CN110201144A - 用Nutlin-3a和肽抑制肺纤维化 - Google Patents

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Abstract

在纤维化肺成纤维细胞中，p53蛋白(和miR‑34a)的基础水平被显著抑制，从而导致减少的p53介导的uPA和uPAR的抑制或PAI‑1的同时诱导。这些变化促成过量FL成纤维细胞增殖和细胞外基质(ECM)的产生并且因此促成肺纤维化。这些过程通过以下方式逆转：用小有机分子nutlin‑3a(NTL)或用肽CSP‑4(SEQ ID NO:1)或所述肽的变体或衍生物或多聚体处理细胞和治疗患有特发性肺纤维化(IPF)的受试者，所述小有机分子nutlin‑3a(NTL)或肽CSP‑4(SEQ ID NO:1)或所述肽的变体或衍生物或多聚体通过抑制MDM2介导的p53蛋白的降解来增加p53水平。使用这些化合物充当一种治疗IPF的新方法，因为它们恢复FL成纤维细胞中的uPA纤溶系统中的p53表达和p53介导的变化并且限制ECM的产生和沉积。

Description

用Nutlin-3a和肽抑制肺纤维化
发明背景
发明领域
本发明在生物化学和医学领域涉及用于增加纤维化肺(FL)成纤 维细胞中的p53蛋白水平、减少uPA和uPAR以及增加PAI-1表达和 减少其增殖、和用于使用nutlin-3a和肽治疗特发性肺纤维化(IPF)的 方法和组合物。
背景技术说明
特发性肺纤维化(IPF)是了解甚少的进行性和致命性肺病，除肺移 植之外尚不存在针对所述疾病的治疗方法(Mason DP等,Ann Thorac Surg 84:1121-8,2007)。在诊断之后五年的中值存活率小于20％。大多 数形式的间质性肺病和其它形式的肺纤维化特征在于纤维化病变，发 生肺泡结构的进行性变形且被具有过量细胞外基质(ECM)沉积的纤 维化或瘢痕组织置换(American Thoracic Society,Am J Respir Crit Care Med 161:646-664,2000；Noble PW等,Clin Chest Med 25:749-758, 2004；Selman M等,Ann Intern Med134:136-151,2001)。这导致进行 性呼吸困难和肺功能损失。标志形态学病变是与已完全形成的纤维化 的区域直接相邻的正常肺的空间和时间异质性并入区域、微观蜂窝现 象、以及进化含有活跃增殖和产生胶原的成纤维细胞/成肌纤维细胞 的纤维化区域(所谓的“纤维化”病灶)。
IPF是病因不明的最常见的慢性、进行性和致命性间质性肺病， 在美国，估计发病率为100,000名个体中有40-50例。增加的纤维化 肺(“FL”)成纤维细胞(或成肌纤维细胞))存活力、活化、产生和ECM 沉积是IPF肺的典型特征(Selman M等,Expert Opin EmergDrugs 16:341-62,2011；Shetty,S等.Am J Respir Cell Mol Biol 15:78-87, 1996；ZhuS等,Am J Physiol:Lung Cell Mol Physiol 297:L97-108, 2009；Suganuma H等,Thorax50:984-9,1995；American Thoracic Society,同上；Noble PW等,同上)。
本发明人(及其它)的先前工作显示肺成纤维细胞(包括来自IPF 患者的肺的FL成纤维细胞)表达尿激酶型纤溶酶原活化剂(uPA)、uPA 受体(uPAR)和纤溶酶原活化剂抑制剂-1(PAI-1)(Shetty等,1996,同 上；Shetty S和Idell S.Am J Physiol 274:L871-L882,1998；Chang W 等,J Biol Chem 285:8196-206,2010)。uPA对于正常肺(NL)和FL成纤 维细胞来说是促有丝分裂的，并且所述过程涉及通过uPA生长因子 结构域结合uPAR的uPA(Tkachuk V等.Clin Exp Pharmacol Physiol 23:759-65,1996；Padro T等,J Cell Sci115:1961-71,2002；Shetty S等, Am J Physiol 268:L972-L982,1995；Shetty S等,Antisense Res Dev 5:307-314,1995)。此外，uPA增强uPAR表达(Shetty S等,J Biol Chem276:24549-56,2001；Shetty S等,Am J Respir Cell MolBiol 30:69-75, 2004)。几年之前，本发明人报道，来自IPF肺的FL成纤维细胞显著 表达更多的uPA和uPAR，并且显示比NL成纤维细胞更高的基础和 uPA介导的增殖速率(Shetty等,1996,同上；1998,同上)。其它组证 实来自具有IPF的患者的由FL成纤维细胞进行的增加的uPAR表达 促成迁移行为(MaceKA等,J Cell Sci 118:2567-77,2005；Basire A 等,.Thromb Haemost 95:678-88,2006；Zhu,S.等,2009,同上
本发明人和同事的研究发现uPA通过调控p53来调控上皮细胞 凋亡/存活(ShettyS等,2005,同上)，p53在转录后水平下控制uPA (Shetty P等,Am J Resp Cell Mol Biol,39:364-72,2008)、其受体uPAR (Shetty S等Mol Cell Biol 27:5607-18,2007)和其主要抑制剂PAI-1 (Shetty S等J Biol.Chem 283:19570-80,2008)的相互表达，并且涉及 uPA、uPAR、小窝蛋白-1(“Cav-1”)与(β1-整联蛋白)之间的新颖细胞表 面信号传导互相作用(Shetty S等,2005,同上)。基于上文的了解，本 发明人设想用于治疗ALI及其随之发生的重塑反应的新型组合物和 方法。
在肺纤维化(所述术语可与“肺(pulmonary)纤维化”互换使用)期 间，转录因子p53(已知主要作为肿瘤抑制蛋白)的表达在纤维化成纤 维细胞中严重受抑制，其进而在PAI-1表达显著受抑制时诱导uPA和 uPAR的表达。由于p53表达纤维化成纤维细胞的抑制造成的PAI-1 表达的遏制以及uPA和uPAR表达的同时诱导引起成纤维细胞增殖和 ECM沉积，即，纤维化。与p53的增加的mdm2相互作用和随后的 mdm2-介导的p53的泛素化促成纤维化成纤维细胞中的p53的抑制。
