MX2011002418A - Metodos para inhibir la angiogenesis ocular. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona métodos para usar TSPAN12 y antagonistas de Norrina para inhibir el desarrollo vascular ocular y tratar enfermedades relacionadas.

Description

MÉTODOS PARA INHIBIR LA ANGIOGÉNESIS OCULAR MEMORIA DESCRIPTIVA SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio bajo 35 USC 119(e) de la solicitud provisional norteamericana número 61/095.757, présentada el 10 de septiembre de 2008; la solicitud proyisional norteamericana número 61/103.502, presentada el 7 de octubre de 2008; y la solicitud provisional norteamericana número 61/234.519, presentada el 17 de agosto de 2009, donde los contenidos de cada i una de ellas se incorporan aquí por referencia. i I CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en general a composiciones y métodos que son útiles para el tratamiento de condiciones y enfermedades asociadas con la angiogénesis. Específicamente, la presente invención se refiere a antagonistas de Tetraspanina 12 (TSPAN12) y Norrina. : ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Actualmente, está bien establecido que la angiogénesis contribuye en forma importante a la patogénesis de una variedad de trastornos. Estos incluyen tumores sólidos y metástasis, enfermedades neovasculares infraoculares tales como retinopatías proliferativas, por ejemplo retinopatía diabética, oclusión venosa ¡retiniana (OVR), degeneración macular i relacionada con la edad (DME) húmeda, glaucomá neovascular, rechazo inmune al tejido corneal trasplantado y otros tejidos, y artritis reumatoide. Duda et al. J. Clin. Oncology 25(26): 4033-42 (2007); Kesisis et al. Curr. Pharm. Des. 13: 2795-809 (2007); Zhang & i Ma Prog. Ret. & Eye Res. 26: 1-37 (2007). i La retina recibe su abastecimiento i de sangre de los vasos retiñíanos que abastecen la parte interna de la retina, y los vasos coroidales que abastecen la parte externa.

Un daño a los vasos retiñíanos ocurre en varios procesos de enfermedad incluyendo retinopatía diabética, retinopatía del prematuro, y oclusiones venosas retinianas central y I ramificada (retinopatías isquémicas). La isquemia retiniana causada por este daño da como I resultado una neo vascularización no deseable. La rÍeovascularización coroidal ocurre en un número de otros procesos de enfermedad, incluyendo DME. En contraste, la vascularización incompleta de la retina es un sello distintivo en pacientes con determinadas enfermedades genéticas, por ejemplo vitreorretihopatía exudativa familiar (VREF) y enfermedad de Norrie causadas por la mutación del receptor de Wnt Frizzled-4 (Fzd4), el co-receptor LRP5 o el ligando secretado Norrina (Berger et al. Nature Genet. 1 :199-203 (1992); Chen et al. Nature Genet. 1 :204-208 (1992); Robitaille et al. Nature Genet. 32:326-30 (2002); Toomes et al. Am. J. Hum. Genet. 74:721-30 (2004)). Modelos para estas enfermedades genéticas están disponibles en ratones en los cuales se ha suprimido la expresión ("knock-out") de los genes homólogos correspondientes.

A pesar de los muchos avances en el campo de la angiogénesis ocular, sigue habiendo una necesidad de identificar blancos y desarrollar medios que puedan complementar o aumentar la eficacia de las terapias existentes.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa, al menos en parte, en los descubrimientos de que TSPAN12 es un componente de la ruta de ¡ transducción de señales mediada por Frizzled-4 y LRP5 e inducida por Norrina, y es requerida para el desarrollo de la angiogénesis patológica. Por lo tanto, Norrina y TSPAN 12 son blancos de fármacos para inhibir la angiogénesis ocular aberrante, incluyendo condiciones que no albergan mutaciones genéticas en los genes de Norrina, : TSPAN 12, Frizzled-4 o LRP5. En consecuencia, la presente invención proporciona nuevos métodos para tratar enfermedades oculares asociadas con la angiogénesis, usando reactivos que bloquean la actividad de Norrina o TSPAN 12. | En un aspecto, la invención proporciona un método para reducir o inhibir la angiogénesis en un sujeto que tiene una enfermedad o condición ocular asociada con la angiogénesis, que comprende administrar al sujeto un antagonista de TSPAN12. En algunas modalidades, el antagonista de TSPAN 12 es un anticuerpo anti-TSPAN12. En algunas modalidades, el antagonista de TSPAN 12 comprende un fragmento de polipéptido de TSPAN 12, incluyendo un dominio extracelular tal como la segunda asa extracelular. En algunas modalidades, el antagonista además comprende una región constante de inmunoglobulina, por ejemplo una Fe de IgG. En algunas modalidades, la enfermedad o condición ocular es seleccionada del grupo consistente en: retinopatía diabética, neovascularización coroidal (NVC), degeneración macular relacionada con la edad (DME), edema macular diabético (EMD), miopía patológica, enfermedad de von Hippel-Lindau, histoplasmosis del ojo, oclusión venosa retiniana central (OVRC), oclusión venosa retiniana central ramificada (OVRRJ, neovascularización de la córnea, neovascularización de la retina, retinopatía del prematuro (RDP), hemorragia subconjuntival y retinopatía hipertensiva. ; En algunas modalidades, el método además comprende administrar un segundo agente antiangiogénico. En algunas modalidades, el segundo agente i antiangiogénico se administra antes o después de la administración del antagonista de TSPAN12. En otras modalidades, el segundo ¡ agente antiangiogénico se administra simultáneamente con el antagonista de TSPAN12J En algunas modalidades, el segundo agente antiangiogénico es un antagonista de Norriria o del factor de crecimiento de células endoteliales vasculares (VEGF). En algunas modalidades, el antagonista de Norrina o antagonista de VEGF es un anticuerpo anti-Norrina o un anticuerpo anti-VEGF (por ejemplo ranibizumab). ¡ En otro aspecto, la invención proporciona un método para reducir o inhibir la angiogénesis en un sujeto que tiene una enfermedad o condición ocular asociada con la angiogénesis, que comprende administrar al sujeto un antagonista de Norrina. En algunas modalidades, el antagonista de Norrina es un anticuerpo anti-Norrina. En algunas modalidades, la enfermedad o condición ocular es ¡ seleccionada del grupo consistente en: I retinopatía diabética, NVC, DME, EMD, miopía patológica, enfermedad de von Hippel- Lindau, histoplasmosis del ojo, OVRC, OVRR, neovascularización de la córnea, neovascularización de la retina, RDP, hemorragia subconjuntival y retinopatía hipertensiva.

En algunas modalidades, el método además comprende administrar un segundo agente antiangiogénico. En algunas modalidades, el segundo agente antiangiogénico se administra antes o después de la administración del antagonista de Norrina. En otras modalidades, el segundo agente antiangiogénico se administra simultáneamente con el antagonista de Norrina. ; En algunas modalidades, el segundo agente antiangiogénico es un antagonista de VEGF1, por ejemplo un anticuerpo anti-VEGF tal como ranibizumab. ¡ En otro aspecto, la invención proporciona un método para tratar una enfermedad o condición ocular asociada con la angiogénesis no deseada en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un antagonista de TSPAN12. En algunas modalidades, el antagonista de TSPAN12 es un anticuerpo anti-TSPAN12. En algunas modalidades, el i antagonista de TSPAN12 comprende un fragmento de polipéptido de TSPAN12, incluyendo un dominio extracelular tal como la segunda asa extracelular. En algunas modalidades, el antagonista además comprende una región constante de inmunoglobulina, por ejemplo una Fe de IgG. En algunas modalidades, la enfermedad o condición ocular es seleccionada del grupo consistente en: retinopatíás proliferativas incluyendo retinopatía diabética proliferativa, NVC, DME, retinopatíás diabética y otras relacionadas con isquemia, EMD, miopía patológica, enfermedad dejvon Hippel-Lindau, histoplasmosis del ojo, OVRC, OVPvR, neovascularización de la córnea, neovascularización de la retina, RDP, hemorragia subconjuntival y retinopatía hipertensiva.

En algunas modalidades, el método además comprende administrar un segundo agente antiangiogénico. En algunas modalidades, el segundo agente antiangiogénico se administra antes o después de la administración del antagonista de TSPAN12. En otras modalidades, el segundo agente antiangiogénico se administra simultáneamente con el antagonista de TSPAN12.: En algunas modalidades, el segundo agente antiangiogénico es un antagonista de Norriná o VEGF. En algunas modalidades, el antagonista de Norrina o antagonista de VEGF! es un anticuerpo anti-Norrina o un anticuerpo anti-VEGF (por ejemplo ranibizumab). ! En otro aspecto, la invención proporciona un método para tratar una enfermedad o condición ocular asociada con la angiogénesis no deseada en un sujeto, que i comprende administrar al sujeto un antagonista dé Norrina. En algunas modalidades, el i antagonista de Norrina es un anticuerpo anti-Norrina. En algunas modalidades, la i -enfermedad o condición ocular es seleccionada del grupo consistente en: retinopatías proliferativas incluyendo retinopatía diabética proliferativa, NVC, DME, retinopatías diabética y otras relacionadas con isquemia, EMD, miopía patológica, enfermedad de von Hippel-Lindau, histoplasmosis del ojo, OVRC, OyRR, neovascularización de la córnea, neovascularización de la retina, RDP, hemorragia subconjuntival y retinopatía hipertensiva.

En algunas modalidades, el método además comprende administrar un i ~ segundo agente antiangiogénico. En algunas modalidades, el segundo agente antiangiogénico se administra antes o después dé la administración del antagonista de Norrina. En otras modalidades, el segundo agente antiangiogénico se administra simultáneamente con el antagonista de Norrina. i En algunas modalidades, el segundo agente antiangiogénico es un antagonista de VEGF;, por ejemplo un anticuerpo anti-VEGF tal como ranibizumab. i I En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir un anticuerpo usando un péptido constituido esencialmente por los amino ácidos CRREPGTDQMMSLK (SEQ ID NO: 5). En algunas modalidades, el método comprende inmunizar un animal con el péptido. En algunas modalidades, el método comprende sondear una biblioteca (por ejemplo, una biblioteca de Fabs) para identificar un anticuerpo i o fragmento de anticuerpo que se une al péptido. En algunas modalidades, la invención proporciona anticuerpos generados por este métodq. En algunas modalidades, la invención I proporciona un método para detectar TSPAN12 usando estos anticuerpos.

En otro aspecto, la invención proporciona métodos in vitro e in vivo para inhibir la formación de multímeros de FZD4, que ¡comprenden administrar un antagonista de TSPAN12. En otro aspecto, la invención proporciona métodos in vitro e in vivo para inhibir la señalización mediada por Norrina, que comprenden administrar un antagonista de TSPAN12. En algunas modalidades, el antagonista de TSPAN12 es un anticuerpo anti-TSPAN12. En algunas modalidades, el antagonista de TSPAN12 comprende un fragmento de polipéptido de TSPAN12, incluyendo un dominio extracelular tal como la segunda asa extracelular. En algunas modalidades, el antagonista además comprende una región i constante de inmunoglobulina, por ejemplo una Fe de IgG.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para tratar a un sujeto con una enfermedad ocular congénita causada por ¡una mutación genética en cualquiera de los genes de Norrina, TSPAN12, FZD4 o LRP5, que comprende administrar al sujeto un agente que aumenta la formación de multímeros ide FZD4. En algunas modalidades, la enfermedad es VREF, enfermedad de Norrie o enfermedad de Coate. En algunas modalidades, el agente que aumenta la formación de multímeros de FZD4 es seleccionado del grupo consistente en: Norrina, anticuerpo nti-FZD4, anticuerpo anti-LRP5, y un anticuerpo biespecífico anti-FZD4/anti-LRP5. En algunas modalidades, la mutación genética deteriora la señalización mediada por FZE>4. En algunas modalidades, la mutación genética en el sujeto produce en el sujeto un prod: ücto de proteína aberrante, seleccionado i j del grupo consistente en: Norrina-C95R, FZD4-M105V y FZD4-M157V. En algunas modalidades, la presencia de la mutación en el sujeto se detecta antes de tratar al sujeto.

BREVE DESCRIPCIÓN DÉ LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra secciones retinianas representativas de retinopatía del prematuro (RDP) para ratones de tipo silvestre (parte superior) y ratones que no expresan TSPAN 12 (KO) (parte inferior). ! j La Figura 2 muestra los resultados cuantitativos del número de núcleos neovasculares observados en secciones retinianas dé RDP de ratones de tipo silvestre (WT; i izquierda) y TSPAN12 KO (Hom; derecha). ¡ La Figura 3 muestra que TSPAN 12 ¡aumenta la transducción de señales por Fzd4/LRP5 mediada por Norrina. ¡ La Figura 4 muestra que el aumento causado por TSPAN 12 de la transducción de señales mediada por Norrina es específico para Fzd4. i La Figura 5 muestra que TSPAN12¡ no aumenta la transducción de señales mediada por Wnt3a.

La Figura 6 muestra que Norrina ise une a Fzd4 pero no a LRP5 ni a TSPAN12. : I La Figura 7 muestra que Norrina se! unió a células que expresan Fzd4 pero no a células que expresan Fzd5, LRP5 o TSPAN12, y que Norrina no coinmunoprecipita con TSPAN12.

La Figura 8 muestra que TSPAN 12 rio se asocia con LRP5.

La Figura 9 muestra que TSPAN12 no aumenta la unión de Norrina a Fzd4.

La Figura 10 muestra que la coexpresión de TSPAN12 no altera la expresión de Fzd4 en la membrana plasmática.

