KR102077333B1 - 단백질 탈 인산화 효소 1 억제 펩타이드를 포함하는 혈관 질환 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 단백질 탈 인산화 효소 1 억제 펩타이드(protein phosphatase 1 inhibitory peptides)를 포함하는 혈관 질환(vascular diseases) 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 PP1 (protein phosphatase 1)-매개 탈 인산화를 억제하여 혈관 평활근세포(vascular smooth nuscle cell, VSMCs)의 비이상적인 증식을 억제할 뿐만 아니라 혈관 내피세포 (vascular endothelial cells, VECs)의 eNOS를 활성화 시킴으로써 기능이상으로부터 회복을 유도하여 폐동맥 고혈압을 포함한 혈관질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

단백질 탈 인산화 효소 1 억제 펩타이드를 포함하는 혈관 질환 치료용 조성물{Compositions comprising protein phosphatase 1(PP1) inhibitory peptides for treating vascular diseases}
본 특허출원은 2016년 10월 24일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제 10-2016-0138612 호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 단백질 탈 인산화 효소 1 억제 펩타이드를 포함하는 혈관 질환 치료용 조성물에 관한 것이다.
혈관 리모델링 (Vascular remodeling)은 폐동맥 고혈압, 관상동맥 재협착. 동맥 경화 등 여러 질환에서 유도되는 현상으로 혈관 손상이나 자극으로 인해 진행된다[Pasterkamp G et al. (2000) Cardiovasc Res 45(4): 843-852]. 혈관의 구조적인 변화를 야기하는 이러한 현상은 세포 증식, 죽음, 기능 이상 등에 기인한다. 혈관의 구성요소 중 혈관 내피 세포 (Vascular endothelial cells, VECs)와 혈관 평활근 세포 (vascular smooth muscle cells, VSMCs)가 손상 및 자극에 반응하는 결정적인 매개체로 혈관의 리모델링을 주도한다[Rabinovitch M et al. (2012) J Clin Invest 122(12): 4306-4313]. VSMCs와 VECs의 상호작용 및 각자의 역할은 혈관의 긴장/이완 등 혈관의 항상성을 유지하는데 중요하다. 이러한 역할들이 비정상적으로 진행되는 병리학적인 조건에서 VECs의 기능이상 및 VSMCs의 이상증식 현상 등이 일어난다. 이처럼 이상증식으로 인해 수축성의 특성을 보이는 내막의 표현형과 더해서 동맥의 외막에 존재하는 섬유화 세포들에 의해 일어나는 세포외기질의 변화는 혈관 섬유화를 가속화 하고 결과적으로는 동맥 경직도를 더욱 증가시킴으로써 고혈압(Hypertension)의 표현형에 이르게 된다[Harvey A et al. (2016) Can J Cardiol 32(5) :659-668; Michell GF (2014) Hypertension 64(1):13-18].
VSMCs의 비정상적인 증식은 앞서 언급한 폐동맥 고혈압이나 대동맥 판막 재협착과 같은 혈관 증식성 질환의 근본적인 원인이다[Dzau VJ et al. (2002) Nature med 8:1249-1256; Novak K et al. (1998) Nature Med 4: 989-990]. 동맥벽이 손상되면 VSMCs가 내막 층으로 이동 (migration)하여 수축 및 정지로부터 표현형을 급격하게 변화시키고, 결과적으로 합성 및 증식으로 이어진다. 합성 표현형을 가진 VSMCs의 비정상적 증식은 신생 내막 성장(neointimal growth)이라고 불리는 현상인 동맥 내막의 확장을 초래한다[Austin GE et al. (1985) J Am Coll Cardiol 6: 369-375; Hanke H et al. (1992) Herz 12: 300-308]. 또한 폐동맥 고혈압 (Pulmonary arterial hypertension,PAH)에서 VSMCs 증식을 억제하는 Nitric oxide (NO), Prostacyclin (PGI2)등의 혈관 확장 물질이 줄어들고 엔도텔린-1(Endothelin-1)과 같은 혈관 수축 물질의 영향에 따라 VSMCs의 이상 증식을 초래한다[Hoeper MM et al. (2000) Engl J Med 342: 1866-1870; Giaid A et al. (1993) N Engl J Med 328: 1732-1739]. 따라서, VSMCs 증식의 조절은 혈관 증식성 질환의 치료에 중요한 요소이다.
VSMCs의 증식은 세포질 Ca2+ 수준의 만성 증가와 관련이 있는데, 이는 리아노딘 수용체(ryanodine receptor)와 SERCA2a (sarco/endoplasmic reticulum (SR) Ca2+-ATPase) 와 같은 Ca2+ 처리(handling) 단백질의 손실로 인해 나타난다[Vallot O et al. (2000) Aerterioscler Thromb Vasc Biol 20: 1225-1235]. SERCA2a 의 유전자 전달 매개 복원은 VSMC의 증식과 신생 내막 형성을 감소시킨다[Lipskaia L et al. (2005) Circ Res 97: 488-495; Lipskaia L et al. (2013) Gene Ther 20: 396-406] 따라서 SERCA2a 활성을 조절하여 낮은 세포질 Ca2+ 수준을 유지하는 것이 VSMCs 증식을 예방, 개선하는 합리적인 전략이 될 수 있다.
SERCA2a 활성은, PLB 포스포람반(phospholamban)과의 직접적인 상호 작용에 의해 억제된다. 억제 활성은 단백질 포스파타아제 1 (phosphatase1, PP1)에 의한 세린 16번째 또는 트레오닌 17번째의 탈 인산화에 의해 증가한다[Steenaart NA et al. (1992) Arch Biochem Biophys 293: 17-24; Mattiazzi A et al. (2005) Cardiovasc Res 68: 366-375; Schwinger RH et al. (1999) J Mol Cell Cardiol 31: 479-491; Sande JB et al. (2002) Cardiovasc Res 53: 382-391]. 따라서, PLB의 PP1-매개 탈 인산화의 억제는 손상된 심장에서 SERCA2a 활성을 상향 조절하는 합리적인 접근법이다. 본 발명자들은 이전에 9-mer 펩타이드인 ψPLB-SE가 인산화된 PLB를 모방하여 PP1의 데코이(decoy) 역할을 한다는 것을 보여주었다[Oh JG et al. (2013) J Mol Cell Cardiol 56: 63-71]. 이 펩타이드는 인 비트로(in vitro) 및 엑스 비보(ex vivo)에서 PLB의 탈 인산화를 억제함으로써 허혈/재관류 후 심장에서 SERCA2a 활성을 회복시켰다.
한편, 혈관 증식 관련 심혈관 질환에서 VECs의 의미는 단순히 해부학적인 경계막에 지나지 않는다. VECs는 혈관의 항상성을 유지하는 물질을 분비하는 중요한 하나의 장기이다. 여러 심혈관계 질환의 발생과 VECs의 기능은 밀접한 관계를 가지고 있으며 특히 고혈압을 유발하는 동맥 경화증의 발생과 진행에 중요한 역할을 한다. 폐동맥 고혈압의 경우 VECs의 기능이상 (Endothelial dysfunction)이 중요한 병인으로 알려져 있으며 실제로 VECs에서 분비되는 여러 물질 중 NO와 prostacyclin은 혈관이완제로서 작용하며 혈소판 응집을 억제하고 VSMCs의 증식을 억제하는 역할을 하는데 이는 폐동맥 고혈압과 같은 동맥경화성 질환의 진행을 억제하는데 중요한 과정이다[Giaid A et al. (1995) N Engl J Med 333: 214-221; Christman BW et al. (1992) N Engl J Med 327: 70-75].
폐동맥 고혈압 환자에서는 상기 혈관이완제들의 감소가 흔하게 보고되며 NO에 의해 활성화된 guanylate cyclase (GC)의 산물인 cyclic guanosine monophosphate (cGMP)가 Phosphodiestarease-5 (PDE-5)의 활성화로 인해 가수 분해된다. cGMP는 혈관 확장 및 세포 증식을 억제하는 기능을 하는데 PDE-5의 활성은 cGMP의 작용 시간을 줄이게 된다. 이러한 맥락에서 현재 PDE-5 억제제인 실데나필(sildenafil), 타다라필(tadalafil) 등이 개발되었다. 하지만 폐동맥 고혈압의 경우 PDE-5의 활성이 증가되어 있을 뿐만 아니라 VECs에서 NO를 생성해내는 능력 자체를 상실하고 있어 근본적으로 cGMP 수준 또한 감소되어 있기 PDE-5의 활성을 억제하는 것만으로는 한계가 있다고 알려져 있다. 실제 최근의 임상결과에서 장기복용에 대한 위험성이 제기되었다[Siehr SL et al. (2015) Front Pediatr 3: 12]. 이에 근본적으로 NO 생성을 증가시키기 위한 eNOS 발현 줄기세포 치료제와 GC 활성제가 임상시험 단계를 지나고 있다 [Wei L et al. (2013) Hypertens Res 36(5): 414-421; Granton J et al (2015) Circ Res 117(7): 645-654].
한편, 가족력을 가지는 폐동맥 고혈압 환자의 70-80% 경우 BMPR2 (Bone morphogenetic protein receptor 2) 유전자에 돌연변이가 보고되는데 BMPR2의 감소로 인해 VECs의 염증반응 관련 GM-CSF (graculocyte macrophage colony-stimulating factor), IL-6 그리고 IL-8등의 사이토카인 생성이 증가되는 현상이 나타난다. 특히 GM-CSF의 경우 eIF2α (eukaryotic translation initiation factor)의 활성화로 인해 번역이 증가하게 된다[Sawada H et al (2014) J Exp Med 211(2): 263-280]. 현재 BMPR2 유전자를 이용한 유전자 치료제 연구가 전임상 단계에서 활발히 진행중이며 BMPR2 신호전달계 활성제인 FK506 (tacrolimus)가 PAH 환자를 대상으로 임상시험 단계에 있다[Spiekerkoetter E et al. (2009) Circ Res 105: 639-647; Spiekerkoetter E et al (2013) Respir Crit Care Med 192: 254-257].
세포 투과성 펩타이드(Cell permeable peptide, CPP)는 신호 펩타이드의 일종으로서 고분자 물질을 세포내로 투과시키는 목적으로 사용하는 펩타이드이다. 7-30여개 정도의 서열로 이루어져 있으며 HIV에서 유래한 TAT의 연구를 시작으로 관련 연구가 본격적으로 진행되었다. 초파리에서 유래한 Antennapedia, HSV-1 바이러스로부터 유래한 VP22, SV40 large antigen T로부터 유래한 pep-1이 1세대 CPP이며, 아르기닌, 라이신이 연속적으로 연결된 펩타이드도 세포투과성을 가진다고 보고되었다. 하지만 이러한 CPP들은 인간 단백질 유래의 서열이 아니기 때문에 세포독성, 면역원성의 위험을 내포하고 있다. 또한 최근의 CPP와 결합된 바이오신약 후보물질의 임상결과에서 인간 세포에 전달 효능이 떨어지거나 수송(cargo)의 효과를 확인하기가 어려웠다. 그 결과 인간세포로의 전달효능을 높인 Hph-1, LPIN3, 그리고 dNP2등의 인간 단백질 유래의 CPP에 대한 연구가 진행되고 있다 [Jung MR et al. (2011) J Control Relase 152(2): 294-302; Lim S et al. (2012) Mol Cells 34(6) 577-582; Lim S et al. (2016) PLos One 11(5):e0155689; Lim S et al. (2015) Nat Commun 6:8244].
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 평활근 세포 (vascular smooth muscle cells, VSMC)의 비정상적인 증식을 조절할 수 있는 새로운 혈관 질환 펩타이드 치료제를 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 단백질 포스파타아제 1(protein phosphatase1, PP1)를 표적으로 하는 펩타이드인 ψPLB-SE가 풍선-손상된(balloon-injured) 래트본 발명자들은 평활근 세포 (vascular smooth muscle cells, VSMC)의 비정상적인 증식을 조절할 수 있는 새로운 혈관 질환 펩타이드 치료제를 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 단백질 포스파타아제 1(protein phosphatase1, PP1)를 표적으로 하는 펩타이드인 ψPLB-SE가 풍선-손상된(balloon-injured) 래트 경동맥의 신생 내막 성장(neointimal growth)을 감소시키는 것을 발견하였고, 또한 ψPLB-SE가 SERCA2a를 활성화시킴으로써 비정상적인 Ca2+ 레벨을 조절하여 혈관 평활근 세포(VSMC)에서 칼페인-의존성 분해로부터 SERCA2a를 보호함을 확인하였다. 이에 더하여 VECs의 eNOS (endothelial Nitric oxide synthase)의 활성을 증가시킴으로써 VECs의 기능이상을 회복하여 폐동맥고혈압을 완화시키는 새로운 메커니즘을 발견하였다. 본 발명자들은 상기 효과들을 통하여 ψPLB-SE가 혈관 증식성 질환의 치료 전략의 기반을 형성할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 혈관 질환(vascular diseases) 치료용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 혈관 질환(vascular diseases) 완화 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 혈관 질환(vascular diseases)의 치료방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 혈관 질환(vascular diseases)을 치료하기 위한 용도의 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 단백질 탈 인산화 효소 1 억제 펩타이드(protein phosphatase 1 inhibitory peptides)의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체;를 포함하는 혈관 질환(vascular diseases) 치료용 약제학적 조성물을 제공한다:
본 발명자들은 평활근 세포 (vascular smooth muscle cells, VSMC)의 비정상적인 증식을 조절할 수 있는 새로운 혈관 질환 펩타이드 치료제를 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 단백질 포스파타아제 1(protein phosphatase1, PP1)를 표적으로 하는 펩타이드인 ψPLB-SE가 풍선-손상된(balloon-injured) 래트 경동맥의 신생 내막 성장(neointimal growth)을 감소시키는 것을 발견하였고, 또한 ψPLB-SE가 SERCA2a를 활성화시킴으로써 비정상적인 Ca2+ 레벨을 조절하여 혈관 평활근 세포(VSMC)에서 칼페인-의존성 분해로부터 SERCA2a를 보호함을 확인하였다. 이에 더하여 VECs의 eNOS (endothelial Nitric oxide synthase)의 활성을 증가시킴으로써 VECs의 기능이상을 회복하여 폐동맥고혈압을 완화시키는 새로운 메커니즘을 발견하였다. 본 발명자들은 상기 효과들을 통하여 ψPLB-SE가 혈관 증식성 질환의 치료 전략의 기반을 형성할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 단백질 탈 인산화 효소 1 억제 펩타이드(protein phosphatase 1 inhibitory peptides)는 포스포람반(phospholamban)의 인산화 형태(서열목록 제1서열의 아미노산)에서, 인산화된 16번째 아미노산 잔기 세린(Serine, Ser)이 글루탐산(glutamic acid, Glu) 또는 아스파르트산(aspartic acid, Asp)으로 치환된 모방(mimic) 펩타이드로서, 단백질 탈 인산화 효소 1에 대하여 기질 유사 억제제(substrate mimetic inhibitor)로 작용한다. 세린 잔기에 극성을 띄는 인산기가 결합하여 음전하를 띄게 되는데, 아미노산 중 음전하를 띄는 글루탐산과 아스파르트산의 구조적, 전기적인 유사성을 가지는 특성을 이용하여 인산화된 세린의 치환 모델로 사용하였다. 아미노산이 일반적으로 단백질 탈 인산화 효소 1 억제 펩타이드는 단백질 탈 인산화 효소 1 (protein phosphatase 1, PP1)의 활성 부위에 결합한 후 탈인산화 되면 기질과 효소가 분리되지만, 본 발명의 펩타이드는 PP1 효소의 활성 부위에서 분리가 되지않아(irreversible) 강력한 저해효과를 나타내는 것으로 예상된다.
