ES2639121T3

ES2639121T3 - Péptidos señuelo que inhiben la desfosforilación de fosfolambano mediada por la proteína fosfatasa 1

Info

Publication number: ES2639121T3
Application number: ES13812631.3T
Authority: ES
Inventors: Woo Jin Park; Roger J. Hajjar; Jae Gyun Oh
Original assignee: Gwangju Institute of Science and Technology
Current assignee: Gwangju Institute of Science and Technology
Priority date: 2012-07-05
Filing date: 2013-07-05
Publication date: 2017-10-25
Anticipated expiration: 2033-07-05
Also published as: EP2870171A1; US10208085B2; KR20140010889A; USRE48636E1; WO2014007584A1; KR101516791B1; JP2016500647A; US10479816B2; EP2870171B1; EP2870171A4; US20190112338A1; JP6404213B2; US20150166603A1

Abstract

Un péptido o polipéptido señuelo que consiste en una secuencia peptídica representada por la Fórmula I siguiente: X1-Ala-X2-X3-Ile-Glu-X4 (I) en la que X1 representa 0-1 residuos de aminoácidos, X2 representa Ser, Glu o Asp, X3 representa Thr, Glu o Asp y X4 representa 0-3 residuos de aminoácidos, con la condición de que X2 no es Ser cuando X3 es Thr; en el que el péptido o polipéptido señuelo inhibe la desfosforilación de PLB (fosfolambano) mediada por PP1 (proteína fosfatasa 1) por una inhibición competitiva, en la que ni X1 ni X4 contienen dominios que abarcan la membrana y con la condición de que el péptido no sea Tyr Ala Asp Asp Ile Glu Lys Lys Ile.

Description

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De acuerdo con las técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, la composición farmacéutica puede formularse con vehículo y/o vehículo farmacéuticamente aceptable como se ha descrito anteriormente, proporcionando finalmente varias formas incluyendo una forma de dosis unitaria y una forma de dosis múltiple. La formulación puede ser aceite o medio acuoso, resuspensión o emulsión, extracto, polvo, gránulo, tableta y cápsula y comprende además dispersante o estabilizante.

En otro aspecto de esta invención, se proporciona un método para preparar un péptido o polipéptido señuelo de PLB capaz de inhibir la desfosforilación mediada por PP1 de PLB mediante una inhibición competitiva, que comprende

(a) diseñar el péptido o polipéptido señuelo de PLB Sustituyendo un residuo de Ser en la posición de aminoácido 16 y/o un residuo de Thr en la posición de aminoácido 17 de la secuencia de aminoácidos de PLB (SEQ ID NO: 10) con un residuo de Glu o Asp y seleccionando 0-4 amino ácido(s) circundante(s) alrededor de la posición de aminoácido (15-19) de la secuencia de aminoácidos de PLB (SEQ ID NO: 10), de manera que el péptido o polipéptido señuelo se compone de una secuencia peptídica representada por la Fórmula I siguiente: Xi-Ala-X2-X3-Ile-Glu-X4 (1) en la que X1 representa 0-1 residuos de aminoácidos, X2 representa Ser, Glu o Asp, X3 representa Thr, Glu o Asp y X4 representa 0-3 (S) de aminoácido, con la condición de que X2 no sea Ser cuando X3 es Thr, con la condición de que el péptido sea No Tyr Ala Asp Asp Ile Glu Lys Lys Ile; y (b) preparar el péptido o polipéptido señuelo diseñado en la etapa (a).

La presente invención se describirá con más detalle como sigue:

En el péptido o polipéptido señuelo de la presente invención, los residuos de aminoácidos en la posición de aminoácidos 15, 18 y 19 de la secuencia de aminoácidos de PLB son Ala, Ile y Glu (véase SEC ID NO: 10 ).

De acuerdo con la presente invención, "Ala-X2-X3-Ile-Glu" del péptido señuelo o secuencia de polipéptido es necesaria para sus acciones y funciones. El (los) residuos de aminoácidos circundante(s) puede tener variaciones de acuerdo con las reivindicaciones. En otras realizaciones, el residuo o residuos de aminoácidos circundante consiste en (i) una secuencia de aminoácidos que abarca 0-1 residuos de aminoácidos en la dirección N-terminal de la posición de aminoácido 15 y (ii) un aminoácido secuencia que abarca 0-3 residuos de aminoácidos en la dirección C-terminal de la posición de aminoácido 19 de la secuencia de aminoácidos de PLB (SEQ ID NO: 10). En otras realizaciones, el residuo de aminoácidos en la dirección N-terminal de la posición de aminoácido 15 es 1 residuo de aminoácidos y el residuo de aminoácidos en la dirección C-terminal de la posición de aminoácido 19 es 0 o 3 residuos de aminoácidos.

