JP6068347B2 - 筋機能を増強させる短ペプチド - Google Patents

Description

本発明は、筋症を治療又は予防するために、特に骨格筋障害又は心筋障害を治療又は予防するために使用することができるＳ１００タンパク質由来の筋機能増強アミノ酸配列を含む短縮ペプチドと、上記ペプチドを含む医薬組成物と、かかる筋症を治療又は予防する方法とに関する。

筋肉組織は、骨格筋組織、心筋組織及び平滑筋組織に細分類され、脊椎動物の最大の器官と考えることができる。例えば、平均的な成人男性は、４０％〜５０％が骨格筋で構成される。骨格筋及び心筋は横紋筋組織に属し、多くの機能的側面を共有する。例えば、骨格筋細胞及び心筋細胞（cardiac muscle cells (cardiomyocytes)）における興奮収縮連関のプロセスは非常に類似している。筋細胞の膜脱分極により、活性化電位依存性Ｌ型カルシウムチャネルを介した筋細胞の細胞質（筋形質）中へのカルシウムの流入が引き起こされる。細胞質のカルシウム濃度の上昇は、カルシウム誘導性カルシウム放出（ＣＩＣＲ）メカニズムを通じたリアノジン受容体（ＲｙＲ）の活性化により筋小胞体（ＳＲ）からのカルシウム放出を引き起こし、ひいては細胞質のカルシウム濃度の更なる迅速な上昇を引き起こす。カルシウム分子は、細胞質を通って拡散し、収縮タンパク質、例えば筋細胞の収縮を引き起こすトロポニンＣと結合する。収縮後、カルシウムは、主に筋小胞体／小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ）の作用により、カルシウムの筋小胞体中への再取込みにより細胞質から除去される。これらの事象は骨格筋細胞及び心筋細胞において本質的に同一であるが、関与するタンパク質のアイソフォームにわずかに相違点がある。例えば、ＲｙＲ１は骨格筋細胞において優勢な筋小胞体カルシウム放出チャネルであるが、心筋細胞においてはＲｙＲ２が優勢である。同様に、骨格筋の筋小胞体／小胞体カルシウムＡＴＰアーゼはＳＥＲＣＡ１ａであり、ＳＥＲＣＡ２ａは心筋細胞特異的である。

筋細胞中のカルシウム循環は、多数のタンパク質により調節される。例えば、Ｓ１００タンパク質ファミリーに属するＳ１００Ａ１（ＥＦハンドを有する最大のカルシウム結合タンパク質サブファミリー）は、ＲｙＲカルシウム放出チャネル及びＳＥＲＣＡの両方と相互作用することが報告されている。Ｓ１００Ａ１は、拡張期にＲｙＲを安定化させてカルシウムスパークの頻度を低減させ、収縮期にカルシウム放出を増強する。さらに、Ｓ１００Ａ１は弛緩期にＳＥＲＣＡ活性を増大させ、心筋細胞及び骨格筋細胞において収縮機能を増大させることが見出された。Ｓ１００Ａ１タンパク質由来のカルボキシ末端ペプチドが全長Ｓ１００Ａ１タンパク質の変力効果を模倣することが分かっている（非特許文献１、非特許文献２）。

筋細胞におけるカルシウム循環不全は、例えば、収縮時における筋小胞体からのカルシウム放出を低減し、異常なカルシウム放出事象、筋小胞体からのカルシウム漏出、又は細胞質からのカルシウム除去の遅延化を引き起こし、様々な筋症、すなわち筋機能障害と関連する疾患をもたらす。例えば、心不全（cardiac insufficiency）、心室収縮機能不全、不整脈、心不全（heartfailure）、心原性ショック、心筋梗塞、及び心臓弁の機能不全は、心筋細胞におけるカルシウム処理（calciumhandling：カルシウムハンドリング）の調節不全と関連している。同様に、骨格筋線維におけるカルシウム循環不全は、筋ジストロフィーと関連付けられている（非特許文献３）。さらに、筋肉細胞におけるカルシウムシグナル伝達の破壊を引き起こすＲｙＲカルシウム放出チャネルにおける突然変異は、筋症と関連している。特に、８０を超える突然変異が、骨格筋のＲｙＲ１カルシウム放出チャネルにおいて特定されており、悪性高熱症、セントラルコア病又はマルチミニコア病（multi-minicore disease）と関連付けられている。さらに、心室性不整脈及び心臓突然死を引き起こす心筋のＲｙＲ２カルシウム放出チャネルにおける４０を超える突然変異が報告されている（非特許文献４）。

現在のところ、骨格筋障害に利用可能な臨床的な変力療法は存在しない。心筋症の変力治療に現在利用可能な認可された治療薬、例えばグリコシド誘導体、カテコールアミン及びホスホジエステラーゼ阻害剤は、重度の副作用、例えば心拍数の増大、及び生命を脅かす催不整脈能という問題を有する。これらの認可された治療薬の他に、Ｓ１００Ａ１タンパク質が、心不全において心筋のＳ１００Ａ１レベルが減少すること、及び心筋細胞へのＳ１００Ａ１の送達により等尺性収縮の増大、その後筋小胞体中に汲み上げられるカルシウム量の増大がもたらされることが示されたため、心筋症における治療薬として提唱されている。しかしながら、筋症を治療する目的での患者へのＳ１００Ａ１の投与は、遺伝子療法の送達経路、例えばウイルス送達を使用する送達経路（全てのその既知の副作用及び欠点を伴う）を必要とする（非特許文献１、特許文献１及び非特許文献５）。

したがって、筋症、好ましくは筋肉細胞におけるカルシウム循環の調節不全と関連する筋症の変力治療のための新規の治療薬であって、認可された治療薬において見られる重度の副作用を示さず、遺伝子療法に係る高リスクの送達経路を必要としない治療薬に対する緊急の必要性が存在する。骨格筋疾患に関して、骨格筋細胞の収縮能力を増大させる能力を有し、及び／又は骨格筋細胞におけるカルシウム誘導性アポトーシス細胞死を低減させるいずれかの変力治療薬に対する緊急の必要性が存在する。

カルシウム結合タンパク質Ｓ１００に由来する２０アミノ酸ペプチドは、変力効果を示すことが知られている（非特許文献２）。ペプチドは非常に有用な治療剤と考えられているが、概して細胞への問題のある送達、すなわち膜透過輸送、又は免疫原性効果等の幾つかの欠点がある。本発明者らは驚くべきことに、Ｓ１００タンパク質のアミノ酸７６〜８５を含む大幅に短縮したペプチドＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１０が、上記２０ｍｅｒペプチドと同様の変力効果を有することを見出した。しかしながら、更なる断片化は機能性ペプチドを生じず、Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１０が最も短い機能性Ｓ１００Ａ１断片を含むことが示されている（特許文献２）。この点から非常に驚くべきことに、本発明者らは今回、更に短いＳ１００Ａ１断片を含むペプチドも変力効果を示すことを見出し、機能性に最低限必要とされる、Ｓ１００Ａ１に由来する４アミノ酸コアモチーフ（Ｓ１００Ａ１タンパク質のアミノ酸７９〜８２）を同定した。これらの短縮ペプチドのサイズの減少のために、細胞への送達が容易になり、免疫原性の副作用が最小限に抑えられる。これらの短縮ペプチドは、非経口投与すると、言及すべき副作用を示さず、遺伝子療法を必要としないことから筋症、例えば心筋障害及び骨格筋障害の治療に有用である。例えば、本発明によるペプチドは、正常な心筋及び不全心筋における並びに正常な及び罹患した骨格筋における変力性を増強するとともに回復させ、筋小胞体のカルシウム処理を増強するとともに回復させ、筋細胞におけるカルシウム誘導性アポトーシス細胞死を防止し、催不整脈性の筋小胞体のカルシウム漏出及び頻脈性不整脈から保護し、心力不全及び頻脈性不整脈からの保護により心臓死を防止する。本発明のペプチドは主要な副作用を伴わずに心筋組織及び骨格筋組織の収縮能力を増強するのに特に有用である。

国際公開第２００８／０５４７１３号 国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／００２３４３号

Most P. et al.,2007, Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 293:R568-577 Voelkers M. etal., 2007, Cell Calcium 41:135-143 Hopf F.W. et al.,2007, Subcell. Biochem. 45:429-64 Dulhunty A.F. etal., 2006, J. Muscle Res. Cell Motil. 27:351-365 Vinge L.E. etal., 2008, Circ. Res. 102:1458-1470

第１の態様では、本発明は、親水性ドメイン、及び／又は１つ又は複数の膜浸透増強ドメイン、及びＳ１００Ａ１タンパク質由来のドメインを含む、又はそれからなる陽性変力ペプチドであって、上記Ｓ１００Ａ１タンパク質由来のドメインが、変力モチーフ：
Φ^１−Φ^２−Φ^３−Φ^４−Ｘ^５−Ψ^６−Ｌ^７−［Ｔ／Ａ］^８−Ψ^９−Ψ^１０
の４個〜９個の連続するアミノ酸からなり、少なくともコアモチーフΦ^４−Ｘ^５−Ψ^６−Ｌ^７（式中、Φ及びΨはそれぞれ独立して選択される疎水性の非芳香族アミノ酸であり、Ｘは任意のアミノ酸である）を含み、該ペプチドが最大１００アミノ酸の完全長を有し、該ペプチドが陽性変力作用を示す、陽性変力ペプチドを提供する。

第２の態様では、本発明は、Ｓ１００Ａ１タンパク質由来のドメインを含む、又はそれからなる陽性変力ペプチドであって、上記Ｓ１００Ａ１タンパク質由来のドメインが、変力モチーフ：
Φ^１−Φ^２−Φ^３−Φ^４−Ｘ^５−Ψ^６−Ｌ^７−［Ｔ／Ａ］^８−Ψ^９−Ψ^１０
の７個〜９個の連続するアミノ酸からなり、少なくともコアモチーフΦ^４−Ｘ^５−Ψ^６−Ｌ^７（式中、Φ及びΨはそれぞれ独立して選択される疎水性の非芳香族アミノ酸であり、Ｘは任意のアミノ酸である）を含むが、ただし、７個〜９個の連続するアミノ酸からなる上記Ｓ１００Ａタンパク質由来のドメインのＮ末端アミノ酸がΦ^１であり、該ペプチドが最大１００アミノ酸の完全長を有する、陽性変力ペプチドを提供する。

第３の態様では、本発明は、医学的使用のための第１又は第２の態様のペプチドに関する。

第４の態様では、本発明は、筋機能障害と関連する障害の治療又は予防における治療上の使用のための第１又は第２の態様のペプチドを提供し、好ましくは、該障害は心筋障害及び／又は骨格筋障害であり、好ましくは、該筋機能障害は筋肉細胞におけるカルシウム循環不全及び／又は収縮能力不全と関連する。好ましくは、該ペプチドは、筋肉細胞においてカルシウム循環を増強する及び／又は回復させるための、及び／又は収縮能力を増強する及び／又は回復させるためのものである。心筋障害は虚血後収縮機能不全、うっ血性心不全、心原性ショック、敗血症ショック、心筋梗塞、心筋症、心臓弁の機能不全、及び心室障害からなる群から選択することができ、骨格筋障害は筋ジストロフィー、筋力低下、筋萎縮症、筋炎、セントラルコア病、ネマリン桿状体筋症（nemaline rod myopathy）、中心核筋細管筋症（centronuclearmyotubular myopathy）、眼の眼筋麻痺、ミトコンドリア筋症からなる群から選択することができる。

第５の態様では、本発明は、本発明の第１又は第２の態様のペプチドと、薬学的に許容可能な添加物、担体及び／又は希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。好ましい一つの実施の形態では、医薬組成物は、筋機能障害と関連する障害を治療又は予防するためのものである。

第６の態様では、本発明は、筋機能障害と関連する障害を治療又は予防する方法であって、それを必要とする個体に対して、上記個体の疾患状態を改善するのに十分な量の本発明によるペプチド又は医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。

第７の態様では、本発明は、本発明の第１又は第２の態様によるペプチドと、カテコールアミン、β−アドレナリン受容体作動薬及びβ−アドレナリン受容体遮断薬からなる群から選択される薬物とを含む医薬組成物を提供する。

