BR112019020451A2

BR112019020451A2 - composições e métodos para se direcionar e matar células-tronco positivas de câncer ?lfa-v beta-3 positiva (cscs) e tratamento de cânceres resistentes ao medicamento

Info

Publication number: BR112019020451A2
Application number: BR112019020451A
Authority: BR
Inventors: Cheresh David; Wettersten Hiromi
Original assignee: Univ California
Priority date: 2017-03-31
Filing date: 2018-03-30
Publication date: 2020-04-28
Also published as: MX2019011717A; CN110662559A; EP3600422B1; US20240067733A1; KR20190133205A; US20200109205A1; JP2020512978A; JP2021095423A; KR102630070B1; WO2018183894A1; EP3600422A4; EP4353318A2; AU2018243670A1; IL269746A; EA201992326A1; EP4353318A3; EP3600422A1; CA3058458A1

Abstract

são fornecidas composições e métodos para tratar ou melhorar um câncer, visando os polipeptídeos avß3 (avb3) expressos na superfície celular em células-tronco do câncer (cscs) para matar os cscs, tratando, assim, melhorando ou retardando o desenvolvimento de cânceres causados ou iniciados por ou sustentados por células cancerígenas ou tumorais, ou células-tronco cancerígenas (cscs), expressando polipeptídeos avß3 em suas superfícies celulares. são fornecidas composições e métodos para direcionar e matar células-tronco cancerígenas avß3-positivas (cscs) e tratar cânceres resistentes a medicamentos. em modalidades alternativas, as composições e métodos aqui fornecidos utilizam um anticorpo que pode se ligar especificamente ao avß3 humano que também compreende uma porção fc que pode mediar a morte por citotoxicidade mediada por células (adcc) mediada por célula dependente de anticorpo de células cancerígenas ou tumorais por macrófagos; por exemplo, que use um anticorpo humanizado para avß3 que foi modificado para incluir uma porção fc manipulada que se liga especificamente aos macrófagos humanos.

Description

“COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA SE DIRECIONAR E MATAR CÉLULASTRONCO POSITIVAS DE CÂNCER ALFA-V BETA-3 POSITIVA (CSCS) E TRATAMENTO DE CÂNCERES RESISTENTES AO MEDICAMENTO” PEDIDOS RELACIONADOS [0001] Este Pedido Internacional de Tratado de Convenção de Patentes (PCT) reivindica o benefício de prioridade ao Pedido Provisório No. 62 / 479.768, depositado em 31 de março de 201 7. O pedido acima mencionado é expressamente incorporado aqui por referência em sua totalidade e para todos os fins.

DIREITOS DO GOVERNO [0002] Esta invenção foi feita com apoio do governo sob o número de concessão T32 OD017853; T32 HL086344; T32 HL098062-03; R-857GC; NCI R01CA045726, concedido pelo National Institutes of Health (NIH). O governo tem certos direitos na invenção.

CAMPO TÉCNICO [0003] A presente invenção se refere, de modo geral, ao campo da imunologia e oncologia. Em formas de realização alternativas, são fornecidas composições e métodos para o tratamento ou melhoria de um câncer focando em polipeptídeos expressos na superfície de células ανβ3 (avb3) em câncer de células tronco (CCC) para matar o CCC, assim, o tratamento melhora ou retarda o desenvolvimento de cânceres causados ou iniciados por ou sustentados por células cancerosas ou tumorais, ou do câncer de célula tronco (CSC), que expressa polipeptídeos ανβ3 nas suas superfícies celulares.

ANTECEDENTES [0004] Os macrófagos associados ao tumor estão envolvidos na regulação do crescimento e da agressividade do câncer. Enquanto os macrófagos M1 desencadeiam uma resposta inflamatória e inibem o crescimento do tumor, os macrófagos M2 secretam citocinas pró-tumorais no microambiente para apoiar a progressão do tumor. Uma troca de macrófagos de M1 para M2 foi associada à progressão do câncer de pulmão e as células-tronco cancerígenas foram implicadas como impulsionadoras dessa reprogramação.

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SUMÁRIO [0005] Em modalidades alternativas, são fornecidos métodos para:

matar ou reduzir o número de células cancerígenas que expressam polipeptídeo ανβ3 (avb3) ou células- tronco cancerígenas (CSCs) em um indivíduo com necessidade,

- tratar, melhorar ou reverter ou retardar o desenvolvimento de um câncer ou tumor que expressa um polipeptídeo ανβ3 (avb3) em um indivíduo com necessidade do mesmo,

- melhorar ou retardar o desenvolvimento de cânceres causados ou iniciados por ou sustentados por células cancerígenas ou tumorais, ou células-tronco cancerígenas (CSCs), expressando polipeptídeos ανβ3 em suas superfícies celulares,

- aumentar a população de um macrófago capaz de desencadear uma resposta inflamatória e inibir o crescimento do tumor in vivo, em que, opcionalmente, a população de macrófago capaz de desencadear uma resposta inflamatória e inibir o crescimento tumoral compreende um macrófago associado a tumor (TAM) ou uma população de macrófagos M1,

- melhorar a sensibilidade de câncer ou tumor expressando ανβ3 (polipeptídeo avb3) para efeitos de terapia, opcionalmente, uma quimioterapia, opcionalmente, terapia com um inibidor de fator de crescimento, [0006] o método compreendendo:

(a) administrar a um indivíduo com necessidade de um anticorpo ou polipeptídeo capaz de se ligar especificamente a um polipeptídeo de integrina ανβ3 (avb3) expresso em um câncer ou em uma célula tumoral ou em um CSC, ou (b) (i) fornecer um anticorpo ou polipeptídeo capaz de se ligar especificamente a um polipeptídeo de integrina ανβ3 (avb3) expresso em um câncer ou em uma célula tumoral ou em um CSC,

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3/47 [0007] em que o anticorpo ou polipeptídeo tem um domínio Fc ou domínio ou fração equivalente capaz de se ligar a um macrófago e iniciar uma morte por citotoxicidade mediada por células (ADCC) dependente de anticorpo da célula à qual o anticorpo se liga especificamente, (ii) administrar o anticorpo ou polipeptídeo a um indivíduo em necessidade do mesmo, [0008] resultando em:

- matar ou reduzir o número de células cancerígenas que expressam o polipeptídeo ανβ3 (avb3) ou células- tronco cancerígenas (CSCs) em um indivíduo com necessidade,

- aumentar uma população de macrófago capaz de desencadear uma resposta inflamatória e inibir o crescimento do tumor in vivo, em que, opcionalmente, a população de macrófago capaz de desencadear uma resposta inflamatória e inibir crescimento tumoral compreende um macrófago associado a tumor (TAM) ou uma população de macrófagos M1,

- aumentar a sensibilidade de câncer expressando c^3(avb3 polipeptídeo) ou tumor para os efeitos da terapia.

[0009] Em modalidades alternativas, são fornecidos métodos: em que o anticorpo ou polipeptídeo é um anticorpo humanizado, opcionalmente um anticorpo murino humanizado; ou em que o anticorpo ou polipeptídeo é um anticorpo recorrente ou manipulado por engenharia; ou em que o anticorpo é um anticorpo humano; ou em que o anticorpo é anticorpo monoclonal ou um anticorpo policlonal; ou em que o

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4/47 anticorpo é anticorpo monoclonal LM609 (Chemicon Int., Temecula, CA) (CVCL_KS89) (hibridoma murino com número de acesso ATCC HB 9537) (ver, por exemplo, patente US n^Q 7.115.261); anticorpo monoclonal CBL544, derivado do clone 23C6 (MilliporeSigma, Burlington, MA); anticorpo monoclonal ab7166 (abeam, Cambridge, MA); ou anticorpo monoclonal ab78289 (abeam, Cambridge, MA); ou qualquer versão humanizada do mesmo, ou qualquer polipeptídeo compreendendo uma ligação ανβ33 ao CDR de LM609, CBL544, ab7166 ou ab78289.

[0010] Em modalidades alternativas, são fornecidos métodos: em que o macrófago é um macrófago humano, ou um macrófago associado à mortalidade (TAM), um macrófago M1 ou um macrófago M2 inibidor de tumor.

[0011] Em modalidades alternativas, são fornecidos métodos: em que o câncer é um câncer epitelial ou célula tumoral epitelial; ou em que o câncer é um câncer resistente a drogas, e, opcionalmente, o fármaco é um inibidor de fator de crescimento ou um inibidor de quinase, em que, opcionalmente, o inibidor do fator de crescimento contempla um inibidor de receptor da tirosina quinase (RTK), opcionalmente erlotinib.

[0012] Em modalidades alternativas, são fornecidos métodos: em que o anticorpo ou polipeptídeo é administrado por via intravenosa, intramuscular ou subeutânea ao indivíduo em necessidade; ou em que o anticorpo ou polipeptídeo é formulado como uma composição farmacêutica estéril ou formulação, ou é formulado para administração por via intravenosa, por via intramuscular ou por via subeutânea; ou em que a dosagem de anticorpo ou polipeptídeo é baseada em dosagem fixa ou com base no peso corporal, ou em uma dose fixa entre cerca de 100 e 1200 mg por mês ou em uma dosagem entre cerca de 0,3 a 10 mg / kg.

[0013] Em formas de realização alternativas, são fornecidos métodos que compreendem ainda a administração de um inibidor do fator de crescimento, em que, opcionalmente, o inibidor do fator de crescimento contempla um receptor da tirosina quinase (RTK), um inibidor de Src, um inibidor anti-metabólito, gemeitabina, GEMZAR™, um veneno mitótico, paclitaxel, um taxol, ABRAXANE™, erlotinib, TARCEVA™, lapatinib, TYKERB™, cetuxamib, ERBITUX™ ou um inibidor do fator de

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5/47 crescimento semelhante à insulina.

[0014] Em modalidades alternativas, são fornecidos usos de: um anticorpo ou polipeptídeo capaz de se ligar especificamente a um polipeptídeo de integrina ανβ3 (avb3) expresso em um câncer ou célula tumoral ou em um CSC; ou um anticorpo ou polipeptídeo capaz de se ligar especificamente a um polipeptídeo de integrina ανβ3 (avb3) expresso em um câncer ou em uma célula tumoral ou em um CSC, em que o anticorpo tem um domínio Fc ou domínio ou fração equivalente capaz de se ligar a um macrófago e iniciar uma morte por citotoxicidade mediada por célula (ADCC) mediada por anticorpo-célula da célula à qual o anticorpo se liga especificamente, na preparação de um medicamento para:

- aumentar uma população de macrófago capaz de desencadear uma resposta inflamatória e inibir o crescimento do tumor in vivo, em que, opcionalmente, a população de macrófago capaz de desencadear uma resposta inflamatória e inibir crescimento tumoral compreende um macrófago associado a tumor (TAM) ou uma população de macrófagos M1, aumentar a sensibilidade de câncer expressando ανβ3 (avb3 polipeptídeo) ou tumor para os efeitos da terapia.

[0015] Em formas de realização alternativas, são fornecidas composições farmacêutica s ou formulações para utilização num método para:

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6/47 matar ou reduzir o número de células cancerígenas que expressam polipeptídeo ανβ3 (avb3) ou células- tronco cancerígenas (CSCs) em um indivíduo com necessidade,

- aumentar a sensibilidade câncer que expressa um polipeptídeo ανβ3 (avb3) ou tumor para os efeitos da terapia, [0016] em que a composição farmacêutica ou uma formulação compreende:

[0017] um anticorpo ou polipeptídeo capaz de se ligar especificamente a um polipeptídeo de integrina ανβ3 (avb3) expresso em um câncer ou em uma célula tumoral ou em um CSC; ou, um anticorpo capaz de se ligar especificamente a um polipeptídeo de integrina ανβ3 (avb3) expresso em um câncer ou em uma célula tumoral ou em um CSC, em que o anticorpo ou polipeptídeo tem um domínio Fc ou domínio ou fração equivalente capaz de se ligar a um macrófago e iniciar uma morte por citotoxicidade mediada por célula (ADCC) mediada por anticorpocélula da célula à qual o anticorpo ou polipeptídeo se liga especificamente.

[0018] Os detalhes de uma ou mais formas de realização exemplares são definidos nos desenhos que acompanham o presente pedido. Outras características, objetos e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição e desenhos e

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7/47 das reivindicações. Todas as publicações, patentes, pedidos de patente aqui mencionados são expressamente incorporados por referência para todos os fins. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0019] Os desenhos aqui apresentados são ilustrativos de formas de realização, tais como aqui proporcionadas, e não são destinados a limitar o âmbito da invenção, tal como abrangido pelas reivindicações.