즉 본 발명의 "단백질 탈 인산화 효소 1 억제 펩타이드"는 인산화된 PLB의 연결 루프를 모방한 펩타이드 서열을 포함하도록 설계된 펩타이드로서, 인산화된 세린을 포함하는 펩타이드와 비교하여 PP1의 작용을 보다 강력하게 차단할 수 있다.
본 발명에서는 단백질 탈 인산화 효소 1 억제 펩타이드인 "ψPLB-SE"가 혈관 증식성 질환인 재협착의 신생내막 성장을 저해하고 폐동맥 고혈압의 증상 또한 완화 시킬 수 있음을 보여준다. ψPLB-SE가 질환의 표현형으로 보고된 VSMCs의 이상증식과 VECs의 기능이상을 각각의 특징적인 메커니즘을 통해 해결한다.
먼저, VSMCs에서 SERCA2a의 분해를 억제함으로써 ψPLB-SE가 쥐 경동맥의 신생 내막 성장을 약화시킨다는 것을 보여준다. 병리학적 조건 하에서, 증가된 세포질 Ca2+ 수준은 차례로 세포질 Ca2+ 수준을 증가시키는 SERCA2a의 분해를 담당하는 칼페인(calpain)의 활성화를 유도한다. 본 발명에 따르면 ψPLB-SE는 Ca2+ 수준의 증가와 SERCA2a 수준의 감소라는 악순환을 억제한다.
손상된 혈관계에서의 신생내막 성장(Neointimal growth)은 혈관 평활근 세포 (vascular smooth muscle cells, VSMCs)의 증식에 의해 크게 촉진되며, 이는 SERCA2a (sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase) 활성과 연관된다. SERCA2a 수준의 유전자 전달 매개 복원은 신생 내막의 성장과 VSMCs의 증식을 감소시킨다. 본 발명자들은 이전 연구에서 단백질 포스파타아제 1, 즉 ψPLB-SE를 표적으로 하는 펩타이드가 심근 세포에서 SERCA2a 활성을 정상화한다고 보고하였다. 본 발명에서는 ψPLB-SE가 풍선-손상된(balloon-injured) 쥐 경동맥의 신생 내막 증식을 감소시키는 것을 발견하였고, 또한 고혈청 배지(합성조건)에서 배양된 VSMCs의 증식 및 이동을 발견했다.
동시에, ΨPLB-SE는 합성조건 하에서 손상된 경동맥과 VSMCs에서 SERCA2a의 분해를 억제하였다. 칼페인 억제제 MDL28170은 또한 합성조건 하에서 SERCA2a 분해 및 VSMC 증식을 약화시켰으며, 이는 칼페인이 SERCA2a를 분해함을 나타낸다. Ca2+ 이오노포어(ionophore) A23187은 VSMCs에서 SERCA2a 분해를 유도하였으며, 이는 ψPLB-SE 또는 MDL28170에 의해 차단되었다. 또한, ΨPLB-SE는 VSMCs에서 A23187 또는 합성 자극에 의해 증가 된 세포질 Ca2+ 수준을 정상화시켰다. 종합적으로, 이들 데이터는 ψPLB-SE가 SERCA2a를 활성화시킴으로써 비정상적인 Ca2+를 조절함을 나타내며, 이는 또한 VSMCs에서 칼페인-의존성 분해로부터 SERCA2a를 보호한다. 이는 폐동맥 고혈압에서 VSMCs의 이상 증식 또한 같은 메커니즘으로 조절할 수 있음을 포스포람반의 16번째 세린잔기의 인산화를 확인하고 SERCA2a의 활성을 측정함으로써 증명하고 실제로 폐동맥 평활근 세포의 증식을 억제한다는 것을 세포증식 대표 단백질의 발현과 증식 분석 실험을 통하여 확인하였다.
또한, 이에 더하여 VECs의 eNOS (endothelial Nitric oxide synthase)의 활성을 증가시킴으로써 VECs의 기능이상을 회복하여 폐동맥고혈압을 완화시키는 새로운 메커니즘을 보여준다. 모노크로탈린(monocrotaline, MCT)으로 유도한 폐동맥 고혈압 랫트와 마우스에서 특징적인 표현형인 혈관 비후, 혈관 외막 조직의 섬유증, 또한 염증반응을 ψPLB-SE가 완화시킴을 증명하였다. 또한 폐동맥 고혈압 동물모델 폐 조직에서 ψPLB-SE의 처리가 eNOS의 인산화를 회복시켜 줄 뿐만 아니라 염증반응의 메커니즘과 관련된 BMPR2의 발현과 eIF2α의 인산화 수준 또한 회복되는 것을 확인하였다.
VECs에서 새로운 메커니즘을 규명하기 위하여 PP1과 eNOS, 또한 알려진 상위 물질인 Akt와의 상호작용을 확인하였고 이를 통해 PP1은 eNOS가 아닌 Akt와 직접적인 상호작용을 확인하고 ψPLB-SE에 의하여 작용이 저해됨을 확인하였다. 또한, 실제 ψPLB-SE의 처리로 인해 증가된 Akt와 eNOS의 인산화가 PP1을 억제함으로써 조절할 수 있는지 확인하기 위해 Akt의 상위 인산화 효소인 PI3K의 저해제인 LY294002를 처리하여 인산화를 상쇄하고 ψPLB-SE를 처리하여 Akt-eNOS의 인산화 증가를 확인하였다. 또한 Akt 저해제인 Inhibitor IV 처리 후 ψPLB-SE에 의한 eNOS의 인산화 증가효과가 상쇄되는 것을 확인하였다. 이러한 ψPLB-SE에 의한 eNOS 활성 증가는 MCT로 폐동맥 고혈압을 유도한 동물 조직 실험을 통해서도 확인할 수 있었다.
이에 더하여 CPP의 세포 투과 효능을 확인하는 실험을 진행하였는데, 세포 투과성 펩타이드 (CPP)의 비교실험을 통해 다양한 형태의 세포 투과성 펩타이드가 ψPLB-SE에 대하여 동일한 효과를 거둘 수 있음을 증명하였다. 본 발명자들은 이러한 효과들을 통하여 ψPLB-SE가 혈관 증식성 질환의 치료 전략의 기반을 형성할 수 있다고 결론 내렸다.
본 발명의 단백질 탈 인산화 효소 1 억제 펩타이드(protein phosphatase 1 inhibitory peptides)는 서열목록 제1서열의 아미노산 서열 중 14번째 내지 22번째 아미노산 서열을 포함하는 모방(mimic) 펩타이드로서, 상기 서열목록 제1서열의 아미노산 서열 중 16번째 아미노산 잔기인 인산화된 세린(phosphorylated Serine residue)이 글루탐산(glutamic acid, Glu) 또는 아스파르트산(aspartic acid, Asp)으로 치환된 아미노산 서열로 구성된다. 보다 명확하게는, 본 발명의 단백질 탈 인산화 효소 1 억제 펩타이드에서 상기 16번째 아미노산 서열은 세린(serine) 또는 인산화된 세린(phosphorylated serine)이 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단백질 탈 인산화 효소 1 억제 펩타이드(protein phosphatase 1 inhibitory peptides)는 서열목록 제2서열 내지 제6서열의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에　따르면, 상기 단백질 탈 인산화 효소 1 억제 펩타이드는 서열목록 제2서열 또는 제3서열의 아미노산 서열로 구성된다. 상기 서열목록 제2서열 내지 제6서열의 단백질 탈 인산화 효소 1 억제 펩타이드에 대해서는 대한민국 등록특허 제 10-1516791 호에 자세히 기재되어 있다.
본 발명의 실시예에서 사용된 단백질 탈 인산화 효소 1 억제 펩타이드는 "Arg-Ala-Ser(P)-Glu-Ile-Glu-Met-Pro-Gln" 서열의 펩타이드에서 인산화된 세린 잔기를 글루탐산(glutamic acid, Glu) 또는 아스파르트산(aspartic acid, Asp)으로 치환하여 제조할 수 있다.
상기 서열목록 제2서열 내지 제6서열은 다음과 같다. 밑줄 표시된 부분은 글루탐산 또는 아스파르트산으로 치환된 아미노산 부위를 나타낸다:
서열목록 제2서열: Arg-Ala- Glu -Thr-Ile-Glu-Met-Pro-Gln.
서열목록 제4서열: Arg-Ala- Asp -Thr-Ile-Glu-Met-Pro-Gln.
서열목록 제4서열: Ala- Glu -Thr-Ile-Glu-Met-Pro-Gln.
서열목록 제5서열: Arg-Ala- Glu -Thr-Ile-Glu-Met.
서열목록 제6서열: Arg-Ala- Glu -Thr-Ile-Glu.
본 발명에 따르면, 본 발명의 단백질 탈 인산화 효소 1 억제 펩타이드는 하기 일반식 I로 표시되는 아미노산 서열로 구성될 수 있다:
X1-Ala-X2-X3-Ile-Glu-X4 (I)
상기 X1은 0-20개의 아미노산 잔기, 상기 X2는 Glu 또는 Asp, 상기 X3은 Thr, Glu 또는 Asp, 상기 X4는 0-30개의 아미노산 잔기를 나타낸다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 일반식 I의 X1은 0-20개, 0-10개, 0-3개 또는 0-1개의 아미노산 잔기이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 일반식 I의 X4은 0-30개, 0-20개, 0-10개 또는 0-3개의 아미노산 잔기이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 X1은 0-20개의 아미노산 잔기이고, 상기 X4는 0-20개의 아미노산 잔기이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 X1은 0-1개의 아미노산 잔기이고, 상기 X4는 0-3개의 아미노산 잔기이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 X1은 Arg 이다. 본 발명의 다른 특정 구현예에 따르면, 상기 X4는 Met, Met-Pro 또는 Met-Pro-Gln 이다.
상기 일반식 I로 표시되는 아미노산 서열은 서열목록 제2서열 내지 제6서열의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
한편, 상기 일반식 I에서, X1 및 X4는 본 발명의 펩타이드가 세포질에 존재하는 것을 방해할 수 있는 아미노산 도메인(예컨대, 막-관통 도메인(membrane-spanning domain) 및/또는 세포 소기관-표적 도메인(organelle-targeting domain)을 포함하지 않는다.
본 발명의 단백질 탈 인산화 효소 1 억제 펩타이드(protein phosphatase 1 inhibitory peptides)는 변형된 측쇄를 가지는 하나 이상의 아미노산이 있는 펩타이드를 포함할 수 있다. 측쇄 변형의 예는 환원 알킬화 반응; 메틸아세티미데이트에 의한 아미디화; 아세틱 언하이드라이드에 의한 알킬화; 시아네이트에 의한 아미노 그룹의 카르바모릴레이션; 2,4,6-트리니트로벤젠 술포닉산(TNBS)에 의한 아미노산의 트리니트로벤질레이션; 숙신 언하이드라이드에 의한 아미노 그룹의 알킬화; 및 피리오살-5-포스페이트 처리후 NaBH4로 환원된 피리도실레이션과 같은 아미노그룹의 변형을 포함한다.
아르기닌 잔기의 구아니딘 그룹은 2,3-부탄디온, 페닐글리옥살 및 글리옥살과 같은 시약에 의한 헤테로고리 축합물의 형성으로 변형될 수 있다. 카르복실 그룹은, O-아킬소우레아 형성에 의하여 카르보디이미드 활성을 하고 이어 유도체화, 예컨대, 아마이드화로 유도체화하여 변형시킬 수 있다.
설프히드릴 그룹은 요오드아세트산 또는 요오드아세트아마이드에 의한 [0044] 카르복실메틸레이션; 시스테인산에로의 퍼폼산 산화; 다른 티올 화합물에 의한 혼합된 다이설파이드의 형성; 말레이미드, 무수말레인산 또는 다른 치환 말레이미드에 의한 반응; 4-클로로머큐리벤조에이트, 4-클로로머큐리페닐술폰산, 페닐머큐릴 클로라이드, 2-클로로머큐리-4-니트로페놀 및 다른 수은제를 사용한 수은 유도체의 형성; 염기 pH에서 시아네이트에 의한 카르바모일레이션과 같은 방법에 의해 변형될 수 있다. 시스테인 잔기의 어떠한 변형도, 펩타이드가 필요로 하는 이황화 결합을 형성하는데 영항을 주지 않아야 한다. 또한, 시스테인의 설프히드릴 그룹은 셀레니움 등가물로 대체할 수 있으며, 이에 의해 펩타이드에는 하나 이상의 이황화 결합 위치에 다이셀레니움 결합이 형성될 수 있다.
트립토판 잔기는 예컨대, N-브로모숙신이미드에 의한 산화 또는 2-히드록시-5-니트로벨질브로마이드 또는 술퍼닐 할라이드에 의한 인돌 고리의 알킬화에 의해 변형될 수 있다. 한편, 타이로신 잔기는 테트라니트로메탄을 이용한 니트로화에 의해 변형되어 3-니트로타이로신 유도체를 형성시킬 수 있다.
히스티딘 잔기의 이미다졸 고리의 변형은 요오도아세트산 유도체에 의한 알킬화 또는 디에틸피로카르보네이트에 의한 N-카르베톡실레이션에 의해 수행될 수 있다.
프롤린 잔기는 예컨대, 4-위치에서의 히드로실레이션에 의해 변형될 수 있다.
