JP2023025195A

JP2023025195A - 腫瘍療法のためのｉｌ－１２とｔ細胞阻害分子遮断薬とを含む医薬組成物

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Publication number: JP2023025195A
Application number: JP2022194205A
Authority: JP
Inventors: ベッヒャー、ブルクハルト; Becher Burkhard; ベルク、ヨハネスフォム; Vom Berg Johannes
Original assignee: Universitaet Zuerich
Current assignee: Universitaet Zuerich
Priority date: 2011-10-11
Filing date: 2022-12-05
Publication date: 2023-02-21
Also published as: WO2013053775A1; EP2766035B1; EP3351261B1; CA2850575C; ES2888249T3; JP2020200346A; JP2018197247A; JP7214238B2; AU2012322999A1; EP2766035A1; PL3351261T3; JP2015505813A; US20150017121A1; AU2017206231B2; AU2012322999B2; EP3925615A1; CA3101783C; JP7110023B2; ES2671728T3; CA2850575A1

Abstract

【課題】悪性腫瘍性疾患の処置のための医薬組成物を提供する。【解決手段】医薬組成物は、ＩＬ－１２の生物活性を有するＩＬ－１２ポリペプチド、またはこのようなＩＬ－１２ポリペプチドをコードする配列を含む核酸発現ベクターと、非アゴニストＣＴＬＡ－４リガンドまたは非アゴニストＰＤ－１リガンド、特に、抗ＣＴＬＡ－４または抗ＰＤ－１免疫グロブリンＧとを含む。【選択図】なし

Description

本発明は、有効用量の、ＩＬ－１２の生物活性を有するポリペプチドとＴ細胞ダウンレギュレーターの非アゴニストリガンド、特に、ＣＴＬＡ－４および／またはＰｒｏｇｒａｍｍｅｄ１（ＰＤ－１）に対する非アゴニストリガンドとを投与することによる、癌を治療するための組成物および方法、特に、神経膠腫などの悪性腫瘍性疾患の免疫療法に関する。

多形性膠芽腫（ＧＢＭ）は、最も悪性度の高い星状細胞腫瘍である。ＧＢＭは浸潤性かつ破壊的な増殖パターンを示し、ヒトにおいて最も多く、最も急速進行性の悪性原発脳腫瘍であり、全頭蓋内腫瘍の２０％を占める。
ほとんどの欧州諸国および北米では、ＧＢＭ罹患率は、年間１０万人に３～３．５人の新症例という範囲である。この疾患の臨床歴は通常短く（症例の５０％超で３か月未満）、ＧＢＭと診断された患者は、侵襲的手術、放射線療法、および化学療法を行っても、生存期間中央値は１４～１８か月である。神経膠腫の従来の治療計画に対する抵抗力は、現代の神経腫瘍学の最大の挑戦の１つである。

インターロイキン（ＩＬ）－１２は、主として炎症特性を有するヘテロ二量体型サイトカインの一群のプロトタイプである。ＩＬ－１２は、ＴＨ１表現型を採るようにナイーブヘルパーＴ細胞を分極し、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞を刺激する。
ＩＬ－１２は、ＩＬ－１２Ｒ－β１とＩＬ－１２Ｒ－β２により形成されるヘテロ二量体型受容体であるＩＬ－１２受容体（ＩＬ－１２Ｒ）と結合する。この受容体複合体は主としてＴ細胞により発現されるが、他のリンパ球亜集団もＩＬ－１２に応答性があることが分かっている。

種々の腫瘍存在におけるＩＬ－１２の治療適用が示唆されてきた。しかしながら、全身適用は有効用量で、死亡を含む重大な有害事象を引き起こしたことから、癌患者での臨床試験は中止しなければならなった。近年の研究では、ＩＬ－１２の様々な投与経路に主として焦点が当てられてきたが、ＩＬ－１２がその腫瘍抑制特性を発揮する正確な機序については、なお未解決な問題が残っている。

ＣＴＬＡ－４およびＰＤ－１はともに、Ｔ細胞レギュレーターの拡張ＣＤ２８／ＣＴＬＡ－４ファミリーのメンバーである。ＰＤ－１は、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞およびマクロファージの表面で発現される。ＰＤ－１（ＣＤ２７９；ＵｎｉｐｒｏｔＱ１５１１６）は、Ｂ７ファミリーのメンバーであるＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１、ＣＤ２７４）とＰＤ－Ｌ２（Ｂ７－ＤＣ、ＣＤ２７３）の、２つのリガンドを有する。

ＣＴＬＡ－４（ＵｎｉｐｒｏｔＩＤＮｏＰ１６４１０）はＴヘルパー細胞の表面で発現され、Ｔリンパ球に阻害シグナルを伝達する。ＣＴＬＡ－４およびＣＤ２８は、抗原提示細胞上のＣＤ８０（Ｂ７－１）およびＣＤ８６（Ｂ７－２）に結合する。ＣＴＬＡ－４はＴ細胞に阻害シグナルを伝達し、一方、ＣＤ２８は刺激シグナルを伝達する。全身的抗ＣＴＬＡ－４処置は臨床用途に承認されており、臨床利益を示す。この処置はさらに他の種々の固形癌に対しても試験されている（非特許文献１；非特許文献２）。ＣＴＬＡ－４に対する市販の抗体は、一般名イピリムマブとして入手可能である（Ｙｅｒｖｏｙとして販売されている）。

種々の抗ＰＤ－Ｌ１抗体（例えば、ＭＤＸ－１１０５／ＢＭＳ－９３６５５９）および抗ＰＤ－１抗体は現在、臨床試験下にある（例えば、ＭＤＸ－１１０６／ＢＭＳ－９３６５５８／ＯＮＯ－４５３８またはＭＫ－３４７５／ＳＣＨ９００４７５またはＡＭＰ－２２４）。

糖タンパク質免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、ヒトにおける体液性免疫応答の主要なエフェクター分子である。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４と呼ばれるヒトＩｇＧの４つの異なる亜群が存在する。
これら４つのサブクラスは、重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に９５％を超える相同性を示すが、ヒンジ領域の構造および柔軟性に関して異なり、特に、このドメイン内の重鎖内ジスルフィド結合の数が異なる。ＩｇＧサブクラス間でのこれらの構造的な違いは、パパイン、プラスミン、トリプシンおよびペプシンなどのタンパク質分解酵素に対するそれらの感受性にも反映される。

ヒトＩｇＧ４のアイソフォームは１つだけ知られている。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３とは対照的に、ヒトＩｇＧ４は補体を活性化しない。さらに、ＩｇＧ４は、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３に比べてタンパク質分解酵素に対する感受性が低い。

Ｈｏｄｉｅｔａｌ．，ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ３６３，７１１－７２３（２０１０）Ｇｒａｚｉａｎｉｅｔａｌ．，ＰｈａｒｍａｃｏｌＲｅｓ（２０１２）Ｊａｎ；６５（１）：９－２２

本発明の基礎にある課題は、固形癌、特に、神経膠腫を処置するための改良された手段および方法の提供である。

関連の齧歯類モデルでの進行した段階のＧＢＭにおけるＩＬ－１２の臨床治療能に焦点を当てた試験の過程で、驚くことに、ＩＬ－１２と、抗ＣＴＬＡ－４抗体による共阻害シグナルの遮断との組合せが、進行した病期であってもほぼ完全な腫瘍根絶と治癒をもたらすことが見出された。同様に、ＩＬ－１２と、抗ＰＤ－１抗体による共阻害シグナルの遮断との組合せは腫瘍退縮をもたらす。

本発明の第一の態様によれば、固形腫瘍、特定の脳腫瘍、特に、神経膠腫の療法において使用するための医薬組成物が提供され、前記医薬組成物は、
ＩＬ－１２ポリペプチドと、
非アゴニストＣＴＬＡ－４リガンドおよび非アゴニストＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２リガンドから選択されるＴ細胞阻害遮断薬と
を含む。

本発明の文脈において、ＩＬ－１２ポリペプチドは、ｐ３５の配列（ＵｎｉｐｒｏｔＩＤ２９４５９、配列番号０５）またはその機能的ホモログを含み、かつ、ｐ４０の配列（ＵｎｉｐｒｏｔＩＤ２９４６０、配列番号０６）またはその機能的ホモログを含むアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
一実施形態では、ＩＬ－１２ポリペプチドは、ｐ３５およびｐ４０両方の配列またはそのホモログを含むアミノ酸配列を同じ連続するアミノ酸鎖の一部として有する。別の実施形態では、ＩＬ－１２ポリペプチドは、２本の異なるアミノ酸鎖を含み、一方はｐ３５配列を含み、他方はｐ４０配列を含む。用語「ＩＬ－１２ポリペプチド」は、本明細書に記載のＩＬ－１２配列に融合された非ＩＬ－１２配列、例えば、免疫グロブリン配列およびそのフラグメントの存在を排除しない。