La Figura 11 muestra las estructuras de orden superior formadas por Norrina i de tipo silvestre y Norrina muíante C95R.

La Figura 12 muestra que la sobre-expresión de TSPAN12 puede compensar los defectos en Norrina C95R monomérica. ¡ I La Figura 13 muestra que TSPAN12 regula el agrupamiento ("clustering") de FZD4 durante la señalización. ! DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS i Definiciones A menos que se definan de otra manera, los términos técnicos y científicos i usados aquí tienen los mismos significados entendidos comúnmente por un técnico de nivel medio en el arte al cual pertenece esta invención.! Véase por ejemplo, Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, ?? 1994); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, NY 1989). ; Para los propósitos de la presente invención, determinados términos se definen a continuación.

Como se usan aquí, los términos ÍTSPAN12", "polipéptido TSPAN12", "Norrina" y "polipéptido Norrina" se refieren a un polipéptido que tiene la secuencia de amino ácidos de un polipéptido TSPAN12 o ; Norrina derivado de la naturaleza, independientemente de su modo de preparación o especie. Así, estos polipéptidos pueden tener la secuencia de amino ácidos de TSPAN12 o Norrina que existen en la naturaleza de un humano, un ratón o cualquier otra especie. j Una secuencia de amino ácidos de TSPAN12 humana de longitud completa es: j MAREDSV CLRCLLYALNLLFWLMSISVLAVSAW RDYL NVLTLTAETRVEEAVILTYFP VVHPVMIAVCCFLIIVGMLGYCGTVKR LLLLAW FGSLLVIFCVELACGVWTYEQEL VP VQWSDMVTLKARMTNYGLPRYRWLTHAWNFFQ REFPGCSKQAHQEDLSDLYQEGCGKKMYSFLRGT QLQVLRFLGISIGVTQILAMILTITL LWALYYDRREPGTDQMMSLK DNSQHLSCPSVELIÍKPSLSRIFEHTSJXLANSFNTHFEMEEL (SEQ ID NO:l). | Una secuencia de amino ácidos de TSPAN12 de ratón de longitud completa es: i MAREDSVKCLRCLLYALNLLFWLMSÍSVLAVSA MRDYLMWLTLTAETRVEEAVILTYFP i VVHPVMIAVCCFLIIVGMLGYCGTVKRNLLLLAWY;FGTLLVIFCVELACGVWTYEQEVMVP VQWSDMVTLKARMTNYGLPRYRWLTHAWJSTifFQREGCGKKMYSFLRGTKQLQVLRFLGISIG VTQILAMILTITLLWALYYDRREPGTDQMLSLKNDTSQHLSCHSVELLKPSLSRIFEHTSM ANSFNTHFEMEEL (SEQ ID NO: 2). ! Una secuencia de amino ácidos de Nórrina humana de longitud completa" es: MRKHVLAASFSMLSLLVIMGDTDSKTDSSFIMDSD'PRRCMRHHYVDSISHPLYKCSSKMVL LARCEGHCSQASRSEPLVSFSTVLKQPFRSSCHCCRPQTSKLKALRLRCSGGMRLTATYRY ILSCHCEECNS (SEQ ID NO: 3). ; j I Una secuencia de amino ácidos de Nórrina de ratón de longitud completa es: una fuente natural o ha sido preparado por métodos recombinantes o sintéticos y purificado.

I Un polipéptido "purificado" es sustancialmente libre de otros polipéptidos o péptidos.

"Sustancialmente libre" significa aquí menos de alr'ededor de 5%, de preferencia menos de alrededor de 2%, de mayor preferencia menos de álrededor de 1 %, de mayor preferencia I aún, menos de alrededor de 0,5%, de máxima preferencia, menos de alrededor de 0,1 % de contaminación con otras proteínas de la fuente. j El término "antagonista" se usa en el sentido más amplio, e incluye cualquier molécula que bloquea, inhibe o neutraliza, parcial o totalmente, una actividad biológica de un polipéptido. Por ejemplo, un j antagonista de TSPAN12 o Norrina bloqueará, inhibirá o neutralizará, parcial o totalmente, la capacidad de TSPAN12 o Norrina para transducir o iniciar la señalización inducida por Norrina o para permitir la I formación de vasos sanguíneos patológicos en ! el ojo. Las moléculas antagonistas adecuadas incluyen específicamente antagonistas :que son anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, fragmentos o variantes de la secuencia de amino ácidos de un polipéptido TSPAN12 o Norrina nativo, péptidos, fragmentos splubles de co-receptor(es) de TSPA 12 j o Norrina, ARNs antisentido, ribozimas, iARN, pequeñas moléculas orgánicas, etc. Los métodos para identificar antagonistas de un polipéptido TSPAN12 o Norrina pueden comprender poner en contacto el polipéptido TSPAN12 o Norrina con una molécula antagonista candidata, y medir un cambio detectable en una o más actividades biológicas normalmente asociadas con el polipéptido.

"Activo" o "actividad", para los propósitos de la presente, se refiere a forma(s) de TSPAN12 o Norrina que conserva(n) una actividad biológica y/o inmunológica, donde actividad "biológica" se refiere a una función biológica causada por TSPAN12 o Norrina que no es la capacidad para inducir la producción de un anticuerpo, y una actividad "inmunológica" se refiere a la capacidad para inducir la producción de un anticuerpo contra un epítope antigénico poseído por TSPAN12 o Norrina. Las actividades biológicas principales de TSPAN12 y Norrina son la transduccion o iniciación de la señalización inducida por Norrina y la inducción ; de la formación de vasos sanguíneos patológicos en el ojo. i "Co-receptor de TSPAN12" o "có-receptor de Norrina" se refieren a moléculas a las cuales se une TSPAN12 o Norrina y que median una actividad biológica de TSPAN12 o Norrina. ¡ El término "anticuerpo" se usa aquí en el sentido más amplio y abarca específicamente anticuerpos monoclonales humanos, no humanos (por ejemplo, de muriho) y humanizados (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), y i fragmentos de anticuerpos siempre que exhiban la actividad biológica deseada.

"Anticuerpos nativos" son habitualmente glicoproteínas heterotetraméricas de alrededor de 150.000 daltons, compuestas de dos cadenas livianas (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena liviana está enlazada a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, en tanto que el número de uniones disulfuro varía entre las cadenas pesadas de los diferentes isotipos de inmunoglobulinas. Cada cadena pesada y liviana tiene también puentes de disulfuro intracadenas espaciados regularmente. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena liviana tiene un ¡dominio variable (VL) en un extremo y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena liviana está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena liviana está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que residuos de amino ácidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de la cadena liviana y la cadena pesada. ¡ La digestión con papaína de los ! anticuerpos produce dos fragmentos idénticos que se unen al antígeno llamados fragmentos "Fab", cada uno con un sitio único de unión al antígeno, y un fragmento "Fe" residual,: cuyo nombre refleja su capacidad para i cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina: proporciona un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación con el antígeno y todavía es capaz de entrecruzarse con el antígeno. \ I "Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio completo de reconocimiento y unión al antígeno. Esta región está constituida por un dímero de un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena liviana, en asociación I no covalente estrecha. : El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena liviana y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el terminal carboxi del dominio CH1 de la cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región de bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la denominación que se da aquí al Fab' en que el o los residuos de cisteína de los dominios constantes llevan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpos F(ab')2 fueron producidos originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas de bisagra entre ellos. También se¡ conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos. ¡ Las "cadenas livianas" de los anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrados pueden ser asignadas a uno de dos tipos claramente definidos llamados kappa (?) y lambda (?), en base a las secuencias de amino ácidos de sus dominios i constantes. i Dependiendo de la secuencia de amino ácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden ser asignadas a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de éstas pueden ser divididas adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2. Los dominios constantes de ¡cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, d, e, ? y µ, respectivamente. Las I estructuras de subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.

Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo de longitud completa, generalmente el dominio variable o de unión al antígeno del mismo.

Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen los: fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv.

El término "anticuerpo monoclonal", como se usa aquí, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, o sea, los anticuerpos individuales que constituyen la población son idénticos, excepto por las posibles mutaciones que se producen naturalmente y que pueden estar presentes en cantidades minoritarias. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos y están dirigidos contra un sitio antigénico único. Además, al contrario de las preparaciones de I anticuerpos (policlonales) convencionales que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopés), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un determinante único en el antígeno¡. El calificativo "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que se obtiene de una población sustancialmente homogénea I de anticuerpos, y no debe interpretarse como que relquiere la producción del anticuerpo por algún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonal es que serán usados de acuerdo con la presente invención pueden prepararse por el método del hibridoma, descrito por primera vez por Kohler et al, Nature, 256:495 (1975), o pueden prepararse por métodos de ADN recombinante (véase por ejemplo, la patente norteamericana US N° 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden ser aislados de bibliotecas de anticuerpos en fagos, usando las técnicas descritas en Clackson et al, Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al, J. Mol Biol, 222:581-597 (1091), por ejemplo.

Los anticuerpos monoclonales incluyen aquí específicamente anticuerpos "quiméricos", en los cuales una porción de la cadena pesada y/o liviana es idéntica u homologa a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie i particular o pertenecientes a una clase o subclase particular de anticuerpos, mientras que el resto de la o las cadenas es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, y también fragmentos de estos anticuerpos siempre que exhiban la actividad biológica deseada (patente norteamericana US N° 4.816.567; Morrison et al., Proc. Nati.

Acad. Sci. USA, 81 :6851-6855 (1984)). j Formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, de murino) son anticuerpos quiméricos que contienen una; secuencia mínima derivada de una I inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo que recibe o aceptor) en que residuos de una región hipervariable del aceptor son reemplazados por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata, conejo o primate no humano, que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, residuos de I la región de armazón (FR) de la inmunoglobulina humana son reemplazados por residuos I no humanos correspondientes. Más aún, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo aceptor ni en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se efectúan para refinar aún más el desempeño del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustanciálmente el total de al menos uno, y ! típicamente dos, dominios variables, donde todas1 o sustanciálmente todas las regiones hipervariables corresponden a las de una inmunoglobulina no humana, y todas o sustanciálmente todas las FRs son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente comprenderá también al menos una porción de una i región constante (Fe) de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana.

Para mayores detalles, véase Jones et al, Nature, 321 :522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol, 2:593-596 (1992).

Como se usa aquí, "tratamiento" es un planteamiento para obtener resultados clínicos beneficiosos o deseados. Para los propósitos de esta invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no están limitados a, alivio de los síntomas, disminución del grado de la enfermedad, estado de! enfermedad estabilizado (o sea, que no empeora), demora o lentificación de la progresión de la enfermedad, mejoría o paliación del estado de enfermedad, y remisión (ya sea parcial o total), ya sean detectables o no detectables. "Tratamiento" es una intervención efectuada con la intención de prevenir el I desarrollo o alterar la patología de un trastorno. 1 En consecuencia, "tratamiento" puede referirse a tratamiento terapéutico o a medidas profilácticas o preventivas. Quienes tienen necesidad de tratamiento incluyen aquéllos que ya tienen el trastorno y también aquéllos en quienes el trastorno debe ser prevenido. Específicamente, el tratamiento puede I directamente prevenir, lentificar o disminuir de otra1 manera la patología de la degeneración o daño celular, tal como la patología de las células tumorales en el tratamiento del cáncer, o puede hacer que las células sean más susceptibles al tratamiento con otros agentes terapéuticos.

Administración "crónica" se refiere a la administración del o de los agentes en un modo continuo, a diferencia de un modo agudo, de manera de mantener el efecto (actividad) terapéutico inicial por un período de' tiempo prolongado. Administración , "intermitente" es un tratamiento que no se efectúa consecutivamente sin interrupción, sino más bien es de naturaleza cíclica. ! Una "enfermedad neovascular infraocular" es una enfermedad caracterizada por neovascularización ocular. Los ejemplos de enfermedades neovasculares intraoculares incluyen, pero no están limitados a, retinopatías proliferativas incluyendo retinopatía diabética proliferativa, neovascularización coróidal (NVC), degeneración macular relacionada con la edad (DME), retinopatías diabética y otras relacionadas con isquemia, edema macular diabético (EMD), miopía patológica, enfermedad de von Hippel-Lindau, histoplasmosis del ojo, oclusión venosa retiniaña central (OVRC), oclusión venosa i retiniana central ramificada (OVRR), neovascularización de la córnea, neovascularización de la retina, retinopatía del prematuro (RDP), hemorragia subconjuntival y retinopatía hipertensiva. De preferencia, una enfermedad neovascular intraocular excluye condiciones que resultan de mutaciones genéticas en cualquiera de los genes de Norrina, TSPAN12, Frizzled-4 o LRP5. Por ejemplo, una enfermedad neovascular intraocular de la invención de preferencia excluye VREF y enfermedad de Norrie.

La "patología" de una enfermedad incluye todos los fenómenos que comprometen el bienestar del paciente. < La administración "en combinación' con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye la administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden. ¡ El término "vehículos", como se usa aquí, incluye vehículos, excipientes o i estabilizadores farmacéuticamente aceptables que, son no tóxicos para la célula o el mamífero expuesto a los mismos, a las dosificaciones y concentraciones empleadas. Frecuentemente, el vehículo fisiológicamente aceptable es una solución acuosa con pH tamponado. Ejemplos de vehículos fisiológicamente aceptables incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de alrededor de 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como polivinilpirrolidona; amino ácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA; alcoholes de azúcares tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales tal como sodio; y/o tensoactivos no iónicos tales i como TWEEN®, polietilenglicol (PEG) y PLURONICS®.

