JP6404213B2 - ホスホランバンのプロテインホスファターゼ1媒介の脱リン酸化抑制用デコイペプチド{DecoyPeptidesInhibitingProteinPhosphatase1−MediatedDephosphorylationofPhospholamban} - Google Patents
ホスホランバンのプロテインホスファターゼ1媒介の脱リン酸化抑制用デコイペプチド{DecoyPeptidesInhibitingProteinPhosphatase1−MediatedDephosphorylationofPhospholamban} Download PDFInfo
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Description
本出願は、2012年7月5日に出願された米国仮特許出願US 61/668,034から優先権主張を伴い、上記仮特許出願に開示された内容は、本明細書に参照により組み込まれる。
公共基金研究に関する陳述
本発明は、大韓民国政府(MEST)によって出資されたグローバル研究室プログラム(M6−0605−00−0001)、GISTのSystems Biology Infrastructure Establishment Grant、及びNIH(HL−080498−1)の後援を受けた。
本発明は、プロテインホスファターゼ1媒介のホスホランバンの脱リン酸化を抑制することができるホスホランバンのデコイペプチドまたはポリペプチド、その用途及び製造方法に関する。
X1−Ala−X2−X3−Ile−Glu−X4 (I)
上記X1は、0〜50個のアミノ酸残基、上記X2は、Ser、GluまたはAsp、上記X3は、Thr、GluまたはAsp、上記X4は、0〜50個のアミノ酸残基を示し、上記X3がThrの場合、X2はSerではなく;上記デコイペプチドまたはポリペプチドは、競争的阻害によってPLB(ホスホランバン)のPP1(プロテインホスファターゼ1)媒介の脱リン酸化を抑制する。
X1−Ala−X2−X3−Ile−Glu−X4 (I)
リン酸化されたPLBを模倣して設計された本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドは、PLBのPP1媒介の脱リン酸化を抑制し、PLBのリン酸化レベルを顕著に増加させ、収縮性パラメータを増加させることで、左心室の弛緩期圧力を顕著に向上する。本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドは、不全性心臓(failing heart)でのSERCA2a活性の回復のための代替様式を提供する。
(a)本発明は、競争的阻害によってPLBのPP1媒介の脱リン酸化を抑制することができるデコイペプチドまたはポリペプチド、その製造方法、及び本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドを有効成分として含むPLB関連疾病の予防または治療用の薬剤学的組成物を提供する。
(b)本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドがPP1媒介の脱リン酸化の抑制によって、PLBのリン酸化レベルを顕著に増加させることは注目に値する。また、上記デコイペプチドまたはポリペプチドは、SERCA2a活性の回復による心臓保護効果及び心筋収縮性向上の強心効果を提供する。
(c)本発明は、PLB関連疾病の予防または治療に寄与することができる。
配列表の配列番号1は、Arg−Ala−Glu−Thr−Ile−Glu−Met−Pro−Glnである。
配列表の配列番号2は、Arg−Ala−Ser−Glu−Ile−Glu−Met−Pro−Glnである。
配列表の配列番号3は、Arg−Ala−Asp−Thr−Ile−Glu−Met−Pro−Glnである。
配列表の配列番号4は、Ala−Glu−Thr−Ile−Glu−Met−Pro−Glnである。
配列表の配列番号5は、Arg−Ala−Glu−Thr−Ile−Glu−Metである。
配列表の配列番号6は、Arg−Ala−Glu−Thr−Ile−Gluである。
X1−Ala−X2−X3−Ile−Glu−X4 (I)
