ES2875853T3 - Método de tratar fibrosis - Google Patents

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Abstract

Una composición farmacéutica para uso en el tratamiento de una afección fibrótica, la composición comprende: (a) un péptido o polipéptido administrable que consiste en la secuencia FTTFTVT (SEQ ID NO: 1) y, opcionalmente, en donde el péptido o polipéptido administrable está unido a, o está asociado con, una secuencia de internalización; y (b) un soporte o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Description

d e s c r ip c ió n
Método de tratar fibrosis
Campo
La presente divulgación está en el campo de la bioquímica y medicina se dirige a métodos y composiciones para aumentar los niveles de la proteína p53, reducir uPA y uPAR y aumentar la expresión de PAI-1, en fibroblastos de pulmón fibrótico (FL) y reducir su proliferación, y para tratar fibrosis pulmonar idiopática (FPI) usando nutlina-3a y péptidos.
Descripción de Ios antecedentes técnicos
La fibrosis pulmonar idiopática (FPI) es una enfermedad del pulmón progresiva y letal mal entendida para la que no existe tratamiento aparte del trasplante de pulmón (Masón DP et al., Ann Thorac Surg 84.í 121-8, 2007). La supervivencia mediana de cinco años después del diagnóstico es menor del 20%. La mayoría de las formas de enfermedades pulmonares intersticiales y otras formas de fibrosis pulmonar se caracterizan por lesiones fibróticas, se produce distorsión progresiva de la arquitectura alveolar y la sustitución con tejidos fibróticos o cicatriciales con exceso de depósito de matriz extracelular (MEC) (American Thoracic Society, Am J Respir Crit Care Med 161:646-664, 2000; Noble PW et al., Clin Chest Med 25:749-758, 2004; Selman M et al., Ann Intern Med 134:136-151,2001). Esto produce disnea progresiva y pérdida de función pulmonar. Una lesión morfológica distintiva es la heterogeneidad espacial y temporal que incorpora áreas de pulmón normal que están directamente adyacentes a áreas de fibrosis completamente establecida, apanalado microscópico, y áreas de fibrosis en evolución que contienen fibroblastos/miofibroblastos en proliferación y que producen colágeno, los denominados “focos fibróticos”.
La FPI es la enfermedad pulmonar intersticial crónica, progresiva y letal más común de etiología desconocida con una incidencia estimada de 40-50 casos por 100.000 individuos en los Estados Unidos. La viabilidad, activación de fibroblastos pulmonares fibróticos (“FL”) (o miofibroblastos), producción y depósito de MEC tipifica los pulmones FPI (Selman M et al., Expert Opin Emerg Drugs 16:341-62, 20l1; Shetty, S et al. Am J Respir Cell Mol Biol i 5:78-87, 1996; Zhu S et al., Am J Physiol: Lung Cell Mot Physiol 297.L97-108, 2009; Suganuma H et al., Thorax 50:984-9,1995; American Thoracic Society, supra; Noble PW et al., supra).
Trabajó previo por los presentes inventores (y otros) mostró que fibroblastos pulmonares incluyendo fibroblastos FL de los pulmones de pacientes de FPI expresan activador de plasminógeno de tipo uroquinasa (uPA), receptor de uPA (uPAR) e inhibidor 1 del activador de plasminógeno (PAI-1) (Shetty et al., 1996, supra; Shetty S e Idell S. Am J Physiol 274:L871-L882, 1998; Chang W et al., J Biol Chem 285:8i 96-206, 2010). uPA es mitógeno tanto para fibroblastos pulmonares nórmales (NL) como FL, y el proceso implica la unión de uPA a uPAR a través del dominio de factor de crecimiento de uPA (Tkachuk V et al. Clin Exp Pharmacol Physiol 23:759-65, 1996; Padró T et al., J Cell Sci 115.í 961-71, 2002; Shetty S et al., Am J Physiol 268:L972-L982, 1995; Shetty S et al., Antisense Res Dev 5:307-314, 1995). Además, uPA aumenta la expresión de uPAR (Shetty S et al., J Biol Chem 276:24549-56, 2001; Shetty S et al., Am J Respir Cell Mol Biol 30:69-75, 2004). Hace varios años, los presentes inventores describieron que fibroblastos FL de pulmones FPI expresan significativamente más uPA y uPAR, y muestran una mayor tasa de proliferación basal y mediada por uPA que los fibroblastos NL (Shetty et al., 1996, supra; 1998, supra). Otros grupos confirmaron que la expresión de uPAR aumentada por fibroblastos FL de pacientes con FPI contribuye al comportamiento migratorio (Mace KA et al., J Cell Sci 118:2567-77, 2005; Basire A et al., Thromb Haemost 95:678-88, 2006; Zhu, S. et al., 2009, supra
Estudios por el presente inventor y colaboradores encontraron que uPA regula la apoptosis/supervivencia de células epiteliales mediante la regulación de p53 (Shetty S et al., 2005, supra) que controla la expresión recíproca de uPA (Shetty P et al., Am J Resp Cell Mol Biol, 39:364-72 ,2008), su receptor uPAR (Shetty S et al. Mol Cell Biol 27:5607-5618,2o07) y su inhibidor principal PAI-1 (Shetty S et al. J Biol. Chem 283:19570-80, 2008) a nivel postranscripcional e implica una novedosa interacción de señalización de superficie celular entre uPA, uPAR, caveolina-1 ("Cav-1") y p lintegrina (Shetty S et al., 2005, supra). Basado en la apreciación de lo anterior, los presentes inventores concibieron nuevas composiciones y métodos para tratar ALI y sus consecuentes reacciones de remodelación.
Durante la fibrosis del pulmón (término que se usa de forma intercambiable con fibrosis “pulmonar”), la expresión del factor de transcripción p53, conocido fundamentalmente como una proteína supresora de tumores, se suprime severamente en fibroblastos fibróticos que a su vez induce la expresión de uPA y uPAR mientras que la expresión de PAI-1 está significativamente inhibida. La supresión de la expresión de PAI-1 y concurrente inducción de la expresión de uPA y uPAR como consecuencia de la inhibición de la expresión de p53 en fibroblastos fibróticos produce la proliferación de fibroblastos y depósito de MEC, es decir, fibrosis. La interacción aumentada de mdm2 con p53 y posterior ubiquitinación de p53 mediada por mdm2 contribuye a la inhibición de p53 en fibroblastos fibróticos.
Se ha demostrado una relación recíproca entre las actividades de p53 y NF-kB en células cancerosas, pero hay poca información respecto a interacciones entre p53 y NF-kB en procesos inflamatorios. Liu G et al. (J Immunol. 182:5063-71(2009)) encontraron que neutrófilos y macrófagos que carecen de p53 (p53('/') tienen mayores respuestas a la estimulación con lipopolisacárido (LPS) bacteriano que células p53(+/+), y producen mayores cantidades de citoquinas proinflamatorias, incluyendo TNF-ci, IL-6 y MIP-2, y demostraron actividad de unión a Ad N de NF-kB aumentada. Los ratones p53('/_) son más susceptibles que ratones p53(+/+) a lesión pulmonar aguda (ALI) inducida por LPS. La respuesta aumentada de células p53(+/+) a LPS no implica alteraciones en los sucesos de señalización intracelular asociados con la implicación del receptor de tipo toll TLR4 (por ejemplo, activación de MAP quinasas, fosforilación de IkB-ci o la subunidad p65 de NF-kB, o degradación de IkB-ci. El cultivo de neutrófilos y macrófagos estimulados con LPS con nutlina-3a, atenuó la actividad de unión a ADN de NF-kB y la producción de citoquinas proinflamatorias. El tratamiento de ratones con nutlina-3a redujo la gravedad de ALI inducida por LPS. Los autores concluyeron que p53 regula la actividad de NF-kB en células inflamatorias y sugirieron que la modulación de p53 pueden tener potenciales beneficios terapéuticos en afecciones inflamatorias agudas tal como ALI.
Nutlina (o nutlina-3a) (también abreviada NTL)
La estructura química de la molécula 4-2-4,5-dihidro-1H-imidazol-1-piperacin-2-ona (C30H30CI2N4O4) también llamada nutlina o nutlina-3a es como se muestra a continuación
Figure imgf000003_0001
Formula 1
NTL es un antagonista de MDM2, que es un activador de p53 y un inductor de apoptosis. MDM2 funciona por unión a la proteína supresora de tumores p53 y regulando negativamente su actividad transcripcional y estabilidad. La inhibición de la interacción MDM-p53 produce la estabilización de p53, parada del ciclo celular y apoptosis. NutIina-3 ha mostrado potencial como un tratamiento de cáncer activando la ruta de p53 en células cancerosas (Tovar, C. et al., Prnc Nati Acad Sci USA 103:1888-1893 (2006); Vassilev, L.T. et al. Science 303844-848 (2004); El-Deiry, W.S. Cáncer J 11:229-236 (1998)).
El documento U.S. 7.893.278 (Haley et al.) divulgo nutIina-3 quiral tanto genérica como específicamente. El documento U.S. 6.734.302 para la nutIina-3 racémica. La patente '278 ensaña un compuesto de la formula
Figure imgf000003_0002
Formula 2
que se describe adicionalmente más adelante.
Ambas patentes anteriores discuten usos como inhibidores de la interacción Mdm2-p53 y en tratamiento de cáncer.
La publicación de patente en EE UU 2011/0301142 (Hutchinson et al.) enseña un método de tratar fibrosis pulmonar idiopática en un mamífero que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista del receptor de LPA1 al mamífero. El antagonista puede ser ciertos derivados de imidazol, pero no compuestos de tipo imidazolina tal como NTL.
El documento U.S. 6.596.744 (Wagle et al.) divulga un método de tratar o mejorar ciertas enfermedades fibroticas con compuestos heterocíclicos, todos los cuales son claramente distintos de NTL. Las enfermedades divulgadas incluyen enfermedades pulmonares fibróticas que tienen como una manifestación hipertrofia fibrótica o fibrosis de tejido pulmonar. Estas enfermedades incluyen fibrosis pulmonar (o enfermedad pulmonar intersticial o fibrosis pulmonar intersticial), fibrosis pulmonar idiopática, el elemento fibrótico de neumoconiosis, sarcoidosis pulmonar, alveolitis fibrosante, el elemento fibrótico o hipertrófico de fibrosis quística, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, síndrome de dificultad respiratoria adulta y enfisema.
Dey et al. en Cell Cycle 6:17, 2178-2185 (2007) describe que se identificaron nutlinas como los primeros antagonistas de Mdm2 de molécula pequeña potentes y específicos que inhiben la interacción p53-MDM2.
Ninguno de los documentos anteriores divulga tratar FPI con nutlina-3a.
Péptidos derivados de caveolina-1
Los presentes inventores descubrieron que un péptido de 20 residuos DGIWKASFTTFTVTKYWFYR, SEQ ID NO:2) que es el dominio de andamiaje de caveolina-1 (Cav-1; SEQ ID NO:3, mostrado posteriormente) protegía células epiteliales pulmonares (LEC) de apoptosis inducida por bleomicina (“BLM”) in vitro e in vivo y prevenía posterior fibrosis pulmonar atenuando el daño pulmonar epitelial (Shetty et al., permitió la solicitud de patente en EE UU 12/398.757 publicada como documento U.S. 2009-0227515A1 (10 Sept., 20o9).
Los presentes inventores también encontraron un péptido de 17 residuos NYHYLESSMTALYTLGH (SEQ ID NO:4), denominado PP-2, también protegía LEC de apoptosis inducida por BLM in vitro e in vivo y prevenía posterior fibrosis pulmonar atenuando el daño pulmonar epitelial (Shetty et al., supra).
Shetty et al., 2009 (supra) también describe variantes biológicamente activas de sustitución, adición y deleción de estos péptidos, así como multímeros de péptidos y polipéptidos administrables que comprenden los péptidos anteriores, y composiciones farmacéuticas que comprenden los péptidos, variantes y multímeros anteriores. Esas composiciones inhiben apoptosis de células epiteliales de pulmón lesionadas o dañadas y tratar lesión pulmonar aguda y fibrosis pulmonar/FPI consecuente.
El documento anterior no identificó un fragmento particular de CSP (divulgado posteriormente como parte de la presente invención) denominado CSP-4, que tiene la secuencia FTTDTVT (SEQ ID NO: 1) y que tiene la actividad biológica de CSP y constituye parte del objeto de la presente invención.
Se divulgan además péptidos derivados de caveolina-1 en el documento WO 2013/184482 A1; E. Tourkina ET AL: "Antifibrotic properties of caveolin-1 scaffolding domain in vitro and in vivo", American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology, vol. 294, no. 5, 18 Enero 2008 (18-01-2008), páginas 843-861; documento US 2009/075875 A1; ARBUZOVA, A. ET AL.: "Membrane Binding of Peptides Containing Both Basic and Aromatic Residues. Experimental Studies with Peptides Corresponding to the Scaffolding Región of Caveolin and the Effector Región of MARCKS", BIOCHEMISTRY, vol. 39, no. 33, 2000, páginas 10330-; WANASKI, S. P. ET AL: "Caveolin Scaffolding Región and the Membrane Binding Región of Src Form Lateral Membrane Domains", BIOCHEMISTRY, vol. 42, no. 1,2003, páginas 42-56; HORTON, M. R. ET AL: "Phase behaviour and the partitioning of caveolin-1 scaffolding domain peptides in model lipid bilayers", JOURNAL OF COLLOID AND INTERFACE SCIENCE, vol. 304, no. 1,2006, páginas 67-76; GUO, C. -J. ET Al .: "Involvement of caveolin-1 in the Jak-Stat signaling pathway and infectious spleen and kidney necrosis virus infection in mandarin fish (Siniperca chuatsi", Mo LECULAR IMMUNOLOGY, vol. 48, no. 8, 2011, páginas 992-1000; DE LA TORRE, B. G. ET AL.: "On choosing the right ether for peptide precipitation after acid cleavage", JOURNAL OF PEPTIDE SCIENCE, vol. 14, no. 3, 2008, páginas 360-363; EPAND, R. M. ET AL.: "Caveolin Scaffolding Región and Cholesterol-rich Domains in Membranes", JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, vol. 345, no. 2, 2004, páginas 339-350; SHETTY, S. K. ET AL.: "Regulation of Airway and Alveolar Epithelial Cell Apoptosis by p53-lnduced Plasminogen Activator lnhibitor-1 during Cigarette Smoke Exposure Injury", AMERICAN JOURNAL OF RESPIRATORY CELL AND MOLECULAR BIOLOGY, vol. 47, no. 4, 2012, páginas 474-83; documento WO 01/11038 A2; o documento WO 2009/111625 A2.
En vista del mal pronóstico y la falta de enfoques terapéuticos para FPl, hay una necesidad urgente para nuevas intervenciones para revertir o al menos ralentizar la evolución de la enfermedad. Esta brecha terapéutica crítica se aborda mediante la presente invención.