En otra realización, el residuo de aminoácidos en la dirección N-terminal de la posición de aminoácido 15 es Arg. En otras realizaciones, el residuo de aminoácidos en la dirección C-terminal de la posición de aminoácido 19 es Met, Met-Pro o Met-Pro-Gln.

En la presente invención, el péptido o polipéptido señuelo sustituido con el residuo de Ser16 o Thr17 con un residuo Glu o Asp aumenta la fosforilación de PLB (ver Fig. 1c y 1d). Por lo tanto, incluso si el único de los residuos Ser16 y Thr17 se sustituye con residuo Glu o Asp, el péptido o polipéptido señuelo podría inhibir la desfosforilación mediada por PP1 de PLB.

En ciertas realizaciones, el péptido o polipéptido señuelo se diseña sustituyendo el residuo Ser o ambos residuos Ser y Thr con un residuo Glu o Asp. En ciertas realizaciones, el péptido o polipéptido señuelo se diseña sustituyendo solamente el residuo Ser por un residuo Glu o Asp.

En realizaciones particulares, el péptido o polipéptido señuelo está diseñado de manera que consista en la secuencia de aminoácidos seleccionada de secuencias de aminoácidos como se establece en las SEQ ID NO: 1-6. En realizaciones particulares, el péptido o polipéptido señuelo está diseñado de tal manera que consiste en la secuencia de aminoácidos seleccionada de secuencias de aminoácidos como se establece en las SEQ ID NO: 1 y 3

6. En realizaciones particulares, el péptido o polipéptido señuelo está diseñado de tal manera que consiste en la secuencia de aminoácidos seleccionada de secuencias de aminoácidos como se establece en las SEQ ID NO: 1, 3 y

6.

Después de la etapa (a), se prepara el péptido o polipéptido señuelo diseñado en la etapa (a).

El péptido o polipéptido señuelo de la presente invención puede prepararse de acuerdo con tecnologías de ADN recombinante o la técnica de síntesis en fase sólida comúnmente empleada en la técnica (Merrifield, RB, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154 (1963), Kaiser, E., Colescot, RL, Bossinger, CD, Cook, PI, Anal. Biochem., 34: 595-598 (1970)). Los aminoácidos con grupos α-amino y de cadena lateral protegidos están unidos a una resina. Después, de eliminar los grupos protectores de α-amino, los aminoácidos se acoplan sucesivamente para obtener un intermedio.

En ciertas realizaciones, la enfermedad asociada con PLB es una enfermedad del corazón. En ciertas realizaciones, la enfermedad cardíaca es insuficiencia cardíaca, isquemia, arritmia, infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca congestiva, rechazo de trasplante, contractilidad anormal del corazón o metabolismo anómalo de Ca2+. En ciertas

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Microscopio de fluorescencia

Para confirmar la captación celular de los péptidos, se marcó ψPLB-SE con FITC. Los cardiomiocitos aislados se colocaron sobre una placa de vidrio recubierta con laminina y se cultivaron en medio de Eagle modificado con solución de sal equilibrada de Hanks, suplementada con L-carnitina 2 mM, creatina 5 mM y taurina 5 mM y 100 UI/ml de penicilina. Las células se expusieron a ψPLB-SE 1 µM marcado con FITC durante 1 h, y después se lavaron dos veces con solución de Tyrode. Las imágenes de fluorescencia se visualizaron usando un microscopio Leica DMRBE (LabCommerce Inc.) equipado con un objetivo de aceite de 63x (1,4NA) y conjuntos de filtros optimizados para fluoresceína FITC (OmegaR Optical Inc.). Las imágenes se adquirieron utilizando una cámara CoolSNAP TMfx CCD (Photometrics) y se analizaron con el software de imágenes Metamorph (Universal Imaging Co.).

Análisis por inmunoprecipitación Western.