上記X1は、0〜50個のアミノ酸残基、上記X2は、Ser、GluまたはAsp、上記X3は、Thr、GluまたはAsp、上記X4は、0〜50個のアミノ酸残基を示し、上記X3がThrの場合、X2はSerではないステップ;及び(b)上記ステップ(a)で設計されたデコイペプチドまたはポリペプチドを製造するステップを含む競争的阻害によって、PLBのPP1媒介の脱リン酸化を抑制する本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドを製造する方法を提供する。
ステップ(a):デコイペプチドまたはポリペプチドの設計
本発明によれば、まず、PLBアミノ酸配列(配列番号10)の16番目のアミノ酸であるSer残基及び/または17番目のアミノ酸であるThr残基をGluまたはAspで置換し、上記PLBアミノ酸配列(配列番号10)の15〜19番目のアミノ酸周辺の周囲アミノ酸残基を0〜95個選択することによって、PLBのデコイペプチドまたはポリペプチドを設計する。上記設計されたデコイペプチドまたはポリペプチドは、一般式I(X1−Ala−X2−X3−Ile−Glu−X4)で表されるペプチド配列で構成され、上記X1は、0〜50個のアミノ酸残基、上記X2は、Ser、GluまたはAsp、上記X3は、Thr、GluまたはAsp、上記X4は、0〜50個のアミノ酸残基を示し、上記X3がThrの場合、X2はSerではない。
ステップ(a)の実施後、設計された本発明のデコイペプチドまたはポリペプチドを製造する。
デコイペプチド
本発明のデコイペプチドは、リン酸化部位であるSer16及びThr17周辺のPLBタンパク質配列(配列表の配列番号10)から誘導した:RAS16T17IEMPQ。上記ペプチドは、細胞内への流入促進のためにシステイン−システイン結合によって細胞透過ペプチドTAT(YGRKKRRQRRR:配列表の配列番号11)をN末端にコンジュゲートした。本発明で使用したペプチドは次のとおりである:PLB−wt,RASTIEMPQ(配列表の配列番号8);ψPLB−SE, RAETIEMPQ(配列表の配列番号1);ψPLB−TE,RASEIEMPQ(配列表の配列番号2); ψPLB−SD,RADTIEMPQ(配列表の配列番号3)。また、下記の短縮されたψPLB−SEペプチドも実験した:8−mer,AETIEMPQ(配列表の配列番号4);7−mer,RAETIEM(配列表の配列番号5);6−mer,RAETIE(配列表の配列番号6);5−mer,RAETI(配列表の配列番号7)。上記のすべてのペプチドをエニゼン社(大韓民国)で合成及び修飾し、1mMのストック濃度で蒸留水に溶解した。ペプチドは >95%純粋だった。上記デコイペプチドを最終濃度1μMで1時間処理した。細胞生存率及び形態はペプチドに重大な影響を及ぼさなかった。
従来の文献[33]に開示されたところから最小限変形をして、これによってSDラットの心臓から心室心筋細胞を分離した。上記ラットは8〜12週齢の雄性ラットを使用した。簡略に説明すれば、5分間イソフルラン(0.5%)を吸入させてラットを痲酔した。上記心臓を胸部から速やかに取り除いて、100%のO2ガス下、37℃で3分間無カルシウムタイロード緩衝液(calcium−free Tyrode buffer:137mMのNaCl、5.4mMのKCl、1mMのMgCl2、10mMのグルコース、10mMのHEPES[pH7.4]、10mMの2,3−ブタンジオンモノオキシム、5mMのタウリン)を大動脈に逆に潅流した。その後、潅流溶液にコラゲナーゼタイプB(0.35U/ml;Roche社)及びヒアルロニダーゼ(0.1mg/ml;Worthington社)を添加して酵素分解を開始した。分解10分後、上記心臓が膨脹を始めるとき、左心室を速やかに取り除いて、数個のかたまりに分けた後、上記と同一の酵素溶液内で37℃で10分間60〜70rpmで撹拌してさらに分解させた。分散された心筋細胞を含む上澄み液を細胞ろ過器(細孔径 100μm、BD Falcon社)でろ過して、500rpmで1分間穏やかに遠心分離した。Ca2+逆行を避けるために、細胞外のCa2+を30分間1.25mMの濃度で逆に添加した。このような過程によって普通80%以上の収率で明確な筋節模様を有するロッド型心室心筋細胞を得た。明確な筋線維膜水疱を有するか、自発的に収縮する心筋細胞は廃棄した。
