CN102149728A - 抑制眼部血管生成的方法 - Google Patents
抑制眼部血管生成的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102149728A CN102149728A CN2009801352804A CN200980135280A CN102149728A CN 102149728 A CN102149728 A CN 102149728A CN 2009801352804 A CN2009801352804 A CN 2009801352804A CN 200980135280 A CN200980135280 A CN 200980135280A CN 102149728 A CN102149728 A CN 102149728A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tspan12
- antagonist
- norrin
- antibody
- angiogenic agent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
- A61P27/10—Ophthalmic agents for accommodation disorders, e.g. myopia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/12—Antihypertensives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Obesity (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明提供使用TSPAN12和Norrin拮抗剂抑制眼部血管发展和治疗相关病症的方法。
Description
相关申请
本申请根据美国专利法119条(e)款(35USC 119(e))要求2008年9月10提交的美国临时申请号61/095,757,2008年10月7日提交的美国临时申请号61/103,502和2009年8月17日提交的美国临时申请号61/234,519的权益,上述每件申请的内容通过引用并入本文。
发明领域
本发明一般涉及可用于治疗与血管生成相关的病症和疾病的组合物和方法。具体地,本发明涉及tetraspanin 12(TSPAN12)和Norrin的拮抗剂。
发明背景
现已相当确定血管生成是促进多种病症发病的重要因子。这些包括实体瘤和转移瘤、眼内新血管疾病(intraocular neovascular disease)如增殖性视网膜病(proliferative retinopathies),例如糖尿病性视网膜病(diabetic retinopathy)、视网膜静脉闭塞(retinal vein occlusion,RVO)、湿性年龄相关的黄斑变性(wet age-related macular degeneration,AMD)、新血管性青光眼(neovascular glaucoma)、移植角膜组织和其它组织的免疫排斥和类风湿性关节炎。Duda等人J.Clin.Oncology(临床肿瘤学杂志)25(26):4033-42(2007);Kesisis等人Curr.Pharm.Des.(现代药物设计)13:2795-809(2007);Zhang和Ma Prog.Ret.& Eye Res.(视网膜和眼研究进展)26:1-37(2007)。
视网膜从视网膜血管和脉络膜血管获得其血液供应,视网膜血管供应视网膜内部部分,脉络膜血管供应外部部分。视网膜血管损伤发生在数种疾病过程中,包括糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病(retinopathy of prematurity)和视网膜中央和分支静脉闭塞(central and branched retinal vein occlusions)(缺血性视网膜病(ischemic retinopathies))。来自这种损伤的视网膜局部缺血导致不良的新血管形成。脉络膜的新血管形成在许多其它疾病 过程(包括AMD)中发生。相比之下,视网膜不完全的血管化是患有某些遗传病的患者的标志,该遗传病例如由Wnt受体Frizzled4(Fzd4)、共受体LRP5或分泌的配体Norrin的突变导致的家族性渗出性玻璃体视网膜病(familial exudative vitreoretinopathy,FEVR)和诺里病(Norrie disease)(Berger 等人Nature Genet.(自然:遗传)1:199-203(1992);Chen等人Nature Genet.(自然:遗传)1:204-208(1992);Robitaille等人Nature Genet.(自然:遗传)32:326-30(2002);Toomes等人Am.J.Hum.Genet.(美国人类遗传性杂志)74:721-30(2004))。可在敲除相应同源基因的小鼠中获得这些遗传病的模型。
尽管在眼部血管生成领域有许多进展,仍然需要鉴定靶点并且开发能够补充或增强现有疗法的效力的方式。
发明概述
本发明至少部分地基于以下发现,TSPAN12是Norrin诱导的、Frizzled-4-和LRP5-介导的信号转导途径的组分并且在病理性的血管生成的发展中是必需的。因此,Norrin和TSPAN12是抑制异常眼部血管生成(包括不含Norrin、TSPAN12、Frizzled-4或LRP5基因的遗传突变的病症)的药物靶点。因此,本发明提供使用阻断Norrin或TSPAN12活性的试剂治疗与血管生成相关的眼部疾病的新方法。
一方面,本发明提供减少或抑制患有与血管生成相关的眼部疾病或病症的受试者中血管生成的方法,该方法包括向该受试者施用TSPAN12拮抗剂。在一些实施方案中,该TSPAN12拮抗剂是抗-TSPAN12抗体。在一些实施方案中,该TSPAN12拮抗剂包含TSPAN12的多肽片段,包括胞外域,如第二胞外环。在一些实施方案中,该拮抗剂还包含免疫球蛋白恒定区,例如IgG Fc。在一些实施方案中,该眼部疾病或病症选自下述各项组成的组:糖尿病性视网膜病(diabetic retinopathy)、脉络膜新血管形成(choroidal neovascularization,CNV)、年龄相关的黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)、糖尿病性黄斑水肿(diabetic macular edema,DME)、病理性近视(pathological myopia)、遗传性斑痣性错构瘤病(von Hippel-Lindau disease)、眼睛的组织胞浆菌病(histoplasmosis of the eye)、视 网膜中央静脉闭塞(central retinal vein occlusion,CRVO)、视网膜分支静脉闭塞(branched central retinal vein occlusion,BRVO)、角膜新血管形成(corneal neovascularization)、视网膜新血管形成(retinal neovascularization)、早产儿视网膜病(retinopathy of prematurity,ROP)、结膜下出血(subconjunctival hemorrhage)和高血压性视网膜病(hypertensive retinopathy)。
在一些实施方案中,该方法还包括施用第二抗-血管生成剂。在一些实施方案中,该第二抗-血管生成剂在施用该TSPAN12拮抗剂之前或之后施用。在一些实施方案中,该第二抗-血管生成剂与该TSPAN12拮抗剂同时施用。在一些实施方案中,该第二抗-血管生成剂是Norrin的拮抗剂或血管内皮细胞生长因子(VEGF)的拮抗剂。在一些实施方案中,该Norrin拮抗剂或该VEGF拮抗剂是抗-Norrin抗体或抗-VEGF抗体(例如,雷珠单抗(ranibizumab))。
另一方面,本发明提供减少或抑制罹患与血管生成相关的眼部疾病或病症的受试者中血管生成的方法,该方法包括向该受试者施用Norrin拮抗剂。在一些实施方案中,该Norrin拮抗剂是抗-Norrin抗体。在一些实施方案中,该眼部疾病或病症选自下述各项组成的组:糖尿病性视网膜病、CNV、AMD、DME、病理性近视、遗传性斑痣性错构瘤病、眼睛的组织胞浆菌病、CRVO、BRVO、角膜新血管形成、视网膜新血管形成、ROP、结膜下出血和高血压性视网膜病。
在一些实施方案中,该方法还包括施用第二抗-血管生成剂。在一些实施方案中,该第二抗-血管生成剂在施用该Norrin拮抗剂之前或之后施用。在一些实施方案中,该第二抗-血管生成剂与该Norrin拮抗剂同时施用。在一些实施方案中,该第二抗-血管生成剂是VEGF的拮抗剂,例如抗-VEGF抗体,如雷珠单抗。
另一方面,本发明提供治疗受试者中与不希望的血管生成相关的眼部疾病或病症的方法,该方法包括向该受试者施用TSPAN12拮抗剂。在一些实施方案中,该TSPAN12拮抗剂是抗-TSPAN12抗体。在一些实施方案中,该TSPAN12拮抗剂包含TSPAN12的多肽片段,包括胞外域,如第二胞外环。在一些实施方案中,该拮抗剂还包含免疫球蛋白恒定区,例如IgG Fc。在一些实施方案中,该眼部疾病或病症选自下述各项组成的组:包括增殖性糖尿病性视网膜病的增殖性视网膜病、CNV、AMD、糖尿病性及其它缺血相关的视网膜病、DME、病理性近视、遗传性斑痣性错构瘤病、眼睛的组织胞浆菌病、CRVO、BRVO、角膜新血管形成、视网膜新血管形成、ROP、结膜下出血和高血压性视网膜病。
在一些实施方案中,该方法还包括施用第二抗-血管生成剂。在一些实施方案中,该第二抗-血管生成剂在施用该TSPAN12拮抗剂之前或之后施用。在其它实施方案中,该第二抗-血管生成剂与该TSPAN12拮抗剂同时施用。在一些实施方案中,该第二抗-血管生成剂是Norrin的拮抗剂或VEGF拮抗剂。在一些实施方案中,该Norrin拮抗剂或该VEGF拮抗剂是抗-Norrin抗体或抗-VEGF抗体(例如,雷珠单抗)。
另一方面,本发明提供治疗受试者中与不希望的血管生成相关的眼部疾病或病症的方法,该方法包括向该受试者施用Norrin拮抗剂。在一些实施方案中,该Norrin拮抗剂是抗-Norrin抗体。在一些实施方案中,该眼部疾病或病症选自下述各项组成的组:包括增殖性糖尿病性视网膜病的增殖性视网膜病、CNV、AMD、糖尿病性及其它缺血相关的视网膜病、DME、病理性近视、遗传性斑痣性错构瘤病、眼睛的组织胞浆菌病、CRVO、BRVO、角膜新血管形成、视网膜新血管形成、ROP、结膜下出血和高血压性视网膜病。
在一些实施方案中,该方法还包括施用第二抗-血管生成剂。在一些实施方案中,该第二抗-血管生成剂在施用该Norrin拮抗剂之前或之后施用。在其它实施方案中,该第二抗-血管生成剂与该Norrin拮抗剂同时施用。在一些实施方案中,该第二抗-血管生成剂是VEGF拮抗剂,例如抗-VEGF抗体,如雷珠单抗。
另一方面,本发明提供使用肽产生抗体的方法,该肽基本上由氨基酸CRREPGTDQMMSLK(SEQ ID NO:5)组成。在一些实施方案中,该方法包括用该肽免疫动物。在一些实施方案中,该方法包括筛选文库(例如Fab文库)以鉴定结合该肽的抗体或抗体片段。在一些实施方案中,本发明提供通过任何此类方法产生的抗体。在一些实施方案中,本发明提供使用任何此类抗体检测TSPAN12的方法。
另一方面,本发明提供抑制FZD4多聚体形成的体外和体内方法,其包括施用TSPAN12拮抗剂。另一方面,本发明提供抑制Norrin-介导的信号传导的体外和体内的方法,其包括施用TSPAN12拮抗剂。在一些实施方案中,该TSPAN12拮抗剂是抗-TSPAN12抗体。在一些实施方案中,该TSPAN12拮抗剂包括TSPAN12的多肽片段,包括胞外域,如第二胞外环。在一些实施方案中,该拮抗剂还包括免疫球蛋白恒定区,例如IgG Fc。
另一方面,本发明提供治疗患有先天眼部疾病的受试者的方法,该眼部疾病是由Norrin,TSPAN12,FZD4或LRP5基因中任意一个的遗传突变导致的,该方法包括向该受试者施用增强FZD4多聚体形成的试剂。在一些实施方案中,该疾病是FEVR、诺里病(Norrie disease)或渗出性视网膜病(Coate’s disease)。在一些实施方案中,提高FZD4多聚体形成的试剂选自由下述各项组成的组:Norrin、抗-FZD4抗体、抗-LRP5抗体和双特异性抗-FZD4/抗-LRP5抗体。在一些实施方案中,该遗传突变破坏FZD4-介导的信号传导。在一些实施方案中,受试者中的该遗传突变在该受试者中产生异常蛋白产物,该产物选自由Norrin-C95R、FZD4-M105V和FZD4-M157V组成的组。在一些实施方案中,在治疗受试者之前检测该突变在受试者中的存在。
附图简述
图1显示代表性早产儿视网膜病(ROP)视网膜切片:野生型(顶部)和TSPAN12敲除(KO)小鼠(底部)。
图2显示在来自于野生型(WT;左)和TSPAN12 KO小鼠(Hom;右)的ROP视网膜切片中观察的新血管核数目的定量结果。
图3显示TSPAN12增强Norrin通过Fzd4/LRP5介导的信号转导。
图4显示TSPAN12对Norrin-介导的信号转导的增强是Fzd4特异性的。
图5显示TSPAN12不增强Wnt3a-介导的信号转导。
图6显示Norrin结合至Fzd4但不结合至LRP5或TSPAN12。
图7显示Norrin结合至表达Fzd4的细胞,但不结合至表达Fzd5,LRP5或TSPAN12的细胞,并且Norrin不与TSPAN12免疫共沉淀。
图8显示TSPAN12不与LRP5相关联。
图9显示TSPAN12不增强Norrin对Fzd4的结合。
图10显示共表达TSPAN12不改变Fzd4在质膜上的表达。
图11显示野生型Norrin和C95R突变体Norrin形成的高级结构。
图12显示过表达TSPAN12能够补偿单体C95R Norrin的缺陷。
图13显示TSPAN12调节FZD4在信号传导过程中的聚集(clustering)。
优选实施方案的详细描述
定义
除非另有定义,本文使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。参见例如Singleton等人,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(微生物学和分子生物学词典)第二版,J.Wiley & Sons(New York,NY 1994);Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(分子克隆,实验室指南),Cold Spring Harbor Press(Cold Spring Harbor,NY 1989)。为本发明的目的,对某些术语定义如下。
当用于本文时,术语“TSPAN12”、“TSPAN12多肽”、“Norrin”、和“Norrin多肽”是指具有从自然界获得的TSPAN12或Norrin多肽的氨基酸序列的多肽,而不论其制备方式或物种。因此,此类多肽可具有来自于人、小鼠或任何其它物种的天然存在的TSPAN12或Norrin的氨基酸序列。全长人TSPAN12氨基酸序列是:
MAREDSVKCLRCLLYALNLLFWLMSISVLAVSAWMRDYLNNVLTLTAETRVEEAVILTYFPVVHPVMIAVCCFLIIVGMLGYCGTVKRNLLLLAWYFGSLLVIFCVELACGVWTYEQELMVPVQWSDMVTLKARMTNYGLPRYRWLTHAWNFFQREFKCCGVVYFTDWLEMTEMDWPPDSCCVREFPGCSKQAHQEDLSDLYQEGCGKKMYSFLRGTKQLQVLRFLGISIGVTQILAMILTITLLWALYYDRREPGTDQMMSLKNDNSQHLSCPSVELLKPSLSRIFEHTSMANSFNTHFEMEEL(SEQ ID NO:1).
