ES2808684T3 - Composiciones que incluyen anticuerpos anti-ceacam1 y anti-pd para terapia de cáncer - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal contra CEACAM1 humano; y una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal para PD-1 humano para uso en el tratamiento del cáncer mediante administración secuencial separada, uno tras otro; en donde dicho anticuerpo monoclonal es capaz de inhibir o bloquear la interacción entre la PD-1 humana y sus ligandos; y en donde dicho anticuerpo monoclonal para CEACAM1 humano tiene: una CDR1 de cadena pesada que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 1, una CDR2 de cadena pesada que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 2, una CDR3 de cadena pesada que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 3, una CDR1 de cadena ligera que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 4, una CDR2 de cadena ligera que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 5 y una CDR3 de cadena ligera que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 6.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones que incluyen anticuerpos anti-CEACAMI y anti-PD para terapia de cáncer

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se refiere a la inmunoterapia del cáncer, en particular a combinaciones de anticuerpos de ligando anti-CEACAM1 y anti-PD-1 para su uso en el tratamiento de cáncer.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] La molécula 1 de adhesión celular relacionada con antígeno carcinoembrionario de proteína transmembrana (CEACAM1, también conocida como la glicoproteína biliar (BGP), CD66a y C-CAM1), es un miembro de la familia de antígeno carcinoembrionario (CEA) que también pertenece a la superfamilia de inmunoglobulinas. A la CEACAM1 humano se le ha asignado el número de acceso SwissProt P13688. CEACAM1 interactúa consigo mismo y con otras proteínas CEACAM conocidas, incluyendo CD66e (CEACAM6) y proteínas CD66e (CEACAM5, CEA). Se expresa en un amplio espectro de células, que van desde las células epiteliales hasta las de origen hemopoyético (p. ej., células inmunes).

[0003] Muchas funciones diferentes se han atribuido a la proteína CEACAM1. Se demostró que la proteína CEACAM1 se sobreexpresa en algunos carcinomas de colon, próstata, así como en otros tipos de cáncer, como el melanoma. Datos adicionales apoyan la participación central de CEACAM1 en la angiogénesis y metástasis. CEACAM1 también juega un papel en la modulación de las respuestas inmunes innatas y adaptativas. Por ejemplo, se demostró que CEACAM1 es un receptor inhibidor para las células T activadas contenidas dentro del epitelio intestinal humano (WO 99/52552 y Morales et al. J. Immunol. 1999, 163, 1363-1370). Informes adicionales han indicado que el compromiso de CEACAM1 por reticulación del receptor de células T con anticuerpos monoclonales (mAbs) o por proteínas Neisseria gonorrea Opa inhibe la activación y proliferación de células T. Ya se conocen varios anticuerpos monoclonales contra la proteína CEACAM1, como 26H7, 5F4, TEC-11, 12-140-4, 4/3/17, COL-4, F36-54, 34B1, YG-C28F2, D14HD11, b18.7.7, D11-AD11, HEA81, B1.1, CLB-gran-10, F34-187, T84.1, B6.2, B1.13, YG-C94G7, 12-140­ 5, TET-2 y scFv-DIATHIS1 (Watt et al., Blood, 2001, Vol. 98, páginas 1469-1479). El documento WO 2010/12557 describe el anticuerpo monoclonal murino contra CEACAM1 humano. El documento WO 2013/054331 describe el anticuerpo monoclonal quimérico contra CEACAM1 CM10 humano.

[0004] Proteína 1 de muerte celular programada (PD-1) es una proteína transmembrana de tipo I que pertenece a la familia CD28/CTLA-4 de inmuno-receptores que median las señales para la regulación de las respuestas inmunes. Al PD-1 humano se le ha asignado el número de acceso SwissProt Q15116. Los miembros de la familia CD28/CTLA-4 regulan al alza (CD28 e ICOS) o regulan a la baja la activación de células T (CTLA-4 y PD-1). PD-1 se expresa en células T activadas, células B, células mieloides y en un subconjunto de timocitos. Ya se conocen varios anticuerpos monoclonales contra la proteína PD-1, como MK-3475 (mAb IgG4 humanizado), AMP514, BMS-936558 (mAb IgG4 completamente humano) y pidilizumab también conocido como CT-011 (mAb IgG1 humanizado) (Topalian et al., Curr. Opin. Immunol., 2012, Vol. 24 (2), páginas 207-212).

[0005] Ligando de muerte celular programada 1 (PD-L1) también conocido como grupo de diferenciación 274 (CD274) o B7 homólogo 1 (B7-H1) es una proteína que en los humanos está codificada por el gen CD274. PD-L1 es una proteína transmembrana tipo 1 de 40 kDa que se ha especulado que juega un papel importante en la supresión del sistema inmune durante eventos particulares como el embarazo, aloinjertos de tejidos y otros estados de enfermedad como la hepatitis. Normalmente, el sistema inmunitario reacciona a los antígenos extraños donde hay una acumulación en los ganglios linfáticos o el bazo que desencadena una proliferación de células T CD8+ específicas de antígeno. La formación del complejo ligando PD-1/PD-L1 transmite una señal inhibitoria que reduce la proliferación de estas células T CD8+ en los ganglios linfáticos y complementaria a que PD-1 también puede controlar la acumulación de células T específicas de antígeno extraño en los ganglios linfáticos a través de la apoptosis, que está mediada por una menor regulación del gen Bcl-2 (Chemnitz JM et al., 2004, Journal of Immunology, 173 (2): 945-54). El compromiso de PD-L1 con su receptor PD-1 que se encuentra en las células T activadas, las células B y las células mieloides entrega una señal que inhibe la activación mediada por TCR de la producción de IL-2 y la proliferación de células T. El ligando 2 de muerte celular programada 1 (también conocido como PD-L2, B7-DC) es una proteína que en humanos está codificada por el gen PDCD1LG2. PDCD1LG2 también ha sido designado como CD273 (grupo de diferenciación 273).

[0006] PD-1 y sus ligandos, PD-L1 y PD-L2, emiten señales inhibidoras que regulan el equilibrio entre las células T de activación, la tolerancia y la inmunopatología. Las respuestas inmunes a antígenos extraños y autoantígenos requieren respuestas específicas y equilibradas para eliminar patógenos y tumores y, sin embargo, mantener la tolerancia. A PD-L1 y PD-L2 humanos se les han asignado los números de acceso SwissProt Q9NZQ7 y Q9BQ51, respectivamente. La inducción y el mantenimiento de la tolerancia de las células T requieren PD-1, y su ligando PD-L1 en células no hematopoyéticas puede limitar las respuestas de las células T efectoras y proteger los tejidos del daño de los tejidos inmunomediados. La vía PD-1:PD-L también ha sido usurpada por microorganismos y tumores para atenuar la inmunidad antimicrobiana o tumoral y facilitar la infección crónica y la supervivencia del tumor. Varios anticuerpos monoclonales contra la proteína p D-L1 ya son conocidos, como Me D i-4736, BMS-936559, MSB0010718C y MPDL3280A (Lu et al., J. Oncol. Pharm. Pract., 2014). También se conocen otros anticuerpos monoclonales contra la proteína PD-L2 , como los descritos en las publicaciones de solicitud PCT nos WO/2010/027827, WO/2010/036959 y WO/2011/066342. El documento WO/2014/059251 se refiere a composiciones y métodos para mejorar la respuesta inmune y/o reducir la tolerancia de células T en sujetos mediante la administración de inhibidores de dos o más de CEACAM1, PD-1 y/o péptido asociado de latencia (LAP).

[0007] La inmunoterapia del cáncer es el uso del sistema inmunológico para tratar el cáncer. Hay tres grupos principales de inmunoterapia: terapias basadas en células, terapias con anticuerpos y terapias con citoquinas. Todos explotan el hecho de que las células cancerosas a menudo tienen diferentes moléculas en su superficie que pueden ser detectadas por el sistema inmune. Estas moléculas se conocen como antígenos cancerosos. La inmunoterapia se usa para provocar que el sistema inmunitario ataque las células tumorales usando estos antígenos cancerosos como dianas.

[0008] Las terapias de anticuerpos son actualmente la forma más exitosa de la inmunoterapia, con muchos tratamientos aprobados para una amplia gama de tipos de cáncer. Los anticuerpos son proteínas producidas por el sistema inmune que se unen a un antígeno diana en la superficie de una célula. En fisiología normal, el sistema inmunitario los utiliza para combatir los patógenos. Cada anticuerpo es específico para una o pocas proteínas muy similares y las que se unen a los antígenos del cáncer se usan en el tratamiento del cáncer. Una vez unidos a un antígeno de cáncer, los anticuerpos pueden inducir citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, activar el sistema del complemento, evitar que un receptor interactúe con su ligando o administrar una carga de quimioterapia o radiación, todo lo cual puede conducir a la muerte celular. Actualmente, la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) de EE.UU. ha aprobado anticuerpos para el tratamiento del cáncer: Rituximab (1997), Trastuzumab (1998), Gemtuzumab ozogamicin (2000), Alemtuzumab (2001), Ibritumomab tiuxetan (2002), Tositumomab (2003), Cetuximab (2004), Bevacizumab (2004), Panitumumab (2006), Ofatumumab (2009), Ipilimumab (2011) y Brentuximab vedotin (2011).

[0009] Aunque originalmente aprobados como monoterapias anti-cáncer, varios anticuerpos fueron aprobados para uso en combinación con otras terapias contra el cáncer, como la quimioterapia. Por ejemplo, la FDA otorgó la aprobación a Rituximab (Rituxan, Genentech, Inc.) en combinación con fludarabina y ciclofosfamida para el tratamiento de pacientes con leucemia linfocítica crónica (CLL) previamente no tratados y tratados previamente. Recientemente, la FDA aprobó Bevacizumab (Avastin, Genentech, Inc.) en combinación con paclitaxel y cisplatino o topotecán para el tratamiento del cáncer cervical persistente, recurrente o metastásico.

[0010] Sapoznik et al dan a conocer en Clinical and Developmental Immunology (2012), vol. 2012, 1-9. terapias antimelanoma usando anticuerpos anti CEACAM1 y anti PD-1.