La presente divulgación constituye una extensión de los anteriores hallazgos del inventor (S. Shetty et al., 2007, 2008 & 2009, supra). Como se describe en las secciones posteriores, p53 regula la expresión de uPA, uPAR y PAl-1. El proceso implica control mediado por MDM2 de la expresión de proteína p53 a nivel postraduccional sin afectar al ARNm de p53. Estas observaciones demuestran un enlace causal entre la expresión de p53 y el sistema fibrinolítico de uPA en reparación fibrótica.
Compendio
La inhibición de la interacción de la proteína p53 con MDM2 usando NTL aumenta p53 y PAl-1 al tiempo que inhibe uPA y uPAR. Estos cambios producen apoptosis de fibroblastos fibróticos e inhibición de la proliferación de fibroblastos fibróticos aislados de Ios pulmones de pacientes con FPI, así como de Ios pulmones de ratones con fibrosis pulmonar acelerada inducida por BLM.
Según la presente invención, NTL inhibe fibrosis pulmonar progresiva y establecida al inducir o aumentar la expresión de p53 en fibroblastos fibróticos. Por tanto, este compuesto es útil para tratar fibrosis pulmonar en un sujeto en necesidad de ello.
Los presentes inventores concibieron que el control mediado por p53 deteriorado del sistema fibrinolítico de uPA en fibroblastos FL es una base para terapia dirigida de FPI. En fibroblastos FL, la expresión basal de p53 y microARN-34a (miR-34a) están marcadamente suprimidos mientras que Ios niveles de proteínas de la MEC tal como colágeno-l (CoI-I) y a actina de músculo liso (ci-SMA) están aumentados. El tratamiento de fibroblastos FL con el compuesto inhibidor de mdm2 nutlina-3a o CSP-4 aumenta la expresión de p53 y PAI-1 con inhibición recíproca de uPA y uPAR. El tratamiento de fibroblastos FL con nutlina-3a o Cs P-4 también inhibe la producción de MEC. Estos hallazgos preliminares y publicaciones recientes de Ios presentes inventores y colaboradores justifican un enfoque intervencionista para restablecer la interrelación entre p53 y el sistema fibrinolítico de uPA que de otra manera está distorsionada en fibroblastos FL lo que produce fibrosis pulmonar. p53 tiene efectos pleiotrópicos que van más allá del control del sistema fibrinolítico de uPA2 Sin embargo, PAI-1 es el efector posterior de p53 en fibroblastos y otras células.
De forma importante, el restablecimiento de p53 en fibroblastos FL modula la expresión de uPA, uPAR y PAI-1, viabilidad celular y producción de MEC. El enfoque dirigido a p53-sistema fibrinolítico de uPA en fibroblastos FL se ilustra en la figura 1. p53 induce la transcripción de miR-34a mientras que miR-34a aumenta la acetilación de p53 mediante la inhibición de la histona desacetilasa sirtuina 1 (SIRT1). Esto lleva a la estabilización de la proteína p53 debido a la inhibición de su degradación mediada por mdm2. Sin embargo, en fibroblastos FL, Ios niveles basales de la proteína p53 y miR-34a están marcadamente suprimidos debido a la ubiquitinación aumentada de la proteína p53 por mdm2 y como consecuencia de baja expresión basal de caveolina-1. Esto lleva a inhibición de uPA y uPAR mediada por p53 reducida, o inducción concurrente de PAI-1. Estos cambios contribuyen a la excesiva proliferación de fibroblastos FL y producción de MEC y son revertidos por CSP-4 y nutilina-3a. CSP-4 y nutilina-3a aumentan Ios niveles de p53 inhibiendo la degradación mediada por mdm2 de la proteína p53. El restablecimiento de la expresión de p53 y cambios mediados por p53 en el sistema fibrinolítico de uPA en fibroblastos FL produce atenuación de la viabilidad, y restringe la producción y depósito de MEC. La fibrosis se inhibe en ratones expuestos a BLM con fibrosis pulmonar establecida a través del restablecimiento de Ios niveles de p53 en fibroblastos FL que a su vez suprime las señales de proliferación uPA y uPAR mientras que induce la señal proapoptótica para estas células; PAI-1.
Los inventores muestran, por primera vez, que Ios cambios mediados por p53 del sistema fibrinolítico de uPA regulan la respuesta profibrótica de fibroblastos pulmonares que son centrales para la patogénesis de la fibrosis pulmonar y que está ruta puede ser objetivo para beneficio terapéutico. A diferencia de Ios fibroblastos NL de pulmones histológicamente “normales”, Ios fibroblastos FL, incluyendo fibroblastos/miofibroblastos de tejidos pulmonares fibróticos, expresan niveles muy bajos de p53, miR-34a y caveolina-1 basales mientras que las expresiones de uPA y uPAR son altas. El tratamiento de fibroblastos FL con CSP-4 o el compuesto de bajo peso molecular nutilina-3a restablece la expresión de p53 y miR-34a, e induce PAI-1. Estos cambios suprimen la expresión de uPA y uPAR e inhiben el depósito de MEC. Estos agentes también revierten la fibrosis pulmonar inducida por BLM y protegen el epitelio pulmonar, lo que demuestra asimismo interrelación entre p53 y la regulación del sistema fibrinolítico. Por tanto, la mitigación mediada por CSP-4 o mediada por nutilina-3a de la fibrosis pulmonar representa enfoques terapéuticos novedosos.
Actualmente no hay tratamiento eficaz para revertir la fibrosis pulmonar. La presente divulgación aborda esta brecha importante y proporciona compuestos y métodos novedosos para dirigirse a fibroblastos FL e interrelación entre p53 y el sistema fibrinolítico de uPA para tratar eficazmente la enfermedad pulmonar fibrótica.
La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas.
Específicamente, la presente divulgación se dirige a un método para aumentar Ios niveles de proteína p53, reducir uPA y uPAR y aumentar la expresión de PAI-1 en fibroblastos de pulmón fibrótico (FL), que comprende proporcionar a fibroblastos FL una cantidad eficaz de un compuesto que inhibe la interacción de MDM2 con la proteína p53 y la degradación mediada por MDM2 de p53, en donde el compuesto es:
(a) NTL o un análogo cis-imidazolina quiral de NTL que inhibe la interacción MDM2-p53;
(b) un péptido seleccionado del grupo que consiste en:
(i) CSP-4, cuya secuencia es FTTFTVT (SEQ ID NO: 1);
(ii) una variante de adición del péptido CSP-4 variante de adición que no supera 20 aminoácidos de longitud; (iii) un derivado químico covalentemente modificado del péptido CSP-4, o
(c) un multímero peptídico que comprende al menos dos monómeros cada monómero es el péptido CSP-4, la variante o el derivado químico de (b),
en donde el análogo de NTL, la variante del péptldo, el derivado químico del péptido o el multímero peptídlco tiene al menos el 20% de la actividad biológica o bioquímica de NTL o el péptido CSP-4 en un ensayo in vitro o in vivo.
El análogo de NTL, la variante del péptido, el derivado químico del péptido o el multímero peptídico descrito anteriormente o posteriormente tiene la siguiente actividad relativa a la actividad de NTL o CSP-4, respectivamente: al menos aproximadamente el 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, aproximadamente el 95%, 97%, 99%, y cualquier intervalo derivable en los mismos, tal como, por ejemplo, desde aproximadamente el 70% hasta aproximadamente el 80%, y más preferiblemente desde aproximadamente el 81% hasta aproximadamente el 90%; o incluso más preferiblemente, desde aproximadamente el 91% hasta aproximadamente el 99%. Esta actividad relativa se puede basar en cualquier método divulgado en el presente documento o conocido en la técnica para evaluar tal actividad.
En una forma de realización preferida del método anterior, el compuesto es NTL. En otra forma de realización, el compuesto es el péptido CSP-4 de SEQ ID NO:1. En otra forma de realización del método, el compuesto es el multímero peptídico, preferiblemente uno que comprende monómeros del péptido CSP-4 (SEQ ID NO: 1).
Preferiblemente, en el método anterior que usa un multímero peptídico
(a) el multímero peptídico tiene la fórmula P1n en donde
(i) P1 es el péptido, variante o derivado químico; y
(ii) n = 2-5, o
(b) el multímero peptídico tiene la fórmula (P1-Xm)n-P2, en donde
(i) cada uno de P1 y P2 es, independientemente, el péptido, variante o derivado químico;
(ii) cada uno de P1 y P2 es el mismo o diferente péptido, variante o derivado químico;
(iii) X es alquilo de C1-C5, alquenilo de C1-C5, alquinilo de C1-C5, poliéter de C1-C5 que contiene hasta 4 átomos de oxígeno;
(Iv) m = 0 o 1 ; y
(v) n = 1-7, o
(c) el multímero peptídico tiene la fórmula (P1-Glyz)n-P2, en donde:
(i) cada uno de P1 y P2 es, independientemente, el péptido, variante o derivado,
(ii) cada uno de P1 y P2 es el mismo o diferente péptido, variante o derivado;
(iii) z = 0-6; y
(Iv) n = 1-25,
Preferiblemente el multímero tiene al menos el 20% de la actividad biológica del péptido CSP-4 en un ensayo in vitro o in vivo.
También se divulga un método para tratar un sujeto mamífero, preferiblemente un ser humano, que tiene una enfermedad o afección caracterizada por fibrosis pulmonar (es decir, FPI), que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un compuesto que, al inhibir la degradación mediada por MDM2 de la proteína p53, aumenta los niveles de proteína de p53, reduce los niveles de uPA y uPAR y aumenta la expresión de PAI-1 en fibroblastos FL. En una forma de realización preferida de este método, el compuesto es
(a) Nutilina-3a (NTL) o un análogo cis-imidazolina quiral de la misma que inhibe la interacción MDM2-p53;
(b) un péptido seleccionado del grupo que consiste en:
(i) CSP-4, cuya secuencia es Ft TFTVT (SEQ ID NO: 1), la forma de realización de péptido más preferida; (ii) una variante de adición del péptido CSP-4 variante de adición que no supera 20 aminoácidos de longitud; (iii) un derivado químico covalentemente modificado del péptido CSP-4, o
(c) un multímero peptídico que comprende al menos dos monómeros cada monómero es el péptido CSP-4, la variante o el derivado químico de (b), lo más preferiblemente un multímero de CSP-4,
en donde el análogo, la variante del péptido, el derivado del péptido o el multímero del péptido tiene al menos el 20% de la actividad biológica o bioquímica de NTL o el péptido c SP-4 en un ensayo in vitro o in vivo.
En este método, el compuesto está preferiblemente en una composición farmacéutica que comprende además un soporte o excipiente farmacéuticamente aceptable. El compuesto es preferiblemente una sal farmacéuticamente aceptable de Nt L, análogo de NTL o compuesto peptídico. En una forma de realización preferida del método, el compuesto es NTL. En otra forma de realización preferida del método, el compuesto es el multímero peptídico, lo más preferiblemente un multímero que comprende monómeros del péptido CSP-4 FTTFTVT (SEQ ID NO: 1).
La presente divulgación también se dirige a composiciones de materia. En una forma de realización la composición es un péptido que aumenta los niveles de proteína p53, reduce uPA y aumenta la expresión de PAI-1 en fibroblastos FL, preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en:
(a) un péptido designado CSP-4 cuya secuencia es FTTFTVT (SEQ ID NO: 1),
(b) una variante de adición del péptido CSP-4 de hasta aproximadamente 20 aminoácidos de longitud y que no el dominio de andamiaje (CSP) de caveolina-1 (Cav-1) que tiene la secuencia SEQ ID NO: 3;
(c) un derivado químico covalentemente modificado del péptido CSP-4 de (a),
(d) un derivado químico covalentemente modificado de la variante de (b),
cuya variante o derivado químico tiene al menos el 20% de la actividad biológica o bioquímica del péptido CSP-4 en un ensayo in vitro o in vivo. La variante o derivado químico puede tener
Una composición preferida es el heptapéptido designado CSP-4, FTTFTVT (SEQ ID NO: 1).
Otra composición es un multímero peptídico que comprende al menos dos monómeros, cada monómero es el péptido CSP-4, la variante o el derivado químico,cuyo multímero :
(a) tiene la fórmula P1n en donde
(i) P1 es el péptido, variante o derivado químico como anteriormente, y
(ii) n = 2-5, o
(b) tiene la fórmula (P1-Xm)n-P2, en donde
(i) cada uno de P1 y P2 es, independientemente, el péptido, variante o derivado químico como anteriormente, (ii) cada uno de P1 y P2 es el mismo o diferente péptido, variante o derivado
(iii) X es alquilo de C1-C5, alquenilo de C1-C5, alquinilo de C1-C5, poliéter de C1-C5 que contiene hasta 4 átomos de oxígeno;
(ív) m = 0 o 1 ; y
(v) n = 1-7,
(c) tiene la fórmula (P1-Glyz)n-P2, en donde:
(i) cada uno de P1 y P2 es, independientemente, el péptido, variante o derivado,
(ii) cada uno de P1 y P2 es el mismo o diferente péptido, variante o derivado;
(iii) z = 0-6; y
(ív) n = 1-25,
en donde el multímero peptídico tiene al menos el 20% de la actividad biológica del péptido CSP-4 en un ensayo in vitro o in vivo.
la siguiente actividad relativa a CSP-4: al menos aproximadamente el 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, aproximadamente el 95%, 97%, 99%, y cualquier intervalo derivable en los mismos, tal como, por ejemplo, desde aproximadamente el 70% hasta aproximadamente el 80%, y más preferiblemente desde aproximadamente el 81% hasta aproximadamente el 90%; o incluso más preferiblemente, desde aproximadamente el 91% hasta aproximadamente el 99%.
También se proporciona una composición farmacéutica antifibrótica que comprende:
(a) la variante del péptido o el derivado químico anterior; y
(b) un soporte o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Lo más preferido es la composición farmacéutica anterior formulada para inyección o instilación pulmonar.
La presente divulgación también se dirige al uso de NTL, el análogo de NTL anterior, el péptido anterior, variante, derivado químico o multímero para uso en aumentar los niveles de proteína p53, reducir uPA y aumentar la expresión de PAI-1 en fibroblastos FL, o en tratar una enfermedad o afección caracterizada como fibrosis pulmonar.
También se divulga el uso de NTL, el análogo de NTL anterior, el péptido anterior, variante, derivado químico o multímero peptídico como se ha definido anteriormente para la fabricación de un medicamento para uso en tratar un sujeto que tiene una enfermedad o afección caracterizada como fibrosis pulmonar.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es una ilustración esquemática que muestra que la baja expresión basal de p53 y el control perturbado mediado por p53 del sistema fibrinolítico de uPA en fibroblastos de pulmón fibrótico (FL) produce fibrogénesis. Se esbozan los mecanismos de acción y rutas implicadas en FPI y en su tratamiento por los métodos y composiciones de la presente invención.
Figuras 2A-2I. Focos fibróticos en pulmones FPI demuestran expresión dism inuida de p53 en fibroblastos FL. Las secciones pulmonares de pacientes de FPI y sujetos “normales” control se tiñeron para H&E (Fig. 2A), vimentina (Fig. 2B), tricromo (Fig. 2C), p53 (Fig. 2D), PAI-1 (Fig. 2E), Kí-67 (Fig. 2F), inmunofluorescencia para PAI y SP-C (Fig. 2G) o p53 y SP-C (Fig. 2H) o p53 y PAI-1 (Fig. 21). Se muestra un ejemplo representativo (n = 5 muestras de pulmón f p i).