全长小鼠TSPAN12氨基酸序列是:
MAREDSVKCLRCLLYALNLLFWLMSISVLAVSAWMRDYLNNVLTLTAETRVEEAVILTYFPVVHPVMIAVCCFLIIVGMLGYCGTVKRNLLLLAWYFGTLLVIFCVELACGVWTYEQEVMVPVQWSDMVTLKARMTNYGLPRYRWLTHAWNYFQREGCGKKMYSFLRGTKQLQVLRFLGISIGVTQILAMILTITLLWALYYDRREPGTDQMLSLKNDTSQHLSCHSVELLKPSLSRIFEHTSMANSFNTHFEMEEL(SEQ ID NO:2).
全长人Norrin氨基酸序列是:
MRKHVLAASFSMLSLLVIMGDTDSKTDSSFIMDSDPRRCMRHHYVDSISHPLYKCSSKMVL LARCEGHCSQASRSEPLVSFSTVLKQPFRSSCHCCRPQTSKLKALRLRCSGGMRLTATYRYILSCHCEECNS(SEQ ID NO:3).
全长小鼠Norrin氨基酸序列是:
MRNHVLAASISMLSLLAIMGDTDSKTDSSFLMDSQRCMRHHYVDSISHPLYKCSSKMVLLARCEGHCSQASRSEPLVSFSTVLKQPFRSSCHCCRPQTSKLKALRLRCSGGMRLTATYRYILSCHCEECSS(SEQ ID NO:4).
此类TSPAN12或Norrin多肽可从自然界分离或可通过重组和/或合成方式产生。
“分离的”用于指多肽时意思是其已经从天然来源纯化或已经通过重组或合成方法制备并纯化。“纯化”的多肽基本上无其它多肽或肽。此处“基本上无”的意思是低于大约5%,优选地低于大约2%,更优选地低于大约1%,甚至更优选地低于大约0.5%,最优选地低于大约0.1%的其它来源蛋白的污染。
术语“拮抗剂”以最广义使用,包括部分或完全阻断、抑制、或中和多肽生物学活性的任何分子。例如TSPAN12或Norrin的拮抗剂将部分或完全阻断、抑制或中和TSPAN12或Norrin的下述能力,即转导或起始Norrin-诱导的信号传导或在眼中形成病理性血管的能力。合适的拮抗剂分子具体包括拮抗性抗体或抗体片段、天然TSPAN12或Norrin多肽的片段或氨基酸序列变体、肽、TSPAN12或Norrin共受体的可溶性片段、反义RNA、核酶、RNAi、有机小分子等。用于鉴定TSPAN12或Norrin多肽的拮抗剂的方法可包括使TSPAN12或Norrin多肽接触候选拮抗剂分子并测量通常与该多肽有关的一种或多种生物学活性的可检测的变化。
为本文的目的“有活性的”或“活性”是指保留生物学和/或免疫学活性的TSPAN12或Norrin的形式,其中“生物学”活性是指TSPAN12或Norrin引起的、除了诱导产生抗体的能力之外的生物学功能,且“免疫学”活性是指诱导产生抗体的能力,该抗体针对TSPAN12或Norrin具有的抗原表位。TSPAN12和Norrin主要的生物学活性是转导或起始Norrin-诱导的信号传导和诱导眼中病理性血管形成。
“TSPAN12共受体(co-receptor)”或“Norrin共受体”是指TSPAN12或Norrin结合并介导TSPAN12或Norrin生物学活性的分子。
术语“抗体”以最广义使用,具体覆盖人、非人(例如鼠的)和人源化的单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段,只要它们能展现出所期望的生物学活性。
“天然抗体”通常是异源四聚体糖蛋白,大约150,000道尔顿,由两条相同轻(L)链和两条相同重(H)链构成。每条轻链通过一个共价二硫键连接至重链,而二硫键的数量在不同免疫球蛋白同种型的重链中是变化的。每条重链和轻链也具有规则间隔的链内二硫键。每条重链在一个末端具有可变结构域(VH),随之是一些恒定结构域。每条轻链在一个末端具有可变结构域(VL),且在其另一个末端具有恒定结构域;轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域并排,且轻链可变结构域与重链的可变结构域并排。认为特定氨基酸残基形成轻-和重-链可变结构域之间的界面。
木瓜蛋白酶消化抗体得到两个相同的抗原结合片段,各带一个抗原结合位点,称为“Fab”片段,和剩余的“Fc”片段,该名称反映了其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理得到F(ab’)2片段,该片段具有两个抗原-结合位点,仍能交联抗原。
“Fv”是最小的含有完整抗原识别和结合位点的抗体片段。该区由一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域紧密、非共价结合的二聚体组成。
Fab段还含有轻链恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab’片段不同于Fab片段,因为在重链CH1结构域羧基末端添加了数个残基,包括来自抗体绞链区的一个或多个半胱氨酸。本申请中Fab’-SH为其恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离巯基的Fab’。F(ab’)2抗体片段最初作为在彼此之间具有铰链半胱氨酸的成对Fab’片段而制备。其它抗体片段的化学偶联也已知。
根据其恒定结构域的氨基酸序列,任一脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”都可被划分为两种完全不同的类型之一,称kappa(κ)和lambda(λ)。
根据其重链恒定结构域的氨基酸序列,免疫球蛋白可以分为不同的类。主要有5类免疫球蛋白:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其中一些还可进一步分为亚类(同种型),例如,IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。 免疫球蛋白不同类的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类免疫球蛋白的亚基结构和三维构象已经熟知。
“抗体片段”包含全长抗体的一部分,通常是其抗原结合结构域或可变结构域。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体,即除了可能少量存在的天然存在的突变之外,构成群体的各个抗体相同。单克隆抗体是高度特异性的,其针对单一抗原位点。另外,与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物相反,每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”表明抗体的特征是从基本上同质的抗体群中获得的抗体,并不能解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如,将用于本发明的单克隆抗体可通过杂交瘤方法(由Kohler等人,Nature(自然),256:495(1975)第一次描述)制备,或可通过重组DNA法(参见如,美国专利No.4,816,567)制备。“单克隆抗体”也可以使用例如在Clackson等人,Nature(自然),352:624-628(1991)和Marks等人,J.Mol.Biol.(分子生物学杂志),222:581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离。
本文的单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体,其中一部分重链和/或轻链与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源,而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源,还可以是此类抗体的片段,只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No.4,816,567;和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院刊),81:6851-6855(1984))。
非人(例如鼠的)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上,人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中受体的高变区残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)(如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的高变区残基替换。在有些情况中,将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外,人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言,人源化抗体将包含基本上全部的至少一个、通常两个可变结构域,其中所有或基本上所有 高变区对应于非人免疫球蛋白的高变区,且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc),通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones等人,Nature(自然)321:522-525(1986);Riechmann等人,Nature(自然)332:323-329(1988);和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.(结构生物学新观点)2:593-596(1992)。
当用于本文时,“治疗()”是获得有益或期望临床结果的方式。为本发明的目的,有益或期望的临床结果包括但不限于缓解症状、减轻疾病程度、稳定(例如不恶化)疾病病症、延缓或减慢疾病进展、改善或缓和疾病病症、和缓解(无论部分或完全)、无论可检测或不可检测。“治疗”是一种介入,其实施的意图是预防病症的进展或改变疾病的病理。因此,“治疗”可以指治疗性处理或预防性或防范性措施。需要治疗的那些包括已经患有病症的那些,也包括其中需要预防病症的那些。具体而言,治疗可直接预防、减缓或其它情况下降低细胞退化的病理或损伤,如在癌症治疗中肿瘤细胞的病理,或可使细胞更易于通过其它治疗剂治疗。
“长期”施用指与短期模式相反,以连续模式施用药剂,从而将初始治疗效果(活性)维持较长一段时间。“间歇”施用指不是无间断连续进行的治疗,而是本质上周期性的。
“眼内新血管疾病(intraocular neovascular disease)”是一种以眼部新血管形成为特征的疾病。眼内新血管疾病的实例包括,但不限于,包括增殖性糖尿病性视网膜病(proliferative diabetic retinopathy)的增殖性视网膜病、脉络膜新血管生成(choroidal neovascularization,CNV)、年龄相关的黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)、糖尿病性及其他缺血相关的视网膜病(diabetic and other ischemia-related retinopathies)、糖尿病性黄斑水肿(diabetic macular edema,DME)、病理性近视(pathological myopia)、遗传性斑痣性错构瘤(von Hippel-Lindau disease)、眼睛的组织胞浆菌病(histoplasmosis of the eye)、视网膜中央静脉闭塞(central retinal vein occlusion,CRVO)、视网膜分支静脉闭塞(branched central retinal vein occlusion,BRVO)、角膜新血管形成(corneal neovascularization)、视网膜新血管形成(retinal neovascularization)、早产儿视网膜病(retinopathy of prematurity,ROP)、结膜下出血(subconjunctival hemorrhage)、和高血压性视网膜病(hypertensive retinopathy)。优选地,眼内新血管疾病不包括由于Norrin、TSPAN12、Frizzled-4或LRP5基因的任一个遗传突变导致的病症。例如,本发明的眼内新血管疾病优选不包括FEVR和诺里病等。
疾病的“病理”包括危害患者健康的所有现象。
“联合”一种或多种其它治疗剂的施用包括同时(共同)和以任意次序的连续施用。
当用于本文时,“载体”包括药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂,其在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。通常,生理学可接受的载体是水性pH缓冲溶液。生理学可接受载体的例子包括缓冲剂,诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸;抗氧化剂,包括抗坏血酸;低分子量(少于约10个残基)多肽;蛋白质,诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水聚合物,诸如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸,诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸;单糖、二糖和其它碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合剂,诸如EDTA;糖醇,诸如甘露醇或山梨醇;成盐抗衡离子,诸如钠;和/或非离子表面活性剂,诸如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。
本文定义的“小分子”具有低于大约500道尔顿的分子量。
实施本发明的方法
TSPAN12或Norrin活性的拮抗剂的制备和鉴定
设计用于拮抗性药物候选物的筛选测定以鉴定下述化合物,该化合物结合或与TSPAN12或Norrin多肽复合,或另外干扰它们的活性和/或与其它细胞蛋白相互作用。
小分子可具有作为TSPAN12或Norrin拮抗剂起作用的能力并因而在治疗上是有用的。此类小分子可包括天然存在的小分子、合成有机或无机化合物和肽。然而。本发明的小分子不限于这些形式。小分子的广泛文库是可商业获得的,并且本文教导的或本领域熟知的广泛的多种测定用于关于期望的活性来筛选这些分子。
在一些实施方案中,小分子TSPAN12或Norrin拮抗剂通过它们抑制 一种或多种TSPAN12或Norrin生物学活性的能力来鉴定。因而,使候选化合物与TSPAN12或Norrin接触,并然后评定TSPAN12或Norrin的生物学活性。在一个实施方案中,评定TSPAN12或Norrin转导或起始Norrin-介导的信号传导的能力。当TSPAN12或Norrin的生物学活性被抑制时,化合物被鉴定为拮抗剂
鉴定为TSPAN12或Norrin拮抗剂的化合物可用于本发明的方法。例如,TSPAN12或Norrin拮抗剂可用于治疗眼内新血管疾病。
多种熟知的动物模型(包括例如早产儿视网膜病和激光-诱导的脉络膜新血管形成的模型;Ruiz-Edera & Verkman Invest.Ophthalmol.& Vis.Sci.(研究性眼科学和视觉科学)48(10):4802-10(2007),Yu等人Invest.Ophthalmol.& Vis.Sci.(研究性眼科学和视觉科学)49(6):2599-605(2007))可用于进一步理解TSPAN12或Norrin在眼内新血管疾病的发展和发病中的作用,以及用于测试候选治疗剂的效力,包括抗体和其它天然TSPAN12或Norrin多肽的拮抗剂(诸如小分子拮抗剂)。此类模型的体内性质使得它们可特别对人患者的反应进行预测。
抗体结合研究
测试了抗体结合并抑制TSPAN12或Norrin在Wnt信号传导报告细胞中的效应的能力。示例性方法在实施例2中提供,但其它方法对本领域普通技术人员是显而易见的。示例性抗体包括多克隆的、单克隆的、人源化的、双特异性的和异源偶联的抗体,其制备在本文中描述。
抗体结合研究可通过任何已知的测定方法(如竞争性结合测定、直接和间接夹心测定、和免疫沉淀测定)来进行。Zola,Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques(单克隆抗体:技术手册)(CRC Press,Inc.,1987),第147-158页。