生物活性リード構造としてのＳ１００Ａ１タンパク質のＣ末端の特性決定を示す図である。図１は、上段に天然ヒトＳ１００Ａ１タンパク質（Ｓ１００Ａ１、９４アミノ酸、配列番号３８）の、及び下段にＣ末端側のカルシウム結合ＥＦハンドを欠くアミノ酸７５〜９４を包含する２０ｍｅｒペプチド（Ｓ１００Ａ１−ｃｔペプチド）としてのＳ１００Ａ１のＣ末端（配列番号３９）の一次構造を示す。 ヒトＳ１００Ａ１の疎水性プロットを示す図である。アミノ酸７５〜９４を包含するＳ１００Ａ１のＣ末端ドメインは、このタンパク質の最も疎水性の高い領域である。本発明者らは、http://www.vivo.colostate.edu/molkit/hydropathy/index.htmlで利用可能な疎水性プロットを利用して、ヒトｓ１００ａ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ００６２７１）の公開済のｃＤＮＡ配列を用いてカイト・ドーリトルプロットを行った。０を超えるｙ軸スコアは、疎水性の増大を示す。アミノ酸７５〜９４を含むＳ１００Ａ１のＣ末端に、灰色のバーで印を付す。 ヒトＳ１００Ａ１タンパク質の三次構造／四次構造を示す図である。図３ＡはヒトＳ１００Ａ１の三次構造／四次構造を可視化しており、これにより疎水性のＣ末端がホモ二量体タンパク質のそれぞれカルシウム非結合形態及びアポ状態（apo-state）の内側に埋め込まれていることが示される。図３Ｂは、両方のＥＦハンドモチーフに対するカルシウムの結合が、Ｓ１００Ａ１のＣ末端の分子表面への露出を引き起こし、これにより疎水性ドメインがタンパク質間相互作用に利用可能となることを示している。したがって、アミノ酸７５〜９４を含むＳ１００Ａ１のＣ末端により、カルシウムが結合し「活性化された」二量体Ｓ１００Ａ１タンパク質における標的タンパク質の結合、及び標的タンパク質の機能／活性の変調が説明されることが示唆された。Ｓ１００Ａ１に対するカルシウムの結合は立体構造変化をもたらし、これによりＣ末端ドメイン（アミノ酸７５〜９４）（点線を付した箱型領域）がタンパク質間相互作用に利用可能となる。 化学的に透過処理した心筋細胞調製物及び骨格筋細胞調製物中におけるヒトＳ１００Ａ１タンパク質及び２０ｍｅｒのＣ末端ペプチドを示す図である。細胞内への到達、並びにＲｙＲ２及びＲｙＲ１の機能の調節が可能となる化学的に透過処理した心筋細胞調製物及び骨格筋細胞調製物中において天然ヒトＳ１００Ａ１タンパク質、及び２０ｍｅｒのＣ末端ペプチドの生物活性が同等であることが、本発明者らにより示された。図４は、ローダミン標識した組換えヒトＳ１００Ａ１タンパク質（Ｍｗ：１０４１５）（図４Ａ／図４Ｂ）、及びＦＩＴＣ標識した２０ｍｅｒの合成Ｓ１００Ａ１のＣ末端ペプチド（Ｍｗ：２２５８）（図４Ｃ／図４Ｄ）に関する類似する細胞内結合パターンを示す。ｒｈｏｄ−Ｓ１００Ａ１タンパク質もＦＩＴＣ−Ｓ１００Ａ１のＣ末端ペプチド（アミノ酸７５〜９４）も、未処理の成体の心筋細胞の細胞膜を透過することができない。 Ｓ１００Ａ１タンパク質が、透過処理した心筋細胞において拡張期のカルシウムスパーク頻度及びＲｙＲ２活性を減少させ（Ａ）、透過処理した骨格筋線維において等尺性単収縮力を増強する（Ｂ）ことを示す図である。Ｓ１００Ａ１タンパク質は、未処理の成体の心筋細胞又は骨格筋線維におけるカルシウム恒常性を変化させない。 ２０ｍｅｒのＳ１００Ａ１のＣ末端ペプチド（Ｓ１００Ａ１タンパク質のアミノ酸７５〜９４）が、透過処理した心筋細胞において拡張期のカルシウムスパーク頻度及びＲｙＲ２活性を減少させ（Ａ）、透過処理した骨格筋線維において等尺性単収縮力を増強する（Ｂ）ことを示す図である。しかし、該Ｃ末端ペプチドは、未処理の成体の心筋細胞又は骨格筋線維におけるカルシウム恒常性を変化させない。 Ｓ１００Ａ１タンパク質（Ｂ１）、及び２０ｍｅｒのＳ１００Ａ１のＣ末端ペプチド（Ｂ３）の両方が、透過処理したマウスＥＤＬ骨格筋線維において等尺性力を増強する同等の生物学的効力を有することを示す図である。Ｂ２及びＢ３により、Ｓ１００Ａ１のＣ末端が単独で変力効果を媒介することが確認される。Ｓ１００Ａ１ペプチド（Ｎ／Ｈ／Ｃ）は、Ｎ末端ペプチド（Ｎ）Ｇ−Ｓ−Ｅ−Ｌ−Ｅ−Ｔ−Ａ−Ｍ−Ｅ−Ｔ−Ｌ−Ｉ−Ｎ−Ｖ−Ｆ（Ｓ１００Ａ１のアミノ酸２〜１６、配列番号４０）、ヒンジ領域ペプチド（Ｈ）Ｌ−Ｓ−Ｇ−Ｆ−Ｌ−Ｄ−Ａ−Ｑ−Ｋ−Ｄ−Ｖ−Ｄ−Ａ（Ｓ１００Ａ１のアミノ酸４２〜５４、配列番号４１）及びＣ末端２０ｍｅｒ（Ｃ）（配列番号３９）を表す。 正常な及び罹患した心筋細胞における細胞透過性Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１配列及び細胞内蓄積を示す図である。Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１はペプチドＤ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ−Ｙ−Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号４２）を表し、配列Ｄ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ（配列番号１７）は親水性モチーフであり、配列Ｙ−Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号４３）はヒトＳ１００Ａ１タンパク質のアミノ酸７５〜８５である。Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１ペプチドは細胞透過性を有し、細胞不透過性の２０ｍｅｒのＣ末端のＳ１００Ａ１ペプチドとは対照的に心筋細胞の細胞内空間に蓄積する。図８により、ＦＩＴＣと結合したＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１は未処理のラット心室心筋細胞の細胞内空間中で濃縮され、抗Ｓ１００Ａ１免疫蛍光染色により評価した内在性Ｓ１００Ａ１タンパク質（Ｃ）と同様の線状のパターン（Ｂ、１５分間の細胞外曝露後に撮影した共焦点画像）をもたらすが、対照（Ａ）は特定の標識パターンを示さなかったことが示される。 電場刺激した単離ラット心室心筋細胞におけるＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１の時間及び用量依存性の陽性変力効果を示す図である。Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１は、成体心室心筋細胞におけるウイルスに媒介され心臓を標的とする（cardiac-targeted）トランスジェニックＳ１００Ａ１過剰発現の用量依存性及び時間依存性の変力効果の両方を模倣する。図９は、電場刺激した（２Ｈｚ）単離ラット心室心筋細胞におけるＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１の用量依存性（上パネル）及び時間依存性（下パネル）の陽性変力効果の代表的な出力波形を示す。１５分間の細胞外曝露後におけるＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１の細胞内蓄積（図８Ｂ）と一致する１０分〜２０分のＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１の変力作用の開始に留意されたい。算出されたＥＣ５０％は８７±６ｎＭ Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１である。カルシウム過渡応答（transients）を、落射蛍光デジタル化顕微鏡法を利用してＦＵＲＡ２−ＡＭを負荷し電場刺激した心筋細胞において評価した。 合成ペプチドＤ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ−Ｙ−Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ（親水性モチーフと融合したヒトＳ１００Ａ１のアミノ酸７５〜８０、配列番号４４）も、合成ペプチドＤ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（親水性モチーフと融合したヒトＳ１００Ａ１のアミノ酸８０〜８５、配列番号４５）も、Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１の変力効果を模倣又は再現するのに十分ではないことを示す図である。カルシウム過渡応答を、落射蛍光デジタル化顕微鏡法を利用してＦＵＲＡ２−ＡＭを負荷し電場刺激した心筋細胞において評価した（各群ｎ＝６０）。 Ｓ１００パラログＡ４及びＢ由来のアミノ酸７５〜８５を包含するペプチドがＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１に媒介される変力性を模倣するのに十分ではないことを示す図である。合成ペプチドＤ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ−Ｙ−Ｃ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｓ−Ｃ−Ｉ−Ａ−Ｍ−Ｍ（親水性モチーフと融合したＳ１００Ａ４のアミノ酸７５〜８５、配列番号４６）及びＤ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ−Ｆ−Ｍ−Ａ−Ｆ−Ｖ−Ａ−Ｍ−Ｖ−Ｔ−Ｔ−Ａ（親水性モチーフと融合したＳ１００Ｂのアミノ酸７５〜８５、配列番号４７）の両方が、Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１の変力作用を再現することができない。（Ａ）は、Ｓ１００Ａ４ｃｔもＳ１００Ｂｃｔも基本条件（左パネル）及びβ−ＡＲ刺激条件（右パネル）下でＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１の変力効果を模倣しないことを示す。（Ｂ）は、Ｄ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ（配列番号１７）と結合したＳ１００Ａ１（上）、Ｓ１００Ａ４（中央）及びＳ１００Ｂ（下）由来のアミノ酸７５〜８５からなるペプチドの一次配列アライメントを示す。Ｓ１００Ａ１ｃｔとＳ１００Ａ４ｃｔとＳ１００Ｂｃｔとの間における同一のアミノ酸に下線を付す。（各群の細胞数ｎ＝６０、^＊Ｐ＜０．０５（対照、Ｓ１００Ａ４ｃｔ及びＳ１００Ｂｃｔに対して）、２方向（2-way）ＡＮＯＶＡ）。１０^−９Ｉｓｏは１０^−９Ｍのイソプロテレノールを意味する。 Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１の変力効果が筋小胞体（ＳＲ）のカルシウム含有量の制御及び調節と関連することを示す図である。Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１の変力効果は、成体心室心筋細胞におけるウイルスに媒介され心臓を標的とするトランスジェニックＳ１００Ａ１過剰発現を利用する天然ヒトＳ１００Ａ１タンパク質の効果と同様にＳＲのカルシウム負荷の増強により伝達される。図１２は、電場刺激した（２Ｈｚ）対照の代表的な出力波形（黒色、左の出力波形）及びＳＲのカルシウムの完全な放出がもたらされるｉｎ ｖｉｔｒｏで１０ｍＭのカフェインに曝したＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１で処理した心室心筋細胞の代表的な出力波形（１０００ｎＭ、薄灰色、右の出力波形）を示す。カフェインに誘起されるカルシウム過渡応答の振幅は、ＳＲのカルシウム含有量の間接的な尺度の役割を果たし、Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１で処理した心筋細胞においてより大きい。これらのデータにより、Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１の変力効果がＳＲのカルシウムの貯蔵及び含有量の制御及び増強と関連することが示される。 心筋細胞におけるＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１の陽性変力効果がそれぞれβ−アドレナリン刺激及びシグナル伝達に対して相加的及び非依存的であることを示す図である。（Ａ）はリン酸化部位特異的抗体を利用する代表的なウェスタンブロットを示し、これにより、Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１が、基本条件及びβ−アドレナリン受容体（βＡＲ）刺激下で筋小胞体（ホスホランバン、ＰＬＢ）及びサルコメア（トロポニンＩ、ＴｎＩ）標的においてｃＡＭＰ依存性キナーゼ（ＰＫＡ）活性を含むβＡＲシグナル伝達を増加させることも変化させることもないことが明らかとなる。これを支持して、図１３Ｂは、Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１の変力効果が、落射蛍光デジタル化顕微鏡法を利用してＦＵＲＡ２−ＡＭを負荷し電場刺激した心筋細胞において評価するとβＡＲ刺激下で相加的であり保存されることを示す。βＡＲ−ＰＫＡ軸の主要な変力効果がＰＬＢ−ｓｅｒ１６のリン酸化の増強により伝達されることに留意されたい。Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１はこのメカニズムを伴うことも変化させることもなく、これによりβＡＲ刺激に対するその相加的な変力効果が説明される。（各群の細胞数ｎ＝６０、^＊Ｐ＜０．０５（対照に対して）、２方向ＡＮＯＶＡ）。１０^−９Ｉｓｏは１０^−９Ｍのイソプロテレノールを意味する。 Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１が心室心筋細胞において拡張期のＲｙＲ２の機能を制御し、生理学的な拡張期のＳＲのカルシウムスパーク頻度を変調させることを示す図である。Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１は、未処理の心室心筋細胞において拡張期のＳＲのカルシウムスパーク頻度を変調させ、透過処理した心室心筋細胞において細胞不透過性の天然Ｓ１００Ａ１タンパク質及び２０ｍｅｒのＳ１００Ａ１のＣ末端ドメインペプチドの効果を模倣する。図１４Ａは、Ｆｌｕｏ−３ＡＭを負荷した対照の及びＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１で処理した静止状態のラット心室心筋細胞におけるカルシウムスパークの代表的な共焦点出力波形を示す。図１４Ｂ〜図１４Ｄは、Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１が拡張期のＳＲのカルシウムスパーク頻度及び振幅を示差的に制御することを示す。１００ｎＭのＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１は基本条件下でカルシウムスパーク頻度を減少させるが、その１０倍の濃度（１０００ｎＭ）のＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１は、カルシウムスパーク頻度を増大させる（各群の細胞数ｎ＝６０、２方向ＡＮＯＶＡ）。 Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１の変力効果を伝達する分子メカニズムが、心筋細胞をそれぞれ不整脈誘発性のストア過負荷誘導性カルシウム放出（ＳＯＩＣＲ）及びカルシウム波から同時に保護することを示す図である。不整脈発生による心臓突然死に関する重大な病理機序であるＳＯＩＣＲを、Isner及びその共同研究者らにより以前に公開されたプロトコル（Venetucci etal., 2007, Circ Res 100:105-111）を利用してｉｎ ｖｉｔｒｏで誘起させた。図１５Ａは、Venetucci et al., 2007, Circ Res 100:105-111により記載されたようにＳＯＩＣＲを引き起こす条件（βＡＲ刺激＋０．５ｍＭのカフェイン）下でその頻度及び空間的特徴が劇的に増大する（中央）、Ｆｌｕｏ−３ＡＭを負荷した対照心筋細胞（左）におけるカルシウムスパークの代表的な共焦点出力波形を示す。１０００ｎＭのＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１での処理により、ＳＲのカルシウム漏出が効果的にアンタゴナイズされることに留意されたい（図１５Ａ、右）。図１５Ｂは、イソプロテレノール／カフェインの存在下における異常なカルシウムスパークの頻度及び空間的特徴を正常化するＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１の治療効果の統計解析結果を明らかにするものである。図１５Ｃは、１００ｎＭ及び１０００ｎＭのＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１により完全に防止されるβＡＲ刺激＋０．５ｍＭのカフェインの存在下におけるＳＯＩＣＲに誘発されるカルシウム波を示す対照心筋細胞の代表的な出力波形を用いて、Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１の強力な抗不整脈効果を示す。ＳＯＩＣＲ及びその後のカルシウム波が致死性の心室性不整脈及び心臓突然死に関する分子基質であることを考慮すると、これらの実験は、心筋細胞における変力性をカルシウム誘導性の不整脈からの保護と関連付けるＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１の特有の分子プロファイルを明らかにする（各群の細胞数ｎ＝６０、２方向ＡＮＯＶＡ）。Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１の保護効果が、ＳＲのカルシウム負荷の増強により心筋細胞において変力作用を発揮する濃度（１００ｎＭ及び１０００ｎＭ）（図９）で効果的であることに留意することが重要である。したがって、ＳＲのカルシウム再隔離（resequestration）に対するそれ自身の増強効果に関わらず、Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１はβＡＲに誘発されるＳＯＩＣＲを効果的にアンタゴナイズし、変力作用を抗不整脈効力と関連付ける特有の分子プロファイルを強調する。Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１と同様に（Akin）、ウイルスに媒介されるＳ１００Ａ１過剰発現も、漏出性の（leaky）ＲｙＲ２を有する成体心室心筋細胞においてβＡＲに誘発される不整脈誘発性のＳＲのカルシウム漏出を防止し、これにより細胞透過性のＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１が過剰発現したＳ１００Ａ１タンパク質の抗不整脈効果を模倣することが示された。 Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１の変力効果を伝達する分子メカニズムが、ＳＲのカルシウム漏出の防止によりアポトーシス細胞死から心筋細胞を同時に保護することを示す図である。Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１は、長期のカフェイン曝露により内腔のカルシウムに感作された漏出性のＲｙＲ２を有する成体心室心筋細胞をアポトーシス細胞死から保護する。図１６Ａは、カフェインに曝露した、対照及びＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１で処理した心筋細胞の代表的な画像を示す。黒色の矢印は、漏出性のＲｙＲ２により促進された、ＳＲのカルシウム漏出により誘導されたアポトーシスによる死細胞を強調している。統計解析により、Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１処理群においてアポトーシス性心筋細胞が大幅に低いことが明らかとなった。図１６Ｂは、２つの独立した実験の代表的なＤＮＡゲルを示し、対照の心筋細胞にはラダリングしたＤＮＡが見られるが、Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１で処理した心筋細胞には見られずアポトーシスの防止を示している。 Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１がヒト血清中における切断及び分解に抵抗性を有し、ｉｎ ｖｉｖｏでの適用及び長期の生物学的有効性を可能とすることを示す図である。ｉｎ ｖｉｔｒｏでＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１と混合した（spiked）ヒト血清（１μＭ）がＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１を３時間まで切断しないことが示され、これによりｉｎ ｖｉｖｏ投与のための必要条件としての血清中での高い安定性、及び長期の生物学的有効性が示される。図１７Ａ〜図１７Ｄは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで１μＭのＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１と混合したヒト血清試料の種々の時点におけるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析の代表的な出力波形を示す。図１７Ａ〜図１７ＤによりＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１の切断及び分解が起きないことが明らかとなり、プロテアーゼが豊富な環境における高い安定性が示されることに留意されたい。 Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１が、基本条件及びβＡＲ刺激条件下で収縮能力の増強をもたらす有意なｉｎ ｖｉｖｏでの血行動態効果を発揮することを示す図である。２２５ｎｇのＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１の静脈内（ｉ．ｖ．）単回適用を受けた麻酔した成体Ｃ５７／Ｂ６雄性マウス（ＢＷ３０ｇ）（四角）が、３時間持続する左心室の収縮能力の増強を示し（左パネル）、これはイソプロテレノールのｉ．ｖ．適用（２５０ｐｇ）に対して（対照動物のベタ塗りのひし形と比較して）保存され相加的であった。ｉｎ ｖｉｖｏでの効果は基本条件及びβＡＲ刺激条件下でのＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１のｉｎ ｖｉｔｒｏでの作用を反映していることに留意されたい。ｉｎ ｖｉｖｏでのＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１の変力効果は、心拍数及びβＡＲ刺激に対するその応答性と無関係であった（右パネル）。Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１は、腹腔内使用及び皮下使用の後の開始の遅延化にも効果的である。図１８は、Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１をｉ．ｖ．注射した後の麻酔したマウスにおいて左心室のカテーテル処置（catherization）により評価される基本収縮能力の有意な増強を示す。機能獲得はβＡＲ刺激下で保存され、心拍数と無関係であった（各群の動物数ｎ＝７、^＊Ｐ＜０．０５（対応する対照動物に対して）、２方向ＡＮＯＶＡ）。 Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１がβ１ＡＲ遮断薬メトプロロールへの応答に効果的である顕著なｉｎ ｖｉｖｏでの血行動態効果を発揮することを示す図である。メトプロロール（６２．５μｇ）の腹腔内（ｉ．ｐ．）投与の１５分後に２２５ｎｇのＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１の静脈内（ｉ．ｖ．）単回適用を受けた麻酔した成体Ｃ５７／Ｂ６雄性マウス（ＢＷ３０ｇ）が、ＥＣＧの異常を伴わずに同様の心拍数の遅延化を示した（図１９）が、Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１に媒介される機能獲得を保存していた（図２０）。図１９は、メトプロロールに応答した伝導異常を伴わずに同様の心拍数の遅延化を伴う、対照（ｉ．ｖ．ビヒクル）及びＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１でｉ．ｖ．処理したマウスにおける代表的な遠隔測定ＥＣＧ記録（DSI systems、Ｅｉｎｔｈｏｖｅｎ ｌｅａｄ ＩＩ）を示す。 麻酔したマウスにおいてβ１ＡＲ遮断薬メトプロロールの存在下でＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１の変力有効性が保存されることを示す図である（左パネル）。Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１がメトプロロールの陰性変力効果をアンタゴナイズするが負の変時効果をアンタゴナイズせず（右パネル）、これにより心機能不全に対するＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１及びメトプロロールの併用療法の実現可能性が強調されることに留意されたい（各群の動物数ｎ＝７、^＊Ｐ＜０．０５（対応する対照動物に対して）、２方向ＡＮＯＶＡ）。 Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１が実験的マウス心不全モデルにおいて血行動態機能を回復させるｉｎ ｖｉｖｏでの有意な治療効果を発揮することを示す図である。虚血後収縮機能不全を有する成体Ｃ５７／Ｂ６雄性／雌性マウス（ＢＷ３０ｇ）の２週間、毎日の２２５ｎｇのＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１でのｉ．ｐ．処理により、心機能及び生存性の有意な改善がもたらされる。図２１Ａは、シリアル心エコー検査により評価した、収縮機能不全を有するマウスの左心室機能を回復させる心不全のＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１による２週間のｉ．ｐ．処理の治療効果を示す。図２１Ｂは、Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１で処理した心不全マウスにおける収縮能力の改善が生存性の有意な改善につながることを示す。（Ａ、各群の動物数ｎ＝１０；Ｂ、各群の動物数１８、^＊Ｐ＜０．０５（ＭＩ前に対して）、†Ｐ＜０．０１（対照心不全動物に対して）、２方向ＡＮＯＶＡ）。 Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１が、実験的心不全動物モデルにおいて不全心筋におけるアポトーシス細胞死を防止するｉｎ ｖｉｖｏでの有意な治療効果を発揮することを示す図である。虚血後収縮機能不全を有する成体Ｃ５７／Ｂ６雄性／雌性マウス（ＢＷ３０ｇ）の２週間、毎日の２２５ｎｇのＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１でのｉ．ｐ．処理により、不全心臓におけるアポトーシスの有意な減弱がもたらされた。ｉｎ ｖｉｖｏでの効果が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの心筋細胞におけるＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１の抗アポトーシス作用を反映していることに留意されたい。図２２は、心不全（ＨＦ）対照及びＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１で処理した（２週間のｉ．ｐ．処理）不全心臓の代表的なＴＵＮＥＬ染色結果を示し、ここで緑色の核は、ＦＩＴＣと結合したプローブにより標識されたＤＮＡ鎖の切断を示す。Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１で処理した不全心臓が示すアポトーシス核はより少ないことに留意されたい（中央のパネル）。統計解析により、生存性に対する全体的な治療効果に寄与するＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１で処理した不全心臓におけるアポトーシスの有意な低減が明らかとなった（各群の動物数ｎ＝６、^＊Ｐ＜０．０１（対照心臓に対して）、２方向ＡＮＯＶＡ）。 Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１がβＡＲに誘発される致死性の心室性頻脈性不整脈から心不全マウスを保護するｉｎ ｖｉｖｏでの顕著な治療効果を発揮することを示す図である。虚血後収縮機能不全を有する成体Ｃ５７／Ｂ６雄性／雌性マウス（ＢＷ３０ｇ）の２週間、毎日の２２５ｎｇのＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１でのｉ．ｐ．処理が、カフェインによりカルシウムに感作された漏出性のＲｙＲ２チャネルを有する心臓におけるβＡＲに誘発される心室細動から保護する。心不全マウスにおける催不整脈プロトコルは、Wayne Chen及び共同研究者らにより以前に公開されたプロトコル（Xiao etal., 2007, JBC 282:34828-34838）を修正したものとした。図２３は、致死性の心室細動の突発を引き起こすエピネフリン／カフェインのｉ．ｐ．注射に曝露した心不全対照及びＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１で処理したマウス（２週間のｉ．ｐ．処理）における代表的なＥＣＧ出力波形を示す（左パネル）。対照心不全マウスが８０％の死亡率を示したのに対してＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１処理群では致死性の心室細動が１０匹の動物のうち２匹のみでしか起こらなかったことに留意されたい（コンティンジェンシーをフィッシャーの正確確率検定により検定した）。 Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１が正常な及び罹患した骨格筋において等尺性単収縮力を有意に増強することを示す図である。１２週齢のＣ５７／Ｂ６雄性マウスから単離した未処理の長指伸筋（extensor digitorum longum）（ＥＤＬ）骨格筋をＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１（１μＭ）とともに４５分間インキュベーションすることにより、本発明者らにより以前に公開されたような筋単離及び等尺性張力測定についての方法（Most et al., 2003, J. Biol. Chem. 278:26356-26364）を適用する図２４Ａに示すように、比等尺性単収縮力及び比強縮性単収縮力の有意な増強がもたらされた。強縮トレイン（Tetanic train）を１２５Ｈｚで１７５ミリ秒適用し、安定な力のプラトーに到達させた。さらに、以前に記載されたように本発明者らにより作製された心筋梗塞後心不全マウス（Most et al., 2006, Circulation 114:1258-1268）が、図２４Ｂに示すように２週間のＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１のｉ．ｐ．処理（２２５ｎｇ、毎日の注射）後に骨格筋機能の改善を示した。心不全患者における主要な臨床症状、例えば疲労及び運動能力の低下は骨格筋機能の低下により引き起こされ、心拍出量と直接関連しないため、このことは重要な知見である。図２４Ａは、Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１の細胞外適用（０．１μＭ〜１μＭ）により、ＥＤＬの等尺性単収縮力及び強縮性単収縮力が用量依存的に有意に増強されることを示す。図２３Ｂは、心不全マウスにおけるＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１の全身（ｉ．ｐ．）投与により、骨格筋機能不全が減衰し、収縮能力が有意に改善することを示す（各群の筋肉／動物の数ｎ＝５、^＊Ｐ＜０．０５（対応する対照に対して）、†Ｐ＜０．０１（対照に対して）、２方向ＡＮＯＶＡ）。 電場刺激した（１Ｈｚ）単離ラット心室心筋細胞におけるカルシウム過渡振幅に対するＳ１００Ａ１ペプチドＮ−７５〜８５−Ｃ（配列番号３８に示されるヒトＳ１００Ａ１タンパク質のアミノ酸７５〜８５）、Ｎ−７６〜８５−Ｃ（配列番号３８に示されるヒトＳ１００Ａ１タンパク質のアミノ酸７６〜８５）、Ｎ−７７〜８５−Ｃ（配列番号３８に示されるヒトＳ１００Ａ１タンパク質のアミノ酸７７〜８５）、Ｎ−７８〜８５−Ｃ（配列番号３８に示されるヒトＳ１００Ａ１タンパク質のアミノ酸７８〜８５）、Ｎ−７９〜８５−Ｃ（配列番号３８に示されるヒトＳ１００Ａ１タンパク質のアミノ酸７９〜８５）の効果を示す図である。Ｎ−７５〜８５−Ｃ及びＮ−７６〜８５−Ｃがカルシウム過渡応答の増強において同様の効力を有することに留意されたい。Ｎ末端アミノ酸のいかなる更なる欠失もペプチドの変力効果を消失させる。ｎは３つの異なる調製物由来の試験した細胞の数に等しい。^＊Ｐ＜０．０５（疎水性要素及びビヒクルに対して）、ＡＮＯＶＡ。 配列Ｄ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号３２）、Ｄ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号４３３）、Ｄ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号３４）、Ｄ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ−Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ（配列番号３５）、Ｄ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ−Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ（配列番号３６）、及びＤ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ−Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ（配列番号３７）からなる短縮ペプチドの変力効果を示す図である。対照細胞に対するカルシウム過渡振幅の増大に関する記載のペプチドの統計解析を示す。濃い灰色のバーは完全な機能等価性を有する短縮ペプチド（７６〜８５及び７６〜８４）を示し、薄い灰色のバーは部分的な機能等価性を有するペプチド（７７〜８５、７９〜８５、７６〜８３及び７６〜８２）を示し、黒色のバーはＮ末端のＹを欠いたＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１（７５〜８５、中間の灰色のバー）と比較して効果を有しないペプチドを示す。細胞は３つの独立した調製物に由来する。細胞数ｎ＝６２。

本発明を以下で詳細に説明する前に、本明細書中に記載される特定の方法論、プロトコル及び試薬は変動し得ることから、本発明はこれらに限定されないと理解すべきである。本明細書中で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためのものにすぎず、添付した特許請求の範囲のみによって限定される本発明の範囲を限定することは意図されないことも理解すべきである。他に規定のない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。

以下では、本発明の要素を記載する。これらの要素を特定の実施形態とともに列挙するが、任意の様式及び任意の数でこれらを組み合わせて、更なる実施形態を作り出すことができることを理解すべきである。様々に記載される実施例及び好ましい実施形態は、本発明を明示的に記載される実施形態のみに限定するものと解釈すべきではない。この記載は、明示的に記載される実施形態を任意の数の開示される及び／又は好ましい要素と組み合わせた実施形態を支持及び包含するものと理解すべきである。さらに、本出願において記載される全ての要素の任意の置換及び組合せが、文脈上他に示されない限り、本出願の記載により開示されるものと考えるべきである。例えば、本発明によるペプチドの一実施形態において、変力ペプチドが変力モチーフ［Ｖ／Ｉ］−［Ｖ／Ｉ］−［Ｌ／Ｍ］−［Ｖ／Ｉ／Ｍ］−［Ａ／Ｇ／Ｓ］−［Ａ／Ｖ］−Ｌ−［Ｔ／Ａ］−［Ｖ／Ａ／Ｉ］−［Ａ／Ｍ／Ｖ］の４個〜９個の連続するアミノ酸からなるＳ１００Ａ１タンパク質由来のドメインを含む、又はそれからなり、別の実施形態において親水性モチーフが親水性アミノ酸モチーフΛ_４−Θ_２（ここで、Λ及びΘは以下で本明細書中で規定されるようなものであり、親水性モチーフは好ましくは筋機能増強アミノ酸配列に含まれるアミノ酸モチーフのアミノ末端と直接連結する）を含む、又はそれからなる場合、アミノ酸配列Λ_４−Θ_２−［Ｖ／Ｉ］−［Ｖ／Ｉ］−［Ｌ／Ｍ］−［Ｖ／Ｉ／Ｍ］−［Ａ／Ｇ／Ｓ］−［Ａ／Ｖ］−Ｌ−［Ｔ／Ａ］−［Ｖ／Ａ／Ｉ］を含むペプチドは本発明によるペプチドの一実施形態である。

