BR112015023287A2 - inibição da fibrose pulmonar com nutlin-3a e peptídeos - Google Patents

Abstract

inibição da fibrose pulmonar com nutlin-3a e peptídeos em fibroblastos pulmonares fibróticos, níveis basais de proteína p53 (e mir-34a) são marcadamente suprimidos, o que leva à redução da inibição mediada por p53 de upa e upar, ou indução concomitante de pai-1. estas alterações contribuem para a proliferação excessiva de fl-fibroblastos e produção de matriz extracelular (ecm), e, por conseguinte, a fibrose pulmonar. estes processos são revertidos pelo tratamento das células, e o tratamento de sujeitos que sofrem de fibrose pulmonar idiopática (ipf), com a pequena molécula orgânica nutlina-3a (ntl) ou com um peptídeo, csp-4 (seq id no: 1), ou variantes ou derivados ou mul tímeros deste peptídeo, o que aumenta os níveis de p53 por inibição da degradação mediada por mdm2 da proteína p53. a utilização destes compostos serve como uma nova abordagem para o tratamento de ipf, conforme restauram a expressão de p53 e alterações mediadas por p53 no sistema upa-fibrinolítico em flfibroblastos e restringem a produção e deposição de ecm

Description

USO DE UMA COMPOSIÇÃO NA FABRICAÇÃO DE UM MEDICAMENTO PARA O TRATAMENTO DE FIBROSE

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Campo da Invenção [1] A presente invenção no campo da bioquímica e medicina é dirigida aos métodos e composições para aumentar os níveis de proteína p53, reduzindo uPA e uPAR e aumentar a expressão de PAI-1, em fibroblastos de pulmão fibrótico (FL) e reduzindo a sua proliferação, e para o tratamento de fibrose pulmonar idiopática (IPF) usando nutlin-3a e peptídeos.

Descrição da Técnica Anterior [2] Fibrose pulmonar idiopática (IPF) é uma doença pulmonar progressiva e fatal mal entendida para a qual não existe um tratamento diferente do transplante pulmonar (Mason DP et al, Ann Thorac Surg 84: 1121-8, 2007) . A sobrevivência média de cinco anos após o diagnóstico é menos do que 20%. A maioria das formas de doenças pulmonares intersticiais e outras formas de fibrose pulmonar é caracterizada por lesões fibróticas, ocorre distorção progressiva da arquitetura alveolar e substituição com tecidos fibróticos ou cicatriciais com excesso de deposição de matriz extracelular (ECM) (American Thoracic Society, Am J Respir Crit Care Med 161: 646-664, 2000; Noble PW et al, Clin Chest Med 25: 749-758, 2004; Selman M et al, Ann Intern Med 134: 136-151, 2001) . Isto resulta em dispnéia progressiva e perda de função pulmonar. Uma lesão morfológica marcante é heterogeneidade espacial e temporal incorporando áreas de pulmão normal sendo diretamente adjacente às áreas de fibrose plenamente estabelecida, faveolamento microscópico, e áreas de fibrose evoluindo contendo fibroblastos/miofibroblastos ativamente se proliferando e produtores de colágeno, os chamados focos fibróticos.

Petição 870170017557, de 16/03/2017, pág. 7/10 [3} IFF é a doença pulmonar intersticial crônica, progressiva e fatal mais comum de aticlogia desconhecida com. uma incidência estimada de 40-50 casos por 100,000 indivíduos nos Estados Unidos. Aumento de viabilidade, ativação, produção de fibroblastos pulmonares fibrótioos (FL^W) (ou miofibroblastos}) e deposição de ECM tipificam pulmões IFF (Selman M et al, Expert Opin Emerg Drugs 16: 341-62, 2011; Shetty, S st al, Am J Respir Cell Mol Biol 75: '78-8?, 1986; Zhu S et al, Am J Physiol: Lung Cell Mol Fhysiol 297: L97-108, 2009; Suganuma H et a.1, Thorax. 50: 984-9,1993; American Thoracic Society, supra; Noble Ph et al, supra) (4.) Trabalhos anteriores pelos presentes inventores (e outros) mostraram que os fibroblastos pulmonares incluindo ELfibroblastos des pulmões des pacientes com. FBI expressam ativador do plasminogênic tipo uroquinase (uPA), receptor de uPA, (uPAR) e inibidor de ativador do plasminogênio 1 (PAI~1) (Shetty et al, 1996, supra; Shetty S e Idell S. Am J Physiol 274: L871-L382, 1996; Chang W et al, J Bid Chem 295: 8196-206, 2010} . uPA é mifccgênica para ambos pulmão normal (NL) e FLfibroblastos, e o processo envolve a ligação de uPAR para uPA através de domínio de fator de crescimento de uPA (Tkachuk V et al, Clin Exp Pharmacol Physiol 23: 759--65, 1996; Fadró T et al, ü Cell Sei 115: 1961-71, 2002; Shetty S et al, Am J Physiol 268: L972-L982, 1995; Shetty S et al, Antisense Res Dev 5: 307-314, 1995) . Além disso, uPA aumenta a expressão de uPAR (Shetty S et al, J Biol Chem. 276: 2454 9-56, 2001; Shetty S et al, Am <J Respir Cell Mol Bid 30: 69-75, 2004). Vários anus atrás, os presentes inventores relataram qua FL-fibroblastos de pulmão IFF expressas: significativamente mais uPA e uPAR, e mostram uma maior taxa de proliferação basal e mediada por uFA que os NL-fibroblastos (Shetty et al, 1936, supra; 1998, supra). Outros grupos confirmaram que o aumento da expressão de uPAR por FLfibroblastos de pacientes com EPI contribui para o comportamento migratório (Mace KA et al, J Cell Sci 1.18: 256'7-77, 2005; Basire A et al, Thromb Haemost 95: 678 -88, 2006; Shu, S. et al, 2009, supra (5] Estudos do presente invenção e seus colegas descobriram que uBA regula a apoptose/sobrevivãnuia de células epitelíais através da regulação de p53 (Shetty S et al, 2005, supra), qua controla a expressão recíproca de uPA (Shetty P et al. Am J Resp Cell Mol Biol, 39: 364-72, 2008), o sen receptor uPAR (Shetty S et al Mol Cell Biol. 27; 5607-18, 2007} e seu principal inibidor PAI-l (Shetty S et al d Biol Chem 283: 19570-80, 2008) ao nivel pés-transcricional e envolve uma nova interação de sinalização de superfície celular entre uPA, uPAR, cavedina-1 (Cav-1) e 61-integrina (Shetty S et al, 2005, supra). Com base na apreciação do exposto, os presentes inventores conceberam novas composições e métodos para o tratamento da AVI e suas consequentes reações de remodelação.

[6] Durante fibrose pulmonar (cujo termo é usado de mudo intercambíável com fibrose pulmonar), a expressão do fator de transcrição de p53, conhecida principaimente como uma proteína supressora de tumor, ê sevoramente reprimida em fibroblastos fibrõticc-s que por sua vez Indus a expressão de uPA e uPAR, enquanto expressão de PAI-1 é inibida significativamente. A supressão da expressão de PAX-1 s a indução concomitante de expressão de uFA e uPAR, como consequência da inibição da expressão de p53 fibroblastos fibrõticos provocam a proliferação de fibroblastos e a deposição de ECM, ou seja, fibrose. O aumento da interação d.e mdm2 com p53 e subsequente ubiquitinação mediada por mdm2 de p53 contribui para a inibição de pS3 em. fibroblastos fibrôticos.

[71 A. relação reciproca entre as atividades de p33 e NE-xB fed demonstrada em células cancerígenas, mas há poucas informações sobre as interações entre p53 e NE-xB em processos inf lamatôrios. Liu G et al< (3 Immunol 182: 3083-71 (2009:; verificaram que os neutrófilos e macrófagoa sem p53 (p53''^s têm maiores respostas ac estímulo com lipopolissacarideo bacteriano (Ids) do que células p53^w-,\ e que produzem maiores quantidades de citocinas prâ-inflamatõrias, incluindo TNF-u, 1L-C, e de MIP2, e demonstram atividade aumentada de ligação de DBA a NF-κΒ. Camundongos p53são mais suscetíveis do que camundongos p53 ·*·'** para lesão pulmonar aguda .induzida por 383 ÍALI} . A resposta aumentada de células ρΰ3^<~·'~’ a IBS não envolve alterações em eventos de sinalização intracelular associados com o envolvimento do acoplamento do receptor TLB4 tipo Toll (por exemplo, a ativação de dA8 quinases, fosforilaçao de Ιχδ-εχ ou a subunidade p65 de FF- ;<B, ou a degradação de IxB-u, Cultura de neutrôfilos estimulados por LPS e maordfagos com nutlina-sa, atividade de ligação ao PNA de FF-sB atenuada e a produção de citocinas pro-inflamatórias. O tratamento de camundongos com nutlina-3a reduziu, a gravidade de AL1 induzida por 383. Cs autores concluíram que a p53 regula a atividade de BF-uB em células inflamatórias e sugeriu que a modulação de p33 pode ter potenciais benefícios terapêuticos em condições inflamatórias agudas, como ALI.

Wtlina (ou n.utlina-3a) (abreviada [8] A estrutura química da molécula orgânica 4-2-4,5-di- hídro-lH-imidazol“l~-piperazíu-2-'ona (CssHsoCIsAqOírt também denominada nutlina ou nutlina~3a é mostrada abaixo

Fórmula 1 [9] NTL é um antagonista de MDM2, que é um ativador de p33 e um indutor de apoptose. MDM2 funciona através da ligação de proteína supresscra de tumores p53 e regula negativamente a sua atividade de transcrição e a estabilidade, A inibição da interação MDM~pS3 resulta na estabilização de p53, a parada do ciclo celular e apoptose. NutXina.-3 demonstrou potencial como um tratamento do câncer através da ativação da via da p53 em células de câncer. (Tovar, C. et al, Free Natl Acad Scí USA 103: 1888-1893 (2008}; Vassilev, L.T. et al, Science 303 844-848 (2034); Bl-Deiry, W.S. Cancer 0' 11: 220-238 ( 1998)).

[10] Patente US 7.893.2'78 (Haley et al.) descreve not li na-3 guiral genericamente e especificamente. Patente US 6.734.302 descreve nutlina-3 racêmica. A patente ^%278 ensina um composto da formula

Fórmula [111 Ambas as patentes acima discutem utilizações como inibidores da interação de proteínas Mdm2~p53 e no tratamento do câncer.

[121 Publicação de Patente US 2011/0301142 (Hutchinson et al.) ensina um método para tratar a fibroso pulmonar idiopática, num mamífero compreendendo a administração de uma quantidade terapeucicamente eficaz de um antagonista do receptor LPA1 ao mamífero. 0 antagonista pode ser determinados derivados de imidazol, mas não compostos do tipo imidazolina como NTL.

[1.3] Patente üS 6.590,744 (Wagle et ai.) descreve um método de tratamento ou melhoramento de determinadas doenças fibrôticas com compostos hetexociclicos, todos os quais são claramente distintos de NTL. As doenças descritas .incluem doenças pulmonares fibróticas que têm como uma manifestação a hipertrofia fibrôtica ou fibrose do tecido pulmonar. Estas doenças incluem fibrose pulmonar (ou doença intersticial pulmonar ou fibrose pulmonar intersticial), fibrose pulmonar idíopática, elemento fibrético de pneumoconíose, sarcoidose pulmonar, alveolite fibrosante, elemento fibróticas ou hipertrófico de fibrose cistica, doença pulmonar obstrutiva crônica, síndrome de dificuldade respiratória do adulto e enfisema.

[14] Day et ai. em Cell Cycle 6: 2178-35 (2007) descreve que nutlinas foram identificadas como os primeiros antagonistas Mdm2 potentes e específicos de moléculas pequenas que inibem a interação da p53~&DM2.

[15] Denhum dos documentos anteriores descreve o tratamento de IPF com nutlina-3a.

Peptideos derivados de CaveoXina-l fiel Os presentes inventores descobriram que um peptideo de 20 resíduos DGISv’KASB'TTFTVTKY^FyK, SEQ XD NO; 2), que ê o dominíu estrutural de caveolina-1 (Cav~l.; SEQ ID NQ: 3_# mostrada abaixo) protegeu células epitelieis de pulmão {LECs) de apoptose induzida por bleomicina (BuMO in vitro e Xn vivo ® impediu a fibrose pulmonar subsequente por meio da atenuação da lesão do epitélio pulmonar (Shetty et ai, pedido de Patente üS permitido 13/398,757 publicado como OS 2Q09~0227515Al (10 de setembro de 2009) que é aqui incorporado por referência na sua totalidade. Os presentes inventores também, um peptideo de 17 resíduos NyH.¥I:ESSHTêLiTLOH (SEQ ID N0: 4), designado PP-2, que também protegeu LECs de apoptose induzida por BLM in vitro e in vivo e preveniu fibrose pulmonar subsequente por meio da atenuação da lesão do epitélio pulmonar.

[17] Shetty et ai, 2009 (supra) também descrevem a substituição biologicamente ativa, além de variantes de deleção destes peptideos, bem como multimeros de peptídeos e polipeptídeos que compreendem os peptídeos administráveis acima, e composições farmacêuticas compreendendo os peptídeos anteriores, variantes e multímeros. Essas composições inibem a apoptose de células epiteliais pulmonares lesadas ou danificadas e o tratamento de lesão pulmonar aguda e fibrose pulmonar/XPF consequente.

[18] 0 documento anterior não identifica um fragmente particular de CS? {descrito abaixo como parte da presente invenção) denominado CSP~4, que tem a sequência FTTFTVT {SEQ ID NO: 1) e que tem a atividade biológica de CSP e constitui parte do objeto da presente invenção.

[191 Em vista do prognóstico fraco e falta de abordagens terapêuticas para IPs’, há uma necessidade urgente da novas intervenções para reverter cü pelo menos retardar a progressão da doença. Esta lacuna terapêutica crítica é dirigida pela presente invenção.

[20] A presente invenção constitui e é extensão dos resultados dos achados anteriores (S. Shetty et al, 2001, 2008 e 2003, supras. Corara descrito nas seções abaixo, a p53 regala a expressão de uPA, uPAR e PAP-1 0 processe envolve o controle mediado por MDM2 da expressão da proteína p53 ao nível de p6s~ tradução,· sem. afetar o mANA de p53. Estas observações demonstram, uma relação causai entre a expressão de p53 e o sistema fíbrinolítico de uPA de reparação fibrõtica.

SWÁRXG DA ZNVENÇÃO [21] A inibição da interação da proteína p53 corn MDM2 usando NTL aumenta p53 e PAI-l, enquanto inibe uPA e uPAR. Estas modificações resultam em apoptose de fibroblastcs fibrõticcs e inibição da proliferação de fibroblastcs fibróticas isolados dos pulmões de pacientes cora IPs, bem corara a partir dos pulmões do camundongos com fibrose pulmonar acelerada induzida por BLM.

[22] De acorde oom a presente invenção, a NTL inibe fibrose pulmonar progressiva a estabelecida por indução ou aumento de expressão da p53 ora fibroblastcs fibrõticos. Portanto, este composto s útil para o tratamento de fibrose pulmonar num sujeito cora essa necessidade.

[23] Ga presentes inventores conceberam que controla mediada por p53 interrompido do sistema fibrinolítico de uPA em FLfibroblastcs d ama base para a terapia alvo do IFF. Era FLfibroblastos, a expressão basal de p53 e raicroAPú-~34a (•miR-34a) são marca.dame.nte suprimidas, enquanto os níveis de proteínas de ECM como o colãgeno~X [Col-I] e a~actina de músculo liso [o-SMA] são aumentadas. Tratamento de FL~fibroblastcs com o composto inibidor de mdmz nutllna-3a ou CSP-4 aumenta a expressão de p<53 e PAX-1 com uma inibição recíproca de uPA e uPAR. O tratamento dos FL-f ibroblastos com nutlina~3a ou. CSP-4 inibe tasbéa a produção de ECM. Estes resultados preliminares e as publicações recentes dc-s presentes inventores e colegas justificam uma abordagexa intervencionista para restaurar cross-talk entre o p53 « o sistema fibrinolítiuo de uPA que ê de outra forma distorcida em FL-fibroblastos levando a fibrose pulmonar. p53 tem efeitos pleíotrópíocs que vão além do controle do sistema fibrinolítico de uPA^-í. Ne entanto, o PAX-1 e o efetor a jusante de p53 em fibroblastos e outras células.

(241 Importante, a restauração de p53 em fibrobiastos FLmoduia a expressão de uPA, uPAR e PAI-l, a viabilidade celular e a produção de ECH. A abordagem direcionada, para o sistema, fibrínolitico p53-uPA em FL-fibroblastos ê ilustrada na Fíq. I. p53 induz transcrição de míR-34a enquanto miR-34a aumenta aoetilação de p53 através da inibição de .histona deacetllase sirtuinl iSIRTl). Isto leva a estabilização da proteína p53, devido à inibição da sua degradação mediada por mdm2. Ko entanto, em. FL-fibrc-blastc-s, os níveis basais de proteína p53 e míR-34a. são marcadamente suprimidos, devido a um aumente· da ubíquítinaçào de proteína p53 por mdm2 como uma consequência da baixa expressão basal de caveolina-1. Isto conduz a uma redução da inibição mediada, por p53 de u.PA e U.PAR, ou indução concomitante de ΡΑΙ-Ί. Estas alterações contribuem para a proliferação excessiva de FL-fibroblastos e produção de ECM e são revertidas por CSF-4 & nutlina~3a. CSP-4 e nutlina~3a aumentam os níveis de p53 por inibir a degradação mediada por mdm2 da proteína p53< Restauração da expressão de p53 e alterações mediadas per p53 no sistema fibrinolítico-uPA em FL fibroblastos leva à atenuação da viabilidade, e restringe a produção e deposição de ECM. A fibrose é inibida em camundongos desafiados por SLfí com fibrose pulmonar estabelecida através do restabelecimento dos níveis de p53 em FL-fibroblastos que, por sua ves suprime os sinais de proliferação do uPA e uFAR, enquanto induzindo o sinal pró-apoptotico para as células; FAX1.