ＩＬ－１２ポリペプチドは、ＩＬ－１２の生物活性を有する。本発明の文脈においてＩＬ－１２の生物活性は、前記ＩＬ－１２ポリペプチドによるＮＫ細胞またはＴ細胞の刺激、最も著しくは、パーフォリンか介して作用するＴエフェクター細胞の刺激である。

医薬組成物の一実施形態では、前記ＩＬ－１２ポリペプチドは、ヒトｐ３５の配列（配列番号０５）と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のポリペプチド配列と、ヒトｐ４０の配列（配列番号０６）と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のポリペプチド配列とを含む。

本発明の文脈において同一性は、位置毎の配列比較の結果を表す単一の量的パラメーターである。配列比較の方法は当技術分野で公知であり、公的に利用可能なＢＬＡＳＴアルゴリズムが一例である。

一実施形態では、前記ＩＬ－１２ポリペプチドは、組換えヒトＩＬ－１２である。一実施形態では、前記ＩＬ－１２ポリペプチドは、合成ヒトＩＬ－１２である。一実施形態では、前記ＩＬ－１２ポリペプチドは、ヒト免疫グロブリンの結晶性フラグメント（Ｆｃ領域）を含む融合ペプチドである。一実施形態によれば、前記ＩＬ－１２ポリペプチドは、ヒト免疫グロブリンＧの結晶性フラグメントを含む。
本発明の文脈において結晶性フラグメントは、ＩｇＧ分子の第二および第三の定常ドメインを意味する。結晶性フラグメント領域（Ｆｃ領域）は、細胞表面受容体（Ｆｃ受容体）および補体系のタンパク質と相互作用する免疫グロブリン抗体のテール領域である。ＩｇＧ抗体アイソタイプでは、Ｆｃ領域は、その抗体の２本の重鎖の第二および第三の定常ドメインに由来する、２つの同一のタンパク質フラグメントから構成される。

一実施形態によれば、前記ＩＬ－１２ポリペプチドは、ヒト免疫グロブリンＧ４の結晶性フラグメントを含む。一実施形態によれば、前記ＩＬ－１２ポリペプチドは、配列番号０１の配列を有するか、または含む。別の実施形態によれば、前記ＩＬ－１２ポリペプチドは、配列番号０１の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列を含む。

ＩＬ－１２ポリペプチド鎖が免疫グロブリンＦｃフラグメントに融合された実施形態は、いくつかの適用に関して利益を付与し得る組換えサイトカインとは異なる薬物動態挙動を示す。

一実施形態では、本医薬組成物のＩＬ－１２ポリペプチド成分は、局所（腫瘍内）投与または送達用の剤形として提供される。このような局所（腫瘍内）投与用の剤形は、前記ＩＬ－１２ポリペプチドが数時間～数週間にわたって放出される徐放型またはデポー型であり得る。
一実施形態では、本医薬組成物のＩＬ－１２ポリペプチド成分は、対流増加送達（ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎｅｎｈａｎｃｅｄｄｅｌｉｖｅｒｙ）（ＣＥＤ）またはその変形形態、例えば、ＵＳ２０１１１３７２８９（Ａ１）（参照により本明細書に組み入れる）に示されているデバイスによって投与される。

一実施形態では、前記ＩＬ－１２ポリペプチドは、全身的ＣＴＬＡ－４／ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２遮断とともに全身投与される。全身的ＣＴＬＡ－４遮断（ｉ．ｐ．）とともに全身適用されたヘテロ二量体型組換えＩＬ－１２（ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）は、単独で投与された各薬剤に比べて生存の有意な改善を達成した（図１１参照）。

本発明の文脈において、非アゴニストＣＴＬＡ－４リガンドは、ＣＴＬＡ－４の生理学的リガンドのいずれか、特にＣＤ８０および／またはＣＤ８６とのＣＴＬＡ－４相互作用の生物学的作用を誘発することなく、末梢血に一般的な条件下でＣＴＬＡ－４と選択的に結合する分子である。

本発明の文脈において、非アゴニストＰＤ－１リガンドは、ＰＤ－１と、ＰＤ－１の生理学的リガンドのいずれか、特に、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２との相互作用の生物学的作用を誘発することなく、末梢血に一般的な条件下でＰＤ－１と選択的に結合する分子である。
非アゴニストＰＤ－Ｌ１（ＰＤ－Ｌ２）リガンドは、ＰＤ－Ｌ１（ＰＤ－Ｌ２）と、その生理学的リガンドのいずれか、特にＰＤ－１との相互作用の生物学的作用を誘発することなく、末梢血に一般的な条件下でＰＤ－Ｌ１（またはＰＤ－Ｌ２）と選択的に結合する分子である。

いくつかの実施形態では、前記非アゴニストＣＴＬＡ－４リガンドは、ＣＴＬＡ－４と結合するポリペプチドである。いくつかの実施形態では、前記非アゴニストＰＤ－１リガンドは、ＰＤ－１と結合するポリペプチドである。

本発明の意味において非アゴニストＣＴＬＡ－４リガンドは、少なくとも１０^－７Ｍ、１０^－８Ｍまたは１０^－９Ｍの解離定数でＣＴＬＡ－４と結合することができ、かつ、その各標的の生物活性を阻害する分子を意味する。本発明の意味において非アゴニストＰＤ－１リガンドまたは非アゴニストＰＤ－Ｌ１（ＰＤ－Ｌ２）リガンドは、少なくとも１０^－７Ｍ、１０^－８Ｍまたは１０^－９Ｍの解離定数でＰＤ－１（ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２）と結合することができ、かつ、その各標的の生物活性を阻害する分子を意味する。

非アゴニストポリペプチドリガンドは、抗体、抗体フラグメント、抗体様分子またはオリゴペプチドであり得、これらはいずれもそれぞれＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１（ＰＤ－Ｌ２）に結合することにより、それらを阻害する。

抗体フラグメントは、抗体のＦａｂドメインもしくはＦｖドメイン、または一本鎖抗体フラグメントであり得、この一本鎖抗体はペプチドリンカーにより連結された抗体の軽鎖および重鎖の可変領域からなる融合タンパク質である。
阻害剤はまた、重鎖または軽鎖から単離された可変ドメインからなるシングルドメイン抗体であってもよい。さらに、抗体はまた、ラクダ科動物に見られる抗体などの、重鎖のみからなる重鎖抗体であってもよい。抗体様分子は、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰａｒｔｎｅｒｓ，Ｚｕｒｉｃｈ）などのリピートタンパク質であってもよい。

本発明の上記態様によるオリゴペプチドは、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２の生理学的リガンドの認識部位に由来するペプチドであり得る。このようなオリゴペプチドリガンドは、それぞれＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２との結合に関して生理学的リガンドと競合する。

特に、非アゴニストＣＴＬＡ－４リガンドまたは非アゴニストＰＤ－１リガンドまたは非アゴニストＰＤ－Ｌ１リガンドまたは非アゴニストＰＤ－Ｌ２リガンドは、Ｔ細胞の表面上のそれぞれＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２と結合した際に、Ｔ細胞活性の減弱をもたらさない。
特定の実施形態では、用語「非アゴニストＣＴＬＡ－４リガンド」または「非アゴニストＰＤ－１リガンド」とは、ＣＴＬＡ－４またはＰＤ－１のアンタゴニストとＣＴＬＡ－４またはＰＤ－１シグナル伝達に対してニュートラルであるリガンドの両方を包含する。
いくつかの実施形態では、本発明において使用される非アゴニストＣＴＬＡ－４リガンドは、ＣＴＬＡ－４と結合した際に、ＣＴＬＡ－４とその結合相手ＣＤ８０および／またはＣＤ８６との相互作用を立体的に遮断することができ、本発明において使用される非アゴニストＰＤ－１リガンドは、ＰＤ－１と結合した際に、ＰＤ－１と、その結合相手ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２との相互作用を立体的に遮断することができる。

一実施形態では、前記非アゴニストＣＴＬＡ－４リガンドは、ＣＴＬＡ－４とその結合相手ＣＤ８０および／またはＣＤ８６との相互作用の生理学的応答を誘発することなく、ＣＴＬＡ－４と結合するγ免疫グロブリンである。

いくつかの実施形態では、前記非アゴニストＰＤ－１リガンドは、ＰＤ－１とその結合相手ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２との相互作用の生理学的応答を誘発することなく、ＰＤ－１と結合するγ免疫グロブリンである。