본 발명의 단백질 탈 인산화 효소 1 억제 펩타이드(protein phosphatase 1 inhibitory peptides)는 이의 아미노산 잔기를 변형시킴으로써 더욱 안정성을 향상시킬 수 있다. 예컨대, 본 발명의 단백질 탈 인산화 효소 1 억제 펩타이드(protein phosphatase 1 inhibitory peptides)는 적어도 하나의 아미노산은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 단백질 탈 인산화 효소 1 억제 펩타이드(protein phosphatase 1 inhibitory peptides)는 아세틸기의 보호기가 결합될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "안정성"은 인 비보에서의 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미한다. 상술한 보호기는 인 비보에서 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 작용을 한다.
본 발명에 따르면, 본 발명에서 이용 가능한 단백질 탈 인산화 효소 1 억제 펩타이드(protein phosphatase 1 inhibitory peptides)의 아미노산 서열은 본 발명의 단백질 탈 인산화 효소 1 억제 펩타이드 서열에 실질적으로 동일성을 가지는 펩타이드 서열을 포함하는 것으로 해석된다. 본 명세서의 용어 "실질적 동일성"은 두 아미노산 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, BLAST, GAP 또는 BESTFIT과 같은 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘 또는 육안 검사를 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 약 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 서열 상동성을 공유하는 것을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch. (1970) J Mol Bio 48:443; Pearson and Lipman. (1988) Methods Mol Biol 24: 307-31; Higgins and Sharp. (1988) Gene 73:237-44; Higgins and Sharp. (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet et al. (1988) Nuc Acids Res 16:10881-90; Huang et al. (1992) Comp Appl BioSci 8:155-65 and Pearson et al. (1994) Meth Mol Biol 24:307-31에 개시되어 있다.
본 발명에 따르면, 상기 단백질 탈 인산화 효소 1 억제 펩타이드(protein phosphatase 1 inhibitory peptides)는 세포막 투과성 펩타이드(cell penetrating peptide, CPP)가 추가적으로 결합될 수 있다. 상기 세포 투과성 펩타이드는 단백질 탈 인산화 효소 1 억제 펩타이드의 N-말단 및/또는 C-말단에 결합될 수 있다.
본 발명의 단백질 탈 인산화 효소 1 억제 펩타이드(protein phosphatase 1 inhibitory peptides)를 세포 내로 운반하기 위해서는, 상기 단백질 탈 인산화 효소 1 억제 펩타이드가 세포막 투과성 펩타이드 또는 이와 유사한 기능을 수행할 수 있는 수송수단을 포함하고 있어야 한다. 본 명세서의 용어 세포막 투과성 펩타이드는 특정 펩타이드를 세포 내로 운반하기 위해 필수적인 펩타이드로, 통상적으로 10-50개 또는 그 이상의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
상기 세포막 투과성 펩타이드는 그 자체로 인지질 이중막의 세포막을 통과할 수 있는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드로, 예컨대, dNP2, Tat-유래 펩타이드, 시그널 펩타이드(예컨대, 세포 투과성 펩타이드), 아르기닌-리치 펩타이드, 트랜스포탄 또는 양친매성 펩타이드 캐리어 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다(Morris, M. C. et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:1173-1176; Dupont AJ. and Prochiantz A. (2002) CRC Handbook on Cell Penetrating Peptides, Langel, Editor, CRC Press; Chaloin, L. et al. (1997) Biochemistry 36(37):11179-87; 및 Lundberg P and Langel U. (2003) J. Mol. Recognit. 16(5):227-233). 또한, 상기와 같은 천연적 서열과 더불어, 레트로인버소(retroinverso) 및 D-아이소머 펩타이드를 포함하는, 세포막 투과 성질을 가진 다양한 안테나 다리(antennapedia)-기초 펩타이드들이 알려져 있다[Brugidou J. et al. (1995) Biochem Biophys Res Commun. 214(2):685-93;Derossi D et al. (1998) Trends Cell Biol. 8:84-87].
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 단백질 탈 인산화 효소 1 억제 펩타이드(protein phosphatase 1 inhibitory peptides)와 세포막 투과성 펩타이드는 링커 펩타이드로 연결될 수 있다. 상기 링커 펩타이드는 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어질 수 있으며, 4 내지 20개 또는 4 내지 15개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 또한， 상기 링커 펩타이드는 글라이신 (glycine, G)， 세린 (serine, S), 알라닌 (alanine, A) 또는 이의 조합으로 구성될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 링커 펩타이드의 서열은 (G)n 의 아미노산 서열로 구성될 수 있다 (단， 상기 n 및 정수 1 내지 20이다). 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 링커 펩타이드는 (G)3 내지 (G)10 의 아미노산으로 구성될 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 링커 펩타이드는 (G)3 내지 (G)5 의 아미노산으로 구성될 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 링커 펩타이드는 (G)3 의 아미노산으로 구성될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "혈관 질환(vascular diseases)"은 심혈관질환(cardiovascular diseases), 폐혈관질환(pulmonary vascular diseases), 뇌혈관질환(cerebral vascular diseases), 말초혈관질환(peripheral vascular diseases), 동맥경화증(arteriosclerosis), 혈관협착(vascular stenosis) 또는 고혈압(hypertension)을 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "고혈압(hypertension)"은 다양한 형태, 진단, 레벨 또는 단계(stage)의 고혈압을 의미한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 고혈압은 폐고혈압(pulmonary hypertension)이다. 상기 폐고혈압은 폐동맥 고혈압(pulmonary arterial hypertension) 및 폐정맥 고혈압(pulmonary venous hypertension) 등을 포함하며 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 고혈압은 폐동맥 고혈압이다.
한편, 상기 고혈압(hypertension)은 고혈압성 혈관질환(hypertensive vascular disease), 고혈압성 폐질환(hypertensive pulmonary disease), 고혈압성 뇌증(hypertensive encephalopathy), 고혈압성 심장질환(hypertensive heart disease), 고혈압성 신경화증(hypertensive nephrosclerosis) 또는 고혈압성 망막병증(hypertensive retinitis) 등을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 혈관 협착은 심혈관협착(cardiovascular stenosis), 경동맥협착(carotid artery stenosis), 뇌혈관협착(cerebral vascular stenosis), 폐동맥협착(pulmonary stenosis), 신동맥협착(renal artery stenosis), 대퇴동맥협착(femoral artery stenosis), 하지동맥협착(lower limb artery stenosis) 및 혈관재협착(vascular restenosis)을 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 혈관재협착은 혈관 외과술(vascular surgery) 또는 혈관 성형술(angioplasty)에 의해 발생할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "혈관 증식성 질환"은 혈관 평활근 세포 (vascular smooth muscle cells, VSMC)의 비정상적인 증식에 의해 나타나는 질환이다. 혈관 평활근 세포 (vascular smooth muscle cells, VSMC)의 비정상적인 증식은 아테롬성 동맥 경화증이나 대동맥 판막 재협착과 같은 여러 혈관 증식성 질환의 근본적인 원인이 된다. 이에 본 발명에서는 혈관 평활근 세포의 증식을 억제하기 위한 기작으로 SERCA2a의 분해를 억제하여 SERCA2a 활성을 상향 조절하는 방법을 이용하였으며, 구체적으로는 단백질 탈인산화 효소 1 억제 펩타이드(protein phosphatase 1 inhibitory peptides; PP1 inhibitory peptides)를 이용하였다. 상기 단백질 탈인산화 효소 1 억제 펩타이드는 PLB(포스포람반)의 PP1(단백질 포스파타아제 1)-매개 탈인산화를 강력하게 억제한다.
본 발명에서 혈관 증식성 질환은 구체적으로 합성 표현형(synthetic phenotype)을 가진 VSMC의 비정상적 증식으로 인한 질환이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 10 % FBS의 고농도 혈청 배지 (합성 조건, synthetic conditions)에서 배양된 래트 대동맥 평활근 세포 (rat aortic smooth muscle cells, RASMC)는 합성 표현형(synthetic phenotype)을 나타낸다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 합성 조건 하에서 RASMC에서 SERCA2a 수준이 감소하고(합성 표현형의 획득), 이 SERCA2a 감소는 본 발명의 단백질 탈인산화 효소 1 억제 펩타이드(예컨대, ψPLB-SE)에 의해 다시 완전히 억제된다(도 2b).
본 발명의 약제학적 조성물은 경구(orally) 또는 비경구(parentally) 투여될 수 있으며, 비경구 투여되는 경우 혈관 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여, 비강 투여/흡입 또는 기도흡입(airway inhalation)으로 투여될 수 있다.
흡입(inhalation)을 통한 약물 전달은 비강 또는 기도를 통과하여 폐의 점막을 통하여 직접 폐세포로 약물을 전달하는 비침습적(non-invasive) 방법 중 하나로, 특히 폐 질환의 광범위한 치료에 에어로졸(또는 스프레이) 전달을 통한 핵산 또는 펩타이드 전달이 유리하게 이용될 수 있다. 이는 폐의 해부학적 구조 및 위치가 즉각적이고 비침습적인 접근을 가능케 하고, 다른 기관에는 영향을 미치지 않으면서 또는 펩타이드 전달 시스템의 국소 적용을 받을 수 있기 때문이다. 따라서, 본 발명의 치료 조성물로서 폐 질환, 특히 폐혈관질환(pulmonary vascular diseases)과 관련된 (i) 핵산을 결합시킨 핵산 전달 복합체 또는 (ii) 펩타이드가 담지된 담체(carrier) 또는 분말입자를 에어로졸 방식으로 폐에 전달하면, 상기 질환에 대한 예방 또는 치료효과를 기대할 수 있다. 흡입 투여용 제형을 위하여, 핵산 전달 복합체 또는 펩타이드 전달 담체가 나노입자 크기를 가지도록 제조할 수 있다.
일 예로서, 핵산 전달 복합체 유효성분을 포함하는 에어로졸 형태의 호흡기내 투여용 약학 제제를 제조하기 위하여, (i) 상기 핵산 구조의 안정화를 위하여 공중합체와 결합하거나 또는 (ii) 상기 핵산 서열을 바이러스성/비바이러스성 벡터에 삽입함으로써 핵산 전달 복합체를 제조할 수 있다.
다른 예로서, 펩타이드 유효성분을 포함하는 에어로졸 형태의 호흡기내 투여용 약학 제제를 제조하기 위하여, 상기 펩타이드 유효성분을 안정한 담체(carrier) 또는 비이클(vehicle) 내에 포집하고, 약학적으로 허용가능한 수성 또는 비-수성 액체의 현탁액 또는 용액, 또는, 수중유 또는 유중수 에멀젼과 혼합함으로써 제조될 수 있다. 또는, 펩타이드 유효성분의 호흡가능 건조 입자를 함유하는 고체 미립자 조성물로 제조될 수 있다. 상기 펩타이드 유효성분을 함유하는 고체 미립자 조성물은 선택적으로 에어로졸의 형성을 촉진하도록 제공되는 분산제를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물이 에어로졸 또는 스프레이 형태의 비강/호흡기내 투여용 약학 제제로 사용되는 경우, 호흡기내 또는 비강 흡입/투여 장치를 포함하는 키트로 제조될 수 있다. 이 키트는 에어로졸 또는 스프레이 발생기, 및 흡입기를 포함할 수 있다. 상기 흡입기는 네뷸라이저(nebulizer) 또는 인서플레이터(insufflator)를 포함할 수 있다.
본 명세서의 용어 "약제학적 유효량"은 대상체에 투여되는, 혈관질환의 치료에 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-10000 ㎎/㎏이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 치료 조성물은 단백질 탈 인산화 효소 1 억제 펩타이드(protein phosphatase 1 inhibitory peptides) 또는 이를 발현하는 핵산 전달 복합체를 에어로졸 전달을 통해 표적 부위에 전달하도록, 흡입 투여용 제형(에어로졸 제형)으로 제제화될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 혈관 질환(vascular diseases)을 치료하기 위한 용도의 조성물로서, (a) 단백질 탈 인산화 효소 1 억제 펩타이드(protein phosphatase 1 inhibitory peptides)의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체;를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 단백질 탈 인산화 효소 1 억제 펩타이드(protein phosphatase 1 inhibitory peptides)를 포함하는 혈관 질환(vascular diseases) 완화 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 식품 조성물은 상술한 본 발명의 혈관 질환 치료용 약제학적 조성물과 동일한 유효성분을 이용하는 것으로서, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 단백질 탈 인산화 효소 1 억제 펩타이드(protein phosphatase 1 inhibitory peptides)의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체;를 포함하는 약제학적 조성물을 대상(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는, 혈관 질환(vascular diseases)의 치료방법을 제공한다:
본 발명의 혈관 질환 치료방법은 상술한 본 발명의 혈관 질환 치료용 약제학적 조성물을 이용하는 것으로서, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 명세서에서 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치(예컨대, 나노파티클 분사기)를 이용해 투여될 수도 있다.
본 명세서에서 용어 "대상(subject)"은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함하고, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간을 의미한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 단백질 탈 인산화 효소 1 억제 펩타이드(protein phosphatase 1 inhibitory peptides)를 포함하는 혈관질환(vascular diseases) 치료용 조성물에 관한 것이다.
(b) 본 발명자들은 서열목록 제1서열(포스포람반)의 아미노산 서열 중 14번째 내지 22번째 아미노산 서열을 포함하는 모방(mimic) 펩타이드(ψPLB-SE)를 제조하였으며, ψPLB-SE가 단백질 탈 인산화 효소 1(protein phosphatase 1, PP1)을 타겟팅함으로써 합성 조건(synthetic condition) 하의 VSMC에서 SERCA2a의 레벨과 활성을 모두 복원시킨다는 것을 입증하였다.
(c) 또한, 혈관 내피 세포 (Vascular endothelial cells, VECs) eNOS (endothelial Nitric oxide synthase)의 활성을 증가시킴으로써 VECs의 기능이상을 회복하여 폐동맥고혈압을 완화시키는 새로운 메커니즘을 발견하였다.
(d) 이로써 ψPLB-SE는 혈관 질환의 치료를 을 위한 치료 전략의 기초가 될 수 있다.
도 1a-1c. 랫트 경동맥에 카테터-유도 풍선 손상을 유도하였다. 손상된 부위는 5 μl의 ψPLB-SE 또는 대조 (Con) 펩타이드로 30 분간 처리 하였다. (1a) 경동맥을 절제하고 헤마톡실린과 에오신으로 염색하거나(상부 패널), 치료 10 일 후에 α-SMA (중간 패널) 및 PCNA (하단 패널)에 대한 항체로 면역염색 하였다. 내막/배지 비율을 계산하였다 (n = 8). 스케일 바, 50 μm. (1b) 흉부 대동맥(thoracic aorta)으로부터 분리된 RASMC를 0.1 % (v/v) FBS 첨가된 DMEM에서 5 일간 배양하여 수축성 표현형(contractile phenotype)을 유도한 다음, 10 % (v/v) FBS 첨가된 DMEM에서 24 시간동안 배양하여 3 μM ψPLB-SE 또는 대조 펩타이드의 존재 하에서의 합성 표현형(synthetic phenotype)을 유도하였다. 면역 염색은 PCNA에 대한 항체(적색)로 수행하였다. 핵은 Hoechst (파란색)로 염색하였다. 대표 병합 이미지를 표시하였다. 스케일 바, 50 μm. (1c) 세포 생존 능력 분석키트를 사용하여 세포 증식을 정량화 하였다.