p53与NF-κB的活性之间的相互关系已在癌细胞证明，但几乎不 存在关于炎症过程中p53与NF-κβ之间的相互作用的信息。Liu G等 (J Immunol.182:5063-71(2009))发现缺乏p53(p53(-/-))的中性粒细胞和 巨噬细胞对于用细菌脂多糖(LPS)刺激具有比p53(+/+)细胞更大的反 应，并且它们产生更大量的促炎细胞因子(包括TNF-α、IL-6以及 MIP-2)，并且展示增强的NF-κB DNA结合活性。p53(-/-)小鼠比p53(+/+)小鼠对LPS诱导的急性肺损伤(ALI)更敏感。p53(-/-)细胞对LPS的增 强的反应不涉及与toll样受体的接合即TLR4接合(例如，MAP激酶 的活化、IκB-α或NF-κB的p65亚基的磷酸化或IκB-α的降解)相关的 细胞内信号传导事件的改变。用nutlin-3a培养LPS刺激的中性粒细 胞和巨噬细胞使NF-κB DNA结合活性和促炎细胞因子的产生减弱。 用nutlin-3a处理小鼠降低LPS诱导的ALI的严重性。作者得出结论 p53调控炎性细胞中的NF-κB活性并且表明调节p53可在急性炎性病 状如ALI中具有潜在治疗益处。
Nutlin(或Nutlin-3a)(缩写NTL)
有机分子4-2-4,5-二氢-1H-咪唑-1-哌嗪-2-酮(C30H30Cl2N4O4)(还 被称为nutlin或nutlin-3a)的化学结构在下文示出
NTL是MDM2的拮抗剂，其是p53活化剂和细胞凋亡诱导剂。 MDM2通过结合p53肿瘤抑制蛋白起作用并且负调控其转录活性和 稳定性。MDM-p53相互作用的抑制导致p53的稳定、细胞周期停滞 和细胞凋亡。Nutlin-3已经显示通过活化癌细胞中的p53途径作为肿 瘤治疗的潜力。(Tovar,C.等,Proc Natl Acad Sci USA 103:1888-1893 (2006)；Vassilev,L.T.等.Science 303 844-848(2004)；El-Deiry,W.S. Cancer J 11:229-236(1998))。
美国专利7,893,278(Haley等)一般地和具体地公开了手性 nutlin-3。美国专利6,734,302描述外消旋nutlin-3。‘278专利教导一 种下式的化合物
以上专利两者均讨论作为Mdm2-p53相互作用的抑制剂和在癌 症治疗中的用途。
美国专利公布2011/0301142(Hutchinson等)教导一种治疗哺乳动 物的特发性肺纤维化的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用治疗 有效量的LPA1受体拮抗剂。拮抗剂可以是某些咪唑衍生物但不是咪 唑啉型化合物如NTL。
美国专利6,596,744(Wagle等)公开一种用杂环化合物治疗或改 善某些纤维化疾病的方法，所述化合物都明显不同于NTL。所公开 的疾病包括具有肺组织的纤维化肥大或纤维化作为表现形式的纤维 化肺病。这些疾病包括肺纤维化(或间质性肺病或间质性肺纤维化)、 特发性肺纤维化、尘肺病的纤维化要素、肺结节病、纤维化肺泡炎、 囊性纤维化的纤维化或肥大要素、慢性阻塞性性肺病、成人呼吸窘迫 综合征和肺气肿。
Dey等在Cell Cycle 6:2178-85(2007)中描述nutlin被鉴别为抑制 p53-MDM2相互作用的第一有效且特异性的小分子Mdm2拮抗剂。
前述文献中没有一个公开用nutlin-3a治疗IPF。
小窝蛋白-l衍生肽
本发明人发现为小窝蛋白-1(Cav-1；SEQ ID NO:3，以下所示) 的支架结构域的20个残基的肽DGIWKASFTTFTVTKYWFYR (SEQ ID NO:2)在体外和体内保护肺上皮细胞(LEC)免于博来霉素 (“BLM”)诱导的细胞凋亡并且通过减弱肺上皮损伤来预防随后的肺 纤维化(Shetty等,经获准美国专利申请12/398,757，其公布为U.S. 2009-0227515A1(2009年9月10日)，其特此以引用的方式整体并入。 本发明人还发现被称为PP-2的17个残基的肽NYHYLESSMTALYTLGH(SEQ ID NO:4)，其也在体外和体内保护 LEC免于BLM-诱导的细胞凋亡并且通过减弱肺上皮损伤来预防随后 的肺纤维化。
Shetty等，2009(同上)也描述这些肽以及肽多聚体和包含以上肽 的可递送多肽的生物活性取代、添加和缺失变体，以及包含前述肽、 变体和多聚体的药物组合物。那些组合物抑制受损的或损伤的肺上皮 细胞的细胞凋亡并且治疗急性肺损伤和随之发生的肺纤维化/IPF。
前述文献未鉴别被称为CSP-4的CSP的特定片段(下文公开为本 发明的一部分)，所述片段具有序列FTTFTVT(SEQ ID NO:1)并且具 有CSP的生物活性且构成本发明的主题的一部分。
鉴于IPF的不良预后和治疗方法的缺乏，迫切需要用于逆转或至 少减缓疾病进展的新的干预。此关键治疗空白由本发明解决。
本发明构成本发明人的早期发现(S.Shetty等,2007,2008和2009, 同上)并且是本发明人的早期发现的延伸。如以下部分中所描述，p53 调控uPA、uPAR和PAI-1的表达。所述过程涉及在翻译后水平下p53 蛋白表达的MDM2介导的控制而不会影响p53mRNA。这些观察结 果证明p53的表达与纤维化修复中的uPA-纤溶系统之间的因果关系。
发明概述
使用NTL抑制p53蛋白与MDM2的相互作用增强p53和PAI-1， 同时抑制uPA和uPAR。这些变化导致纤维化成纤维细胞的细胞凋亡 和自具有IPF的患者的肺以及自具有BLM诱导的加速的肺纤维化的 小鼠的肺分离的纤维化成纤维细胞的增殖抑制。
根据本发明，NTL通过在纤维化成纤维细胞中诱导或增强p53 表达来抑制进行性和已形成的肺纤维化。因此，所述化合物适用于治 疗有需要的受试者中的肺纤维化。
本发明人设想FL成纤维细胞中的uPA-纤溶系统的破坏的p53介 导的控制是IPF的靶向疗法的基础。在FL成纤维细胞中，当ECM 蛋白如胶原-I(Col-I)和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的水平增加时，p53 的基线表达和微小RNA-34a(miR-34a)被显著抑制。用mdm2抑制化合物nutlin-3a或CSP-4处理FL成纤维细胞在uPA和uPAR的相互抑 制情况下增强p53和PAI-1表达。用nutlin-3a或CSP-4处理FL成纤 维细胞还抑制ECM的产生。本发明人和同事的这些初步发现和最近 公开证实用于恢复p53与uPA-纤溶系统之间的相互作用(cross-talk)的干预方法，所述系统否则在FL成纤维细胞中扭曲，从而导致肺纤维 化。p53具有超出uPA-纤溶系统的控制的多效性作用2。然而，PAI-1 是成纤维细胞和其它细胞中的p53的下游效应子。
重要地，FL成纤维细胞中的p53的恢复调节uPA、uPAR和PAI-1 的表达、细胞存活力和ECM的产生。FL成纤维细胞中的p53-uPA纤 溶系统靶向方法在图1中示出。p53诱导miR-34a转录，而miR-34a 通过抑制组蛋白去乙酰化酶sirtuin 1(SIRT1)增强p53的乙酰化。这导 致由于抑制由mdm2介导的其降解所致的p53蛋白的稳定。然而，在 FL成纤维细胞中，p53蛋白和miR-34a的基础水平被显著抑制，这 是由于作为小窝蛋白-1的较低基线表达的结果p53蛋白通过mdm2 的增加的泛素化所致。这导致uPA和uPAR的减少的p53介导的抑制， 或PAI-1的同时诱导。这些变化促成过量FL成纤维细胞增殖和ECM 的产生并且通过CSP-4和nutlin-3a逆转。CSP-4和nutlin-3a通过抑 制p53蛋白的mdm2介导的降解来增加p53水平。FL成纤维细胞中 p53表达的恢复和uPA-纤溶系统中的p53介导的变化导致存活力的衰 减，并且限制ECM的产生和沉积。纤维化在具有已形成的肺纤维化 的BLM激发的小鼠中通过FL成纤维细胞中的p53水平的恢复得以 抑制，这进而抑制增殖信号uPA和uPAR，同时诱导这些细胞的促细 胞调亡信号；PAI-1。