いくつかの実施形態では、前記非アゴニストＰＤ－Ｌ１（ＰＤ－Ｌ２）リガンドは、ＰＤ－１とその結合相手ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２との相互作用の生理学的応答を誘発することなく、ＰＤ－Ｌ１（ＰＤ－Ｌ２）と結合するγ免疫グロブリンである。

ＣＴＬＡ－４リガンドの限定されない例として、臨床承認済みの抗体トレメリムマブ（ＣＡＳ７４５０１３－５９－６）およびイピリムマブ（ＣＡＳＮｏ．４７７２０２－００－９；Ｙｅｒｖｏｙ）がある。

ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２リガンドの限定されない例として、現在臨床開発下にある抗体ＭＤＸ－１１０５／ＢＭＳ－９３６５５９、ＭＤＸ－１１０６／ＢＭＳ－９３６５５８／ＯＮＯ－４５３８、ＭＫ－３４７５／ＳＣＨ９００４７５またはＡＭＰ－２２４がある。

本明細書において用語「γ免疫グロブリン」は、完全な免疫グロブリン分子およびその機能的フラグメントの両方を包含することを意図し、その機能は上記で展開したようにＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１（ＰＤ－Ｌ２）との結合である。

一実施形態では、本併用療法は２つの異なる剤形を含み、前記ＩＬ－１２ポリペプチドは腫瘍内送達または腫瘍近傍への局所送達用の剤形として提供され、前記非アゴニストＣＴＬＡ－４リガンドまたは非アゴニストＰＤ－１リガンドは全身送達、特に静脈内注射による全身送達用の剤形として提供される。しかしながら、前記非アゴニストＣＴＬＡ－４リガンドまたは非アゴニストＰＤ－１リガンドは、ＩＬ－１２ポリペプチドと同様に局所適用してもよい。別の実施形態によれば、ＩＬ－１２ポリペプチドは、腫瘍所属リンパ節に直接適用される。

別の実施形態によれば、本併用療法は一剤形を含み、それにより、前記ＩＬ－１２ポリペプチドは、例えば注射による頭蓋内送達用に提供される。

本発明の別の態様によれば、医薬組成物は、悪性腫瘍性疾患、特に、固形癌性病変の療法において使用するために、上記で示したように提供される。一実施形態では、前記悪性腫瘍性疾患は神経膠腫である。一実施形態では、前記悪性腫瘍性疾患は二次脳腫瘍（脳の外部で生じた腫瘍性病変の脳転移）である。
一実施形態では、前記疾患は多形性膠芽腫である。一実施形態では、前記悪性腫瘍性疾患は髄膜腫である。一実施形態では、前記悪性腫瘍性疾患は黒色腫である。一実施形態では、前記悪性腫瘍性疾患は膵臓癌である。一実施形態では、前記悪性腫瘍性疾患は肺癌である。一実施形態では、前記悪性腫瘍性疾患は前立腺癌である。一実施形態では、前記悪性腫瘍性疾患は膀胱癌である。

癌性病変は、それらの起源に応じて、隣接組織ならびに身体の異なる部位に拡がる傾向を持つ。全ての癌の２０～４０％は脳転移を起こし、中でも肺癌、乳癌および皮膚癌（黒色腫）が、最も多い脳転移源である（Ｓｏｆｉｅｔｔｉｅｔａｌ．，ＪＮｅｕｒｏｌ２４９，１３５７－１３６９（２００２））。原発性悪性脳腫瘍と同様に、脳転移は処置を行っても予後が不良であり、急速に死に至る。
Ｔ細胞は、ＩＬ－１２を介した脳の腫瘍排除に重要なエフェクター細胞集団である。ＩＬ－１２と抗ＣＴＬＡ－４、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１または抗ＰＤ－Ｌ２との併用処置は、特にＴ細胞に働きかけてそれらを活性化し、再分極させる。脳転移は原発性脳腫瘍と同じ免疫コンパートメントで増殖するので、二次脳腫瘍に罹患している患者もこの併用処置から利益を受ける。

一実施形態では、本医薬組成物は、ヒトｐ４０のアミノ酸、ヒトｐ３５のアミノ酸配列およびヒトＩｇＧ４の結晶性フラグメントを含む融合タンパク質として提供される、ＩＬ－１２の生物活性を有するＩＬ－１２ポリペプチドを含み、前記ＩＬ－１２ポリペプチドは腫瘍内送達用の剤形として調剤される。
この実施形態によれば、医薬組成物は、全身送達用の剤形として調剤された、非アゴニストＣＴＬＡ－４リガンドおよび／または非アゴニストＰＤ－１リガンドとしての、ＣＴＬＡ－４またはＰＤ－１に対して作製された免疫グロブリンＧをさらに含む。この実施形態によれば、医薬組成物は、悪性腫瘍性疾患、特に、神経膠腫、多形性膠芽腫、髄膜腫、黒色腫、膵臓癌、肺癌、前立腺癌または膀胱癌の処置のために提供される。

本発明のさらに別の態様によれば、ＩＬ－１２の生物活性を有するＩＬ－１２ポリペプチドと非アゴニストＣＴＬＡ－４リガンドおよび／または非アゴニストＰＤ－１リガンドは、悪性腫瘍性疾患、特に神経膠腫、および他の固形組織腫瘍、例えば、多形性膠芽腫、髄膜腫、黒色腫、膵臓癌、肺癌、前立腺癌または膀胱癌の療法において使用するための医薬組成物の製造において使用される。

本発明のさらに別の態様によれば、悪性腫瘍性疾患、特に神経膠腫、および他の固形組織腫瘍に罹患している患者を処置するための方法が提供され、前記患者へのＩＬ－１２の生物活性を有するＩＬ－１２ポリペプチドと非アゴニストＣＴＬＡ－４リガンドおよび／または非アゴニストＰＤ－１リガンドの投与を含む。

本発明の別の態様によれば、併用療法は、ＩＬ－１２の生物活性を有するコード化ＩＬ－１２ポリペプチドをコードするＩＬ－１２核酸発現ベクターと、
非アゴニストＣＴＬＡ－４リガンドおよび
非アゴニストＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２リガンド
から選択されるＴ細胞阻害遮断薬とを含む。

ＣＴＬＡ－４リガンドおよび非アゴニストＰＤ－１リガンドは、上記で示したように、ポリペプチド、特に抗体により具現化される。コード化ＩＬ－１２ポリペプチドの限定されない例としては、免疫グロブリンＧフラグメントとＩＬ－１２構成ポリペプチド鎖、ヒトＩＬ－１２またはその機能的等価物との融合物である。
１つの限定されない例が、図１に示されるように短いアミノ酸配列により連結されたＩＬ－１２の構成ポリペプチドを有する融合構築物であり、そのアミノ酸配列は配列番号０１として示され、コード核酸配列は配列番号０７として示される。

本発明のさらに別の態様によれば、
ａ．ヒトｐ３５の配列（配列番号０５）と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列、および
ｂ．ヒトｐ４０の配列（配列番号０６）と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列、および
ｃ．ヒト免疫グロブリンＧサブグループ４結晶性フラグメント
を含むポリペプチドペプチドが提供される。

いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、配列番号０１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、または配列番号０１である配列を含むか、または前記配列から本質的になる。

組換えサイトカインよりもむしろサイトカインと免疫グロブリンの結晶性フラグメントとの融合タンパク質を使用することの利点は、薬物動態の向上である（Ｂｅｌｌａｄｏｎｎａｅｔａｌ．，ＪＩｍｍｕｎｏｌ１６８，５４４８－５４５４（２００２）；Ｓｃｈｍｉｄｔ，ＣｕｒｒＯｐｉｎＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖＤｅｖｅｌ／１２，２８４－２９５（２００９）；Ｅｉｓｅｎｒｉｎｇｅｔａｌ．，ＮａｔＩｍｍｕｎｏｌ１１，１０３０－１０３８（２０１０））。

本発明のこの態様によるＩＬ－１２核酸発現ベクターは、限定されない例として、例えば頭蓋内注射により腫瘍に送達するための、ＩＬ－１２ポリペプチドをコードする核酸配列をヒト腫瘍細胞で作動可能なプロモーター配列の制御下に含む「裸の」ＤＮＡ発現プラスミドであり得る。このＩＬ－１２核酸発現ベクターは、同様に、ウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、レンチウイルスまたはヘルペスウイルスであってもよい。