[0020] As FIG. 1 A-l ilustram esquematicamente e graficamente a avaliação da via de resistência adquirida envolvendo resistência ao câncer de pulmão aos inibidores de EGFR, o que leva à regulação positiva de ανβ3 e à aquisição de um destino semelhante a um tronco resistente a medicamentos:

[0021] A FIG. 1A: ilustra esquematicamente um esquema do modelo de xenoenxerto resistente ao erlotinib, isto é, como camundongos portando xenoenxertos subcutâneos negativos para o câncer de pulmão humano de células pequenas (ΕΰΕΗ-ανβ3) foram tratados com veículo ou erlotinib e mediram o crescimento do tumor ao longo do tempo;

[0022] A FIG. 1B: ilustra graficamente os dados que mostram como, eventualmente, os tumores começaram a voltar a crescer após várias semanas, que mostra o volume do tumor como uma função dos dias tratados, em comparação com o controle (“Veh”, ou veículo), HCC827 (β3-) camundongos de xenoenxerto e tratados com controle ou erlotinib;

[0023] A FIG. 1C: ilustra uma imagem de tecidos tumorais corados para β3;

[0024] A FIG. 1D: ilustra graficamente os dados de um estudo de citometria de fluxo em que células isoladas de tecidos resistentes ao erlotinib foram coradas para ανβ3 e ALDH1A1;

[0025] A FIG. 1E: ilustra graficamente os dados de uma citometria de fluxo em que as células tumor isoladas de um camundongo tratado com veículo (veh) e um camundongo tratado com erlotinib (ErIR) foram coradas para ανβ3;

[0026] A FIG. 1F: ilustra graficamente a viabilidade celular após o tratamento com erlotinib ou osimertinib por 72 horas;

[0027] A FIG. 1G: ilustra graficamente os dados que mostram que o e rlotinibe

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8/47 aumentou as CTCs enquanto os tumores primários ainda respondem ao tratamento; onde 8 semanas após a injeção pulmonar de células HCC827 (β3-, GFP +, luciferase +), os camundongos foram tratados com erlotinib por 30 dias antes do isolamento das CTCs, e as CTCs foram coradas para ανβ3 e CTCs ανβ3 positivo (β3 +) e negativo (β3-) de camundongos antes (pré-tratamento, n = 3) e após o tratamento (pós-tratamento, n = 5) foram contados;

[0028] A FIG. 1H: ilustra uma imagem das massas primárias da FIG. 1G;

[0029] A FIG. 11 : ilustra graficamente os dados que mostram como o aumento de M2-TAMs nos tecidos do xenoenxerto resistente ao elrotinibe; a porcentagem de M1 (cinza escuro) e M2- TAMs (cinza claro) nos tecidos tumorais foi comparada entre os tratamentos veículo (n = 9) e erlotinib (n = 9) após 50 dias dos tratamentos;

[0030] conforme discutido em mais detalhes no Exemplo 1 abaixo.

[0031] As FIG. 2A- E ilustram esquematicamente e graficamente os dados que mostram que o LM609 produziu um fenótipo menos agressivo:

[0032] A FIG. 2A ilustra graficamente a aquisição inibida por LM609 da resistência ao erlotinib, em que camundongos xenoenxerto HCC827 (β3-) foram tratados com erlotinib ou erlotinib e LM609;

[0033] A FIG. 2B, painéis superiores e inferiores, ilustram graficamente e em imagens e dados de amostras coradas de tecido que mostram que o LM609 isento de células β3-ροείΐίν35; onde os camundongos xenoenxerto HCC827 (β3-) foram tratados com Captisol e PBS, Captisol e LM609, erlotinib e PBS, ou erlotinib e LM609 por 50 dias, e tecidos de tumor foram corados (painel inferior) para integrina β3 e área positiva para β3 nos tecidos foram quantificados (painel superior);

[0034] As FIG. 2C-E ilustram esquematicamente e graficamente que o LM609 diminuiu o número de CTCs induzidas pelo erlotinib : oito semanas após a injeção no pulmão direito de células HCC827 (β3-, GFP +, luciferase +), os camundongos foram tratados com erlotinib ou a combinação de erlotinib e LM609 (erlotinib + LM609) por quatro semanas antes da CTCs ser isolada e o volume do tumor foi medido por bioluminescência (FIG. 2D) antes dos tratamentos e após o tratamento com erlotinib (pós-erlotinib, n = 4) ou a combinação de erlotinib e LM609 (Pós-Erl + LM609, n = 5)

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9/47 e quantificado ( FIG. 2C, painel superior); as CTCs foram coradas para ανβ3 para quantificar CTCs ανβ3 positivas (β3 +) e negativas (β3-) (FIG. 2C, painel inferior); um exemplo de CTCs positivo para ανβ33 é mostrado (FIG. 2E);

[0035] conforme discutido em mais detalhes no Exemplo 1 abaixo.

[0036] As FIG. 3A-E ilustram graficamente que o LM609 eliminou células positivas para ανβ3 via ADCC mediado por macrófagos:

[0037] As FIG. 3A-C: LM609 livre de células positivas para ανβ3 via ADCC mediado por macrófagos in vitro; ensaios ADCC com macrófagos derivados da medula óssea ( BMDMs ) ou células NK foram realizados com células cancerígenas com e sem integrina ανβ3 tratadas com o isotipo IgG ou LM6 09 10 pg / mL e / ou bloqueador Fc;

[0038] As FIG. 3D-E: LM609 livres de crescimento de tumor positivo para ανβ3 apenas nos camundongos que possuem macrófagos. Camundongos nus foram injetados subcutaneamente com células β3 que expressam ectopicamente β3 e tratados com lipossomo controle e PBS (FIG. painel esquerdo 3D, controle), lipossomo controle e LM609 (FIG. 3D Painel esquerdo, LM609), lipossoma de clodronato e PBS (FIG. 3D painel direito, controle) ou lipossoma de clodronato e LM609 (FIG. 3D painel direito, LM609), o crescimento do tumor foi monitorado por 15 dias e, após os tratamentos, quantificou-se a coloração de F4 / 80 nos tecidos do tumor (FIG. 3E);

[0039] conforme discutido em mais detalhes no Exemplo 1 abaixo.

[0040] As FIG. 4A-C ilustram graficamente que as células tumorais resistentes ao erlotinib ganharam integrina ανβ3 e eram resistentes ao osimertinib:

[0041] A FIG. 4A ilustra graficamente os dados que mostram que o tumor tratado com erlotinib ganhou resistência, onde os ratos xenoenxerto subcutâneo PC9 (β3-) foram tratados com o veículo (Veh) (n = 1) ou erlotinib (ErIR, n = 1);

[0042] A FIG. 4B ilustra graficamente os dados mostrando que as células do tecido resistente ao erlotinib foram positivas para ανβ3, enquanto as células do animal tratado com veículo não eram; os níveis de ανβ3 em células isoladas dos animais tratados com veículo (Veh, painel esquerdo) e tratados com erlotinib

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10/47 (ErIR, painel direito) foram medidos por citometria de fluxo;

[0043] A FIG. 4C: as células resistentes ao erlotinib eram resistentes ao osimertinib. As células dos animais tratados com veículo (Veh) e tratados com erlotinib (ErIR) foram tratadas com erlotinib (painel esquerdo) ou osimertinib (painel direito) nas doses indicadas e o ensaio MTT foi realizado para medir a viabilidade celular;

[0044] conforme discutido em mais detalhes no Exemplo 1 abaixo.

[0045] As FIG. 5 A-B ilustram graficamente dados que mostram a ligação ao ligando inibido por LM609 da integrina ανβ3, mas não a viabilidade celular:

[0046] A FIG 5A ilustra graficamente os dados de s que mostram que o LM609 inibiu a ligação ao integrante da integrina ανβ3, em que as células M21 (ανβ3 +) foram plaqueadas em colágeno ou vitronectina (ligante ανβ3) com doses indicadas de LM609 e o número de células aderentes foi medido;

[0047] A FIG. 5 B ilustra graficamente os dados de s mostrando que o LM609 não afetou a viabilidade celular, as células ανβ3 positivas (β3 +) e negativas (β3) transmitidas pelo ar foram tratadas com doses indicadas de LM609 e o ensaio MTT foi realizado para medir a viabilidade celular.

[0048] A FIG. 6 ilustra graficamente os dados que mostram que a terapêutica com anticancerígeno enriquece a integrina β3 nas células epiteliais do câncer: qPCR foi realizado para detectar a expressão do mRNA das subunidades integrina α e β em resposta ao aumento da dose de peróxido de hidrogênio (H2O2) por 72 h, expresso como dobra em relação ao veículo ao controle.

[0049] Numerais de referência semelhantes nos vários desenhos indicam elementos semelhantes.

[0050] Agora será feita referência em detalhes a várias modalidades exemplares, exemplos dos quais são ilustrados nos desenhos anexos. A descrição detalhada a seguir é fornecida para proporcionar ao leitor uma melhor compreensão de certos detalhes de aspectos e modalidades conforme aqui fornecidos, e não deve ser interpretada como uma limitação no escopo da invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA [0051] Em modalidades alternativas, são fornecidas composições e métodos para

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11/47 o tratamento ou melhoria de um câncer, visando os polipeptídeos ανβ3 (avb3) expressos na superfície celular em Células-Tronco do Câncer (CSCs) para matar os CSCs, tratando assim a melhoria ou a lentidão do desenvolvimento de cânceres causados ou iniciados ou sustentado por células cancerígenas ou tumorais, ou células-tronco cancerígenas (CSCs) expressando polipeptídeos ανβ3 em suas superfícies celulares. Em modalidades alternativas, são fornecidas composições e métodos para direcionar e matar células-tronco cancerígenas (CSCs) c^3-positivas e tratar cânceres resistentes a medicamentos. Em modalidades alternativas, as composições e métodos aqui fornecidos utilizam um anticorpo ou polipeptídeo que pode se ligar especificamente ao ανβ3 humano que também compreende uma porção Fc que pode mediar a morte por citotoxicidade mediada por células (ADCC) mediada por células dependente de anticorpo de células cancerígenas ou tumorais por macrófagos; por exemplo, uso de um anticorpo humanizado para ανβ3 que foi modificado para incluir uma porção Fc manipulada que se liga especificamente aos macrófagos humanos. Em modalidades alternativas, a administração do anticorpo anti-avb3 pode erradicar ou reduzir o número de cânceres altamente agressivos, resistentes a medicamentos positivos para ανβ3, recrutando macrófagos associados a tumores que se ligam ao anticorpo ou polipeptídeo (que também se liga a ανβ3) e aos macrófagos e, assim, matar o câncer pelo ADCC. Em modalidades alternativas, anticorpos, por exemplo, anticorpos humanizados, como o anticorpo anti ανβ3 LM609, são usados para direcionar polipeptídeos ανβ3 in vivo para ligar a célula cancerígena positiva para ανβ3, por exemplo, um CSC, e também se ligar a macrófagos, matar CSCs expressando o polipeptídeo ανβ3 por ADCC.

[0052] Embora a invenção não seja limitada por nenhum mecanismo de ação específico, em modalidades alternativas, anticorpos anti - ανβ3 como LM609 ( Chemicon Int., Temecula, CA ); CBL544, derivado do clone 23C6 (MilliporeSigma, Burlington, MA); ab7166 (abeam, Cambridge, MA); e o anticorpo monoclonal ab78289 (abeam, Cambridge, MA) e suas versões humanizadas são utilizados para prolongar a sensibilidade ao medicamento contra

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12/47 câncer em indivíduos que dele necessitam, visando células cancerígenas resistentes a medicamentos via citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos mediada por macrófagos (ADCC).

[0053] As composições e métodos como aqui fornecidos são usados para direcionar e matar células-tronco cancerígenas (CSCs), que podem representar as células mais agressivas e resistentes a medicamentos dentro de uma população de tumores. As composições e os métodos tal como aqui fornecidas são utilizadas para se dirigir a integrina ανβ33, um polipeptídeo que identifica um CSC população dentro de vários epiteliais cânceres e é, ao mesmo tempo, necessário e suficiente para promover a droga resistência.

[0054] O anticorpo anti ανβ3 integrina, LM609, prolongou a sensibilidade ao erlotinib em um modelo de xenoenxerto de adenocarcinoma de pulmão de EGFR mutante. São aqui descritos estudos que demonstram que o tratamento de pulmão tumor rolamento camundongos com o inibidor de EGFR, erlotinib, enquanto inicialmente suprimir o crescimento do tumor, em última análise, resulta no tumor associado a ανβ33 expressão, levando a uma progressão do tumor, como medida por um aumento nas células tumorais circulantes (CTC). Adicionalmente, camundongos tratados com erlotinib mostraram uma marcada acumulação de macrófagos associados a tumor (MAT) em relação aos tumores não tratados. A administração sistêmica de LM609, um anticorpo monoclonal direcionado a ανβ3, destrói os CSCs resistentes a medicamentos dentro do tumor primário e elimina CTCs. Este efeito antitumoral é dependente de macrófagos, uma vez que camundongos sem macrófagos são incapazes de responder a esse anticorpo. In vitro, o LM609 em combinação com macrófagos, mas não células NK, destrói os CSCs devido à citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). Estes resultados demonstram que o erlotinib, enquanto inicialmente age no controle do tumor de crescimento, em última análise conduz ao aumento de sternness, resistência a drogas, progressão de tumor e acumulação de TAM. São fornecidas evidências de que o LM609, por direcionamento a ανβ33, pode dirigir TAM para destruir os maioria

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13/47 resistentes a drogas de células dentro do núcleo primário do tumor, controlando assim a progressão do tumor.

[0055] Recentemente, foi relatado que a expressão de integrina ανβ3 é induzida em células de adenocarcinoma de pulmão durante a resistência a drogas e é necessário e suficiente para reprogramar essas tumores para um estado haste semelhante. Dado o papel que as células-tronco cancerígenas desempenham na troca de macrófagos M1 para M2 (a troca de macrófagos de M1 para M2 foi associada à progressão do câncer de pulmão), perguntou-se se a expressão de ανβ3 nas células de adenocarcinoma pulmonar é responsável por essa conversão de macrófagos. A proporção de macrófagos M1 / M2 em tumores ανβ3-ροείΐίνο5 diminuiu acentuadamente em relação aos tumores que não possuem ανβ3. Em seguida, tratamos camundongos portadores de tumores positivos para ανβ3 com um anticorpo monoclonal (LM609) direcionado a este receptor para avaliar sua capacidade de alterar o fenótipo de macrófagos nesses tumores. LM609 foi capaz de eliminar seletivamente as células tronco câncer ανβ33-ροείΐίνο via dependente de anticorpo de citotoxicidade mediada por células (ADCC), marcadamente aumentar a sensibilidade destes tumores para os efeitos da terapia. Estes resultados revelam que ανβ3 que expressam as células tronco câncer enriquecem macrófagos M2 associados a pró-tumoral (MAT). A eliminação de células-tronco cancerígenas ανβ3positivas via ADCC serve para prolongar a sensibilidade do tumor à terapia.

