JP2002514913A

JP2002514913A - 生反応性アロステリックポリヌクレオチド

Info

Publication number: JP2002514913A
Application number: JP52804998A
Authority: JP
Inventors: アールブレーカー，ロナルド
Original assignee: エールユニバーシティ
Priority date: 1996-12-19
Filing date: 1997-12-18
Publication date: 2002-05-21
Also published as: US20050176017A1; EP0958303A4; AU724627B2; WO1998027104A1; CA2275541A1; EP0958303A1; AU5810798A; US6630306B1

Abstract

(57)【要約】化学的エフェクター及び／又は物理的シグナルによりポリヌクレオチドの機能又は配置を修飾するアロステリック性を有するポリヌクレオチドは、診断及び触媒の目的でバイオセンサー及び／又は酵素として主として使用される。或る好ましい態様では、ポリヌクレオチドは、自己触媒作用の観察により化合物、その濃縮物又はサンプル中の物理的変化の存在又は不存在を検出するためにバイオセンサーとして溶液／懸濁物で又は固体支持体へ結合して使用されるＤＮＡ酵素である。化学的エフェクターは、有機化合物例えばアミノ酸、アミノ酸誘導体、ペプチド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ステロイド及びこれらの相互及びこれらと金属イオン、細胞代謝物又は生物学的サンプルから得られる血液成分、ステロイド医薬品、殺虫剤、殺草剤、食品トキシンとの混合物などを含む。物理的シグナルは、放射、温度変化、及びこれらの組合せを含む。

Description

【発明の詳細な説明】生反応性アロステリックポリヌクレオチド技術分野本発明は、アロステリック性を示す機能性ＤＮＡポリヌクレオチドに主として関し、さらに化学的エフェクター、物理的シグナル又はこれらの紐合せによりコントロールできるラットとの触媒的性質を有する触媒的ＤＮＡ及びＤＮＡポリヌクレトチドに主として関する。本発明の生反応性（ｂｉｏｒｅａｃｔｉｖｅ）ポリヌクレオチドは、種々の応用、特にバイオセンサーとして有用である。背景技術バイオセンサーは、医薬品、農薬、工業及び環境科学、特に診断の目的で広く使用されている。バイオセンサーは、代表的には、分析中の剤又は条件の定量的読み取りを得るために、変換器（トランスデュサー）にカップリングする生物学的化合物（センサー材料）からなる。通常、バイオセンサーの生物学的成分は、高分子であり、しばしば、その対応するリガンドの認識及び結合により立体配座的変化をうける。自然では、この効果は、直ぐにシグナル工程を開始する（例えば、神経細胞のイオンチャンネル機能）。「アフィニティセンサー」の群には、レクチン、抗体、受容体及びオリゴヌクレオチドが含まれる。バイオセンサーでは、アフィニティセンサーへのリガンド結合は、光電子装置、電位差測定電極、電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）などにより検出される。別に、蛋白の特異性及び触媒的能力は、酵素機能を経て操作するバイオセンサーを生ずるのに利用されている。同様に、蛋白は、種々の工業的な応用に固定化触媒として使用されている。精製された酵素、又はオルガネラ全体、微生物或いは組織であってもその酵素的活性は、電位差測定又はアンペア測定電極、ＦＥＴ又はサーミスターによりモニターできる。市販されているバイオセンサーの大多数は、酵素に基づいており、そのオキシドレダクターゼ及びリアーゼは、非常に関心がある。それは、殆ど全部、変換器が利用できるこれらの酵素により触媒化される反応の反応物である。これらの変換器は、電位差測定電極、ＦＥＴ，ｐＨ −及びＯ₂感受性プローブ、及びＨ₂Ｏ₂及びレドックスメディエータに関するアンペア測定電極を含む。例えば、レドックス当量の移勅を触媒化する酵素の群であるオキシドレダクターゼは、Ｈ₂Ｏ₂又はＯ₂濃度に感受性のある検出器によりモニターできる。酵素は、感知装置における応用に十分に適している。多くの酵素及び受容体に関する結合定数は、極めて低く（例えば、アビシン：Ｋ_d＝１０^-15Ｍ）、そして触媒速度は、毎秒数千のオーダーにあるが、６０００００秒^-1にすら達することができる（カーボアンヒドラーゼ）（Ｗａｌｓｈ，Ｃ．（１９７８）ＥｎｚｙｍｅＲｅａｃｔｉｏｎＭｅｃｈａｎｉｓｍｓ、Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏ．ＮｅｗＹｏｒｋ）。酵素は、基質を生成物に転換するそれらの能力を経てバイオセンサーとしてモニターでき、そしてまた触媒的機能の阻害剤として働く或る分析物の能力である。有機化学及び生化学は、新しい分子が蛋白受容体及び酵素の機能を刺激するように作られる進歩の状態に達している。マクロサイクリック環、インプリンティング用のポリマー、及び自己集合性モノレイヤーは、バイオセンサーにおけるそれらの応用の可能性について集中的に現在研究されている。さらに、動物の免疫系は、人工的な生体認識系として働くことができる新しいリガンド結合蛋白を生じさせるために利用できる。遷移状態の類似体を結合するように作られている抗体は、また化学反応を触媒化し、それにより新規な「人工酵素」として機能する（Ｓｃｈｕｌｔｚｅ、Ｐ．Ｇ．Ｌｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２、１８３５−１８４２）。後者の例は、非天然の化合物を検出するのに使用できるバイオセンサー、又は非生理学的条件下で機能するバイオセンサーの生成に重要なルートである。自然では、ＲＮＡは、情報移動のプロセスのコンポーネントとして働くばかりでなく、分子認識及び触媒作用を含む、蛋白により概して達成される仕事を行う。一見際限のないように多いアプタマーそしてＤＮＡアプタマーですら、生体内で生成でき、それらは大きな親和性及び特異性で種々のリガンドと結合する（Ｇｏｌｄ，Ｌ．Ｐｏｌｉｓｋｙ，Ｂ．Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，Ｏ．Ｙａｒｕｓ，Ｍ．（１９９５）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４、７６３−７９７）。核酸は、リガンドと結合できそしてまた化学的トランスフォーメーションを触媒化できる、広範囲なしかもまだ開発されていない能力を採用する特定の立体配座を有するようである（Ｇｏｌｄ，Ｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０、１３５８１−１３５８４）。新しいＲＮＡ及びＤＮＡ受容体及び触媒のエンジニアリングは、生体外選択、即ち数兆の異なるオリゴヌクレオチド配列が、所望の機能を発揮する分子についてスクリーニングされる方法により主として達成される。この方法は、分子によるが生きている生物にはよらないダーウィンの進化をシミュレーションするやり方での選択及び増幅の繰り返しからなる（Ｂｒｅａｋｅｒ、Ｒ．Ｒ．（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７，４４２−４４８）。バイオセンサーとして現存の酵素を使用する一つの欠点は、現存する酵素又は受容体の性質に基づくセンサーを開発することに制限されることである。顕著な利点は、もし特別な応用にセンサーを「目的に合う（ｔａｉｌｏｒ−ｍａｋｅ）」ようにすることができるならば、得ることができる。現在のバイオセンサーの能力の範囲を超えて広がる性質及び特異性を有する全く新しいバイオセンサーを生成するように核酸を用いることが望ましいだろう。生体内選択は、最近、新しいリボザイムの発見に対する主な手段であった。リボザイムの触媒的レパートリーは、ＲＮＡ及びＤＮＡホスホエステル加水分解及びエステル交換、ＲＮＡ共有結合、ＲＮＡ燐酸化、アルキル化、アミド及びエステル結合形成、並びにアミド開裂反応を含む。最近の証拠は、生体触媒作用がＲＮＡ及び蛋白の領域のみではないことを示している。ＤＮＡは、ＲＮＡを有効に開裂し（Ｂｒｅａｋｅｒ、Ｒ．Ｒ．及びＪｏｙｃｅ、Ｇ．Ｆ．（１９９４）Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．１、２２３−２２９；Ｂｒｅａｋｅｒ、Ｒ．Ｒ．及びＪｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．（１９９５）Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．２、６６５−６６０）、ＤＮＡを共有結合し（Ｃｕｅｎｏｕｄ、Ｂ．及びＳｚｏｓｔａｋ、Ｊ．Ｗ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ、３７５、６１１−６１４）、そしてポルフィリン環の金属化を触媒化する（Ｌｉ、Ｙ．及びＳｅｎ，Ｄ．（１９９６）ＮａｔｕｒｅＳｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３、７４３−７４７）触媒的配置を形成することが示されている。本明細書で記述したように、自己開裂ＤＮＡは、レドックス機構を経て操作する分子のランダム配列のプールから単離され、バイオセンサーにおいてオキシドレダクターゼ酵素の代わりに人工のＤＮＡ酵素の使用を可能にする。さらに、これらのＤＮＡ酵素即ち「デオキシリボザイム」は、ＤＮＡ又は蛋白酵素の何れかよりかなり安定であり、これはバイオセンサー装置のセンサーコンポーネントにとり魅力的な特徴である。発明の開示固体支持体に結合したポリヌクレオチドを含む、バイオセンサーにおける使用のためのＲＮＡ及びＤＮＡ感知要素の例を提供することが本発明の目的である。ＲＮＡ及びＤＮＡの両者は、かなりの特異性及び親和性で種々のリガンドを結合するようにデザインできる。さらに、ＲＮＡ及びＤＮＡの両者は、使用者が規定する条件下で化学的トランスフォーメンションを触媒化するようにされる。合理的なデザイン及び組合せ（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ）法の組合せが、ＲＮＡ及びＤＮＡに基づく原型のバイオセンサーを生成するのに使用されている。本発明のこれら及び他の目的は、本発明により達成され、それは、化学的エフェクター、物理的シグナル又はこれらの組合せによりポリスクレオチドの機能又は配置を修飾するアロステリック性を示す精製された機能的なＤＮＡポリヌクレオチドを提供する。本発明は、さらに、化学的エフェクター、物理的シグナル又はこれらの組合せによりコントロールできる速度で、触媒的な性質を有する精製された機能的なポリヌクレオチドを提供する。いくらかの態様は、酵素の触媒作用の速度を修飾するアロステリック性を示す酵素である。さらに、本発明は、本明細書で記述された生反応性アロステリックポリヌクレオチドからなるバイオセンサーを含む。化学的エフェクターの例は、有機化合物、例えばアミノ酸、アミノ酸誘導体、ペプチド、ヌクレオシド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ステロイド、並びに有機化合物及び金属イオンの混合物を含むが、これらに限定されない。いくらかの態様では、エフェクターは、微生物又は細胞の代謝物、又は体液例えば生物学的サンプルから得られる血液及び尿の成分である。他の態様では、エフェクターは、医薬品、殺虫剤、殺草剤及び食品トキシンである。物理的シグナルは、照射及び温度の変化を含むが、これらに限定されない。本発明は、また、本発明の生反応性アロステリックポリヌクレオチド及びそれらを配合したバイオセンサーを使用して、生物学的、工業的及び環境的サンプルの化合物又は化合物の濃縮物、そしてこれらサンプル中の物理的変化の存在又は不存在を測定する方法を提供する。図面の簡単な説明図１は、本発明のバイオセンサーの例の概略図である。この態様では、自己開裂ＤＮＡは、プラスチック「スピン−カラム」にマウントされた固体マトリックス上に固定化される。自己開裂ＤＮＡは、それがアロステリック誘導を生じさせる特定のエフェクター分子に遭遇しない限り、不活性のままである。テストサンプルは、多孔性のマトリックスに添加され、インキュベートされ、次に溶液を遠心分離により管の底で集められる。触媒活性がエフェクターの存在（濃度での）の関数であるため、離脱されたＤＮＡフラグメントの濃度は、エフェクターの存在及び量を知らせるだろう。図２は、本発明の自己開裂ＤＮＡに関する配列及び二次配置モデルを示す（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）。かっこは、ＤＮＡ開裂の主な領域を示す。図３は、（Ａ）本発明の固定化ＤＮＡ生体触媒、並びに（Ｂ）簡単な反応器アセンブリの例をスケッチしている。図４は、固定化ＤＮＡ酵素による触媒機能の証明を示す。５’³²ＰラベルＲＮＡ基質は、５’−ビオチニルＤＮＡ酵素により誘導体化されたストレプタビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）カラム（ＡｆｆｉｎｉＴｉｐＳｔｒｅｐ２０、ＧｅｎｏｓｙｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に適用された。ＤＮＡ酵素は固定化されて、有効な濃度を〜１μＭとした。基質（０．５μＭ）を、２０ μＬずつ繰り返しカラムに適用し、１０分間反応させ、次にポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析のために回収した。開裂した基質のフラクションを、溶離した体積の関数としてプロットした。図５は、以下の実施例１に記述されたハンマーヘッドリボザイム構成物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を示す。Ｈ１（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）は、Ｆｅｄｏｒ及びＵｈｌｅｎｂｅｃｋにより初めて確認されたリボザイム「ＨＨ１５」と同じである（Ｆｅｄｏｒ、Ｍ．Ｊ．及びＵｈｌｅｎｂｅｃｋ，Ｏ．Ｃ．（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１、１２０４２）。Ｈ２（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）は、ステムＩの追加のＧ−Ｃ塩基対を有し、そして不活性配置の出現を減少させるために短いヘアピンとしてデザインされた補助配列によりそれぞれの末端で側面に配置される。Ｈ３（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）は、ＡＴＰ−及びアデノシン −特異性アプタマーの尖端を切ったバージョンに相当するＲＮＡドメインを含む組み込みハンマーヘッドリボザイムである（Ｓａｓｓａｎｆａｒ，Ｍ．及びＳｚｏｓｔａｋ、Ｊ．Ｗ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ，３６４，５５０−５５３及びＳｃｉｅｎｃｅ、２６３、１４２５−１４２９）。Ｈ４及びＨ５は、それぞれ、アプタマードメインの突然変異及びステムＩＩの３塩基対拡張を含むＨ３の修飾されたバージョンである。矢印は、リボザイム媒介開裂の部位を示す。図６は、実施例１に記載されたハンマーヘッドリボザイムのＡＴＰ−及びアデノシン−媒介阻害の証拠を示す。（Ａ）ハンマーヘッド構成物Ｈ１、Ｈ２及びＨ３（４００ｎＭ）は、３０分間１ｍＭＡＴＰの不存在（−）又は存在（＋）の下痕跡量の(５’−³²Ｐ)ラベル基質(Ｓ)とともにインキュベートされた。（Ｂ）エフェクター分子の特異性は、指示されたように１ｍＭの種々のヌクレオチドなし（−）又はありで、実施例１に記載したように４５分間Ｈ３及びＳをインキュベートすることにより、調べられた。同様に、構成物Ｈ４及びＨ５は、１ｍＭＡＴＰの存在下活性について調べられた。反応生成物は、変性（８Ｍ尿素）２０％ポリアクリルアミドケルにより分離され、そしてオートラシオグラフィーにより視覚化された。Ｅ、Ｓ及びＰは、それぞれ酵素、基質及び生成物のバンドを同定している。図７は、実施例１に記載したＡＴＰによりＨ３の触媒的阻害の動力学的分析の結果をプロットしている。（Ａ）１０μＭ（白丸）及び１ｍＭ（黒丸）の存在下のＨ３リボザイム活性（４００ｍＭ）のプロット。点線は、ＡＴＰの不存在下又は約１ｍＭｄＡＴＰの存在下で得られる平均の最初のスロープを表す。