[0011] WO 2013/054331 se refiere a anticuerpos que reconocen un epítopo específico de la proteína CEACAM1 y opcionalmente también se une a otros subtipos de la familia de proteínas CEACAM.

[0012] Sigue existiendo una necesidad insatisfecha de terapias basadas en anticuerpos combinatorios mejorados, que emplean una diversidad de anticuerpos dirigidos a mecanismos distintos o paralelos de la progresión del cáncer.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

[0013] La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal a CEACAM1 humano; y una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal para PD-1 humano para uso en el tratamiento del cáncer mediante administración secuencial separada, es decir, uno después del otro; en donde dicho anticuerpo monoclonal para PD-1 humano es capaz de inhibir o bloquear la interacción entre PD-1 humano y sus ligandos; y en donde dicho anticuerpo monoclonal para CEACAM1 humano tiene: una CDR1 de cadena pesada que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 1, una CDR2 de cadena pesada que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 2, una CDR3 de cadena pesada que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 3, una CDR1 de cadena ligera que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 4, una cadena ligera CDR2 que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 5, y una CDR3 de cadena ligera que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 6.

[0014] En una realización, el anticuerpo monoclonal a CEACAM1 humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo es capaz de unirse con una afinidad de al menos aproximadamente 10'8M a una proteína CEACAM1 humano.. En otra realización, el anticuerpo monoclonal para CEACAM1 humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo es capaz de unirse con una afinidad de al menos aproximadamente 5x10'7M a al menos una de una proteína CEACAM3 humana y CEACAM5 humana. En otra realización, el anticuerpo monoclonal para CEACAM1 humano es CM-24.

[0015] Otros aspectos de la invención se definen en las reivindicaciones adjuntas.

[0016] Más allá de la invención, la descripción proporciona un kit, que comprende las dos composiciones farmacéuticas como se define en las reivindicaciones.

[0017] Por otra parte se debe entender que la invención se define por las reivindicaciones y no está limitada a los ejemplos. Por lo tanto, los anticuerpos mencionados en las reivindicaciones y las composiciones relativas pueden modificarse. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal que reconoce CEACAM1 humano puede comprender: una secuencia marco seleccionada del grupo que consiste en: IgG2a de ratón, IgG2b de ratón, IgG3 de ratón, IgG1 humana, IgG2 humana, IgG3 humana.

[0018] También puede comprender regiones constantes derivadas de humanos seleccionadas del grupo que consiste en: IgG1 humana, IgG2 humana e IgG3Te humana o anticuerpo monoclonal humano o humanizado que reconoce CEACAM1 humano puede comprender una subclase de región constante del subtipo de IgG1 humana.

[0019] En una realización, el anticuerpo monoclonal a PD-1 humano se selecciona del grupo que consiste en MK-3475, AMP514, BMS-936558, CT-011, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y cualquier combinación de los mismos.

[0020] El anticuerpo monoclonal a CEACAM1 humano y el anticuerpo monoclonal a PD-1 humano puede ser un anticuerpo monoclonal humano o humanizado. El anticuerpo humano puede ser un anticuerpo humano aislado, es decir, aislado de un donante humano. El anticuerpo humano puede ser un anticuerpo humano aislado de una línea celular de hibridoma. El anticuerpo humano puede referirse a un anticuerpo humano recombinante, es decir, producido por tecnología de ADN recombinante.

[0021] En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente comprenden adicionalmente células de linfocitos.

[0022] Las células de linfocitos pueden expresar CEACAM1, PD-1, o ambas, y pueden ser pre-incubadas con el anticuerpo anti-CEACAM1, respectivamente, el anticuerpo anti-PDL en las composiciones respectivas antes de la administración respectiva.

[0023] Las células de linfocitos se pueden seleccionar del grupo que consiste de células infiltrantes de tumor de linfocitos (TIL), células asesinas activadas por linfoquinas (LAK), células asesinas inducidas por citoquinas (CIK), células T, células B, células NK, y cualquier combinación de las mismas. Las células de linfocitos pueden seleccionarse del grupo que consiste en células de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) y células asesinas activadas por linfocinas (LAK). Las células de linfocitos pueden ser células de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL). Las células linfocitarias pueden ser células asesinas activadas por linfocinas (LAK).

[0024] Las células de linfocitos se pueden activar. Las células linfocitarias pueden ser citotóxicas para una célula cancerosa.

[0025] La célula de cáncer puede expresar CEACAM1, PD-L1, PD-L2, o cualquier combinación de los mismos. La célula cancerosa puede expresar CEACAM1, PD-L1 o ambos. La célula de cáncer puede expresar CEACAM1, PD-L2, o ambos.

[0026] En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona de entre el grupo que consiste en cánceres celulares de melanoma, linfoma, pulmón, tiroides, mama, colon, próstata, hepáticos, de vejiga, renales, de cáncer de cuello uterino, pancreáticos, de leucemia, mieloide, ovario, útero, sarcoma, biliar y endometriales. El cáncer se selecciona del grupo que consiste en cánceres de melanoma y linfoma. Los usos médicos de la invención implican la administración secuencial de las dos composiciones, una tras otra. En una realización, el anticuerpo monoclonal a PD-1 humano se administra antes del anticuerpo monoclonal a CEACAM1 humano. En otra realización, el anticuerpo monoclonal a PD-1 humano se administra después del anticuerpo monoclonal a CEACAM1 humano.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0027]

Figura 1A-B. Las células de melanoma humano expresan CEACAM1 y PD-L1 tras la activación de IFN-y. Las células MALME 3M se incubaron con IFN-y durante 24 horas, y se analizaron mediante FACS con un anticuerpo anti-PD-Ll conjugado con PE (histograma vacío) o un anticuerpo de control de isotipo compatible (histogramas completos) (A), o con un anticuerpo monoclonal conjugado a PE con CEACAM1 humano (histograma vacío) o anticuerpo de control de isotipo compatible (histogramas completos) (B).

Figura 2A-B. Las células TIL humanas expresan PD-1 y CEACAM1. Las células TIL se tiñeron con un anticuerpo monoclonal para PD-1 humano y se analizaron mediante FACS. Se presenta la expresión de PD-1 (histograma vacío) en comparación con un control de isotipo coincidente (histograma completo) (A), o con un anticuerpo monoclonal conjugado con PE para CEACAM1 humano (histograma vacío) o un anticuerpo de control de isotipo compatible (histogramas completos) (B).

Figura 3. Efectos sinérgicos de los anticuerpos anti-CEACAM1 y anti-PD-1 sobre la citotoxicidad de las células TIL humanas contra las células de melanoma humano. Se cultivaron células de melanoma humano en presencia de IFN-y para inducir la expresión de PD-1. Las células TIL se incubaron con diversas concentraciones de un anticuerpo monoclonal para CEACAM1 humano (línea negra discontinua, marcador de esfera), un anticuerpo monoclonal para PD-1 humano (línea gris continua, marcador rectangular) o una combinación de ambos anticuerpos (línea negra continua, marcador de triángulo). Las células de melanoma tratadas con IFN-y se agregaron para una incubación durante la noche. Los resultados representan un promedio de % de citotoxicidad ±DE según lo determinado por el ensayo clásico de liberación de LDH de pocillos por triplicado por tratamiento. * P<0,05 prueba T emparejada en comparación con el anticuerpo monoclonal para CEACAM1 humano solamente.

Figura 4A-B. Efectos sinérgicos de los anticuerpos anti-CEACAM1 y anti-PD-1 sobre los niveles de Granzima B y la citotoxicidad de las células TIL humanas contra las células de melanoma humano cuando se agregan anticuerpos anti-PD-1 antes de la adición de anticuerpos anti-CEACAM1. Se cultivaron células de melanoma humano en presencia de IFN-y para inducir la expresión de PD-L1. Las células TIL humanas se incubaron con medio solo (negro), anticuerpo IgG no específico (blanco), diversas concentraciones de un anticuerpo monoclonal para CEACAM1 humano (líneas verticales), un anticuerpo monoclonal para PD-1 humano (líneas horizontales) o una combinación de ambos anticuerpos (puntos). El anticuerpo monoclonal para PD-1 humano se añadió primero durante 30 minutos a 37°C, seguido de la adición del anticuerpo monoclonal a CEACAM1 humano. Se agregaron células MALME 3M tratadas con IFN-Y para la incubación durante la noche. (A) Los resultados representan un promedio de % de citotoxicidad ±DE según lo determinado por el ensayo clásico de liberación de LDH de pocillos por triplicado por tratamiento. * P <0,05 prueba T emparejada en comparación con a-PD-1 solamente. (B) Los resultados representan los niveles de Granzima B ±De según lo determinado por el kit comercial ELISA Granzima B de pocillos por triplicado por tratamiento.

Figura 5A-B. Efectos sinérgicos de los anticuerpos anti-CEACAM1 y anti-PD-L1 sobre los niveles de Granzima B y la citotoxicidad de las células TIL humanas contra las células de melanoma humano cuando se agregan anticuerpos anti-PD-L1 antes de la adición de anticuerpos anti-CEACAM1. Se cultivaron células de melanoma humano en presencia de IFN-y para inducir la expresión de PD-L1. Las células TIL humanas se incubaron con medio solo (negro), anticuerpo IgG no específico (blanco), varias concentraciones de un anticuerpo monoclonal para PD-L1 humano (líneas horizontales), un anticuerpo monoclonal para CEACAM1 humano (líneas verticales) o una combinación de ambos anticuerpos (puntos). El anticuerpo anti-PD-Ll se añadió primero durante 30 minutos a 37°C, seguido de la adición del anticuerpo monoclonal al CEACAM1 humano. Se agregaron células MALME 3M tratadas con IFN-y para la incubación durante la noche antes de la evaluación de citotoxicidad (A). Los resultados representan un promedio de % de citotoxicidad ±DE según lo determinado por el ensayo clásico de liberación de LDH de pocillos por triplicado por tratamiento. (B) Los resultados representan los niveles de Granzima B ±DE según lo determinado por el kit comercial ELISA Granzima B de pocillos por triplicado por tratamiento. * P<0,05 prueba T emparejada en comparación con a-PD-L1 solamente.