[25] Os inventores mós tiam,· pela primeira ves, que alterações mediadas por p53 do sistema fibrinolítico-uPA regulam a resposta pró-fibrótica de fibroblastos pulmonares que são centrais para a patogênese da fibrose pulmonar e que esta via pode ser alvo de beneficio terapêutico. Ao contrário fibroblastos de pulmões histologicamente normais, FL~ fibroblastos, incluindo fibroblastos/míofíbroblastos de tecidos pulmonares fibróticas, expressam níveis muito baixos de p53 basal, mi'R~34a e caveolina-1, enquanto expressões de uPA e uPAF. são elevadas. Tratamento de FL-fibroblastos com CSP-4, ou o composto de baixo peso molecular nutlina-3a restauram expressão de pS3 e mi.R~34a, e induzem PAI-I. Estas alterações suprimem a expressão de uPA e uPAR e inibem a deposição de ECH. Estes agentes também revertem a fibrose pulmonar induzida por BLM e protegem o epitélio pulmonar, que também demonstra o cross-ieiâ entre p53 e regulação do sistema fibrinolitico. Portanto, mitigação de fibrose pulmonar mediada por CSF-4 ou mediada por nutlina~3a representam novas abordagens terapêuticas.

Atualmente, não há tratamento eficaz para reverter a fibrose pulmonar. A presente invenção aborda esta lacuna importante e proporciona novos compostos e métodos para o direcionamento de FL-fibroblastos e cross-talk entre p53 e o sistema fíbrínoliticG de uPA para tratar eficazmente a doença pulasonar fibrótica.

[27] A presente invenção também é dirigida a composições de objeto, home modalidade, a composição ê ura composto peptídico que aumenta os níveis de proteína pã3, redes uPA e aumenta a expressão de PAX-1 em FL~fibroblastos, da preferência, selecionados do grupo que consiste em:

[aj ura peptídeo designado CS.F--4 cuja sequência è FTTFTVT ÍSEQ 11) NO: 1} ;

{b} uma variante de adição do Peptídeo de CS.P-4 até cerca de 20 amincácídos de comprimento e que não o domínio estrutural (CSFj de cavedina-T (Cav-Ί) possuindo a sequência de SEQ ID NO: 3;

(c) um derivado químico modificado covalentemente do peptídeo de CSP-4 (aí, (d) ura derivado químico covalentemente modificado da variante de [b], cuja variante ou derivado químico tem, polo menos, 20% da. atividade biológica ou bioquímica do peptídeo de CSP-4 nem ensaio in vitro ou in vivo. 0 peptídeo variante, derivado químico ou multime.ro descrito acima ou abaixo de um modo preferencial tem a seguinte atividade relax ivamente à atividade de CSP-4: pelo menos cerca de 201, 30%, 40%, 50%, €0·%, 55%, 70%, 75%, 80%, 85%, 50%, cerca de 95%, 97%, 99%, e qualquer faixa entra estes, como, por exemplo, desde cerca de 70% a cerca de 80%, e mais preferencialmente do cerca de 81% a cerca de 30%; ou ainda mais preferencialmente, desde cerca de 91% a cerca de 99%. O derivado químico variante ou multímero de peptídeo poda ter 100% ou mais do que 100% da atividade do CSr~4. Esta atividade relativa pode ser baseada em qualquer método aqui descrito ou conhecida na técnica para avaliar essa atividade» [28} Dm composto preferencial é o heptapeptideo designado CSP-4, BTTFTVT (SEQ ID DO: li.

[29] Um. peptídeo muitimera preferencial compreende pelo menos dois monômeres, cada monómero sendo o peptídeo CSP-4, a variante eu α derivada químico, cuja multimerc:

íaj tem a fórmula geral Ρ\ em que (í) P^A é o peptídeo, variante au derivado químico, como (ii) n ^:::: 2-5, ou (b) tem a fórmula (Ρ⁵·~Χ»)»-Ρ², em que (i) cada um de P¹ e P¹ é, independent emente, o peptídeo, variante do derivado químico como acima, •íii} cada um dos P' e P² ê o mesmo ou diferente peptídeo, variante cu derivado (iii) X é um grupo 0.-0$ alquil, C_:r-C« alquenil, Ci~C« alquin.il, Ci-C_s poliéter contendo atè 4 átomos de oxigênio;

(iv) m ” 0 ou 1; e (v) n - 1-7, (c) tem a fórmula (iA-Gly,)_fl~P² , em quej íi) cada um. de P¹ e P'^: é, independentemente, o peptídeo, variante ou derivado, (ii) cada um dos Ρ^Λ e P² ê o mesma ou diferente peptídeo ou variante ou derivado;

(iii) z 0-6; a (iv) n ~ 1-25, em que o muXtímero de peptídeo tem de preferência pelo menos 20% da atividade biológica do peptideo de CSP-4 em um ensaio in vitro ou in vivo.

[30] Numa outta modalidade, a presents invenção é dirigida a can peptide© liberável, qu composiçao de polipeptidso ou. peptideo multImero compreendendo:

las o peptidee acima, variante, derivado, polipeptid.ee, ou multimero, e (b) uma liberação ou molécula de translocação ou fração a seta ligada ou associada ou misturada com. a mesma.

[31] Molécula© de translocação ou frações preferenciais são descritas abaixo.

[32] É também proporcionado uma composição farmacêutica antifibrôtióa compreendéndo:

(a) um carteador ou exoipiente farmaceutí©amante aceitável (b) como c ingrediente ativo, o peptídeo acima, peptide© variante, derivado químico, polipeptídeo ou peptídeo muitímero, opcionalmente em combinação ©em uma composição farmacêutica compreendendo nutlina-3s (NTL} ou um análogo quire1 cisimidasolina de NTL que inibe a interação de MDM2~pS3, cujo análogo de 'NTL< tem, pelo menos, 20% da atividade biológica ou bioquímica de NTL em um ensaio in vitro ou in vivo;

[33] Mais preferencial é a composição farmacêutica relacionada com peptide© acima formulada para Injeção ou

instílação pulmonar,	enquanto	que o NT1 ou	snálogo de	NTL
©peienaImente combinado é administração oral ou injeção.	de preferência	formulado	para
[34] A p r e se nt e	invenção	é dirigida a	um método	para

aumentar os niveis de proteina p53, redusindo uPA e uPAR e aumentar a expressão de PA.I-1 em fibroblast©© fibróticos pulmonares (Flò, que compreende proporcionar aos FL fiforoblastos uma quantidade eficaz da um composto que inibe a interação de

MDM2 com proteína p53 e degradação mediada por Μ DM2 da p53# em que o composto é: (a; NTL on ura análogo quiral cis-imidazolina da NTL que inibe a interação de MDM2~p53;

(bi um peptídeo selecionado a partir do grupo que consiste (i) CSP-4# a sequência do qual é FTTFTVT {SEQ ID NOí 1) ;

(ii) uma variante da adição do peptídeo de CSP-4 cuja variante de adição não excede 20 amínoácidos de comprisiento#· (iií) um derivado químico covalentemente modificado do peptídeo de CSr~4# ou (cj um muitimero de peptídeo que compreende pelo menos dois monômeros cada monômero sendo o peptídeo CS.P-4# a variante ou o derivado químico de (b) , ou (d) uma combinação de qualquer um de (aj ~ (c>

em que o análogo NTI<# o peptídeo variante# o derivado químico do peptídeo ou multímero de peptídeo tem pelo menos 20% da atividade biológica ou bioquímica de NTL ou o peptídeo de CSP-4 em um ensaio .in vitro ou in vivo, [351 O análogo MTL descrito acima ou abaixo de um modo preferencial tem a seguinte atividade rei ativamente à atividade de KTL: pele menos cerca da 20%, 30%, 40%,· 50%, 60%, 651# ⁷0%# 75%, 80%# 85%, 90%# cerca de 55%, 97%, 09%, e qualquer faixa entre estes# como# por exemplo# desde cerca de 701 a cerca de 80%# e mais pre.ferencialm.ente de cerca de 81% a cerca de 90%; ou ainda mais preferencíalmente# desde cerca de 91% a cerca de 99%. O análogo de NTL pode ter 100% ou mais do que 100% da atividade de NTLx Esta atividade relativa pode ser baseada ett, qualquer método aqui descrito cu conhecido na técnica para avaliar essa atividade.

[36j Na modalidade preferencial do método acima, o composto no método acima é NTL. Numa outra modalidade, o composto é o peptideo de CSP-t SEQ ID NO: 1. Numa. outra modalidade do método, o composto é o muitimero de peptideo, de preferência um que compreende monômeros do peptideo CSP-4 (SEQ XD NO: 1) .

[37] Da preferência, quando o método acima usa um mult.im.ero de peptideo:

(ai o multimero de peptideo tem à formula gerai P^A _a em que (i) é o peptideo, variante ou derivado químico, e (11.) n - 2-5, ou (b) o peptideo multimero tem. a fórmula (F-X-j «-F , em que (ii cada um de P³· e P* é, independentemente, o peptideo, variante ou derivado químico;

(ii; cada um doa Ρ^Λ e F é o mesmo ou diferente peptideo, variante ou derivado;

iiií X é um. grupo C$-C§ alquil, Ci-Cs alquenil, Ci“C₅ alquinil, C$,~C§ poliéter contendo até 4 átomos de oxigênio;

(iv) m ~ 0 ou 1; e (v} n » 1-7, qu (c) o peptideo multimero tem a fórmula (P^-Glys _f em que:

(i) cada um de F a p* é, independentemente, o peptideo, variante ou derivado, (ii) cada um dos P^x e ê o mesmo ou diferente peptideo ou variante ou derivado;

(ill) z ~ 0-6; e (iv; n 1-25, [38J Preferencialmente, o multimero possui pelo menos 20% da atividade biológica do peptideo de CSP-4 em um ensaio in vitro ou í n vi vo.

[39] E também proporcionado um método para tratamento de ara sujeito raamifsro, preferencialmente um ser humano, que tem uma doença ou condição caracterizada por fibrose pulmonar (ou seja, IPF}, compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade eficas de um composto ou composição que, através da inibição da degradação mediada por MDM2 da proteína p33, aumenta os níveis de proteína p.53, reduz ou níveis de uPA e uPAR e aumenta a expressão de Pãi-1 em FL f ibroblãstos, Numa modalidade preferencial deste método, o composto ou composição é (aj nutlina~3a (NTL) ou um análogo quiral cis-ímidazolina do mesmo que inibe a interação de MDM2~p53;

(b) um peptideo selecionado a partir do grupo que consiste (íj CSP~4, a sequência do qual ê FTTFTvT {SEQ ID NO: 1), a modalidade de peptideo mais preferencial;

(li) uma variante de adição do peptídeo de CSP-4 variante de adição não excede 30 aminoácidos de comprimento;

(ííi; um derivado químico covalentemente modificado do peptídeo CSp-4, ou {c> multímero de peptídeo que compreende pelo menos dois .monômeros sendo cada monõrnero o peptídeo CSP-4, a variante ou o derivado químico de (b), mais preferencialmente, um muitime xo de OSfc* 4, (d) a composição de peptídeo liberâvel ou polipeptídeo ou peptídeo multime.ro, ou (e) uma. combinação de qualquer ura de (a) a (d), em que c análogo NTL, cu o peptídeo variante, o derivado de peptídeo ou o peptídeo multímero possui pelo menos 20% da atividade biológica ou bioquímica de NTL ou. o peptídeo CSP-4, respect!vamente, em um ensaio in vitro ou in vivo.

[40] Neste método, o composto é preferenciaimente em uma composição farmacêutica que compreende adicionalmente um carreador ou excipiente farmaeeuticamente aceitável. G composto pode ser um sal farmaeeuticamente aceitável NTL, análogo de NTu ou composto de peptideo. Numa modalidade preferencial do método, o composto é ML. Numa outra modalidade da presente método, o composto é o multímero de peptideo, mais preferenciaimente um multímero compreendendo monômeros do CSP-4 FTTFTVT peptideo (SBQ XD NO: li.

[41] A presente invenção é também dirigida para a utilisação de NIL, o análogo NTL acima, o peptideo, variante, derivado químico ou multímero acima para (aj aumentar os níveis da proteína p53, reduzindo uPA a aumentando a expressão de FÃ’I~1 em fl fibroblastos, ou (b) tratamento de uma doença ou condição caracterizada como fibrosa pulmonar.

[42] Também é proporcionada a utilização de NTL, o análogo NTL aoima, o peptideo acima, variante, derivado químico ou multímero de peptideo como aqui definido para a fabricação de um medicamento para utilização no tratamento de um paciente portador de uma doença ou condição caracterizada como fibrose pulmonar«

[43] A Figura 1 é uma ilustração esguemática que mostra que a baixa expressão basal de p53 e controle mediado por p53 fera de faixa do sistema fibrinolitico de uPA em fibrcblastos pulmonares fíbrdtioos (FL) leva à fibrogênese. Qs mecanismos de ação e vias envolvidos na IFF e no seu tratamento pelos métodos e composições da presente invenção são descritos.

[44) Figuras 2A-3I. Focos de fibrose nos pulmões IFF demonstram expressão da p53em Fix-fibroblastos mortos. As seções de pulmão de pacientes com IFF e sujeitos normais de controle foram coradas para H&E (Fig. 2A), vimentina (Fig. 2D), tricrdmico (Fig. 2C) _t p53 (Fig. 2D), PAI-l (Fig. 2:E), Ki~67 (Fig. 2F) _r imunefluorescância para o PAI-1 e SF-G (Fig. 2G) ou pS3 e SF-C (Fig. 28), cu p53 e PAX-1 (Fig. 21). üm exemplo representativo é mostrado (n ~ 5 amostras de pulmão IFF; » [45) Figuras 3A-3B. Gavec-lina-1, p53 e PAI são diminuídos e uFA é aumentada em fibroblastos Fu humanos (IFF) de pulmão IFF estão associados com o aumento da ccl-I e inibição de miR~34a. (Fig. 3Aj Os lisados celulares de pulmão normal (NL) e Fufibroblastos foram coradas imunelogicamente para alterações nas pxOteinas. A figura ilustra os resultados típicos de NL— fibroblastos (n - 10 linhagens celulares) e FL-fibroblast-oa (n 18 linhagens celulares). (Fig. 3D) RNA total de fibroblastos Nula » 3) e FL-(n - 4) foi testado para a expressão de miR-34a por FCR. em tempo real. Northern blotting de RNA a partir de amostras representativas usando sonda antissenso marcada com F para miR34a e o snKNA de controle de carga (U6) são apresentados na parte inferior da barra.

[48j Figuras 4A-4B. Expressão disparate de mRNAs de uFA, uFAR e PAI-1 por fibroblastos de pulmões IFF e normais. O RNA total isola.dc a partir de tecidos de pulmão de sujeitos normais e pacientes com IFF (Fig. 4A) ou a partir de NL- (n 8) e FL-fibroblastos (n ^:::: 3) (Fig. 4Bj foram testados para mRNA de uFA» PAI-l e col-I pot PCR quantitativo em tempo real ( (RTPCR) e normalizado para os níveis correspondentes de mRNA. 8actina.

[47 J Figuras 5A-5D. A expressão diferencial do uPA e PAI-1 per fibroblastos NL- versus FL- de oamundongos. FL-fibroblastos isolados dos palmes de camundongos 21 dias apôs a lesão BLB ou FL-fibroblastos de camundongos da controle expostos a solução salina intranacal, conform descrito em outre local (Bandhary et al, 2012, supra) . Os lisados de fibroblast-os BL· e FL foram imunotrans feridos para alterações na expressão de pS3, de probeleas uPA, PAI-1 e col-I (Fig. 5A) . 0 ABA total extraído de tecidos de pulmão do camundongo (Fig. SB) ou a partir de isolado f ibroblastos BL- e FL-(n == 6) (Fig. SC) a partir dos tecidos pulmonares de camundongos com fibrose indue ida por BLM ou camundongos de controle (salina) foram, testados para mRBA de uPA, PAI-l e de colágeno-I (Cai-I) par PCR quantitativo em tempo real. Fibroblastos NL- e FL- de camundongos foram cultivados em placas de 12 poços em meio DMEM. Depois de três dias os fibroblastos foram contados para determinar a taxa de proliferação (Fig. 5D).

[48) Figuras SA-SD. CSP (CSP4) aumenta a expressão cia p53 através da indução de miR-34a. em. FL-fibroblastos (IPF). (Fig. FA) Fibroblastos ML- e FL-in - 3} foram tratados com PBS, CSP-4 (CSP) ou peptideo de controle (CP) . Ο ΒΝΛ foi analisado para miR-34a por PCH em tempo real. (Fig. 6B) FL-fibroblastos foram, tratados com. PBS ou CSP ou. CP com ou asm miR-34a antissenso (miR-34a~AS) ou prê-miR-34a ou miRNA de controle (Ctr-miR) . Os meios condicionadas (CM) foram imunotransferidos para PAX-1 e os lisados (CL) para p53 e B~actina> (Fig. FC) FL-fibroblastos faram tratados com. PBS ou CSP ou CP na. presença au ausência de miR-34a-AS, pré-miR-34a ou Ctr-miB. 0 FKA foi analisado para alterações em mi.R-34a por PCS em tempo real. (Figura 6D) . Uma serie de deleções sobrepostas foi feita em CSP e estes peptideos fora® utilizados para tratar co® EI.-fihroblastos. Mudanças n.® p53, uPA, PAI-1 e col-I fora® posteriormente avaliadas para identificar os a®inoácidos ®ini®os exigidos para os efeitos de CSF.

