未満のROI光子束を示すGl261 Fc動物は非腫瘍担持体または成長の遅い腫瘍担持体とみなし、生存分析から除外した(5〜10%)。21日以降は、動物を毎日確認した。無気力、重度の猫背および/またはピーク体重の20%を超える体重減として症状を示した動物は安楽死させた。B16−F10腫瘍担持マウスも、同じスキームに従い、5日から開始して実験の終了まで毎日スコアをとった。
組織学のために、動物をCO2で安楽死させ、氷冷PBSで経心的に潅流し、断頭した。全脳を注意深く単離し、4%ホルマリン中で固定し、パラフィンに包埋し、3μm切片をHE染色および/または免疫組織化学向けに処理し、F4/80(BM8;BMA biomedicals)を検出した。一次抗体をセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体で検出した。
染色はHRP基質としての3,3’−ジアミノベンジジン(DAB)で可視化した。画像はオリンパス(登録商標)ColorViewllluカメラを備えたオリンパスBX41光学顕微鏡およびオリンパスcell^B画像取得ソフトウエアを用いて作製した。全脳切片の全体像を、Adobe Photoshop(登録商標) CS3を用いてトリミングした。
カプラン・マイヤー生存曲線の統計分析では、ログランク(マンテル−コックス)検定を用いて各図に示されたp値を算出した。0.05未満のp値を統計学的に有意とみなした。分析はMac OSX用GraphPad Prismバージョン5.0a(GraphPad Software Inc)を用いて行った。
本発明者らは、フレキシブルペプチドリンカーを介してp35サブユニットに連結されたヒトIL−12のp40サブユニットからなる融合タンパク質を設計し、クローニングした。次に、この一本鎖構築物をヒトIgG4重鎖の定常領域と融合させた(図1A)。
本発明者らはこのヒト一本鎖融合タンパク質をIL−12Fc(配列番号01)と呼称した。本発明者らは、このタンパク質をHEK293ヒト胎児腎臓細胞で発現させ、天然条件下で二量体型ならびに単量体型を検出した。還元条件下では、単量体型のみが検出可能である(図1B)。IL−12Fc(配列番号01)は、市販のヘテロ二量体型IL−12(Peprotechから購入)と同様の機能的特性を有する。IL−12Fc(配列番号01)が神経膠腫により誘導された局所的免疫抑制環境に打ち勝つのに好適であり得るかどうかを判定するため、および関与するエフェクター機構を明らかにするために、本発明者らは、このサイトカインのマウス型(Belladonna et al., J Immunol 168, 5448−5454 (2002),IL−12Fc(配列番号02))をGl261マウス神経膠腫細胞で発現させた。
頭蓋内の腫瘍成長を生物発光イメージング(BLI)により非侵襲的に測定するために、本発明者らはまず、キタアメリカホタル・ルシフェラーゼを構成的に発現するGl261株を作出した。本発明者らは、この細胞株をGl261−lucと呼称した。
本発明者らは、次に、この細胞株を、IL−12とマウス免疫グロブリンG3の結晶性フラグメントとの融合タンパク質(IL−12Fc;配列番号02、09)または対照としてのFc(配列番号08)単独を絶えず放出するように改変した(それぞれ「Gl261 IL−12Fc」および「Gl261 Fc」と呼称)。この融合構築物の選択されたマウスタンパク質配列はヒト変異体(配列番号01)と相同であり、リンカー(G4S)3により連結されたIL−12のサブユニットp40とp35、ならびにIgG3の結晶性フラグメントのサブユニットCH2、CH3およびCH1の最後の6個のアミノ酸からなる(ただし、CH1とCH2はヒンジ領域により連結されている)。
対照フラグメントおよびIL−12融合構築物の発現のためのベクターはそれぞれ配列番号08および09に示される。組換えサイトカインよりもむしろ融合タンパク質を使用する意味は、それらが薬物動態の改善を示すかどうかを知るということであった。本発明者らは、サブユニットp40およびp70に関するELISAによりIL−12Fc(配列番号02)の分泌を確認した。本発明者らはさらに、RT−PCRによりFcテールの発現を確認した。頭蓋内の右線条体に移植したところ、発光測定値と立体解析学的方法により評価される腫瘍体積は強い相関を示した(データは示されていない)。