Figura 6. Efectos sinérgicos de los anticuerpos anti-CEACAM1 y anti-PD-1 sobre la citotoxicidad de las células LAK humanas contra las células de melanoma humano cuando se agregan anticuerpos anti-PD-1 antes de la adición de anticuerpos anti-CEACAM1. Se cultivaron células de melanoma humano en presencia de IFN-y para inducir la expresión de PD-L1. Las células LAK humanas generadas por la activación de PBMC de un donante humano sano con IL-2 se incubaron con medio solo (negro), anticuerpo IgG no específico (blanco), varias concentraciones de un anticuerpo monoclonal contra CEACAM1 humano (líneas verticales), un anticuerpo monoclonal para PD-1 humano (líneas horizontales) o una combinación de ambos anticuerpos (puntos). El anticuerpo monoclonal para PD-1 humano se añadió primero durante 30 minutos a 37°C, seguido de la adición del anticuerpo monoclonal a CEACAM1 humano. Se añadieron células SKMEL28 tratadas con IFN-y durante 24 horas de incubación. Los resultados representan un promedio de % de citotoxicidad ±DE según lo determinado por el ensayo clásico de liberación de LDH de pocillos por triplicado por tratamiento. * P<0,05 prueba T emparejada en comparación con a-PD-1 solamente. El índice de combinación se calculó como se describió anteriormente.

Figura 7A-B. El tratamiento con anticuerpos anti-CEACAM1 aumenta la expresión de PD-L1 en las células cancerosas diana. Las células NK (n K92MI) se incubaron con o sin un anticuerpo monoclonal contra CEACAM1 humano (CM-24) (10 pg/ml), seguido de la adición de células de melanoma humano (SKMEL28). Las células se incubaron durante 24, 48 y 72 horas y los niveles de PD-L1 se midieron en cada punto de tiempo mediante análisis FACS. A. Relación media de anti-PD-Ll en comparación con un control de isotipo apropiado para los tratamientos indicados en los diferentes puntos de tiempo. B. Análisis representativo de FACS de los niveles de expresión de PD-L1 después de 48 horas.

Figura 8. Efectos sinérgicos de los anticuerpos anti-CEACAM1 y anti-PD-1 sobre la progresión tumoral en ratones inmunocompetentes. Las células de linfoma murino se implantaron por vía subcutánea en el abdomen de ratones BALB/C (Día 1). En los días 10, 15 y 20, los ratones se administraron por vía intravenosa con PBS (línea negra discontinua, círculos vacíos), un anticuerpo anti-murino CEACAM1 (línea gris continua, rectángulos grises), un anticuerpo anti-murino PD-1 (línea gris sólida, triángulos grises) o una combinación de ambos anticuerpos (línea negra sólida, esferas negras). El experimento finalizó el día 22.

Figura 9A-D. Curvas de progresión tumoral individuales. Curvas de progresión tumoral individuales para los ratones tratados con PBS (A), un anticuerpo anti-murino CEACAM1 (B), un anticuerpo anti-murino PD-1 (C) o una combinación de ambos anticuerpos (D).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0028] La presente invención se basa en el sorprendente hallazgo de que las combinaciones de anticuerpos anti-CEACAM1 y anticuerpos dirigidos para interrumpir la unión de PD-1 a sus ligandos naturales, PD-L1 y PD-L2, significativamente elevaron la citotoxicidad de las células de linfocitos, como las células de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) y las células asesinas activadas por linfocinas (LAK), hacia diferentes tipos de cáncer. Se descubrió sorprendentemente que la preincubación gradual de las células de linfocitos con estos anticuerpos, en lugar de la incubación concurrente, maximiza la citotoxicidad de los linfocitos. También se descubrió que la expresión de los ligandos CEACAM1 y PD en las células cancerosas está interrelacionada, ya que la unión de los anticuerpos anti-CEACAM1 a las células cancerosas aumenta la expresión de PD-L1. Además, se encontró que tales combinaciones de anticuerpos atenúan significativamente la progresión de tumores establecidos en un modelo murino inmunocompetente, suponiendo explotar el entorno linfocitario natural de los ratones.

[0029] Sin desear quedar ligado a ninguna teoría o mecanismo, se hipotiza, de acuerdo con los presentes hallazgos que los linfocitos que expresan CEACAM1 y/o PD-1 pueden suprimirse sustancialmente mediante interacciones con sus correspondientes ligandos, CEACAM1 y/o PD-L1 y/o PD-L2, que se presentan, por ejemplo, por células cancerosas. Por otro lado, cuando estas interacciones supresoras se bloquean, estos linfocitos pueden volverse citotóxicos hacia estas células cancerosas tras la activación y provocar la muerte de las células malignas.

[0030] En el presente documento se proporcionan composiciones farmacéuticas dirigidas a obstruir dos importantes interacciones homotípicas inmunosupresoras, CEACAM1linfocitos/CEACAM1celulares cancer°sas, y PD-1linf°cit°/PD-ligandocelulares cancer°sas, y para aumentar el nivel de las células citotóxicas contra el cáncer dentro del cuerpo de un paciente diagnosticado con cáncer. Sin limitarse a ninguna teoría o mecanismo, se presume que las composiciones divulgadas generan una combinación de "dos golpes", en la que se eleva el nivel de linfocitos citotóxicos anticancerígenos dentro del paciente con cáncer, mientras que su citotoxicidad se mantiene por interacción protectora con anticuerpos anti-CEACAM1 y/o anticuerpos anti-PD-1/PD-L1/PD-L2, unidos a las moléculas CEACAM1 y/o PD-1 presentadas por los propios linfocitos, las moléculas CEACAM1/PD-L1/PD-L2 presentadas por las células de cáncer, o ambas.

[0031] La presente invención proporciona por lo tanto, en un aspecto, una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal a molécula humana adhesión celular relacionada a antígeno carcinoembrionario 1 (CEACAM1), y una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal para la proteína de la muerte celular programada humana 1 (PD-1), para su uso en el tratamiento del cáncer mediante administración secuencial separada, una tras otra, en donde el anticuerpo contra PD-1 es capaz de inhibir o bloquear la interacción entre PD-1 humano y sus ligandos y en donde dicho anticuerpo monoclonal contra el CEACAM1 humano tiene: una CDR1 de cadena pesada que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 1, una CDR2 de cadena pesada que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 2, una CDR3 de cadena pesada que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 3, una CDR1 de cadena ligera que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 4, una CDR2 de cadena ligera que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 5, y una CDR3 de cadena ligera que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 6.

[0032] El término "administración por separado" como se usa aquí, se refiere a diferentes agentes terapéuticos tales como anticuerpos estando comprendidos en composiciones farmacéuticas separadas. Las dos composiciones farmacéuticas se administran a los pacientes de cáncer secuencialmente uno después del otro. Por lo tanto, por la frase "un anticuerpo monoclonal a CEACAM1 humano, y un anticuerpo monoclonal a PD-1 humano, para uso en el tratamiento del cáncer mediante administración separada" se entiende que el anticuerpo anti-CEACAM1 está comprendido en una composición que es diferente de la composición que comprende el anticuerpo anti-PD-1.

[0033] El término "CEACAM1" se usa para referirse al producto de proteína del gen CEACAM1, por ejemplo, NP_001020083.1, NP_001703.2. En humanos, hasta ahora se han detectado 11 variantes diferentes de empalme de CEACAM1. Las isoformas individuales de CEACAM1 difieren con respecto al número de dominios extracelulares de tipo inmunoglobulina (por ejemplo, CEACAM1 con cuatro dominios extracelulares de tipo inmunoglobulina se conoce como CEACAM1-4), anclaje de membrana y/o la longitud de su cola citoplasmática (por ejemplo, CEACAM1-4 con una cola citoplasmática larga se conoce como CEACAM1-4L y CEACAM1-4 con una cola citoplasmática corta se conoce como CEACAM1-4S). El dominio N-terminal de CEACAM1 comienza inmediatamente después del péptido señal y su estructura se considera de tipo IgV. Por ejemplo, en la anotación P13688 de CEACAM1, el dominio de tipo IgV N-terminal está compuesto por 108 aminoácidos, desde el aminoácido 35 al 142. Este dominio se identificó como responsable de la actividad de unión homofílica (Watt et al., 2001, Blood. 98, 1469-79). Todas las variantes, incluidas estas variantes de empalme, se incluyen dentro del término "CEACAM1".

[0034] El término "composición farmacéutica", como se usa aquí se refiere a una composición que comprende al menos un ingrediente biológicamente activo. Los anticuerpos, sus fragmentos de unión a antígeno y las células de linfocitos son ejemplos no limitantes de ingredientes biológicamente activos.

[0035] El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio e incluye anticuerpos monoclonales (incluyendo longitud completa o anticuerpos monoclonales intactos), anticuerpos policlonales, anticuerpos multivalentes, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), agentes inmunomoduladores, y fragmentos de anticuerpos de tamaño suficiente para retener y exhibir la actividad biológica deseada del anticuerpo completo.

[0036] El término "agente inmunomodulador" o "proteína inmuno-moduladora" o "fragmento de anticuerpo" como se usa de manera intercambiable incluye proteínas sintéticas o modificadas por ingeniería genética que actúan como un anticuerpo uniéndose a un antígeno específico para formar un complejo. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos aislados que consisten en las regiones variables, tales como los fragmentos "Fv" que consisten en las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras y las moléculas de polipéptidos de cadena sencilla recombinantes en las que las regiones variables ligeras y pesadas están conectadas por un péptido enlazador ("proteínas scFv"). Los fragmentos pueden construirse de diferentes maneras para producir formas de unión multivalentes y/o multiespecíficas. El anticuerpo o los anticuerpos descritos en el presente documento incluyen anticuerpos intactos, tales como anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales (mAbs), así como fragmentos proteolíticos de los mismos tales como los fragmentos Fc, Fab o F(ab')2. Además se describen anticuerpos quiméricos; anticuerpos humanos y humanizados; anticuerpos recombinantes y modificados genéticamente, y fragmentos de los mismos.