Formulações e composições farmacêuticas [0056] Em modalidades alternativas, são fornecidas composições e formulações farmacêuticas, por exemplo, compreendendo anticorpos anti- ανβ3 (avb3) e métodos para : matar ou reduzir o número de células cancerígenas que expressam o polipeptídeo ανβ3 (avb3) ou células- tronco cancerígenas (CSCs) em um indivíduo em necessidade do mesmo, tratando, melhorando ou revertendo ou retardando o desenvolvimento de um câncer ou tumor que expressa um polipeptídeo ανβ3 (avb3) em um indivíduo com necessidade do mesmo, melhorando ou retardando o desenvolvimento de cânceres causados ou iniciados por ou sustentados por câncer ou células de tumor ou câncer de células tronco (CSCs), que

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14/47 expressam polipeptídeos ανβ33 nas suas superfícies celulares, manipulando MAT in vivo, ou acessando a sensibilidade câncer que expressa um polipeptídeo ανβ3 (avb3) ou tumor para os efeitos da terapia.

[0057] Em modalidades alternativas, as composições aqui fornecidas e as composições usadas para praticar os métodos aqui fornecidos, são formuladas com um veículo farmaceuticamente aceitável. Em modalidades alternativas, a composição farmacêutica usada para praticar os métodos aqui fornecidos pode ser administrada parenteralmente, tópica, oralmente ou por administração local, tal como por aerossol ou transdermicamente. A composição farmacêutica pode ser formulada de qualquer maneira e pode ser administrada em uma variedade de formas de dosagem unitárias, dependendo da condição ou doença e do grau da doença, da condição médica geral de cada paciente, do método de administração preferido resultante e semelhantes. Detalhes sobre técnicas para formulação e administração são bem descritos na literatura científica e de patentes, ver, por exemplo, a edição mais recente da Remington's Pharmaceutical Sciences, Maack Publishing Co, Easton PA (Remington's).

[0058] Os agentes terapêuticos conforme aqui fornecidos, por exemplo, compreendendo anticorpos anti- ανβ3 (avb3) e anticorpos utilizados para praticar os métodos como aqui fornecidos, podem ser administrados isoladamente ou como um componente de uma formulação farmacêutica (composição) ou simultaneamente com, antes e / ou depois da administração com outro agente ativo, por exemplo, um inibidor de fator de crescimento, em que, opcionalmente, o inibidor de fator de crescimento contempla um receptor da tirosina quinase (RTK), um inibidor de Src, um inibidor anti-metabólito, gemcitabina, GEMZAR™, um veneno mitótico, paclitaxel, taxol, ABRAXANE™, erlotinib, TARCEVA™, lapatinib, TYKERB™, cetuxamib, ERBITUX™ ou um inibidor do fator de crescimento semelhante à insulina.

[0059] As composições e formulações farmacêuticas, por exemplo, compreendendo anticorpos anti- ανβ3 (avb3), podem ser formuladas para administração de qualquer maneira conveniente para uso em medicina humana ou veterinária. Também podem estar presentes nas composições agentes umectantes,

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15/47 emulsificantes e lubrificantes, como lauril sulfato de sódio e estearato de magnésio, bem como corantes, liberadores, agentes de revestimento, adoçantes, aromatizantes e perfumadores, conservantes e antioxidantes.

[0060] As formulações das composições aqui fornecidas, e como usadas para praticar os métodos aqui fornecidos, incluem aquelas adequadas para administração oral / nasal, tópica, parentérica, retal e / ou intravaginal. As formulações podem ser convenientemente apresentadas numa forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por quaisquer métodos bem conhecidos na arte da farmácia. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material transportador para produzir uma forma de dosagem única variará dependendo do indivíduo a ser tratado e do modo particular de administração. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material transportador para produzir uma forma de dosagem única será geralmente a quantidade do composto que produz um efeito terapêutico.

[0061] As formulações farmacêuticas aqui fornecidas, e como usadas para praticar os métodos aqui fornecidos, podem ser preparadas de acordo com qualquer método conhecido na técnica para a fabricação de produtos farmacêuticos. Tais drogas podem conter agentes adoçantes, aromatizantes, corantes e conservantes. Uma formulação pode ser misturada com excipientes não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis que são adequados para a sua fabricação. As formulações podem compreender um ou mais diluentes, emulsificantes, conservantes, tampões, excipientes, etc. e podem ser fornecidas em formas como líquidos, pós, emulsões, pós liofilizados, sprays, cremes, loções, formulações de liberação controlada, comprimidos, pílulas, géis, em emplastros, em implantes, etc.

[0062] As formulações farmacêuticas para administração oral podem ser formuladas utilizando veículos farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na técnica, em dosagens apropriadas e adequadas. Tais transportadores permitem que os produtos farmacêuticos sejam formulados em formas de dosagem unitárias como comprimidos, tabletes em gel, pílulas, pó, drágeas, cápsulas, líquidos, pastilhas, géis, xaropes, pastas, suspensões, etc., adequados para ingestão pelo paciente. As preparações farmacêuticas para uso oral podem ser formuladas como um excipiente

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16/47 sólido, moendo opcionalmente uma mistura resultante e processando a mistura de grânulos, após adição de compostos adicionais adequados, se desejado, para obter comprimidos ou núcleos de drágeas. Excipientes sólidos adequados são cargas de carboidratos ou proteínas que incluem, por exemplo, açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol ou sorbitol; amido de milho, trigo, arroz, batata ou outras plantas; celulose como metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose ou carboximetilcelulose de sódio; e gomas, incluindo arábica e tragacant; e proteínas, por exemplo, gelatina e colágeno. Podem ser adicionados agentes desintegrantes ou solubilizantes, como a polivinilpirrolidona reticulada, ágar, ácido algínico ou um sal do mesmo, como o alginato de sódio.

[0063] Os núcleos de drágea são fornecidos com revestimentos adequados, como soluções de açúcar concentrado, que também podem conter goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenoglicol e / ou dióxido de titânio, soluções de laca e solventes orgânicos adequados ou misturas de solventes. Corantes ou pigmentos podem ser adicionados aos revestimentos de comprimidos ou drágeas para identificação do produto ou para caracterizar a quantidade de composto ativo (isto é, dosagem). As preparações farmacêuticas aqui fornecidas, e como usadas para praticar os métodos aqui fornecidos, também podem ser usadas por via oral, utilizando, por exemplo, cápsulas de encaixe por pressão de gelatina, bem como cápsulas moles e seladas de gelatina e um revestimento como glicerol ou sorbitol. As cápsulas de encaixe por pressão podem conter agentes ativos misturados com um material de enchimento ou ligantes como lactose ou amidos, lubrificantes como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizadores. Nas cápsulas moles, os agentes ativos podem ser dissolvidos ou suspensos em líquidos adequados, como óleos graxos, parafina líquida ou polietilenoglicol líquido com ou sem estabilizadores. [0064] As suspensões aquosas podem conter um agente ativo (por exemplo, um anticorpo ou polipeptídeo anti- ανβ3 (avb3)) em mistura com excipientes adequados para a fabricação de suspensões aquosas. Tais excipientes incluem um agente de suspensão, como carboximetilcelulose de sódio, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, alginato de sódio, polivinilpirrolidona, tragacant de goma e

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17/47 acácia de goma e agentes dispersantes ou umectantes, como um fosfatídeo de ocorrência natural (por exemplo, lecitina), um produto de condensação de um alquileno óxido com um ácido graxo (por exemplo, estearato de polioxietileno), um produto de condensação de óxido de etileno com um álcool alifático de cadeia longa (por exemplo, heptadecaetileno oxicetanol), um produto de condensação de óxido de etileno com um éster parcial derivado de um ácido graxo e um hexitol ( por exemplo, mono-oleato de polioxietileno sorbitol) ou um produto de condensação de óxido de etileno com um éster parcial derivado de ácido graxo e um anidrido de hexitol (por exemplo, mono-oleato de polioxietileno sorbitano). A suspensão aquosa também pode conter um ou mais conservantes, como p-hidroxibenzoato de etil ou n-propil, um ou mais agentes corantes, um ou mais agentes aromatizantes e um ou mais agentes adoçantes, como sacarose, aspartame ou sacarina. As formulações podem ser ajustadas quanto à osmolaridade.

[0065] Produtos farmacêuticos à base de óleo são particularmente úteis para administração de agentes ativos hidrofóbicos (por exemplo, um anticorpo ou polipeptídeo anti- ανβ3 (avb3)) usados para praticar os métodos aqui fornecidos. As suspensões à base de óleo podem ser formuladas suspendendo um agente ativo em um óleo vegetal, como óleo de amendoim, azeite, óleo de gergelim ou óleo de coco, ou em um óleo mineral como parafina líquida; ou uma mistura destes. Ver, por exemplo, a Patente US No. 5.716.928, que descreve o uso de óleos essenciais ou componentes de óleo essencial para aumentar a biodisponibilidade e reduzir a variabilidade inter e intraindividual de compostos farmacêuticos hidrofóbicos administrados por via oral (ver também a Patente U.S. No. 5.858.401). As suspensões de óleo podem conter um agente espessante, como cera de abelha, parafina dura ou álcool cetílico. Podem ser adicionados agentes adoçantes para proporcionar uma preparação oral palatável, como glicerol, sorbitol ou sacarose. Estas formulações podem ser preservadas pela adição de um antioxidante como o ácido ascórbico. Como exemplo de um veículo a óleo injetável, ver a publicação de Minto (1997) J. Pharmacol. Exp. Ther. 281: 93-102. As formulações farmacêuticas aqui fornecidas também podem estar na forma de emulsões de óleo em água. A fase

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18/47 oleosa pode ser um óleo vegetal ou um óleo mineral, descrito acima, ou uma mistura destes. Agentes emulsificantes adequados incluem gomas de ocorrência natural, como goma arábica e goma tragacant, fosfatídeos de ocorrência natural, como lecitina de soja, ésteres ou ésteres parciais derivados de ácidos graxos e anidridos de hexitol, como mono-oleato de sorbitano e produtos de condensação desses ésteres parciais com óxido de etileno, como mono-oleato de polioxietileno sorbitano. A emulsão também pode conter agentes adoçantes e aromatizantes, como na formulação de xaropes e elixires. Tais formulações também podem conter um agente demulcente, conservante ou corante.

[0066] Na modalidade de prática aqui fornecida, os compostos farmacêuticos também podem ser administrados nas vias intranasal, intraocular e intravaginal, incluindo formulações de supositórios, insuflação, pós e aerossóis (para exemplos de inalantes de esteróides, ver a publicação de Rohatagi (1995) J. Clin. Pharmacol. 35: 1187-1193; Tjwa (1995) Ann. Allergy Asthma Immunol. 75: 107-111). As formulações de supositórios podem ser preparadas misturando o fármaco com um excipiente não irritante adequado que é sólido a temperaturas comuns, mas líquido na temperatura corporal e, portanto, derrete no corpo para liberar o fármaco. Tais materiais são manteiga de cacau e polietileno glicóis.

[0067] Na prática das modalidades aqui fornecidas, os compostos farmacêuticos podem ser entregues por via transdérmica, por via tópica, formulados como palitos aplicadores, soluções, suspensões, emulsões, géis, cremes, pomadas, pastas, geleias, tintas, pós e aerossóis.

[0068] Na prática das modalidades aqui fornecidas, os compostos farmacêuticos também podem ser entregues como microesferas para liberação lenta no corpo. Por exemplo, as microesferas podem ser administradas por injeção intradérmica de fármaco que libera lentamente por via subcutânea; ver a publicação de Rao (1995) J. Biomater Sei. Polym. Ed. 7: 623-645; como formulações em gel biodegradáveis e injetáveis, ver, por exemplo, a publicação de Gao (1995) Pharm. Res. 12: 857-863 (1995); ou, como microesferas para administração oral, ver, por exemplo, a publicação de Eyles (1997) J. Pharm. Pharmacol. 49: 669-674.

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19/47 [0069] Na prática das modalidades aqui fornecidas, os compostos farmacêuticos podem ser administrados parentericamente, como por administração ou administração intravenosa (IV) em uma cavidade ou lúmen do corpo de um órgão. Estas formulações podem compreender uma solução de agente ativo dissolvido em um veículo farmaceuticamente aceitável. Os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregados são a água e a solução de Ringer, um cloreto de sódio isotônico. Além disso, os óleos fixos estéreis podem ser utilizados como solvente ou meio de suspensão. Para este fim, qualquer óleo fixo suave pode ser empregado, incluindo mono- ou diglicerídeos sintéticos. Além disso, ácidos graxos como o ácido oleico também podem ser usados na preparação de injetáveis. Essas soluções são estéreis e geralmente livres de matéria indesejável. Estas formulações podem ser esterilizadas por técnicas convencionais de esterilização bem conhecidas. As formulações podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis, conforme necessário para aproximar condições fisiológicas, tais como agentes de ajuste e tampão de pH, agentes de ajuste de toxicidade, por exemplo, acetato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, lactato de sódio e similares. A concentração de agente ativo nessas formulações pode variar amplamente e será selecionada principalmente com base em volumes de fluido, viscosidades, peso corporal e similares, de acordo com o modo de administração específico selecionado e as necessidades do paciente. Para administração IV, a formulação pode ser uma preparação injetável estéril, como uma suspensão aquosa ou oleaginosa injetável estéril. Esta suspensão pode ser formulada utilizando os agentes dispersantes ou umectantes e agentes de suspensão adequados. A preparação injetável estéril também pode ser uma suspensão em um diluente ou solvente não tóxico aceitável por via parentérica, como uma solução de 1,3butanodiol. A administração pode ser por bolus ou infusão contínua (por exemplo, introdução substancialmente ininterrupta em um vaso sanguíneo por um período de tempo especificado).