Una "molécula pequeña" se define aquí como teniendo un peso molecular por debajo de alrededor de 500 Daltons. ¡ Métodos para llevar a cabo la invención Preparación e identificación de antagonistas dejla actividad de TSPAN12 o Norrina Los ensayos de sondeo para fármacos antagonistas candidatos están diseñados para identificar compuestos que se unen ó forman complejos con los polipéptidos TSPAN12 o Norrina, o interfieren de otra manera con su actividad y/o interacción con otras proteínas celulares.

Moléculas pequeñas pueden tener la! capacidad de actuar como antagonistas de TSPA 12 o Norrina y así ser terapéuticamente útiles. Estas moléculas pequeñas pueden incluir moléculas pequeñas que existen en la j naturaleza, compuestos orgánicos o inorgánicos sintéticos y péptidos. Sin embargo, las moléculas pequeñas en la presente invención no están limitadas a estas formas. Extensas bibliotecas de moléculas pequeñas están disponibles en el comercio, y una amplia variedad de ensayos se enseñan aquí o son bien conocidos en el arte para sondear estas moléculas en cuanto a la actividad deseada.

En algunas modalidades, antagonistas de TSPAN12 o Norrina de molécula pequeña son identificados por su capacidad para ¡inhibir una o más de las actividades biológicas de TSPAN12 o Norrina. Así, un compuesto candidato se pone en contacto con TSPAN12 o Norrina y enseguida se evalúa una actividad biológica de TSPAN12 o Norrina. En una modalidad, se evalúa la capacidad de TSPAN12 o Norrina para transducir o iniciar la señalización mediada por Norrina. Un compuesto es identificado como un antagonista cuando la actividad biológica de TSPAN12 o Norrina es inhibida.

Compuestos identificados como antagonistas de TSPÁN12 o Norrina pueden usarse en los métodos de la presente invención. Por ejemplo, antagonistas de TSPAN12 o Norrina pueden usarse para tratar una enfermedad neo vascular intraocular.

Una variedad de modelos animales bien conocidos (incluyendo, por ejemplo, modelos de retinopatía del prematuro y neovascularización coroidal inducida por láser; Ruiz-Edera & Verkman Invest. Ophthalmol. & Vis. Sci. 48(10): 4802-10 (2007), Yu et al. Invest. Ophthalmol. & Vis. Sci. 49(6): 2599-605 (2007)) pueden usarse para entender mejor el rol de TSPAN12 o Norrina en el desarrollo y la patogénesis de una enfermedad neovascular intraocular, y para ensayar la eficacia de agentes terapéuticos candidatos, incluyendo anticuerpos y otros antagonistas de los polipéptidos TSPA 12 o Norrina nativos, tales como antagonistas de molécula pequeña. La naturaleza in vivo de estos modelos los hace particularmente predictivos de las respuestas en pacientes humanos.

Estudios de unión de los anticuerpos j Se ensaya la capacidad de los anticuerpos para unirse a, e inhibir el efecto de, TSPAN12 o Norrina en células reporteras de la señalización Wnt. Ejemplos de métodos se proporcionan en el Ejemplo 2, pero otros métodos se pondrán de manifiesto fácilmente a un técnico de nivel medio en el arte. ¡ Los ejemplos de anticuerpos incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecíficos y heteroconjugados, cuya preparación se describe en la presente. ! ^ Los estudios de unión de los anticuerpos pueden efectuarse con cualquier método de ensayo conocido, tal como ensayos de unión competitiva, ensayos de "emparedado" directos e indirectos y ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques (CRC Press, Ihc, 1987), pp.147-158.

Lós ensayos de unión competitiva sje basan en la capacidad de un estándar marcado para competir con el analito de la muestra de prueba por la unión con una cantidad limitada de anticuerpo. La cantidad de proteíná blanco en la muestra de prueba es inversamente proporcional a la cantidad de estándar que se une a los anticuerpos. Para facilitar la determinación de la cantidad de estándar que se une, los anticuerpos de preferencia son insolubilizados antes o después de la competencia, de manera que el estándar y el analito que están unidos a los anticuerpos puedan ser convenientemente , separados del estándar y el analito que permanecen no unidos.

Los ensayos de emparedado involucran el uso de dos anticuerpos, cada uno capaz de unirse a una porción inmunogénica, o epítope, diferente de la proteína que será detectada. En un ensayo de emparedado, el analito de la muestra de prueba se une a un primer anticuerpo que está inmovilizado en un soporte sólido, y enseguida un segundo anticuerpo se une al analito, formando así un complejo insoluble de tres partes. Véase por ejemplo, la patente norteamericana US N° 4.376.11Q. El segundo anticuerpo puede estar él mismo marcado con una especie detectable (ensayos de emparedado directos) o puede i medirse usando un anticuerpo anti-inmunoglobulina que está marcado con una especie ' I detectable (ensayo de emparedado indirecto). ! Por ejemplo, un tipo de ensayo de emparedado es un ensayo ELISA, en cuyo caso la especie detectable es una enzima.

Para la inmunohistoquímica, la muestra de tejido puede ser fresca o congelada, o puede estar incluida en parafina y fijada con un preservante tal como formalina, por ejemplo.

Las composiciones útiles en el tratamiento de trastornos cardiovasculares, endoteliales y angiogénicos incluyen, sin limitación, anticuerpos, pequeñas moléculas orgánicas e inorgánicas, péptidos, fosfopéptidos, moléculas antisentido, de ARNip y de ribozima, moléculas de triple-hélice, etc., que ihhiben la expresión y/o actividad del producto génico blanco. ! Ejemplos más específicos de antagonistas potenciales incluyen un polipéptido que se une a TSPAN12 o Norrina, y en particular anticuerpos incluyendo, sin limitación, anticuerpos poli- y monoclonales y fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de una sola cadena, anticuerpos anti-idiotípicos, y versiones quiméricas o humanizadas de estos anticuerpos o fragmentos, y también anticuerpos y fragmentos de anticuerpos humanos. Para TSPAN12, determinados dominios extracelulares también pueden servir como antagonistas (véase por ejemplo, Ho et al. J. Virol. 80(13): 6487-96 (2006); Hemler Nature Rev. Drug Discovery 7: 747-58 (2008)). Alternativamente, un antagonista potencial i puede ser una proteína estrechamente relacionada, por ejemplo, una forma mutada de TSPAN12 o Norrina que interactúa con co-receptor(es) pero no imparte ningún efecto, inhibiendo así competitivamente la acción de TSPAN12 o Norrina.

Otro antagonista potencial de TSPAN12 o Norrina es una construcción de ARN o ADN antisentido preparada usando tecnología antisentido donde, por ejemplo, una molécula de ARN o ADN antisentido actúa bloqueando directamente la traducción del ARNm, hibridándose con el ARNm blanco e impidiendo la traducción de la proteína. La tecnología antisentido puede usarse para controlar la expresión génica a través de formación de triple hélice o ADN o ARN antisentido, donde estos dos métodos se basan en la unión de un polinucleótido a ADN o ARN. Por ejemplo, la porción de codificación 5' de la secuencia del polinucleótido, que codifica los polipéptidos maduros TSPAN12 y Norrina de la presente, se usa para diseñar un oligonucleótido de ARN antisentido de alrededor de 10 a 40 pares de bases de longitud. Se diseña1 un oligonucleótido de ADN que sea complementario a una región del gen involucrado én la transcripción (triple hélice - véase Lee et al, Nucí. Acids Res. 6:3073 (1979); Cooneyjeí al, Science 241 :456 (1988); Dervan et al, Science 251 :1360 (1991)), impidiendo así la transcripción y la producción de TSPAN12 o Norrina. Una secuencia "complementária" a una porción de un ARN, como se señala aquí, significa una secuencia que tiene suficiente complementariedad como para ser capaz de hibridarse con el ARN, formando un dúplex estable; en el caso de ácidos i nucleicos antisentido de doble hebra, puede analizarse así una sola hebra del ADN dúplex, o puede determinarse la formación de la triple! hélice. La capacidad de hibridarse dependerá tanto del grado de complementariedad como de la longitud del ácido nucleico antisentido. Generalmente, mientras más largo es el ácido nucleico que se híbrida, más son las desigualdades de bases con un ARN que puede; contener y seguir formando un dúplex estable (o triplex, según sea el caso). Un experto en el arte puede averiguar el grado tolerable de desigualdad usando procedimientos estándar para determinar el punto de fusión i del complejo hibridado. El oligonucleótido de ARN antisentido se híbrida con el ARNm in vivo y bloquea la traducción de la molécula de ARiNm a TSPAN12 (antisentido - Okano, Neurochem. 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene i Expression (CRC Press: Boca Ratón, FL, 1988). j Los oligonucleótidos antisentido pueden ser ADN o ARN o mezclas quiméricas o derivados o versiones modificadas de los mismos, de una sola hebra o de doble hebra. El oligonucleótido puede ser modificado en la especie base, la especie azúcar o el esqueleto de fosfato, por ejemplo, para mejorar la estabilidad de la molécula, la hibridación, etc. El oligonucleótido puede incluir otros grupos adheridos tales como péptidos (por ejemplo, para apuntar a receptores de' células huésped in vivo), o agentes que I facilitan el transporte a través de la membrana celular (véase, por ejemplo, Letsinger, et al, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556 (1989);' Lemaitre, et al, Proc. Nati. Acad. Sci.

U.S.A. 84:648-652 (1987); publicación PCT N° WO 88/09810, publicada el 15 de diciembre de 1988) o la barrera hematoencefálica (véase por ejemplo, la publicación PCT N° WO 89/10134, publicada el 25 de abril de 1988), agentes de corte gatillados por la hibridación (véase por ejemplo, Krol et al, BioTéchniques 6:958-976 (1988)) o agentes intercaladores (véase por ejemplo, Zon, Pharm. Res. 5:539-549 (1988)). Con este fin, el I oligonucleótido puede ser conjugado con otra molécula, por ejemplo un péptido, un agente de entrecruzamiento gatillado por la hibridación, un agente de transporte, un agente de corte gatillado por la hibridación, etc. ! El oligonucleótido antisentido puede ¡comprender al menos una especie base I I modificada, que es seleccionada del grupo que ' incluye pero no está limitado a 5- fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4- acetilcitosina, 5-(carboxi-hidroxilmetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5- carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6- isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina- 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2- metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina,¡ N6-adenina, 7-metilguanina, 5- metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'- metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2- tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, metil éster del ácido uracil-5- oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2- I carboxipropil)uracilo, (acp3)w, y 2,6-diaminopuriná.

El oligonucleótido antisentido también puede comprender al menos una especie azúcar modificada, seleccionada del grupo que incluye pero no está limitado a arabinosa, 2-fluóroarabinosa, xilulosa y hexosa. J i En otra modalidad, el oligonucleótido antisentido comprende al menos un esqueleto de fosfato modificado seleccionado del grupo consistente en un fosforotioato, un fosforoditioato, un fosforoamidotioato, un fosforoamidato, un fosforodiamidato, un metilfosfonato, un alquil fosfotriéster, y un formacetal o análogo del mismo.

En otra modalidad, el oligonucleótido antisentido es un oligonucleótido anomérico. Un oligonucleótido anomérico forma rjíbridos de doble hebra específicos con ARN complementario donde, al contrario de las unidades habituales, las hebras corren paralelas entre sí (Gautier, et al, Nucí. Acids Res. 15:6625-6641 (1987)). El oligonucleótido es un 2'-0-metilribonucleótido (Inpue, et al, Nucí Acids Res. 15:6131- 6148 (1987)), o un análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue, et al, FEBS Lett. 215:327- i 330 (1987)). 1 i En algunas modalidades, los antagonistas son ARNs dúplex inhibidores, por ejemplo ARNip, ARNhc, etc. ¡ Los oligonucleótidos de la invención pueden ser sintetizados por métodos estándar conocidos en el arte, por ejemplo mediante el uso de un sintetizador de ADN automatizado (tal como los disponibles en el comercio de Biosearch, Applied Biosystems, etc.). Como ejemplos, los oligonucleótidos de fosforotioato pueden ser sintetizados por el I método de Stein, et al. (Nucí. Acids Res. 16:3209 (1988)), los oligonucleótidos de metilfosfonato pueden prepararse mediante el uso ! de soportes de polímeros de vidrio de poro controlado (Sarin, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. ¡ U.S.A. 85:7448-7451 (1988)), etc.

Los oligonucleótidos descritos más arriba también pueden ser entregados a las células de manera tal que el ARN o ADN antisentido pueda ser expresado in vivo para inhibir la producción de TSPAN12 o Norrina. ; Cuando se usa ADN antisentido, se prefieren los oligodesoxirribonucleótidos derivados del sitio de traducción-iniciación, por ejemplo, entre alrededor de -10 y +10 posiciones de la secuencia nucleotídica del gen blanco. i Los antagonistas potenciales además incluyen moléculas pequeñas que se unen a TSPAN12 o Norrina, bloqueando así su actividad. Los ejemplos de moléculas pequeñas incluyen, pero no están limitados a, pequeños péptidos o moléculas similares a péptidos, de preferencia péptidos solubles, y compuestos orgánicos o inorgánicos no peptídicos sintéticos. : Antagonistas potenciales adicionales, son las ribozimas, que son moléculas de ARN enzimáticas capaces de catalizar el corte específico del ARN. Las ribozimas actúan por hibridación secuencia-específica con el :ARN blanco complementario, seguida j por corte endonucleolítico. Los sitios de corte específicos de las ribozimas dentro de un blanco de ARN potencial pueden ser identificados por técnicas conocidas. Para más detalles, véase por ejemplo, Rossi, Current Biology ¡4:469-471 (1994), y la publicación PCT N° WO 97/33551 (publicada el 18 de septiembre de' 1997).