好ましくは、本明細書中で使用される用語は、"Amultilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)",H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Koelbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010Basel, Switzerland, (1995)に記載されているように定義される。

本発明を実施するために、特に明示のない限り、当該技術分野の文献（例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition, J.Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor1989を参照されたい）において説明される、従来の化学、生化学、細胞生物学の方法及び組換えＤＮＡ法を利用する。さらに、当該技術分野の文献（例えばPractical Methods in Cardiovascular Research, S. Dhein et al. eds.,Springer Verlag Berlin Heidelberg, 2005を参照されたい）でも説明される従来の臨床心臓病学の方法を利用する。

以下の本明細書及び添付の特許請求の範囲を通じて、文脈上他の意味に解釈すべき場合を除き、「含む」という単語、及びその変化形（the word "comprise", and variations such as"comprises" and "comprising"）は、記載された整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を包含することを示唆するが、任意の他の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を除外することを示唆しないと理解される。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されるように、数量を特定していない単数形（the singular forms "a", "an", and"the"）は、文脈上他に明確に示されていない限り、複数の指示対象を含む。

複数の文献が、本明細書の文章を通じて引用される。本明細書中で引用される文献（全ての特許、特許出願、科学的刊行物、製造業者の仕様書、取扱説明書等を含む）の各々が、上記のものであるか又は下記のものであるかに関わらず、その全体が引用することにより本明細書の一部を成すものとする。本明細書のどの記載も、本発明が従来の発明に基づくこのような開示に先行する権利を有しないことを認めるものと解釈すべきではない。

本発明による「ペプチド」は、自然発生的なものであっても又は天然のアミノ酸残基の誘導体であってもよく、好ましくはペプチド結合を介して連結されるアミノ酸残基の鎖を表し、ここで該ペプチドは１００個以下のアミノ酸残基又はアミノ酸残基の誘導体からなる。「アミノ酸」という用語は、天然のアミノ酸、及びアミノ酸誘導体を包含する。本発明との関連では「低分子アミノ酸」は好ましくは、１２５ダルトン未満の分子量を有するアミノ酸である。好ましくは、本発明との関連では低分子アミノ酸は、アミノ酸グリシン、アラニン、セリン、システイン、トレオニン及びバリン、又はそれらの誘導体からなる群から選択される。本発明との関連では疎水性の非芳香族アミノ酸は好ましくは、０．５より高い、より好ましくは１．０より高い、更により好ましくは１．５より高いカイト・ドーリトルのヒドロパシーインデックスを有し、芳香族ではない任意のアミノ酸である。好ましくは、本発明との関連では疎水性の非芳香族アミノ酸は、アミノ酸アラニン（カイト・ドーリトルのヒドロパシーインデックス１．８）、メチオニン（カイト・ドーリトルのヒドロパシーインデックス１．９）、イソロイシン（カイト・ドーリトルのヒドロパシーインデックス４．５）、ロイシン（カイト・ドーリトルのヒドロパシーインデックス３．８）及びバリン（カイト・ドーリトルのヒドロパシーインデックス４．２）、又は上で規定されるようなカイト・ドーリトルのヒドロパシーインデックスを有するそれらの誘導体からなる群から選択される。

本発明との関連では「筋肉」は、好ましくは横紋筋組織、又は横紋筋組織由来の筋肉細胞、例えば骨格筋細胞／骨格筋組織並びに心筋細胞及び心筋組織を意味する。

本発明によれば、「筋機能増強アミノ酸配列」という用語は、任意の筋肉固有の（specific）機能を増強する及び／又は回復させること、例えば筋肉細胞及び筋肉組織の、好ましくは横紋筋組織の、最も好ましくは心筋細胞及び骨格筋細胞及び心筋組織及び骨格筋組織の収縮能力を増強することが可能であるアミノ酸配列を表す。適切な筋機能は筋肉細胞内における機能的なカルシウム処理に密接に依存すると考えられるため、「筋機能増強アミノ酸配列」という用語は、筋肉細胞、好ましくは骨格筋細胞及び／又は心筋細胞におけるカルシウム処理／循環、好ましくは筋小胞体のカルシウム処理／循環を増強する及び／又は回復させることが可能であるアミノ酸配列も表す。筋細胞における収縮能力を、例えばビデオエッジ検出（video-edge-detection）（ＶＥＤ）技法を使用して電場刺激した単一の心筋細胞の収縮性を評価することにより、直接測定することができる（Most et al., 2004, J. Clin. Invest. 114:1550-1563（１５６１頁））。カルシウム処理を、蛍光カルシウム指示薬を使用してカルシウム過渡応答を評価することにより決定することができる（Most et al., 2004, J. Clin. Invest. 114:1550-1563（１５６１頁））。

本発明との関連では「増強する（enhancing）」（例えば筋機能、収縮能力及び／又はカルシウム処理を増強する）という用語は、特定の機能を、該機能が正常であるか又は不完全であるか、すなわち筋肉細胞が健常であるか又は罹患しているかどうかと無関係に増大させる／増強することを意味する。好ましくは、「増強する」は、特定の機能を、対照の設定と比較して少なくとも１５％、好ましくは少なくとも２５％、好ましくは少なくとも３５％、より好ましくは少なくとも４５％、最も好ましくは少なくとも５０％増強することを意味する。好ましくは対照の設定は、健常患者、又は健常患者の群の平均の筋機能、収縮能力及び／又はカルシウム処理である。

本発明との関連では「回復させる（restoring）」（例えば筋機能、収縮能力及び／又はカルシウム処理を回復させること）という用語は好ましくは、不完全な機能を、正常な機能の少なくとも５０％まで、好ましくは正常な機能の少なくとも６０％まで、好ましくは正常な機能の少なくとも７０％まで、より好ましくは正常な機能の少なくとも８０％まで、より好ましくは正常な機能の少なくとも８５％まで、更により好ましくは正常な機能の少なくとも９０％まで、更により好ましくは正常な機能の少なくとも９５％まで、最も好ましくは正常な機能の少なくとも１００％まで戻すことを意味し、ここで「正常な機能」は、いずれの筋疾患にも罹患していない個体由来の筋肉細胞により示される機能の平均値を意味する。例えば、左心室のカテーテル処置において力の発生を左心室における血圧上昇の一次導関数＋ｄｐ／ｄｔ［ｍｍＨｇ／秒］により評価し、心エコー検査において収縮能力をＭ−Ｍｏｄｅでの短縮率（ＦＳ％）、又は駆出率の算出値（ＥＦ％）により評価し（Most et al., 2004, J. Clin. Invest. 114: 1550-1563、Most et al., 2006, Circulation 114, 1258-1268、オンラインでの補遺における材料及び方法）、ＶＥＤにおいて収縮性を短縮率（ＦＳ％）及び収縮速度（μｍ／秒）により評価する。カルシウム循環は単一細胞でのみ評価することができ、較正される場合、ｎＭ単位の遊離カルシウム濃度で測定される。およそ、麻酔したマウスにおける「正常な」＋ｄｐ／ｄｔは５０００ｍｍＨｇ／秒〜８０００ｍｍＨｇ／秒の範囲であることがあり、エコー検査の「正常な」ＥＦ％は６０％〜８０％、ＦＳ％は４０％〜７０％であり、「正常な」細胞のＦＳ％は５％〜１２％の範囲であることがあり、較正したカルシウム過渡応答は２００ｎＭ〜４００ｎＭの範囲であることがある。

作用剤との関連での「変力作用」という用語は、上記作用剤が筋肉の種類に関係なく筋肉収縮力に影響を及ぼすことを意味する。「陽性変力作用」は筋肉収縮力を増大させることを意味し、「陰性変力作用」は筋肉収縮力を減少させることを意味する。本発明のペプチドは、好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで、陽性変力作用を示す。作用剤の、例えば本発明の陽性変力ペプチドの変力効果は、例えば試験対象の作用剤／ペプチドの存在下及び非存在下において刺激した筋細胞におけるカルシウム過渡応答を決定することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏで容易に決定することができる。例えば、カルシウム過渡応答を、落射蛍光デジタル化顕微鏡法を利用してＦＵＲＡ２−ＡＭを負荷し電場刺激した心筋細胞において評価することができる（Most et al., 2004, J. Clin. Invest. 114: 1550-1563（１５６１頁））。Ｆｌｕｏカルシウム指示薬ファミリーの成員、又はＲｈｏｄ−２ＡＭのような任意の蛍光カルシウム指示薬を、ＦＵＲＡ−２ＡＭの代わりに使用することができる。根本的な原理（principal）は同じである。代替的には、パッチクランプ処理した（patch-clamped）単離心筋細胞におけるカルシウム過渡応答測定（Kettlewell/Most et al., 2005, J. Mol. Cell. Cardiol., 200: 900-910（９０１頁））を使用することもできる。ペプチドの陽性変力効果を、例えばペプチドを投与して及び投与せずに麻酔したマウスにおける左心室のカテーテル処置により収縮能力を決定することにより、ｉｎ ｖｉｖｏで試験することもできる。通常、この実験においては、収縮性を、最大の左心室の血圧上昇の一次導関数（＋ｄｐ／ｄｔｍａｘ）として記載する（Most et al., 2004, J. Clin. Invest. 114: 1550-1563、Most et al., 2006, Circulation 114;1258-1268）。代替的には、心エコー検査（Most et al.,2006, Circulation 114; 1258-1268）を使用することができる。

本発明との関連では「カルシウム循環を増強する及び／又は回復させる」という用語は、筋細胞におけるカルシウム循環、好ましくは筋小胞体のカルシウム循環を、正常状態／非病的状態下において改善させる、又は病的状態下（すなわちカルシウム循環が不完全である場合）において上で記載したように正常な機能まで回復させることを意味する。カルシウム循環不全は、筋小胞体におけるカルシウム含有量の低減、興奮収縮連関時における筋小胞体からのカルシウムの放出の低減、静止状態の筋肉細胞における筋小胞体からのカルシウム漏出（例えば漏出性のＲｙＲ筋小胞体カルシウム放出チャネルによる）、カルシウムスパーク頻度の増大、又は収縮後における筋小胞体及び／又はミトコンドリア中へのカルシウムの再取込みの低減／遅延化（例えば機能障害を有する若しくは機能しない筋小胞体／小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ）による）の結果として起こるものであり得る。したがって本発明によれば、カルシウム循環を、好ましくは、上記パラメータを改善させること、例えば、筋小胞体のカルシウム含有量を増大させること、興奮収縮連関時における筋小胞体からのカルシウムの放出を増大させること、静止状態の筋肉細胞において筋小胞体からのカルシウム漏出を低減させること、カルシウムスパーク頻度を低減させること、及び／又は筋小胞体若しくはミトコンドリア中へのカルシウムの再取込みを改善させることにより、増強する又は回復させることができる。この理論に拘束されるものではないが、カルシウム循環不全は、筋肉細胞の収縮能力不全、例えば収縮機能不全に関する主要な理由の１つであると考えられる。したがって、カルシウム循環を増強する又は回復させることで、収縮能力も増強する及び／又は回復すると考えられる。

本発明との関連では「収縮能力」という用語は、筋肉収縮、例えば筋肉収縮力又は筋肉収縮時機（timing）と関連する任意の機能を包含する。骨格筋の場合には、強縮性収縮も、「収縮能力」という用語の範囲内に入る。「収縮能力不全」は、正常な／健常な筋肉細胞又は筋肉組織に関する平均値と比較した場合の収縮機能不全を表す。例えば、筋肉細胞又は筋肉組織の収縮能力は、例えば、所与の筋肉細胞又は筋肉組織の収縮力が正常な／健常な筋肉細胞又は筋肉組織に関する平均値から少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、最も好ましくは少なくとも５０％逸脱する場合、不完全であると考えられ、ここで「逸脱する」という用語は正常な平均値未満の値を、又は正常な平均値より高い値を表すことができ、好ましくは該用語は正常な平均値未満の値を表す。例えば、意識のあるヒトに関しては、心エコー検査による５０％未満の心臓のＥＦ％は、心不全の開始と考えられる。正常な意識のあるヒト心臓のＥＦ％はおよそ６５％〜７０％である。好ましくは、「収縮能力を増強する及び／又は回復させる」という用語は、筋肉細胞又は筋肉組織、好ましくは骨格筋細胞若しくは骨格筋組織又は心筋細胞若しくは心筋組織の収縮力の増大、及び筋肉細胞収縮の不完全な時機の修正を意味する。この関連では、「不完全な時機」という用語は、適切に時機制御されない（inappropriately timed）筋肉収縮事象、例えば心筋における不整脈、又は骨格筋組織の振戦若しくは単収縮を表す。

本発明によるペプチドとの関連では「抗不整脈能（Anti-arrhythmic potential）」は、ペプチドが、筋細胞における、好ましくは心筋細胞及び心臓組織における適切に時機制御されない筋肉収縮、すなわち不整脈事象を低減させることが可能であることを意味する。本発明のペプチドは好ましくは、例えば致死性の心室性不整脈により不整脈発生による心臓突然死の基礎となる重大な病理機序である、不整脈誘発性のストア過負荷誘導性カルシウム放出（ＳＯＩＣＲ）から心筋細胞を保護する。好ましい一実施形態では、本発明によるペプチドは、心筋細胞における不整脈、好ましくはカルシウム誘導性不整脈からの保護と変力作用を関連付ける。当業者は、ペプチドが抗不整脈効力を示すかどうかを、例えば試験対象のペプチドが心筋細胞、好ましくは内腔のカルシウムに感作された漏出性のＲｙＲ２を有する心室心筋細胞をβＡＲに誘発される催不整脈性のＳＯＩＣＲ及びカルシウム波から保護することが可能であるかどうかを評価することにより、容易に決定することができる。例えば、正常な心室心筋細胞を、潜在的に抗不整脈効力を示すペプチドの存在下及び非存在下において１０^−７Ｍのイソプロテレノール及び０．５ｍＭのカフェインで処理し、拡張期のカルシウム濃度に関してモニタリングすることができる。不全心筋細胞において、１０^−７Ｍのイソプロテレノール、又は等効果のカテコールアミン（例えばドブタミン、ノルアドレナリン、アドレナリン）単独での処理を用いて、カルシウム処理との関連での不整脈誘発性の分子変化を明らかにすることができる。加えて、適切な等効果用量の、β−アドレナリン受容体の下流にあるセカンドメッセンジャーである環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）を増強する他の作用剤、例えばホスホジエステラーゼ阻害剤（ロリプラム、エノキシモン）を、カフェインの存在下又は非存在下において使用することができる。ＳＯＩＣＲを、蛍光カルシウム指示薬を負荷した静止状態の心筋細胞における共焦点顕微鏡によるカルシウム波及びカルシウムスパーク測定により（非特許文献２（１３６頁））、又は落射蛍光顕微鏡法により蛍光カルシウム指示薬を負荷し電場刺激した（Most et al., 2004, J. Clin. Invest. 114:1550-1563）及びパッチクランプ処理した（Kettlewell et al., 2005, J. Mol. Cell. Cardiol. 39:900-910（９０１頁））心筋細胞における拡張期のカルシウム波／放出として特定することができる。代替的には、ＳＯＩＣＲ及びカルシウム波の均等物（equivalents）、例えば遅延又は早期後収縮を、ＶＥＤにより、電場刺激した心筋細胞における拡張期収縮により評価することができる（Most et al., 2004, J. Clin. Invest. 114:1550-1563）。

本発明との関連では、「Ｓ１００タンパク質のカルボキシ末端アミノ酸」という用語は好ましくは、Ｓ１００タンパク質のカルボキシ末端の２０アミノ酸を、例えば配列番号３８に示されるアミノ酸配列のアミノ酸７５〜９４、すなわちアミノ酸配列Ｙ−Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ−Ｃ−Ｎ−Ｎ−Ｆ−Ｆ−Ｗ−Ｅ−Ｎ−Ｓ（配列番号３９）を、より好ましくはＳ１００タンパク質のカルボキシ末端の２５アミノ酸を、最も好ましくはＳ１００タンパク質のカルボキシ末端の３０アミノ酸を表す。

本発明によるペプチドとの関連では「細胞膜に浸透することが可能な」という用語は、ペプチドが未処理の細胞の細胞膜を横断することができることを意味し、ここで好ましくは該細胞は、脊椎動物の細胞、より好ましくは哺乳動物の細胞、例えばマウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ又はウマ等の細胞、最も好ましくはヒトの細胞である。好ましくは、本発明との関連では細胞は、筋肉細胞、好ましくは骨格筋細胞又は心筋細胞である。したがって、最も好ましくは本発明との関連では細胞は、哺乳動物の筋肉細胞である。当業者は、例えば、上記ペプチドを例えば放射性マーカー又は蛍光マーカーで標識することと、標識したペプチドを未処理の細胞、好ましくは哺乳動物の筋肉細胞、例えばラット心室心筋細胞とともにインキュベートすることと、細胞内において、例えば未処理の細胞の細胞質中において標識したペプチドを、例えば蛍光顕微鏡法により検出することができるかどうかを評価することとにより、ペプチドが細胞膜に浸透することが可能であるかどうかを容易に評価することができる（Most et al., 2005, J. Cell Sci. 118:421-431（４２２頁）、非特許文献２（１３６頁））。

本発明との関連ではＳ１００カルシウム結合タンパク質は好ましくは、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｚ、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｔ、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｓ及びＳ１００タンパク質α鎖からなる群から選択される。最も好ましくは、本発明との関連ではＳ１００カルシウム結合タンパク質は、Ｓ１００Ａ１である。本発明との関連ではＳ１００カルシウム結合タンパク質は、任意の種のもの、例えばヒト又は他の霊長類、マウス若しくはラット等のＳ１００タンパク質であってもよく、好ましくはヒト起源のものである。Ｓ１００カルシウム結合タンパク質の好ましい例は、以下のＧｅｎＢａｎｋ又はＲｅｆ Ｓｅｑのアクセッション番号：ＸＰ＿００１４９４９２０．１、ＸＰ＿００１３６５０５７．１、ＸＰ＿００１１４０１４４、ＸＰ＿５１３８２０．２、ＸＰ＿００１１１１０５２．１、ＣＡＩ１９６７４．１、ＸＰ＿５３７２６５．１、ＮＰ＿００１０９２５１２．１、ＮＰ＿００６２６２．１、ＮＰ＿００１１２７３１９．１、ＡＡＢ２０５３９．２、ＮＰ＿００１００７６３７．１、ＮＰ＿０３５４３９．１、ＸＰ＿００２１９６０２９．１、ＸＰ＿００１３３２６９２．１、ＮＰ＿００１０８２８２０．１、ＸＰ＿００１５０４０００．２、ＮＰ＿５７０１２８．２、ＸＰ＿５２６８８７．２、ＸＰ＿２２６７１０．１、ＸＰ＿６０７１５４．２、ＸＰ＿８５３２１９．１、ＮＰ＿００１０７４６２８．１、ＮＰ＿００１０１３５１３．１、ＡＡＮ６３５２７．１、ＡＣＩ６８０６０．１及びＸＰ＿００１３４４５７５．２により利用可能なものである。

本発明との関連では疾患又は障害を「治療する」という用語は、疾患の原因が除去されるかどうかとは無関係に疾患状態が改善される、すなわち疾患を有する個体が治癒する、又はその症状のみが減弱することを意味する。したがって、本発明によるペプチドは筋肉細胞においてカルシウム循環／処理を安定化させる及び／又は回復させること、並びにそれにより上記細胞の収縮能力を改善させることによりその治療効果を発揮すると考えられるけれども、このペプチドを、カルシウム循環不全により引き起こされるものではない筋疾患の治療のために使用することもできる。例えば、筋肉細胞におけるカルシウム循環不全により引き起こされるものではない、又はこれと関連するものではない骨格筋障害の症状、例えば筋力低下も、本発明によるペプチドにより減弱する。