Fc発現腫瘍を担持する動物はBLIに急増を示し、すぐに、場合によっては注射後35日前であっても、中止基準に達した。これに対し、IL−12Fc発現Gl261腫瘍を注射した動物のBLI測定値は、21日目以降に検出限界付近のレベルまで低下した(データは示されていない)。この所見と一致して、本発明者らはこの群の一部の動物に残存腫瘍が検出できたに過ぎなかったが、Fc対照を注射した動物は、組織学的に分析した際に、著しい腫瘍形成を示した(図2)。
Gl261 IL−12FcまたはGl261 Fc細胞を移植した動物を90日まで追跡したところ、本発明者らは、初期確立の後、IL−12Fc分泌腫瘍を担持するマウスの高い割合で腫瘍の排除を認めた(図3)。
Gl261 IL−12FcによるIL−12Fcの分泌が腫瘍細胞自体よりもむしろ宿主に作用することを確認するために、本発明者らは、IL−12に対する受容体を欠くマウスにおいてGl261 IL−12FcとGl261 Fcの増加が同等であることを確認した。
IL−12rβ2−/−動物におけるGl261 IL−12の制御されない増加は、IL−12Fcがレシピエントマウスである細胞種に特異的に作用することを示す(データは示されていない)。T細胞およびNK細胞は、最も顕著なIL−12応答性白血球に属す。IL−12Fcを介したこれらの細胞の流入の機能的妥当性を体系的に調べるために、本発明者らは、一連のマウス突然変異体を頭蓋内Gl261 IL−12Fcで刺激した。本発明者らは、Gl261 IL−12Fc細胞を、T細胞およびB細胞を欠くマウス(Rag1−/−)または従来のNk細胞を欠くマウス(Il−15ra−/−)またはT細胞、B細胞、Nk細胞とリンパ系組織インデューサー様細胞の両方を欠くマウス(Rag2−/−Il2rg−/−)に移植した(図4A)。
初期誘導期から注射後14日目の後、全ての群が28日目まで、発光の強い増強を示し、これは強い腫瘍成長を反映している。28日目〜42日目の間に、ほとんどの動物は腫瘍により死に至った。wtマウスとIl−15ra−/−マウスだけが腫瘍を制御することができ、Rag2−/−Il2rg−/−およびRag1−/−動物に比べて有意な生存延長を示す。T細胞またはB細胞はIL−12Fcを介した神経膠腫排除に極めて重要であると思われるが、Il−15ra−/−マウスのGl261 IL−12排除能は、NK細胞は大抵の場合犠牲にできたことを示す。
両突然変異群とも野生型群に比べて生存期間は短かった。これらのデータは、IL−12Fcを介した腫瘍排除がヘルパーT細胞およびCTLを含むT細胞の活性に依存することを明らかに示している。
T細胞依存的腫瘍制御の特徴をさらに調べるために、本発明者らは、Gl261 IL−12Fc細胞で従前に刺激した生存wt動物をT細胞記憶形成に関して調べた(図5)。これらの動物は図3/実施例1に記載のとおりに処置した。一次刺激とは対照的に、本発明者らは、この場合には、生存個体またはナイーブwt動物の反対側の半球にGl261 Fc細胞を注射した。
本発明者らは、数日内に対照腫瘍の速やかな排除を確認した。1日目に測定された発光はこれらの2群間で同一の接種量を示唆したが、ナイーブマウスだけが7日目以降に測定可能なシグナルを示し、このことは、この場合には異所発現された炎症誘発性サイトカインとは独立に抗神経膠腫記憶応答を迅速かつ効果的に消去することを示唆する。
IL−12は、TH1表現型を採るようにナイーブT細胞を分極させるということは、十分に確認されている(Trinchieri, Nat Rev Immunol 3, 133−146 (2003))。IL−12により誘導される実験的神経膠腫の排除の基礎にある機構的理解をさらに明らかにするため、本発明者らは、TH1の特徴的サイトカインIFN−γに欠陥があるマウス(Ifng−/−)をIL−12Fc発現Gl261細胞で刺激した(図6A)。これらの動物は図3/実施例1に記載のとおりに処置した。