竞争性结合测定依赖于标记的标准物和测试样品分析物竞争性结合有限量的抗体的能力。测试样品中靶标蛋白的量与已经与抗体结合的标准物的量成反比。为助于确定已经结合的标准物的量,抗体在竞争前或竞争后优选是不溶解的,从而结合至抗体的标准物和分析物可方便地从保持未结合的标准物和分析物中分离。
夹心测定涉及使用两种抗体,每种能够结合至待检测蛋白的不同免疫原性部分,或表位。在夹心测定中,测试样品分析物通过固定于固相支持物上的第一抗体结合,此后第二抗体结合至分析物,从而形成不溶的三-部分复合物。参见例如美国专利号No.4,376,110。第二抗体本身可通过可检测的结构部分标记(直接夹心测定)或可使用标记有可检测的结构部分的抗-免疫球蛋白抗体测量(间接夹心测定)。例如,一种类型的夹心测定是ELISA测定,在该情形中可检测的结构部分是酶。
对于免疫组化,例如组织样品可以是新鲜的或冷冻的,或可以埋入石蜡并通过防腐剂(如福尔马林)固定。
在治疗心血管、内皮和血管原性病症中有用的组合物非限制性地包括抑制靶标基因产物的表达和/或活性的抗体、小有机分子和无机分子、肽、磷酸肽、反义的、siRNA和核酶分子、三股螺旋(triple-helix)分子等。
潜在拮抗剂的更具体的实例包括结合TSPAN12或Norrin的多肽,特别是抗体,该抗体非限制性地包括多克隆和单克隆抗体和抗体片段、单链抗体、抗独特型抗体、和此类抗体或片段的嵌合或人源化版本,以及人抗体和抗体片段。对于TSPAN12,某些胞外结构域也可以作为拮抗剂(参见例如Ho等人J.Virol.(病毒学杂志)80(13):6487-96(2006);Hemler Nature Rev.Drug Discovery(自然综述:药物发现)7:747-58(2008))。备选地,潜在的拮抗剂可以是密切相关蛋白,例如,与共受体相互作用但没有效应的突变形式的TSPAN12或Norrin,由此竞争性抑制TSPAN12或Norrin的作用。
另一种潜在的TSPAN12或Norrin拮抗剂是使用反义技术制备的反义RNA或DNA构建体,其中例如反义RNA或DNA分子通过与靶标mRNA杂交并防止蛋白质翻译来起直接阻断mRNA翻译的作用。反义技术可用于通过形成三股螺旋或者反义DNA或RNA来控制基因表达,这两种方法都以多核苷酸与DNA或RNA的结合为基础。例如,编码本文所述成熟TSPAN12或Norrin多肽的多核苷酸序列的5’编码部分,可用于设计长度为约10-40个碱基对的反义RNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸被设计成与参与转录的基因区域互补(三股螺旋-参见,Lee等人,Nucl.Acids Res.(核酸研究)6:3073(1979);Cooney等人,Science(科学)241:456(1988);Dervan等人, Science(科学)251:1360(1991)),从而阻止TSPAN12或Norrin的转录和生成。本文所述的与RNA一部分“互补的”序列是指,具有与RNA杂交形成稳定双链体的足够互补性的序列;在双链反义核酸情况下,可以由此测试双链体DNA的单链,或者可以测试三股螺旋的形成。杂交能力取决于互补程度以及反义核酸的长度。通常,杂交核酸越长,它含有的与RNA错配的碱基越多,但仍可形成稳定的双链体(或者三链体,视情况而定)。本领域技术人员可以通过使用常规方法测定杂交复合物的解链温度,来确定错配的耐受程度。反义RNA寡核苷酸在体内可与mRNA杂交,并阻断所述mRNA分子翻译成TSPAN12(反义-Okano,Neurochem.(神经化学)56:560(1991);Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression(寡核苷酸作为基因表达的反义抑制剂)(CRC Press:Boca Raton,FL,1988)。
反义寡核苷酸可以是单链或双链形式的DNA或RNA、或其嵌合混合物或衍生物或改良形式。例如,为了改善分子稳定性、杂交等,所述寡核苷酸可以在碱基结构部分、糖结构部分或磷酸骨架上进行修饰。所述寡核苷酸可以包括:其它附加基团,例如肽(例如,为了靶向体内宿主细胞受体),或有助于穿过细胞膜的试剂(参见,例如,Letsinger,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国科学院院刊)86:6553-6556(1989);Lemaitre,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国科学院院刊)84:648-652(1987);PCT公开WO88/09810,1988年12月15日公开)或有助于穿过血脑屏障的试剂(参见,例如,1988年4月25目公开的PCT公开号为W089/10134),杂交-触发的切割试剂(参见,例如,Krol等人,BioTechniques(生物技术)6:958-976(1988))或嵌入剂(参见,例如,Zon,Pharm.Res.(药物研究)5:539-549(1988))。为此,可以将所述寡核苷酸与另一分子例如肽、杂交触发的交联剂、转运剂、杂交-触发的切割剂等偶联。
反义寡核苷酸可包括至少一种修饰的碱基结构部分,其选自包括但不限于下列基团的组:5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖Q核苷(β-D-galactosylqueosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺苷、1-甲基鸟苷、1-甲 基肌苷、2,2-二甲基鸟苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、N6-腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷(β-D-mannosylqueosine)、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷、尿嘧啶-5-氧基乙酸(oxyacetic acid)(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫代胞苷、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w、和2,6-二氨基嘌呤。
反义寡核苷酸另外还可以包含至少一种修饰的糖结构部分,其选自包括但不限于下列基团的组:阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖。
另一实施方案中,所述反义寡核苷酸包含至少一种修饰的磷酸酯骨架,其选自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代亚磷酸酯(phosphoramidothioate)、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯(phosphordiamidate)、甲基膦酸酯、烷基磷酸三酯,及其formacetal或类似物组成的组。
另一实施方案中,所述反义寡核苷酸是一种异头(anomeric)寡核苷酸。异头寡核苷酸与互补RNA形成特异性双链杂合体,其中与通常的单元不同,所述链是彼此平行的(Gautier,等人,Nucl.Acids Res.(核酸研究)15:6625-6641(1987))。所述寡核苷酸是一种2’-O-甲基核糖核苷酸(Inoue,等人,Nucl.Acids Res.(核酸研究)15:6131-6148(1987)),或一种嵌合的DNA-DNA类似物(Inoue,等人,FEBS Lett.(欧洲生化学会联盟通讯)215:327-330(1987))。
在一些实施方案中,拮抗剂是抑制性双链体RNA,例如siRNA,shRNA等。
本发明的寡核苷酸可以用本领域已知的标准方法合成,例如,通过利用一种自动DNA合成仪(例如可购自Biosearch,Applied Biosystems等)。例如,硫代磷酸酯寡核苷酸可以用Stein,等人(Nucl.Acids Res.(核酸研究)16:3209(1988))所述的方法合成,甲基膦酸酯寡核苷酸可以通过使用可控的有孔玻璃多聚体支持物(controlled pore glass polymer supports)(Sarin,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国科学院院刊)85:7448-7451(1988))等来制备。
上述寡核苷酸还可以递送至细胞,从而使反义RNA或DNA在体内表达以抑制TSPAN12或Norrin的生成。当使用反义DNA时,优选源自翻译起始位点的寡脱氧核糖核苷酸,例如,位于靶基因核苷酸序列约第-10至+10位之间。
潜在的拮抗剂还包括与TSPAN12或Norrin6结合的小分子,从而封闭其活性。小分子的实例包括,但不限于,肽或肽-样小分子,优选可溶性肽,和合成的非-肽基的有机或无机化合物。
另外的潜在拮抗剂是核酶,它是一种能催化RNA特异性切割的酶促RNA分子。核酶通过与互补的靶RNA序列特异性杂交,然后内核分离(endonucleolytic cleavage)来起作用。潜在RNA靶标中的特异性核酶切割位点可以用已知技术鉴定。更多细节见,例如,Rossi,CurrentBiology(现代生物学)4:469-471(1994),和PCT公开号为WO 97/33551(公开于1997年9月18日)。
尽管能在位点特异性识别序列处切割mRNA的核酶都可用于破坏靶基因mRNA,优选使用锤头核酶。锤头核酶在侧翼区域支配(dictated)的位置切割mRNA,所述侧翼区域与所述靶mRNA形成互补碱基对。唯一的要求是靶mRNA具有下列两个碱基的序列:5′-UG-3’。锤头核酶的构建和制备已为本领域所熟知,更完整的描述于Myers,Molecular Biology and Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference(分子生物学和生物技术:综合案头参考),VCH Publishers,New York(1995),(特别是参见第833页图41)和描述于Haseloff和Gerlach,Nature(自然),334:585-591(1988),在此全文引入本文。
优选将核酶改造为将所述切割识别位点置于靶基因mRNA 5’端附近,即,为了提高效率,并将无功能mRNA转录物的胞内积累降至最低。
本发明的核酶还包括RNA核糖核酸内切酶(在下文中称为“Cech-型核酶”)例如在嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)天然出现的核酶(被称为IVS,或L-19 IVS RNA),和已被Thomas Cech和合作者进行了全面描述的核酶(Zaug,等人,Science(科学),224:574-578(1984);Zaug和Cech,Science(科学),231:470-475(1986);Zaug,等人,Nature(自然),324:429-433(1986);公开的University Patents Inc.的国际专利申请WO 88/04300;Been 和Cech,Cell(细胞),47:207-216(1986))。所述Cech-型核酶具有一个8个碱基对的活性位点,其与靶RNA序列杂交然后发生靶RNA6的切割。本发明包括靶向存在于靶基因的8个碱基对活性位点序列的Cech-型核酶。
反义方法中,核酶可由修饰的寡核苷酸组成(例如,为了提高的稳定性,靶向性,等),应该被递送至体内表达靶基因的细胞。一种优选的递送方法包括:使用受强效组成型pol III或pol II启动子控制的“编码”核酶的DNA构建体,从而使得转染细胞产生足量核酶来破坏内源性的靶基因信使并抑制翻译。因为核酶与反义分子不同,是催化性的,所以发挥效力需要较低的胞内浓度。
用于抑制转录的呈三股螺旋形式的核酸分子应该是单链的并由脱氧核苷酸组成。这些寡核苷酸的碱基组成被设计使得经Hoogsteen碱基配对规则促进三股螺旋的形成,这通常需要在双链体的一条链上有相当长的一段嘌呤或嘧啶。更多细节参见,例如,如上公开号为WO 97/33551的PCT申请。
TSPAN12或Norrin拮抗剂还可用于治疗眼内疾病,包括但不限于包括增殖性糖尿病性视网膜病(proliferative diabetic retinopathy)的增殖性视网膜病(proliferative retinopathies)、脉络膜新血管生成(choroidal neovascularization,CNV)、年龄相关的黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)、糖尿病性及其他缺血相关的视网膜病(diabetic and other ischemia-related retinopathies)、糖尿病性黄斑水肿(diabetic macular edema,DME)、病理性近视(pathological myopia)、遗传性斑痣性错构瘤(von Hippel-Lindau disease)、眼睛的组织胞浆菌病(histoplasmosis of the eye)、视网膜中央静脉闭塞(central retinal vein occlusion,CRVO)、视网膜分支静脉闭塞(branched central retinal vein occlusion,BRVO)、角膜新血管形成(corneal neovascularization)、视网膜新血管形成(retinal neovascularization)、早产儿视网膜病(retinopathy of prematurity,ROP)、结膜下出血(subconjunctival hemorrhage)、和高血压性视网膜病(hypertensive retinopathy)。
施用方式、方案、剂量和制剂
TSPAN12或Norrin拮抗剂可在药学可作为上述各种病症及疾病的预防及治疗剂。
通过下述操作制备呈冻干制剂或水溶液形式的拮抗剂治疗组合物备用:将具有适当纯度的所需分子与任选的药物可接受的载体、赋形剂、或稳定剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences,16th edition,Osol,A.ed.(1980))混合。可接受的载体,赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度对于接受者是无毒的,并包括缓冲剂例如磷酸盐,柠檬酸盐,及其它有机酸;抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸;防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵;六甲氯铵;苯扎氯铵,苄索氯铵;酚、丁醇或苯甲醇;烷基对羟基苯甲酸酯如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯;邻苯二酚;间苯二酚;环己醇;3-戊醇;和间甲酚);低分子量多肽(少于约10个残基);蛋白质如血清白蛋白,明胶或免疫球蛋白;亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸;单糖、二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精;螯合剂如EDTA;糖类如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇;成盐抗衡离子(salt-forming counter-ions)如钠;金属络合物(例如,Zn-蛋白络合物);和/或非离子型表面活性剂如TWEENTM,PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
所述载体的其它例子包括离子交换剂,氧化铝,硬脂酸铝,卵磷脂,血清蛋白,如人血清白蛋白,缓冲物质如磷酸盐,甘氨酸,山梨酸,山梨酸钾,饱和植物脂肪酸的偏甘油酯(partial glyceride of saturated vegetable fatty acids)混合物,水,盐或电解质如鱼精蛋白硫酸盐(protamine sulfate),磷酸氢二钠,磷酸氢钾,氯化钠,锌盐,胶态(Colloidal)硅石,三硅酸镁,聚乙烯吡咯烷酮,纤维素基物质,和聚乙二醇。拮抗剂的局部或胶体基形式的载体,包括多糖例如羧甲基纤维素钠或甲基纤维素,聚乙烯吡咯烷酮,聚丙烯酸酯,聚氧乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物,聚乙二醇,和木蜡醇(wood wax alcohols)。对于所有施用而言,常规储存形式是适合使用的。所述形式包括,例如,微胶囊,纳米胶囊(nano-capsules),脂质体,膏剂(plaster),吸入形式,喷鼻剂,舌下片剂,和缓释制剂。TSPAN12或Norrin拮抗剂通常以约0.1mg/ml至100mg/ml的浓度配制于所述载体中。