本発明との関連では「個体」という用語は好ましくは、動物患者、好ましくは心筋障害若しくは骨格筋障害に罹患している、又はその両方に罹患している動物患者を表す。動物患者は、好ましくは脊椎動物患者、より好ましくは哺乳動物患者、例えば家畜、例えばマウス、ラット、ネコ、モルモット、ウサギ、イヌ、ブタ、ウシ又はウマである。最も好ましくは動物患者はヒト患者であり、「個体」という用語は、筋障害に、好ましくは心筋障害及び／又は骨格筋障害に罹患しているヒト患者を表す。本発明によるペプチドの機能的特質の評価との関連では、「個体」という用語は好ましくは、実験動物、例えばマウス、ラット、ウサギ又は霊長類を表し、最も好ましくはこの関連では上記用語は、心不全動物モデル、例えば心筋梗塞後マウスモデル又は心筋梗塞後ラットモデルを表す（マウス：Most et al., 2006, Circulation 114:1258-1268（補遺）；ラット：Most et al., 2004, J. Clin. Invest. 114:1550-1563）。

第１の態様では、本発明は、親水性ドメイン、及び／又は１つ又は複数の膜浸透増強ドメイン、及びＳ１００Ａ１タンパク質由来のドメインを含む、又はそれからなる陽性変力ペプチドであって、上記Ｓ１００Ａ１タンパク質由来のドメインが、変力モチーフ：
Φ^１−Φ^２−Φ^３−Φ^４−Ｘ^５−Ψ^６−Ｌ^７−［Ｔ／Ａ］^８−Ψ^９−Ψ^１０
の４個〜９個の連続するアミノ酸からなり、少なくともコアモチーフΦ^４−Ｘ^５−Ψ^６−Ｌ^７（式中、Φ及びΨはそれぞれ独立して選択される疎水性の非芳香族アミノ酸であり、Ｘは任意のアミノ酸である）を含み、該ペプチドが最大１００アミノ酸、好ましくは最大１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０又は９５アミノ酸の完全長を有し、該ペプチドが陽性変力作用を示す、陽性変力ペプチドを提供する。

第２の態様では、本発明は、Ｓ１００Ａ１タンパク質由来のドメインを含む、又はそれからなる陽性変力ペプチドであって、上記Ｓ１００Ａ１タンパク質由来のドメインが、変力モチーフ：
Φ^１−Φ^２−Φ^３−Φ^４−Ｘ^５−Ψ^６−Ｌ^７−［Ｔ／Ａ］^８−Ψ^９−Ψ^１０
の７個〜９個の連続するアミノ酸からなり、少なくともコアモチーフΦ^４−Ｘ^５−Ψ^６−Ｌ^７（式中、Φ及びΨはそれぞれ独立して選択される疎水性の非芳香族アミノ酸であり、Ｘは任意のアミノ酸である）を含むが、ただし、９個の連続するアミノ酸からなる上記Ｓ１００Ａタンパク質由来のドメインのＮ末端アミノ酸がΦ^１であり、該ペプチドが最大１００アミノ酸、好ましくは最大７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０又は９５アミノ酸の完全長を有する、陽性変力ペプチドを提供する。第２の態様の陽性変力ペプチドは好ましくは陽性変力作用を示す。さらに、Ｓ１００Ａ１タンパク質由来のドメインが９個の連続するアミノ酸からなる実施形態では、アミノ酸はΦ^１−Φ^２−Φ^３−Φ^４−Ｘ^５−Ψ^６−Ｌ^７−［Ｔ／Ａ］^８−Ψ^９である。第２の態様の更に好ましい実施形態では、７個又は８個の連続するアミノ酸からなる上記Ｓ１００Ａタンパク質由来のドメインのＮ末端アミノ酸がΦ^１である、すなわち、Ｓ１００Ａ１タンパク質由来のドメインがΦ^１−Φ^２−Φ^３−Φ^４−Ｘ^５−Ψ^６−Ｌ^７−［Ｔ／Ａ］^８又はΦ^１−Φ^２−Φ^３−Φ^４−Ｘ^５−Ψ^６−Ｌ^７からなることが好ましい。したがって、この条件が７個〜９個の連続するアミノ酸からなるＳ１００Ａ１タンパク質由来のドメインに適用されることが好ましい。

好ましい一実施形態では、第１の態様のペプチドは、１０アミノ酸〜８０アミノ酸の、より好ましくは１０アミノ酸〜７０アミノ酸の、より好ましくは１０アミノ酸〜６０アミノ酸の、より好ましくは１０アミノ酸〜５０アミノ酸の、更により好ましくは１０アミノ酸〜４０アミノ酸の、更により好ましくは１０アミノ酸〜３０アミノ酸の長さを有し、最も好ましくはペプチドは、１０アミノ酸〜１５アミノ酸の長さを有する。好ましい一実施形態では、ペプチドは、１３アミノ酸長、１４アミノ酸長又は１５アミノ酸長である。

好ましい一実施形態では、第２の態様ののペプチドは、７アミノ酸〜８０アミノ酸の、より好ましくは７アミノ酸〜７０アミノ酸の、より好ましくは７アミノ酸〜６０アミノ酸の、より好ましくは７アミノ酸〜５０アミノ酸の、更により好ましくは７アミノ酸〜４０アミノ酸の、更により好ましくは７アミノ酸〜３０アミノ酸の長さを有し、最も好ましくはペプチドは、７アミノ酸〜１５アミノ酸の長さを有する。好ましい一実施形態では、ペプチドは、７アミノ酸長〜９アミノ酸長、すなわち７アミノ酸長、８アミノ酸長又は９アミノ酸長である。

好ましくは、第１又は第２の態様で明記されたＳ１００Ａ１タンパク質由来のドメインを除く第１又は第２の態様のペプチドは、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１のカルボキシ末端アミノ酸と、好ましくはＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｚ、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｔ、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｓ及びＳ１００タンパク質α鎖からなる群から選択されるＳ１００カルシウム結合タンパク質と顕著に異なり、最も好ましくは任意のＳ１００カルシウム結合タンパク質のカルボキシ末端と顕著に異なる。より好ましくは、第１又は第２の態様で明記されたＳ１００Ａ１タンパク質由来のドメインを除く第１又は第２の態様のペプチドは、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１のアミノ酸配列と、好ましくはＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｚ、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｔ、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｓ及びＳ１００タンパク質α鎖からなる群から選択されるＳ１００カルシウム結合タンパク質と顕著に異なり、最も好ましくは任意のＳ１００カルシウム結合タンパク質のアミノ酸配列と顕著に異なる。「顕著に異なる（significantly differs）」という用語は、アミノ酸配列が少なくとも８０％異なり、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％異なることを意味する。配列における差異を、ポリペプチド配列を整列させることにより評価することができる。かかるアライメントツールは当業者に既知であり、例えばワールドワイドウェブ、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ（www.ebi.ac.uk/clustalw）又はＡｌｉｇｎ（http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/ index.html）において標準的な設定（好ましくはＡｌｉｇｎに関してはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ Ｏｐｅｎ １０．０、Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ ０．５）を用いて取得することができる。２つ以上のポリペプチド配列における残基は、最良の配列アライメントにおいて整列される残基が互いに異なる場合、互いに異なるとされる。２つのポリペプチドの間の「最良の配列アライメント」は、整列される同一の残基の数が最大となるアライメントと定義される。

第１の態様のペプチドの好ましい実施形態では、ペプチドは、１つ又は複数のエピトープタグ、及びペプチド標的化ドメインからなる群から選択される要素のうちの１つ又は複数を更に含む。第１の態様のペプチドが、膜浸透増強ドメインを既に含んでいる場合に親水性ドメインを更に含むか、又は親水性ドメインを既に含んでいる場合に膜浸透増強ドメインを更に含むことも好ましい。これらの更なる要素は、ペプチドの他の要素のＮ末端又はＣ末端に、好ましくは親水性ドメイン又は１つ又は複数の膜浸透増強ドメインのＮ末端に直接又は間接的に連結していてもよい。

第２の態様のペプチドの好ましい実施形態では、ペプチドは、親水性ドメイン、膜浸透増強ドメイン、１つ又は複数のエピトープタグ、及びペプチド標的化ドメインからなる群から選択される要素のうちの１つ又は複数、好ましくは親水性ドメイン、膜浸透増強ドメイン又は親水性ドメイン及び膜浸透増強ドメインを更に含む。これらの要素は、Ｓ１００Ａ１タンパク質由来のドメインのＮ末端又はＣ末端、好ましくは、以下に詳細に記載されるようにＮ末端に直接又は間接的に連結していてもよい。

本発明の目的上、本発明の陽性変力ペプチドに含まれる２つの要素は、一方の要素のＮ末端のアミノ酸と、他方の要素のＣ末端のアミノ酸との間にペプチド結合が存在する場合に「直接連結する」。「間接的に連結する」という用語は、２つの要素のそれぞれのＮ末端及びＣ末端の間に１つ又は複数の付加的な要素、好ましくは１つ又は複数のアミノ酸が存在することを意味する。かかる１つ、２つ、３つ、４つ又はそれ以上のアミノ酸は好ましくはリンカーである。「リンカー」という用語は、柔軟性を与えるアミノ酸のストレッチを表すために当該技術分野で用いられる。当業者はこの文脈で用いられ得る多数のリンカーを認識している。本発明の陽性変力ペプチドの全長を最小限に抑えるためには、リンカーの長さは１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸又は５アミノ酸を超えないことが好ましい。

上記親水性ドメインは、酸性の、塩基性の、及び／又はそうでなくとも負に若しくは正に荷電したアミノ酸を含む。本発明によるペプチドの好ましい特定の実施形態では、親水性ドメインは、アミノ酸モチーフΛ_４−Θ_２（式中、Λはアスパラギン酸、グルタミン酸、リジン及びアルギニンからそれぞれ独立して選択され、Θはα−ヘリックス遮断因子、好ましくはプロリン又はグリシンである）を含む、又はそれからなる。好ましくは、親水性ドメインは、［Ｄ／Ｅ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｐ／Ｇ］−［Ｐ／Ｇ］、［Ｋ／Ｒ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｐ／Ｇ］−［Ｐ／Ｇ］、［Ｄ／Ｅ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｐ／Ｇ］−［Ｐ／Ｇ］、［Ｄ／Ｅ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｐ／Ｇ］−［Ｐ／Ｇ］、［Ｄ／Ｅ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｐ／Ｇ］−［Ｐ／Ｇ］、［Ｋ／Ｒ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｐ／Ｇ］−［Ｐ／Ｇ］、［Ｋ／Ｒ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｐ／Ｇ］−［Ｐ／Ｇ］、［Ｋ／Ｒ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｐ／Ｇ］−［Ｐ／Ｇ］、［Ｄ／Ｅ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｐ／Ｇ］−［Ｐ／Ｇ］、［Ｄ／Ｅ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｐ／Ｇ］−［Ｐ／Ｇ］、［Ｄ／Ｅ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｐ／Ｇ］−［Ｐ／Ｇ］、［Ｋ／Ｒ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｐ／Ｇ］−［Ｐ／Ｇ］、［Ｋ／Ｒ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｐ／Ｇ］−［Ｐ／Ｇ］、［Ｋ／Ｒ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｐ／Ｇ］−［Ｐ／Ｇ］、［Ｄ／Ｅ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｐ／Ｇ］−［Ｐ／Ｇ］及び［Ｋ／Ｒ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｐ／Ｇ］−［Ｐ／Ｇ］からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、又はそれからなる。好ましくは、親水性ドメインは、アミノ酸配列［Ｄ／Ｅ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｐ／Ｇ］−［Ｐ／Ｇ］（配列番号３）を含む、又はそれからなる。より好ましくは、親水性ドメインは、Ｄ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ（配列番号１７）、Ｅ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ（配列番号４８）、Ｄ−Ｒ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ（配列番号４９）、Ｄ−Ｋ−Ｅ−Ｄ−Ｐ−Ｐ（配列番号５０）、Ｄ−Ｋ−Ｄ−Ｅ−Ｐ−Ｐ（配列番号５１）、Ｅ−Ｒ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ（配列番号５２）、Ｅ−Ｋ−Ｅ−Ｄ−Ｐ−Ｐ（配列番号５３）、Ｅ−Ｋ−Ｄ−Ｅ−Ｐ−Ｐ（配列番号５４）、Ｄ−Ｒ−Ｅ−Ｄ−Ｐ−Ｐ（配列番号５５）、Ｄ−Ｒ−Ｄ−Ｅ−Ｐ−Ｐ（配列番号５６）、Ｄ−Ｋ−Ｅ−Ｅ−Ｐ−Ｐ（配列番号５７）、Ｅ−Ｒ−Ｅ−Ｄ−Ｐ−Ｐ（配列番号５８）、Ｅ−Ｒ−Ｄ−Ｅ−Ｐ−Ｐ（配列番号５９）、Ｄ−Ｒ−Ｅ−Ｅ−Ｐ−Ｐ（配列番号６０）、Ｅ−Ｋ−Ｅ−Ｅ−Ｐ−Ｐ（配列番号６１）及びＥ−Ｒ−Ｅ−Ｅ−Ｐ−Ｐ（配列番号６２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、又はそれからなる（上記配列におけるＰ−Ｐは、Ｇ−Ｇに置き換えてもよい）。最も好ましくは、親水性ドメインは、アミノ酸配列Ｄ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ（配列番号１７）を含む、又はそれからなる（上記配列におけるＰ−ＰもＧ−Ｇであってもよい）。好ましくは親水性ドメインは、本発明によるペプチド内において、筋機能増強アミノ酸配列に対してアミノ末端に位置するが、筋機能増強アミノ酸配列に対してカルボキシ末端に位置していてもよい。特に好ましい実施形態では、上記親水性ドメインのＣ末端が、直接又は間接的に上記変力ドメインのＮ末端に連結し、好ましくは該Ｎ末端に連結するアミノ酸が疎水性の非芳香族アミノ酸ではない。

上記膜浸透増強ドメインは、上で記載したように膜に浸透することが可能である任意のアミノ酸配列、例えば細胞浸透ペプチド（ＣＣＰ）であり得る。かかるドメインは、上記膜浸透増強ドメインが上記高分子と結合した場合、通常は細胞膜を横断する能力を有しない他の高分子、例えばペプチド、タンパク質又は核酸が未処理の細胞膜に浸透することを可能とし得る。かかる膜浸透増強ドメインは、タンパク質形質導入ドメイン由来のものであってもよく、両親媒性ペプチドであってもよく、又は任意の他の浸透ペプチドであってもよい。例えば、膜浸透増強ドメインは、ＨＩＶ Ｔａｔペプチド、例えばＧ−Ｒ−Ｋ−Ｋ−Ｒ−Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ（配列番号６３）、ペネトラチンペプチド、例えばＲ−Ｑ−Ｉ−Ｋ−Ｉ−Ｗ−Ｆ−Ｑ−Ｎ−Ｒ−Ｒ−Ｍ−Ｋ−Ｗ−Ｋ−Ｋ（配列番号６４）若しくはＫ−Ｋ−Ｗ−Ｋ−Ｍ−Ｒ−Ｒ−Ｎ−Ｑ−Ｆ−Ｗ−Ｖ−Ｋ−Ｖ−Ｑ−Ｒ−Ｇ（配列番号６５）、トランスポータンペプチド、例えばＧ−Ｗ−Ｔ−Ｌ−Ｎ−Ｓ−Ａ−Ｇ−Ｙ−Ｌ−Ｌ−Ｇ−Ｋ−Ｉ−Ｎ−Ｌ−Ｋ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｋ−Ｋ−Ｉ−Ｌ（配列番号６６）、ＭＰＧ／Ｐｅｐファミリーの成員のペプチド、例えばＧ−Ａ−Ｌ−Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｓ−Ｔ−Ｍ−Ｇ−Ａ−Ｗ−Ｓ−Ｑ−Ｐ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｒ−Ｋ−Ｖ（配列番号６７）若しくはＫ−Ｅ−Ｔ−Ｗ−Ｗ−Ｅ−Ｔ−Ｗ−Ｗ−Ｔ−Ｅ−Ｗ−Ｓ−Ｑ−Ｐ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｒ−Ｋ−Ｖ（配列番号６８）、又はアルギニンリッチペプチド等由来のものであり得る（Deshayes et al., 2005, Cell. Mol. Life Sci. 62:1839-1849）。かかる膜浸透増強ドメインは、本発明によるペプチド内において、筋機能増強アミノ酸配列に対してアミノ末端に又はカルボキシ末端に位置し得る。さらに、本発明によるペプチドは２つ以上の膜浸透増強ドメインを含んでいてもよく、例えば本発明によるペプチドは２つ、３つ、４つ又は５つのかかるドメインを含有していてもよい。

一実施形態では、第１の態様のペプチドは、エピトープタグ（複数の場合もあり）及び／又はペプチド標的化ドメインを更に含む。別の実施形態では、第１又は第２の態様のペプチドは、親水性ドメイン、膜浸透増強ドメイン、１つ又は複数のエピトープタグ、及びペプチド標的化ドメインからなる群から選択される要素のうちの１つ又は複数、例えば１つ、２つ、３つ又は４つを更に含む。

エピトープは、抗体が結合する分子の一部分である。本発明との関連では、エピトープは好ましくは、ペプチドタグ、例えばヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ又はポリＨｉｓタグである。かかるエピトープタグを使用して、例えば本発明のペプチドが細胞膜に浸透する、すなわち細胞膜を横断するかどうかを決定するために、細胞内に本発明のペプチドを位置付けることができ、該タグを、上記ペプチドとともにインキュベートした未処理の細胞の内部で見出すことができる。

本発明との関連ではペプチド標的化ドメインは、ｉｎ ｖｉｖｏでペプチドを特定の器官又は特定の細胞に対して標的化するのに好適な任意の部分であり得る。例えば、ペプチド標的化ドメインは、或る特定の細胞又は或る特定の器官に特異的な特定の受容体と特異的に結合するペプチドであり得る。好ましくは、本発明によるペプチド内におけるペプチド標的化ドメインの存在により、該ペプチドが全身投与された患者における細胞又は器官の特異的な標的化が可能となる。

好ましい一実施形態では、第１又は第２の態様のペプチドのコアモチーフが［Ｖ／Ｉ／Ｍ］−［Ａ／Ｇ／Ｓ］−［Ａ／Ｖ］−Ｌ（配列番号１）である。好ましくは、上記コアモチーフが、アミノ酸配列Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ（配列番号４）、Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ（配列番号５）、Ｖ−Ｓ−Ｖ−Ｌ（配列番号６）、Ｍ−Ｇ−Ａ−Ｌ（配列番号７）、Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ（配列番号８）からなる群から選択され、好ましくはＶ−Ａ−Ａ−Ｌ（配列番号８）である。

別の好ましい一実施形態では、第１又は第２のペプチドの変力モチーフが［Ｖ／Ｉ］−［Ｖ／Ｉ］−［Ｌ／Ｍ］−［Ｖ／Ｉ／Ｍ］−［Ａ／Ｇ／Ｓ］−［Ａ／Ｖ］−Ｌ−［Ｔ／Ａ］−［Ｖ／Ａ／Ｉ］−［Ａ／Ｍ／Ｖ］（配列番号２）である。好ましくは、上記変力モチーフが、アミノ酸配列Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号９）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１０）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１１）、Ｉ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１２）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ａ（配列番号１３）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１４）、Ｉ−Ｉ−Ｌ−Ｍ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１５）、及びＶ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号１６）からなる群から選択される。最も好ましくは、上記変力モチーフはＶ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号９）である。

第１又は第２の態様のペプチドの変力モチーフのΨは好ましくは、アラニン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン及びバリン、好ましくはアラニン、メチオニン、イソロイシン及びバリンからなる群からそれぞれ独立して選択される。第１又は第２の態様のペプチドの変力モチーフのΦは好ましくは、アラニン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン及びバリン、好ましくはメチオニン、イソロイシン、ロイシン及びバリンからなる群からそれぞれ独立して選択される。第１又は第２の態様のペプチドの特に好ましい一実施形態では、Φはメチオニン、イソロイシン、ロイシン及びバリンからそれぞれ独立して選択され、Ψはアラニン、メチオニン、イソロイシン及びバリンからそれぞれ独立して選択される。

第１又は第２の態様のペプチドの別の好ましい実施形態では、Ｘは低分子アミノ酸であり、ここで該低分子アミノ酸は好ましくはプロリンではない。好ましくは、Ｘはグリシン、アラニン、セリン、システイン、トレオニン及びバリンからなるアミノ酸の群から選択され、より好ましくはＸはグリシン、アラニン及びセリンからなる群から選択される。第１又は第２の態様のペプチドの特に好ましい一実施形態では、Φはメチオニン、イソロイシン、ロイシン及びバリンからそれぞれ独立して選択され、Ψはアラニン、メチオニン、イソロイシン及びバリンからそれぞれ独立して選択され、Ｘはグリシン、アラニン、セリン、システイン、トレオニン及びバリンから、好ましくはグリシン、アラニン及びセリンから選択される。