[0037] Un "anticuerpo monoclonal a CEACAM1 humano", "un anticuerpo que reconoce CEACAM1", "un anticuerpo contra CEACAM1", o "un anticuerpo a CEACAM1" es un anticuerpo que se une a la proteína CEACAM1 con la suficiente afinidad y especificidad. Típicamente, un anticuerpo monoclonal contra CEACAM1 humano es capaz de unirse a CEACAM1 con una afinidad mínima de aproximadamente 10-8 o 10-9 M. Algunos de los anticuerpos monoclonales anti-CEACAM1 son capaces de unirse a CEACAM3, 5 y/u 8 con una mínima afinidad de aproximadamente 5x10-7 M. En ciertos casos, el anticuerpo monoclonal para CEACAM1 humano es capaz de prevenir, interferir o disociar una interacción entre CEACAM1 presentada por linfocitos y CEACAM1 presentada por células cancerosas.

[0038] Un "anticuerpo neutralizante", como se usa aquí se refiere a una molécula que tiene un sitio de unión al antígeno a un receptor específico o diana de ligando capaz de reducir o inhibir (bloquear) la actividad o la señalización a través de un receptor, como se determina por ensayos in vivo o in vitro, según la especificación.

[0039] El término "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza aquí se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos y se dirigen contra un solo antígeno. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante en el antígeno. El modificador "monoclonal" no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo por ningún método en particular. El Abs monoclonal puede obtenerse por métodos conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se usarán en el presente documento se pueden preparar mediante el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature 1975, 256, 495, o se pueden preparar mediante métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpos de fago usando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature 1991, 352, 624-628 o Marks et al., J. Mol. Biol., 1991,222: 581-597, por ejemplo.

[0040] El término "pluralidad" tal como se utiliza aquí, se refiere a dos o más de las dianas especificadas.

[0041] Los mAbs pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA. Un hibridoma que produce un mAb puede cultivarse in vitro o in vivo. Se pueden obtener altos títulos de mAbs en la producción in vivo donde las células de los hibridomas individuales se inyectan intraperitonealmente en ratones BALB/c cebados con prístina para producir fluido ascítico que contiene altas concentraciones de los mAbs deseados. Los Abs monoclonales del isotipo IgM o IgG pueden purificarse a partir de tales fluidos ascíticos o de sobrenadantes de cultivo, utilizando métodos de cromatografía en columna bien conocidos por los expertos en la materia.

[0042] El término "determinante antigénico" o "epítopo", como se usa aquí se refiere a la región de una molécula de antígeno que específicamente reacciona con anticuerpo particular. Un "antígeno" es una molécula o una porción de una molécula capaz de provocar la formación de anticuerpos y estar unida por un anticuerpo. Un antígeno puede tener uno o más de un epítopo. Un antígeno según la presente invención es una proteína CEACAM1 o un fragmento de la misma.

[0043] Los anticuerpos, o inmunoglobulinas, comprenden dos cadenas pesadas unidas entre sí por enlaces disulfuro y dos cadenas ligeras, estando cada cadena ligera ligada a una cadena pesada respectiva por enlaces disulfuro en una configuración en forma de "Y".La digestión proteolítica de un anticuerpo produce dominios Fv (Fragmento variable) y Fc (fragmento cristalino). Los dominios de unión a antígeno, Fab, incluyen regiones donde varía la secuencia de polipéptidos. El término F(ab')2 representa dos brazos Fab' unidos entre sí por enlaces disulfuro. El eje central del anticuerpo se denomina fragmento Fc. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido de varios dominios constantes (CH). Cada cadena ligera tiene un dominio variable (VL) en un extremo y un dominio constante (CL) en el otro extremo, el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada y el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada (CHI). Los dominios variables de cada par de cadenas ligeras y pesadas forman el sitio de unión al antígeno. Los dominios en las cadenas ligera y pesada tienen la misma estructura general y cada dominio comprende cuatro regiones marco, cuyas secuencias están relativamente conservadas, unidas por tres dominios hipervariables conocidos como regiones determinantes de complementariedad (CDR1-3). Estos dominios aportan especificidad y afinidad del sitio de unión al antígeno. El isotipo de la cadena pesada (gamma, alfa, delta, épsilon o mu) determina la clase de inmunoglobulina (IgG, IgA, IgD, IgE o IgM, respectivamente). La cadena ligera es uno de los dos isotipos (kappa, k o lambda, A) que se encuentran en todas las clases de anticuerpos.

[0044] Los términos "un anticuerpo monoclonal a CEACAM1 humano", "anticuerpo monoclonal a PD-1 humano", "anticuerpo anti-PD-Ll" y "anticuerpo anti-PD-L2" como se usa en este documento se refieren a moléculas de inmunoglobulina completas, por ejemplo, IgM, IgD, IgEs, IgAs o IgG, dominios de unión a antígeno de tales moléculas de inmunoglobulina, por ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab)2, fragmentos F(ab)2 quiméricos o fragmentos Fab' quiméricos, fragmentos Fab quiméricos o regiones VH o CDR aisladas, e isoformas conocidas y modificaciones de inmunoglobulinas, por ejemplo, anticuerpos monocatenarios o fragmentos Fv monocatenarios (scAB/scFv) o construcciones de anticuerpos biespecíficos, capaces de unirse a sus dianas indicadas. Los términos "anticuerpo anti-humano-CEACAM1", "anticuerpo anti-humano-PD-1", "anticuerpo monoclonal para PD-L1 humano" y "anticuerpo monoclonal para PDL2 humano" como se usan en este documento se refieren a anticuerpos capaces de unirse a sus objetivos indicados, en donde estos objetivos son de origen humano.

[0045] Los términos "fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo" y "fragmento de unión a antígeno" utilizados intercambiablemente en el presente documento, se refieren a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retiene la capacidad de unirse específicamente al antígeno descrito. Por ejemplo, el fragmento de unión a antígeno puede incluir, entre otros, fragmento Fab, fragmento F(ab')2, fragmento scFv, fragmento dAb, fragmento que contiene CDR o CDR aislado. Por lo tanto, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal contra CEACAM1 humano puede ser, por ejemplo, un fragmento Fab de un anticuerpo monoclonal contra CEACAM1 humano, o cualquier molécula que imite las secuencias y la estructura de dicho fragmento Fab, sin obtenerlo directamente de un anticuerpo monoclonal contra CEACAM1 humano, por ejemplo, por escisión química o enzimática.

[0046] "Fragmentos de anticuerpo" comprenden sólo una porción de un anticuerpo intacto, generalmente incluyendo un sitio de unión a antígeno del anticuerpo intacto y reteniendo de este modo la capacidad de unir antígeno. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos abarcados por la presente definición incluyen: (i) el fragmento Fab, que tiene dominios VL, CL, VH y CH1; (ii) el fragmento Fab', que es un fragmento Fab que tiene uno o más residuos de cisteína en el extremo C del dominio CH1; (iii) el fragmento Fd que tiene dominios VH y CH1; (iv) el fragmento Fd' que tiene dominios VH y CHI y uno o más residuos de cisteína en el extremo C del dominio CH1; (v) el fragmento Fv que tiene los dominios Vl y VH de un solo brazo de un anticuerpo; (vi) el fragmento dAb (Ward et al., Nature 1989, 341, 544­ 546) que consiste en un dominio VH; (vii) regiones CDR aisladas; (viii) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab' unidos por un puente disulfuro en la región de la bisagra; (ix) moléculas de anticuerpos de cadena sencilla (por ejemplo, cadena simple Fv; scFv) (Bird et al., Science 1988, 242, 423-426; y Huston et al., PNAS (EE.UU.) 1988, 85,5879-5883); (x) "diacuerpos" con dos sitios de unión a antígeno, que comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptidos (véase, por ejemplo, EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 1993, 90, 6444-6448); (xi) "anticuerpos lineales" que comprenden un par de segmentos Fd en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que, junto con polipéptidos de cadena ligera complementarios, forman un par de regiones de unión a antígenos (Zapata et al. Protein Eng., 1995, 8, 1057-1062; y la Patente de Estados Unidos N° 5.641.870).

[0047] Por el término "fragmento variable de cadena única (scFv)" se quiere decir una fusión de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, unidas junto con un enlazador corto (generalmente serina, glicina). Los anticuerpos de cadena sencilla pueden ser polipéptidos compuestos de cadena sencilla que tienen capacidades de unión a antígeno y que comprenden secuencias de aminoácidos homólogas o análogas a las regiones variables de una cadena ligera y pesada de inmunoglobulina (VH-VL unida o Fv de cadena sencilla (scFv)). Tanto VH como VL pueden copiar secuencias de anticuerpos monoclonales naturales o una o ambas cadenas pueden comprender una construcción CDR-FR del tipo descrito en la patente de los Estados Unidos 5.091.513. Los polipéptidos separados, análogos a las regiones variables de las cadenas ligera y pesada, se mantienen unidos por un enlazador de polipéptido. Los métodos de producción de tales anticuerpos de cadena única, particularmente cuando se conoce el ADN que codifica las estructuras de polipéptidos de las cadenas VH y VL, se pueden realizar de acuerdo con los métodos descritos, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos 4.946.778, 5.091.513 y 5.096.815.

[0048] Los anticuerpos de cadena única pueden ser polipéptidos compuestos de cadena única que tienen capacidades de unión a antígeno y que comprenden secuencias de aminoácido homóloga o análoga a las regiones variables de una inmunoglobulina ligera y la cadena pesada, es decir, V^h-V^l enlazado o Fv de cadena sencilla (scFv).

