ES2858309T3 - Un agente capaz de disminuir las células T CD8 para el tratamiento del infarto de miocardio o infarto agudo de miocardio - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal anti-CD8 capaz de disminuir las células T CD8 para el uso en un método de tratamiento del infarto de miocardio (IM) en un sujeto que lo necesita.

Description

DESCRIPCIÓN

Un agente capaz de disminuir las células T CD8 para el tratamiento del infarto de miocardio o infarto agudo de miocardio

Campo:

La presente invención pertenece al campo de la medicina, en particular la cardiología.

Antecedentes:

El Infarto de Miocardio (IM) o Infarto Agudo de Miocardio (IAM) se define como la necrosis de los cardiomiocitos debida a la isquemia temporal o permanente en las áreas de una o más arterias coronarias. El IM o IAM es la causa principal de muerte en los países industrializados, y en Francia se informó de 120.000 casos en 2014, que incluyeron 18.000 muertes. La generalización de la angioplastia coronaria, los tratamientos fibrinolíticos y antitrombóticos dio como resultado una disminución significativa de la mortalidad en un mes, alrededor del 5% en grandes ensayos aleatorizados [1]. Pero estos resultados alentadores no deberían oscurecer la incidencia creciente de la insuficiencia cardiaca tras un infarto. De hecho, IM o IAM pueden dar como resultado una remodelación perjudicial que implica la dilatación ventricular izquierda, una función contráctil cardiaca disminuida y la exposición al riesgo de insuficiencia cardiaca.

Actualmente se acepta que parte del daño miocárdico durante la oclusión coronaria no está relacionado directamente con la hipoxia tisular. La isquemia miocárdica transitoria o permanente induce la incorporación de células inflamatorias de la inmunidad innata y adaptativa en el miocardio [2]. Varios estudios han mostrado que los neutrófilos y monocitos están implicados en la remodelación perjudicial convencional, produciendo citocinas pro-inflamatorias, radicales libres de oxígeno y proteasas de la matriz [3]. Hace más de treinta años, Romson et al. ya informó del papel patógeno de los neutrófilos en un modelo de infarto en perros que mostró una disminución del tamaño de infarto en la disminución de los neutrófilos [4].

El papel de los linfocitos solamente se ha explorado recientemente. En su laboratorio, los inventores han demostrado que los linfocitos B2 maduros desempeñan un papel perjudicial en la remodelación ventricular post-isquémica, en particular al producir una quimiocina CCL-7 que estimula la incorporación de monocitos desde la médula ósea a la sangre y después al miocardio isquémico [5]. El papel global de las células T CD4 sigue siendo controvertido. Se ha demostrado que la subpoblación de linfocitos T denominada CD4 Foxp3 reguladora protege contra la remodelación post-isquémica por medio de la producción de mediadores anti-inflamatorios tales como IL-10 y TGF-p [6]. De forma similar, el papel de las células T CD8 también sigue siendo controvertido. El papel de las células T CD8 citotóxicas nunca se ha estudiado in vivo. Un estudio informó que las células T CD8 in vitro pueden inducir la apoptosis en cardiomiocitos de rata [7], pero un estudio reciente [8] sugiere que un subtipo de células T CD8 está incrementado tras un IM agudo, y tiene un papel cardioprotector durante el IM. Por tanto, existe la necesidad de entender claramente el papel de las células T CD8 durante el IM.

Sumario de la invención:

La presente invención se refiere a un anticuerpo anti-CD8 capaz de disminuir las células T CD8 para el uso en un método de tratamiento del infarto de miocardio (IM) en un sujeto que lo necesita. La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas.

Descripción detallada:

Por primera vez, los inventores han demostrado que la disminución de las células T CD8 mediante inyección de un anticuerpo monoclonal anti-CD8 en un modelo de ratón de infarto de miocardio indujo una reducción significativa del tamaño de la necrosis, redujo la remodelación perjudicial tal como se demostró mediante la disminución de la fibrosis peri-necrótica y provocó una desviación de la respuesta inmunitaria local hacia un perfil anti-inflamatorio. Estos resultados podrían proporcionar una aproximación terapéutica nueva para limitar la remodelación ventricular izquierda perjudicial tras el infarto de miocardio.

Estos resultados sugieren que la disminución de las células T CD8 es beneficiosa para el tratamiento de IM o IAM.

Método de tratamiento

La presente descripción se refiere a un método para el tratamiento de IM o IAM en un sujeto que lo necesita, que comprende una etapa de administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente capaz de disminuir las células T CD8. Más en particular, la presente descripción se refiere a un método para el tratamiento del infarto agudo de miocardio reduciendo el tamaño de la necrosis y limitando la remodelación ventricular izquierda post­ isquémica.

En particular, el agente capaz de disminuir las células T CD8 es un anticuerpo. En particular, el anticuerpo, tal como se usa en la presente memoria, es un anticuerpo monoclonal.

En particular, el método de tratamiento descrito en la presente memoria es adecuado para reducir el tamaño de la necrosis post-infarto.

En particular, el método de tratamiento descrito en la presente memoria es adecuado para reducir la zona infartada.

En particular, el método de tratamiento descrito en la presente memoria es adecuado para reducir los efectos secundarios de la remodelación.

Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "células T CD8" se refiere a células T que expresan receptores de células T (TCRs) que pueden reconocer un antígeno específico. Más en particular, la expresión "células T CD8" se refiere a células T que portan el co-receptor CD8. CD8 es una glicoproteína transmembrana que sirve como coreceptor para el TCR. Como el TCR, CD8 se une a una molécula del complejo de histocompatibilidad principal I (MHC I). Las "células T CD8" se diferencian en células T CD8 citotóxicas, y destruyen células cancerosas y células infectadas, en particular por virus, de dos maneras. La primera manera consiste en la liberación de citotoxinas tales como perforina y granzimas. La segunda manera consiste en la inducción de la apoptosis mediante la interacción de superficies celulares entre las células T CD8 y la célula infectada (FAS-L, que está presente en las células T CD8 y FAS, que está presente en la célula objetivo). Por tanto, las células T CD8 se denominan linfocitos T citotóxicos (CTL), células citotóxicas T, células T citolíticas, células T CD8+ o células T citotóxicas.

Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "agente capaz de disminuir las células T CD8" se refiere a una molécula que disminuye o destruye las células T CD8 en un paciente y/o interfiere con una o más funciones de las células T CD8, p.ej. reduciendo o previniendo la actividad citotóxica provocada por las células T CD8. En general, el agente capaz de disminuir las células T CD8 se une a un marcador superficial de las células T CD8. En general, el agente capaz de disminuir las células T CD8 es capaz de disminuir las células T CD8 (es decir, reducir los niveles de células T CD8 circulantes) en un paciente tratado con él. Tal disminución se puede conseguir por medio de diversos mecanismos tales como la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), la inhibición de la proliferación de células T CD8 y/o la inducción de la muerte de células T CD8 (p.ej. por medio de apoptosis). Los agentes capaces de disminuir las células T CD8 incluyen, pero sin limitación, los anticuerpos, péptidos de secuencias sintéticas o nativas y antagonistas de molécula pequeña que se unen a las células T CD8, opcionalmente conjugados o fusionados a un agente citotóxico. En general, el agente que disminuye las células T CD8 es un anticuerpo.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio, y de manera específica cubre los anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (p.ej. anticuerpos biespecíficos) formados por al menos dos anticuerpos intactos, y los fragmentos de anticuerpos con tal de que exhiban la actividad biológica deseada. En los anticuerpos naturales, dos cadenas pesadas están unidas entre sí mediante enlaces disulfuro, y cada cadena pesada está unida a una cadena ligera mediante un enlace disulfuro. Existen dos tipos de cadenas ligeras, lambda (l) y kappa (k). Existen cinco clases principales de cadenas pesadas (o isotipos) que determinan la actividad funcional de una molécula de anticuerpo: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. Cada cadena contiene dominios de secuencia diferentes. La cadena ligera incluye dos dominios, un dominio variable (VL) y un dominio constante (CL). La cadena pesada incluye cuatro dominios, un dominio variable (VH) y tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3, denominados en conjunto CH). Las regiones variables de las cadenas ligeras (VL) y pesadas (VH) determinan el reconocimiento y la especificidad de unión hacia el antígeno. Los dominios de la región constante de las cadenas ligeras (CL) y pesadas (CH) confieren propiedades biológicas importantes, tales como la asociación de las cadenas de anticuerpos, la secreción, la movilidad trans-placentaria, la unión al complemento, y la unión a receptores de Fc (FcR). El término incluye los fragmentos de anticuerpos que comprenden un dominio de unión al antígeno tal como Fab', Fab, F(ab')2, los anticuerpos de dominio simple (DABs), dímero TandAbs, Fv, scFv (Fv de cadena simple), dsFv, ds-scFv, Fd, anticuerpos lineales, minicuerpos, diacuerpos, fragmentos de anticuerpos biespecíficos, bicuerpo, tricuerpo (fusiones scFv-Fab, biespecíficas o triespecíficas, respectivamente); sc-diacuerpo; kappa(lamda) cuerpos (fusiones scFv-CL); BiTE (molécula biespecífica acopladora de células T, tándems scFv-scFv para atraer células T); DVD-Ig (anticuerpo de dominio variable doble, formato biespecífico); SIP (inmunoproteína pequeña, un tipo de minicuerpo); SMIP ("compuesto inmunofarmacéutico modular pequeño", dímero scFv-Fc; DART (diacuerpo estabilizado por ds, "reselección del objetivo con afinidad doble"); moléculas miméticas pequeñas de anticuerpos que comprenden una o más CDRs, y similares. Las técnicas para preparar y usar diversas construcciones basadas en anticuerpos y fragmentos son muy conocidas en la técnica (véase Kabat et al., 1991). Los diacuerpos, en particular, se describen adicionalmente en los documentos EP 404.097 y WO 93/11161; mientras los anticuerpos lineales se describen adicionalmente en Zapata et al. (1995). Los anticuerpos se pueden fragmentar mediante el uso de técnicas convencionales. Por ejemplo, se pueden generar fragmentos F(ab')2 tratando el anticuerpo con pepsina. El fragmento F(ab')2 resultante se puede tratar para reducir los puentes disulfuro para producir fragmentos Fab'. La digestión con papaína puede conducir a la formación de fragmentos Fab. También se pueden sintetizar Fab, Fab' y F(ab')2, scFv, Fv, dsFv, Fd, dAbs, TandAbs, ds-scFv, dímeros, minicuerpos, diacuerpos, fragmentos de anticuerpos biespecíficos y otros fragmentos mediante técnicas recombinantes, o se pueden sintetizar químicamente. Las técnicas para producir fragmentos de anticuerpos son muy conocidas, y se describen en la técnica. Por ejemplo, Beckman et al., 2006; Holliger y Hudson, 2005; Le Gall et al., 2004; Reff y Heard, 2001; Reiter et al., 1996; y Young et al., 1995 describen adicionalmente y posibilitan la producción de fragmentos de anticuerpos eficaces.

En particular, el anticuerpo es un anticuerpo "quimérico" en el que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase particular de anticuerpos, mientras el resto de la(s) cadena(s) es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como los fragmentos de tales anticuerpos, con tal de que exhiban la actividad biológica deseada (véase, p.ej., la pat. de EE.UU. n° 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). En general, un "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo que comprende un dominio VH y un dominio VL de un anticuerpo murino, y un dominio CH y un dominio CL de un anticuerpo humano. Los anticuerpos quiméricos incluyen los anticuerpos PRIMATIZED®, en donde la región de unión al antígeno del anticuerpo deriva de un anticuerpo producido, p.ej., inmunizando monos macacos con el antígeno de interés.

En particular, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (p.ej., murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. En particular, un anticuerpo humanizado es una inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor) en el que los residuos de una HVR (regiones hipervariables) del receptor se sustituyen por residuos de una HVR de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata, conejo, o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad, y/o capacidad deseadas. En ciertos casos, los residuos de FR (regiones estructurales) de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se hallan en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se pueden hacer para afinar adicionalmente el comportamiento del anticuerpo. En general, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y en general dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana, y todas o sustancialmente todas las FRs son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), en general la de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, véase, p.ej., Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Véase también, p.ej., Vaswani y Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle y Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994); y las pat. de EE.UU. n°s 6.982.321 y 7.087.409.