好ましい一実施形態では、第１又は第２の態様のペプチドの変力モチーフは、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号９）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１０）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１１）、Ｉ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１２）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１４）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号１６）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号６９）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号７０）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号７１）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号７２）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号７３）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号７４）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号７５）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号７６）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号７７）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号７８）、Ｉ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号７９）、Ｉ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号８０）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号８１）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号８２）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号８３）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号８４）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号８５）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号８６）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号８７）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号８８）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号８９）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号９０）、Ｖ−Ｉ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号９１）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号９２）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号９３）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号９４）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号９５）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号９６）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号９７）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号９８）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号９９）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号１００）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号１０１）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１０２）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１０３）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１０４）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１０５）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１０６）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号１０７）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号１０８）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号１０９）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号１１０）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１１１）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１１２）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１１３）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号１１４）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号１１５）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号１１６）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号１１７）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号１１８）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１１９）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１２０）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１２１）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号１２２）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号１２３）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号１２４）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号１２５）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号１２６）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１２７）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号１２８）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号１２９）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号１３０）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号１３１）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号１３２）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１３３）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号１３４）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号１３５）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号１３６）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号１３７）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号１３８）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号１３９）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号１４０）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号１４１）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号１４２）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号１４３）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ａ（配列番号１４４）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｉ−Ａ（配列番号１４５）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ｍ（配列番号１４６）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ｖ（配列番号１４７）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ｍ（配列番号１４８）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ｖ（配列番号１４９）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ｍ（配列番号１５０）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ｖ（配列番号１５１）、Ｉ−Ｉ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１５２）、Ｉ−Ｉ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１５３）、Ｉ−Ｉ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１５４）、Ｉ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１５５）、Ｉ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１５６）、Ｉ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号１５７）、Ｉ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号１５８）、Ｉ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号１５９）、Ｉ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号１６０）、Ｉ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号１６１）、Ｉ−Ｖ−Ｍ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１６２）、Ｉ−Ｖ−Ｍ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１６３）、Ｉ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１６４）、Ｉ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１６５）、Ｉ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１６６）、Ｉ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号１６７）、Ｉ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号１６８）、Ｉ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号１６９）、Ｉ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号１７０）、Ｉ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号１７１）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１７２）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１７３）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１７４）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号１７５）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号１７６）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号１７７）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号１７８）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号１７９）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１８０）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１８１）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１８２）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号１８３）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号１８４）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号１８５）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号１８６）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号１８７）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１８８）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号１８９）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号１９０）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号１９１）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号１９２）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号１９３）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１９４）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号１９５）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号１９６）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号１９７）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号１９８）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号１９９）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号２００）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号２０１）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号２０２）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号２０３）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号２０４）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ａ（配列番号２０５）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｉ−Ａ（配列番号２０６）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ｍ（配列番号２０７）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ｖ（配列番号２０８）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ｍ（配列番号２０９）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ｖ（配列番号２１０）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ｍ（配列番号２１１）、Ｉ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ｖ（配列番号２１２）、Ｖ−Ｉ−Ｍ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２１３）、Ｖ−Ｉ−Ｍ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２１４）、Ｖ−Ｉ−Ｍ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２１５）、Ｖ−Ｉ−Ｍ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２１６）、Ｖ−Ｉ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２１７）、Ｖ−Ｉ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号２１８）、Ｖ−Ｉ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号２１９）、Ｖ−Ｉ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号２２０）、Ｖ−Ｉ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号２２１）、Ｖ−Ｉ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号２２２）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２２３）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｉ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２２４）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２２５）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号２２６）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号２２７）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号２２８）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号２２９）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号２３０）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｍ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２３１）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｍ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２３２）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２３３）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号２３４）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号２３５）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号２３６）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号２３７）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号２３８）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ
（配列番号２３９）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号２４０）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号２４１）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号２４２）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号２４３）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号２４４）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号２４５）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号２４６）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号２４７）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号２４８）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号２４９）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号２５０）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号２５１）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号２５２）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号２５３）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号２５４）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ａ（配列番号２５５）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｉ−Ａ（配列番号２５６）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ｍ（配列番号２５７）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ｖ（配列番号２５８）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ｍ（配列番号２５９）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ｖ（配列番号２６０）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ｍ（配列番号２６１）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ｖ（配列番号２６２）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２６３）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｉ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２６４）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｉ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２６５）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号２６６）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号２６７）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号２６８）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号２６９）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号２７０）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｍ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２７１）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｍ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２７２）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｍ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２７３）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号２７４）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号２７５）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号２７６）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号２７７）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号２７８）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ｇ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２７９）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号２８０）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号２８１）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号２８２）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号２８３）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号２８４）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ｓ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２８５）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号２８６）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号２８７）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号２８８）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号２８９）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号２９０）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号２９１）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号２９２）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号２９３）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号２９４）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号２９５）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ａ（配列番号２９６）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｉ−Ａ（配列番号２９７）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ｍ（配列番号２９８）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ｖ（配列番号２９９）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ｍ（配列番号３００）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ｖ（配列番号３０１）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ｍ（配列番号３０２）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ｖ（配列番号３０３）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ｇ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号３０４）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号３０５）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号３０６）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号３０７）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号３０８）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号３０９）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ｓ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号３１０）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号３１１）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号３１２）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号３１３）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号３１４）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号３１５）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号３１６）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号３１７）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号３１８）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号３１９）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号３２０）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ａ（配列番号１３）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｉ−Ａ（配列番号３２１）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ｍ（配列番号３２２）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ｖ（配列番号３２３）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ｍ（配列番号３２４）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ｖ（配列番号３２５）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ｍ（配列番号３２６）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ｖ（配列番号３２７）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ｇ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号３２８）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号３２９）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号３３０）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号３３１）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号３３２）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号３３３）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ｓ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号３３４）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号３３５）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号３３６）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号３３７）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号３３８）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号３３９）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号３４０）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号３４１）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号３４２）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号３４３）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号３４４）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ａ（配列番号３４５）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｉ−Ａ（配列番号３４６）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ｍ（配列番号３４７）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ｖ（配列番号３４８）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ｖ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号３４９）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号３５０）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号３５１）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号３５２）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号３５３）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ａ（配列番号３５４）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｉ−Ａ（配列番号３５５）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ｍ（配列番号３５６）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ｖ（配列番号３５７）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ｍ（配列番号３５８）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ｖ（配列番号３５９）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ｍ（配列番号３６０）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ｖ（配列番号３６１）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ｖ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ（配列番号３６２）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ａ（配列番号３６３）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ａ（配列番号３６４）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｍ（配列番号３６５）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号３６６）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ａ（配列番号３６７）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｉ−Ａ（配列番号３６８）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ｍ（配列番号３６９）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ａ−Ｖ（配列番号３７０）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ｍ（配列番号３７１）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ｖ（配列番号３７２）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ｍ（配列番号３７３）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ｖ（配列番号３７４）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ａ（配列番号３７５）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ａ−Ｉ−Ａ（配列番号３７６）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ｍ（配列番号３７７）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ｖ（配列番号３７８）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ｍ（配列番号３７９）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ｖ（配列番号３８０）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ｍ（配列番号３８１）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ｖ（配列番号３８２）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｍ（配列番号３８３）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ｖ（配列番号３８４）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｉ−Ｍ（配列番号３８５）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ｉ−Ｖ（配列番号３８６）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ｍ（配列番号３９０）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ａ−Ｖ（配列番号３９１）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ｍ（配列番号３９２）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ｖ（配列番号３９３）、及びＩ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号３９４）からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む。これらのアミノ酸配列は、本発明によるペプチドに含まれる変力モチーフの好ましい特定の実施形態である。

好ましい別の実施形態では、変力モチーフは、アミノ酸配列Ｖ−［Ｖ／Ｉ］−Ｌ−［Ｖ／Ｉ］−［Ａ／Ｓ］−［Ａ／Ｖ］−Ｌ−［Ｔ／Ａ］−［Ｖ／Ａ］−Ａ（配列番号３８７）を含む、又はそれからなり、好ましい配列はＶ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号９）であり、好ましくは最大４個、より好ましくは最大３個、更により好ましくは最大２個、最も好ましくは最大１個のアミノ酸が上で記載したように置換される。したがって、特に好ましい一実施形態では、変力モチーフはアミノ酸配列Ｖ−［Ｖ／Ｉ］−Ｌ−［Ｖ／Ｉ］−［Ａ／Ｓ］−［Ａ／Ｖ］−Ｌ−［Ｔ／Ａ］−［Ｖ／Ａ］−Ａ（配列番号３８７）からなり、好ましい配列はＶ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号９）であり、好ましくは最大４個、より好ましくは最大３個、更により好ましくは最大２個、最も好ましくは最大１個のアミノ酸が上で記載したように別のアミノ酸で置換される。

好ましい一実施形態では、変力モチーフは、アミノ酸配列Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号９）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１０）、Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１１）、Ｉ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１２）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ａ−Ａ−Ａ（配列番号１３）、Ｖ−Ｉ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１４）、Ｉ−Ｉ−Ｌ−Ｍ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号１５）及びＶ−Ｖ−Ｍ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｖ（配列番号１６）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、又はそれからなる。これらのアミノ酸配列は、本発明によるペプチドに含まれる変力モチーフの特に好ましい特定の実施形態である。

第１の態様のペプチドのＳ１００Ａ１タンパク質由来のドメインは、好ましくはアミノ酸配列Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ（配列番号１８）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ（配列番号１９）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ（配列番号２０）、Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２１）、Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ（配列番号２２）、Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ（配列番号２３）、Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ（配列番号２４）、Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２５）、及びＬ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ（配列番号２６）、Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ（配列番号２７）、Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ（配列番号２８）、Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２９）、Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ（配列番号３０）、Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ（配列番号３１）、及びＶ−Ａ−Ａ−Ｌ（配列番号８）からなる群から選択される。

最も好ましい実施形態では、第１の態様のペプチドは、アミノ酸配列Ｄ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号３２）、Ｄ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号３３）、Ｄ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号３４）、Ｄ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ−Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ（配列番号３５）、Ｄ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ−Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ（配列番号３６）、及びＤ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ−Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ（配列番号３７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、又はそれからなる。

別の実施形態では、第２の態様のペプチドのＳ１００Ａ１タンパク質由来のドメインは、アミノ酸配列Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ（配列番号１８）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ（配列番号１９）、及びＶ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ（配列番号２０）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、又はそれからなる。好ましくは、第２の態様のペプチドは、アミノ酸配列Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ（配列番号１８）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ（配列番号１９）、及びＶ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ（配列番号２０）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、又はそれからなる。配列番号１８〜配列番号２０によるアミノ酸配列を含む、又はそれからなるこれらのペプチドは各々、上記アミノ酸配列のＮ末端に連結する親水性ドメインＤ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐを更に含み得る。

第１又は第２の態様のペプチドのＳ１００Ａ１タンパク質由来のドメインは、好ましくは第１又は第２の態様のペプチドのＣ末端に位置する。より好ましくは、上記ペプチドはＳ１００Ａ１タンパク質の２０アミノ酸Ｃ末端領域に含まれる９個以下の連続するアミノ酸を含有する。

別の実施形態では、第１又は第２の態様のペプチドは、マーカー部分を更に含む。本発明との関連ではマーカー部分は、ペプチドを直接検出することを可能とする任意の部分、例えば蛍光標識、例えばフルオレセイン（例えばフルオレセインイソチオシアネートＦＩＴＣ）、ローダミン（例えば、テトラメチルローダミンＴＡＭＲＡ、又はそのイソチオシアネート誘導体ＴＲＩＴＣ、スルホローダミン１０１、及びそのスルホニルクロリド形態であるテキサスレッド（商標）、及びローダミンレッド）、又はアレクサフルオル（商標）色素、放射標識、例えば放射標識したアミノ酸又はビオチンであり得る。一実施形態では、本発明のペプチドは、親水性モチーフ、好ましくはＤ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ（配列番号１７）、及びマーカー部分、好ましくはＦＩＴＣ又はローダミンを含み、好ましくは筋機能増強アミノ酸配列はＶ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号９）であり、好ましくは親水性モチーフは筋機能増強アミノ酸配列のアミノ末端と直接連結する。

好ましい一実施形態では、本発明によるペプチドのアミノ酸配列は、αヘリックス構造を形成する。

特に好ましい一実施形態では、本発明のペプチドは、細胞膜、好ましくは脊椎動物の細胞膜、更により好ましくは哺乳動物の細胞膜、更により好ましくは哺乳動物の筋肉細胞膜、最も好ましくは哺乳動物の骨格筋細胞膜、及び哺乳動物の心筋細胞膜に浸透することが可能である。好ましくは、本発明のペプチドは、生理学的環境中で、例えば培養培地（例えば、哺乳動物の組織培養用の培養培地）中で、及び／又は体液中で、例えば血液中で、上で規定されるような細胞膜に浸透することが可能である。したがって、最も好ましくは、本発明のペプチドは、非経口の投与経路により、例えば静脈内注射により投与される場合、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞膜に浸透することが可能である。

本発明の第１の態様の好ましい一実施形態では、Ｓ１００Ａ１タンパク質由来のドメインは、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｚ、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｔ、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｓ及びＳ１００タンパク質α鎖からなる群から選択されるＳ１００カルシウム結合タンパク質のカルボキシ末端アミノ酸のうちの９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下又は４個以下の連続するアミノ酸を含有し、ここでＳ１００カルシウム結合タンパク質は好ましくはヒト起源のもの、最も好ましくは任意の種のものである。したがって、好ましくは本発明によるＳ１００Ａ１タンパク質由来のドメインは、好ましくは、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１のカルボキシ末端アミノ酸のうちの９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下又は４個以下の連続するアミノ酸を含有し、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｚのカルボキシ末端アミノ酸のうちの９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下又は４個以下の連続するアミノ酸を含有し、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｔのカルボキシ末端アミノ酸のうちの９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下又は４個以下の連続するアミノ酸を含有し、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｓのカルボキシ末端アミノ酸のうちの９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下又は４個以下の連続するアミノ酸を含有し、Ｓ１００タンパク質α鎖のカルボキシ末端アミノ酸のうちの９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下又は４個以下の連続するアミノ酸を含有し、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質は好ましくはヒト起源のもの、最も好ましくは任意の種のものである。最も好ましい一実施形態では、本発明のＳ１００Ａ１タンパク質由来のドメインは、好ましくはヒト起源の、より好ましくは任意の種の任意のＳ１００カルシウム結合タンパク質のカルボキシ末端アミノ酸のうちの９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下又は４個以下の連続するアミノ酸を含有する。

本発明の第２の態様の好ましい一実施形態では、Ｓ１００Ａ１タンパク質由来のドメインは、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｚ、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｔ、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｓ及びＳ１００タンパク質α鎖からなる群から選択されるＳ１００カルシウム結合タンパク質のカルボキシ末端アミノ酸のうちの９個以下、８個以下又は７個以下の連続するアミノ酸を含有し、ここでＳ１００カルシウム結合タンパク質は好ましくはヒト起源のもの、最も好ましくは任意の種のものである。したがって、好ましくは本発明によるＳ１００Ａ１タンパク質由来のドメインは、好ましくは、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１のカルボキシ末端アミノ酸のうちの９個以下、８個以下又は７個以下の連続するアミノ酸を含有し、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｚのカルボキシ末端アミノ酸のうちの９個以下、８個以下又は７個以下の連続するアミノ酸を含有し、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｔのカルボキシ末端アミノ酸のうちの９個以下、８個以下又は７個以下の連続するアミノ酸を含有し、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｓのカルボキシ末端アミノ酸のうちの９個以下、８個以下又は７個以下の連続するアミノ酸を含有し、Ｓ１００タンパク質α鎖のカルボキシ末端アミノ酸のうちの９個以下、８個以下又は７個以下の連続するアミノ酸を含有し、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質は好ましくはヒト起源のもの、最も好ましくは任意の種のものである。最も好ましい一実施形態では、本発明のＳ１００Ａ１タンパク質由来のドメインは、好ましくはヒト起源の、より好ましくは任意の種の任意のＳ１００カルシウム結合タンパク質のカルボキシ末端アミノ酸のうちの９個以下、８個以下又は７個以下の連続するアミノ酸を含有する。上で概説したように、本態様では、それぞれのＳ１００カルシウム結合タンパク質の最もＣ末端のアミノ酸のうち１つ、２つ又は（正：or）３つがＳ１００Ａ１タンパク質由来のドメインに含まれないことが好ましい。

特に好ましい一実施形態では、本発明のペプチドは、筋細胞において、好ましくは骨格筋細胞又は心筋細胞において収縮能力及び／又はカルシウム循環を増強する能力を示す。

特に好ましい一実施形態では、本発明のペプチドは、筋細胞に対する、好ましくは心筋細胞に対する抗不整脈能を示し、したがって好ましくは、不整脈から、好ましくはカテコールアミンに誘発される不整脈から、好ましくは心臓突然死の原因であることが多い心室性不整脈から筋細胞及び心臓組織を保護することが可能である。好ましくは、本発明のペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで抗不整脈能を示す。好ましくは、本発明のペプチドは、致死性の心室性頻脈性不整脈から、好ましくはβ−アドレナリン受容体（βＡＲ）に誘発される致死性の心室性頻脈性不整脈から、好ましくはカテコールアミンに誘発される致死性の心室性頻脈性不整脈から個体を保護する能力を示す。好ましくは、非経口の投与経路を介してペプチドが投与される場合、ｉｎ ｖｉｖｏで抗不整脈能が観察される。ペプチドの抗不整脈能を、例えばペプチドが上で記載したようなＳＯＩＣＲから心筋細胞を保護するかどうかを検証することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏで評価することができる。ペプチドの抗不整脈能を、例えば心不全動物モデルにおいて、例えば心筋梗塞後マウスモデルにおいてβＡＲに誘発される頻脈性不整脈によりもたらされる死亡率に対するペプチドでの処理の効果を検証することにより、ｉｎ ｖｉｖｏで評価することができる（Most et al., 2006, Circulation 114:1258-1268、補遺）。例えばペプチドを、好ましくは非経口的に、例えば腹腔内に、静脈内に、又は皮下に、数日間、例えば６日間、７日間、８日間若しくは９日間、最大数週間、例えば２週間、３週間又は４週間、好ましくは２週間毎日、又は隔日で、虚血後収縮機能不全を有するマウスに投与することができる。致死性の心室性頻脈性不整脈を、ペプチドでの或る特定の期間の処理後に、例えば７日後、８日後、９日後、１０日後に、又は２週間後に、カフェイン（例えば１００ｍｇ／ｋｇ〜１４０ｍｇ／ｋｇの範囲の濃度、好ましくは１２０ｍｇ／ｋｇの濃度）と組み合わせたエピネフリン（例えば１．５ｍｇ／ｋｇ〜２．５ｍｇ／ｋｇの範囲の濃度、好ましくは２ｍｇ／ｋｇの濃度）の投与により、動物において誘発することができる。致死性の心室細動を、遠隔測定ＥＣＧによりモニタリングすることができる（例えばXiao et al., 2007, J. Biol. Chem. 282:34828-34838を参照されたい）。

別の好ましい実施形態では、本発明のペプチドは、筋細胞、例えば骨格筋細胞及び心筋細胞において、好ましくは心筋細胞においてカルシウムスパーク頻度を低減させる能力を有する。好ましくは、本発明のペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでカルシウムスパーク頻度を低減させる能力を示す。好ましくは、非経口の投与経路を介してペプチドが投与される場合、ｉｎ ｖｉｖｏでの効果が観察される。この関連では「低減させる（Reducing）」は好ましくは、ペプチドで処理した筋細胞におけるカルシウムスパーク頻度が、ペプチドで処理していない対照筋細胞と比較して少なくとも１５％、より好ましくは少なくとも２５％、更により好ましくは少なくとも３０％、最も好ましくは少なくとも４０％低減することを意味する。好ましくは、この能力は、心筋細胞に適用されるペプチドの濃度に依存する。好ましくは、本発明のペプチドは、未処理の心筋細胞が存在する液体に添加される場合、該未処理の心筋細胞においてカルシウムスパーク頻度を低減させる能力を有する。例えば、本発明のペプチドは好ましくは、５０ｎＭ〜５００ｎＭの範囲の濃度で心筋細胞の培地に添加される場合、好ましくは５０ｎＭ〜２５０ｎＭの範囲の濃度で適用される場合、より好ましくは７５ｎＭ〜１５０ｎＭの範囲の濃度で適用される場合、最も好ましくは１００ｎＭで適用される場合、静止状態の心筋細胞において、例えば培養した静止状態のラット心室心筋細胞において、カルシウムスパーク頻度を低減させるが、６００ｎＭ以上の濃度で、好ましくは７００ｍＭ以上の濃度で、より好ましくは８００ｎＭ以上の濃度で、更により好ましくは９００ｎＭ以上の濃度で、最も好ましくは１０００ｎＭ以上の濃度で適用される場合、カルシウムスパーク頻度を増大させる（非特許文献２）。したがって、当業者は、ペプチドがカルシウムスパーク頻度を低減させる能力を有するかどうかを容易に決定することができる。特に好ましい一実施形態では、本発明のペプチドは、上で記載したように抗不整脈能、及びカルシウムスパーク頻度を低減させる能力を示す。