ペプチドの細胞内流入(uptake)を確認するために、FITCでψPLB−SEを標識した。上記分離した心筋細胞をラミニンコーティングされたガラスプレートに塗抹し、2mMのL−カルニチン、5mMのクレアチン、5mMのタウリン及び100IU/mlのペニシリンが補充されたHBSS(Hanks’ Balanced Salts Solution)が含有されたMEM(modified Eagle’s Medium)培地で培養した。上記細胞を1μMのFITC標識されたψPLB−SEに1時間露出させた後、タイロード溶液で二回洗浄した。63x(1.4NA)油浸対物レンズ及びフルオレセイン(fluorescein)FITC最適化フィルタセット(OmegaR Optical Inc., 米国)が装着されたLeica DMRBE顕微鏡(LabCommerce社、米国)を用いて蛍光イメージを視覚化した。CoolSNAP TMfx CCD(Photometrics社、米国)カメラを用いてイメージを得て、メタモルフイメージングソフトウェア(Universal Imaging社、米国)で分析した。
SDS試料緩衝液内の心臓溶解物(50μg)をSDS−PAGEゲルに展開させた後、PVDF膜(Bio−Rad社、米国)に移した。上記膜を5%脱脂乳(skim milk)溶液で遮断し、その後PLB(Affinity Bioreagents社、米国)、リン酸化PLB(Ser16、Cell Signaling社、米国)、リン酸化PLB(Thr17、Badrilla社、イギリス)、SERCA2a(Santa Cruz社、米国)、カスパーゼ3(Cell Signaling社、米国)、またはGAPDH(Santa Cruz社、米国)に対する抗体で一晩インキュベートした。その後、上記膜をホースラディッシュペルオキシダーゼ(horseradish peroxidase、Jackson Immuno Research社、米国)がコンジュゲーションされた2次抗体でインキュベートし、ウェスタンライティングケミルミネセンス試薬(Western Lighting chemiluminescence reagent、Perkin Elmer社、米国)を用いて現像した。
心室心筋細胞の機械的な特性は、従来の文献[34]に記載された通りにビデオ基盤のエッジ感知システム(IonOptix社、米国)を用いて評価した。簡略に説明すれば、倒立顕微鏡(Nikon Eclipse TE−100F、Nikon社、日本)の載物台に載せられたチャンバ内に細胞を付着したラミニンコーティングされたカバースリップを位置させ、37℃で約1ml/minの速度でタイロード緩衝液(137mMのNaCl、5.4mMのKCl、1mMのCaCl2、1mMのMgCl2、10mMのグルコース、10mMのHEPES[pH7.4])を潅流した。HLD−CS培養チャンバ/stimホルダー上に位置したSTIM−AT刺激装置/サーモスタット(Cell Micro Controls社、米国)を用いて3Hz(30V)の頻度で上記細胞をフィールド刺激した。IonOptix MyoCamカメラ(IonOptix社、米国)を用いて上記目的の心筋細胞をコンピュータモニタ上に表示し、毎8.3msごとに速やかにイメージ区域をスキャンした結果、短縮または再延長の振幅及び速度が忠実に記録された。短縮または再延長する間の細胞長さの変化を捕捉し、ソフトエッジソフトウェア(IonOptix社、米国)を用いて分析した。上記心筋細胞をCa2+敏感性指示計(indicator)である0.5μΜのFura2−AM(Molecular Probes社、米国)37℃で15分間置いた。蛍光放出を筋細胞カルシウム及び収縮性記録システム(Myocyte calcium and contractility recording system、IonOptix社、米国)を用いて収縮性の測定と同時に記録した。上述したように、フィールド刺激する間、340または380nmフィルターを通じた75Wハロゲンランプによって放出される光に心筋細胞を露出した。340nmで0.5秒間初期照光した後、フォトマルチプライヤーチューブによって480及び520mで蛍光放出を探知した後、380nmで記録プロトコルの持続期間の間、蛍光放出を探知した。プロトコルの終了時点で上記340nm励起スキャンを繰り返し、二つの波長でのFura蛍光強度の割合から細胞内Ca2+濃度の質的変化を推論した。