このようなＩＬ－１２核酸発現ベクターは、上記で示したようなタンパク質非アゴニストＣＴＬＡ－４リガンドおよび／または非アゴニストＰＤ－１リガンドと組み合わせて腫瘍内送達用の剤形として提供してもよい。同様に、本発明の範囲は、悪性腫瘍性疾患、特に神経膠腫、多形性膠芽腫、髄膜腫、黒色腫、膵臓癌、肺癌、前立腺癌または膀胱癌の療法において使用するための医薬組成物の製造方法における、非アゴニストＣＴＬＡ－４リガンドおよび／または非アゴニストＰＤ－１リガンドと組み合わせたこのようなＩＬ－１２核酸発現ベクターの使用も包含する。
同様に、悪性腫瘍性疾患、特に神経膠腫、または他の固形組織腫瘍に罹患している患者を処置するための方法が提供され、前記患者へのＩＬ－１２の生物活性を有するＩＬ－１２核酸発現ベクターと非アゴニストＣＴＬＡ－４リガンドおよび／または非アゴニストＰＤ－１リガンドの投与を含む。

配列番号０１で示される融合タンパク質の構造および配列を示す。ＩＬ－１２のサブユニットｐ４０およびｐ３５を長方形で示す。これらのサブユニットはリンカー（Ｇ_４Ｓ）_３により連結されている。免疫グロブリンの結晶性フラグメントのサブユニットＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ１の最後の６個のアミノ酸を長楕円で示す。配列番号０１で示される融合タンパク質を示し、左の画像は、ＨＲＰ結合ポリクローナル抗ヒトＦｃ抗体で可視化した、還元条件を用いた免疫ブロットを示し、右の画像は、非還元条件下（ＤＴＴ－）および還元条件下（ＤＴＴ＋）での融合タンパク質の銀染色を示す。酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により評価した際のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のＩＦＮ－γ生産を示す。細胞は、ＣＤ３に対する抗体の存在下、市販のヘテロ二量体型組換えヒトＩＬ－１２（ｒｈＩＬ－１２）または配列番号０１で示される精製融合タンパク質（ｈＩＬ－１２Ｆｃ）のいずれかで刺激した（ポリクローナルＴ細胞刺激）。非刺激：ＩＬ－１２刺激も抗ＣＤ３刺激も無し（ベースライン対照）。実験は３反復で行い、エラーバーは３回の独立した実験の代表的なｓ．ｅ．ｍ．データを表す。２×１０^４Ｇｌ２６１ＩＬ－１２ＦｃまたはＧｌ２６１Ｆｃ細胞による刺激から５週間後に同系Ｃ５７／Ｂｌ６マウスから得たホルマリン固定腫瘍切片をＦ４／８０に対する抗体で染色し、ヘマトキシリンで対比染色を行った免疫組織化学を示す（代表例、各群マウスｎ＝６個体）。スケールバーは２ｍｍを示し、矢印は残存するＧｌ２６１ＩＬ－１２Ｆｃ（配列番号０２）腫瘍を示す。キタアメリカホタル（ｐｈｏｔｉｎｕｓｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼを構成的に発現し、ＩＬ－１２とマウスの免疫グロブリンＧ３の結晶性フラグメントとの融合タンパク質（Ｇｌ２６１ＩＬ－１２ＦＣ（配列番号０２））または対照としてのＦｃ単独（Ｇｌ２６１Ｆｃ）を放出する２×１０^４Ｇｌ２６１細胞の移植後の同系Ｃ５７／Ｂｌ６マウス（各群マウスｎ＝５～６個体）におけるマウス神経膠腫の非侵襲的生物発光イメージング（ＢＬＩ）を示す。上のパネル：改変型神経膠腫細胞の注射後の日数に対する関心領域（ＲＯＩ）内の光子束（ｐ／ｓ）と相関する腫瘍成長の定量。下のパネル：カプラン・マイヤー生存分析。データは２回の独立した実験の代表的なものである。キタアメリカホタル・ルシフェラーゼを構成的に発現し、ＩＬ－１２とマウス免疫グロブリンＧ３の結晶性フラグメントとの融合タンパク質（Ｇｌ２６１ＩＬ－１２Ｆｃ（配列番号０２））を放出する２×１０^４Ｇｌ２６１細胞の移植後のＷＴ動物および種々のマウス突然変異体（各群マウスｎ＝５～７個体）におけるマウス神経膠腫の非侵襲的生物発光イメージング（ＢＬＩ）を示す。上のパネル：改変型神経膠腫細胞の注射後の日数に対するＢＬＩ法による腫瘍成長の定量。下のパネル：カプラン・マイヤー生存分析。Ａ）Ｇｌ２６１ＩＬ－１２Ｆｃを、Ｔ細胞およびＢ細胞を欠くマウス（Ｒａｇ１^－／－）またはＮＫ細胞を欠くマウス（Ｉｌ－１５ｒａ^－／－）またはＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞とリンパ系組織インデューサー様細胞の両方を欠くマウス（Ｒａｇ２^－／－Ｉｌ２ｒｇ^－／－）に移植した。Ｂ）Ｇｌ２６１ＩＬ－１２Ｆｃを、それぞれＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞を欠くＭＨＣＩＩ欠陥マウス（Ｉａ（ｂ）^－／－）およびＭＨＣＩ欠陥マウス（β２ｍ^－／－）（マウスｎ＝５～８個体／群）に移植した。データは２回の独立した実験の代表的なものである。２×１０^４Ｇｌ２６１ＩＬ－１２Ｆｃ（配列番号０２）細胞で従前に刺激した生存ｗｔ動物におけるＴ細胞記憶形成を示す。ナイーブｗｔ動物に比べ、Ｇｌ２６１Ｆｃ細胞で再刺激した生存ｗｔ動物の脳から発せられる生物発光の例を示す（上のパネル、再刺激１日、７日および２１日後を示す）。さらに、改変型神経膠腫細胞の注射後の日数に対するこれらの腫瘍の生物発光を、関心領域（ＲＯＩ）内の光子／秒（ｐ／ｓ）で示す（下のパネル）。生存ｗｔ動物における対照腫瘍の急速な排除が見られた。１日目に測定された発光はこれらの２群間で同一の接種量を示唆したが、ナイーブマウスだけが７日目以降に測定可能なシグナルを示し、このことは、この場合には異所発現された炎症誘発性サイトカイン（すなわち、ＩＬ－１２Ｆｃ（配列番号０２））とは独立に抗神経膠腫記憶応答を迅速かつ効果的に消去することを示唆する（マウスｎ＝４～６個体／群）。データは２回の独立した実験の代表的なものである。キタアメリカホタル・ルシフェラーゼを構成的に発現し、ＩＬ－１２とマウス免疫グロブリンＧ３の結晶性フラグメントとの融合タンパク質（Ｇｌ２６１ＩＬ－１２Ｆｃ（配列番号０２））を放出する２×１０^４Ｇｌ２６１Ｆｃ細胞の移植後の種々のマウス突然変異体（各群マウスｎ＝４～８個体）におけるマウス神経膠腫の非侵襲的生物発光イメージング（ＢＬＩ）を示す。Ａ）ｗｔ（白丸）およびＩＦＮγ^－／－（黒丸）動物。Ｂ）ｗｔ（白丸）およびパーフォリン^－／－（黒丸）動物。改変型神経膠腫細胞の注射後の日数に対する関心領域（ＲＯＩ）内の光子束（ｐ／ｓ）と相関する腫瘍成長の定量を示す（上のパネル）。下のパネル：カプラン・マイヤー生存分析。データは２回の独立した実験の代表的なものである。２×１０^４Ｇｌ２６１Ｆｃ細胞を接種したｗｔマウスにおける腫瘍成長を示す。処置は２１日目に開始した（矢印）。ＩＬ－１２Ｆｃ（配列番号０２）（またはＰＢＳ）を腫瘍に送達する浸透圧ミニポンプを神経膠腫担持動物に移植した。２２日目に開始して、動物にαＣＴＬＡ－４遮断抗体またはＰＢＳのｉ．ｐ．注射を施した後、図に示すように注射を行った。上のグラフ：示された処置を受けた腫瘍担持ｗｔ動物のＲＯＩ光子束の定量。下のグラフ：上記動物のカプラン・マイヤー生存分析；ＰＢＳ／ＰＢＳ対ＩＬ－１２Ｆｃ／αＣＴＬＡ－４ｐ＝０．００４５、ＰＢＳ／ＰＢＳ対ＩＬ－１２Ｆｃ／ＰＢＳｐ＝０．３４３５、ＰＢＳ／αＣＴＬＡ４対ＩＬ－１２Ｆｃ／αＣＴＬＡ－４ｐ＝０．０１０１；ログランク（マンテル－コックス）検定。データは各群２～５個体を用いた３回の独立した実験の代表的なものである。２１日目にＧｌ２６１Ｆｃ細胞で刺激した後、および実施例５に記載のように全身的ＣＴＬＡ－４遮断と組み合わせたＩＬ－１２Ｆｃ（配列番号０２）の局所投与後に、同系Ｃ５７／Ｂｌ６マウスから得られた腫瘍切片の免疫組織化学を示す。これらの切片をヘマトキシリンおよびエオジンで染色した。スケールバーは２ｍｍを示す。２×１０^４Ｇｌ２６１Ｆｃ細胞を接種したｗｔマウスにおける腫瘍成長を示す。処置は２１日目に開始した（矢印）。ＩＬ－１２Ｆｃ（配列番号０２）を腫瘍に送達する浸透圧ミニポンプを神経膠腫担持動物に移植した。２２日目に開始して、動物にαＰＤ－１遮断抗体またはアイソタイプ対照抗体のｉ．ｐ．注射を施した後、図に示すように注射を行った。上のグラフ：示された処置を受けた腫瘍担持ｗｔ動物のＲＯＩ光子束の定量。下のグラフ：上記動物のカプラン・マイヤー生存分析；ＰＢＳ／アイソタイプ対ＩＬ－１２Ｆｃ／αＰＤ－１ｐ＝０．００６４、ログランク（マンテル－コックス）検定。データは各群５～６個体を用いた１回の実験の代表的なものである。５０個のＢ１６－Ｆ１０細胞を接種したｗｔマウスにおける腫瘍成長を示す。処置は５日目に開始した（矢印）。ＩＬ－１２Ｆｃ（配列番号０２）を腫瘍に送達する浸透圧ミニポンプを神経膠腫担持動物に移植した。６日目に開始して、動物にαＣＴＬＡ－４遮断抗体またはＰＢＳのｉ．ｐ．注射を施した後、図に示すように注射を行った。カプラン・マイヤー生存分析；ＰＢＳ／ＰＢＳ対ＩＬ－１２Ｆｃ／αＣＴＬＡ－４ｐ＝０．００２８、ログランク（マンテル－コックス）検定。データは各群６個体を用いた１回の実験の代表的なものである。組換えヘテロ二量体型ＩＬ－１２の全身投与とｗｔマウスの右線条体へのＣＴＬＡ４遮断２×１０^４Ｇｌ２６１Ｆｃ細胞の注射の組合せを示し、腫瘍成長を９０日間追跡した。全身処置：２１日目に（矢印）、担癌動物をまず２００μｇのαＣＴＬＡ－４マウスＩｇＧ２ｂ（９Ｄ９）（薄いグレーの三角、ｎ＝８）、２００ｎｇの組換えヘテロ二量体型ＩＬ－１２（ｒＩＬ－１２）（濃いグレーの三角、ｎ＝９）または両方の組合せ（黒い三角、ｎ＝９）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射で処置した。対照群にはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を施した（白い三角、ｎ＝７）。実験の終了まで、１００μｇのαＣＴＬＡ－４または１００ｎｇのｒＩＬ－１２または両方の組合せで３回／週、処置を継続した。上のグラフ：示された処置を受けた担癌ｗｔ動物のＲＯＩ光子束の定量。下のグラフ：上記動物のカプラン・マイヤー生存分析；ログランク（マンテル－コックス）検定を用いて、示されたｐ値を算出した；２回の独立した実験からプールしたデータ。