本发明人首次表明，uPA-纤溶系统的p53介导的变化调控对肺纤 维化的发病机制重要的肺成纤维细胞的促纤维化反应，并且此途径可 被靶向治疗益处。与来自组织学上“正常的”肺的NL-成纤维细胞不 同，来自纤维化肺组织的FL成纤维细胞(包括成纤维细胞/成肌纤维 细胞)在uPA和uPAR表达较高时表达极低水平的基线p53、miR-34a 和小窝蛋白-1。用CSP-4或低分子量化合物nutlin-3a处理FL成纤维 细胞恢复p53和miR-34a表达，并且诱导PAI-1。这些变化遏制uPA 和uPAR表达并且抑制ECM沉积。这些药剂还逆转BLM诱导的肺纤维化并且保护肺上皮，其同样证明p53与纤溶系统的调控之间的相 互作用。因此，CSP-4介导的或nutlin-3a介导的肺纤维化减轻代表新 颖的治疗方法。
当前不存在有效治疗来逆转肺纤维化。本发明解决此重要空白并 且提供用于靶向FL成纤维细胞和p53与uPA-纤溶系统之间的相互作 用以有效地治疗纤维化肺病的新颖化合物和方法。
本发明还涉及物质组合物。在一个实施方案中，所述组合物是增 加FL成纤维细胞中的p53蛋白水平、减少uPA并且增加PAI-1表达 的肽化合物，所述肽化合物优选地选自由以下组成的组：
(a)指定为CSP-4的肽，其序列是FTTFTVT(SEQ ID NO:1)；
(b)最多约20个氨基酸长度的CSP-4肽的添加变体，并且其不 是具有序列SEQ IDNO:3的小窝蛋白-1(Cav-1)的支架结构域(CSP)；
(c)(a)的CSP-4肽的经共价修饰的化学衍生物，
(d)(b)的变体的经共价修饰的化学衍生物，
所述变体或化学衍生物在体外或体内测定中具有至少20％的 CSP-4肽的生物或生物化学活性。以上或以下所述的肽变体、化学衍 生物或多聚体优选地相对于CSP-4的活性具有以下活性：至少约 20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、约95％、97％、99％以及其中可推论出的任何范围，例如像约70％至 约80％，并且更优选约81％至约90％；或甚至更优选，约91％至约 99％。所述肽变体化学衍生物或多聚体可具有100％或大于100％的 CSP-4的活性。这种相对活性可以是基于本文所公开的或本领域中已知用于评价这种活性的任何方法。
优选的化合物是被指定为CSP-4的七肽，FTTFTVT(SEQ ID NO:1)。
优选的肽多聚体包含至少两个单体，每个单体是CSP-4肽、所述 变体或所述化学衍生物，所述多聚体：
(a)具有式P1 n，其中
(i)P1是如上的肽、变体或化学衍生物，以及
(ii)n＝2-5，或
(b)具有式(P1-Xm)n-P2，其中
(i)P1和P2各自独立地是如上的肽、变体或化学衍生物，
(ii)P1和P2各自是相同或不同的肽、变体或衍生物
(iii)X是C1-C5烷基、C1-C5烯基、C1-C5炔基、含有最多4个氧 原子的C1-C5聚醚；
(iv)m＝0或1；以及
(v)n＝1-7，
(c)具有式(P1-Glyz)n-P2，其中：
(i)P1和P2各自独立地是所述肽、变体或衍生物，
(ii)P1和P2各自是相同或不同的肽或变体或衍生物；
(iii)z＝0-6；以及
(iv)n＝1-25，
其中所述肽多聚体优选地在体外或体内测定中具有至少20％的 CSP-4肽的生物活性。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种可递送的肽或多肽或肽多 聚体组合物，所述组合物包含：
(a)以上肽、变体、衍生物、多肽或多聚体，以及
(b)与其结合或与其缔合或混合的递送或易位分子或部分。
优选的易位分子或部分在下文进行描述。
还提供一种抗纤维化药物组合物，其包含：
(a)药学上可接受的载体或赋形剂，以及，
(b)以上肽、肽变体、化学衍生物、多肽或肽多聚体作为活性成 分，任选地与包含抑制MDM2-p53相互作用的nutlin-3a(NTL)或NTL 的手性顺式-咪唑啉类似物的药物组合物组合，所述NTL类似物在体 外或体内测定中具有至少20％的NTL的生物或生物化学活性；
最优选的是被配制用于注射或肺滴注的以上肽相关的药物组合 物，而经任选组合的NTL或NTL类似物优选地被配制用于注射或口 服施用。
本发明涉及一种用于增加纤维化肺(FL)成纤维细胞中的p53蛋白 水平、减少uPA和uPAR以及增加PAI-1表达的方法，所述方法包括 向所述FL成纤维细胞提供有效量的抑制MDM2与p53蛋白的相互 作用和MDM2介导的p53的降解的化合物，其中所述化合物是：
(a)抑制MDM2-p53相互作用的NTL或NTL的手性顺式-咪唑啉 类似物；
(b)选自由以下组成的组的肽：
(i)CSP-4，其序列是FTTFTVT(SEQ ID NO:1)；
(ii)所述CSP-4肽的添加变体，所述添加变体的长度不超过20 个氨基酸；
(iii)所述CSP-4肽的经共价修饰的化学衍生物，或
(c)包含至少两个单体的肽多聚体，每个单体是(b)的CSP-4肽、 变体或化学衍生物，或
(d)(a)-(c)的任何的组合
其中所述NTL类似物、所述肽变体、所述肽化学衍生物或所述 肽多聚体在体外或体内测定中具有至少20％的NTL或CSP-4肽的生 物或生物化学活性。
以上或以下所述的NTL类似物优选地相对于NTL的活性具有以 下活性：至少约20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、 80％、85％、90％、约95％、97％、99％以及其中可推论出的任何范 围，例如像约70％至约80％，并且更优选约81％至约90％；或甚至更优选，约91％至约99％。所述NTL类似物可具有100％或大于100％ 的NTL活性。这种相对活性可以是基于本文所公开的或本领域中已 知用于评价这种活性的任何方法。
在以上方法的优选实施方案中，以上方法中的化合物是NTL。 在另一个实施方案中，所述化合物是SEQ ID NO:1的CSP-4肽。在 所述方法的另一个实施方案中，所述化合物是肽多聚体，优选地包含 CSP-4肽(SEQ ID NO:1)的单体的肽多聚体。
优选地，当以上方法使用肽多聚体时：
(a)所述肽多聚体具有式P1 n，其中
(i)P1是所述肽、变体或化学衍生物，以及
(ii)n＝2-5，或
(b)所述肽多聚体具有式(P1-Xm)n-P2，其中
(i)P1和P2各自独立地是所述肽、变体或化学衍生物；
(ii)P1和P2各自是相同或不同的肽、变体或衍生物；
(iii)X是C1-C5烷基、C1-C5烯基、C1-C5炔基、含有最多4个氧 原子的C1-C5聚醚；
(iv)m＝0或1；以及
(v)n＝1-7，或
(c)所述肽多聚体具有式(P1-Glyz)n-P2，其中:
(i)P1和P2各自独立地是所述肽、变体或衍生物，
(ii)P1和P2各自是相同或不同的肽或变体或衍生物；
(iii)z＝0-6；以及
(iv)n＝1-25，
优选地所述多聚体在体外或体内测定中具有至少20％的CSP-4 肽的生物活性。
还提供一种用于治疗具有以肺纤维化(即，IPF)为特征的疾病或病 状的哺乳动物受试者(优选地人)的方法，所述方法包括向所述受试者 施用有效量的通过抑制MDM2-介导的p53蛋白的降解来增加FL成 纤维细胞中的p53蛋白水平、减少uPA和uPAR水平并且增加PAI-1 表达的化合物或组合物。在所述方法的一个优选实施方案中，所述化 合物或组合物是
(a)抑制MDM2-p53相互作用的Nutlin-3a(NTL)或其手性顺式- 咪唑啉类似物；
(b)选自由以下组成的组的肽：
(i)CSP-4，其序列是FTTFTVT(SEQ ID NO:1)，最优选的肽实 施方案；
(ii)所述CSP-4肽的添加变体，所述添加变体的长度不超过20 个氨基酸；
(iii)所述CSP-4肽的经共价修饰的化学衍生物，或
(c)包含至少两个单体的肽多聚体，每个单体是(b)的CSP-4肽、 变体或化学衍生物，最优选地CSP-4的多聚体，
(d)以上可递送的肽或多肽或肽多聚体组合物，或
(e)(a)至(d)的任何的组合，
其中所述NTL类似物或所述肽变体、所述肽衍生物或所述肽多 聚体在体外或体内测定中分别具有至少20％的NTL或CSP-4肽的生 物或生物化学活性。
在所述方法中，所述化合物优选地处于还包含药学上可接受的载 体或赋形剂的药物组合物的形式。所述化合物可以是所述NTL、NTL 类似物或肽化合物的药学上可接受的盐。在所述方法的一个优选实施 方案中，所述化合物是NTL。在所述方法的另一个实施方案中，所 述化合物是肽多聚体，最优选地包含CSP-4肽FTTFTVT(SEQ ID NO:1)的单体的多聚体。
本发明还涉及使用NTL、以上NTL类似物、以上多肽、变体、 化学衍生物或多聚体用于
(a)增加FL成纤维细胞中的p53蛋白水平、减少uPA且增加 PAI-1表达，或
(b)治疗特征为肺纤维化的疾病或病状。
还提供如本文所定义的NTL、以上NTL类似物、以上肽、变体、 化学衍生物或肽多聚体用于制造用于治疗具有特征为肺纤维化的疾 病或病状的受试者的药剂的用途。
附图简述
图1是示出纤维化肺(FL)-成纤维细胞中p53的低基线表达和 uPA-纤溶系统的错乱的p53介导的控制导致纤维发生的示意性图示。 概述了在IPF中和在通过本发明的方法和组合物进行的其治疗中涉 及的作用机制和途径。
图2A-2I.IPF肺中的纤维化病灶展示降低的FL成纤维细胞p53 表达。将来自IPF患者和对照“正常”受试者的肺切片针对H&E(图 2A)、波形蛋白(图2B)、三色(图2C)、p53(图2D)、PAI-1(图2E)、 Ki-67(图2F)、PAI-1和SP-C的免疫荧光(图2G)或p53与SP-C(图 2H)或p53与PAI-1(图2I)进行染色。示出一个代表性实例(n＝5IPF 肺样本)。
图3A-3B.在来自IPF肺的人FL(IPF)-成纤维细胞中小窝蛋白 -1、p53和PAI减少并且uPA增加，其与增加的col-I和miR-34a的 抑制相关。(图3A)将来自正常肺(NL)-和FL成纤维细胞的细胞溶解产 物针对蛋白质中的变化进行免疫印迹。所述图示出NL-成纤维细胞(n＝10个细胞系)和FL成纤维细胞(n＝18个细胞系)的典型结果。(图 3B)通过实时PCR将来自NL-(n＝3)和FL-(n＝4)成纤维细胞的总RNA 针对miR-34a表达进行测试。在条形图的底部示出使用针对miR-34a 的32P-标记的反义探针和负载对照snRNA(U6)，来自代表性样品的RNA的RNA印迹。
图4A-4B.来自IPF和“正常”肺的成纤维细胞的uPA、uPAR和 PAI-1mRNA的不同表达。将从来自“正常”受试者和具有IPF的患者 的肺组织(图4A)或从NL-(n＝6)和FL成纤维细胞(n＝8)(图4B)分离的 总RNA通过定量实时PCR((RT-PCR)针对uPA、PAI-1和col-I mRNA进行测试并且标准化至β-肌动蛋白mRNA的对应水平。
图5A-5D.来自小鼠的FL-对比NL-成纤维细胞的uPA和PAI-1 的差异表达。FL成纤维细胞在BLM损伤之后21天从小鼠的肺分离 或使来自对照小鼠的NL-成纤维细胞暴露于鼻内盐水，如其它地方所 述(Bandhary等,2012,同上)。将来自NL-和FL成纤维细胞的溶解产物 针对p53、uPA、PAI-1和col-I蛋白的表达中的变化进行免疫印迹(图 5A)。将从小鼠肺组织(图5B)或从自具有BLM诱导的纤维化的小鼠 的肺组织的分离的NL-和FL成纤维细胞(n＝6)(图5C)或对照(盐水) 小鼠提取的总RNA通过定量实时PCR针对uPA、PAI-1和胶原-I(Col-I) mRNA进行测试。将来自小鼠的NL-和FL成纤维细胞在12孔板中 在DMEM培养基中进行培养。在三天之后，对成纤维细胞进行计数 以测定增殖速率(图5D)。
图6A-6D.CSP(CSP4)通过诱导FL(IPF)-成纤维细胞中的 miR-34a来增强p53表达。(图6A)将NL-和FL成纤维细胞(n＝3)用 PBS、CSP-4(CSP)或对照肽(CP)进行处理。将RNA通过实时PCR针 对miR-34a进行分析。(图6B)将FL成纤维细胞在有或无miR-34a反 义(miR-34a-AS)或前体-miR-34a或对照miRNA(Ctr-miR)的情况下用 PBS或CSP或CP进行处理。将条件培养基(CM)针对p53和β-肌动 蛋白的PAI-1和溶解产物(CL)进行免疫印迹。(图6C)将FL成纤维细 胞在存在或不存在miR-34a-AS、前体-miR-34a或Ctr-miR的情况下 用PBS或CSP或CP进行处理。将RNA通过实时PCR针对miR-34a 中的变化进行分析。(图6D)在CSP中进行一系列重叠缺失并且这些 肽用于处理FL成纤维细胞。随后评定p53、uPA、PAI-1和col-I中的变化以鉴别CSP作用所需的最少氨基酸。
图7A-7B.FL(IPF)-成纤维细胞中增加的mdm2-介导的p53蛋白 的降解。(图7A)将来自NL-和FL成纤维细胞(n＝3)的溶解产物针对p53、mdm2和β-肌动蛋白进行免疫印迹。(图7B)将来自NL-和FL 成纤维细胞的溶解产物用抗-mdm2抗体进行免疫沉淀(IP)并且针对相关的p53蛋白进行免疫印迹(IB)。
图8A-8C.FL(IPF)-成纤维细胞中nutlin-3a(NTL)中的p53-纤溶 系统相互作用或CSP-4-介导的col-I表达的抑制的作用。(图8A)使 FL成纤维细胞暴露于PBS、nutlin-3a(10μM)、CSP-4(10nM)或对照 肽(CP)48小时。将细胞溶解产物针对Col-I、PAI-1、p53、uPA和β-肌动蛋白的表达进行免疫印迹。(图8B)使在12孔板中在DMEM培 养基中培养的FL成纤维细胞暴露于媒介物(PBS)或nutlin-3a、CSP-4 或CP。在3天之后，将细胞脱离且计数。(图8C)将FL成纤维细胞 用单独空腺病毒载体(Ad-EV)或表达p53(Ad-p53)、PAI-1(Ad-PAI-1) 或小窝蛋白-1(Ad-Cav-1)的Ad-载体进行转导。在48小时之后，将细 胞溶解产物针对Col-I、p53、PAI-1、uPA和β-肌动蛋白进行免疫印 迹。