別の好ましい実施形態では、本発明のペプチドは、アポトーシス細胞死から、好ましくはカルシウム誘導性アポトーシス細胞死から、好ましくは筋小胞体のカルシウム漏出に誘発されるアポトーシス細胞死から筋細胞、好ましくは骨格筋細胞及び／又は心筋細胞を保護する。したがって、好ましくは、本発明のペプチドは、抗アポトーシス能を示す。好ましくは、本発明のペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでこの抗アポトーシス効果を示す。好ましくは、本発明のペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏで不全心筋におけるアポトーシス細胞死を防止する、すなわちｉｎ ｖｉｖｏでアポトーシス細胞死から不全心筋における心筋細胞を保護する。好ましくは、非経口の投与経路を介してペプチドが投与される場合、ｉｎ ｖｉｖｏでの保護効果が観察される。この関連では「保護する（Protecting）」は、本発明によるペプチドで処理した細胞におけるアポトーシス細胞死の程度が、対照群と比較して少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、更により好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも６０％低減することを意味する。当業者は、例えばペプチドの存在下及び非存在下において長期のカフェイン曝露により内腔のカルシウムに感作された漏出性のＲｙＲカルシウム放出チャネルを有する筋細胞における、好ましくは心室心筋細胞におけるアポトーシスの程度を観察することにより、この特質に関してｉｎ ｖｉｔｒｏで試験することができる。アポトーシスの指標は例えば、例えばＤＮＡラダリングにより検証することができる断片化ゲノム（Liu et al., 2005, Circulation 111:90-96）、シトクロムｃ放出又はカスパーゼ３活性である（Most et al., 2003, J. Biol. Chem. 278:48404-48412）。ペプチドの抗アポトーシス効果を、実験的心不全動物モデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏで評価することができる。例えば、虚血後収縮機能不全を有するマウスを、ペプチドで処理することができ、処理したマウス及び対照のマウスの心臓組織を、アポトーシス心筋細胞の程度に関して評価することができる。ペプチドを、好ましくは非経口的に、例えば腹腔内に、静脈内に、又は皮下に、数日間、例えば６日間、７日間、８日間若しくは９日間、最大数週間、例えば２週間、３週間又は４週間、好ましくは２週間毎日、又は隔日で、投与することができる。アポトーシス細胞の程度を、ＴｎＩ及びＣＤ３１について対比染色した（TnI and CD31 counterstained）心臓組織切片のＴＵＮＥＬ染色により評価することができる（Most et al., 2006, Circulation 114:1258-1268）。特に好ましい一実施形態では、本発明のペプチドは、上で記載したように抗不整脈能を示し、アポトーシス細胞死から筋細胞を保護する。

別の好ましい実施形態では、本発明のペプチドは、好ましくは静止状態の筋細胞、例えば骨格筋細胞及び心筋細胞において筋小胞体からのカルシウム漏出を防止する及び／又は低減させる能力を有する。好ましくは、本発明のペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでこの効果を示す。好ましくは、非経口の投与経路を介してペプチドが投与される場合、このｉｎ ｖｉｖｏでの効果が観察される。この理論に拘束されるものではないが、本発明のペプチドは、その閉じた立体構造においてＲｙＲ筋小胞体カルシウム放出チャネルを安定化させ、それによりこれらのチャネルからのカルシウム漏出を低減させると考えられる（Most et al., 2006, Circulation 114:1258-1268、非特許文献２）。特に好ましい一実施形態では、本発明のペプチドは、上で記載したように抗不整脈能を示し、カルシウム漏出を防止する及び／又は低減させる。

別の好ましい実施形態では、本発明のペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏで血行動態機能を回復させる能力を示す。好ましくは、本発明のペプチドは、心不全に罹患している個体において、例えば心筋梗塞時又は心筋梗塞後に血行動態機能を回復させる。好ましくは、非経口の投与経路を介してペプチドが投与される場合、この効果が観察される。当業者は、例えば実験的マウス心不全モデルを使用することにより、この機能に関してペプチドを容易に試験することができる。例えば、当業者は、ペプチドを投与して及び投与せずに虚血後収縮機能不全を有するマウスにおける心機能及び生存率を決定することができる。ペプチドを、好ましくは非経口的に、例えば腹腔内に、静脈内に、又は皮下に、数日間、例えば６日間、７日間、８日間若しくは９日間、最大数週間、例えば２週間、３週間又は４週間、好ましくは２週間毎日、又は隔日で、投与することができる。実験動物の左心室機能を、シリアル心エコー検査により評価することができる（Most et al., 2003, J. Bio. Chem. 278; 33809-33817、Most et al., 2006, Circulation 114:1258-1268）。好ましくは、本発明のペプチドは、抗不整脈効力、及びｉｎ ｖｉｖｏで血行動態機能を回復させる能力を示す。

別の好ましい実施形態では、本発明のペプチドは、骨格筋組織、例えば骨格筋線維において等尺性単収縮力及び／又は強縮性単収縮力を増強する。好ましくは、本発明のペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでこの効果を示す。好ましくは、非経口の投与経路を介してペプチドが投与される場合、このｉｎ ｖｉｖｏでの効果が観察される。当業者は、例えばペプチド処理した及び処理していない未処理の筋肉又は筋線維、例えば実験動物から単離した未処理の長指伸筋骨格筋における等尺性張力測定により、所与のペプチドに対してこの機能を容易に評価することができる。例えば、単離した筋肉を、或る特定の期間、例えば３０分間〜６０分間、好ましくは４５分間、種々の濃度の、例えば５００ｎＭ〜４μＭの範囲の濃度の、好ましくは１μＭの濃度のペプチドとともにインキュベートすることができる。単離した筋肉をその後、強縮トレイン（例えば１２５Ｈｚで１７５ミリ秒間適用される）で刺激することができ、等尺性張力を測定することができる（Weisleder et al., 2006, J. Cell Biol. 174:639-654）。好ましくは、等尺性単収縮力及び／又は強縮性単収縮力に対する増強効果は、ペプチド（好ましくはこのペプチドは非経口投与されたものである）で全身的に処理された実験動物から単離した筋線維に対しても観察される。したがって、好ましい一実施形態では、本発明のペプチドは、全身的に、好ましくは非経口的に、例えば腹腔内に、静脈内に、又は皮下に投与される場合、骨格筋機能不全を減衰させ、ｉｎ ｖｉｖｏで骨格筋細胞において収縮能力を増強する。特に好ましい一実施形態では、本発明のペプチドは、上で記載された、骨格筋細胞において等尺性単収縮力及び強縮性単収縮力を増強する能力、心筋細胞において収縮能力を増大させる能力、並びに抗不整脈能を示す。

特に好ましい一実施形態では、本発明のペプチドは、上記の機能、すなわち抗不整脈能、抗アポトーシス能、カルシウムスパーク頻度を低減させる能力、筋小胞体からのカルシウム漏出を防止する及び／又は低減させる能力、好ましくは心不全に罹患している個体において、血行動態機能を回復させる能力、並びに骨格筋細胞及び／又は骨格筋線維における等尺性単収縮力及び／又は強縮性単収縮力を増強する能力のうちの１つ又は複数、例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つ、好ましくは全てを示す。好ましくは、上記機能を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで観察することができる。好ましくは、非経口の投与経路を介してペプチドが投与される場合、上記のｉｎ ｖｉｖｏでの効果を観察することができる。

当業者は、本発明によるペプチドを製造する方法を十分に認識する。例えば、ペプチドを、例えば液相ペプチド合成若しくは固相ペプチド合成により、化学的に合成することができ、又はペプチドを、組換えＤＮＡ技法、及び細胞発現系、例えば細菌（例えば大腸菌）細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞等、若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系を使用して遺伝子工学的に製造することができる。

第３の態様では、本発明は、医学的使用のための本発明の第１又は第２の態様によるペプチドを提供する。

第４の態様では、本発明は、筋機能障害と関連する障害、例えば筋症の治療及び／又は予防に関する治療上の使用のための本発明の第１又は第２の態様によるペプチドを提供する。好ましくは、上記障害は、心筋障害及び／又は骨格筋障害である。障害は、後天性又は先天性のものであり得る。この関連では、「後天性の（acquired）」という用語は、医学的状態、すなわち障害が、胎生期後に（post-fetally）発症したことを意味する。本発明との関連ではかかる後天性障害は心筋梗塞であり得る。後天性骨格筋障害の一例は筋炎である。先天性障害は、遺伝学的異常、形態形成の誤り、又は染色体異常の結果として起こり得る成長中の胎児に対する欠陥を含む。遺伝学的疾患又は障害は、人生の後半まで現れない又は認識されないとしても、全て先天性のものである。本発明との関連では先天性障害は例えば、ネマリン筋症、筋細管筋症又は中心核筋症である。さらに本発明との関連では、心筋障害又は骨格筋障害は、急性又は慢性のものであり得る。例えば、急性心筋障害は急性心不全であり、急性骨格筋障害は横紋筋融解症である。慢性骨格筋障害は例えば皮膚筋炎である。慢性心筋疾患は例えば慢性心不全である。

本発明の第４の態様の好ましい一実施形態では、筋機能障害は、筋肉細胞における、好ましくは骨格筋細胞又は心筋細胞におけるカルシウム循環不全及び／又は収縮能力不全と関連する。好ましくは、ペプチドは、筋肉細胞においてカルシウム循環を増強する及び／又は回復させるための、及び／又は収縮能力を増強する及び／又は回復させるためのものである。筋細胞におけるカルシウム循環不全は、筋小胞体におけるカルシウム含有量の低減、興奮収縮連関時における筋小胞体からのカルシウムの放出の低減、筋小胞体からのカルシウム漏出（例えば漏出性のＲｙＲ筋小胞体カルシウム放出チャネルによる）、カルシウムスパーク頻度の増大、又は収縮後における筋小胞体及び／又はミトコンドリア中へのカルシウムの再取込みの低減若しくは遅延化（例えば機能障害を有する若しくは機能しない筋小胞体／小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ）による）の結果として起こるものであり得る。この理論に拘束されるものではないが、カルシウム循環不全は、筋肉細胞の収縮能力不全、例えば収縮機能不全に関する主要な理由の１つであると考えられる。したがって、カルシウム循環を増強する又は回復させることは、収縮能力も増強する及び／又は回復させると考えられる。ほとんど全ての心筋及び骨格筋の障害／疾患は、それぞれの筋肉細胞の収縮機能不全の結果として起こるものである。例えば心不整脈においては、心筋収縮が正確に時機制御されない。このことは、致死的な転帰をもたらし得る。骨格筋障害のほとんどでは、収縮能力が低減し、例えば様々な種類のジストロフィーにおけるもののような、筋力低下の転帰をもたらす。本発明の第１の態様によるペプチドは、筋細胞におけるカルシウム循環を増強する及び／又は回復させることが可能であり、それにより収縮能力を増強する及び／又は回復させると考えられる。しかしながら、本発明のペプチドが、筋機能障害と関連する障害（該筋機能障害はカルシウム循環不全と関連する）を治療するのに好適なだけでなく、カルシウム処理の機能障害に基づくものでない筋疾患を治療するのにも好適であることが強調される。これらの疾患においては本発明のペプチドは、症状、例えば筋力低下を軽減することができる。

本発明の第３及び第４の態様の好ましい一実施形態では、ペプチドは、不整脈から、好ましくはカテコールアミンに誘発される不整脈から筋細胞、好ましくは骨格筋細胞及び／又は心筋細胞、より好ましくは心臓組織を保護するための、好ましくは心室性不整脈から、好ましくは致死性の心室性頻脈性不整脈から、したがって好ましくは心臓突然死から個体を保護するためのものである。好ましくは上記機能は、好ましくはペプチドを非経口的に適用する場合に、ｉｎ ｖｉｖｏで示され、遺伝子療法を必要としない。

本発明の第３及び第４の態様のさらに好ましい一実施形態では、ペプチドは、筋細胞において、好ましくは骨格筋細胞及び／又は心筋細胞においてカルシウムスパーク頻度を低減させるための、及び／又は筋細胞、好ましくは骨格筋細胞及び／又は心筋細胞の筋小胞体からのカルシウム漏出を防止する及び／又は低減させるためのものである。好ましくは上記機能は、好ましくはペプチドを非経口的に適用する場合に、ｉｎ ｖｉｖｏで示され、遺伝子療法を必要としない。

本発明の第３及び第４の態様のさらに好ましい一実施形態では、ペプチドは、筋肉細胞の、好ましくは骨格筋細胞及び／又は心筋細胞の筋小胞体からのカルシウム漏出を防止する又は低減させるためのものである。好ましくは、ペプチドは、漏出性のＲｙＲ筋小胞体カルシウム放出チャネルによる筋小胞体からのカルシウム漏出を防止する又は低減させるためのものである。好ましくは上記機能は、好ましくはペプチドを非経口的に適用する場合に、ｉｎ ｖｉｖｏで示され、遺伝子療法を必要としない。

本発明の第３及び第４の態様の別の好ましい実施形態では、ペプチドは、アポトーシス細胞死から、好ましくはカルシウム誘導性アポトーシス細胞死から、好ましくは筋小胞体のカルシウム漏出に誘発されるアポトーシス細胞死から筋細胞、好ましくは骨格筋細胞及び／又は心筋細胞を保護するためのものである。好ましくは、ペプチドは、不全心筋におけるアポトーシス細胞死を防止する、すなわち不全心筋におけるアポトーシス細胞死から心筋細胞を保護するためのものである。好ましくは上記機能は、好ましくはペプチドを非経口的に適用する場合に、ｉｎ ｖｉｖｏで示され、遺伝子療法を必要としない。

本発明の第３及び第４の態様の特に好ましい別の実施形態では、ペプチドは、血行動態機能、例えば心機能、例えば心筋細胞の収縮能力を回復させる及び／又は増強するためのものであり、好ましくはペプチドは、心不全に、例えば心筋梗塞に罹患している又は罹患したことがある個体において血行動態機能を回復させる及び／又は増強するためのものである。好ましくは上記機能は、ペプチドを非経口的に適用する場合に、ｉｎ ｖｉｖｏで示され、遺伝子療法を必要としない。

本発明の第３及び第４の態様の別の好ましい実施形態では、ペプチドは、骨格筋細胞において収縮能力を増強する及び／又は回復させるための、好ましくは骨格筋細胞において、好ましくは骨格筋組織において等尺性単収縮力及び／又は強縮性単収縮力を増強する及び／又は回復させるためのものである。等尺性単収縮力は筋肉の短縮を伴わない張力の発生であり、強縮性単収縮力は最大の等尺性力の発生であり、通常、単収縮は５０Ｈｚ超の刺激でマージし（merge）始める。好ましくは上記機能は、好ましくはペプチドを非経口的に適用する場合に、ｉｎ ｖｉｖｏで示され、遺伝子療法を必要としない。

本発明の第１又は第２の態様における本発明によるペプチドの特定の実施形態の機能的特徴に関する開示が、本発明の第３及び第４の態様にも適用されることが強調される。

本発明の第４の態様の好ましい一実施形態では、心筋障害は、虚血後収縮機能不全、好ましくは虚血後右心室収縮機能不全及び／又は虚血後左心室収縮機能不全、うっ血性心不全、好ましくは代償性及び／又は非代償性うっ血性心不全、心原性ショック、敗血症ショック、心筋梗塞、心筋症、心臓弁の機能不全、並びに心室障害、例えば急性又は慢性の右心室障害からなる群から選択される。

本発明の第４の態様の好ましい一実施形態では、骨格筋障害は、筋ジストロフィー、筋力低下、筋萎縮症、筋炎、セントラルコア病、ネマリン（桿状体）筋症、中心核筋症、筋細管筋症、中心核筋細管筋症、眼の眼筋麻痺、及びミトコンドリア筋症からなる群から選択される。筋ジストロフィーは、ベッカー型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー、エメリ・ドレフュス型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、筋強直性筋ジストロフィー及び眼咽頭型筋ジストロフィーからなる群から選択することができる。筋炎は、骨化性筋炎、線維筋炎、特発性炎症性筋症（例えば皮膚筋炎、多発性筋炎及び封入体筋炎）及び化膿性筋炎からなる群から選択することができる。

第５の態様では、本発明は、第１若しくは第２の態様のペプチド、又はその薬学的に許容可能な塩、並びに薬学的に許容可能な添加物、担体及び／又は希釈剤を含む医薬組成物を提供する。

「薬学的に許容可能な塩」という用語は、本発明のペプチドの塩を表す。好適な薬学的に許容可能な塩は、例えば、本発明のペプチドの溶液を、薬学的に許容可能な酸（例えば塩酸、硫酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酢酸、安息香酸、クエン酸、酒石酸、炭酸又はリン酸）の溶液と混合することにより形成することができる酸付加塩を含む。さらに、ペプチドが酸性部分を保有する場合には、好適なその薬学的に許容可能な塩は、アルカリ金属塩（例えばナトリウム塩又はカリウム塩）；アルカリ土類金属塩（例えばカルシウム塩又はマグネシウム塩）；及び好適な有機リガンド（例えばハロゲン化物イオン、水酸化物イオン、カルボン酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、硝酸イオン、アルキルスルホン酸イオン及びアリールスルホン酸イオン等の対陰イオンを使用して形成した、アンモニウム陽イオン、四級アンモニウム陽イオン及びアミン陽イオン）で形成される塩を含み得る。薬学的に許容可能な塩の例は、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重硫酸塩、重酒石酸塩、ホウ酸塩、臭化物塩、酪酸塩、エデト酸カルシウム塩、カンファー酸塩（camphorate）、カンファースルホン酸塩（camphorsulfonate）、カンシル酸塩、炭酸塩、塩化物塩、クエン酸塩、クラブラン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、二塩酸塩、ドデシル硫酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストール酸塩（estolate）、エシル酸塩（esylate）、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコヘプトン酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリセロリン酸塩、グリコリルアルサニル酸塩（glycolylarsanilate）、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヘキシルレゾルシン酸塩（hexylresorcinate）、ヒドラバミン塩（hydrabamine）、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物塩、イソチオン酸塩（isothionate）、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メタンスルホン酸塩、メチル硫酸塩、ムチン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、Ｎ−メチルグルカミンアンモニウム塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩（エンボン酸塩（embonate））、パルミチン酸塩、パントテン酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、ポリガラクツロン酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、硫酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシル酸塩、トリエチオジド塩（triethiodide）、ウンデカン酸塩、吉草酸塩等を含むがこれらに限定されない（例えば、S. M. Berge et al., "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci.,66, pp. 1-19（1977）を参照されたい）。

本明細書中で使用される場合の「添加物」という用語は、例えば担体、結合剤、滑剤、増粘剤、界面活性剤、保存料、乳化剤、緩衝液、香料又は着色料等の、活性成分ではない、医薬製剤中の全ての物質を示すことが意図される。

好ましい一実施形態では、本発明の医薬組成物は、本発明の第４の態様における本発明のペプチドに関して上で記載したような筋機能障害と関連する障害を治療又は予防するためのものである。

別の好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、本発明の第４の態様における本発明によるペプチドに関して上で記載したように、不整脈から筋細胞を保護する、心室性不整脈から、好ましくは致死性の心室性頻脈性不整脈から、したがって好ましくは心臓突然死から個体を保護するための、筋細胞においてカルシウムスパーク頻度を低減させるための、筋細胞の筋小胞体からのカルシウム漏出を防止する及び／又は低減させるための、アポトーシス細胞死から筋細胞を保護する、好ましくは不全心筋におけるアポトーシス細胞死から心筋細胞を保護するための、血行動態機能を回復させる及び／又は増強する、好ましくは心不全に罹患している個体において血行動態機能を増強するための、及び／又は骨格筋細胞において収縮能力を増強する及び／又は回復させるための、好ましくは骨格筋細胞において等尺性単収縮力及び／又は強縮性単収縮力を増強する及び／又は回復させるためのものである。

本発明の対象となる医薬組成物を、当業者に既知の様々な方法で配合することができる。例えば、本発明の医薬組成物は、液体形態で、例えば溶液、乳濁液又は懸濁液の形態であり得る。好ましくは、本発明の医薬組成物を、非経口投与用に、好ましくは静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、肺内投与、腹腔内投与、心臓内投与用に、又は粘膜を介した投与用に、好ましくは静脈内投与、皮下投与若しくは腹腔内投与用に製剤化する。好ましくは、本発明の医薬組成物は、他の物質、例えば溶液を血液と等張にするのに十分な塩又はグルコースを含有し得る無菌水溶液の形態である。水溶液は好適には、必要に応じて、緩衝化（好ましくは３〜９のｐＨまで、より好ましくは５〜７のｐＨまで）するものとする。

医薬組成物は、好ましくは単位投与形態である。かかる形態では、医薬組成物は、適切な量の活性成分を含有する単位用量に細分類される。単位投与形態は包装された調製物であってもよく、該包装は例えばバイアル又はアンプルのように分離した量の医薬組成物を含有する。