En particular, el anticuerpo es un anticuerpo humano. Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano, y/o que se ha producido mediante el uso de cualquiera de las técnicas para la producción de anticuerpos humanos tal como se describen en la presente memoria. Esta definición de un anticuerpo humano excluye de manera específica un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión al antígeno no humanos. Los anticuerpos humanos se pueden producir mediante el uso de diversos métodos conocidos en la técnica, que incluyen las bibliotecas de expresión en fagos. Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). También están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos los métodos descritos en Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991). Véase también van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001). Se pueden preparar anticuerpos humanos administrando el antígeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir tales anticuerpos en respuesta a la exposición antigénica, pero cuyos loci endógenos se han inhabilitado, p.ej., xenoratones inmunizados (véanse, p.ej., las pat. de EE.UU. n°s 6.075.181 y 6.150.584 en relación con la tecnología XENOMOUSE™). Véase también, por ejemplo, Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) en relación con los anticuerpos humanos generados por medio de una tecnología de hibridomas con células B humanas.

En particular, el anticuerpo es un anticuerpo de dominio simple. La expresión "anticuerpo de dominio simple" (sdAb) o "VHH" se refiere al dominio variable de la cadena pesada simple de los anticuerpos del tipo que se puede hallar en mamíferos camélidos, que están naturalmente desprovistos de cadenas ligeras. Tal VHH también se denomina "nanocuerpo®". Según la presente descripción, el sdAb puede ser en particular un sdAb de llama. Para una descripción general de los anticuerpos de dominio simple, se hace referencia al documento EP 0368684, Ward et al. (Nature, 12 de oct. de 1989; 341 (6242): 544-6), Holt et al., Trends Biotechnol., 2003, 21(11):484-490; y los documentos WO 06/030220, WO 06/003388.

En particular, el agente capaz de disminuir las células T CD8 es un anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar y aislar mediante el uso de cualquier técnica que posibilite la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en cultivo. Las técnicas para la producción y el aislamiento incluyen, pero sin limitación, la técnica de hibridomas, la técnica de hibridomas de células B humanas y la técnica de hibridomas con EBV.

En particular, el anticuerpo es un conjugado de anticuerpo monoclonal anti-células T CD8-fármaco (ADC). Un "conjugado de anticuerpo monoclonal anti-células T CD8-fármaco", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a un anticuerpo monoclonal anti-células T CD8 conjugado a un agente terapéutico. En particular, se conjuga un anticuerpo monoclonal anti-células T CD8 con un agente citotóxico. Se puede usar cualquier agente citotóxico bien conocido para la persona experta. Los ADCs pueden ser inmunoconjugados o bioconjugados. En general, los ADCs inmunoconjugados son anticuerpos conjugados con una segunda molécula que es un agente citotóxico o un agente inhibitorio del crecimiento. La expresión "agente citotóxico", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a una sustancia que inhibe o impide la función de las células y/o que provoca la destrucción de las células. Un "agente inhibitorio del crecimiento", cuando se usa en la presente memoria, se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente las células T CD8, in vitro o in vivo. En general, un agente citotóxico o un agente inhibitorio del crecimiento puede ser una toxina, radioisótopo o marcador. Los ejemplos de agentes inhibitorios del crecimiento incluyen los agentes que bloquean la progresión del ciclo celular, tales como los agentes que inducen la parada en G1 y la parada en la fase M. En general, los anticuerpos monoclonales descritos en la presente memoria se conjugan a un agente citotóxico por medio de un ligador. Los anticuerpos descritos en la presente memoria localizan estas proteínas en el cuerpo y se unen a la superficie de las células T CD8. La reacción bioquímica entre el anticuerpo y la proteína objetivo desencadena una señal en las células T CD8, que después absorbe o interioriza el anticuerpo junto con el agente citotóxico. Después de interiorizar el ADC, se libera el fármaco citotóxico y destruye las células T CD8. En general, los ADC bioconjugados son anticuerpos producidos mediante una estrategia química para formar una unión covalente estable entre dos moléculas, y al menos una de ellas es una biomolécula. En particular, el agente citotóxico o citostático es auristatina E (también conocida en la técnica como dolastatina-10) o un derivado de la misma. En general, el derivado de auristatina E es, p.ej., un éster formado entre la auristatina E y un cetoácido. Por ejemplo, se puede hacer reaccionar la auristatina E con ácido para-acetil benzoico o ácido benzoilvalérico para producir AEB y AEVB, respectivamente. Otros derivados de auristatina típicos incluyen AFP (dimetilvalina-valina-dolaisoleucina-dolaproina-fenilalanina-p-fenilendiamina), MMAF (dovalina-valina-dolaisoleucinadolaproina-fenilalanina), y MAE (monometil auristatina E). La síntesis y la estructura de la auristatina E y sus derivados se describen en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 20030083263; publicaciones de patentes internacionales n2s WO 2002/088172 y WO 2004/010957; y patentes de EE.UU. n°s 6.884.869; 6.323.315; 6.239.104; 6.034.065; 5.780.588; 5.665.860; 5.663.149; 5.635.483; 5.599.902; 5.554.725; 5.530.097; 5.521.284; 5.504.191; 5.410.024; 5.138.036; 5.076.973; 4.986.988; 4.978.744; 4.879.278; 4.816.444; y 4.486.414.

En particular, el agente de disminución de células T CD8 es una proteína de fusión.

La conjugación de los anticuerpos descritos en la presente memoria con los agentes citotóxicos o agentes inhibitorios del crecimiento se puede realizar mediante el uso de una diversidad de agentes bifuncionales de acoplamiento de proteínas. De manera alternativa, se puede producir una proteína de fusión que comprende el anticuerpo monoclonal y el agente citotóxico o el agente inhibitorio del crecimiento, mediante técnicas recombinantes o síntesis peptídica. La longitud del ADN puede comprender las regiones respectivas que codifican las dos porciones del conjugado adyacentes entre sí o separadas por una región que codifica un péptido ligador que no destruye las propiedades deseadas del conjugado.