Figuras 3A-3B. Caveolina-1, p53 y PAI-1 están dism inuidas y uPA está aumentada en fibroblastos FL (FPI) humanos de pulmones FPI está asociada con coI-I aumentada e inhibición de miR-34a. (Fig. 3A) Lisados celulares de fibroblastos de pulmón normal (NL) y FL se inmunotransfirieron para cambios en las proteínas. La figura ilustra los resultados típicos de fibroblastos NL (n = 10 líneas celulares) y fibroblastos FL (n = 18 líneas celulares). (Fig. 3B) Se ensayó ARN total de fibroblastos NL (n = 3) y FL (n = 4) para expresión de miR-34a por PCR en tiempo real. Se muestran transferencia tipo Northern de ARN de muestras representativas usando una sonda antisentido marcada con 32P para miR-34a y el control de carga ARNnp (U6) en la parte inferior de la barra.
Figuras 4A-4B. Expresión dispar de Ios ARNm de uPA, uPAR y PAI-1 por fibroblastos de pulmones FPI y “ normales” . Se ensayó ARN total aislado de tejidos pulmonares de sujetos “normales” y pacientes con FPI (Fig. 4A) o de fibroblastos NL (n = 6) y FL (n = 8) (Fig. 4B) para ARNm de uPA, pA|-1 y coI-I por Pc R en tiempo real cuantitativa ((RT-PCR) y normalizada a Ios niveles correspondientes de ARNm de p-actina.
Figuras 5A-5D. Expresión diferencial de uPA y PAI-1 por fibroblastos FL frente a NL de ratones. Los fibroblastos FL aislados de Ios pulmones de ratones 21 días después de lesión con BLM o fibroblastos NL de ratones control expuestos a solución salina intranasal se describen en otro sitio (Basnhary et al., 2012, supra). Los lisados de fibroblastos NL y FL se inmunotransfirieron para cambios en la expresión de proteínas p53, uPA, PAI-1 y coI-I (Fig. 5A). Se ensayó ARN total extraído de tejidos pulmonares de ratón (Fig. 5B) o de fibroblastos NL y FL (n = 6) (Fig. 5C) de Ios tejidos pulmonares de ratones con fibrosis inducida por BLM o ratones control (solución salina) para ARNm de uPA, PAI-1 y colágeno-l (CoI-I) por PCR en tiempo real cuantitativa. Los fibroblastos NL y FL de ratones se cultivaron en placas de 12 pocilios en medio DMEM. Después de tres días Ios fibroblastos se contaron para determinar la velocidad de proliferación (Fig. 5D).
Figuras 6A-6D. CSP (CSP4) aumenta la expresión de p53 mediante la inducción de miR-34a en fibroblastos FL (FPI). (Fig. 6A) Se trataron fibroblastos NL y FL (n = 3) con PBS, CSP-4 (CSP) o péptido control (CP). Se analizó el ARN para miR-34a por PCR en tiempo real. (Fig. 6B) Se trataron fibroblastos FL con PBS o CSP o CP con o sin miR-34a antisentido (miR-34a-AS) o pre-miR-34a o miARN control (miR-Ctr). Se inmunotransfierieron medios acondicionados (CM) para PAl-1 y lisados (CL) para p53 y p-actina. (Fig. 6C) Se trataron fibroblastos FL con PBS o CSP o CP en presencia o ausencia de miR-34a-AS o pre-miR-34a o miR-Ctr. Se analizó ARN para cambios de miR-34a por PCR en tiempo real. (Fig. 6D) Se hicieron una serie de deleciones solapantes en CSP y estos péptidos se usaron para tratar fibroblastos FL con. Se evaluaron después cambios en p53, uPA, PAl-1 y coI-I para identificar Ios aminoácidos mínimos requeridos para Ios efectos de CSp.
Figuras 7A-7B. Degradación de proteínas p53 mediada por mdm2 aumentada en fibroblastos FL (FPI). (Fig. 7A) Lisados de fibroblastos NL y FL (n = 3) se inmunotransfierieron para p53, mdm2 y p-actina. (Fig. 7B) Lisados de fibroblastos NL y FL se inmunoprecipitaron (IP) con anticuerpo anti-mdm2 e inmunotransfirieron (IB) para la proteína p53 asociada.
Figuras 8A-8C. Papel de la interrelación p53-sistema fib rino lítico en inhibición mediada por nutlina-3a (NTL) o CSP-4 de la expresión de coI-I en fibroblastos FL (FPI). (Fig. 8A) Se expusieron fibroblastos FL a PBS, nutlina-3a (10 mM), CSP-4 (10 nM) o péptido control (CP) durante 48 horas. Los lisados celulares se inmunotranfirieron para la expresión de CoI-I, PAl-1, p53, uPA y p-actina. (Fig. 8B) Fibroblastos FL cultivados en placas de 12 pocilios en medio DMEM se expusieron a vehículo (PBS) o nutlina-3a, CSP-4 o CP. Después de 3 d, las células se separaron y contaron. (Fig. 8C) Se transdujeron fibroblastos FL con vector de adenovirus vacío solo (Ad-EV) o vector Ad que expresa p53 (Ad-p53), PAl-1 (Ad-PAI-1) o caveolina-1 (Ad-Cav-1). Después de 48 h, Ios lisados celulares se inmunotransfirieron para CoI-I, PAl-1, p53, upA y p-actina.
Figuras 9A-9B. Papel de la interrelación p53-sistema fib rino lítico en la inducción de la expresión de coI-I en fibroblastos NL. Fibroblastos NL aislados de pulmones humanos histológicamente “normales” se trataron con ARNhc de p53 en vector lentivírico para inhibir la expresión basal de p53. Se trataron células control con ARNhc no específico (Ctr). (Fig. 9A): Muestras de medios acondicionados se inmunotransfirieron para PAl-1, uPA, y coI-I soluble mientras que se ensayaron lisados celulares para p53, (a-SMA) y p-actina. (Fig. 8B): se analizó ARN total aislado de fibroblastos Nl tratados con ARNhc control o de p53 para cambios en la expresión del ARNm de uPA, PAl-1, coI-I y p-actina por PCR en tiempo real cuantitativa.
Figuras 10A-10D. Nutlina-3a (NTL) inhibe la fibrosis pulmonar en ratones tratados con BLM. Los ratones se expusieron a BLM durante 14 d para inducir fibrosis pulmonar. Se usaron ratones tratados con solución salina como controles de fibrosis. Después de 14 d, Ios ratones expuestos a BLM fueron inyectados IV con vehículo o nutlina-3a (10 mg/kg de peso corporal) (Zhang F et al. Drug Metab Dispos 39.í 5-21, 2011) para determinar si nutlina-3a inhibía fibrosis pulmonar establecida. El día 21 después de la lesión con BLM, Ios ratones se sometieron TAC para evaluar la extensión de la fibrosis (Fig. 10A). Se muestra un ejemplo representativo (n = 9). (Fig. 10B) Se midieron la distensibilidad y resistencia pulmonar en Ios mismos ratones usando el sistema Flexivent para evaluar la mejora en la función pulmonar después del tratamiento con nutlina-3a (n = 9). (Fig. 10C) Se sometieron secciones pulmonares a tinción tricrómica para evaluar la arquitectura pulmonar y depósito de colágeno como una indicación de fibrosis pulmonar. (Fig. 10D) Se analizaron homogenizados de pulmones enteros para contenido en colágeno total (hidroxiprolina) y desmosina como una evaluación independiente de cambios en la MEC.
Figuras 11A-11D. CSP-4 inhibe fibrosis pulmonar establecida y mejora la función pulmonar. Se expusieron ratones a BLM para inducir fibrosis pulmonar. Después de 14 d, Ios ratones fueron inyectados IV con vehículo o 1,5 mg/kg de peso corporal de CSP-4 o péptido control (“CP”) de secuencia mezclada. El día 21 después de la lesión con BLM, Ios ratones se sometieron t Ac para evaluar la extensión de la fibrosis (Fig. 11A). Se muestra un ejemplo representativo (n = 9). (Fig. 11B): Se midieron Ios volúmenes pulmonares en Ios mismos ratones (n = 9) usando rendiciones de TAC cuantitativas. (Fig. 11C): Se sometieron secciones pulmonares a tinción tricrómica y tinción de H&E (no mostrado) para evaluar el depósito de colágeno como un indicador de fibrosis pulmonar. (Fig. 11D) Análisis de homogenizados de pulmón entero para contenido de hidroxiprolina total.
Figuras 12A-12C. CSP-4 o nutlina-3a (NTL) inhibe la proliferación de fibroblastos FL. Se expusieron ratones a BLM para inducir fibrosis pulmonar significativa o a solución salina (controles de fibrosis). 14 d después, Ios ratones expuestos a BLM se trataron con CSP-4, CP o nutlina-3a (véanse las figuras 10A0D/11A-D). (Fig. 12A): Se sometieron secciones pulmonares (d21 después de la lesión con BLM) a inmunohistoquímica (IHC) para Ki-67 para evaluar la proliferación. Se muestra un ejemplo representativo (n = 9). Se aislaron fibroblastos de Ios pulmones de ratones expuestos a solución salina, BLM o BML+nutlina-3a (como se describe en la figura 11A) se ensayaron Ios cambios en la expresión de proteínas coI-I, p53 y posteriores uPA y PAI-1 por inmunotransferencia (Fig. 12B); y ARNm por RT-PCR cuantitativa (Fig. 12C).
Figura 13. Inhibición de fibrosis pulmonar inducida por BLM por tratamiento ex vivo de tejidos pulmonares de ratones WT con CSP-4 o nutlina-3a (NTL). Se expusieron ratones a BLM intranasal durante 21 d para inducir fibrosis pulmonar. Estos ratones (n = 3) se sacrificaron, Ios pulmones se extirparon, cortaron en trozos pequeños y se colocaron en placas de cultivo con medio DMEM que contenía suero bovino fetal al 10%. Las muestras de tejido se trataron posteriormente con CSP-4 (10 nM), péptido control (CP) y nutlina-3a (NTL) (10 |jM) durante 72 h. Se prepararon medios acondicionados y lisados de tejido y se analizaron para cambios en coI-I, a-SMA y p-actina por inmunotransferencia.
Descripción de formas de realización preferidas
Los presentes inventores descubrieron que la expresión basal de la proteína “supresora de tumores”, p53 y el inhibidor-1 del activador de plasminógeno (PAI-1) están marcadamente reducidas en fibroblastos FL obtenidos de Ios pulmones de pacientes de f P i. Esto también es cierto para ratones con fibrosis pulmonar acelerada inducida por BLM, un modelo aceptado de FPI humana. p53 regula la expresión de componentes principales del sistema fibrinolítico de uPA (uPA, uPAR y PAI-1). Sin embargo, no está claro cómo Ios cambios en Ios niveles de estas proteínas contribuyen a la patogénesis de la fibrosis pulmonar, y si el restablecimiento del modo normal de la interrelación p53-sistema fibrinolítico de uPA mitiga la fibrosis pulmonar.
Según la presente invención, la expresión aumentada de uPA y uPAR, y una inhibición concurrente de PAI-1 debido a una falta de expresión de p53 en fibroblastos FL son críticas para el desarrollo de fibrosis pulmonar. La inducción de la expresión de p53, y el restablecimiento de la interrelación p53-sistema fibrinolítico de uPA mediante la reducción de uPA mediada por p53, y un aumento concurrente en la expresión de PAI-1 en fibroblastos FL, mitiga la FPI y es la base para tratar esta enfermedad con NTL.
A diferencia de Ios fibroblastos de pulmón normal (“NL”), Ios fibroblastos obtenidos de pulmones de pacientes con FPI (fibroblastos “FL”) o de ratones con fibrosis pulmonar inducida por BLM expresan p53 mínima. Además, Ios fibroblastos FL producen niveles bajos de PAI-1, mientras que la expresión de uPA y uPAR están marcadamente elevadas.
La presente invención se dirige a Ios tres componentes principales (uPA, uPAR y PAI-1) del sistema fibrinolítico de uPA de una manera global y coordinada. Dirigirse al mismo tiempo a Ios tres componentes principales del sistema fibrinolítico de uPA mediante el restablecimiento de la expresión de p53 en fibroblastos FL mitiga la fibrosis.
Según esto, este tratamiento afecta principalmente a fibroblastos FL y tejido pulmonar aislado de pacientes con FPI ex vivo e in vivo. Estos cambios se observaron en un modelo de ratón con fibrosis pulmonar establecida en el que se definieron Ios intermediarios y mediadores posteriores de Ios efectos beneficiosos de nutlina-3a.
Nutlina-3a
Los compuestos útiles en el método de la presente divulgación incluyen nutlina-3a (también denominada nutlina y NTL) que es 4-2-4,5-dihidro-1H-imidazol-1-piperacin-2-ona (C30H30CI2N4O4)
Figure imgf000010_0001
Este compuesto se describe en el documento U.S. 7.893.278 (Haley et al). También son útiles en la presente divulgación un género más amplio de análogos cis-imidazolina quirales de NTL que comparten la propiedad de inhibir las interacciones MDM2-p53. Por análogos de NTL se pretende el género de moléculas divulgadas en la patente '278, y caracterizados por la fórmula 2 a continuación.
Figure imgf000010_0002
Fórmula 2
en la que
R se selecciona de anillos de 5 y 6 miembros saturados o insaturados que contienen al menos un heteroátomo; el heteroátomo puede ser S, N u O. El anillo puede estar sustituido con un grupo alquilo inferior alquilo que puede estar además sustituido con al menos uno de -C=O-Ri , -SO2CH3, o -CH2C=OCH3,
Ri se selecciona del grupo consistente en H, -NH2, -N-alquilo inferior, alquilo inferior sustituido con un hidroxi, alquilo inferior sustituido con -NH2, y un anillo saturado de 5 o 6 miembros que contiene al menos un heteroátomo (S, N u O);
X i y X2 se seleccionan independientemente del grupo consistente en H, alcoxi inferior, -CH2OCH3, -CH2OCH2CH3, -OCH2CF3 y -OCH2CH2F,
Y i e Y2 se seleccionan cada uno independientemente del grupo consistente en -Cl, -Br, -NO2, -C=N, y -C=CH, y
la estequiometría absoluta en la posición 4 y 5 del anillo de imidazolina es S y R, respectivamente.
Otros compuestos que se consideran análogos de NTL son compuestos de fórmula 2 en donde R es piperacinilo sustituido con al menos un grupo seleccionado de alquilo inferior, cicloalquilo, -C=ORi , -N-alquilo inferior, -SO2CH3, =0, -CH2C=OCH3, o piperidinilo sustituido con al menos un grupo seleccionado de alquilo de C1-C3, alcoxi de C1-C2, -C=0CH3, -S02CH3'-C=0, -OH, -CH2NH2, -C=0CH2NH2, -C=0CH20H, -C=0CH(0H)CH20H, -CH2CH(0H)CH20H, -C=0 N(CH2)2, -C=0 NH2, y -C=0 N(CH3)CH3, -N(CH3)CH3, pirrolidinilo y piperadinilo.