（Ｂ）種々の濃度のｄＡＴＰ（白丸）及びＡＴＰ（黒丸）の存在下のＨ３リボザイム活性（ｋ_obs）のプロット。またｙ軸には、エフェクター分子を添加していないＨ１、Ｈ２及びＨ３（それぞれ、白四角、黒四角及び白丸）のｋ_obs値をプロットしている。図８（Ａ）は、ＡＴＰ（Ｈ６、ＳＥＱＩＤＮＯ：５及びＨ７、ＳＥＱＩＤＮＯ：６）によるアロステリック誘導、並びに実施例１に記載されたテオフィリン（Ｈ８）によるアロステリック阻害に関する統合構成物を画いている。Ｈ７は、Ｇ、Ｕミスマッチにより中心のＵ−Ａ対を置換し、そしてハンマーヘッド触媒作用をさらに低下させるようにデザインされている。Ｈ８は、ＡＴＰ−アプタマードメインが、Ｊｅｎｉｓｏｎら（Ｊｅｎｉｓｏｎ、Ｒ．Ｄ、Ｓ．Ｃ．Ｇｉｌｌ、Ａ．Ｐａｒｄｉ、Ｂ．Ｐｏｌｉｓｋｙ（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６３、１４２５）により記述された「ｍＴＣＴ８−４」に相当するテオフィリンアプタマーにより置換されていることを除いて、Ｈ３に類似している。矢印は、リボザイム媒介開裂の部位を指示している。（Ｂ）リボザイム反応中のリボザイム触媒作用の誘導が、１ｍＭＡＴＰの不存在（白丸）及び存在（白四角）でＨ６をインキュベートすることにより調べられ、そしてＡＴＰが添加されるとき（黒丸）、行われているリボザイム反応中１ｍＭの最終の濃縮物まで添加された。図９は、実施例２に記載された自己開裂ＤＮＡの生体外選択を示す。ａでは、（Ｉ）５’−ビオチニル化ＤＮＡのプールがストレプタビシンマトリックス上で固定化され、洗浄されて未結合のＤＮＡを除き、次に（ＩＩ）所望の反応条件下で溶離させて不活性なものから自己開裂ＤＮＡを分離する。（ＩＩＩ）選択されたＤＮＡがポリメラーゼ連鎮反応（ＰＣＲ）により増幅され、そして（ＩＶ）選択の一巡が、得られる二本鎖ＤＮＡを新しいマトリックス上に固定化し、次に化学的変性により非ビオチニル化鎮を除くことにより完了する。（Ｖ）プールは、非ビオチニル化プライマーによるＰＣＲ増幅によりさらなる分析に調製される。黒丸Ｂは、５’ビオチンを示す。ｂでは、選択の最初の一巡に使用される構成物は、限定された配列の３８及び１４ヌクレオチドが側面に位置する５０ランダム配列ヌクレオチド（Ｎ₅₀）のドメインを含む。次の一巡に使用されるＤＮＡは、プライマー１（ＳＥＱＩＤＮＯ：７；プライマー２はＳＥＱＩＤＮＯ：８である）により定義されるさらなる２６ヌクレオチドを有する。上線をつけた領域内で開裂するプレカーサは、増幅のために十分な５’プライマー結合部位を維持し、そして選択中好ましいことが予想される。ｃでは、最初のＤＮＡプール（Ｇ０）、並びに選択の７回後に単離されたブール（Ｇ７）の自己開裂活性である。５’³²ＰラベルプレカーサＤＮＡ（Ｐｒｅ）は、指示された種々の時間に関する、それぞれＣｕ²⁺及びアスコルベート１０μＭの存在（＋）又は不存在（− ）で、又はＣｕ²⁺及びアスコルベート（それぞれ−Ｃｕ²⁺及び−ａｓｃ）の不存在下でインキュベートされた。Ｍは５’³²Ｐラベルプライマー３でありＣ１ｖは開裂生成物を同定する。図１０は、実施例２に記載された個々のＧ８ＤＮＡの配列分析及び触媒的活性を示す（ＳＥＱＩＤＮＯ：９−３１）。ａでは、３４配列の列は、共通の配列（枠内のヌクレオチド）のセットを特徴とする分子の二つの主な群の存在を明らかにする。一度より多く遭遇したＤＮＡは、かっこ内の出現の数を示すことにより同定される。ｂでは、Ｇ８ＤＮＡからそしてＣｕ²⁺及びアスコルベート（それぞれ１０μＭ）の不存在（−）又は存在（＋）下の個々のものＣＡ１、ＣＡ２及びＣＡ３からの〜５ｎＭ５’³²ＰラベルプレカーサＤＮＡの自己開裂活性を示す。図１１は、実施例２に記載された、ＣＡ３（レーン２）、ＣＡ３の最適な変異型（レーン３）、及びＣＡ１（レーン４）の開裂部位分析を示す。ＤＮＡサイズマーカー（レーン１）は、指示されたように１０−１３ヌクレオチドの５’³²ＰラベルＤＮＡである。これらのマーカーのヌクレオチド配列は、プレカーサの５ ’末端一定領域に相当する。図１２（ａ）は、実施例２に記載されたＣＡ１（ＳＥＱＩＤＮＯ：３０）変異型の人工的な系統発生を示す。数字を付された配列は、野生型ＣＡ１であり、この配列とは異なる変異型のヌクレオチドは、その下に配列される。ダッシュは、欠失したヌクレオチドを示す。（ｂ）ＣＡ１の変異型（矢印、ＳＥＱＩＤＮＯ：３２）に関する部分的な二次配置モデル。数字を付されたヌクレオチドは、開始プールでランダム化された領域から由来する。星印は、一次開裂部位を示し、そしてバーは検出可能な開裂をしている領域を規定する。触媒的活性をまた必要としている３’プライマー結合部位内のヌクレオチドは、詳細にされていない。図１３は、実施例２に記載されたＣｕ²⁺−依存自己開裂ＤＮＡを示す。（ａ）Ｇ８ＤＮＡ、ＣＡ１(ＳＥＱＩＤＮＯ：３０)、ＣＡ３(ＳＥＱＩＤＮＯ：３１)及びＣＡ３変異型の最適な集団の開裂アッセイは、突然変異誘発そして５回のさらなる選択後に単離された。（ｂ）Ｃｕ²⁺により触媒的機能について最適化されている個々のＣＡ３変異型の配列。数字を付した配列は野生型ＣＡ３であり、そしてこの配列とは異なる変異型のヌクレオチドは、その下に配列される。ダッシュは、欠失したヌクレオチドを示す。矢印は、示されているようにＣＡ３変異型１−３を示す。星印及びバーは、それぞれ大きなそして小さいＣ１ｖ２開裂部位を示す。図１４は、実施例３に記載された最小自己開裂ＤＮＡの配列及び予想される二次配置を示す。（Ａ）生体外選択により単離された合成の６９ヌクレオチド自己開裂ＤＮＡの配列及び二次配置（ＳＥＱＩＤＮＯ：３３）。数字は、初めのＤＮＡプールに含まれた５０ヌクレオチドランダム配列のドメインに相当するヌクレオチドを示す（このドメインの１９塩基は欠失していることに注意）。保存されたヌクレオチド（１１−３１、枠内）は、この群のデオキシリボザイム（実施例２）を規定するのに既に使用されたものと同様である。（Ｂ）全活性を保持するクラスＩＩＤＮＡの４６−ヌクレオチドの尖端を切ったバージョン(ＳＥＱＩＤＮＯ：３４）。Ｉ及びＩＩは、配置上折り畳むプログラム「ＤＮＡｍ折り畳み」により予測され（Ｈｅｒｍａｎｎ，Ｔ及びＨｅｕｍａｎｎ，Ｈ．（１９９５）ＲＮＡ，１，１００９−１０１７；Ｈｅｒｓｃｈｌａｇ，Ｄ．＆Ｃｅｃｈ，Ｔ．Ｒ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４４，４０５−４０９）、以後の突然変異分析（図１５）により確認された４６マーのステム−ループ配置を明示する。デオキシリボザイムの保存されたコアは、ヌクレオチド２７−４６に及び、そしてＤＮＡ開裂の主要な部位は矢印により示される。囲まれたヌクレオチドは除かれて、生体分子コンプレックスを生成し、ヌクレオチド１−１８は、「基質」サブドメインを構成し、そしてヌクレオチド２２−４６は、「触媒」サブドメインを構成する。図１５は、実施例３に記載された突然変異分析によりステムＩ及びＩＩの確認を示す。（Ａ）痕跡量の５’³²Ｐラベル基質ＤＮＡ（ｓ１ｓ３）は、１５分間２３℃で１０μＭのＣｕＣｌ₂を含む反応緩衝液中で５μＭの相補的又は非相補的な触媒ＤＮＡ（ｃ１−ｃ３）とともにインキュベートされた。反応生成物は、変性２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分離され、そしてオートラジオグラフィーにより造影した。かっこは、基質開裂生成物の位置を示す。（Ｂ）ステムＩＩに塩基置換を有する変異型ＤＮＡの活性と比較した初めの４６マー配列の自己開裂活性。偏々の４６マー変異型（１００ｐＭ５’³²ＰラベルプレカーサＤＮＡ）は、上記のような反応条件下で示される時間にインキュベートされた。Ｃ１ｖ１及びＣ１ｖ２は、それぞれ一次及び二次の部位でのプレカーサＤＮＡ（Ｐｒｅ）切断で生成する５’−開裂フラグメントを示す。突然変異された位置は、図１４に示された数字を付す系を使用して規定される。図１６は、実施例３に記載された触媒ＤＮＡと基質との間の三重らせん相互反応を示す。改定された配置上の表示は、ステムＩＩの４個の塩基対と基質ＤＮＡの５’末端に近い４個の逐次ピリミシン残基の間の三重らせん相互反応（点）を表している。ｃ４及びｓ４は、ステムＩＩ内に塩基の対を保持し、そして塩基三重らせんの交互の配列を使用するｃ３(ＳＥＱＩＤＮＯ:３６)及びｓ３(ＳＥＱＩＤＮＯ：３５)の配列の変異型を表す。ＤＮＡ開裂アッセイは、図１５Ａに記載されたように行われた。かっこは、基質開裂生成物の位置を示す。図１７は、遺伝子工学で作られた二重らせん及び三重らせん認識要素によりデオキシリボザイムを使用してＤＮＡ基質の目標をきめた開裂を示す。（Ａ）三つの異なるデオキシリボザイム開裂部位を有する１０１ヌクレオチドＤＮＡは、オートメーション化化学合成により製造された（ＳＥＱＩＤＮＯ：３７）。それぞれの開裂部位は、同じリーダー配列（灰色の枠）次にユニーク配列のステムＩ認識要素からなる。台成触媒ＤＮＡｃ１、ｃ３及びｃ７間の特定の塩基相補性も示されている。触媒的コア配列及びそれぞれの部位に関するリーダー配列／ステムＩＩ相互反応は、同じである（挿入図）。星印は、ｃ１とｃ３に対するターゲットとの間の相互反応を行うＧ−Ｔゆらぎ対を示す。点は、塩基三重らせん相互反応を示す。（Ｂ）ｃ１、ｃ３及びｃ７による１０１マーＤＮＡの開裂は、指示されたように、５μＭの触媒ＤＮＡの不存在（−）又は存在（＋）の何れかで、２０分間２３℃で３０μＭのＣｕＣｌ₂を含む反応緩衝液中で痕跡量の５’³² Ｐラベル基質をインキュベートすることにより調べられた。反応生成物は、変性１０％ＰＡＧＥにより分離されそしてオートラジオグラフィーにより目で見られるようにされた。（Ｃ）同様に、ユニーク配列の８個の連続するピリミジンヌクレオチドを先にもつ３個の同じステムＩ対領域（灰色の枠）を含む１００ヌクレオチドＤＮＡを製造した（ＳＥＱＩＤＮＯ：３８）。同じステムＩ対要素（挿入図）及びユニーク配列の拡張ステムＩＩサブドメインを有する３個の合成デオキシリボザイム（ｃ９、ｃ１０、ｃ１１）を、ＤＮＡ三重らせん相互反応により３個の開裂部位のみを目標にするようにデザインされた。（Ｄ）ｃ９、ｃ１０及びｃ１１による１００マーＤＮＡの開裂は、上記の（Ｂ）に記述したように確立した。誤開裂は、オートラジオグラフィー中延長した露出によりそれぞれの三重らせんガイドデオキシリボザイムについて検出され（例えばｃ１１）、弱く形成された三重らせん相互反応がいくらかのＤＮＡ開裂活性を生じさせたことを指示する。図１８は、実施例４に記載したヒスチジン依存デオキシリボザイムの生体外選択を示す。（ａ）４×１０¹³ビオチン修飾ＤＮＡのプールを、ストレプタビシン由来カラムマトリックス上に固定化した。それぞれのＤＮＡは、単一の埋め込まれたＲＮＡ結合（ｒＡ）、並びに目標とするホスホジエステルの両方の５’及び３’に存在するヌクレオチドに相補性がある領域を側面に有する４０ヌクレオチドランダム配列ドメインを有する（対要素ｉ及びｉｉ：ＳＥＱＩＤＮＯ：３９及び４０）。これらの予め遺伝子工学操作された基質−結合相互反応は、単離する活性触媒の可能性を増大させることを予想させる（Ｂｒｅａｋｅｒ、Ｒ．Ｒ．及びＪｏｙｃｅ、Ｇ．Ｆ．（１９９５）Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．２，６６５− ６６０）。ヒスチジンにより緩衝された溶液とのインキュベーションによりＲＮＡ結合の開裂を触媒化するＤＮＡは、マトリックスから離脱し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅され、そして増幅生成物は、再び固定化されて選択サイクルを完成した（Ｆｒａｎｋ−Ｋａｍｅｎｅｔｓｋｉｉ，Ｍ．Ｄ．及びＭｉｒｋｉｎ，Ｓ．Ｍ．（１９９５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４，６５ −９５；Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ，３１９，６１８；Ｈｉｒａｏ，Ｈ．及びＥｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ａ．Ｄ．(１９９５)ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｌ．５，１０１７；Ｇｏｌｄ，Ｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１３５８１−１３５８４）。（ｂ）四つの群のデオキシリボザイムは、配列の比較により調べられた（ＳＥＱＩＤＮＯ：４１−４４）。それぞれの群内の変異型は、示された配列から２以下の突然変異により異なった。ＨＥＰＥＳ又はヒスチジン緩衝液の何れかが使用されるとき、触媒アッセイは活性（＋）であり、一方ヒスチジンが存在しないとき、クラスＩＩＤＮＡは活性ではない（−）。矢印は、開裂の部位を示し、数字は初めの４０ヌクレオチドランダム配列ドメインに相当する。図１９は、実施例４で論じられた変異型デオキシリボザイムの配列及び二次配置を示す。（ａ）クラスＩＩデオキシリボザイム（ＩＩ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５）又はＨＤ２デオキシリボザイム（ＨＤ２プール、ＳＥＱＩＤＮＯ：４６）に基づく突然変異を誘発させたプールの再選択後単離された個々のＤＮＡ。画かれているのは、再選択後調べられたそれぞれの変異型デオキシリボザイムに関するスクレオチド変化、並びに親ＤＮＡの突然変異を誘発されたコアに関するヌクレオチド配列である。デオキシリボザイムＨＤ１（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７）及びＨＤ２（ＳＥＱＩＤＮＯ：４８）は、それぞれ５０又は５ｍＭのヒスチジンによる再選択５回後に生じたＤＮＡプールから回収された。（ｂ）それぞれのデオキシリボザイムは、再組織化されて生体分子コンプレックスを生じ、それにより分離された基質分子は、酵素ドメインにより塩基相補性の二つの領域（ステムＩ及びＩＩ）により認識される。デオキシリボザイムヌクレオチドは、５’末端から連続して数えられる。図２０は、実施例４に記述されたデオキシリボザイムによる補因子認識を示す。（ａ）塩酸による前処理を受けたか（＋）又は受けていない（−）、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン及び種々のシペプチドによるＨＤ１の触媒的活性。ＨＤ１（１０μＭ）を痕跡量の５’³²Ｐラベル基質オリゴヌクレオチドの存在下インキュベートし（図１９ｂ）、そして指示されたように５０ｍＭのＬ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン及び種々のシペプチドとともに２．５時間２３℃でインキュベートした。反応生成物を、変性（８Ｍ尿素）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分析し、そしてオートラジオグラフィーにより造影した。Ｓ及びＰは、それぞれ基質及び生成物（５’−開裂フラグメント）のバンドを示す。（ｂ）デオキシリボザイム補因子の特異性をプローブするのに使用されたＬ−ヒスチジン及び類似体の化学配置。（ｃ）選択されたアミノ酸及びヒスチジン類似体によるＨＤ１（Ｅ１）触媒的活性に関する代表的なデオキシリボザイムアッセイ。反応及び分析物は、ａに記載したように行われた。図２１は、実施例４に記載されたデオキシリボザイム中のヒスチジンの包含を示すグラフである。（ａ）ヒスチジンによるデオキシリボザイムの濃度依存誘導。白い矢印及び灰色の矢印は、それぞれＨＤ１及びＨＤ２の選択中に維持されたヒスチジンの濃度を示す。（ｂ）ｐＨに対するデオキシリボザイム機能の依存性。主なプロットに表されたデータは、１ｍＭのヒスチジンを使用して生成され、一方挿入図で示されたデータは、５ｍＭのヒスチジンを使用して得られた。黒丸、白丸及び灰色の丸は、それぞれ、ＭＥＳ−、Ｔｒｉｓ−及びＣＡＰＳ−緩衝溶液を使用して集められた。発明を実施するための最良の形態生体外の選択により単離されている天然のリボザイム及び人工のリボザイム及びデオキシリボザイムは、アロステリックリボザイムとして操作することが知られていない。本発明は、低分子のエフェクターがリボザイム及びデオキシリボザイムのドメインに結合できそして触媒速度を調整するという発見に基づく。例えば、合理的なデザインの戦略を使用して、本明細書に記述された「ハンマーヘッド」自己開裂リボザイムは、異なるアプタマードメインにカップリングして、その速度が、アデノシン及びその５’−ホスホリル化誘導体により又はテオフィリンにより特異的にコントロールできるリボザイムを生成した。