另一种制剂包括将TSPAN12或Norrin拮抗剂装入有一定形状的制品。 所述制品可用于调控内皮细胞生长和血管生成。此外.可以用这些制品调控肿瘤的侵入和转移。
将要用于体内施用的TSPAN12或Norrin拮抗剂必须是无菌的。这可以通过在冻干和重建之前或之后通过除菌滤膜进行过滤而轻易实现。如果是冻干形式,TSPAN12或Norrin拮抗剂通常与其它成分联合配制,以在使用时用合适的稀释剂重建。TSPAN12或Norrin拮抗剂的液体制剂的例子是一种无菌、澄清、无色的未经防腐处理的溶液,该溶液被装入单一剂量小瓶来作皮下注射。例如,主要根据适应症和多肽类型,适于重复使用的经过防腐处理的药物组合物可包含:
TSPAN12或Norrin拮抗剂;
缓冲剂,其能够保持溶液中的多肽或其它分子的最大稳定性的pH范围,优选约4-8;
主要用于稳定多肽或分子以抵抗搅拌引发的聚集的洗涤剂/表面活性剂;
等渗剂(isotonifier);
选自苯酚、苯甲醇和苄索卤化铵(例如苄索氯铵)的组的防腐剂;以及水。
如果使用非离子型洗涤剂,它可以为例如,聚山梨醇酯(例如,POLYSORBATETM(TWEENTM)20,80,等)或泊洛沙姆(poloxamers)(例如,POLOXAMERTM 188)。使用非离子型表面活性剂可使得所述制剂暴露于剪切面应力(shear surface stresses),但不使多肽变性。另外,所述含表面活性剂的制剂可以在气溶胶设备,如肺部定量给药(pulmonary dosing)所用的那些设备,和无针喷射注射枪(needleless jet injection gun)(参见,例如,EP 257,956)中使用。
可存在等渗剂以保证TSPAN12或Norrin拮抗剂的液态组合物的等渗性,并包括多羟基糖醇,优选三羟基或更高级的糖醇,例如甘油,赤藓糖醇,阿拉伯糖醇,木糖醇,山梨醇,和甘露醇。这些糖醇可以单独或联合使用。备选地,氯化钠或其它合适无机盐可用于使溶液等渗。
所述缓冲液可以是,例如,醋酸盐,柠檬酸盐,琥珀酸盐,或磷酸盐 缓冲液,视需要的pH而定。本发明所述的一种类型的液态制剂的pH被缓冲到约4-8的范围,优选大约为生理pH。
防腐剂苯酚、苯甲醇和苄索卤化铵,例如苄索氯铵是已知可以使用的抗微生物剂。
本文所述的治疗性多肽组合物通常置于带有无菌存取口(access port)的容器中,(例如该容器可以是带有能通过皮下注射针穿刺的塞子的静脉点滴袋(intravenous solution bag)或小瓶)。制剂可以重复静脉内(i.v.),皮下(s.c.)或肌内(i.m.)注射剂,或以适于鼻内或肺内投递的气溶胶制剂来施用(肺内投递参见,例如,EP 257,956)。制剂优选以玻璃体内(IVT)或结膜下投递来施用。
治疗性多肽还可以缓释制剂的方式来施用。缓释制剂的合适的实例包括包含蛋白质的固态疏水聚合物的半通透性基质,所述基质为具有一定形状的制品,如膜或微胶囊。缓释基质实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟基乙基-甲基丙烯酸酯),如Langer等人,J.Biomed.Mater.Res.(生物医学材料研究杂志)15:167-277(1981)和Langer,Chem.Tech.12:98-105(1982)所述,或聚(乙烯醇)、聚交酯(美国专利No.3,773,919,EP 58,481),L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman等人,Biopolymers(生物多聚物)22:547-556(1983)),不可降解的乙烯乙酸乙酯(Langer等人,见上文),可降解的乳酸-乙醇酸共聚物例如Lupron Depot (由乳酸-乙醇酸共聚物与醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球体),和聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。
聚合物如乙烯乙酸乙酯和乳酸-乙醇酸能释放分子100天以上,而一些水凝胶释放蛋白的时间较短。当胶囊化的蛋白质在生物体保留长时间,在37℃接触湿气可使它们变性或聚集,导致生物活性的丧失并可能导致免疫原性改变。可以根据涉及的机理制定合理策略进行蛋白质稳定化处理。例如,如果发现聚集机理是由于硫代-二硫化物互换而形成分子间S-S键,可以通过下述操作实现稳定化:修饰巯基残基,从酸性溶液冻干,控制湿度,使用合适添加剂,和开发特异性聚合物基质组合物。
缓释的TSPAN12或Norrin拮抗剂组合物还包括脂质体包埋的拮抗剂。所述脂质体用本身已知的方法制备:DE 3,218,121;Epstein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院刊)82:3688-3692(1985);Hwang等人,Proc. Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院刊)77:4030-4034(1980);EP 52,322;EP 36,676;EP 88,046;EP 143,949;EP 142,641;日本专利申请83-118008;美国专利4,485,045和4,544,545;和EP 102,324。通常所述脂质体是小的(约200-800埃)单层型的,其中脂类含量大于约30mol%胆固醇,对所选比例调整以求最佳疗效。
当然,TSPAN12或Norrin拮抗剂的治疗有效量将变化,其取决于下列等因素:所治疗(包括预防)的病症,施用方法,治疗用化合物的类型,任何涉及的共同治疗(co-therapy),患者年龄,体重,一般身体状况,病史,等,其对于执业医师而言在技术范围内良好确定。因此,医生必须根据需要来滴定剂量并调整给药途径,以求获得最佳治疗效果。
根据上述指导原则,所述有效剂量的范围通常为约0.001至约1.0mg/kg,更优选约0.01-1.0mg/kg,最优选约0.01-0.1mg/kg。
TSPAN12或Norrin拮抗剂的施用途径与已知方法一致,例如,经过静脉内、肌内、脑内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、眼内(包括玻璃体内)、关节内、滑膜内、鞘内、经口、局部、或吸入途径、或通过所述的缓释系统注射或输注。
如果肽或小分子作为拮抗剂使用,优选以液态或固态的形式口服或非口服施用至哺乳动物。
成盐且下文中可用的分子的可药用盐的实例包括碱金属盐(例如,钠盐,钾盐),碱土金属盐(例如,钙盐,镁盐),铵盐,有机碱盐(例如,吡啶盐,三乙胺盐),无机酸盐(例如,氢氯化物,硫酸盐,硝酸盐),以及有机酸盐(例如,醋酸盐,草酸酯,对甲苯磺酸盐)。
联合治疗
通过连续施用活性药剂,或联合对那些目的有效的另一药剂(在同一组合物中或作为单独的组合物)施用活性药剂,可以提高TSPAN12或Norrin拮抗剂在预防或治疗需要治疗的病症中的效果。
例如,用于治疗血管生成相关病症如眼部疾病的TSPAN12或Norrin拮抗剂,可以与其它药剂联合。特别地,将TSPAN12或Norrin拮抗剂相互联合或与另一种抗-血管生成药剂联合是理想的。在一些实施方案中,将 TSPAN12或Norrin拮抗剂与VEGF拮抗剂(例如抗体,例如雷珠单抗(ranibizumab))联用。
与TSPAN12或Norrin拮抗剂联用的治疗剂的有效量由医师或兽医确定。剂量施用及对它的调整是为了最大限度地治疗要治疗的病症。另外,所述剂量还取决于待用治疗剂的类型和所治疗的具体患者等因素。通常,所用量等于如果给定的治疗剂不与TSPAN12或Norrin联用时所使用的剂量。
TSPAN12或Norrin抗体
本发明所述的最有前途的一些候选药物是能抑制TSPAN12或Norrin的产生和/或降低TSPAN12或Norrin活性的抗体及抗体片段。
多克隆抗体
制备多克隆抗体的方法已为本领域技术人员所知。多克隆抗体可以在哺乳动物产生,例如通过一或多次注射免疫剂,如果需要的话,注射佐剂。通常,免疫剂和/或佐剂通过多次皮下或腹膜内注射至哺乳动物中。免疫剂可包括TSPAN12或Norrin多肽或其融合蛋白。可以采用将免疫剂偶联至已知对于所免疫动物来说具有免疫原性的蛋白质。这类免疫原性蛋白质的实例包括但不限于,钥孔 血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin),血清白蛋白,牛甲状腺球蛋白,和大豆胰蛋白酶抑制剂。可以使用的佐剂的实例包括弗氏完全佐剂和MPL-TDM佐剂(单磷酰脂质A或合成的trehalose dicorynomycolate)。本领域技术人员无需过度试验即可选定免疫方案。
单克隆抗体
备选地,所述抗-TSPAN12或抗Norrin抗体可以是单克隆抗体。单克隆抗体可以使用杂交瘤方法制备,例如描述见Kohler和Milstein,Nature 256:495(1975)。杂交瘤方法中,通常用免疫剂免疫小鼠、仓鼠或其它合适宿主动物,来激发淋巴细胞产生或能产生特异性结合所述免疫剂的抗体。备选地,可以体外免疫所述淋巴细胞。
所述免疫剂通常包括TSPAN12或Norrin多肽或其融合蛋白。通常,如果需要人源细胞时,则使用外周血单核细胞(“PBLS”),或者如果需要 非人源哺乳动物的细胞时,则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后,使用合适的融合剂,例如聚乙二醇,将淋巴细胞与无限增殖细胞系融合形成杂交瘤细胞。Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(单克隆抗体:原理和实践)(New York:Academic Press,1986),第59-103页。无限增殖细胞系通常是转化的哺乳动物细胞,特别是来源于啮齿动物、牛和人的骨髓瘤细胞。通常,使用大鼠或小鼠的骨髓瘤细胞系。可以将所述杂交瘤细胞培养于合适的培养基中,优选含有一种或多种能抑制未融合的无限增殖细胞的生长或存活的物质。例如,如果所述亲代细胞不含次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT),那么杂交瘤的培养基通常会含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶(“HAT培养基”),这些物质阻止了HGPRT-缺陷型细胞的生长。
优选的无限增殖细胞系能高效融合、支持由所选的抗体-生成细胞稳定高水平地表达抗体,并且对于培养基(如HAT培养基)敏感。更优选的无限增殖细胞系是鼠骨髓瘤系,例如可获自Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,California和American Type Culture Collection(美国典型培养物保藏中心),Manassas,Virginia。另外还描述了使用人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系产生人单克隆抗体。Kozbor,J.Immunol.133:3001(1984);Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications(单克隆抗体产生技术和应用)(Marcel Dekker,Inc.:New York,1987)pp.51-63。
然后测定培养杂交瘤细胞的培养基中是否存在抗TSPAN12或Norrin多肽的单克隆抗体。优选地,通过杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性,可以通过免疫沉淀法或通过体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。这类技术及测定是本领域已知的。单克隆抗体的结合亲合力可以用,例如Munson和Pollard,Anal.Biochem.(分析生物化学)107:220(1980)的Scatchard分析来确定。
在鉴定出所需杂交瘤细胞后,将这些克隆用有限稀释程序进行亚克隆并用标准方法使其生长。Goding,同上。适于此目的培养基包括,例如,达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)和RPMI-1640培养基。备选地,所述杂交瘤细胞可作为腹水在哺乳动物体内 生长。
亚克隆分泌的单克隆抗体可以用常规的免疫球蛋白纯化方法(例如,蛋白质A-Sepharose,羟磷灰石层析,凝胶电泳,透析或亲和层析)从培养基或腹水中分离或纯化。
也可用重组DNA方法(如美国专利4,816,567所述的那些)制备单克隆抗体。可用常规程序(例如,通过使用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链基因的寡核苷酸探针)容易地分离并测序编码本发明单克隆抗体的DNA。本发明的杂交瘤细胞可作为此类DNA的优选来源。一旦分离,所述DNA可置入表达载体中,然后转染到宿主细胞(如猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不产生其它免疫球蛋白的骨髓瘤细胞)中,来在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。也可以修饰DNA,例如,通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列替换同源鼠序列(美国专利4,816,567;Morrison等,见上文),或通过将免疫球蛋白编码序列与全部或部分的非免疫球蛋白多肽编码序列共价连接。此类非免疫球蛋白多肽可以被本发明抗体的恒定结构域替换,或被本发明抗体的一个抗原结合位点的可变结构域替换,来产生嵌合的二价抗体。
所述抗体可以是单价抗体。制备单价抗体的方法是本领域熟知的。例如,一种方法涉及重组表达免疫球蛋白轻链和修饰的重链。所述重链通常在Fc区的任意点被截短,从而避免重链的交联。或者,相关的半胱氨酸残基被其它的氨基酸残基替换或者缺失,从而避免交联。
体外方法也适合用于制备单价抗体。可以使用本领域已知常规技术消化抗体产生其片段,尤其是Fab片段。
人和人源化抗体
所述的抗-TSPAN12或抗-Norrin抗体还可以进一步包括人源化抗体或人的抗体。非人(例如,鼠)抗体的人源化形式是嵌合的免疫球蛋白,免疫球蛋白链,或其片段(如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2,或者抗体的其它抗原结合亚序列(subsequence)),其包含源自非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体包括这样的人免疫球蛋白(受体抗体),其中来自该受体的CDR的残基用具有期望特异性、亲和力和能力的来自非人物种(供体抗体)诸如小鼠、 大鼠、或兔的CDR的残基替换。在有些情况中,将人免疫球蛋白的Fv框架残基用相应的非人残基替换。人源化抗体还可包含在受体抗体或引进的CDR或框架序列中均没有找到的残基。一般而言,人源化抗体将包含至少一个、通常两个可变结构域的基本上所有可变结构域,在所述可变结构域中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区,且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列的FR区。人源化抗体优选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc),通常是人免疫球蛋白的恒定区。Jones等人,Nature(自然)321:522-525(1986);Riechmann等人,Nature(自然)332:323-329(1988);Presta,Curr.Op.Struct.Biol.(结构生物学新观点)2:593-596(1992)。
本领域已知将非人抗体人源化的方法。通常,人源化抗体具有一或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“引进的”残基,它们常来自“引进的”可变结构域。人源化基本可根据Winter及合作者的方法进行(Jones等人,Nature 321:522-525(1986);Riechmann等人,Nature 332:323-327(1988);Verhoeyen等人,Science 239:1534-1536(1988)),该方法通过啮齿类动物的一个或多个CDR的序列替换人抗体的相应序列。因此,这些“人源化”的抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567),其中基本上小于完整的人可变结构域已经被来自非人物种的相应序列替换。实践中,人源化抗体通常是人的抗体,其中一些CDR残基且可能有部分FR残基被啮齿类动物抗体中类似位点的残基替换。