（実施例）
方法
動物
Ｃ５７ＢＬ／６マウスはＪａｎｖｉｅｒから入手した；ｂ２ｍ^－／－、Ｉａ（ｂ）^－／－、Ｉｌ１２ｒｂ２^－／－、Ｒａｇ１^－／－、Ｒａｇ２^－／－Ｉｌ２ｒｇ^－／－、Ｐｒｆ１^－／－およびＩｆｎｇ^－／－マウスはＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。Ｉｌ１５ｒａ^－／－マウスはＳ．Ｂｕｌｆｏｎｅ－Ｐａｕｓにより提供された。動物は全て、所内にて、特定病原体不在条件下、１２時間明／暗周期で、食物と水を自由に与えて維持した。動物実験は全て、スイス連邦獣医局（ＳｗｉｓｓＣａｎｔｏｎａｒｙｖｅｔｅｒｉｎａｒｙｏｆｆｉｃｅ）（１６／２００９）により承認されたものである。

マウス腫瘍細胞株
Ｃ５７／Ｂｌ６ネズミ神経膠腫（Ｇｌ２６１）細胞（チューリッヒ大学実験免疫学のＡ．Ｆｏｎｔａｎａにより厚意により提供された）をｐＧｌ３－ｃｔｒｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびｐＧＫ－Ｐｕｒｏ（ミュンヘン工科大学のＴ．Ｂｕｃｈにより厚意により提供された）でトランスフェクトした。線状化した構築物を、エッペンドルフ・マルチポレーターを用いて１０：１の比でエレクトポレーションにより導入した後、０．８μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で選択し、ルシフェラーゼ安定Ｇｌ２６１細胞を作出した。単一のクローンを限界希釈により単離し、頭蓋内腫瘍接種によりｉｎｖｉｖｏで継代培養し、４週間後に腫瘍を分離し、０．８μｇ／ｍｌのピューロマイシンで再選択した。
次に、細胞にｐＣＥＰ４－ｍＩｇＧ３、ｐＣＥＰ４－ｍＩｌ－１２ｍＩｇＧ３（配列番号０９）およびｐＣＥＰ４－ｍＩｌ－２３ｍＩｇＧ３（配列番号０８）（Ｅｉｓｅｎｒｉｎｇｅｔａｌ，２０１０）をエレクトポレーションにより導入し、０．８μｇ／ｍｌピューロマイシンおよび０．２３ｍｇ／ｍｌハイグロマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）でバルク選択を行った。
サイトカイン生産はＥＬＩＳＡ（ＯｐｔＥＩＡＩｌ－１２／２３ｐ４０、ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およびｒｔ－ＰＣＲ（ＩｇＧ３ｆｗ：ＡＣＡＣＡＣＡＧＣＣＴＧＧＡＣＧＣ（配列番号０３）ＩｇＧ３ｒｅｖ：ＣＡＴＴＴＧＡＡＣＴＣＣＴＴＧＣＣＣＣＴ（配列番号０４））によって検出した。Ｇｌ２６１細胞および誘導細胞株は、３７℃および１０％ＣＯ_２にて、上記で示した選択抗生物質の存在下、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したダルベッコの改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で維持した。Ｂ１６－Ｆ１０ネズミ黒色腫細胞はＡＴＣＣから購入した。

ＩＬ－１２Ｆｃの発現および精製
ＩＬ－１２Ｆｃ（配列番号０２）は、標準プロトコールに従った、４５μｇのベクターＤＮＡ（ｐＣＥＰ４－ｍＩＬ－１２ＩｇＧ３、配列番号０９）／１５ｃｍ組織培養プレートを用いたリン酸カルシウム媒介トランスフェクション後の２９３Ｔ細胞において発現された。トランスフェクション３日後および６日後に上清を採取し、濾過除菌し、ＰＢＳ中に１：１希釈した。タンパク質を、精製装置（ＡｋｔａＰｒｉｍｅ）を用い、０．１ＭグリシンｐＨ２で溶出するプロテインＧカラム（１ｍｌ、ＨｉＴｒａｐ、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）にて精製し、ＰＢＳｐＨ７．４中で一晩透析した。
ＩＬ－１２Ｆｃ（配列番号０２）の濃度および純度は、ＥＬＩＳＡ（ＯｐｔＥＩＡＩｌ－１２／２３ｐ４０、ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およびＳＤＳ－ＰＡＧＥとその後の銀染色および免疫ブロット法により測定した。ＩＬ－１２Ｆｃは、ラット抗マウスＩＬ－１２ｐ４０抗体（Ｃ１７．８、ＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓ）およびヤギ抗ラットＨＲＰ結合抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）で検出した。ヒトＩＬ－１２Ｆｃ（配列番号０１、０７）の発現にも同じ手順を用いた。