[0070] Os compostos e formulações farmacêuticas aqui fornecidos, e como utilizados para praticar os métodos aqui fornecidos, podem ser liofilizados.

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Também são fornecidos estável formulação liofilizada s compreendendo uma composição aqui fornecida, que podem ser feitos por liofilização de uma solução compreendendo um fármaco fornecida aqui no e um agente de volume, por exemplo, manitol, trealose, rafinose e sacarose ou suas misturas. Um processo para preparar uma formulação liofilizada estável pode incluir a liofilização de uma solução de cerca de 2,5 mg / mL de proteína, cerca de 15 mg / mL de sacarose, cerca de 19 mg / mL de NaCI e um tampão de citrato de sódio com um pH maior que 5,5, mas menor que 6,5. Veja, por exemplo, aplicativo de patente dos EUA. No. 2004/0028670.

[0071] As composições e formulações fornecidas aqui, e como usadas para praticar os métodos aqui fornecidos, podem ser entregues pelo uso de lipossomas. Utilizando lipossomas, particularmente onde a superfície do lipossoma transporta ligantes específicos para as células alvo ou, de outro modo, preferencialmente direcionados para um órgão específico, pode-se concentrar a entrega do agente ativo nas células alvo in vivo. Ver, por exemplo, Patentes US Nos. 6.063.400; 6.007.839; Al-Muhammed (1996) J. Microencapsul. 13: 293-306; Chonn (1995) Curr. Opin. Biotechnol. 6: 698-708; Ostro (1989) Am. J. Hosp. Pharm. 46:15761587.

[0072] As formulações aqui fornecidas, e como usadas para praticar os métodos aqui fornecidos, podem ser administradas para tratamentos profiláticos e / ou terapêuticos. Em aplicações terapêuticas, as composições são administradas a um sujeito que já sofre de uma condição, infecção ou doença em uma quantidade suficiente para curar, aliviar ou interromper parcialmente as manifestações clínicas da condição, infecção ou doença e suas complicações (uma quantidade terapeuticamente eficaz) Por exemplo, em modalidades alternativas, as composições farmacêuticas aqui fornecidas são administradas em uma quantidade suficiente para: matar ou reduzir o número de células cancerígenas que expressam o polipeptídeo ανβ3 (avb3) ou células- tronco cancerígenas (CSCs) em um indivíduo em necessidade; tratar, melhorar ou reverter ou retardar o desenvolvimento de um câncer ou tumor que expressa o polipeptídeo ανβ3 (avb3) em um indivíduo com necessidade do mesmo; e / ou melhorar ou retardar o desenvolvimento de cânceres causados ou

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21/47 iniciados por ou sustentados por células cancerígenas ou tumorais, ou Células-Tronco Câncer (CSCs), expressando polipeptídeos ανβ3 em suas superfícies celulares. A quantidade de composição farmacêutica adequada para conseguir isso é definida como uma dose terapeuticamente eficaz. O cronograma de dosagem e as quantidades efetivas para esse uso, isto é, o “regime de dosagem”, dependerão de uma variedade de fatores, incluindo o estágio da doença ou condição, a gravidade da doença ou condição, o estado geral da saúde do paciente, status físico do paciente, idade e afins. No cálculo do regime de dosagem para um paciente, o modo de administração também é levado em consideração.

[0073] O regime de dosagem também leva em consideração parâmetros farmacocinéticos bem conhecidos na técnica, isto é, a taxa de absorção, biodisponibilidade, metabolismo, depuração e similares dos agentes ativos (ver, por exemplo, Hidalgo-Aragones (1996) J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 58: 611-617; Groning (1996) Pharmazie 51: 337-341; Fotherby (1996) Contraception 54: 59-69; Johnson (1995) J. Pharm. Sei. 84: 1144-1146; Rohatagi (1995) Pharmazie 50: 610613; Brophy (1983) Eur. J. Clin. Pharmacol. 24: 103-108; o último Remington's, supra). O estado da técnica permite ao clínico determinar o regime de dosagem para cada paciente individual, agente ativo e doença ou condição tratada. As diretrizes fornecidas para composições semelhantes usadas como produtos farmacêuticos podem ser usadas como orientação para determinar o regime de dosagem, isto é, programa de doses e níveis de dosagem, um medicamento administrado praticando os métodos aqui fornecidos são corretos e apropriados.

[0074] Podem ser administradas administrações únicas ou múltiplas de formulações, dependendo da dosagem e frequência, conforme necessário e tolerado pelo paciente. As formulações devem fornecer uma quantidade suficiente de agente ativo para tratar, prevenir ou melhorar efetivamente uma condição, doença ou sintoma como aqui descrito. Por exemplo, uma formulação farmacêutica exemplar para a administração oral das composições aqui proporcionadas ou como utilizado para a prática os métodos aqui proporcionados podem ser numa quantidade diária de entre cerca de 0,1 para 0,5 a cerca de 20, 50, 100 ou 1000 ou mais u g por quilograma de

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22/47 peso corporal por dia. Numa modalidade alternativa, são utilizadas dosagens de cerca de 1 mg a cerca de 4 mg por kg de peso corporal por paciente por dia. Dosagens mais baixas podem ser usadas, em contraste com a administração oral, na corrente sanguínea, na cavidade do corpo ou no lúmen de um órgão. Dosagens substancialmente mais altas podem ser usadas na administração tópica ou oral ou na administração por pós, spray ou inalação. Os métodos reais para a preparação de formulações administradas parentericamente ou não parentericamente serão conhecidos ou aparentes para os técnicos no assunto e são descritos com mais detalhes em publicações como Remington's, supra.

[0075] Os métodos aqui fornecidos podem ainda compreender a co-administração com outros medicamentos ou produtos farmacêuticos, por exemplo, composições para tratamento de câncer, choque séptico, infecção, febre, dor e sintomas ou condições relacionados. Por exemplo, os métodos e / ou composições e formulações aqui fornecidas podem ser co-formulados com e / ou co-administrados com antibióticos (por exemplo, peptídeos ou proteínas antibacterianos ou bacteriostáticos), particularmente aqueles eficazes contra bactérias gram-negativas, fluidos, citocinas, agentes imunorreguladores, agentes anti-inflamatórios, agentes ativadores de complemento, como peptídeos ou proteínas compreendendo domínios semelhantes a colágeno ou domínios semelhantes a fibrinogênio (por exemplo, uma ficolina), domínios de ligação a carboidratos e semelhantes e combinações dos mesmos.

Nanopartículas e lipossomas [0076] Também são fornecidas nanopartículas e membranas lipossomais compreendendo compostos (por exemplo, anticorpos anti- av33(avb3)) utilizado para a prática dos métodos aqui proporcionados. Em modalidades alternativas, também são fornecidas nanopartículas e membranas lipossômicas voltadas para célulastronco tumorais (câncer) e células-tronco disfuncionais. Em um aspecto, as composições usadas para praticar os métodos aqui fornecidos são especificamente direcionadas para células cancerígenas ou células-tronco cancerígenas.

[0077] Em modalidades alternativas, também são fornecidas nanopartículas

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23/47 e membranas lipossômicas que compreendem (além de compostos utilizados para a prática dos métodos aqui fornecidos) moléculas, por exemplo, peptídeos ou anticorpos, que visam seletivamente o crescimento anormal, doente, infectado, disfuncional e / ou câncer (tumor) de receptores celulares. Em modalidades alternativas, também são fornecidas nanopartículas e membranas lipossômicas usando o receptor IL-11 e / ou o receptor GRP78 para receptores direcionados em células, por exemplo, em células tumorais, por exemplo, em células de câncer de próstata ou ovário. Ver, por exemplo, a publicação do pedido de patente No. US 2006/0239968.

[0078] São fornecidas nanocélulas para permitir a entrega sequencial de dois agentes terapêuticos diferentes com diferentes modos de ação ou farmacocinéticas diferentes, pelo menos um dos quais compreende uma composição utilizada para a prática os métodos aqui proporcionados. Uma nanocélula é formada encapsulando um nanonúcleo com um primeiro agente dentro de uma vesícula lipídica contendo um segundo agente; ver, por exemplo, Sengupta, et al., publicação Pat. US No. 20050266067. O agente no compartimento lipídico externo é liberado primeiro e pode exercer seu efeito antes que o agente no nanonúcleo seja liberado. O sistema de entrega de nanocélulas pode ser formulado em qualquer composição farmacêutica para entrega aos pacientes.

[0079] Em uma modalidade, um inibidor de ou depletor de um gene de acetil transferase, de expressão ou atividade de transcrição (mensageiro) e / ou proteína está contido na vesícula lipídica externa da nanocélula e um agente antiangiogênico aqui fornecido é carregado no nanonúcleo. Este arranjo permite que o agente ativo seja lançado primeiro e entregue ao tumor antes do fornecimento de sangue do tumor ser cortado pela composição aqui proporcionada.

[0080] Também são fornecidos lipossomas multicamadas compreendendo compostos utilizados para praticar modalidades aqui fornecidas, por exemplo, para absorção transdérmica, por exemplo, como descrito em Park, et al., publicação Pat. US No. 2007/0082042. Os lipossomas de múltiplas camadas podem ser preparados utilizando uma mistura de componentes da fase oleosa compreendendo

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24/47 esqualano, esteróis, ceramidas, lipídios ou óleos neutros, ácidos graxos e lecitinas, até cerca de 200 a 5000 nm em tamanho de partícula, para aprisionar uma composição aqui fornecida.

[0081] Um lipossoma multicamada usado para praticar modalidades aqui fornecidas pode ainda incluir um anti-séptico, um antioxidante, um estabilizador, um espessante e semelhantes para melhorar a estabilidade. Anti-sépticos sintéticos e naturais podem ser usados, por exemplo, em uma quantidade de 0,01% a 20%. Antioxidantes podem ser usados, por exemplo, BHT, erisorbato, tocoferol, astaxantina, flavonóide vegetal e seus derivados, ou uma substância antioxidante derivada de planta. Um estabilizador pode ser usado para estabilizar a estrutura dos lipossomas, por exemplo, polióis e açúcares. Exemplos de polióis incluem butileno glicol, polietileno glicol, propileno glicol, dipropileno glicol e etil carbitol; exemplos de açúcares são trealose, sacarose, manitol, sorbitol e quitosana, ou um monossacarídeo ou um oligossacarídeo ou um amido de alto peso molecular. Um espessante pode ser usado para melhorar a estabilidade da dispersão de lipossomas construídos na água, por exemplo, um espessante natural ou uma acrilamida, ou um espessante polimérico sintético. Espessantes exemplificativos incluem polímeros naturais, como goma arábica, goma xantana, goma gelana, goma alfarroba e amido, derivados de celulose, como hidroxietilcelulose, hidroxipropil celulose e carboximetil celulose, polímeros sintéticos, como ácido poliacrílico, poli-acrilamida ou polivinilpirolidona e álcool polivinílico, e seus copolímeros ou materiais reticulados.

[0082] Os lipossomas podem ser produzidos usando qualquer método, por exemplo, como descrito em Park et al., publicação Pat. US No. 2007/0042031, incluindo o método de produção de um lipossoma encapsulando um produto terapêutico que compreende proporcionar uma solução aquosa de um primeiro reservatório; fornecer uma solução lipídica orgânica em um segundo reservatório, em que uma da solução aquosa e a solução lipídica orgânica inclui um produto terapêutico; misturar a solução aquosa com a referida solução lipídica orgânica em uma primeira região de mistura para produzir uma solução lipossômica, em que a solução lipídica orgânica se mistura com a referida solução aquosa de modo a

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25/47 produzir substancialmente instantaneamente instantaneamente um lipossomo encapsulando o produto terapêutico; e imediatamente depois misturar a solução de lipossomas com uma solução tampão para produzir uma solução diluída de lipossomas.

[0083] Também são fornecidas nanopartículas que compreendem compostos utilizados para a prática de formas de realização aqui proporcionadas (por exemplo, anticorpos anti- av33(avb3)) para fornecer a composição como uma nanopartícula que contém o fármaco (por exemplo, uma nanopartícula secundária), tal como descrito, por exemplo, na publicação Pat. US No. 20070077286. Numa forma de realização, também são fornecidas nanopartículas compreendendo um fármaco solúvel em gordura aqui fornecido ou um fármaco solúvel em água gordurasolubilizado atuando com um sal de metal bivalente ou trivalente.