En particular, el anticuerpo monoclonal anti-células T CD8 descrito en la presente memoria se usa para inducir la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). La ADCC se refiere a una forma de citotoxicidad en la que los anticuerpos se unen a los receptores de Fc (FcRs) presentes en ciertas células citotóxicas (p.ej. células citotóxicas naturales, células NK). Estas células efectoras citotóxicas son capaces de unirse de manera específica a una célula objetivo que alberga un antígeno, y posteriormente destruyen la célula objetivo. La ADCC implica la activación de las células NK mediante los anticuerpos descritos en la presente memoria. Las células NK expresan CD16, que es un receptor de Fc. Este receptor reconoce, y se une a, la porción de Fc de los anticuerpos descritos en la presente memoria que se ha unido a la superficie de las células T CD8. El receptor Fc más habitual en la superficie de una célula NK se denomina CD16 o FcyRIII. En general, en el contexto de la presente descripción, se usa un anticuerpo monoclonal anti-células T CD8 que comprende una región Fc con función efectora para inducir la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. Los métodos para inducir la ADCC incluyen en general poner en contacto las células T CD8 con una cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal anti-células T CD8 que comprende una región Fc que tiene actividad de ADCC, en donde la etapa de puesta en contacto se realiza en presencia de una célula efectora inmunitaria citolítica que expresa un receptor de Fc que tiene actividad citolítica. Las células efectoras inmunitarias que expresan receptores de Fc citolíticos (p.ej., FcYRIIIa o CD16) incluyen, por ejemplo, las células NK. Una vez que el receptor de Fc se une a la región Fc del anticuerpo monoclonal anti-células T CD8 descrito en la presente memoria, la célula NK libera citocinas (tales como IFN-y) y granzimas/perforinas que destruyen las células T CD8.

En particular, el anticuerpo monoclonal anti-células T CD8 descrito en la presente memoria se usa para inducir la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). La CDC se refiere a la lisis de una célula objetivo en presencia del complemento. La activación de la ruta clásica del complemento se inicia mediante la unión del primer componente del sistema del complemento a los anticuerpos descritos en la presente memoria, que se unen a las células T CD8. La CDC se inicia cuando C1q, el componente iniciador de la ruta clásica del complemento, se fija a la porción Fc de los anticuerpos unidos al objetivo. Brevemente, los anticuerpos descritos en la presente memoria se dirigen contra las células T CD8, la porción Fc de los anticuerpos es reconocida por C1q de la ruta clásica del complemento, y desencadena una cascada que induce la lisis de las células T CD8.

En particular, el anticuerpo monoclonal anti-células T CD8 descrito en la presente memoria interfiere en la ruta de señalización de las células T CD8. En general, el anticuerpo monoclonal anti-células T CD8 descrito en la presente memoria interacciona con CD8, el marcador de la superficie, e inhibe la interacción de CD8 con moléculas coestimuladoras que son necesarias para la activación de las células T CD8.

En particular, el anticuerpo monoclonal anti-células T CD8 induce la muerte de las células T CD8 (p.ej., por medio de apoptosis).

En particular, el anticuerpo anti-células T CD8 es monoespecífico, biespecífico, triespecífico, o de mayor multiespecificidad. Los anticuerpos multiespecíficos, que incluyen los anticuerpos biespecíficos y triespecíficos, útiles para poner en práctica los métodos descritos en la presente memoria, son anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente tanto a las células T CD8 como a un segundo receptor superficial celular o complejo de receptores que media en la ADCC, la fagocitosis, y/o la CDC, tal como CD16/FcgRIII, CD64/FcgRI, receptores inhibitorios o activantes de células citotóxicas, o la proteína de control del complemento CD59. En particular, la unión de la porción del anticuerpo multiespecífico a la segunda molécula superficial celular o complejo de receptores incrementa las funciones efectoras del anticuerpo anti-células T CD8. En particular, el anticuerpo anti-células T CD8 es un anticuerpo biespecífico. La expresión "anticuerpo biespecífico" tiene su significado general en la técnica, y se refiere a cualquier molécula que consiste en un sitio de unión para un antígeno objetivo en las células T CD8 y un segundo lado de unión para una molécula que desencadena la activación en una célula efectora, tal como CD16 (FcyRlll) en células citotóxicas naturales (NK), monocitos y macrófagos, CD89 (FcaRI) y CD64 (FcyRI) en neutrófilos y monocitos/macrófagos, y DEC-205 en células dendríticas. Según la presente descripción, el anticuerpo biespecífico comprende un sitio de unión para las células T CD8. Aparte de la incorporación específica de la población de células efectoras preferidas, los anticuerpos biespecíficos evitan la competición con la inmunoglobulina G (IgG) endógena cuando el sitio de unión seleccionado para la molécula activadora en la célula efectora no se solapa con los epítopos de unión de Fc. Los métodos para producir anticuerpos biespecíficos se conocen en la técnica. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares cadena pesadacadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas tienen especificidades diferentes (véase, p.ej., Milstein et al., 1983, Nature 305:537-39). Debido a la mezcla aleatoria de las cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpos diferentes, de las cuales solamente una tiene la estructura biespecífica correcta. Se describen procedimientos similares en la publicación internacional n° WO 93/08829, y en Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-59. En el contexto de la presente descripción, los términos "tratamiento" o "tratar", tal como se usan en la presente memoria, se refieren al tratamiento tanto profiláctico como preventivo, así como al tratamiento curativo o modificador de una enfermedad, que incluye el tratamiento de un paciente en riesgo de haber contraído la enfermedad o que se sospecha que ha contraído la enfermedad, así como los pacientes que están enfermos o a los que se les ha diagnosticado que padecen una enfermedad o afección médica, e incluye la eliminación de la recidiva clínica. El tratamiento se puede administrar a un sujeto que tiene un trastorno médico o que finalmente puede contraer el trastorno, para prevenir, curar, retrasar el inicio, reducir la gravedad, o mejorar uno o más síntomas de un trastorno o trastorno recurrente, o para prolongar la supervivencia de un sujeto más allá de la esperada en ausencia de tal tratamiento. Un "régimen terapéutico" significa el patrón de tratamiento de una enfermedad, p.ej., el patrón de dosificación usado durante la terapia. Un régimen terapéutico puede incluir un régimen de inducción y un régimen de mantenimiento. La frase "régimen de inducción" o "periodo de inducción" se refiere a un régimen terapéutico (o la porción de un régimen terapéutico) que se usa para el tratamiento inicial de una enfermedad. El objetivo general de un régimen de inducción es proporcionar un nivel elevado de fármaco a un paciente durante el periodo inicial de un régimen de tratamiento. Un régimen de inducción puede emplear (en parte o completamente) un "régimen de carga", que puede incluir administrar una dosis mayor del fármaco de la que emplearía un médico durante un régimen de mantenimiento, administrar un fármaco con más frecuencia con la que un médico administraría el fármaco durante un régimen de mantenimiento, o ambos. La frase "régimen de mantenimiento" o "periodo de mantenimiento" se refiere a un régimen terapéutico (o la porción de un régimen terapéutico) que se usa para el mantenimiento de un paciente durante el tratamiento de una enfermedad, p.ej., para mantener al paciente en remisión durante periodos largos de tiempo (meses o años). Un régimen de mantenimiento puede emplear una terapia continua (p.ej., la administración de un fármaco a intervalos regulares, p.ej., semanalmente, mensualmente, anualmente, etc.) o una terapia intermitente (p.ej., tratamiento interrumpido, tratamiento intermitente, tratamiento en la recidiva, o tratamiento tras la consecución de un criterio predeterminado particular [p.ej., dolor, manifestación de la enfermedad, etc.]).