生体外選択及び合理的なデザイン戦略の混合を使用して、核酸センサー要素に基づく新規なバイオセンサーを構成することが可能である。これを達成するために、ユニークＲＮＡ又はＤＮＡアプタマーは、リボザイム又はデオキシリボザイムに結合しそれにより特定の化学的エフェクター（例えば関心のある診断薬の分子）、物理的シグナル及びこれらの組合せにより影響される触媒速度を有する新しい酵素を生成する。本発明の実施では、化学的エフェクター、物理的シグナル又はこれらの組合せによりポリヌクレオチトの機能又は配置を修飾するアロステリック性を示す精製された機能性ＤＮＡポリヌクレオチドが構成される。或る態様では、ＤＮＡは、酵素の触媒作用の速度を修飾するアロステリック性を示す酵素である。本発明は、さらに、化学的エフェクター、物理的シグナル又はこれらの組合せによりコントロールできる速度をもつ触媒的性質を有する精製された機能性ＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチドを提供する。或る態様では、ポリヌクレオチドは、約１０− 約１００の塩基を含み、他のものはそれより遥かに多い。すべての元素、イオン及び／又は分子は、本発明の生反応性アロステリックポリヌクレオチドとの相互反応用の化学的エフェクターとして使用できる。その例は、有機化合物、並びに有機化合物及び金属イオンの混合物を含むが、これらに限定されない。化学的エフェクターは、アミノ酸、アミノ酸誘導体、ペプチド（ペプチドホルモンを含む）、ポリペプチド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ステロイド、砂糖又は他の炭水化物、医薬品及びこれらの任意のものの混合物であろう。多くの態様では、化学的エフェクターは、微生物又は細胞の代謝物又は他の生物学的サンプルである。液状の生物学的サンプル、例えば血液、血清、尿、精液、涙、医学的或いは獣医学的な診断又は治療の目的で患者から採取された生検ホモシネートに見いだされる成分は、或る態様では特に好ましい化学的エフェクターである。工業的及び環境的な応用では、エフェクターは、殺虫剤、殺草剤、食品トキシン、製品成分、反応物及び混入物、医薬などである。本発明の生反応性ポリヌクレオチドは、別の態様で物理的シグナル、又は物理的シグナル及び化学的エフェクターの組合せによりポリマーの機能又は配置を修飾するアロステリック性を示す。物理的シグナルは、照射（特に光線）、温度変化、運動、サンプルの物理的な立体配座の変化、並びにこれらの組合せを含むが、これらに限定されない。多くの態様は、図１に説明されているそれのような固体支持体に結合した、又は溶液中、又は懸濁物中のバイオセンサーとして、本発明の生反応性のアロステリックポリヌクレオナトを用いる。バイオセンサー単独又はその成分として、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドとの接触により、化合物又はその濃縮物及び／又は物理的シグナルの存在又は不存在を検出するのに使用される。これらの方法の代表的な実施では、サンプルは、アロステリック相互反応により生ずるポリヌクレオチドの修飾又は配置を観察にするのに十分な条件下、或る時間感知要素としてポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドからなるバイオセンサーとともにインキュベートされる。これらは、当業者に周知の任意の方法、例えばポリヌクレオチドの自己開裂の測定及び／又は観察、放射性、蛍光又は発色の標識の結合、モノクロール又は融合ファージ抗体の結合、又は成分の濃度、分光測光又は電気的性質を使用してモニターされる。電位差電極、ＦＥＴ、種々のプローブ、レドックスメディエータなどを使用する最近のバイオセンサー技術が、ポリヌクレオチドの機能又は配置における変化の測定のために、本発明の新しいポリヌクレオチドバイオセンサーとともに使用するように適合できることは、本発明の利点である。以下の実施例に記述された最初の研究は、特定の補因子とともに機能するか、又は特定の低分子化学的エフェクター、物理的シグナル又はこれらの組合せにより調節できる新規なＲＮＡ−及びＤＮＡ−開裂酵素の生成及び特徴の発見を含む。同様なセンサー及び生体触媒的性質を有する追加の分子が同様な手段により生成でき、それによりこれら分子の応用を拡大することは明らかである。ＡＴＰに関する原型バイオセンサーの生成及び特徴の発見は、本明細書に示される。一つの構成物（Ｈ３）は、特に、ＡＴＰ濃度依存触媒活性を示し、このリボザイムがテスト溶液中のこのリガンドの濃度を知らせるのに使用することに適合できることを示す。特に、Ｈ３ＲＮＡは、１ミクロモルより低いＡＴＰの濃度で活性的に自己開裂するが、１ミリモルのＡＴＰの存在下で最大に阻害（１７０倍の速度低下）する（図３ｂ）。これらの二つの極端の間に及ぶＡＴＰの濃度のリボザイムの触媒速度は、ＡＴＰ濃度を反映し、そして未知の濃度の値を決めるのに使用できる。このアロステリックリボザイムの受容体部分は完全に人工（生体外選択により生成）であり（Ｓａｓｓａｎｆａｒ，Ｍ．及びＳｚｏｓｔａｋ、Ｊ．Ｗ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ、３６４、５５０−５５３並びにＳｃｉｅｎｃｅ、２６３、１４２５−１４２９）、さらに他のリガンドに特異的な他の人工又は天然の受容体ドメインと交換できることに注目することは重要である。新しいしかも非常に特異的な受容体は、簡単なクロマトグラフィー及び核酸増幅技術（Ｂｒｅａｋｅｒ、Ｒ．Ｒ．（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７、４４２−４４８、そして実施例に説明）を使用して、生体外選択又は「ＳＥＬＥＸ」（Ｂｒｅａｋｅｒ、Ｒ．Ｒ．（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７、４４２−４４８；Ｂｒｅａｋｅｒ、Ｒ．Ｒ．及びＪｏｙｃｅ、Ｇ．Ｆ．（１９９４）Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．１、２２３−２２９）により製造できる。このやり方で製造されたＲＮＡ及びＤＮＡ「アプタマー」は、小さい有機化合物、金属イオンそして大きな蛋白について有効なしかも選択的な受容体として働くことができる。ＲＮＡ受容体機能の劇的な表示では、テオフィリンに関する一連のＲＮＡアプタマーが単離され（Ｓａｓｓａｎｆａｒ，Ｍ．及びＳｚｏｓｔａｋ、Ｊ．Ｗ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ、３６４、５５０−５５３並びにＳｃｉｅｎｃｅ、２６３、１４２５−１４２９）、それはカフェインに対して〜１００００倍の差別を示し、それは単一のメチル基によりテオフィリンから異なる。医学の診断、環境の分析などに使用される新規なバイオセンサー又はコントロール可能な治療用リボザイムすら生成する多数の化合物に特異的な新しい群のアプタマーを単離できる。以下の実施例では、簡単なデザイン戦略は、その速度が小さいエフェクター分子によりコントロールできる結合できるアプタマー−リボザイムコンプレックスを生成するのに使用されている。予備的な研究は、テオフィリン依存リボザイムが合理的なデザインにより生成できることを既に示している。例えば、テオフィリンは、喘息の治療用の重要な医薬であり、その治療的効果は非常に濃度に依存する。テオフィリンの濃度に関するバイオセンサーは、顕著な価稙のあるものであろう。このアロステリックリボザイム及び他のモデルリボザイムのさらなる検討は、ＲＮＡ及びＤＮＡに基づく追加のセンサー分子のデザインに関する生化学及び構造上の基礎を築くのに助けになるだろう。ＤＮＡが酵素として機能する発見（Ｂｒｅａｋｅｒ、Ｒ．Ｒ．及びＪｏｙｃｅ、Ｇ．Ｆ．（１９９４）Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．１、２２３−２２９）は、ＲＮＡ又は蛋白の何れかより化学的にさらに安定である醇素の遺伝子工学による作成を実際的なものにしたのは、本発明の利点である。ＤＮＡホスホエステルの加水分解的破壊の半減期は、〜２億年であり、ＤＮＡを３種の主な生体ポリマーの中で最も安定にする。ＤＮＡのこれらの特徴は、ＤＮＡがまた大きな特異性及び親和性で種々のリガンドと結合するようにできる事実とともに、このポリマーを、新しい工業的な酵素の生成のための魅力的な媒体とし、そして診断用のセンサー要素とする。また、自然のヌクレアーゼによる劣化に抵抗性のある修飾されたＤＮＡが製造され、ＤＮＡ類似体を生物学的溶液中で使用する魅力のあるポーマットを作る。以下に説明されるように、ＤＮＡが金属イオン依存のやり方で自己開裂するように作ることができることが見いだされた。銅の存在下それら自体の開裂を触媒化するこれらのＤＮＡの生成は、溶液中の遊離の銅の濃度の感受性のあるリポーターとして使用できる。以下に示される他の例は、ヒスチジンに反応性のあるポリヌクレオチドである。これらの触媒のさらなる遺伝子工学操作は、広い範囲のリガンドを検出するのに使用できるか、又は他の反応条件例えば塩の濃度、ｐＨ、温度などを教えるアロステリックＤＮＡを生成するだろう。さらに、これらのＤＮＡは、アンペア測定Ｈ₂Ｏ₂プローブにより、又は銅のレドックス状態の分光測光分析によりモニターするのに伝導性がある。明らかに、ＲＮＡ及びＤＮＡのセンサーの両者に関するシグナルの読み取りの多様性は、拡大できる。本発明の他の特徴は、バイオセンサーとしてのポリヌクレオチドの使用が、多数の商業的及び工業的なプロセスで蛋白に基づく酵素より利点があることである。蛋白の安定性、供給、基質の特異性及び硬直した反応条件などの問題は、天然の生体触媒の実際的な実施をすべて制限している。上述したように、ＤＮＡは遺伝子工学操作されて、限定された反応条件下で触媒として操作できる。その上、ＤＮＡから作られた触媒は、遥かに安定であることが予想され、そしてオートメーションによるオリゴヌクレオチド合成により容易に製造できる。さらに、ＤＮＡ触媒は、それらの能力を既に選択されて、固体支持体上で機能し、そして固定化されたとき、それらの活性を保持することが予想される。本発明は、さらに、触媒的プロセスで使用される固体支持体に結合した生反応性アロステリックポリヌクレオチドの使用を包含している。新規なＤＮＡ酵素の固定化は、生理学的及び非生理学的な条件の両者で、連続流反応器中の化学的変換の有効な触媒作用のために、酵素被覆表面の新しい形を提供するだろう。新しいＤＮＡ酵素の単離は、使用者が規定した反応条件下で特定の化学的変換を有効に触媒化するようにそれぞれ目的に合うようにされる。種々の触媒的プロセスに使用できる酵素被覆表面を生成する触媒的ＤＮＡの機能は、本明細書に記述されそして図４に画かれる。ＤＮＡホスホジエステルの結合の高い安定性のために、これらの表面は、蛋白−又はＲＮＡ−に基づく酵素により被覆されている同様な表面より遥かに長く活性のままであると予想される。種々の異なるクロマトグラフィー樹脂及びカップリング法がＤＮＡ酵素を固定化するのに使用できる。例えば、モデル実験を行うためのビオチンに対するストレプタビシンの強い結合親和性を利用する簡単な非共有結合法は、図３に画かれている。他の態様では、ＤＮＡ酵素は、マトリックスへの共有結合によりカラム支持体にカップリングでき、それにより長い寿命の触媒支持体を生成する。温度、反応条件、基質及び補因子の濃度及び流速を含む系の種々のパラメータは、最適な生成物の収量を得るように調節できる。事実、これらのパラメータは、固定化ＤＮＡ酵素により発揮される動力学的特徴に基づいて予めセットできる。しかし、実施には、生成物の形成は、モニターされ、そしてクロマトグラフィーのパラメータは、系を最適にするためにそれに従って調節されるだろう。固定化ＤＮＡ酵素を使用するＲＮＡ基質の大規模な処理用のプロトタイプの系は、本明細書に記述される。生成物の収率は、³²Ｐラベル基質の分析により決定され、そして生成物の分子は溶離サンプルのポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定された。反応性クロマトグラフィーの表面のテスト中の固定化酵素のマルチプルターンオーバーは、観察された（図４）。新しい目的に合ったＤＮＡ生体触媒の生体外選択及び遺伝子工学操作は、実際的に使用されしかも従来なかった安定性及び触媒の可変性を有する触媒的表面を生成するだろう。実施例以下の実施例は、本発明をさらに説明するために提供され、決してそれを限定するものｔ考えてはならない。実施例１上述のように、天然のリボザイム（総説として、Ｃｅｃｈ，Ｃ．Ｒ．（１９９０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９，５４３；Ｓｙｍｏｎｓ，Ｒ．Ｈ．（１９９２）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１、６４１；Ａｌｔｍａｎ，Ｓ．Ｋｉｒｓｅｂｏｍ，Ｌ．及びＴａｌｂｏｔ，Ｓ．（１９９５）Ｉｎ：ｔＲＮＡ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄＦｕｎｃｔｉｏｎ，Ｄ．Ｓｏｌｌ及びＵ．ＲａｊＢｈａｎｄａｒｙ編、ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｔｏｎ，ＤＣ，ｐｐ６７−７８；ＭｉｃｈｅｌＦ.及びＦｅｒａｔ，Ｊ.−Ｌ.（１９９５）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈeｍ．６４，４３５（１９９５））並びに生体外選択により単離されたリボザイムは、アロステリック酵素として操作することは知られていない（Ｂｒｅａｋｅｒ，Ｒ．Ｒ．及びＪｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．（１９９４）ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈ．１２、２６８）。この実施例はアロステリックリボザイムを説明する。簡単な合理的なデザインの概念を使用して、ハンマーヘッド自己開裂リボザイムを有するアプタマードメイン（Ｆｏｒｓｔｅｒ，Ａ．Ｃ．及びＳｙｍｏｎｓ、Ｒ．Ｈ．（１９８７）Ｃｅｌｌ、４９、２１１）をモジュラーのやり方で結合させて、低分子エフェクターによる正及び負の両方のアロステリックコントロールを受ける一連の触媒的ＲＮＡを生成した。最初の努力は、Ｓａｓｓａｎｆａｒ及びＳｚｏｓｔａｋ（（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ、３６４、５５０−５５３並びにＳｃｉｅｎｃｅ、２６３、１４２５−１４２９）により記述された「ＡＴＰ−４０−１」と呼ばれる４０−ヌクレオチドＡＴＰ結合アプタマーに集中した。この主皿は、アデノシン５’トリホスフェート（ＡＴＰ；Ｋ_D〜１０μＭ）及びアデノシンに対する特定の親和性を示すが、２’−デオキシアデノシン５’トリホスフェート（ｄＡＴＰ）を含む種々のＡＴＰ類似体又は残りの３種の天然のリボヌクレオシドトリホスフェートに対して検出できる親和性を有しない。アプタマーは、また、化学的プローブ研究により測定されるような、リガンド結合による顕著な立体配座の変化を行う。これらの特徴は、ＡＴＰ依存アロステリックコントロールにかけられるだろう結合したアプタマー−リボザイム分子を生成するように利用された。最初の統合したデザインであるＨ３は、Ｈ１により具現されるさもなければ変化しない二分子ハンマーヘッドリボザイム中に二三の主な特徴を挿入する（図５）。それぞれのリボザイム及び結合したアプタマー−リボザイムは、対応するアンチセンスＤＮＡテンプレート及びプライマー５’ＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＧＡＡＡＧＣＣＧＧＧＣＧＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９）及び５’ＧＡＧＣＴＣＴＣＧＣＴＡＣＣＧＴ（ＳＥＱＩＮＮＯ：５０）を使用してポリメラーゼ連鎖反応により生成した二本鎖ＤＮＡテンプレートから生体外転写により製造した。前者のプライマーは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモータをエンコードしている。５０μＬの転写反応は、３７℃で２時間、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５、２３℃）、１５ｍＭのＭｇＣｌ₂、５ｍＭのジチオスレイトール、２ｍＭのスペルミジン、２ｍＭのそれぞれＮＴＰ、２０μＣｉ（α−³²Ｐ）−ＵＴＰ及び６００単位のＴ７ＲＮＡポリメラーゼの存在下３０ｐモルのテンプレートＤＮＡをインキュベートすることにより行った。