イソフルラン(0.5%)を5分間吸入させてラットを痲酔した。心臓を速やかに取り除いた後、冷却過酸化タイロード溶液(137mMのNaCl、5.4mMのKCl、1mMのMgCl2、10mMのグルコース、1mMのCaCl2、10mMのHEPES[pH7.4]、100%のO2)に位置させた。大動脈にキャニュラーを挿入し、一定の圧力(65mmHg、37±0.2℃)でランゲンドルフ法によって過酸化タイロード溶液を潅流した。心臓機能の継続的な測定のために水で満たされたラテックスバルーンを左心室チャンバに挿入し、圧力トランスデューサー(AD Instruments社、米国)を連結した。パワーラブチャートシステムズ(AD Instruments社、米国)を用いて心拍動、左心室の弛緩期圧力(LVDP)及び左心室圧の一次導関数(最大LV+dP/dt及び最大LV−dP/dt)を全部記録した。測定された最後の弛緩期圧力が6〜10mmHgの範囲になるように上記バルーンの体積を約250〜300μlに調節した。30分の安定期後、全般的な虚血誘導のために20分間上記心臓の潅流を中止し、その後30分間再潅流させた。最終濃度1μΜでデコイペプチドを潅流させた。
適切な評価のために平均±SDでデータを表示した。Student’s t−testまたはボンフェローニ補正(Bonferroni correction)を装着した一元配置分散分析(one−way ANOVA、Ststview version 5.0、SAS社、米国)を用いて各群の平均を比較した。P−value<0.05を統計学的に有意なものと見なした。
デコイペプチド
PLBはN末端に細胞質ヘリックス、C末端に膜貫通ヘリックス、そして上記二つのヘリックスを連結する流動的なループを含む(図1、左側)。リン酸化部位は上記連結ループ部分内のSer16及びThr17残基である。本発明者らは、ループ地域の9個のアミノ酸と正確にマッチングされる配列である9−merペプチド(RASTIEMPQ、配列表の配列番号8)を合成し、ジスルフィド結合によって細胞透過ペプチドTATと結合させて、ψPLB−wtを製造した。また、本発明者らは、TAT結合された類似ペプチドを製造したが、これはPLBのSer16またはThr17と相応するSerまたはThr残基それぞれをGluで代替したψPLB−SEまたはψPLB−TEである(図1a、右側)。上記ペプチドをFITCで標識して、ラット左心室から分離して培養した心筋細胞に添加した。蛍光顕微鏡下で観察した結果、ほとんどすべての心筋細胞内に上記ペプチドが効果的に流入されたことが分かった(図1b)。上記実験によって、上記心筋細胞が効果的に本発明のペプチドを吸収することを確認し、標識していないペプチドは、その後の実験で使用した。
本発明者らは、次にψPLB−SEが心筋細胞の収縮性に影響を及ぼすか否かを試験した。分離した成体心筋細胞をペプチドで前処理して、PMAで処理した。ピーク短縮を含む収縮性パラメータの減少及び収縮と弛緩速度で示すように、PMAは収縮性をかなり減少させた。ψPLB−wt及びψPLB−TEが収縮性においてないか軽微な効果を示すのに対し、ψPLB−SEは、収縮性のPMA誘導された減少を完璧に防止した(図2a)。PMAはまた、Ca2+一過性増幅の顕著な減少及びCa2+一過性減少の時定数(τ)の顕著な増加を誘発した。ψPLB−wt及びψPLB−TEの細胞内Ca2+調節に対する効果が、無視しても良い程度または僅かな程度であるのに対し、ψPLB−SE前処理は、上記PMA誘導された欠陷を完全に転換させた(図2b)。このようなデータは、ψPLB−SEの前処理によって内因性PLBの復元されたリン酸化レベルが収縮性を正常化させることを示す。ψPLB−SD及びψPLB−6−merは、いずれも収縮性維持及びカルシウムイオンの調節にψPLB−SEと同様に効果的だった(図2c及び2d)。
本発明者らは、さらに、エクスビボで虚血/再潅流(I/R: ischemia/reperfusion)中のψPLB−SEの利点を実験した。ラットの心臓をランゲンドルフ潅流し、全般的な虚血誘導のために20分間潅流を中止した後、30分間再潅流した。I/Rは左心室の弛緩期圧力を顕著に低下させた(37〜44mmHg vs.虚血前 80〜100mmHg)。再潅流時点で、ψPLB−SEまたは対照群ペプチドTATを再潅流溶液に添加した。TATは効果がなかったのに対し、ψPLB−SEは弛緩期圧力を顕著に増加させた(73〜78mmHg)(図3a)。実験の終了時点で、心臓溶解物を製造してウェスタンブロッティングを行った。I/RはSer16及びThr17いずれにおいてもPLBのリン酸化をかなり減少させ、ψPLB−SEはSer16でのリン酸化を顕著に回復させた。また、I/Rは細胞死滅に関連するカスパーゼ3を活性化させ、ψPLB−SEはこのような結果を完璧に逆行させた(図3b)。総括的に、このようなデータはψPLB−SEがSer16でPLBのリン酸化レベルを増加させることによって、少なくとも部分的でもI/R後の機能的な回復を向上することを示す。