[49] Figuras 7A-7B. 0 au®ento da degradação ®ediada per ®d®2 das proteínas p53 a® FL-fibroblastos (IFF). {Fig. 7A) Lisados a partir de NL- e FL-fibrcblastos (n ^::: 3) fora® i®uno®aroadcs para p53, ®d®2 e β-actina. (Fig. ’?B) Os lisados de NL- e FLfibroblastos fora® i®unopr edpi t ados (TP) co® anticorpo anti®d®2 e imunotransferidos (IB) para a proteína p53 associada.

[50] Figuras 8A-8C. Papel do siste®a cross'-talk p53- fibrinolitico a® nutlina-3a (NTL) ou inibição ®ediada por CSP-4 da expressão col-1 e® FL-fibroblastos (IFF). (Fig. 8A) FI.fibroblastos fora® expostos a PBS, nutlina-Sa (10 uM), CSP-4 (10 nd) ou peptideo de controle (CP) _f durante 46 h. Os lisados celulares fora® i.®unotransferidos para a expressão de Col~I, PAI-1, p53, uPA e g-actina. (Fig. 8B) FL-fibroblastos cultivados e® placas de 12 poços e® ®eio DHEd fora® expostos a veiculo (PBS) ou nutlina-3a, CSP-4 ou CP. Depois de 3 Bias, as células fora® desprendidas e contadas. (Fig. SC] FL-fibroblastos fora® transduzidoe apenas co® o vetor vazio de adenovirus (Ad-EV) ou Ad-vetor que expressa a p53 (Ad-p53) _# PA.I-1 (Ad-PAI-lj ou caveolina-1 (Ad-Cav ~1) . Depois de 4Sh_# os lisados celulares fora® i®unotransferidos para Col-I, pS3, PAX-1, uPA e g-actina.

[51] Figuras §A-§3. Papel do eiste®a cx'oss-talk p53~ fibrinolirico na indução da expressão de col-1 e® NL~ fibroblastos. N'L- fibroblastos isolados a partir de pul®des hu®anos histoiogica®ente munais¹* fora® tratados co® ρ53 shRNA no vetor lentiviral para inibir a expressão de p53 basal. As células de controle fora® tratadas co® shRNA não específico (Ctr)< (Fig. 9A) : amostras de meio condicionado foram imunotransferidas para PAI-1, uAA, s col-I solúvel, enquanto os lísados de células foram testados para a ps3, o-SMA e £~actina. {Fig. 8B) : O RNA total isolado a partir de NL-fibroblastos tratados com controle ou p53 shRNA foram analisados para alterações na expressão de uFA, FA1-1, col-X e mRDA β-aotina por PCR quantitativo em tempo real.

(52] Figuras 10A-1QO. Nutlina~3a (NTL) inibe a fibrose pulmonar, em camundongos tratados com BLM. Os camundongos foram expostos a SLM de 14 d para induzir a fibrose pulmonar, Camundongos tratados com salina foram usados como controles de fibrose. Após 14 d, os camundongos expostos a BI34 foram injetados XV com qualquer veículo ou nu.tlína-3a (10 mg/kg de peso corporal) (Zhang F> et al<, Drug ?4etab Dispôs 39: 15-21, 2011} para determinar se nutlina-3a inibia fibrose pulmonar estabelecida. No dia 21 após a lesão DLü, os camundongos foram submetidos a tomografia computadorizada (CT) para avaliar a extensão de fibrose (Fig. IDA), üm exemplo representativo é mostrado (n ^::: 9} < (Fig. 10B) Conformidade e resistência pulmonares foram medidas nos mesmos camundongos utilizando o sistema Flexivent para avaliar a melhoria da função pulmonar depois de tratamento com nutlina~3a (n 9} . Seções pulmonares (Fig. 10C) foram submetidas a coloração com tricromo para avaliar a arquitetura pulmonar e deposição de colágeno, como uma indicação da fibrosa pulmonar. (Fig. 10D) Homogeneizados de pulmão inteiros foram analisados para conteúdo de colágeno total (hidroxiprolina) e desmcsina como uma avaliação independente das mudanças na ECM.

[53] Figuras 11A-11D. CFF-4 inibe a fibrose pulmonar estabelecida a melhora a função pulmonar. Da camundongos foram expostos a 8LM para induzir a fibrose pulmonar. Após 14 dias, os camundongos foram injetados por via intravenosa cora veiculo ou 1,5 mg/kg de peso corporal do CSP-4 cu peptídeo de controle (CP} da sequência misturada» Em 21 dias após a lesão PLM, os camundongos foram submetidos a varredura CT para avaliar inibição de CS.P-4 de fibrose pulmonar estabelecida (Fig. 11 A.) . Um exemplo representativo è mostrado (n ^::: 9} » (Fig. IIP) : volumes pulmonares' foram medidos nos mesmos camundongos (n ™ 9} utilizando rendições quantitativas CT. (Figura 11C.): Seções de pulmão foras: submetidas a tricromo e coloração de H&E (não mostrado} para avaliar a deposição de colagens como um indicador da fibrose pulmonar. (Fig.. 11D} Análise de homogeneizados de pulmão inteiro para o teor total de hidroxíprolina» [54] Figuras 12A~12C. CSP-4 ou nutl.ina~3a (NTL) inibe a proliferação de FL-fibroblastos. Os camundongos foram expostos a BLH de 14 dias para induzir a fibrose pulmonar significativa ou a solução salina (controle de fibrose). 14 dias depois, camundongos expostos a BLM foram tratados com CSP-4 ou CP, ou nutlina~3a (ver figuras 10AOD/1ÍA~D). (Fig. 12A) : cortes de pulmão (21 dias após a lesão BLM} foras· submetidos a ímunohistoquimica (IHC) para Kí~67 para avaliar a proliferação. Um exemplo representativo é mostrado (n ~ 9) . Os fibroblastos foram isolados dos pulmões de oamundougou expostos a solução salina, ou BLH BLM ·?· nutiina~3a (como descrito na figura UAj, foram testados para as alterações na expressão de col-X, e p53 do ui?A à jusante e proteínas ΡΑ1-Ί por transferência Western {Fig. 128} : e mRNA por RT-PCR quantitativo (fig. 120.

[55] Figura 13. Inibição de fibrose pulmonar induzida por BLN por tratamento ex vivo de tecidos pulmonares de camundongos PT com CSP-4 ou nutlina~3s (NTL). Os camundongos foram expostos a BLM intranasal por 21 dias para induzir a fibrose pulmonar. Estes camundongos (n ™ 3) foram sacrificados, os .pulmões foram excisados, cortados em pequenos pedaços e colocados em placas de cultura com meio DMEM contendo 10% de soro fetal bovino. As amostras de tecido furam depois tratadas com CSP-4 (10 nM), peptídeo de controle (CP) e nutlina-.3a (NTL) (10 pM) por 72h. Meio condicionado e lisados de tecido foram preparados e analisados para mudanças em col~I, α-ΒΜΑ e β-actina por Western blotting.

DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES PREEEREHCXAXS [56] Os presentes inventores descobriram que a expressão basal de proteínas supressor de tumor, p53 e inibidor do at.ivad.or do plasmlnogênio-l (FAI-l) são marcadamente reduzidas em FL-fibroblastos obtidos a partir dos pulmões de pacientes com IFF. isto também é verdade para os camundongos còe fibrose pulmonar acelerada induzida por BLM, um modelo aceite de IPF humano. p53 regula a expressão dos principais componentes do sistema uPA~xibrinolitico (uPA, uPAR e PAI-1). No entanto, tem sido pouco clara como as alterações nos níveis destas proteínas contribuem para a patogêness da fibrose pulmonar, e se a restauração do modo normal de cross-talk de pS3~uPA sistema fibr.ino.litico atenua a fibrose pulmonar.

[571 De acordo com a presente invenção, o aumento de expressão de uFA e uFAR, e uma inibição concorrente de PAX-1, devido a uma falta de expressão de »53 em FL-fibroblastos são críticos para o desenvolvimento de fibrose pulmonar. A indução da expressão de p53_f e recuperação do sistema de cross-ta.lk de p53-uFA-fibrinolitico através da redução mediada por p53 de uFA, um. aumento concomitante na expressão de RAI-1 em FL fibrab.last.os, atenua IFF e é a base para o tratamento desta doença com ΝΤΙ».

Γ581 Ao contrário de fibroblastos de pulmão normal PKL), os fibroblastos obtidos a partir de pulmões de pacientes com. fibrose pulmonar idiopática {FL-fibroblastos} ou a partir de oamundongos com. fibrose pulmonar induzida por 8LM expressam p53 minima. Além disso, FL~fibroblastos produzem, baixos níveis de ΡΑΪ-1, enquanto que a expressão de uPA e uPAR é maroadamente elevada.

[59J A presente invenção tem como alvo todos os três componentes principais (uPA, uPAR e PAI-1} do sistema de uPAfibrinolítico de forma, global e coordenada. Simultaneamente direcionamento de todos os três principais componentes do sistema uFA-fibrinolítico através de restabelecimento da expressão de p53 em Ei,-fibroblastos atenua a fibrose.

[60} Por conseguinte, este tratamento· afeta FL-fibroblastos primários e tecido pulmonar isolados a partir de pacientes com IFF ex vivo e in vivo. Estas alterações foram, observadas em um modelo de oamundongo com fibrose pulmonar estabelecida em que furam definidos os intermediários a mediadores a jusante dos efeitos salutares do nutlina-3a.

^utlxna-3a

Γ6Ιί Os compostos úteis no método da presente invenção incluem nutlina~3a (também dita oomo nutlina e NTL) que ê 4-24₁ 5 - di -hi d r o-1H- imi da ζα 1 -1 -p ipe r a z i n - 2 - o na

Formula 1 [62] Este composto está descrito na Patente US 7.893.278 (Baley et al), aqui incorporada. por referência. na sua totalidade. Também são úteis na presente invenção um gênero amplo de análogos quixais cis~imidazolina de NTL que partilham a propriedade de inibir interações de NDM2~pS3< Por análogos de NTL entende-se o gênero de moléculas descritas na patente *278, e caracterizada pela Formula 2 a seguir.

Formula 2 (63] na qual [64] R é selecionado de anéis com 5 e 6 membros, saturados e insaturados que contêm pelo menos um heteroátomo; o heteroátomo pode ser 8, N ou 0. 0 anel pode ser substituído com um grupo alquil inferior cujo grupo alquil pode ainda ser substituído com pelo menos um de -C®O-F.x, -80_s CH₂, ou 'CHsC^OCHx, [65] R- é selecionado a partir do grupo que consiste sa H, ~

NHs, -N-alquil inferior, alquil inferior substituido com um hidrcxi, alquil inferior substituido com e um anel, saturado de 5 ou 6 membros contendo pelo menos um heteroátomo (S, K ou O) ;

[66] Xj. e x₂ são selecionados índependentemente do grupo que consiste em H, alcoxi inferior, -CHgOGHs? -CHgOCSgGHj, -OCHsCFj, e “OCH_èCH₂E, [67] Yt e Yg são cada um independeu temente selecionado a partir do grupo que consiste em -Cl, -Br, -HOg, -C ™ N, e -C ^;:: CH, e [68'J a esterec-quimica absoluta na posição 4 e 5 do anel de imidazolina ê S e R, respectivamente♦ [69] Outros compostos que são considerados análogos de DTL são os compostos de Fórmula 2 em que B é piperazinil substituído com. pelo menos um. grupo selecionado de alquil inferior, cicloalquil, C«ORx, alquil inferior substituído co® hidroxi, alquil inferior substituído oc-m ~RHg, alquil inferior substituído com -OCR*. D-alquil inferior, N, -SG2CH3, «O, -CH;>C™OCH₂, ou píperidinil substituído oom pelo menos um grupo selecionado a partir de C1-C3 alqu.il, -Cl-C2-alcox.i, -OQGH^, -SQ₂CH₃'-C»O, QH, “CH₂NH_2f “C^OCK_sDH_3f -OOCH2OH, ~C«OCH (OH]CH₂OH, CHsCHCOmCHgOH, -C<m(CH₂h, -C-0HH2,e-C-ON(CH₃}CH3, -N(CH₃}CH_3# pirrolidinii e piperadinil, [70] Também preferenciais são os compostos de fórmula. 2, em que o grupo XI na posição orto é selecionado a partir de alcoxi inferior, -OCH₂ CF. e -GCH^CH^F, e o grupo X2 na posição para é alcoxi inferior» Ainda mais preferenciais são cs compostos em que o grupo XI na posição orto é selecionado entre os grupos etoxi, isopropoxi, -OCHsCFj, e ~OCS₂CHgF, e o grupo X2 na posição para é selecionado a partir de metoxi e etoxi.

[71] Ainda preferenciais são os compostos de Fórmula 2 em que R é selecionado de entre píperaziníl e píperazinil substituído. Tais compostos são, por exemplo: 1-{4-([43,SR-4,3Bis-(4-cloro-fenil)-2-(2-isopropoxi-4-metoxi-fenil;-4,5-dihidro-imida.zol-lcarbcnil] -píperazin-l-il) -etanana; 4- [ (4$, SRj 4,5-Bis~(4-cloro~fenil;-2-(2-isopropaxi-4metoxi~fenil}-4,5~dí~ hidro-imídazal-l.-oarbaníl]piperazin-2-an.a; [ (43, SR)-4,S-Bis- (4oloro~fen.il) -2- (2-isopropoxi~4-5-metoxi~f eníl} -4,5-di-hidx'O~ imidazol-l-il]-{4-pirrdidin-l-il~piperidin~l-il}-metanona; 4[ (42, 5R4 -4, S-Bís- í 4~clOro~fenil) -2- {2-eto.Xi-fedí 1) -4, 5-di-hidroimid-azol-1 -carbon! 1] -píperasín~2ona; 1- (4- ( (43, SR) -4, S-Bis~ (4cioro-fenil?-2-(2~etoxifenil)-4,S-di~hidro~imidazol~l-carbenil] piperasín-l-íl)-etanana; 2-(4-( (48, 58)-4, 5-Bis--{4-aloro-fenll)2- (2-etoxifenil j -4,5d.i“hidro~imidazol~l~carbonii] -pipe.razi.n~lil}-l~morfolin~4-i1-etanona; ((48, SR) -4, 5-Bis-(4~cloro~fenil)-2 (2-etoxí-fenil)4,S-di-hidro-imidazol-l~il]-[4-·2 metanesulfoniletil)-pipex&tin-l-il]-metanona; e [i4S,5R)-4,5Bis-(4-cloro--fenil}-2-{2-isopropoxi~4-metoxi-fenil}-4,5-dihidro-imidazol-l-il]-H-metil-piperazin-l-il)-metanona>

[72] Síntese de todas essas moléculas é conhecida na técnica, sigumas das quais estão descritas na

Peptideos baseados ns Sesraencxa Cav—i [73] O domínio estrutural de Caveolina-1 patente '278.

(Cav-1) ou peptideo (também dito como CSD ou CS?) interfere com interação Cav~l com

Src quinases imita o efeito combinado de uPA e anticorpo antiβΐ-integrina, come discutido em mais detalhes abaixa.. Cav-l nativa humana tem um comprimento de 178 aminoâcidos e um peso molecular da kBa. A. sequência de aminoàcidos de Cav-l é mostrada abaixo (SEQ ID KO: 3).

61 121

MSGGKWQSS GMLYTVPIRt QG^IYKP^K AMAOELStKQ VYBÂHTmO hOWKIhFÊO VIAEPSGTHS FtXSXWKASFT TFTVTKWY RUSALFgSP ILSFLHXWAV VraKSFLIE IQCXSRVYSl 'WRWCOPLF EAWKIFSNV

LWROPKHLN

MAS..IW6IYFA [74] CSP è o peptídeo de 20 resíduos sublinhados acima, e tem. a sequência GIWKASETTETVTKYWFYR (SEQ ID hO: 2) , 0 peptídeo preferencial de presente invenção, designado CüF-4 é o fragmento FTTFTVT (SEQ ID NO; 1} de CEP e ê mostrado duplo sublinhado na sequência Cav·!. CSP-M tem atividades apresentadas nus Exemplos e Figuras, abaixo, s afeta o modo como o p53 regula viabilidade LEC através de controle coordenado de uPA, uPAR (para cima; e expressão de PAI-l (para baixo) e por este mecanismo presumive1, protege LECs ou epitèlio do pulmão da apoptose ín vivo e bloqueia a fibrose que resulta da ALI>

[75] Nos estudes aqui divulgados, um peptídeo de controle para CSP-4, o que s denominado ’’CP e um. peptídeo codificado com a mesma composição de aminoâoidos como o maior CSP (SEQ ID NO: 2), mas tem uma sequência diferente: NGIDKAFFTTSTVTYKWFRY (SEQ 10 NO: 5) .

[76] Modifinações e alterações podem ser feitas na estrutura de CSP-4, e para criar moléculas com características semelhantes ou de outra forma desejáveis. Esses derivados funcionais ou derivados biologicamente ativos (cujos termos são utilizados de modo intercambiàvel) estão englobados no escopo da presente invenção, [77] Derivados funcionais preferenciais são variantes de adição e olígõmetos/multímeros de peptideos, e semelhantes.

[78] Estes podem ser gerados sinteri.camente, mas também por produção recombinants, e testados quanto às propriedades de ligação ou a atividade biológica do CSP-4, Um modo preferencial para medir a atividade da variante é em um ensaio de ligação competitiva em que a capacidade da variante do peptídeo para competir com a ligação de caveolina solúvel, como aquele que ê marcada de forma detsctàvel, com uPAR. solúvel (suPAR}<

[79] Entende-se que os derivados distintos de CSP-4 e polipeptídeos mais iongos compreendendo CSP-4 podem ser facilmente preparados da acordo com a invenção, por métodos de tratamento químico (sintéticos) ou por meios recombinantes (preferenciais para polipeptídeos mais longosj.