ＲＮＡ生成物を、ポリアクリルアミドケル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分離し、オートラジオグラフィーにより目で見えるようにし、リボザイムを、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５、２３℃）、２００ｍＭのＮａＣｌ及び１ｍＭのＥＤＴＡ中に粉砕浸漬することにより削り取ったゲルスライスから回収し、そして液体シンチレーションカウンティングにより定量した。ＲＮＡ基質は、標準の固相法により製造し（ＫｅｃｋＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＲｅｓｏｕｒｃｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＹａｌｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、２’−ＴＢＤＭＳ基はトリエチルアミントリヒドロフルオライド（ＡＵ₂₆₀粗製ＲＮＡ当たり１５μＬ）による２４時間処理により除いた。基質ＲＮＡは、ＰＡＧＥにより精製し、粉砕浸漬により単離し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ及び（γ−³²Ｐ）− ＡＴＰにより（５’−³²Ｐ）ラベルし、そしてＰＡＧＥにより再精製した。Ｈ１による徹底的なインキュベーション後でも、約４５％のＲＮＡが未開裂のままである。動力学的計算は、それに従って調節された。外面的には、５’及び３’端末での配列は、さらなる研究のための逆転写−ポリメラーゼ連鎮反応方法により増幅されやすい構成物を作るように追加される。Ｈ２（図５）として独立して調べると、これらの変化は、Ｈ１に比べてｋ_obsにおける６倍の低下を生じさせる（速度は表１に要約される）。５’−及び３’− 末端のフランキング配列に加えて、Ｈ３は、ＡＴＰアプタマーを有する修飾されたハンマーヘッドステムＩＩを含む。ここにアプタマーを配置する決定は、主にステムＩＩの変化がハンマーヘッドリボザイムの触媒速度に大きな影響を有するために、なされた（Ｌｏｎｇ，Ｄ．Ｍ．及びＵｈｌｅｎｂｅｃｋ，Ｏ．Ｃ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ９１，６９７７及びその中の参考文献；Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．及びＥｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０、６９９１）。ＡＴＰの不存在下、この改変は、Ｈ１に比べて速度においてさらなる２倍の低下を生じさせる。Ｈ３のＲＮＡ−開裂活性は、１ｍＭのＡＴＰとインキュベートされたとき、顕著に低下する（図６Ａ）。対照的に、ＡＴＰは、Ｈ１又はＨ２の開裂活性に影響を与えない。その上。阻害はアデノシンの存在下で観察されるが、ｄＡＴＰ又は他のリボヌクレオシドトリホスフェートではそうではない（図２Ｂ）。この阻害は、非常に特異的であり、そしてアプタマーの観察された結合特異性と一致する（Ｓａｓｓａｎｆａｒ及びＳｚｏｓｔａｋ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ、３６４、５５０−５５３並びにＳｃｉｅｎｃｅ、２６３、１４２５−１４２９）。ＡＴＰによるＨ３の阻害の機構を検討するために、２種の追加の統合構成物( 図５)をデザインした。Ｈ４はＨ３と同じであるが、アプタマードメインによるＡＴＰ結合を排除することを予想するＧ対Ｃ点突然変異を有する(Ｓａｓｓａｎｆａｒ及びＳｚｏｓｔａｋ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ、３６４、５５０−５５３並びにＳｃｉｅｎｃｅ、２６３、１４２５−１４２９)。予想されるように、この突然変異は、ＡＴＰの阻害効果を排除する。アロステリック効果は、アプタマー及びハンマーヘッドドメインの付近によるであろう。特に、ハンマーヘッドの構造上のモデルは、ステムＩ及びＩＩに関する平行な配向を示す（Ｐｌｅｙ、Ｈ．Ｗ．、Ｋ．Ｍ．Ｆｌａｈｅｒｔｙ、Ｄ．Ｂ，Ｍｃｋａｙ、Ｎａｔｕｒｅ，３７２，６８（１９９４）；Ｔ．Ｔｕｓｃｈ１，Ｃ．Ｇｏｈｌｋｅ，Ｔ．Ｍ．Ｊｏｖｉｎ，Ｅ．Ｗｅｓｔｈｏｆ，Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６，７８５（１９９４）；Ｓ．Ｔ．Ｓｉｇｕｒｄｓｓｏｎ及びＦ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、ＴｒｅｎｄＢｉｏｔｅｃｈ．ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈ．１３，２８６（１９９５）；Ｗ．Ｇ．Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｔ．Ｆｉｎｃｈ，Ａ．Ｋｌｕｇ，Ｃｅｌｌ，８１，９９１（１９９５））。非コンプレックス状態では、アプタマードメインは、触媒作用を障害なしに進ませる単一又はセットの立体配座状態に存在するようである。しかし、ＡＴＰとコンプレックスを形成するとき、このドメインは、ステムＩ及びＩＩに追加する構造間に立体干渉を恐らく生じさせる立体配座の変化を行う。Ｈ５は、ヘリックスＩＩに追加の３個の塩基対を有して、ドメインをさらに分離し、そしてＡＴＰにより阻害されない。これは、立体配座の変化、並びにアプタマー及びリボザイムドメインの相互に排他的な形成を含むアロステリック阻害メカニズムと一致する。Ｈ３によるＡＴＰの阻害効果は、動力学的分析により確認かつ定量されている。リボザイム活性アッセイは、痕跡量の基質、並びにＫ_mを顕著に超える過剰のリボザイム濃度で行われた。同様なアッセイ条件下で２００、４００及び８００ｎＭのリボザイム濃度でＨ１及びＨ２について得られた繰り返しｋ_obs値は、２倍より低く異なり、それぞれの構成物について、ｋ_obs値は、Ｖ_maxに近づくことを示唆している。反応は、また、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５、２３ ℃）及び２０ｍＭのＭｇＣｌ₂を含み、そしてそれぞれの実験について示されたインキュベーション時間及びエフェクター分子の濃度で、２３℃でインキュベートされた。リボザイム及び基質は、反応緩衝液中でまた存在するときはエフェクター分子とともに、〜１０分間別々に予備インキュベートされ、そして反応は予備インキュベートされた混合物を組み合わせることにより開始された。Ｈ８によるアッセイは、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３、２３℃）、５００ｍＭのＮａＣｌ及び１０ｍＭのＭｇＣｌ₂で行われた。触媒速度（ｋ_obs）は、開裂した基質のフラクション対時間をプロットしそしてデータへの最小二乗の適合度により反応の最初の速度を表示する曲線の傾きを確立することにより得られた。動力学的アッセイは、ＰＡＧＥにより分析され、そしてＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓＰｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒで視覚化され分析された。より短いエフェクター分子予備インキュベーションが使用されるとき、触媒的バーストがさらに顕著であり、遭遇したとき、バースト後の傾きは、計算に使用された。実験の繰り返しは、５０％より低く異なるｋ_obs値を日常的に与え、そして報告された値は、二つ以上の実験の平均である。当量速度は、重複したリボザイム及び基質の調製物について得られた。Ｈ３リボザイムは、ＡＴＰの異なる濃度で（図７Ａ）、そのリガンドに関するアプタマーのＫ_Dを厳密に予測する曲線で、短いバースト相後異なる開裂速度を示す。ｋ_obsのプロット対ＡＴＰ又はｄＡＴＰ濃度（図７Ｂ）は、Ｈ３が、ＡＴＰの濃度の増大とともに、触媒速度の〜１７０倍の低下を行うが、ｄＡＴＰでは阻害されないことを立証する。ＡＴＰがリボザイム機能の正のエフェクターとして機能するようにされるかどうかは、Ｈ６次にＨ７（図８Ａ）をデザインすることにより研究され、その両者は、ＡＴＰ依存アロステリック誘導を示すことが分かった。Ｈ６は、Ｈ５に類似しているが、但しステムＩＩの４個のＷａｔｓｏｎ／Ｃｒｉｃｋ塩基対はより安定ではないＧ、Ｕミスマッチにより置換される。これらの変化は、ステムＩＩを顕著に弱くすることが予想され、減少したリボザイム活性を生じさせる。アプタマードメイン内にステムＩＩを開始するＧ−Ｃ対がＡＴＰの不存在下対にならないが、ＡＴＰがコンブレックスになるとき安定な対を形成し（Ｓａｓｓａｎｆａｒ及びＳｚｏｓｔａｋ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ、３６４、５５０−５５３並びにＳｃｉｅｎｃｅ、２６３、１４２５−１４２９）、それによりステムの全体の安定性を増大させそして触媒活性を誘導するという事実を利用することを目的とした。事実、Ｈ５と比べてＨ６による触媒活性の〜５倍の低下が見いだされ、リボザイム機能は、特異的でありＡＴＰにより十分に回収された。Ｈ６の触媒速度も、反応中に添加されるとき、ＡＴＰにより増強される（図８Ｂ）。蛋白のアロステリックエフェクターと同じように、エフェクター分子とリボザイムの基質との間に真の類似性は存在しない。基質及びエフェクターは、異なる結合部位を占め、しかもエフェクター結合に対する立体配座の変化は、近くの触媒ドメインに機能的な変化をもたらす。リボザイムのアロステリックコントロールの特異性は、複雑であり、そしてこの実施例では、リボザイム活性は、エフェクター分子中の単一の酸素原子の差に敏感である。同様なモデルの研究により、コントロールされた触媒活性を有するリボザイムを生成するのに使用できる戦略的アプローチ及びデザインの選択肢の好みが形成できる。本発明で使用される原則（二次結合部位、立体配座の変化、立体効果及び構造上の安定）、並びに他のものは、一般に適用可能であり、そして追加のアロステリックリボザイム、又はアロステリックデオキシリボザイムですらデザインするのに使用できる（Ｓｅｒｒａ，Ｍ．Ｊ．及びＴｕｒｎｅｒ，Ｄ．Ｈ．（１９９５）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．２５９，２４２）。例えば、Ｊｅｎｉｓｏｎら（Ｊｅｎｉｓｏｎ，Ｒ．Ｄ．Ｓ．Ｃ．Ｇｉｌｌ，Ａ．Ｐａｒｄｉ，Ｂ．Ｐｏｌｉｓｋｙ（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６３，１４２５）により記述されているテオフィリンアプタマーを含むアロステリックハンマーヘッド（Ｈ８、図８Ａ）をデザインした。この構成物は、テオフィリンが１００μＭの最終の濃度で添加されるとき、リボザイム活性を最低３倍低下させる（０．００６ｖ．０．００２分^-1のｋ_obs）。さらに、Ｓａｒｇｕｅｉｌら（Ｊｅｎｉｓｏｎ，Ｒ．Ｄ．Ｓ．Ｃ．Ｇｉｌｌ，Ａ．Ｐａｒｄｉ，Ｂ．Ｐｏｌｉｓｋｙ（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６３，１４２５）は、「ヘアピン」自己開裂リボザイムについて同様な研究を示唆している。実施例２ランダム配列オリゴヌクレオチドのプールから自己開裂ＤＮＡの二つの異なる群の生体外選択による単離は、本実施例で報告される。「クラスＩ」からの個々の触媒は、Ｃｕ⁺²及びアスコルベートの両者を必要として、酸化的自己開裂を媒介する。クラスＩＩからの個々の触媒は、単一の補因子として銅と操作することが分かった。生体外選択によるクラスＩＩの個々のもののさらなる最適化は、新しい触媒的ＤＮＡを生じ、それは、ＤＮＡ開裂の触媒化されていない速度に比べて１００万倍を超える増加でＣｕ⁺²依存自己開裂を助ける。ＤＮＡは、加水分解より、脱プリン／β−脱離によるか又は酸化的メカニズムにより切断されやすい（Ｌｉｎｄａｈ１，Ｔ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ，３６２，７０９−７１５）。人工的なＤＮＡ開裂ＤＮＡ酵素を広範囲な調査を始めるために、レドックス依存メカニズムによる自己開裂を助けるＤＮＡがスクリードングされた。還元剤の存在下のレドックス活性金属（例えばＦｅ³⁺、Ｃｕ²⁺）のキレートによるＤＮＡの開裂が、Ｈ₂Ｏ₂の還元（即ちＦｅｎｔｏｎ反応）により生成されるヒドロキシル基の反応性によるＤＮＡホスホエステル加水分解へのさらに容易な代替物であると予想される。その上、種々の天然及び人工の「化学的ヌクレアーゼ」は、同様な開裂メカニズムに依存する（Ｓｉｇｍａｎ，Ｄ．Ｓ．＆Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ｂ．（１９９０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９，２０７−２３６；Ｓｉｇｍａｎ，Ｄ．Ｓ．Ｍａｚｕｍｄｅｒ，Ａ．＆Ｐｅｒｒｉｎ，Ｄ．Ｍ．（１９９３）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９３，２２９５−２３１６）。〜２×１０¹³ランダム配列ＤＮＡのプールから初めて（図１３ｂ）、８回の選択を、ＣｕＣｌ₂及びアスコルベートの存在下自己開裂するＤＮＡについて行った（Ｂｒｅａｋｅｒ、Ｒ．Ｒ．及びＪｏｙｃｅ、Ｇ．Ｆ．（１９９４）Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．１、２２３−２２９；Ｃｕｅｎｏｕｄ，Ｂ．及びＳｚｏｓｔａｋ、Ｊ．Ｗ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ、３７５、６１１−６１４）（以下の材料及び方法のセクション参照）。７回後単離されたＤＮＡのプール（Ｇ７ＤＮＡ）は、Ｃｕ⁺²及びアスコルベートの両者を要する激しい自己開裂活性を示す（図１３ｃ）。痕跡量の非特異性ＤＮＡ開裂は、１００μＭ以上のＣｕ⁺²及びアスコルベート濃度で検出できるが、しかしランダム配列（Ｇ０）ＤＮＡの開裂は、最終の選択条件（１０μＭのそれぞれの補因子）下で検出されなかった。逆に、Ｇ７ＤＮＡのインキュベーションは、多数の異なるＤＮＡ開裂生成物を生じ、プールがユニークな部位で自己開裂を促進するＤＮＡの複数の群を含むことを示唆している。Ｇ８からの個々のＤＮＡの配列分析は、配列の類似性に基づいて二つの群（図１０ａ）に区別される異なるセットの触媒を明らかにする。代表的なＤＮＡ（ＣＡ１、ＣＡ２及びＣＡ３）からの開裂アッセイは、二つの異なるクラスの触媒が単離されていることを確かにする（図１０ｂ）。選択された触媒に関する開裂部位が初めの構成物の初めの２３ヌクレオチド内にもっぱら存在するだろうことが予想された（図１３ｂ）。この領域の開裂は、固体マトリックスからの分子の脱離を生じさせ、開裂された分子は、ＰＣＲによる増幅を行うのに十分な初めのプライマー結合部位を維持するだろう。分子中のどこかの開裂は、５’−末端プライマー結合部位を失ったＤＮＡフラグメントを放出し、そしてＰＣＲ中顕著な増幅が不可能であろう。驚くべきことに、ＣＡ１がこの予想された領域内のＤＮＡ開裂を促進するが、ＣＡ２及びＣＡ３のそれぞれは、予想されるように５’末端に近い一次領域（Ｃ１ｖ１）で開裂し、そして遠位の領域（Ｃ１ｖ２）で、それは、初めのＤＮＡプール中でランダムなドメイン内に存在する。ＣＡ３のＣ１ｖ１／Ｃ１ｖ２生成物の比は、ほぼ２：１である。ＣＡ３の二つの部位間の開裂生成物の分布は、選択プロセス中顕著な不利をもたらすことが予想される。約３５％のＣＡ３様の分子は、分子の中心内で開裂し（そしてそれゆえ恐らく増幅されない）、一方わずか約６５％が予想される部位で開裂し、そしてＰＣＲによる増幅を経て選択の次の回で永続できる。逆に、プライマー結合領域でもっぱら開裂する触媒の１００％は増幅でき、クラスＩからの個々のものに明らかな選択的な利点を与える。しかし、ＣＡ３様触媒は、生体外選択の追加の回で存続しそして実際に世代１３により集団を支配するようになることが分かった。これらの触媒の成功は、ＣＡ１及びＣＡ３の触媒速度を謂べることにより、部分的に理解できる。０．０１８分^-1という開裂速度（ｋ_obs）は、最終の選択条件下でＣＡ１について得られ、一方ＣＡ３のＣ１ｖ１での開裂は、０．１４分^-1というｋ_obsで生ずる。