Lipossomas [0084] As composições (por exemplo, anticorpos anti- av33(avb3)) e formulações usados para praticar formas de realização aqui proporcionadas podem ser entregues pela utilização de lipossomas. Ao usar lipossomas, particularmente onde a superfície do lipossoma transporta ligantes específicos para as células-alvo ou, de outra forma, é preferencialmente direcionada a um órgão ou célula específica, por exemplo, células-tronco cancerígenas, pode-se concentrar a entrega do agente ativo nas células-alvo in vivo. Ver, por exemplo, Patentes US Nos. 6.063.400; 6.007.839; AlMuhammed (1996) J. Microencapsul. 13: 293-306; Chonn (1995)

Curr. Opin. Biotechnol. 6: 698-708; Ostro (1989) Am. J. Hosp. Pharm. 46: 15761587. Por exemplo, em uma modalidade, as composições e formulações usadas para praticar modalidades aqui fornecidas são fornecidas pelo uso de lipossomos com lipídios rígidos com grupos de cabeça e caudas hidrofóbicas, por exemplo, como usando um lipídeo ligado a polietilenoglicol com uma cadeia lateral que corresponde a pelo menos um porção do lipídeo, como descrito, por exemplo, na publicação Pat US No. 2008/0089928. Em outra modalidade, composições e formulações usadas para praticar modalidades aqui fornecidas são fornecidas pelo uso de lipossomas anfotéricos compreendendo uma mistura de lipídios, por exemplo, uma mistura

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26/47 compreendendo um anfifílico catiônico, um anfifílico aniônico e/ou anfifílicos neutros, como descrito, por exemplo, na publicação Pat US No. 2008/0088046 ou 2008/0031937. Em outra modalidade, composições e formulações usadas para praticar modalidades fornecidas neste documento são fornecidas pelo uso de lipossomas compreendendo uma fração de polialquileno glicol ligada através de um grupo tioéter e um anticorpo também ligado através de um grupo tioéter ao lipossomo, como por exemplo, na publicação Pat US No. 2008/0014255. Em outra modalidade, composições e formulações usadas para praticar modalidades aqui fornecidas são fornecidas pelo uso de lipossomos compreendendo glicerídeos, glicerol- fosfolípidos, glicerofosfinolípidos, glicerofosfonolípidos, sulfolípidos, esfingolípidos, fosfolípidos, isoprenolidos, esteróides, estearinas, esteróis e / ou lipídios contendo carboidratos, como descrito, por exemplo, na publicação Pat US No. 2007/0148220.

Anticorpos e polipeptídeos de ligação ao antígeno como composições farmacêuticas [0085] Em formas de realização alternativas, também são fornecidos composições e métodos que compreendem anticorpos ou seus fragmentos ativos, ou polipeptídeos de ligação ανβ33 (por exemplo, compreendendo CDRs capaz de se ligar especificamente a um ανβ3) capaz de se ligar especificamente a um polipeptídeo ανβ33 (avb3) integrina expresso em um câncer ou uma célula tumoral, ou em um CSC, em que o anticorpo ou polipeptídeo tem um domínio Fc ou domínio ou fração equivalente capaz de se ligar a um macrófago e iniciar uma morte por citotoxicidade mediada por célula (ADCC) dependente de anticorpo da célula à qual o anticorpo ligase especificamente (por exemplo, anticorpos 3ηΐί-ανβ33 (avb3)). Em modalidades alternativas, são fornecidas composições para administrar esses anticorpos e polipeptídeos.

[0086] Em aspectos alternativos, um anticorpo ou polipeptídeo para a prática de modalidades aqui fornecidas pode compreender um peptídeo ou polipeptídeo derivado de, modelado após ou substancialmente codificado por um gene de imunoglobulina ou genes de imunoglobulina, ou seus fragmentos, capaz de se ligar especificamente a um antígeno ou epítopo, consultar e.g. Fundamental Immunology, Third Edition, WE Paul, ed., Raven Press, NY (1993); Wilson (1994) J.

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Immunol. Métodos 175: 267-273; Yarmush (1992) J. Biochem. Biophys. Métodos 25: 85-97. Em aspectos alternativos, um anticorpo ou polipeptídeo para a prática de modalidades aqui fornecidas inclui porções de ligação ao antígeno, ou seja, locais de ligação ao antígeno (por exemplo, fragmentos, subsequências, regiões determinantes da complementaridade (CDRs)) que retêm capacidade de ligação ao antígeno, incluindo (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de dobra; (iii) um fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546)), que consiste em um domínio VH; e (vi) uma região determinante de complementaridade isolada (CDR). Os anticorpos de cadeia única também são incluídos por referência no termo anticorpo. [0087] Em formas de realização alternativas, o método compreende a utilização de um polipeptídeo capaz de se ligar especificamente a um polipeptídeo ανβ33 (avb3) integrina, incluindo polipeptídeos que compreendem a ανβ33 ligação ao CDR de: anticorpo monoclonal LM609 (Chemicon Int, Temecula, CA) ( CVCL_KS89 ) (o hibridoma murino com número de acesso ATCC HB 9537 ) (ver, por exemplo, patente US n^Q 7.115.261); anticorpo monoclonal CBL544, derivado do clone 23C6 (MilliporeSigma, Burlington, MA); anticorpo monoclonal ab7166 (abeam, Cambridge, MA); ou anticorpo monoclonal ab78289 (abeam, Cambridge, MA), que pode ser facilmente determinado por um técnico no assunto.

[0088] Uma modalidade alternativa pode usar anticorpos humanizados, incluindo formas de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) que são anticorpos quiméricos que compreendem sequência mínima (por exemplo, o fragmento de ligação ao antígeno) derivado de imunoglobulina não humana. Em modalidades alternativas, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas nas quais resíduos de uma região hipervariável (HVR) de um receptor (por exemplo, uma sequência de anticorpos humanos) são substituídos por resíduos de uma região hipervariável (HVR) de uma espécie não humana (anticorpo doador ), como

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28/47 camundongo, rato, coelho ou primata não humano, com a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em modalidades alternativas, os resíduos da região estrutural (FR) da imunoglobulina humana são substituídos pelos resíduos não humanos correspondentes para melhorar a afinidade de ligação ao antígeno.

[0089] Em modalidades alternativas, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Essas modificações podem ser feitas para melhorar a afinidade do anticorpo ou a atividade funcional. Em modalidades alternativas, o anticorpo humanizado pode compreender substancialmente todos os pelo menos um e, tipicamente, dois domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões hipervariáveis correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e toda ou substancialmente toda a estrutura de regiões Ab são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana.

[0090] Em modalidades alternativas, um anticorpo humanizado usado para praticar modalidades fornecidas neste documento pode compreender pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de ou derivada de uma imunoglobulina humana.

[0091] No entanto, em modalidades alternativas, anticorpos completamente humanos também podem ser usados para praticar modalidades aqui fornecidas, incluindo anticorpos humanos compreendendo a sequência de aminoácidos que corresponde à de um anticorpo produzido por um humano. Esta definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado compreendendo resíduos de ligação ao antígeno não humano.

[0092] Em formas de realização alternativas, o método compreende a utilização de anticorpos humanizados capazes de se ligar especificamente a um polipeptídeo ανβ33 (avb3) integrina, incluindo versões humanizadas de ανβ33 ligado ao: anticorpo monoclonal LM609 (Chemicon Int, Temecula, CA) ( CVCL_KS89 ) (hibridoma murino tendo o número de acesso ATCC HB 9537 ) (ver, por exemplo, patente US n^Q7.115.261); anticorpo monoclonal CBL544, derivado do clone 23C6 (MilliporeSigma, Burlington, MA); anticorpo monoclonal ab7166 (abeam, Cambridge, MA); ou anticorpo

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29/47 monoclonal ab78289 (abeam, Cambridge, MA), em que várias versões humanizadas podem ser prontamente determinadas por um técnico no assunto.

[0093] Em modalidades alternativas, os anticorpos utilizados para praticar modalidades aqui fornecidas compreendem anticorpos maturados por afinidade, por exemplo, anticorpos compreendendo com uma ou mais alterações em uma ou mais regiões hipervariáveis que resultam em uma melhoria na afinidade do anticorpo para o antígeno; por exemplo, uma histona metil e / ou acetil transferase, em comparação com um anticorpo progenitor que não possui essas alterações. Nas modalidades alternativas, os anticorpos utilizados para praticar as modalidades aqui fornecidas são anticorpos amadurecidos com afinidades nanomolares ou mesmo picomolares para o antígeno alvo, por exemplo, uma histona metil e / ou acetil transferase. Os anticorpos amadurecidos por afinidade podem ser produzidos por procedimentos conhecidos na técnica.

[0094] Em formas de realização alternativas, os anticorpos utilizados para praticar os métodos tal como aqui proporcionada são: o anticorpo monoclonal LM609 (. Chemicon Int, Temecula, CA) (CVCL_KS89) (do hibridoma de murino que tem o número de acesso ATCC HB 9537) (ver, por exemplo, patente US n° 7.115.261); anticorpo monoclonal CBL544, derivado do clone 23C6 (MilliporeSigma, Burlington, MA); anticorpo monoclonal ab7166 (abeam, Cambridge, MA); ou anticorpo monoclonal ab78289 (abeam, Cambridge, MA) e suas versões humanizadas. O anticorpo monoclonal LM609 é descrito, por exemplo, por Cheresh et al., J Biol Chem. 1987; 262 (36): 17703-11; e patente US 5.753.230 e US 6.590.079. LM609 é um anticorpo monoclonal murino específico para a integrina ανβ3, ver, por exemplo, Cheresh, DA, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 6471-6475 (1987) e Cheresh et al., J. Biol. Chem. 262: 17703-17711 (1987). O LM609 foi produzido contra e é reativo com o receptor de adesão celular M21, agora conhecido como integrina ανβ3. O LM609 inibe a ligação de células M21 a ligantes ανβ3, como vitronectina, fibrinogênio e fator de von Willebrand (Cheresh e Spiro, supra) e também é um inibidor de patologias mediadas por ανβ3, como angiogênese induzida por tumor (Brooks et al., Cell 79: 1157 -1164 (1994)), desenvolvimento de tecido de granulação na ferida

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30/47 cutânea (Clark et al., Am. J. Pathology, 148:1407-1421 (1996)) e migração de células do músculo liso como a que ocorre durante a reestenose (Choi et al. J. Vascular Surg., 19: 125-134 (1994); Jones et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. 93: 2482-2487 (1996)).

Kits e Instruções [0095] Também são fornecidos kits que compreendem composições (por exemplo, anticorpos) para a prática dos métodos e usos conforme aqui fornecidos, opcionalmente também incluindo instruções para seu uso. Em modalidades alternativas, também são fornecidos kits que compreendem os anticorpos ou polipeptídeos monoclonais capazes de se ligar especificamente a um ανβ3, como aqui descrito.

[0096] A invenção será ainda descrita com referência aos seguintes exemplos; no entanto, deve ser entendido que as modalidades exemplares aqui fornecidas, ou a invenção, não são limitadas a tais exemplos.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1: Direcionamento imunológico de câncer de pulmão resistente a medicamentos [0097] Este exemplo e os dados aqui apresentados demonstram a eficácia das composições e métodos como aqui fornecidos para o tratamento de cânceres. São aqui fornecidos composições e métodos para o tratamento de tumores que se tornaram adaptados para os efeitos da terapia e ter tornado altamente agressivo e invasivo. Este exemplo descreve uma abordagem para evitar este processo através da exploração de dois fenômenos que surgem durante a resistência aos fármacos adquirida. Em primeiro lugar, os tumores de pulmão mutantes do EGFR tratados com o inibidor de RTK erlotinib ganham expressão da integrina ανβ3, e esse marcador é altamente enriquecido nas células tumorais circulantes. Em segundo lugar, os tumores tratados com erlotinib mostram um acúmulo de macrófagos associados ao tumor M2, demonstrando como o tumor pode manipular o sistema imunológico para suportar sua própria proliferação e metástase. Enquanto cada um desses eventos gera um fenótipo de tumor mais agressivo e resistente a medicamentos, sua coexistência cria uma oportunidade única. Demonstramos que a administração sistêmica do anticorpo

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31/47 monoclonal ανβ3 LM609 não apenas destrói as células resistentes a medicamentos dentro do tumor primário, mas elimina as células tumorais circulantes. Mecanicamente, a morte de células tumorais ocorre por citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC), para a qual os macrófagos são as células efetoras in vitro e in vivo. Enquanto erlotinib pode inicialmente limitar o crescimento do tumor, esta terapia em última análise, cria um tumor mais agressivo, através do enriquecimento de células que expressam ανβ33 / ALDH1A1 e recrutamento de macrófagos associados a tumores. Ao direcionar ανβ33, as composições e métodos como aqui proporcionados, incluindo o uso exemplar de LM609, exploram a manipulação do tumor do sistema imune para destruir a maioria da droga - células resistentes e travar a progressão do tumor.

[0098] Nosso grupo relatou anteriormente que pacientes com adenocarcinoma de pulmão que haviam progredido no erlotinib mostraram um aumento significativo na expressão da integrina ανβ3, que camundongos portadores de tumores pulmonares negativos para ανβ3 ganharam expressão de ανβ3 à medida que se tornaram resistentes ao erlotinib (2) e que ο ανβ3 é altamente enriquecido em lesões metastáticas em comparação com tumores primários dos mesmos pacientes (3). De fato, estabeleceu-se que a integrina ανβ3 é tanto necessário quanto suficiente para induzir não só resistência ao erlotinib, mas um fenótipo de haste semelhante agressivo (2-4). Assim, o direcionamento terapêutico de ανβ3 pode não apenas diminuir a progressão do tumor, mas também pode eliminar as células mais resistentes a medicamentos na população.

[0099] No nível molecular, identificamos um papel para ο ανβ3 nesse processo que era independente de sua função como receptor de adesão (5). Como tal, estratégias para bloquear a função de integrina canônica de ανβ3 usando peptídeos RGD cíclicos ou antagonistas de integrina semelhantes que competem pela ligação integrina-ligante não afetam sua capacidade de estimular a resistência ao fármaco e à rigidez (2). Em vez disso, relatamos que interromper a sinalização da quinase 1 de ligação a TANK (TBK1) / NF-κΒ acionada por ανβ3 foi capaz de reverter o fenótipo dessas células tumorais agressivas (2). Como essa abordagem interrompe apenas

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32/47 uma via a jusante, consideramos abordagens alternativas para direcionar e destruir diretamente as células tumorais que expressam a integrina ανβ3.