图9A-9B.NL-成纤维细胞中p53-纤溶系统相互作用在诱导col-I 表达中的作用。将从组织学上“正常”的人肺分离的NL-成纤维细胞用 慢病毒载体中的p53shRNA进行处理以抑制基线p53表达。将对照 细胞用非特异性(Ctr)shRNA进行处理。(图9A)：将条件培养基样品 针对PAI-1、uPA和可溶性col-I进行免疫印迹，而将细胞溶解产物针 对p53、α-SMA和β-肌动蛋白进行测试。(图8B)：将从用对照或p53 shRNA处理的NL-成纤维细胞分离的总RNA通过定量实时PCR针 对uPA、PAI-1、col-I和β-肌动蛋白mRNA的表达中的变化进行分析。
图10A-10D.Nutlin-3a(NTL)抑制BLM-处理的小鼠中的肺纤维 化。将小鼠暴露于BLM持续14天以诱导肺纤维化。经盐水处理的 小鼠用作纤维化对照。在14天之后，将暴露于BLM的小鼠用媒介 物或nutlin-3a(10mg/kg体重)静脉内注射(Zhang F等Drug MetabDispos 39:15-21,2011)以确定nutlin-3a是否抑制已形成的肺纤维化。 在BLM损伤之后第21天，小鼠进行CT扫描以评定纤维化的程度(图10A)。示出一个代表性实例(n＝9)。(图10B)使用Flexivent系统在同一 小鼠中测量肺顺应性和抗性以评定在nutlin-3a处理(n＝9)之后肺功能 的改善。(图10C)使肺切片经受三色染色以评定肺结构和作为肺纤维 化的指示的胶原沉积。(图10D)将全肺匀浆针对总胶原(羟基脯氨酸) 和锁链素含量作为ECM中的变化的独立评定来进行分析。
图11A-11D.CSP-4抑制已形成的肺纤维化并且改进肺功能。将 小鼠暴露于BLM以诱导肺纤维化。在14天之后，将小鼠用媒介物 或1.5mg/kg体重的CSP-4或加扰序列的对照肽(“CP”)静脉内注射。 在BLM损伤之后第21天，小鼠进行CT扫描以检查已形成的肺纤维 化的CSP-4抑制(图11A)。示出一个代表性实例(n＝9)。(图11B)：使 用定量CT再现在同一小鼠(n＝9)中测量肺体积。(图11C)：使肺切片 经受三色和H&E染色(未图示)以评定作为肺纤维化的指标的胶原沉 积。(图11D)针对总羟基脯氨酸含量分析全肺匀浆。
图12A-12C.CSP-4或nutlin-3a(NTL)抑制FL成纤维细胞的增 殖。将小鼠暴露于BLM持续14天以诱导显著肺纤维化或暴露于盐 水(纤维化对照)。14天之后，将暴露于BLM的小鼠用CSP-4或CP 或nutlin-3a进行处理(参见图10A-10D/11A-11D)。(图12A)：使肺切 片(在BLM损伤之后第21天)经受针对Ki-67的免疫组织化学(IHC) 以评定增殖。示出一个代表性实例(n＝9)。将从暴露于盐水、BLM或 BLM+nutlin-3a(如在图11A中所描述)的小鼠的肺分离的成纤维细胞 通过蛋白质印迹法针对col-I、p53和下游uPA以及PAI-1蛋白的表达 中的变化进行测试(图12B)；并且通过定量RT-PCR针对mRNA进行 测试(图12C)。
图13.通过用CSP-4或nutlin-3a(NTL)离体处理WT小鼠肺组织 来抑制BLM诱导的肺纤维化。将小鼠暴露于鼻内BLM持续21天以 诱导肺纤维化。将这些小鼠(n＝3)处死，肺切除，切成小片并且置于 具有含有10％胎牛血清的DMEM培养基的培养皿中。随后将组织样品用CSP-4(10nM)、对照肽(CP)和nutlin-3a(NTL)(10μM)处理72 小时。制备条件培养基和组织溶解产物并且通过蛋白质印迹法针对 col-I、α-SMA和β-肌动蛋白中的变化进行分析。
优选实施方案的描述
本发明人发现“肿瘤抑制”蛋白、p53和纤溶酶原活化剂抑制剂-1 (PAI-1)的基础表达在从IPF患者的肺获得的FL成纤维细胞中显著降 低。对于具有BLM诱导的加速的肺纤维化的小鼠(人IPF的公认模型) 来说也是如此。p53调控uPA-纤溶(uPA、uPAR和PAI-1)系统的主要 组分的表达。然而，尚不清楚这些蛋白质的水平的变化如何促成肺纤 维化的发病机制，以及恢复p53-uPA纤溶系统相互作用的正常模式是 否减轻肺纤维化。
根据本发明，FL成纤维细胞中由于p53表达的缺乏所致的增加 的uPA和uPAR表达和PAI-1的同时抑制对于肺纤维化的发展来说是 关键的。FL成纤维细胞中p53表达的诱导和通过p53介导的uPA的 减少来恢复p53-uPA-纤溶系统相互作用以及PAI-1表达的同时增加减 轻IPF并且是用NTL治疗此疾病的基础。
与正常肺(“NL”)成纤维细胞不同，从具有IPF的患者的肺获得的 成纤维细胞(“FL”-成纤维细胞)或从具有BLM-诱导的肺纤维化的小 鼠获得的成纤维细胞表达最少p53。此外，FL成纤维细胞产生较低 水平的PAI-1，同时uPA和uPAR的表达显著升高。
本发明以全局和协同方式靶向uPA-纤溶系统的所有三种主要组 分(uPA、uPAR和PAI-1)。通过恢复FL成纤维细胞中的p53表达同 时靶向uPA-纤溶系统的所有三种主要组分减轻纤维化。
因此，这种治疗离体和体内影响从具有IPF的患者分离的原代 FL成纤维细胞和肺组织。在具有已形成的肺纤维化的小鼠模型中观 察到这些变化，其中定义nutlin-3a的有益作用的中间体和下游介体。
Nutlin-3a
适用于本发明的方法中的化合物包括nutlin-3a(还被称为nutlin 和NTL)，其是4-2-4,5-二氢-1H-咪唑-1-哌嗪-2-酮(C30H30Cl2N4O4)
此化合物描述于以引用的方式整体并入的美国专利7,893,278 (Haley等)中。还适用于本发明中的是更广泛种属的NTL的手性顺式 -咪唑啉类似物，所述类似物共享抑制MDM2-p53相互作用的特性。 NTL的类似物意图是'278专利中所公开且特征在于以下式2的分子的 种属。
其中
R选自含有至少一个杂原子的饱和的和不饱和的5和6元环；所 述杂原子可以是S、N或O。所述环可被低级烷基取代，所述烷基可 被-C＝O-R1、-SO2CH3或-CH2C＝OCH3中的至少一个进一步取代，
R1选自由以下组成的组：H、-NH2、-N-低级烷基、被羟基取代 的低级烷基、被-NH2取代的低级烷基以及含有至少一个杂原子(S、N 或O)的5或6元饱和环；
X1和X2独立地选自由以下组成的组：H、低级烷氧基、-CH2OCH3、 -CH2OCH2CH3、-OCH2CF3以及-OCH2CH2F，
Y1和Y2各自独立地选自由以下组成的组：-Cl、-Br、-NO2、-C＝N 以及-C＝CH，以及
在咪唑啉环的4和5位置处的绝对立体化学分别是S和R。