También son preferidos compuestos de fórmula 2 en donde el grupo X I en posición orto se selecciona de alcoxi inferior, -OCH2CF3 y -OCH2CH2F, y el grupo X2 en la posición para es alcoxi inferior. Aún son más preferidos compuestos en donde el grupo X I en la posición orto se selecciona de etoxi, isopropoxi, -OCH2CF3 y -OCH2CH2F, y el grupo X2 en la posición para se selecciona de metoxi y etoxi.
Más preferidos son compuestos de fórmula 2 en donde R se selecciona del piperacinilo y piperacinilo sustituido. Tales compuestos son, por ejemplo: 1-{4-[(4S,5R)-4,5-Bis-(4-cloro-fenil)-2-(2-isopropoxi-4-metoxi-fenil)-4,5-dihidro-imidazol-1carbonil]-piperacin-1-il}-etanona; 4-[(4S,5R)-4,5-Bis-(4-cloro-fenil)-2-(2-isopropoxi-4metoxi-fenil)-4,5-dihidroimidazol-1-carbonil]piperacin-2-ona; [(4S,5R)-4,5-Bis-(4-cloro-fenil)-2-(2-isopropoxi-4-5-metoxi-fenil)-4,5-dihidroimidazol-1-il]-(4-pirrolidin-1-il-piperidin-1-il)-metanona; 4-[(4S,5R)-4,5-Bis-(4-cloro-fenil)-2-(2-etoxi-fenil)-4,5-dihidro im¡dazol-1-carbon¡l]-piperac¡n-2ona; 1-{4-[(45,5R)-4,5-B¡s-(4-cloro-fen¡l)-2-(2-etox¡fen¡l)-4,5-d¡h¡dro-¡m¡dazol-1-carbonil]-piperac¡n-1-¡l}-etanona; 2-{4-[(45,5R)-4,5-B¡s-(4-doro-fen¡l)-2-(2-etox¡fen¡l)-4,5-d¡h¡dro-¡m¡dazoM-carbon¡l]-piperadn-1-¡l}-1-morfolin-4-¡l-etanona; [(4S,5R)-4,5-B¡s-(4-cloro-fen¡l)-2-(2-etox¡-fen¡l)4,5-d¡h¡dro-¡m¡dazol-1-¡lH4-(2-metanesulfonilet¡l)-piperadn-1-¡l]-metanona; y [(4S,5R)-4,5-B¡s-(4-cloro-fen¡l)-2-(2-¡sopropox¡-4-metox¡-fen¡l)-4,5-dih¡dro-¡m¡dazol-1-¡l]-(4-met¡l-p¡peradn-1-il)-metanona.
La síntesis de todas estas moléculas se conoce en la técnica, alguna de las cuales se describe en la patente '278.
Péptidos derivados de la secuencia Cav-1
El dominio o péptido de andamiaje de caveolina-1 (Cav-1) (también denominado CSD o CSP) interfiere con la interacción de Cav-1 con las quinasas Src y mimetiza el efecto combinado de uPA y anticuerpo anti-p1-intergrina como se discute en más detalle posteriormente. La Cav-1 humana nativa tiene una longitud de 178 aminoácidos y un peso molecular de 22 kDa. La secuencia de aminoácidos de Cav-1 se muestra a continuación (SEQ ID NO: 3).
1 M5GGKYVDSEGHLYTVPIREQGNIYKPNNK AMADELSEKQ VYDAHTKEID LVNRDPKHLN 61 DDWKIDFED VIAEPEGTHS FDGIWKASFT TFTVTKYWFY RLLSALFGIP MALIWGIYFA 121 ILSFLHIWAV VPCIKSFLIE IQCISRVYSI YVHTVCDPLF EAVGKIFSNV RINLQKEI
CSP es el péptido de 20 residuos subrayado anteriormente, y tiene la secuencia GIWKASFTTFTVTKYWFYR (SEQ ID NO:2). El péptido preferido de la presente invención, designado CSP-4 es el fragmento FTTFTVT (SEQ ID NO: 1) de CSP y se muestra con doble subrayado en la secuencia de Cav-1. CSP-4 tiene las actividades mostradas en los ejemplos y figuras, posteriormente, y afecta cómo p53 regula la viabilidad de LEC a través del control coordinado de la expresión de uPA, uPAR (hacia arriba) y PAI-1 (hacia abajo) y por este presunto mecanismo protege las LEC o epitelio pulmonar in vivo de apoptosis y bloquea la fibrosis que resulta de ALI.
En estudios divulgados en el presente documento, un péptido control para CSP-4, que se denomina “CP” es un péptido mezclado con la misma composición de aminoácidos que el CSP mayor (SEQ ID NO: 2), pero tiene una secuencia diferente: WGIDKAFFTTSTVTYKWFRY (SEQ ID NO:5).
Se pueden hacer modificaciones y cambios en la estructura de CSP-4, y crear moléculas con características similares o de otra manera deseables. Tales derivados funcionales o derivados biológicamente activos (términos que se usan de forma intercambiable) están abarcados en la presente divulgación.
Los derivados funcionales preferidos son variantes de adición y oligómeros/multímeros peptídicos, y similares.
Estos se pueden generar sintéticamente, pero también por producción recombinante, y ensayar para las propiedades de unión o actividad biológica de CSP-4. Una manera preferida de medir la actividad de la variante es en un ensayo de unión competitiva en donde la capacidad de la variante del péptido para competir con la unión de caveolina soluble, tal como una que está marcada detectablemente, con uPAR soluble (“suPAR”).
Se entiende que distintos derivados de CSP-4 y polipéptidos más largos que comprenden CSP-4 se pueden hacer fácilmente según la invención, ya sea por métodos químicos (sintéticos) o por medios recombinantes (preferido para polipéptidos más largos).
Están incluidos en la definición de variantes funcionales de CSP-4 adición que preferiblemente comprende 1-5 aminoácidos adicionales en cualquier extremo o en ambos extremos. En otras formas de realización (que se pretende que sea distinta de multímeros peptídicos discutidos posteriormente), se pueden añadir más residuos adicionales, hasta aproximadamente 20 residuos. En la variante de adición de CSP-4, los residuos adicionales N-terminal a, y/o C-terminal a SEQ ID NO: 1 (el péptido central CSP-4) puede incluir algunos de esos en el orden en que se producen en la secuencia nativa en Cav-1 (SEQ ID NO: 4. Sin embargo, la variante de adición no puede ser SEQ ID NO: 3. Alternativamente, se pueden añadir otros aminoácidos en cualquier extremo de SEQ ID NO: 1, con el entendimiento de que la variante de adición mantiene la actividad biológica y actividad de unión de CSP-4 (al menos el 20% de la actividad, o preferiblemente más, como se muestra posteriormente).
Las variantes de sustitución preferidas de CSP-4 es sustituciones conservadoras en las que 1, 2 o 3 residuos se han sustituido por un residuo diferente. Para una descripción detallada de química y estructura de proteínas, véase, Schultz G.E. et al., Principies of Prntein Structure, Springer-Verlag, Nueva York, 1979, y Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties, 2a ed., W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1993. Las sustituciones conservadoras y se definen en el presente documento como intercambios en uno de los siguientes grupos:
Phe se puede sustituir por un residuo aromático grande: Tyr, Trp.
Thr se puede sustituir por residuos alifáticos pequeños, no polares o ligeramente polares: por ejemplo, Ala, Ser o Gly.
Val se puede sustituir por residuos alifáticos grandes, no polares: Met, Leu, lie, Cys.
Incluso cuando es difícil predecir el efecto exacto de una sustitución antes de hacerla, un experto en la materia apreciará que el efecto se puede evaluar por ensayos de cribado rutinarios, preferiblemente los ensayos biológicos y bioquímicos descritos en el presente documento. La actividad de un lisado celular o polipéptido o variante peptídica purificada se criba en un ensayo de cribado adecuado para la característica deseada.
Además de los 20 L-aminoácidos “estándar”, D-aminoácidos o aminoácidos no estándar, modificados o inusuales que están bien definidos en la técnica también se contemplan para uso en la presente invención. Estos incluyen, por ejemplo, incluyen p-alanina (p-Ala) y otros ^-aminoácidos tal como ácido 3-aminopropiónico, ácido 2,3-diaminopropiónico (Dpr), ácido 4-aminobutírico y así; ácido a-aminoisobutírico (Aib); ácido £-aminohexanoico (Aha); ácido 6-aminovalérico (Ava); N-metilglicina o sarcosina (MeGly); ornitina (Orn); citrulina (Cit); t-butilalanina (t-BuA); tbutilglicina (t-BuG); N-metilisoleucina (Melle); fenilglicina (Phg); norleucina (Nle); 4-clorofenilalanina (Phe(4-Cl)); 2-fluorofenilalanina (Phe(2-F)); 3-fluorofenilalanina (Phe(3-F)); 4-fluorofenilalanina (Phe(4-F)); penicilamina (Pen); ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxílico (Tic); homoarginina (hArg); N-acetil lisina (AcLys); ácido 2,4-diaminobutírico (Dbu); ácido 2,4-diaminobutírico (Dab); p-aminofenilalanina (Phe(pNH2)); N-metil valina (MeVal); homocisteína (hCys), homofenilalanina (hPhe) y homoserina (hSer); hidroxiprolina (Hyp), homoprolina (hPro), aminoácidos N-metilados y peptoides (glicinas N-sustituidas).
Se pueden diseñar otros compuestos por diseño de fármacos racional para funcionar de una manera similar a CSP-4. El fin del diseño de fármacos racional es producir análogos estructurales de compuestos biológicamente activos. Al crear tales análogos, es posible producir fármacos que sean más activos o más estables que las moléculas naturales (es decir, péptidos), menor susceptibilidad a alteraciones que afectan funciones. Un enfoque es generar una estructura tridimensional de CSP-4, por ejemplo, por RMN o cristalografía de rayos X, modelado por ordenador o mediante una combinación. Un enfoque alternativo es sustituir aleatoriamente grupos funcionales en la secuencia de CSP-4, y determinar el efecto en la función.
Además, un derivado biológicamente activo tiene la actividad de CSP-4 en un ensayo in vitro o in vivo de unión o de actividad biológica, tal como los ensayos descritos en el presente documento. Preferiblemente, el polipéptido inhibe o previene apoptosis de LEC inducida por BLM in vitro o in vivo con actividad al menos aproximadamente el 20% de la actividad de CSP-4, o al menos aproximadamente el 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, aproximadamente el 95%, 97%, 99%, y cualquier intervalo derivable en los mismos, tal como, por ejemplo, desde aproximadamente el 70% hasta aproximadamente el 80%, y más preferiblemente desde aproximadamente el 81% hasta aproximadamente el 90%; o incluso más preferiblemente, desde aproximadamente el 91% hasta aproximadamente el 99%. El derivado puede tener el 100% o incluso mayor actividad que CSP-4.
El péptido puede estar protegido en su extremos N o C con un grupo acilo (abreviado “Ac”) y un amido (abreviado “Am”), respectivamente, por ejemplo, acetilo (CH3CO-) en el extremo N y amido (-NH2) en el extremo C. Se contempla una amplia gama de funciones de protección N-terminal, preferiblemente en una unión al grupo amino terminal, por ejemplo, formilo;
alcanoilo, que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, tal como acetilo, propionilo, butirilo;
alquenoilo, que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, tal como hex-3-enoilo;
alquinoilo, que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, tal como hex-5-inoilo;
aroilo, tal como benzoilo o 1 -naftoilo;
heteroaroilo, tal como 3-pirroilo o 4-quinoloilo;
alquilsulfonilo, tal como metanosulfonilo;
ariisulfonilo, tal como bencenosulfonilo o sulfanililo;
heteroarilsulfonilo, tal como piridina-4-sulfonilo;
alcanoilo sustituido, que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, tal como 4-aminobutirilo;
alquenoilo sustituido, que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, tal como 6-hidroxi-hex-3-enoilo;
alquinoilo sustituido, que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, tal como 3-hidroxi-hex-5-inoilo;
aroilo sustituido, tal como 4-clorobenzoilo o 8-hidroxi-naft-2-oilo;
heteroaroilo sustituido, tal como 2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahidro-3-metil-quinazolin-6-oilo;
alquilsulfonilo sustituido, tal como 2-aminoetanosulfonilo;
ariisulfonilo sustituido, tal como 5-dimetilamino-1-naftalenosulfonilo;
heteroarilsulfonilo sustituido, tal como 1 -metoxi-6-isoquinolinesulfonilo;
carbamoilo o tiocarbamoilo;
carbamoilo sustituido (R'-NH-CO) o tiocarbamoilo sustituido (R'-NH-CS) en donde R' es alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, alquilo sustituido, alquenilo sustituido, alquinilo sustituido, arilo sustituido, o heteroarilo sustituido; carbamoilo sustituido (R'-NH-CO) y tiocarbamoilo sustituido (R'-NH-CS) en donde R' es alcanoilo, alquenoilo, alquinoilo, aroilo, heteroaroilo, alcanoilo sustituido, alquenoilo sustituido, alquinoilo sustituido, aroilo sustituido o heteroaroilo sustituido, todos como se han definido anteriormente.
La función de protección C-terminal puede ser un enlace amida o éster con el carboxilo terminal. Las funciones de protección que proporcionan un enlace amida se designan como NR1R2 en donde R1 y R2 se pueden extraer independientemente del siguiente grupo: hidrogeno;
alquilo, que preferiblemente tiene de 1 a 10 átomos de carbono, tal como metilo, etilo, isopropilo;
alquenilo, que preferiblemente tiene de 1 a 10 átomos de carbono, tal como prop-2-enilo;
alquinilo, que preferiblemente tiene de 1 a 10 átomos de carbono, tal como prop-2-inilo;
alquilo sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, tal como hidroxialquilo, alcoxialquilo, mercaptoalquilo, alquiltioalquilo, halogenoalquilo, cianoalquilo, aminoalquilo, alquilaminoalquilo, dialquilaminoalquilo, alcanoilalquilo, carboxialquilo, carbamoilalquilo;
alquenilo sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, tal como hidroxialquenilo, alcoxialquenilo, mercaptoalquenilo, alquiltioalquenilo, halogenoalquenilo, cianoalquenilo, aminoalquenilo, alquilaminoalquenilo, dialquilaminoalquenilo, alcanoilalquenilo, carboxialquenilo, carbamoilalquenilo;
alquinilo sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, tal como hidroxialquinilo, alcoxialquinilo, mercaptoalquinilo, alquiltioalquinilo, halogenoalquinilo, cianoalquinilo, aminoalquinilo, alquilaminoalquinilo, dialquilaminoalquinilo, alcanoilalquinilo, carboxialquinilo, carbamoilalquinilo;
aroilalquilo que tiene hasta 10 átomos de carbono, tal como fenacilo o 2-benzoiletilo;
arilo, tal como fenilo o 1-naftilo;
heteroarilo, tal como 4-quinolilo;
alcanoilo que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, tal como acetilo o butirilo;
aroilo, tal como benzoilo;
heteroaroilo, tal como 3-quinoloilo;
OR' o NR'R" donde R' y R" son independientemente hidrogeno, alquilo, arilo, heteroarilo, acilo, aroilo, sulfonoilo, sulfinilo, o SO2-R"' o SO-R"' donde R"' es alquilo, arilo, heteroarilo, alquenilo o alquinilo sustituido o sin sustituir.