A pesar de que ribozimas que i cortan el ARNm en secuencias de i reconocimiento sitio-específicas pueden ser usadas para destruir ARNms del gen blanco, se prefiere el uso de ribozimas cabeza de martillo ("hammerhead"). Las ribozimas cabeza de martillo cortan los ARNms en ubicaciones impuestas por regiones flanqueadoras que I forman pares de bases complementarios con el ARNm blanco. El único requerimiento es que el ARNm blanco tenga la siguiente secuencia de dos bases: 5'-UG-3'. La construcción y la producción de ribozimas cabeza de martillo i son bien conocidas en el arte y están descritas en forma más completa en Myers, Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, New York (1995) (véase especialmente Figura 4, página 833), y en Haseloff y Gerlach Nature, 334:585-591 (1988), que se i incorpora aquí por referencia en su totalidad.

De preferencia, la ribozima es modificada por ingeniería genética tal que el sitio de reconocimiento de corte esté ubicado cerpa del extremo 5' del ARNm del gen blanco, o sea, para aumentar la eficiencia y minimizar la acumulación intracelular de transcriptos de ARNm no funcionales. ! Las ribozimas de la presente ! invención ' también incluyen ARN endorribonucleasas (en adelante, "ribozimas de tipo Cech"), tal como la que existe I naturalmente en Tetrahymena thermophila (conocida como ARN IVS o ARN L-19 IVS) y que ha sido extensamente descrita por Thomas Cech y colaboradores (Zaug, et al, Science, i I 224:574-578 (1984); Zaug y Cech, Science, 231 :470-475 (1986); Zaug, et al, Nature, 324:429-433 (1986); solicitud de patente internácional publicada N° WO 88/04300 de University Patents Inc.; Been y Cech, Ce/7, 47:207-216 (1986)). Las ribozimas de tipo i Cech tienen un sitio activo de ocho pares de bases que se híbrida con una secuencia de i ARN blanco, después de lo cual se produce el icorte del ARN blanco. La invención i comprende aquellas ribozimas de tipo Cech que apuntan a secuencias del sitio activo de ocho pares de bases que están presentes en el gen blanco. j Al igual que en la propuesta aritisentido, las ribozimas pueden estar compuestas de oligonucleótidos modificados (por ejemplo, para una mejor estabilidad, direccionamiento, etc.) y deberían ser entregadas á células que expresan el gen blanco in vivo. Un método de entrega preferido involucra usar una construcción de ADN "que codifica" la ribozima bajo el control de un promotor constitutivo fuerte pol III o pol II, de manera que las células transfectadas produzcan suficientes cantidades de la ribozima como i para destruir mensajes de genes blanco endógenos e inhibir la traducción. Debido a que las ribozimas, a diferencia de las moléculas antisentido, son catalíticas, se require una menor concentración intracelular para lograr eficiencia. · Las moléculas de ácido nucleico eii formación de triple hélice usadas para inhibir la transcripción deben ser de una sola hebra y compuestas de desoxinucleótidos. La composición de bases de estos oligonucleótidos está diseñada de tal manera que promueva la formación de triple hélice mediante las reglas de apareamiento de bases de Hoogsteen, i que generalmente requieren segmentos de tamaño considerable de purinas o pirimidinas en I una hebra de un dúplex. Para mayores detalles, véase por ejemplo, la publicación PCT N° WO 97/33551, supra. \ Los antagonistas de TSPAN12 o Norrina también pueden ser útiles para tratar enfermedades intraoculares incluyendo, i pero no limitadas a, retinopatías proliferativas incluyendo retinopatía diabética próliferativa, neovascularización coroidal (NVC), degeneración macular relacionada con la edad (DME), retinopatías diabética y otras relacionadas con isquemia, edema macular! diabético (EMD), miopía patológica, enfermedad de von Hippel-Lindau, histoplasmosis del ojo, oclusión venosa retiniana central I (OVRC), oclusión venosa retiniana central ramificada (OVRR), neovascularización de la córnea, neovascularización de la retina, retinopatía del prematuro (RDP), hemorragia i subconjuntival y retinopatía hipertensiva. j Protocolos de administración, esquemas, dosis y formulaciones i Los antagonistas de TSPAN12 o ¡Norrina son útiles en farmacia como i agentes profilácticos y terapéuticos para diversos trastornos y enfermedades como se señaló más arriba.

Las composiciones terapéuticas de¡ los antagonistas se preparan para el almacenamiento mezclando la molécula deseada que tiene el grado apropiado de pureza con vehículos, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a. Edición, Osol, A. ed. (1980)), en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos para los sujetos receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos i orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; preservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; : cloruro de hexametonio; cloruro de I benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de alrededor de 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como polivinilpirrolidona; amino ácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraionés formadores de sales tal como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensoactivos no iónicos tales como TWEEN®, PLURONICS® o polietilenglicol (PEG).

Ejemplos adicionales de estos vehículos incluyen intercambiadores iónicos, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas tal como albúmina sérica humana, sustancias tamponantes tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos tales como sulfato de protamina, fosfato hidrogenado disódico, fosfato hidrogenado de potasio, cloruro de sodio, sales ¡de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias a base! de celulosa, y polietilenglicol. Los vehículos para formas tópicas o a base de gel del antagonista incluyen polisacáridos tales como carboximetilcelulosa sódica o metilcelulosa, polivinil-pirrolidona, poliacrilatos, polímeros de bloque de polioxietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y alcoholes de cera de madera. Para todas las administraciones, se usan adecuadamente formas de depósito convencionales. Estas formas incluyen, por ejemplo, microcápsulas, nanocápsulas, liposomas, yesos, formas para inhalación, sprays nasales, tabletas sublinguales y i preparaciones de liberación sostenida. Los antagonistas de TSPAN12 o Norrina típicamente serán formulados en estos vehículos a una concentración de alrededor de 0,1 mg/ml a 100 mg/ml.

Otra formulación comprende incorporar antagonistas de TSPAN12 o Norrina en artículos conformados. Estos artículos pueden usarse para modular el crecimiento celular endotelial y la angiogénesis. i Además, la invasión del tumor y la metástasis pueden ser moduladas con estos artículos.

Los antagonistas de TSPAN12 ó Norrina para ser usados para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se: logra fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles, antes o después de la liofilización y reconstitución. Si está en forma liofilizada, el antagonista de TSPAN12 o Norrina se formula típicamente en combinación con otros ingredientes para su reconstitución con un diluyente apropiado al I momento del uso. Un ejemplo de una formulación ¡líquida de un antagonista de TSPAN12 o Norrina es una solución estéril, clara, incolora y sin preservantes, contenida en un frasco de dosis única para inyección subcutánea. Las composiciones farmacéuticas con preservante adecuadas para uso repetido pueden contener, por ejemplo, dependiendo principalmente de la indicación y el tipo de polipéptido: antagonista de TSPAN12 o Norrina; I un tampón capaz de mantener el pH !en un rango de máxima estabilidad del polipéptido u otra molécula en solución, de preferencia alrededor de 4-8; un detergente/tensoactivo principalmente para estabilizar el polipéptido o molécula contra la agregación inducida por la agitación; un isotonificador; : un preservante seleccionado del grupo de fenol, alcohol bencílico y un haluro, por ejemplo cloruro, de bencetonio; y i - agua. : Si el detergente empleado es no iónico, pueden ser por ejemplo polisorbatos (por ejemplo, POLYSORBATE® (TWEEN®) 20, :80, etc.) o poloxámeros (por ejemplo, POLOXAMER® 188). El uso de tensoactivos no iónicos permite que la formulación sea expuesta a tensiones superficiales de corte sin causar la desnaturalización del polipéptido. Además, estas formulaciones que contienen tensoabtivo pueden emplearse en dispositivos de aerosol, tales como los que se usan en dosificación pulmonar, y pistolas inyectoras de chorro sin aguja (véase, por ejemplo, la patente europea EP 257.956).

Un isotonificador puede estar presente para asegurar la isotonicidad de una composición líquida de un antagonista de TSPAN12 o Norrina, e incluye alcoholes de azúcares polihídricos, de preferencia alcoholes de ^azúcares trihídricos o superiores, tales como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y'manitol. Estos alcoholes de azúcares pueden usarse solos o en combinación. Alternativamente, cloruro de sodio u otras sales inorgánicas apropiadas pueden usarse para hacer isotónicas las soluciones.

El tampón puede ser, por ejemplo, uri tampón de acetato, citrato, succinato o fosfato, dependiendo del pH deseado. El pH de ún tipo de formulación líquida de esta invención es tamponado en el rango de alrededor dé 4 a 8, de preferencia alrededor del pH fisiológico. ; Los preservantes fenol, alcohol bencílico y haluros, por ejemplo cloruro, de bencetonio son agentes antimicrobianos conocidos que pueden emplearse.

Las composiciones del polipéptido terapéutico descritas aquí generalmente se colocan en un contenedor que tiene un orificio de acceso estéril, por ejemplo una bolsa de solución intravenosa o un frasco que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica. Las formulaciones pueden administrarse como inyecciones S repetidas intravenosas (i.v.), subcutáneas (s.c.) l 0 intramusculares (i.m.), o como formulaciones en aerosol adecuadas para administración intranasal o intrapulmonar (para administración intrapulmonar véase, por ejemplo, j la patente europea EP 257 956). Las formulaciones de preferencia se administran aplicación intravítrea (IVT) subconjuntival.

Los polipéptidos terapéuticos también pueden ser administrados en la forma i de preparaciones de liberación sostenida. Los ej'emplos adecuados de preparaciones de j liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen la proteína, cuyas matrices están en¡ la forma de artículos conformados, por ? ejemplo películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, polil(metacrilato de 2-hidroxietilo), como se describe en Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981) y Langer, Chem. i Tech., 12:98-105 (1982) o poli(alcohol vinílico)), poliláctidos (patente norteamericana US N° 3.773.919, patente europea EP 58 481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman et al, Biopolymers, 22: 547-556 (1983)), etileno-acetato de vinilo no degradable (Langer et al., suprd), copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como los Lupron Depot® (rriicroesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolide), y ácido poli-D-(-)-3- hidroxibutírico (patente europea EP 133 988). ! I A pesar de que polímeros tales como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación dé moléculas durante más de 100 días, determinados hidrogeles liberan proteínas durante ¡períodos de tiempo más cortos. Cuando las proteínas encapsuladas permanecen en el cuerpo durante mucho tiempo, ellas pueden desnaturalizarse o sufrir agregación como resultado de la exposición a la humedad a 37°C, I ! resultando una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad.

Pueden diseñarse estrategias racionales para la estábilización de proteínas dependiendo del mecanismo involucrado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la I formación de enlaces S-S intermoleculares a través de intercambio tio-disulfuro, la j estabilización puede lograrse modificando los residuos sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando el contenido de iumedad, usando aditivos apropiados y desarrollando composiciones de matrices de polímeros específicos.

Las composiciones de antagonistas de TSPAN12 o Norrina de liberación sostenida también incluyen antagonistas encerrados en liposomas. Estos liposomas se j preparan por métodos conocidos per se: patente alemana DE 3218121 ; Epstein et al, Proc. Nati. Acad. Sel USA 82:3688-3692 (1985); Hwang et al, Proc. Nati Acad. Sel USA 77:4030-4034 (1980); patentes europeas EP 52 322, EP 36 676, EP 88 046, EP 143 949, EP 142 641; solicitud de patente japonesa 83-118008; patentes norteamericanas US números 4.485.045 y 4.544.545; y patente europea EP 102 324. Normalmente, los liposomas son del tipo pequeño (alrededor de 200-800 Angstroms) y unilaminar, en los cuales el contenido de lípido es mayor que alrededor de 30 moles% de colesterol, donde la i proporción seleccionada se ajusta para una terapia óptima.

I La dosis terapéuticamente eficaz del antagonista de TSPAN12 o Norrina, i ¡ por supuesto, variará dependiendo de factores tales como la condición patológica que será tratada (incluyendo prevención), el método de administración, el tipo de compuesto que se i está usando para el tratamiento, cualquier co-terapiá involucrada, y la edad, peso, condición j médica general, historia médica, etc. del paciente, y su determinación está dentro de la capacidad de un médico tratante. En consecuencia,! será necesario que el terapeuta ajuste la j dosificación y modifique la vía de administración como se requiera para obtener el máximo I efecto terapéutico. ¡ i Con las pautas dadas más arriba, la dosis eficaz generalmente está dentro del i fango de alrededor de 0,001 a alrededor de 1,0 mg/kg, de mayor preferencia alrededor de í 0,01-1,0 mg/kg, de máxima preferencia alrededor dé 0,01-0,1 mg/kg. i La vía de administración del antagonista de TSPAN12 o Norrina es de i acuerdo a métodos conocidos, por ejemplo por inyección o infusión por vía intravenosa, i intramuscular, intracerebral, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intraocular I (incluyendo intravítrea), intra-articular, intrasinbvial, intratecal, oral, tópica o por inhalación, o por sistemas de liberación sostenida cómo ya se señaló.