Se pasaron lisados de corazón (50 µg) en amortiguador de muestra de SDS a un gel de SDS-PAGE y después se transfirieron a una membrana de PVDF (Bio-Rad). La membrana se bloqueó con una solución de leche desnatada al 5% y luego se incubó durante la noche con anticuerpos dirigidos contra PLB (Affinity Bioreagents), fosfo-PLB (Ser16, Cell Signaling), fosfo-PLB (Thr17, Badrilla), SERCA2a (Santa Cruz), Caspasa 3 (Cell Signaling), o GAPDH (Santa Cruz). Las membranas se incubaron luego con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (Jackson Immuno Research) y se desarrollaron usando el reactivo de quimioluminiscencia Western Lighting (Perkin Elmer).

Contractilidad Celular y Mediciones Transientes Intracelulares de Ca2+

Las propiedades mecánicas de los miocitos ventriculares se evaluaron utilizando un sistema de detección de contornos basado en vídeo (IonOptix), como se describió previamente [34]. En resumen, los cubreobjetos recubiertos con laminina con células unidas se colocaron en una cámara montada en la platina de un microscopio invertido (Nikon Eclipse TE-100F) y se perfundieron (aproximadamente 1 ml/min a 37ºC) con amortiguador Tyrode (NaCl 137 mM, KCl 5,4 mM, CaCl2 1 mM, MgCl2 1 mM, glucosa 10 mM y HEPES 10 mM [pH 7,4]). Las células fueron estimuladas en campo a una frecuencia de 3 Hz (30 V) usando un estimulador/termostato STIM-AT colocado en un soporte de estimulación/cámara de cultivo HLDCS (Cell Micro Controls). El miocito de interés se visualizó en un monitor de ordenador utilizando una cámara IonOptix MyoCam, que escaneó rápidamente el área de la imagen cada 8,3 ms, de modo que la amplitud y velocidad de acortamiento o realargamiento se registraron con fidelidad. Los cambios en la longitud de la célula durante el acortamiento y el realargamiento fueron capturados y analizados usando el software de contornos suaves (IonOptix). Los cardiomiocitos se cargaron con Fura2-AM 0,5 μM (Molecular Probes), un indicador sensible al Ca2+, durante 15 minutos a 37ºC. Las emisiones de fluorescencia se registraron simultáneamente con las mediciones de contractilidad utilizando el sistema de registro de calcio y contractilidad de Myocyte (IonOptix). Los cardiomiocitos se expusieron a la luz emitida por una lámpara halógena de 75 W a través de un filtro 340 o 380 nm mientras que se estimulaban en campo como se ha descrito anteriormente. Las emisiones de fluorescencia se detectaron entre 480 y 520 nm mediante un tubo fotomultiplicador después de la iluminación inicial a 340 nm durante 0,5 ms y luego a 380 nm durante la duración del protocolo de registro. El escaneo de excitación de 340 nm se repitió al final del protocolo y se dedujeron cambios cualitativos en la concentración de Ca2+ intracelular a partir de la relación de la intensidad de fluorescencia de Fura en ambas longitudes de onda.

Experimentos con corazón perfundido aislado

Las ratas se anestesiaron por inhalación de isoflurano (0,5%) durante 5 min. El corazón se retiró rápidamente y se colocó en una solución fría de Tyrode oxigenada (NaCl 137 mM, KCl 5,4 mM, MgCl2 1 mM, glucosa10 mM, CaCl2 1 mM, HEPES 10 mM [pH 7,4], 100% de O2). La aorta fue canulada y perfundida por el método de Langendorff con solución de Tyrode oxigenada a presión constante (65 mmHg, temperatura 37 ± 0,2ºC). Se insertó un balón de látex relleno de agua en la cámara ventricular izquierda y se conectó a un transductor de presión (AD Instruments) para la medición continua del rendimiento cardíaco. La frecuencia cardiaca, la presión desarrollada por el ventrículo izquierdo (LVDP) y las primeras derivadas de la presión del LV (LV -dP/dt max y LV -dP/dt max) se registraron usando PowerLab Chart Systems (AD Instruments). El volumen del balón se ajustó en 250-300 μl para dar lugar a una presión diastólica final medida en el intervalo de 6-10 mmHg. Después de un período de estabilización de 30 minutos, los corazones se sometieron a 20 minutos de no flujo para inducir la isquemia global, seguidos de 30 minutos de reperfusión. La perfusión de los péptidos señuelo se realizó a una concentración final de 1 μM.