[0049] El término "molécula que tiene la parte de unión a antígeno de un anticuerpo" tal como se utiliza aquí, se pretende incluir no sólo las moléculas de inmunoglobulina intactas de cualquier isotipo y generadas por cualquier línea celular animal o microorganismo, sino también la fracción reactiva de unión al antígeno del mismo, incluidos, entre otros, el fragmento Fab, el fragmento Fab', el fragmento F(ab')2, la porción variable de sus cadenas pesadas y/o ligeras, mini-anticuerpos Fab (véase el documento WO 93/15210, w O 96/13583, WO 96/37621, mini-anticuerpos biespecíficos diméricos (ver Muller et al., 1998) y anticuerpos quiméricos o de cadena sencilla que incorporan dicha fracción reactiva, así como cualquier otro tipo de molécula o célula en que se ha insertado físicamente una tal fracción reactiva de anticuerpos, tal como un receptor quimérico de células T o una célula T que tiene dicho receptor, o moléculas desarrolladas para suministrar restos terapéuticos por medio de una porción de la molécula que contiene dicha fracción reactiva. Se pueden proporcionar tales moléculas por cualquier técnica conocida, que incluye, pero no se limita a, escisión enzimática, síntesis de péptidos o técnicas recombinantes.

[0050] El término "antígeno" tal como se utiliza aquí se refiere a una molécula o una porción de una molécula capaz de provocar la formación de anticuerpos y/o unirse por un anticuerpo. Un antígeno puede tener uno o más de un epítopo. Por ejemplo, las proteínas c Ea c AM1, PD-1, cada una se considera un antígeno por la presente invención. En realizaciones preferidas, los antígenos son antígenos humanos.

[0051] El término "anticuerpo capaz de inhibir o bloquear la interacción entre PD-1 y sus ligandos" tal como se utiliza aquí, se refiere a cualquier anticuerpo o fragmento de unión de antígeno del mismo que interfiere, inhibe, disminuye, elimina o previene una interacción entre una molécula PD-1, por ejemplo, presentada por una célula de linfocitos, por ejemplo, presentada por una célula cancerosa, opcionalmente por interacción química y/o física con PD-1.

[0052] El término "tratamiento de cáncer' como se usa aquí, se refiere a la administración de cantidades efectivas terapéuticas de agentes tales como anticuerpos y/o células de linfocitos a un paciente diagnosticado con cáncer, para inhibir el crecimiento adicional de células malignas en el paciente, para inhibir la propagación de las células malignas en el paciente y/o causar la muerte de las células malignas en el paciente. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, tratar el cáncer significa atenuar la progresión del tumor, inhibir la propagación de las células malignas en el paciente, provocando la muerte de las células malignas en el paciente y cualquier combinación de las mismas. Cada posibilidad representa una realización separada de la invención. En ciertas realizaciones, tratar el cáncer significa atenuar la progresión del tumor, causando la muerte de células malignas en el paciente, o ambas.

[0053] El término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un fármaco eficaz para tratar una enfermedad o trastorno en un mamífero. En el caso del cáncer, la cantidad terapéuticamente efectiva del medicamento puede reducir la cantidad de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor; inhibir (es decir, ralentizar hasta cierto punto y preferiblemente detener) la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; inhibir (es decir, ralentizar hasta cierto punto y preferiblemente detener) la metástasis tumoral; inhibir, hasta cierto punto, el crecimiento tumoral; y/o aliviar en cierta medida uno o más de los síntomas asociados con el trastorno. En la medida en que el medicamento puede prevenir el crecimiento y/o matar las células cancerosas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. Para la terapia contra el cáncer, la eficacia in vivo se puede medir, por ejemplo, evaluando la duración de la supervivencia, el tiempo hasta la progresión de la enfermedad (TTP), las tasas de respuesta (RR), la duración de la respuesta y/o la calidad de vida.

[0054] Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren o describen la condición fisiológica en mamíferos que normalmente se caracteriza por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, entre otros, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de melanoma, pulmón, tiroides, mama, colon, próstata, hígado, vejiga, renal, cervical, pancreático, leucemia, linfoma, mieloide, ovario, útero, sarcoma, biliar o endometrial.

[0055] El término "composición anti-neoplásica" se refiere a una composición útil en el tratamiento de cáncer que comprende al menos un agente terapéutico activo capaz de inhibir o prevenir el crecimiento o la función de tumor, y/o causa la destrucción de células tumorales. Los agentes terapéuticos adecuados en una composición antineoplásica para tratar el cáncer incluyen, pero no se limitan a, agentes quimioterapéuticos, isótopos radiactivos, toxinas, citocinas tales como interferones y agentes antagonistas dirigidos a citocinas, receptores de citocinas o antígenos asociados con células tumorales.

[0056] El término "kit", como se usa en el presente documento, se refiere a una combinación de reactivos y otros materiales. Se contempla que el kit puede incluir reactivos tales como anticuerpos, mezclas de anticuerpos, tampones, diluyentes y otras soluciones acuosas, y/o uno o más viales de almacenamiento u otros recipientes. No se pretende que el término "kit" se limite a una combinación particular de reactivos y/u otros materiales.

[0057] En el presente documento se proporcionan composiciones farmacéuticas dirigidas a obstruir simultáneamente dos principales interacciones inmunosupresoras: CEACAM1linfocito/CEACAM1célula cancerasa y PD-1linfocit°/PD-ligandocélula cancer°sa. Por lo tanto, las composiciones farmacéuticas comprenden un anticuerpo monoclonal para CEACAM1 humano como se detalla anteriormente y un anticuerpo monoclonal para PD-1 humano. Cada posibilidad representa una realización separada de la invención. La frase "las composiciones farmacéuticas comprenden el anticuerpo A y el anticuerpo B" se refiere a al menos dos composiciones farmacéuticas separadas, cada una de las cuales comprende al menos un anticuerpo que es diferente del anticuerpo comprendido en la otra composición farmacéutica. La frase "la composición farmacéutica comprende" se refiere a una única composición farmacéutica que comprende al menos dos anticuerpos diferentes.

[0058] Ya se conocen muchos anticuerpos monoclonales contra la proteína CEACAM1, todos los cuales están considerados apropiados para su uso en las composiciones y métodos descritos en este documento. En un aspecto particular, el anticuerpo monoclonal para CEACAM1 humano es CM-24. Los segmentos CDR de CM-24 se identificaron utilizando dos métodos de algoritmo diferentes:

1. Algoritmo IMGT (Lefranc et al., 1999, Nucleic Acids Research, 27, 209-212);

2. Algoritmo KABAT (Wu TT y Kabat EA, 1970, J. Exp. Med. 132, 211 -250).

[0059] La Tabla 1 resume las secuencias de CDR determinadas utilizando los dos métodos, así como la secuencia consenso mínima y la secuencia combinada de secuencias identificadas utilizando ambos métodos.

[0060] El anticuerpo monoclonal que reconoce CEACAM1, comprende la cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 que tiene respectivamente SEQ ID NO: 1, 2, 3 y la cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 que tiene respectivamente SEQ ID NO: 4, 5 y 6. También puede comprender una secuencia marco seleccionada del grupo que consiste en: IgG2a de ratón, IgG2b de ratón, IgG3 de ratón, IgG1 humana, IgG2 humana, IgG3 humana.

[0061] También puede comprender regiones constantes derivadas de humanos seleccionadas del grupo que consiste en: IgG1 humana, IgG2 humana e IgG3 humana, preferiblemente una subclase de región constante del subtipo de IgG1 humana.

[0062] En un aspecto, el anticuerpo monoclonal a CEACAM1 humano es capaz de unirse con una afinidad de al menos aproximadamente 10-8 M a una proteína CEACAM1 humano. En otro aspecto, el anticuerpo monoclonal para CEACAM1 humano es capaz de unirse con una afinidad de al menos aproximadamente 5x10-7 M a al menos una de una proteína de CEACAM3 humano y CEACAM5 humano.

[0063] Ya se conocen varios anticuerpos monoclonales contra la proteína de PD-1, todos los cuales se consideran apropiados para uso en los usos médicos de la presente invención. Sin embargo, en algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal para PD-1 humano se selecciona del grupo que consiste en MK-3475, AMP514, BMS-936558, CT-011, y cualquier combinación de los mismos. Para evitar la inmunogenicidad cuando se administra a un paciente humano, el anticuerpo monoclonal para CEACAM1 humano puede ser un anticuerpo monoclonal humano o humanizado. El término "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica del sitio in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo en las CDR. Sin embargo, el término "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos en los que las secuencias de c Dr derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, como un ratón, se hayan injertado en secuencias marco humanas. El término "anticuerpo humano" se refiere a un anticuerpo humano aislado, es decir, aislado de un donante humano, o aislado de una línea celular de hibridoma, o un anticuerpo humano recombinante, es decir, producido por tecnología de ADN recombinante.

[0064] Un "anticuerpo humano" es aquel que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo se ha hecho por un humano y/o usando cualquiera de las técnicas para preparar anticuerpos humanos como se describe en el presente documento. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos. Los anticuerpos humanos pueden producirse usando diversas técnicas conocidas en la técnica. En una realización, el anticuerpo humano se selecciona de una biblioteca de fagos, donde esa biblioteca de fagos expresa anticuerpos humanos (Vaughan et al. Nature Biotechnology 1996 14,309-314; Sheets et al. PNAS (EE. UU.), 1998, 95, 6157-6162); Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 1991,227, 381; Marks y col., J. Mol. Biol., 1991,222, 581). Los anticuerpos humanos también pueden prepararse introduciendo loci de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo, ratones en los que los genes de inmunoglobulina endógena se han inactivado parcial o completamente. Tras el desafío, se observa la producción de anticuerpos humanos, que se asemeja mucho a la observada en humanos en todos los aspectos, incluida la reorganización de genes, el ensamblaje y el repertorio de anticuerpos. Este enfoque se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. Nos 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, y en las siguientes publicaciones científicas: Marks et al, Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995). Alternativamente, el anticuerpo humano puede prepararse mediante la inmortalización de linfocitos B humanos que producen un anticuerpo dirigido contra un antígeno diana (tales linfocitos B pueden recuperarse de un individuo o pueden haberse inmunizado in vitro). Ver, por ejemplo, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner y col., J. Immunol., 147 (1): 86-95 (1991); y la Patente de Estados Unidos N° 5.750.373.

[0065] El término "anticuerpo humano recombinante", como se usa en el presente documento, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped, anticuerpos aislados de una biblioteca recombinante, combinatoria de anticuerpos humanos, anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, Taylor, LD, et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique la unión de secuencias del gen de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes pueden someterse a mutagénesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgénico para secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y, por lo tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, si bien se derivan y se relacionan con secuencias de VH y VL de línea germinal humana, puede no existir naturalmente dentro del repertorio de línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.