Las funciones de protección que proporcionan un enlace éster se designan como OR, en donde R puede ser: alcoxi; ariloxi; heteroariloxi; aralquiloxi; heteroaralquiloxi; alcoxi sustituido; ariloxi sustituido; heteroariloxi sustituido; aralquiloxi sustituido; o heteroaralquiloxi sustituido.
Las funciones de protección N-terminal o C-terminal, o ambas, pueden ser de tal estructura que la molécula protegida funciona como un profármaco (un derivado farmacológicamente inactivo de la molécula de fármaco parental) que experimenta transformación espontánea o enzimática en el cuerpo con el fin de liberar el fármaco activo y que tienen propiedades de administración mejoradas sobre la molécula de fármaco parental (Bundgaard H, Ed: Design of Prodrugs, Elsevier, Ámsterdam, 1985).
La elección juiciosa de grupos de protección permite la adición de otras actividades en el péptido. Por ejemplo, la presencia de un grupo sulfhidrilo unido a la protección N- o C-terminal permitirá la conjugación del péptido derivatizado a otras moléculas.
Derivados químicos de CSP-4
Además de los grupos protectores descritos anteriormente que se consideran “derivados químicos” de CSP-4, Ios derivados químicos preferidos de CSP-4 pueden contener fracciones químicas adicionales no normalmente una parte de una proteína o péptido que se pueden introducir en CSP-4 o una variante de adición de CSP-4 por medios conocidos para constituir el derivado químico como se define en el presente documento. Las modificaciones covalentes de Ios péptidos se incluyen en el ámbito de esta invención. Tales fracciones derivatizadas pueden mejorar la solubilidad, absorción, semivida biológica, y similares. Las fracciones capaces de mediar tales efectos se divulgan, por ejemplo, en Gennaro, AR, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins Publishers; 21a Ed, 2005 (o la última edición).
Tales modificaciones se pueden introducir en la molécula haciendo reaccionar residuos de aminoácidos objetivo del péptido con un agente de derivación orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales o residuos terminales seleccionados. Otra modificación es la ciclación del péptido - que en general se logra añadiendo residuos de Cys terminales que se pueden unir a través de un enlace disulfuro para generar un péptido cíclico. Alternativa, se añade una Lys (K) entrecruzable en un extremo y un GIu (E) en el otro extremo.
Los residuos cisteinilo (añadidos, por ejemplo, para fines de ciclación) lo más comúnmente se hacen reaccionar con a-haloacetatos (y aminas correspondientes) para dar derivados carboximetilo o carboxiamidometilo. Los residuos cisteinilo también se derivatizan por reacción con bromotrifluoroacetona, ácido a-bromo-p-(5-imidozoil)propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo, disulfuro de metil-2-piridilo, pcloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitro-fenol, o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.
Los residuos de lisinilo añadidos (por ejemplo, para ciclación) y el residuo amino terminal se pueden derivatizar con anhídridos de ácido succínico u otros ácidos carboxílicos. La derivatización con un anhídrido carboxílico cíclico tiene el efecto de revertir la carga de Ios residuos lisinilo. Otros reactivos adecuados para derivatizar residuos que contienen amino incluyen imidoésteres tal como picolinimidato de metilo; fosfato de piridoxal; piridoxal; cloroborohidruro; ácido trinitrobencenosulfónico; O-metilisourea; 2,4-pentaodiona; y reacción catalizada por transaminasa con glioxilato.
La derivatización con agentes bifuncionales es útil para entrecruzar el péptido u oligómero o multímero a una matriz soporte insoluble en agua u otro soporte macromolecular. Los agentes de entrecruzamiento comúnmente usados incluyen 1,1-bis(diazoacet¡l)-2-fen¡letano, glutaraldehído, ásteres de N-hidroxisuccinimida, ásteres con ácido 4-azidosalicíclico, imidoásteres homobifuncionales, incluyendo ásteres de disuccinimidilo tal como 3,3'-dit¡ob¡s(sucdnim¡d¡l propionato), y maleimidas bifuncionales tal como bis-N-maleimido-1,8-octano. Los agentes de derivatización tal como metil-3-[(p-az¡dofen¡l)d¡t¡o]prop¡o¡midato dan intermedios fotoactivables que son capaces de formar entrecruzamiento en presencia de luz. Alternativamente, las matrices insolubles en agua reactivas tal como hidratos de carbono activados con bromuro de cianógeno y los sustratos reactivos descritos en las patentes en EE UU 3.969.287, 3.691.016, 4.195.128, 4.247.642, 4.229.537, y 4.330.44o se emplean para inmovilización de proteínas.
Otras modificaciones incluyen hidroxilación de lisina, fosforilación de los grupos hidroxilo de residuos de treonilo, metilación de los grupos a-amino de las cadenas laterales de las cadenas de residuos de lisina (añadidos) (Creighton, supra), acetilación de la amina N-terminal y, en algunos casos, amidación de los grupos carboxilo C-terminal. Tambián se incluyen páptidos en donde uno o más D-aminoácidos se sustituyen por uno o más L-aminoácidos.
Páptidos multimáricos u oligomáricos
La presente divulgación tambián incluye páptidos más largos construidos a partir de unidades repetitivas de CSP-4 o un derivado funcional del mismo que tiene la actividad antiapoptótica y protectora de CSP-4. La unidad de páptido de tal multímero es FTTFTVT (SEQ Id NO: 1). Las variantes de adición de este páptido que pueden ser la “unidad” del multímero preferiblemente incluyen desde 1-4 aminoácidos adicionales.
Un multímero peptídico puede comprender diferentes combinaciones de monómeros peptídicos (que puede incluir uno o ambos de SEQ ID NO: 1 o variantes de adición del mismo o una forma químicamente derivatizada del páptido. Tales páptidos oligomáricos o multimáricos se pueden hacer por síntesis química o por tácnicas de ADN recombinante como se discute en el presente documento. Cuando se producen por síntesis química, los oligómeros preferiblemente tienen de 2-5 repeticiones de una secuencia peptídica central, y el número total de aminoácidos en el multímero no debe superar aproximadamente 160 residuos, preferiblemente no más de 100 residuos (o sus equivalentes, cuando incluyen enlazadores o espaciadores).
Un multímero peptídico químico sintático preferido tiene la fórmula
P1n
en donde el páptido central P1 es SEQ ID NO: 1, y en donde n = 2-5, y en donde el páptido central solo o en forma oligo- o multimárica tiene la actividad biológica de Cs P-4 como se divulga en el presente documento en un bioensayo in vitro o in vivo de tal actividad.
En otra forma de realización, un multímero peptídico químico sintático preferido tiene la fórmula
(P1-Xm)n-P2
P1 y P2 son los páptidos centrales descritos anteriormente, incluyendo variantes adicionales, en donde
(a) P1 y P2 pueden ser iguales o diferentes; además, cada aparición de P1 en el multímero puede ser un páptido diferente (o variante)
(b) X es un espaciador que comprende o consiste en
(i) una cadena orgánica corta, preferiblemente alquilo de C1-C5, alquenilo de C1-C5, alquinilo de C1-C5, poliáter de C1-C5 que contiene hasta 4 átomos de oxígeno, en donde m = 0 o 1 y n = 1-7; o
(¡i) Glyz en donde z = 1-6,
y en donde el páptido central solo o en forma oligo- o multimárica tiene la actividad biológica de CSP-4 como se divulga en el presente documento en un bioensayo in vitro o in vivo de tal actividad.
Cuando se produce de forma recombinante, un espaciador preferido es Glyz como se describe anteriormente, donde z = 1-6, y los multímeros pueden tener tantas repeticiones de la secuencia peptídica central como el sistema de expresión permita, por ejemplo, de dos hasta aproximadamente 25 repeticiones. Un multímero peptídico recombinantemente producido preferido tiene la fórmula:
(P1-Glyz)n-P2
en donde
(a) P1 y P2 son, independientemente, SEQ ID NO: 1 o 3 o una variante de adición o forma derivatizada de los mismos, en donde P1 y P2 pueden ser iguales o diferentes; además, cada aparición de P1 en el multímero puede ser un páptido diferente (o variante)
en donde
n = 1-25 y z = 0-6; (Ios intervalos preferidos de n Incluyen n = 1-5, 1-10, 1-15 o 1-20) y en donde el péptido central solo o en forma multimérica tiene la actividad biológica de CSP-4 como se divulga en el presente documento en un bioensayo in vitro o in vivo de tal actividad.
En Ios presentes multímeros peptídicos, P1o P2 es preferiblemente SEQ ID NO: 1 o una variante de adición o derivado químico del mismo. El multímero está opcionalmente protegido. Se entiende que tales multímeros pueden estar construidos de cualquiera de Ios péptidos o variantes descritos en el presente documento. También se entiende que el multímero peptídico debe ser diferente de SEQ ID NO: 3 (es decir, no Cav-1 humana nativa y es preferiblemente no un homólogo de Cav-1 de mamífero nativa).
Peptidomiméticos
También se divulga un compuesto peptidomimético que mimetiza Ios efectos biológicos de CSP-4. Un agente peptidomimético puede ser un péptido no natural o un agente no peptídico que recrea las propiedades estereoespaciales de Ios elementos de unión de CSP-4 de modo que tiene la actividad de unión y actividad biológica de CSP-4. Similar a un péptido CSP-4 biológicamente activo, multímero peptídico, un peptidomimético tendrá una cara de unión (que interacciona con cualquier ligando al que se une CSP-4) y una cara de no unión. De nuevo, similar a CSP-4, la cara de no unión de un peptidomimético contendrá grupos funcionales que se pueden modificar por acoplamiento de varias fracciones terapéuticas sin modificar la cara de unión del peptidomimético. Una forma de realización preferida de un peptidomimético contendría una anilina en la cara de no unión de la molécula. El grupo NH2 de una anilina tiene un pKa ~ 4,5 y podría por tanto modificarse por cualquier reactivo selectivo de NH2 sin modificar ningún grupo funcional NH2 en la cara de unión del peptidomimético. Otros peptidomiméticos pueden no tener ningún grupo funcional NH2 en su cara de unión y, por tanto, cualquier NH2, sin consideración por el pKa se podrían mostrar en la cara de no unión como un sitio para conjugación. Además, otros grupos funcionales modificables, tal como -SH y -COOH se podrían incorporar en la cara de no unión de un peptidomimético como un sitio de conjugación. También se podría incorporar directamente una fracción terapéutica durante la síntesis de un peptidomimético y preferentemente mostrarse en la cara de no unión de la molécula.
Se divulgan además compuestos que retienen características peptídicas parciales. Por ejemplo, cualquier enlace proteolíticamente inestable en un péptido de la invención se podría sustituir selectivamente por un elemento no peptídico tal como un isóstero (N-metilación; D-aminoácido) o un enlace peptídico reducido mientras que el resto de la molécula retine su naturaleza peptídica.
Se han descrito compuestos peptidomiméticos, ya sean agonistas, sustratos o inhibidores, para un número de péptidos/polipéptidos bioactivos tal como péptidos opioides, VIP, trombina, proteasa de VIH, etc. Los métodos para diseñar y preparar compuestos peptidomiméticos se conocen en la técnica (Hruby, VJ, Biopolymers 33:1073-1082 (1993); Wiley, RA et al., Med. Res. Rev. 13:327-384 (1993); Moore et al., Adv. in Pharmacol 33:91-141 (1995); Giannis et al., Adv. in Drug Res. 29:1-78 (1997). Se describen ciertos miméticos que mimetizan la estructura secundaria en Johnson et al., En: Biotechnology and Pharmacy, Pezzuto et al., Chapman y Hall (Eds.), NY, 1993. Estos métodos se usan para hacer peptidomiméticos que poseen al menos la capacidad y especificidad de unión del péptido CSP-4 y preferiblemente también poseen la actividad biológica. El conocimiento de química de péptidos y química orgánica general disponible para Ios expertos en la materia es suficiente, en vista de la presente divulgación, para diseñar y sintetizar tales compuestos.
Por ejemplo, tales peptidomiméticos se han identificado por inspección de la estructura tridimensional de un péptido de la invención libre o unido en complejo con un ligando (por ejemplo, uPAR soluble o un fragmento del mismo). Alternativamente, la estructura de un péptido de la invención unido a su ligando se puede obtener por las técnicas de espectroscopia de resonancia magnética nuclear. Un mayor conocimiento de la estereoquímica de la interacción del péptido con su ligando o receptor permitirá el diseño racional de tales agentes peptidomiméticos. La estructura de un péptido o polipéptido de la invención en ausencia de ligando también podría proporcionar un andamiaje para el diseño de moléculas miméticas.
Péptidos administrables
Una forma de realización de la divulgación comprende un método de introducir el péptido de la invención en células animales, tal como células humanas. Las composiciones útiles para este método, denominadas péptidos o polipéptidos “administrables” o “administrables a células” o “dirigidos a células” comprenden un péptido biológicamente activo según la invención, preferiblemente CSP-4, o un derivado funcional del mismo, o un multímero peptídico del mismo, que tiene unido al mismo o está asociado con, un componente adicional que sirve como una “secuencia de internalización” o sistema de administración celular. El término “asociado con” puede incluir químicamente unido o acoplado a, sea por enlace covalente u otros o fuerzas, o combinado con, como en una mezcla. Como se usa en el presente documento, “administración” se refiere a internalizar un péptido/polipéptido en una célula. Las moléculas de administración contempladas en el presente documento incluyen péptidos/polipéptidos usados por otros para realizar entrada celular. Véase, por ejemplo, Morris et al., Nature Biotechnology, 19:1173-6, 2001). Una estrategia preferida es como sigue: un péptido inhibidor de apoptosis (“biológicamente activo”) de la invención se une a o mezcla con un péptido especialmente diseñado que facilita su entrada en células, preferiblemente células humanas. Este sistema de administración no requiere que el péptido de administración esté fusionado o químicamente acoplado al péptido o polipéptido biológicamente activo (aunque se prefiere), ni el péptido o polipéptido biológicamente activo se tiene que desnaturalizar antes del proceso de administración o internalización. Una desventaja de sistemas de administración anteriores es el requisito para desnaturalización de la proteína de “carga” antes de la administración y posterior restauración intracelular. Estas formas de realización se basan en enfoques conocidos para fomentar la translocación de proteínas a células.