도 2a-2d. (2A) 경동맥을 절단하고 펩타이드 처리 10 일 후에 SERCA2a 또는 SERCA2b (적색) 및 α-SMA (녹색)에 대한 항체로 면역 염색하였다. 병합된 이미지를 표시하였다(하단). a, 외막(adventitia); ec, 내피 세포층(endothelial cell layer); m, 내층(medial layer); ni, 신생내막층(neointimal layer). 스케일 바, 50 μm. (2b) 흉부 대동맥으로부터 분리된 RASMC를 5일 동안 0.1 % (v/v) FBS가 첨가된 DMEM에서 수축시켜 수축성 표현형(contractile phenotype)을 유도 한 다음, 3 μM ψPLB-SE 또는 대조 펩타이드의 존재 하에서 10 % (v/v) FBS가 첨가된 DMEM에서 5일 동안 배양하여 합성 표현형을 유도하였다. SERCA2a 또는 SERCA2b (녹색) 및 PCNA (적색)에 대한 항체로 면역염색을 수행하였다. 핵은 Hoechst (파란색)로 염색하였다. 대표 병합 이미지를 표시하였다. 스케일 바, 50 μm. (2c) 세포 추출물의 웨스턴 블럿 분석. (2d) ψPLB-SE 또는 대조 펩티드로 처리한 흉부 대동맥의 엑스 비보(ex vivo) 배양. 조직 추출물을 웨스턴 블로팅하였다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 나타내었다 (n = 3-4; *, P <0.05).
도 3a-3b. (3a) RASMC는 도 2B에 설명된 것과 동일한 조건에서 칼페인 억제제 MDL28170 또는 DMSO를 처리하였다. SERCA2a 또는 SERCA2b (녹색) 및 PCNA (적색)에 대한 항체로 면역 염색을 수행 하였다. 핵은 Hoechst (파란색)로 염색하였다. 대표 병합 이미지를 표시하였다. 스케일 바, 50 μm. (3b) 세포 추출물의 웨스턴 블롯 분석. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 나타내었다(n = 3-4; *, P <0.05).
도 4a-4d. (4a-4c) HCSMC를 3 μM ψPLB-SE와 15 μM MDL28170으로 1 시간동안 전처리한 다음, 50 μM A23187로 2 시간 동안 처리하였다. (4a) SERCA2a 및 SERCA2b (녹색)에 대한 항체로 면역 염색하였다. 핵은 Hoechst (파란색)로 염색하였다. 대표 병합 이미지를 표시하였다. 스케일 바, 50 μm. (4b) 세포 추출물을 사용하여 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 나타내었다(n = 3-4; *, P <0.05). (4c) 기준 Ca2+ 농도는 IonOptix 칼슘 이미징 시스템으로 측정하였다. (4d) 도 1B과 동일한 조건하에서 RASMC에 ψPLB-SE 또는 대조 펩타이드를 처리하였다. 기준(baseline) Ca2+ 농도는 IonOptix 칼슘 이미징 시스템 (*, P <0.05)으로 측정하였다.
도 5a-5f. (5a-5b) RASMC는 수축성 또는 합성 배지에서 배양한 후 스크래칭(scratching)하였다. 대조군 또는 ψPLB-SE 펩타이드를 첨가하고 24 시간 동안 배양하였다. 세포 이동의 상대 거리는 위상차 현미경으로 측정하였다. 적색 선은 RASMC 배양물의 경계를 나타낸다. 대표 이미지(왼쪽) 및 세포 이동 거리(오른쪽)를 나타내었다 (n = 4). 스케일 바, 50 μm. (5c) RASMC는 수축성 배지에서 배양하였고, 합성 표현형은 대조군 또는 ψPLB-SE 펩타이드 3 μM의 존재 하에 PDGF-BB를 첨가함으로써 유도하였다. 면역염색은 PCNA에 대한 항체 (적색)로 수행하였다. 핵은 Hoechst (파란색)로 염색하였다. 대표 병합 이미지를 표시하였다. 스케일 바, 50 μm. (5d) 세포 생존 능력 분석 키트를 사용하여 세포 증식을 정량화 하였다. (5e-5f) RASMC는 도 5c에서 설명한 것과 동일한 조건 하에서 스크래치 분석을 실시하였다. 대표 이미지(왼쪽)와 세포 이동 거리(오른쪽)를 나타낸다. 스케일 바, 50 μm.
도 6a-6b. RASMC는 대조군 또는 ψPLB-SE 펩타이드 3 μM의 존재 하에 수축성 또는 합성 배지에서 배양되었다. de novo 단백질 합성을 방지하기 위해 사이클로헥사마이드(Cycloheximide)를 5 μg/ml의 최종 농도로 배지에 첨가하였다. 배양 0일, 3일 및 5 일 후에 세포를 수확하고 단백질 추출물을 웨스턴 블로팅하였다. 데이터는 평균±표준 편차로 나타내었다 (n = 3-4; *, P <0.05).
도 7. ψPLB-SE는 VSMC에서 PLB 탈 인산화를 감소시킨다. 도 2c에 나타낸 단백질 샘플로 웨스턴 블로팅하였다. PLB 또는 포스포-PLB 항체를 사용하였다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 나타내었다 (n = 3-4; *, P <0.05).
도 8a-8b. 랫트에 60 mg/kg의 MCT를 주입하고 1주일 간격으로 4회 펩타이드 (ψPLB-SE)를 기관내 흡입으로 투여하여 치료효과를 확인하기 위한 실험이다. 4주차의 랫트를 흉부개방 상태로 우심도자술을 실시하여 수축기말 우심실 혈압 (RVESP), 좌심실 혈압 (LVESP), 이완기말 우심실 혈압 (RVEDP), 좌심실 혈압 (LVEDP) 그리고 심박출량 (CO)를 측정하였다. (Sham n=3, MCT n=5, ψPLB-SE n=6; *, P<0.05 vs sham,)
도 9a-9b. 도 8a-8b와 같은 조건에서, (9a) 헤마톡실린과 에오신 염색을 통해 폐동맥의 비후 정도를 확인하였으며 (9b) phospho-eNOS 와 total eNOS, 그리고 GAPDH의 항체를 이용해 단백질 발현을 웨스턴 블로팅을 통해 정량 분석하였다.
도 10a-10b. 도 8a-8b와 같은 조건에서, (10a) 폐동맥 외막의 섬유증 정도를 확인하기 위해 Masson-Trichrome 염색을 통해 확인하였으며 (10b) Vimentin, αSMA, GAPDH의 항체를 이용해 단백질 발현을 웨스턴 블로팅을 통해 정량 분석하였다.
도 11a-11d. 도 8a-8b와 같은 조건에서, (11a) BMPR2, phospho-eIF2α, eIF2a, GAPDH 항체를 이용해 단백질 발현을 웨스턴 블로팅을 통해 정량 분석하였으며 (11b-11d) 폐 조직에서 사이토카인 믹스쳐 키트를 이용하여 염증 반응성 사이토카인의 함유정도를 측정하였다. (Sham n=3, MCT n=4, ψPLB-SE n=6; *, P<0.05 vs sham; #, P<0.05 vs MCT)
도 12a-12b, 마우스에 600 mg/kg의 MCT를 주입하고 2주차부터 1주일 간격으로 4회 펩타이드 (ψPLB-SE)를 기관내 흡입으로 투여하여 치료효과를 확인하기 위한 실험이다. (12a) 헤마톡실린과 에오신 염색을 통해 폐동맥의 비후 정도를 확인하였으며 (12b) phospho-eNOS 와 total eNOS, SERCA2a그리고 GAPDH의 항체를 이용해 단백질 발현을 웨스턴 블로팅을 통해 정량 분석하였다.
도 13a-13c. 도12A-12B와 같은 조건에서 (13a) 폐동맥 외막의 섬유증 정도를 확인하기 위해 Masson-Trichrome 염색을 통해 확인하였으며 (13b) Vimentin, αSMA, GAPDH의 단백질 발현을 웨스턴 블로팅을 통해 정량 분석하였다. 또한 (13c) 실시간 정량적 RT-PCR을 통해 TGF-β1, Collagen 1, αSMA의 mRNA 발현 정도를 정량 분석하였다.
도 14a-14b. 도 12a-12b와 같은 조건에서 (14a) 폐 조직 전체의 단핵 세포 침윤과 같은 염증반응 정도를 헤마톡실린과 에오신 염색을 통해 확인하였고 (14b) 실시간 정량적 RT-PCR을 통해 TNF-α, IL-1β, F4/80, MCP-1의 mRNA 발현정도를 정량 분석하였다. (sham, MCT, ψPLB-SE, n=4; *, P<0.05 vs sham; #, P<0.05 vs MCT)
도 15a-15b. 도 12a-12b와 같은 조건에서, 폐 조직에서 싸이토 카인 믹스쳐 키트를 이용하여 염증 반응성 사이토카인의 함유정도를 측정하였다. (Sham n=3, MCT n=4, ψPLB-SE n=6; *,P<0.05 vs sham; #,P<0.05 vs MCT)
도 16a-16c. (16a-16b) PAEC를 3μM의 ψPLB-SE로 1시간 동안 처리하였고, Phospho-eNOS (ser1177), total eNOS, phospho-Akt (Ser473, Thr308), total Akt, 그리고 GAPDH의 항체를 이용해 단백질 발현을 웨스턴 블로팅을 통해 정량 분석 하였다. (16c) 폐 조직의 용해물을 PP1 항체를 이용한 면역침강법으로 ψPLB-SE를 처리유무에 따른 PP1과 eNOS, Akt의 상호작용을 각각의 항체로 확인하였다.
도 17a-17c. (17a) PAEC를 50μM의 PI3K 저해제인 LY294002로 24시간 처리하고 3μM의 ψPLB-SE로 1시간 처리하였다. Phospho-eNOS (ser1177), total eNOS, phospho-Akt (Ser473, Thr308), total Akt, 그리고 GAPDH의 항체를 이용해 단백질 발현을 웨스턴 블로팅을 통해 정량 분석 하였다. (17b) PAEC를 10μM의 Akt 저해제인 inhibitor IV로 2시간 처리하고 3μM의 ψPLB-SE로 1시간 처리하였다. total eNOS, 그리고 GAPDH의 항체를 이용해 단백질 발현을 웨스턴 블로팅을 통해 정량 분석 하였다. (17c) PAEC를 100nM의 PP1 저해제인 OA를 24시간 처리하고 3μM의 ψPLB-SE로 1시간 처리하였다. Phospho-eNOS (ser1177), total eNOS, phospho-Akt (ser473, thr308), total Akt, 그리고 GAPDH의 항체를 이용해 단백질 발현을 웨스턴 블로팅을 통해 정량 분석 하였다.
도 18a-18b. PASMC를 3일동안 0.1%(v/v) 소태아 혈청(FBS)가 포함된 DMEM에서 수축성 표현형 (contractile phenotype)을 유도한 다음, 3μM의 ψPLB-SE의 존재 하에서 10%(v/v) FBS가 첨가된 DMEM에서 3일간 배양하여 합성 표현형 (synthetic phenotype)을 유도하였다. (18a) Phospho-PLB (ser16), total PLB, 그리고 GAPDH 항체를 이용해 단백질 발현을 웨스턴 블로팅을 통해 정량 분석하였다. 데이터는 ± 표준 편차로 나타내었다. (n=3~4; *, P<0.05 vs contractile; #,P<0.05 vs Synthetic-con) (18b) 칼슘 재흡수 실험을 통해 SERCA2a의 활성을 측정하였다.
도 19a-19b. PASMCs를 3일동안 0.1%(v/v) 소태아 혈청(FBS)가 포함된 DMEM에서 수축성 표현형 (contractile phenotype)을 유도한 다음, 3μM의 dNP2로 24시간 동안 처리하였다. (19a) 처리후 12시간과 24시간에서 PCNA와 GAPDH의 항체를 이용해 단백질 발현을 웨스턴 블로팅을 통해 정량 분석하였다. (19b) EZ-CyTox Cell Viability Assay Kit를 이용하여 세포 증식 분석을 수행하였다.
도 20a-20b. (20a) PAECs에 3가지 형태(dNP2, linear TAT, cyclic TAT)의 3μM의 ψPLB-SE를 1시간동안 처리하여 phospho-eNOS, eNOS와 phospho-Akt, Akt의 항체를 이용하여 단백질 발현을 웨스턴 블로팅을 통해 정량 분석하였다. (20b) 도 18과 동일한 조건에서 PASMC에 에 3가지 형태(dNP2, linear TAT, cyclic TAT)의 3μM의 ψPLB-SE 존재하에서 Phospho-PLB (ser16), total PLB, 그리고 GAPDH 항체를 이용해 단백질 발현을 웨스턴 블로팅을 통해 정량 분석하였다. (liTAT = linear TAT, cTAT = cyclic TAT)
이하, 실시예를 통하여 본 발명에 대해 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 목적과 요지에 따라 본 발명의 범위가 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험방법
1. 윤리 규정(Ethics statement)
Sprague-Dawley 랫트와 C57BL/6 마우스를 이용한 동물 실험은 서울대학교 병원과 이화여자대학교 그리고 광주과학기술원 동물 관리 및 윤리위원회 (IACUC)의 승인을 받아, 미 국립 보건원 (국립 아카데미)에서 발행한 실험실 동물의 관리 및 사용 안내서 (Press, 8th Edition, 2011)에 따라 수행되었다. Charles River의 8 주령 웅성 Sprague-Dawley 랫트를 이용하여 모든 실험을 수행하였다. 환경 조건은 25 ± 2 ℃의 온도, 50 ± 5 %의 상대 습도 및 12:12 시간의 명암 사이클을 제공하도록 제어되었다.