第６の態様では、本発明は、筋機能障害と関連する障害を治療又は予防するための医薬組成物の調製のための本発明の第１又は第２の態様によるペプチドの使用を提供し、ここで上記障害は好ましくは本発明の第４の態様において上で記載したようなものである。好ましい一実施形態では、ペプチドの使用は、本発明の第４の態様における本発明によるペプチドに関して上で記載したように、不整脈から筋細胞を保護する、心室性不整脈から、好ましくは致死性の心室性頻脈性不整脈から、したがって好ましくは心臓突然死から個体を保護するための、筋細胞においてカルシウムスパーク頻度を低減させるための、筋細胞の筋小胞体からのカルシウム漏出を防止する及び／又は低減させるための、アポトーシス細胞死から筋細胞を保護する、好ましくは不全心筋におけるアポトーシス細胞死から心筋細胞を保護するための、心不全に罹患している個体において血行動態機能を回復させる及び／又は増強するための、及び／又は骨格筋細胞において収縮能力を増強する及び／又は回復させるための、好ましくは骨格筋細胞において等尺性単収縮力及び／又は強縮性単収縮力を増強する及び／又は回復させるための医薬組成物の調製のためのものである。本発明の第６の態様の好ましい一実施形態では、該使用は、筋障害、好ましくは骨格筋障害及び／又は心筋障害と関連する疾患状態を改善するための医薬組成物の調製のためのものであり、ここで「疾患状態を改善する」という用語は、本発明の第７の態様に関して定義されるようなものである。

第７の態様では、本発明は、筋機能障害と関連する障害を治療又は予防する方法であって、それを必要とする個体に対して、上記個体、好ましくは患者の疾患状態を改善するのに十分な量の本発明の第１又は第２の態様のペプチド、又は本発明の第５の態様の医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。この関連では「疾患状態を改善する」は、例えば、ペプチド若しくは医薬組成物が患者に投与された後、或る特定の期間の後に個体が改善の主観的感覚を有すること、又は本発明のペプチド若しくは医薬組成物での治療後に罹患した筋肉の機能が測定可能な程度まで改善されていることを意味する。例えば、収縮能力、例えば筋肉組織、例えば罹患した心筋又は罹患した骨格筋の収縮力が、正常な収縮機能の平均値から５０％逸脱していた場合、治療後に、上記筋肉組織の収縮能力が、対応する健常な筋肉組織の正常な収縮機能の平均値から５０％未満、例えば４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満逸脱していれば、又は全く逸脱していなければ、治療により疾患状態が改善されている。収縮能力は、健常な心臓組織の平均的な心機能と比較して改善することもある。「それを必要とする個体」という用語は好ましくは、上で規定されるような動物患者を、より好ましくは哺乳動物患者を、最も好ましくはヒト患者を表す。

筋機能障害と関連する障害は好ましくは、本発明の第４の態様に関して規定されるようなものである。

好ましい一実施形態では、本発明の第７の態様による方法は、本発明の第４の態様における本発明によるペプチドに関して上で記載したように、不整脈から筋細胞を保護する、心室性不整脈から、好ましくは致死性の心室性頻脈性不整脈から、したがって好ましくは心臓突然死から個体を保護するための、筋細胞においてカルシウムスパーク頻度を低減させるための、筋細胞の筋小胞体からのカルシウム漏出を防止する及び／又は低減させるための、アポトーシス細胞死から筋細胞を保護する、好ましくは不全心筋におけるアポトーシス細胞死から心筋細胞を保護するための、心不全に罹患している個体において血行動態機能を回復させる及び／又は増強するための、及び／又は骨格筋細胞において収縮能力を増強する及び／又は回復させるための、好ましくは骨格筋細胞において等尺性単収縮力及び／又は強縮性単収縮力を増強する及び／又は回復させるためのものである。

本発明の第６及び第７の態様において記載されるように筋機能障害と関連する障害を治療又は予防するために、本発明によるペプチド又は医薬組成物を、動物患者、好ましくは哺乳動物患者、好ましくはヒト患者に対して、好ましくは非経口の投与経路を介して、例えば静脈内に、筋肉内に、皮下に、経皮的に、肺内に、腹腔内に、心臓内に、又は粘膜を介して、好ましくは静脈内に、皮下に、若しくは腹腔内に投与することができる。投与は、点滴若しくは古典的な注射によるもの、例えばカニューレを使用するもの、又は無針注射技法によるものであり得る。

第８の態様では、本発明は、筋機能障害と関連する疾患、好ましくは骨格筋疾患、より好ましくは心筋疾患を治療又は予防するために通常投与される別の薬物と組み合わせて本発明の第１又は第２の態様によるペプチドを含む、又はそれからなる組成物を提供する。好ましくは、上記組成物は、１つ又は複数の薬学的に許容可能な希釈剤、担体及び／又は添加物も含み得る医薬組成物である。好ましい一実施形態では、上記薬物は、好ましくは心筋細胞に対して、催不整脈能を示す。本発明の本態様の好ましい一実施形態では、本発明によるペプチドは、上記薬物の催不整脈能を低減させる。好ましくは上記薬物は、カテコールアミン、例えば直接β−模倣剤（mimetics）、例えば内因性若しくは合成のカテコールアミン、又は間接β−模倣剤、例えばホスホジエステラーゼ阻害剤β−模倣剤、又はＲｙＲ２のカルシウム感受性を増強する別の作用剤、例えばカフェイン、又は類似の化学物質、例えばプリンアルカロイド若しくはジメチルキサンチンである。本発明の第８の態様の好ましい一実施形態では、上記薬物は、カテコールアミン、β−アドレナリン受容体作動薬及びβ−アドレナリン受容体遮断薬からなる群から（正：from）選択される。一実施形態では、上記薬物は、カテコールアミン、例えばドブタミン、ノルアドレナリン、アドレナリン、ドーパミン又はイソプレナリン、好ましくはドブタミン、ノルアドレナリン又はアドレナリンである。別の実施形態では、上記薬物は、β−アドレナリン受容体作動薬、例えばイソプロテレノール、サルブタモール、フェノテロール、ホルモテロール、メタプロテレノール、サルメテロール、テルブタリン、クレンブテロール、アルブタミン、ベフノロール、ブロモアセチルアルプレノロールメンタン（bromoacetylalprenololmenthane）、ブロキサテロール、シマテロール、シラゾリン、デノパミン、エピネフリン、エチレフリン、ヘキソプレナリン、ヒゲナミン、イソエタリン、イソクスプリン、マブテロール、メトキシフェナミン、ニリドリン、オキシフェドリン、ピルブテロール、プレナルテロール、プロカテロール、ラクトパミン、レプロテロール、リミテロール、リトドリン、トレトキノール、トルブテロール（tolubuterol）、キサモテロール、ジルパテロール（zilpaterol）又はジンテロール、好ましくはイソプロテレノール、サルブタモール、フェノテロール、ホルモテロール、メタプロテレノール、サルメテロール、テルブタリン、クレンブテロール、より好ましくはイソプロテレノールである。別の実施形態では、上記薬物は、β−アドレナリン受容体遮断薬、例えばメトプロロール、アテノロール、ビソプロロール、ネビボロール、エスモロール、ベタキソロール、アセブトロール、セリプロロール、ブプラノロール、プロプラノロール、チモロール、カルベジロール、ソタロール、ピンドロール、オクスプレノロール又はアルプレノロール、好ましくはメトプロロール、アテノロール、ビソプロロール、ネビボロール、エスモロール又はベタキソロール、最も好ましくはメトプロロールである。本発明の第８の態様による組成物は、本発明の第１又は第２の態様によるペプチドと組み合わせて、同じ分類の又は異なる分類の１つ又は複数の、例えば１つ、２つ、３つ又は４つの異なる薬物を含み得る。

本発明者らは驚くべきことに、本発明による短縮ペプチドは、そのサイズが大幅に減少しているにもかかわらず、機能的である、すなわち本明細書全体を通じて記載したような筋機能障害と関連する障害を治療又は予防するために有用であること、本発明によるペプチドが薬物、例えばカテコールアミン、β−アドレナリン受容体作動薬又はβ−アドレナリン受容体遮断薬の催不整脈能をそれらの有益な効果を打ち消すことなく低減させる能力を有すること、及び上記ペプチドのこれらの治療効果が、ペプチドが非経口的に、好ましくは静脈内、腹腔内又は皮下の投与経路を介して投与される場合であっても発揮され、遺伝子療法による遺伝子修飾を必要とせず、主な副作用を引き起こすことがないことを見出した。

実施例は、本発明を更に説明するために設計され、より良い理解に役立つ。実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるものでは決してない。

実施例１：透過処理した心筋細胞及び骨格筋線維に対するＳ１００Ａ１タンパク質、及びＳ１００Ａ１のＣ末端の２０ｍｅｒペプチドの変力効果。
成体ウサギ心室心筋細胞を、以前に記載されたように４匹の異なる動物から単離し（Loughrey C.M. et al., 2004, J. Physiol. 556:919-934）、β−エスチン（０．１ｍｇ／ｍｌ）を使用して透過処理した。透過処理した細胞を、ローダミン標識したヒトＳ１００Ａ１タンパク質（０．１μＭ）、又は親水性リンカーと融合したＦＩＴＣ標識したＳ１００Ａ１のＣ末端の２０ｍｅｒペプチド（０．１μＭ）（親水性要素Ｄ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ（配列番号１７）と融合したヒトＳ１００Ａ１のアミノ酸７５〜９４）とともに１分間インキュベートした。細胞を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ２０００レーザー走査型共焦点顕微鏡（ＬＳＣＭ）を使用してモニタリングした。リアノジン染色パターンに類似する線状の染色パターンを観察することができる（図４）。

さらに、Ｓ１００Ａ１タンパク質、又は親水性要素と融合したＳ１００Ａ１のＣ末端の２０ｍｅｒペプチドで処理した透過処理した細胞においてＣａ^２＋スパーク頻度を評価し、全長タンパク質及びＣ末端断片の両方が、透過処理した心筋細胞においてカルシウムスパーク頻度を減少させることが示された（図５及び図６）。単離した心筋細胞を、擬似（mock）細胞内溶液で灌流し、β−エスチン（０．１ｍｇ／ｍｌ）を使用して透過処理した。灌流溶液中に存在するＦｌｕｏ−３遊離酸（１０μＭ）を４８８ｎｍ（Ｋｒレーザー）で励起させ、×６０−１．２ＮＡの水浸型対物レンズを備えた倒立顕微鏡の落射蛍光光学系（epifluorescence optics）を適用して５１５ｎｍ超で測定した。ラインスキャンモードにおいて２ミリ秒／ラインで蛍光を取得した。ピクセル寸法は０．３μｍであった（５１２ピクセル／スキャン；ズーム＝１．４）。スキャンするレーザーラインを、長軸と平行に配向させ、確実に核領域がスキャンラインに含まれないようにするために、細胞の外縁及び核（単数又は複数）からおよそ等距離となるように配置した。この出力波形を遊離カルシウム濃度（［Ｃａ^２＋］）に変換することができるように、各Ｃａ^２＋スパーク測定期間の終了時に、１０ｍＭのＥＧＴＡを組み込んだ一連の較正溶液を使用した。Ｃａ^２＋スパークに関する全ての実験において、試験溶液中の［Ｃａ^２＋］は１４５ｎＭ〜１６０ｎＭであった。Ｆｌｕｏ−３を含有する溶液において記録されたＣａ^２＋スパークを、自動検出及び測定アルゴリズムを使用して定量化した。全てのＣａ^２＋スパーク測定を、細胞の透過処理後７分〜８分以内に行った。この時間を標準化して、可溶性タンパク質の損失を最小限に抑えた。Ｓ１００Ａ１タンパク質又はＳ１００Ａ１−ｃｔペプチドを、重力供給型灌流システムを使用して擬似溶液中に適用した。効果を、Ｓ１００Ａ１を添加していない擬似溶液で灌流した透過処理した対照心筋細胞と比較した。各動物由来の最大４個の異なる細胞をＣａ^２＋スパーク測定に対して使用した。

筋線維調製及び実験溶液
全ての動物を、ハイデルベルク大学の動物実験委員会（animal care committee）の指針に従って取り扱った。雄性ＢＡＬＢ／ｃマウス（３ヶ月齢〜６ヶ月齢）を二酸化炭素の過剰投与により屠殺し、以前に記載された（Fink R.H. and Stephenson D.G., 1987, Pflugers Arch. Eur. J. Physiol.409:374-380、Makabe M. etal., 1996, Pflugers Arch. Eur. J. Physiol. 432: 717-726）ように筋線維調製を実施した。ＥＤＬ（長指伸筋）又はヒラメ筋を単離し、２つ〜４つの単線維（直径８０μｍ〜１５０μｍ及び長さ３ｍｍ〜４ｍｍ）を含有する小線維束をパラフィン油中で切り出した。線維調製物を、力変換ピン（force transducer pin）（ＡＥ８０１、Senso-Noras、Horton, Norway）とマイクロメートル加減ネジ（micrometer-adjustablescrew）との間に接着した（glued）。全ての実験を室温（２３℃〜２５℃）で実施した。全ての溶液をｐＨ７．０に調整した。遊離イオン濃度を、G. L. Smith（Glasgow, Scotland）からのコンピュータプログラムＲＥＡＣＴ（バージョン２．０）を用いて算出した。表Ｉは実験に使用した溶液の濃度を示す。

表１
総濃度（角括弧内のものは遊離濃度）
ＬＲ、低弛緩溶液；ＨＲ、高弛緩溶液；ＨＡ、高活性化溶液；ＳＫ、スキニング（skinning）溶液；ＬＳ、ローディング（loading）溶液。

高弛緩溶液及び高活性化溶液は遊離のＣａ^２＋を緩衝する５０ｍＭのＥＧＴＡを含有するものであったが、低弛緩溶液は、０．５ｍＭのＥＧＴＡ、及び４９．５ｍＭの１，６−ジアミノヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−四酢酸（ＨＤＴＡ）（ＥＧＴＡと対照的に、Ｃａ^２＋に対する親和性が非常に低い）を含有するものであった。スキニング溶液は、低弛緩溶液に対する５０μｇ／ｍｌのサポニンの添加により得られる。放出溶液は、５ｍＭのカフェインを添加した低弛緩溶液からなるものであった。ローディング溶液は、遊離のＣａ^２＋を０．４μＭ（ｐＣａ６．４）までクランプするために５０ｍＭのＥＧＴＡを含有するものであった。ｐＣａ−力の関係を測定するための溶液を、高弛緩溶液を適量の高活性化溶液、及び添加された５ｍＭのカフェインと混合することにより得た。全ての実験を、ストリップチャートレコーダーを使用して記録し、同時に、Axon InstrumentsのＤｉｇｉｄａｔａ １２００インターフェースボード（boardand interface）（Ａｘｏｔａｐｅソフトウェア、バージョン２．０を使用する）によりデジタル変換した。筋線維調製及び力測定に関しては、Weisleder N. et al., 2006, J. Cell Biol. 174:639-645も参照されたい。

骨格筋線維におけるＣａ^２＋誘導性等尺性単収縮力及びＣａ^２＋過渡応答の評価。
全長Ｓ１００Ａ１タンパク質及びＣ末端断片の両方が、透過処理したマウス骨格筋線維において等尺性単収縮力を増強する効力を有することが示された（図７）。ヘリウム−ネオンレーザーの回折パターンを使用してサルコメア長を２．６μｍ±０．１μｍに調整しつつ、筋線維をスキニング溶液中で５分間スキニングした。ＳＲをローディング溶液（ｐＣａ６．４）により１分間ローディングする前に、線維を、放出溶液及び高弛緩溶液中に短時間浸漬し、その後低弛緩溶液中で２分間平衡化した。その後、調製物を高弛緩溶液中に１秒間、更に低弛緩溶液中に２分間浸した。初期の力の過渡応答が静止時の（resting）力のレベルに戻るまで、線維を５ｍＭのカフェインを含有する放出溶液に曝露した。最大の力は、ｐＣａ４．２８の高活性化溶液及び５ｍＭのカフェイン下で測定された。その後線維を、Ｃａ^２＋を緩衝するために高弛緩溶液中で１分間弛緩させた。幾つかの対照過渡応答を記録した後、線維をＳ１００Ａ１タンパク質又はＳ１００Ａ１ペプチド混合物（Ｎ／Ｈ／Ｃ）又はＣ末端２０ｍｅｒに単独で曝露し、実験を上で概説したように繰り返した。Ｓ１００Ａ１タンパク質又はペプチドを、放出前及び放出時に低弛緩溶液に、並びに高活性化溶液に添加した。Ｓ１００Ａ１処置（０．００１μＭ〜１０μＭ）への応答におけるｐＣａ−力の関係を、６つの異なるＣａ^２＋濃度（ＥＤＬ、ｐＣａ９．０７、５．９１、５．７２、５．４９、５．１７及び４．２８）（各々が５ｍＭのカフェインを含有する）で測定した。ＥＣ５０及びヒル係数を、ヒル型フィッティング（Hilltype fit）から得た。ＥＣ５０値は、収縮装置のＣａ^２＋感受性の尺度としての、最大値の半分の等尺性力の活性化に必要とされるＣａ^２＋濃度を示す。ヒル係数は、シグモイド曲線の最大の峻度の指標を与える。相関係数を、フィッティングの精度を決定するために算出した。力の過渡応答を、以前に記載されたようにＣａ^２＋の指標として個々のｐＣａ^２＋−力の関係を使用すること、及び力の過渡応答の各点を対応する遊離Ｃａ^２＋レベルへと変換すること（reversing）により、対応する遊離Ｃａ^２＋過渡応答へと変換した。Ｃａ^２＋調節タンパク質の感受性、及び対応する力の発生により直接、遊離の筋原線維Ｃａ^２＋の尺度が得られるという事実に基づき、ｐＣａ−力の関係は、遊離Ｃａ^２＋と力とを関連付けるものである。したがって、ＳＲからのＣａ^２＋放出に由来するかなり緩やかな力の過渡応答を見掛けのＣａ^２＋過渡応答へと変換するｐＣａ−力の関係を、バイオアッセイとして使用することができる。

実施例２：Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１ペプチドの細胞透過性
ローダミン標識したＳ１００Ａ１タンパク質も、親水性モチーフ、例えばＤ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ（配列番号１７）を有する又は有しないＦＩＴＣ標識したＳ１００Ａ１のＣ末端の２０ｍｅｒペプチドも、未処理の成体の心筋細胞の細胞膜に浸透することができない。しかしながら、本発明者らは驚くべきことに、Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１と称される配列Ｄ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ−Ｙ−Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号４２）を有するペプチドが細胞透過性を有することを見出した。ＦＩＴＣ標識したＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１を未処理のラット心室心筋細胞とともに１５分間インキュベートした後、細胞を共焦点レーザー走査型顕微鏡法を使用してモニタリングした。内在性Ｓ１００Ａ１タンパク質を、従来の免疫蛍光プロトコルを使用して染色した。ＦＩＴＣ標識したＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１の細胞内染色パターンは、内在性Ｓ１００Ａ１の細胞内染色パターンに類似している（図８）。

実施例３：心筋細胞におけるＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１ペプチドの機能的特性決定
Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１ペプチドの機能的特性決定のために行った全ての実験を、未処理の、すなわち透過処理していない心筋細胞（正：cardiomyocytes）に対して行った。Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１ペプチドは刺激した単離心室心筋細胞に対して陽性変力効果を発揮する（図９）が、その断片（図１０）、又はＳ１００Ａ４若しくはＳ１００Ｂのカルボキシ末端由来の対応するペプチド（図１１）はこの能力を示さないことが示された。カルシウム過渡応答を、落射蛍光デジタル化顕微鏡法を利用してＦＵＲＡ２−ＡＭを負荷し電場刺激した心筋細胞において評価し、筋小胞体のカルシウム負荷を決定した（図１２）。

心筋細胞におけるＣａ^２＋過渡応答、及びＳＲのＣａ^２＋負荷の較正及び測定。
マウス心室心筋細胞の細胞内Ｃａ^２＋過渡応答を、以前に記載されたように較正及び測定した（Remppis A. et al., 2002, Basic Res. Cardiol. 97: I/56-I/62）。簡潔に述べると、単離した細胞を、ＨＥＰＥＳ改変培地１９９（Ｍ１９９）（Sigma）中で洗浄し、２μＭのＦｕｒａ２−ＡＭを含む１ｍｌのＭ１９９（２ｍＭ ［Ｃａ^２＋］_ｅ）中で室温で２０分間インキュベートした。較正及び蛍光測定を、モノクロメータ（Ｐｏｌｙｃｈｒｏｍｅ ＩＩ、T.I.L.L. Photonics GmbH、Germany）と接続されたＵＶフィルタを備えたオリンパス株式会社の倒立（inverse）顕微鏡（Ｉｘ７０）を使用して実施した。細胞を、１Ｈｚで電気刺激し、３４０ｎｍ／３８０ｎｍで励起させた。蛍光放出を、５１０ｎｍで検出し、デジタル化し、T.I.L.L.のＶＩＳＩＯＮソフトウェア（バージョン３．３）で解析した。５つの連続する定常状態の過渡応答由来のベースラインデータを、過渡振幅（Ｃａ^２＋振幅（ｎＭ））、ピークとなる時間（ミリ秒）、及び５０％低下する時間（ミリ秒）の解析のために平均化した。５０個の細胞に対するＦｕｒａ２−ＡＭを負荷したマウス心室筋細胞に関する較正により最小の比（Ｒ_ｍｉｎ）０．３８±０．０５、及び最大の比（Ｒ_ｍａｘ）３．３６±０．２１が得られ、β及びＫｄはそれぞれ５．２１±０．２４ｎＭ及び２３６±２９ｎＭの量と推測された。遊離細胞内Ｃａ^２＋濃度［Ｃａ^２＋］_ｉを、Grynkiewicz et al.の式（Grynkiewicz G. et al.,1985, J. Biol. Chem. 260:3440-3450）により算出した。Ｃａ^２＋過渡応答を、１Ｈｚの電気刺激及び２ｍＭ ［Ｃａ^２＋］_e（Ｍ１９９中）下において、ベースラインで及び段階的に増大するイソプロテレノール濃度（１０^−９Ｍ〜１０^−５Ｍ）に対して調査した。ＳＲのＣａ^２＋負荷を、標準カフェインパルスプロトコルを使用して評価した。２分の電気刺激（１Ｈｚ）の後、筋細胞を、カフェイン（１０ｍＭ）を含む０Ｎａ^＋／０Ｃａ^２＋溶液に急遽曝露した。カフェイン誘導性Ｃａ^２＋過渡応答のピークを、ＳＲのＣａ^２＋負荷の指標として使用した。