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad mínima de agente activo que es necesaria para conferir un beneficio terapéutico a un sujeto. Por ejemplo, una "cantidad terapéuticamente eficaz" para un paciente es tal cantidad que induce, mejora o de otra manera provoca una mejora en los síntomas patológicos, la progresión de la enfermedad o las condiciones fisiológicas asociadas, o la resistencia a sucumbir a un trastorno.

El término "sujeto" se refiere a cualquier mamífero, tal como un roedor, un felino, un canino, y un primate. En particular, en la presente descripción, el sujeto es un ser humano afectado o susceptible de verse afectado de IM o IAM.

Composición farmacéutica

En particular, la presente descripción se refiere a una composición farmacéutica que comprende un agente capaz de disminuir las células T CD8. El agente capaz de disminuir las células T CD8 descrito en la presente memoria se puede combinar con excipientes farmacéuticamente aceptables, y opcionalmente matrices de liberación sostenida, tales como polímeros biodegradables, para formar las composiciones terapéuticas.

En las composiciones farmacéuticas de la presente descripción, el principio activo, solo o en combinación con otro principio activo, se puede administrar en una forma de administración unitaria, como una mezcla con soportes farmacéuticos convencionales, a animales y seres humanos. Las formas unitarias de administración adecuadas comprenden formas para la vía oral tales como comprimidos, cápsulas de gelatina, polvos, gránulos y suspensiones o disoluciones orales, formas de administración sublinguales y bucales, aerosoles, implantes, formas de administración subcutáneas, transdérmicas, tópicas, intraperitoneales, intramusculares, intravenosas, subdérmicas, transdérmicas, intratecales e intranasales, y formas de administración rectales.

En general, las composiciones farmacéuticas contienen vehículos que son farmacéuticamente aceptables para una formulación capaz de ser inyectada. Estas pueden ser en particular isotónicas, estériles, soluciones salinas (fosfato monosódico o disódico, cloruro sódico, potásico, cálcico o magnésico, y similares, o mezclas de tales sales), o composiciones secas, especialmente liofilizadas que tras la adición, dependiendo del caso, de agua esterilizada o solución salina fisiológica, permiten la constitución de soluciones inyectables.

Las formas farmacéuticas adecuadas para el uso inyectable incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles; formulaciones que incluyen aceite de sésamo, aceite de cacahuete o propilen glicol acuoso; y polvos estériles para la preparación improvisada de disoluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida, de manera que se pueda utilizar fácilmente con una jeringa. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y se debe preservar de la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos.

Las disoluciones que comprenden los compuestos descritos en la presente memoria en forma de base libre o sales farmacológicamente aceptables se pueden preparar en agua mezclada de manera adecuada con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. También se pueden preparar dispersiones en glicerol, polietilen glicoles líquidos, y mezclas de los mismos, y en aceites. En condiciones habituales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para impedir el crecimiento de microorganismos.

El agente capaz de disminuir las células T CD8 descrito en la presente memoria se puede formular en una composición en una forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden obtener a partir de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxido sódico, potásico, amónico, cálcico, o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares.

El vehículo también puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilen glicol, y polietilen glicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de una dispersión, y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos se puede llevar a cabo mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede llevar a cabo usando en las composiciones agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Se preparan disoluciones inyectables estériles incorporando los polipéptidos activos en la cantidad necesaria en el disolvente adecuado con otros de los ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización mediante filtración. En general, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios de los enumerados anteriormente. En el caso de los polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son las técnicas de secado al vacío y liofilización, que proporcionan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una disolución de los mismos previamente esterilizada mediante filtración. Tras la formulación, las disoluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación farmacéutica, y en una cantidad que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una diversidad de formas farmacéuticas, tales como el tipo de disoluciones inyectables descritas anteriormente, pero también se pueden emplear cápsulas de liberación de fármacos y similares.

Para la administración parenteral en una disolución acuosa, por ejemplo, la disolución se debería tamponar de manera adecuada si es necesario, y el diluyente líquido primero se haría isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas disoluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, los medios acuosos estériles que se pueden emplear serán conocidos para los expertos en la técnica teniendo en cuenta la presente descripción. Por ejemplo, se podría disolver una dosis en 1 ml de disolución isotónica de NaCl y añadirla a 1000 ml de fluido de hipodermoclisis o inyectarla en el sitio propuesto de infusión. Se dará necesariamente cierta variación en la dosis dependiendo de la afección del sujeto a tratar. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis adecuada para el sujeto individual.

El agente capaz de disminuir las células T CD8 descrito en la presente memoria se puede formular en una mezcla terapéutica para que comprenda alrededor de 0,0001 a 1,0 miligramos, o alrededor de 0,001 a 0,1 miligramos, o alrededor de 0,1 a 1,0 o incluso alrededor de 10 miligramos por dosis más o menos. También se pueden administrar múltiples dosis.

Además de los compuestos descritos en la presente memoria formulados para administración parenteral, tal como inyección intravenosa o intramuscular, otras formas farmacéuticamente aceptables incluyen, p.ej., comprimidos u otros sólidos para administración oral; formulaciones de liposomas; cápsulas de liberación retardada; y cualquier otra forma usada actualmente.

La presente descripción se ilustrará adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos y figuras no se deberían interpretar de ninguna manera como limitantes del alcance de la presente descripción.

Figuras:

Figura 1: Disminución de células T CD8 en la sangre en el día 3 (A). Cinética de la disminución en el miocardio, se realizó la ligadura coronaria en el día 0. P < 0,0001 (n = 6-8 / grupo) (B)

Figura 2: Cuantificación del mARN de Perforina y Granzima B en el día 7 tras IM mediante qPCR en el corazón isquémico, * P<0,05. (n = 6-8 / grupo).