2. 화학물질(Chemicals) 및 단백질 탈 인산화 효소 1 억제 펩타이드(protein phosphatase 1 inhibitory peptides) 합성
ΨPLB-SE (RAE16TIEMPQ; 서열목록 제2서열)는 Ser16 인산화 부위를 둘러싸는 PLB 단백질 서열로부터 유래되었다. 세포 내 유입을 용이하게 하기 위해, 상기 펩타이드를 세포 투과성 펩티드 dNP2 (KIKKVKKKGRKGSKIKKVKKKGRK; 서열목록 제21서열) 혹은 TAT (YGRKKRRQRRR; 서열목록 제22서열)에 접합시켰다. 본 발명에서 사용된 펩타이드는 ΨPLB-SE (RAETIEMPQ; 서열목록 제2서열) 및 대조군 펩타이드 (RASTIEMPQ; 서열목록 제23서열) 이다. ΨPLB-SE 와 세포투과성 펩타이드는 링커 펩타이드 (GGG; 서열목록 제24서열)에 의해 연결하였다. 펩타이드(순도 95 % 이상, AnyGen, 광주, 대한민국)를 3 mM (세포실험) 혹은 2.5mg/ml (랫트), 500 μg/ml (마우스) 저장 농도에서 이중 증류수 혹은 생리식염수에 재현탁 하였다. 랫트의 경우 1 mg/kg, 마우스의 경우 2 mg/kg의 펩타이드를 처리하였으며 랫트 동맥평활근 세포(Rat Aortic Smooth Muscle Cells, RASMCs)와 인간 관상동맥 평활근 세포(Human Coronary Smooth Muscle Cells, HCSMCs), 폐동맥 내피 세포 (Pulmonary Arterial Endothelial Cells, PAECs)와 폐동맥 평활근 세포(Pulmonary Arterial Smooth Muscle Cells, PASMCs)는 펩타이드 3 μM의 최종 농도로 1 시간 동안 처리하였다. PAECs (Pulmonary arterial endothelial cells) 실험에 사용된 PI3K 저해제인 LY294002(Millipore, 미국), Akt 저해재인 Inhibitor IV (Calbiochem, 미국), PP1 저해제인 오카다산(okadaic acid) (Sigma Aldrich, 미국)을 구입하였다. 모노크로탈린(monocrotaline) 수용액은 모노크로탈린 분말(Sigma Aldrich, 미국)을 소량의 1 M 염산 용액(HCL) 에 녹인 후 멸균 증류수로 희석하고 수산화나트륨(NaOH)를 첨가하여 pH 7.35로 맞추고 희석하였다. 정해진 실험 기간 동안 대조군과 동일한 조건 하에서 사육하며 관찰하였다. 또한 칼슘 이오노포어 A23187, 칼페인 I 및 II 억제제 MDL28170, 사이클로헥사마이드는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
3. 랫트 경동맥의 풍선-유도 손상(Balloon-induced injury)
좌 총경동맥(left common carotid artery)을 2F Fogarty balloon embolectomy catheter 삽입으로 손상시켰다. 요컨대, 랫트를 아이소플루레인 가스 (70 % N2O / 30 % O2)로 마취시키고, 왼쪽 외 경동맥(left external carotid artery)을 노출시키고, 그 branch 혈관을 전기 응고시켰다(electro-coagulated). 횡행 동맥 절개를 통해 카테터를 외 경동맥에 약 1 cm 삽입하고, 총 경동맥을 따라 카테터를 3 회 통과시켜 내피 박리를 일으켰다. 카테터를 제거한 후, 관통 영역을 클램핑하고 200 μL의 인산염 완충 식염수 (PBS)에 용해된 5 μg의 펩타이드를 주입하였다. 15 분 동안 반응시킨 후, 밀봉된 경동맥을 재개방하여 혈류를 재개시켰다. 달리 명시되지 않는 한, 랫트를 10 일 동안 회복시켰다. 조직학적 분석을 위해, 랫트를 마취시키고, 3.7 % (w/v) 포름 알데히드를 함유하는 헤파린 처리된 식염수로 경심관류(transcardiac perfusion) 후 총 경동맥을 절제하였다. 표본을 파라핀에 끼우고 파라핀 블록을 Leica RM2255 회전식 마이크로톰으로 절단하였다. 총 경동맥의 중심에서 두 개의 연속적인 조직 절편 (두께, 4 μm)을 얻었고, 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 라미나(lamina), 내부 탄성층(internal elastic lamina) 및 외부 탄성층(external elastic lamina)은 National Institutes of Health ImageJ 소프트웨어 (버전 1.62)로 측정하였다. 내막(intimal)과 내측(medial) 영역은 각각 내측 탄성 라미나 영역(internal elastic laminal area)에서 라미나 영역(laminal area)을 뺀 값과 외측 탄성 라미나 영역(external elastic laminal area)에서 내측 탄성 라미나 영역을 뺀 값으로 결정하였다. 랫트 당 2 개의 연속 절편으로부터의 값을 평균하였다.
4. 면역조직화학
경동맥을 실온에서 48 시간 동안 4 % (w/v) 파라포름알데하이드로 고정시킨 다음 PBS로 세척하였다. 표본을 파라핀에 매립하고 조직 블록을 절단한 후, 과산화수소로 처리하여 내인성 퍼옥시다아제 활성을 차단하고, 항원 회수 버퍼에서 끓였다. α-SMA (Sigma-Aldrich), SERCA2a, SERCA2b (21st Century Biochemical) 및 PCNA (Abcam)에 대한 항체로 표본을 면역 염색하였다.
5. 세포 배양
랫트 동맥평활근 세포(Rat Aortic Smooth Muscle Cells, RASMCs)는 콜라게나아제 (50 U/mL, Worthington) 및 췌장 엘라스타아제 (0.25 mg/mL, Sigma-Aldrich)를 사용하여 37 에서 4 시간 동안 효소 반응에 의해 웅성 Sprague-Dawley 랫트 (체중, 180-200 g)의 흉부 대동맥의 내층(medial layer)으로부터 분리하였다. 세포를 수확하고 20 % (v/v) 소태아혈청을 함유하는 DMEM에 재현탁시켰다. 이후 콜라겐 I (Sigma-Aldrich)-코팅된 유리 커버 슬립에 도말하여 37 , 5 % (v/v) CO2 및 95 % (v/v) 대기의 공기 중에서 배양하였다. 인간 관상동맥 평활근 세포(HCSMCs), 인간 폐동맥 내피 세포(PAECs), 인간 폐동맥 평활근 세포(PASMCs)는 Lonza에서 구입하여 0.5 mg/mL hEGF, 5 mg/mL 인슐린, 1 mg/mL hFGF, 50 mg/mL 젠타마이신/암포테리신-B 및 5 % 소태아 혈청이 함유된 EBM, SmBM (Lonza)에서 배양하였다. 모든 세포는 37 , 5 % (v/v) CO2와 95 % (v / v)의 공기 중에서 배양하였다. RASMC와 HCSMC는 면역염색과 웨스턴블로팅 실험을 위해 1 x 104 cells/cm2와 1 x 105 cells/cm2의 밀도로 각각 분주되었다. RASMC와 PASMC의 세포증식 실험의 경우 소태아 혈청을 제거한 배지에 3일간 배양시킨 후 혈청 추가하여 증식을 유도하였다.
6. 형광 면역 염색
랫트 동맥평활근 세포(Rat Aortic Smooth Muscle Cells, RASMCs)를 실온에서 4 % (w/v) 파라포름알데히드로 10 분 동안 고정시키고, PBS로 세척한 후, PBS 하의 0.1 % (v/v) Triton X-100으로 40 분 동안 투과 처리 하였다. PBS 하의 3 % (w / v) BSA로 세척하고 블로킹한 후, SERCA2a (1 : 250), SERCA2b (1 : 250) 및 PCNA (1:50) 항체를 처리하고 세포를 실온에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 다음 날, 세포를 PBS로 세척하고 각각 Alexa Fluor 488 및 594에 접합된 항-래빗 및 항-마우스 IgG를 처리하여 실온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 세포에 FluoroGuard antifade 시약 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 처리하고 커버슬립을 형광 현미경으로 관찰하였다.
7. 세포 증식 분석
랫트 동맥평활근 세포(Rat Aortic Smooth Muscle Cells, RASMCs)와 폐동맥 평활근 세포(Pulmonary Arterial Smooth Muscle Cells, PASMCs)(1 x 104 cells/well)를 96웰 마이크로 플레이트에 분주하고 펩타이드를 최종 농도 3 μM으로 24시간 동안 처리하였다. 세포 증식 분석은 EZ-CyTox Cell Viability Assay Kit (Daeil Lab Services Co., Ltd.)를 이용하여 수행하였다.
8. 대동맥 엑스 비보(ex vivo) 장기 배양
랫트의 흉부 대동맥을 수확하고, 20 mM HEPES, 2 mM L- 글루타민, 100 IU / mL 페니실린 및 100 μg / mL 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI-1640 배지에서 배양 하였다. 외막(adventitia)을 제거하고 대동맥을 세로로 자른 다음, 수지(resin)에 고정시켰다. SERCA2a의 분해를 조사하기 위해, 조직 단편을 20 % (v/v) FCS를 함유하는 RPMI-1640 배지에서 7-10 일 동안 배양하였다. 배지는 매 48 시간마다 교체되었다.
9. 웨스턴 블로팅
혈관 평활근 세포 (vascular smooth muscle cells, VSMCs)를 브로드-스펙트럼 프로테아제 저해제 칵테일 (Calbiochem)이 첨가된 최소 부피의 50 mM Tris-HCl, pH 7.4에서 균질화시켰다. 단백질을 SDS-PAGE로 분리 한 다음 폴리 비닐리덴 플루오라이드 멤브레인(Schleicher & Schuell)으로 옮겼다. 5% (w/v) 탈지유로 1 시간 동안 블로킹하고 TBST로 세척한 후, 멤브레인을 SERCA2a, SERCA2b(21st century biochemical), PCNA (abcam), GAPDH (Sigma-Aldrich), phospho-eNOS, eNOS, phospho-eIF2α, eIF2α (cell signaling), Vimentin, α-SMA, BMPR2 (Santa cruz), phospho-Akt, Akt (cell signaling), phospho-phospholamban (Merck), Phospholamban (cell signaling), 항체와 함께 반응시켰다. 이어서 멤브레인을 홀스래디쉬 퍼옥시다아제-컨쥬게이트 2차 항체 (Jackson ImmunoResearch, WestGrove, PA, USA)와 함께 반응시키고 화학발광기질 (Dogen)을 사용하여 현상하였다. LAS 소프트웨어를 사용하여 블럿을 스캔하고 정량화하였다.
10. 세포 내(Intracellular) Ca2+ 측정
37 에서 15분 동안, Ca2+-민감성 지표인 0.5 μM Fura2-AM (Molecular Probes, Eugene OR, USA)을 VSMC에 로딩하여, 세포 내 Ca2+ 수준을 측정하였다. 형광은 IonOptix 칼슘 이미징 시스템을 사용하여 기록하였다. VSMC는 340 nm 또는 380 nm 필터를 통해 75W 할로겐 램프에 의해 방출되는 광에 노출되도록 하여 자극시켰다. 형광 방출은 340 nm에서 0.5 초간 그리고 기록되는 동안 380 nm에서 초기 조사 후, 광전자 증배관에 의해 480 nm에서 520 nm 사이에서 검출되었다. 340 nm 여기 스캔(excitation scan)을 프로토콜의 마지막에서 반복하였고, 세포 내 Ca2+ 수준의 질적 변화를 두 파장 모두에서 Fura2 형광 강도의 비율로 추측하였다.
11. 인 비트로 세포 스크래치(scratch) 분석
흉부 대동맥(thoracic aorta)으로부터 분리된 RASMC를 0.1% (v/v) FBS (수축성) 또는 10% (v/v) FBS (합성) 첨가된 DMEM에서 3 μM의 대조군 펩타이드(Con; 서열목록 제23서열) 또는 ψPLB-SE 펩타이드(서열목록 제2서열)와 배양하였다. 또는 0.1% (v/v) FBS가 첨가된 DMEM에서 배양된 RASMC를 3 μM 대조군 또는 ψPLB-SE 펩타이드 존재 하에 10 ng/ml PDGF-BB (R & D Systems) (합성)로 처리하였다. 멸균 200 μL 피펫 팁으로 플레이트를 긁음으로써 RASMC 층의 일부 영역을 제거하였다. 세포를 12 시간 또는 24 시간 동안 배양한 후 1X80 현미경 (Olympus) 하에서 관찰하였다. MetaMorph 소프트웨어를 사용하여 세포가 이동 한 거리를 측정하였다.
12. SERCA2a 안정성(stability) 분석
RASMC를 0.1% (v/v) FBS (수축형) 첨가된 DMEM, 또는 3 μM의 대조군 또는 ψPLB-SE 펩타이드의 존재 하에 10 % (v/v) FBS (합성) 첨가된 DMEM에서 배양하였다. 사이클로헥사마이드(Sigma)를 5 μg/ml의 최종 농도로 배지에 첨가하였다. 배양 0일, 3일 및 5 일 후에 세포를 수확하고 단백질 추출물을 웨스턴 블로팅하였다.
13. 폐동맥 고혈압 동물모델
250 g - 300 g 사이의 Sprague-Dawley 랫트 (다물사이언스, 대한민국)에 60 mg/kg 의 Monocrotaline (MCT) (Sigma Aldrich)를 복강주사를 통하여 11마리에 투여 하였으며 비교군 3마리에는 0.9%의 생리 식염수를 투여하였다. 투여 계획에 따르면 MCT 투여와 동시에 6마리의 비교군에 300 μl에 희석시킨 ψPLB-SE 펩타이드를 1주일 간격으로 4번 기관내 흡입을 통하여 투여하였다. 5마리의 대조군에는 대조군 펩타이드를 투여하였다. 마지막 펩타이드 투여 1주일후 랫트를 희생하여 조직분석 및 분자생물학적 실험을 시행하였다.
마우스의 경우 25 g-30 g의 C57BL/6 마우스(다물사이언스, 대한민국) 15 마리에 600 mg/kg의 MCT를 1주일에 한번씩 5번 처리하였으며 그 중 비교군 8 마리에 ψPLB-SE 펩타이드를 MCT 투여 후 15일차부터 1주일 간격으로 4회 투여하였다. 5마리의 대조군에는 대조군 펩타이드를 투여하였다. 마지막 투여 1주일 후 마우스를 희생하여 조직분석 및 분자생물학적 실험을 시행하였다.