[0066] El término "anticuerpo humanizado", como se usa aquí, se refiere, pretende incluir anticuerpos que tienen sus CDRs (regiones determinantes de la complementariedad) derivadas de una especie no humana de inmunoglobulina y el resto de la molécula de anticuerpo derivado principalmente de una inmunoglobulina humana.

[0067] Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región hipervariable del receptor se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) como ratón, rata, conejo o primates no humanos que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región marco (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se realizan para refinar aún más el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprende sustancialmente todos al menos uno, y típicamente dos dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todos o sustancialmente todos los FR son aquellos de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprende al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, ver Jones et al., Nature 1986, 321, 522-525; Riechmann et al., Nature 1988, 332, 323-329; y Presta, Curr. Op. Estructura Biol., 19922, 593-596.

[0068] El término "anticuerpo humano recombinante", como se usa en el presente documento, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped, anticuerpos aislados de una biblioteca recombinante, combinatoria de anticuerpos humanos, anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, Taylor, LD, et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique la unión de secuencias del gen de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Sin embargo, en ciertos casos, tales anticuerpos humanos recombinantes pueden someterse a mutagénesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgénico para secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y, por lo tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, si bien se derivan y están relacionadas con las secuencias VH y VL de la línea germinal humana, pueden no existir naturalmente dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.

[0069] Sin desear quedar ligado a ningún mecanismo o teoría, se sugiere que el efecto citotóxico contra el cáncer sustancial demostrado por combinación de los los anticuerpos de la presente invención, tanto in vitro como in vivo puede fortalecerse por las células de linfocitos exógenos. Por lo tanto, las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente pueden comprender además células de linfocitos humanos.

[0070] El término "célula de linfocitos" o "linfocitos" tal como se utiliza aquí se refiere a cualquiera de una célula asesina natural (NK) (normalmente implicada en la inmunidad innata citotóxica mediada por células), una célula T (normalmente implicada en inmunidad adaptativa citotóxica mediada por células), una célula B (generalmente implicada en inmunidad adaptativa humoral impulsada por anticuerpos), una pluralidad de las mismas y cualquier combinación de las mismas. Las células mononucleadas de sangre periférica (PBMC), las células de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) y las células asesinas activadas por linfocitos (LAK) (generalmente involucradas en la muerte de las células tumorales) también se consideran células de linfocitos. Los ejemplos no limitantes de linfocitos incluyen linfocitos citotóxicos (CTL, CD8+ o CD4+), células NK (CD2+) y células T auxiliares (CD4+).

[0071] Los términos "células asesinas activadas por linfoquinas (LAK)", "células asesinas activadas por linfocinas" y "células LAK" se usan indistintamente y se refieren a las células de linfocitos que han sido estimuladas o activadas para destruir las células tumorales, es decir, para convertirse en más citotóxicas hacia las células tumorales. Ya que las células LAK pueden producirse a partir de poblaciones de células homogéneas o heterogéneas, los términos anteriores se refieren además a poblaciones de células homogéneas o heterogéneas, estimuladas o activadas para volverse más citotóxicas hacia las células tumorales. Las células LAK se producen a partir de células PBMC por IL-2.

[0072] Se ha establecido bien anteriormente que agentes de activación de linfocitos conocidos, tales como IL-2, interferón y (IFN-y) y/o anticuerpos monoclonales anti-CD3, son capaces de linfocitos de transformación, tales como células PBMC, a se vuelven más citotóxicos, produciendo así una población celular denominada "células de linfocitos citotóxicos activados", "células de linfocitos activados", "células de linfocitos citotóxicos" o "linfocitos activados", tanto in vitro como in vivo. La presente divulgación y otras, proporcionan una amplia guía para una persona de habilidad promedio en el campo en cuanto a cómo activar las PBMC para producir diversas poblaciones de células de linfocitos citotóxicos activados sin efectos secundarios adversos. Por ejemplo, Stephen E. Ettinghausen y sus colegas han establecido que la administración sistémica de IL-2 recombinante estimula la proliferación de células linfoides in vivo en los tejidos (Stephen E. Ettinghausen et al., The Journal of Immunology, 1985, Vol. 135, No. 2, páginas 1488-1497), y que la IL-2 recombinante estimula la proliferación in vivo de células LAK transferidas adoptivamente (Stephen E. Ettinghausen y col., The Journal of Immunology, 1985, Vol. 135, No. 5, páginas 3623-3635) Joseph H. Phillips y sus colegas han establecido que la administración continua de 100.000 U IL-2/kg/q8 es suficiente para preparar las células PBMC para que se conviertan en células LAK en pacientes con carcinoma de colon avanzado, melanoma maligno o cáncer de células renales (J. Clin. Oncol., 1987, Vol. 5, págs. 1933-1941). Las células asesinas inducidas por citoquinas (CIK) son células T CD8 humanas activadas in vitro que han adquirido citotoxicidad antitumoral no específica, lo que representa una población celular con doble fenotipo de células T y células NK. Debido a su orientación intratumoral in vivo y a la falta de reactividad de injerto contra huésped (GVH), las células CIK se han utilizado ampliamente en pacientes con cáncer en contextos autólogos o alogénicos. M. Introna y col. (Immunology Letters, 2013, Vol. 155, páginas 27-30) proporciona un resumen de las principales características biológicas de las células CIK, así como sus resultados clínicos más destacados.

[0073] Las células de linfocitos pueden expresar CEACAM1, PD-1, o ambos. Las células de linfocitos pueden seleccionarse del grupo que consiste en células de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), células asesinas activadas por linfocinas (LAK), células asesinas inducidas por citocinas (CIK), células T, células B, células NK y cualquier combinación de las mismas. Las células de linfocitos pueden seleccionarse del grupo que consiste en células de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) y células asesinas activadas por linfocinas (LAK). Las células de linfocitos son células de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL). En ciertos casos, las células de linfocitos son células asesinas activadas por linfocinas (LAK).

[0074] Sin estar vinculado a ningún mecanismo o teoría, se sugiere que el efecto citotóxico anticancerígeno deseado demostrado aquí por los linfocitos in vitro puede maximizarse usando linfocitos activados células. El término "activado" tal como se utiliza aquí se refiere a cualquier célula de linfocitos que exhiben una actividad citotóxica, por ejemplo, contra una línea celular de cáncer, tales como células humanas de melanoma (Malme 3M o SKMEL28), o que muestran los niveles de producción B granzima elevados.

[0075] Las células de linfocitos pueden ser citotóxicas a una célula cancerosa.

[0076] El término "citotóxico" tal como se utiliza aquí se refiere a un agente (tal como células de linfocitos) que es perjudicial para una célula de estructura (tal como una célula de cáncer) y/o función. Por ejemplo, cuando se exponen a células somáticas disfuncionales, los linfocitos T citotóxicos (CTL) liberan las citotoxinas perforina, granzimas y granulisina. A través de la acción de la perforina, las granzimas entran al citoplasma de las células diana y su función de serina proteasa desencadena la cascada de caspasa, que es una serie de proteasas de cisteína que eventualmente conducen a la apoptosis (muerte celular programada).

[0077] Los usos médicos de las composiciones como se describe aquí se demuestran como eficaces contra varios tipos de cáncer no relacionados por origen. La célula cancerosa expresa CEACAM1, PD-L1, PD-L2, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cánceres de melanoma, linfoma, pulmón, tiroides, mama, colon, próstata, hepático, vejiga, renal, cervical, pancreático, leucemia, mieloide, ovario, útero, sarcoma, biliar, y células endometriales. Cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en un cáncer de melanoma y linfoma. El anticuerpo monoclonal para PD-1 humano, es capaz de inhibir o bloquear la interacción entre PD-1 humano y sus ligandos.

[0078] Se encontró sorprendentemente que la unión de los anticuerpos anti-CEACAM1 y anticuerpos anti-PD-1 a sus respectivas dianas en las células de linfocitos es de algún modo interrelacionado. Por lo tanto, la célula linfocítica puede preincubarse con el anticuerpo monoclonal para CEACAM1 humano o con un anticuerpo monoclonal para PD-1 humano antes de la administración. La frase "preincubado con" como se usa en el presente documento se refiere a células linfocitarias que están presentes en la misma composición que el anticuerpo monoclonal para CEACAM1 humano y/o en la misma composición que el anticuerpo monoclonal para PD-1 humano en condiciones que permiten que anticuerpos se unan a sus dianas presentadas por las células linfocitarias de una manera específica.

[0079] El antígeno leucocitario humano (HLA) del sistema es el locus de los genes que codifican para proteínas en la superficie de las células que son responsables de la regulación del sistema inmune en seres humanos. Los genes HLA son las versiones humanas de los principales genes del complejo de histocompatibilidad (MHC) que se encuentran en la mayoría de los vertebrados. Los HLA se usan habitualmente para unir a un paciente de una enfermedad con un donante sano para trasplante de células u órganos. El mejor resultado de trasplante ocurre cuando los HLA del paciente y los HLA del donante coinciden estrechamente, preferiblemente idénticos. El término "célula de linfocito autólogo" tal como se usa en el presente documento se refiere a una célula de linfocito obtenida o derivada de un paciente con cáncer, opcionalmente expandida o incubada con anticuerpos anti-CEACAM1 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos y/o anticuerpos anti-PD-1 o fragmentos de unión a antígeno del mismo, y administrados al mismo paciente con cáncer. El término "célula de linfocito autólogo", como se usa en el presente documento, se refiere además a una célula de linfocito obtenida o derivada de un donante compatible con el antígeno leucocitario humano (HLA).

[0080] Un kit puede comprender una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo monoclonal a CEACAM1 humano y una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal a PD-1 humano. Cada composición farmacéutica que comprende el anticuerpo está contenida en un recipiente separado dentro del kit.

[0081] El kit puede comprender además una composición farmacéutica que comprende células de linfocitos. Alternativamente, las células de linfocitos ya pueden estar incluidas en una o en ambas composiciones del kit que comprenden los anticuerpos contra CAECAM1 humano y contra PD-1 humano. El kit puede comprender además instrucciones para el uso del kit.