[80] incluídos na definição de variantes funcionais da CSP-4 são adição que compreende preferencíalmente um 1 -5 amincãcidos adicionais em qualquer das extremidades ou em ambos os terminais. Em outras modalidades (que se destinam a ser diferentes dos multimeros de peptideos discutidos abaixo), podem ser adicionados outros resíduos adicionais, até cerca de 20 resíduos. Na variante de adiçãc· de CSP-4, os resíduos Nterminais adicionais para, e/ou Otermínais para SEQ ID N0: 1 (o núcleo de peptídeo CSP-4) podem incluir alguns destes na ordem em que ocorrem na sequência nativa em Cav-1 (SEQ ID NO: d. No entanto, a variante de adição não pode ser a SEQ ID ND: 3. Alternatívamente, outros aminoácidos podem ser adicionados a. qualquer dos terminais da ESQ ID NO: I, com o entendimento de que a variante de adição mantém a atividade biológica a a atividade de ligação do CSP-4 (pelo menus 288 da atividade, de um. modo preferencial, maior ou, como ê definido abaixo] .

[81] Substituições variantes de CSP-4 preferenciais são substituições conservatives em que um, dois ou três resíduos foram substituídos por residua diferente. Para uma descrição detalhada da química e estrutura de proteínas, ver Schulz G.E. et al, Principies of Protein Structure, Springer-Verlag, New fork, 1973, e Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties, ed., N.H. Freeman & Co., San Francisco, 1993, qua são aqui incorporados por referência. As substituições conservadoras são aqui definidas coxno trocas dentro de um dos seguintes grupos:

[82] Phe pode ser substituído por um grande resíduo aromático: Tyr, Trp.

[83] Thr pede ssr substituído por um pequeno resíduo alifátíco, não polares ou ligeiramente polar: por exemplo, Ala, Ser, ou Gly.

[84] Vai pode ser substituído por um. grande resíduo alifático, não polar; Met, Leu, Xle, Cys<

[85] Mesmo quando ê difícil prever o efeito exato da substituição antes da preparação, um especialista n.a técnica apreciará que o efeito pode ser avaliado por ensaios de triagem de rotina, preferencíalmente, os ensaios biológicos e bioquímicos aqui descritos. A atividade de um Usado celular* ou uma variante do polípeptideo ou peptídeo purificado é testada num ensaio de triagem adequado para a característica desejada.

[88] Além dos 20 L-aminoácidos padrões, D~am.inoácidos ou aminoácidos não padrões, modi ficados ou não usuais que são bem definidos na técnica, também são contemplados para utillração na presente invenção. Estes incluem, por exemplo, incluem β-alanina {_:S-Ala; e outros o~aminoácidos como o ácido 3~aminoprop.i.Ônico, ácido 2,3~diamínopropiônico (Dpr), ácido 4~aminobutlrico e assim por diante; ácido o-aminoísobutírico (Alb); ácido saminohexanoico (Aba); ácido ã-aminovalérico (Ava); Nmetllglicina ou sarcosine (MeGlyj; ornitina (Orn); citrulina (Cit}; t~butila.lanina (t-BuA); t~butilgliclna (t-BuGH &·· metilisoleucina (Melle); fenllglicina (Phg); nc-rleucina {die); 4-c.lorofenila.lanina (Phe{4-C.H ) ,* 2~f luorofenilalanina (Phe(2~ Ej}; 3-f luorof eni lalanina (P'he(3-FH; 4-f luorofeniialanina (Phe(4-n }; penicilamina (>en) ; ácido 1,2, 3, 4-tetrahidroisoquinolina~3-carboxilico (Tic); homoargxnina (hArg.); Xacetll-lísina (ácLys) ; ácido 2,4-diam.xn.obutlrico (Dbu); ácido 2,4~dxamincbutxrico (Dahi; p-amincfenilalanina (PheipNHF); N~ metil-va.lina (beVal); humocisteína. (hCys), homofsnilalanina íhPha) e- hmseriM {hSer}; hidroxiprolina (Hynj, homoprolina (hPrc;, amíncásidoa M-metilados e peptoides (glicinas N~ substituídas) .

[87] Outros compostos podem sex concebidos por desenho racional de drogas para funcionar de um mode semelhante ae CSP4» ü objetivo da concepção racional de drogas ê produzir análogos estruturais de compostos biologicamente ativos. Através da criação de tais análogos, é possível produzir medicamentos que são mais ativas ou mais estáveis dc que as moléculas naturais (isto é, peptideos), -menor susceptibilidade a alterações que afetam funções. Uma abordagem, é a de gerar uma estrutura tridimensional de CSP-4, por exemplo, por NMR ou cristalografia de ralos X, modelação em computador ou uma combinação, Uma abordagem alternativa é a de substituir grupos funcionais aleatoriamente na sequência CSP-4, e determinar o efeito sobre a função.

(8SJ Além disso, um derivado biologicamente ative tem a atividade de P.EU-4 em um ensaio de ligação eu de atividade biológica in vitro ou in vivo, como os ensaios aqui descritos. Preferencialmente, o polipeptideo inibe ou previne a apcptose de LuCs induzida por BnM in vitro ou in vivo com uma atividade de pelo menus cerca de 20% da atividade de CSF-4, ou pelo menos cerca de 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 00%, cerca de 85%, 87%, 38%, e qualquer faixa entre estes, como, por exemplo, desde cerca de 70% a cerca de 80%, e mais preferencialmente desde cerca de 31% a cerca de 88%; ou aluda mais preferencíalmente# desde cerca de 91% a cerca de 99%. 0 derivada pode ter 100%. ou mesmo maior atividade do que o CSP-4.

[89] O peptídeo pede ser limitado nos seus terminais N e C, com um. grupo acil (abreviado como Ac; e um grupo amido (abreviado Am;, respectivamente# por exemplo acetíl (CH_sCO-ç no terminal F e amido (“-NHs; no terminal C. Uma ampla faixa de funções de capeamento ^-terminal, preferencíalmente, numa ligação para o grupo amino terminal# está contemplada# por exemplo: formil;

[90] a.lcanoi.1# tendo aoet.il, propíonil, but ir 11	da 1 de 1 a	a 10	10 átomos	de carbono#	nome hex···
[91]	alquenoil# tendo	átomos	de	carbono,	como
3-enoil; 1921	alquínaíl, tendo	de 1 a	10	átomos	de	carbono#	o orno	hex-

á-inoll;

[93] aroil# oomo benzol1 ou 1-naftail,* [94] heteroareil# como 3-pírral ou 4~quinolo.il #' [95] alquílsulfunil, como metanossulfonil;

[96] arilsulfonil# como benzenossulfonil ou sulfan.il.il;

[97] heteraarílsulfonil# como piridína-4-sulfanil#’

[9δ]	alcanoil substituído# tende·	de	1 a	10	átomos	de
carbono# [99]	coma 4-aminobutiril; alquenoil substituído, tendo de	1 a	10	átomos	de
carbono, como o é^hidroxi-hex-S-enoil; [100] alquínoíl substituído#	tendo	de 1	a 10	átomos	de

carbono# como 3-hidroxi-hex-5-inai.l;

(101} aroil substituído, como 4-clorobenzoil ou shidroxi-naft~2~oil;

[1021 heteroaroi.1 substituído# como 2# 4~dioxo~.l, 2# 3# 4~ tetra~hidro~3~metil~quínasolin~6~oil;

[103] alquiisulfcní1 substituído, como 2~ aminoetancsulfonil;

[104] arílsulfonil substituído, como 5~dimetilamins~l~ naftalenossulfanil;

[105] heteroarilsulfonil substituído, como l-metoxi-õ-· i s oqu in o 1 i n a s u 1 f orvi 1;

[106.1 carbamoil ou tiocarbamoil;

[107] carbamoil. substituído {R^Z~NH~CO} ou tioea.rba.moil substituído {R'~NH~CS) em que é alquil, alquenil, alquínil.

aril, heteroaril, alqu.il substituído, alquenil substituído, alquiníl substituído, aril substituído, ou heteroaril substituído ;

[108] carbamoil substituído (R*~NH~COi e tíecarbamoil substituído (R^?-NH-CS) em que R^z ê alcanoil, alquenoil, alquinoil, aroil, heteroaroil, alcanoil substituído, aiquenoil substituído, alquinoil substituído, aroil substituído, ou .heteroaroií substituído, todos como acima definidos.

[109] A função d.e capaamento C-terminal pode estar em uma ligação amída ou éster com o grupo carboxil terminal. As funções de capeamento que proporcionam uma ligação amida são designadas como NRMd em que 3/ e R'⁵ podem ser desenhados de forma independente a. partir do seguinte grupo: hidrogênio;

[110] alquil, preferencialmente tendo de 1 a 10 átomos de carbono, como metil, etil, isopxopil;

[111] alqueníl, tendo preferencialmente de 1 a 10 átomos de carbono, como prop-2-enil;

[112] alquinil, tendo prsferenoialmente de 1 a 10 átomos de carbono, como prop~2~in.il;

[113] alquü substituído tendo de 1 a 10 átomos de carbono, como hidrcnialquíl, alcoxialquil, mercaptoaiquil,

4 / 71 aiquiltioalqui1, halogenoalquli, danoalquíl, asdnoalquil, a1qu11aminoa1quí1, d1a1qui1ami ηoa1qui1, a 1 c an o i X a 1 q ui 1, carbox 1a Xqui1, ea rbamo X X a1qui1;

[114] alquenil substituído tendo de 1 a 10 átomos de carbono, como hldroxialquenil, alcoxialquaníl,· mercsptoalquen.il, a 1 qu i 11 i oa 1 que nil, ha1ogenca1quen11, c i a η o a. iquenl 1, aminoalqueni 1, alqui laminoa.1 quení .1 ,· d ia qui laminoa Iquenl 1, a1cano11aIqueηi1, carbox X aX queni1, carbamo11a1que η X1;

[ 11S] alquinil substituído tendo de 1 a 10 átomos de carbono, como hidrexí a lquin.il, alcoxialquinil, mercaptoalquinil, a 1 qu. 1111 o a 1 qu 1 n i 1, ha 1 ogenoa 1 qu i n i .1, c i anoa 1 qu X n i 1, aminoalquln.ll, alqui laminoalquinil, díalquilaminoalqulnil, a1caηo11a1quiη11, c a rbcxi aIqui n i1, c a r bamoi1 a1qui ni1;

[116] aroilalquii tenda atê 10 átomos de carbono, como fenacil ou 2~benzoilet.il;

[117] aril, como fenil ou l~naftil;

[118] heteroari.1, coso 4~quinoli.l;

[119] a icanai 1 tendo 1 a 10 átomos de carbono, como acetil ou butíril;

[120]	aroil,	como benzoil;
i 1211	hetercarc.il, como 3~qu.inclo.il;
[122]	OR.' ou	NR'R em que R' e R são	i ndependentement e
hidrogênio,	alquil,	ari.1, heteroaril, acli,	aroil, auironil.
sulfínil, ou	SQí-R''f	ou SO~R' em que P/ '' é	alquil substituído

ou não substituído, aril, heteroaril, alquenil, ou alquinil.

[1.23] A.s funções de espeameuto que proporcionam uma ligação enter são designadas como QR, em que R pode ser: alcoxi; ariloxi; heteroariloxi; aralqulloxi; hetarcaraIquiloxi; alcoxi substituído; ariloxil substituído; heteroariloxi substituído;

aralquíloxil substituído; ou heteroaralquiloxi substituído.

[1241 A função de capeamento am ^-terminal on Q~ terminal, ou ambos, podem ser de uma dita estrutura que molécula capeada funciona como uma prô-droga (um derivado farmacologicamente inativo da molécula da droga parente) > que passa por uma transformação espontânea ou enrimâtica dentro do corpo em a fim. de libertar a droga ative e que tem propriedades de liberação melhoradas em relação â molécula de droga original (Bundgaard H, Edí design of Prodrugs, Elsevier, Amsterdam, 1925} .

[125] Escolha criteriosa de grupos de capeamento permite a adição de outras atividades sobre o peptídeo, Por exemplo, a presença de um grupo sulfidril ligado à capa de d- ou C~terminal irá permitir a conjugação do peptídeo derivatitado para outras •moléculas.

Derivados químicos da CSP-4 [1251 Além dos grupos de capeamento descritos acima que são considerados como derivados químicos de C3P-4, os derivados químicos preferenciais de CSP-4 podem conter frações químicas adicionais que normalmente não fazem parte de uma proteína ou peptídeo que pode ser introduzido para CSP~« ou uma variante da adição de CSP-4 por meios conhecidos para constituir o derivado químico como aqui definido» As modificações covalentes do peptídeo estão incluídas dentro dc· escopo da presente invenção» Estas frações derivadas podem melhorar a solubilidade^ absorção, meia-vida biológica e similares» As frações capazes de mediar tais efeitos são divulgadas, por exemplo, Gennaro, AR, Remington: lhe Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins Publishers; 21* Ed, 2005 (ou última edição).

Tais modificações podem ser introduzidas na molécula por reação de resíduos de aminoácidos alvos do peptídeo com um agente de derivatização orgânico que è capaz de reagir com cadeias laterais selecionadas ou resíduos terminais. Outra modificação é a ciclização do peptídeo - que é geralmente conseguida através da adição de resíduos de Cys terminais que podem ser ligados através de uma ligação de dissulfeto para produzir o peptídeo cíclico. Alternativa, uma Lys reticulada (K) è adicionada a um terminal e um Olu (Ej no outro terminal.

[128] Os resíduos cisteinil (adicionados, por exemplo, para fins de ciclização) mais comumente são reagidos cem ohalogenoacetatos (e aminas correspondentesj, para gerar derivados oarboxímetil ou carboxiamidometil. Os resíduos cisteinil também são derivatirados por reação com bromotrifluoroacetona# ácido a-bromo-β-(5-imidozoil) propiôníco, fosfato de cloroacetil, N~a.lqu.ilmaleimídas, 3-nitro-2~piridil dissulfeto, metil-2~piridíldissulfeto, p-Oloromercuribenzoato, 2~cloromsrcurí~4-nitro-fenol, ou cloro-Ç-nitrobenzo-S-oxa-l,3diazol.

[129] Os resíduos lisinil adicionados (por exemplo, para a ciclizaçâo) e o resíduo do terminal amino podem ser derivatizados com anidridos de ácido succinico ou outros carboxílicos. A derivatízação com um anidrido carboxílico cíclico tem o efeito de reverter a carga dos resíduos lisinil. Outros reagentes adequados para derivatiz&r resíduos contendo amíno incluem imidoésteres como picolínimidato de met 11; fosfato de piridoxal; piridoxal; cloroborohidreto; ácido trínitrobenzenossulfônico; o-metilisoureia; 2,4 pentanodiona; e reação com glíoxilato catalisada por transaminase.

[130] A derivatização com agentes bifuncionais é útil para reticular o olígômero ou peptideo ou muitimero para uma matriz de suporta insolávs.1 nm água eu outro carreador macromolecular. Os agentes de reticulação comumente utilizados incluem 1, l~bis (diazoaceti.1) “2~feniletano·, glutaraldeído, ésteres de N-hidroxissuocinimida, ésteres com ácido 4azidossalicílico, ímidoésteres homobifuncionais, incluindo ésteres de dissuccinimidil como 3,3^ditiobis(succínimidiipropionato), e maleimidas bifuncionais como bis-N-maleimido-l,8-octano. Os agentes de derivatiração como metil-3-[{p~azidofenil)ditio]propioimidato geram intermediários foto-at i .viveis que são capazes de formar reticulações na presença de luz> Alternativamente, as matrizes reativas Insolúveis em água como carboidratos ativados por brometo de cíanogênio e os substratos reativos descritos nas Patentes US. 3.969.287; 3.65)1.016; 4.198.123; 4.247,642; 4.229.537; ®

4.330,440, são empregues para imobiiizaçào de proteínas.

[131] Outras modificações incluem hidroxilação de lisina, fosforilação de grupos hídroxil de resíduos de treon.il., a metilação dos grupos a~amino de cadeias laterais de cadeias de resíduos de Usina (adicionados) (Creighton, supra)> acetilação da amina ^-terminal e, em alguns cases, a amidação des grupos carboxil C-terminal. Também estão incluídos peptidees, em que um ou mais D-aminoácidos são substituídos por um ou mais Laminoàoidos.

Peptidéos multiméxicos ou oligumérioos [132] Â presente invenção também inclui peptídeos mais longos construídos a partir de unidades de repetição de CSP-4 ou um derivada funcional doe mesmos que tem a atividade antiapoptótioa e de proteção do CSr~4. A unidade peptídica preferencial de um dito muitimers é FTTFTVT (SEQ 11> NO: 1}. Variantes de adição deste peptideo qu® podem ser a unidade de multi.me.ro preferenciaImente incluam aminoácidos 1-4 adicionais.

[133; Um peptideo multímere pode compreender diferentes combinações de mcnõmeros de peptideo (os quais podem incluir um ou ambos de SSQ ID NO: I ou variantes de adição da mesma ou uma sua forma quimicamente derívatizada do peptideo. Tais peptídeos oligomérices ou multimérices podem ser feitos por síntese química ou por técnicas de DNÃ recombinante como aqui discutido. Quando produzidos por sintese química, cs oligômsros possuem preferencialmente 2-5 repetições de uma sequência de peptideo nuclear, e c número total de aminoácidos no mu.ltim.ero nau deve exceder cerca de 160 resíduos, preferencialmente não mais do que 100 residues (ou seus equivalentes, quando incluindo lígantes ou e sp a çaderes?.

[134] Um muitimero peptideo químico sintético preferencial tem. a fórmula [135] [136] em que o peptideo F' central é a SEQ ID NO: 1, e em que n ~ 2-5, e em que o peptideo nuclear isc-ladc· ou em forma oliqo- eu multimérica tem a atividade biológica do CSP-4, como aqui descrito ou em um bíoensaio in vitro cu in vivo de tal atividade.