Figura 3: Cinética de la infiltración de células inmunitarias en el miocardio isquémico: Análisis cuantitativo de la infiltración celular mediante citometría de flujo. (n = 6-8 /grupo /punto temporal).

Figura 4: Tamaño de infarto en D21: Análisis cuantitativo (A) y fotografías representativas (B) del área infartada en el miocardio. En rojo/púrpura y azul el miocardio sano, y en verde el área infartada *** P<0,001. (n = 12/grupo).

Figura 5: Fibrosis intersticial en el Día 21 en el área peri-infarto. Análisis cuantitativo (A) y fotografías representativas (B) de la fibrosis intersticial teñida con Rojo Sirius. Amarillo para los cardiomiocitos y Rojo para las fibras de colágeno y reticulina, ***: P<0,005. (n = 12/grupo).

Figura 6: Expresión génica mediante qPCR, 7 días tras la ligadura coronaria. (n=4-6/grupo).

Figura 7: Actividad de metaloproteasa en el día 7 tras el IM, Análisis (A) y fotografías representativas (B) de zimografía que muestran la actividad catalítica de MMP-9 y -2 obtenida de las proteínas miocárdicas, *: P<0,05 (n=4-6/grupo).

Figura 8: Expresión génica de citocinas (A a E) en el miocardio isquémico en el día 7 tras el IM agudo mediante qPCR. P<0,05 * (n= 4-6/grupo).

Figura 9: Expresión génica de macrófagos del corazón isquémico analizada mediante qPCR. Marcadores M1: COX2, iNOS y TNF-a, y marcadores M2: Arginasa-1, IL-10 y CD206 (n = 4-6 / grupo).

Figura 10: Efecto de la disminución de células T CD8+ sobre la función cardiaca. Se indujo un infarto de miocardio en ratones C57B16 macho de 10 semanas de edad mediante ligadura coronaria izquierda. Una hora más tarde, un grupo de control de ratones recibió un isotipo de IgG de manera intraperitoneal (100 pg/ratón, n=8) y un grupo recibió el anticuerpo de disminución anti-CD8 IP (100 pg/ratón, n=8). Los animales recibieron una inyección adicional de anticuerpo en el día 14.

Figura 11: Efecto a largo plazo de la disminución de células T CD8 sobre el tamaño de infarto Se indujo un infarto de miocardio en ratones C57B16 macho de 10 semanas de edad mediante ligadura coronaria izquierda. Una hora más tarde, un grupo de control recibió un isotipo de IgG de manera intraperitoneal (100 pg/ratón) y un grupo recibió el anticuerpo de disminución anti-CD8 IP (100 pg/ratón) cada 14 días. Los animales se sacrificaron en el día 56 (N=5/grupo).

Ejemplo:

Material y método:

Infarto de miocardio

Todos los ratones fueron de origen C57BL/6J. C57BL/6 (Janvier). Se indujo el infarto de miocardio mediante una ligadura coronaria izquierda (Zouggari et al, Nat Med 2013). Los ratones se anestesiaron mediante el uso de ketamina (100 mg por kg de peso corporal) y xilazina (10 mg por kg de peso corporal) por medio de inyección intraperitoneal (i.p.), y después se intubaron y se ventilaron con aire mediante el uso de un respirador para animales pequeños. Se afeitó la pared torácica y se llevó a cabo una toracotomía en el cuarto espacio intercostal izquierdo. Se visualizó el ventrículo izquierdo, después se retiró el pericardio, y se ligó permanentemente la arteria descendente anterior izquierda mediante el uso de una sutura monofilamento 7/0 (Peters surgical, Francia) en el sitio de aparición bajo la aurícula izquierda. Los cambios de color significativos en el área isquémica se consideraron indicativos de una oclusión coronaria eficaz. La toracotomía se cerró con suturas monofilamento 6/0. Se llevó a cabo el mismo procedimiento para los ratones de control operados de manera simulada, excepto porque la ligadura se dejó desatada. El tubo endotraqueal se retiró una vez que se reanudó la respiración espontánea, y los ratones se colocaron en una almohadilla caliente mantenida a 37 °C hasta que despertaron completamente. Una hora tras la inducción del infarto de miocardio, los ratones se trataron i.p. con un anticuerpo anti-CD8 monoclonal de ratón previamente validado (200 pg por ratón), con un control de isotipo. Los experimentos se llevaron a cabo según las directrices veterinarias francesas, y las formuladas por la Comunidad Europea para el uso de animales experimentales, y fueron aprobadas por el Instituto Nacional de Salud e Investigación Médica.

Análisis histopatológico

Se estudió la cicatrización cardiaca tras el infarto de miocardio en el día 21. Los corazones se extirparon, se lavaron en PBS y se congelaron en nitrógeno líquido. Los corazones se cortaron mediante un criostato (CM 3050S, Leica) en cortes de 7 gm de grosor. Se llevaron a cabo las tinciones tricrómica de Masson y rojo Sirius para el estudio del tamaño de infarto y la fibrosis miocárdica. El tamaño de infarto (en %) se calculó como la circunferencia total de infarto dividida por la circunferencia total del V.I. La inmunotinción de las células T CD8 en la biopsia humana se llevó a cabo según un método indirecto con inmunoperoxidasa mediante el uso de un anticuerpo anti-CD8 conjugado con biotina de ratón (Clon C8/144B, Dako) a una dilución de 1:50.

Células

Los ratones se sacrificaron a las 12 h y en los días 1, 3, 5, 7 y 14 tras el infarto de miocardio. Se extrajo sangre periférica por medio de una punción en la vena cava inferior con disolución de heparina. La sangre completa se lisó tras una tinción de inmunofluorescencia mediante el uso de la disolución de lisis de BD FACS (BD Biosciences), y se determinó el número total de leucocitos sanguíneos mediante el uso de azul tripán. Se extrajeron células de la médula ósea del fémur y la tibia, y se filtraron a través de una malla de nailon de 40 gm (BD Biosciences). Se recogieron los bazos, se desmenuzaron con tijeras finas y se filtraron a través de una malla de nailon de 40 gm (BD Biosciences). Para los esplenocitos y las células derivadas de médula ósea, la suspensión celular se centrifugó a 400 g durante 10 min a 4 °C. Los eritrocitos se lisaron mediante el uso de tampón de lisis de eritrocitos (Sigma-Aldrich), y los esplenocitos y las células de médula ósea se lavaron con PBS complementado con un 3% (vol/vol) de FBS. Se recogieron los corazones, se desmenuzaron con tijeras finas y se colocaron en un cóctel de colagenasa I (450 U ml-1), colagenasa XI (125 U ml-1), DNasa I (60 U ml-1), y hialuronidasa (60 U ml-1) (Sigma-Aldrich), y se agitó a 37 °C durante 1 h. Las células se trituraron después a través de una malla de nailon (40 gm) y se centrifugaron (10 min, 400 g, 4 °C). Las células mononucleares se purificaron mediante centrifugación en gradiente de densidad mediante el uso de Ficoll (Histopaque-1083, Sigma-Aldrich) (25 min, 400 g, temperatura ambiente). Las suspensiones celulares resultantes se lavaron mediante el uso de PBS, y se determinó el número total de leucocitos.