人抗体还可以使用各种本领域已知技术制备,包括噬菌体展示文库。Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)227:381(1991);Marks等人,J.Mol.Biol.222:581(1991)。Cole等人和Boerner等人所述技术也可用制备人单克隆抗体。Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(单克隆抗体和癌症治疗),Alan R.Liss,p.77(1985)和Boerner等人,J.Immunol.(免疫学杂志)147(1):86-95(1991)。相似地,可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物来制备人抗体,所述转基因动物如内源性免疫球蛋白基因已经被部分或全部灭活的小鼠。攻击后,可观察到人抗体的产生,其各个方面非常类似在人中所见,包括基因重排,装配(assembly),以及抗体所有组成成分(repertoire)。对此方法的描述见例如,例如美国专 利5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;和5,661,016,以及下列科学出版物:Marks等人,Bio/Technology(生物技术)10:779-783(1992);Lonberg等人,Nature(自然)368:856-859(1994);Morrison,Nature(自然),368:812-813(1994);Fishwild等人,Nature Biotechnology(自然:生物技术)14:845-851(1996);Neuberger,Nature Biotechnology 14:826(1996);Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.(免疫学国际综述)13:65-93(1995)。
双特异性抗体
双特异性抗体是具有针对至少两种不同抗原的结合特异性的单克隆抗体(优选人抗体或人源化抗体)。在本发明中,一种结合特异性是针对TSPAN12或Norrin多肽,另一种结合特异性是针对多肽或任何其它抗原。例子包括细胞表面的蛋白质或受体或受体亚基。
制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统上,双特异性抗体的重组制备是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达,其中两条重链具有不同特异性。Milstein & Cuello,Nature 305:537-539(1983)。由于免疫球蛋白重链和轻链随机配(random assortment),这些杂交瘤(四分瘤(quadroma))产生10种不同抗体分子的可能的混合物,其中只有一种具有正确的双特异性结构。对所述正确分子的纯化通常通过亲和层析步骤来进行。类似的方法见1993年5月13目公开的WO 93/08829和Traunecker等人,EMBO J.10:3655-3659(1991)。
可以将具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变结构域区与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。优选与包含铰链区、CH2及CH3区的至少一部分的免疫球蛋白重链恒定结构域发生融合。优选使含有轻链结合所需位点的第一重链恒定区(CH1)出现在至少一种融合物中。可将编码免疫球蛋白重链融合体(以及必要时,编码免疫球蛋白轻链)的DNA插入不同表达载体,共转染至适当宿主生物。更多产生双特异性抗体的细节见例如Suresh等人,Methods in Enzymology(酶学方法)121:210(1986)。
异源偶联抗体
异源偶联抗体由共价联结的两个抗体构成。有观点认为,这类抗体例 如可以使免疫系统细胞靶向不需要的细胞(美国专利4,676,980),并用于治疗HIV感染。WO 91/00360;WO 92/200373;EP 03089。可以使用已知的合成蛋白化学方法(包括涉及交联剂的方法)体外制备所述抗体。例如,免疫毒素可用二硫化物互换反应或通过形成硫醚键来构建。用于此目的的适宜的试剂包括亚胺硫醇(iminothiolate)和甲基-4-巯基丁酰亚胺(methyl-4-mercaptobutyrimidate)和例如美国专利4,676,980中所公开的那些。
免疫脂质体
本发明公开的抗体也被配制成免疫脂质体。含有所述抗体的脂质体通过本领域已知方法制备,如Epstein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院刊)82:3688(1985);Hwang等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院刊)77:4030(1980);和美国专利4,485,045和4,544,545中所述的方法。在美国专利5,013,556中公开了具有延长的循环时间的脂质体。
特别有用的脂质体可通过包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物经反相蒸发法产生。通过使脂质体在挤压之下穿过指定孔径大小的滤膜,可产生具有所需直径的脂质体。本发明抗体的Fab’片段可如Martin等人,J.Biol.Chem.(生物化学杂志)257:286-288(1982)所述,经二硫键交换反应与脂质体偶联。可任选在所述脂质体中包含化疗药物(如多柔比星)。见Gabizon等人,J.National Cancer Inst.(国家癌症研究杂志)81(19):1484(1989)。
抗体的药物组合物
特异性结合本申请所述TSPAN12或Norrin多肽的抗体以及通过上文所述筛选试验鉴定出的其它分子,可以药物组合物形式施用,用于治疗上文和下文所述的各种病症。
本发明所述制剂还可含有一种以上的治疗具体适应症必需的活性化合物,优选具有不会彼此抵触的互补活性的化合物。备选地或者另外地,所述组合物可以含有能增强其功能的药剂。这类分子适合以对预定目标有效的量联合存在。
活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶状药物递送系统中(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术披露于Remington′s Pharmaceutical Sciences,见上文。
将要用于体内施用的制剂必须是灭菌的。这可以通过用除菌滤膜进行过滤而容易地实现。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质,该基质是成形制品的形式,例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919、L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOT (由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够释放分子达100天以上,但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当封装的抗体在体内长时间维持时,它们可能由于暴露于37℃的潮湿环境而变性或聚集,导致生物学活性损失和可能的免疫原性改变。可以根据涉及的机制来设计合理的稳定化策略。例如,如果发现聚集机制是经由硫-二硫化物互换的分子间S-S键形成,那么可通过修饰巯基残基、由酸性溶液冻干、控制湿度、采用适宜添加剂和开发特定聚合物基质组合物来实现稳定化。
使用抗体的治疗方法
考虑了TSPAN12或Norrin的抗体可用于治疗上述各种血管生成相关的病症。
所述抗体根据已知的方法施用给哺乳动物,优选人,诸如,作为推注或通过一段时间的连续输注的静脉内施用,通过玻璃体内的、肌肉内的、腹膜内的、脑脊内的、皮下的、关节内的、滑膜内的、鞘内的、经口的、局部的、或吸入途径。玻璃体内施用该抗体是优选的。
在一个实施方案中,病理性眼部血管生成在联合治疗中受到攻击。将 抗-TSPAN12和/或抗-Norrin抗体与另一抗体(例如,抗-VEGF)以治疗有效剂量施用给患者。
例如,根据病症的类型和严重程度,施用至患者的抗体的初始候选剂量为约1μg/kg-50mg/kg(例如,0.1-20mg/kg),无论是例如通过一次或多次单独施用,还是通过连续输注。根据上述因素,常规的每日或每周剂量的范围约为1μg/kg-100mg/kg或更多。对于在几天或更长时间内重复施用而言,可根据病情重复或持续所述治疗,直至理想地抑制疾病症状。但是,可以使用其它剂量方案。可以用常规技术和试验(包括例如放射照相的肿瘤显影)容易地监测此治疗的进展。
提供以下实施例仅是为了举例说明的目的,绝非以任何方式意图限制本发明的范围。
在本说明书中引用的所有专利和参考文献公开的全文通过引用并入本文。
实施例
除非另有说明,实施例中提及的商业上可获得的试剂根据厂家的说明书使用。本文引用的所有参考文献通过引用并入本文。
实施例1.TSPAN12参与正常和病理的血管生成
尽管TSPAN12的编码区在数种生物(包括人和小鼠)中是已知的(参见例如对于hTSPAN12,GenBank 登录号NM_012338,和对于mTSPAN12,NM_173007),尚未鉴定其功能。为了开始阐明其功能,使用常规方法产生了TSPAN12敲除(KO)小鼠。具体而言,靶向构建体通过电穿孔进入129/SvEvBrd(Lex-2)ES细胞中并且通过DNA印迹鉴定被靶向的克隆。来自于被靶向的克隆的细胞注射入C57BL/6(白化体(albino))胚泡中。产生的嵌合体与C57BL/6(白化体(albino))雌性小鼠交配以产生对该突变杂合的小鼠,随后回交至C57/BL6背景(>N3)并用于表型分析和其它实验。TSPAN12-/-小鼠是存活且可育的。
我们产生了针对c-末端细胞内肽CRREPGTDQMMSLK(SEQ ID NO:5)的兔多克隆血清,称之为αTSPAN12-Anaspec-C,并将其亲和纯化。我 们还产生了第二多克隆血清,称之为α-TSPAN12-Josman-B,其是针对有his标签的对应于在细菌中表达并纯化的氨基酸116-221(aa116-221-His6)的TSPAN12片段。在突变小鼠中的靶向通过DNA印迹(Southern blot)、PCR和蛋白质印迹(western blot)对来自于P1头馏分(heads)的裂解物确认,该裂解物是使用αTSPAN12-Anaspec-C通过免疫沉淀对TSPAN12进行富集的裂解物。
我们首先分析了TSPAN12在多种组织中的表达,发现在P15其在发育中的视网膜脉管中表达,在P1其在脑膜中表达。在非-CNS脉管中检测到很少或无表达。然而,在来自于根据公开的程序(Gerhardt等人,J.Cell.Biol.(细胞生物学杂志)161(6):1163-77(2003))处理的TSPAN12 KO小鼠的同工凝集素-染色的视网膜整装制片(wholemount preparation)中,我们未观察到NFL脉管系统的大规模的显著的形态变化。因此,我们在多种眼部疾病模型中分析TSPAN12突变体小鼠的表型。
产生了来自于八个TSPAN12(C57BL/6)het x het杂交的幼鼠并用于小鼠早产儿视网膜病(ROP)模型中。六只小动物,随着它们的授乳母亲一起置于75%氧气(氧过多)中,从P7开始放置5天的时间。在P12,动物返回室内空气条件(常氧)并维持另外五天(P17)。使用尾部活组织检查进行基因分型,37只动物分组如下:纯合野生型n=8,杂合的n=21,纯合突变体n=8。
在P17,右眼置于4%PFA中且左眼置于Davidson’s固定剂中。从左眼中去除角膜和晶状体用于石蜡处理和切片。眼杯(eye cups)置于块(block)中,虹膜边向下,朝向切片面。获得间隔16微米的切片并使用装有用户定制设计的核算法(nuclear algorithm)的Aperio ScanScope 对新血管形成进行分析。简而言之,与神经纤维层(NFL)密切相关的新血管丛被鉴定为进行算法定量的感兴趣的区域。对每例最少30个含有新血管核的切片进行定量,用于评价视网膜新血管形成。
在针对模型ROP设计的条件下培养的野生型动物中,鉴定了视网膜/玻璃体(vitreal)界面处的新血管细胞核(图1)。相比之下,纯合TSPAN12突变体小鼠具有显著更少的新血管细胞核(图2)。这些数据表明在这种ROP模型中TSPAN12对病理的新血管形成是必需的。
在ROP模型中观察了这种表型之后,我们分析了更精细范围上视网膜脉管系统的发育。在鼠视网膜中,出生后P0-P10天之间,NFL中建立了从视神经乳头通过萌发、迁移和重塑的组合的浅表血管丛。随后,血管萌发到外网状层(OPL)并萌发到内网状层(IPL),在那里建立了两个毛细血管床,产生了三层的脉管结构。至P8,我们发现在TSPAN12-/-小鼠的视网膜全样载片(wholemount)中NFL脉管系统的发育没有显著变化。在横切面中我们发现至P11在TSPAN12+/+小鼠OPL毛细血管的形成已经开始,而在TSPAN12-/-小鼠中完全没有萌发。在脉管系统中检测到TSPAN12表达而在其它视网膜组织中没有的事实,以及视网膜组织学在苏木素和伊红染色中显示正常的观察结合起来表明脉管的缺陷是初级的。在成年TSPAN12-/-小鼠中,OPL也不形成脉管,证明该缺陷不是一过性的。不同于IPL中有组织的毛细血管床,TSPAN12-/-小鼠在NFL和IPL之间的空隙中显示有些增大的并且扭曲的毛细血管。TSPAN12-/-视网膜中内和外核层的厚度在成年小鼠中持续降低,但在发育中的小鼠中并不如此,表明神经细胞受到脉管形成缺陷的继发影响。
总之,TSPAN12-/-小鼠表型的特征是大部分正常发育的浅表脉管丛和OPL中缺少毛细血管,该表型似乎与报道的Fzd4突变体小鼠(Xu等人Cell(细胞)116:883-95(2004))和Norrin突变体小鼠(Luhmann等人Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.(研究性眼科学和视觉科学)46(9):3372-82(2005))的表型十分相似。因此,我们测试了是否TSPAN12-/-小鼠展示另外的由Fzd4或其配体Norrin的破坏所导致的特征。Norrin突变体小鼠显示非常特征性的小动脉瘤(microaneurisms),其在P15从NFL延伸至内核层。令人吃惊地,通过共聚焦显微镜对P16 TSPAN12-/-小鼠的视网膜的分析揭示小动脉瘤样的脉管畸形,其与在Norrin突变体小鼠中描述的那些非常相似。这些高度特征性的畸形的相似性得到下述事实的支持:在Norrin突变体小鼠和在TSPAN12-/-小鼠中发生的畸形均在实际上相同的时间点发生。其它相似性包括Meca-32在TSPAN12-/-小鼠的视网膜血管中的异常表达,Meca-32是有孔血管的标志物,其在视网膜脉管系统中正常不表达,但在Fzd4突变体小鼠中上调。由于Norrin和Fzd4是配体/受体对,联合共受体LRP5激活标准(canonical)Wnt-途径并促进胞质β-连环蛋白(β-catenin)的积累,我 们对TSPAN12-/-小鼠的表型特征分析表明TSPAN12在Norrin/β-连环蛋白信号传导中也是必需的。
实施例2.TSPAN12参与Wnt信号传导
基于在TSPAN12、Fzd4和Norrin KO小鼠中观察到的表型的相似性,我们进行了Topflash报道物分析来确定是否TSPAN12参与Norrin诱导的通过Fzd4的β-连环蛋白Wnt信号传导。Topflash构建体由含有LEF/TCF共有位点的启动子下的萤火虫荧光素酶组成,因此可响应标准β-连环蛋白信号传导。在组成型启动子下表达renilla荧光素酶的构建体用作内对照。报道物构建体和受体转染的细胞通过10nM的重组Norrin在外源TSPAN12或载体对照存在下激活。16-18小时后,确定报道物活性(萤火虫活性除以海肾活性)。Norrin介导的信号传导在过表达TSPAN12的细胞中比对照细胞中高约4倍(图3,左组-右组显示对照海肾荧光素酶的表达在所有条件下相同)。我们在使用siRNA降低野生型TSPAN12 mRNA的细胞中(表达略低于对照水平的1/5)进行了相似的实验,并发现Norrin诱导的、Fzd4/LRP5-介导的表达在TSPAN12敲降(knock-down)后显著降低。
为进一步探测TSPAN12效应的特异性,我们进行了数个实验,其中我们改变了frizzled构建体和/或配体。首先我们使用转染了相同载体的细胞进行了实验,该载体表达其它frizzled构建体(Fzd1,Fzd2,Fzd7,Fzd10),以及Fzd4。如图4所示,TSPAN12对Norrin-介导的Wnt/β-连环蛋白标准信号转导的主要效应是Fzd4特异性的,对Fzd10-介导的信号传导的效应要小的多。下一步我们使用Wnt3a作为配体诱导信号传导分析了在这种测定中的信号传导。在此我们发现TSPAN12并不显著增强任何FZD-介导的信号传导(图5)。使用Wnt5a作为配体我们观察到相似的结果.