誤開裂の高い頻度にかかわらず、クラスＩＩ触媒は、正確な部位でさらに急速に開裂し、ＣＡ３様触媒にクラスＩからの触媒よりも明確な選択的利点を与える。両方のクラスの開裂部位は、５’³²Ｐラベル自己開裂生成物のゲル移勤性分析によりさらに位置を求められる（図１１）。ＣＡ１は、９−ヌクレオチドフラグメントに相当するゲル移動性を有する主な開裂生成物を生成し、そしてまた３− ８ヌクレオチドのＤＮＡに相当する一連の少数の生成物を生ずる。ＣＡ１について観察される開裂部位の不規則性は、拡散可能なヒドロキシル基を含む酸化的開裂メカニズムと一致する。代表的に、酸化的開裂剤による核酸の開裂は、ある範囲のヌクレオチトで生じ、一次開裂部位は、低い頻度で開裂する部位をそれぞれの側面に存在させる。ＤＮＡ開裂の頻度が、目標のホスホエステル結合及びヒドロキシル基の世代部位を分離する距離に逆比例することが示唆されている（Ｈｅｒｍａｎｎ，Ｔ．及びＨｅｕｍａｎｎ，Ｈ．（１９９５）ＲＮＡ，１，１００９ −１０１７）。しかし、ＣＡ１により形成される開裂生成物の分布は、主な開裂部位の５’側面に直ぐに位置するヌクレオチドでのみ局在化したＤＮＡ開裂を生じさせるユニーク活性部位を指示する。回様に、ＣＡ３のＣ１ｖ１は、移動性で９−１４ヌクレオチドに及ぶ一連の生成物からなり、主な生成物は、１２ヌクレオチドＤＮＡに相当する（図１１）。Ｃ１ｖ２でのＤＮＡ切断で形成される主な生成物は、７０ヌクレオチドに相当し、少数の生成物は６６−６９ヌクレオチドのＤＮＡに相当する。Ｃ１ｖ２での開裂の最も頻繁な部位は、初めのランダム配列ドメインの位置３４（Ｇ）に近く位置する。ＤＮＡの酸化的開裂は、種々の経路により進むことができ、それぞれは異なる開裂生成物末端を生成する（Ｊｏｓｈｉ，Ｒ．Ｒ．Ｌｉｋｈｉｔｅ，Ｓ．Ｍ．Ｋｕｍａｒ，Ｒ．Ｋ．及びＧａｎｅｓｈ，Ｋ．Ｎ．（１９９４）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１１９９，２８５−２９２）。それゆえ、これらの開裂部位の立体配座は、反応生成物の化学的構造のさらに詳細な分析を行うことにより進行させねばならない。ＣＡ１の二次構造を考察するために、比較的配列分析（Ｗｌａｄｋｏｗｓｋｉ，Ｂ．Ｄ．Ｋｒａｕｓｓ，Ｍ．＆Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｗ．Ｊ．（１９９５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７，１０５３７−１０５４５）に関する機能性ＣＡ１配列変異型の人工的な系統発生（Ｂｅｒｚａｌ−ｈａｒｒａｎｚ，Ａ．Ｊｏｓｅｐｈ，Ａ及びＢｕｒｋｅ，Ｊ．Ａ．（１９９２）ＧｅｎｅｓａｎｄＤｅｖ．６，１２９−１３４）を行った。初めのランダム配列ドメインに相当する５０ヌクレオチドは、それぞれの野生型のヌクレオチドが０．８５の確率で生じそしてそれぞれの残りのヌクレオチドが０．０５の確率で生ずるように、合成ＤＮＡプールを製造することにより突然変異された。残ったプールを、それぞれ１０μ ＭのＣｕ²⁺及びアスコルベートの存在下活性についてさらなる５回の選択にかけられた。３９の得られたクローンの配列（図１２ａ）は、変異を許容する領域を散らされた厳密に保存された配列の二つの主な領域（ヌクレオチド２０−２８及び４１−５０）を明らかにする。合計２５の位置が２以下の突然変異を経験した。他の位置は、配列の共変動を示し、これらのヌクレオチドがデオキシリボザイムの活性な立体配座において物理的な接触をすることを指示する。例えば、Ａ３２及びＧ４０は、それぞれ、しばしばＣ又はＴに突然変異する。これは、これらの塩基がＣ−Ｇ又はＡ−Ｔと対になることを選択することを示唆する。事実、この推測された対になることは、ヘアピン構造の形成と一致する、かなりな塩基対ポテンシャルを有する領域（ヌクレオチド２８−４４）で生ずる。配列データ及び先切りの分析を使用して、ＣＡ１に関する部分的な二次構造モデルを構築した（図１２ｂ）。５’−及び３’−末端ヌクレオチドの両者は、分子の基質ドメインにより顕著な塩基対ポテンシャルを示す。上記の推定上のヘアピンドメイン（ヌクレオチド２８−４４）は、保存された３’末端、そして主としてＧ残基からなる非常に保存された領域を側面に配置される。３’プライマー結合部位に位置する追加のＧの豊富な領域の除夫が、ＣＡ１の触媒活性を完全に破壊することが分かった。「Ｇ−カルテット」構造（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．（１９９４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２３，７０３−７３０）を形成するＧ残基の広がった伸張は、多数の他の一本鎖ＤＮＡで同定されている（Ｂｏｃｋ，Ｌ．Ｃ．Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｌ．Ｃ．Ｌａｔｈａｍ，Ｊ．Ａ．Ｖｅｒｍａａｓ，Ｅ．Ｈ．及びＴｏｏｌｅ，Ｊ．Ｊ．（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ，３５５，５６４−５６６；Ｈｕｉｚｅｎｇａ，Ｄ．Ｅ．及びＳｚｏｓｔａｋ、Ｊ．Ｗ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４，６５６−６６５；Ｌｉｎ，Ｙ．Ｐａｄｍａｐｒｉｙａ，Ａ．Ｍｏｒｄｅｎ，Ｋ．Ｍ．及びＪａｙａｓｅｎａ，Ｓ．Ｄ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，１１０４４−１１０４８；Ｗｏｅｓｅ，Ｃ．Ｒ．＆Ｐａｃｅ，Ｎ．Ｒ．（１９９３）Ｉｎ：ＴｈｅＲＮＡＷｏｒｌｄ，Ｒ．Ｒ．Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ及びＪ．Ｆ．Ａｔｋｉｎｓ編、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓｐｐ９１−１１７）。ＣＡ１のＧの豊富な配列は、また独立して又は触媒の一次構造のどこかで生ずるＧ残基の他の伸張ともに、Ｇ−カルテットを形成できる。ＣＡ１は、アスコルベートの不存在下で検出できる活性を有しないが、驚くべきことに、Ｇ８集団ＤＮＡ及びＣＡ３の両者は、Ｃｕ²⁺のみが添加されるとき顕著な開裂を示す（図１２ａ）。Ｃ１ｖ１に関するｋ_obs＝８×１０^-4分^-1が、１０μＭのＣｕ²⁺の存在下ＣＡ３について測定された。生体外選択は、ＣＡ３の増大したＣｕ²⁺依存活性でＣＡ３変異型を単離するのに使用された。ＣＡ３を突然変異し（上記参照）、そして単独の補因子として１０μＭのＣｕ²⁺を使用して５回の選択にかけられた。４０の得られたクローンの配列（図１３ｂ）は、非常に保存された配列の単一の領域を明らかにし、初めのランダム配列ドメインのヌクレオチド１５−５０に及ぶ。この領域内の２７ヌクレオチドの塩基の同一性が、３以下の偏々のもので変化することを見いだした。この配列保存への最も有名な例外は、ヌクレオチド３９及び４５間のＴ欠失、並びにヌクレオチド２８で生ずるＴ対Ｇ突然変異である。関連する選択実験では、初めのランダム配列ドメインのヌクレオチド１−２０が欠失しているＣＡ３の活性変異型が単離されていた。再選択されたＣＡ３プールの触媒活性は、ほぼ１００倍改善され、変異型ＤＮＡ１，２及び３（図１３ｂ）は、それぞれ０．０５２分^-1、０，０３３分^-1、及び０．０４３分^-1のｋ_obs値を示した。Ｃｕ²⁺の存在下のＤＮＡ開裂の触媒化されていない速度は、同じ条件下で５’³²ＰラベルＤＮＡオリゴマー（プライマー）をインキュベートすることにより評価された。ＤＮＡのＣｕ²⁺依存開裂は、たとえ２３℃での２週間のインキュベーション後でも、検出されなかった。ＣＡ３変異型の全体の速度の増加は、触媒化されていない速度に比べて１０⁶倍よりかなり大きいと推定された。ＣＡ３及び変異型１の両者は、それらの同様な触媒化開裂パターンにより立証されるように、同じＤＮＡ開裂メカニズムを経て進むようである（図１１）。３’−末端プライマー結合部位を欠く変異型１の合成８７ヌクレオチドバージョンは、活性を有するままであるが（Ｃ１ｖ１、１０μＭのＣｕ²⁺についてｋ_obs＝０．０２分^-1）、一方阻害作用は１００μＭのＣｕ²⁺について観察される。さらに、この先を切ったＤＮＡの自己開裂活性は、７．５のｐＨの最適値を有し、特定の１価のカチオンの要求はない。このＤＮＡの５’末端からのヌクレオチドの配列の欠失は、触媒活性の漸進性の低下をもたらし、４ −ヌクレオチド欠失は、機能のほぼ完全な損失をもたらす。Ｃｕ²⁺／アスコルベート依存の種々の自己開裂ＤＮＡの単離は、同様な条件下で一本鎖ＤＮＡの部位特異性開裂の以前の報告（Ｋａｚａｋｏｖ，Ｓ．Ａ．Ａｓｔａｓｈｋｉｎａ，Ｔ．Ｇ．Ｍａｍａｅｖ，Ｓ．Ｖ．及びＶｌａｓｓｏｖ，Ｖ．Ｖ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ，３３５，１８６−１８８）と一致する。これらの結果は、ＤＮＡが化学的形質転換を促進する種々の構造を形成できることを確認する。さらに、自己開裂ＤＮＡの両方のクラスに関する触媒速度は、他のデオキシリボザイムによりそして天然及び人工のリボザイムにより達成されるものに奸ましく比較される。ＤＮＡがまたＣｕ²⁺単独による自己開裂を行うことができるという発見は、ＤＮＡの酸化的開裂に関するメカニズムが還元剤例えばアスコルベート又はチオール化合物を必要とするため（Ｓｉｇｍａｎ，Ｄ．Ｓ．＆Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ｂ．（１９９０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９，２０７− ２３６；Ｓｉｇｍａｎ，Ｄ．Ｓ．Ｍａｚｕｍｄｅｒ，Ａ＆Ｐｅｒｒｉｎ，Ｄ．Ｍ．（１９９３）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９３，２２９５−２３１６）、予想されない。多数の化学的ヌクレアーゼは、他のものにより製造され、そして部位特異性ＤＮＡ開発剤としてそれらのポテンシャルについて調べた。例えば、１，１０−フェンアンスロリン及び同様な剤は、恐らく挿入によりＤＮＡと結合し、そして反応性酸素誘導体の形成がＤＮＡ鎖の開裂を好むリボース−ホスフェート骨格の近くに銅イオンを配置する（Ｓｉｇｍａｎ，Ｄ．Ｓ．Ｍａｚｕｍｄｅｒ，Ａ＆Ｐｅｒｒｉｎ，Ｄ．Ｍ．（１９９３）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９３，２２９５−２３１６）。別に、金属結合リガンドは、トリプルヘリックス形成によりＤＮＡを認識する非常に特異的なＤＮＡ開裂剤を構成するために、オリゴヌクレオチドプローブに結合している（Ｌｉｎ，Ｙ．Ｐａｄｍａｐｒｉｙａ，Ａ．Ｍｏｒｄｅｎ，Ｋ．Ｍ．及びＪａｙａｓｅｎａ，Ｓ．Ｄ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，１１０４４−１１０４８）。この報告に記述された触媒的ＤＮＡは、領域特異性自己開裂を促進するようにそれら自体の金属結合ポケットを形成することにより、化学的ヌクレアーゼの投割を置換するようである。事実、合成クラスＩＩＤＮＡの触媒アッセイへの１、１０−フェンアンスロリンの添加は、実際に触媒的機能を阻害する。８７−ヌクレオチドＤＮＡに関する最適のＣｕ²⁺濃度は、〜１０μＭであり、触媒活性は、１及び１００μＭのＣｕ²⁺ の両者で顕著に低下する。１、１０−フェンアンスロリンの阻害作用は、Ｃｕ²⁺ −フェンアンスロリンコンプレックスの形成による遊離のＣｕ²⁺の濃度の低下によるものであろう。すべての理論に束縛されることを望まないが、クラスＩＩＤＮＡの酸化的開裂に関する二三のメカニズムは、可能なようである。例えば、クラスＩＩＤＮＡは、反応緩衝液中に存在する痕跡量の銅及び還元剤を簡単にスカベンシすることができる。別に、これらのＤＮＡ分子は、最初の電子供与体として内部の化学基を利用するだろう。それぞれの実施例において、触媒的ＤＮＡは、酸化的メカニズムによりなお開裂できたが、還元剤の外部の源から少なくとも独立できるように見えた。酸化的プロセスにおけるＨ₂Ｏ₂の重要性は、水及び分子状酸素を生ずるＨ₂Ｏ₂分子の不均化を有効に促進する酵素であるカタラーゼにより調べることができる。クラスＩＩからの代表的なＤＮＡの触媒活性は、カタラーゼの添加により完全に阻害され、Ｈ₂Ｏ₂がＤＮＡの酸化的経路中の必要な中間体であるという考えと一致する。ＣＡ３変異型の触媒速度は、添加されたＨ₂Ｏ₂の存在下インキュベートされるとき、非常に増大する。例えば、８７ヌクレオチドＤＮＡは、１０μＭのＣｕ²⁺及び３５ｍＭのＨ₂Ｏ₂の存在下Ｃ１ｖ１（ｋ_obs＝１．５分^-1）で定量的に開裂するようにできる。水中の痕跡量のＨ₂Ｏ₂が触媒により使用されるか、又はもしＤＮＡが還元剤の不存在下でＨ₂Ｏ₂を生成できるかどうかは決定されていない。反応緩衝液（マイナスＣｕ²⁺）中の触媒的ＤＮＡ及び水性Ｃｕ²⁺を予備インキュベーションし、次にカタラーゼを熱変性することが、２種の溶液を混合するとき十分な自己開裂活性を生じされることが分かった。われわれは、８７ヌクレオチド変異型の自己開裂は、反応に存在する触媒的ＤＮＡの濃度に関係なく、〜７０％の組み合わされた最大（Ｃ１ｖ１＋Ｃ１ｖ２）に達することを見いだした。同様に、反応混合物と過剰のラベルされていない触媒（１μＭ）との予備インキュベーション、次に痕跡量の同じ５’³²Ｐラベル触媒の添加は、通常の収量のラベルしたＤＮＡ開裂生成物を生成する。最後に、既にインキュベートした反応混合物への新しい反応緩衝液の添加は、限定された量の還元剤が活性に関係することが予想されるように、さらなるＤＮＡ開裂を促進しない。Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａの自己スプライシングリボザイムの或る構成物は、エステル交換メカニズムを経てＤＮＡの開裂を触媒化することを示しており（Ｈｅｒｓｃｈｌａｇ，Ｄ．＆Ｃｅｃｈ，Ｔ．Ｒ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４４，４０５−４０９；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｄ．Ｌ．及びＪｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３３４，４６７−４６８）、そしてリボヌクレアーゼＰからのリボザイムは、加水分解によりＤＮＡを開裂することが分かった（Ｐｅｒｒｅａｕｌｔ，Ｄ．Ｍ．及びＡｎｓｌｙｎ，Ｅ．Ｖ．（１９９７）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．ＥｎｇＩ．３６，４３２−４５０）。これらのリボザイムは、またＲＮＡ開裂「触媒的アンチセンス」リボザイムの機能に類似した治療用ＤＮＡ開裂剤として働くようにできるだろう（Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎ、Ｒ．Ｅ．及びＭａｒｒ、Ｊ．Ｊ．（１９９５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８、２０２３−２０３７）。ＣＡ１の二次構造モデル（図１２ｂ）は、一次開裂部位への５’及び３’の両者の予測された塩基対の伸張を含み、「基質」及び「酵素」ドメインが分離できることを示唆している。同様に、クラスＩＩ分子の予備的分析は、同様な塩基相補性を明らかにしている。クラスＩ及びクラスＩＩの両者のＤＮＡは遺伝子工学操作されて、マルチプル代謝回転動力学によりＤＮＡ基質を特異的に開裂する触媒的ＤＮＡを生成できることが予想される。要するに、それら自体の開裂を促進する２種の異なるクラスのＤＮＡを単離した。一つのクラスは、銅を要し、そして百万倍より早い速度でＤＮＡの酸化的開裂を触媒化する。両方のクラスの自己開裂ＤＮＡの伸張領域は、選択された個々のものにより見いだされる配列保存により示されるように、触媒的構造の形成に重要である。これらの結果は、ＤＮＡが、リボース２’−ヒドロキシル基の不存在にかかわらず、リボザイムに似た機能を有する高次の構造を採用するかなりなポテンシャルを有するという見解を支持する。材料及び方法オリゴヌクレオチドすべての合成ＤＮＡは、オートメーション化化学的合成（ＫｅｃｋＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＲｅｓｏｕｒｃｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＹａｌｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）により製造された。