I Si un péptido o molécula pequeña se emplea como un antagonista, de preferencia es administrado por vía oral o no oral en la forma de un líquido o sólido a mamíferos. ! I Ejemplos de sales farmacológicamente aceptables de moléculas que forman G sales y son útiles aquí, incluyen sales de metales alcalinos (por ejemplo, sal de sodio, sal de i potasio), sales de metales alcalinotérreos (por ejemplo, sal de calcio, sal de magnesio), sales de amonio, sales de bases orgánicas (por ejemplo, sal de piridina, sal de trietilamina), sales i i de ácidos inorgánicos (por ejemplo, clorhidrato, sulfato, nitrato), y sales de ácidos ¡ i orgánicos (por ejemplo, acetato, oxalato, p-toluenosulfonato).

Terapias de combinación j i La eficacia de los antagonistas de TSPA 12 o Norrina para prevenir o tratar el trastorno en cuestión puede mejorarse administrando el agente activo en serie o en i combinación con otro agente que sea eficaz para esos propósitos, ya sea en la misma i composición o como composiciones separadas. ¡ i Por ejemplo, los antagonistas de TSPAN12 o Norrina usados para tratar i condiciones asociadas con la angiogénesis tales ¡ como enfermedades oculares, pueden I combinarse con otros agentes. En particular, es deseable usar antagonistas de TSPAN12 o Norrina combinados entre sí o con otro agente antiangiogénico. En algunas modalidades, i el antagonista de TSPAN12 o Norrina se usa en combinación con un antagonista de VEGF, j por ejemplo un anticuerpo, por ejemplo ranibizumab.

Las cantidades eficaces de los agentes terapéuticos administrados en combinación con el antagonista de TSPAN12 o Norrina serán según el criterio del médico o veterinario. Se efectúa la administración y ajuste de la dosificación para lograr el máximo j control de las condiciones que serán tratadas. La dosis dependerá además de factores tales 1 como el tipo de agente terapéutico que será usado y el paciente específico que será tratado. i Típicamente, la cantidad empleada será la misma dosis que se usa cuando el agente terapéutico dado se administra sin TSPAN12 o Norrina.

Anticuerpos contra TSPAN12 o Norrina Algunos de los fármacos candidatos más promisorios de acuerdo con la presente invención son anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que pueden inhibir la producción de TSPAN12 o Norrina y/o reducir una; actividad de TSPAN12 o Norrina.

Anticuerpos policlonales i I Los métodos para preparar anticuerpos policlonales son conocidos para un i experto en el arte. Anticuerpos policlonales pueden ser producidos en un mamífero, por ejemplo, mediante una o más inyecciones de un| agente inmunizante y, si se desea, un adyuvante. Típicamente, el agente inmunizante y/o adyuvante serán inyectados al i mamífero mediante múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. El agente inmunizante puede incluir el polipéptido TSPA 12 o Norrina o una proteína de fusión del mismo. Puede ser útil conjugar el agente inmunizante con una proteína que se sabe que es inmunogénica en el mamífero que está siendo inmunizado. Los ejemplos de estas proteínas inmunogénicas incluyen, pero no están limitados a, hemocianina de lapa californiana, albúmina sérica, tiroglobulina de bovino e inhibidor de tripsina de poroto de soya. Los ejemplos de adyuvantes que pueden emplearse incluyen adyuvante completo de Freund.y adyuvante MPL-TDM (monofosforil Lípido A o dicorinomicolato de trehalosa sintético).

El protocolo de inmunización puede ser seleccionado por un experto en el arte sin experimentación excesiva. ' j ? Anticuervos monoclonales Los anticuerpos anti-TSPAN12 o ariti-Norrina pueden ser, alternativamente, anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando métodos de hibridoma, tales como los descritos por Kohler y Milstein, Nature 256:495 (1975). En un método de hibridoma, un ratón, hámster u otro animal huésped apropiado es típicamente inmunizado con un agente inmunizante para obtener linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán j específicamente al agente inmunizante.

Alternativamente, los linfocitos pueden ser inmunizados in vitro.

El agente inmunizante típicamente incluirá el polipéptido TSPAN12 o Norrina o una proteína de fusión del mismo. Generalmente, se usan linfocitos de sangre periférica ("PBLs") si se desean células de origen humano, o bien se usan células de bazo o células de ganglios linfáticos si se desean fuentes de mamíferos no humanos. Enseguida, los linfocitos son fusionados con una línea celular inmortalizada usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para forinar una célula de hibridoma. Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice (New York: Academic Press, 1986), pp. 59-103. Las líneas celulares inmortalizadas son habitualmente células de mamíferos transformadas, particularmente células de mieloma de origen de roedor, bovino y humano.

Habitualmente, se emplean líneas celulares de mieloma de rata o ratón. Las células de i hibridoma pueden cultivarse en un medio de cultivó adecuado, que de preferencia contiene i una o más sustancias que inhiben el crecimiénto o supervivencia de las células i inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"), cuyas sustancias impiden el crecimiento de células deficientes en HGPRT.

Las líneas celulares inmortalizadas preferidas son aquéllas que se fusionan eficientemente, sustentan una expresión de alto nivel y estable del anticuerpo por las células productoras de anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más preferidas son líneas de mieloma de murino, i que pueden obtenerse, por ejemplo, de Salk Institüte Cell Distribution Center, San Diego, California y de American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano también han sido descritas para la producción de anticuerpos monoclonales humanos. j Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur et al, Monoclonal Antibody Production' Techniques and Applications (Marcel Dekker, Inc. : New York, 1987) pp. 51 -63.

Enseguida, el medio de cultivo en el cual se cultivan las células de i hibridoma puede ser analizado para determinar la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el polipéptido TSPAN12 o Norriria. De preferencia, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o por un ensayo de unión z'n, vitro, tal como I radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Estas técnicas y ensayos son conocidos en el arte. ÍLa afinidad de unión del .anticuerpo monoclonal pueden determinarse, por ejemplo, mediante el análisis Scatchard de Munson y Pollard, Biochem. 107:220 (1980).

Después de identificar las células de j hibridoma deseadas, los clones pueden ser subclonados por procedimientos de dilución; limitante y cultivados por métodos estándar. Goding, supra. Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, medio de Eagle modificado por Dulbecco y medio RPMI-1640.

Alternativamente, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo como ascitis en un mamífero. ¡ Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden ser aislados o purificados del medio dé cultivo o ¡ fluido de ascitis por procedimientos convencionales de purificación 'de inmunoglobulinas, por ejemplo, proteína A-Sefarosa, cromatografía en hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía por afinidad.

Los anticuerpos monoclonales también pueden fabricarse por métodos de ADN recombinante, tales como los descritos én la patente norteamericana US N° 4.816.567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención puede ser fácilmente aislado y secuenciado usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y livianas de anticuerpos de murino). Las células de hibridoma de la invención sirven como una fuente preferida de este ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse dentro de vectores de expresión, que luego son transfectados en células huésped tales como células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO), o células de mieloma que de otra manera rio producen proteína inmunoglobulina, i para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. El ADN también puede ser modificado, por ejemplo, sustituyendo la secuencia de codificación para los dominios constantes de cadenas pesadas y livianas humanas en lugar de las secuencias de murino homologas (patente norteamericana US N° 4.816.567; Morrison et al, supra) o uniendo en forma covalente a la secuencia de codificación de la i inmunoglobulina, toda o parte de la secuencia de codificación de un polipéptido que no es inmunoglobulina. Este polipéptido que no es inmunoglobulina puede ser sustituido en lugar de los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o puede ser sustituido en lugar de los dominios variables de un sitio de combinación al antígeno de un anticuerpo de la invención, para crear un anticuerpo bivalente quimérico.

Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes. Los métodos para preparar anticuerpos monovalentes son bien conocidos en el arte. Por ejemplo, un método involucra la expresión recombinante de una cadena liviana y una cadena pesada modificada de inmunoglobulina. La cadena pesada es truncada generalmente en cualquier punto en la región Fe, de manera de impedir el entrecruzamiento de las cadenas pesadas. Alternativamente, los residuos de cisteína relevantes son, sustituidos por otro residuo de amino ácido o son delecionados para impedir el entrecruzamiento.

Métodos in vitro también son adecuados para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de los anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente fragmentos Fab, puede efectuarse usando técnicas rutinarias conocidas en el arte. ! ! Anticuerpos humanos y humanizados Los anticuerpos anti-TSPAN12 o anti-Norrina pueden comprender además anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, de murino) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de unión al antígeno de anticuerpos) que contienen la secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo aceptar) en las cuales residuos de una CDR del aceptor son reemplazados por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata o conejo que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, residuos del armazón Fv de la inmunoglobulina humana son reemplazados por residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados i también pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo aceptor ni en las secuencias del armazón o CDR importadas. ¡En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente el total de al menos uno y típicamente dos dominios variables, en los cuales todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana, y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. De preferencia, el anticuerpo humanizado también comprenderá al menos una porción de una región constante (Fe) de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana. Jones et al, Nature 321 :522-525 (1986); Riechmann et al, Nature 332:323-329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en I el arte. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiéné uno o más residuos de amino ácidos introducidos en el mismo desde una fuente que es1 no humana. Estos residuos de amino i ácidos no humanos frecuentemente se denominan residuos "importados", que típicamente son sacados de un dominio variable "importado"'. La humanización puede efectuarse esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature 321 :522-525 (1986); Riechmann et ai, Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)), sustituyendo CDRs o secuencias de CDRs de roedor en lugar de las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. En consecuencia, estos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente norteamericana US N° 4.816.567), donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una 'especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR están sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores. ¡ Los anticuerpos humanos también pueden ser producidos usando diversas técnicas conocidas en el arte, incluyendo bibliotecas de exhibición en fagos. Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991); Marks et: al, J. Mol. Biol. 222:581 (1991). Las técnicas de Colé et al. y Boerner et al. también están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos. Colé et al, Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) y Boerner et al , J. Immunol. 147(l):86-95 (1991). De manera similar, anticuerpos humanos pueden prepararse introduciendo loci de inrnunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo ratones en los cuales los genes de inrnunoglobulina endógenos han sido ¡parcial o completamente inactivados. i Después del desafío, se observa una producción de anticuerpos humanos que se asemeja mucho a la que se ve en seres humanos en todos los aspectos, incluyendo reordenamiento de genes, ensamblaje y repertorio de anticuerpos. Esta propuesta se describe, por ejemplo, en las patentes norteamericanas US números 5.545.807, 5.545.806, 5.569.825, 5.625.126, 5.633.425 y 5.661.016, y en las siguientes publicaciones científicas: Marks et al, Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg et al, 'Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature, 368:812-813 (1994); Fishwild et al, Nature Biotechnology 14:845-851 (1996); i Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995). ¡ Anticuerpos biespecíficos ¡ Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales, de preferencia humanos o humanizados, que tienen especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de unión es para el polipéptido TSPAN12 o Nortina, y la otra es para el polipéptido o cualquier otro antígeno. Los ejemplos incluyen una proteína de la superficie celular o receptor o subunidad de receptor.

Los métodos para fabricar anticuerpos biespecíficos son conocidos en el arte. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la co-expresión de dos pares de cadena pesada-cadena liviana de inmunoglobulina, donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades. Milstein & Cuello, Nature 305:537-539 (1983). Debido al surtido aleatorio de cadenas pesadas y livianas de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez diferentes moléculas de anticuerpo, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula, correcta habitualmente se efectúa mediante pasos de cromatografía por afinidad. Procedimientos similares se divulgan en la patente WO 93/08829, publicada el 13 de mayo de 1993, y en T mnecker et al, EMBO J. 10:3655-3659 (1991). ; Dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) pueden ser fusionados a secuencias de dominios constantes de inmunoglobulinas. La fusión de preferencia es con un dominio i constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones de bisagra, CH2 y CH3. Es preferible qtfe la primera región constante de cadena pesada (CH1), que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena liviana, esté presente en al menos una de las fusiones. ADNs ique codifican las fusiones de la cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena liviana de inmunoglobulina, son insertados en vectores de expresión separados, y j son co-transfectados en un organismo huésped adecuado. Para mayores detalles sobre la generación de anticuerpos biespecíficos, véase por ejemplo, Suresh et al, Methods in Enzymology 121 :210 (1986).

I Anticuerpos heteroconjusados ! Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos unidos en forma covalente. Estos anticuerpos han sido propuestos, por ejemplo, para direccionar células del sistema inmune a células nó deseadas (patente norteamericana US I N° 4.676.980) y para el tratamiento de la infección.por VIH. Patentes WO 91/00360, WO 92/200373 y patente europea EP 03 089. Está contemplado que los anticuerpos pueden prepararse in vitro usando métodos conocidos en la química de proteínas sintéticas, incluyendo aquéllos que involucran agentes de eritrecruzamiento. Por ejemplo, pueden i construirse inmunotoxinas usando una reacción de intercambio de disulfuros o formando un enlace tioéter. Los ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen iminotiolato y 4-mercaptobutirimidato de metilo y los divulgados, por ejemplo, en la patente norteamericana US N° 4.676.980. ¡ Inmunoliposomas \ Los anticuerpos divulgados aquí también pueden ser formulados como inmunoliposomas. Liposomas que contienen el anticuerpo se preparan por métodos conocidos en el arte, tales como los descritos en Epstein et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang et al, Proc. Nati Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); y las patentes norteamericanas US números 4.485.045 y 4.544.545. Liposomas con tiempo de circulación aumentado se divulgan en la patente norteamericana US N° 5.013.556.