[137] Numa outra medalidade, um multimero de peptideo químico sintética preferencial tem a fórmula [138] (fMqúb-R² [139] P² a P² são os pept idees do núcleo descritos acima, incluindo as variantes adicionais, em que (a) P⁵· e podem sex iguais ou diferentes; além disso, cada ocorrência de P'¹ no multimero pode ser um peptideo diferente (ou variante);

(b) X é um espaçador que compreende ou consiste em:

(í) uma cadeia orgânica curta, preferencialmente Q-C5 al-quil, C;.“C« alquenil, Cj-Cg-alquinil, Cj.~C§ poliéter contendo até 4 átomos de oxigênio, em que m - 0 ou 1 e n ^:- 1-7; ou (ii) Gly_s em que, z - 1~C, [140] e em que o peptides d.e núcleo isolado ou na forma multimérica tem a atividade biológica do CSP-4, como aqui divulgado em um ensaio in vitro ou in vivo de tal atividade.

[141] Quando produzidos de forma recombinants, um espaçador preferencial é Gly_K como descrito acima, em que z - 16, e os mu.1 timer os podem ter tantas repetições da sequência peptidica do núcleo quanto o sistema de expressão permitir, por exempla, de dois a cerca de 25 repetições, Um multimero da peptideo produzido de forma recombinante preferencial tem. a fórmula:

[142] (P^Glydr-P² [143] em que:

(ai P e P^ são, independentemsnte, SSQ 10 NO: 1 ou 3, c-u um variante de adição c-u uma forma derivada da mesma, em que P^! e P’^? podem ser iguais ou diferentes; além disso, cada ocorrência de F no multimero pode ser um peptideo diferente (ou variante);

[144] em que n - 1-25 e z - 0-6; (faixas preferenciais de n incluem n ^:::: 1-5, Ι-ΙΟ, 1-15, ou 1-20) e ® que o peptideo de núcleo isolado ou na forma multimérica tem. a atividade biológica do CSP-4, como aqui divulgado em bioensaio in vitro ou in vivo de tal atividade.

[145] Nos presentes multimeros de peptideos, ou P* ou P é preferencialmente a SEQ ID NO; 1 ou uma variante de adição ou derivado químico do mesmo. 0 multimero ê opcionalmente capeade« Entende-se que tais multimeros podem ser construídos a partir de qualquer um dos peptideos ou as variantes aqui descritas. E também entendido que o multímero de pentideo deve ser diferente a partir de SEQ ID NO: 3 (isto é, Cav-1 não humana nativa e ê, preferencialmente ws. homólogo de Cav-1 mamífero- nativo) .

Feptxdomimé ti cos [146] Também incluído dentro do escopo da presente invenção é um composto peptidomimético que imita os efeitos biológicos do CSP-4, Um agente peptidomimético pode ser um peptídeo não natural ou um agente não peptideo que recria as propriedades estereoespaciais dos elementos de ligação de CSP--4 de tal modo que tem a atividade de ligação e atividade biológica de CSP-4. Semelhante a um peptideo CSP-4 biologicamente ativo, multímero de peptideo, um peptidomimético terá uma face de ligação (que interage com qualquer .ligante ao qual CSP-ése liga} e uma face não ligante. Mais uma. vez, semelhante a CSP-4, a face não ligante de uai peptidomimético irá conter grupos funcionais que podem ser modificados pelo acoplamento de várias frações terapêuticas sem modificar a face de ligação do peptidomimético. Uma modalidade preferencial de um peptidomimético contería uma anilína na face não ligante da molécula. O grupo NH₂ de uma aniline tem um pKa - 4,5 e poder ia, portanto, ser modificado por qualquer reagente seletivo para hlh sem modificar quaisquer grupos funcionais NrP na face de ligação do peptidomimético. Outros peptidomíméticos podem não ter quaisquer grupos NK₂ funcionais na face de ligação e, por conseguinte, qualquer NH_:Jí sem ter em conta para pK_s podería ser exibido na face não ligante como um sitia para conjugação. Além disso, outros grupos funcionais modificaveis como -SH e -CQOH podem ser incorporados à fans nâo ligante da um. peptidomimêtico, como um sitio de conjugação. Uma fração terapêutica também pode ser incorporada diretament-s durante a síntese de um peptidomímétíco e preferencialmente, ser exibida na face não ligante da molécula.

[147] Esta invenção também inclui compostos que retêm as características de peptideos parciais. Por exemplo, qualquer ligação proteóliticamente instável dentro de um peptideo da. presente invenção podería ser substituída seletivamente por ® elemento não peptidico, como um isôsteru (N-metilação; Daminoàcido) ou. uma ligação peptidica .reduzida, enquanto o resto da molécula mantêm a sua natureza peptidica.

[148] Compostos peptidomimétícos, agonistas, substratos ou inibidores, têm sido descritos para uma série de peptideos/polípeptídeos bioativos, como os peptideos opioides, VXP, a trombina, a protease de HIV, etc. Os métodos para a concepção e preparação de compostos peptidomiméticos sâo conhecidos na técnica (Hruby, VJ, Biopolymers 33: 1073-1082 (1993); Wiley, RA et al, Med Res Rev. 13: 327-384 (1993); Moore et al, Adv. In Pharmacol 33: 91-141 (1995); Giannis et al, Adv. In Drug Res. 29: 1-78 (1997). Certos miméticos que imitam a estrutura secundária estão descritos em Johnson, et al, Em: (Eds.) Biotechnology and Pharmacy, Pesauto et al, Chapman and Hall, K¥, 1993. Estes métodos são usados para preparar peptidomimétióos que possuem, pelo menos, a capacidade de ligação e especificidade do peptideo CSB-4 e preferencialmente também possuem a atividade biológica. 0 conhecimento da química dos peptideos e da química orgânica geral, disponíveis para os especialistas na técnica são 5uf.ic.ien.tes, tendo em vista a presente descrição, para conceber e sintetizar tais compostos.

Por exemplo, tais peptidomiméticos podem, ser identificados por inspeção da estrutura tridimensional de um peptideo da invenção ou livre ou ligado em complexo com um ligante (por exemplo, uPAR solúvel ou um fragmento do mesmo). Alternativamente, a estrutura de um peptideo da presente invenção ligado ao seu ligante pode ser obtida pelas técnicas de espectroscopia de ressonância magnética nuclear. Um maior conhecimento da estereoquimica da interação do peptideo com o seu ligante ou receptor irá permitir a concepção racional de tais agentes peptidomiméticos. A estrutura de um peptideo ou polipeptidso da invenção na ausência de ligante também pode proporcionar um suporte temporário para a concepção de moléculas miméticas.

Peptideoa e Muitimeros de Peptideo Liberáveis [149] Uma modalidade da invenção compreende um método de introdução do peptideo da invenção em células de animais, como células humanas. Composições úteis para este método, ditas como peptídeos ou polipepfcideos liberáveis ou direcionados para célula compreendem um. peptideo biologicamente ativo de acordo com a invenção, preferencialmente CSP-4, ou um seu derivado funcional, ou um muitimero de peptideo do mesmo, que tem a ele ligado ou está associado com, outro componente que serve eomo uma sequência de internalização ou sistema de liberação celular, 0 termo associado com pede incluir quimicamente ligado ou acoplado a, por ligações covaientes ou outras ligações ou forças, ou combinado oom, como numa mistura. Como aqui utilizado, liberação refere-se a internaiinação de um peptideo/polipeptídeo em uma célula. As moléculas liberéveis aqui, contempladas incluem peptídeos/polipeptídeos utilizados por outros para efeito de entrada celular. Ver.,· por exemplo, Morris et al, Nature Biotechnology, 19; 1173-6, 2001}, Uma estratégia preferencial é a seguinte: um peptídeo de inibição de apoptose (biologicamente ative) da invenção está ligado a ou misturado com um peptídeo espacialmente concebido que facilita a sua entrada nas células, preferencíalmente células humanas. Este sistema de liberação não requer a liberação de peptídeos para ser fusíonado ou quixsícamente acoplado ao peptídeo ou polipeptídao biologicamente ativo (embora isso seja preferencial), nem peptídeo ou polípeptídeo biologicaxaerxte ativo tem de ser desnaturado antes do processo de liberação nu ix^ternalização. Urna desvantagem de sistemas de libertação precoces é o requisita para a desnaturação da proteína por carga antes da liberação e subsequente renaturação intracelular. Estas modalidades são baseadas em abordagens conhecidas para promover a translocação da proteína nas células» [150] Um tipo de peptídeo/polipeptídeo de liberação que promove a translocação/ínternalízação inclui a proteína HIVTAT (Frankel, AD et al, Cell 55: 1189-93 (1998), e a terceiro <x hélice do homeodomínio de Antennapedia {Deroasi et al, J, Biol Chem 289: 18444-50 {1994}; Lindgren, M et al, Trends Pharm Sei 27: 99-103 {2080}; Lindgren et al, Bioconjug Chem (2080); Maniti 0 et al, FLoL ONE 5el5819 (2010) <· Este último peptídeo, tambéxa conhecido como penetratina é um peptídeo de 18 aminoácídos com a sequência de tipo selvagem RQIRIWFQN RRMKWKK (SBQ 10 NO: 6) ou dois análogos/variantes designado W48F (RQIKIFFQNRRMKWKK, 8FQ ID NO: 7) e W56F (FQIKINF&NF.RNKFKK, SEQ ID NO; 8) (Christíaens δ st al, Eu.r J Biochem 2002, 269: 2910-2928} , Dutra variante ccm ambas as mutações acima é RQIKIFFQNRRMKFKK (SEQ ID NO: 9} .

Transpurtan, um peptídeo de penetração celular é ias peptídeo longo de 27 aminoãcídos que contém 12 amíncãddos funcionais a partir do N- terminai da galanina neuropeptides ligado por ® resíduo Lys adicionado ã sequência de mastoparan (Fooga, M et al, FASES J. 12: 87-77 {1998}}. A sequência de transporter: é GWTLNSAGELLGKINKÁLAALAKKIL ÍSÉQ ID RO: 10) - Análogos de penetratina e transportan são descritos por Lindgren et al, Bíóconjug Chem. 2000.

(1511 Outra proteína (família) inclui VP22, uma proteína do virus herpes simplex, que tem a propriedade notável de transporte intercelular e distribui uma proteína de muitas células vizinhas (Elliott, G et al, 1997, Cell 88: 223-33;

Q'Hare et al, Patente ÜS 6.017.735). Por exemplo, VP22 ligada à p53 (Phelan, A. et al, 1998, Nat Biotechnol 18: 440-3} ou timidina quinase (Dilber, MS et al, 1999, Gene Ther 6; 12-21} facilitando a disseminação de proteínas ligadas para circundar as células in vitro. Também úteis são os homólogos de VP22 em outros virus do herpes, como o vírus da doença de Marek aviária {MOV} proteína VL49, que partilha homologia com. o HSV-1 VP22 (Koptidesova et al, 1995, Arch Virol 140: 355-82} e demonstrou ser capaz de transporte .intercelular após a aplicação exôgena {Derange et al, 2000, d. Gen. Virol 81: 2219} < Todas estas proteínas partilham a propriedade de propagação intercelular que proporcionam uma abordagexs para aumentar a absorção celular dos peptideos, variantes e multímeros desta invenção.

(1521 Também estão incluídos cs ‘'derivados funcionais do espalhamento intercelular acima ou proteínas e peptídeo® de liberação liberáveis ou internalização, como o H1V-TAT ou VP22, que incluem variantes, fragmentes ou derivados químicos de substituição de amínoácidos homólogos, cujos termos são aqui o / /1 para os pep-tídeos biologicamente ativos. Um derivado funcional retém atividade de transíocação mensurável ou espalhamonto intercelular (VP22-.líke) , que promove a entrada do polipeptideo desejado# que promove a utilidade do presente peptídeo biologicamente ativo# por exemplo# para a terapia. Derivados funcionais englobam variantes (preferencíalmente variantes de substituição conservativa) e fragmentos independentemente do fato de quais termos são usados em conjunto ou na alternativa.

[153] Uma ves que as proteínas de transporte- acima são ditas funcionam melhor quando conjugadas ou de outra forma ligadas ao peptídeo que estão transportando# como o CSR-4 ou uma sua variants ou seu multímero# há um número de desvantagens para usá-los. Um polipeptideo de liberação mais eficaz que pode ser misturado com o peptídeo biologicamente ativo e não precisa ser ligado quimicamente para sua ação está descrito sm Morris et al, supra# como Pep-l, que possui a sequência de aminoácidos antipático KETWETWWTEW5QPKKKBKV {SEQ ID RO: 11}. Pep -1 ê composto por três domínios:

(1) um motivo rico cm Trp hidrofóbico contendo cinco resíduos Trp KETWETWTEW (resíduos 1-12 de SEQ ID NO; 11# acima). Este motivo é desejável# ou necessário# para um eficiente direcionamento para a membrana celular e para entrar em interações hidrofbbicas com proteínas;

(2) um domínio rico em lys hidrofílico KKKMv (os € resíduos do 0-terminal de SEQ ID NO; 11} # que é derivado da sequência de localização nuclear do antigeno I grande do vírus SV40# e melhora a liberação intracelular e solubilidade de peptídeo; e {3} um domínio espaçador SQP (3 resíduos internos de SBQ ID RO: 12} e que separam os dois domínios ativos acima e incluem urn Pro que melhora a flexibilidade e integridade de ambos os domínios hidrofóbicos e hidrofilicos>

[154] Por conseguinte, uma outra modalidade da invenção é um peptídeo ou polípeptídeo liberável compreendendo CSP-4 ou um seu derivado funcionai, uomo descrito acima, e uma molécula de liberação ou trans -locação cu fração ligada a esta ou a esta associado. A molécula de liberação pode ser um peptídeo ou polipeptídeo, por exemple, (a) proteína hxV-'Χάτ ou um derivado ativo do mesmo de modo translocável, (b) penetra tina tendo a sequência RQIKIWFQN RRMKWKK (SEQ ID NO: 8), (c) uma variante de penetratina VH8F tendo a sequência

RQIKIFBQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 7} (d; uma variante de penetratina W58F tendo a sequência

RQIKX^FQNRRMKFKK (SEQ ID NQ: 13} {e} uma. variante penetratina tendo a sequência RQXKIWFQNRRMKFKK (SEQ ID NO: ln>

(f'} trensportan. tendo a sequência GWTLNSAGYLLGKINKALAA.LAKKIE (5EQ ID NO: 10} jg) proteína VP22 da vírus herpes simplex, ou. um. homólogo ativo de modo translocâvel do mesmo a partir de uai vírus do herpes diferente, como MDV proteína UL49; ou (h) Pep-Γ, tendo a sequência KE1WETWWTEWSQPKKKRKV (SEQ ID NO: 9}.

[155] Quando uma fração de liberação, como- os peptideoe e proteínas acima discutidos ê conjugada ou fusionada com o peptídeo biologicamente ativo da presente invenção, é preferencial que a fração de liberação seja o peptídeo biologicamente ativo N-terminal.

Tastes X» das Competições *MA^MMW*MMW.^^WWMWWWMMMWWMVWMAWWWWWWWWWWWWVWmWWWWWWVhWMWiW* [15η] Os compos tos desta invenção são testados quanto à sua atividade biológica, por exemplo, atividade antifíbrótica, a sua capacidade para afetar a expressão de mRAAs de uPA, uPAR e PAI-l, inibir a proliferação de fibroblastos de pulmão, etc. utilizando qualquer um dos ensaios descritos e/ou aqui exempli ficados ou outros bs® conhecidos na técnica.

Bnsaios ín vivo de composições [157] A capacidade de u® composto cerno u® análogo BTL ou variantes de CSP-4 ou derivados ou multímeros de peptídeos para inibir a fibrose pulmonar e® oamundongos tratados com. BLM ê um ensaio preferencial para avaliar a atividade funcional do composto. Outros testes conhecidos na técnica que medem o mesmo tipo de atividade pode ta®bé® ser usados.

Métodks úfô pxev&nçiw ou tx&t&s&fônto l&sâo e fibrose [159] Os compostos e as composições aqui descritos são utilizados no método para inibir a interação de MDM2 com a proteína p53 in vitro ou in vivo, e para tratar doenças ou condições associadas co® ALI e fibrose pulmonar/lPE.

Composições farmacêuticas e terapêuticas e sua administração [159] Os compostos que podem ser utilizados nas composições farmacêuticas da invenção incluem NTI», e todos os compostos de peptídeos acima descritos, bem como os sais farmaceuticamente aceitáveis destes compostos. ^uSal farmaceuticamente aceitável/ refere-se a saís de adição de ácida ou sais de adição de base convencionais que retêm a eficácia biológica e as propriedades dos compostos da presente invenção e ssc formados a partir de ácidos orgânicos ou inorgânicos não tóxicos ou bases adequadas orgânicas ou inorgânicas. Exemplos de sais de adição de ácido incluem aqueles derivados a partir de ácidos inorgânicas como ácida clorídrico, ácido bromídrico, ácido iodidríco, ácido sulfúrico, ácidc sulfâmico, ácido fosfórico e ácida nitrica, e os derivados de ácidos orgânicos como ácido p-toluenossulfóniou, ácidc saiicilico, ácido metanossuifônicc, ácido oxálico, ácido succinico, ácido cítrico, ácido málico, ácido lãctico, ácido fumárico,· e semelhantes» Qe sais de adição de base amostra incluem os derivados de amônio, potássio, sódio e, hidróxidos de amônio quaternários, coma, por exemplo, hidróxido de tetrametiiamônio. A modificação química de um composto farmacêutico {isto é, drogas) em um sal é uma técnica bem conhecida para os químicos farmacêuticos para se obter uma melhor estabilidade física e química, higroscopicidade, fluidez e soiubilidade de campcstos. Ver, par exempla, H. Ansel et al, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (6*Ed. 1995} em pp. 196 e 1456-1457.