原料プールは、５’末端ビオチン基、並びに５０ランダム配列ヌクレオチドの中心のドメインを有するＤＮＡからなる。プライマー３は、３’末端リボヌクレオシドを含むブライマーＩ（図１３ｂ）の類似体である。プライマー４は、プライマー２の非ビオチニル化バージョンである（図１３ｂ）。プライマー５はプライマーの５’−ビオチニル化の形である。生体外選択４０μＬの緩衝液Ａ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２３℃でｐＨ７．０、０．５ＭのＮａＣｌ，０．５ＭのＫＣｌ）中の合計４０ｐモルのプールＤＮＡを、２本のストレプタビシン−マトリックスカラム（ＡｆｆｉｎｔｉｐＳｔｒｅｐ２０，ＧｅｎｏｓｙｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に加え、〜５分間インキュベートした。未結合ＤＮＡを次に５００μＬの緩衝液Ａ、次に５００μＬのＮａＯＨにより予備溶離することによりそれぞれのカラムから取り出し、得られたマトリックス結合ＤＮＡを５００μＬの緩衝液Ａにより平衡させた。触媒的ＤＮＡを１−３回に連続する２０μＬずつの緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ、１００μＭのＣｕＣｌ₂、１０μＭのアスコルベート）、又は４−８回に緩衝液Ｃ（緩衝液Ａ、１０ μＭのＣｕＣｌ₂、１０μＭのアスコルベート）により溶離した。各カラムからの溶離液を１２０μＬの４ｍＭのＥＤＴＡ、及び４０ｐモルのプライマー１及び２のそれぞれと組み合わせた。選択されたＤＮＡ及び添加されたプライマーをエタノールによる沈澱により回収し、そして０．０５ＵμＬ−２Ｔａｑポリメラーゼ、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（２３℃でｐＨ８．３）、０．０１％のゼラチン、並びに０．２ｍＭのそれぞれのｄＮＴＰを含む２００μＬの反応物を９２℃で１０秒、５０℃で１０秒及び７２ ℃で３０秒の２５サイクルでＰＣＲにより増幅した。ビオチン基を含むそれぞれの開裂したＤＮＡの５’末端領域は、この段階で再導入された。次の回は、単一のストレプタビシンカラム上に２０ｐモルのプールＤＮＡを固定化することにより行われ、そして選択されたＤＮＡは、１０−２０の温度サイクルで１００μＬ反応物中で増幅された。ステップＩＩ−ＩＶ（図１３）は、集団が所望の触媒活性を示すまで繰り返され、そのときプールはプライマー１及び３によりＰＣＲ増幅され、クローンされ（ＯｒｉｇｉｎａｌＴＡＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、そして配列決定した（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ２．０ＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ，Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。ＣＡ１及びＣＡ３による再選択を２０ｐモルの合成ＤＮＡにより開始した。これは、野生型に比べて７以下の突然変異を有するすべての配列変異型のほぼ総合的な提示をもたらすことを予想させる。触媒アッセイ５’³²ＰラベルプレカーサＤＮＡは、５’³²Ｐラベルプライマー４並びにプライマー５又はプライマー３の何れかを使用して、二本鎖ＤＮＡ集団又はプラスミドＤＮＡをＰＣＲ増幅することにより製造された。アンチセンス鎖は、ストレプタビシンマトリックスヘビオチニル化鎖を結合する（プライマー５）ことによるか、又はＲＮＡホスホジエステル含有鎖のアルカリ性開裂次にＰＡＧＥ精製する（プライマー３）ことによるかの何れかにより、除かれる。ＤＮＡ自己開裂アッセイ（〜５ｎＭの５’³²ｐラベルプレカーサＤＮＡ）を、それぞれの実験について詳しいように添加された補因子とともに、緩衝液Ａ中の２３℃で行われた。生体外の選択の両者及びアッセイについて、アスコルベートを含んだ反応級衡液を使用直前に製造した。カタラーゼ（ウシ肝臓、Ｓｉｇｍａ）により行われる自己開裂アッセイは、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（２３℃でｐＨ７．０）、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０μＭのＣｕＣｌ₂、及び０．５Ｕ／μＬのカタラーゼを含み、そして２０分間室温でインキュベートされた。カタラーゼ活性は、５分間９０℃で加熱することにより破壊された。生成物は、１０％のケルを使用して変性（８Ｍ尿素）ポリアクリルアミドケル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分離され、そしてオートラジオグラフィーにより視覚化され、又はＰｈｏｓｐｈｏｒｌｍａｇｅｒ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ）により視覚化及び定量化された。開裂生成物分析ＣＡ１及びＣＡ３に関する一次開裂部位は、緩衝液Ｃ中の５’³²ＰラベルプレカーサＤＮＡをインキュベートし、そしてプレカーサＤＮＡの５’末端への配列に相当する一連の５’³²Ｐラベル合成ＤＮＡと比較して、変性２０％ＰＡＧＥを使用して分析することにより５’末端開裂フラグメントの移動性を評価することにより同定された。Ｃ１ｖ２での切断から得られる生成物を、変性６％ＰＡＧＥにより分析した。動力学的分析触媒速度は、開裂されたプレカーサＤＮＡのフラクション対時間をプロットし、そしてデータへの最小二乗の適合度により決定される反応の最初の速度を表示する曲線の傾きを確立することにより得られた。動力学的アッセイは、それぞれの実験において指示されるように、緩衡液Ｃ又は緩衝液Ａプラス１０μＭのＣｕＣ 12中で行われた。実験の繰り返しから得られた速度は、２倍より少なく異なり、そして報告された値は少なくとも２回の分析の平均である。実施例３この実施例は、イオン性銅の存在下一本鎖ＤＮＡ基質を開裂できるＤＮＡ構造を記述している。このデオキシリボザイムは、自己開裂できるか、又はそれは、ＤＮＡ基質を結合及び開裂するために二重らせん及び三重らせん相互反応を同時に利用すう１生体分子コンプレックスとして操作できる。ＤＮＡ鎖切断は、０．２分^-1というＫ_obsで進み、その速度は、ＤＮＡホスホエステル加水分解の触媒化されない速度より〜１０¹²倍の早さである。二重らせん及び三重らせん認識ドメインは、変化でき、異なるヌクレオチド配列を有する一本鎖ＤＮＡの目標とする開裂を可能にする。二三の小さい合成ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡの部位特異性開裂について簡単な「制限酵素」として機能させた。最小のＣｕ²⁺依存自己開裂ＤＮＡ。実施例２では、種々の自己開裂ＤＮＡが、ランダム配列ＤＮＡのプールから生体外選択により単離された。８回（Ｇ８）の選択後単離された殆どの個々のＤＮＡは、ヌクレオチド配列及びＤＮＡ開裂パターンの類似性に基づき、二つの異なるクラスにした。クラスＩ及びクラスＩＩの両者からの個々のＤＮＡはＣｕ²⁺及びアスコルベートを十分な活性のために要するが、Ｇ８ＤＮＡ集団は、Ｃｕ²⁺単独の存在では弱い自己開裂活性を示す。ＣＡ３と呼ばれる代表的なクラスＩＩＤＮＡは、突然変異されたＣＡ３の個々のものからなるＤＮＡプールに生体外選択を適用することにより、アスコルベート依存活性についてさらに最適化された。ＤＮＡのこの人工的な系統発生からの配列データは、それらの殆どが分子の３’末端に近く位置する約２７ヌクレオチドが自己開裂活性に重要であることを示す。最初のＧ７ＤＮＡ集団から始めて、追加の６回の生体外選択は、還元剤を添加することなく、１０μＭのＣｕ²⁺の存在下自己開裂するＤＮＡについて行われた。ＤＮＡのＧ１３集団の分析は、激しい自己開裂活性を明らかにし、触媒的ＤＮＡが２価の金属補因子のみを使用してＤＮＡの有効な開裂を促進できることを立証した。Ｇ１３集団は、個々のクラスＩＩＤＮＡについて観察されたのと同じ開裂パターンを示し、クラスＩＩ様のＤＮＡが最後のＤＮＡプールを支配することを示した。Ｇ１３からの合計２７の個々のＤＮＡを配列決定し、そして例外なく、それぞれは、クラスＩＩ自己開裂ＤＮＡを規定するために既に使用されたコンセンサス配列に殆ど合う２１ヌクレオチド配列ドメインを有した。厳重な保存したコア（ヌクレオチド１１−３１に及ぶ、図１４Ａ）を有する個々のものはＧ１３プールを支配するが、このコンセンサス配列からの二つの共通の変異は、位置１７（２８の個々のものの６）におけいるＣ対Ｔ突然変異、又はヌクレオチド２１−２５に及ぶ領域の５（２７の個々のものの４）の代わりに６の過剰なＴの存在を含む。しかし、ヌクレオチド配列の顕著な差は、この保存されたドメインの外で生ずることが分かり、単離されたクラスＩＩデオキシリボザイムの多くの部分が触媒活性に必要ではないかもしれないことを示した。事実、三つの個々のＤＮＡが、最初の出発プールにランダムにある５０ヌクレオチドドメイン内の１６、１９及び２０ヌクレオチドの欠失を行うことが分かった。Ｚｕｃｋｅｒ［ＤＮＡｍｆｏｌｄ」プログラム（３３，５０：ＤＮＡｍｆｏｌｄサーバは、ｗｗｗ．ｉｂｃ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｚｕｋｅｒ／ｄｎａ／ｆｏｒｍｌ．ｃｇｉ．でインターネットに接続できる）により得られる、１９ヌクレオチド欠失突然変異種に関する予測された二次構造は、三つの塩基対領域の存在を示し、二つは、最初のランダム配列ドメイン及び「基質」ドメインの間の対を含み、そして一つは、保存された配列領域内にあるヌクレオチドの推定される塩基対を含む。図１４Ａに画かれた６９マーに相当する合成ＤＮＡは、生体外選択に使用される条件下で、約０．３分^-1の組合わさった触媒速度で二つの位置でＣｕ²⁺依存自己開裂を行う（触媒速度に関する追加の議論には、以下の材料及び方法を参照）。可変の配列領域内にある６９マーの二つの対領域がより小さいステムループ構造により置換できるかどうかは、この不完全なヘアピンの２６ヌクレオチドがトリヌクレオチドループＧＡＡにより置換された４６マーＤＮＡを合成することによりテストされた（図１４Ｂ）。予想されるように、先を切った「４６マー」ＤＮＡは十分な触媒活性を維持し、それにより欠失したヌクレオチドがデオキシリボザイムの機能に必須ではないことを確認した。この４６ヌクレオチドデオキシリボザイムは、一本鎖ＤＮＡの領域を側面にもつ二つの塩基対構造要素（ステムＩ及びＩＩ）からなるピストル様の二次構造（図１４Ｂ）を採用することが予測される。ＤＮＡ開裂の一次部位は、４６マーの推定されるステム構造の一つ内に存在する位置１４に位置する。触媒は、また酸化的開裂メカニズムを利用するデオキシリボザイムについて予想されるように、主な開裂部位から離れて位置する領域内のＤＮＡ開裂（実施例２）を促進する（Ｊｏｓｈｉ，Ｒ．Ｒ．Ｌｉｋｈｉｔｅ，Ｓ．Ｍ．Ｋｕｍａｒ，Ｒ．Ｋ．及びＧａｎｅｓｈ，Ｋ．Ｎ．（１９９４）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１１９９，２８５−２９２）。生体分子デオキシリボザイムコンプレックス：二重らせん及び三重らせん形成による基質認識。別々の「基質」及び「触媒」ＤＮＡは、ステムＩの接続ループを排除することにより４６マーから生成できる（図１４Ｂ）。活性生体分子コンプレックスは、次に独立して製造された基質及び触媒ＤＮＡを組み合わせることにより再構成できる。単分子４６マー及び二分子コンプレックスの両者は、同じ速度で開裂を調べ、約０．２分^-1のｋ_obsにより一次部位開裂を促進した。ステムＩの重要性は、異なる触媒ＤＮＡ（ｃ１、ｃ２及びｃ３）を合成し、そして異なる基質分子（ｓ１、ｓ２及びｓ３）を開裂するそれらの能力を評価することにより確認された（図１５Ａ）。例えば、ｃ１はその相当する基質（ｓ１）では活性を示すが、非相補性基質ＤＮＡｓ２又はｓ３に置換されるとき、そうではない。同様に、ｃ２及びｃ３は、それぞれそれらの相当する基質ＤＮＡｓ２及びｓ３を開裂するに過ぎない。さらに安定な相互反応を生ずる拡張したステムＩは、また基質と触媒オリゴヌクレオチドとの間の大きな結合親和性を付与することが分かった。これらのデータは、ステムＩを構成する塩基対相互反応が触媒／基質認識における必須の決定因子であることを示す。ステムＩＩを、４６マー自己開裂ＤＮＡの突然変異種バージョンを使用して同様なアプローチにより調べた。推定されるステムＩＩ構造に含まれる一つ又は二つの突然変異による一連の変異型デオキシリボザイムを合成し、そして触媒活性についてアッセイした（図１５Ｂ）。位置３５でのＣ対Ｇの突然変異又は位置４３でのＧ対Ｃの突然変異の何れかによる、ステムＩＩ中の最初のＣ３５−Ｇ４３塩基対の分裂は、活性の実質的な損失をもたらす。開裂活性は、これらの突然変異が同じ分子で組み合わされてＧ３５−Ｃ４３塩基対を生成するとき、部分に保存される。これらの結果は、図１４でモデルとしたステム−ループ構造と一致する。ステムＩＩの存在のさらなる支持は、ＤＮＡの最初の生体外選択されたプールに存在するデオキシリボザイムの配列分析により分かった。最もしばしば表示されるデオキシリボザイムのそれから顕著に異なるコア配列を有する単一の自己開裂ＤＮＡが見いだされた。さらに普通の４６マー配列のヌクレオチド３８−４０は、ヌクレオチド５’−ＣＴＧＧＧＧにより変異型デオキシヌクレオチドで置換される。この別の配列は、単一のＣ−Ｇ塩基対によりステムＩＩを延長し、予測されたステム−ループ構造の形成と一致する。ステムＩＩの存在は、突然変異分析から由来するデータにより支持されるが、デオキシリボザイム活性の全体の保存が塩基相補性の保存により達成されないという事実は、この構造要素における塩基対の同一性が最大の触媒機能に重要であることを示す。その上、４６マーのヌクレオチド１−７の突然変異又は欠失が、ＤＮＡ開裂活性の劇的な損失を生ずることが分かった。基質のこの必須の領域内のスクレオチド４−７が、ＹＲ^*ＹＤＮＡ三重らせんの形成にステムＩＩの対の配列に相補的であるポリピリミシン区域を形成することが認識された（Ｆｒａｎｋ−Ｋａｍｅｎｅｔｓｋｉｉ，Ｍ．Ｄ．＆Ｍｉｒｋｉｎ，Ｓ．Ｍ．（１９９５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４，６５−９５）。デオキシリボザイムの活性構造の三重らせん形成の可能性を調べるために、われわれは、ステムＩＩの塩基対配列（ｃ４）、及び基質のポリピリミシン区域の配列（ｓ４）の両者を修飾して、特異性を変更したが、しかし四つの隣接する塩基トリプルを形成するポテンシャルを維持した（図１６）。ｃ４変異型ＤＮＡは、その対応するｓ４ＤＮＡ基質を開裂するが、最初のポリピリミシン配列を有する基質では活性を示さない。たとえステムＩＩ内の単一の突然変異（例えば図１５Ｂ）又はポリピリミシン区域内の単一の突然変異でも、触媒活性に顕著な低下を生じさせることが分かった。しかし、三重らせん形成と一致するやり方での６の突然変異の導入は、十分なＤＮＡ開裂活性を示す変異型（ｃ４／ｓ４）コンプレックスを生じさせる。これは、その活性構造の形成に伸張した三重らせんを利用する、天然又は人工の触媒的ポリヌクレオチドの第一の例である（Ｓｔｒｏｂｅｌ、Ｓ．Ａ．＆Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ａ．（１９９７）ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２２，２６２−２６６）。デオキシリボザイムによるＤＮＡ「制限部位」の目標を決めた開裂。上記の結果は、クラスＩＩデオキシリボザイムが、ステムＩ及びＩＩにより別々に形成される二つの異なる認識ドメインを同時に利用することにより、基質ＤＮＡを同定することを立証している。これらの構造は、ことなる目標部位でＤＮＡを選択的に開裂するデオキシリボザイムを遺伝子工学操作する認識要素としてさらに利用されるだろう。この能力を立証するために、それぞれは異なるステムＩ認識配列を伴う三つの同じリーダー配列を有する１０１ヌクレオチドＤＮＡを合成した（図１７Ａ）。３種の触媒ＤＮＡ（ｃ１、ｃ２及びｃ３）は、それぞれ、三つの目標部位の一つにユニークに相補性であるようにデザインされた。１０１マー基質と別々にインキュベートされるとき、ＤＮＡｃ３及びｃ７は、それらの相当する目標部位でもっぱら開裂し、一方ｃ１は、その目的とする部位で開裂し、そしてまた低い程度でｃ３開裂部位で開裂する（図１７Ｂ）。ｃ１について観察される相互の反応性は、ステムＩの塩基対ポテンシャルを調べることにより説明できる。