Citometría de flujo

Se usaron los siguientes anticuerpos: anti-CD11b conjugado a FITC (M1/70, BD Pharmingen), anti-Ly6G conjugado a ^{ficoeritrina (PE) (1A8, BD Pharmingen), anti-NK-1.1 conjugado a PE} (Pk ^{136, BD Pharmingen), anti-Ly-6B.2 conjugado} a aloficocianina (APC) (clon 7/4, AbD Serotec), anti-CD3e conjugado a APC (17A2, eBioscience), anti-CD4 conjugado a FITC (RM 4-5, eBioscience), anti-CD8a conjugado a PercP (53-6.7, BD Pharmingen), anti-CD45R/B220 conjugado a PE (RA3-6B2, eBioscience), anti-IgM conjugado a APC (11/41, eBioscience), anti-CD11c conjugado a PE-Cy7 (N418, eBioscience), anti-CD19 conjugado a APC (1D3, BD Pharmingen), anti-CD45.1 conjugado a APC (A20, BD Pharmingen). Todos los anticuerpos se usaron a una dilución de 1:100, excepto para anti-Ly-6B.2 conjugado a APC, que se usó a 1:20. Los monocitos se identificaron como CD11bhiLy6G-7/4hi/l°. Los neutrófilos se identificaron como CD11b+Ly6Ghi7/4hi. Los macrófagos y las células dendríticas se identificaron como CD11chi. Las células citotóxicas naturales se identificaron como CD11b+Ly6G-7/4-NK1.1+. Las células se analizaron mediante el uso de un citómetro de flujo (LSR II, BD Biosciences).

PCR cuantitativa en tiempo real

La PCR cuantitativa en tiempo real se llevó a cabo en un aparato Step-One Plus (Applied Biosystems). Se usó GAPDH para normalizar la expresión génica. Se usaron las siguientes secuencias de cebadores:

Análisis estadístico

Todos los datos se expresan como la media ± EE. Las comparaciones de 2 grupos diferentes se analizaron mediante la prueba U de Mann-Whitney. Se usó la prueba ANOVA con análisis post-hoc de Bonferroni para más de 2 grupos. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo con el programa informático Prism 5 (GraphPad). Los valores P < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

Resultados:

Eficacia del anticuerpo de disminución anti-CD8

La administración intravenosa del anticuerpo anti-CD8 permitió una disminución de más del 95% de las células T CD8+ en la sangre, el bazo y el miocardio (Figura 1A). La disminución se mantiene a lo largo del tiempo (Figura 1B). En el miocardio isquémico, la disminución de las células T CD8 está asociada a una reducción significativa de perforina y granzima B (mARN mediante qPCR), ambas enzimas producidas por las células T CD8+ citotóxicas (Figura 2). Efecto de la disminución de las células T CD8 sobre la infiltración de subgrupos de leucocitos

Recientemente se ha informado que durante el IM agudo, las células B controlan la incorporación de monocitos en el miocardio a través de la producción de Ccl-7. De acuerdo con estos resultados, se determinó el efecto de la disminución de las células T CD8 sobre la incorporación de leucocitos (monocitos, macrófagos y neutrófilos) en el ventrículo izquierdo isquémico mediante el uso de citometría de flujo. No se observó ninguna diferencia entre el grupo de control y el grupo con disminución de células T CD8 en los Días1, D3, D6 y D11 tras la ligadura de la arteria coronaria (Figura 3).

Disminución de CD8 y tamaño del infarto

Veintiún días tras el IM, se sacrificaron los animales y se cuantificó el área infartada mediante el uso de una tinción tricrómica de Masson. En comparación con el grupo de control, se observó una disminución del 60% del tamaño de infarto en el grupo con disminución de CD8 (P <0,001, Figura 4). Tras la tinción con rojo Sirius, también se descubrió una reducción significativa de la fibrosis miocárdica en el grupo con disminución de CD8 (Figura 5).

Actividad de metaloproteasas en el miocardio isquémico

Las metaloproteasas desempeñan un papel importante en la remodelación ventricular post-isquémica. De manera interesante, se descubrió una disminución de la expresión génica de MMP-2 y -9 en el miocardio isquémico de ratones con disminución de CD8 en comparación con el grupo de control. Además, el mARN de Timp-1, un inhibidor de metaloproteinasas, está incrementado en el corazón isquémico del ratón con disminución de CD8 (Figura 6). Mediante el uso de zimografía con los extractos de proteínas del miocardio isquémico, se confirmó la disminución significativa de la actividad catalítica miocárdica de MMP-2 y MMP-9 tras el tratamiento anti-CD8 (Figura 7).

Respuesta inflamatoria en el miocardio isquémico

El tratamiento anti-CD8 alteró significativamente el perfil de la expresión de citocinas en el miocardio isquémico. No se descubrió ninguna diferencia entre los grupos en relación con el mARN de los genes que codifican citocinas pro­ inflamatorias tales como IL-1 beta, IL-6 y TNF-alfa. Sin embargo, se descubrió un incremento significativo de mARN de IL-10 y TGF-beta1 tras la disminución de las células T CD8 (Figura 8A a 8E).

Finalmente, 7 días tras el infarto de miocardio, se aislaron los macrófagos del tejido cardiaco mediante el uso de citometría de flujo, y se analizó su perfil de expresión génica mediante qPCR. La disminución de las células T CD8 indujo una desviación de la polarización de los macrófagos hacia un fenotipo M2 con un incremento significativo del mARN de Arginasa-1, IL-10 y una tendencia al incremento del mARN de CD206 (Receptor de Manosa). La expresión de los genes M1 tal como iNos y Cox-2 no fue diferente entre ambos grupos. Finalmente, hubo una disminución significativa en la expresión de mARN de TNF-alfa en los macrófagos de los ratones con disminución de CD8 (Figura 9).