[160] Como afirmada acima, as campastes da invenção possuem a capacidade de inibir a interação de MDM2 com proteína p53 e são exploradas no tratamento da lesão pulmonar aguda e, em particular fibrose pulmonar.

[161] Os compostos da invenção, bem como as seus sais farmaceuticamente aceitáveis, pedem ser incorporados em formas de dosagem convenientes, coma cápsulas, bolachas impregnadas, comprimidos au, preferenciaimente preparações injetáveis. Transportadores sólidos ou líquidos farmaceuticamente aceitáveis podem ser utilizados. Farmaceuticamente aceitável, o orno oarreador farmaceuticamente aceitável, excipíente,· etc, significa farmacologicamente aceitável e substancialmente não tóxico para o sujeita ao qual o composta particular é administrado.

[162j Os veículos sólidos incluem, amido, lactose, sulfato do cálcio di-.hidratado, terra aids, sacarcse, talco, gelatina, ágar, peotina, acácia, estearato de magnésio e ácido esteáríco. Os carteadores líquidos incluam xarope, óleo de amendoim, azeite, solução salina, água, dextrose, glicerol e semelhantes. De modo semelhante, o car.reader ou diluents pode incluir qualquer material de liberação prolongada, como monoestearato de gliceril ou dies team to de gliceril, sozinho ou com uma cera. Quando um carteador líquido ê utilizado, a preparação pode estar na forma de um xarope, elixir, emulsão, cápsula de gelatina mole, liquido injetável estéril (por exemplo, uma solução), corno uma ampola, ou uma suspensão liquida aquosa ou não aquosa. Um resumo de tais composições farmacêuticas pode ser encontrado, por exemplo, em Gennaro, AR, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins Publishers; 21^st Ed, 2005 (ou mais recente edição).

[163] As preparações farmacêuticas são feitas seguindo técnicas convencionais da química farmacêutica envolvendo passos como mistura, granulação e compressão, quando necessário para formas em comprimidos, ou mistura, enchimento e dissolução dos ingredientes, como apropriado, para gerar os produtos desejados pata administração oral, parenteral, tópica, transdérmica, intravaginal, intrapeniana, intranasal, intrabronquiai, intracraniana, intraocular, administração intra-aux'al e ratal. As composições farmacêuticas podem também, conter quantidades menores de substâncias auxiliares não tóxicas como agentes molhantes ou emulsíonantes, agentes tamponantes de pH e assim por diante.

[164] A presente invenção pode ser utilizada no tratamento de qualquer um. de uma série de gêneros e espécies de animais, e são iqualmente aplicáveis na prática da medicina humana ou veterinária. Assim, as composições farmacêuticas podem ser utilizadas para tratar animais domésticos e comerciais, incluindo aves e mais preferencialmente mamíferos, mais preferencialmente humanos.

[165] 0 termo administração sistêmica se refere á administração de uma composição ou agente como NIL ou o peptideo aqui descrito, de uma maneira que resulta na introdução da composição no sistema circulatório do sujeito cu de outro modo permite a sua difusão através do corpo, como injeção ou infusão íntravenosa ;i.v.j .. Administração regions1 refere-se à administração num espaço especifico, e um. pouco mala limitada, anatômica, como instilação no pulmão, a via preferencial, ou intrapleural, intraperitoneal, intratecal, subdural,· ou para um. órgão especifico. Outros exemplos incluem, intranasal, que é uma via que corresponde a instilaçãc· nos pulmões, intrabronquial, intra-auxal ou intraocular, etc» 0 termo administração local refere-se à administração de uma composição ou medicamenta para um número limitado de, ou circunscrito, espaço anatômica, como injeções subcatãneas (s.c.), injeções intramusculares (i..m.}. Um especialista na técnica iria entender que a administração local ou administração regional muitas veses também resulta na introdução de uma composição para o sistema circulatório, isto é, de modo que sc ou im também sãa vias d® administração sistêmica. Freparações instilãveis, injetáveis ou para infusão podem ser preparadas sm formas convencionais, quer como soluções ou suspensões sólidas, formas adequadas para solução ou suspensão em liquido antes da ínjeç-ão ou infusão, ou como emulsões. Embora as vias de administração preferenciais regionais sejam para os pulmões, a composição farmacêutica pede ser administrada .sistemicamente ou topicamente ou por via transdêrmica, separadamente a partir de, ou concorrentemente cem, a instilaçào para os pulmões» Outros carreadores farmaceuticamente aceitáveis para as composições do presente invenção são os lipossomas, composições farmacêuticas em que o polipeptídeo' ativo está contido disperse· ou variadamente presente em corpúsculos constituídos por camadas concêntricas aquosas aderentes às camadas lipidicas. 0 polipeptídeo ativo está preferencialmente presente na camada aquosa e na camada lipídica, dentro ou fora, ou, em qualquer caso, no sistema não homogêneo geralmente conhecido como uma suspensão lipossõmica. A camada hidrofõbica, ou camada lipídica, geralmente, mas não exclusivamente, compreende fosfolipideos como lecitina e esfingomielina, esteroides como colesterol, substâncias ativas de superfície mais ou menos iônicas como o dicet11fosfato, estearílamina ou ácido fosfatldico, e/pu outros materiais de uma natureza hidrofõbica. Os especialistas na técnica irão apreciar outras modalidades adequadas das presentes formulações lipossômleas.

[167] A. dosagem terapêutica administrada é uma quantidade que é terapeuticamente eficaz, como é conhecido ou facilmente determínável pelos especialistas na técnica. A dose •também depende da idade, saúde e peso do receptor, tipo de tratamento concomitante, se houver,· frequência do tratamento, e natureza do efeito desejado.

Métodos Terapêuticos [163] Os métodos da presente invenção podem ser utilizados para tratar a fibrosa pulmonar ou fibrose pulmonar idiopática# num sujeita cqs necessidade dos mesmos. 0 termo tratamento é definido de modo amplo para incluir# pelo menos# o seguinte; inibir# reduzir.# melhorar# prevenir# reduzir a ocorrência ou recorrência# incluindo a frequência e/ou tempo de recorrência# ou a gravidade dos sintomas da doença ou condição a ser tratada ou prevenida. Isto pode ocorrer como resultado da inibição da morte celular epitelial# inibição da proliferação de fihroblastos# qualquer um dos outros mecanismos biológicos ou bioquímicos· aqui divulgados como estando associadas cem ou são responsáveis pela IPF>

[169] NTL, NTL análogo# ou peptídeo ou derivado peptídeo ou sal farmaceuticamente aceitável é administrado preferencíalmente sob a forras de uma composição farmacêutica como descrito acima.

[170] As doses do composto de um modo preferencial incluem unidades de dosagem farmacêuticas compreendendo uma quantidade eficaz do peptídeo ou NTL. forma de dosagem unitária refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosaqens unitárias para um sujeito mamífera#’ cada unidade contém uma quantidade predeterminada de material ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado# em associação cora o carteador farmacêutica requerido. A especificação para as formas de dosagem unitárias da invenção sâo ditadas por e diretamente dependentes de (a) as características únicas do material ativo e do efeito terapêutico particular a ser alcançado# e (b) as limitações inerentes na técnica de compor um dito composto ativo para o tratamento de# e de sensibilidade# sujeitos individuais.

[171] Por uma quantidade .eficaz entende-se uma quantidade suficiente para atingir uma concentração regional ou uma concentração em estado estacionário án vivo# o que resulta em uma redução mensurável em qualquer parâmetro relevante de doença.

[172] A quantidade de composto ativo a ser administrada depende do HTA, NTL derivado, peptídeo ou derivado dc mesmo selecionado, da doença ou condição exata, a via de administração, a saúde e peso do receptor, a existência de outro tratamento concorrente, se existir, a frequência do tratamento, a natureza do efeito desejado, e o julgamento do praticante especialista.

[173] Uma dose única preferencial, administrada uma vez por dia para o tratamento de um sujeito, preferencialmente um mamífero, mais preferencialmente humano que está em sofrimento, ou susceptive! a IPF deste resultante é de entre cerca de 0,2 mg kg e cerca de 250 mg/kg, preferenoiaimente entre cerca de 10 mg/kg e cerca de 50 mg/kg, por exemplo, através de instilaçâo (por inalação} <. Uma dita dose .pode ser administrada diariamente durante qualquer lugar a partir de cerca de 3 dias a uma semana ou mais. A administração crônica também é possível, embora a dose possa ter de ser ajustada para baixo, como é bem compreendido na técnica. As faixas precedentes são, no entanto, sugestivas, já que o número de variáveis em um regime de tratamento individual ê grande, e excursões consideráveis a partir destes valores preferenciais eâo esperadas.

[1.74] Para a administração continua, por exemplo, por um sistema de bumba como uma bomba osmótica que foi utiUsada, em alguns dos experimentos descritos abaixo, uma dosagem total para um curso dé tempo de cerca de 1-2 semanas ê, preferencialmente na faixa de 1 mg/kg a 1 g/kg, de um modo preferencial 20-30C mg/kg, mais preferencialmente 50-200 mg/kg. Depois de um dito regime de dosagem continua, a concentração total do composto ativo è preferencialmente na faixa de cerca de 0,5 a cerca de 50 uM, preferencíalmente cerca da 1 a cerca de 10 uM.

[175] Üma concentração eficaz do composto ativo para a inibição ou prevenção de inibir a apoptose in vitro, está na faixa de cerca de 0,5 nM a cerca de 100 nM, mais preferencialmente 6® cerca da 2 nM a cerca de 20 nM. As doses eficazes e os intervalos de dose ideal podem ser determinados in vit.ro utilizando os métodos aqui descritos.

[176] Tendo agora descrito geralmente a invenção, a mesmo serà mais facilmente compreendido através de referência aos seguintes exemplos, que são fornecidos a titulo de ilustração, e não se destinam a ser limitativos da presente invenção, a menos que especificado. Os exemplos são incluídos para demonstrar modalidades preferenciais da invenção< Deve ser apreciado pelos especialistas na técnica que as técnicas divulgadas nos exemplos que se seguem representam técnicas descobertas pelo invenção para funcionar bem na prática da invenção,· e assim podem ser consideradas como constituindo modos preferenciais para a sua prática, No entanto, os especialistas na técnica devem, â luz da presente descrição, apreciar que muitas alterações podem ser feitas nas modalidades especificas que são reveladas e ainda assim obter um resultado igual ou semelhante sem. se afastar do espirito e escopo da invenção.

EXEMPLO 1

Expressão de p53 em FL—Fibroblastos mortos em Focos fibrõticos de Pulmões IFF [177] Coloração de seções de pulmão de pacientes IFF e sujeitos de controle normais com vários reagentes, incluindo por imunohistoquímica (IHQ} (ver Fig. 2A-2I) revelou que os tecidos IPF exibem focos fibróticos que são densos com ECM. EL- fibroblastos dispersos nos focos ricos em vimentiua apresentaram coloração minima para antigenos p53 e PAI-l. No entanto, a coloração de imunofluorescência para SP~C, PAI-l, p53 e caspase3 ativa (não mostrados) demonstraram que as células alveolares tipo II (ATII) gue rodeiam os foces fíbróticos mostram coloração elevada para antigenos p53 e PAI-l, e são positivos para caspase-3 ativa, o que indica a apoptose de células ATI! circundantes. Os resultados IHC revelam qua as células ATI! que encerram focos fibrôticos continuamente morrem devido a um aumento da expressão de p.53 e PAI-l. Estas feridas são substituídas por fibroblastos ativados que mostram p53 mínima basal e PÁI-1, e elevada coloração de ki-67 indicando a proliferação devido á supressão de p53 e expressão de PAI-l.

jKtNf^.'T&jPIxJK jwxLi* Λ · X

Diminuição de Caveolina-l, p53 e ΡΆΧ e Auxaento da uPA em Humanos FL fibroblastos dos 1BF [178] Os Usados celulares de fibroblastos NL- e FLforam coradas imunologicamente para revelar alterações nas proteínas e um miRÁA. veja Fig.3A-3S. A expressão basal de miR~ 34a foi sign!floativamente menor nos EL™fibroblastos indicando que reduziu a expressão da p53 e consequentes alterações nu oross-talÀ de sistema fibrinolítico p53~uPA contribuiu para fibrogênese. Essas alterações estão associadas com o aumento da col-l e inibição da min~34a. Os resultados demonstraras· ainda que o aumento na transcrição de miR~34a induzida por p53 ou estabilização de p53 em fibroblastos humanos mediadas por FLfibroblastos mediada por miR~34a pode atenuar a fibrose p-ulmonar.

ExpressãodisparatedemRNAade uPA, PAI-l e col-1 pox fibrublastos de Pulmões IFF « aomis , [179] 0 RN'A total isolado s partir de tecidos pulmonares de sujeitos normals e pacientes com IFF ou NL- foram testados para mRNA de UFA, PAX~.l e col-I por RT-PCR quantitative s normalizados para os niveis de mRNA. correspondentes de Santina. Os resultados são mostrados nas Figs. 4A-4S.

[180] Expressão de mRNA de col-I e PAI-1 aumentou, significarivamente em tecidos pulmonares IFF enquanto que mRNA de uFA foi reduzida. Curiósamente, ao contrário de tecidos pulmonares IFF, mRNA Do col-I a uPA o menor nível de expressão de mRNA de FAI-1 foram encontradas em FL-fibroblastos em comparação com NL~.f ibroblastos. A proteína uPAR e mRNA também são elevados em FL-fibroblastos> A elevada FAI-1 nos tecidos pulmonares pode ser atribuída a um aumento da expressão de PAI-1 por células epiteliais do pulmão ou macrófagc-s, em vez de FL[IFF}-fibroblastos. Isto é consistente com um aumsnto da expressão de ool-I, uPA e uPAR e proteínas PAI-1 reduzidas em EL-fibroblastos de pulmão IFF (ver Figura 3A).

&XWFLO XV

Pspressão Diferencial de uPA a PAI-l per FL- vs NLf ibrohlas tos de camundongos [181] FL-fibroblastos foram isolados dos pulmões de camundongos 21 dias apds a lesão BLM ou NL-f ibroblastos de camundongos de controle expostos a salina intranasal,· conforms descrito em outro local» Os Usados de NL- o FL~ fibroblastos foram corados imunologicamente. Alterações na expressão de proteínas p53, de uFA, PAI-1 e col-I foram detectadas por imunotransferência de lísados da células de NL- o FLfibroblastos» (Fig. 5A-5D}. O RNA total foi extraído a partir de

NL- e FL- fibroblastos de tecidos de pulmão do camundongo dos tecidos pulmonares dos camundongos oom fibrose induzida pur BLN ou de controle (tratados com salina} e testados para mRNA de uFA, PA.I-1 e co .1-1, às taxas de proliferação de NL e FLfibroblastos de camuudongos foram comparados. Consistente com FL(IPE)-fibroblastos de pulmões IPf\ a taxa basal da proliferação de FL(BLM>-fibroblastos murines foi sign!ficativamente maior do que de NL-fibroblastos (a partir de camundongos tratados com salina), p53 inibiu a transcrição do gene do uPA, simultaneamente ligado a urn promoter de PAI-1 a transcrição aumentada de mRNA de PAI-l^s3~^J*. p53 também inibiu a expressão de uPA e uPAR pur desestabil inação das suss transcrições, enquanto a estabilização do transcrito de PAI-P³ Pur último, inibição de qualquer uF.A ou uPAR aumenta a expressão da p53 e indução mediada por p53 a jusante de PAI-X, aumentando assim a senescéncia celular e apeptose. Co.nclui.u-se que a regulação mediada por p53 de sistema uFA-fib.ri noli tico nos níveis de transcrição e põs-transcrição está comprometida em FLfibroblastos devido à ausência da expressão de p53. Isto leva a um aumento de uF.A. e uPAR, e inibição de PAI-1 nestas células.

EXEMPLO V

CEF Aumenta Expressão de p53 via indução da miK-34aem. FL(IFF)-Fifer dblastoe .

[ 4.82 j ML— e F.U—r rerun la st os tor am tratados com C3F e CP e analisados para RNA para miR-34a pur FCF. em tempo real. Aiár: disso, us FL-fibroblastos foram cultivados na presença de PBS ou CSP ou CP com. ou sem o miR-34a antissenso (miR-34a-AS) ou pré-miR-34a (controle miRNA). C meio condicionado (CM) a partir destas culturas foi imunotransferido para PAI-l e üsados celulares (CL) furam corados imunologicamente para p53. Em um experimento, FL-fibroblastos foram tratados com P8S ou CS? ou CP ou na presença ou ausência de miR~34a~AS, pré~m.iR~34a ou. controle mlR. O RNA foi analisado para alterações em miR~34a per PCR em tempo real. Os resultados são apresentados nas Figuras 6A--6C, [183] Uma série de delações sobrepostas foi realizada em. CSP e estas fragmentos peptidicos foram testados em FL~ fibroblastos para alterações em p53, uPA, RAI~1 e col-l {Fig. 6DI .

[184] CSP aumentou significativamente expressão de miR~ 34a e de p53 em FI<~ mas não em NL~fibrcblastos. A. indução de p53 por CSP foi imitada por expressão de pré-míR-34a sozinho o abolido pela inibição de miR~34a por miR-34a-AS. Isto indicou que a indução de p53 ocorre através da estabilização mediada por miR™34a.

[185] A análise de deleção do CSP 20mer revelou que um fragmento interno de 7 aminoáoidos,· denominado CSP-4 e tendo a sequência FTTFTVT (SE$ ID NO: 1) apresentou a atividade do peptideo de comprimento total. Isto permite concluir que o efeito salutar de CSP-4 em. F.L-f.Íbro.blastos ou camundongos com fibrose pulmonar estabelecida (ver figura 11A-11D), envolve o controle de p53 e expressão da m.iR~34a.