Liposomas particularmente útiles pueden ser generados por el método de evaporación en fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas son eximidos a través de filtros de tamaño de poro definido, para dar liposomas con el diámetro deseado. Fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención pueden ser conjugados con los liposomas, como se describe en Martin et al, J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982), mediante una reacción de intercambio de disulfuros. Un agente quimioterapéutico (tal como doxorrubicina) está contenido opcionalmente ¡dentro del liposoma. Véase Gabizon et al, J. National Cáncer Inst. 81(19):1484 (1989). 1 Composiciones farmacéuticas de anticuerpos \ Los anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido TSPAN12 o Norrina identificado aquí, y también a otras moléculas identificadas por los ensayos de sondeo divulgados aquí, pueden administrarse para el tratamiento de diversos trastornos como se señala más arriba y más abajo, en la forma de composiciones farmacéuticas.

La presente formulación también puede contener más de un compuesto activo, como sea necesario para la indicación particular que está siendo tratada, de preferencia aquéllos con actividades complementarias que no se afectan adversamente unos con otros. Alternativa o adicionalmente, la composición puede comprender un agente que mejora su función. Estas moléculas están presentes convenientemente en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito destinado.

Los ingredientes activos también pueden estar encerrados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o: de gelatina y microcápsulas de poli-(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesféras de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Estas técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences, supra.

Las formulaciones que serán usadas para administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente por filtración' a través de membranas de filtración estériles. ! Pueden elaborarse preparaciones dé liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices están en la forma de artículos conformados, por ejemplo películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) o poli(alcohol vinílico)), poliláctidos (patente norteamericana US N° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y ? etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como los LUPRON DEPOT® (microesféras inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolide), y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. A pesar de que polímeros tales :como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de'; moléculas durante más de 100 días, determinados hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante mucho tiempo, ellos pueden desnaturalizarse o sufrir agregación como resultado de la exposición a la humedad a 37°C, resultando una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Pueden diseñarse estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo involucrado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S-S intermoleculares a través de intercambio tio-disulfuro, la estabilización puede lograrse modificando los residuos sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos apropiados y desarrollando composiciones de matrices de polímeros específicos. i Métodos de tratamiento usando el anticuerpo Está contemplado que los anticuerpos contra TSPAN12 o Norrina pueden i usarse para tratar diversas condiciones asociadas con la angiogénesis, como se señaló más arriba. ; Los anticuerpos son administrados a un mamífero, de preferencia un ser humano, de acuerdo con métodos conocidos, tal como administración intravenosa como un bolo o por infusión continua durante un período de tiempo, por vía intravítrea, intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o por inhalación. La administración intravítrea del anticuerpo es preferida. j En una modalidad, la neovascularización ocular patológica es atacada con una terapia de combinación. El anticuerpo anti-TSPAN12 y/o anti-Norrina y otro i anticuerpo (por ejemplo, anti-VEGF) son administrados a los pacientes en dosis terapéuticamente eficaces. j Por ejemplo, dependiendo del tipo y gravedad del trastorno, de alrededor de i 1 µ??/kg a 50 mg/kg (por ejemplo, 0,1-20 mg/kg) de anticuerpo es una dosificación candidata inicial para administración al paciente, ya sea por una o más administraciones separadas, o por infusión continua. Una dosificación típica diaria o semanal puede estar en el rango de alrededor de 1 µg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados más arriba. Para administraciones repetidas por varios días o más tiempo, dependiendo de la condición, el tratamiento se repite o se mantiene hasta que se produce una supresión deseada de los síntomas del trastorno. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles. El progreso de está terapia es monitoreado fácilmente por técnicas y ensayos convencionales, incluyendo por ejemplo, formación de imágenes radiográficas del tumor. ¡ ' Los siguientes Ejemplos se presentan sólo para propósitos ilustrativos, y no están destinados a limitar el alcance de la presente invención de ninguna manera.

Las enseñanzas de todas las patentes! y referencias de la literatura citadas en la presente memoria se incorporan aquí por referencia en su totalidad.

EJEMPLO^ Los reactivos disponibles en el comercio mencionados en los Ejemplos fueron usados de acuerdo con las instrucciones del: fabricante, a menos que se indique otra cosa. Todas las referencias citadas aquí se incorporan en la presente por referencia.

EJEMPLO 1. TSPA 12 está involucrada en la angiogénesis normal y patológica A pesar de que la región de codificación para TSPAN12 es conocida en varios organismos, incluyendo seres humanos y ratones (véase por ejemplo, GenBank® Números de acceso NM_012338 para hTSPAN12 y NM_173007 para mTSPA 12), no se I ha identificado ninguna función para la misma. Para comenzar a dilucidar su función, ratones "knockout" (KO) para TSPAN12 fueron generados usando métodos convencionales. Específicamente, la construcción para direccionamiento fue electroporada en células 129/SvEvBrd (Lex-2) ES y los clones ¡blanco fueron identificados usando un ensayo de inmunotransferencia "Southern blot". i Células de un clon blanco fueron inyectadas en blastocistos de C57BL/6 (albino). Las quimeras resultantes fueron apareadas con hembras C57BL/6 (albino) para generar ratones que eran heterocigotos para la mutación, y posteriormente fueron retrocruzados en un ambiente de C57/BL6 (>N3) y usados para análisis fenotípico y otros experimentos. Los ratones TSPAN12-/- eran viables y fértiles.

Generamos un suero policlonal de conejo denominado aTSPAN12-Anaspec- C contra el péptido intracelular C-terminal CRREEGTDQMMSLK (SEQ ID NO: 5) y lo purificamos por afinidad. También preparamos un segundo suero policlonal denominado a-TSPAN12-Josman-B contra un fragmento de TSPAN12 marcado con his, correspondiente a los amino ácidos 116-221 (aal l6-221-His6), expresado en bacterias y purificado. El direccionamiento en los ratones mutantes fue confirmado por inmunotransferencia "Southern blot", PCR e inmunotransferencia "Western blot" en lisados de cabezas de Pl, que fueron enriquecidos para TSPAN12 por inmunoprecipitación usando aTSPAN12-Anaspec-C. j Primero analizamos la expresión I de TSPAN12 en diversos tejidos y encontramos que se expresaba en la vasculatura retiniana en desarrollo en P15 y en las meninges en Pl. Poca o ninguna expresión fue detectada en vasculatura que no era del SNC. Sin embargo, no observamos ninguna alteración morfológica significativa a gran escala en la vasculatura de la NFL en preparaciones completas de retina teñidas con isolectina de ratones TSPAN12 KO, que fueron procesadas de acuerdo con procedimientos publicados (Gerhardt et al, J. Cell. Biol. 161(6):l 163-77 (2003)). De acuerdo con esto, i analizamos los ratones mutantes para TSPAN12 eri cuanto a fenotipos en una variedad de modelos de enfermedades oculares. \ Crías de ratones de ocho cruzas het! x het de TSPAN12 (C57BL/6) fueron generadas y usadas en un modelo en ratón de retinopatía del prematuro (RDP). Seis carnadas, junto con sus madres nodrizas, fueron colocadas en oxígeno al 75% (hiperoxia) •por un período de cinco días comenzando en P7. En P12, los animales fueron devueltos a condiciones de aire ambiente (normoxia) y mantenidos por cinco días más ( 17). Biopsias de la cola fueron usadas para la determinación del genotipo y los 37 animales se dividieron como sigue: homocigotos de tipo silvestre n=8, heterocigotos n=21, homocigotos mutantes n=8. ? En P17, el ojo derecho fue colocado en PFA al 4% y el ojo izquierdo fue colocado en fijador de Davidson. La córnea y el cristalino fueron removidos de los ojos izquierdos para procesamiento con parafína y seccionamiento. Copas para ojos fueron colocadas en el bloque con el lado del iris hacia abajo, enfrentando la superficie de i seccionamiento. Se obtuvieron secciones espaciadas por 16 micrones y se analizaron para determinar la neovascularización usando el instrumento Apeno ScanScope® equipado con un algoritmo nuclear de diseño personalizado.! En breve, penachos neovasculares íntimamente asociados con la capa fibrosa del nervio (NFL) fueron identificados como regiones de interés para la cuantificación del algoritmo. Un mínimo de 30 secciones por caso, conteniendo núcleos neovasculares, fueron cuantificadas para evaluar la neovascularización de la retina. ¡ En animales de tipo silvestre criados bajo condiciones diseñadas para un modelo de RDP, se identificaron núcleos neovasculares en la interfaz retiniana/vítrea (Figura 1). En contraste, ratones imitantes , para TSPAN12 homocigotos tenían marcadamente menos núcleos neovasculares (Figura 2). Estos datos indicaron que TSPAN12 es requerida para la neovascularización patológica en este modelo de RDP.

Después de observar este fenotipo i en el modelo de RDP, analizamos el desarrollo de la vasculatura retiniana a una escala ¡más fina. En la retina de murino, un plexo vascular superficial en la NFL se establece desde la cabeza del nervio óptico mediante una combinación de brote de vasos, migración y remodelación entre los días postnatales P0 - PIO. Posteriormente, los vasos brotan hacia dentro de la capa plexiforme externa (OPL) y hacia dentro de la capa plexiforme interna (IPL), donde se establecen dos lechos capilares, resultando una arquitectura vascular de tres capas. En P8, encontramos que el desarrollo de la vasculatura de la NFL noj había cambiado significativamente en preparaciones completas de retina de ratones TSPAN12-/-. En secciones transversales, encontramos que la formación de capilares OPL había comenzado en Pl l en los ratones TSPAN12+/+, en tanto que el brote de vasos estaba completamente ausente en los ratones TSPAN12-/-. El hecho de que se detectara expresión de TSPAN12 en la j vasculatura pero no en otros tejidos retiñíanos, junto con la observación de que la histología retiniana aparecía normal en tinciones con hematoxilina y eosina, indica que el defecto . i vascular es primario. En ratones TSPAN12;/- adultos la OPL tampoco estaba vascularizada, confirmando que el defecto no es transitorio. En lugar de un lecho capilar organizado en la IPL, los ratones TSPAN12-/- éxhibían capilares algo ensanchados y tortuosos en el espacio entre la NFL y la IPL. El espesor de las capas nucleares internas y externas en retinas TSPAN12-/- era consistentemente reducido en ratones adultos pero no en ratones en desarrollo, indicando que las células neurales eran afectadas secundariamente por defectos en la vascularización. ¡ En conjunto, el fenotipo de los ratones TSPAN12-/- se caracterizaba por un desarrollo mayormente normal del plexo vascular superficial y una falta de capilares en la OPL, un fenotipo que parecía ser muy similar a los fenotipos informados para ratones mutantes para Fzd4 (Xu et al. Cell 116: 883-95 (2004)) y ratones mutantes para Norrina (Luhmann et al. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 4ó(9): 3372-82 (2005)). Por lo tanto, analizamos si los ratones TSPAN12-/- exhibían aspectos característicos adicionales que son causados por disrupción de Fzd4 o su ligando Norrina. Los ratones mutantes para Norrina exhiben microaneurismas muy característicos que se extienden desde la NFL hacia la capa nuclear interna en P15. Sorprendentemente, el análisis de retinas de ratones TSPAN12-/- en P16 por microscopía confocal, reveló malformaciones vasculares similares a microaneurismas que eran notablemente similares a las descritas en ratones mutantes para Norrina. La similandad de estas malformaciones altamente características fue apoyada por el hecho de que tanto en ratones imitantes para Norrina como en ratones TSPAN12-/-, las malformaciones se desarrollaron en puntos de tiempo virtualmente idénticos. Similaridades adicionales incluían la expresión aberrante de Meca-32 en los vasos retiñíanos de ratones TSPAN12-/-, un marcador para vasos fenestrados que normalmente no se expresa en la vasculatura retiniana pero está regulado hacia arriba en ratones imitantes para Fzd4.

Debido a que Norrina y Fzd4 son un par ligando/receptor que, en conjunto con el co- receptor LRP5, activan la ruta de Wnt canónica y promueven la acumulación de ß-catenina citoplasmática, nuestra caracterización fenotípica e los ratones TSPAN12-/- indicó que TSPAN12 también puede ser requerida para la señalización de Norrina/B-catenina.

EJEMPLO 2. TSPAN12 está involucrada en la señalización Wnt En base a la similaridad entre los fenotipos observados en los ratones TSPAN12, Fzd4 y Norrina KO, efectuamos ensayos de reportero Topflash para determinar si TSPAN12 está involucrada en la señalización ;Wnt/fi-catenina inducida por Norrina a través de Fzd4. La construcción Topflash consiste en luciferasa de luciérnaga bajo un promotor que contiene sitios de consenso LEF/TCF, y que por lo tanto responde a la ¡ señalización por ß-catenina canónica. Una construcción que expresa luciferasa de renilla bajo un promotor constitutivo se usa como control interno. Células transfectadas con construcciones reporteras y receptores fueron activadas con Norrina recombinante 10 nM en presencia de TSPAN12 exógena o vector control. 16-18 horas más tarde, se determinó la actividad del reportero (actividad de luciérnaga! dividida por actividad de renilla). La señalización mediada por Norrina fue aproximadamente 4 veces más alta en las células que i sobre-expresan TSPAN12 que en las células de control (Figura 3, panel de la izquierda - el panel de la derecha muestra que la expresión de la luciferasa de renilla de control era la misma bajo todas las condiciones). Efectuamos experimentos similares en células donde el ARNm de TSPAN12 de tipo silvestre se redujo al usar ARNip (la expresión era ligeramente menor que un quinto de los niveles de control) y encontramos que la expresión mediada por Fzd4/LRP5 e inducida por Norrina se reducía significativamente después de la reducción de la expresión ("knock-down") de TSPAN12.