实施例3.TSPAN12是Fzd4-受体复合物的一部分
如果TSPAN12的确在Norrin/β-连环蛋白信号传导的起始过程中发挥功能,将预期与该受体复合物组分的共定位和相互作用。为测试这种可能性,我们使用flag-Fzd4(flag位于细胞外)和HA-TSPAN12转染Hela细胞。质膜Fzd4通过flag抗体在未透化的活细胞在冰上检测,随后TSPAN12在 固定和透化后检测。这种染色模式揭示大量Fzd4在Hela细胞表面上表达。Fzd4不是均匀的分散于质膜中,而相反发现其在许多斑点区聚集。TSPAN12在很大程度上与Fzd4阳性斑点共定位,并且此外在不被抗-fag染色的细胞内结构(因为抗-flag染色在细胞表面进行而不透化细胞)中存在。相比之下,CD9和Fzd4并不共定位。当用Fzd5替换Fzd4并与TSPAN12共表达时,我们发现TSPAN12和Fzd5几乎独立地定位(仅在强烈表达两种蛋白的少数细胞中部分地克服分离)。
已经使用条件培养基研究Norrin-受体相互作用,该条件培养基含有融合了Norrin的N-末端碱性磷酸酶(AP-Norrin)(Xu等人 见上文)。我们用Fzd4、LRP5或TSPAN12之一转染了HeLa细胞,并通过含有flag-AP-Norrin的条件培养基探测这些细胞。与以前的报道一致,我们发现flag-AP-Norrin有效结合表达Fzd4的细胞,而不是表达LRP5的细胞。重要地,Norrin也不结合仅表达TSPAN12的细胞(图6)。为了探测TSPAN12和受体复合物的相互作用,我们在293细胞中共表达了Fzd4,LRP5和TSPAN12并在各自的对照中使用Fzd5作为备选的Frizzled和CD9作为备选的tetraspanin。在将这些细胞与含有flag-AP-Norrin的条件培养基在冰上孵育(以防止内在化事件)和广泛洗涤之后,Norrin相关的膜蛋白温和交联,然后通过抗-flag抗体免疫沉淀。Norrin有效沉淀Fzd4但不沉淀Fzd5。另外,TSPAN12通过Norrin与Fzd4共沉淀,但不与Fzd5共沉淀,并在没有Frizzled存在时不沉淀。相比之下,CD9尽管与TSPAN12有相似的表达水平,不通过Norrin与Fzd4共沉淀(图7)。因此,TSPAN12物理上与Fzd4受体复合物相关联。在不存在来自于去垢剂提取物(1%NP-40+0.1%N-十二烷基-beta-D-麦芽糖苷(maltoside))的LRP5,当不使用交联剂时,TSPAN12也通过Norrin与Fzd4共沉淀(数据未显示)。当TSPAN12和LRP5共表达且TSPAN12被免疫沉淀时,未检测到与LRP5的关联(图8)。
考虑到TSPAN12对Norrin/β-连环蛋白信号传导的强烈增强,我们分析了是否TSPAN12能够提高Norrin对Fzd4的结合。为此目的,用flag-Fzd4,LRP5,TSPAN12或载体对照转染Hela细胞,并随后用几种稀释的flag-AP-Norrin条件培养基探测。在所有测试的Norrin浓度下,存在或不存在TSPAN12时,flag-AP-Norrin与细胞的结合相似(图9)。为排除 TSPAN12降低Fzd4表达水平但同时提高Norrin的结合的可能性,我们直接确定了Fzd4的表达,这通过针对flag肽的HRP-偶联的抗体进行。TSPAN12的共表达不改变Fzd4在细胞膜上的表达(图10)。结合在一起,TSPAN12不与Norrin免疫共沉淀(除非存在Fzd4)(图7)并且不增强Norrin与Fzd4的结合(图9)的发现表明TSPAN12以一种独特的方式增强信号传导。这与几种其它tetraspanins的功能是一致的,它们典型地不直接结合配体,相反被认为是组织微结构域(microdomain),该微结构域促进包埋的受体的信号传导。因此,我们下一步检查了TSPAN12促进受体复合物组分之间相互作用的可能性。
实施例4.单体Norrin C95R的缺陷被TSPAN12绕过
Norrin属于半胱氨酸knot蛋白亚群,其通过分子间二硫键形成二聚体(Vitt等人Mol.Endocrinol.(分子内分泌学)15(5):681-94(2001)),并且已经显示Norrin二聚体可进一步组装成更高分子量的结构(Perez-Vilar等人J.Biol.Chem.(生物化学杂志)272(52):33410-15(1997))。除非Norrin融合至AP(Xu等人 见上文),Norrin与细胞外基质(ECM)强烈相关。通过还原分子间二硫键,Norrin可完全转化为单体,或者,预测位点95的半胱氨酸突变破坏分子间二硫键。我们在293细胞中表达带V5-标签的野生型Norrin和带V5-标签的Norrin C95R,并从ECM中提取Norrin。还原条件下的SDS PAGE揭示野生型和突变体Norrin的单体实际上是不可区分的。与以前的报道一致,非还原条件下的分析揭示野生型Norrin形成二聚体和更高分子量的组装物。相比之下,Norrin-C95R突变体大部分是单体的并且不形成大的组装物(图11)。全部Norrin C95R的一小部分形成二聚体,可能是通过非共价结合或通过C95以外的位点的分子间二硫键。
我们预测大于单体的Norrin组装物具有如下潜能:使多个Fzd4分子在膜上紧密接近并增强Norrin/β-连环蛋白的信号传导,而单体Norrin-C95R则不能。为测试这种想法,我们在293细胞中,在存在或不存在TSPAN12时,转染了渐增量的野生型Norrin或Norrin C95R cDNA连同受体来诱导Topflash活性。当5-100ng Norrin质粒与FZD4和LRP5共转染时,野生型Norrin的表达有效诱导Norrin/β-连环蛋白信号传导,并 且添加TSPAN12强烈增强这种活性(图12)。然而,单体Norrin C95R突变体在不过表达TSPAN12的细胞中实际上是无活性的,即使在100ng的Norrin质粒的最高剂量下。与TSPAN12能够将受体带进微结构域并允许它们相互的位置靠近的想法一致,TSPAN12在很大程度上拯救了Norrin C95R突变体的信号传导缺陷。另外,添加TSPAN12提高了野生型Norrin的信号传导(图12)。总之,这些数据表明Norrin多聚体和TSPAN12各自提供不同的方式使多个FZD4分子紧密接近,并且这两种机制共同作用诱导最大的信号传导。
实施例5.TSPAN12增强受体聚集(Clustering)
我们使用以前描述的突变FZD4-M157V对受体聚集进行了生化分析,该突变强烈破坏Norrin/β-连环蛋白信号传导但维持结合Norrin的能力(Xu等人,见上文)。在结构信息(Dann等人Nature(自然)412:86-90(2001))的帮助下,已经提议M157V突变影响Norrin诱导的FZD4二聚化以及因此的多聚化(Dann等人,见上文;Toomes等人,见上文;Xu等人,见上文)。与以前的报道(Xu等人,见上文)一致,我们发现FZD4-M157V介导的信号传导受到严重破坏。有趣的是,TSPAN12共表达完全拯救了FZD4-M157V的信号传导缺陷(图13A)。
我们然后利用FZD4-M157V直接研究TSPAN12在FZD4多聚化中的作用。用TSPAN12或对照载体转染293细胞,并且用FLAGTM-FZD4和gD-FZD4共转染,或用FLAG-FZD4-M157V和gD-FZD4-M157V共转染。细胞与含Norrin或无配体的培养基一起进行冰浴。细胞裂解物与抗-FLAG抗体免疫沉淀并探测gD-FZD4的免疫共沉淀。为了能够对蛋白-蛋白相互作用进行定量,在这一实验中未使用交联剂。检测到gD-FZD4和FLAG-FZD4之间或gD-FZD4-M157V和FLAG-FZD4-M157V之间相似基线水平的关联(图13B和数据未显示)。Norrin和TSPAN12各自提高被FLAG-FZD4拖下来的gD-FZD4的量,并且Norrin和TSPAN12的组合进一步提高了FZD4聚集(图13B,左组;13C,空的柱图)。重要地,M157V突变严重破坏Norrin使FLAG-FZD4与gD-FZD4聚集的能力,而共表达TSPAN12补偿了这种缺陷(图13B,右组,13C,填充的柱图)。总之,这 些数据显示TSPAN12和Norrin均促进FZD4多聚化,并表明起始Norrin/β-连环蛋白的信号转导需要i)促进FZD4多聚化的因子和ii)通过配体结合激活FZD4。
我们下一步测试了添加增强FZD4受体聚集的抗体能否拯救FZD4-M157V的活性。在24-孔板中,用含有β-连环蛋白报道物混合物(Topflash,pRL-CMV和pCan-myc-lef-1),LRP5,和FZD4或FZD4-M157V的DNA混合物转染1.6x105细胞/孔。转染后24小时,所示的孔接受1μg/ml的抗-LRP5/6抗体。一小时后,添加125ng/ml的重组Norrin至所示的孔中。在37℃孵育另外16小时后,裂解细胞,使用Promega Dual-Glo 试剂测量萤火虫和海肾荧光素酶的表达。萤火虫荧光素酶的值根据海肾的表达进行标准化。结果显示于表1中。在表达FZD4的细胞中,在存在Norrin时报道物的活性被激活~6倍。当表达了FZD4-M157V时,Norrin的激活显著破坏至仅~2倍。添加LRP5抗体部分地拯救了大约2倍的FZD4-M157V中的信号传导缺陷。
表1.抗-LRP5/6抗体部分地拯救了FZD4-M157V的缺陷
实施例6.抗-TSPAN12和抗-Norrin抗体的产生
我们使用多种方法产生抗-TSPAN12和抗-Norrin抗体。例如,我们通过免疫接种和杂交瘤技术产生抗体。我们还使用合成的噬菌体抗体文库,其通过在重链和轻链的互补决定区(CDR)内引入多样性在单框架(人源化抗-ErbB2抗体,4D5)上建立(Lee,等人J.Mol.Biol.340:1073-93(2004);Liang等人J.Biol.Chem.281:951-61(2006))。针对固定在MaxiSorpTM免 疫板上的有His-标签的人TSPAN12进行幼稚文库 的板淘洗(plate panning)。四轮富集后,随机挑选克隆并使用噬菌体ELISA鉴定特异性结合物。产生的hTSPAN12结合克隆进一步通过有His-标签的鼠TSPAN12蛋白进行筛选以鉴定种间交叉(cross-species)克隆。对每个阳性噬菌体克隆,重链和轻链可变区亚克隆至pRK表达载体,该载体被工程化以表达全长IgG链。重链和轻链构建体共转染293或CHO细胞,并且表达的抗体使用蛋白质A亲和柱从无血清培养基中纯化。纯化的抗体通过ELISA测试对重组TSPAN12或Norrin的结合,通过FACS测试对稳定细胞系的结合,该细胞系表达联合FZD4的全长人TSPAN12或鼠TSPAN12或表达人或鼠Norrin。然后测试该抗体阻断通过TSPAN12的Norrin-介导的、FZD4/LRP5-介导的Wnt报道物活性的增强(抗-TSPAN12抗体),或阻断Norrin-介导的信号传导(抗-Norrin抗体)。对于亲和力成熟,通过软性随机化策略构建噬菌体文库,该文库含有来自于感兴趣的最初克隆的CDR环的三种不同组合(CDR-L3,-H1和-H2),从而每个选定的位点以约50∶50的频率被突变为非野生型残基或维持为野生型(Liang等人,2006,上文)。然后,通过进行性提高的严格性下的四轮溶液相淘洗鉴定高亲和力克隆,该淘洗针对人和鼠两者的带有His-标签的TSPAN12蛋白进行。
实施例7.眼部疾病的鼠模型
我们在鼠模型中测试了抗体或TSPAN12多肽。对于鼠ROP模型,小动物置于75%氧气(氧过多)下从P7开始五天时间。在P12,动物返回室内空气条件(常氧)并维持另外五天(P17)。抗-TSPAN12,抗-Norrin抗体或TSPAN12大的胞外环(例如Ho等人 见上文)经玻璃体注射至P12动物中。根据通过拮抗剂亲和力和稳定性确定的预测实施了多种剂量水平和频率。在P17,右眼置于4%PFA并且左眼置于Davidson’s固定剂中。从左眼中去除角膜和晶状体用于石蜡处理和切片。将眼杯置于块中,虹膜边向下,朝向切片面。获得间隔16微米的切片并使用装有用户定制设计的核算法(nuclear algorithm)的Aperio ScanScope 对新血管形成进行分析。与NFL密切相关的新血管丛被鉴定为进行算法定量的感兴趣的区域。对每例最少30个含有新血管核的切片进行定量,用于评价视网膜新血管形成。
我们还在鼠激光诱导的脉络膜新血管形成模型中测试了该抗体和多肽。
认为前文的书面描述足以使本领域技术人员实施本发明。然而,根据前文描述,对本文显示和描述的发明以外的多种修改对本领域技术人员来说是明显的并落入所附权利要求的范围。
Claims (50)
1.一种减少或抑制患有与血管生成相关的眼部疾病或病症的受试者中血管生成的方法,该方法包括向该受试者施用TSPAN12拮抗剂。
2.权利要求1的方法,其中该TSPAN12拮抗剂是抗-TSPAN12抗体。
3.权利要求1的方法,其中该TSPAN12拮抗剂包含TSPAN12的多肽片段。
4.权利要求3的方法,其中该TSPAN12的多肽片段包含TSPAN12的胞外域。
5.权利要求3或4的方法,其中该TSPAN12拮抗剂还包含免疫球蛋白恒定区。
6.权利要求5的方法,其中该免疫球蛋白恒定区是IgG Fc。
7.权利要求1的方法,其中该眼部疾病或病症选自下述各项组成的组:糖尿病性视网膜病、脉络膜新血管形成(CNV)、年龄相关的黄斑变性(AMD)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、病理性近视、遗传性斑痣性错构瘤病、眼睛的组织胞浆菌病、视网膜中央静脉闭塞(CRVO)、视网膜分支静脉闭塞(BRVO)、角膜新血管形成、视网膜新血管形成、早产儿视网膜病(ROP)、结膜下出血和高血压性视网膜病。
8.权利要求7的方法,其中该眼部疾病或病症选自由糖尿病性视网膜病、AMD、DME、CRVO和BRVO组成的组。
9.权利要求1的方法,还包括向该受试者施用第二抗-血管生成剂。
10.权利要求9的方法,其中该第二抗-血管生成剂在施用该TSPAN12拮抗剂之前或之后施用。
11.权利要求9的方法,其中该第二抗-血管生成剂与该TSPAN12拮抗剂同时施用。
12.权利要求9的方法,其中该第二抗-血管生成剂是Norrin拮抗剂或血管内皮细胞生长因子(VEGF)拮抗剂。
13.权利要求12的方法,其中该Norrin拮抗剂是抗-Norrin抗体。
14.权利要求12的方法,其中该VEGF拮抗剂是抗-VEGF抗体。
15.权利要求14的方法,其中该抗-VEGF抗体是雷珠单抗。
16.一种减少或抑制患有与血管生成相关的眼部疾病或病症的受试者中血管生成的方法,该方法包括向该受试者施用Norrin拮抗剂。
17.权利要求16的方法,其中该Norrin拮抗剂是抗-Norrin抗体。
18.权利要求16的方法,其中该眼部疾病或病症选自下述各项组成的组:糖尿病性视网膜病、CNV、AMD、DME、病理性近视、遗传性斑痣性错构瘤病、眼睛的组织胞浆菌病、CRVO、BRVO、角膜新血管形成、视网膜新血管形成、ROP、结膜下出血和高血压性视网膜病。
19.权利要求18的方法,其中该眼部疾病选自由糖尿病性视网膜病、AMD、DME、CRVO和BRVO组成的组。
20.权利要求16的方法,还包括向该受试者施用第二抗-血管生成剂。
21.权利要求20的方法,其中该第二抗-血管生成剂在施用该Norrin拮抗剂之前或之后施用。
22.权利要求20的方法,其中该第二抗-血管生成剂与该Norrin拮抗剂同时施用。
23.权利要求20的方法,其中该第二抗-血管生成剂是VEGF拮抗剂。
24.权利要求23的方法,其中该VEGF拮抗剂是抗-VEGF抗体。
25.权利要求23的方法,其中该抗-VEGF抗体是雷珠单抗。
26.一种治疗受试者中与不希望的血管生成相关的眼部疾病或病症的方法,该方法包括向该受试者施用TSPAN12拮抗剂。
27.权利要求26的方法,其中该TSPAN12拮抗剂是抗-TSPAN12抗体。
28.权利要求26的方法,其中该TSPAN12拮抗剂包含TSPAN12的多肽片段。
29.权利要求27的方法,其中该TSPAN12的多肽片段包含TSPAN12的胞外域。
30.权利要求28或29的方法,其中该TSPAN12拮抗剂还包含免疫球蛋白恒定区。
31.权利要求30的方法,其中该免疫球蛋白恒定区是IgG Fc。
32.权利要求26的方法,其中该眼部疾病或病症选自下述各项组成的组:包括增殖性糖尿病性视网膜病的增殖性视网膜病、CNV、AMD、糖尿病性及其它缺血相关的视网膜病、DME、病理性近视、遗传性斑痣性错构瘤病、眼睛的组织胞浆菌病、CRVO、BRVO、角膜新血管形成、视网膜新血管形成、ROP、结膜下出血和高血压性视网膜病。
33.权利要求32的方法,其中该眼部疾病或病症选自由糖尿病性视网膜病、AMD、DME、CRVO和BRVO组成的组。
34.权利要求26的方法,还包括向该受试者施用第二抗-血管生成剂。
35.权利要求34的方法,其中该第二抗-血管生成剂在施用该TSPAN12拮抗剂之前或之后施用。
36.权利要求34的方法,其中该第二抗-血管生成剂与该TSPAN12拮抗剂同时施用。
37.权利要求34的方法,其中该第二抗-血管生成剂是Norrin拮抗剂或VEGF拮抗剂。
38.权利要求37的方法,其中该Norrin拮抗剂是抗-Norrin抗体。
39.权利要求37的方法,其中该VEGF拮抗剂是抗-VEGF抗体。
40.权利要求39的方法,其中该抗-VEGF抗体是雷珠单抗。