Un tipo de péptido/polipéptido de “administración” que fomenta la translocación/internalización incluye la proteína TAT de VIH (Frankel, AD et al., Cell 55:1189-93 (1998), y la tercera hélice a del homeodominio de Antennapedia (Derossi et al., J. Biol. Chem. 269:10444-50 (1994); Lindgren, M et al., Trends Pharm. Scí. 21:99-103 (2000); Lindgren et al., Bioconjug Chem. (2000); Maniti O et al., PLoS ONE 5e15819 (2010). El último péptido, también conocido como "penetratina" es un péptido de 16 aminoácidos con la secuencia de tipo salvaje Rq IKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO:6) o dos análogos/variantes designadas W48F (RQIKIFFQNRRMKWKK, SEQ ID NO:7) y W56F (RQIKIWFQNRRMKFKK, SEQ ID NO:8) (Christiaens B et al., Eur Biochem 2002, 269:2918-2926). Otra variante con ambas de las mutaciones anteriores es RQIKIFFQNRRMKFKK (SEQ ID NO:9). Transportano, un péptido que penetra en células es un péptido de 27 aminoácidos de longitud que contiene 12 aminoácidos funcionales del extremo N del neuropéptido galanina unido por un residuo de Lys añadido a la secuencia de mastoparán (Pooga, M et al., FASEB J.
12:67-77 (1998)). La secuencia de transportano es GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO:10). Se describen análogos de penetratina y transportano por Lindgren et al., Bioconjug Chem. 2000.
Otra (familia de) proteína incluye VP22, una proteína del virus del herpes simple que tiene la notable propiedad de transporte intracelular y distribuye una proteína a muchas células circundantes (Elliott, G et al., 1997, Cell 88:223-33; O'Hare et al., Patente en EE u U 6.017.735). Por ejemplo, VP22 unida a p53 (Phelan, A. et al., 1998, Nat Biotechnol 16:440-3) o timidina quinasa (Dilber, MS et al., 1999, Gene Then 6:12-21) facilita la propagación de proteínas unidas a las células circundantes in vitro. También son útiles homólogos de VP22 en otros herpesvirus, tal como la proteína del virus aviar de la enfermedad de Marek (MDV) UL49, que comparte homología con VP22 de HSV-1 (Koptidesova et al., 1995, Arch Virol. 140 :355-62) y se ha mostrado que es capaz de transporte intracelular después de la aplicación exógena (Dorange et al., 2000, J Gen Virol. 81:2219). Todas estas proteínas comparten la propiedad de propagación intercelular que proporciona un enfoque para aumentar la absorción celular de péptidos, variantes y multímeros de esta invención.
También se incluyen “derivados funcionales” de las proteínas y péptidos anteriores de propagación intracelular o “administración” “administración” o “internalización” tales como TAT de VIH o VP22 que incluyen variantes de sustitución de aminoácidos homólogos, fragmentos o derivados químicos, términos que son en el presente documento para los péptidos biológicamente activos. Un derivado funcional retiene actividad cuantificable de translocación o propagación intercelular (de tipo VP22) que fomenta la entrada del polipéptido deseado, que fomenta la utilidad del presente péptido biológicamente activo, por ejemplo, para terapia. “Derivados funcionales” abarca variantes (preferiblemente variantes de sustitución conservadora) y fragmentos independientemente de si los términos se usan en enlazante o la alternativa.
Puesto que se dice que las anteriores proteínas de transporte funcionan mejor cuando están conjugadas o unidas de otra manera al péptido que transportan, tal como CSP-4 o una variante o multímero del mismo, hay un número de desventajas al usarlas. Se describe un polipéptido de administración más eficaz que se puede mezclar con el péptido biológicamente activo y no necesita estar unido químicamente para su acción en Morris et al., supra, como “Pep-1” que tiene la secuencia de aminoácidos anfipática KeTWWETw Wt EWSQPKKKRKV (SEQ ID NO:11). Pep -1 consiste en tres dominios:
(1) un motivo hidrofóbico rico en Trp que contiene cinco residuos de Trp KETWWETWWTEW (residuos 1-12 de SEQ ID NO: 11, anterior). Este motivo es deseable, o requerido, para dirigirse eficazmente a la membrana celular y para entrar en interacciones hidrofóbicas con proteínas;
(2) un dominio hidrofílico rico en Lys KKKRKV (Ios 6 residuos C-terminales de SEQ ID NO: 11) que deriva de la secuencia de localización nuclear del antígeno T grande del virus SV40, y mejora la administración intracelular y solubilidad del péptido; y
(3) un “dominio” espaciador SQP (3 residuos internos de SEQ ID NO: 12) que y separa Ios dos dominios activos anteriores e incluye una Pro que mejora la flexibilidad e integridad de Ios dominios tanto hidrofóbico como hidrofílico.
Según esto, otra forma de realización de la divulgación es un péptido o polipéptido administrable que comprende CSP-4 o un derivado funcional del mismo como se ha descrito anteriormente, y una molécula o fracción de administración o translocación unida al mismo o asociada con el mismo. La molécula de administración puede ser un péptido o polipéptido, por ejemplo,
(a) proteína TAT de VIH o un derivado translocacionalmente activo de la misma,
(b) penetratina que tiene la secuencia Rq IKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO:8),
(c) una variante de penetratina W48F que tiene la secuencia RQIKIFFQNRRMKWKK (SEQ ID NO:7)
(d) una variante de penetratina W56F que tiene la secuencia RQIKIWFQNRRMKFKK (s EQ ID NO:13)
(e) una variante de penetratina que tiene la secuencia RQIKIWFQNRRMKFKK (SEQ ID NO:16) (f) transportano que tiene la secuencia GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO:10)
(g) proteína VP22 del virus del herpes simple o un homólogo translocacionalmente activo de la misma de un herpesvirus diferente tal como la proteína de MDV UL49; o
(h) Pep-1 que tiene la secuencia KETWWETWWTEWSQPKKKRKV (SEQ ID NO:9).
Cuando una fracción de administración, tal como los péptidos y proteínas discutidos anteriormente, se conjuga o fusiona al péptido biológicamente activo de la invención, se prefiere que la fracción de administración está N-terminal respecto al péptido biológicamente activo.
Ensayo in vitro de composiciones
Los compuestos de esta invención se ensayan para su actividad biológica, por ejemplo, actividad antifibrótica, su capacidad de afectar la expresión de los ARNm de uPA, uPAR y PAI-1, inhibir la proliferación de fibroblastos de pulmón, etc., usando cualquiera de los ensayos descritos y/o ejemplificados en el presente documento u otros bien conocidos en la técnica.
Ensayo in vivo de composiciones
La capacidad de un compuesto (tal como análogos de NTL o variantes o derivados o multímeros peptídicos de CSP-4 para inhibir fibrosis pulmonar en ratones tratados con BLM es un ensayo preferido para evaluar la actividad funcional del compuesto. También se pueden usar otros ensayos conocidos en técnica que miden el mismo tipo de actividad.
Método de prevenir o tratar lesión pulmonar o fibrosis
Los compuestos y composiciones descritos en el presente documento se usan en un método para inhibir la interacción de MDM2 con la proteína p53 in vitro o in vivo, y para tratar enfermedades o afecciones asociadas con ALI y fibrosis pulmonar/FPI.
Composiciones farmacéuticas y terapéuticas y su administración
Los compuestos que se pueden emplear en las composiciones farmacéuticas de la divulgación incluyen NTL, y todos los compuestos peptídicos descritos anteriormente, así como las sales farmacéuticamente aceptables de estos compuestos. “Sal farmacéuticamente aceptable” se refiere a sales de adición ácida o sales de adición de base convencionales que retienen la eficacia biológica y propiedades de los compuestos de la presente invención y se forman de ácidos orgánicos o inorgánicos no tóxicos adecuado o bases orgánicas o inorgánicas. Las sales de adición ácida de muestra incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos tal como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido yodhídrico, ácido sulfúrico, ácido sulfámico, ácido fosfórico y ácido nítrico, y las derivadas de ácidos orgánicos tal como ácido p-toluenosulfónico, ácido salicílico, ácido metanosulfónico, ácido oxálico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido láctico, ácido fumárico, y similares. Las sales de adición de base de muestra incluyen las derivadas de hidróxidos de amonio, potasio, sodio y amonio cuaternario, tal como, por ejemplo, hidróxido de tetrametilamonio. La modificación química de un compuesto farmacéutico (es decir, fármaco) a una sal es una técnica bien conocida para los químicos farmacéuticos para obtener estabilidad física y química, higroscopicidad, fluidez y solubilidad mejoradas de compuestos. Véase, por ejemplo, H. Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (6a Ed. 1995) en las pp. 196 y 1456-1457.
Como se ha afirmado anteriormente, los compuestos de la invención poseen la capacidad para inhibir la interacción de MDM2 con la proteína p53 y se aprovechan en el tratamiento de lesión pulmonar aguda y, en particular, fibrosis pulmonar.
Los compuestos de la invención, así como las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, se pueden incorporar en formas farmacéuticas convenientes, tal como cápsulas, obleas impregnadas, comprimidos o preferiblemente, preparaciones inyectables. Se pueden emplear soportes farmacéuticamente aceptables sólidos o líquidos. “Farmacéuticamente aceptable”, tal como soporte, excipiente, etc. farmacéuticamente aceptable significa farmacológicamente aceptable y sustancialmente no tóxico para el sujeto al que se administra el compuesto particular.
Los soportes sólidos incluyen almidón, lactosa, sulfato de calcio dihidrato, arcilla blanca, sacarosa, talco, gelatina, agar, pectina, goma arábiga, estearato de magnesio y ácido esteárico. Los soportes líquidos incluyen jarabe, aceite de cacahuete, aceite de oliva, solución salina, agua, dextrosa, glicerol y similares. De forma similar, el soporte o diluyente puede incluir cualquier material de liberación prolongada, tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo, solo o con una cera. Cuando se usa un soporte líquido, la preparación puede estar en forma de un jarabe, un elixir, emulsión, cápsula de gelatina blanda, líquido inyectable estéril (por ejemplo, una solución), tal como una ampolla, o una suspensión líquida acuosa o no acuosa. Se puede encontrar un resumen de tales composiciones farmacéuticas, por ejemplo, en Gennaro, AR, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins Publishers; 2 ia Ed, 2005 (o la última edición).
Las preparaciones farmacéuticas se hacen según técnicas convencionales de química farmacéutica que implican etapas como mezclado, granulación y compresión, cuando es necesario para formas de comprimido, o mezclar, rellenar y disolver los ingredientes, según sea apropiado, para dar los productos deseados para la administración oral, parenteral, tópica, transdérmica, intravaginal, intrapenil, intranasal, intrabronquial, intracraneal, intraocular, intraauricular y rectal. Las composiciones farmacéuticas también pueden contener cantidades minoritarias de sustancias auxiliares no tóxicas tal como agentes humectantes o emulsionantes, agentes reguladores de pH y así sucesivamente.
La presente invención se puede usar en el tratamiento de cualquiera de un número de géneros y especies animales, y son igualmente aplicables en la práctica de medicina humana o veterinaria. Por tanto, las composiciones farmacéuticas se pueden usar para tratar animales domésticos y comerciales, incluyendo aves y más preferiblemente mamíferos, lo más preferiblemente seres humanos.
El término “administración sistémica” se refiere a administración de una composición o agente tal como NTL o Ios péptidos descritos en el presente documento, de una forma que produce la introducción de la composición en el sistema circulatorio del sujeto o permite de otra manera su propagación a lo largo del cuerpo, tal como inyección o infusión intravenosa (í.v .). Administración “regional” se refiere a la administración a un espacio anatómico específico, y algo más limitado, tal como instilación en el pulmón, la ruta preferida, o intrapleural, intraperitoneal, intratecal, subdural o a un órgano específico. Otros ejemplos incluyen intranasal, que es una ruta que corresponde a instilación en Ios pulmones, intrabronquial, intraauricular o intraocular, etc. El término “administración local” se refiere a la administración de una composición o fármaco en un espacio anatómico limitado, o circunscrito, tal como inyecciones subcutáneas (s.c.), inyecciones intramusculares (i.m.). Un experto en la materia entendería que la administración local o la administración regional con frecuencia también producen entrada de una composición en el sistema circulatorio, es decir, de modo que s.c. o i.m. también pueden ser rutas para la administración sistémica. Se pueden preparar preparaciones instilables, inyectables o infusibles en formas convencionales, ya sea como soluciones o suspensiones, formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en líquido antes de la inyección o infusión, o como emulsiones. Aunque las rutas regionales preferidas de administración son en Ios pulmones, la composición farmacéutica se puede administrar por vía sistémica o tópica o transdérmica ya sea por separado de, o al mismo tiempo que, instilación en Ios pulmones.
Otros soportes farmacéuticamente aceptables para composiciones de la presente invención son liposomas, composiciones farmacéuticas en las que el polipéptido activo está contenido ya sea dispersado o diversamente presente en corpúsculos que consisten en capas concéntricas acuosas adherentes a capas lipídicas. El polipéptido activo está preferiblemente presente en la capa acuosa y en la capa lipídica, dentro o fuera, o, en cualquier caso, en el sistema no homogéneo en general conocido como una suspensión liposómica. La capa hidrofóbica, o capa lipídica, en general, pero no exclusivamente, comprende fosfolípidos tal como lecitina y esfingomielina, esteroides tal como colesterol, sustancias tensioactivas más o menos iónicas tal como dicetilfosfato, estearilamina o ácido fosfatídico, y/u otros materiales de una naturaleza hidrofóbica. Los expertos en la materia apreciarán otras formas de realización adecuadas de las presente formulaciones liposómicas.
La dosis terapéutica administrada es una cantidad que es terapéuticamente eficaz, como saben o es fácilmente determinable por Ios expertos en la materia. La dosis también depende de la edad, salud, y peso del receptor, tipo de tratamiento(s) concurrente(s), si hay alguno, la frecuencia del tratamiento, y la naturaleza del efecto deseado.
Métodos terapéuticos
Los métodos de esta divulgación se pueden usar para tratar fibrosis pulmonar o FPI en un sujeto en necesidad de ello. El término “tratar” se define en sentido amplio para incluir, al menos lo siguiente: inhibir, reducir, mejorar, prevenir, reducir la aparición o recaída, incluyendo la frecuencia y/o tiempo a la recaída, o la gravedad de Ios síntomas de la enfermedad o afección que se trata o previene. Esto se puede producir como resultado de inhibir la muerte celular epitelial, inhibir la proliferación de fibroblastos, cualquiera de Ios otros mecanismos biológicos o bioquímicos divulgados en el presente documento que se asocia con o responsable de FPI.
La NTL, análogo de NTL, o péptido o derivado peptídico o sal farmacéuticamente aceptable del mismo preferiblemente se administra en forma de una composición farmacéutica como se ha descrito anteriormente.
Las dosis del compuesto preferiblemente incluyen formas posológicas farmacéuticas que comprenden una cantidad eficaz de la NTL o péptido. La forma farmacéutica se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para un sujeto mamífero; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de material activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con el soporte farmacéutico requerido. La especificación de las formas farmacéuticas de la invención está dictada por y depende directamente de (a) las características únicas del material activo y el efecto terapéutico particular que se va a alcanzar, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de composición de tal compuesto activo para el tratamiento de, y sensibilidad de, sujetos individuales.
Mediante una cantidad eficaz se quiere decir una cantidad suficiente para alcanzar una concentración regional o concentración de estado estacionario in vivo que produce una reducción cuantificable en cualquier parámetro relevante de la enfermedad.
La cantidad de compuesto activo que se va a administrar depende de la NTL, análogo de NTL, péptido o derivado del mismo seleccionado, la enfermedad o afección precisa, la vía de administración, la salud y peso del receptor, la existencia de otro tratamiento concurrente, si hay alguno, la frecuencia del tratamiento, la naturaleza del efecto deseado, y el Juicio del experto.
Una dosis individual preferida, dada una vez al día para tratar un sujeto, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano que padece o es susceptible a FPI resultante de la misma es entre aproximadamente 0,2 mg/kg y aproximadamente 250 mg/kg, preferiblemente es entre aproximadamente 10 mg/kg y aproximadamente 50 mg/kg, por ejemplo, mediante instilación (por inhalación). Tal dosis se puede administrar a diario desde donde sea desde aproximadamente 3 días a una o más semanas. También es posible la administración crónica, aunque puede ser necesario ajustar la dosis hacia abajo como se entiende bien en la técnica. Los intervalos anteriores son, sin embargo, indicativos, ya que el número de variables en una pauta de tratamiento individual es grande, y se esperan desplazamientos considerables de estos valores preferidos.
Para la administración continua, por ejemplo, mediante un sistema de bomba tal como una bomba osmótica que se usó en algunos de los experimentos descritos posteriormente, una dosis total durante un tiempo de aproximadamente 1-2 semanas está preferiblemente en el intervalo de 1 mg/kg a 1 g/kg, preferiblemente 20-300 mg/kg, más preferiblemente 50-200 mg/kg. Después de tal pauta de dosis continua, la concentración total del compuesto activo está preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 50 |jM, preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 |jM.
Una concentración eficaz del compuesto activo para inhibir o prevenir inhibir apoptosis in vitro está en el intervalo de aproximadamente 0,5 nM a aproximadamente 100 nM, más preferiblemente de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 20 nM. Las dosis eficaces e intervalos de dosis óptimos se pueden determinar in vitro usando los métodos descritos en el presente documento.
e j e m p l o i
Expresión de p53 en fibroblastos FL disminuida en focos fibróticos de pulmones FPI
La tinción de secciones de pulmón de pacientes de FPI y sujetos “normales” control con varios reactivos, incluyendo inmunohistoquímica (IHC) (véase, las figuras 2A-2I) reveló que los tejidos FPI muestran focos fibróticos que son densos con MEC. Los fibroblastos FL dispersados en los focos ricos en vimentina mostraron tinción mínima para antígenos p53 y PAI-1. Sin embargo, la tinción de inmunofluorescencia para SP-C, PAI-1, p53 y caspasa-3 activa (no mostrado) demostró que células alveolares de tipo II (ATII) que rodean los focos fibróticos muestran tinción elevada para antígenos p53 y Pa I-1, y son positivas para caspasa-3 activa, lo que indica apoptosis de células ATII circundantes. Los resultados de iHc revelan que las células ATII que encierran los focos fibróticos mueren continuamente debido a expresión aumentada de p53 y PAI-1. Estas heridas se sustituyen por fibroblastos activados que muestran tinción de p53 y PAI-1 basal mínima, y elevada de Ki-67 lo que indica proliferación debido a la supresión de la expresión de p53 y PAI-1.
e j e m p l o II
Caveolina-1, p53 y PAI-1 disminuidas y uPA aumentada en fibroblastos FL humanos de pulmones FPI
Se inmunotransfirieron lisados celulares de fibroblastos NL y FL para revelar cambios en las proteínas y miARN. Véase las figuras 3A-3B. La expresión de miR-34a basal era significativamente menor en fibroblastos FL lo que indica que la expresión reducida de p53 y cambios consecuentes en la interrelación p53-sistema fibrinolítico de uPA contribuía a fibrogénesis. Tales cambios se asocian con col-I aumentada e inhibición de miR-34a. Los resultados mostraron además que aumentos en la transcripción de miR-34a inducida por p53 o estabilización de p53 en fibroblastos FL humanos mediada por miR-34a puede mitigar la fibrosis pulmonar.
e j e m p l o III
Expresión dispar de los ARNm de uPA, PAI-1 y col-I por fibroblastos de pulmones FPI y “normales”
Se ensayó ARN total aislado de tejidos pulmonares de sujetos “normales” y pacientes con FPI o de NL para ARNm de uPA, PAI-1 y col-I por RT-PCR cuantitativa y se normalizó a los niveles correspondientes del ARNm de p-actina. Los resultados se muestran en las figuras 4A-4B.
La expresión del ARNm de col-I y PAI-1 aumentó significativamente en tejidos de pulmones FPI mientras que el ARNm de uPA se redujo. De forma interesante, a diferencia de los tejidos de pulmones FPI, el ARNm de col-I y uPA y menor nivel de la expresión del ARNm de PAI-1 se encontraron en fibroblastos FL comparado con fibroblastos NL. La proteína y el ARNm de uPAR también están elevados en fibroblastos FL. El PAI-1 elevado en los tejidos pulmonares es atribuible a expresión aumentada de PAI-1 por células epiteliales pulmonares o macrófagos más que fibroblastos FL (FPI). Esto es consistente con la expresión aumentada de proteínas coI-I, uPA y uPAR y PAI-1 reducida en fibroblastos FL de pulmones FPI (véase la figura 3A).
e j e m p l o iv
Expresión diferencial de uPA y PAI-1 por fibroblastos FL frente a NL de ratones
Se aislaron fibroblastos FL de Ios pulmones de ratones 21 días después de lesión con BLM o fibroblastos NL de ratones control expuestos a solución salina intranasal como se describe en otro lugar26. Los lisados de fibroblastos NL y FL se inmunotransfirieron para
Se detectaron cambios en la expresión de proteínas p53, uPA, PAI-1 y coI-I por inmunotransferencia de lisados celulares de fibroblastos NL y FL (Figs. 5A-5D). Se extrajo ARN total de tejidos de pulmones de ratón fibroblastos NL y FL de tejidos de pulmón de ratones con fibrosis inducida por BLM o control (tratados con solución salina) y se ensayaron para ARNm de uPA, PAI-1 y CoI-I. Se compararon las tasas proliferativas de fibroblastos NL y f L de ratones. Consistente con fibroblastos FL (FPI) de pulmones FPI2, la tasa basal de proliferación de fibroblastos Fl (BLM) murinos era significativamente mayor que la de fibroblastos NL (de ratones tratados con solución salina). p53 inhibía la transcripción génica de uPA, al mismo tiempo se unía al promotor de PAI-1 y aumentaba la transcripción del ARNm de PAI-133-34 p53 también inhibía la expresión de uPA y uPAR mediante la desestabilización de sus transcritos al tiempo que estabiliza el transcrito de PAI-123’35. Por último, la inhibición de uPA o uPAR aumenta la expresión de p53 y posterior inducción de PAI-1 mediada por p53, aumentando de esta manera la senescencia celular y apoptosis. Se concluyó que la regulación mediada por p53 del sistema fibrinolítico de uPA a niveles transcripcional y postranscripcional está comprometida en fibroblastos FL debido a la falta de expresión de p53. Esto lleva a uPA y uPAR aumentadas e inhibición de PAI-1 en estas células.
e j e m p l o v
CSP aumenta la expresión de p53 a través de la inducción de miR-34a en fibroblastos FL(FPI)
Se trataron fibroblastos NL y FL con PBS, CSP o CP y se analizó el ARN para miR-34a por PCR en tiempo real. Además, se cultivaron fibroblastos FL en presencia de PBS o CSP o CP con o sin miR-34a antisentido (miR-34a AS) o pre-miR-34a (o miARN control. Se inmunotransfirió medio acondicionado (CM) de estos cultivos para PAI-1 y se inmunotransfirieron lisados celulares (CL) para p53. En un experimento, Ios fibroblastos FL se trataron con PBS o Cs P o CP en presencia o ausencia de miR-34a AS, pre-miR-34a o miR control. Se analizó ARN para cambios en miR-34a por PCR en tiempo real. Los resultados aparecen en las figuras 6A-6C.
Se hicieron una serie de deleciones solapantes en CSP y estos fragmentos peptídicos se ensayaron en fibroblastos FL para cambios en p53, uPA, PAI-1 y coI-I (Fig. 6D).
CSP aumentó significativamente la expresión de miR-34a y p53 en fibroblastos FL, pero no NL. La inducción de p53 por CSP estaba mimetizada por la expresión de pre-miR-34a solo y abolida por inhibición de miR-34a por miR-34a AS. Esto indicaba que la inducción de p53 se produce mediante estabilización mediada por miR-34a.
El análisis de deleción del 20mero CSP reveló que un fragmento interno de 7 aminoácidos, llamado CSP-4 y que tiene la secuencia FTTFTVT (SEQ ID NO: 1) tenía la actividad del péptido de longitud completa. Esto apoya la conclusión de que el efecto beneficioso de CSP-4 en fibroblastos FL o ratones con fibrosis pulmonar establecida (véase las figuras 11A-11D), implica control de la expresión de p53 y miR-34a.
e j e m p l o vi
Degradación aumentada mediada por mdm2 de proteínas p53 en fibroblastos FL(FPI)
Lisados de fibroblastos NL y FL se inmunotransfirieron para p53 y mdm2, o se inmunoprecipitaron con anticuerpo antimdm2 e inmunotransfirieron (IB) para la proteína p53 asociada. Los resultados mostraron interacción mdm2-p53 robusta en fibroblastos NL que estaban ausentes en fibroblastos FL (véase las figuras 7A-7B) a pesar de niveles elevados de mdm2 en Ios fibroblastos FL. Por tanto, la degradación aumentada mediada por mdm2 de la proteína p53 contribuía a la marcada supresión de Ios niveles basales de p53 en fibroblastos FL, lo que apoya el uso de las intervenciones terapéuticas divulgadas en el presente documento para dirigirse a la interacción de mdm2 y p53.
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Inhibición mediada por nutlina-3a (NTL) o CSP-4 de la expresión de coI-I en fibroblastos FL(FPI): Papel de la interrelación p53-sistema fibrinolítico
Se expusieron fibroblastos FL a PBS (control), nutlina-3a (10 mM), CSP-4 (10 nM) o CP durante 48 horas. Se inmunotransfirieron lisados para la expresión de CoI-I, PAI-1, p53 y uPA. Los resultados se muestran en las figuras 8A-8B. Se expusieron FL cultivados a vehículo (PBS), o nutlina-3a, CSP-4 o CP y se contaron para evaluar la proliferación. Los resultados mostraron que tanto nutlina-3a como CSP-4 inhibieron la proliferación de fibroblastos FL. El proceso implica inducción de la expresión de p53 y PAI-1 e inhibición concurrente de uPA.
En otro experimento (resultados en la figura 8C), se transdujeron fibroblastos FL con vector de adenovirus que expresa p53, PAI-1 o caveolina-1 o controles de vector apropiados y se cultivaron durante 2 días momento en que se Ios lisados celulares se inmunotransfirieron para CoI-I, p53, PAI-1 y uPA. La transducción de fibroblastos FL de pulmones FPI con Ad-Cav-1 indujo p53 y PAI-1 mientras que inhibía la expresión de uPA y coI-I. Los efectos de nutlina-3a o CSP-4 en fibroblastos FL estaban mimetizados al expresar p53 o PAI-1 o caveolina-1 solas. Por tanto, la inducción mediada por p53 de PAI-1 y la inhibición de la expresión de uPA contribuyen a la inhibición de coI-I. De forma interesante, el tratamiento de fibroblastos FL de Ios pulmones de pacientes de FPI o ratones tratados con BLM con proteína PAI-1 recombinante fracasó para inducir apoptosis o senescencia (no mostrado) mientras que PAI-1 elevada exógena inducía apoptosis de células ATII tanto in vitro como in vivo. La resistencia de fibroblastos f L a PAI-1 exógena permitiría que estas células prosperaran en medios ricos en proteínas PAI-1 de pulmones de FPI o dañados con BLM.
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Papel de la interrelación p53-sistema fibrinolítico en la inducción de la expresión de coI-I en fibroblastos NL
Se transfectaron fibroblastos NL de pulmones humanos histológicamente “normales”2 con un vector de lentivirus que porta ARNhc de p53 para inhibir la expresión basal de p53. Se trataron similarmente células controles con un ARNhc no específico. Se inmunotransfirió medio acondicionado de Ios cultivos para PAI-1, uPA y coI-I soluble, y se ensayaron lisados celulares para p53 y ci-SMA. Se analizó ARN total aislado de estos fibroblastos para cambios en la expresión del ARNm de uPA, pA|-1 y coI-I por RT-PCR cuantitativa. Los resultados (en las figuras 9A-9B) muestran que la inhibición de la expresión de p53 en fibroblastos NL aumentó uPA, coI-I y ci-SMA, pero inhibió PAI-1. Esto apoya el vínculo descrito aquí entre cambios mediados por p53 en el sistema de uPa y fibrogénesis.
e j e m p l o ix
Nutlina-3a inhibe fibrosis pulmonar en ratones tratados con BLM
Ratones expuestos a BLM (o solución salina en controles) durante 14 d para inducir fibrosis pulmonar se inyectaron IV con nutlina-3a (10 mg/kg de peso corporal)35 o un control vehículo para determinar y el efecto en fibrosis pulmonar establecida se examinó. La fibrosis se evaluó por TAC y la función pulmonar (distensibilidad y resistencia) se midieron usando el sistema Flexivent. Se sometieron secciones pulmonares a tinción tricrómica y tinción de H&E (la última no mostrada) para evaluar la arquitectura pulmonar y depósito de colágeno como una indicación de fibrosis. Por último, se analizaron homogenizados de pulmones enteros para contenido total en colágeno (hidroxiprolina) y desmosina26,36 como una evaluación independiente de cambios en la MEC. Los resultados (Fig. 10-10D) de todos Ios ensayos anteriores indicaban un efecto beneficioso de nutlina-3a en fibrosis pulmonar. La administración oral de nutlina-3a 14 días después de la lesión de BLM inhibió asimismo la fibrosis pulmonar en ratones
e j e m p l o x
El péptido CSP-4 inhibe fibrosis pulmonar establecida y mejora la función pulmonar
Se expusieron ratones a BLM para inducir fibrosis pulmonar. Después de 14 d, Ios ratones se inyectaron IV con vehículo o 1,5 mg/kg de peso corporal de
CSP-4 (SEQ ID NO: 1) o péptido control (secuencia mezclada de Ios mismos aminoácidos; CP, SEQ ID NO: 5)) a 1,5 mg/kg de peso corporal o vehículo se inyectó IV en ratones expuestos a BLM 14 días antes. Una semana después, Ios ratones se ensayaron por TAC para evaluar fibrosis pulmonar. Se midió el volumen pulmonar en Ios mismos ratones usando rendiciones de TAC cuantitativa. Se sometieron secciones pulmonares a tinción (tricrómica y H&E para evaluar el depósito de colágeno como un indicador de fibrosis pulmonar. Se analizaron homogenizados de pulmones enteros para contenido total de hidroxiprolina y desmosina (la última no mostrada). Los resultados están en las figuras 11A-11D. Todos Ios ensayos mostraron que CSP-4 inhibía la fibrosis pulmonar inducida por BLM. Consistente con Ios efectos in vitro de tanto CSP como CSP-4 en fibroblastos FL de pulmones FPI (véase la figura 6D), CSP-4 ejercía un efecto beneficioso in vivo contra fibrosis pulmonar establecida, mimetizando Ios efectos beneficiosos del péptido de longitud completa, CSP (SEQ ID NO: 3).
e j e m p l o xi
El péptido CSP-4 y nutlina-3a inhiben la proliferación de fibroblastos FL
Ratones expuestos a BLM 14 días antes se trataron con CSP-4 o su control (CP) o nutlina-3a IV (como en Ios ejemplos IX y X). Siete días después se obtuvieron secciones pulmonares y se sometieron a IHC para Ki-67 para evaluar proliferación celular (véase la figura 12A). La tinción aumentada para antígenos ki-67 observada en secciones pulmonares de ratones fibróticos se reducía significativamente por el tratamiento con nutlina-3a o CSP-4. Se ensayaron fibroblastos aislados de Ios pulmones de estos animales (como se describe en el ejemplo X) para Ios cambios en la expresión de proteínas coI-I, p53 y posteriores uPA y PAI-1 por inmunotransferencia y ARNm por RT-PCR cuantitativa (véase las figuras 12B-12C). Los fibroblastos FL de ratones con fibrosis inducida por BLM establecida mostraron expresión aumentada de ARNm y proteínas uPA y coI-I comparados con fibroblastos NL de ratones sin lesión pulmonar. Estas células también mostraron expresión mínima de p53 y PAI-1. Sin embargo, en fibroblastos de ratones tratados con nutlina-3a, la expresión de proteína y ARNm de uPA y coI-I estaban significativamente suprimidas. Estos cambios estaban asociados con marcada inducción de proteína p53, y expresión de proteína y ARNm de PAI-1, Io que indica que el restablecimiento de la interrelación p53-sistema fibrinolítico mitiga la fibrosis.
e j e m p l o x ii
Inhibición de cambios fibróticos por tratamiento ex vivo con CSP-4 o nutlina-3a
Se expusieron ratones a BLM intranasal durante 21 d para inducir fibrosis pulmonar, se sacrificaron y sus pulmones se extirparon y cortaron y en trozos pequeños y se colocaron en medio de cultivo. Estas muestras de tejido se trataron después de ello con péptido CSP-4 lO nN, péptido control (CP) o nutlina-3a durante 72 h. Medio acondicionado y lisados de tejido se y analizaron para cambios en coI-I y a-SMA por inmunotransferencia. Los resultados (Fig. 13) mostraron que el tratamiento de explantes de tejido pulmonar fibrótico con CSP-4 o nutlina-3a inhibía la fibrosis ex vivo. El péptido CSP de longitud completa dio inhibición similar de coI-I y a-SMA (resultados no mostrados). Se espera que nutlina-3a y CSP-4 actúen de forma similar para afectar tejidos de pulmones FPI humanos ex vivo. Los datos más recientes de Ios presentes inventores y artículos recientes (por ejemplo, Bhandary et al. supra), fuertemente apoyan la concepción de que Ios cambios posteriores mediados por p53 en uPA y PAI-1 regulan la viabilidad de fibroblastos f l .
e j e m p l o x iii
La expresión de p53 en fibroblastos FL y la inversión posterior de sistema fibrinolítico de uPA mitiga fibrosis pulmonar in vivo
Los resultados descritos en el presente documento y en otros sitios (Bhandary YP et al., Am J Physiol: Lung Cell Mot Physiol 3O2:L463-473, 2012 ; Shetty SK et al., Am J Respir Cell Mol Biol 47:474-83, 2012) muestran que inyecciones IP o IV con CSP o CSP-4 (Fig. 11A-11D), o administración IV u oral de nutlina-3a en ratones de tipo salvaje (WT) (Fig. 1OA-1OD) empezando 14 d después de BLM mitiga la fibrosis pulmonar establecida. Por tanto, la degradación mediada por mdm2 de la proteína p53 y la pérdida de la posterior interrelación p53-sistema de uPA aumenta la viabilidad de Ios fibroblastos FL y la producción de MEC in vivo, lo que produce la destrucción de la arquitectura pulmonar y pérdida de la función pulmonar. Puesto que Ios pacientes con frecuencia presentan en el momento del diagnóstico fases avanzadas de FPI, Ios mecanismos por Ios que nutlina-3a y CSP-4 inhiben la fibrosis pulmonar establecida se evalúan las dianas posteriores de nutlina-3a y CSP-4 se identifican. Estos estudios utilizan tejidos pulmonares de pacientes de FPI y ratones con fibrosis pulmonar avanzada debido a lesión pulmonar por BLM. La contribución y la especificidad de la interrelación p53-sistema de uPA se confirmarán usando ratones deficientes en uPA, uPAR, PAI-1 y p53.
A. Determinación de Ios efectos del tratamiento de nutlina-3a y CSP-4 en fibrosis usando tejidos FL(FPI) ex vivo
Se tratan tejidos pulmonares FL recién disecados de pacientes de FPI con nutlina-3a (10 |jM) o CSP-4 (10 nM) durante 3 a 7 días (véase la figura 13). Los tejidos pulmonares se homogenizan y ensayan para cambios en la MEC (hidroxiprolina y desmosina). Los controles incluyen tejidos de pulmón fibrótico (FL) de pacientes de FPI tratados con vehículo o péptido control, CP, o tejidos pulmonares sin tratar mantenidos en medio de cultivo. Otros controles incluyen tejidos NL extirpados de pulmones histológicamente “normales”. Los pulmones de pacientes de-identificados (“normal” y FPI) que no eran adecuados para trasplante y donados para investigación médica se obtienen a través de IIAM (Edison, NJ) y el NDRI (Filadelfia, PA) y se usan para estudios ex vivo. Se aíslan fibroblastos de estos tejidos y se analizan cambios en la expresión de p53, uPA, uPAR y PAI-1, producción de MEC y viabilidad. También se miden cambios en la velocidad de síntesis de MEC. Los explantes de tejido FL de pacientes con FPI tienen síntesis elevada de MEC cuando se comparan con Ios niveles de expresión en secciones de tejidos NL de sujetos control. Sin embargo, Ios explantes de pulmón FL tratados con nutlina-3a o CSP-4 muestran velocidades sintéticas de MEC significativamente reducidas cuando se comparan con Ios que permanecen sin tratar o expuestos a vehículo solo o CP. Los fibroblastos aislados de explantes de FPI tratados con nutlina-3a o CSP-4 muestran niveles elevados de expresión de p53, miR-34a y PAI-1 y reducidos de uPA y uPAr. La fosforilación de Akt y la expresión del ARNm y proteína de PDGFR-p también están reducidos en fibroblastos de explantes de FPI tratados con nutlina-3a o CSP-4. La velocidad de proliferación y producción de MEC de estos fibroblastos son significativamente menores que fibroblastos FL de controles sin tratar o tratados con vehículo o CP, pero comparables a la de Ios fibroblastos aislados de tejidos NL.
B. Papel de p53 y m¡R-34a en el control de fibrosis pulmonar
Basado en los resultados anteriores, se predice que la falta de expresión de p53 y m¡R-34a por fibroblastos FL contribuye a la fibrosis pulmonar y que el restablecimiento de la expresión basal de p53 por nutlina-3a o CSP-4 mediante la inducción de m¡R-34a mitiga la fibrosis pulmonar. Puesto que la fibrosis pulmonar máxima se produce entre los días 14-28 después de la lesión con BLM (Bhandary YP et al., Am J Physiol: Lung Cell Mol Physlol 302:L463-473, 2012; Bhandary y P et al.,. Regulation of alveolar epithelial injury and lung fibrosis by p53-mediated changes in urokinase and plasminogen activator inhibitor-1. Am J Pathol (enviado)) pre-m¡R-34a se expresa en fibroblastos pulmonares de ratón por inyección IV de lentivirus (LV) que contiene promotor de colágeno proa2(l) con pre-m¡R-34a a los 14 y 21 días después de la lesión pulmonar con BLM. La fibrosis pulmonar se evalúa 28 días después. El papel de m¡R-34a en la mitigación mediada por nutlina-3a o CSP-4 de fibrosis pulmonar se confirma por expresión de Lv de m¡R-34a-AS en fibroblastos usando el promotor proa2(l) en pulmones fibróticos.
El papel de p53 en los efectos beneficiosos contra la fibrosis pulmonar se confirma directamente al expresar p53 en fibroblastos pulmonares de ratones con fibrosis establecida usando LV o Ad-p53 que contiene promotor de colágeno proa(l) con o sin inhibición de m¡R-34a. Se evalúan fibrosis pulmonar y expresión de m¡R-34a, por ejemplo, 28 días después de la lesión con BLM. Alternativamente o, además, la expresión de p53 se inhibe usando LV ARNhc en ratones WT con fibrosis pulmonar inducida por BLM o el uso de ratones deficientes en p53 con fibrosis pulmonar establecida (Davis DW et al., J Exp Med 192:857-869, 2000). Estos ratones se exponen después a nutlina-3a o CSP-4, por ejemplo, 14 y 21 d después de la lesión con BLM. Se exponen ratones control con fibrosis pulmonar a ARNhc no específico o ratones WT sin exposición y tratados con nutlina-3a o CSP-4. Los ratones se ensayan para fibrosis pulmonar y expresión de m¡R-34a, por ejemplo, 28 días después del inicio de la lesión con BLM. La contribución de la interrelación p53-sistema de uPA se confirma exponiendo ratones WT y deficientes en p53, uPA, uPAr y PAI-1 a BLM durante 14-21 d para inducir fibrosis pulmonar, alterar la expresión de m¡R-34a en fibroblastos como se ha descrito anteriormente, y ensayar los efectos sobre fibrosis, por ejemplo, el día 28 después de la lesión con BLM.
C. El restablecimiento de la expresión de p53 y posterior interrelación p53-sistema fibrinolítico de uPA por nutlina-3a 0 CSP-4 inhibe fibrosis pulmonar
La contribución de la interrelación p53-sistema fibrinolítico de uPA en la mitigación de fibrosis pulmonar por nutlina-3a y CSP-4 en ratones se confirma aislando fibroblastos de estos ratones, por ejemplo, 28 d después de la lesión por BLM. Estas células se ensayan para cambios en la expresión de p53, uPA, uPa R y PAI-1 y producción de MEC. Se espera encontrar que fibroblastos FL aislados de los pulmones de ratones con lesión por BLM mostrarán uPA y uPAR, viabilidad y producción de MEC elevados. Estos fibroblastos FL muestran expresión de p53 y PAI-1 mínima en comparación con fibroblastos NL de pulmones sin lesionar. Sin embargo, los fibroblastos de los pulmones de ratones con fibrosis inducida por BLM expuestos a nutlina-3a o CSP-4 muestran p53 elevada. Estas células son menos proliferativas con producción mínima de MEC. La expresión de uPA y uPAR se reduce mientras PAI-1 aumenta comparado con fibroblastos FL obtenidos de ratones lesionados con BLM. Los niveles de uPA, uPAR y PAI-1 en los fibroblastos pulmonares de ratones tratados con BLM nutlina-3a o BLM CSP-4 son comparables a fibroblastos NL aislados de ratones sin lesionar.
Para confirmar la implicación de la interrelación p53-sistema de uPA, fibroblastos FL extraídos de pulmones de ratones lesionados con BLM se transducen con Ad-p53. Los fibroblastos de pulmones lesionados con BLM expuestos a nutlina-3a o CSP-4 son controles positivos mientras que los expuestos a CP o Ad-EV son controles negativos. Las células se ensayan para cambios en uPA, uPAR y PAI-1.
La transducción de Ad-p53 o el tratamiento con nutlina-3a o CSP-4 aumenta la expresión de PAI-1 e inhibe la de uPA y uPAR. Estas células suprimen la producción de MEC y una velocidad de proliferación comparada con fibroblastos FL expuestos a CP o Ad-Ev. Los fibroblastos FL de ratones BLM expresan niveles marcadamente bajos de caveolina-1 y la expresión de caveolina-1 mitiga el exceso de producción de MEC. Por tanto, los fibroblastos Fl se transducen con Ad-Cav-1 para ver si p53 y cambios posteriores mediados por p53 en el sistema fibrinolítico de uPA, MEC y viabilidad celular se reducen comparado con los tratados con Ad-Ev.
D. Papel de nutlina-3a o CSP-4 en la inhibición de la fosforilación de Akt en mitigación de fibrosis pulmonar
Los fibroblastos FL muestran elevada fosforilación de Akt y expresión de PDGFR-p que proporciona señales de supervivencia (Stambolic V et al. Mol Cell 8:317-25, 2001; L¡ J et al. J Environ Pathol ToxícoI Oncol 23:253-66, 2004; Hoyle GW et al. Am J Pathol 154:1763-75, 1999; Meinecke AK et al. Blood 14:119 :5931-42, 2012) Además, p53 aumenta la expresión de PTEN (Stambolic et al., supra; Mayo LD, et al. J Blot Chem 277:5484-89, 2002) e inhibe PDGFR-p (Widau RC et al., Mol Cell Biol 32:4270-82, 2012; Thornton JD et al., Cell Cycle 4:1316-9, 2005) mientras PAI-1 inhibe la fosforilación de Akt (Shetty SK et al., 2012, supra; Stambolic et al., supra, Malinowsky K et al. Transí Oncol 5:98-104, 2012). La transducción de fibroblastos FL con Ad-Cav-1 inhibe la fosforilación de Akt a través de actividad PTEN aumentada (Tourkina E et al. Open Rheumatol J. 6:116-22, 2012; Wang XM et al. J Exp Med 203:2895-906, 2006; Xia H et al. Am J Pathol 176:2626-37, 2010).

Claims (8)

r e iv in d ic a c io n e s
1. Una composición farmacéutica para uso en el tratamiento de una afección fibrótica, la composición comprende:
(a) un péptido o polipéptido administrable que consiste en la secuencia FTTFTVT (SEQ ID NO: 1) y, opcionalmente, en donde el péptido o polipéptido administrable está unido a, o está asociado con, una secuencia de internalización; y
(b) un soporte o excipiente farmacéuticamente aceptable.
2. La composición para uso de la reivindicación 1, formulada para inyección o instilación pulmonar.
3. La composición para uso de la reivindicación 1, formulada para instilación pulmonar.
4. La composición para uso de la reivindicación 1, en donde el péptido o polipéptido administrable que consiste en la secuencia Ft TFTVT (SEQ ID NO: 1) está unido a, o está asociado con una secuencia de internalización.
5. La composición para uso de la reivindicación 1, en donde la afección fibrótica comprende fibrosis pulmonar.
6. La composición para uso de la reivindicación 1, en donde la afección fibrótica comprende fibrosis pulmonar idiopática.
7. La composición para uso de la reivindicación 1, en donde el péptido o polipéptido administrable está compuesto de L-aminoácidos.
8. La composición para uso de la reivindicación 1, en donde el péptido o polipéptido administrable está protegido en sus extremos N y C.
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