[0082] Los siguientes ejemplos están destinados a ilustrar cómo hacer y usar los compuestos y métodos descritos en este documento y de ninguna manera deben interpretarse como una de la invención, que se define por las reivindicaciones.

EJEMPLOS

Ejemplo 1 - Las células de melanoma humano expresan CEACAM1 y PD-L1 tras la activación de IFN-y.

[0083] Células de melanoma humano (Malme 3M) se incubaron con IFN-y (2000 unidades/ml) durante 24 horas, seguido por análisis de FACS con un anticuerpo anti-PD-Ll (clon 29E.2A3) conjugado con PE o con un anticuerpo monoclonal conjugado con PE contra CEACAM1 humano (CM-24, desarrollado por cCAM Biotherapeutics). Se realizó un ensayo similar para el control de isotipos. La Figura 1 demuestra que las células de melanoma humano utilizadas en los experimentos expresan tanto CEACAM1 como PD-L1.

Ejemplo 2 - Las células TIL humanas expresan PD-1 y CEACAM1.

[0084] Las células TIL humanas (linfocitos infiltrantes de tumores expandidos de forma pacientes n° 14 en el Instituto Ella, Lote 14, TIL14,) se tiñeron con un anticuerpo monoclonal a PD-1 humano (clon E12.2H7) o con un anticuerpo monoclonal conjugado con PE para CEACAM1 humano (CM-24) seguido de análisis FACS. Se presenta la expresión de PD-1 (A) y CEACAM1 (B) en comparación con un control de isotipo correspondiente.

[0085] La Figura 2 demuestra que las células TIL humanas usadas en los experimentos expresan tanto PD-1 como CEACAM1.

Ejemplo 3 - Efectos sinérgicos de los anticuerpos anti-CEACAM1 y anti-PD-1 sobre la citotoxicidad de las células TIL humanas contra las células de melanoma humano.

[0086] Se cultivaron células de cáncer de melanoma humano (Malme 3M) en presencia de IFN-y para inducir la expresión de PD-L1. Las células TIL humanas (TIL14) se incubaron con un anticuerpo monoclonal contra CEACAM1 humano (CM-24) (0,01 pg/ml, 0,05 pg/ml, 0,1 pg/ml, 0,5 pg/ml), un anticuerpo monoclonal para PD-1 humano (clon E12.2H7) o con una combinación de ambos anticuerpos (0,005, 0,025, 0,05 y 0,25 pg/ml de cada anticuerpo) durante 30 minutos a 37°C.

[0087] Células de cáncer humano de melanoma tratadas con IFN-y se añadieron para la incubación durante la noche, antes de la evaluación de citotoxicidad (Figura 3). Los resultados representan un promedio de % de citotoxicidad ±DE según lo determinado por el ensayo clásico de liberación de LDH de pocillos por triplicado por tratamiento. * Prueba T emparejada P <0,05 en comparación con CM-24 solamente. El índice de combinación (IC) se calculó para ser < 0,2, de acuerdo con la siguiente ecuación:

[0088] La Figura 3 demuestra que tanto anticuerpos anti-CEACAM1 como anticuerpos anti-PD-1 eran capaces de unirse a sus respectivas dianas en los linfocitos humanos, tales como células TIL, y que esta unión aumentó significativamente la toxicidad de las células TIL humanas contra las células cancerosas humanas sobre cada monoterapia sola. Por lo tanto, los datos presentados en la Figura 3 indican que proteger a los linfocitos de las señales inmunosupresoras de las células cancerosas diana resulta en una citotoxicidad sustancial hacia estas células cancerosas.

Ejemplo 4 - Efectos sinérgicos de los anticuerpos anti-CEACAM1 y anti-PD-1 sobre los niveles de Granzima B y la citotoxicidad de las células TIL humanas contra las células de melanoma humano cuando se agregan anticuerpos anti-PD-1 antes de la adición de anticuerpos anti-CEACAM1.

[0089] Se cultivaron células de cáncer de melanoma humano (MALME 3M) en presencia de IFN-y para inducir la expresión de PD-L1. Las células TIL humanas (TIL14) se incubaron solo con medio (negro), anticuerpo IgG no específico (0,8 pg/ml, blanco), diversas concentraciones (0,05 pg/ml, 0,1 pg/ml, 0,2 pg/ml, 0,4 pg/ml, 0,8 pg/ml) de un anticuerpo monoclonal contra CEACAM1 humano (CM-24), un anticuerpo monoclonal contra PD-1 humano (clon E12,2H7) o una combinación de ambos anticuerpos (0,05 pg/ml cada uno, 0,1 pg/ml cada uno, 0,2 pg/ml cada uno, 0,4 pg/ml cada uno, 0,8 pg/ml cada uno).

[0090] Se añadió el anticuerpo monoclonal a PD-1 humano primero durante 30 minutos a 37°C, seguido de la adición de anticuerpo monoclonal a CEACAM1 humano. Se agregaron células de cáncer de melanoma humano tratadas con IFN-y para la incubación durante la noche, antes de la evaluación de citotoxicidad (Figura 4A). El índice de combinación (IC) se calculó en 0,15. Los resultados representan un promedio de % de citotoxicidad ±DE según lo determinado por el ensayo clásico de liberación de LDH de pocillos por triplicado por tratamiento. * P<0,05 prueba T emparejada en comparación con a-PD-1 solamente. En el mismo ensayo, el nivel de la proteína citotóxica granzima B que se secreta tras la activación de las células citotóxicas se evaluó mediante el kit comercial ELISA de granzima B (Figura 4B). Los resultados representan el nivel promedio de granzima B de pocillos por triplicado por tratamiento.

[0091] La Figura 4 demuestra que los anticuerpos anti-CEACAM1 y anticuerpos anti-PD-1 son capaces de unirse a sus respectivas dianas en los linfocitos humanos, tales como células TIL, y que esto aumenta la unión de la secreción de la granzima B y la toxicidad de las células TIL humanas contra células cancerosas humanas. La Figura 4 demuestra además que la unión de estos anticuerpos a las células TIL humanas está de alguna manera interrelacionada, lo que garantiza un estudio adicional de su mecanismo de unión. En similitud con los datos presentados en la Figura 3, la Figura 4 indica nuevamente que proteger a los linfocitos de las señales inmunosupresoras de las células cancerosas diana produce una citotoxicidad sustancial hacia las células cancerosas diana y sugiere que el tiempo podría ser un factor crítico en la terapia combinada.

Ejemplo 5 - Efectos sinérgicos de los anticuerpos anti-CEACAM1 y anti-PD-Ll sobre los niveles de Granzima B y la citotoxicidad de las células TIL humanas contra las células de melanoma humano cuando se agregan anticuerpos anti-PD-L1 antes de la adición de anticuerpos anti-CEACAM1 (no según a la invención).

[0092] Se hicieron crecer células de melanoma humano (Malme 3M) en presencia de IFN-y para inducir la expresión de PD-L1. Las células TIL humanas (TIL14) se incubaron solo con medio (negro), anticuerpo IgG no específico (0,8 pg/ml, blanco), diversas concentraciones (0,05 pg/ml, 0,1 pg/ml, 0,2 pg/ml, 0,4 pg/ml, 0,8 pg/ml) de un anticuerpo monoclonal para CEACAM1 humano (CM-24), un anticuerpo monoclonal para PD-L1 humano (clon 29E,2A3) o una combinación de ambos anticuerpos (0,05 pg/ml cada uno, 0,1 pg/ml cada uno, 0,2 pg/ml cada uno, 0,4 pg/ml cada uno, 0,8 pg/ml cada uno). El anticuerpo anti-PD-L1 se añadió primero durante 30 minutos a 37°C, seguido de la adición del anticuerpo monoclonal al CEACAM1 humano.

[0093] Se añadieron las células de cáncer humano con melanoma tratadas con IFN-y para la incubación durante la noche antes de la evaluación de citotoxicidad (Figura 5A). El índice de combinación (IC) se calculó en 0,67. Los resultados representan un promedio de % de citotoxicidad ±DE según lo determinado por el ensayo clásico de liberación de LDH de pocillos por triplicado por tratamiento. * P<0,05 prueba T emparejada en comparación con a-PD-L1 solamente. En el mismo ensayo, los niveles de la proteína citotóxica de granzima B que se secreta tras la activación de la célula citotóxica se evaluaron mediante el kit comercial ELISA de granzima B (Figura 5B). Los resultados representan el nivel promedio de granzima B de pocillos por triplicado por tratamiento.

[0094] La Figura 5 demuestra que los anticuerpos anti-CEACAM1 y anticuerpos anti-PD-L1 son capaces de unirse a sus respectivas dianas en los linfocitos humanos (tales como células TIL) y sobre células cancerosas humanas (tales como células de melanoma), y que esta unión aumenta la secreción de granzima B y la toxicidad de las células TIL humanas contra las células cancerosas humanas. La Figura 5 demuestra además que bloquear las interacciones PD-1/PD-L1 y CEACAM1/CEACAM1 puede provocar un efecto sinérgico. Por lo tanto, los datos presentados en la Figura 5 indican que la protección de los linfocitos de la señal inmunosupresora de PD-1linfocitos/PD-Ligandocélula cancerasa produce una citotoxicidad sustancial hacia estas células cancerosas, independientemente del antígeno dirigido, ya sea PD-1, PD-L1 o PD-L2.

Ejemplo 6 - Efectos sinérgicos de los anticuerpos anti-CEACAM1 y anti-PD-1 sobre la citotoxicidad de células LAK humanas contra células de melanoma humano cuando se agregan anticuerpos anti-PD-1 antes de la adición de anticuerpos anti-CEACAM1.