14. 폐동맥 압력 측정을 위한 랫트 우심도자술 (Right heart catheterization)
폐동맥 압력을 간접적으로 측정하기 위해 우심도자술을 실시하였으며 2008년에nature protocols에 보고된 과정을 기반으로 수행하였다. 랫트를 마취 후 기도 삽관을 실시하고, 심도자술 동안 체온 유지를 위해 homeothermic plate (AD Instruments, Spechbach, Germany)에 올려 놓고 동물 전용 인공 호흡기(MiniVent type 845, Hugo Sachs Elektronik, March-Hugstetten, Germany)로 호흡을 유지시킨다. 랫트의 흉부를 개방하여. high-fidelity 1.4F micromanometer/Mikro-Tip Pressure catheter (Millar Instruments, Houston, TX)를 심첨부위에 침투시킴으로써 수축기와 이완기말의 우심실, 좌심실의 압력(RVESP, RVEDP, LVESP, LVEDP)을 측정하였다. 관련 수치와 데이터는PowerLab data acquisition system (MPVS-Ultra Single Segment Foundation System, AD Instruments)과 LabChart 7 for Windows software을 통하여 수집되고 분석하였다.
15. 조직병리학적 염색 (Hematoxylin-Eosin, Masson-Trichrome 염색법)
동물 모델들로부터 폐 조직을 취한 후 실온에서 5일 동안 4 % (w/v) 파라포름알데하이드로 고정시킨 다음 PBS로 세척하였다. 표본을 파라핀에 매립하고 조직 블록을 7 μm 두께로 절편한 후, 혈관두께 및 염증반응 확인을 위한 방법으로 헤마톡실린-에오신 (Sigma Aldrich) 염색하고 혈관주변 섬유증 정도를 확인하기 위하여 Masson-Trichrome (Sigma Aldrich) 염색한 후 광학 현미경을 통해 관찰하였다.
16. 사이토카인 분석
랫트와 마우스의 폐 조직을 얻어내고, 조직의 사이토카인 수준을 human proinflammatory 10plex Meso Scale Diagnostics plates (MSD;Rockville, MD)를 이용하여 정량 분석하였다.
17. 정량적 RT-PCR
SYBR premix Ex TaqTM (Takara)을 사용하여 정량적 실시간 RT-PCR을 수행하였고 이를 통해 표적 유전자들의 전사 수준을 분석하였다. 트리졸 (ambion)을 사용하여 폐 조직으로부터 RNA를 분리하여 이를 cDNA로 합성하였다. 정량적 실시간 RT-PCR 조건은 40 사이클: 94°C 10초, 59°C 30초 72°C 10초였다. 실험에 사용된 프라이머의 정보는 하기 표 1과 같다.
유전자 정방향 프라이머 역방향 프라이머
마우스
TGF-β 1		 5'-CAACAATTCCTGGCGTTACCTTGG-3'
(서열목록 제7서열)		 5'-GAAAGCCCTGTATTCCGTCTCCTT-3'
(서열목록 제8서열)
마우스
Collagen 1		 5'-CCCAAGGAAAAGAAGCACGTC-3'
(서열목록 제9서열)		 5'-AGGTCAGCTGGATAGCGACATC-3'
(서열목록 제10서열)
마우스
α-SMA		 5'-ATCGTCCACCGCAAA-3'
(서열목록 제11서열)		 5'-AAGGAACTGGAGGCGCTG-3'
(서열목록 제12서열)
마우스
IL-1β		 5'-CAACCAACAAGTGATATTCTCCAT-3'
(서열목록 제13서열)		 5'-GATCCACACTCTCCAGCTGCA-3'
(서열목록 제14서열)
마우스
TNF-α		 5'-CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA-3'
(서열목록 제15서열)		 5'-TGGGAGTAGACAAGGTACAACCC-3'
(서열목록 제16서열)
마우스
F4/80		 5'-CTTGGCTATGGGCTTCCAGTC-3'
(서열목록 제17서열)		 5'-GCAAGGAGGACAGAGTTTATCGTG-3'
(서열목록 제18서열)
마우스
MCP-1		 5'-GCTCAGCCAGATGCAGTTAA-3'
(서열목록 제19서열)		 5'-TCTTGAGCTTGGTGACAAAAACT-3'
(서열목록 제20서열)
18. 칼슘 재흡수 실험 (Uptake assay)
폐동맥 평활근 세포(Pulmonary Arterial Smooth Muscle Cells, PASMCs)는 40 mM imidazole, 10 mM NaF, 1 mM EDTA, 300 mM sucrose, 0.5 mM DTT가 포함된 pH 7.0의 용액에 균질화 시키고, 250 μg의 용해물을 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 5 mM NaN3, 0.5 M EGTA, 40 mM 이미다졸인 pH 7.0 uptake buffer에 첨가하여 방사선 동위원소가 포함된 pCa 6 칼슘 농도에서 흡수실험을 시행하였다. 1 μM의 루테늄 레드(Ruthenium red, Sigma Aldrich)을 처리하고 37℃에서 3분동안 대기후 5 mM의 K-oxalate와 Mg-ATP (Sigma Aldrcih)를 처리하며 반응을 시작하고 1분간격으로 4분까지 500 μl의 반응물을 0.45 μm 필터(Millipore)에 걸러내어 scintillation counter (Beckman)을 이용하여 cpm (count per minute)을 측정하였다.
19. 통계분석
모든 데이터는 평균±표준편차로 나타내었다. StatView 5.0 소프트웨어 (SAS Institute, Cary, NC, USA)를 이용한 Bonferroni post-hoc 분석을 사용하여 Student 's t-test 또는 one-way ANOVA로 통계적 유의성을 결정하였다. p <0.05는 통계적으로 유의하다고 간주되었다.
실험결과
1. ψPLB-SE 는 VSMC의 세포증식을 억제한다
본 발명자들은 이전 연구에서 허혈-재관류 손상 동안 SERCA2a 활성을 보존함으로써 심근 세포 수축성을 향상시키는 9-mer 펩타이드 ψPLB-SE을 발명하였다[Oh JG et al. (2013) J Mol Cell Cardiol 56: 63-71]. 본 발명에서는 상기 펩타이드가 유사한 분자 메커니즘을 통해 혈관 평활근 세포 (vascular smooth muscle cells, VSMCs)의 증식을 억제할 수 있는지 여부를 실험하였다. 풍선 경동맥 성형술을 시행하여 랫트 경동맥 손상을 유도한 후, ψPLB-SE 또는 대조 펩타이드를 손상 부위에 투여하였다. 치료 4 주 후에 동맥을 수확하고, 조직 절편으로 헤마톡실린 및 에오신 염색 및 면역 세포 화학 검사를 수행하였다. 헤마톡실린과 에오신 염색 결과는, ψPLB-SE로 처리한 동맥에서의 신생 내막 형성(neointimal formation)이 대조 펩타이드로 처리한 동맥보다 억제되었음을 보여주었다. ψPLB-SE의 영향을 받은 내막층은 α-SMA (α-smooth muscle actin)과 PCNA (proliferating cell nuclear antigen)에 대한 항체로 양성 면역 염색되었다. 이러한 결과는 ψPLB-SE가 신생 내막의 성장과 인 비보(in vivo) VSMCs 증식을 억제한다는 것을 나타낸다 (도 1a).
본 발명자들은 랫트 대동맥 평활근 세포 (rat aortic smooth muscle cells, RASMCs)에 대한 ψPLB-SE의 효과를 조사하였다. RASMCs는 저농도 혈청 (0.1 % FBS)이 첨가된 배지에서 배양하였을 때 수축성 표현형(contractile phenotype)을 보였으나 고농도 혈청 (10 % FBS) 배지에서는 합성 표현형(synthetic phenotype)을 나타내었다. 따라서 본 발명자들은 높은 혈청 배양 조건을 합성으로 정의했다. RASMCs는 현저한 PCNA 발현이 나타난 바와 같이, 합성 조건 하에서 활동적인 세포 분열을 나타내었지만, 이것은 ψPLB-SE에 의해 완전히 차단되었다 (도 1b). 세포 증식 분석은 또한 합성 조건 하에서의 RASMCs의 증가된 세포 증식이 ψPLB-SE에 의해 억제되었음을 보여주었다 (도 1c). 합성 조건 하에서 또는 PDGF-BB의 처리 시 RASMCs의 증가 된 이동 활성(migratory activity)은 또한 ψPLB-SE에 의해 억제되었다 (도 5a-5f). 이러한 데이터는 ψPLB-SE가 인 비트로 합성 조건 하에서 VSMCs의 증식을 현저하게 억제한다는 것을 나타낸다.
2. ψPLB-SE 는 VSMCs에서 SERCA2a 분해를 차단한다
SERCA2a는 증식성 VSMCs에서 급격히 분해되는 반면, SERCA2b는 비교적 안정하다. 유전자 전달에 의한 SERCA2a 수준의 회복은 합성 조건 하에서의 VSMCs의 증식을 억제한다. 따라서 본 발명자들은 ψPLB-SE의 항증식 효과가 합성 조건 하에서 SERCA2a 수준 및 활성의 유지와 관련될 수 있다고 추론하였다. 도 1a에 기재된 실험으로부터 얻어진 경동맥 절편을 SERCA2a, SERCA2b 및 α-SMA에 대한 항체로 면역 염색 하였다. SERCA2b 단백질 수준은 변하지 않았지만, SERCA2a 수준은 풍선 혈관 형성-매개 손상으로 현저히 감소되었고 이러한 현상은 ψPLB-SE 에 의해 억제되었다(도 2a). 또한, 면역 염색은 합성 조건 하에서 RASMCs에서 SERCA2a 수준이 감소하고, 이 SERCA2a 감소가 ψPLB-SE에 의해 다시 완전히 억제됨을 보여주었다(도 2b). 또한 동일 조건에서 웨스턴 블로팅으로 합성 조건 하에서 RASMCs에서 SERCA2a의 감소를 억제한다는 것을 확인하였다(도 2c). 우리는 de novo 단백질 합성이 사이클로헥사마이드로 차단된 조건 하에서, RASMCSs에서의 SERCA2a 수준을 측정하였다. SERCA2a의 안정성은 합성 조건 하에서 현저하게 감소되었으며, ψPLB-SE 처리시 수축 조건에서 관찰된 수준으로 거의 회복되었다 (도 6a-6b). 랫트 흉부 대동맥의 생체 외(ex vivo) 배양을 준비하였다. 긁힘에 의한 손상 유발 후, VSMCs는 SERCA2a 수준이 감소하였고, 이는 합성 표현형의 획득을 의미한다. VSMCs에서의 SERCA2a의 손상-의존성 감소는 ψPLB-SE에 의해 완전히 저해되었다 (도 2d). 종합적으로, 이들 데이터는 ψPLB-SE가 VSMCSs에서 SERCA2a의 분해를 억제한다는 것을 나타낸다.
3. 칼페인(calpain)은 VSMCs에서 SERCA2a 분해에 관여한다
세포질 Ca2+ 수준의 증가는 세포질 단백질의 칼페인-매개 분해를 유도한다[Saido TC et al. (1994) Faseb J 8: 814-822; Matsumura Y et al. (2001) J Mol Cell Cardiol 33: 1133-1142]. VSMCs의 증식에 칼페인이 관여하기 때문에 [Ariyoshi H et al. (1998) Arterioscler Thromb Vasc Biol 18: 493-498], 본 발명자들은 VSMCs에서 SERCA2a의 분해에서의 칼페인 역할을 조사하였다. 면역 염색결과에서 볼 수 있듯이, 칼페인 억제제 MDL28170은 합성 조건에서 RASMCs에서 SERCA2a의 분해를 억제하였다 (도 3a). MDL28170의 보호 효과는 웨스턴 블로팅에 의해 추가로 확인되었다 (도 3b). 이들 데이터는 칼페인이 합성 조건 하에서 VSMsC에서 SERCA2a의 분해를 매개한다는 것을 나타낸다. MDL28170에 의해 감소된 PCNA 수준은, 지속적인(sustained) SERCA2a 수준이 VSMCs 증식의 저해를 일으킨다는 것을 나타낸다 (도 3a).
4. ψPLB-SE 는 칼페인-의존적 SERCA2a 분해를 억제한다
Ca2+ 이오노포어 A23187은 인간 관상동맥 평활근 세포 (human coronary smooth muscle cells, HCSMCs)에서 SERCA2a의 분해를 일으켰지만 SERCA2b는 분해되지 않았으며, 이는 증가된 세포질 Ca2+ 이 SERCA2a의 분해를 유발한다는 것을 나타낸다. A23187의 효과는 MDL28170에 의해 완전히 차단되어 세포질 Ca2+ 의 증가 시 VSMCs에서 SERCA2a의 분해에 칼페인이 관여한다는 것을 보여주었다 (도 4a-4b). SERCA2a의 Ca2+ 의존적 분해 또한 ψPLB-SE에 의해 완전히 저해되었다 (도 4a-4b). A23187에 의한 세포질 Ca2+ 의 상승은 ψPLB-SE에 의해 정상화되었지만 칼페인 억제제에 의해서는 정상화되지 않았다 (도 4c). 또한 합성 조건 하에서 상승된 세포질 Ca2+ 수준은 ψPLB-SE에 의해 감소되었다 (도 4d). 종합하면, 이들 데이터는 ψPLB-SE가 합성 조건 하의 VSMCs에서 상승된 세포질 Ca2+ 수준을 정상화함으로써, SERB2-SE의 칼페인-매개 SERCA2a 분해를 억제한다는 것을 시사한다.
5. ψPLB-SE는 랫트의 폐동맥 고혈압을 치료한다.