Para sondear adicionalmente la especificidad del efecto de TSPA 12, efectuamos varios experimentos donde variamos lias construcciones de Frizzled y/o el ligando. Primero efectuamos experimentos usando células transfectadas con el mismo vector que expresa otras construcciones de Frizzled (Fzdl, Fzd2, Fzd7, FzdlO), y también Fzd4. Como se ve en la Figura 4, el principal efecto de TSPAN12 sobre la transducción de señales canónica Wnt/B-catenina mediada por Norrina es específico para Fzd4, con un efecto mucho menor sobre la señalización mediada por FzdlO. Enseguida analizamos la señalización en este ensayo usando Wnt3a como él ligando para inducir la señalización.

Aquí encontramos que TSPAN12 no aumentó significativamente ninguna señalización mediada por FZD (Figura 5). Observamos resultados similares usando Wnt5a como el ligando. | I I EJEMPLO 3. TSPAN12 es parte del complejo Fzd4-Receptor Si TSPAN12 realmente funciona durante la iniciación de la señalización de Norrina/B-catenina, se podría esperar que se colocálizara e interacruara con componentes del complejo del receptor. Con el fin de ensayar esta posibilidad, transfectamos células i I I I Hela con flag-Fzd4 (flag ubicado en forma extrácelular) y HA-TSPAN12. Fzd4 en la membrana plasmática fue detectado con un anticuerpo contra flag en células vivas no permeabilizadas en hielo, y TSPAN12 fue detectada posteriormente después de la fijación y la permeabilización. Este paradigma de tinción reveló abundante expresión de Fzd4 en la i superficie de las células Hela. Fzd4 no estaba homogéneamente disperso en la membrana plasmática, sino que se encontró que estaba condensado en numerosas áreas punteadas.

TSPAN12 se colocalizó en gran medida con los ¡puntos positivos para Fzd4, y además apareció en estructuras intracelulares que no estaban teñidas por el anticuerpo anti-flag, porque la tinción con anti-flag se efectuó en la superficie celular sin permeabilizar las células. En contraste, CD9 y Fzd4 no se colocalizaron. Cuando Fzd4 fue sustituido por Fzd5 y coexpresado con TSPAN12, encontramos que TSPAN12 y Fzd5 estaban localizados mayormente separados (sólo en escasas células que expresaban fuertemente ambas proteínas, la segregación fue parcialmente superada).

Medio acondicionado que conteníá fusiones con fosfatasa alcalina N-terminales de Norrina (AP -Norrina) fue usado para estudiar las interacciones Norrina-receptor (Xu et al. suprd). Transfectamos células HeLa ya sea con Fzd4, LRP5 o TSPAN12 y sondeamos estas células con medio acondicionado que contenía flag-AP-Norrina. Consistentemente con informes previos, encontramos que flag-AP -Norrina se unió eficientemente a células que expresan Fzd4 pero no LRP5. Es importante que Norrina tampoco se unió a células que expresan TSPAN12 sola (Figura 6). Con el fin de sondear las interacciones de TSPAN12^con el complejo del 1 receptor, coexpresamos Fzd4, LRP5 y TSPAN12 en células 293 y usamos Fzd5 como Frizzled alternativo y CD9 como tetraspanina alternativa en los controles respectivos. Después de la incubación de estas células con medio acondicionado que contenía flag-AP -Norrina en hielo (para impedir eventos de internalización) y un lavado extenso, las proteínas de membrana asociadas con Norrina estaban levemente entrecruzadas y después fueron inmunoprecipitadas por el anticuerpo anti-flag. Norrina precipitó eficientemente Fzd4 pero no Fzd5. Más aún, TSPAN12 fue coprecipitada por Norrina con Fzd4 pero no Fzd5, y no fue precipitada cuando no había ningún Frizzled presente. En contraste, CD9, a pesar de estar expresada a un nivel similar a TSPAN12, no fue coprecipitada con Fzd4 por Norrina (Figura 7). Luego, TSPAN12 está físicamente asociada con el complejo Fzd4 receptor. TSPAN12 también fue coprecipitada por Norrina con Fzd4 en ausencia de LRP5 de extractos de detergente (1% de NP-40 + 0,1% de N-dodecil-beta-D-maJtósido) cuando no se usó agente de entrecruzamiento (no mostrado). Cuando TSPAN12 y LRP5 fueron coexpresados y i TSPAN12 fue inmunoprecipitada, no se detectó ninguna asociación con LRP5 (Figura 8). i Dado el fuerte aumento de la señalización de Norrina/B-catenina provocado i por TSPAN12, analizamos si TSPAN12 puede aumentar la unión de Norrina a Fzd4. Para este propósito, células Hela fueron transfectadas con flag-Fzd4, LRP5, TSPAN12 o vector control, y posteriormente sondeadas con varias diluciones de medio acondicionado con ' I flag-AP -Norrina. La unión de flag-AP -Norrina a las células fue similar en presencia o ausencia de TSPAN12 a todas las concentraciones de Norrina ensayadas (Figura 9). Para excluir la posibilidad de que TSPAN12 redujera los niveles de expresión de Fzd4 pero al mismo tiempo aumentara la unión a Norrina, determinamos directamente la expresión de I Fzd4 con un anticuerpo acoplado a HRP dirigido contra el péptido flag. La coexpresión de TSPAN12 no alteró la expresión de Fzd4 en la membrana plasmática (Figura 10). En j conjunto, el hallazgo de que TSPAN12 no coinmunoprecipita con Norrina (a menos que Fzd4 esté presente) (Figura 7) y no aumenta la unión de Norrina a Fzd4 (Figura 9), indica i que TSPAN12 aumenta la señalización de una manera singular. Esto es consistente con las i funciones de varias otras tetraspaninas, que típicamente no se unen directamente a ligandos, j sino que se piensa que organizan microdominios que facilitan la señalización de los receptores insertados. Por lo tanto, enseguida examinamos la posibilidad de que TSPAN12 facilite la interacción entre componentes del complejo del receptor.

EJEMPLO 4. Los defectos de Norrina C95R monomérica son eludidos por TSPAN12 Norrina pertenece al subgrupo de ¡proteínas con nudos de cisteína que forman dímeros mediante enlaces disulfuro intermpleculares (Vitt et al. Mol. Endocrinol. 15(5): 681-94 (2001)), y se ha sugerido que los dímeros de Norrina pueden además ensamblarse en estructuras de peso molecular más íalto. (Pérez- Vilar et al. J. Bipl. Chem. 272(52): 33410-15 (1997)). Norrina está fuertemente asociada con la matriz extracelular (ECM), a menos que Norrina esté fusionada a AP (^ u et al. supra). Mediante la reducción de los enlaces disulfuro intermoleculares, Norrina puede ser completamente convertida en monómeros, alternativamente, se pronostica que la mutación de la cisteína en la posición 95 suprime enlaces disulfuro intermoleculares. Expresamos Norrina de tipo silvestre marcada con V5 y Norrina C95R muíante marcada con V5 en células 293, y extrajimos Norrina de la ECM. SDS PAGE bajo condiciones reductoras ¡reveló monómeros de Norrina de tipo silvestre y muíante que eran virtualmente indistinguibles. Consistentemente con informes previos, el análisis bajo condiciones no reductoras reveló que Norrina de tipo silvestre formaba dímeros y estructuras ensambladas de peso molecular más alto. En contraste, Norrina C95R muíante era mayormeníe monomérica y no formaba grandes estructuras ensambladas (Figura 11). Una pequeña fracción del total de Norrina C95R formó dímeros, posiblemente por asociación no covalente o por disulfuros intermoleculares en una posición distinta de C95. ¡ Pronosticamos que las estructuras ensambladas de Norrina más grandes que los monómeros tienen el potencial de llevar a i moléculas múltiples de Fzd4 a una I proximidad estrecha en la membrana y aumentar la señalización de Norrina/fi-catenina, en tanto que Norrina C95R monomérica no puede hacerlo. Para probar esta idea, transfectamos cantidades crecientes de ADNc de Norrina de tipo silvestre o Norrina C95R en conjunto con los receptores, para inducir actividad Topflash en presencia o ausencia de TSPAN12 en células 293. La expresión de Norrina de tipo silvestre indujo eficientemente la señalización de Norrina/B-catenina cuando 5-1Ó0 ng de plásmido de Norrina fueron cotransfectados con FZD4 y LRP5, y la adición de TSPAN12 aumentó fuertemente esta actividad (Figura 12). Sin embargo, Norrina C95R muíante monomérica fue virtualmente inactiva en células que no sobre-expresaban TSPAN12, incluso a la dosis más alta de 100 i ng de plásmido de Norrina. Consistentemente con la idea de que TSPAN12 puede llevar a los receptores a microdominios y permitirles situarsé cercanos entre sí, TSPA 12 rescató el defecto de señalización de Norrina C95R muíante en gran medida. Además, la adición de i TSPAN12 aumentó la señalización de Norrina de tipo silvestre (Figura 12). En conjunto, i estos datos indicaban que los multímeros de Norrina y TSPAN12 proporcionaban cada uno diferentes medios para llevar a moléculas múltiples <de FZD4 a una estrecha proximidad, y estos dos mecanismos actúan juntos para producir urja señalización máxima. ' i i EJEMPLO 5. TSPAN12 aumenta el agrupamíento ("clustering") de los receptores j Efectuamos un análisis bioquímico del agrupamiento de los receptores usando la mutación descrita anteriormente FZD4-M157V, que deteriora fuertemente la señalización de Norrina/p-catenina pero conserva la capacidad de unirse a Norrina (Xu et al, supra). Con la ayuda de información estructural (Dann et al. Nature 412:86-90 (2001)), se ha propuesto que la mutación M157V afecta la dimerización de FZD4 inducida por Norrina y por consiguiente la multimerizacióh (Dann et al, supra; Toomes et al, j supra; Xu et al, supra). Consistentemente con: informes previos (Xu et al, supra), i encontramos que la señalización mediada por FZD4-M157V estaba severamente deteriorada. Es interesante que la coexpresión de TSPAN12 rescató totalmente el defecto i de señalización de FZD4-M157V (Figura 13A). j Después, utilizamos FZD4-M157V para investigar directamente el rol de TSPAN12 en la multimerización de FZD4. Células 293 fueron transfectadas con TSPAN12 o vector control y cotransfectadas con FLAG®-FZD4 y gD-FZD4, o con FLAG-FZD4-M157V y gD-FZD4-Ml 57V. Las células fueron incubadas en hielo con un medio que contenía Norrina o ningún ligando. Lisados de ¡células fueron inmunoprecipitados con anticuerpo anti-FLAG y sondeados para coinmiinoprecipitación de gD-FZD4. Para permitir la cuantificación de las interacciones pr teína-proteína, no se usó agente de entrecruzamiento en este experimento. Se detectaron niveles básales similares de asociación entre gD-FZD4 y FLAG-FZD4 o gD-FZD4-M157V y FLAG-FZD4-M157V (Figura 13B y datos no mostrados). Cada una de Norrina y TSPAN12 aumentó la cantidad de gD-FZD4 bajada por FLAG-FZD4, y la combinación de Norrina y TSPAN12 aumentó aún más el agrupamiento de FZD4 (Figura 13B, ¡paneles de la izquierda; 13C, barras blancas). Es importante que la mutación M157V ¿eterioró severamente la capacidad de Norrina para agrupar gD-FZD4 con FLAG-FZD4, en tanto que la coexpresión de TSPAN12 compensó este defecto (Figura 13B, paneles de la derecha; 13C, barras oscuras).

En conjunto, estos datos indican que TSPAN12 y Norrina ambas promueven la multimerización de FZD4, y sugieren que la iniciación de la señalización de Norrina/ß- catenina requiere i) factores que promueven la multimerización de FZD4 y ii) activación de FZD4 por unión al ligando. i Enseguida analizamos si la adición de anticuerpos que aumentan el agrupamiento de los receptores FZD4 podía rescatar la actividad de FZD4-M157V. En placas de 24 pocilios, 1,6 x 105 células/pocilio fueron transfectadas con una mezcla de reportero ß-catenina que contenía una mezcla de ADN (Topflash, pRL-CMV, y pCan-myc- lef-1), LRP5 y ya sea FZD4 o FZD4-M157VÍ Veinticuatro horas después de la i transfección, los pocilios indicados recibieron 1 de anticuerpo anti-LRP5/6. Una hora más tarde, 125 ng ml de Norrina recombinanté fueron agregados a los pocilios como se indicó. Después de una incubación adicional de 16 horas a 37°C, las células fueron Usadas y la expresión de luciferasa de luciérnaga y; de renilla fue medida usando reactivos Dual-Glo® de Promega. Los valores para luciferasa de luciérnaga fueron normalizados a la expresión de renilla. Los resultados se muestran en la Tabla 1. En células que expresan FZD4, la actividad del reportero es activada en ~6 veces en presencia de Norrina. Cuando se expresa FZD4-M157V, la activación por Norrina se deteriora significativamente a sólo ~2 veces. Al agregar el anticuerpo contra LRP5,i se rescata parcialmente el defecto de señalización en FZD4-M157 V en aproximadamente 2 veces.