ヒトＩＬ－１２Ｆｃの特性決定
ヒトＩＬ－１２Ｆｃ（配列番号０１）の濃度および純度は、ＥＬＩＳＡ（ヒトＩＬ－１２（ｐ７０）、Ｍａｂｔｅｃｈ、＃２４５５－１Ｈ－６）およびＳＤＳ－ＰＡＧＥとその後の銀染色および免疫ブロット法により測定した。ヒトＩｇＧ４タグは、ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（＃Ａ０１７０、Ｓｉｇｍａ）で検出した。ヒトＩＬ－１２Ｆｃ（配列番号０１）の機能的特性決定のために、チューリッヒ大学の倫理ガイドラインに従って取得したＰＢＭＣを、９６ウェルプレートの、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したＲＰＭＩ培地中に１００，０００細胞／ウェルで播種し、組換えヒトＩＬ－１２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）またはヒトＩＬ－１２Ｆｃ（配列番号０１）のいずれかで刺激した。
両サイトカインを、ヒトＩＬ－１２ｐ７０ＥＬＩＳＡ（Ｍａｂｔｅｃｈ、＃２４５５－１Ｈ－６）から導き出された濃度に従って互いにノーマライズした。ＰＢＭＣを、１μｇ／ｍｌのマウスＩｇＧ２ａ抗ヒトＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、Ｂｉｏ－Ｘ－ｃｅｌｌ）の存在下で刺激した。５％ＣＯ_２および３７℃で２日間培養した後、上清を採取し、抗ヒトＩＦＮ－γＥＬＩＳＡ（Ｍａｂｔｅｃｈ、＃３４２０－１Ｈ－６）を行った。

正所性神経膠腫接種
簡単に述べると、６～１０週齢のマウスにフルニキシン（Ｂｉｏｋｅｍａ、５ｍｇ／ｋｇ体重）をｉ．ｐ．注射した後、誘導室にて３～５％イソフルラン（Ｍｉｎｒａｄ）で麻酔した。電気ヘアトリマーで頭の毛を剃った。定位フレーム（ＤａｖｉｄＫｏｐｆＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に固定した後、動物の頭皮を１０％ヨウ素溶液で消毒し、正中に沿って皮膚を切開した。
定位フレーム上での麻酔は、ノーズアダプター（ＤａｖｉｄＫｏｐｆＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）から送達される３％イソフルランで維持した。次に、鈍端シリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、７５Ｎ、２６ｓ／２”／２、５μｌ）をマイクロインジェクションポンプの操作アームに取り付け、プレグマの側位１．５ｍｍ、前位１ｍｍに置いた。針を、手動で開けた穿頭孔の中を硬膜表面から４ｍｍの深さに下ろし、１ｍｍ後退させて小さなリザーバーを作った。
マイクロインジェクションポンプ（ＵＭＰ－３、ＷｏｒｌｄＰｒｅｃｉｓｉｏｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＩｎｃ．）を用い、２×１０^４細胞を、容量２μｌ、１μｌ／分で注入した。針をその場に２分間残した後、１ｍｍ／分で後退させた。穿頭孔をボーンワックス（Ａｅｓｃｕｌａｐ、Ｂｒａｕｎ）で塞ぎ、頭皮の創傷を組織グルー（Ｉｎｄｅｒｍｉｌ、Ｈｅｎｋｅｌ）で封止した。

ｉｎｖｉｖｏ生物発光イメージング
腫瘍担持マウスを注意深く秤量し、イソフルラン（２～３％）で麻酔し、Ｄ－ルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ体重、ＣａｌｉｐｅｒＬｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を注射した。動物をＸｅｎｏｇｅｎＩＶＩＳ１００（ＣａｌｉｐｅｒＬｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）イメージングシステムの暗室に移し、麻酔を、ノーズコーンを介した２％イソフルランで維持した。注射１０分後、発光を記録した。次に、データを、ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅ２．５ソフトウエア（ＣａｌｉｐｅｒＬｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。動物の頭の周りに円形の関心領域（ＲＯＩ；１．４６ｃｍφ）を規定し、この領域の光子束を読み取り、プロットした。

確立された神経膠腫の処置
神経膠腫細胞の移植後２１日目に、腫瘍担持動物をそれらのＲＯＩ光子束に基づいて実験群に均等に分配した。ＲＯＩ光子束が１×１０^５ｐ／ｓ未満の動物を非担持個体とみなして除外した。移植４０～４８時間前（処置開始の２日前）に、浸透圧ポンプ（モデル２００４、０．２５μｌ／ｈ；Ａｌｚｅｔ）にマウスＩＬ－１２Ｆｃ（配列番号０２、ＰＢＳ中８．３３ｎｇ／μｌ）またはＰＢＳ単独を充填し、ＰＢＳ中、３７℃でプライミングした。
手術直前に、マウスにフルニキシンのｉ．ｐ．注射を行った（Ｂｉｏｋｅｍａ、５ｍｇ／ｋｇ体重）。マウスを３～５％イソフルランで麻酔し、頭皮を消毒し、正中切開を行った。従前の神経膠腫注射の穿頭孔を探し当て、ボーンワックスおよび骨膜を除去し、動物の背部に形成した皮膚嚢にポンプを入れた。注入カニューレを穿頭孔から腫瘍の推定中心へ３ｍｍ下ろした。このカニューレをシリコンチューブでポンプ（脳注入キットＩＩＩ１～３ｍｍ、Ａｌｚｅｔ）に接続し、シアノアクリレート接着剤で適正な位置に保持した。皮膚を４－０ナイロン糸で縫合した。
手術後、マウスを飲用水中０．１％（ｖ／ｖ）Ｂｏｒｇａｌ（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ）で３日間処置した。４９日目にポンプを取り出した。５種類の用量の抗マウス－ＣＴＬＡ－４マウス－ＩｇＧ２ｂ抗体（クローン９Ｄ９、ｂｉｏ－Ｘ－ｃｅｌｌ；Ｐｅｇｇｓｅｔａｌ．；ＪＥｘｐＭｅｄ２０６，１７１７－１７２５（２００９））または等量のＰＢＳを２２日目（２００μｇ）、２６日目（１００μｇ）、２９日目（１００μｇ）、３５日目（１００μｇ）および４２日目（１００μｇ）にｉ．ｐ．注射した。

あるいは、図９に示される実験のために、動物に抗マウス－ＰＤ－１ラットＩｇＧ２ａ（クローンＲＭＰ１－１４、ｂｉｏ－Ｘ－ｃｅｌｌ）またはラットＩｇＧ２ａアイソタイプ対照抗体（クローン２Ａ３、ｂｉｏ－Ｘ－ｃｅｌｌ）を施した。投与計画および適用経路は図７に示す実験と同様であった。
確立されたＢ１６－Ｆ１０由来脳腫瘍の処置のために、注射５日後にポンプを移植し、抗マウス－ＣＴＬＡ－４マウス－ＩｇＧ２ｂ抗体（クローン９Ｄ９、ｂｉｏ－Ｘ－ｃｅｌｌ；Ｐｅｇｇｓｅｔａｌ．；ＪＥｘｐＭｅｄ２０６，１７１７－１７２５（２００９））または等量のＰＢＳを６日目（２００μｇ）、１１日目（１００μｇ）、１３日目（１００μｇ）および１９日目（１００μｇ）にｉ．ｐ．注射した。

腫瘍担持動物の生存分析
腫瘍担持動物を、神経膠腫の接種後２１日目まで、ＢＬＩによりモニタリングし、神経学的症状を確認し、毎週秤量した。２１日目に１×１０^５ｐ／ｓ未満のＲＯＩ光子束を示すＧｌ２６１Ｆｃ動物は非腫瘍担持体または成長の遅い腫瘍担持体とみなし、生存分析から除外した（５～１０％）。２１日以降は、動物を毎日確認した。無気力、重度の猫背および／またはピーク体重の２０％を超える体重減として症状を示した動物は安楽死させた。Ｂ１６－Ｆ１０腫瘍担持マウスも、同じスキームに従い、５日から開始して実験の終了まで毎日スコアをとった。

組織学
組織学のために、動物をＣＯ_２で安楽死させ、氷冷ＰＢＳで経心的に潅流し、断頭した。全脳を注意深く単離し、４％ホルマリン中で固定し、パラフィンに包埋し、３μｍ切片をＨＥ染色および／または免疫組織化学向けに処理し、Ｆ４／８０（ＢＭ８；ＢＭＡｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を検出した。一次抗体をセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体で検出した。
染色はＨＲＰ基質としての３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）で可視化した。画像はオリンパス(登録商標)ＣｏｌｏｒＶｉｅｗｌｌｌｕカメラを備えたオリンパスＢＸ４１光学顕微鏡およびオリンパスｃｅｌｌ＾Ｂ画像取得ソフトウエアを用いて作製した。全脳切片の全体像を、ＡｄｏｂｅＰｈｏｔｏｓｈｏｐ(登録商標) ＣＳ３を用いてトリミングした。