EXEMPLO VX

Mdm2 mediou o aumento da degradação d® proteínas pS3 a® [188] Cs Usados de NL~ a F.L fíbroblastos foram corados imunologícaments para p53 e mdm2 ou ímunoprecipitados com anticorpo antí~m.dm2 e imunotrans ferí dos (18} para a proteína pS3 associada. Oa resultados mostraras: a interação robusta. mdm2-p53 em NL~fibroblastos que estavam, ausentes em FL~fibroblastos (ver

Fig 7A-7B), apesar de níveis elevados de mdm2 nos ELfibroblastos. Assim, o aumento da degradação mediada por mdm2 da proteína p53 contribuiu para a supressão acentuada dos níveis de p53 basal nm FL~fibrobíastos, suportando a utilização de intervenções terapèuticag aqui divulgadas para ter como alvo a interação de mdm2 e põ3.

BXEMFW VIX

Inibição médiádá. por Nuflip^-la(t?TL) oa CSP-4 da Expressão de col-~X sã F& (XFF)-f ibroblasto«: Papel do cross-talk de sistema *pS3 [187] FL-fibroblastos foram expostos a PBS {controle}, nutlina~3a (10 uM), CSP-4 (10 nM) ou CP durante 48 horas. Os Usados foram imunotransferidcs para a expressão de col-I, PA11, p53, e uPA. Os resultados são mostrados na Fig» 8A-8B» FL~ oultivados foram expostos ao veículo (BBS) ou nutl.in.a-3a, CSF-4 ou C? e contados para avaliar a proliferação. Os resultados mostraram que ambas n.utlina-3a e CSF-4 inibiram a expressão de col-l e a proliferação de FL-fibroblastos. O processo envolve a. indução de expressão de p53 e PA1-1, e a inibição concomitante do uPA.

[188] Num outro experimento (resultados na Fig. 80;, FLfibroblastos foram transduzídos com o vetor de adenovirus expressando p53, PAI-1 ou ca.veolina-1 ou os controles de vetor apropriados e cultivados durante 2 dias em cujo tempo os Usados celulares foram imunotransferidos para col-I, p53, FAI-1, e uFA» Transdução de FL-fibroblastos de pulmões IFF com p53 e ΡΆΧ-1 induzida por Ad-Cav-1, inibindo a expressão de uFA e col-I. Os efeitos de nutlina-3a eu CFP-4 em FL--fibroblastos foram imitados expressando p53 ou. PAX-1 ou oaveolína-1 sozinhos. Por conseguinte, a indução mediada por p53 de PAI-1 e inibição da expressão de uPA contribuem pars a inibição de col-I. Curiosamente, o tratamento de FL-fibroblastos dos pulmões des pacientes com. IFF ou camundengcs tratados com BLM com proteína PAI-1 recombinante não conseguiu Indusir a apeptese ou senescêncla (não mestrado), enquanto que ο ΡΑΙ-1 exõgeno elevado induziu apoptose de células ATII, tanto In vitro como in alvo. A resistência dos FL-f ibroblastos para PAI-l. exógena permitiría que essas células florescessem em um ambiente rico em proteína PA.X-1 de pulmões IFF ou lesionados por BLM.

VHX

Papel d® Cross-talA de Sistema pSS-Fibrinolitico am Indução de expressão dq cql-X em ibroblastos<

[189] NL-fibroblastos isolados a partir de pulmões histologicamente normais humanos (S. Shetty et al, 1996, supra) foram transfectados com um vetor lentivíral carreando p53 shRNA para inibir a expressão de p53 basal. As células de controle foram tratadas de modo semelhante com um shRNA não específico. 0 meio condicionado a partir das culturas foi imunotransferido para o PAI-1, uPA, e col~I solúvel, e os lisados de células foram testados pars a p53 e <x-SMA, O RNA total isolado a partir destes fibroblastos foi analisado para alterações na expressão de mRNA de uPA, ,PAI~1 e col-I per RT-PCR quantitativo. Os resultados (na Fig 9A-9B) mostram que a inibição da expressão de p53 em NL-fibroblastos aumentada de uPA, co.l-1 e σ-SMA, mas inibiu PAI-1. Isso apoia a ligação descrita aqui entre as alterações mediada por p53 no sistema uPA e fibrogênése>

bxeufIíO xx

Nutlina-ãa. Inibe a fibroso pulmonar em camundongos tratados Cüffi BIM

Í19GJ Os camundongos expostos a BLM (ou. salina nos controles) para 14 dias para induzir a fibrose pulmonar foram injetados XV com nutii'na-3a (15 mg/kg de peso corporal) (2hang et al, supra) ou um controle de veiculo para determinar o efeito sobre fibrose pulmonar estabelecida foram avaliados. A fibrose foi avaliada por tomografia computadorizada e função pulmonar (complacência e resistência} foram medidas utilizando o sistema Flexivsnt. Seções de pulmão foram submetidas a coloração com trier orno e coloração com Η & E (este último não· representado) para avaliar a arquitetura pulmonar a deposição de colágeno, como uma indicação de fibrose. Finalmente, homogeneizados de pulmão total foram analisados para colágeno total (hidroxiprolina) e conteúdo de desmosina (Bhandary YF et al, Am J Physiol: Lung Cell Mol Physiol 302: L453-73, 2012; Bhandary ¥P et al, Am J Pathol, 183: 131-43 2013} como uma avaliação independente da ECM. Os resultados (Fig 10-10D) de tedos os testes acima ditos indicou um efeito benéfico de nutlina~3a em fibrose pulmonar. A administração oral de nutlina-3a 14 dias após a lesão BLM da mesma forma inibiu a fibrose, pulmonar em camundongos.

EXEMPLO X

Peptídeo CSF-4 Inibe a Fibrose pulmonar estabelecida e melhora a função pulmonar.

[1911 Os camundongos foram, expostos a BLM para induzir a fibroso pulmonar. Após 14 dias, os camundongos foram injetados IV com qualquer veículo ou 1,5 mg/kg de peso corporal de CSP-4 {SEQ XD NO: 1} ou peptídeo de controls (sequência misturada dos mesmos aminoácídos; CP, SEQ XD NO; 5} ) com. 1,5 mg/kg de peso corporal ou o veículo foi injetado por via intravsnosa em camundcngcs expostos a SuM 14 dias mais cedo. Uma semana mais tarde, os camundongos furam testados por varrimento de CT para avaliar a fibrose pulmonar. Q volume pulmonar foi medida nos mesmos camundongos utilizando rendições CT quantitativas. Seções de pulmão furam submetidas coradas (tricrcmo u Η & E; para avaliar a deposição de oolágeno como um indicador da fibrose pulmonar. Homogeneizados de pulmão total foram analisados para hidroxiproüna total e conteúdo de desmosina (os últimos resultados não apresentados)< Os resultados estão nas Figs. 11A11D. Todos os testes mostraram que o CSR-4 inibiu fibrose pulmonar induzida por BLM. Consistente com os efeitos In vitro de ambos CS? e CSP -4 em EL-fibroblastos de pulmão IFF (ver FIG 6D), o CS?-4 exerceu um efeito benéfico in vivo contra fibrose pulmonar estabelecida, imitando os efeitos salutares do peptídeo de comprimento total, CSF (SEQ ID NO: 3} .

EXEMFL0 XX

Peptídeo CSP-4 e nutlin&-3& inibem a proliferação de FL~ fibroblastos, [192] Os camundongos expostos a BLM 14 dias antes foram tratados com CSP-4 ou o seu controle (CF) ou nutlina~3a XV (como nos Exemplos IX e Xj . Sete dias mais tarde seções de pulmão foram obtidas e submetidas a IHC para o Kí-67 para avaliar a proliferação celular (ver Figs, 12A). 0 aumento da coloração para antígeno® ki-67 observadas am seções de pulmão de camundongos fibrõticos foi significativamente reduzido pelo tratamento com nutlina-3a ou CSP-4. Os fibroblastos isoladas a partir dos pulmões destes animais (como descrito no Exemplo X) foram testados para as alterações na expressão de col-X, e p53 do uFA a jusante e proteínas PAX- 1 por Western blotting, e o mRNA por RT-FCR quantitativo (ver Figs. 12B-12C). FL~ fibroblastos de camundongos com fibrose induzida por BLb estabelecida mostraram, aumento de mRNA da u.PA e col-I e expressão da proteína em comparação com N'L~f ibrobiastos de camundongos sem lesão pulmonar. Estas células também demonstraram expressão mínima de p53 e FAl-l. No entanto, em fibroblastos de camundongos tratados com. nutlina~3a, urA e proteína coJr-I e a expressão de mRNA foram suprimidos de modo significativo. Estas alterações foram associadas com a indução mareada da proteína P53_f e proteína FAI~1 e expressão do miRNA, indicando que a restauração do cross-· calx? do sistema pS3 fíbrinolítico atenua fibrose.

κιχ

Inibição de altnrações f ibrõticas por tratamento ex vivo com CSP-4 ou nutllna-Sa [193] Cs oamundengos foram expostos a BLH intranaaal por 21 dias para induzir a fibrosa pulmonar, sacrificados a os seus pulmões excisados e cortados em pequenos pedaços e colocados em meio de cultura. Estas amostras de tecido foram depois tratadas com 10 nd de peptídeo CSF-4, peptídeo de controle (CP) ou nutl.ina-3a por 72h. Meio condicionado e li.sados de tecido foram analisados para alterações cm col-1 e a-SMA por Western blotting. Os resultados (Fig. 13} mostraram que o tratamento de explantes de tecido pulmonar fibroticcs com CSP~4 ou nutlina~3a inibiu a fibrose ex vivo. Q peptídeo CEP de comprimento completo gerou inibição semelhante da ccl~I e o-EMA (resultados não mostrados) . Nutlina-3a e CSP-4 são esperados para agir de forma semelhante a afetar os tecidos do pulmão IFF humano ex vivo. Resultados dos presentes inventores fornecidos aqui a em relatórios recentes (por exemplo, Bhandary et al, 2012, 2013, supra), apoiam fortemente a concepção de quo mudanças mediadas / 71 por ρ53 à jusante em uPA e PAX-1 regula a viabilidade de FLfibroblastos.

BKEMFLO KZII

Expressão d® p53 em FL-fibrcblastós e Reversão a jusante do Sistema uPA-fibrinolitico atenua Fibrose Pulmonar tn vivo.

[194] Qs resultados relatados aqui e em outros lugares CBhandary YP et ai, 2Q12, supra) Shetty SK et al, Am J Respir Cell Mol Biol 47· 474-83, 2912} mostram que a administração IF ou IV do CSP ou. CSP-4 (Fig. 11A-11D) , ou IV, ou a administração oral de nutlina~3a em camundongos tipo selvagem (WT) (Figura 10A-10D), com inicio 14 dias após BLM atenua a fibrose pulmonar estabelecida. Por conseguinte, a degradação mediada por mdm2 da proteína p53 e da perda à jusante do cross-talk de sistema p53~ uPA aumenta a viabilidade de EL-fibrcblastes e produção de ECM ia vivo, conduzindo à destruição da arquitetura pulmonar e perda de função pulmonar. Como os pacientas muitas vezes apresentam-se com estágios avançados de IFF (no momento do diagnóstico inicial), os mecanismos pelos quais nutlina-3a e CSP-4 inibem a fibrose pulmonar estabelecida são avaliados e os alvos a jusante de nutlina-3a e CSP-4 são identificados. Estes estudas utilizam tecidos pulmonares de pacientes XRF e camundongos com fibrose pulmonar avançada devido a lesão pulmonar BLM» A contribuição e a especificidade de cross-talk de sistema p53~uPA é confirmada usando camundongos deficientes em uPA, uPAR, PAI-1 e ρ33.

A, Determinação dos efeitos de nutlina-Sa e CSP-4 ao tratamento de fibroso utilizando tecidos FL (FFI) ex vivo, [19ã] Os tecidos pulmonares EL recém dissecados de pacientes com IFF são tratados com nutlina~3a (ΙΟρΜ) ou CSF-4 (10 nM) durante 3 a 7 dias (ver Figura 13) . Tecidos de pulmão homogeneizados e são testados para mudanças em ECM (hidroxiproiina e desmasina). Cs controles inuiuem tecidos pulmonares fibróticos (FL) de pacientes cam IFF tratados com veículo ou com. peptídeo de controle, CF ou tecidos pulmonares naive mantidos em. meio de cultura. Outros controles incluem DLtecidos ressecados de pulmões histologicamente normais. Pulmões de paciente de-identifícado (normal e IFF) que não foram adequados para o transplante e doados para a investigação médica são obtidas par meio de IIAM (Edison, NJ) e N.DRX (Philadelphia, PA) e usados para estudas ex vivo. Os fíbroblastos são isoladas a partir destes tecidos e analisados para alterações em expressão de p53, uPA, uPAR e PAI-1, produção de ECM e viabilidade, As alterações na taxa de sintese de ECM são também medidas. Explantes de tecida FL de pacientes cam IFF têm elevada de sintese de ECM quando em comparação com os níveis de expressão nas fatias de ML-tecidos a partir de sujeitos de controle. Nc· entanto, os explantes de pulmão FL tratadas com nut.lina~3a ou CSP-4 mastram redux idas signifioativamente as taxas de sintese de .ECM quando comparadas cam aqueles que permanecem sem tratamento ou expostos a veículo sozinho ou CP, Os fíbroblastos isolados a partir de explantes IFF tratados com ou nutlina-3a cu CSP-4 mostram níveis elevados de p53, miR-34a e PAI-1, e reduzida expressão de uPA e uFAF, A fosforílação de Akt e expressão de mRNA de ROGER-3 e proteínas também é reduzida em fíbroblastos a partir de explantes IPF tratados com nutlina~3a au CSP-4. A taxa de proliferação e produção de ECM desses fíbroblastos é significatívamente mais baixa do que de EL.fíbroblastos a partir controles não tratadas ou tratados com veiculo ou que foram tratados ucm CP, mas comparável com a de fíbroblastos isoladas a partir de NL-tecidos.

B, Papal da pS3 e miR~34a no controle da fibrose pulmonar.

[186] Com bass nos resultados acima, prevê-se qua a falta de expressão de p53 e de miR-34a por FL-f ibroblastos contribui para a fibrose pulmonar e que a recuperação basal de expressão de p53 por nutlina-3a ou CSP-4 através da indução de miR-34a reduz a fibrose pulmonar. Uma vez que a fibrose pulmonar máxima ocorre entre 14-28 dias apôs a lesão SLR (Bhandary ¥8 et al, 2012, supra; Bhandary YP et al, 2013, supra; a os dados aqui apresentados) pré-miR~34a é expresso em fibroblastos de pulmão do camundongo por injeção XV de lentivirus (LV) contendo promotor de colágeno proo2(X} com prê-mi.R-34a aos 14 e 21 dias apôs a lesão pulmonar BW. Fibrose pulmonar ê avaliada 28 dias depois. O papel dc míã-34a na mitigação mediada per nutli.-n.a-3a ou CSP-4 de fibrose pulmonar é confirmado pela expressão LV de miR-34a-AS em fibroblastos usando promotor pro<x2(I) nos pulmões fibróticos<

[137] O papel da p53 nos efeitos salutares contra a fibrose pulmonar é confix'mado diretamente pela, expressão de p53 em fibroblastos de pulmão de camundongos com fibrose estabelecida usando LV ou Ad-p53 contendo promotor de colágeno proo(X) com ou sem inibição do miR-34a. Fibrose pulmonar e expressão dc miR~34a ê avaliada, por exemplo, 28 dias após a lesão 8LM. Alternativamente ou adiciona Imente, a expressão de p.53 é inibida utilizando LV shRNA em camundongos WT com fibrose pulmonar induzida por BLM ou uso de camundongos deficientes em p53 com fibrosa pulmonar estabelecida (Davis DW et al, J Exp bed 182: 857-86$, 2000). Estes camundongos são então expostos a nutlína-3a ou CSF-4, por exemplo, 14 e 21 dias após a lesão BLM. Os camundongos de controle com fibrose pulmonar são expostos a ShRNA não específica ou camundongos WT naive e tratadas ccm nutlina-3a ou CSP-4. Gs camundongos são testados para a. fibrose pulmonar e expressão de miR~34a# por exemplo, 28 dias apôs o íníoio da lesão 313. A contribuição do cross-tal.% de sistema pS3-u?A é .confirmada por exposição de camundongos %^TT_f deficientes em p53, uPA, uPAR e PAX-1 para BLM para 14-21 dias para induzir fibrose pulmonar, alterar a expressão de mi.R-34a em fibroblastos, como descrito acima, e testar us efeitos na fibrose# por exemplo, nu dia 28 após a lesão BLM.

C< Restauração da expressão da p53 e p53“Ul*A a jusante do cross-tall: de sistema fibrinolitioa per nutlina-3a ou CRR-4 inibe a fibrose pulmonar.

[198] A contribuição de cross-talá de sistema f ibrin.olitiuo p53-uPA na mitigação de fibrose pulmonar por nutlina-3a e CSP-4 em camundongos é confirmada isolando fibroblastos destes çamundongos# por exemplo, 28 dias apôs a lesão PX»M. Estas células são testadas para alterações em expressão de p53, uPA# uPAR e PAI-l e produção da ECM. Esperamos encontrar que os Fl-fibroblastos isolados dos pulmões de camundongos cost; lesão BLM mostrarão elevados uPA e uDAR, viabilidade e produção de ECM. Estes FL-f ibroblasto-s mostrem expressão de p53 minima e PAI-1 em comparação com NLfibroblastos de pulmões não lestonados. Fo entanto# os fíbroblastos dos pulmões dos camundongos com fibrose induzida por B1M expostos a nutlina-3a ou CSP-4 mostram p53 elevada. Estas células são menos prolíferatívas com uma produção mínima de ECM. A expressão de uPA -e uPAR é reduzida enquanto RAI-1 aumenta em comparação cora FL~fíbroblastos obtidos a partir de camundongos lestonados BXM. Híveis de uFA# uFÁR e FAX-1 em fibroblastos de pulmão de camundongos tratados com BLM r nutlína-3a ou -t- CSR-4 são comparáveis aos NL-fibroblastos isolados a partir de camundongos não íesionados.