ｃ１の認識配列中の６ヌクレオチドの内、四つは標準の塩基対を形成でき、一方残りの二つは、Ｇ−Ｔゆらぎ対を形成する。二重らせん及び三重らせんの両者の認識要素の寄与は、恐らく、この二次の位置で検出可能な開裂活性を可能にする。ステムＩＩの塩基対配列により規定される三重らせんの相互反応は、また特定のＤＮＡ基質を目標にするのに利用できる。われわれは、同じステムＩ対サブドメインを有するが、伸張ししかもユニークなステムＩＩサブドメインを有する３種の新しい触媒ＤＮＡ（ｃ９、ｃ１０及びｃ１１）をデザインした（図１７Ｃ）。三つのユニークに相補的なポリピリミシン区域を有する１００ヌクレオチドＤＮＡと別々にインキュベートされるとき、それぞれの触媒ＤＮＡは、最初の自己開裂ＤＮＡについて見いだされるそれと十分に相当する速度で、その相当する目標部位を開裂する。この例では、基質選択性は、触媒と基質分子との間の同じでしかも拡大した塩基相補性（ステムＩ）の存在にかかわらず、三重らせん形成により殆ど完全に決定される。デオキシリボザイムにより触媒化されるＤＮＡ開裂が基質ドメイン内に集中するが、実質的な（〜３０％）の開裂は、触媒鎮の保存されたコア内で生ずる。この副次的な損傷は、デオキシリボザイムの不活性化を生じさせ、その結果、超化学量論的な量の触媒ＤＮＡがＤＮＡ基質の定量的な開裂を確実にするために必要とされる。基質サブドメインの開裂は、触媒コア内の開裂より急速に進む。過剰のｃ１の存在では、ｓ１は、約０．２分^-1の速度で開裂し（３０μＭのＣｕＣｌ₂ を含む反応緩衝液）、２０分後に〜８０％開裂されたプラトーに達する。対照的に、過剰のｓ１の存在下のｃ１の開裂は、２倍より多く遅く進み、基質ドメイン中に位置する自己開裂対触媒コア中の自己開裂の比が、〜２：１の比を与えるというわれわれの以前の報告と一致する。誤開裂による不活性化を防ぐために、触媒鎮が多重代謝回転を行うことができることが立証された。熱サイクルによる開裂二本鎖ＤＮＡ。クラスＩＩ触媒ＤＮＡは、それらが二重らせん内に存在するとき、目標ＤＮＡを開裂できない。触媒ＤＮＡは、その短い認識配列により、恐らく、開裂部位に接近するために、目標のより長いしかもより固く巻かれた相補性鎮を置換できない。伸張したＤＮＡ二重らせんの１本の鎖の特定の開裂のための有効な手段が、熱変性及び再アンニーリングのサイクルの繰り返しを利用することであることを見いだした。例えば、ｃ３は、熱サイクルがないときには二本鎖ＤＮＡ目標物に対して不活性のままであるが、繰り返される加熱及び冷却サイクルにより同じＤＮＡ基質を有効に開裂する。放射ラベル目標物の開裂は、６回の熱サイクル後では定量的である。クラスＩＩＤＮＡによるＤＮＡ開裂は、ステムＩに相当する塩基対領域内で生じ、恐らくこの領域が二重らせんの形のときそうである。これは、三重らせんの形成による基質認識の観察とともに、異なるＤＮＡ酵素が遺伝子工学操作をうけて熱変性の必要なしに二重らせんＤＮＡ基質を開裂するであろうことを示唆している。このデオキシリボザイムの活性は、化学的につながれた金属錯体例えばＦｅ−ＥＤＴＡを使用して二重らせんＤＮＡを結合かつ開裂する多数の三重らせん形成オリゴヌクレオチドにより行われるのと同様であろう（Ｌｉ，Ｙ．＆Ｓｅｎ，Ｄ．（１９９６）ＮａｔｕｒｅＳｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３，７４３−７４７；Ｌｉｍ，Ｃ．＆Ｔｏｌｅ，Ｐ．（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４，７２４５−７２５２；Ｌｉｎ，Ｙ．Ｐａｄｍａｐｒｉｙａ，Ａ．Ｍｏｒｄｅｎ，Ｋ．Ｍ．＆Ｊａｙａｓｅｎａ，Ｓ．Ｄ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，１１０４４−１１０４８；Ｌｉｎｄａｈｌ，Ｔ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ，３６２，７０９−７１５）。結論。その単分子配置では、クラスＩＩデオキシリボザイムは、さもなければ安定なＤＮＡ構成物への自己開裂のための能力を付与するために使用できた。その二分子の形では、デオキシリボザイムは、一本鎮ＤＮＡのための人工的な制限酵素として作用でき、一方非二重らせんＤＮＡを開裂する蛋白に基づくヌクレアーゼは、顕著な配列特異性を示さない。密接に関係する目標配列間のクラスＩＩ触媒によるＹ最大区別は、二重らせん及び三重らせんの認識ドメインの注意深いデザインにより達成できたようである。これは、ここで観察された相互反応性を排除することが予想される。基質ドメイン内の殆どのヌクレオチドの役割が基質の認識に含まれるが、リーダー配列内のそれぞれのヌクレオチドの重要性は、まだ十分に詳細に記述されていない。しかし、二重らせん及び三重らせんの形成の基本的な規則に導かれて、一つのｗ３は、ポリヌクレオチド鎖に沿って規定された位置で、一本鎖ＤＮＡの開裂を触媒化できる非常に特異的なデオキシリボザイムを遺伝子工学操作できる。材料及び方法オリゴヌクレオチド合成ＤＮＡは、オートメーション化化学的合成（ＫｅｃｋＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＲｅｓｏｕｒｃｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＹａｌｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）により製造され、そして使用前に変性（８Ｍ尿素）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により精製した。二本鎖１０１マーＤＮＡは、プライマーＤＮＡ５’³²Ｐ−ＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＧＡＧＣＴＣＧＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１）５’ＧＴＡＧＡＴＣＧＴＡＡＡＧＣＴＴＣＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２）、並びにテンプレートとして１０１マーＤＮＡ（図１７Ａ）を使用して、実施例２に記載したようにポリメラーゼ連鎮反応（ＰＣＲ）により製造した。生体外選択クラスＩＩ自己開裂ＤＮＡの最適化は、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（２３℃でｐＨ７．０）、０．５ＭのＮａＣｌ、０．５ＭのＫＣｌ（緩衝液Ａ）からなるＤＮＡ開裂のための反応混合物を使用して実施例２で本質的に記述された生体外選択により達成され、さらにそれは１０μＭのＣｕＣｌ₂を含んだ。選択プロセスは、それぞれの触媒鎖の５’末端がビオチン基を有する２０ｐモルのＧ７ＰＣＲＤＮＡで開始され、それによりこのそして次の世代からのＤＮＡをストレプタビシン由来クロマトグラフィーマトリックス上に固定させた。反応時間は、それぞれ、Ｇ８−Ｇ１０からの固定化ＤＮＡについて１５分間であり、そしてＧ１１− Ｇ１３ＤＮＡ集団について１２、７及び５分間であった。Ｇ１３からの個々の自己開裂ＤＮＡは、クローニング(ＯｒｉｇｉｎａｌＴＡＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)及び配列決定（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ２．０ＤＮＡＫｉｔ，Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）により分析された。ＤＮＡ開裂アッセイ自己開裂分子のＤＮＡ開裂活性を評価するために、放射ラベルプレカーサＤＮＡは、２５ｍＭのＣＨＥＳ（２３℃でｐＨ９．０）、５ｍＭのＭｇＣｌ₂、３ｍＭのＤＴＴ、１μＭのＤＮＡ、１．２μＭの（γ−³²Ｐ）−ＡＴＰ（〜１３０μ Ｃｉ）、並びに１Ｕ／μＬのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを含む反応物中で合成ＤＮＡの５’末端に酵素的に標識を付することにより製造され、それは１時間３７℃でインキュベートされた。得られる５’³²ＰラベルＤＮＡは、変性ＰＡＧＥにより単離し、そして１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（２３℃でｐＨ７．５）、０．２ＭのＮａＣｌ並びに１ｍＭのＥＤＴＡ中粉砕浸漬することによりゲルマトリックスから回収された。回収されたＤＮＡは、エタノールによる沈澱により濃縮され、そして脱イオン水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中に再懸濁された。痕跡量の放射ラベルプレカーサＤＮＡ（〜１００ｐＭ）を使用する自己開裂アッセイは、それぞれの実験に指示されるようにＣｕＣｌ₂を含む緩衝液Ａ中で２３℃で行われた。二分子コンプレックスのＤＮＡ開裂活性の調査は、痕跡量の５’³²Ｐラベル「基質」ＤＮＡを使用して同様な条件下で行われた。開裂生成物は、変性ＰＡＧＥにより分離され、オートラジオグラフィーにより又はＰｈｏｓｐｈｏｒｌｍａｇｅｒ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ）により造影され、そして生成物の収量は、対応するプレカーサ及び生成物のパンドの定量化 (ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ)により決定された。動力学的分析触媒速度は、開裂されたプレカーサ又は基質ＤＮＡのフラクション対時間をプロットし、そしてデータへの最小二乗の適合度により決定される反応の最初の速度を表示する曲線の傾きを確立することにより得られた。精密な検査により、基質及び酵素ドメインの両者におけるＤＮＡ開裂は、最初の開裂速度の測定を複雑にする短い遅延相を示した。遅延相を避けるために、最初の傾きは、反応が１分間進んだ後に集められたデータのみを使用して計算された。実験の繰り返しから得られる速度は、５０％より少なく異なり、そして報告された値は少なくとも三つの分析値の平均である。実施例４ＲＮＡ開裂反応用の活性成分としてヒスチジンを使用する触媒的ＤＮＡの生体外選択は、この実施例に記述されている。最適化されたデオキシリボザイムは、Ｌ−ヒスチジン又は二三の密接に関連する類似体に結合するに過ぎず、そして次に触媒化されていない速度より〜１０００万倍の速度増加によりＲＮＡホスホエステル開裂を触媒化する。すべての理論に束縛されることを望まないが、ＤＮＡ −ヒスチジンコンプレックスは、明らかに、ヒスチジンのイミダソール基が一般的な塩基触媒として働く、リボヌクレアーゼＡの触媒メカニズムの始めの段階に類似している反応を行う。本明細書で記述された補因子としてアミノ酸ヒスチジンを使用してＲＮＡホスホエステル結合の開裂を触媒化するデオキシリボザイムの群は、図１８ａに画かれる。金属依存デオキシリボザイムがＤＮＡのランダム配列プールから回収されないことを確かめるために、２価金属−キレート剤エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を５０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ７．５）により緩衝された反応混合物に含ませた。１１回の選択的増幅後、ＤＮＡのプールは、生体外選択条件下しかもヒスチジンの代わりにＨＥＰＥＳ（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）を含む反応緩衝液中の両者で、ＲＮＡホスホエステル−開裂活性を示した。最終のＤＮＡプールからクローンされた個々の分子は、四つの配列クラスの一つにグループ分けされ（図１９ｂ）、そして代表的なクローンを触媒活性についてテストした。クラスＩＩＤＮＡのみが、ヒスチジンに対する完全な依存性を示し、一方残りのクラスは任意の金属イオン又は小さい有機補因子とは独立して操作するように見える。最初のクラスＩＩデオキシリボザイムの触媒速度は、殆どの天然の自己開裂リボザイムより〜１０００倍遅かった（ｋ_obs＝１．５×１０^-3分^-1）（Ｓｙｍｏｎｓ，Ｒ．Ｈ．（１９９２）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１，６４１− ６７１）。その結果、触媒活性のさらなる最適化は、比較配列分析について変異型触媒の人工的な系統発生を提供するために、探索された。新しいＤＮＡプールは、クラスＩＩデオキシリボザイムの配列に基づいて製造されて、最初のランダム配列ドメインに相当する３９ヌクレオチドが、０．２１の縮重で突然変異した（Ｂｒｅａｋｅｒ、Ｒ．Ｒ．＆Ｊｏｙｃｅ、Ｇ．Ｆ．（１９９４）ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈ．１２、２６８）。最初のクラスＩＩ配列に比較して７以下の突然変異を有するすべての可能な変異型ＤＮＡをサンプルした突然変異したプールから始めて、平行な再選択を、５０ｍＭのヒスチジン、又は５ｍＭのヒスチジン及び５０ｍＭのＨＥＰＥＳの何れかにより緩衝された反応溶液を使用して行った。５回の再選択から得られる集団から単離された個々のＤＮＡは、最初のクラスＩＩデオキシリボザイムより活性があり、さらに保存された配列及び突然変異の獲得の特定のパターンを示す（図１９ａ）。最初のＤＮＡ構成物（図１８ａ）に含まれる遺伝子工学操作された対要素ｉがクラスＩＩデオキシリボザイムにより利用されつつあることが予想された。対照的に、コアの３’末端に近い保存された配列ドメイン（図１９ａ、ヌクレオチド３２−３６）が対要素ｉｉと同じであることが認識された。これらの観察を考慮して、個々のデオキシリボザイムＨＤ１及びＨＤ２は、別々の基質及び酵素ドメインとして操作されるようにデザインされた（図１９ｂ）。基質オリゴヌクレオチドに関する特異性は、基質と酵素ドメインの二つの対アームとの間のＷａｔｓｏｎ／Ｃｒｉｃｋ塩基相補性により規定される。クラスＩＩデオキシリボザイムは、シペプチドの形で伝達される「かごに入った（ｃａｇｅｄ）」ヒスチジンに対する、そして酸加水分解により各シペプチドから遊離される遊離のアミノ酸に対して二分子ＨＤ１構成物の活性により示されるようにヒスチジンに関する絶対的な要件を有する（図１６ａ）。さらに、ＨＤ１は、補因子としてＬ−ヒスチジンを受容するが、Ｄ−ヒスチジンを受容しない。しかし、Ｄ−ヒスチジンのサンプルは、酸性の条件中の二つの異性体の形の間の相互転換の加速された速度に従ってＨＣｌによる処理により、活性になる。ヒスチジン類似体のより大きなパネルを、触媒活性について重要であるヒスチジンの化学基をさらに注意深く調べるために、そして触媒が金属イオン補因子の汚染によるであろうという可能性を排除するために、調べた（Ｆｏｇｉｒｅ１６ｂ）。ＨＤ１は、種々のヒスチジン類似体を区別するが、Ｌ−ヒスチジンのメチルエステルと十分な活性を示す（図１６ｃ）。１−メチル−及び３−メチル−Ｌ −ヒスチジンの類似体の両者は、ＨＤ１活性を支持せず、ヒスチジンのイミダソール環がデオキシリボザイムの機能に重要であることを示す。予想されるように、ＨＤ２は、補因子の区別の同様なパターンを有する（表２）。両方の触媒は、ヒスチジンの立体特異性の認識を示し、そして最大の補因子結合を得るためにα −アミノ基、両方のカルボキシル酸素、及びイミダソール基との相互反応を利用する。多数の類似体がデオキシリボザイム活性を支持できないが、どんな化合物も競合的阻害剤として機能せず、それらの不活性がデオキシリボザイムと結合することができないことによることを示す。ＨＤ２促進触媒作用に関する速度定数（０．２分^-1のｋ_obs、５０ｍＭのヒスチジン）は、天然の自己開裂リボザイムのそれと似ており、触媒化されていない反応より〜１０００万倍の速度の増加に相当する（生体外選択条件下でｋ_obs＜１０^-8分^-1）。ヒスチジン濃度への速度定数の依存性は、ヒスチジンに関する飽和可能な結合部位の存在の特徴であるが、ＨＤ１又はＨＤ２の何れもたとえ補因子の１００ｍＭの濃度でも飽和に達しない。しかし、特別の補因子の確立された特異性は、両方の触媒が事実ヒスチジン結合部位を形成することを示す。ＨＤ２は、低いヒスチジン濃度でより大きな活性を示し、恐らく、低いヒスチジン選択の型からのその単離により予想されるように、ヒスチジンに関するより大きな結合親和性を反映する。ＨＤ２に関するｐＨ依存活性プロフィルは、また触媒プロセスの統合成分としてヒスチジンを含む（図２１ｂ）。ＨＤ２の速度定数は、７及び９の値の間のｐＨに完全に無関係である。