본 발명에서는 또한 상기 펩타이드가 유사한 혹은 새로운 메커니즘을 통해 폐동맥 고혈압에 치료효과를 확인할 수 있는지 여부를 실험하였다. 랫트에 모노크로탈린(monocrotaline, MCT) 주입을 통해 폐동맥 고혈압을 유도하고 ψPLB-SE를 기관내 흡입으로 주 1회, 총 4주간 투여하였다. 폐동맥 고혈압 유도 4주후 우심도자술을 통하여 우심실 수축기말 혈압(Right Ventricular End Systolic Pressure)을 측정하였다. 혈압 측정 결과를 살펴보면, MCT를 통해 폐동맥 고혈압을 유도한 그룹에서 우심실 수축기말 혈압이 증가한 것으로 나타났으며 (67.4 ± 6.4 vs sham = 33.7 ± 1.7) ψPLB-SE를 처리함에 따라 비교군의 수준으로 낮아진 것을 확인할 수 있었다 (33.5 ± 5.8) (도 8a-8b). 폐동맥 고혈압에서 특징적으로 나타나는 표현형으로는 폐동맥 내피세포 및 평활근 세포의 이상 증식으로 혈관벽이 비후되는 현상이 있으며 혈관 외막에서 증가하는 섬유증 (Fibrosis), 그리고 폐 조직 전반에서 일어나는 단핵 세포 침윤과 사이토카인 증가로 대표되는 염증반응 (Inflammation) 등이 있다[Thompson AA et al. (2017) Trends Mol Med 23(1): 31-45; Stenmark KR et al. (2011) Compr Physiol 1(1): 141-161; Aihara K et al, (2012) Int J Vasc Med 2012:596796]. 이를 조직학적 연구로 확인하기 위하여 혈압 측정 후 랫트로부터 얻어낸 폐 조직에서 헤마톡실린과 에오신 염색을 통해서 혈관 비후정도를 확인한 결과 폐동맥 고혈압이 유도된 그룹에서 나타나는 혈관 비후 증가가 ψPLB-SE를 처리함에 따라 감소되는 것을 확인할 수 있었다 (도 9a). 또한 폐 조직에서 얻어낸 단백질 정량분석을 통하여 폐동맥 고혈압에서 특징적으로 나타나는 eNOS 활성 감소 현상이 ψPLB-SE를 처리함에 따라 증가하는 것을 eNOS 인산화 수준 증가로 확인할 수 있었다 (도 9b). 그리고 혈관 외막 섬유증에 ψPLB-SE가 미치는 영향을 확인하기 위해 폐 조직을 Masson-Trichrome 염색법을 통해 콜라겐 침착 정도를 확인하였다. 폐동맥 고혈압으로 증가된 섬유증 정도는 ψPLB-SE를 통해서 감소된 것을 확인할 수 있었다 (도 10a). 또한 단백질 정량분석을 통하여 섬유증 타겟 유전자로 알려져 있는 Vimentin, α-SMA의 발현 증가가 ψPLB-SE 처리를 통하여 감소된 것을 확인하였다 (도 10b). 마지막으로 ψPLB-SE의 염증반응 감소효과를 증명하기 위해 염증반응 메커니즘 관련 단백질인 BMPR2 발현 정도와 이와 연관된 신호 전달계 물질인 eIF2α의 인산화 수준을 확인한 결과 폐동맥 고혈압에서 줄어든 발현과 활성이 ψPLB-SE을 처리함에 따라 회복되는 것을 확인하였다 (도 11a). 이때 실제 사이토카인의 수준을 측정한 결과 GM-CSF, TNF-α, IL-17, IL-1β, IL-6, TGF-β 등의 proinflammatory cytokine의 폐동맥 고혈압에서 증가하였으며 ψPLB-SE를 처리함에 따라 정상수준에 가깝게 회복된 것을 확인하였다 (도 11b-11d).
6. ψPLB-SE는 마우스의 폐동맥 고혈압을 치료한다.
랫트에서 확인한 펩타이드의 회복 효과를 또 다른 동물 모델인 마우스 모델에서 확인하였다. 마우스에 모노크로탈린(monocrotaline, MCT) 주입을 통해 폐동맥 고혈압을 유도하고 2주후부터 ψPLB-SE를 기관 내 흡입으로 주 1회, 총 4주간 투여하였다. ψPLB-SE 투여 4주후 혈압 측정을 제외한 동일한 실험을 마우스 폐 조직에서 수행하였다. 먼저 마우스로부터 얻어낸 폐 조직에서 헤마톡실린과 에오신 염색을 통해서 혈관 비후 정도를 확인하였다. 폐동맥 고혈압이 유도된 그룹에서 나타나는 혈관 비후 증가가 ψPLB-SE를 처리함에 따라 감소되는 것을 확인하였다 (도 12a). 또한 폐 조직에서 얻어낸 단백질 정량분석을 통하여 폐동맥 고혈압에서 특징적으로 나타나는 eNOS 활성 감소 현상이 ψPLB-SE를 처리함에 따라 증가하는 것을 eNOS 인산화 수준 증가로 확인할 수 있었다. SERCA2a의 발현 정도 또한 ψPLB-SE를 처리함에 따라 증가되는 것을 확인하였다 (도 12b). 이어서 혈관 외막 섬유증에 ψPLB-SE가 미치는 영향을 확인하기 위해 폐 조직을 Masson-Trichrome 염색법을 통해 콜라겐 침착 정도를 확인하였다. 폐동맥 고혈압으로 증가된 섬유증 정도는 ψPLB-SE를 통해서 감소된 것을 확인하였다 (도 13a). 또한 단백질 정량분석을 통하여 섬유증 타겟 유전자로 알려져 있는 TGF-β, Collagen 1, Vimentin, α-SMA의 단백질 및 mRNA 발현 증가가 ψPLB-SE 처리를 통하여 감소된 것을 확인하였다 (도 13b-13c). 마지막으로 ψPLB-SE의 염증반응 감소효과를 증명하기 위해 폐 조직 내 단핵 세포 침윤 현상을 헤마톡실린과 에오신 염색으로 확인하고 염증반응 관련 사이토카인의 mRNA 수준을 측정한 결과 폐동맥 고혈압에서 증가된 단핵 세포 침윤 증가가 ψPLB-SE 처리를 통해 감소된 것을 확인하였으며 (도 14a), 염증반응 관련 타겟 유전자인 TNF-α, IL-17, IL-1β, F4/80, MCP-1의 mRNA 발현 수준이 ψPLB-SE의 처리를 통해 감소된 것을 확인하였다 (도 14b). 마지막으로 랫트에서와 동일하게 폐 조직에서 염증반응 관련 사이토카인의 수준을 측정한 결과 GM-CSF, TNF-α, IL-17, IL-1β, IL-6, TGF-β 등의 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)이 폐동맥 고혈압에서 증가하였으며 ψPLB-SE를 처리함에 따라 정상수준에 가깝게 회복된 것을 확인하였다 (도 15a-15b).
7. ψPLB-SE는 폐동맥 내피세포(PAECs)에서 PP1을 기인하여 eNOS의 활성을 증가시킨다.
폐동맥 고혈압에서 내피세포의 기능부전으로 인해 감소된 eNOS의 활성이 혈관확장제인 NO생성 감소는 널리 알려진 특징이다[Giaid A et al. (1995) N Engl J Med 333: 214-221]. 본 발명자의 조직 실험을 통해 확인된 결과 가운데 ψPLB-SE를 처리함에 따라 eNOS의 인산화 수준이 증가하는데 이에 대한 새로운 메커니즘을 밝히기 위한 연구를 진행하였다. 먼저 PAECs에서 ψPLB-SE에 의한 eNOS의 활성증가 확인을 위해 PAECs에 3 μM 의 ψPLB-SE를 1시간 처리한 결과 eNOS 의 활성인산화 잔기인 세린 1177번의 인산화가 증가하였으며 억제성 인산화 잔기인 트레오닌 495번? 잔기의 인산화는 감소하였다. 또한 잘 알려져 있는 eNOS의 상위물질인 Akt[Michell BJ et al. (1999) Curr Biol 9(15): 845-848]의 활성을 나타내는 세린 473번째 잔기와 트레오닌 308번째 잔기의 인산화 또한 증가함을 확인하였다 (도 16a-16b). 또한 ψPLB-SE가 PP1의 저해제로서 고안된 물질임을 감안하였을 때 실제로 이러한 결과가 PP1의 억제효과를 통해 이루어지는지를 확인하기 위해, 폐동맥 내피 세포 (Pulmonary Arterial Endothelial Cells, PAECs)\에 일반적인 PP1 억제제인 100nM의 오카다산 (Okadaic acid, OA)를 처리하고 ψPLB-SE를 처리하고 eNOS와 Akt의 인산화를 확인하였다. 그 결과 OA를 처리함에 따라 eNOS의 Akt의 인산화가 증가한 것을 확인하고 펩타이드를 처리함에 따라 인산화가 더 증가하는 시너지효과를 확인하였다. 이러한 결과는 ψPLB-SE가 PP1을 저해함으로써 eNOS와 Akt의 활성을 조절한다는 것을 나타낸다 (도 16c).
이러한 PP1과 eNOS, Akt간의 상호 관계를 심도있게 확인하기 위해 폐 조직의 용해물에서 PP1의 항체를 이용해 면역침강법을 실시하였고 침강시 ψPLB-SE를 첨가하여 상호작용에 미치는 영향을 알아보았다. 그 결과, Akt의 경우 eNOS와 달리 PP1과 직접 상호작용함을 확인하였고 이 작용은 ψPLB-SE를 처리함에 따라 약화되는 것을 확인하였다. 이러한 결과 ψPLB-SE는 PP1과 Akt의 상호작용을 저해함으로써 Akt와 eNOS의 탈 인산화를 억제한다는 것을 나타낸다 (도 17a). 이러한 PP1과 Akt간의 상호작용 저해를 통한 eNOS의 활성화는 Akt의 상위 인산화 효소를 억제하는 실험을 통해 보강하였다. Akt의 알려진 상위 인산화 효소인 phosphoinositide-3-kinase (PI3K)의 저해제인 LY294002를 50μM의 농도로 처리함으로써 Akt의 인산화 조건을 상쇄하고 ψPLB-SE를 처리함으로써 탈 인산화 억제로 인한 Akt와 eNOS의 인산화 증가를 확인하고자 하였다. 그 결과 PI3K 억제로 인해 줄어든 eNOS와 Akt의 인산화가 ψPLB-SE를 처리함에 따라 증가하였다 (도 17b). 마지막으로 ψPLB-SE의 처리 효과가 실제로 Akt를 통해 나타나는 것인지 여부를 판단하기 위해 Akt 저해제인 Inhibitor IV를 10 μM의 농도로 처리한 다음 ψPLB-SE를 처리하여 eNOS의 인산화에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과 Akt 저해제에 의해 줄어든 eNOS의 인산화는 ψPLB-SE를 처리하여도 증가하지 않는 것을 확인하였다 (도 17c). 이러한 결과는 ψPLB-SE의 eNOS 활성화 효과가 PP1과 Akt의 상호작용을 저해함으로써 Akt 탈 인산화를 막고 Akt를 활성화 시킴으로써 나타난다는 것을 의미한다.
8. ψPLB-SE는 폐동맥 평활근 세포(PASMCs)에서 PP1을 기인하여 SERCA2a의 활성을 조절하여 세포증식을 억제한다.
폐동맥 고혈압에서 내피세포의 기능부전으로 인한 폐동맥 평활근 세포(Pulmonary Arterial Smooth Muscle Cells, PASMCs)의 이상 증식은 폐동맥의 혈압을 높이는데 결정적인 역할을 하는 요소이다. 본 발명자들은 선행 연구를 통해 ψPLB-SE가 랫트로부터 분리한 혈관 평활근 세포의 SERCA2a 활성을 조절함으로써 이상증식을 억제하는 것을 확인하였다. 동일한 현상을 폐동맥 평활근 세포에서도 확인하기 위해 저농도 혈청 (0.1% FBS)으로 유도시킨 수축성 표현형 (Contractile phenotype)에 비교하여 고농도 혈청 (10% FBS)으로 증식시킨 합성 표현형 (Synthetic phenotype)을 유도하였다. ψPLB-SE를 처리함에 따라서 합성 표현형에서 감소된 포스포람반(Phospholamban)의 세린 16번 잔기의 인산화가 회복된 것을 확인할 수 있었으며 (도 18a), 동일 조건에서 칼슘 재흡수 실험 (Ca2+ uptake assay)를 통해 SERCA2a의 활성을 측정한 결과 합성표현형에서 감소된 SERCA2a의 활성이 ψPLB-SE의 처리에 따라 회복된 것을 확인하였다 (도 18b). 이러한 결과는 본 발명자의 선행연구 결과와 일치하는 결과이며 ψPLB-SE가 폐동맥 평활근 세포에서도 SERCA2a의 활성을 조절할 수 있음을 나타낸다.
또한 이러한 SERCA2a 활성 조절을 통해서 실제 ψPLB-SE가 폐동맥 평활근 세포의 증식을 막을 수 있는지 여부를 확인하기 위해 도 18a-b의 조건에서 세포 증식관련 대표 유전자인 PCNA의 발현을 확인하고 세포 증식 분석을 수행하였다. 그 결과 합성 표현형 유도를 통해 증가하는 PCNA의 발현이 ψPLB-SE를 처리함에 따라 감소되는 것을 확인하였으며 (도 19a) 세포 증식 분석 실험을 통해서 실제로 세포의 증식이 억제되는 효과를 확인하였다 (도 19b). 이러한 결과는 ψPLB-SE가 폐동맥 고혈압에서 나타나는 특징인 평활근 세포의 이상 증식을 억제할 수 있음을 나타낸다.
9. ψPLB-SE의 효과는 세포 투과성 펩타이드 (CPP)의 종류와 형태에 따라서 영향을 받지 않는다.
세포 투과성 펩타이드는 신호 펩타이드의 일종으로서 단백질, DNA 등의 물질을 세포내로 전달하는 목적으로 사용하는 아미노산 조합 펩타이드이다. 본 발명자들은 인간 유래서열 CPP인 dNP2를 사용하여 앞선 치료효과들을 규명하였다. 이에 더하여 본 발명자들은 TAT 뿐만 아니라 펩타이드를 고리화 (cyclization)시킴으로써 CPP의 종류와 형태를 다양화 시키고 기존 dNP2를 기반으로 한 펩타이드와 효과를 비교하였다. 그 결과, 선형 TAT과 고리화 TAT을 서열로 갖는 ψPLB-SE 또한 VECs에서 eNOS와 Akt의 인산화를 증가시켰으며 (도 20a), 합성표현형을 유도한 VSMCs에서 PLB의 인산화를 증가시켰다 (도 20b). 이러한 결과는 ψPLB-SE의 효과는 CPP의 종류와 형태에 국한되지 않고 효과를 나타낸다는 것을 의미한다.
결과분석 및 추가 논의
심혈관계 질환 중 폐동맥 고혈압 (PAH)이나 관상동맥 중재술 후 나타나는 재협착 (restenosis) 모두 VECs의 물리적, 병리학적 손상에 기인하며 궁극적으로 혈관 평활근 세포 (vascular smooth muscle cells, VSMCs)의 이상증식에 의해 병인이 나타나는 질병이다. 이러한 현상은 넓은 개념으로써 고혈압 (hypertension)에 포함될 수 있다. 폐동맥 고혈압의 경우 10여년 전까지도 특별한 약이 없다고 여겨져 왔으며, 비록 수년간 많은 연구결과들의 누적으로 많은 치료약제들의 개발됨에 따라 환자의 삶의 질과 생존기간이 늘어나기는 하였으나 다른 심혈관 질환에 비해 높은 이환율과 사망률을 보이고 있다. 또한 완벽하게 해결되지 않은 재협착 문제 또한 확실한 치료 가이드라인이 없는 상태에서 연구들이 진행되고 있다.