驚くべきことに、本発明者らは、wt動物の場合と同様の腫瘍排除を確認し、このことは、この排除機構がIFN−γに依存しないことを示唆する。逆に、IL−12はまたCTLの細胞傷害活性も刺激する。CD8+ CTLおよびNk細胞上で主として発現される細胞溶解性分子であるパーフォリンの役割を分析した際、本発明者らは、生存曲線に明らかな相違を見出した(図6B)。
パーフォリンは、CD8+ CTLおよびNK細胞により主として発現され、CD4+ T細胞によっても発現される細胞溶解性分子である。IL−12Fcにより誘導される神経膠腫排除の機構をさらに検討するために、パーフォリン欠損マウス(prf1−/−)をIL−12Fc発現Gl261細胞で刺激した。Ifng−/−とは対照的に、パーフォリン欠損動物(prf1−/−)は腫瘍を制御できなかった。このことはさらに、CTLがIL−12Fcを介した神経膠腫排除の主要なエフェクター細胞であることの裏付けとなる。wtとprf1−/−の生存曲線には明らかな相違が見られた。
T細胞の活性化表現型をさらに増強および延長するために、本発明者らは、次の一連の実験で、中和抗体により共阻害分子CTLA−4を遮断した。進行した段階の腫瘍を有するマウスにIL−12を局所投与した。21日前にGl261 Fcで刺激し、強い生物発光シグナルをすでに示している(進行した段階の神経膠腫成長を示す)動物に処置を行った。
局所処置:21日目に、腫瘍に50ng IL−12Fc/日(またはPBS)を送達する浸透圧ミニポンプを神経膠腫担持動物に移植した。28日後(腫瘍注射から49日後)に、生存動物から空のポンプを取り出した。全身処置:22日目に、腫瘍担持動物に200μgのαCTLA−4マウスIgG2b(9D9)またはPBS i.p.を施した。26日目、29日目、35日目および42日目に100μgのαCTLA−4で処置を持続した(図7)。IL−12Fcも抗CTLA−4も単独では有意な生存利益を付与しなかった。注目すべきことに、腫瘍部位への直接的な局所的IL−12Fc投与と全身的CTLA−4遮断の組合せは、腫瘍の完全緩解をもたらした(図8)。
接種90日後、生存動物の脳組織の組織学的評価は、脱髄または浸潤物のいずれの徴候も示さなかった。局所的IL−12Fc投与と全身的PD−1遮断の組合せはまた、生存動物の有意な増加ももたらしたが、その頻度は全身的CTLA−4遮断の場合よりも低かった(図9)。上記の併用療法(図7)は、B16−F10同系マウス黒色腫細胞の頭蓋内成長の場合であっても有意な生存利益を付与する(図10)。これは転移形成の様々な段階を飛ばしているので、二次脳腫瘍の完全なモデルではない。このように、より急速進行性の場合であっても、本併用処置は生存期間を延長する。
臨床状況を密接に模倣するために、本発明者らは、腫瘍をヒトにおいて有意な神経学的症状を引き起こす可能性の高い大きさまで進行させた。ここで、局所適用(腫瘍内)IL−12による単剤療法は、有意ではあるが最小の生存効果しか持たなかった。
本発明者らは、すでに、全身的IL−12処置と全身的CTLA−4遮断を組み合わせた際に弱い相乗作用を見出した。局所的IL−12注射を全身的CTLA−4遮断と組み合わせると、抗神経膠腫効果は顕著であった。
Claims (20)
- 悪性腫瘍性疾患の療法において使用するための、
IL−12ポリペプチド、または前記IL−12ポリペプチドをコードする配列を含む核酸発現ベクターと、
非アゴニストCTLA−4リガンドおよび非アゴニストPD−1リガンドから選択されるT細胞阻害遮断薬と
を含み、
前記IL−12ポリペプチド、または前記核酸発現ベクターが腫瘍への、腫瘍の近傍への、または腫瘍に関連するリンパ節への投与により提供される、
医薬組成物。 - 前記IL−12ポリペプチドが、
a.ヒトp35の配列(配列番号05)と少なくとも95%同一のポリペプチド配列と、
b.ヒトp40の配列(配列番号06)と少なくとも95%同一のポリペプチド配列と
を含む、請求項1に記載の医薬組成物。 - 前記IL−12ポリペプチドが免疫グロブリンG結晶性フラグメントを含む、請求項2に記載の医薬組成物。
- 前記IL−12ポリペプチドがヒト免疫グロブリンGサブグループ4結晶性フラグメントを含む、請求項2または3に記載の医薬組成物。