しかし、この酵素の活性は、この最適の範囲の外にあるｐＨ値で急激に落ちる。最も明らかなのは、低いｐＨ条件へのＨＤ２の応答である。ｋ_obs値は、ｐＨ４．５−５．５間でｐＨが増すにつれ直線的に増大し、約１の傾きを与える。この結果は、もし単一の官能基のプロトン化の状態が触媒速度を決定するならば、予想される。その上、最大稙の半分である速度定数は、ｐＨ６で得られ、この化学基は半分脱プロトン化されるだろう。この値は、遊離ヒスチジンのイミダソール基に関するｐＫ_aにより正確に相当する。一緒にして、これらの結果は、メカニズムと一致し、それによりイミダソール基は２’−ヒドロキシル基の脱プロトン化のための一般の塩基触媒として働き、それにより隣接する燐原子に対する親核性攻撃に酸素を活性化する。より高いｐＨ植での触媒活性の損失は、推定される第二のヒスチジン補因子のイミダソール基のｐＫ_aがその通常の値から劇的にシフトしない限り、ヒスチジンのプロトン化によるとは予想されない。９より大きいｐＫ_aを有するヒスチジンのβ−アミノ基も、恐らく、触媒作用に含まれるだろう。しかし、それぞれＴ及びＧの残基の脱プロトン化又はＣ及びＡ残基のプロトン化の顕著なレベルにより、９より高い又は４．５より低いｐＨ値により活性の損失を見いだすことが予想される。ヒスチジンは、中性のｐＨの近くで一般的な酸及び一般的な塩基の触媒作用の両者で機能するイミダソール側鎖に関するポテンシャルのために、補因子の候補者として選ばれた。この性質は、ＲＮＡの４種の標準のヌクレオチド、又は残りの天然のアミノ酸の何れにも固有のものではない。その結果、ヒスチジンは、蛋白酵素の活性部位で最も頻繁に使用されるアミノ酸の一つである。例えば、二つの活性部位ヒスチジンは、ウシの膵臓からリボヌクレアーゼＡの機能に必須であり、これらの能力の両者はＲＮＡ開裂を促進するのに使用される。リボヌクレアーゼＡは酵素作用の研究のモデルとして長い間利用されたが、それぞれの活性部位残基が触媒プロセスで果たす特定の役割は、なお激しく議論されている（Ｐｅｒｒｅａｕｌｔ，Ｄ．Ｍ．＆Ａｎｓｌｙｎ，Ｅ．Ｖ．（１９９７）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３６，４３２−４５０）。古典的な見解は、位置１２のヒスチジンが２’ヒドロキシルの脱プロトン化のための一般的な塩基として働き、一方位置１１９のヒスチジンが一般的な酸として働きそして５’ 酸素脱離基をプロトン化することを主張している。Ｂｒｅｓｌｏｗら（Ｌｉｍ，Ｃ．＆Ｔｏｌｅ，Ｐ．（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４，７２４５−７２５２；Ｗｌａｄｋｏｗｓｋｉ，Ｂ．Ｄ．Ｋｒａｕｓｓ，Ｍ．＆Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｗ．Ｊ．（１９９５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７，１０５３７−１０５４５）は、ヒスチジン１１９の投割が、その代わり、ホスホラン中間体をプロトン化し、それにより触媒プロセス中優先する段階としてイミダソール基による一般的な酸触媒作用を行うことを提案している。本明細書に記述されたデータは、クラスＩＩデオキシリボザイムのヒスチジン補因子がプロトン化段階に含まれないが、一般的な塩基触媒としてもっぱら機能しつつあることを示す。蛋白に比べて、核酸を構成しているモノマー性単位のさらに繰り返す性質は、折り畳まれたポリヌクレオチドの微細な構造の形成、並びにＲＮＡ及びＤＮＡの化学的反応性の両者を制限する。核酸酵素が蛋白に基づく酵素の好ましい化学的単位の一つを取り込むことができるという事実は、ＲＮＡがその制限された構造形成ポテンシャルを回復させ、そして最近の蛋白酵素の触媒的道具を使用して、コンプレックス代謝状態を生成させそして維持できたという主張を支持する。材料及び方法生体外選択及び再選択生体外選択は、既に記述されたように本質的に実施された（Ｂｒｅａｋｅｒ、Ｒ．Ｒ．＆Ｊｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．（１９９４）Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．１、２２３−２２９；Ｂｒｅａｋｅｒ、Ｒ．Ｒ．＆Ｊｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．（１９９５）Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．２、６６５−６６０；Ｗｌａｄｋｏｗｓｋｉ，Ｂ．Ｄ．Ｋｒａｕｓｓ，Ｍ．＆Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｗ．Ｊ．（１９９５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７，１０５３７−１０５４５）。最初のＤＮＡプールは、９４℃ （１５秒）、５０℃（３０秒）、及び７２℃（３０秒）の４回の熱サイクルで、４００ｐモルのプライマーＢ２、５’−ビオチン−ＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴｒＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５）、並びに４００ｐモルのプライマー１、５’−ＣＡＡＣＣＡＣＡＣＣＡＡＣＣＴＣＡＣ(ＳＥＱＩＤＮＯ：５６)を含む５００μＬのＰＣＲ反応物中のテンプレート５’−ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＡＡＧＡＧＡＴＧＧＣＧＡＣＡＴＣＴＣ（Ｎ）₄₀ＧＴＧＡＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３及び５４）（５０ｐモル；Ｎは４種のヌクレオチドの発現の等しい可能性）のＰＣＲ増幅により製造された。ＰＣＲ反応混合物は、既述されたように製造された（Ｇｏｌｄ、Ｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０、１３５８１−１３５８４）。増幅されたＤＮＡは、エタノールにより沈澱され、結合緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（２３℃でｐＨ７．５）、０．５ＭのＮａＣｌ、０．５ＭのＫＣｌ及び０．５ｍＭのＥＤＴＡ）中に再懸濁され、そして溶液をストレプタビジン由来アフィニティマトリックスを通して固定化一本鎖ＤＮＡ¹⁵を生成させた。プールＤＮＡを示すマトリックスを、繰り返し結合緩衝液（３０分かけて１．５ｍＬ）により洗い、そして次に１時間かけて、ＨＥＰＥＳが５０ｍＭのヒスチジンにより置換された反応緩衝液（ｐＨ７．５、２３℃）２０μＬで３回溶離した。８−１１回で、反応時間は、さらに有効に開裂するこれらの分子に好ましいため、２５−１５分に短縮された。選択されたＤＮＡは、エタノールにより沈澱させ、そしてプライマー１及びプライマー２、５’−ＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＡＡＧＡＧＡＴＧＧＣＧＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７）を使用してＰＣＲにより増幅され、得られたＰＣＲは、上記のように再増幅されてビオチン及び埋め込まれたリボヌクレオチド基を再導入した。クラスＩＩデオキシリボザイムの再選択は、それぞれが１位置あたり０．２１の縮重により突然変異された３９ヌクレオチドコアを有する、１０¹³ＤＮＡのプールにより開始された。同様に、ＨＤ２の再選択は、２６ヌクレオチドが１位置あたり０．３３の縮重に突然変異された最初のプールで行われた。最終の選択されたプールからの個々のものは、クローニング及び配列決定により分析された。ＤＮＡプールは、プライマーＢ２の代わりにプライマー２を使用してＰＣＲ増幅によりこのプロセスについて製造された。ＤＮＡ集団及び個々のプレカーサＤＮＡは、既述したようにアッセイするために製造された(Ｂｒｅａｋｅｒ、Ｒ．Ｒ．＆Ｊｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．（１９９５）Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．２、６６５−６６０)。デオキシリボザイム触媒作用アッセイすべての触媒アッセイは、０．５ＭのＮａＣｌ、０．５ＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのＥＤＴＡの存在下行われた。単一の代謝回転アッセイは、それぞれのアッセイについて記述したように痕跡量（〜５０ｎＭ）基質オリゴヌクレオチド及び過剰（１−１０μＭ）のＤＮＡ触媒を含んだ。使用される補因子は、それ以外を述べていない限り、Ｌ−ヒスチジンであった。反応は、９５％ホルムアミド、０．０５％キシレン、シアノール及び０．０５％ブロモフェニルブルーを含む等体積の溶液に添加することにより停止され、そしてゲル電気泳勤前に氷で貯蔵された。尿素及びＥＤＴＡの両者を含む停止緩衝液は、デオキシリボザイム活性を完全に停止させることが出来なかった。かごに入った（ｃａｇｅｄ）ヒスチジンの実験は、未処理ジペプチドにより又は或る濃度の加水分解されたジペプチド生成物により行われた。ジペプチドの加水分解は、２３時間１１５℃で密封した管中で１００ｍＭのジペプチド及び６ＮのＨＣｌを含む溶液をインキュベートすることにより達成された。サンプルを真空で蒸発させ、脱イオン水と共蒸発させ、そして再懸濁したサンプルを使用前に中性のｐＨに調節した。触媒速度定数（ｋ_obs）は、それぞれ、反応の最初の速度を測定することにより（Ｇｏｌｄ、Ｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０、１３５８１ −１３５８４）、又は時間の経過とともに残る基質のフラクションの自然対数をプロットすることにより、決定されるが、二三の半減期で得られる線の負の傾きがｋ_obsを表す。触媒化されていない速度は、２１日間２３℃又は−２０℃で、デオキシリボザイムの不存在下反応条件下で痕跡量の５’³²Ｐラベル基質をインキュベートすることにより測定された。ＲＮＡホスホエステルの比較分析は、ヒスチジンの存在下の触媒化されていないＲＮＡ開裂に関する速度定数が、放射線分解による基質の劣化の速度を超えないことを示す。埋め込まれたＲＮＡ結合の開裂の最大の触媒化されていない速度は１０^-8分^-1を超えないことが予想される。この値は、１ｍＭのＭｇ²⁺の存在で得られる値より〜１０倍低い（Ｂｒｅａｋｅｒ、Ｒ．Ｒ．＆Ｊｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．（１９９５）Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．２、６６５−６６０）。上記の記述は、当業者に本発明をいかに実施するかを教示する目的のためであり、そして記述を読んで当業者に明らかになるであろうそのすべての明白な修飾及び変化を詳述することを目的としていない。しかし、すべての明白な修飾及び変化は、以下の請求の範囲に規定されている本発明の範囲内の含まれることを目的としている。請求の範囲は、テキストが逆のことを特に指示していない限り、そこで目的としている目標に合致するのに有効な任意の順序でコンポーネント及び段階をカバーすることを目的とする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ

Claims

【特許請求の範囲】１．化学的エフェクター、物理的シグナル又はこれらの組合せによりポリヌクレオチドの機能又は配置を修飾するアロステリック性を示す精製された機能性ＤＮＡポリヌクレオチド。２．醇素の触媒作用の速度を修飾するアロステリック性を示す酵素である請求項１のポリヌクレオチド。３．化学的エフェクター、物理的シグナル又はこれらの組合せによりコントロールできる速度を有する触媒的性質を有する精製された機能性ポリヌクレオチド。４．ＤＮＡを含む請求項３のポリヌクレオチド。５．ＲＮＡを含む請求項３のポリヌクレオチド。６．ＳＥＱＩＤＮＯ１、３−６、及び９−４８からなる群から選ばれる配列を含む請求項１−５の何れか一つの項のポリヌクレオチド。７．化学的エフェクターが、有機化合物及び有機化合物、並びに金属イオンの混合物からなる群から選ばれる請求項１−５の何れか一つの項のポリヌクレオチド。８．化学的エフェクターが、アミノ酸、アミノ酸誘導体、ペプチド、ヌクレシド、ヌクレオチド、ステロイド、及びこれらの混合物からなる群から選ばれる請求項７のポリスクレオチト。９．化学的エフェクターが、微生物又は細胞の代謝物又は血液又は尿成分又は生物学的サンプルから得られる他の体液である請求項１−５の何れか一つの項のポリヌクレオチド。１０．化学的エフェクターが、医薬品である請求項１−５の何れか一つの項のポリヌクレオチド。１１．化学的エフェクターが、殺虫剤、殺草剤、食品トキシン、及びこれらの混合物からなる群から選ばれる請求項１−５の何れか一つの項のポリヌクレオチド。１２．物理的シグナルが、放射、温度の変化、及びこれらの組合せからなる群から選ばれる請求項１−５の何れか一つの項のポリヌクレオチド。１３．請求項１−５又は８の何れか一つの項のポリヌクレオチドを含むバイオセンサー。１４．固体支持体に結合した請求項１３のバイオセンサー。１５．請求項１−５又は８の何れか一つの項のポリヌクレオチドが結合された固体支持体。１６．請求項１−５又は８の何れか一つの項のポリヌクレオチドをサンプルと接触させることからなるサンプル中の化合物又はその濃縮物の存在又は不存在を検知する方法。１７．化合物又はその濃縮物の存在又は不存在が、ポリヌクレオチドの自己開裂の観察により検出される請求項１６の方法。１８．化合物の存在又は濃度が、ポリヌクレオチドの配置又は機能における変化の観察により検出される請求項１６の方法。１９．請求項１−５又は８の何れか一つの項のポリヌクレオチドをサンプルと接触させることからなるサンプル中の物理的な変化の存在又は不存在を検出する方法。２０．物理的変化の存在が、ポリヌクレオチドの自己開裂の観察により検出される請求項１９の方法。２１．サンプル中の物理的変化の存在が、ポリヌクレオチドの配置又は機能の変化の観察により検出される請求項１９の方法。２２．化学的エフェクター、物理的シグナル又はこれらの組合せによりポリヌクレオチドの機能又は配置を修飾するアロステリック性を示すポリヌクレオチドを含むバイオセンサー。２３．触媒的ポリヌクレオチドを含むバイオセンサー。２４．ポリヌクレオチドがＤＮＡを含む請求項２２又は２３のバイオセンサー。２５．ポリヌクレオチドがＲＮＡを含む請求項２２又は２３のバイオセンサー。２６．ポリヌクレオチドが自己開裂活性を有する請求項２２又は２３のバイオセンサー。２７．ポリヌクレオチドの触媒的又はアロステリック的性質が化学的エフェクターによりコントロールされる請求項２２又は２３のバイオセンサー。２８．化学的エフェクターが、有機化合物及び有機化合物、並びに金属イオンの混合物からなる群から選ばれる請求項２７のバイオセンサー。２９．化学的エフェクターが、アミノ酸、アミノ酸誘導体、ペプチド、ヌクレシド、ヌクレオチド、ステロイド、及びこれらの混合物からなる群から選ばれる請求項２７のバイオセンサー。３０．化学的エフェクターが、微生物又は細胞の代謝物又は血液又は尿成分又は生物学的サンプルから得られる他の体液である請求項２７のバイオセンサー。３１．化学的エフェクターが、医薬品である請求項２７のバイオセンサー。３２．化学的エフェクターが、殺虫剤、殺草剤、食品トキシン、及びこれらの混合物からなる群から選ばれる請求項２７のバイオセンサー。３３．ポリヌクレオチドの触媒的又はアロステリック的性質が、放射、温度の変化、及びこれらの組合せからなる群から選ばれる物理的シグナルによりコントロールされる請求項２２又は２３のバイオセンサー。３４．ポリヌクレオチドが固体支持体に結合している請求項２２、２３、２８、２９、３０−３２の何れか一つの項のバイオセンサー。３５．請求項２２、２３、２８、２９、３０−３２の何れか一つの項のバイオセンサーをサンプルと接触させ、そしてポリヌクレオチドの機能性又は配置の変化を観察することからなる、サンプル中の化合物又はその濃縮物の存在又は不存在を検出する方法。３６．請求項２２、２３、２８、２９、３０−３２の何れか一つの項のバイオセンサーをサンプルと接触させ、そしてポリヌクレオチドの機能性又は配置の変化を観察することからなる、サンプル中の物理的変化の存在又は不存在を検出する方法。