[0095] Células de melanoma humano (SKMEL28, CEACAM1 positivo, PD-L1 positivo) se hicieron crecer en presencia de IFN-y para inducir la expresión de PD-L1. Las células LAK humanas (asesinas activadas por linfocina) generadas por la activación de PBMC de un donante humano sano con IL-2 (500 unidades/ml) durante 7 días se incubaron con medio solo (negro), anticuerpo IgG no específico (0,8 mg/ml, blanco), varias concentraciones (0,05 pg/ml, 0,1 pg/ml, 0,2 pg/ml, 0,4 pg/ml, 0,8 pg/ml) de un anticuerpo monoclonal contra CEACAM1 humano (CM-24), un anticuerpo monoclonal para PD-1 humano (clon E12,2H7) o una combinación de ambos anticuerpos (0,05 pg/ml cada uno, 0,1 pg/ml cada uno, 0,2 pg/ml cada uno, 0,4 pg/ml cada uno, 0,8 pg/ml cada uno). El anticuerpo monoclonal para PD-1 humano se añadió primero durante 30 minutos a 37°C, seguido de la adición del anticuerpo monoclonal a CEACAM1 humano.

[0096] Células de melanoma humano tratadas con IFN-y se añadieron para horas de incubación de 24, antes de la evaluación de citotoxicidad (Figura 6). Se calculó que el índice de combinación (IC) era <0,2. Los resultados representan un promedio de % de citotoxicidad ±DE según lo determinado por el ensayo clásico de liberación de LDH de pocillos por triplicado por tratamiento. * P<0,05 prueba T emparejada en comparación con a-PD-1 solamente.

[0097] La Figura 6 demuestra que los anticuerpos anti-CEACAM1 y anticuerpos anti-PD-1 son capaces de unirse a sus respectivas dianas en los linfocitos humanos activados, tales como células LAK, y que esto aumenta la unión de la toxicidad de las células LAK humanas contra las células cancerosas humanas. La Figura 6 demuestra además que la unión de estos anticuerpos a las células LAK está de alguna manera interrelacionada, lo que garantiza un estudio adicional de su mecanismo de unión, y que este mecanismo está presente en una variedad de linfocitos activados.

Ejemplo 7 - T ratamiento con anticuerpos anti-CEACAM1 aumenta la expresión de PD-L1 en células cancerosas diana.

[0098] Las células NK humanas (NK92MI) se incubaron con o sin un anticuerpo monoclonal a CEACAM1 humano (10 pg/ml CM-24), seguido de la adición de células de cáncer de melanoma humano (SKMEL28). Las células se incubaron durante 24, 48 y 72 horas y los niveles de PD-L1 se midieron en cada punto de tiempo mediante análisis FACS. La Figura 7A ilustra los niveles medios de relación de anti-PD-L1 en comparación con un control de isotipo apropiado para los tratamientos indicados en los diferentes puntos de tiempo. B. Análisis FACS representativo de los niveles de PD-L1 después de 48 horas. La Figura 7 demuestra que la expresión de CEACAM1 y PD-L1 en células cancerosas está de hecho interrelacionada. La adición de anticuerpos anti-CEACAM1 da como resultado una mayor expresión de PD-L1 en las células cancerosas sobrevivientes, proporcionando así un soporte adicional para el tratamiento combinado con ambos agentes. Por lo tanto, puede ser beneficioso tratar el cáncer primero administrando anticuerpos anti CEACAM1 y luego administrando además anticuerpos anti-PD-L1 y/o anti-PD-L2, ya que el número de proteínas PD-L1 en las células cancerosas sigue siendo relativamente alto, haciendo que las células sean más sensibles para el tratamiento con anticuerpos anti PD-1/PD-L1, lo que implica que la terapia combinatoria puede mejorar el resultado clínico.

[0099] Los datos presentados en los Ejemplos 4 a 6 demuestran un hallazgo sorprendente, según el cual la administración de anticuerpos diferentes en momentos separados, en lugar de simultáneamente, maximiza el efecto citotóxico de los linfocitos contra las células cancerosas. Sin estar vinculado a ninguna teoría o mecanismo, este hallazgo puede estar relacionado con otro hallazgo sorprendente de la presente invención, según el cual el tratamiento con anticuerpos anti-CEACAM1 aumenta la expresión de PD-L1 en las células cancerosas diana. Hipotéticamente, esto respaldaría la necesidad de una pluralidad de anticuerpos para obtener una eficacia mejorada para los linfocitos citotóxicos. Se puede imaginar que la administración de anticuerpos anti-PD-1 bloquea primero las moléculas PD-1 en los linfocitos, la administración posterior de anticuerpos anti-CEACAM1 bloquea las moléculas CEACAM1 en los linfocitos y/o las células cancerosas diana y aumenta la expresión de los ligandos PD-1 en las células cancerosas diana. Sin embargo, dado que las moléculas PD-1 en los linfocitos ya están bloqueadas, los niveles elevados de expresión de los ligandos PD-1 en las células cancerosas diana no impiden que los linfocitos ejerzan de manera eficiente todo su potencial citotóxico.

Ejemplo 8 - Efectos sinérgicos de los anticuerpos anti-CEACAM1 y anti-PD-1 sobre la progresión tumoral en ratones inmunocompetentes.

[0100] Las células de linfoma murino (5*106, A20) se injertaron en el abdomen de ratones Balb/C mediante inyección subcutánea el día 1. En el día 10, los tumores alcanzaron un volumen promedio de 45 mm3, y los ratones fueron aleatorizados en 4 grupos separados (11-12 ratones por grupo), y administrados por vía intravenosa con PBS (Figura 8, línea negra discontinua, círculos vacíos), CC-1 (anticuerpo CEACAM1 anti murino, 6 mg/kg, Figura 8, línea gris sólida, rectángulos grises), PRM-1 (anticuerpo PD-1 anti murino, 6 mg/kg, Figura 8, línea gris continua, triángulos grises) o una combinación de CC-1 y PRM-1 (6 mg/kg cada uno, Figura 8, línea negra sólida, esferas negras). Los tratamientos se repitieron los días 15 y 20. El experimento finalizó el día 22. Se siguió el efecto de un anticuerpo monoclonal contra CEACAM1 humano solo, un anticuerpo monoclonal contra PD-1 humano solo y se siguió una combinación de ambos anticuerpos sobre la inhibición del crecimiento tumoral. Se seleccionaron ratones Balb/C inmunocompetentes para este experimento para permitir la evaluación de la actividad biológica de los anticuerpos anti-CEACAM1 y anti-murino-PD-1 en ratones con sistema inmune intacto y para evaluar la reacción completa del sistema inmune contra las células de cáncer murinas. En general, este modelo simula terapias en humanos, en las cuales los pacientes con cáncer recibirían combinaciones de anticuerpos anti-CEACAM1 humano y anti-humano-PD-1/PD-L1/PD-L2. Sin limitarse a ninguna teoría o mecanismo, se presume que una combinación de anticuerpos anti-CEACAM1 y anti-PD-1/PD-L1/PD-L2 prohibiría a las células cancerosas eludir la activación y la citotoxicidad del sistema inmunitario del paciente, produciendo así una respuesta anticancerígena significativa.

[0101] La Figura 8 demuestra que los anticuerpos anti-CEACAM1 y los anticuerpos anti-PD-1/PD-L1/PD-L2 pueden unirse a sus dianas respectivas en células tumorales y/o células inmunes in vivo, y que esta unión combinada atenúa significativamente la progresión tumoral en comparación con cada monoterapia. Este resultado es muy importante, ya que da fe de la eficacia y el potencial del uso de una combinación de anti-CEACAM1 y anti-PD-1/PD-L1/PD-L2 incluso en tumores establecidos de volúmenes considerables, que imitan el entorno clínico donde los pacientes con tumores establecidos están siendo tratados.

[0102] La Figura 9 proporciona curvas de progresión tumoral para cada ratón individual, agrupadas por sus respectivas terapias (control, anticuerpos anti-CEACAM1, anticuerpos anti-PD-1 o una combinación de anticuerpos anti-CEACAM1 y anti-PD-1).

Ejemplo 9 - T ratamiento de un modelo de xenoinjerto de cáncer con una combinación de un anticuerpo anti-CEACAM-1 y un anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal contra CEACAM1 humano; y una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal para PD-1 humano para uso en el tratamiento del cáncer mediante administración secuencial separada, uno tras otro;

en donde dicho anticuerpo monoclonal es capaz de inhibir o bloquear la interacción entre la PD-1 humana y sus ligandos; y

en donde dicho anticuerpo monoclonal para CEACAM1 humano tiene:

una CDR1 de cadena pesada que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 1,

una CDR2 de cadena pesada que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 2,

una CDR3 de cadena pesada que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 3,

una CDR1 de cadena ligera que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 4,

una CDR2 de cadena ligera que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 5 y

una CDR3 de cadena ligera que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 6.

2. Las composiciones farmacéuticas para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo monoclonal para CEACAM1 humano se une con una afinidad de al menos aproximadamente 10-8 M a CEACAM1 humano.

3. Las composiciones farmacéuticas para uso según la reivindicación 2, en donde dicho anticuerpo monoclonal para CEACAM1 humano se une con una afinidad de al menos aproximadamente 5x10-7 M a al menos uno de CEACAM3 humano y CEACAM5 humano.

4. Las composiciones farmacéuticas para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo monoclonal para CEACAM1 humano es CM-24.

5. Las composiciones farmacéuticas para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo monoclonal para PD-1 humano se selecciona del grupo que consiste en MK-3475, AMP514, BMS-936558, CT-011, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y cualquier combinación de los mismos.

6. Las composiciones farmacéuticas para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dichos anticuerpos monoclonales son anticuerpos monoclonales humanos o humanizados.

7. Las composiciones farmacéuticas para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprenden además células de linfocitos humanos.

8. Las composiciones farmacéuticas para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho cáncer se selecciona del grupo que consiste en cánceres de células de melanoma, linfoma, pulmón, tiroides, mama, colon, próstata, hepático, de vejiga, renal, cervicales, pancreáticas, de leucemia, mieloides, de ovario, útero, sarcoma, biliar y endometriales.

9. Las composiciones farmacéuticas para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde dicho anticuerpo monoclonal para PD-1 humano se administra a dicho paciente antes de dicho anticuerpo monoclonal para CEACAM1 humano.

10. Las composiciones farmacéuticas para uso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde dicho anticuerpo monoclonal para PD-1 humano se administra a dicho paciente después de dicho anticuerpo monoclonal para CEACAM1 humano.