被认为是NTL的类似物的其它化合物是式2的化合物，其中R 是被至少一个选自以下的基团取代的哌嗪基：低级烷基、环烷基、C ＝OR1、被羟基取代的低级烷基、被-NH2取代的低级烷基、被-C＝OR1取代的低级烷基。N-低级烷基、-SO2CH3、＝O、-CH2C＝OCH3或被至 少一个选自以下的基团取代的哌啶基：C1-C3烷基、-C1-C2烷氧基、 -C＝OCH3、-SO2CH3'-C＝O、-OH、-CH2NH2、-C＝OCH2NH2、-C＝OC H2OH、-C＝OCH(OH)CH2OH、-CH2CH(OH)CH2OH、-C＝ON(CH2)2、 -C＝ONH2以及-C＝ON(CH3)CH3、-N(CH3)CH3、吡咯烷基和哌啶基。
还优选的是如下式2的化合物，其中在邻位的X1基团选自低级 烷氧基、-OCH2CF3和-OCH2CH2F，并且在对位的X2基团是低级烷 氧基。还进一步优选的是如下化合物，其中在邻位的X1基团选自乙 氧基、异丙氧基、-OCH2CF3和-OCH2CH2F，并且在对位的X2基团 选自甲氧基和乙氧基。
进一步优选的是如下式2的化合物，其中R选自哌嗪基和取代 的哌嗪基。所述化合物是例如：1-{4-[(4S,5R)-4,5-双-(4-氯-苯基)-2-(2- 异丙氧基-4-甲氧基-苯基)-4,5-二氢-咪唑-羰基]-哌嗪-1-基}-乙酮； 4-[(4S,5R)-4,5-双-(4-氯-苯基)-2-(2-异丙氧基-4甲氧基-苯基)-4,5-二氢- 咪唑-1-羰基]哌嗪-2-酮；[(4S,5R)-4,5-双-(4-氯-苯基)-2-(2-异丙氧基-4-5-甲氧基-苯基)-4,5-二氢-咪唑-1-基]-(4-吡咯烷-1-基-哌啶-1-基)-甲酮；4-[(4S,5R)-4,5-双-(4-氯-苯基)-2-(2-乙氧基-苯基)-4,5-二氢-咪唑-1- 羰基]-哌嗪-2酮；l-{4-[(4S,5R)-4,5-双-(4-氯-苯基)-2-(2-乙氧基苯 基)-4,5-二氢-咪唑-1-羰基]-哌嗪-1-基}-乙酮；2-{4-[(4S,5R)-4,5-双-(4- 氯-苯基)-2-(2-乙氧基苯基)-4,5-二氢-咪唑-1-羰基]-哌嗪-1-基}-1-吗啉 -4-基-乙酮；[(4S,5R)-4,5-双-(4-氯-苯基)-2-(2-乙氧基-苯基)4,5-二氢- 咪唑-1-基]-[4-(2-甲磺酰基乙基)-哌嗪-1-基]-甲酮；以及[(4S,5R)-4,5- 双-(4-氯-苯基)-2-(2-异丙氧基-4-甲氧基-苯基)-4,5-二氢-咪唑-1-基]-(4- 甲基-哌嗪-1-基)-甲酮。
这些所有分子的合成是本领域中已知的，其中的一些描述于‘278 专利中。
基于Cav-1序列的肽
小窝蛋白-1(Cav-1)支架结构域或肽(还被称为CSD或CSP)干扰 Cav-1与Src激酶的相互作用，模拟uPA和抗-β1-整联蛋白抗体的的 组合作用，如在下文更详细地讨论。天然人Cav-1具有178个氨基酸 的长度和22kDa的分子量。Cav-1的氨基酸序列在下文示出(SEQID NO:3)。
CSP是以上加下划线的20个残基的肽，并且具有序列 GIWKASFTTFTVTKYWFYR(SEQID NO:2)。被指定为CSP-4的本 发明的优选肽是CSP的片段FTTFTVT(SEQ ID NO:1)并且在Cav-1 序列内以双下划线示出。CSP-4具有在下文实施例和附图中所示的活 性，并且影响p53通过uPA、uPAR(向上)和PAI-1表达(向下)的协调 控制来调控LEC存活力的方式，并且通过这种假定机制在体内保护 LEC或肺上皮免于细胞凋亡且阻断由ALI产生的纤维化。
在本文所公开的研究中，CSP-4的对照肽(其被称为“CP”)是具有 与更大CSP(SEQID NO:2)相同的氨基酸组成的加扰肽，但具有不同 序列：WGIDKAFFTTSTVTYKWFRY(SEQ IDNO:5)。
可在CSP-4的结构中进行修改和变化，并且产生具有相似或其它 所需特征的分子。这类功能衍生物或生物活性衍生物(所述术语可互 换使用)涵盖在本发明内。
优选的功能衍生物是添加变体和肽低聚物/多聚体等。
这些可合成地产生，但也可通过重组产生，并且针对CSP-4的结 合特性或生物活性进行测试。用于测量变体的活性的优选方式是在竞 争性结合测定中，其中肽变体能够与可溶性uPAR(“suPAR”)竞争结合 可溶性小窝蛋白(如可检测地标记的小窝蛋白)。
应理解，CSP-4的不同衍生物和包含CSP-4的更长多肽可容易地 根据本发明通过化学(合成)方法或通过重组方式(优选对于更长多肽 而言)来制备。
添加包括在CSP-4的功能变体的定义内，所述添加优选地包含在 任一末端或在两个末端处的另外1-5个氨基酸。在其它实施方案(所 述实施方案意图与下文所讨论的肽多聚体不同)中，可进一步添加最 多约20个残基的另外残基。在CSP-4的添加变体中，SEQ IDNO:1(核 心CSP-4肽)的N末端和/或C末端的另外残基可包括SEQID NO:1(核 心CSP-4肽)的N末端和/或C端另外的残基可包括以它们在Cav-1 (SEQ ID NO:4)的天然序列中出现的次序的那些中的一些。然而，添 加变体不可能是SEQ ID NO:3。或者，其它氨基酸可添加在SEQID NO:1的任一末端，并应理解，添加变体维持CSP-4的生物活性和结 合活性(至少20％的所述活性，或优选地更大，如下文中所阐述)。
CSP-4的优选取代变体是其中1、2或3个残基已被不同残基取 代的保守性取代。关于蛋白质化学和结构的详细说明，参见Schultz G.E.等,Principles of ProteinStructure,Springer-Verlag,New York,1979, 和Creighton,T.E.,Proteins:Structureand Molecular Properties,第2版, W.H.Freeman&Co.,San Francisco,1993，所述文献特此以引用的方式 并入。保守性取代在本文被定义为在以下组中之一内的交换：
Phe可被较大芳香族残基取代：Tyr、Trp。
Thr可被较小脂肪族、非极性或轻微极性残基取代：例如，Ala、 Ser或Gly。
Val可被较大脂肪族、非极性残基取代：Met、Leu、Ile、Cys。
即使当难以预测在这样做之前取代的确切作用时，本领域的技术 人员应理解，所述作用可通过常规筛选测定来评价，优选地本文所述 的生物和生物化学测定。在适合的筛选测定中针对所需特征筛选细胞 溶解产物或纯化的多肽或肽变体的活性。
除20种“标准”L-氨基酸之外，在本领域中明确定义的D-氨基酸 或非标准、修饰的或非常规氨基酸也被考虑用于本发明中。这些包括， 例如，β-丙氨酸(β-Ala)和其它ω-氨基酸，如3-氨基丙酸、2,3-二氨基 丙酸(Dpr)、4-氨基丁酸等；α-氨基异丁酸(Aib)；ε-氨基己酸(Aha)；δ- 氨基戊酸(Ava)；N-甲基甘氨酸或肌氨酸(MeGly)；鸟氨酸(Orn)；瓜氨 酸(Cit)；叔丁基丙氨酸(t-BuA)；叔丁基甘氨酸(t-BuG)；N-甲基异亮 氨酸(MeIle)；苯基甘氨酸(Phg)；正亮氨酸(Nle)；4-氯苯丙氨酸 (Phe(4-Cl))；2-氟苯丙氨酸(Phe(2-F))；3-氟苯丙氨酸(Phe(3-F))；4-氟 苯丙氨酸(Phe(4-F))；青霉胺(Pen)；1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸(Tic)； 高精氨酸(hArg)；N-乙酰基赖氨酸(AcLys)；2,4-二氨基丁酸(Dbu)；2,4- 二氨基丁酸(Dab)；对-氨基苯丙氨酸(Phe(pNH2))；N-甲基缬氨酸 (MeVal)；高半胱氨酸(hCys)、高苯丙氨酸(hPhe)和高丝氨酸(hSer)； 羟基脯氨酸(Hyp)、高脯氨酸(hPro)、N-甲基化氨基酸和类肽(N-取代 的甘氨酸)。