Estadísticas

Cuando sea apropiado, los datos se expresan como ± SD medias. Las comparaciones de las medias de grupo se hicieron utilizando una prueba t de Student o una ANOVA unidireccional con corrección de Bonferroni (Statview versión 5.0, SAS). Se consideró que un valor de P <0,05 era estadísticamente significativo.

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Resultados

Péptido señuelo

El PLB está compuesto por una hélice citoplásmica en el extremo N, una hélice transmembrana en el extremo C, y un bucle flexible que conecta las dos hélices (figura 1a, a la izquierda). Los sitios de fosforilación Ser16 y Thr17 residen en la región del bucle de conexión. Se sintetizó un péptido 9-mero (RASTIEMPQ (SEQ ID NO. 8)) que coincidía exactamente con la secuencia de nueve aminoácidos de la región de bucle y se acopló a un péptido permeable a células TAT a través de un enlace disulfuro para producir ψPLB-p. Además, se generaron péptidos acoplados a TAT similares, en los que el residuo Ser o Thr correspondiente a Ser16 o Thr17 de PLB fue sustituido individualmente por Glu para producir ψPLB-SE o ψPLB-TE, respectivamente (Figura 1a, derecha). Estos péptidos se marcaron con FITC y se añadieron a los cardiomiocitos cultivados aislados de ventrículos izquierdos de rata. La observación bajo un microscopio de fluorescencia reveló una captación intracelular eficiente de los péptidos en prácticamente todos los cardiomiocitos (figura 1b). Este experimento aseguró que los cardiomiocitos tomaron eficientemente los péptidos, y así los péptidos no marcados se usaron entonces para el resto de los experimentos.

Se sabe que el tratamiento de cardiomiocitos con PMA (13-acetato 12-miristato de forbol) reduce significativamente la fosforilación de PLB mediante la activación de PKCα. El pretratamiento con ψPLB-SE, pero no con ψPLB-p, bloqueó significativamente la desfosforilación inducida por PMA de PLB tanto en Ser16 como en Thr17. ΨPLB-TE también bloqueó la desfosforilación, pero fue menos eficaz que ψPLB-SE (Figura 1c). Los niveles elevados de fosforilación de PLB observados después del tratamiento con ψPLBSE fueron ligera pero significativamente más altos que los niveles basales. Teniendo en cuenta que PP1 es la única proteína fosfatasa conocida para desfosforilar PLB, estos datos demostraron que ψPLB-SE sirvió como un péptido señuelo eficaz para inhibir competitivamente PP1 mediada por desfosforilación de PLB.

El ΨPLB-SD, en el que Ser16 se reemplazó con Asp, fue tan eficaz como ψPLB-SE al elevar los niveles de fosforilación de PLB (Figura 1c). Se sintetizaron péptidos ψPLB-SE acortados que consistían en AETIEMPQ (SEQ ID NO. 4) (ψPLB-8-mero), RAETIEM (SEQ ID NO: 5) (ψPLB-7-mero), RAETIE (SEQ ID NO: 6) (ΨPLB-6-mero), y RAETI (SEQ ID NO: 7) (ψPLB-5-mero). Entre estos péptidos, sólo ψ PLB-5-mero fue ineficaz en la elevación de los niveles de fosforilación de PLB (Fig. 1d). Por lo tanto, parecía que ASTIE (SEQ ID NO: 9) es la secuencia de aminoácidos mínima requerida, y que el residuo Ser puede ser reemplazado por Glu o Asp para crear un péptido señuelo efectivo para PP1.

ΨPLB-SE aumenta la contractilidad de los cardiomiocitos

A continuación, probamos si ψPLB-SE afectaba a la contractilidad de los cardiomiocitos. Los cardiomiocitos adultos aislados fueron pretratados con los péptidos y luego tratados con PMA. Como se indica por la reducción de los parámetros contráctiles, incluyendo el acortamiento de pico, y las tasas de contracción y relajación, la contractilidad se redujo significativamente por PMA. Mientras que ψPLBwt y ψPLB-TE no produjeron efectos marginales o únicos sobre la contractilidad, ψPLB-SE evitó completamente la reducción inducida por PMA en la contractilidad (Figura 2a). PMA también evocó una reducción significativa en la amplitud transiente de Ca2+ y un aumento significativo en la constante de tiempo del decaimiento transiente de Ca2+ (τ). Estos defectos inducidos por PMA se revirtieron completamente mediante el pretratamiento con ψPLB-SE, mientras que los efectos de ψPLB-wt y ψPLB-TE en el manejo intracelular de Ca2+ fueron insignificantes o marginales (figura 2b). Estos datos indicaron que los niveles de fosforilación restaurados de PLB endógeno mediante el pretratamiento de ψPLB-SE produjeron una contractilidad normalizada. Tanto ψPLB-SD como ψPLB-6-mero fueron tan eficaces como ψPLB-SE en la preservación de la contractilidad y el manejo de Ca2+ (Fig. 2c y 2d).