심혈관 질환의 주요 원인 중 하나는 SR (sarco/endoplasmic reticulum) 기능의 결함으로 인한 비정상적인 세포 내 Ca2+ 조절이다[Lou Q et al. (2012) Adv Exp Med Biol 740: 1145-1174; Heijman J et al. (2012) Wien Med Wochenschr 162: 287-291]. SR에 의한 비정상적 Ca2+ 유입(uptake)은 주로 발현 및/또는 번역 후 변형(post-translational modification)에 의해 유발될 수 있는 SERCA2a 활성의 감소로 인한 것이다[Meyer M et al. (1995) Circulation 92: 778-784; Kho C et al. (2011) Nature 477: 601-605]. 심장 근육세포(cardiomyocytes)에서 SERCA2a 수준의 유전자 전달 매개 복원은 심장 마비의 마우스 및 돼지 심부전(heart failure) 모델에서 심장 보호효과(cardioprotective)를 나타낸다[Miyamoto MI et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97: 793-798; Kawase Y et al (2008) J Am Coll Cardiol 51: 1112-1119; del Monte F et al. (2001) Circulation 104: 1424-1429]. 또한, SERCA2a 유전자 전달은 풍선-유도 손상 모델에서 VSMCs의 증식과 신생 내막의 성장을 억제한다. 따라서, SERCA2a는 동맥 재협착(arterial restenosis) 및 PAH를 포함하는 혈관 증식성 질환에 대한 치료에 개입할 수 있다.
SERCA2a 활성은 억제제 -1 (I-1), PP1 및 포스포람반 (phospholamban, PLB)을 포함하는 일련의 신호 전달에 의해 조절된다. I-1은 PP1과 결합하여 PP1을 저해하여 PLB 인산화 및 SERCA2a 활성이 상승한다. 그러므로, 지속적으로 활성화된 I-1 (I-1c)의 과발현은 다양한 병적 손상에서 심근 세포에서의 SERCA2a 활성을 회복시킬 수 있다[Nicolaou P et al. (2009) J Moll Cell Cardiol 47: 365-371]. 또한, I-1c 유전자 전달은 SERCA2a 활성을 증가시킴으로써 VSMCs 증식 및 신생 내막 형성을 억제한다. I-1c 및 SERCA2a 유전자 전달은 상승작용(synergistical)을 나타낸다[Lipskaia L et al. (2014) Cirucation 129: 773-785].
본 발명자들은 이전 연구에서, 9 mer 펩타이드인 ψPLB-SE 가 PP1을 타겟팅하고, PLB의 탈 인산화를 억제하여, 심근세포에서 SERCA2a 활성을 증가시키는 것을 밝혔다. 이와 유사하게, ψPLB-SE는 RASMCs와 PASMCs에서도 PLB의 탈 인산화를 억제하였다 (본원명세서 도 7, 도 18a 및 도 20b 참조).
본 발명에서는 합성 조건 하에서 VSMCs의 SERCA2a 수준을 상승시킴으로써 VSMCs의 증식과 신생 내막 형성을 억제한다는 것을 보여주었다. 이전의 연구에서 SERCA 유전자 전달은 SERCA2a 수준을 회복시키는 반면, I-1c 유전자 전달은 SERCA2a 활성을 회복시켰다. 따라서 ψPLB-SE에 의한 PP1 타겟팅이 또한 SERCA2a 수준을 회복시키는 것은 놀라운 일이다. 이러한 현상을 설명하기 위해 본 발명에서는 SERCA2a 수준과 활성이 밀접하게 상호 관련되어있는 모델을 제안한다. 합성 조건 하에서, 증가된 세포질 Ca2+ 수준은 칼페인을 활성화시켜 SERCA2a 단백질을 분해 할 수 있고, 감소된 SERCA2a 수준은 세포질 Ca2+ 수준을 더욱 증가시킬 수 있다. 본 발명의 데이터는 세포질 Ca2+ 의 증가 및 SERCA2a 감소의 악순환이 PP1을 타겟팅함으로써 중단될 수 있음을 보여준다. ψPLB-SE로 PPI를 타겟팅함으로써, 증가 SERCA2a 활성은 세포질 Ca2+ 수준을 더욱 감소시킬 것이며, 이로 인해 칼페인-매개 SERCA2a 분해를 억제함으로써 SERCA2a 수준을 증가된다.
한편, 혈관 내피 세포의 중요한 역할인 혈관 이완/긴장도를 조절하는 기능 가운데 NO 생성은 혈관이완제로써 그리고 증식 억제의 효과를 가진다. 폐동맥 고혈압에서 감소된 NO의 생성은 eNOS의 활성 감소에 기인하며 eNOS의 활성화는 SERCA2a를 통한 세포내 칼슘 농도 조절만으로는 설명하기 충분치 않다. eNOS의 활성화 경로에는 칼슘 의존적 경로와 칼슘 비의존적 경로가 존재한다[Zhao Y et al. (2015) J Pharmacol Sci 129(2): 83-94]. 칼슘 비 의존적 경로의 경우 상위 신호전달을 통해 Akt, AMPK, CamKII, PKA 등을 통해 eNOS의 인산화를 조절함으로써 이루어진다. 이로 인해 생성된 NO는 VSMCs에 영향을 미쳐 cGMP 의존적 단백질 인산화 효소의 활성을 증가시켜서 세포내 칼슘을 낮추는 역할을 하기도 한다[Blatter LA et al. (1994) Cell Calcium 15(2): 122-131]. 현재까지의 연구들은 내피전구세포(EPC)를 기반으로 한 eNOS 유전자 전달, cGMP 생성 효소 활성화제 (riociguat), cGMP 가수분해 억제제 (sildenafil)등으로 근본적으로 NO의 생성이나 역할을 극대화하는 방향으로 진행되고 있다[Prior DL et al. (2016) Med J Aust 205(6): 271-276; Granton J et al (2015) Circ Res 117(7): 645-654]. 본 발명에서는 선행연구에서 입증한 ψPLB-SE의 포스포람반을 타겟으로 한 메커니즘 이외에 PP1-Akt-eNOS 신호전달 메커니즘을 제시함으로써 ψPLB-SE가 VSMCs의 증식을 억제할 뿐만 아니라 혈관 기능전체를 관장하는 VECs의 기능이상 또한 회복시켜줄 수 있음을 증명하였다. ψPLB-SE가 PP1과 Akt의 상호작용을 억제하여 Akt의 탈 인산화를 막고 이로 인해 eNOS의 활성이 조절됨을 증명하였다.
또한, 본 발명에서는 표현형으로 나타나는 특징 중 랫트와 마우스의 폐동맥 고혈압 모델의 혈관에서 나타나는 VSMCs의 이상증식 저해효과와 Masson's trichrome 염색 결과 및 Collagen I, TGF-β등의 유전자 발현 수준의 정상화로 나타나는 혈관 섬유화 감소 효과는 ψPLB-SE가 잠재적으로 고혈압의 치료효과를 기대할 수 있는 가능성을 보여준다.
결과적으로, 본 발명에서는 ψPLB-SE로 PP1을 타겟팅함으로써 합성 조건 하의 VSMCs에서 SERCA2a의 수준과 활성을 회복되는 것을 입증하고 폐동맥 고혈압에서 VECs의 eNOS활성을 증가시키는 것 또한 입증하였다. 이는 ψPLB-SE는 혈관 증식성 질환의 치료를 위한 전략의 기초가 될 수 있으며, 펩타이드로서 또한 유전자 요법에 비해 다른 장점을 가질 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> GWANGJU INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Compositions comprising protein phosphatase 1(PP1) inhibitory peptides for treating vascular diseases <130> PN160362P <150> KR 10-2016-0138612 <151> 2016-10-24 <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 52 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16) <223> 16Ser - phosphorylation <400> 1 Met Glu Lys Val Gln Tyr Leu Thr Arg Ser Ala Ile Arg Arg Ala Ser 1 5 10 15 Thr Ile Glu Met Pro Gln Gln Ala Arg Gln Lys Leu Gln Asn Leu Phe 20 25 30 Ile Asn Phe Cys Leu Ile Leu Ile Cys Leu Leu Leu Ile Cys Ile Ile 35 40 45 Val Met Leu Leu 50 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> protein phosphatase 1 inhibitory peptide <400> 2 Arg Ala Glu Thr Ile Glu Met Pro Gln 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> protein phosphatase 1 inhibitory peptide <400> 3 Arg Ala Asp Thr Ile Glu Met Pro Gln 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> protein phosphatase 1 inhibitory peptide <400> 4 Ala Glu Thr Ile Glu Met Pro Gln 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> protein phosphatase 1 inhibitory peptide <400> 5 Arg Ala Glu Thr Ile Glu Met 1 5 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> protein phosphatase 1 inhibitory peptide <400> 6 Arg Ala Glu Thr Ile Glu 1 5 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse TGF-b 1 F primer <400> 7 caacaattcc tggcgttacc ttgg 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse TGF-b 1 R primer <400> 8 gaaagccctg tattccgtct cctt 24 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Collagen 1 F-primer <400> 9 cccaaggaaa agaagcacgt c 21 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Collagen 1 R-primer <400> 10 aggtcagctg gatagcgaca tc 22 <210> 11 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse a-SMA F primer <400> 11 atcgtccacc gcaaa 15 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse a-SMA R primer <400> 12 aaggaactgg aggcgctg 18 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse IL-1b F primer <400> 13 caaccaacaa gtgatattct ccat 24 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse IL-1b R primer <400> 14 gatccacact ctccagctgc a 21 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse TNF-a F primer <400> 15 catcttctca aaattcgagt gacaa 25 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse TNF-a R primer <400> 16 tgggagtaga caaggtacaa ccc 23 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse F4/80 F-primer <400> 17 cttggctatg ggcttccagt c 21 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse F4/80 R-primer <400> 18 gcaaggagga cagagtttat cgtg 24 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse MCP1 F primer <400> 19 gctcagccag atgcagttaa 20 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse MCP1 R primer <400> 20 tcttgagctt ggtgacaaaa act 23 <210> 21 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> dNP2 <400> 21 Lys Ile Lys Lys Val Lys Lys Lys Gly Arg Lys Gly Ser Lys Ile Lys 1 5 10 15 Lys Val Lys Lys Lys Gly Arg Lys 20 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TAT <400> 22 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> wild type peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) <223> 3Ser - phosphorylation <400> 23 Arg Ala Ser Thr Ile Glu Met Pro Gln 1 5 <210> 24 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 24 Gly Gly Gly 1

Claims (18)

  1. (a) 하기 일반식 I로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 단백질 탈 인산화 효소 1 억제 펩타이드(protein phosphatase 1 inhibitory peptides)의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 혈관 증식성 질환, 동맥경화증, 혈관협착 및 고혈압으로 구성되는 군에서 선택되는 질환을 대상으로 하는 치료용 약제학적 조성물:
    X1-Ala-X2-X3-Ile-Glu-X4 (I),
    상기 X1은 0-20개의 아미노산 잔기이고, 상기X2는 Glu 또는 Asp 이며, 상기 X3은 Thr, Glu 또는 Asp 이고, 및 상기 X4는 0-30개의 아미노산 잔기를 나타낸다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 단백질 탈 인산화 효소 1 억제 펩타이드는 서열목록 제1서열의 아미노산 서열 중 16 번째 아미노산 잔기인 인산화된 세린(phosphorylated Serine residue)이 글루탐산(glutamic acid, Glu) 또는 아스파르트산(aspartic acid, Asp)으로 치환된 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 단백질 탈 인산화 효소 1 억제 펩타이드는 서열목록 제1서열의 아미노산 서열 중 14번째 내지 22번째 아미노산 서열을 포함하는 모방(mimic) 펩타이드로서, 상기 제1서열의 아미노산 서열 중 16번째 아미노산 잔기인 인산화된 세린(phosphorylated Serine residue)이 글루탐산(glutamic acid, Glu) 또는 아스파르트산(aspartic acid, Asp)으로 치환된 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 단백질 탈 인산화 효소 1 억제 펩타이드는 서열목록 제2서열 내지 제6서열의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 단백질 탈 인산화 효소 1 억제 펩타이드는 서열목록 제2서열 또는 제3서열의 아미노산으로 구성되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 삭제
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 X1은 0-20개의 아미노산 잔기이고, 상기 X4는 0-20개의 아미노산 잔기인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 X1은 0-1개의 아미노산 잔기이고, 상기 X4는 0-3개의 아미노산 잔기인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 X1은 Arg인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 8 항에 있어서, 상기 X4는 Met, Met-Pro 또는 Met-Pro-Gln인 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 단백질 탈 인산화 효소 1 억제 펩타이드는 세포막 투과성 펩타이드(cell penetrating peptide, CPP)가 추가적으로 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여 가능한 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 비경구 투여는 혈관 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여, 비강 투여 또는 기도흡입인 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 삭제
  15. 제 1 항에 있어서, 상기 혈관 협착(vascular stenosis)은 심혈관협착(cardiovascular stenosis), 경동맥협착(carotid artery stenosis), 뇌혈관협착(cerebral vascular stenosis), 폐동맥협착(pulmonary stenosis), 신동맥협착(renal artery stenosis), 대퇴동맥협착(femoral artery stenosis), 하지동맥협착(lower limb artery stenosis) 또는 혈관 재협착(vascular restenosis)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 혈관 재협착(vascular restenosis)은 혈관 수술(vascular surgery) 또는 혈관성형술(angioplasty)에 의한 재협착(restenosis)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 제 1 항에 있어서, 상기 고혈압(hypertension)은 고혈압성 혈관질환(hypertensive vascular disease), 고혈압성 폐질환(hypertensive pulmonary disease), 고혈압성 뇌증(hypertensive encephalopathy), 고혈압성 심장질환(hypertensive heart disease), 고혈압성 신경화증(hypertensive nephrosclerosis) 또는 고혈압성 망막병증(hypertensive retinitis)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  18. 하기 일반식 I로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 단백질 탈 인산화 효소 1 억제 펩타이드(protein phosphatase 1 inhibitory peptides)를 포함하는 혈관 증식성 질환, 동맥경화증, 혈관협착 및 고혈압으로 구성되는 군에서 선택되는 질환의 완화 또는 개선용 식품 조성물:
    X1-Ala-X2-X3-Ile-Glu-X4 (I),
    상기 X1은 0-20개의 아미노산 잔기이고, 상기 X2는 Glu 또는 Asp 이며, 상기 X3은 Thr, Glu 또는 Asp 이고, 및 상기 X4는 0-30개의 아미노산 잔기를 나타낸다.
KR1020170138581A 2016-10-24 2017-10-24 단백질 탈 인산화 효소 1 억제 펩타이드를 포함하는 혈관 질환 치료용 조성물 KR102077333B1 (ko)

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