[0100] Além das propriedades de bloqueio da função, certos anticorpos podem marcar as células tumorais s para eliminação pela citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC). Esse processo é desencadeado quando o anticorpo se liga aos antígenos das células tumorais e é simultaneamente reconhecido pelo FcyR nas células efetoras imunológicas (6). Considerando-se que outros grupos também relataram uma acumulação de macrófagos associados a tumores (TAM) em tumores resistentes a erlotinib (2, 7, 8), é aqui proporcionada uma estratégia para explorar este estado de expressão ανβ33 reforçada e enriquecimento em macrófagos como tática eliminar células tumorais agressivas que expressam ανβ3.

Resultados e discussão [0101] Estudos anteriores em camundongos e humanos revelam que a resistência ao câncer de pulmão aos inibidores de EGFR leva à regulação positiva de ανβ3 e à aquisição de um destino semelhante a um tronco resistente a medicamentos (2). Para avaliar esta via de resistência adquirida, tratamos camundongos portadores de xenoenxertos subcutâneos de câncer de pulmão humano não pequenas células ανβ3EGFR-mutante (HCC827) com veículo ou erlotinib e medimos o crescimento do tumor ao longo do tempo (Figura 1 A). Enquanto o erlotinib produziu a inibição esperada do crescimento do tumor em alguns dias, os tumores começaram a crescer novamente após várias semanas (Figura 1B). Como visto anteriormente em pacientes erlotinibresistente (2), express dec^3integrina foi enriquecido em tumores resistentes a erlotinib em comparação com o grupo de veículo, e as células que expressam ανβ33 eram positivas para o marcador de haste aldeído desidrogenase 1A1, ALDH1A1 (Figura 1B -D). O HCC827-ErlR, uma linha celular estabelecida a partir de um tumor resistente ao erlotinib, reteve a resistência ao erlotinib in vitro e também foi resistente ao inibidor de EGFR de terceira geração, osimertinib (Figura 1 E-F). Importante, fomos capazes de confirmar estes resultados utilizando ανβ, xenoenxertos 3-negativas PC9 EGFR mutante.

[0102] Dado que a integrina ανβ3 tem sido associada à progressão de tumores e

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33/47 metástases para uma gama de cânceres (3, 9), nós concluímos que a expressão de ανβ33 induzida por erlotinib pode facilitar o aumento de invasão tumoral. Para avaliar essa possibilidade, examinamos o número de células tumorais circulantes (CTCs) em animais portadores de tumor ortotópico HCC827 durante o tratamento sistêmico com erlotinib (Figura 1 A). Embora a inibição do crescimento tumoral no pulmão tenha sido mantida 30 dias após o início do tratamento com erlotinib, detectamos um aumento acentuado no número de CTCs no grupo tratado com erlotinib (Figura 1 GH), sugerindo que a disseminação aumentada das células tumorais para a circulação ocorra antes aquisição de resistência a drogas na massa primária do tumor. É importante ressaltar que a grande maioria dos CTCs detectados após o tratamento com erlotinib foram positivos para ανβ3 (Figura 1 G-H). Esses achados revelam que, apesar de controlar inicialmente o crescimento do tumor primário, o erlotinib tem capacidade para converter células em um estado positivo ανβ3 / ALDH1A1, com capacidade de intravasar e sobreviver na circulação, destacando a necessidade de atingir essa população de fármacos semelhantes a caule, células tumorais resistentes que emergem antes que a progressão da doença seja detectável.

[0103] Macrófagos associados a tumores (TAMs), particularmente o tipo M2 (10), secretam fatores de crescimento, citocinas pró-tumorigênicas e enzimas imunossupressoras para promover a progressão do tumor por indução de angiogênese, metástase e supressão imunológica (11-14). Nesse sentido, a observação de TAMs enriquecidas nos tecidos tumorais está associada a um mau prognóstico em vários tipos de câncer, incluindo adenocarcinoma de pulmão (7). Como observado para tumores de pacientes com adenocarcinoma de pulmão resistente a inibidores de EGFR (7, 8), encontramos um número maior de TAMs (CD11b positivo, Ly-6G negativo), particularmente do tipo M2 (CD206 positivo ou CD206- e MHCII- negativo duplo na população da TAM), nos tumores resistentes ao erlotinib aos de camundongos tratados com um controle de veículo (Figura 11).

[0104] Os resultados acima sugerem que o ambiente tumoral resistente ao erlotinib pode ser idealmente adequado para uma abordagem terapêutica que explora a infiltração de macrófagos para atingir células tumorais que expressam ανβ3. Como

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34/47 estratégia para conseguir isso, usamos um anticorpo anti-av33 humano (LM609) que desenvolvemos anteriormente e caracterizamos como um agente antitumoral / antiangiogênico em modelos pré-clínicos (15). Na verdade, uma forma humanizada e amadurecida por afinidade do anticorpo LM609, e racizumab, também mostrou atividade clínica em alguns pacientes com tumores sólidos (16-19), embora heterogeneidade na expressão de ανβ33 pode explicar a falta de eficácia em outros. Desde e racizumab foi relatado para mediar a citotoxicidade por mediação celular dependente de anticorpos (ADCC) in vitro (19), consideramos LM609 como uma oportunidade única t o envolver TAM para alvejar a população enriquecida de células de tumor que expressam ανβ33 que surgem durante adquirida resistência ao erlotinib in vivo.

[0105] Enquanto o erlotinib sozinho enriqueceu para ανβ3 e levou ao crescimento do tumor e ao aparecimento de CTCs, a combinação de erlotinib e LM609 manteve a sensibilidade ao erlotinib (Figura 2A). Não só LM609 elimina células o^3-positivas (Figura 2B), mas também preveniu o aumento de CTC ανβ33-ροείΐίνο (Figura 2C E), sugerindo que o LM609 impede tanto erlotinib e o intravasamento / sobrevivência de circulação de células tumorais o^3-positivas durante o curso da terapia. Enquanto integrina ανβ3 funciona como uma célula-matriz molécula de adesão (15), o tratamento com LM609 por si só não afetou a viabilidade de qualquer célula ανβ3positivo -negativas. Esse achado é consistente com outros estudos que mostraram que o papel da integrina ανβ3 nas células tumorais é independente de sua função como molécula de adesão e, antes, na indução do crescimento independente da ancoragem (2,3). Em vez disso, determinamos que o LM609 aumenta a morte celular ανβ3-ροείΐίν3 por ADCC, e determinou-se que este processo era mediado por macrófagos, mas não as células NK (Figura 3A e 3B).

[0106] De fato, o bloqueio b de receptores Fcy em macrófagos diminuiu o efeito de LM609 in vitro (Figura 3C). Enquanto o LM609 suprimiu o crescimento de tumores positivos para 3νβ3 in vivo, a eliminação de macrófagos usando lipossomas de clodronato aboliu esse efeito (Figura 3D). Juntos, esses estudos apontam para o ADCC mediado por macrófagos como mecanismo primário de atividade do LM609,

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35/47 tanto in vitro quanto in vivo.

[0107] Nosso estudo demonstra como a terapia com erlotinib altera o tumor, enriquecendo a expressão de ανβ3, e destaca como o tumor pode manipular o sistema imunológico do hospedeiro para apoiar um fenótipo resistente a medicamentos. Embora essas adaptações possam facilitar a progressão do tumor durante o tratamento com erlotinib, elas também oferecem uma oportunidade única de explorar esse cenário. Com efeito, um anticorpo anti- ανβ3 estimula macrófagos para destruir seletivamente células 3ηΐί-ανβ3 resistente a droga / células que expressam ALDH1A1 tumorais dentro do tumor primário, bem como CTC, em conjunto retardar o aparecimento de resistência adquirida (Figura 2A). Como o LM609 reconhece apenas a integrina humana α v β 3, nosso modelo de xenoenxerto nos permite separar seu papel no ADCC de qualquer impacto nas células endoteliais associadas ao tumor s que requerem essa integrina para angiogênese (20, 21). Considerando que a angiogênese contribui para o crescimento do tumor, e como o LM609 e o etaracizumab são anticorpos IgG 1 com maior afinidade para os receptores Fcy dos macrófagos humanos versus camundongos (22), nossa avaliação pré-clínica pode subestimar a eficácia dessa estratégia terapêutica para tumores resistentes ao erlotinib em humanos. Além disso, dado que não apenas o erlotinib, mas também outras terapêuticas contra o câncer aumentam a expressão da integrina β3 nas células epiteliais do câncer (Figura 6), a terapia com anticorpo antiανβ3 pode ser usada com várias terapêuticas. Em conclusão, as combinações aqui proporcionadas são anticorpos anti- ανβ3 com inibidores de EGFR e / ou outros medicamentos contra o câncer como uma abordagem terapêutica única para os pacientes de câncer epiteliais que progridem de um padrão de terapia.

Métodos

Linhas de células e reagentes [0108] Células de adenocarcinoma pulmonar (HCC827 em RPMI) foram obtidas de ATCC. A linha de células de melanoma, M21, foi um presente do Dr. DL Morton (Universidade da Califórnia, Los Anjo e s, EUA). A linha celular de adenocarcinoma de pulmão, PC9, foi um presente da Dra. Joan Massague (Sloan-Kettering Institute,

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EUA). A autenticação da linha celular foi realizada pelo ATCC usando perfis de DNA repetidos em tandem curtos. Após o recebimento, cada linha celular foi expandida, criopreservada como material de passagem baixa e testada rotineiramente para Mycoplasma. Para expressão ectópica e knockdown genético, as células foram transfectadas com controle vetorial (marcado com GFP), integrina β3 ou luciferase usando um sistema lentiviral como descrito anteriormente (1). Os níveis de integrina ανβ3 foram testados por citometria de fluxo, como descrito abaixo.

[0109] O captisol foi obtido da Cydex™ (NC0604701) e diluído em água a 6%. O erlotinib foi obtido de SellekChem™ (S1023) e diluído em DMSO para in vitro ou em captisol para experiências in vivo. O LM609 foi produzido neste laboratório como descrito anteriormente (2). A atividade foi confirmada pelo ensaio de adesão como descrito abaixo. Soluções de controle e lipossomas de clodronato foram obtidas em ClodronateLiposome.com.

Ensaio de adesão [0110] As células M21 (ανβ3 +) foram plaqueadas em uma placa revestida com vitronectina ou revestida com colágeno com e sem LM609. As células aderentes foram coradas com violeta de cristal e a absorvância visível (600 nm) de cada poço foi quantificada usando um leitor de microplacas.

Modelo de xenoenxerto de adenocarcinoma pulmonar resistente ao erlotinib [0111] O modelo de xenoenxerto de adenocarcinoma de pulmão resistente ao erlotinib foi utilizado como descrito anteriormente (3). Resumidamente, HCC827 (5 x 10⁶ células de tumor em 100 de RPMI) as células foram injetadas subcutaneamente no flanco direito de camundongos nu fêmea / nu (8 - 10 semanas de idade). Os tumores foram medidos duas vezes por semana com pinças (volume do tumor (mrrr) = comprimento x largura x largura / 2). Os animais com volume tumoral de 250 - 700 mm^J foram divididos aleatoriamente em grupos tratados com captisol (oral, seis vezes / semana) e PBS (ip, duas vezes / semana), captisol e LM609 (ip, 10 mg / kg, duas vezes / semana), erlotinib (oral, 6,25 mg / kg, seis vezes / semana) e PBS, ou erlotinib e LM609. Os ratos nos grupos captisol foram sacrificados no dia 15 devido ao grande tamanho do tumor. Os grupos erlotinib foram sacrificados no dia 50. Os tecidos

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37/47 tumorais foram divididos em três partes para congelamento rápido, congelamento em composto OCT (VWR, 25608-930) ou fixação de formalina a 10% (Fisher Scientific, 23-313095) para análises posteriores.

Quantificação de TAMs [0112] Os TAMs foram isolados a partir de tecidos tumorais, como descrito anteriormente (4). Os tecidos tumorais congelados foram descongelados, picados e dissociados em HBSS contendo colagenase IV (Sigma, C5138, 0,5 mg / mL), hialuronidase (Sigma, H2654, 0,1 mg / mL), dispase II (Roche, 04942078001,0,6 U / mL ) e DNase IV (Millipore, 260913-10MU, 5 U / mL) a 37 °C por 15 minutos. As suspensões celulares foram filtradas através de um filtro celular de 70 pm e lavadas com PBS. Suspensões de células únicas (10⁶ células /100 pL em 5% de BSA em PBS) foram incubadas com Mouse BD Fc Block™ (BD Biosciences, 553142,1:50) por 10 minutos a 4 °C e anticorpos marcados com fluorescência, CD11 b (eBioscience, 17-0112-81, 1: 100), Ly-6G (eBioscience, 25-5931, 1: 100), CD206 (BioRad, MCA2235PET) e MHCII (BD Biosciences, 562928) durante uma hora a 4 °C. A citometria de fluxo foi realizada no BD LSRFortessa ™ e a proporção de TAMs (CD11 b positivo, Ly-6G negativo), M1 (CD206 negativo, MHCII positivo dentro dos TAMs) e M2 (população não M1 dentro dos TAMs) em o tecido tumoral foi calculado usando o programa de análise por citometria de fluxo FlowJo™ (Treestar).