I Tabla 1. El anticuerpo anti-LRP5/6 rescata parcialmente el defecto de FZD4-M157V i EJEMPLO 6. Generación de anticuerpos anti-TSPAN12 y anti-Norrina j Generamos anticuerpos anti-TSPAN12 y anti-Norrina usando múltiples métodos. Por ejemplo, generamos anticuerpos por inmunización y tecnología de hibridoma. También usamos bibliotecas de anticuerpos en fagos sintéticos construidas en un solo armazón (anticuerpo anti-ErbB2 humanizado, 4D5), introduciendo diversidad dentro de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de las cadenas pesadas y livianas (Lee, et al. J. Mol. Biol. 340: 1073-93 (2004); Liang et al. J. Biol. Chem. 281 : 951-61 (2006)). Se efectúa reconocimiento y selección en placas ("píate panning") con bibliotecas ingenuas contra TSPAN12 humana \ marcada con His inmovilizada en i inmunoplacas MaxiSorp®. Después de cuatro rondas de enriquecimiento, los clones son elegidos aleatoriamente y los clones específicos que se unen son identificados usando ensayo ELISA de fagos. Los clones que se unen á hTSPAN12 resultantes son sondeados adicionalmente con proteína TSPAN12 de murino marcada con His, para identificar clones de especies cruzadas. Para cada clon de fago positivo, regiones variables de cadenas pesadas y livianas son subclonados en vectores de expresión pRK, que son modificados por i ingeniería genética para expresar cadenas de IgG de longitud completa. Construcciones de cadenas pesadas y cadenas livianas son co-transfectadas en células 293 o CHO, y los anticuerpos expresados son purificados a partir de medio libre de suero usando una columna de afinidad con proteína A. Los anticuerpos purificados son analizados por un ensayo ELISA para determinar la unión a TSPAN1|2 o Norrina recombinante, y por FACS para determinar la unión a líneas celulares estables (que expresan ya sea TSPAN12 humana de longitud completa o TSPAN12 de murino en conjunto con FZD4, o que expresan Norrina humana o de murino. Enseguida, los anticuerpos son ensayados en cuanto al bloqueo del aumento de la actividad del reportero de Wnt mediada por FZD4/LRP5 y mediada por Norrina por parte de TSPAN12 (anticuerpos anti-TSPAN12), o en cuanto al bloqueo de la señalización inducida por Norrina (anticuerpos anti-Norrina). Para la maduración de la afinidad, bibliotecas en fagos con tres combinaciones diferentes de asas ¡ de CDR (CDR-L3, -Hl y -H2) derivadas del clon de interés inicial, son construidas por una estrategia de aleatorización blanda, de manera que cada posición seleccionada es mutada a un residuo que no es de tipo silvestre o mantenida como de tipo silvestre a una frecuencia de alrededor de 50:50 (Liang et al, 2006, más arriba). Enseguida, clones de alta afinidad son identificados mediante cuatro rondas de reconocimiento y selección ("panning") en fase de solución contra proteínas TSPAN12 marcadas con His tanto humanas como de murino, con una rigurosidad progresivamente aumentada. ¡ EJEMPLO 7. Modelos en murino de enfermedad ocular Ensayamos los anticuerpos o polipéptidos TSPAN12 en modelos de murino.

Para el modelo de RDP en murino, las crías se colocan en oxígeno al 75% (hiperoxia) por un período de cinco días comenzando en P7. En P12, los animales son devueltos a condiciones de aire ambiente (normoxia) y mantenidos por cinco días más (P17). Anticuerpo anti-TSPAN12 o anti-Norrina o asa extracelular grande de TSPAN12 (por ejemplo Ho et al, supra) es inyectado por vía iritravítrea en los animales en P12. Se ensayan niveles de dosis múltiples y frecuencias eft base a predicciones determinadas por afinidad del antagonista y estabilidad. En P17, el ojo derecho se coloca en PFA al 4% y el ojo izquierdo se coloca en fijador de Davidson. La ¡córnea y el cristalino son removidos de los ojos izquierdos para procesamiento con parafina1 y seccionamiento. Copas para ojos se colocan en el bloque con el lado del iris hacia abajo, enfrentando la superficie de seccionamiento. Se obtienen secciones espaciadas por 16 micrones y se analizan para determinar la neovascularización, usando el instrumento Aperio ScanScope® equipado con un algoritmo nuclear de diseño personalizado. : Penachos neovasculares íntimamente i asociados con la NFL son identificados como regiones de interés para la cuantificación del i algoritmo. Un mínimo de 30 secciones por caso, conteniendo núcleos neovasculares, son cuantificadas para la evaluación de la neovascularización de la retina.

También ensayamos anticuerpos ,y polipéptidos en un modelo de neovascularización coroidal inducido por láser en murino. i La memoria escrita que antecede sé considera suficiente para permitir que un experto en el arte lleve a la práctica la invención. Sin embargo, diversas modificaciones de la invención, además de las mostradas y descritas aquí, serán evidentes para los expertos en el arte a partir de la descripción que antecede, y caen dentro del ámbito de las j reivindicaciones adjuntas. i

Claims (50)

I REIVINDICACIONES

1. Un método para reducir o inhibir la jangiogénesis en un sujeto que tiene una enfermedad o condición ocular asociada con la angiogénesis, CARACTERIZADO porque I comprende administrar al sujeto un antagonista de TSPAN12. i I

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque i el antagonista de TSPAN12 es un anticuerpo anti-TSPAN12.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque el antagonista de TSPAN12 comprende un fragmento de polipéptido de TSPAN12.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, CARACTERIZADO porque el fragmento de polipéptido de TSPAN12 comprende un dominio extracelular de TSPAN12. I i

5. El método de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4, CARACTERIZADO porque el antagonista de TSPA 12 además comprende una región constante de inmunoglobulina. \ : j

6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, CARACTERIZADO porque la región constante de inmunoglobulina es una Fe de IgG. i

7. El método de acuerdo con la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque la enfermedad o condición ocular es seleccionada del grupo consistente en: retinopatía diabética, neovascularización coroidal (NVC), degeneración macular relacionada con la edad (DME), edema macular diabético (EMD), miopía patológica, enfermedad de von Hippel-Lindau, histoplasmosis del ojo, oclusión venosa retiniana central (OVRC), oclusión venosa retiniana central ramificada (OVRR ,! neovascularización de la córnea, neovascularización de la retina, retinopatía i del prematuro (RDP), hemorragia subconjuntival y retinopatía hipertensiva. !

8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, CARACTERIZADO porque la enfermedad o condición ocular es seleccionada del grupo consistente en retinopatía diabética, DME, EMD, OVRC y OVRR. ¡

9. El método de acuerdo con la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque además comprende administrar al sujeto un segundo! agente antiangiogénico.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, CARACTERIZADO porque i el segundo agente antiangiogénico se administra antes o después de la administración del antagonista de TSPAN 12. i ¡

11. El método de acuerdo con la reivindicación 9, CARACTERIZADO porque el segundo agente antiangiogénico se administra simultáneamente con el antagonista de TSPAN 12. i

12. El método de acuerdo con la reivindicación 9, CARACTERIZADO porque el segundo agente antiangiogénico es un antagonista de Norrina o del factor de crecimiento de células endoteliales vasculares (VEGF). ¡

13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, CARACTERIZADO porque el antagonista de Norrina es un anticuerpo ariti-Norrina.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 12, CARACTERIZADO porque el antagonista de VEGF es un anticuerpo anti-VEGF.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, CARACTERIZADO porque el anticuerpo anti-VEGF es ranibizumab. !

16. Un método para reducir o inhibir la angiogénesis en un sujeto que tiene una enfermedad o condición ocular asociada con la angiogénesis, CARACTERIZADO porque comprende administrar al sujeto un antagonista de N;orrina.

17. El método de acuerdo con la reivindicación 16, CARACTERIZADO porque el antagonista de Norrina es un anticuerpo anti-Norrina.

18. El método de acuerdo con la reivindicación 16, CARACTERIZADO porque la enfermedad o condición ocular es seleccionada del grupo consistente en: retinopatía diabética, NVC, DME, EMD, miopía patológica, enfermedad de von Hippel- Lindau, histoplasmosis del ojo, OVRC, OVRR, neovascularización de la córnea, neovascularización de la retina, RDP, hemorragia subconjuntival y retinopatía hipertensiva.

19. El método de acuerdo con la reivindicación 18, CARACTERIZADO porque la enfermedad ocular es seleccionada del grupo consistente en retinopatía diabética, DME, EMD, OVRC y OVRR. i

20. El método de acuerdo con la reivindicación 16, CARACTERIZADO porque además comprende administrar al sujeto un segundo agente antiangiogénico.

21. El método de acuerdo con la reivindicación 20, CARACTERIZADO porque el segundo agente antiangiogénico se administra antes o después de la administración del antagonista de Norrina.

22. El método de acuerdo con la reivindicación 20, CARACTERIZADO porque el segundo agente antiangiogénico se ¡ administra simultáneamente con el antagonista de Norrina.

23. El método de acuerdo con la reivindicación 20, CARACTERIZADO porque el segundo agente antiangiogénico es un antagonista de VEGF. i I

24. El método de acuerdo con la reivindicación 23, CARACTERIZADO porque el antagonista de VEGF es un anticuerpo anti-VEGF.

25. El método de acuerdo con la reivindicación 23, CARACTERIZADO porque el anticuerpo anti-VEGF es ranibizumab. i !

26. Un método para tratar una enfermedad o condición ocular asociada con la angiogénesis no deseada en un sujeto, CARACTERIZADO porque comprende administrar al sujeto un antagonista de TSPAN12. ¡

27. El método de acuerdo con la reivindicación 26, CARACTERIZADO porque el antagonista de TSPAN12 es un anticuerpo anti-TSPAN12.

28. El método de acuerdo con la reivindicación 26, CARACTERIZADO porque el antagonista de TSP AN 12 comprende un fragmento de polipéptido de TSPAN 12.

29. El método de acuerdo con la reivindicación 27, CARACTERIZADO porque el fragmento de polipéptido de TSPAN 12 comprende un dominio extracelular de

30. El método de acuerdo con la reivindicación 28 ó 29, CARACTERIZADO i porque el antagonista de TSPAN 12 además comprende una región constante de inmunoglobulina. j

31. El método de acuerdo con la reivindicación 30, CARACTERIZADO porque la región constante de inmunoglobulina es una Fe dé IgG.

32. El método de acuerdo con la reivindicación 26, CARACTERIZADO porque la enfermedad o condición ocular es seleccionada idel grupo consistente en: retinopatías proliferativas incluyendo retinopatía diabética proliferativa, NVC, DME, retinopatías diabética y otras relacionadas con isquemia, EMD, 'miopía patológica, enfermedad de von Hippel-Lindau, histoplasmosis del ojo, OVRC, OVRR, neovascularización de la córnea, neovascularización de la retina, RDP, hemorragia subconjuntival y retinopatía hipertensiva. i

33. El método de acuerdo con la reivindicación 32, CARACTERIZADO porque la enfermedad o condición ocular es seleccionada del grupo consistente en retinopatía diabética, DME, EMD, OVRC y OVRR. j

34. El método de acuerdo con la reivindicación 26, CARACTERIZADO porque además comprende administrar al sujeto un segundo agente antiangiogénico.

35. El método de acuerdo con la reivindicación 34, CARACTERIZADO porque el segundo agente antiangiogénico se : administra antes o después de la administración del antagonista de TSP AN 12. j

36. El método de acuerdo con la reivindicación 34, CARACTERIZADO ¡ porque el segundo agente antiangiogénico se ! administra simultáneamente con el i antagonista de TSP AN 12. j i I

37. El método de acuerdo con la reivindicación 34, CARACTERIZADO porque el segundo agente antiangiogénico es un antagonista de Norrina o VEGF. j

38. El método de acuerdo con la reivindicación 37, CARACTERIZADO porque el antagonista de Norrina es un anticuerpo ahti-Norrina. I i I

39. El método de acuerdo con la reivindicación 37, CARACTERIZADO porque el antagonista de VEGF es un anticuerpo anti-VEGF.

40. El método de acuerdo con la reivindicación 39, CARACTERIZADO porque el anticuerpo anti-VEGF es ranibizumab. '

41. Un método para tratar una enfermedad o condición ocular asociada con la angiogénesis no deseada en un sujeto, CARACTERIZADO porque comprende administrar al sujeto un antagonista de Norrina: : ;

42. El método de acuerdo con la reivindicación 41, CARACTERIZADO porque el antagonista de Norrina es un anticuerpo ¡anti-Norrina.

43. El método de acuerdo con la reivindicación 41, CARACTERIZADO porque la enfermedad o condición ocular es seleccionada del grupo consistente en: i ! retinopatías proliferativas incluyendo retinopatia ! diabética proliferativa, NVC, DME, retinopatías diabética y otras relacionadas con j isquemia, EMD, miopía patológica, enfermedad de von Hippel-Lindau, histoplasmosis del ojo, OVRC, OVRR, neovascularización de la córnea, neovascularización de la retina, RDP, hemorragia subconjuntival y retinopatia hipertensiva. i i

44. El método de acuerdo con la reivindicación 43, CARACTERIZADO porque la enfermedad ocular es seleccionada del grupo consistente en retinopatia diabética, DME, EMD, OVRC y OVRR. i i I

45. El método de acuerdo con la reivindicación 41, CARACTERIZADO porque además comprende administrar al sujeto un s¡egundo agente antiangiogénico. i ;

46. El método de acuerdo con la reivindicación 45, CARACTERIZADO porque el segundo agente antiangiogénico se ¡ administra antes o después de la administración del antagonista de Nortina. i i i

47. El método de acuerdo con la reivindicación 45, CARACTERIZADO porque el segundo agente antiangiogénico se ¡ administra simultáneamente con el antagonista de Norrina. | j i ¡ j

48. El método de acuerdo con la reivindicación 45, CARACTERIZADO porque el segundo agente antiangiogénico es un antagonista de VEGF. I I

49. El método de acuerdo con la reivindicación 48, CARACTERIZADO i porque el antagonista de VEGF es un anticuerpo anti-VEGF. i · i

50. El método de acuerdo con la reivindicación 49, CARACTERIZADO porque el anticuerpo anti-VEGF es ranibizumab. i