SERCA2aは心筋細胞で細胞内Ca2+調節の決定的な調節子であり、心不全及びI/R損傷での上記SERCA2aの役割はよく確立されている[6]。したがって、SERCA2aレベル及び/または活性の正常化様相は、重要な治療的潜在要素になることができる。不全性心臓で抑制されたSERCA2aレベルの遺伝子移動媒介の回復が一つの接近になることができる。このような接近は、心不全動物モデルで効果的であり[13−16]、最近末期ヒト心不全患者において安全で効果的であることが明らかになった[17、18]。
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Claims (8)
- 配列表の配列番号1ないし配列番号6のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなるデコイペプチドまたはポリペプチドであって、
前記デコイペプチドまたはポリペプチドは、競争的阻害によってPLB(ホスホランバン)のPP1(プロテインホスファターゼ1)媒介の脱リン酸化を抑制するデコイペプチドまたはポリペプチド。 - 配列表の配列番号1ないし配列番号6のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と、細胞膜透過性ペプチドとからなるデコイペプチドまたはポリペプチドであって、
前記配列表の配列番号1ないし配列番号6のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と、前記細胞膜透過性ペプチドとが結合されており、
前記デコイペプチドまたはポリペプチドは、競争的阻害によってPLB(ホスホランバン)のPP1(プロテインホスファターゼ1)媒介の脱リン酸化を抑制するデコイペプチドまたはポリペプチド。 - 前記配列表の配列番号1ないし配列番号6のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列は、ジスルフィド結合によって前記細胞膜透過性ペプチドに結合されていることを特徴とする請求項2に記載のデコイペプチドまたはポリペプチド。
- 下記一般式Iで表されるペプチド配列からなるデコイペプチドまたはポリペプチド:
X 1 −Ala−X 2 −X 3 −Ile−Glu−X 4 (I)
前記X 1 は、存在しないまたはArgを示し、前記X 2 は、Ser、GluまたはAspを示し、前記X 3 は、ThrまたはGluを示し、前記X 4 は、存在しない、Met、Met−ProまたはMet−Pro−Glnを示し、前記X 3 がThrの場合、X 2 はSerではなく;
前記デコイペプチドまたはポリペプチドは、競争的阻害によってPLB(ホスホランバン)のPP1(プロテインホスファターゼ1)媒介の脱リン酸化を抑制する。 - 下記一般式Iで表されるペプチド配列と、細胞膜透過性ペプチドとからなるデコイペプチドまたはポリペプチド:
X 1 −Ala−X 2 −X 3 −Ile−Glu−X 4 (I)
前記X 1 は、存在しないまたはArgを示し、前記X 2 は、Ser、GluまたはAspを示し、前記X 3 は、ThrまたはGluを示し、前記X 4 は、存在しない、Met、Met−ProまたはMet−Pro−Glnを示し、前記X 3 がThrの場合、X 2 はSerではなく;
前記一般式Iで表されるペプチド配列と、前記細胞膜透過性ペプチドとが結合されており、
前記デコイペプチドまたはポリペプチドは、競争的阻害によってPLB(ホスホランバン)のPP1(プロテインホスファターゼ1)媒介の脱リン酸化を抑制する。 - (a)請求項1から5のいずれかに記載のデコイペプチドまたはポリペプチドの薬剤学的有効量;及び(b)薬剤学的に許容される担体を含むPLB関連疾病の予防または治療用の薬剤学的組成物。
- 前記PLB関連疾病は、心臓疾患であることを特徴とする請求項6に記載の薬剤学的組成物。
- 前記心臓疾患は、心不全、虚血、不整脈、心筋梗塞、うっ血性心不全、移植拒絶、異常な心臓収縮または異常なCa 2+ 代謝であることを特徴とする請求項7に記載の薬剤学的組成物。
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