Análise imuno-histoquímica [0113] A coloração imuno-histoquímica foi realizada em lâminas de FFPE não coradas, de acordo com as recomendações do fabricante para o kit VECTASTAIN Elite ABC HRP (Vector Laboratories, PK-6100). Foram utilizados um anticorpo antiintegrina p3 (Cell Signaling, 13166, 1: 200) e um anticorpo biotinilado de cabra anticoelho (Vector Laboratories, BA-1000,1: 200). Os tecidos corados foram fotografados no NanoZoomer Slide Scanning System™ (Hamamatsu), e a fração da área β3 positiva em relação ao tecido tumoral foi calculada utilizando Imaged (NIH) (5). Modelo de adenocarcinoma ortotópico do pulmão e isolamento da CTC [0114] Células HCC827 Luciferase- e GFP-positiva (5 x 10⁶ células em 50 pl de

PBS) foram injetadas nas certas pulmões de camundongos nu fêmea / nu (8 - 10

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38/47 semanas de idade). O crescimento do tumor foi monitorado pelo IVIS SPECTRUM™ (PerkinElmer) a cada quatro semanas. Oito semanas após a injeção, os camundongos foram divididos aleatoriamente em três grupos: pré-tratamento, tratamento com erlotinib (oral, 6,25 mg / kg, seis vezes / semana) e a combinação de erlotinib e LM609 (ip, 10 mg / kg, Duas vezes por semana). Os ratos do grupo prétratamento foram sacrificados na semana 8 para análise de CTC. Os ratos do grupo de tratamento foram tratados com erlotinib e / ou LM609 por quatro semanas antes de serem sacrificados. O sangue total (0,5 mL / camundongo) foi coletado em tubos EDTA, e os PBMCs, incluindo CTCs, foram isolados usando Lymphoprep™ (STEMCELL Technologies, 85415) e SepMate™ (STEMCELL Technologies, 07801) seguindo o protocolo do fabricante. As células isoladas foram lavadas com PBS, plaqueadas em placas de 8 poços revestidas com poli-L-lisina (Sigma, P1399), fixadas com PFA a 4% (VWR, AA43368-9M) e coradas com DAPI (Life Technologies, D1306, 1 pg / mL em BSA a 1% em PBS), LM609 (5 pg / mL em BSA a 1% em PBS) e um anticorpo secundário marcado com fluorescência (Thermo, A21235, 1: 500). As células foram analisadas utilizando o microscópio confocal Nikon Eclipse C2™ (Nikon). Os CTCs foram definidos como células duplamente positivas para DAPI e GFP. Foram contados os números de CTCs positivos e negativos 3νβ3 por camundongo. Após o sacrifício dos camundongos, o volume de massa tumoral nos pulmões também foi medido utilizando um sistema de imagem por fluorescência OV100™ (Olympus).

Estabelecimento de linhas celulares positivas para ανβ3 induzidas por erlotinib [0115] As células HCC827 (HCC827-R) resistentes ao erlotinib e as células PC9 (PC9-R) foram estabelecidas como descrito anteriormente (3). A resistência aos inibidores de EGFR (erlotinib e AZD9291) foi confirmada por ensaios de MTT (Figura 1B).

Ensaio MTT [0116] As células foram plaqueadas em placas de 96 poços e, após tratamentos apropriados, as células foram incubadas em solução de MTT (Sigma, M2128, 0,5 mg / mL em meio de crescimento) por duas horas a 37 °C. Em seguida, a solução de MTT

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39/47 foi removida e o precipitado cristalino azul em cada poço foi dissolvido em DMSO. A absorvância visível de cada poço a 560 nm foi quantificada usando um leitor de microplacas.

Isolamento de macrófagos derivados da medula óssea (DMO) [0117] As BMDMs foram colhidas assepticamente de camundongos C57BL / 6 fêmeas de 8 a 10 semanas de idade, lavando os ossos das pernas de camundongos eutanasiados com RPMI, filtrando através de filtros de células de 70 pm e incubando em tampão de lise de células vermelhas do sangue Hybri-Max™ (Sigma, R7757). Isolamento de células NK [0118] Os esplenócitos foram colhidos assepticamente de camundongos C57BL / 6 fêmeas de 8 a 10 semanas de idade, por meio da trituração de baços de camundongos eutanasiados com PBS contendo 2% de FBS e 1 mM de EDTA, filtrando através de filtros de 40 pm e incubando em tampão de hemácias Hybri-Max™ (Sigma, R7757). As células NK foram isoladas a partir dos esplenócitos usando o NK Cell Isolation Kit II™ (Miltenyi, 130-096-892).

Ensaio ADCC [0119] As células alvo coradas com CFSE Cell Division Tracker Kit ™ (BioLegend, 423801) ou CellTrace™ Far Red Cell Proliferation Kit ™ (ThermoFisher, C34564) foram co-cultivadas com BMDMs ou células NK com ou sem isotipo IgG ou LM609 por cinco horas às 37 °C. Após a incubação, as células foram coradas com PI (Sigma, P4864, 1: 1000) e a citometria de fluxo foi realizada no BD LSRFortessa™. A proporção de células alvo mortas (positivas para PI) e a população total de células alvo (CFSE ou positivo para o vermelho distante) foi calculada como descrito anteriormente (6).

Modelo de xenoenxerto de adenocarcinoma pulmonar com depleção de macrófagos [0120] HCC827-33 (5 x 10⁶ células de tumor em 100 de RPMI) as células foram injetadas subcutaneamente para o flanco direito de camundongos nu fêmea / nu (8 10 semanas de idade). Os tumores foram medidos duas vezes por semana com pinças. Os animais com volume tumoral de 30 - 110 mm foram divididos aleatoriamente em grupos tratados com lipossoma controle (ip, 200 pL, duas vezes /

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40/47 semana) e PBS (ip, duas vezes / semana, n = 5), lipossoma controle (ip, 200 μΙ_, duas vezes / semana) e LM609 (ip, 10 mg / kg, duas vezes / semana, n = 6), lipossoma de clodronato (ip, 200 μΙ_, duas vezes / semana) e PBS (ip, duas vezes / semana, n = 5), ou lipossoma clodronato (ip, 200 μΙ_, duas vezes / semana) e LM609 (ip, 10 mg / kg, duas vezes / semana, n = 6). Após 15 dias dos tratamentos, os tecidos do tumor foram fixados e congelados em composto OTC.

Imunofluorescência [0121] A coloração por imunofluorescência foi realizada em lâminas de OCT não coradas. As lâminas foram permeabilizadas com TritonX-100 a 0,1% (Bio-Rad, 1610407) em PBS por um minuto, bloqueadas com NGS a 10% (Jackson ImmunoResearch, 005-000-121) em PBS por duas horas e incubadas com DAPI (Life Technologies, D1306, 1 pg / mL em BSA a 1% em PBS) e um anticorpo anticamundongo F4/80 (eBioscience, 14-4801, conjugado com fluorocore TexasRed por OneWorldLab) por duas horas à temperatura ambiente. Foram tiradas fotos de microscopia confocal utilizando o microscópio confocal Nikon Eclipse C2 ™ (Nikon). / 80-positivo F4 área fração com respeito ao tecido do tumor foi calculado utilizando o ImageJ™ (NIH) (5).

Citometria de fluxo para integrina ανβ3 [0122] Os grânulos de células foram lavados bloqueados com BSA a 1% em PBS por 30 minutos à temperatura ambiente e corados com LM609 (5 pg / mL em BSA a 1% em PBS) e um anticorpo secundário marcado com fluorescência (Thermo, A21235,1:500). Após a coloração, as células foram incubadas com PI (Sigma, P4864, 1: 1000) e a citometria de fluxo foi realizada no BD LSRFortessa™. Os níveis de integrina ανβ3 foram analisados usando o programa de análise por citometria de fluxo FlowJo™ (Treestar).

Expressão genética [0123] O RNA total foi coletado usando o kit de purificação de RNA RNeasy™ (Qiagen). O cDNA foi sintetizado com a transcriptase reversa MultiScribe ™ usando iniciadores aleatórios (Thermo), e a PCR com transcrição reversa foi realizada em um LightCycler™ com sondas SYBR Green

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41/47 (Roche). A expressão relativa aos genes de referência foi calculada usando o método 2-ddCT.

Aprovação do estudo [0124] Todas as pesquisas foram realizadas sob o protocolo S05018 e aprovadas pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da UCSD. Todos os estudos estão de acordo com as diretrizes estabelecidas no Guia do NIH para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

Análise estatística [0125] Teste T de Student, de Mann-Whitney U, ou ANOVA foi realizado para comparar os grupos de amostras independentes. Kaplan-Meier foi realizada para medir a resistência - sobrevida livre. Excel (Microsoft) e SPSS (IBM Analytics) foram utilizados para análise estatística.

Legendas das figuras

Figura 1. A resistência ao erlotinib impactou o tumor primário, CTC e estroma.

[0126] FIG. 1 A: Um esquema do modelo de xenoenxerto resistente ao erlotinib.

[0127] FIG. 1B-D: Os tecidos resistentes ao erlotinib exibem células expressando aumento de ανβ3 / ALDH1A1. Camundongos xenoenxertos HCC827 (β3-) foram tratados com o veículo (Veh, n = 5) ou erlotinib (ErIR, n = 9). O crescimento do tumor foi medido (FIG. 1 B). Os tecidos tumorais foram corados por β3 (FIG. 1C). Barras, 10 pm. As células isoladas de tecidos resistentes ao erlotinib foram coradas para ανβ3 e ALDH1A1 para citometria de fluxo (FIG. 1 D). O gráfico representa dois ratos.

[0128] FIG. 1E-F: As células positivas para ανβ3 resistentes ao erlotinib foram resistentes a um inibidor de EGFR de terceira geração, osimertinib. As células tumorais isoladas de um camundongo tratado com veículo (veh) e um camundongo tratado com erlotinib (ErIR) foram coradas para ανβ3 para citometria de fluxo (FIG. 1E). Os gráficos são reflexos de três experimentos. As células foram tratadas com erlotinib ou osimertinib por 72 horas, e a viabilidade celular foi medida (FIG. 1F).

[0129] FIG. 1G-H: O erlotinib aumentou as CTCs enquanto os tumores primários ainda estão respondendo ao tratamento. Oito semanas após a injeção pulmonar de

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42/47 células HCC827 (β3-, GFP +, luciferase +), os camundongos foram tratados com erlotinib por 30 dias antes do isolamento dos CTCs. Os CTCs foram corados para ανβ3. CTCs ανβ3 positivo (β3 +) e negativo (β3-) de camundongos antes (prétratamento, n = 3) e após o tratamento (pós-tratamento, n = 5) foram contados (FIG. 1G). As massas primárias foram visualizadas (FIG. 1H). GFP, tecido tumoral; Barras, 5 mm.

[0130] FIG. 1 I: ilustra graficamente os dados que mostram como o aumento de M2-TAMs nos tecidos do xenoenxerto resistente ao elrotinibe; a porcentagem de M1 (cinza escuro) e M2- TAMs (cinza claro)) nos tecidos tumorais foi comparada entre os tratamentos veículo (n = 9) e erlotinib (n = 9) após 50 dias dos tratamentos. O teste t de Student bicaudal foi utilizado para determinar a significância estatística (* P <0,05 comparado aos controles). As barras de erro indicam erros padrão.

Figura 2. O LM609 produziu um fenótipo menos agressivo.

[0131] FIG. 2A: LM609 inibiu a aquisição de resistência ao erlotinib. Os ratos HCC827 (β3-) xenoenxerto foram tratados com erlotinib (Erlotinib, η = 9) ou erlotinib e LM609 (Erlotinib + LM609, η = 10). O crescimento do tumor foi medido duas vezes por semana. A sobrevida livre de progressão foi analisada utilizando o estimador Kaplan Meier.

[0132] FIG. 2B: LM609 elimina células 3-positivas. Os camundongos xenoenxerto HCC827 (β3-) foram tratados com Captisol e PBS (controle, n = 5), Captisol e LM609 (LM609, n = 5), erlotinib e PBS (Erlotinib, n = 9) ou erlotinib e LM609 (Erl + LM609, n = 10) por 50 dias. Os tecidos tumorais foram corados para a integrina β3, e a área positiva para β3 nos tecidos foi quantificada (n = 9 campos por grupo) (painel superior). As fotos (painel inferior) são representantes. Barras, 10 pm. O teste t de Student bicaudal foi utilizado para determinar a significância estatística (* P <0,05). As barras de erro indicam desvios padrão.

[0133] FIG. 2C-E: LM609 diminuiu o número de CTCs induzidas pelo erlotinib. Oito semanas após a injeção no pulmão direito de células HCC827 (β3-, GFP +, luciferase +), os camundongos foram tratados com erlotinib ou a combinação de erlotinib e LM609 (erlotinib + LM609) por quatro semanas antes que os CTCs fossem isolados. O

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43/47 volume do tumor foi medido por bioluminescência usando ο IVIS Spectrum antes dos tratamentos (pré-tratamento, η = 14) e após o tratamento com erlotinib (pós-erlotinib, η = 4) ou a combinação de erlotinib e LM609 (pós-Erl + LM609, n = 5) e quantificado (FIG. 2C). As figuras são representativas (FIG. 2D). As CTCs foram coradas para ανβ3 para quantificar CTCs ανβ3 positivas (β3 +) e negativas (β3-) (FIG. 2E). Um exemplo de CTCs ανβ3-ροείΐίνο5 é mostrado (painel inferior direito). O teste t de Student bicaudal foi utilizado para determinar a significância estatística (* P <0,05 em comparação com o pré-tratamento). As barras de erro indicam erros padrão (painel superior) e desvios padrão (painel inferior). Barras, 5 mm (painel superior); barras, 10 pm (painel inferior); azul, DAPI; verde, GFP; vermelho, ανβ3.

Figura 3. O LM609 eliminou células positivas para ανβ3 via ADCC mediado por macrófagos.

[0134] FIG. 3A- C: LM609 eliminou células positivas para ανβ3 via ADCC mediado por macrófagos in vitro. Os ensaios ADCC com macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) ou células NK foram realizados com células cancerígenas com e sem integrina ανβ3 tratadas com o isotipo IgG ou LM6 09 10 pg / mL e / ou bloqueador Fc. A percentagem de morte celular de células cancerígenas foi quantificada utilizando iodeto de propídio por citometria de fluxo. A relação efetor e alvo foi de 5: 1. O teste t de Student bicaudal foi utilizado para determinar a significância estatística (* P <0,05 comparado aos controles do isotipo IgG). As barras de erro indicam erros padrão. Vetor vazio, EV; plasmídeo p3, p3; Veh, células isoladas de um tecido tratado com veículo; ErIR, células isoladas de um tecido resistente ao erlotinib.