41.一种治疗受试者中与不希望的血管生成相关的眼部疾病或病症的方法,该方法包括向该受试者施用Norrin拮抗剂。
42.权利要求41的方法,其中该Norrin拮抗剂是抗-Norrin抗体。
43.权利要求41的方法,其中该眼部疾病或病症选自下述各项组成的组:包括增殖性糖尿病性视网膜病的增殖性视网膜病、CNV、AMD、糖尿病性及其它缺血相关的视网膜病、DME、病理性近视、遗传性斑痣性错构瘤病、眼睛的组织胞浆菌病、CRVO、BRVO、角膜新血管形成、视网膜新血管形成、ROP、结膜下出血和高血压性视网膜病。
44.权利要求43的方法,其中该眼部疾病选自由糖尿病性视网膜病、AMD、DME、CRVO和BRVO组成的组。
45.权利要求41的方法,还包括向该受试者施用第二抗-血管生成剂。
46.权利要求45的方法,其中该第二抗-血管生成剂在施用该Norrin拮抗剂之前或之后施用。
47.权利要求45的方法,其中该第二抗-血管生成剂与该Norrin拮抗剂同时施用。
48.权利要求45的方法,其中该第二抗-血管生成剂是VEGF拮抗剂。
49.权利要求48的方法,其中该VEGF拮抗剂是抗-VEGF抗体。
50.权利要求49的方法,其中该抗-VEGF抗体是雷珠单抗。
Applications Claiming Priority (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US9575708P | 2008-09-10 | 2008-09-10 | |
US61/095,757 | 2008-09-10 | ||
US10350208P | 2008-10-07 | 2008-10-07 | |
US61/103,502 | 2008-10-07 | ||
US23451909P | 2009-08-17 | 2009-08-17 | |
US61/234,519 | 2009-08-17 | ||
PCT/US2009/056557 WO2010030813A2 (en) | 2008-09-10 | 2009-09-10 | Methods for inhibiting ocular angiogenesis |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201410541677.6A Division CN104306967A (zh) | 2008-09-10 | 2009-09-10 | 抑制眼部血管生成的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102149728A true CN102149728A (zh) | 2011-08-10 |
CN102149728B CN102149728B (zh) | 2014-10-15 |
Family
ID=42005747
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201410541677.6A Pending CN104306967A (zh) | 2008-09-10 | 2009-09-10 | 抑制眼部血管生成的方法 |
CN200980135280.4A Expired - Fee Related CN102149728B (zh) | 2008-09-10 | 2009-09-10 | 抑制眼部血管生成的方法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201410541677.6A Pending CN104306967A (zh) | 2008-09-10 | 2009-09-10 | 抑制眼部血管生成的方法 |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US20100129375A1 (zh) |
EP (1) | EP2334702A2 (zh) |
JP (2) | JP5859307B2 (zh) |
KR (1) | KR20110051245A (zh) |
CN (2) | CN104306967A (zh) |
AU (1) | AU2009291747B2 (zh) |
BR (1) | BRPI0913476A2 (zh) |
CA (1) | CA2734694A1 (zh) |
CL (1) | CL2011000513A1 (zh) |
HK (1) | HK1204274A1 (zh) |
IL (2) | IL211279A (zh) |
MX (1) | MX2011002418A (zh) |
RU (2) | RU2530583C2 (zh) |
SG (1) | SG193209A1 (zh) |
WO (1) | WO2010030813A2 (zh) |
ZA (1) | ZA201101202B (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2023155144A1 (en) * | 2022-02-18 | 2023-08-24 | Tsinghua University | Methods for regulating angiogenesis |
Families Citing this family (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9114078B2 (en) | 2009-03-17 | 2015-08-25 | Retinol Solutions Llc | Methods and compositions for genetic and retinal disease |
BR112014017518A2 (pt) | 2012-01-18 | 2018-09-04 | Genentech Inc | anticorpo e ácido nucleico isolados, célula hospedeira, métodos, imunoconjugado, formulação farmacêutica e uso do anticorpo |
US20150141340A1 (en) * | 2012-06-04 | 2015-05-21 | Yale University | Method of treating and preventing ocular angiogenesis |
CN105431161A (zh) * | 2013-02-21 | 2016-03-23 | 范安德尔研究所 | Norrin突变体多肽、其制造方法和用途 |
ES2875853T3 (es) | 2013-03-15 | 2021-11-11 | Univ Texas | Método de tratar fibrosis |
US20150050277A1 (en) | 2013-03-15 | 2015-02-19 | Aerpio Therapeutics Inc. | Compositions and methods for treating ocular diseases |
EP3074049B1 (en) | 2013-11-26 | 2020-05-06 | Yale University | Novel cell-penetrating compositions and methods using same |
US9840553B2 (en) | 2014-06-28 | 2017-12-12 | Kodiak Sciences Inc. | Dual PDGF/VEGF antagonists |
EP3191526B1 (en) * | 2014-09-12 | 2023-02-22 | The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University | Wnt signaling agonist molecules |
US10206978B2 (en) | 2015-06-08 | 2019-02-19 | Retinal Solutions Llc | Norrin regulation of junction proteins and the use thereof to treat epithelial or endothelial membrane leakage induced edema |
US10669321B2 (en) | 2015-06-08 | 2020-06-02 | Retinal Solutions Llc | Retinal capillary regeneration with synthetic norrin protein |
US10202429B2 (en) | 2015-06-08 | 2019-02-12 | Retinal Solutions Llc | Norrin regulation of cellular production of junction proteins and use to treat retinal vasculature edema |
BR112018013407A2 (pt) | 2015-12-30 | 2018-12-18 | Kodiak Sciences Inc | anticorpos e conjugados dos mesmos |
WO2018111099A1 (en) | 2016-12-12 | 2018-06-21 | Stichting Vumc | Biomarkers and treatments for cerebral amyloid angiopathy (caa) |
RU2669787C2 (ru) * | 2016-12-13 | 2018-10-16 | Общество с ограниченной ответственностью "Международный Биотехнологический Центр "Генериум" | Средство для лечения заболевания, сопровождающегося отеком макулы вследствие повышенной экспрессии VEGF-A |
US20180264049A1 (en) * | 2017-03-20 | 2018-09-20 | Batu Biologics, Inc. | Immunotherapy of Aberrant Ocular Angiogenesis by Placental Vaccination |
EP3618851A4 (en) * | 2017-05-05 | 2020-04-15 | Retinal Solutions LLC | NORRIN INDUCED EXPRESSION OF GENES AND THEIR USE FOR TREATING DISEASES |
CN111727203B (zh) | 2017-12-19 | 2024-04-26 | 瑟罗泽恩奥普瑞汀公司 | Wnt替代分子和其用途 |
WO2019126401A1 (en) | 2017-12-19 | 2019-06-27 | Surrozen, Inc. | Anti-lrp5/6 antibodies and methods of use |
KR102096509B1 (ko) * | 2018-03-28 | 2020-04-03 | 재단법인 대구경북과학기술원 | 항-Tspan12 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 그의 용도 |
AU2019339260A1 (en) | 2018-09-10 | 2021-03-25 | Lung Therapeutics, Inc. | Modified peptide fragments of Cav-1 protein and the use thereof in the treatment of fibrosis |
WO2020149593A2 (ko) * | 2019-01-14 | 2020-07-23 | 황인후 | 테트라스파닌-2 억제제를 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 예방, 개선 또는 치료용 조성물 |
AU2020364071A1 (en) | 2019-10-10 | 2022-05-26 | Kodiak Sciences Inc. | Methods of treating an eye disorder |
US20230126239A1 (en) * | 2020-03-09 | 2023-04-27 | Retinal Solutions, LLC | Norrin regulation of plasmalemma vesicle-associated protein and use to treat macular degeneration |
EP4229091A1 (en) * | 2020-10-15 | 2023-08-23 | The Regents of the University of California | Anti-cancer inhibitory antibodies |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1620288A (zh) * | 2002-01-23 | 2005-05-25 | 诺瓦提斯公司 | Cox-2抑制剂在血管生成介导的眼部疾病中的药学应用 |
WO2006132788A2 (en) * | 2005-06-06 | 2006-12-14 | Genentech, Inc. | Transgenic models for different genes and their use for gene characterization |
Family Cites Families (37)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3773919A (en) | 1969-10-23 | 1973-11-20 | Du Pont | Polylactide-drug mixtures |
FR2413974A1 (fr) | 1978-01-06 | 1979-08-03 | David Bernard | Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie |
US4263428A (en) | 1978-03-24 | 1981-04-21 | The Regents Of The University Of California | Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same |
US4376110A (en) | 1980-08-04 | 1983-03-08 | Hybritech, Incorporated | Immunometric assays using monoclonal antibodies |
DE3169595D1 (en) | 1980-11-10 | 1985-05-02 | Gersonde Klaus | Method of preparing lipid vesicles by ultrasonic treatment, the use of this method and apparatus for its application |
IE52535B1 (en) | 1981-02-16 | 1987-12-09 | Ici Plc | Continuous release pharmaceutical compositions |
US4485045A (en) | 1981-07-06 | 1984-11-27 | Research Corporation | Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes |
JPS58118008A (ja) | 1982-01-06 | 1983-07-13 | Nec Corp | デ−タ処理装置 |
DE3374837D1 (en) | 1982-02-17 | 1988-01-21 | Ciba Geigy Ag | Lipids in the aqueous phase |
DE3218121A1 (de) | 1982-05-14 | 1983-11-17 | Leskovar, Peter, Dr.-Ing., 8000 München | Arzneimittel zur tumorbehandlung |
EP0102324A3 (de) | 1982-07-29 | 1984-11-07 | Ciba-Geigy Ag | Lipide und Tenside in wässriger Phase |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