其它化合物可通过合理药物设计来进行设计以按类似于CSP-4 的方式起作用。合理药物设计的目标是产生生物活性化合物的结构类 似物。通过产生这类类似物，有可能产生比天然分子(即，肽)活性更 高或更稳定、对影响功能的改变的敏感性更低的药物。一种方法是例 如通过NMR或X射线晶体学、计算机建模或通过组合产生CSP-4 的三维结构。替代方法是随机替换CSP-4序列中的功能性基团，并且 确定对功能的影响。
此外，生物活性衍生物在体外或体内结合测定或生物活性测定 (如本文所述的测定)中具有CSP-4的活性。优选地所述多肽在体外或 体内以活性抑制或预防由BLM诱导的LEC的细胞凋亡，所述活性为 CSP-4的活性的至少约20％，或至少约30％、40％、50％、60％、65％、 70％、75％、80％、85％、90％、约95％、97％、99％以及其中可推论 出的任何范围，例如像约70％至约80％，并且更优选约81％至约90％； 或甚至更优选，约91％至约99％。所述衍生物可具有100％或甚至比 CSP-4更高的活性。
肽可在其N和C末端分别以酰基(缩写“Ac”)和酰胺基(缩写“Am”) 加帽，例如在N末端以乙酰基(CH3CO-)并且在C末端以酰胺基 (-NH2)。考虑广泛范围的N末端加帽功能，优选地呈与末端氨基的键 联的形式，例如：甲酰基；
具有1至10个碳原子的烷酰基，如乙酰基、丙酰基、丁酰基；
具有1至10个碳原子的烯酰基，如己-3-烯酰基；
具有1至10个碳原子的炔酰基，如己-5-炔酰基；
芳酰基，如苯甲酰基或1-萘甲酰基；
杂芳酰基，如3-吡咯甲酰基或4-喹啉甲酰基；
烷基磺酰基，如甲磺酰基；
芳基磺酰基，如苯磺酰基或对氨苯磺酰基(sulfanilyl)；
杂芳基磺酰基，如吡啶-4-磺酰基；
具有1至10个碳原子的取代的烷酰基，如4-氨基丁酰基；
具有1至10个碳原子的取代的烯酰基，如6-羟基-己-3-烯酰基；
具有1至10个碳原子的取代的炔酰基，如3-羟基-己-5-炔酰基；
取代的芳酰基，如4-氯苯甲酰基或8-羟基-萘-2-酰基；
取代的杂芳酰基，如2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢-3-甲基-喹唑啉-6- 酰基；
取代的烷基磺酰基，如2-氨基乙烷磺酰基；
取代的芳基磺酰基，如5-二甲基氨基-1-萘磺酰基；
取代的杂芳基磺酰基，如1-甲氧基-6-异喹啉磺酰基；
氨甲酰基或硫代氨甲酰基；
取代的氨甲酰基(R’-NH-CO)或取代的硫代氨甲酰基 (R’-NH-CS)，其中R’是烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、取代的 烷基、取代的烯基、取代的炔基、取代的芳基或取代的杂芳基；
取代的氨甲酰基(R’-NH-CO)或取代的硫代氨甲酰基 (R’-NH-CS)，其中R’是烷酰基、烯酰基、炔酰基、芳酰基、杂芳酰 基、取代的烷酰基、取代的烯酰基、取代的炔酰基、取代的芳酰基或 取代的杂芳酰基，所有皆如上所定义。
C末端加帽功能可处于具有末端羧基的酰胺或酯键形式。提供酰 胺键的加帽功能被指定为NR1R2，其中R1和R2可独立地从以下组中 得到：氢；
优选具有1至10个碳原子的烷基，如甲基、乙基、异丙基；
优选具有1至10个碳原子的烯基，如丙-2-烯基；
优选具有1至10个碳原子的炔基，如丙-2-炔基；
具有1至10个碳原子的取代的烷基，如羟烷基、烷氧基烷基、 巯基烷基、烷硫基烷基、卤代烷基、氰基烷基、氨基烷基、烷基氨基 烷基、二烷基氨基烷基、烷酰基烷基、羧基烷基、氨甲酰基烷基；
具有1至10个碳原子的取代的烯基，如羟基烯基、烷氧基烯基、 巯基烯基、烷硫基烯基、卤代烯基、氰基烯基、氨基烯基、烷基氨基 烯基、二烷基氨基烯基、烷酰基烯基、羧基烯基、氨甲酰基烯基；
具有1至10个碳原子的取代的炔基，如羟基炔基、烷氧基炔基、 巯基炔基、烷硫基炔基、卤代炔基、氰基炔基、氨基炔基、烷基氨基 炔基、二烷基氨基炔基、烷酰基炔基、羧基炔基、氨甲酰基炔基；
具有最多10个碳原子的芳酰基烷基，如苯甲酰甲基或2-苯甲酰 基乙基；
芳基，如苯基或1-萘基；
杂芳基，如4-喹啉基；
具有1至10个碳原子的烷酰基，如乙酰基或丁酰基；
芳酰基，如苯甲酰基；
杂芳酰基，如3-喹啉甲酰基；
OR’或NR’R”，其中R’和R”独立地是氢、烷基、芳基、杂芳基、 酰基、芳酰基、磺酰基、亚磺酰基；或SO2-R’”或SO-R’”，其中R’” 是取代的或未取代的烷基、芳基、杂芳基、烯基或炔基。
提供酯键的加帽功能被指定为OR，其中R可以是：烷氧基；芳 氧基；杂芳氧基；芳烷氧基；杂芳烷氧基；取代的烷氧基；取代的芳 氧基；取代的杂芳氧基；取代的芳烷氧基；或取代的杂芳烷氧基。
N末端或C末端加帽功能或两者均可具有这种结构以使得加帽 的分子充当前药(母体药物分子的药理学上无活性的衍生物)，所述前 药在体内经历自发或酶促转化以便释放活性药物并且具有优于母体 药物分子的改进的递送特性(Bundgaard H编辑:Designof Prodrugs, Elsevier,Amsterdam,1985)。
加帽基团的明智选择允许对肽添加其它活性。例如，连接至N 或C末端帽的硫氢基的存在将允许衍生肽与其它分子的缀合。
CSP-4的化学衍生物
除了以上所述的被认为是CSP-4的“化学衍生物”的加帽基团之 外，CSP-4的优选化学衍生物可包含通常不是蛋白质或肽的一部分的 另外化学部分，所述部分可通过已知方式引入至CSP-4或CSP-4的 添加变体中以构成如本文所定义的化学衍生物。肽的共价修饰包括于 本发明的范围内。这类衍生的部分可改善溶解度、吸收、生物半衰期 等。公开了能够介导这类作用的部分，例如Gennaro,AR,Remington: The Science and Practice ofPharmacy,Lippincott Williams&Wilkins Publishers；第21版,2005(或最新版本)。
这类修饰可通过使肽的靶向氨基酸残基与能够与选定侧链或末 端残基反应的有机衍生化试剂反应来引入至分子中。另一种修饰是肽 的环化，所述环化通常通过添加末端Cys残基来完成，所述残基可通 过二硫键键合以产生环状肽。或者，在一个末端添加可交联的Lys(K) 并且在另一末端添加Glu(E)。
半胱胺酰残基(例如出于环化目的添加)最常见地与α-卤乙酸盐 (和对应的胺)反应，以得到羧甲基或羧酰胺甲基衍生物。半胱胺酰残 基也可通过与溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙酰磷酸盐、 N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化 物、对氯汞苯甲酸盐、2-氯汞-4-硝基-苯酚或氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑等反应而衍生。