[0135] FIG. 3D -E: LM609 eliminou o crescimento de tumor positivo para ανβ3 apenas nos camundongos que possuem macrófagos. Os camundongos nus foram injetados subcutaneamente com células β3 que expressam ectopicamente β3 e tratados com lipossomo de controle e PBS ( FIG. Painel esquerdo 3D, controle, n = 5), lipossoma de controle e LM609 ( FIG. Painel esquerdo 3D, LM609, n = 6), lipossoma de clodronato e PBS ( painel direito, controle, n = 5) ou lipossoma de clodronato e LM609 ( Figura 3D painel direito, LM609, n = 6). O crescimento do tumor

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44/47 foi monitorado por 15 dias e após os tratamentos, quantificou-se a coloração de F4 / 80 nos tecidos do tumor (FIG. 3 D painel direito, n = 10 campos por grupo). O teste t de Student bicaudal foi utilizado para determinar a significância estatística (* P <0,05 comparado ao controle). Barreiras de erro indicam erros padrão.

Figura 4: As células tumorais resistentes ao erlotinib ganharam integrina ανβ3 e foram resistentes ao osimertinib.

[0136] FIG. 4A: O tumor tratado com erlotinib ganhou resistência. Camundongos xenoenxertos subcutâneos PC9 (β3-) foram tratados com o veículo (Veh) (n = 1) ou erlotinib (ErIR, n = 1). O crescimento do tumor foi medido semanalmente.

[0137] FIG. 4B: As células do tecido resistente ao erlotinib o^3-positivas, enquanto as células do animal tratado com veículo não eram. Os níveis de ανβ3 nas células isoladas dos animais tratados com veículo (Veh) e tratados com erlotinib (ErIR) foram medidos por citometria de fluxo. Controle secundário azul; vermelho, manchado com LM609.

[0138] FIG. 4C: As células resistentes ao erlotinib eram resistentes ao osimertinib. As células dos animais tratados com veículo (Veh) e tratados com erlotinib (ErIR) foram tratadas com erlotinib ou osimertinib nas doses indicadas e o ensaio MTT foi realizado para medir a viabilidade celular.

[0139] O teste t de Student bicaudal foi utilizado para determinar a significância estatística (* P <0,05 comparado ao controle). As barras de erro indicam desvios padrão.

Figura 5: LM609 inibiu a ligação ao ligando da integrina ανβ3, mas não a viabilidade celular.

[0140] FIG 5 A: LM609 inibiu a ligação do ligando da integrina ανβ3. As células M21 (ανβ3 +) foram plaqueadas em colágeno ou vitronectina (ligante ανβ3) com doses indicadas de LM609. O número de células aderentes foi medido.

[0141] FIG. 5 B: LM609 não afetou a viabilidade celular. Células ανβ3 positivas (β3 +) e negativas (β3-) emparelhadas foram tratadas com doses indicadas de LM609, e o ensaio MTT foi realizado para medir a viabilidade celular.

[0142] O teste t de Student bicaudal foi utilizado para determinar a significância

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45/47 estatística. As barras de erro indicam desvios padrão. EV, vetor vazio; plasmídeo p3, p3; Veh, células isoladas do grupo veículo (sensíveis ao erlotinib); ErIR, células isoladas do tecido resistente ao erlotinib.

A FIG. 6 ilustra graficamente os dados que mostram que a terapêutica com anticancerígeno enriquece a integrina β3 nas células epiteliais do câncer: qPCR foi realizado para detectar a expressão do mRNA das subunidades integrina α e β em resposta ao aumento da dose de peróxido de hidrogênio (H2O2) por 72 h, expresso como dobra em relação ao veículo ao controle. As barras de erro indicam desvios padrão. * P <0,05 comparado aos controles.

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[0171] Algumas modalidades exemplares foram descritas. No entanto, será entendido que várias modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito e escopo da invenção. Deste modo, outras modalidades estão dentro do escopo das reivindicações a seguir.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método caracterizado pelo fato de que é para:

- matar ou reduzir o número de células cancerígenas que expressam o polipeptídeo ανβ3 (avb3) ou células-tronco cancerígenas (CSCs) em um indivíduo com necessidade do mesmo,

- tratar, melhorar ou reverter ou retardar o desenvolvimento de um câncer ou tumor que expressa o polipeptídeo ανβ3 (avb3) em um indivíduo com necessidade do mesmo,

- melhorar ou retardar o desenvolvimento de cânceres causados ou iniciados por ou sustentados por células cancerígenas ou tumorais, ou células-tronco cancerígenas (CSCs), expressando polipeptídeos ανβ3 em suas superfícies celulares,

- aumentar uma população de macrófagos capaz de desencadear uma resposta inflamatória e inibir o crescimento do tumor in vivo, em que opcionalmente a população de macrófagos capaz de desencadear uma resposta inflamatória e inibir o crescimento do tumor compreende um macrófago associado ao tumor (TAM) ou uma população de macrófagos M1,

- aumentar a sensibilidade do câncer ou tumor que expressa o polipeptídeo ανβ3 (avb3) aos efeitos da terapia, opcionalmente uma quimioterapia, opcionalmente terapia com um inibidor do fator de crescimento, o método compreendendo:

(a) administrar, a um indivíduo com necessidade deste, um anticorpo ou polipeptídeo capaz de se ligar especificamente a um polipeptídeo de integrina ανβ3 (avb3) expresso em um câncer ou em uma célula tumoral ou em um CSC, ou (b) (i) fornecer um anticorpo ou polipeptídeo capaz de se ligar especificamente a um polipeptídeo de integrina ανβ3 (avb3) expresso em um câncer ou em uma célula tumoral ou em um CSC, em que o anticorpo ou polipeptídeo tem um domínio Fc ou domínio ou fração equivalente capaz de ligar um macrófago e iniciar uma morte por citotoxicidade mediada por células (ADCC) dependente de anticorpo da célula à qual o anticorpo se liga especificamente, (ii) administrar o anticorpo ou polipeptídeo a um indivíduo em necessidade

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2/5 do mesmo, resultando em:

matar ou reduzir o número de células cancerígenas que expressam polipeptídeo ανβ3 (avb3) ou células-tronco cancerígenas (CSCs) em um indivíduo com necessidade do mesmo,

- tratar, melhorar ou reverter ou retardar o desenvolvimento de um câncer ou tumor que expressa o polipeptídeo ανβ3 (avb3) em um indivíduo com necessidade do mesmo,

- melhorar ou retardar o desenvolvimento de cânceres causados ou iniciados por ou sustentados por células cancerígenas ou tumorais, ou células-tronco cancerígenas (CSCs), expressando polipeptídeos ανβ3 em suas superfícies celulares,

- aumentar uma população de macrófagos capaz de desencadear uma resposta inflamatória e inibir o crescimento do tumor in vivo, em que opcionalmente a população de macrófagos capaz de desencadear uma resposta inflamatória e inibir o crescimento do tumor compreende um macrófago associado ao tumor (TAM) ou uma população de macrófagos M1,

- aumentar a sensibilidade do câncer ou tumor que expressa o polipeptídeo ανβ3 (avb3) aos efeitos da terapia.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou polipeptídeo é ou compreende um anticorpo humanizado, opcionalmente um anticorpo murino humanizado.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou polipeptídeo é um anticorpo ou polipeptídeo recombinante ou manipulado por engenharia.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humano ou polipeptídeo humano.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal ou um anticorpo policlonal.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou polipeptídeo é: anticorpo monoclonal LM609 (Chemicon Int, Temecula,

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CA) (CVCL_KS89) (hibridoma murino com número de acesso ATCC HB 9537) (ver, por exemplo, a patente US7115261); anticorpo monoclonal CBL544, derivado do clone 23C6 (MilliporeSigma, Burlington, MA); anticorpo monoclonal ab7166 (abeam, Cambridge, MA); ou anticorpo monoclonal ab78289 (abeam, Cambridge, MA), ou qualquer versão humanizada do mesmo, ou qualquer polipeptídeo compreendendo uma CDR de ligação 3νβ3 de LM609, CBL544, ab7166 ou ab78289.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o macrófago é um macrófago humano ou um macrófago associado a um tumor (TAM).
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o câncer é um câncer epitelial ou uma célula tumoral epitelial.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o câncer é um câncer resistente a medicamentos e, opcionalmente, o medicamento é um inibidor do fator de crescimento ou um inibidor de quinase, em que opcionalmente o inibidor de fator de crescimento compreende um inibidor de Receptor Tirosino Quinase (RTK), opcionalmente erlotinibe.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou polipeptídeo é administrado por via intravenosa, intramuscular ou subeutânea ao indivíduo em necessidade.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou polipeptídeo é formulado como uma composição ou formulação farmacêutica estéril, ou é formulado para administração intravenosa, intramuscular ou subeutânea.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a dosagem de anticorpo ou polipeptídeo é baseada em dosagem fixa ou com base no peso corporal, ou em uma dose fixa entre cerca de 100 e 1200 mg por mês ou em uma dosagem entre cerca de 0,3 a 10 mg / kg.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a administração de um inibidor de

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4/5 fator de crescimento, em que opcionalmente o inibidor de fator de crescimento compreende um inibidor de Receptor Tirosino Quinase (RTK), um inibidor de Src, um inibidor de anti-metabolico, gencitabina, GEMZAR®, um veneno mitótico, paclitaxel, um taxol, ABRAXANE®, erlotinibe, TARCEVA®, lapatinibe, TYKERB®, cetuxamibe, ERBITUX® ou um inibidor do fator de crescimento da insulina.
14. Uso de: um anticorpo ou polipeptídeo capaz de se ligar especificamente a um polipeptídeo de integrina ανβ3 (avb3) expresso em um câncer ou em uma célula tumoral ou em um CSC; ou, um anticorpo ou polipeptídeo capaz de se ligar especificamente a um polipeptídeo de integrina ανβ3 (avb3) expresso em um câncer ou em uma célula tumoral ou em um CSC, caracterizado pelo fato de o anticorpo ou polipeptídeo tem um domínio Fc ou domínio ou fração equivalente capaz de se ligar a um macrófago e iniciar uma morte por citotoxicidade mediada por células (ADCC) dependentes de anticorpos da célula à qual o anticorpo ou polipeptídeo se liga especificamente, na preparação de um medicamento para:

- matar ou reduzir o número de células cancerígenas que expressam polipeptídeo ανβ3 (avb3) ou células-tronco cancerígenas (CSCs) em um indivíduo com necessidade,

- tratar, melhorar ou reverter ou retardar o desenvolvimento de um câncer ou tumor que expressa o polipeptídeo ανβ3 (avb3) em um indivíduo com necessidade do mesmo,

- melhorar ou retardar o desenvolvimento de cânceres causados ou iniciados por ou sustentados por células cancerígenas ou tumorais, ou células-tronco cancerígenas (CSCs), expressando polipeptídeos ανβ3 em suas superfícies celulares,

- aumentar uma população de macrófagos capaz de desencadear uma resposta inflamatória e inibir o crescimento do tumor in vivo, em que opcionalmente a população de macrófagos capaz de desencadear uma resposta inflamatória e inibir o crescimento do tumor compreende um macrófago associado ao tumor (TAM) ou uma população de macrófagos M1,

- aumentar a sensibilidade do câncer ou tumor que expressa o polipeptídeo ανβ3 (avb3) aos efeitos da terapia.

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15. Composição farmacêutica ou uma formulação caracterizada pelo fato de ser para uso em um método para:

- matar ou reduzir o número de células cancerígenas que expressam polipeptídeo ανβ3 (avb3) ou células-tronco cancerígenas (CSCs) em um indivíduo com necessidade do mesmo,

- tratar, melhorar ou reverter ou retardar o desenvolvimento de um câncer ou tumor que expressa o polipeptídeo ανβ3 (avb3) em um indivíduo com necessidade do mesmo,

- melhorar ou retardar o desenvolvimento de cânceres causados ou iniciados por ou sustentados por células cancerígenas ou tumorais, ou células-tronco cancerígenas (CSCs), expressando polipeptídeos ανβ3 em suas superfícies celulares,

- aumentar uma população de macrófagos capaz de desencadear uma resposta inflamatória e inibir o crescimento do tumor in vivo, em que opcionalmente a população de macrófagos capaz de desencadear uma resposta inflamatória e inibir o crescimento do tumor compreende um macrófago associado ao tumor (TAM) ou uma população de macrófagos M1,

- aumentar a sensibilidade do câncer ou tumor que expressa o polipeptídeo ανβ3 (avb3) aos efeitos da terapia, em que a composição farmacêutica ou uma formulação compreende:

um anticorpo ou polipeptídeo capaz de se ligar especificamente a um polipeptídeo de integrina ανβ3 (avb3) expresso em um câncer ou em uma célula tumoral ou em um CSC; ou, um anticorpo ou polipeptídeo capaz de se ligar especificamente a um polipeptídeo de integrina ανβ3 (avb3) expresso em um câncer ou em uma célula tumoral ou em um CSC, em que o anticorpo ou polipeptídeo tem um domínio Fc ou domínio ou fração equivalente capaz de se ligar a um macrófago e iniciar uma morte por citotoxicidade mediada por células (ADCC) dependente de anticorpo da célula à qual o anticorpo ou polipeptídeo se liga especificamente.
16. Kit caracterizado pelo fato de que compreende uma composição farmacêutica ou uma formulação conforme definida na reivindicação 15.