統計分析
カプラン・マイヤー生存曲線の統計分析では、ログランク（マンテル－コックス）検定を用いて各図に示されたｐ値を算出した。０．０５未満のｐ値を統計学的に有意とみなした。分析はＭａｃＯＳＸ用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍバージョン５．０ａ（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅＩｎｃ）を用いて行った。

実施例１：ＩＬ－１２Ｆｃの腫瘍内発現は実験的神経膠腫の排除を促進する
本発明者らは、フレキシブルペプチドリンカーを介してｐ３５サブユニットに連結されたヒトＩＬ－１２のｐ４０サブユニットからなる融合タンパク質を設計し、クローニングした。次に、この一本鎖構築物をヒトＩｇＧ４重鎖の定常領域と融合させた（図１Ａ）。
本発明者らはこのヒト一本鎖融合タンパク質をＩＬ－１２Ｆｃ（配列番号０１）と呼称した。本発明者らは、このタンパク質をＨＥＫ２９３ヒト胎児腎臓細胞で発現させ、天然条件下で二量体型ならびに単量体型を検出した。還元条件下では、単量体型のみが検出可能である（図１Ｂ）。ＩＬ－１２Ｆｃ（配列番号０１）は、市販のヘテロ二量体型ＩＬ－１２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈから購入）と同様の機能的特性を有する。ＩＬ－１２Ｆｃ（配列番号０１）が神経膠腫により誘導された局所的免疫抑制環境に打ち勝つのに好適であり得るかどうかを判定するため、および関与するエフェクター機構を明らかにするために、本発明者らは、このサイトカインのマウス型（Ｂｅｌｌａｄｏｎｎａｅｔａｌ．，ＪＩｍｍｕｎｏｌ１６８，５４４８－５４５４（２００２），ＩＬ－１２Ｆｃ（配列番号０２））をＧｌ２６１マウス神経膠腫細胞で発現させた。
頭蓋内の腫瘍成長を生物発光イメージング（ＢＬＩ）により非侵襲的に測定するために、本発明者らはまず、キタアメリカホタル・ルシフェラーゼを構成的に発現するＧｌ２６１株を作出した。本発明者らは、この細胞株をＧｌ２６１－ｌｕｃと呼称した。
本発明者らは、次に、この細胞株を、ＩＬ－１２とマウス免疫グロブリンＧ３の結晶性フラグメントとの融合タンパク質（ＩＬ－１２Ｆｃ；配列番号０２、０９）または対照としてのＦｃ（配列番号０８）単独を絶えず放出するように改変した（それぞれ「Ｇｌ２６１ＩＬ－１２Ｆｃ」および「Ｇｌ２６１Ｆｃ」と呼称）。この融合構築物の選択されたマウスタンパク質配列はヒト変異体（配列番号０１）と相同であり、リンカー（Ｇ４Ｓ）_３により連結されたＩＬ－１２のサブユニットｐ４０とｐ３５、ならびにＩｇＧ３の結晶性フラグメントのサブユニットＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ１の最後の６個のアミノ酸からなる（ただし、ＣＨ１とＣＨ２はヒンジ領域により連結されている）。
対照フラグメントおよびＩＬ－１２融合構築物の発現のためのベクターはそれぞれ配列番号０８および０９に示される。組換えサイトカインよりもむしろ融合タンパク質を使用する意味は、それらが薬物動態の改善を示すかどうかを知るということであった。本発明者らは、サブユニットｐ４０およびｐ７０に関するＥＬＩＳＡによりＩＬ－１２Ｆｃ（配列番号０２）の分泌を確認した。本発明者らはさらに、ＲＴ－ＰＣＲによりＦｃテールの発現を確認した。頭蓋内の右線条体に移植したところ、発光測定値と立体解析学的方法により評価される腫瘍体積は強い相関を示した（データは示されていない）。

次に、本発明者らは、同系Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの右線条体にＧｌ２６１ＩＬ－１２ＦｃおよびＦｃを移植し、非浸襲性生物発光イメージング（ＢＬＩ）により腫瘍成長を追跡した。初期の発光増強の後、全ての群が注射後１４日前後に低下を示した。
Ｆｃ発現腫瘍を担持する動物はＢＬＩに急増を示し、すぐに、場合によっては注射後３５日前であっても、中止基準に達した。これに対し、ＩＬ－１２Ｆｃ発現Ｇｌ２６１腫瘍を注射した動物のＢＬＩ測定値は、２１日目以降に検出限界付近のレベルまで低下した（データは示されていない）。この所見と一致して、本発明者らはこの群の一部の動物に残存腫瘍が検出できたに過ぎなかったが、Ｆｃ対照を注射した動物は、組織学的に分析した際に、著しい腫瘍形成を示した（図２）。
Ｇｌ２６１ＩＬ－１２ＦｃまたはＧｌ２６１Ｆｃ細胞を移植した動物を９０日まで追跡したところ、本発明者らは、初期確立の後、ＩＬ－１２Ｆｃ分泌腫瘍を担持するマウスの高い割合で腫瘍の排除を認めた（図３）。

実施例２：Ｔ細胞はＩＬ－１２Ｆｃを介した神経膠腫排除の主要なエフェクター細胞種である
Ｇｌ２６１ＩＬ－１２ＦｃによるＩＬ－１２Ｆｃの分泌が腫瘍細胞自体よりもむしろ宿主に作用することを確認するために、本発明者らは、ＩＬ－１２に対する受容体を欠くマウスにおいてＧｌ２６１ＩＬ－１２ＦｃとＧｌ２６１Ｆｃの増加が同等であることを確認した。
ＩＬ－１２ｒβ２^－／－動物におけるＧｌ２６１ＩＬ－１２の制御されない増加は、ＩＬ－１２Ｆｃがレシピエントマウスである細胞種に特異的に作用することを示す（データは示されていない）。Ｔ細胞およびＮＫ細胞は、最も顕著なＩＬ－１２応答性白血球に属す。ＩＬ－１２Ｆｃを介したこれらの細胞の流入の機能的妥当性を体系的に調べるために、本発明者らは、一連のマウス突然変異体を頭蓋内Ｇｌ２６１ＩＬ－１２Ｆｃで刺激した。本発明者らは、Ｇｌ２６１ＩＬ－１２Ｆｃ細胞を、Ｔ細胞およびＢ細胞を欠くマウス（Ｒａｇ１^－／－）または従来のＮｋ細胞を欠くマウス（Ｉｌ－１５ｒａ^－／－）またはＴ細胞、Ｂ細胞、Ｎｋ細胞とリンパ系組織インデューサー様細胞の両方を欠くマウス（Ｒａｇ２^－／－Ｉｌ２ｒｇ^－／－）に移植した（図４Ａ）。
初期誘導期から注射後１４日目の後、全ての群が２８日目まで、発光の強い増強を示し、これは強い腫瘍成長を反映している。２８日目～４２日目の間に、ほとんどの動物は腫瘍により死に至った。ｗｔマウスとＩｌ－１５ｒａ^－／－マウスだけが腫瘍を制御することができ、Ｒａｇ２^－／－Ｉｌ２ｒｇ^－／－およびＲａｇ１^－／－動物に比べて有意な生存延長を示す。Ｔ細胞またはＢ細胞はＩＬ－１２Ｆｃを介した神経膠腫排除に極めて重要であると思われるが、Ｉｌ－１５ｒａ^－／－マウスのＧｌ２６１ＩＬ－１２排除能は、ＮＫ細胞は大抵の場合犠牲にできたことを示す。

次に、本発明者らは、ＭＨＣＩＩ欠陥マウス（Ｉａ（ｂ）^－／－）およびＭＨＣＩ欠陥マウス（β２ｍ^－／－）を用いて、ＣＤ４陽性Ｔ細胞およびＣＤ８陽性Ｔ細胞の寄与を検討した。ｗｔマウスとは対照的に、ＣＤ４Ｔ細胞を欠くＩａ（ｂ）^－／－マウスはＧｌ２６１ＩＬ－１２Ｆｃ腫瘍を制御することができず、β２ｍ^－／－マウスはその後間もなく神経膠腫から死に至った（図４Ｂ）。
両突然変異群とも野生型群に比べて生存期間は短かった。これらのデータは、ＩＬ－１２Ｆｃを介した腫瘍排除がヘルパーＴ細胞およびＣＴＬを含むＴ細胞の活性に依存することを明らかに示している。