US4544545A (en) | 1983-06-20 | 1985-10-01 | Trustees University Of Massachusetts | Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting |
HUT35524A (en) | 1983-08-02 | 1985-07-29 | Hoechst Ag | Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance |
ATE59966T1 (de) | 1983-09-26 | 1991-02-15 | Ehrenfeld Udo | Mittel und erzeugnis fuer die diagnose und therapie von tumoren sowie zur behandlung von schwaechen der zelligen und humoralen immunabwehr. |
EP0143949B1 (en) | 1983-11-01 | 1988-10-12 | TERUMO KABUSHIKI KAISHA trading as TERUMO CORPORATION | Pharmaceutical composition containing urokinase |
US4676980A (en) | 1985-09-23 | 1987-06-30 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Target specific cross-linked heteroantibodies |
US4902505A (en) | 1986-07-30 | 1990-02-20 | Alkermes | Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier |
EP0257956B2 (en) | 1986-08-19 | 2000-11-22 | Genentech, Inc. | Use of polypeptide growth factors and cytokines for the manufacture of a device and of a dispersion |
US4987071A (en) | 1986-12-03 | 1991-01-22 | University Patents, Inc. | RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods |
US4904582A (en) | 1987-06-11 | 1990-02-27 | Synthetic Genetics | Novel amphiphilic nucleic acid conjugates |
GB8823869D0 (en) | 1988-10-12 | 1988-11-16 | Medical Res Council | Production of antibodies |
CA2062795A1 (en) | 1989-06-29 | 1990-12-30 | Michael W. Fanger | Bispecific reagents for aids therapy |
US5013556A (en) | 1989-10-20 | 1991-05-07 | Liposome Technology, Inc. | Liposomes with enhanced circulation time |
EP0814159B1 (en) | 1990-08-29 | 2005-07-27 | GenPharm International, Inc. | Transgenic mice capable of producing heterologous antibodies |
US5545806A (en) | 1990-08-29 | 1996-08-13 | Genpharm International, Inc. | Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
US5625126A (en) | 1990-08-29 | 1997-04-29 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
US5661016A (en) | 1990-08-29 | 1997-08-26 | Genpharm International Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes |
US5633425A (en) | 1990-08-29 | 1997-05-27 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
JPH06507398A (ja) | 1991-05-14 | 1994-08-25 | リプリジェン コーポレーション | Hiv感染治療のための異種複合抗体 |
WO1993008829A1 (en) | 1991-11-04 | 1993-05-13 | The Regents Of The University Of California | Compositions that mediate killing of hiv-infected cells |
AU2582897A (en) | 1996-03-15 | 1997-10-01 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for the diagnosis, prevention, and treatment of neoplastic cell growth and proliferation |
US20050181478A1 (en) * | 1998-09-01 | 2005-08-18 | Baker Kevin P. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
AU2003208833A1 (en) * | 2002-02-14 | 2003-09-04 | Merck Patent Gmbh | Methods and compositions for the treatment of eye diseases |
JP4095498B2 (ja) * | 2003-06-23 | 2008-06-04 | 株式会社東芝 | 磁気ランダムアクセスメモリ、電子カードおよび電子装置 |
US20080181893A1 (en) * | 2006-08-07 | 2008-07-31 | Lobov Ivan B | Therapeutic methods for treating vascular eye disorders with DII4 antagonists |
BR112014017518A2 (pt) * | 2012-01-18 | 2018-09-04 | Genentech Inc | anticorpo e ácido nucleico isolados, célula hospedeira, métodos, imunoconjugado, formulação farmacêutica e uso do anticorpo |
-
2009
- 2009-09-10 CA CA2734694A patent/CA2734694A1/en not_active Abandoned
- 2009-09-10 SG SG2013062047A patent/SG193209A1/en unknown
- 2009-09-10 BR BRPI0913476A patent/BRPI0913476A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2009-09-10 US US12/557,394 patent/US20100129375A1/en not_active Abandoned
- 2009-09-10 AU AU2009291747A patent/AU2009291747B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2009-09-10 CN CN201410541677.6A patent/CN104306967A/zh active Pending
- 2009-09-10 KR KR1020117005578A patent/KR20110051245A/ko not_active Application Discontinuation
- 2009-09-10 WO PCT/US2009/056557 patent/WO2010030813A2/en active Application Filing
- 2009-09-10 MX MX2011002418A patent/MX2011002418A/es not_active Application Discontinuation
- 2009-09-10 JP JP2011526975A patent/JP5859307B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2009-09-10 CN CN200980135280.4A patent/CN102149728B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2009-09-10 EP EP09771441A patent/EP2334702A2/en not_active Ceased
- 2009-09-10 RU RU2011113854/15A patent/RU2530583C2/ru not_active IP Right Cessation
-
2011
- 2011-02-15 ZA ZA2011/01202A patent/ZA201101202B/en unknown
- 2011-02-17 IL IL211279A patent/IL211279A/en not_active IP Right Cessation
- 2011-03-10 CL CL2011000513A patent/CL2011000513A1/es unknown
- 2011-08-25 US US13/218,360 patent/US20120276083A1/en not_active Abandoned
-
2014
- 2014-04-25 US US14/262,368 patent/US20150093375A1/en not_active Abandoned
- 2014-06-26 IL IL233390A patent/IL233390A0/en unknown
- 2014-07-16 RU RU2014129316A patent/RU2014129316A/ru not_active Application Discontinuation
-
2015
- 2015-03-24 JP JP2015061635A patent/JP2015164918A/ja not_active Withdrawn
- 2015-05-21 HK HK15104837.2A patent/HK1204274A1/zh unknown
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1620288A (zh) * | 2002-01-23 | 2005-05-25 | 诺瓦提斯公司 | Cox-2抑制剂在血管生成介导的眼部疾病中的药学应用 |
WO2006132788A2 (en) * | 2005-06-06 | 2006-12-14 | Genentech, Inc. | Transgenic models for different genes and their use for gene characterization |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
HEMLER MARTIN ET AL.: "Targeting of tetraspanin proteins-potenetial benefits and strategies.", 《NATURE REVIEWS》 * |
JUNGE HJ ET AL.: "TSPAN12 regulates retinal vascular development by promoting Norrin- but not Wnt-induced FZD4/beta-catenin signaling.", 《CELL》 * |
丁小燕 等: "Norrin在氧诱导的视网膜病变中的时空表达及其意义_丁小燕", 《中国病理生理杂志》 * |
丁小燕 等: "Norrin基因对人视网膜微血管内皮细胞增殖和周期的影响", 《中国病理生理杂志》 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2023155144A1 (en) * | 2022-02-18 | 2023-08-24 | Tsinghua University | Methods for regulating angiogenesis |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
MX2011002418A (es) | 2011-04-05 |
CL2011000513A1 (es) | 2012-02-24 |
JP2015164918A (ja) | 2015-09-17 |
WO2010030813A3 (en) | 2010-09-30 |
CA2734694A1 (en) | 2010-03-18 |
RU2011113854A (ru) | 2012-10-20 |
US20150093375A1 (en) | 2015-04-02 |
RU2014129316A (ru) | 2016-02-10 |
AU2009291747B2 (en) | 2016-05-26 |
JP5859307B2 (ja) | 2016-02-10 |
IL211279A (en) | 2015-03-31 |
IL211279A0 (en) | 2011-04-28 |
HK1204274A1 (zh) | 2015-11-13 |
WO2010030813A2 (en) | 2010-03-18 |
EP2334702A2 (en) | 2011-06-22 |
ZA201101202B (en) | 2015-08-26 |
US20100129375A1 (en) | 2010-05-27 |
KR20110051245A (ko) | 2011-05-17 |
BRPI0913476A2 (pt) | 2015-12-01 |
RU2530583C2 (ru) | 2014-10-10 |
JP2012502106A (ja) | 2012-01-26 |
AU2009291747A1 (en) | 2010-03-18 |
US20120276083A1 (en) | 2012-11-01 |
CN102149728B (zh) | 2014-10-15 |
CN104306967A (zh) | 2015-01-28 |
SG193209A1 (en) | 2013-09-30 |
IL233390A0 (en) | 2014-08-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102149728B (zh) | 抑制眼部血管生成的方法 | |
CN1997394B (zh) | 含有用于调节血管发育的egfl7拮抗剂的组合物及方法 | |
CN102596998B (zh) | 血管增殖病症的治疗 | |
US20090068102A1 (en) | Treating stroke | |
CN101970670B (zh) | 使用egfl8拮抗剂抑制血管发生的方法 | |
US10961304B2 (en) | Method of reducing the effect of a stroke comprising administering an inhibitor of vascular endothelial growth factor B (VEGF-B) | |
CN102239178A (zh) | 抑制p1gf以治疗费城染色体阳性白血病 | |
WO2022236134A1 (en) | Anti-il-27 antibodies and uses thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20141015 Termination date: 20170910 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |