BR112015023287B1 - Uso de uma composição na fabricação de um medicamento para o tratamento de fibrose - Google Patents

Abstract

USO DE UMA COMPOSIÇÃO NA FABRICAÇÃO DE UM MEDICAMENTO PARA O TRATA-MENTO DE FIBROSE Em fibroblastos pulmonares fibróticos, níveis basais de proteína p53 (e miR-34a) são marcada-mente suprimidos, o que leva à redução da inibição mediada por p53 de uPA e uPAR, ou indução concomitante de PAI-1. Estas alterações contribuem para a proliferação excessiva de FL-fibro-blastos e produção de matriz extracelular (ECM), e, por conseguinte, a fibrose pulmonar. Estes processos são revertidos pelo tratamento das células, e o tratamento de sujeitos que sofrem de fibrose pulmonar idiopática (IPF), com a pequena molécula orgânica nutlina-3a (NTL) ou com um peptídeo, CSP-4 (SEQ ID NO: 1), ou variantes ou derivados ou multímeros deste peptídeo, o que aumenta os níveis de p53 por inibição da degradação mediada por MDM2 da proteína p53. A uti-lização destes compostos serve como uma nova abordagem para o tratamento de IPF, conforme restauram a expressão de p53 e alterações mediadas por p53 no sistema uPA-fibrinolítico em FL-fibroblastos e restringem a produção e deposição de ECM.

Description

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO Campo da Invenção

[1] A presente invenção no campo da bioquímica e medicina é dirigida aos métodos e composições para aumentar os níveis de proteína p53, reduzindo uPA e uPAR e aumentar a expressão de PAI-1, em fibroblastos de pulmão fibrótico (FL) e reduzindo a sua proliferação, e para o tratamento de fibrose pulmonar idiopática (IPF) usando nutlin-3a e peptídeos.

Descrição da Técnica Anterior

[2] Fibrose pulmonar idiopática (IPF) é uma doença pulmonar progressiva e fatal mal entendida para a qual não existe um tratamento diferente do transplante pulmonar (Mason DP et al, Ann Thorac Surg 84: 1121-8, 2007). A sobrevivência média de cinco anos após o diagnóstico é menos do que 20%. A maioria das formas de doenças pulmonares intersticiais e outras formas de fibrose pulmonar é caracterizada por lesões fibróticas, ocorre distorção progressiva da arquitetura alveolar e substituição com tecidos fibróticos ou cicatriciais com excesso de deposição de matriz extracelular (ECM) (American Thoracic Society, Am J Respir Crit Care Med 161: 646-664, 2000; Noble PW et al, Clin Chest Med 25: 749-758, 2004; Selman M et al, Ann Intern Med 134: 136-151, 2001). Isto resulta em dispneia progressiva e perda de função pulmonar. Uma lesão morfológica marcante é heterogeneidade espacial e temporal incorporando áreas de pulmão normal sendo diretamente adjacente às áreas de fibrose plenamente estabelecida, faveolamento microscópico, e áreas de fibrose evoluindo contendo fibroblastos/miofibroblastos ativamente se proliferando e produtores de colágeno, os chamados “focos fibróticos”.

[3] IPF é a doença pulmonar intersticial crônica, progressiva e fatal mais comum de etiologia desconhecida com uma incidência estimada de 40-50 casos por 100.000 individuos nos Estados Unidos. Aumento de viabilidade, ativação, produção de fibroblastos pulmonares fibróticos ("EL") (ou miofibroblastos)) e deposição de ECM tipificam pulmões IPF (Selman M et al, Expert Opin Emerg Drugs 16: 341-62, 2011; Shetty, S et al. Am J Respir Cell Mol Biol 75: 78-87, 1996; Zhu S et al, Am J Physiol: Lung Cell Mol Physiol 297: L97-108, 2009; Suganuma H et al, Thorax 50: 984-9,1995; American Thoracic Society, supra; Noble PW et al, supra)

[4] Trabalhos anteriores pelos presentes inventores (e outros) mostraram que os fibroblastos pulmonares incluindo FL- fibroblastos dos pulmões dos pacientes com FPI expressam ativador do plasminogênio tipo uroquinase (uPA), receptor de uPA, (uPAR) e inibidor de ativador do plasminogênio 1 (PAI-1) (Shetty et al, 1996, supra; Shetty S e Idell S. Am J Physiol 274: L871-L882, 1998; Chang W et al, J Biol Chem 285: 8196-206, 2010) . uPA é mitogênica para ambos pulmão normal (NL) e FL- fibroblastos, e o processo envolve a ligação de uPAR para uPA através do dominio de fator de crescimento de uPA (Tkachuk V et al, Clin Exp Pharmacol Physiol 23: 759-65, 1996; Padró T et al, J Cell Sei 115: 1961-71, 2002; Shetty S et al, Am J Physiol 268: L972-L982, 1995; Shetty S et al, Antisense Res Dev 5: 307-314, 1995) . Além disso, uPA aumenta a expressão de uPAR (Shetty S et al, J Biol Chem 276: 24549-56, 2001; Shetty S et al, Am J Respir Cell Mol Biol 30: 69-75, 2004). Vários anos atrás, os presentes inventores relataram que FL-fibroblastos de pulmão IPF expressam significativamente mais uPA e uPAR, e mostram uma maior taxa de proliferação basal e mediada por uPA que os NL-fibroblastos (Shetty et al, 1996, supra; 1998, supra) . Outros grupos confirmaram que o aumento da expressão de uPAR por FL- fibroblastos de pacientes com FPI contribui para o comportamento migratório (Mace KA et al, J Cell Sei 118: 2567-77, 2005; Basire A et al, Thromb Haemost 95: 678 -88, 2006; Zhu, S. et al, 2009, supra

[5] Estudos do presente invenção e seus colegas descobriram que uPA regula a apoptose/sobrevivência de células epiteliais através da regulação de p53 (Shetty S et al, 2005, supra) , que controla a expressão reciproca de uPA (Shetty P et al, Am J Resp Cell Mol Biol, 39: 364-72, 2008), o seu receptor uPAR (Shetty S et al Mol Cell Biol. 27: 5607-18, 2007) e seu principal inibidor PAI-1 (Shetty S et al J Biol Chem 283: 19570-80, 2008) ao nivel pós-transcricional e envolve uma nova interação de sinalização de superficie celular entre uPA, uPAR, caveolina-1 ("Cav-1") e βl-integrina (Shetty S et al, 2005, supra). Com base na apreciação do exposto, os presentes inventores conceberam novas composições e métodos para o tratamento da ALI e suas consequentes reações de remodelação.

[6] Durante fibrose pulmonar (cujo termo é usado de modo intercambiável com fibrose "pulmonar"), a expressão do fator de transcrição de p53, conhecida principalmente como uma proteina supressora de tumor, é severamente reprimida em fibroblastos fibróticos que por sua vez induz a expressão de uPA e uPAR, enquanto expressão de PAI-1 é inibida significativamente. A supressão da expressão de PAI-1 e a indução concomitante de expressão de uPA e uPAR, como consequência da inibição da expressão de p53 fibroblastos fibróticos provocam a proliferação de fibroblastos e a deposição de ECM, ou seja, fibrose. O aumento da interação de mdm2 com p53 e subsequente ubiquitinação mediada por mdm2 de p53 contribui para a inibição de p53 em fibroblastos fibróticos.

[7] A relação reciproca entre as atividades de p53 e NF-KB foi demonstrada em células cancerígenas, mas há poucas informações sobre as interações entre p53 e NF-KB em processos inflamatórios. Liu G et al. (J Immunol 182: 5063-71 (2009))verificaram que os neutrófilos e macrófagos sem p53 (p53(’/_> têm maiores respostas ao estimulo com lipopolissacarideo bacteriano (LPS) do que células p53<+/+>, e que produzem maiores quantidades de citocinas pró-inflamatórias, incluindo TNF-α, IL-6, e de MIP- 2, e demonstram atividade aumentada de ligação de DNA a NF-KB. Camundongos p53(”/-)são mais suscetíveis do que camundongos p53(+/+) para lesão pulmonar aguda induzida por LPS (ALI). A resposta aumentada de células p53(-/‘) a LPS não envolve alterações em eventos de sinalização intracelular associados com o envolvimento do acoplamento do receptor TLR4 tipo Toll (por exemplo, a ativação de MAP quinases, fosforilação de IKB-OÍ OU a subunidade p65 de NF- KB, OU a degradação de IKB-O. Cultura de neutrófilos estimulados por LPS e macrófagos com nutlina-3a, atividade de ligação ao DNA de NF-KB atenuada e a produção de citocinas pró-inflamatórias. O tratamento de camundongos com nutlina-3a reduziu a gravidade de ALI induzida por LPS. Os autores concluiram que a p53 regula a atividade de NF-KB em células inflamatórias e sugeriu que a modulação de p53 pode ter potenciais benefícios terapêuticos em condições inflamatórias agudas, como ALI.

Nutlina (ou nutlina-3a) (abreviada NTL)

[8] A estrutura quimica da molécula orgânica 4-2-4,5-di- hidro-lH-imidazol-l-piperazin-2-ona (C30H30CI2N4O4) também denominada nutlina ou nutlina-3a é mostrada abaixo

[9] NTL é um antagonista de MDM2, que é um ativador de p53 e um indutor de apoptose. MDM2 funciona através da ligação de proteina supressora de tumores p53 e regula negativamente a sua atividade de transcrição e a estabilidade. A inibição da interação MDM-p53 resulta na estabilização de p53, a parada do ciclo celular e apoptose. Nutlina-3 demonstrou potencial como um tratamento do câncer através da ativação da via da p53 em células de câncer. (Tovar, C. et al, Proc Natl Acad Sei USA 103: 1888-1893 (2006); Vassilev, L.T. et al, Science 303 844-848 (2004); El-Deiry, W.S. Cancer J 11: 229-236 ( 1998)).

[10] Patente US 7.893.278 (Haley et al.) descreve nutlina-3 quiral genericamente e especificamente. Patente US 6.734.302 descreve nutlina-3 racêmica. A patente '278 ensina um composto de fórmula

[11] Ambas as patentes acima discutem utilizações como inibidores da interação de proteinas Mdm2-p53 e no tratamento do câncer.

[12] Publicação de Patente US 2011/0301142 (Hutchinson et al.) ensina um método para tratar a fibrose pulmonar idiopática, num mamifero compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista do receptor LPA1 ao mamifero. O antagonista pode ser determinados derivados de imidazol, mas não compostos do tipo imidazolina como NTL.

[13] Patente US 6.596.744 (Wagle et al.) descreve um método de tratamento ou melhoramento de determinadas doenças fibróticas com compostos heterociclicos, todos os quais são claramente distintos de NTL. As doenças descritas incluem doenças pulmonares fibróticas que têm como uma manifestação a hipertrofia fibrótica ou fibrose do tecido pulmonar. Estas doenças incluem fibrose pulmonar (ou doença intersticial pulmonar ou fibrose pulmonar intersticial), fibrose pulmonar idiopática, elemento fibrótico de pneumoconiose, sarcoidose pulmonar, alveolite fibrosante, elemento fibróticos ou hipertrófico de fibrose cistica, doença pulmonar obstrutiva crônica, sindrome de dificuldade respiratória do adulto e enfisema.

[14] Dey et al. em Cell Cycle 6: 2178-85 (2007) descreve que nutlinas foram identificadas como os primeiros antagonistas Mdm2 potentes e específicos de moléculas pequenas que inibem a interação da p53-MDM2.

[15] Nenhum dos documentos anteriores descreve o tratamento de IPF com nutlina-3a.

Peptideos derivados de Caveolina-1

[16] Os presentes inventores descobriram que um peptideo de 20 residues DGIWKASFTTFTVTKYWFYR, SEQ ID NO: 2), que é o dominio estrutural de caveolina-1 (Cav-1; SEQ ID NO: 3, mostrada abaixo) protegeu células epiteliais de pulmão (LECs) de apoptose induzida por bleomicina ("BLM") in vitro e in vivo e impediu a fibrose pulmonar subsequente por meio da atenuação da lesão do epitélio pulmonar (Shetty et al, pedido de Patente US permitido 12/398.757 publicado como US 2009-0227515A1 (10 de setembro de 2009) que é aqui incorporado por referência na sua totalidade. Os presentes inventores também um peptideo de 17 residues NYHYLESSMTALYTLGH (SEQ ID NO: 4), designado PP-2, que também protegeu LECs de apoptose induzida por BLM in vitro e in vivo e preveniu fibrose pulmonar subsequente por meio da atenuação da lesão do epitélio pulmonar.

[17] Shetty et al, 2009 (supra) também descrevem a substituição biologicamente ativa, além de variantes de deleção destes peptideos, bem como multimeros de peptideos e polipeptideos que compreendem os peptideos administráveis acima, e composições farmacêuticas compreendendo os peptideos anteriores, variantes e multimeros. Essas composições inibem a apoptose de células epiteliais pulmonares lesadas ou danificadas e o tratamento de lesão pulmonar aguda e fibrose pulmonar/IPF consequente.

[18] O documento anterior não identifica um fragmento particular de CSP (descrito abaixo como parte da presente invenção) denominado CSP-4, que tem a sequência FTTFTVT (SEQ ID NO: 1) e que tem a atividade biológica de CSP e constitui parte do objeto da presente invenção.

[19] Em vista do prognóstico fraco e falta de abordagens terapêuticas para IPF, há uma necessidade urgente de novas intervenções para reverter ou pelo menos retardar a progressão da doença. Esta lacuna terapêutica critica é dirigida pela presente invenção.

[20] A presente invenção constitui e é extensão dos resultados dos achados anteriores (S. Shetty et al, 2001, 2008 e 2009, supra). Como descrito nas seções abaixo, a p53 regula a expressão de uPA, uPAR e PAI-1 0 processo envolve o controle mediado por MDM2 da expressão da proteina p53 ao nivel de pós- tradução, sem afetar o mRNA de p53. Estas observações demonstram uma relação causal entre a expressão de p53 e o sistema fibrinolitico de uPA de reparação fibrótica.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[21] A inibição da interação da proteina p53 com MDM2 usando NTL aumenta p53 e PAI-1, enquanto inibe uPA e uPAR. Estas modificações resultam em apoptose de fibroblastos fibróticos e inibição da proliferação de fibroblastos fibróticas isolados dos pulmões de pacientes com IPF, bem como a partir dos pulmões de camundongos com fibrose pulmonar acelerada induzida por BLM.

[22] De acordo com a presente invenção, a NTL inibe fibrose pulmonar progressiva e estabelecida por indução ou aumento de expressão da p53 em fibroblastos fibróticos. Portanto, este composto é útil para o tratamento de fibrose pulmonar num sujeito com essa necessidade.

[23] Os presentes inventores conceberam que controle mediada por p53 interrompido do sistema f ibrinolitico de uPA em FL- fibroblastos é uma base para a terapia alvo do IPF. Em FL- fibroblastos, a expressão basal de p53 e microARN-34a (miR-34a) são marcadamente suprimidas, enquanto os niveis de proteinas de ECM como o colágeno-I (Col-I) e a-actina de músculo liso (ot-SMA) são aumentadas. Tratamento de FL-fibroblastos com o composto inibidor de mdm2 nutlina-3a ou CSP-4 aumenta a expressão de p53 e PAI-1 com uma inibição reciproca de uPA e uPAR. 0 tratamento dos FL-fibroblastos com nutlina-3a ou CSP-4 inibe também a produção de ECM. Estes resultados preliminares e as publicações recentes dos presentes inventores e colegas justificam uma abordagem intervencionista para restaurar cross-talk entre o p53 e o sistema fibrinolitico de uPA que é de outra forma distorcida em FL-fibroblastos levando a fibrose pulmonar. p53 tem efeitos pleiotrópicos que vão além do controle do sistema fibrinolitico de uPA2. No entanto, o PAI-1 é o efetor a jusante de p53 em fibroblastos e outras células.

[24] Importante, a restauração de p53 em fibroblastos FL- modula a expressão de uPA, uPAR e PAI-1, a viabilidade celular e a produção de ECM. A abordagem direcionada para o sistema fibrinolitico p53-uPA em FL-fibroblastos é ilustrada na Fig. 1. p53 induz transcrição de miR-34a enquanto miR-34a aumenta acetilação de p53 através da inibição de histona deacetilase sirtuinl (SIRT1). Isto leva a estabilização da proteina p53, devido à inibição da sua degradação mediada por mdm2. No entanto, em FL-fibroblastos, os niveis basais de proteina p53 e miR-34a são marcadamente suprimidos, devido a um aumento da ubiquitinação de proteina p53 por mdm2 como uma consequência da baixa expressão basal de caveolina-1. Isto conduz a uma redução da inibição mediada por p53 de uPA e uPAR, ou indução concomitante de PAI-1. Estas alterações contribuem para a proliferação excessiva de FL-fibroblastos e produção de ECM e são revertidas por CSP-4 e nutlina-3a. CSP-4 e nutlina-3a aumentam os niveis de p53 por inibir a degradação mediada por mdm2 da proteina p53. Restauração da expressão de p53 e alterações mediadas por p53 no sistema fibrinolitico-uPA em FL- 10/71 fibroblastos leva à atenuação da viabilidade, e restringe a produção e deposição de ECM. A fibrose é inibida em camundongos desafiados por BLM com fibrose pulmonar estabelecida através do restabelecimento dos niveis de p53 em FL-fibroblastos que, por sua vez suprime os sinais de proliferação do uPA e uPAR, enquanto induzindo o sinal pró-apoptótico para as células; PAI- 1.

[25] Os inventores mostram, pela primeira vez, que alterações mediadas por p53 do sistema fibrinolitico-uPA regulam a resposta pró-fibrótica de fibroblastos pulmonares que são centrais para a patogênese da fibrose pulmonar e que esta via pode ser alvo de beneficio terapêutico. Ao contrário NL- fibroblastos de pulmões histologicamente "normais", FL- fibroblastos, incluindo fibroblastos/miofibroblastos de tecidos pulmonares fibróticas, expressam niveis muito baixos de p53 basal, miR-34a e caveolina-1, enquanto expressões de uPA e uPAR são elevadas. Tratamento de FL-fibroblastos com CSP-4, ou o composto de baixo peso molecular nutlina-3a restauram expressão de p53 e miR-34a, e induzem PAI-1. Estas alterações suprimem a expressão de uPA e uPAR e inibem a deposição de ECM. Estes agentes também revertem a fibrose pulmonar induzida por BLM e protegem o epitélio pulmonar, que também demonstra o cross-talk entre p53 e regulação do sistema fibrinolitico. Portanto, mitigação de fibrose pulmonar mediada por CSP-4 ou mediada por nutlina-3a representam novas abordagens terapêuticas.

[26] Atualmente, não há tratamento eficaz para reverter a fibrose pulmonar. A presente invenção aborda esta lacuna importante e proporciona novos compostos e métodos para o direcionamento de FL-fibroblastos e cross-talk entre p53 e o sistema fibrinolitico de uPA para tratar eficazmente a doença pulmonar fibrótica.

[27] A presente invenção também é dirigida a composições do objeto. Numa modalidade, a composição é um composto peptidico que aumenta os niveis de proteina p53, reduz uPA e aumenta a expressão de PAI-1 em FL-fibroblastos, de preferência selecionados do grupo que consiste em: (a) um peptideo designado CSP-4 cuja sequência é FTTFTVT (SEQ ID NO: 1) ; (b) uma variante de adição do Peptideo de CSP-4 até cerca de 20 aminoácidos de comprimento e que não o dominio estrutural (CSP) de caveolina-1 (Cav-1) possuindo a sequência de SEQ ID NO: 3; (c) um derivado quimico modificado covalentemente do peptideo de CSP-4 (a), (d) um derivado quimico covalentemente modificado da variante de (b), cuja variante ou derivado quimico tem, pelo menos, 20% da atividade biológica ou bioquímica do peptideo de CSP-4 num ensaio in vitro ou in vivo. 0 peptideo variante, derivado quimico ou multimero descrito acima ou abaixo de um modo preferencial tem a seguinte atividade relativamente à atividade de CSP-4: pelo menos cerca de 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, cerca de 95%, 97%, 99%, e qualquer faixa entre estes, como, por exemplo, desde cerca de 70% a cerca de 80%, e mais preferencialmente de cerca de 81% a cerca de 90%; ou ainda mais preferencialmente, desde cerca de 91% a cerca de 99%. O derivado quimico variante ou multimero de peptideo pode ter 100% ou mais do que 100% da atividade do CSP-4. Esta atividade relativa pode ser baseada em qualquer método aqui descrito ou conhecido na técnica para avaliar essa atividade.

[28] Um composto preferencial é o heptapeptideo desiqnado CSP-4, FTTFTVT (SEQ ID NO: 1).

[29] Um peptideo multimero preferencial compreende pelo menos dois monômeros, cada monômero sendo o peptideo CSP-4, a variante ou o derivado quimico, cujo multimero: (a) tem a fórmula geral P^ em que (i) P1 é o peptideo, variante ou derivado quimico, como acima, e (ii) n = 2-5, ou (b) tem a fórmula (P1-Xm)n-P2, em que (i) cada um de P1 e P2 é, independentemente, o peptideo, variante do derivado quimico como acima, (ii) cada um dos P1 e P2 é o mesmo ou diferente peptideo, variante ou derivado (iii) X é um grupo Ci-C5 alquil, Ci~C5 alquenil, C1-C5 alquinil, C1-C5 poliéter contendo até 4 átomos de oxigênio; (iv) m = 0 ou 1; e (v) n = 1-7, (c) tem a fórmula (P1-Glyz) n~P2 , em que: (i) cada um de P1 e P2 é, independentemente, o peptideo, variante ou derivado, (ii) cada um dos P1 e P2 é o mesmo ou diferente peptideo ou variante ou derivado; (iii) z = 0-6; e (iv) n = 1-25, em que o multimero de peptideo tem de preferência pelo menos 20% da atividade biológica do peptideo de CSP-4 em um ensaio in vitro ou in vivo.

[30] Numa outra modalidade, a presente invenção é dirigida a um peptideo liberável, ou composição de polipeptideo ou peptideo multimero compreendendo: (a) o peptideo acima, variante, derivado, polipeptideo, ou multimero, e (b) uma liberação ou molécula de translocação ou fração a esta ligada ou associada ou misturada com a mesma.

[31] Moléculas de translocação ou frações preferenciais são descritas abaixo.

[32] É também proporcionado uma composição farmacêutica antifibrótica compreendendo: (a) um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável e, (b) como o ingrediente ativo, o peptideo acima, peptideo variante, derivado quimico, polipeptideo ou peptideo multimero, opcionalmente em combinação com uma composição farmacêutica compreendendo nutlina-3a (NTL) ou um análogo quiral cis- imidazolina de NTL que inibe a interação de MDM2-p53, cujo análogo de NTL tem, pelo menos, 20% da atividade biológica ou bioquímica de NTL em um ensaio in vitro ou in vivo;

[33] Mais preferencial é a composição farmacêutica relacionada com peptideo acima formulada para injeção ou instilação pulmonar, enquanto que o NTL ou análogo de NTL opcionalmente combinado é de preferência formulado para administração oral ou injeção.

[34] A presente invenção é dirigida a um método para aumentar os niveis de proteina p53, reduzindo uPA e uPAR e aumentar a expressão de PAI-1 em fibroblastos fibróticos pulmonares (FL), que compreende proporcionar aos FL fibroblastos uma quantidade eficaz de um composto que inibe a interação de MDM2 com proteina p53 e degradação mediada por MDM2 da p53, em que o composto é: (a) NTL ou um análogo quiral cis-imidazolina de NTL que inibe a interação de MDM2-p53; (b) urn peptideo selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) CSP-4, a sequência do qual é FTTFTVT (SEQ ID NO: 1); (ii) uma variante de adição do peptideo de CSP-4 cuja variante de adição não excede 20 aminoácidos de comprimento; (iii) um derivado quimico covalentemente modificado do peptideo de CSP-4, ou (c) um multimero de peptideo que compreende pelo menos dois monômeros cada monômero sendo o peptideo CSP-4, a variante ou o derivado quimico de (b), ou (d) uma combinação de qualquer um de (a) - (c) em que o análogo NTL, o peptideo variante, o derivado quimico do peptideo ou multimero de peptideo tem pelo menos 20% da atividade biológica ou bioquimica de NTL ou o peptideo de CSP-4 em um ensaio in vitro ou in vivo.

[35] O análogo NTL descrito acima ou abaixo de um modo preferencial tem a seguinte atividade relativamente à atividade de NTL: pelo menos cerca de 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, cerca de 95%, 97%, 99%, e qualquer faixa entre estes, como, por exemplo, desde cerca de 70% a cerca de 80%, e mais preferencialmente de cerca de 81% a cerca de 90%; ou ainda mais preferencialmente, desde cerca de 91% a cerca de 99%. O análogo de NTL pode ter 100% ou mais do que 100% da atividade de NTL. Esta atividade relativa pode ser baseada em qualquer método aqui descrito ou conhecido na técnica para avaliar essa atividade.

[36] Na modalidade preferencial do método acima, o composto no método acima é NTL. Numa outra modalidade, o composto é o peptideo de CSP-4 SEQ ID NO: 1. Numa outra modalidade do método, o composto é o multimero de peptideo, de preferência um que compreende monômeros do peptideo CSP-4 (SEQ ID NO: 1).

[37] De preferência, quando o método acima usa um multimero de peptideo: (a) o multimero de peptideo tem a fórmula geral P1n em que (i) P1 é o peptideo, variante ou derivado quimico, e (ii) n = 2-5, ou (b) o peptideo multimero tem a fórmula (P1-Xra)n_P2 , em que (i) cada um de P1 e P2 é, independentemente, o peptideo, variante ou derivado quimico; (ii) cada um dos P1 e P2 é o mesmo ou diferente peptideo, variante ou derivado; (iii) X é um grupo C1-C5 alquil, C1-C5 alquenil, C1-C5 alquinil, C1-C5 poliéter contendo até 4 átomos de oxigênio; (iv) m = 0 ou 1; e (v) n = 1-7, ou (c) o peptideo multimero tem a fórmula (P1-Glyz) n-P2 , em que: (i) cada um de P1 e P2 é, independentemente, o peptideo, variante ou derivado, (ii) cada um dos P1 e P2 é o mesmo ou diferente peptideo ou variante ou derivado; (iii) z = 0-6; e (iv) n = 1-25,

[38] Preferencialmente, o multimero possui pelo menos 20% da atividade biológica do peptideo de CSP-4 em um ensaio in vitro ou in vivo.

[39] É também proporcionado um método para tratamento de um sujeito mamifero, preferencialmente um ser humano, que tem uma doença ou condição caracterizada por fibrose pulmonar (ou seja, IPF) , compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de um composto ou composição que, através da inibição da degradação mediada por MDM2 da proteina p53, aumenta os niveis de proteina p53, reduz os niveis de uPA e uPAR e aumenta a expressão de PAI-1 em FL fibroblastos. Numa modalidade preferencial deste método, o composto ou composição é (a) nutlina-3a (NTL) ou um análogo quiral cis-imidazolina do mesmo que inibe a interação de MDM2-p53; (b) um peptideo selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) CSP-4, a sequência do qual é FTTFTVT (SEQ ID NO: 1), a modalidade de peptideo mais preferencial; (ii) uma variante de adição do peptideo de CSP-4 variante de adição não excede 20 aminoácidos de comprimento; (iii) um derivado quimico covalentemente modificado do peptideo CSP-4, ou (c) multimero de peptideo que compreende pelo menos dois monômeros sendo cada monômero o peptideo CSP-4, a variante ou o derivado quimico de (b) , mais preferencialmente, um multimero de CSP- 4, (d) a composição de peptideo liberável ou polipeptideo ou peptideo multimero, ou (e) uma combinação de qualquer um de (a) a (d), em que o análogo NTL, ou o peptideo variante, o derivado de peptideo ou o peptideo multimero possui pelo menos 20% da atividade biológica ou bioquimica de NTL ou o peptideo CSP-4, respectivamente, em um ensaio in vitro ou in vivo.

[40] Neste método, o composto é preferencialmente em uma composição farmacêutica que compreende adicionalmente um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. O composto pode ser um sal farmaceuticamente aceitável NTL, análogo de NTL ou composto de peptideo. Numa modalidade preferencial do método, o composto é NTL. Numa outra modalidade do presente método, o composto é o multimero de peptideo, mais preferencialmente um multimero compreendendo monômeros do CSP-4 FTTFTVT peptideo (SEQ ID NO: 1).

[41] A presente invenção é também dirigida para a utilização de NTL, o análogo NTL acima, o peptideo, variante, derivado quimico ou multimero acima para (a) aumentar os niveis de proteina p53, reduzindo uPA e aumentando a expressão de PAI-1 em FL fibroblastos, ou (b) tratamento de uma doença ou condição caracterizada como fibrose pulmonar.

[42] Também é proporcionada a utilização de NTL, o análogo NTL acima, o peptideo acima, variante, derivado quimico ou multimero de peptideo como aqui definido para a fabricação de um medicamento para utilização no tratamento de um paciente portador de uma doença ou condição caracterizada como fibrose pulmonar.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[43] A Figura 1 é uma ilustração esquemática que mostra que a baixa expressão basal de p53 e controle mediado por p53 fora de faixa do sistema fibrinolitico de uPA em fibroblastos pulmonares fibróticos (FL) leva à fibrogênese. Os mecanismos de ação e vias envolvidos na IPF e no seu tratamento pelos métodos e composições da presente invenção são descritos.

[44] Figuras 2A-2I. Focos de fibrose nos pulmões IPF demonstram expressão da p53em FL-fibroblastos mortos. As seções de pulmão de pacientes com IPF e sujeitos "normais" de controle foram coradas para H&E (Fig. 2A) , vimentina (Fig. 2B) , tricrômico (Fig. 2C) , p53 (Fig. 2D), PAI-1 (Fig. 2E) , Ki-67 (Fig. 2F) , imunofluorescência para o PAI-1 e SP-C (Fig. 2G) ou p53 e SP-C (Fig. 2H) , ou p53 e PAI-1 (Fig. 21). Um exemplo representativo é mostrado (n = 5 amostras de pulmão IPF).

[45] Figuras 3A-3B. Caveolina-1, p53 e PAI são diminuídos e uPA é aumentada em fibroblastos FL humanos (IPF) de pulmão IPF estão associados com o aumento da col-I e inibição de miR-34a. (Fig. 3A) Os lisados celulares de pulmão normal (NL) e FL- fibroblastos foram coradas imunologicamente para alterações nas proteínas. A figura ilustra os resultados tipicos de NL- fibroblastos (n = 10 linhagens celulares) e FL-fibroblastos (n = 18 linhagens celulares). (Fig. 3B) RNA total de fibroblastos NL- (n = 3) e FL-(n = 4) foi testado para a expressão de miR-34a por PCR em tempo real. Northern blotting de RNA a partir de amostras representativas usando sonda antissenso marcada com P para miR- 34a e o snRNA de controle de carga (U6) são apresentados na parte inferior da barra.

[46] Figuras 4A-4B. Expressão disparate de mRNAs de uPA, uPAR e PAI-1 por fibroblastos de pulmões IPF e "normais". O RNA total isolado a partir de tecidos de pulmão de sujeitos "normais" e pacientes com IPF (Fig. 4A) ou a partir de NL- (n = 6) e FL-fibroblastos (n = 8) (Fig. 4B) foram testados para mRNA de uPA, PAI-1 e col-I por PCR quantitativo em tempo real ( (RT- PCR) e normalizado para os niveis correspondentes de mRNA β- actina.

[47] Figuras 5A-5D. A expressão diferencial do uPA e PAI-1 por fibroblastos NL- versus FL- de camundongos. FL-fibroblastos isolados dos pulmões de camundongos 21 dias após a lesão BLM ou NL-fibroblastos de camundongos de controle expostos a solução salina intranasal, conforme descrito em outro local (Bandhary et al, 2012, supra) . Os lisados de fibroblastos NL- e FL foram imunotransferidos para alterações na expressão de p53, de proteinas uPA, PAI-1 e col-I (Fig. 5A) . O RNA total extraido de tecidos de pulmão do camundongo (Fig. 5B) ou a partir de isolado fibroblastos NL- e FL-(n = 6) (Fig. 5C) a partir dos tecidos pulmonares de camundongos com fibrose induzida por BLM ou camundongos de controle (salina) foram testados para mRNA de uPA, PAI-1 e de colágeno-I (Col-I) por PCR quantitativo em tempo real. Fibroblastos NL- e FL- de camundongos foram cultivados em placas de 12 poços em meio DMEM. Depois de três dias os fibroblastos foram contados para determinar a taxa de proliferação (Fig. 5D) .

[48] Figuras 6A-6D. CSP (CSP4) aumenta a expressão da p53 através da indução de miR-34a em FL-fibroblastos (IPF). (Fig. 6A) Fibroblastos NL- e FL-(n = 3) foram tratados com PBS, CSP-4 (CSP) ou peptideo de controle (CP) . O RNA foi analisado para miR-34a por PCR em tempo real. (Fig. 6B) FL-fibroblastos foram tratados com PBS ou CSP ou CP com ou sem miR-34a antissenso (miR-34a-AS) ou pré-miR-34a ou miRNA de controle (Ctr-miR). Os meios condicionados (CM) foram imunotransferidos para PAI-1 e os lisados (CL) para p53 e β-actina. (Fig. 6C) FL-fibroblastos foram tratados com PBS ou CSP ou CP na presença ou ausência de miR-34a-AS, pré-miR-34a ou Ctr-miR. O RNA foi analisado para alterações em miR-34a por PCR em tempo real. (Figura 6D) . Uma série de deleções sobrepostas foi feita em CSP e estes peptideos foram utilizados para tratar com FL-fibroblastos. Mudanças na p53, uPA, PAI-1 e col-I foram posteriormente avaliadas para identificar os aminoácidos minimos exigidos para os efeitos de CSP.

[49] Figuras 7A-7B. O aumento da degradação mediada por mdm2 das proteinas p53 em FL-fibroblastos (IPF). (Fig. 7A) Lisados a partir de NL- e FL-fibroblastos (n = 3) foram imunomarcados para p53, mdm2 e β-actina. (Fig. 7B) Os lisados de NL- e FL- fibroblastos foram imunoprecipitados (IP) com anticorpo anti- mdm2 e imunotransferidos (IB) para a proteina p53 associada.

[50] Figuras 8A-8C. Papel do sistema cross-talk p53- fibrinolitico em nutlina-3a (NTL) ou inibição mediada por CSP-4 da expressão col-I em FL-fibroblastos (IPF). (Fig. 8A) FL- fibroblastos foram expostos a PBS, nutlina-3a (10 μM) , CSP-4 (10 nM) ou peptideo de controle (CP) , durante 48 h. Os lisados celulares foram imunotransferidos para a expressão de Col-I, PAI-1, p53, uPA e β-actina. (Fig. 8B) FL-fibroblastos cultivados em placas de 12 poços em meio DMEM foram expostos a veiculo (PBS) ou nutlina-3a, CSP-4 ou CP. Depois de 3 dias, as células foram desprendidas e contadas. (Fig. 8C) FL-fibroblastos foram transduzidos apenas com o vetor vazio de adenovirus (Ad-EV) ou Ad-vetor que expressa a p53 (Ad-p53), PAI-1 (Ad-PAI-1) ou caveolina-1 (Ad-Cav -1). Depois de 48h, os lisados celulares foram imunotransferidos para Col-I, p53, PAI-1, uPA e β-actina.

[51] Figuras 9A-9B. Papel do sistema cross-talk p53- fibrinolitico na indução da expressão de col-I em NL- fibroblastos. NL-fibroblastos isolados a partir de pulmões humanos histologicamente "normais" foram tratados com p53 shRNA no vetor lentiviral para inibir a expressão de p53 basal. As células de controle foram tratadas com shRNA não especifico (Ctr) . (Fig. 9A) : amostras de meio condicionado foram imunotransferidas para PAI-1, uPA, e col-I solúvel, enquanto os lisados de células foram testados para a p53, α-SMA e β-actina. (Fig. 8B) : 0 RNA total isolado a partir de NL-fibroblastos tratados com controle ou p53 shRNA foram analisados para alterações na expressão de uPA, PAI-1, col-I e mRNA β-actina por PCR quantitativo em tempo real.

[52] Figuras 10A-10D. Nutlina-3a (NTL) inibe a fibrose pulmonar, em camundongos tratados com BLM. Os camundongos foram expostos a BLM de 14 d para induzir a fibrose pulmonar. Camundongos tratados com salina foram usados como controles de fibrose. Após 14 d, os camundongos expostos a BLM foram injetados IV com qualquer veiculo ou nutlina-3a (10 mg/kg de peso corporal) (Zhang F. et al., Drug Metab Dispôs 39: 15-21, 2011) para determinar se nutlina-3a inibia fibrose pulmonar estabelecida. No dia 21 após a lesão BLM, os camundongos foram submetidos a tomografia computadorizada (CT) para avaliar a extensão de fibrose (Fig. 10A). Um exemplo representativo é mostrado (n = 9) . (Fig. 10B) Conformidade e resistência pulmonares foram medidas nos mesmos camundongos utilizando o sistema Flexivent para avaliar a melhoria da função pulmonar depois de tratamento com nutlina-3a (n = 9) . Seções pulmonares (Fig. 10C) foram submetidas a coloração com tricromo para avaliar a arquitetura pulmonar e deposição de colágeno, como uma indicação da fibrose pulmonar. (Fig. 10D) Homogeneizados de pulmão inteiros foram analisados para conteúdo de colágeno total (hidroxiprolina) e desmosina como uma avaliação independente das mudanças na ECM.

[53] Figuras 11A-11D. CSP-4 inibe a fibrose pulmonar estabelecida e melhora a função pulmonar. Os camundongos foram expostos a BLM para induzir a fibrose pulmonar. Após 14 dias, os camundongos foram injetados por via intravenosa com veiculo ou 1,5 mg/kg de peso corporal do CSP-4 ou peptideo de controle ("CP") da sequência misturada. Em 21 dias após a lesão BLM, os camundongos foram submetidos a varredura CT para avaliar inibição de CSP-4 de fibrose pulmonar estabelecida (Fig. 11 A). Um exemplo representativo é mostrado (n = 9). (Fig. 11B): volumes pulmonares foram medidos nos mesmos camundongos (n = 9) utilizando rendições quantitativas CT. (Figura 11C.): Seções de pulmão foram submetidas a tricromo e coloração de H&E (não mostrado) para avaliar a deposição de colágeno como um indicador da fibrose pulmonar. (Fig. 11D) Análise de homogeneizados de pulmão inteiro para o teor total de hidroxiprolina.

[54] Figuras 12A-12C. CSP-4 ou nutlina-3a (NTL) inibe a proliferação de FL-fibroblastos. Os camundongos foram expostos a BLM de 14 dias para induzir a fibrose pulmonar significativa ou a solução salina (controle de fibrose) . 14 dias depois, camundongos expostos a BLM foram tratados com CSP-4 ou CP, ou nutlina-3a (ver figuras 1OA0D/11A-D). (Fig. 12A): cortes de pulmão (21 dias após a lesão BLM) foram submetidos a imunohistoquimica (IHC) para Ki-67 para avaliar a proliferação. Um exemplo representativo é mostrado (n = 9) . Os fibroblastos foram isolados dos pulmões de camundongos expostos a solução salina, ou BLM BLM + nutlina-3a (como descrito na figura 11A) , foram testados para as alterações na expressão de col-I, e p53 do uPA à jusante e proteinas PAI-1 por transferência Western (Fig. 12B) : e mRNA por RT-PCR quantitativo (fig. 12C) .

[55] Figura 13. Inibição de fibrose pulmonar induzida por BLM por tratamento ex vivo de tecidos pulmonares de camundongos WT com CSP-4 ou nutlina-3a (NTL). Os camundongos foram expostos a BLM intranasal por 21 dias para induzir a fibrose pulmonar. Estes camundongos (n = 3) foram sacrificados, os pulmões foram excisados, cortados em pequenos pedaços e colocados em placas de cultura com meio DMEM contendo 10% de soro fetal bovino. As amostras de tecido foram depois tratadas com CSP-4 (10 nM) , peptideo de controle (CP) e nutlina-3a (NTL) (10 μM) por 72h. Meio condicionado e lisados de tecido foram preparados e analisados para mudanças em col-I, a-SMA e β-actina por Western blotting.

DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES PREFERENCIAIS

[56] Os presentes inventores descobriram que a expressão basal de proteínas "supressor de tumor", p53 e inibidor do ativador do plasminogênio-1 (PAI-1) são marcadamente reduzidas em FL-fibroblastos obtidos a partir dos pulmões de pacientes com IPF. Isto também é verdade para os camundongos com fibrose pulmonar acelerada induzida por BLM, um modelo aceite de IPF humano. p53 regula a expressão dos principais componentes do sistema uPA-fibrinolitico (uPA, uPAR e PAI-1). No entanto, tem sido pouco clara como as alterações nos niveis destas proteínas contribuem para a patogênese da fibrose pulmonar, e se a restauração do modo normal de cross-talk de p53-uPA sistema fibrinolitico atenua a fibrose pulmonar.

[57] De acordo com a presente invenção, o aumento de expressão de uPA e uPAR, e uma inibição concorrente de PAI-1, devido a uma falta de expressão de p53 em FL-fibroblastos são criticos para o desenvolvimento de fibrose pulmonar. A indução da expressão de p53, e recuperação do sistema de cross-talk de p53-uPA-fibrinolitico através da redução mediada por p53 de uPA, e um aumento concomitante na expressão de PAI-1 em FL- fibroblastos, atenua IPF e é a base para o tratamento desta doença com NTL.

[58] Ao contrário de fibroblastos de pulmão normal ("NL"), os fibroblastos obtidos a partir de pulmões de pacientes com fibrose pulmonar idiopática (''FL-f ibroblastos") ou a partir de camundongos com fibrose pulmonar induzida por BLM expressam p53 minima. Além disso, FL-fibroblastos produzem baixos niveis de PAI-1, enquanto que a expressão de uPA e uPAR é marcadamente elevada.

[59] A presente invenção tem como alvo todos os três componentes principais (uPA, uPAR e PAI-1) do sistema de uPA- fibrinolitico de forma global e coordenada. Simultaneamente direcionamento de todos os três principais componentes do sistema uPA-fibrinolitico através de restabelecimento da expressão de p53 em FL-fibroblastos atenua a fibrose.

[60] Por conseguinte, este tratamento afeta FL-fibroblastos primários e tecido pulmonar isolados a partir de pacientes com IPF ex vivo e in vivo. Estas alterações foram observadas em um modelo de camundongo com fibrose pulmonar estabelecida em que foram definidos os intermediários e mediadores a jusante dos efeitos salutares do nutlina-3a.

Nutlina-3a

[61] Os compostos úteis no método da presente invenção incluem nutlina-3a (também dita como nutlina e NTL) que é 4-2- 4,5-di-hidro-lH-imidazol-l-piperazin-2-ona

[62] Este composto está descrito na Patente US 7.893.278 (Haley et al) , aqui incorporada por referência na sua totalidade. Também são úteis na presente invenção um gênero amplo de análogos quirais cis-imidazolina de NTL que partilham a propriedade de inibir interações de MDM2-p53. Por análogos de NTL entende-se o gênero de moléculas descritas na patente '278, e caracterizada pela Fórmula 2 a seguir.

[63] na qual

[64] Ré selecionado de anéis com 5 e 6 membros, saturados e insaturados que contêm pelo menos um heteroátomo; o heteroátomo pode ser S, N ou 0. 0 anel pode ser substituído com um grupo alquil inferior cujo grupo alquil pode ainda ser substituído com pelo menos um de -C=O-Ri, -S02 CH3, ou -CH2C=OCH3,

[65] Ri é selecionado a partir do grupo que consiste em H, -NH2, -N-alquil inferior, alquil inferior substituído com um hidroxi, alquil inferior substituído com -NH2, e um anel saturado de 5 ou 6 membros contendo pelo menos um heteroátomo (S, N ou 0) ;

[66] Xi e X2 são selecionados independentemente do grupo que consiste em H, alcoxi inferior, -CH2OCH3, -CH2OCH2CH3, -OCH2CF3, e -OCH2CH2F,

[67] Yi e Y2 são cada um independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em -Cl, -Br, -N02, -C = N, e -C = CH, e

[68] a estereoquimica absoluta na posição 4 e 5 do anel de imidazolina é S e R, respectivamente.

[69] Outros compostos que são considerados análogos de NTL são os compostos de Fórmula 2 em que R é piperazinil substituído com pelo menos um grupo selecionado de alquil inferior, cicloalquil, C=ORi, alquil inferior substituído com hidroxi, alquil inferior substituído com -NH2, alquil inferior substituído com -C=ORi. N-alquil inferior, N, -SO2CH3, =0, -CH2C=OCH3, ou piperidinil substituído com pelo menos um grupo selecionado a partir de C1-C3 alquil, -Cl-C2-alcoxi, -C=OCH3, -SO2CH3' -C=0, - OH, -CH2NH2, -C=OCH2NH2, -C=OCH2OH, -C=OCH(OH)CH2OH, - CH2CH(OH)CH2OH, -C=ON(CH2)2, -C=ONH2, e-C=ON (CH3) CH3, -N(CH3)CH3, pirrolidinil e piperadinil.

[70] Também preferenciais são os compostos de fórmula 2, em que o grupo XI na posição orto é selecionado a partir de alcoxi inferior, -OCH2 CF3 e -OCH2CH2F, e o grupo X2 na posição para é alcoxi inferior. Ainda mais preferenciais são os compostos em que o grupo XI na posição orto é selecionado entre os grupos etoxi, isopropoxi, -OCH2CF3, e -OCH2CH2F, e o grupo X2 na posição para é selecionado a partir de metoxi e etoxi.

[71] Ainda preferenciais são os compostos de Fórmula 2 em que R é selecionado de entre piperazinil e piperazinil substituído. Tais compostos são, por exemplo: 1-{4-[(4S,5R)-4,5- Bis-(4-cloro-fenil)-2-(2-isopropoxi-4-metoxi-fenil)-4,5-di- hidro-imidazol-lcarbonil]-piperazin-l-il}-etanona; 4-[(4S,5R)- 4,5-Bis-(4-cloro-fenil)-2-(2-isopropoxi-4metoxi-fenil)-4,5-di- hidro-imidazol-l-carbonil]piperazin-2-ona; [(4S,5R)-4,5-Bis-(4- cloro-fenil)-2-(2-isopropoxi-4-5-metoxi-fenil)-4,5-di-hidro- imidazol-l-il]-(4-pirrolidin-l-il-piperidin-l-il)-metanona; 4- [(4S,5R)-4,5-Bis-(4-cloro-fenil)-2-(2-etoxi-fenil)-4,5-di-hidro- imid-azol-l-carbonil]-piperazin-2ona; 1—{4 —[ (4S,5R)-4,5-Bis-(4-cloro-fenil)-2-(2-etoxifenil)-4,5-di-hidro-imidazol-l-carbonil]- piperazin-l-il}-etanona; 2 —{4 —[(4S,5R)-4,5-Bis-(4-cloro-fenil)- 2-(2-etoxifenil)-4,5-di-hidro-imidazol-l-carbonil]-piperazin-l- il } -l-morfolin-4-il-etanona; [ (4S,5R)-4,5-Bis-(4-cloro-fenil)-2- (2-etoxi-fenil)4,5-di-hidro-imidazol-l-il]-[4-(2- metanesulfoniletil)-piperazin-l-il]-metanona; e [(4S,5R)-4,5- Bis-(4-cloro-fenil)-2-(2-isopropoxi-4-metoxi-fenil)-4,5-di- hidro-imidazol-l-il] -(4-metil-piperazin-l-il)-metanona.

[72] Síntese de todas essas moléculas é conhecida na técnica, algumas das quais estão descritas na patente '278.

Peptideos baseados na Sequência Cav-1

[73] 0 domínio estrutural de Caveolina-1 (Cav-1) ou peptideo (também dito como CSD ou CSP) interfere com interação Cav-1 com Src quinases imita o efeito combinado do uPA e anticorpo anti- βl-integrina, como discutido em mais detalhes abaixo. Cav-1 nativa humana tem um comprimento de 178 aminoácidos e um peso molecular de 22 kDa. A sequência de aminoácidos de Cav-1 é mostrada abaixo (SEQ ID NO: 3).

[74] CSP é o peptideo de 20 resíduos sublinhados acima, e tem a sequência GIWKASFTTFTVTKYWFYR (SEQ ID NO: 2) . 0 peptideo preferencial do presente invenção, designado CSP-4 é o fragmento FTTFTVT (SEQ ID NO: 1) de CSP e é mostrado duplo sublinhado na sequência Cav-1. CSP-4 tem atividades apresentadas nos Exemplos e Figuras, abaixo, e afeta o modo como o p53 regula viabilidade LEC através de controle coordenado de uPA, uPAR (para cima) e expressão de PAI-1 (para baixo) e por este mecanismo presumível, protege LECs ou epitélio do pulmão da apoptose in vivo e bloqueia a fibrose que resulta da ALI.

[75] Nos estudos aqui divulgados, um peptideo de controle para CSP-4, o que é denominado "CP" é um peptideo codificado com a mesma composição de aminoácidos como o maior CSP (SEQ ID NO: 2), mas tem uma sequência diferente: WGIDKAFFTTSTVTYKWFRY (SEQ ID NO: 5).

[76] Modificações e alterações podem ser feitas na estrutura de CSP-4, e para criar moléculas com características semelhantes ou de outra forma desejáveis. Esses derivados funcionais ou derivados biologicamente ativos (cujos termos são utilizados de modo intercambiável) estão englobados no escopo da presente invenção.

[77] Derivados funcionais preferenciais são variantes de adição e oligômeros/multímeros de peptídeos, e semelhantes.

[78] Estes podem ser gerados sinteticamente, mas também por produção recombinante, e testados quanto às propriedades de ligação ou a atividade biológica do CSP-4. Um modo preferencial para medir a atividade da variante é em um ensaio de ligação competitiva em que a capacidade da variante do peptideo para competir com a ligação de caveolina solúvel, como aquele que é marcada de forma detectável, com uPAR solúvel ("suPAR").

[79] Entende-se que os derivados distintos de CSP-4 e polipeptideos mais longos compreendendo CSP-4 podem ser facilmente preparados de acordo com a invenção, por métodos de tratamento quimico (sintéticos) ou por meios recombinantes (preferenciais para polipeptideos mais longos).

[80] Incluidos na definição de variantes funcionais da CSP-4 são adição que compreende preferencialmente um 1 -5 aminoácidos adicionais em qualquer das extremidades ou em ambos os terminais. Em outras modalidades (que se destinam a ser diferentes dos multimeros de peptideos discutidos abaixo), podem ser adicionados outros residues adicionais, até cerca de 20 residues. Na variante de adição de CSP-4, os residues N- terminais adicionais para, e/ou C-terminais para SEQ ID NO: 1 (o núcleo de peptideo CSP-4) podem incluir alguns destes na ordem em que ocorrem na sequência nativa em Cav-1 (SEQ ID NO: 4). No entanto, a variante de adição não pode ser a SEQ ID NO: 3. Alternativamente, outros aminoácidos podem ser adicionados a qualquer dos terminais da SEQ ID NO: 1, com o entendimento de que a variante de adição mantém a atividade biológica e a atividade de ligação do CSP-4 (pelo menos 20% da atividade, de um modo preferencial maior ou, como é definido abaixo).

[81] Substituições variantes de CSP-4 preferenciais são substituições conservativas em que um, dois ou três residues foram substituídos por residue diferente. Para uma descrição detalhada da quimica e estrutura de proteínas, ver Schulz G.E. et al, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, 1979, e Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties, 2nd ed., W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1993, que são aqui incorporados por referência. As substituições conservadoras são aqui definidas como trocas dentro de um dos seguintes grupos:

[82] Phe pode ser substituído por um grande residuo aromático: Tyr, Trp.

[83] Thr pode ser substituído por um pequeno residuo alifático, não polares ou ligeiramente polar: por exemplo, Ala, Ser, ou Gly.

[84] Vai pode ser substituído por um grande residuo alifático, não polar: Met, Leu, Ile, Cys.

[85] Mesmo quando é dificil prever o efeito exato da substituição antes da preparação, um especialista na técnica apreciará que o efeito pode ser avaliado por ensaios de triagem de rotina, preferencialmente, os ensaios biológicos e bioquímicos aqui descritos. A atividade de um lisado celular ou uma variante do polipeptideo ou peptideo purificado é testada num ensaio de triagem adequado para a característica desejada.

[86] Além dos 20 L-aminoácidos "padrões", D-aminoácidos ou aminoácidos não padrões, modificados ou não usuais que são bem definidos na técnica, também são contemplados para utilização na presente invenção. Estes incluem, por exemplo, incluem β-alanina (β-Ala) e outros w-aminoácidos como o ácido 3-aminopropiônico, ácido 2,3-diaminopropiônico (Dpr), ácido 4-aminobutirico e assim por diante; ácido ot-aminoisobutirico (Aib) ; ácido ε- aminohexanoico (Aha); ácido 5-aminovalérico (Ava); N- metilglicina ou sarcosina (MeGly); ornitina (Orn); citrulina (Cit); t-butilalanina (t-BuA); t-butilglicina (t-BuG); N- metilisoleucina (Melle); fenilglicina (Phg); norleucina (Nle); 4-clorofenilalanina (Phe(4-Cl)); 2-fluorofenilalanina (Phe(2- F)) ; 3-fluorofenilalanina (Phe(3-F)); 4-fluorofenilalanina (Phe(4-F)); penicilamina (Pen); ácido 1,2,3,4-tetra- hidroisoquinolina-3-carboxilico (Tic); homoarginina (hArg); N- acetil-lisina (AcLys); ácido 2,4-diaminobutirico (Dbu); ácido 2,4-diaminobutirico (Dab); p-aminofenilalanina (Phe(pNH2)); N- metil-valina (MeVal); homocisteina (hCys), homofenilalanina (hPhe) e homoserina (hSer); hidroxiprolina (Hyp), homoprolina (hPro), aminoácidos N-metilados e peptoides (glicinas N- substituidas).

[87] Outros compostos podem ser concebidos por desenho racional de drogas para funcionar de um modo semelhante ao CSP- 4. 0 objetivo da concepção racional de drogas é produzir análogos estruturais de compostos biologicamente ativos. Através da criação de tais análogos, é possivel produzir medicamentos que são mais ativas ou mais estáveis do que as moléculas naturais (isto é, peptideos), menor susceptibilidade a alterações que afetam funções. Uma abordagem é a de gerar uma estrutura tridimensional de CSP-4, por exemplo, por NMR ou cristalografia de raios X, modelação em computador ou uma combinação. Uma abordagem alternativa é a de substituir grupos funcionais aleatoriamente na sequência CSP-4, e determinar o efeito sobre a função.

[88] Além disso, um derivado biologicamente ativo tem a atividade de PEC-4 em um ensaio de ligação ou de atividade biológica in vitro ou in vivo, como os ensaios aqui descritos. Preferencialmente, o polipeptideo inibe ou previne a apoptose de LECs induzida por BLM in vitro ou in vivo com uma atividade de pelo menos cerca de 20% da atividade de CSP-4, ou pelo menos cerca de 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, cerca de 95%, 97%, 99%, e qualquer faixa entre estes, como, por exemplo, desde cerca de 70% a cerca de 80%, e mais preferencialmente desde cerca de 81% a cerca de 90%; ou ainda mais preferencialmente, desde cerca de 91% a cerca de 99%. 0 derivado pode ter 100% ou mesmo maior atividade do que o CSP-4.

[89] 0 peptideo pode ser limitado nos seus terminais N e C, com um grupo acil (abreviado como "Ac") e um grupo amido (abreviado "Am"), respectivamente, por exemplo acetil (CH3CO-) no terminal N e amido (-NH2) no terminal C. Uma ampla faixa de funções de capeamento N-terminal, preferencialmente, numa ligação para o grupo amino terminal, está contemplada, por exemplo: formil;

[90] alcanoil, tendo de 1 a 10 átomos de carbono, como acetil, propionil, butiril;

[91] alquenoil, tendo de 1 a 10 átomos de carbono, como hex- 3-enoil;

[92] alquinoil, tendo de 1 a 10 átomos de carbono, como hex- 5-inoil;

[93] aroil, como benzoil ou 1-naftoil;

[94] heteroaroil, como 3-pirrol ou 4-quinoloil;

[95] alquilsulfonil, como metanossulfonil;

[96] arilsulfonil, como benzenossulfonil ou sulfanilil;

[97] heteroarilsulfonil, como piridina-4-sulfonil;

[98] alcanoil substituído, tendo de 1 a 10 átomos de carbono, como 4-aminobutiril;

[99] alquenoil substituído, tendo de 1 a 10 átomos de carbono, como o 6-hidroxi-hex-3-enoil;

[100] alquinoil substituído, tendo de 1 a 10 átomos de carbono, como 3-hidroxi-hex-5-inoil;

[101] aroil substituído, como 4-clorobenzoil ou 8- hidroxi-naft-2-oil;

[102] heteroaroil substituído, como 2,4-dioxo-l,2,3,4- tetra-hidro-3-metil-quinazolin-6-oil;

[103] alquilsulfonil substituído, como 2-aminoetanosulfonil;

[104] arilsulfonil substituído, como 5-dimetilamino-l-naftalenossulfonil ;

[105] heteroarilsulfonil substituído, como l-metoxi-6-isoquino1inasulfonil;

[106] carbamoil ou tiocarbamoil;

[107] carbamoil substituído (R'-NH-CO) ou tiocarbamoil substituído (R'-NH-CS) em que R' é alquil, alquenil, alquinil, aril, heteroaril, alquil substituído, alquenil substituído, alquinil substituído, aril substituído, ou heteroaril substituído ;

[108] carbamoil substituído (R' -NH-CO) e tiocarbamoil substituído (R'-NH-CS) em que R' é alcanoil, alquenoil, alquinoil, aroil, heteroaroil, alcanoil substituído, alquenoil substituído, alquinoil substituído, aroil substituído, ou heteroaroil substituído, todos como acima definidos.

[109] A função de capeamento C-terminal pode estar em uma ligação amida ou éster com o grupo carboxil terminal. As funções de capeamento que proporcionam uma ligação amida são designadas como NR1R2 em que R1 e R2 podem ser desenhados de forma independente a partir do seguinte grupo: hidrogênio;

[110] alquil, preferencialmente tendo de 1 a 10 átomos de carbono, como metil, etil, isopropil;

[111] alquenil, tendo preferencialmente de 1 a 10 átomos de carbono, como prop-2-enil;

[112] alquinil, tendo preferencialmente de 1 a 10 átomos de carbono, como prop-2-inil;

[113] alquil substituído tendo de 1 a 10 átomos de carbono, como hidroxialquil, alcoxialquil, mercaptoalquil, alquiltioalquil, halogenoalquil, cianoalquil, aminoalquil, alquilaminoalquil, dialquilaminoalquil, alcanoilalquil, carboxialquil, carbamoilalquil;

[114] alquenil substituído tendo de 1 a 10 átomos de carbono, como hidroxialquenil, alcoxialquenil, mercaptoalquenil, alquiltioalquenil, halogenoalquenil, cianoalquenil,aminoalquenil, alquilaminoalquenil, dialquilaminoalquenil, alcanoilalquenil, carboxialquenil, carbamoilalquenil;

[115] alquinil substituído tendo de 1 a 10 átomos de carbono, como hidroxialquinil, alcoxialquinil, mercaptoalquinil, alquiltioalquinil, halogenoalquinil, cianoalquinil,aminoalquinil, alquilaminoalquinil, dialquilaminoalquinil, alcanoilalquinil, carboxialquinil, carbamoilalquinil;

[116] aroilalquil tendo até 10 átomos de carbono, como fenacil ou 2-benzoiletil;

[117] aril, como fenil ou 1-naftil;

[118] heteroaril, como 4-quinolil;

[119] alcanoil tendo 1 a 10 átomos de carbono, como acetil ou butiril;

[120] aroil, como benzoil;

[121] heteroaroil, como 3-quinoloil;

[122] OR' ou NR' R' ' em que R' e R" são independentemente hidrogênio, alquil, aril, heteroaril, acil, aroil, sulfonil, sulfinil, ou SO2-R' ' ' ou SO-R''' em que R' ' ' é alquil substituído ou não substituído, aril, heteroaril, alquenil, ou alquinil.

[123] As funções de capeamento que proporcionam uma ligação éster são designadas como OR, em que R pode ser: alcoxi; ariloxi; heteroariloxi; aralquiloxi; heteroaralquiloxi; alcoxi substituído; ariloxil substituído; heteroariloxi substituído;aralquiloxil substituído; ou heteroaralquiloxi substituído.

[124] A função de capeamento em N-terminal ou C- terminal, ou ambos, podem ser de uma dita estrutura que molécula capeada funciona como uma pró-droga (um derivado farmacologicamente inativo da molécula da droga parente), que passa por uma transformação espontânea ou enzimática dentro do corpo em a fim de libertar a droga ativa e que tem propriedades de liberação melhoradas em relação à molécula de droga original (Bundgaard H, Ed: Design of Prodrugs, Elsevier, Amsterdam, 1985).

[125] Escolha criteriosa de grupos de capeamento permite a adição de outras atividades sobre o peptideo. Por exemplo, a presença de um grupo sulfidril ligado à capa de N- ou C-terminal irá permitir a conjugação do peptideo derivatizado para outras moléculas.

Derivados químicos da CSP-4

[126] Além dos grupos de capeamento descritos acima que são considerados como "derivados químicos" de CSP-4, os derivados químicos preferenciais de CSP-4 podem conter frações químicas adicionais que normalmente não fazem parte de uma proteína ou peptideo que pode ser introduzido para CSP-4 ou uma variante da adição de CSP-4 por meios conhecidos para constituir o derivado químico como aqui definido. As modificações covalentes do peptideo estão incluídas dentro do escopo da presente invenção. Estas frações derivadas podem melhorar a solubilidade, absorção, meia-vida biológica e similares. As frações capazes de mediar tais efeitos são divulgadas, por exemplo, Gennaro, AR, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins Publishers; 21st Ed, 2005 (ou última edição).

[127] Tais modificações podem ser introduzidas na molécula por reação de residuos de aminoácidos alvos do peptideo com um agente de derivatização orgânico que é capaz de reagir com cadeias laterais selecionadas ou residuos terminais. Outra modificação é a ciclização do peptideo - que é geralmente conseguida através da adição de residuos de Cys terminais que podem ser ligados através de uma ligação de dissulfeto para produzir o peptideo ciclico. Alternativa, uma Lys reticulada (K) é adicionada a um terminal e um Glu (E) no outro terminal.

[128] Os residuos cisteinil (adicionados, por exemplo, para fins de ciclização) mais comumente são reagidos com a- halogenoacetatos (e aminas correspondentes), para gerar derivados carboximetil ou carboxiamidometil. Os residuos cisteinil também são derivatizados por reação com bromotrifluoroacetona, ácido α-bromo-β-(5-imidozoil) propiônico, fosfato de cloroacetil, N-alquilmaleimidas, 3-nitro-2-piridil dissulfeto, metil-2-piridildissulfeto, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitro-fenol, ou cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-l,3- diazol.

[129] Os residuos lisinil adicionados (por exemplo, para a ciclização) e o residuo do terminal amino podem ser derivatizados com anidridos de ácido succinico ou outros carboxilicos. A derivatização com um anidrido carboxilico ciclico tem o efeito de reverter a carga dos residuos lisinil. Outros reagentes adequados para derivatizar residuos contendo amino incluem imidoésteres como picolinimidato de metil; fosfato de piridoxal; piridoxal; cloroborohidreto; ácido trinitrobenzenossulfônico; O-metilisoureia; 2,4 pentanodiona; e reação com glioxilato catalisada por transaminase.

[130] A derivatização com agentes bifuncionais é útil para reticular o oligômero ou peptideo ou multimero para uma matriz de suporte insolúvel em água ou outro carreador macromolecular. Os agentes de reticulação comumente utilizados incluem 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldeido, ésteres de N-hidroxissuccinimida, ésteres com ácido 4- azidossalicilico, imidoésteres homobifuncionais, incluindo ésteres de dissuccinimidil como 3,3'- ditiobis(succinimidilpropionato) , e maleimidas bifuncionais como bis-N-maleimido-1,8-octano. Os agentes de derivatização como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato geram intermediários foto-ativáveis que são capazes de formar reticulações na presença de luz. Alternativamente, as matrizes reativas insolúveis em água como carboidratos ativados por brometo de cianogênio e os substratos reativos descritos nas Patentes US. 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; e 4.330.440, são empregues para imobilização de proteinas.

[131] Outras modificações incluem hidroxilação de lisina, fosforilação de grupos hidroxil de residues de treonil, a metilação dos grupos ot-amino de cadeias laterais de cadeias de residues de lisina (adicionados) (Creighton, supra), acetilação da amina N-terminal e, em alguns casos, a amidação dos grupos carboxil C-terminal. Também estão incluidos peptideos, em que um ou mais D-aminoácidos são substituídos por um ou mais L- aminoácidos.

Peptideos multiméricos ou oligoméricos

[132] A presente invenção também inclui peptideos mais longos construídos a partir de unidades de repetição de CSP-4 ou um derivado funcional dos mesmos que tem a atividade anti- apoptótica e de proteção do CSP-4. A unidade peptidica preferencial de um dito multimero é FTTFTVT (SEQ ID NO: 1) . Variantes de adição deste peptideo que podem ser a "unidade" de multimero preferencialmente incluem aminoácidos 1-4 adicionais.

[133] Um peptideo multimero pode compreender diferentes combinações de monômeros de peptideo (os quais podem incluir um ou ambos de SEQ ID NO: 1 ou variantes de adição da mesma ou uma sua forma quimicamente derivatizada do peptideo. Tais peptideos oligoméricos ou multiméricos podem ser feitos por sintese quimica ou por técnicas de DNA recombinante como aqui discutido. Quando produzidos por sintese quimica, os oligômeros possuem preferencialmente 2-5 repetições de uma sequência de peptideo nuclear, e o número total de aminoácidos no multimero não deve exceder cerca de 160 residues, preferencialmente não mais do que 100 residues (ou seus equivalentes, quando incluindo ligantes ou espaçadores).

[134] Um multimero peptideo quimico sintético preferencial tem a fórmula

[135] Pxn

[136] em que o peptideo P1 central é a SEQ ID NO: 1, e em que n = 2-5, e em que o peptideo nuclear isolado ou em forma oligo- ou multimérica tem a atividade biológica do CSP-4, como aqui descrito ou em um bioensaio in vitro ou in vivo de tai atividade.

[137] Numa outra modalidade, um multimero de peptide quimico sintética preferencial tem a fórmula

[138] (P1-Xm)n-P2

[139] P1 e P2 são os peptideos do núcleo descritos acima, incluindo as variantes adicionais, em que (a) P1 e P2 podem ser iguais ou diferentes; além disso, cada ocorrência de P1 no multimero pode ser um peptideo diferente (ou variante); (b) X é um espaçador que compreende ou consiste em: (i) uma cadeia orgânica curta, preferencialmente C1-C5 alquil, C1-C5 alquenil, Ci-Cj-alquinil, C1-C5 poliéter contendo até 4 átomos de oxigênio, em que m=0oulen= 1-7; ou (ii) Glyz em que, z = 1-6,

[140] e em que o peptideo de núcleo isolado ou na forma multimérica tem a atividade biológica do CSP-4, como aqui divulgado em um ensaio in vitro ou in vivo de tal atividade.

[141] Quando produzidos de forma recombinante, um espaçador preferencial é Glyz como descrito acima, em que z = 16, e os multimeros podem ter tantas repetições da sequência peptidica do núcleo quanto o sistema de expressão permitir, por exemplo, de dois a cerca de 25 repetições. Um multimero de peptideo produzido de forma recombinante preferencial tem a fórmula:

[142] (P1-Glyz)n-P2

[143] em que: (a) P1 e P2 são, independentemente, SEQ ID NO: 1 ou 3, ou um variante de adição ou uma forma derivada da mesma, em que P1 e P2 podem ser iguais ou diferentes; além disso, cada ocorrência de P1 no multimero pode ser um peptideo diferente (ou variante);

[144] em que n = 1-25 e z = 0-6; (faixas preferenciais de n incluem n = 1-5, 1-10, 1-15, ou 1-20) e em que o peptideo de núcleo isolado ou na forma multimérica tem a atividade biológica do CSP-4, como aqui divulgado em bioensaio in vitro ou in vivo de tal atividade.

[145] Nos presentes multimeros de peptideos, ou P1 ou P2 é preferencialmente a SEQ ID NO: 1 ou uma variante de adição ou derivado quimico do mesmo. 0 multimero é opcionalmente capeado. Entende-se que tais multimeros podem ser construidos a partir de qualquer um dos peptideos ou as variantes aqui descritas. É também entendido que o multimero de peptideo deve ser diferente a partir de SEQ ID NO: 3 (isto é, Cav-1 não humana nativa e é, preferencialmente um homólogo de Cav-1 mamifero nativo).

Peptidomiméticos

[146] Também incluido dentro do escopo da presente invenção é um composto peptidomimético que imita os efeitos biológicos do CSP-4. Um agente peptidomimético pode ser um peptideo não natural ou um agente não peptideo que recria as propriedades estereoespaciais dos elementos de ligação de CSP-4 de tal modo que tem a atividade de ligação e atividade biológica de CSP-4. Semelhante a um peptideo CSP-4 biologicamente ativo, multimero de peptideo, um peptidomimético terá uma face de ligação (que interage com qualquer ligante ao qual CSP-4se liga) e uma face não ligante. Mais uma vez, semelhante a CSP-4, a face não ligante de um peptidomimético irá conter grupos funcionais que podem ser modificados pelo acoplamento de várias frações terapêuticas sem modificar a face de ligação do peptidomimético. Uma modalidade preferencial de um peptidomimético conteria uma anilina na face não ligante da molécula. O grupo NH2 de uma anilina tem um pKa ~ 4,5 e poderia, portanto, ser modificado por qualquer reagente seletivo para NH2 sem modificar quaisquer grupos funcionais NH2 na face de ligação do peptidomimético. Outros peptidomiméticos podem não ter quaisquer grupos NH2 funcionais na face de ligação e, por conseguinte, qualquer NH2, sem ter em conta para pKa poderia ser exibido na face não ligante como um sitio para conjugação. Além disso, outros grupos funcionais modificáveis como -SH e -COOH podem ser incorporados à face não ligante de um peptidomimético, como um sitio de conjugação. Uma fração terapêutica também pode ser incorporada diretamente durante a sintese de um peptidomimético e preferencialmente, ser exibida na face não ligante da molécula.

[147] Esta invenção também inclui compostos que retêm as características de peptideos parciais. Por exemplo, qualquer ligação proteoliticamente instável dentro de um peptideo da presente invenção poderia ser substituída seletivamente por um elemento não peptidico, como um isóstero (N-metilação; D- aminoácido) ou uma ligação peptidica reduzida, enquanto o resto da molécula mantém a sua natureza peptidica.

[148] Compostos peptidomiméticos, agonistas, substratos ou inibidores, têm sido descritos para uma série de peptideos/polipeptideos bioativos, como os peptideos opioides, VIP, a trombina, a protease de HIV, etc. Os métodos para a concepção e preparação de compostos peptidomiméticos são conhecidos na técnica (Hruby, VJ, Biopolymers 33: 1073-1082 (1993); Wiley, RA et al, Med Res Rev. 13: 327-384 (1993); Moore et al, Adv. In Pharmacol 33: 91-141 (1995); Giannis et al, Adv. In Drug Res. 29: 1-78 (1997). Certos miméticos que imitam a estrutura secundária estão descritos em Johnson, et al, Em: (Eds.) Biotechnology and Pharmacy, Pezzuto et al, Chapman and Hall, NY, 1993. Estes métodos são usados para preparar peptidomiméticos que possuem, pelo menos, a capacidade de ligação e especificidade do peptideo CSP-4 e preferencialmente também possuem a atividade biológica. O conhecimento da quimica dos peptideos e da quimica orgânica geral, disponíveis para os especialistas na técnica são suficientes, tendo em vista a presente descrição, para conceber e sintetizar tais compostos.Por exemplo, tais peptidomiméticos podem ser identificados por inspeção da estrutura tridimensional de um peptideo da invenção ou livre ou ligado em complexo com um ligante (por exemplo, uPAR solúvel ou um fragmento do mesmo). Alternativamente, a estrutura de um peptideo da presente invenção ligado ao seu ligante pode ser obtida pelas técnicas de espectroscopia de ressonância magnética nuclear. Um maior conhecimento da estereoquimica da interação do peptideo com o seu ligante ou receptor irá permitir a concepção racional de tais agentes peptidomiméticos. A estrutura de um peptideo ou polipeptideo da invenção na ausência de ligante também pode proporcionar um suporte temporário para a concepção de moléculas miméticas.

Peptideos e Multimeros de Peptideo Liberáveis

[149] Uma modalidade da invenção compreende um método de introdução do peptideo da invenção em células de animais, como células humanas. Composições úteis para este método, ditas como peptideos ou polipeptideos "liberáveis" ou "direcionados para célula" compreendem um peptideo biologicamente ativo de acordo com a invenção, preferencialmente CSP-4, ou um seu derivado funcional, ou um multimero de peptideo do mesmo, que tem a ele ligado ou está associado com, outro componente que serve como uma "sequência de internalização" ou sistema de liberação celular. 0 termo "associado com" pode incluir quimicamente ligado ou acoplado a, por ligações covalentes ou outras ligações ou forças, ou combinado com, como numa mistura. Como aqui utilizado, "liberação" refere-se a internalização de um peptideo/polipeptideo em uma célula. As moléculas liberáveis aqui contempladas incluem peptideos/polipeptideos utilizados por outros para efeito de entrada celular. Ver, por exemplo, Morris et al, Nature Biotechnology, 19: 1173-6, 2001). Uma estratégia preferencial é a seguinte: um peptideo de inibição de apoptose ("biologicamente ativo") da invenção está ligado a ou misturado com um peptideo especialmente concebido que facilita a sua entrada nas células, preferencialmente células humanas. Este sistema de liberação não requer a liberação de peptideos para ser fusionado ou quimicamente acoplado ao peptideo ou polipeptideo biologicamente ativo (embora isso seja preferencial), nem peptideo ou polipeptideo biologicamente ativo tem de ser desnaturado antes do processo de liberação ou internalização. Uma desvantagem de sistemas de libertação precoces é o requisito para a desnaturação da proteina por "carga" antes da liberação e subsequente renaturação intracelular. Estas modalidades são baseadas em abordagens conhecidas para promover a translocação da proteina nas células.

[150] Um tipo de peptideo/polipeptideo de "liberação" que promove a translocação/internalização inclui a proteina HIV- TAT (Frankel, AD et al, Cell 55: 1189-93 (1998), e a terceiro a hélice do homeodominio de Antennapedia (Derossi et al, J. Biol Chem 269: 10444-50 (1994); Lindgren, M et al, Trends Pharm Sei 27: 99-103 (2000); Lindgren et al, Bioconjug Chem (2000); Maniti 0 et al, PLoS ONE 5el5819 (2010). Este último peptideo, também conhecido como "penetratina" é um peptideo de 16 aminoácidos com a sequência de tipo selvagem RQIKIWFQN RRMKWKK (SEQ ID NO: 6) ou dois análogos/variantes designado W48F (RQIKIFFQNRRMKWKK, SEQ ID NO: 7) e W56F (RQIKIWFQNRRMKFKK, SEQ ID NO: 8) (Christiaens B et al, Eur J Biochem 2002, 269: 2918-2926). Outra variante com ambas as mutações acima é RQIKIFFQNRRMKFKK (SEQ ID NO: 9) . Transporter!, um peptideo de penetração celular é um peptideo longo de 27 aminoácidos que contém 12 aminoácidos funcionais a partir do N- terminal da galanina neuropeptideo ligado por um residue Lys adicionado à sequência de mastoparan (Pooga, M et al, FASEB J. 12: 67-77 (1998)). A sequência de transportan é GWTLNSAGYLLGKINKALAALAKKIL (SEQ ID NO: 10) . Análogos de penetratina e transportan são descritos por Lindgren et al, Bioconjug Chem. 2000.

[151] Outra proteina (familia) inclui VP22, uma proteina do virus herpes simplex, que tem a propriedade notável de transporte intercelular e distribui uma proteina de muitas células vizinhas (Elliott, G et al, 1997, Cell 88: 223-33;O'Hare et al, Patente US 6.017.735). Por exemplo, VP22 ligada à p53 (Phelan, A. et al, 1998, Nat Biotechnol 16: 440-3) ou timidina quinase (Dilber, MS et al, 1999, Gene Ther 6: 12-21) facilitando a disseminação de proteinas ligadas para circundar as células in vitro. Também úteis são os homólogos de VP22 em outros virus do herpes, como o virus da doença de Marek aviária (MDV) proteina UL49, que partilha homologia com o HSV-1 VP22 (Koptidesova et al, 1995, Arch Virol 140: 355-62) e demonstrou ser capaz de transporte intercelular após a aplicação exógena (Dorange et al, 2000, J. Gen. Virol 81: 2219). Todas estas proteinas partilham a propriedade de propagação intercelular que proporcionam uma abordagem para aumentar a absorção celular dos peptideos, variantes e multimeros desta invenção.

[152] Também estão incluídos os "derivados funcionais" do espalhamento intercelular acima ou proteinas e peptideos de "liberação" "liberáveis" ou "internalização", como o HIV-TAT ou VP22, que incluem variantes, fragmentos ou derivados quimicos de substituição de aminoácidos homólogos, cujos termos são aqui para os peptideos biologicamente ativos. Um derivado funcional retém atividade de translocação mensurável ou espalhamento intercelular (VP22-like), que promove a entrada do polipeptideo desejado, que promove a utilidade do presente peptideo biologicamente ativo, por exemplo, para a terapia. "Derivados funcionais" englobam variantes (preferencialmente variantes de substituição conservative) e fragmentos independentemente do fato de quais termos são usados em conjunto ou na alternativa.

[153] Uma vez que as proteinas de transporte acima são ditas funcionam melhor quando conjugadas ou de outra forma ligadas ao peptideo que estão transportando, como o CSP-4 ou uma sua variante ou seu multimero, há um número de desvantagens para usá-los. Um polipeptideo de liberação mais eficaz que pode ser misturado com o peptideo biologicamente ativo e não precisa ser ligado quimicamente para sua ação está descrito em Morris et al, supra, como "Pep-1", que possui a sequência de aminoácidos anfipático KETWWETWWTEWSQPKKKRKV (SEQ ID NO: 11). Pep -1 é composto por três dominios: (1) um motivo rico em Trp hidrofóbico contendo cinco residues Trp KETWWETWWTEW (residues 1-12 de SEQ ID NO: 11, acima). Este motivo é desejável, ou necessário, para um eficiente direcionamento para a membrana celular e para entrar em interações hidrofóbicas com proteinas; (2) um dominio rico em Lys hidrofilico KKKRKV (os 6 residues do C-terminal de SEQ ID NO: 11), que é derivado da sequência de localização nuclear do antigeno T grande do virus SV40, e melhora a liberação intracelular e solubilidade de peptideo; e (3) um "dominio" espaçador SQP (3 residues internos de SEQ ID NO: 12) e que separam os dois dominios ativos acima e incluem um Pro que melhora a flexibilidade e integridade de ambos os dominios hidrofóbicos e hidrofilicos.

[154] Por conseguinte, uma outra modalidade da invenção é um peptideo ou polipeptideo liberável compreendendo CSP-4 ou um seu derivado funcional, como descrito acima, e uma molécula de liberação ou translocação ou fração ligada a esta ou a esta associado. A molécula de liberação pode ser um peptideo ou polipeptideo, por exemplo, (a) proteina HIV-TAT ou um derivado ativo do mesmo de modo translocável, (b) penetratina tendo a sequência RQIKIWFQN RRMKWKK (SEQ ID NO: 8), (c) uma variante de penetratina W48F tendo a sequência RQIKIFFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 7) (d) uma variante de penetratina W56F tendo a sequência RQIKIWFQNRRMKFKK (SEQ ID NO: 13) (e) uma variante penetratina tendo a sequência RQIKIWFQNRRMKFKK (SEQ ID NO: 16) (f) transportan tendo a sequência GWTLNSAGYLLGKINKALAALAKKIL (SEQ ID NO: 10) (g) proteina VP22 de virus herpes simplex ou um homólogo ativo de modo translocável do mesmo a partir de um virus do herpes diferente, como MDV proteina UL49; ou (h) Pep-1, tendo a sequência KETWWETWWTEWSQPKKKRKV (SEQ ID NO: 9).

[155] Quando uma fração de liberação, como os peptideos e proteinas acima discutidos é conjugada ou fusionada com o peptideo biologicamente ativo da presente invenção, é preferencial que a fração de liberação seja o peptideo biologicamente ativo N-terminal.

Testes In vitro das Composições

[156] Os compostos desta invenção são testados quanto à sua atividade biológica, por exemplo, atividade antifibrótica, a sua capacidade para afetar a expressão de mRNAs de uPA, uPAR e PAI-1, inibir a proliferação de fibroblastos de pulmão, etc. utilizando qualquer um dos ensaios descritos e/ou aqui exemplificados ou outros bem conhecidos na técnica.

Ensaios in vivo de composições

[157] A capacidade de um composto como um análogo NTL ou variantes de CSP-4 ou derivados ou multimeros de peptideos para inibir a fibrose pulmonar em camundongos tratados com BLM é um ensaio preferencial para avaliar a atividade funcional do composto. Outros testes conhecidos na técnica que medem o mesmo tipo de atividade pode também ser usados.

Método de prevenção ou tratamento de lesão pulmonar e fibrose

[158] Os compostos e as composições aqui descritos são utilizados no método para inibir a interação de MDM2 com a proteina p53 in vitro ou in vivo, e para tratar doenças ou condições associadas com ALI e fibrose pulmonar/IPF.

Composições farmacêuticas e terapêuticas e sua administração

[159] Os compostos que podem ser utilizados nas composições farmacêuticas da invenção incluem NTL, e todos os compostos de peptideos acima descritos, bem como os sais farmaceuticamente aceitáveis destes compostos. "Sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a sais de adição de ácido ou sais de adição de base convencionais que retêm a eficácia biológica e as propriedades dos compostos da presente invenção e são formados a partir de ácidos orgânicos ou inorgânicos não tóxicos ou bases adequadas orgânicas ou inorgânicas. Exemplos de sais de adição de ácido incluem aqueles derivados a partir de ácidos inorgânicos como ácido cloridrico, ácido bromidrico, ácido iodidrico, ácido sulfúrico, ácido sulfâmico, ácido fosfórico e ácido nitrico, e os derivados de ácidos orgânicos como ácido p-toluenossulfônico, ácido salicilico, ácido metanossulfônico, ácido oxálico, ácido succinico, ácido citrico, ácido málico, ácido láctico, ácido fumárico, e semelhantes. Os sais de adição de base amostra incluem os derivados de amónio, potássio, sódio e, hidróxidos de amónio quaternários, como, por exemplo, hidróxido de tetrametilamônio. A modificação quimica de um composto farmacêutico (isto é, drogas) em um sal é uma técnica bem conhecida para os quimicos farmacêuticos para se obter uma melhor estabilidade fisica e quimica, higroscopicidade, fluidez e solubilidade de compostos. Ver, por exemplo, H. Ansel et al, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (6aEd. 1995) em pp. 196 e 1456-1457.

[160] Como afirmado acima, os compostos da invenção possuem a capacidade de inibir a interação de MDM2 com proteina p53 e são explorados no tratamento da lesão pulmonar aguda e, em particular fibrose pulmonar.

[161] Os compostos da invenção, bem como os seus sais farmaceuticamente aceitáveis, podem ser incorporados em formas de dosagem convenientes, como cápsulas, bolachas impregnadas, comprimidos ou, preferencialmente preparações injetáveis. Transportadores sólidos ou liquidos farmaceuticamente aceitáveis podem ser utilizados. "Farmaceuticamente aceitável", como carreador farmaceuticamente aceitável, excipiente, etc, significa farmacologicamente aceitável e substancialmente não tóxico para o sujeito ao qual o composto particular é administrado.

[162] Os veículos sólidos incluem amido, lactose, sulfato de cálcio di-hidratado, terra alba, sacarose, talco, gelatina, ágar, pectina, acácia, estearato de magnésio e ácido esteárico. Os carreadores líquidos incluem xarope, óleo de amendoim, azeite, solução salina, água, dextrose, glicerol e semelhantes. De modo semelhante, o carreador ou diluente pode incluir qualquer material de liberação prolongada, como monoestearato de gliceril ou diestearato de gliceril, sozinho ou com uma cera. Quando um carreador líquido é utilizado, a preparação pode estar na forma de um xarope, elixir, emulsão, cápsula de gelatina mole, líquido injetável estéril (por exemplo, uma solução), como uma ampola, ou uma suspensão líquida aquosa ou não aquosa. Um resumo de tais composições farmacêuticas pode ser encontrado, por exemplo, em Gennaro, AR, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins Publishers; 21st Ed, 2005 (ou mais recente edição).

[163] As preparações farmacêuticas são feitas seguindo técnicas convencionais da química farmacêutica envolvendo passos como mistura, granulação e compressão, quando necessário para formas em comprimidos, ou mistura, enchimento e dissolução dos ingredientes, como apropriado, para gerar os produtos desejados para administração oral, parenteral, tópica, transdérmica, intravaginal, intrapeniana, intranasal, intrabronquial, intracraniana, intraocular, administração intra-aural e retal. As composições farmacêuticas podem também conter quantidades menores de substâncias auxiliares não tóxicas como agentes molhantes ou emulsionantes, agentes tamponantes de pH e assim por diante.

[164] A presente invenção pode ser utilizada no tratamento de qualquer um de uma série de gêneros e espécies de animais, e são igualmente aplicáveis na prática da medicina humana ou veterinária. Assim, as composições farmacêuticas podem ser utilizadas para tratar animais domésticos e comerciais, incluindo aves e mais preferencialmente mamiferos, mais preferencialmente humanos.

[165] O termo "administração sistêmica" se refere à administração de uma composição ou agente como NTL ou o peptideo aqui descrito, de uma maneira que resulta na introdução da composição no sistema circulatório do sujeito ou de outro modo permite a sua difusão através do corpo, como injeção ou infusão intravenosa (i.v.). Administração "regional" refere-se à administração num espaço especifico, e um pouco mais limitada, anatômica, como instilação no pulmão, a via preferencial, ou intrapleural, intraperitoneal, intratecal, subdural, ou para um órgão especifico. Outros exemplos incluem intranasal, que é uma via que corresponde a instilação nos pulmões, intrabronquial, intra-aural ou intraocular, etc. 0 termo "administração local" refere-se à administração de uma composição ou medicamento para um número limitado de, ou circunscrito, espaço anatômico, como injeções subcutâneas (s.c.), injeções intramusculares (i.m.). Um especialista na técnica iria entender que a administração local ou administração regional muitas vezes também resulta na introdução de uma composição para o sistema circulatório, isto é, de modo que sc ou im também são vias de administração sistêmica. Preparações instiláveis, injetáveis ou para infusão podem ser preparadas em formas convencionais, quer como soluções ou suspensões sólidas, formas adequadas para solução ou suspensão em liquido antes da injeção ou infusão, emulsões. Embora as vias de administração preferenciais regionais sejam para os pulmões, a composição farmacêutica pode ser administrada sistemicamente ou topicamente ou por via transdérmica, separadamente a partir de, ou concorrentemente com, a instilação para os pulmões.

[166] Outros carreadores farmaceuticamente aceitáveis para as composições do presente invenção são os lipossomas, composições farmacêuticas em que o polipeptideo ativo está contido disperso ou variadamente presente em corpúsculos constituídos por camadas concêntricas aquosas aderentes às camadas lipidicas. 0 polipeptideo ativo está preferencialmente presente na camada aquosa e na camada lipidica, dentro ou fora, ou, em qualquer caso, no sistema não homogêneo geralmente conhecido como uma suspensão lipossômica. A camada hidrofóbica, ou camada lipidica, geralmente, mas não exclusivamente, compreende fosfolipideos como lecitina e esfingomielina, esteroides como colesterol, substâncias ativas de superfície mais ou menos iônicas como o dicetilfosfato, estearilamina ou ácido fosfatidico, e/ou outros materiais de uma natureza hidrofóbica. Os especialistas na técnica irão apreciar outras modalidades adequadas das presentes formulações lipossômicas.

[167] A dosagem terapêutica administrada é uma quantidade que é terapeuticamente eficaz, como é conhecido ou facilmente determinável pelos especialistas na técnica. A dose também depende da idade, saúde e peso do receptor, tipo de tratamento concomitante, se houver, frequência do tratamento, e natureza do efeito desejado.

Métodos Terapêuticos

[168] Os métodos da presente invenção podem ser utilizados para tratar a fibrose pulmonar ou fibrose pulmonar idiopática, num sujeito com necessidade dos mesmos. 0 termo "tratamento" é definido de modo amplo para incluir, pelo menos, o seguinte: inibir, reduzir, melhorar, prevenir, reduzir a ocorrência ou recorrência, incluindo a frequência e/ou tempo de recorrência, ou a gravidade dos sintomas da doença ou condição a ser tratada ou prevenida. Isto pode ocorrer como resultado da inibição da morte celular epitelial, inibição da proliferação de fibroblastos, qualquer um dos outros mecanismos biológicos ou bioquimicos aqui divulgados como estando associados com ou são responsáveis pela IPF.

[169] NTL, NTL análogo, ou peptideo ou derivado peptideo ou sal farmaceuticamente aceitável é administrado preferencialmente sob a forma de uma composição farmacêutica como descrito acima.

[170] As doses do composto de um modo preferencial incluem unidades de dosagem farmacêuticas compreendendo uma quantidade eficaz do peptideo ou NTL. Forma de dosagem unitária refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para um sujeito mamifero; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de material ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com o carreador farmacêutico requerido. A especificação para as formas de dosagem unitárias da invenção são ditadas por e diretamente dependentes de (a) as características únicas do material ativo e do efeito terapêutico particular a ser alcançado, e (b) as limitações inerentes na técnica de compor um dito composto ativo para o tratamento de, e de sensibilidade, sujeitos individuais.

[171] Por uma quantidade eficaz entende-se uma quantidade suficiente para atingir uma concentração regional ou uma concentração em estado estacionário in vivo, o que resulta em uma redução mensurável em qualquer parâmetro relevante de doença.

[172] A quantidade de composto ativo a ser administrada depende do NTL, NTL derivado, peptideo ou derivado do mesmo selecionado, da doença ou condição exata, a via de administração, a saúde e peso do receptor, a existência de outro tratamento concorrente, se existir, a frequência do tratamento, a natureza do efeito desejado, e o julgamento do praticante especialista.

[173] Uma dose única preferencial, administrada uma vez por dia para o tratamento de um sujeito, preferencialmente um mamifero, mais preferencialmente humano que está em sofrimento, ou susceptivel a IPF deste resultante é de entre cerca de 0,2 mg kg e cerca de 250 mg/kg, preferencialmente entre cerca de 10 mg/kg e cerca de 50 mg/kg, por exemplo, através de instilação (por inalação) . Uma dita dose pode ser administrada diariamente durante qualquer lugar a partir de cerca de 3 dias a uma semana ou mais. A administração crônica também é possivel, embora a dose possa ter de ser ajustada para baixo, como é bem compreendido na técnica. As faixas precedentes são, no entanto, sugestivas, já que o número de variáveis em um regime de tratamento individual é grande, e excursões consideráveis a partir destes valores preferenciais são esperadas.

[174] Para a administração continua, por exemplo, por um sistema de bomba como uma bomba osmótica que foi utilizada em alguns dos experimentos descritos abaixo, uma dosagem total para um curso de tempo de cerca de 1-2 semanas é, preferencialmente na faixa de 1 mg/kg a 1 g/kg, de um modo preferencial 20-300 mg/kg, mais preferencialmente 50-200 mg/kg. Depois de um dito regime de dosagem continua, a concentração total do composto ativo é preferencialmente na faixa de cerca de 0,5 a cerca de 50 μM, preferencialmente cerca de 1 a cerca de 10 μM.

[175] Uma concentração eficaz do composto ativo para a inibição ou prevenção de inibir a apoptose in vitro, está na faixa de cerca de 0,5 nM a cerca de 100 nM, mais preferencialmente de cerca de 2 nM a cerca de 20 nM. As doses eficazes e os intervalos de dose ideal podem ser determinados in vitro utilizando os métodos aqui descritos.

[176] Tendo agora descrito geralmente a invenção, a mesmo será mais facilmente compreendido através de referência aos seguintes exemplos, que são fornecidos a titulo de ilustração, e não se destinam a ser limitativos da presente invenção, a menos que especificado. Os exemplos são incluidos para demonstrar modalidades preferenciais da invenção. Deve ser apreciado pelos especialistas na técnica que as técnicas divulgadas nos exemplos que se seguem representam técnicas descobertas pelo invenção para funcionar bem na prática da invenção, e assim podem ser consideradas como constituindo modos preferenciais para a sua prática. No entanto, os especialistas na técnica devem, à luz da presente descrição, apreciar que muitas alterações podem ser feitas nas modalidades especificas que são reveladas e ainda assim obter um resultado igual ou semelhante sem se afastar do espirito e escopo da invenção.

EXEMPLO I Expressão de p53 em FL-Fibroblastos mortos em Focos fibróticos de Pulmões IPF

[177] Coloração de seções de pulmão de pacientes IPF e sujeitos de controle "normais" com vários reagentes, incluindo por imunohistoquimica (IHQ) (ver Fig. 2A-2I) revelou que os tecidos IPF exibem focos fibróticos que são densos com ECM. FL- fibroblastos dispersos nos focos ricos em vimentina apresentaram coloração minima para antigenos p53 e PAI-1. No entanto, a coloração de imunofluorescência para SP-C, PAI-1, p53 e caspase- 3 ativa (não mostrados) demonstraram que as células alveolares tipo II (ATII) que rodeiam os focos fibróticos mostram coloração elevada para antigenos p53 e PAI-1, e são positivos para caspase-3 ativa, o que indica a apoptose de células ATII circundantes. Os resultados IHC revelam que as células ATII que encerram focos fibróticos continuamente morrem devido a um aumento da expressão de p53 e PAI-1. Estas feridas são substituídas por fibroblastos ativados que mostram p53 mínima basal e PAI-1, e elevada coloração de ki-67 indicando a proliferação devido à supressão de p53 e expressão de PAI-1.

EXEMPLO II Diminuição de Caveolina-1, p53 e PAI e Aumento da uPA em Humanos FL fibroblastos dos pulmões IPF

[178] Os lisados celulares de fibroblastos NL- e FL- foram coradas imunologicamente para revelar alterações nas proteínas e um miRNA. Veja Fig.3A-3B. A expressão basal de miR- 34a foi significativamente menor nos FL-fibroblastos indicando que reduziu a expressão da p53 e consequentes alterações no cross-talk de sistema fibrinolitico p53-uPA contribuiu para fibrogênese. Essas alterações estão associadas com o aumento da col-I e inibição de miR-34a. Os resultados demonstraram ainda que o aumento na transcrição de miR-34a induzida por p53 ou estabilização de p53 em fibroblastos humanos mediadas por FL- fibroblastos mediada por miR-34a pode atenuar a fibrose pulmonar.

EXEMPLO III Expressão disparate de mRNAs de uPA, PAI-1 e col-I por fibroblastos de Pulmões IPF e "normais".

[179] 0 RNA total isolado a partir de tecidos pulmonares de sujeitos "normais" e pacientes com IPF ou NL- foram testados para mRNA de uPA, PAI-1 e col-I por RT-PCR quantitativa e normalizados para os niveis de mRNA correspondentes de β-actina. Os resultados são mostrados nas Figs. 4A-4B.

[180] Expressão de mRNA de col-I e PAI-1 aumentou significativamente em tecidos pulmonares IPF enquanto que mRNA de uPA foi reduzida. Curiosamente, ao contrário de tecidos pulmonares IPF, mRNA De col-I e uPA e menor nivel de expressão de mRNA de PAI-1 foram encontradas em FL-fibroblastos em comparação com NL-fibroblastos. A proteina uPAR e mRNA também são elevados em FL-fibroblastos. A elevada PAI-1 nos tecidos pulmonares pode ser atribuida a um aumento da expressão de PAI-1 por células epiteliais do pulmão ou macrófagos, em vez de FL(IPF)-fibroblastos. Isto é consistente com um aumento da expressão de col-I, uPA e uPAR e proteinas PAI-1 reduzidas em FL-fibroblastos de pulmão IPF (ver Figura 3A).

EXEMPLO IV Expressão Diferencial de uPA e PAI-1 por FL- vs NL- fibroblastos de camundongos

[181] FL-fibroblastos foram isolados dos pulmões de camundongos 21 dias após a lesão BLM ou NL-f ibroblastos de camundongos de controle expostos a salina intranasal, conforme descrito em outro local26. Os lisados de NL- e FL- fibroblastos foram corados imunologicamente. Alterações na expressão de proteinas p53, de uPA, PAI-1 e col-I foram detectadas por imunotransferência de lisados de células de NL- e FL- fibroblastos.(Fig. 5A-5D). 0 RNA total foi extraido a partir de NL- e FL- fibroblastos de tecidos de pulmão do camundongo dos tecidos pulmonares dos camundongos com fibrose induzida por BLM ou de controle (tratados com salina) e testados para mRNA de uPA, PAI-1 e col-I. As taxas de proliferação de NL e FL- fibroblastos de camundongos foram comparados. Consistente com FL(IPF)-fibroblastos de pulmões IPF2, a taxa basal da proliferação de FL(BLM)-fibroblastos murinos foi significativamente maior do que de NL-fibroblastos (a partir de camundongos tratados com salina). p53 inibiu a transcrição do gene do uPA, simultaneamente ligado a um promotor de PAI-1 e transcrição aumentada de mRNA de PAI-133'34 . p53 também inibiu a expressão de uPA e uPAR por desestabilização das suas transcrições, enquanto a estabilização do transcrito de PAI-123' 25. Por último, inibição de qualquer uPA ou uPAR aumenta a expressão da p53 e indução mediada por p53 a jusante de PAI-1, aumentando assim a senescência celular e apoptose. Concluiu-se que a regulação mediada por p53 de sistema uPA-fibrinolitico nos niveis de transcrição e pós-transcrição está comprometida em FL- fibroblastos devido à ausência da expressão de p53. Isto leva a um aumento de uPA e uPAR, e inibição de PAI-1 nestas células.

EXEMPLO V CSP Aumenta Expressão de p53 via indução de miR-34a em FL(IPF)-Fibroblastos.

[182] NL- e FL-fibroblastos foram tratados com PBS, CSP e CP e analisados para RNA para miR-34a por PCR em tempo real. Além disso, os FL-fibroblastos foram cultivados na presença de PBS ou CSP ou CP com ou sem o miR-34a antissenso (miR-34a-AS) ou pré-miR-34a (controle miRNA). 0 meio condicionado (CM) a partir destas culturas foi imunotransferido para PAI-1 e lisados celulares (CL) foram corados imunologicamente para p53. Em um experimento, FL-fibroblastos foram tratados com PBS ou CSP ou CP ou na presença ou ausência de miR-34a-AS, pré-miR-34a ou controle miR. 0 RNA foi analisado para alterações em miR-34a por PCR em tempo real. Os resultados são apresentados nas Figuras 6A-6C.

[183] Uma série de deleções sobrepostas foi realizada em CSP e estes fragmentos peptidicos foram testados em FL- fibroblastos para alterações em p53, uPA, PAI-1 e col-I (Fig. 6D) .

[184] CSP aumentou significativamente expressão de miR- 34a e de p53 em FL- mas não em NL-fibroblastos. A indução de p53 por CSP foi imitada por expressão de pré-miR-34a sozinho e abolido pela inibição de miR-34a por miR-34a-AS. Isto indicou que a indução de p53 ocorre através da estabilização mediada por miR-34a.

[185] A análise de deleção do CSP 20mer revelou que um fragmento interno de 7 aminoácidos, denominado CSP-4 e tendo a sequência FTTFTVT (SEQ ID NO: 1) apresentou a atividade do peptideo de comprimento total. Isto permite concluir que o efeito salutar de CSP-4 em FL-fibroblastos ou camundongos com fibrose pulmonar estabelecida (ver figura 11A-11D), envolve o controle de p53 e expressão de miR-34a.

EXEMPLO VI Mdm2 mediou o aumento da degradação de proteínas p53 em FL(IPF)-Fibroblastos.

[186] Os lisados de NL- e FL- fibroblastos foram corados imunologicamente para p53 e mdm2 ou imunoprecipitados com anticorpo anti-mdm2 e imunotransferidos (IB) para a proteína p53 associada. Os resultados mostraram a interação robusta mdm2-p53 em NL-fibroblastos que estavam ausentes em FL-fibroblastos (ver Fig 7A-7B) , apesar de niveis elevados de mdm2 nos FL- fibroblastos. Assim, o aumento da degradação mediada por mdm2 da proteina p53 contribuiu para a supressão acentuada dos niveis de p53 basal em FL-fibroblastos, suportando a utilização de intervenções terapêuticas aqui divulgadas para ter como alvo a interação de mdm2 e p53.

EXEMPLO VII Inibição mediada por Nutlina-3a (NTL) ou CSP-4 da Expressão de col-I em FL(IPF)-fibroblastos: Papel do cross-talk de sistema fibrinolitico p53

[187] FL-fibroblastos foram expostos a PBS (controle), nutlina-3a (10 μM) , CSP-4 (10 nM) ou CP durante 48 horas. Os lisados foram imunotransferidos para a expressão de col-I, PAI- 1, p53, e uPA. Os resultados são mostrados na Fig. 8A-8B. FL- cultivados foram expostos ao veiculo (PBS) ou nutlina-3a, CSP-4 ou CP e contados para avaliar a proliferação. Os resultados mostraram que ambas nutlina-3a e CSP-4 inibiram a expressão de col-I e a proliferação de FL-fibroblastos. O processo envolve a indução de expressão de p53 e PAI-1, e a inibição concomitante do uPA.

[188] Num outro experimento (resultados na Fig. 8C), FL- fibroblastos foram transduzidos com o vetor de adenovirus expressando p53, PAI-1 ou caveolina-1 ou os controles de vetor apropriados e cultivados durante 2 dias em cujo tempo os lisados celulares foram imunotransferidos para col-I, p53, PAI-1, e uPA. Transdução de FL-f ibroblastos de pulmões IPF com p53 e PAI-1 induzida por Ad-Cav-1, inibindo a expressão de uPA e col-I. Os efeitos de nutlina-3a ou CSP-4 em FL-fibroblastos foram imitados expressando p53 ou PAI-1 ou caveolina-1 sozinhos. Por conseguinte, a indução mediada por p53 de PAI-1 e inibição da expressão de uPA contribuem para a inibição de col-I. Curiosamente, o tratamento de FL-fibroblastos dos pulmões dos pacientes com IPF ou camundongos tratados com BLM com proteina PAI-1 recombinante não conseguiu induzir a apoptose ou senescência (não mostrado), enquanto que o PAI-1 exógeno elevado induziu apoptose de células ATII, tanto in vitro como in vivo. A resistência dos FL-fibroblastos para PAI-1 exógena permitiria que essas células florescessem em um ambiente rico em proteina PAI-1 de pulmões IPF ou lesionados por BLM.

EXEMPLO VIII Papel de Cross-talk de Sistema p53-Fibrinolitico em Indução de expressão de col-I em NL-fibroblastos.

[189] NL-fibroblastos isolados a partir de pulmões histologicamente "normais" humanos2 (S. Shetty et al, 1996, supra) foram transfectados com um vetor lentiviral carreando p53 shRNA para inibir a expressão de p53 basal. As células de controle foram tratadas de modo semelhante com um shRNA não especifico. O meio condicionado a partir das culturas foi imunotransferido para o PAI-1, uPA, e col-I solúvel, e os lisados de células foram testados para a p53 e a-SMA. O RNA total isolado a partir destes fibroblastos foi analisado para alterações na expressão de mRNA de uPA, PAI-1 e col-I por RT-PCR quantitativo. Os resultados (na Fig 9A-9B) mostram que a inibição da expressão de p53 em NL-fibroblastos aumentada de uPA, col-I e a-SMA, mas inibiu PAI-1. Isso apoia a ligação descrita aqui entre as alterações mediada por p53 no sistema uPA e fibrogênese.

EXEMPLO IX Nutlina-3a Inibe a fibrose pulmonar em camundongos tratados com BLM

[190] Os camundongos expostos a BLM (ou salina nos controles) para 14 dias para induzir a fibrose pulmonar foram injetados IV com nutlina-3a (10 mg/kg de peso corporal) (Zhang et al, supra) ou um controle de veiculo para determinar o efeito sobre fibrose pulmonar estabelecida foram avaliados. A fibrose foi avaliada por tomografia computadorizada e função pulmonar (complacência e resistência) foram medidas utilizando o sistema Flexivent. Seções de pulmão foram submetidas à coloração com tricromo e coloração com H & E (este último não representado) para avaliar a arquitetura pulmonar e deposição de colágeno, como uma indicação de fibrose. Finalmente, homogeneizados de pulmão total foram analisados para colágeno total (hidroxiprolina) e conteúdo de desmosina (Bhandary YP et al, Am J Physiol: Lung Cell Mol Physiol 302: L463-73, 2012; Bhandary YP et al, Am J Pathol, 183: 131-43 2013) como uma avaliação independente da ECM. Os resultados (Fig 10-10D) de todos os testes acima ditos indicou um efeito benéfico de nutlina-3a em fibrose pulmonar. A administração oral de nutlina-3a 14 dias após a lesão BLM da mesma forma inibiu a fibrose pulmonar em camundongos.

EXEMPLO X Peptideo CSP-4 Inibe a Fibrose pulmonar estabelecida e melhora a função pulmonar.

[191] Os camundongos foram expostos a BLM para induzir a fibrose pulmonar. Após 14 dias, os camundongos foram injetados IV com qualquer veiculo ou 1,5 mg/kg de peso corporal de CSP-4 (SEQ ID NO: 1) ou peptideo de controle (sequência misturada dos mesmos aminoácidos; CP, SEQ ID NO: 5)) com 1,5 mg/kg de peso corporal ou o veiculo foi injetado por via intravenosa em camundongos expostos a BLM 14 dias mais cedo. Uma semana mais tarde, os camundongos foram testados por varrimento de CT para avaliar a fibrose pulmonar. 0 volume pulmonar foi medida nos mesmos camundongos utilizando rendições CT quantitativas. Seções de pulmão foram submetidas coradas (tricromo e H & E) para avaliar a deposição de colágeno como um indicador da fibrose pulmonar. Homogeneizados de pulmão total foram analisados para hidroxiprolina total e conteúdo de desmosina (os últimos resultados não apresentados). Os resultados estão nas Figs. 11A- 11D. Todos os testes mostraram que o CSP-4 inibiu fibrose pulmonar induzida por BLM. Consistente com os efeitos in vitro de ambos CSP e CSP -4 em FL-fibroblastos de pulmão IPF (ver FIG 6D) , o CSP-4 exerceu um efeito benéfico in vivo contra fibrose pulmonar estabelecida, imitando os efeitos salutares do peptideo de comprimento total, CSP (SEQ ID NO: 3) .

EXEMPLO XI Peptideo CSP-4 e nutlina-3a inibem a proliferação de FL- fibroblastos.

[192] Os camundongos expostos a BLM 14 dias antes foram tratados com CSP-4 ou o seu controle (CP) ou nutlina-3a IV (como nos Exemplos IX e X) . Sete dias mais tarde seções de pulmão foram obtidas e submetidas a IHC para o Ki-67 para avaliar a proliferação celular (ver Figs. 12A) . 0 aumento da coloração para antigenos ki-67 observadas em seções de pulmão de camundongos fibróticos foi significativamente reduzido pelo tratamento com nutlina-3a ou CSP-4. Os fibroblastos isolados a partir dos pulmões destes animais (como descrito no Exemplo X) foram testados para as alterações na expressão de col-I, e p53 do uPA a jusante e proteinas PAI- 1 por Western blotting, e o mRNA por RT-PCR quantitativo (ver Figs. 12B-12C). FL-fibroblastos de camundongos com fibrose induzida por BLM estabelecida mostraram aumento de mRNA de uPA e col-I e expressão de proteina em comparação com NL-fibroblastos de camundongos sem lesão pulmonar. Estas células também demonstraram expressão minima de p53 e PAI-1. No entanto, em fibroblastos de camundongos tratados com nutlina-3a, uPA e proteina col-I e a expressão de mRNA foram suprimidos de modo significativo. Estas alterações foram associadas com a indução marcada da proteina p53, e proteina PAI-1 e expressão do mRNA, indicando que a restauração do cross-talk do sistema p53 - fibrinolitico atenua fibrose.

EXEMPLO XII Inibição de alterações fibróticas por tratamento ex vivo com CSP-4 ou nutlina-3a

[193] Os camundongos foram expostos a BLM intranasal por 21 dias para induzir a fibrose pulmonar, sacrificados e os seus pulmões excisados e cortados em pequenos pedaços e colocados em meio de cultura. Estas amostras de tecido foram depois tratadas com 10 nM de peptideo CSP-4, peptideo de controle (CP) ou nutlina-3a por 72h. Meio condicionado e lisados de tecido foram analisados para alterações em col-I e a-SMA por Western blotting. Os resultados (Fig. 13) mostraram que o tratamento de explantes de tecido pulmonar fibróticos com CSP-4 ou nutlina-3a inibiu a fibrose ex vivo. 0 peptideo CSP de comprimento completo gerou inibição semelhante de col-I e a-SMA (resultados não mostrados) . Nutlina-3a e CSP-4 são esperados para agir de forma semelhante a afetar os tecidos do pulmão IPF humano ex vivo. Resultados dos presentes inventores fornecidos aqui e em relatórios recentes (por exemplo, Bhandary et al, 2012, 2013, supra), apoiam fortemente a concepção de que mudanças mediadas por p53 à jusante em uPA e PAI-1 regula a viabilidade de FL- fibroblastos.

EXEMPLO XIII Expressão de p53 em FL-fibroblastos e Reversão a jusante do Sistema uPA-fibrinolitico atenua Fibrose Pulmonar In vivo.

[194] Os resultados relatados aqui e em outros lugares (Bhandary YP et al, 2012, supra) Shetty SK et al, Am J Respir Cell Mol Biol 47: 474-83, 2012) mostram que a administração IP ou IV do CSP ou CSP-4 (Fig. 11A-11D) , ou IV, ou a administração oral de nutlina-3a em camundongos tipo selvagem (WT) (Figura 10A-10D), com inicio 14 dias após BLM atenua a fibrose pulmonar estabelecida. Por conseguinte, a degradação mediada por mdm2 da proteina p53 e da perda à jusante do cross-talk de sistema p53- uPA aumenta a viabilidade de FL-fibroblastos e produção de ECM in vivo, conduzindo à destruição da arquitetura pulmonar e perda de função pulmonar. Como os pacientes muitas vezes apresentam-se com estágios avançados de IPF (no momento do diagnóstico inicial), os mecanismos pelos quais nutlina-3a e CSP-4 inibem a fibrose pulmonar estabelecida são avaliados e os alvos a jusante de nutlina-3a e CSP-4 são identificados. Estes estudos utilizam tecidos pulmonares de pacientes IPF e camundongos com fibrose pulmonar avançada devido a lesão pulmonar BLM. A contribuição e a especificidade de cross-talk de sistema p53-uPA é confirmada usando camundongos deficientes em uPA, uPAR, PAI-1 e p53.

A. Determinação dos efeitos de nutlina-3a e CSP-4 no tratamento de fibrose utilizando tecidos FL (FPI) ex vivo.

[195] Os tecidos pulmonares FL recém dissecados de pacientes com IPF são tratados com nutlina-3a (lOμM) ou CSP-4 (10 nM) durante 3 a 7 dias (ver Figura 13). Tecidos de pulmão homogeneizados e são testados para mudanças em ECM (hidroxiprolina e desmosina) . Os controles incluem tecidos pulmonares fibróticos (FL) de pacientes com IPF tratados com veiculo ou com peptideo de controle, CP ou tecidos pulmonares naive mantidos em meio de cultura. Outros controles incluem NL- tecidos ressecados de pulmões histologicamente "normais". Pulmões de paciente de-identifiçado ("normal" e IPF) que não foram adequados para o transplante e doados para a investigação médica são obtidos por meio de IIAM (Edison, NJ) e NDRI (Philadelphia, PA) e usados para estudos ex vivo. Os fibroblastos são isoladas a partir destes tecidos e analisados para alterações em expressão de p53, uPA, uPAR e PAI-1, produção de ECM e viabilidade. As alterações na taxa de sintese de ECM são também medidas. Explantes de tecido FL de pacientes com IPF têm elevada de sintese de ECM quando em comparação com os niveis de expressão nas fatias de NL-tecidos a partir de sujeitos de controle. No entanto, os explantes de pulmão FL tratados com nutlina-3a ou CSP-4 mostram reduzidas significativamente as taxas de sintese de ECM quando comparadas com aqueles que permanecem sem tratamento ou expostos a veiculo sozinho ou CP. Os fibroblastos isolados a partir de explantes IPF tratados com ou nutlina-3a ou CSP-4 mostram niveis elevados de p53, miR-34a e PAI-1, e reduzida expressão de uPA e uPAR. A fosforilação de Akt e expressão de mRNA de PDGFR-β e proteinas também é reduzida em fibroblastos a partir de explantes IPF tratados com nutlina-3a ou CSP-4. A taxa de proliferação e produção de ECM desses fibroblastos é significativamente mais baixa do que de FL- fibroblastos a partir controles não tratados ou tratados com veiculo ou que foram tratados com CP, mas comparável com a de fibroblastos isolados a partir de NL-tecidos.

B. Papel da p53 e miR-34a no controle da fibrose pulmonar.

[196] Com base nos resultados acima, prevê-se que a falta de expressão de p53 e de miR-34a por FL-f ibroblastos contribui para a fibrose pulmonar e que a recuperação basal de expressão de p53 por nutlina-3a ou CSP-4 através da indução de miR-34a reduz a fibrose pulmonar. Uma vez que a fibrose pulmonar máxima ocorre entre 14-28 dias após a lesão BLM (Bhandary YP et al, 2012, supra; Bhandary YP et al, 2013, supra; e os dados aqui apresentados) pré-miR-34a é expresso em fibroblastos de pulmão do camundongo por injeção IV de lentivirus (LV) contendo promotor de colágeno proα2(I) com pré-miR-34a aos 14 e 21 dias após a lesão pulmonar BLM. Fibrose pulmonar é avaliada 28 dias depois. O papel do miR-34a na mitigação mediada por nutlina-3a ou CSP-4 de fibrose pulmonar é confirmado pela expressão LV de miR-34a-AS em fibroblastos usando promotor proo<2(I) nos pulmões fibróticos.

[197] O papel da p53 nos efeitos salutares contra a fibrose pulmonar é confirmado diretamente pela expressão de p53 em fibroblastos de pulmão de camundongos com fibrose estabelecida usando LV ou Ad-p53 contendo promotor de colágeno proα(I) com ou sem inibição do miR-34a. Fibrose pulmonar e expressão de miR-34a é avaliada, por exemplo, 28 dias após a lesão BLM. Alternativamente ou adicionalmente, a expressão de p53 é inibida utilizando LV shRNA em camundongos WT com fibrose pulmonar induzida por BLM ou uso de camundongos deficientes em p53 com fibrose pulmonar estabelecida (Davis DW et al, J Exp Med 192: 857-869, 2000). Estes camundongos são então expostos a nutlina-3a ou CSP-4, por exemplo, 14 e 21 dias após a lesão BLM. Os camundongos de controle com fibrose pulmonar são expostos a shRNA não especifica ou camundongos WT naive e tratados com nutlina-3a ou CSP-4. Os camundongos são testados para a fibrose pulmonar e expressão de miR-34a, por exemplo, 28 dias após o inicio da lesão BLM. A contribuição do cross-talk de sistema p53-uPA é confirmada por exposição de camundongos WT, deficientes em p53, uPA, uPAR e PAI-1 para BLM para 14-21 dias para induzir fibrose pulmonar, alterar a expressão de miR-34a em fibroblastos, como descrito acima, e testar os efeitos na fibrose, por exemplo, no dia 28 após a lesão BLM.

C. Restauração da expressão da p53 e p53-uPA a jusante do cross-talk de sistema fibrinolitico por nutlina-3a ou CSP-4 inibe a fibrose pulmonar.

[198] A contribuição de cross-talk de sistema fibrinolitico p53-uPA na mitigação de fibrose pulmonar por nutlina-3a e CSP-4 em camundongos é confirmada isolando fibroblastos destes camundongos, por exemplo, 28 dias após a lesão BLM. Estas células são testadas para alterações em expressão de p53, uPA, uPAR e PAI-1 e produção da ECM. Esperamos encontrar que os FL-fibroblastos isolados dos pulmões de camundongos com lesão BLM mostrarão elevados uPA e uPAR, viabilidade e produção de ECM. Estes FL-fibroblastos mostram expressão de p53 minima e PAI-1 em comparação com NL- fibroblastos de pulmões não lesionados. No entanto, os fibroblastos dos pulmões dos camundongos com fibrose induzida por BLM expostos a nutlina-3a ou CSP-4 mostram p53 elevada. Estas células são menos proliferativas com uma produção minima de ECM. A expressão de uPA e uPAR é reduzida enquanto PAI-1 aumenta em comparação com FL-fibroblastos obtidos a partir de camundongos lesionados BLM. Niveis de uPA, uPAR e PAI-1 em fibroblastos de pulmão de camundongos tratados com BLM + nutlina-3a ou BLM + CSP-4 são comparáveis aos NL-fibroblastos isolados a partir de camundongos não lesionados.

[199] Para confirmar o envolvimento do cross-talk de sistema p53-uPA, FL-fibroblastos extraidos de pulmões lesionados por BLM de camundongos são transduzidos com Ad-p53. Os fibroblastos de pulmões lesionados por BLM expostos a nutlina-3a ou CSP-4 são os controles positivos, enquanto aqueles expostos a CP ou Ad-EV são controles negativos. As células são testadas para mudanças em uPA, uPAR e PAI-1.

[200] Transdução de Ad-p53 ou o tratamento com nutlina- 3a ou CSP-4 aumenta PAI-1 e inibe a expressão de uPA e uPAR. Estas células suprimem a produção de ECM e uma taxa de proliferação em comparação com FL-fibroblastos expostos a CP ou Ad-EV. FL-fibroblastos de camundongos BLM expressam niveis extraordinariamente baixos de caveolina-1 e a expressão da caveolina-1 atenua o excesso de produção de ECM. Portanto, FL- fibroblastos são transduzidos com Ad-Cav-1 para ver se p53 e mudanças à jusante mediadas por p53 em sistema uPA fibrinolitico, ECM e viabilidade celular são reduzidas em comparação com os tratados com Ad-EV.

D. Papel da mediada por nutlina-3a- ou CSP-4 na inibição da fosforilação de Akt na mitigação de fibrose pulmonar.

[201] FL-fibroblastos exibem elevada fosforilação de Akt e expressão de PDGFR-β que fornece sinais de sobrevivência (Stambolic V et al Mol Cell 8: 317-25, 2001; Li J et al J Environ Pathol Toxicol Oncol 23: 253-66, 2004; Hoyle GW et al Am J Pathol 154: 1763-75, 1999; Meinecke AK et al Blood 14: 119: 5931-42, 2012). Além disso, a p53 aumenta a expressão de PTEN (Stambolic et al, supra; Mayo LD, et al J Biol Chem 277: 548489, 2002) e inibe a PDGFR-β (Widau RC et al, Mol Cell Biol 32: 4270-82, 2012; Thornton JD et al, Cell Cycle 4:1316-9 de 2005), enquanto que o PAI-1 inibe a fosforilação de Akt (Shetty SK et al, 2012, supra; Stambolic et al, supra, Malinowsky K et al Transl Oncol 5: 98-104, 2012). Transdução de FL-fibroblastos com Ad-Cav-1 inibe a fosforilação da Akt através do aumento da atividade PTEN (Tourkina E et al Open Rheumatol J. 6: 116-22 2012; Wang XM et al J Exp Med 203: 2895-906, 2006; Xia H et al Am J Pathol 176: 2626-37, 2010).

[202] Os resultados aqui apresentados mostraram que nutlina-3a e CSP-4 aumentam p53 e reprimem a produção de ECM em FL-fibroblastos, e mitigam a fibrose pulmonar induzida por BLM. Os inventores da presente invenção, por conseguinte, conceberam que a inibição de Akt e sinais de sobrevivência PDGFR-β em FL- fibroblastos, devido à indução de p53 e alterações em cros-talk de sistema fibrinolitico p53-uPA, atenua a fibrose. Para testar isto, FL-fibroblastos de pulmões de camundongos lesionados por BLM são testados para a fosforilação de Akt e expressão de PDGFR-β. As respostas são comparadas com os fibroblastos extraidos a partir de camundongos tratados com nutlina-3a ou CSP-4 ou CP após a lesão por BLM. Espera-se que FL-fibroblastos de camundongos lesionados por BLM tenham uma expressão minima de p53 basal e a fosforilação de Akt elevada. Expressão de PDGFR-β é esperada aumentar em FL-fibroblastos. p53 deve ser aumentada em fibroblastos de camundongos tratados com ou nutlina-3a ou CSP-4, que conduz à inibição da fosforilação de Akt e expressão de PDGFR-β. Uma vez que FL-fibroblastos de camundongos lesionados por BLM expressam mais uPA e uPAR, estes fibroblastos manifestarão aumento da viabilidade e ECM comparação com fibroblastos de camundongos tratados com BLM mais nutlina-3a ou CSP-4. No entanto, a transdução de FL-fibroblastos de camundongos BLM com Ad-p53 ou Ad-Cav-1 irá reduzir a fosforilação da Akt e PTEN, expressão de PDGFR-β, a viabilidade celular e produção de ECM em comparação com células de controle tratadas com Ad-EV. A inibição da p53 usando shRNA vai inibir a produção de ECM, expressão de PDGFR-β e viabilidade de FL- fibroblastos expostos a Ad-Cav-1 ou nutlina-3a ou CSP-4. Estas células irão mostrar elevada uPA e uPAR com o minimo de PAI-1 em comparação com FL-fibroblastos transduzidos com Ad-Cav-1 ou nutlina-3a ou CSP-4 na presença de shRNA controle.

[203] De acordo com a presente invenção, porque pacientes com IPF, muitas vezes apresentam-se com doença fibrótica avançada no momento do diagnóstico, ter como alvo FL- fibroblastos tem uma vantagem clinica sobre a prevenção de apoptose celular ATII ou transição mesenquimal epitelial. Nutlina-3a e CSP-4 induzem eficazmente a p53 apenas em FL- fibroblastos acentuadamente reduzidos para o p53 basal e a expressão elevada de mdm2 em FL-fibroblastos em comparação com NL-fibroblastos ou células ATII em pulmões lesionados. Isto é particularmente verdadeiro com células expressão de caveolina-1 e p53 em ATII, que é marcadamente aumentada nos pulmões dos pacientes com IPF ou camundongos com lesão pulmonar BLM. Com base neste experimento, outra indução de p53 em células ATII não está prevista em resposta a nutlina-3a ou CSP-4 por causa dos niveis basais mais elevados em pulmões BLM ou IPF. De fato, os presentes inventores e seus colegas descobriram que CSP ou CSP-4 inibiram expressão de célula ATII induzida por fumaça de cigarro ou BLM e apoptose (Bhandary et al, 2012, 2013, supra; Shetty SK et al, Am J Respir Cell Mol Biol 47: 474-83, 2012) através do bloqueio de fosforilação de p53 de serina-15 mediada por ATM quinase ao competir com caveolina-1, que é de outro modo induzida em células ATII devido a lesão BLM para proteina fosfatase 2A-C (Volonte D et al, . J Biol Chem 284: 5462-66, 2009). Além disso, a ação de nutlina-3a em neutrófilos e macrófagos podia ter um efeito benéfico contra a inflamação através da inibição mediada por p53 de atividade de ligação ao DNA de NF-KB DNA e a produção de citocinas pró-inflamatórias (Liu G et al, J. Immunol 182:. 5063-71, 2009).

[204] Portanto, os beneficios de intervenções de nutlina-3a e CSP-4 superam quaisquer potenciais efeitos deletérios ou fora do alvo. Proliferação excessiva e produção de colágeno proa(I) pelos FL-fibroblastos deverá conduzir a expressão eficiente de pré-miR-34a e miR-34a antissenso em FL- fibroblastos utilizando LV após fibrose pulmonar induzida por BLM em camundongos (Liu et al X., Am J Physiol: Lung Cell Mol Physiol 298:L819-29, 2010; Merkel 0 et al, Cell Cycle 9: 2764-8, 2010) .

[205] Transdução de pulmões lesionados com BLM com Ad- Cav-1 (Wang XM et al. J Exp Med 203: 2895-906, 2006) inibe a fibrose apesar do aumento da expressão de caveolina-1 pelas células ATII durante a lesão BLM. Isto sugere que a expressão de p53, pré-miR-34 e miR-34a antissenso devem ser ainda eficaz mesmo se transduzir NL-fibroblastos, bem como FL-fibroblastos em camundongos com fibrose pulmonar estabelecida.

[206] As referências citadas acima são todas incorporadas aqui por referência, se especificamente incorporadas ou não.

[207] Tendo agora descrito completamente esta invenção, será apreciado por aqueles especialistas na técnica que a mesma pode ser realizada dentro de uma vasta faixa de parâmetros equivalentes, concentrações e condições sem se afastar do espirito e escopo da invenção e sem experimentação indevida.

Claims (7)

1. Uso de uma composição compreendendo um polipeptídeo recombinante que consiste em uma sequência de aminoácidos FTTFTVT (SEQ ID NO:1) caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para o tratamento de doença fibrótica em um sujeito.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo recombinante é capeado em seu N-terminal e/ou C-terminal.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo recombinante é um sal farmaceuticamente aceitável de FTTFTVT (SEQ ID NO: 1).

4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a composição compreende pelo menos um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o sujeito é humano.

6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a fibrose é fibrose pulmonar.

7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a fibrose é fibrose pulmonar idiopática.