実施例３：抗腫瘍記憶応答は異所発現されるＩＬ－１２ＦＣに依存しない
Ｔ細胞依存的腫瘍制御の特徴をさらに調べるために、本発明者らは、Ｇｌ２６１ＩＬ－１２Ｆｃ細胞で従前に刺激した生存ｗｔ動物をＴ細胞記憶形成に関して調べた（図５）。これらの動物は図３／実施例１に記載のとおりに処置した。一次刺激とは対照的に、本発明者らは、この場合には、生存個体またはナイーブｗｔ動物の反対側の半球にＧｌ２６１Ｆｃ細胞を注射した。
本発明者らは、数日内に対照腫瘍の速やかな排除を確認した。１日目に測定された発光はこれらの２群間で同一の接種量を示唆したが、ナイーブマウスだけが７日目以降に測定可能なシグナルを示し、このことは、この場合には異所発現された炎症誘発性サイトカインとは独立に抗神経膠腫記憶応答を迅速かつ効果的に消去することを示唆する。

実施例４：ＣＴＬはＩＬ－１２Ｆｃを介した神経膠腫排除の主要なエフェクター細胞である
ＩＬ－１２は、Ｔ_Ｈ１表現型を採るようにナイーブＴ細胞を分極させるということは、十分に確認されている（Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ，ＮａｔＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ３，１３３－１４６（２００３））。ＩＬ－１２により誘導される実験的神経膠腫の排除の基礎にある機構的理解をさらに明らかにするため、本発明者らは、Ｔ_Ｈ１の特徴的サイトカインＩＦＮ－γに欠陥があるマウス（Ｉｆｎｇ^－／－）をＩＬ－１２Ｆｃ発現Ｇｌ２６１細胞で刺激した（図６Ａ）。これらの動物は図３／実施例１に記載のとおりに処置した。
驚くべきことに、本発明者らは、ｗｔ動物の場合と同様の腫瘍排除を確認し、このことは、この排除機構がＩＦＮ－γに依存しないことを示唆する。逆に、ＩＬ－１２はまたＣＴＬの細胞傷害活性も刺激する。ＣＤ８^＋ＣＴＬおよびＮｋ細胞上で主として発現される細胞溶解性分子であるパーフォリンの役割を分析した際、本発明者らは、生存曲線に明らかな相違を見出した（図６Ｂ）。
パーフォリンは、ＣＤ８^＋ＣＴＬおよびＮＫ細胞により主として発現され、ＣＤ４^＋
Ｔ細胞によっても発現される細胞溶解性分子である。ＩＬ－１２Ｆｃにより誘導される神経膠腫排除の機構をさらに検討するために、パーフォリン欠損マウス（ｐｒｆ１^－／－）をＩＬ－１２Ｆｃ発現Ｇｌ２６１細胞で刺激した。Ｉｆｎｇ^－／－とは対照的に、パーフォリン欠損動物（ｐｒｆ１^－／－）は腫瘍を制御できなかった。このことはさらに、ＣＴＬがＩＬ－１２Ｆｃを介した神経膠腫排除の主要なエフェクター細胞であることの裏付けとなる。ｗｔとｐｒｆ１^－／－の生存曲線には明らかな相違が見られた。

実施例５：ＩＬ－１２Ｆｃの局所投与と全身的ＣＴＬＡ－４遮断の組合せは進行した段階の実験的神経膠腫に対して有効である
Ｔ細胞の活性化表現型をさらに増強および延長するために、本発明者らは、次の一連の実験で、中和抗体により共阻害分子ＣＴＬＡ－４を遮断した。進行した段階の腫瘍を有するマウスにＩＬ－１２を局所投与した。２１日前にＧｌ２６１Ｆｃで刺激し、強い生物発光シグナルをすでに示している（進行した段階の神経膠腫成長を示す）動物に処置を行った。
局所処置：２１日目に、腫瘍に５０ｎｇＩＬ－１２Ｆｃ／日（またはＰＢＳ）を送達する浸透圧ミニポンプを神経膠腫担持動物に移植した。２８日後（腫瘍注射から４９日後）に、生存動物から空のポンプを取り出した。全身処置：２２日目に、腫瘍担持動物に２００μｇのαＣＴＬＡ－４マウスＩｇＧ２ｂ（９Ｄ９）またはＰＢＳｉ．ｐ．を施した。２６日目、２９日目、３５日目および４２日目に１００μｇのαＣＴＬＡ－４で処置を持続した（図７）。ＩＬ－１２Ｆｃも抗ＣＴＬＡ－４も単独では有意な生存利益を付与しなかった。注目すべきことに、腫瘍部位への直接的な局所的ＩＬ－１２Ｆｃ投与と全身的ＣＴＬＡ－４遮断の組合せは、腫瘍の完全緩解をもたらした（図８）。
接種９０日後、生存動物の脳組織の組織学的評価は、脱髄または浸潤物のいずれの徴候も示さなかった。局所的ＩＬ－１２Ｆｃ投与と全身的ＰＤ－１遮断の組合せはまた、生存動物の有意な増加ももたらしたが、その頻度は全身的ＣＴＬＡ－４遮断の場合よりも低かった（図９）。上記の併用療法（図７）は、Ｂ１６－Ｆ１０同系マウス黒色腫細胞の頭蓋内成長の場合であっても有意な生存利益を付与する（図１０）。これは転移形成の様々な段階を飛ばしているので、二次脳腫瘍の完全なモデルではない。このように、より急速進行性の場合であっても、本併用処置は生存期間を延長する。

前臨床モデルにおける腫瘍の予防的処置は、免疫機構おsよび腫瘍細胞と腫瘍微小環境の間の相互作用についての研究を可能とし得る。しかしながら、予防的療法は、言い換えれば、癌患者を治療するためには臨床的関連が限定されるということである。よって、本発明者らは、進行性および悪性度の高い疾患モデルにおいて、介入に極めて遅い時点を選択することにした。
臨床状況を密接に模倣するために、本発明者らは、腫瘍をヒトにおいて有意な神経学的症状を引き起こす可能性の高い大きさまで進行させた。ここで、局所適用（腫瘍内）ＩＬ－１２による単剤療法は、有意ではあるが最小の生存効果しか持たなかった。
本発明者らは、すでに、全身的ＩＬ－１２処置と全身的ＣＴＬＡ－４遮断を組み合わせた際に弱い相乗作用を見出した。局所的ＩＬ－１２注射を全身的ＣＴＬＡ－４遮断と組み合わせると、抗神経膠腫効果は顕著であった。

Claims

ＩＬ－１２ポリペプチドと、
非アゴニストＣＴＬＡ－４抗体、非アゴニストＰＤ－１抗体および非アゴニストＰＤ－Ｌ１抗体から選択されるＴ細胞阻害遮断薬と、
を含む悪性腫瘍性疾患の療法において使用するための医薬組成物であって、
前記ＩＬ－１２ポリペプチドが腫瘍への、腫瘍の近傍への、または腫瘍に関連するリンパ節への投与により提供されるとともに、前記Ｔ細胞阻害遮断薬が全身送達用の剤形として提供される、
医薬組成物。
前記ＩＬ－１２ポリペプチドが、
ａ．ヒトｐ３５の配列（配列番号０５）と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列と、
ｂ．ヒトｐ４０の配列（配列番号０６）と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列と
を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
前記非アゴニストＣＴＬＡ－４抗体が、ＣＴＬＡ－４と結合するγ免疫グロブリンであり、かつ／または
前記非アゴニストＰＤ－１抗体が、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１と結合するγ免疫グロブリンである、
請求項１または２に記載の医薬組成物。
前記ＩＬ－１２ポリペプチドが腫瘍内注射用の剤形として提供される、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記Ｔ細胞阻害遮断薬が静脈内注射用の剤形として提供される、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
神経膠腫、多形性膠芽腫、髄膜腫、二次脳癌、脳転移、黒色腫、膵臓癌、肺癌、前立腺癌または膀胱癌の療法において使用するための、請求項１～５の少なくとも一項に記載の医薬組成物。
悪性腫瘍性疾患の療法において使用するための医薬組成物の製造における、ＩＬ－１２の生物活性を有するＩＬ－１２ポリペプチドと、非アゴニストＣＴＬＡ－４抗体、非アゴニストＰＤ－１抗体および非アゴニストＰＤ－Ｌ１抗体から選択されるＴ細胞阻害遮断薬と、の使用であって、前記ＩＬ－１２ポリペプチドが腫瘍への、腫瘍の近傍への、または腫瘍に関連するリンパ節への投与のための剤形として提供される、使用。
前記悪性腫瘍性疾患は、神経膠腫、多形性膠芽腫、髄膜腫、二次脳癌、脳転移、黒色腫、膵臓癌、肺癌、前立腺癌または膀胱癌である、請求項７に記載の使用。