Para confirmar ο envolvimento do cross-tali de sistema p53-uFA, FL-f ibx'oblastos extraídos de pulmões les tonados per BLM de oamundongos sac transduzidos cot; Ad~p53> Os fibroblastos de pulmões lesionados por BX^4 expostos a nut1ina-3a ou CSP-4 são oa controles positivos, enquanto aqueles expostos a CF ou Ad-EV são controles negativos. As células sãc testadas para mudanças em uPA, uPAR e PAI-1.

[200] Transdução de Ad-p53 ou o tratamento com nutlína3a ou CS.P-4 aumenta PAX-1 e inibe a expressão de uPA e uPAR. Estas células suprimem a produção de ECM e uma taxa de proliferação em comparação com FL~fibrnbiastoa expostos a CP ou Ad-EV. FL-fibroblastos da camundongos BL.-M expressam níveis extraordinariamente baixos de eaveelina-1 e a expressão da caveolina-1 atenua o excesso de produção de ECM. Portanto, FLfibroblastos são transduzidos com Ad-Cav-1 para ver se p53 e mudanças à jusante mediadas por p53 em sistema uPA fibrinolítico, ECM e viabilidade celular são reduzidas em comparação com os tratados com. Ad-EV.

p. Rapei da mediada por nutlina-Sa- ou CSP-4 na inibição da fósforilação da Akt na mitigação de fibroso pulmonar, [201] FL-fibroblastos exibem elevada fosforilação de A.kt e expressão de FüGFR-β que fornece sinais de sobrevivência sStamboiic V et al Mol Cell 8: 317-25, 2001; Li J er. al 0 Environ Pathol Toxicol Oncol 23: 253-86, 2004; Hoyle GW et al Am 0 Pathol 154: 1763-75, 1999; Reinecke AK et al Blood 14: 119: 5931-42, 2012) . Além disse, a p53 aumenta a expressão de PTEN (Stambolic et al, supra; Mayo L.D, et al J Riel Chem 277: 548489, 2002} e inibe a PDGFR-6 (Widau RC et al, Mol Cell Biel 32: 4270-82, 2012; Thornton JO et al, Ceil Cycle 4:1316-9 de 2005), enquanto cue o PAI-1 inibe a fosforilação de Akt (Shetty SK et al, 2012, supra; Stambolic et. al, supra, Malinovsky K et al Trans1 Oncol 5: 98-104, 2012}. Transdução de FL~fibroblastos oom Ad-Cav-1 inibe a fbsforilação da Akt através do aumento da atividade ETEN (Tourkina E st al Open Rheumatol J. €: 1.16-22 2012; Wang XM et al 2 Exp Med 203: 2895-906, 2006; Xia H et al Am J Pathol 178: 2626-37, 2010}.

[202] Os resultados aqui apresentados mostraram que nutlína-3a e CSP-4 aumentam p53 e .repfimem a produção de BCM em FL-fibrcblastcs, e mitigam a fibrose pulmonar induzida por BI24. Os inventores da presente invenção, por conseguinte, conceberam que a Inibição de Akt e sinais de sobrevivência PDGFR-β em FL<fibroblastos, devido à indução de p53 e alterações em cxos-talk de sistema fíbrinolltico p53-uPA, atenua a fibroso. Para testar isto, FL~fibroblastos de pulmões de camundongos lesionados por But· são testados para a fosforilaçào de Akt s expressão de PDGFR-β. As respostas são comparadas com os fibroblastos extraídos a partir de camundongos tratados com nutlina-3a ou CSP-4 ou CP apôs a lesão por BLM. Espera-se que FL~fibroblastos de camundongos lesionados por BLM tenham uma expressão minima de. p53 basal e a fosforilação de Akt elevada. Expressão de PDGFR-3 A esperada aumentar em FL-.fibroblastos. p53 deve ser aumentada em fibrcbiastos de camundongos tratados com ou nutlína-3a ou CSP-4, que conduz à inibição da fosforilação de Akt e expressão de PDGFR-β. Uma vez que FL-f ibroblastos de camundongos lesionados por BLM expressam mais uPA e u?AR, estes fibroblastos manifestarão aumento da viabilidade e ECM comparação com fibroblastos da camundongos tratados com ΒΧ2Ί mais nutlina-3a ou CSP-4. Ne entanto, a transdução de FL-fibroblastos de camundongos SLM com Ad-p53 ou Ad-Cav-1 irá reduzir a fosforilação da Akt e PTER, expressão de PDGFR-E, a viabilidade celular e produção de ECM em comparação ca® células de controle tratadas com Ad-EV. A inibição da p53 usando shRNA vai inibir a produção de ECM, expressão de FDSFR-β e viabilidade de FLfibroblastos expostos a Ad-Cav-l ou nutiina-3a ou CSP-4. Estas células irão mostrar elevada uPA e u8A8. co®, o mínimo de PAI-1 em comparação com FL-fibroblastos transduzidos com. Ad-Cav~l eu. nutlina-3a ou CSP-4 na presença de shRNA controle.

[203] De acordo com a presente invenção, porque pacientes co® IFF,· muitas vezes apresentam-se com doença f.íbrótica avançada no momento do diagnóstico,· ter como alvo FLfibroblastos tem uma vantagem clínica sobre a prevenção de apoptose celular AT II ou transição mesenguimal epitelial. hutlina-3a e CS.F-4 induze® eficazmente a p53 apenas em. F.Lfibroblastos acentuadamente reduzidos para o p53 basal e a expressão elevada de mdm2 em FL-.fibroblastos em comparação co® HL~fibroblastos cu células ATII em pulmões lesionados. Isto é particularmente verdadeiro com células expressão de cavsolina-1 e p53 em ATI1, que é ®arcadamente aumentada nos pulmões dos pacientes com I.PF ou çamundcngos cam lesão pulmonar BEM. .Co® base neste experimente, outra indução de p53 em células ATII não está prevista em resposta a nutlina-áa ou C8P-4 por causa dos níveis basais mais elevados em pulmões BLM ou IFF. De fato, os presentes inventares e seus colegas descobriram que CSP ou CSP-4 inibira® expressão de célula ATII induzida par fumaça de cigarro ou BLM e apoptose (Bhandary et al, 2012, 2013, supra; Shetty SK et al, Am 0 Respir Cell Mol Biol 47; 474-03, 2012) através do bloqueio da fosforiiação de p53 de serin.a~lS mediada por ATM quinase ao competir com caveolina-1, que é de outro modo induzida em células ATI! devido a lesão BLM para proteína fosfatase 2A-C (Volante D et al, . J Biol Chem 284 ; 5462-68,

2009) . Além disso, a ação de nutlina~3a em. neutrôfilos e aiacrôfagos podia ter um efeito benéfico contra a inflamação através da inibição mediada por p53 de atividade de ligação ao DNA de NF-K.B DNA e a produção de citocínas prõ~inflamatórias (Liu d et al_f J. Immunol 182:. 5QÕ3-71, 2009; >

(204 ] Portanto, os benefícios de intervenções de nutlina-3a e CSP-4 superam quaisquer potenciais efeitos deletérios ou fora do alvo. Froliferação excessiva e produção de colágeno pron(I) pelos FL-f ibroblastos deverá conduzir a expressão eficiente de pré~miR~34a a miR-34a anti.ssen.so em. ELfibroblastos utilizando LV após fibrose pulmonar induzida por BLM. em camundongos (Liu et al X., Am 0 Physiol: Lung Cell. Mol Physiol 298:1:819-23, 2010; Merkel 0 et al, Cell Cycle 9: 2764-8,

2010) .

[205] Transdução de pulmões lesionados cos; BLM com AdCav-1 (R'ang XM et al. J Exp Med 203: 2895-905, 2006; ini.be a. fibrose apesar do aumento da expressão de caveolina-1 pelas células ATII durante a lesão ELM. isto sugere que a expressão de p53, prs-miK-34 e miR-34a antissenso devem ser ainda eficaz mesmo se transduzir NL-fibroblastos, bem como FL-fibroblastos em camundongos com fibrose pulmonar estabelecida.

[206] As referências citadas acima são todas incorporadas aqui por referência, se especificamente incorporadas ou não.

[207] Tendo agora descrito completamente esta invenção, será apreciado por aquelas especialistas na técnica que a mesma pode ser realizada dentro de urna vasta faixa de parâmetros equivalentes, concentrações e condições sem se afastar do espírito e escopo da invenção e sem experimentação indevida.

Claims (18)

1. REIVINDICAÇÕES lx Peptídeo que aumenta os nivele de proteína p53, reduz o at.iva.dor de pXasminaqênio de uroquinase {uPAJ e o receptor de ui?A. (uPAR), e aumenta a expressão de inibidor ativador do plasminogênio 1 (PAX-1) em fibroblastcs pulmonares fihrôticos (FIò, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo que consiste emi (a) um peptídeo designado CSP-4 cuja sequência é FTTFTVT (SEQ 13 3G: 1};

   (b) um peptídeo que é uma variante da. adição do dito peptídeo de CSP-4; até cerca de 20 aminoãcídcs de comprimento, que não é o domínio estrutural de caveolina-1 (Cav-X) de 2EQ 13 30: 3;

   (c) um derivado químico covalentemente modificado do dito,, peptídeo de CSP-4 (ai, (d) um derivado químico cc-valentemente modificado da dita variante de (b), suja variante ou derivado químico tem, pelo menos, 20% da atividade- biológica ou bioquímica do dito peptídeo de CSP-4 em um ensaio .in vitro ou ir vivo.
2. 2. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ê FTTFTVT (SEQ ID 30: 11,
3. 3. Multímero de peptídeo, caracterizado pelo fato de que compreende pele menos doía monômeros, cada monômero sendo dito peptídeo CSP-4, dita variante ou dito derivado químico de qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, cujo multírnero:

   (a) tem a fórmula geral Ρ'_!Λ em que (I) P¹ é dito peptídeo, variante ou derivado químico, e [ii; n - 2-5, ou (b; tem a fórmula. (P^:-X_{a Λ}---Ρ^<:, em que

   2/8 (i) cada um de e P'^; é, independentemente, o peptídeo, variante ou derivado químico, íiii cada um dug e P* é o mesmo ou diferente peptídeo, variante ou derivado (ill) X é ura grupo C1-C5 alquil, <h~Cs aíquenil, Cx~C_&~ alquinil, 0/-¾ políéter contendo até 4 átomos de oxigênio;

   {ív i m - 0 ou 1; e {v> n - 1-7, ou (o) tem a fórmula (P''-G1 yJ-v-W, em que:

   (i) cada um de P‘ e ?² é, independentemente, 0 dito peptídeo, variante ou. derivado, (ii) cada um de P^l e s'' é o mesmo ou diferente peptídeo ou variante ou derivado;

   {iii} z ~ 0-6; e (iv) n 1.-25, em que o peptídeo muitimero tem, pele menos, 204 da atividade biológica do peptídeo de CSP-4 era um ensaie in vitro ou í.u vivo.
4. 4. Composição de peptídeo ou polipeptídeo líberável, caracterizada pelo fato de que compreende:

   (a) o peptídeo, polipeptídeo, ou multimsro de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, e (b) uma molécula de liberação ou translocação ou fração a esta ligada ou associada com a mesma.
5. 5. Composição de peptídeo ou polipeptídeo líberável, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a molécula de liberação ou translocação ou fração é selecionada entre o grupo que consiste em (i) proteína HIV-TAT ou ura derivado ativo do mesmo de medo translocável;

   3/8 (ii) tendo a sequência de penetratina RQIKIWFQNRRbKWKK (REQ ID ND: 6);

   (iii) uma variante penetratina W48F tendo a sequência de RQIKIFFQNRRM.KWKK (SEQ ID NO: 7);

   Civ) uma variante penetrating N56F tendo a sequência de RQININFQNRRNNFKN (SEQ ID NO: 8};

   (v) uma variante penetratina tendo a sequência de

   RQIKIWFQNRRRKFKK (REQ ID NO: 9);

   (vi) transpsrtan tense a sequência GWTLNDACYLLGKIN OÜAA1AKKIL (REQ ID NO; 10);

   (vii) prsteína VF22 de virus herpes simplex ou um homólogo ativo de modo translocâvel do mesmo a partir de urn virus do herpes, como diferentes M'PV proteína UL49; e {viii) Pep-1, tendo a sequência ds KETWWEl'WWTE'WSQPKKKRKV (SEQ 10 NO: 11}.
6. 6. Composição farmacêutica antifibrótica caracterizada pels fato de que compreende:

   (a) o peptideo, variante ou derivado químico de qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, ou multimero de peptideo, de acorda com a reivindicação 3; e (b) um earreador ou excipients farmaceuticamente aceitável.
7. 7< Composição farmacêutica antifibrótica, caracterizada pelo fato de que compreende:

   ía) uma composição se peptideo ou pollpeptídes liberável, de acordo oum qualquer uma das reivindicações 4 ou 5; e ib) um carreador ou excipiante farmaceuticamente aceitável.
8. 8. Composição farmacêutica antif'ibrótica, caracterizada pelo fato de que compreende uma combinação da:

   (i) a composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 6 ou 7 e

   4/8 (ii) nutlina~3a (NTL) ou um. análogo quiral cis-imidazolina de NTL que inibe a interação de MDM2-p53, cujo análogo tem. pelo menos 20% da atividade biológica ou bioquímica de NTL em um ensaio in vitro ou in vivo;

   S. Composição farmacêutica antifibrótica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizada pelo fato de que é formulada para injeção ou instalação pulmonar.
9. 10. Composição farmacêutica antifibrótica, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que é formulada para ínstilação pulmonar.
10. 11. Método para aumentar os níveis de proteína p53, reduzir expressão de uPA e uPAR e aumentar a expressão de PAX-1, em FLfíbroblastos e reduzir a proliferação de fíbroblastos, caracterizado pelo fato de que compreende proporcionar á ditos FL-fibroblastos uma quantidade eficaz de um composto ou composição que inibe a interação de MDM2 com proteína pS3 e degradação mediada por ΜΏΜ2 da p53, em. que o dito composto ou composição e:

    (a) NTL ou nm análogo quiral eis-imidazolína. de NTL que inibe interação MD^2-pS3, cujo análogo tem pelo menos 20% da atividade biológica ou bioquímica de um em: NTL em ensaio in vitro ou in vivo;

    (b) o peptideo ou variante de peptideo, de acordo com. qualquer uma das reivindicações 1 ou 2;

    (c) o multímero de peptideo, de acordo com a reivindicação 3;

    (d) a composição peptideo, polipeptideo ou multímero liberável, de acordo com qualquer um.a das reivindicações 4 ou 5;

    (e) uma combinação de qualquer um de (a) a (d.); ou (f) a composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma cl&s .c&.í vi.nci ic« co&s β >s 10»
11. 12, Método, de acordo com a reivindicação H, caracterizado oa.io fato de uns o composto é NTL.
12. 13« Método, de acordo cos a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o composto é dito peptídeo C5r4 FTTETVT (S.EQ ID fcjQ ^y ': í
13. 14. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o composto é dito muitímero de peptídeo.
14. 15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de quo cs dito multímero de peptídeo compreende monômeros de peptídeo, cada um dos quais é peptídeo CSP-4 pççpTpç (BEQ TD DO: 1}
15. 16. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o NTL é NTL ou análogo de NTL.
16. 17. Método, de acordo com. qualquer uma das reivindicações II a 16, caracterizado pelo fato de que o dito torne cimento é ,ín
17. 18. Método para trataxuento de um sujeito mamífero tendo uma

    

    

    26 < Uso, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o dito composto é:

    (a) NTL ou um análogo quiral cis-imídazolina de NTL que iniue interação de MDM2“pS3, cujo análogo tea^-» pelo menos 208 da atividade biológica ou bioquímica de um em NTL em um ensaio ia vitro ou in vivo;

    (b) o peptideo ou variante de peptideo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2; ou (c) o multímero de peptideo, de acordo com a reivindicação 3, ou (d) uma combinação de qualquer dos compostos de qualquer de (a) a (o) .

    27. Uso, de acordo oom a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a dita composição é a composição de peptideo, polipeptideo ou multímero llberãvel, de acordo com qualquer -uma das reivindicações 4 ou 5.

    28. Use, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a dita composição é a composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações € a 10,
18. 23. Uso de um composto ou composição, caracterizado pelo rato de que é para a fabricação de um medicamento para tratamento de fibrose pulmonar, cujo composto inibe a degradação mediada por MDM2 da protei.ua p53 e aumenta os níveis de proteína p53, reduz os níveis de expressão de uPA e aumenta PAI-1 em FLi i brob x a st.es *

    30, Uso, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o dito composto é;

    (a) NIL ou um análogo quiral cis-imídazolina de NTL que inibe interação de HDM2~p53, cujo análogo tem pelo menos 208 da

    S / Β atividade biológica ou bioquímica de Nil em um ensaio in vitro ou in vivo;

    (b) c· peptídeo ou variante de peptideo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2; ou (c) o multímero de peptideo, de acordo com a reivindicação 3- _f ou (d) uma combinação de qualquer um dos compostos de -a) a (c? .

    31. Uso, de acordo com a reivindicação 29,- caracterizado pelo fato de que a dita composição é a composição de peptideo, po.lipept.ideo ou composição iíberàvel de qualquer uma das reivindicações 4 ou 5.

    32. Uso, da acordo com a reivindicação 29, caracterizado paio fato de que a dita composição é a composição farmacêutica de qualquer uma das reivindicações 6' a 10.