筋細胞収縮パラメータ。
単離した心室筋細胞の収縮性研究を、ビデオエッジ検出システム（Crescent Electronics、Sandy, UT）を用いて、近年記載されたように行った（Most P. et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98:13889-13894）。簡潔に述べると、筋細胞をＭ１９９中、室温で、１Ｈｚで電気刺激して収縮させた。エッジ検出の測定値を、基本条件下及び漸増イソプロテレノール濃度（１０^−９Ｍ〜１０^−５Ｍ）下で取得した。５つの連続する定常状態の単収縮のデータを、細胞の短縮率（％ＣＳ（％））、短縮速度（−ｄＬ／ｄｔ（μｍ／ｓ））及び再伸長速度（＋ｄＬ／ｄｔ（μｍ／ｓ））の解析のために平均化した。

実施例４：Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１は、β−アドレナリン受容体シグナル伝達を変化させず、不整脈誘発性のストア過負荷誘導性カルシウム放出（ＳＯＩＣＲ）から心筋細胞を保護する
Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１の変力効果は、β−アドレナリン刺激に対して相加的でありかつこれと独立している（図１３）。心室心筋細胞を上で記載したように単離し、カルシウム過渡振幅を、イソプロテレノールの存在下及び非存在下で、並びにＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１ペプチドの存在下又は非存在下で、それぞれ評価した。

さらに、Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１ペプチドは、不整脈誘発性のストア過負荷誘導性カルシウム放出（ＳＯＩＣＲ）から心筋細胞を保護する（図１５）。カルシウムスパークを、Ventucci et al., 2007, Circ. Res. 100:105-111に記載されたように、対照及びβＡＲ（１０^−７Ｍのイソプロテレノール＋０．５ｍＭのカフェイン）条件下で、Ｆｌｕｏ−３ＡＭを負荷した心筋細胞において評価した。Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１の保護効果は、ＳＲのカルシウム負荷の増強により心筋細胞において変力作用を発揮する濃度（１００ｎＭ及び１０００ｎＭ）で効果的であることに留意することが重要である。したがって、ＳＲのＣａ再隔離に対するそれ自身の増強効果に関わらず、Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１はβＡＲに誘発されるＳＯＩＣＲを効果的にアンタゴナイズし、変力作用を抗不整脈効力と関連付ける特有の分子プロファイルを強調する。

実施例５：正常な心臓及び罹患した
心臓におけるＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１ペプチドの機能的特性決定。
Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１ペプチドは、基本条件及びβＡＲ刺激条件下で収縮能力の増強をもたらす有意なｉｎ ｖｉｖｏでの血行動態効果を発揮する（図１８）。これらの血行動態効果は、β１ＡＲ遮断薬メトプロロールへの応答に効果的である（図１９及び図２０）。さらに、Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１ペプチドは、実験的心不全マウスモデルにおいて血行動態機能を回復させ（図２１）、上記マウスモデルにおいて不全心筋におけるアポトーシス細胞死を防止する（図２２）ｉｎ ｖｉｖｏでの有意な治療効果を発揮する。さらに、Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１ペプチドは、βＡＲに誘発される致死性の心室性頻脈性不整脈から心不全マウスを保護する（図２２）。

経胸壁心エコー検査。
２次元誘導（guided）Ｍ−モード及びドップラー心エコー検査を、以前に記載されたように、覚醒マウスにおいてＨＤＩ５０００心エコー検査装置（ATL、Bothell, WA）を使用して実施した（Kohout et al., 2001, Circulation 104:2485-2491）。３回の独立した心エコー検査の測定値を、両方のモードで取得した。収縮終期の左室腔直径（ＬＶＥＳＤ）、及び拡張終期の左室腔直径（ＬＶＥＤＤ）、心室中隔厚（ＩＶＳｔｈ）、拡張終期の左室後壁厚（ＬＶＰｔｈ）、並びにＬＶ短縮率（ＦＳ％）を、乳頭筋のレベルで短軸Ｍ−モードビュー（M-modeview）において決定した。ＦＳ％＝［（ＬＶＥＤＤ−ＬＶＥＳＤ）／ＬＶＥＤＤ］×１００（％）。ＬＶ駆出時間（ＬＶＥＴ）、及び大動脈弁ドップラー測定から取得した心拍数（ｂｐｍ）を使用して、心拍数で補正した円周方向線維短縮の平均速度を評価した：平均Ｖｃｆｃ＝ＦＳ％／ＥＴ×√６０／ｂｐｍ×１０（周（circ）／秒）。

心臓カテーテル処置及び血行動態評価。
自発呼吸する軽く麻酔した（anesthesized）マウス（トリブロモエタノール／アミレン水和物；アバチン；２．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）、８μｌ／ｇ（ＩＰ））における経胸壁２次元心エコー検査（ＴＴＥ）を、偽マウス及び梗塞マウスの両方において１２ＭＨｚプローブを用いて行った。ＭモードでのＴＴＥを、外科処置の前後（７日及び２８日）に傍胸骨の短軸において実施して、ＬＶ直径及び引き続き短縮率（ＦＳ％＝［（ＬＶＥＤＤ−ＬＶＥＳＤ）／ＬＶＥＤＤ］×１００）を評価した。同じ麻酔下で、１．４フレンチマイクロマノメータが先端に付いたカテーテル（ＳＰＣ−３２０、Millar instruments, Inc.）を、右頚動脈中に挿入した後、ＬＶ中まで進めた。心拍数（回／分）、ＬＶ拡張終期圧（ＬＶＥＤＰ）、並びにＬＶ圧の最大一次導関数（ＬＶ ＋ｄｐ／ｄｔ_ｍａｘ）及び最小一次導関数（ＬＶ ｄｐ／ｄｔ_ｍｉｎ）を含む血行動態解析を行った。

心筋の組織病理学検査及びアポトーシス
ＬＶ組織を、凍結して切り出し（cryosectioned）（５μｍ）、ヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）で染色して、ＬＶの遠隔の非梗塞性領域において筋細胞の幅を測定し、ＮＩＨ画像ソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ １．３４、http:/rsb.info.nih.gov/ij）を使用して、長軸方向に切り出した筋細胞において核のレベルでの尺度を取得した。末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介性ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）染色を、製造業者のプロトコル（Roche、１１６８４７９５００１）に従って実施した。遠隔領域におけるＴＵＮＥＬ陽性心筋細胞核の数を、オリンパス株式会社のＩＸ７０倒立顕微鏡（T.I.L.L. Ｖｉｓｉｏｎソフトウェア、バージョン３．３）を用いて計測し、同じ切片においてＨＥ染色により特定された１０^５個の総核数当たりの数値に正規化した。心臓起源の細胞又は物体（bodies）を特定するために、切片を、心臓特異的抗トロポニンＣ抗体（SantaCruz、ｓｃ−８１１７、希釈率１：５０）、及びロバ抗ヤギアレクサフルオル５６８（MolecularProbes、１：１００）の対応する対で二重染色した（データは示していない）。心筋組織におけるカスパーゼ３活性を、カスパーゼ−Ｇｌｏアッセイキット（Promega）を使用して測定した。簡潔に述べると、発光前（proluminescent）基質がカスパーゼ３により切断される。カスパーゼによる切断の後、ルシフェラーゼに対する基質（アミノルシフェリン）が放出され、ルシフェラーゼ反応、及び発光シグナルの産生をもたらす。心臓組織由来の細胞質抽出物を、プロテアーゼ阻害剤混合物（１錠／５ｍｌ）（Roche；ＭｉｎｉコンプリートＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤）を含有する低張抽出緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＥＧＴＡ）中における均質化により調製した後、遠心分離した（１５分、１３０００ｒｐｍ、４℃）。上清のタンパク質濃度を、抽出緩衝液により１ｍｇ／ｍｌに調整し、−８０℃で保存した。等体積の試薬、及び１０μｇ／ｍｌの細胞質タンパク質を、白色の壁の９６ウェルプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。各試料の発光を、プレートリーディングルミノメーターにおいて三連で測定した。

不整脈誘発プロトコルは、Wayne Chen及び共同研究者らにより以前に公開されたプロトコル（Xiao etal., 2007, J. Biol. Chem. 282:34828-34838）から修正したものである。

実施例６：正常な骨格筋におけるＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１ペプチドの機能的特性決定
Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１ペプチドは、正常な及び罹患した骨格筋において等尺性単収縮力を有意に増強する（図２４）。骨格筋線維における等尺性単収縮力を評価するのに使用したプロトコルを、実施例１に記載している。Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１ペプチドの実験のために、未処理の（透過処理していない）長指伸筋（ＥＤＬ）骨格筋線維を使用した。単離した筋線維の単収縮力は、ペプチドを単離した筋線維とともにインキュベートしたかどうか（図２４Ａ）、又は筋線維を単離する前にペプチドを全身投与したかどうか（図２４Ｂ）に関係なく、Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１処理により増強された。

実施例７：Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１ペプチドの変力効果は、より短いペプチドによっても発揮される。
親水性要素（Ｄ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ、配列番号１７）と融合したヒトＳ１００Ａ１のアミノ酸７６〜８５からなるペプチドは、Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１ペプチドと同じ変力機能を発揮する（図２５）。カルシウム過渡振幅を評価するためのプロトコルを、上に記載している。疎水性要素単独、ビヒクル単独、又はアミノ酸７６以降の（morethan）アミノ酸を欠くアミノ末端欠失ペプチドは、変力効果を示さない。この実験により、７６位のチロシンがＳ１００Ａ１ｃｔ_６／１１ペプチドの変力機能及び細胞透過性のために必須ではないことが実証される。

実施例８：そのＮ末端で６ｍｅｒペプチド（Ｄ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ）と結合する、一次ヒトＳ１００Ａ１タンパク質配列のａａ７９〜８２のコアモチーフを包含するペプチドは、Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１ペプチドの細胞内効果を完全に模倣する。
ラット心室心筋細胞を、本発明者らにより以前に公開されたような標準手順（Most et al., J Clin Invest. 2004; 114(11):1550-63）を用いて単離し、培養した。２０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣＬ（ｐＨ７．０）と５０％のＤＭＳＯとの混合物に溶解したペプチドを、ＦＵＲＡ２−ＡＭを負荷した細胞に、カルシウム過渡応答の評価の３０分前に添加した。２Ｈｚでの電界刺激カルシウム過渡応答の測定を行い、本発明者らにより詳細に記載されたように解析した（Pleger and Most et al., Circulation. 2007 May15;115(19):2506-15）。

図中英語
図１
SEQ ID NO: 配列番号
protein タンパク質
peptide ペプチド
EF-Hand ＥＦハンド
図２
Kyte-Doolittle Scale (hydrophobicity) カイト・ドーリトル尺度（疎水性）
Hydrophobicity 疎水性
C-terminus Ｃ末端
Amino Acid Number アミノ酸番号
Window Size ウインドウサイズ
図４
Transmission 透過
C-terminus Ｃ末端
図５
control 対照
protein タンパク質
Events/μm/sec 事象／μｍ／秒
sec 秒
図６
control 対照
Events/μm/sec 事象／μｍ／秒
sec 秒
図７
M. ext. dig. longum 長指伸筋
rel. force 相対力
arbitrary units 任意単位
protein タンパク質
control 対照
time(s) 時間（秒）
peptide ペプチド
図８
transmission 透過
Endogenous S100A1 内在性Ｓ１００Ａ１
図９
calcium カルシウム
sec 秒
min 分
time 時間
図１０
SEQ ID NO: 配列番号
Calcium transient amplitude カルシウム過渡振幅
FURA 340/380 ratio counts ＦＵＲＡ ３４０／３８０のカウント比
control 対照
inotropic effect 変力効果
図１１
Calcium transient amplitude カルシウム過渡振幅
FURA 340/380 ratio counts ＦＵＲＡ ３４０／３８０のカウント比
control 対照
SEQ ID NO: 配列番号
図１２
Calcium amplitude カルシウム振幅
FURA 340/380 ratio, 0.15 arbitrary units ＦＵＲＡ ３４０／３８０比、０．１５任意単位
control 対照
caffeine カフェイン
図１３
control 対照
Calcium transient amplitude カルシウム過渡振幅
FURA 340/380 ratio counts ＦＵＲＡ ３４０／３８０のカウント比
図１４
control 対照
Events/μm/sec 事象／μｍ／秒
図１５
Isoproterenol イソプロテレノール
caffeine カフェイン
control 対照
normal diastolic Ca 正常な拡張期Ｃａ
Events/μm/sec 事象／μｍ／秒
図１６
caffeine カフェイン
control 対照
Dead cells/total cells ratio norm. to K0 Ｋ０に対して正規化した（norm.）死細胞／総細胞の比
図１７
min 分
図１８
LV contractile performance ＬＶの収縮能力
Control 対照
min 分
Heart rate 心拍数
beats/min 拍動数／分
図１９
Control 対照
awake 覚醒
Metoprolol メトプロロール
min 分
図２０
LV contractile performance ＬＶの収縮能力
min 分
Metoprolol メトプロロール
Heart rate 心拍数
beats/min 拍動数／分
Control 対照
図２１
control (vehicle i.p.) 対照（ビヒクルｉ．ｐ．投与）
Pre-MI ＭＩ前
7d post-MI ＭＩの７日後
14d post-MI ＭＩの１４日後
% death in HF mice 2 weeks after myocardialischemia 心筋虚血の２週間後のＨＦマウスの死亡率（％）
control 対照
図２２
control 対照
TUNEL positive nuclei/HPF ＴＵＮＥＬ陽性核／ＨＰＦ
図２３
control 対照
Epinephrin エピネフリン
Caffeine カフェイン
% HF mice with VF after epinephrin/caffeineinjection エピネフリン／カフェイン注射後におけるＶＦを有するＨＦマウス（％）
図２４
EDL (normal mice)/extracellular S100A1ct _6/11application ＥＤＬ（正常なマウス）／Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１の細胞外適用
Specific isometric twitch force 比等尺性単収縮力
control 対照
Specific tetanic force 比強縮性単収縮力
EDL (HF mice)/systemic i.p. S100A1ct_6/11application ＥＤＬ（ＨＦマウス）／Ｓ１００Ａ１ｃｔ_６／１１の全身（ｉ．ｐ．）適用
図２５
Calcium transient amplitude in FURA2 AMloaded cells ＦＵＲＡ２ ＡＭを負荷した細胞におけるカルシウム過渡振幅
340/380 ratio counts ３４０／３８０のカウント比
Control 対照
linker リンカー
vehicle ビヒクル
図２６
Calcium transient amplitude カルシウム過渡振幅
control 対照

Claims (20)

1. 親水性ドメイン、及び／又は１つ又は複数の膜浸透増強ドメイン、及びＳ１００Ａ１タンパク質由来のドメインを含む、又はそれからなる陽性変力ペプチドであって、前記Ｓ１００Ａ１タンパク質由来のドメインが、アミノ酸配列Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ（配列番号１８）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ（配列番号１９）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ（配列番号２０）、Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２１）、及びＶ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２９）からなる群から選択され、前記ペプチドが、Ｓ１００Ａ１タンパク質の２０アミノ酸Ｃ末端領域に含まれる９個以下の連続するアミノ酸を含有し、該ペプチドが最大２０アミノ酸の完全長を有し、該ペプチドが陽性変力作用を示す、陽性変力ペプチド。
2. Ｓ１００Ａ１タンパク質由来のドメインを含む、又はそれからなる陽性変力ペプチドであって、前記Ｓ１００Ａ１タンパク質由来のドメインが、アミノ酸配列Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ（配列番号１８）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ（配列番号１９）、Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ（配列番号２０）、Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２１）、及びＶ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号２９）からなる群から選択され、前記ペプチドが、Ｓ１００Ａ１タンパク質の２０アミノ酸Ｃ末端領域に含まれる９個以下の連続するアミノ酸を含有し、該ペプチドが最大２０アミノ酸の完全長を有する、陽性変力ペプチド。
3. 親水性ドメイン、膜浸透増強ドメイン、１つ又は複数のエピトープタグ、及びペプチド標的化ドメインからなる群から選択される要素のうちの１つ又は複数を更に含む、請求項１又は２に記載のペプチド。
4. 前記親水性ドメインのＣ末端が、直接又は間接的に前記変力ドメインのＮ末端に連結し、該Ｎ末端に連結するアミノ酸が疎水性の非芳香族アミノ酸ではない、請求項１又は３に記載のペプチド。
5. 前記親水性ドメインが酸性の、塩基性の、及び／又はそうでなくとも負に若しくは正に荷電したアミノ酸を含む、請求項１又は３〜４のいずれか一項に記載のペプチド。
6. 前記親水性ドメインが、親水性アミノ酸モチーフ：
   Λ−Λ−Λ−Λ−Θ−Θ
   （式中、Λはアスパラギン酸、グルタミン酸、リジン及びアルギニンからそれぞれ独立して選択され、Θはα−ヘリックス遮断因子であり、又はプロリン若しくはグリシンからそれぞれ独立して選択される）を含む、又はそれからなる、請求項１又は３〜５のいずれか一項に記載のペプチド。
7. 前記親水性ドメインが、アミノ酸配列：
   ［Ｄ／Ｅ］−［Ｋ／Ｒ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｄ／Ｅ］−［Ｐ／Ｇ］−［Ｐ／Ｇ］（配列番号３）を含む、又はそれからなる、請求項１又は３〜６のいずれか一項に記載のペプチド。
8. 前記親水性ドメインが、アミノ酸配列：
   Ｄ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ（配列番号１７）を含む、又はそれからなる、請求項１又は３〜７のいずれか一項に記載のペプチド。
9. 前記膜浸透増強ドメインが、タンパク質形質導入ドメイン又は両親媒性ペプチドに由来する膜浸透増強ドメインを含む、請求項１又は３〜８のいずれか一項に記載のペプチド。
10. 前記膜浸透増強ドメインが、ＨＩＶ Ｔａｔペプチド、ペネトラチンペプチド、トランスポータンペプチド、ＭＰＧ／Ｐｅｐファミリーの成員のペプチド、又はアルギニンリッチペプチドに由来する膜浸透増強ドメインを含む、請求項１又は３〜９のいずれか一項に記載のペプチド。
11. 前記ペプチドが、アミノ酸配列Ｄ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号３２）、Ｄ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ（配列番号３４）、Ｄ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ−Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ−Ｖ（配列番号３５）、Ｄ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ−Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｔ（配列番号３６）、及びＤ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｐ−Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｌ（配列番号３７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、又はそれからなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のペプチド。
12. 前記Ｓ１００Ａ１タンパク質由来のドメインが前記ペプチドのＣ末端に位置する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のペプチド。
13. 膜浸透増強ドメイン、１つ又は複数のエピトープタグ、及びペプチド標的化ドメインからなる群から選択される要素のうちの１つ又は複数を更に含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のペプチド。
14. マーカー部分を更に含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のペプチド。
15. 医学的使用のための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のペプチド。
16. 後天性又は先天性の心臓障害又は骨格筋障害の治療又は予防における使用のための請求項１〜１５のいずれか一項に記載のペプチド、又は請求項１〜１５のいずれか一項に記載のペプチドと、薬学的に許容可能な添加物、担体及び／又は希釈剤とを含む医薬組成物。
17. 前記心臓障害が、虚血後収縮機能不全、急性及び慢性の心臓収縮機能不全及び心臓拡張機能不全、うっ血性心不全、細胞生存障害及び電気的興奮性亢進、心原性ショック、敗血症ショック、心筋梗塞、心筋症、心臓弁の機能不全、並びに心室障害からなる群から選択される、請求項１６に記載のペプチド又は医薬組成物。
18. 前記骨格筋障害が、筋ジストロフィー、心不全関連の骨格筋機能不全、筋力低下、筋萎縮症、筋炎、セントラルコア病、ネマリン桿状体筋症、中心核筋細管筋症、眼の眼筋麻痺、ミトコンドリア筋症からなる群から選択される、請求項１７に記載のペプチド又は医薬組成物。
19. 請求項１〜１６のいずれか一項に記載のペプチドと、薬学的に許容可能な添加物、担体及び／又は希釈剤とを含む医薬組成物。
20. カテコールアミン、β−アドレナリン受容体作動薬及びβ−アドレナリン受容体遮断薬からなる群から選択される活性成分を更に含む、請求項１９に記載の医薬組成物。

Images