Infiltración de células T CD8 en corazón isquémico humano

Finalmente, se analizó la infiltración de células T CD8 en biopsias miocárdicas humanas de pacientes que padecieron un infarto de miocardio mediante inmunohistoquímica. Se observó una infiltración en la etapa temprana del evento isquémico (1 día) en el área peri-vascular y peri-infarto. (Figura 10 A). La infiltración de células T CD8 fue más pronunciada en la etapa posterior del IM (7 días) (Figura 10 B).

Efecto de la disminución de células T CD8+ sobre la función cardiaca

Se indujo un infarto de miocardio en ratones C57B16 macho de 10 semanas de edad mediante ligadura coronaria izquierda. Una hora más tarde, un grupo de control de ratones recibió un isotipo de IgG de manera intraperitoneal (100 |jg/ratón, n=8) y un grupo recibió el anticuerpo de disminución anti-CD8 IP (100 |jg/ratón, n=8). Los animales recibieron una inyección adicional de anticuerpo en el día 14.

La disminución de CD8 en la sangre se confirmó mediante citometría de flujo en el día 9 y el día 28. La función ventricular izquierda se analizó con enmascaramiento mediante ecocardiografía en el día 9 y el día 28. Además, en el día 28, se analizó la función cardiaca de manera invasiva mediante el uso de cateterización ventricular izquierda. Como se representa más adelante, se descubrió que la disminución de células T CD8 fue protectora, ya que la función sistólica ventricular izquierda fue significativamente mayor en los animales con disminución de CD8 en los días 9 y 28 tras el IM en comparación con los animales tratados con el isotipo (Figura 1A). La disminución de CD8 limitó la remodelación ventricular izquierda perjudicial, ya que el diámetro telediastólico ventricular izquierdo fue significativamente inferior en los animales con disminución de CD8 (Figura 1B). En el sacrificio, mediante el uso de un catéter ventricular Millar, se midieron varios parámetros que reflejan la contractilidad (dP/dt max) y relajación (dP/dt min) cardiaca. Como se muestra más adelante, la disminución de las células T CD8 mejoró ambos parámetros hemodinámicos tras el infarto de miocardio.

Efecto a largo plazo de la disminución de células T CD8 sobre el tamaño de infarto

Se indujo un infarto de miocardio en ratones C57B16 macho de 10 semanas de edad mediante ligadura coronaria izquierda. Una hora más tarde, un grupo de control recibió un isotipo de IgG de manera intraperitoneal (100 jg/ratón) y un grupo recibió el anticuerpo de disminución anti-CD8 IP (100 jg/ratón) cada 14 días. Los animales se sacrificaron en el día 56 (N=5/grupo). Se cuantificó el tamaño de infarto tras la tinción tricrómica de Masson. Como se representa más adelante, el tamaño de infarto fue significativamente más pequeño en los animales con disminución de CD8 en el día 56, lo que sugiere que los efectos protectores de la disminución de CD8 se mantuvieron a lo largo del tiempo.

Conclusión:

Por primera vez, los inventores han demostrado que la disminución de las células T CD8+ mediante inyección de un anticuerpo monoclonal anti-CD8 en un modelo de ratón de infarto de miocardio indujo una reducción significativa del tamaño de la necrosis, redujo la remodelación perjudicial tal como se demostró mediante la disminución de la fibrosis peri-necrótica y provocó una desviación de la respuesta inmunitaria local hacia un perfil anti-inflamatorio. Estos resultados son alentadores y podrían proporcionar una aproximación terapéutica nueva para limitar la remodelación ventricular izquierda perjudicial tras el infarto de miocardio.

A lo largo de esta solicitud, las diversas referencias describen el estado de la técnica a la que pertenece la presente descripción.

Referencias:

1. Puymirat, E., et al., Association of changes in clinical characteristics and management with improvement in survival among patients with ST-elevation myocardialinfarction. JAMA, 2012. 308(10): págs. 998-1006.

2. Frangogiannis, N.G., Regulation of the inflammatory response in cardiac repair. Circ Res, 2012. 110(1): págs. 159­ 73.

3. Silvestre, J.S., D.M. Smadja, y B.I. Levy, Postischemic revascularization: from cellular and molecular mechanisms to clinical applications. Physiol Rev, 2013. 93(4): págs. 1743-802.

4. Romson, J.L., et al., Reduction of the extent of ischemic myocardial injury by neutrophil depletion in the dog. Circulation, 1983. 67(5): págs. 1016-23.

5. Zouggari, Y., et al., B lymphocytes trigger monocyte mobilization and impair heart function after acute myocardial infarction. Nat Med, 2013. 19(10): págs. 1273-80.

6. Weirather, J., et al., Foxp3+ CD4+ T cells improve healing after myocardial infarction by modulating monocyte/macrophage differentiation. Circ Res, 2014. 115(1): págs. 55-67.

7. Varda-Bloom, N., et al., Cytotoxic T lymphocytes are activated following myocardial infarction and can recognize and kill healthy myocytes in vitro. J Mol Cell Cardiol, 2000. 32(12): págs. 2141-9.

8. Curato, Caterina, et al. "Identification of noncytotoxic and IL-10producing CD8+ AT2R+ Tcellpopulation in response to ischemic heart injury." The Journal of Immunology 185.10 (2010): 6286-6293.

9. Bourgeois, C. y B. Stockinger, CD25+CD4+ regulatory T cells and memory T cells prevent lymphopenia-induced proliferation of naive Tcells in transient states of lymphopenia. J Immunol, 2006. 177(7): págs. 4558-66.

Claims (4)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal anti-CD8 capaz de disminuir las células T CD8 para el uso en un método de tratamiento del infarto de miocardio (IM) en un sujeto que lo necesita.

2. El anticuerpo monoclonal anti-CD8 capaz de disminuir las células T CD8 para el uso según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo está conjugado a un agente citotóxico.

3. El anticuerpo monoclonal anti-CD8 capaz de disminuir las células T CD8 para el uso según la reivindicación 1, que induce la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC).

4. El anticuerpo monoclonal anti-CD8 capaz de disminuir las células T CD8 para el uso según la reivindicación 1, que es un anticuerpo quimérico, humanizado o humano.