ΨPLB-SE mejora la recuperación funcional después de isquemia/reperfusión ex vivo

Examinamos además los beneficios de ψPLB-SE durante la isquemia/reperfusión (I/R) ex vivo. Corazones de rata fueron perfundidos según Langendorff, sometidos a 20 minutos sin flujo para inducir isquemia global, y luego 30 minutos de reperfusión. La presión desarrollada de los ventrículos izquierdos se redujo significativamente (37-44 mmHg frente a 80-100 mmHg en la preisquemia) por I/R. En el momento de la reperfusión, se añadió ψPLB-SE o un péptido de control TAT a las soluciones de reperfusión. Aunque TAT no tuvo efectos, ψPLB-SE elevó significativamente la presión desarrollada (73-78 mmHg) (Fig. 3a). Al final del experimento, se prepararon lisados de los corazones y se sometieron a inmunotransferencia Western. La fosforilación de PLB tanto en Ser16 como en Thr17 se redujo significativamente por I/R, y la fosforilación en Ser16 se recuperó significativamente por ψPLB-SE. Además, la caspasa 3 relacionada con la muerte celular fue activada por I/R, que fue completamente invertida por ψPLB-SE (Figura 3b). Colectivamente, estos datos mostraron que ψPLB-SE mejoró la recuperación funcional después de I/R, al menos en parte, a través de la elevación de los niveles de fosforilación de PLB en Ser16.

Discusión

SERCA2a es un regulador crucial de la manipulación intracelular de Ca2+ en cardiomiocitos, y su función en la insuficiencia cardíaca y la lesión I/R está bien establecida [6]. Por lo tanto, las modalidades que normalizan los

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niveles y/o actividad de SERCA2a podrían tener potenciales terapéuticos significativos. Uno de estos enfoques implica una recuperación mediada por la administración génica de niveles de SERCA2a suprimidos en corazones que fallan. Este enfoque es eficaz en los modelos animales de la insuficiencia cardíaca [13-16], y recientemente se ha demostrado ser seguro y eficaz en la fase final de pacientes con insuficiencia cardíaca [17, 18].

PLB es un inhibidor endógeno de SERCA2a y es por lo tanto un objetivo potencial para la modulación de la actividad de SERCA2a. La subregulación de PLB con ARN antisentido [35] o ARN de interferencia pequeño [36] parcialmente restauró la actividad de SERCA2a y la contractilidad de los cardiomiocitos. Una forma negativa dominante de PLB, K3E/R14E, diseñada para interrumpir la integridad estructural de PLB endógeno, aumentó la actividad de SERCA2a en cardiomiocitos de neonatales y adultos [35].

En este estudio, se demostró que ψPLB-SE previene la desfosforilación de PLB sirviendo como un péptido señuelo para PP1. Curiosamente, encontramos que ψ PLB-TE no fue tan eficaz como ψPLB-SE (Fig. 1c]. Aunque una visión estructural no está disponible actualmente, es posible que PLB con una fosforilación en Ser16 es un mejor sustrato para PP1 que PLB con una fosforilación en Thr17. Es notable que la fosforilación en Thr17 se produce sólo después de la fosforilación en Ser16 durante β-adrenérgicos estimulación [36]. Por lo tanto, PLB con fosforilación sólo en Thr17 puede no existir in vivo. En conclusión, se mostró que ψ PLB-SE provocó efectos cardioprotectores mediante la restauración de SERCA2a actividad. Como un péptido corto, ψPLB-SE tiene varias ventajas terapéuticas sobre los ARNsi o las proteínas PLB mutantes. Se necesitan otros experimentos para determinar si ψPLB-SE es eficaz en varios modelos quirúrgicos y genéticos de insuficiencia cardíaca.

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<110> GWANGJU INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY

<120> PÉPTIDOS SEÑUELO QUE INHIBEN LA DESFOSFORILACIÓN DE FOSFOLAMBANO MEDIADA POR LA PROTEÍNA FOSFATASA 1

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