- 前記IL−12ポリペプチドが、
a.免疫グロブリンG結晶性フラグメントおよび組換えもしくは合成ヒトIL−12配列、または
b.配列番号01と少なくとも95%同一の配列
を含む、請求項4に記載の医薬組成物。 - 前記T細胞阻害遮断薬が、
非アゴニストポリペプチドCTLA−4リガンド、および
非アゴニストポリペプチドPD−1リガンド
から選択される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の医薬組成物。 - 前記非アゴニストCTLA−4リガンドが、CTLA−4と結合するγ免疫グロブリンであり、かつ/または
前記非アゴニストPD−1リガンドが、PD−1と結合するγ免疫グロブリンである、
請求項1〜6のいずれか一項に記載の医薬組成物。 - 前記IL−12ポリペプチドが腫瘍内注射用の剤形として提供される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記T細胞阻害遮断薬が静脈内注射または局所適用用の剤形として提供される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 神経膠腫、多形性膠芽腫、髄膜腫、二次脳癌、脳転移、黒色腫、膵臓癌、肺癌、前立腺癌または膀胱癌の療法において使用するための、請求項1〜9の少なくとも一項に記載の医薬組成物。
- 前記IL−12ポリペプチドが、ヒトp40のアミノ酸、ヒトp35のアミノ酸配列およびヒトIgG4の結晶性フラグメントを含む融合タンパク質であり、
前記IL−12ポリペプチドが腫瘍内送達用の剤形として提供され、かつ、
前記T細胞阻害遮断薬が全身送達用の剤形として提供される免疫グロブリンGである、
悪性腫瘍性疾患、特に、神経膠腫、多形性膠芽腫、髄膜腫、二次脳癌、脳転移、黒色腫、膵臓癌、肺癌、前立腺癌または膀胱癌の処置のための、請求項1に記載の医薬組成物。 - T細胞阻害遮断薬が、
非アゴニストCTLA−4抗体、および
非アゴニストPD−1抗体
から選択される、請求項11に記載の医薬組成物。 - 前記核酸発現ベクターがアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルスまたはヘルペスウイルスである、請求項1〜9のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 悪性腫瘍性疾患、神経膠腫、多形性膠芽腫、髄膜腫、二次脳癌、脳転移、黒色腫、膵臓癌、肺癌、前立腺癌または膀胱癌の療法において使用するための医薬組成物の製造における、IL−12の生物活性を有するIL−12ポリペプチドと、非アゴニストCTLA−4リガンドおよび非アゴニストPD−1リガンドから選択されるT細胞阻害遮断薬の使用であって、前記IL−12ポリペプチドが腫瘍への、腫瘍の近傍への、または腫瘍に関連するリンパ節への投与のための剤形として提供される、使用。
- 悪性腫瘍性疾患に罹患している患者を処置する方法であって、
IL−12の生物活性を有するIL−12ポリペプチドの、腫瘍への、腫瘍の近傍への、または腫瘍に関連するリンパ節への投与と、非アゴニストCTLA−4リガンドおよび非アゴニストPD−1リガンドから選択されるT細胞阻害遮断薬の投与とを含む、方法。 - a.ヒトp35の配列(配列番号05)と少なくとも95%同一のポリペプチド配列と、
b.ヒトp40の配列(配列番号06)と少なくとも95%同一のポリペプチド配列と、
c.ヒト免疫グロブリンGサブグループ4結晶性フラグメントと
を含む、ポリペプチド。 - 配列番号01と少なくとも95%同一の配列を有する、請求項16に記載のポリペプチド。
- 薬剤として使用するための請求項16または17に記載のポリペプチド。
- 癌療法において使用するための請求項16または17に記載のポリペプチド。
- 神経膠腫、多形性膠芽腫、髄膜腫、二次脳癌、脳転移、黒色腫、膵臓癌、肺癌、前立腺癌または膀胱癌の療法において使用するための請求項16または17に記載のポリペプチド。
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