添加的赖氨酰残基(例如，出于环化)和氨基末端残基可用琥珀酸 或其它羧酸酐衍生化。用环状羧酸酐衍生化具有逆转赖氨酰残基的电 荷的作用。用于衍生含氨基的残基的其它适合的试剂包括亚氨酸酯， 如甲基吡啶亚胺甲酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；硼氢化氯；三硝基苯磺 酸；O-甲基异脲；2,4戊二酮；以及转胺酶催化的与乙醛酸盐的反应。
用双官能试剂衍生适用于将肽或低聚物或多聚体交联至水不溶 性载体基质或其它大分子载体。常用的交联剂包括例如1,1-双(重氮 乙酰基)-2-苯基乙烷；戊二醛；N-羟基琥珀酰亚胺酯，与4-叠氮基水 杨酸的酯；同质双官能亚氨酸酯，包括二琥珀酰亚氨基酯，如3,3'- 二硫代双(琥珀酰亚氨基丙酸酯)；以及双官能马来酰亚胺，如双-N- 马来酰亚胺基-1,8-辛烷。如甲基-3-[(对-叠氮苯基)二硫代]丙亚氨酸酯 的衍生化试剂产生能够于光存在下形成交联的光可活化中间体。或 者，为固定蛋白质，采用如描述于美国专利3,969,287；3,691,016； 4,195,128；4,247,642；4,229,537以及4,330,440中的如溴化氰活化的碳水化合物的反应性水不溶性基质和反应性基体。
其它修饰包括赖氨酸的羟基化、苏氨酰残基的羟基的磷酸化、(添 加的)赖氨酸残基链的侧链的α-氨基的甲基化(Creighton,同上)、N- 末端胺的乙酰化并且在一些情况下C-末端羧基的酰胺化。还包括肽， 其中一个或多个D-氨基酸被取代为一个或多个L-氨基酸。
多聚体肽或寡聚体肽
本发明还包括从CSP-4或其功能衍生物的重复单元构建的具有 CSP-4的抗凋亡和保护活性的更长肽。所述多聚体的优选肽单元是 FTTFTVT(SEQ ID NO:1)。所述肽的可以是多聚体的“单元”的添加变 体优选地包括1-4个另外氨基酸。
肽多聚体可包含肽单体(其可包括SEQ ID NO:1或其添加变体中 的任一者或两者)的不同组合或肽的化学衍生形式。这类寡聚体或多 聚体肽可通过如本文所讨论的化学合成或通过重组DNA技术来制 备。当通过化学合成产生时，寡聚体优选地具有核心肽序列的2-5个 重复单元，并且多聚体中的氨基酸的总数目不应超过约160个残基， 优选地不多于100个残基(或其等效物，当包括接头或间隔区时)。
优选的合成化学肽多聚体具有式
P1 n
其中核心肽P1是SEQ ID NO:1，并且其中n＝2-5，并且其中单独 或成寡聚体或多聚体形式的核心肽在这种活性的体外或体内生物测 定中具有如本文所公开的CSP-4的生物活性。
在另一个实施方案中，优选的合成化学肽多聚体具有式
(P1-Xm)n-P2
P1和P2是以上所述的核心肽，包括另外变体，其中
(a)P1和P2可以是相同的或不同的；此外，P1在多聚体中的每次 出现可以是不同的肽(或变体)；
(b)X是包含或由以下组成的间隔区：
(i)短有机链，优选C1-C5烷基、C1-C5烯基、C1-C5炔基、含有最 多4个氧原子的C1-C5聚醚，其中m＝0或1并且n＝1-7；或
(ii)Glyz，其中z＝1-6，
并且其中单独或呈多聚体形式的核心肽在这种活性的体外或体 内测定中具有如本文所公开的CSP-4的生物活性。
当重组产生时，优选的间隔区是如上所述的Glyz，其中z＝1-6， 并且所述多聚体可具有如表达系统所允许尽可能多的核心肽序列的 重复单元，例如2至约25个重复单元。优选的重组产生的肽多聚体 具有式：
(P1-Glyz)n-P2
其中：
(a)P1和P2独立地是SEQ ID NO:1或3或其添加变体或衍生形式， 其中P1和P2可以是相同的或不同的；此外，P1在多聚体中的每次出 现可以是不同的肽(或变体)；
其中
n＝1-25且z＝0-6；(n的优选范围包括n＝1-5、1-10、1-15或1-20) 并且其中单独或呈多聚体形式的核心肽在这种活性的体外或体内生 物测定中具有如本文所公开的CSP-4的生物活性。
在本发明的肽多聚体中，P1或P2优选地是SEQ ID NO:1或其添 加变体或化学衍生物。所述多聚体是任选地加帽的。应理解，可从本 文所述的任何肽或变体构建所述多聚体。还应理解，所述肽多聚体应 不同于SEQ ID NO:3(即，不是天然人Cav-1并且优选地不是天然哺 乳动物Cav-1同源物)。
肽模拟物
本发明的范围内还包括一种肽模拟物化合物，其模拟CSP-4的生 物作用。肽模拟药剂可以是非天然肽或非肽药剂，其再产生CSP-4 的结合元件的立体空间特性，以使得它具有CSP-4的结合活性和生物 活性。与生物活性CSP-4肽、肽多聚体类似，肽模拟物将具有结合面 (其与CSP-4所结合的任何配体相互作用)和非结合面。再次，与CSP- 4类似，肽模拟物的非结合面将含有官能团，所述官能团可通过偶联 不同治疗性部分来进行修饰而不修饰肽模拟物的结合面。肽模拟物的 优选实施方案将在分子的非结合面上含有苯胺。苯胺的NH2基团具 有pKa约4.5并且可因此通过任何NH2选择性试剂进行修饰，而不修 饰肽模拟物的结合面上的任何NH2官能团。其它肽模拟物可能在其 结合面上不具有任何NH2官能团，并且因此不考虑pKa，任何NH2可在非结合面上展示作为缀合位点。此外，其它可修饰的官能团如-SH 和-COOH可并入至肽模拟物的非结合面中作为缀合位点。治疗性部 分还可在肽模拟物的合成期间直接并入并且优先地在分子的非结合 面上展示。
本发明还包括保留部分肽特征的化合物。例如，本发明的肽内的 任何蛋白水解不稳定的键可选择性地被非肽元件如同电子排列体(N- 甲基化；D-氨基酸)或还原的肽键置换，而所述分子的其余部分保留 其肽性质。
已经针对多种生物活性肽/多肽如阿片肽、VIP、凝血酶、HIV蛋 白酶等描述了肽模拟物化合物，激动剂、底物或抑制剂。用于设计和 制备肽模拟物化合物的方法是本领域中已知的(Hruby,VJ, Biopolymers 33:1073-1082(1993)；Wiley,RA等,Med.Res.Rev. 13:327-384(1993)；Moore等,Adv.in Pharmacol 33:91-141(1995)； Giannis等,Adv.in DrugRes.29:1-78(1997)。模拟二级结构的某些模 拟物描述于Johnson等,Biotechnology andPharmacy,Pezzuto等, Chapman和Hall(编辑),NY,1993中。这些方法用于制备至少具有CSP-4肽的结合能力和特异性并且优选地还具有生物活性的肽模拟 物。鉴于本公开，本领域的技术人员可获得的肽化学和一般有机化学 的知识足以用于设计和合成这类化合物。
例如，这类肽模拟物可通过检查游离的或与配体(例如，可溶性 uPAR或其片段)结合在复合物中的本发明的肽的三维结构来鉴别。或 者，与其配体结合的本发明的肽的结构可通过核磁共振光谱法的技术 获得。对所述肽与其配体或受体的相互作用的立体化学的更多了解将 允许这类肽模拟药剂合理设计。在配体不存在下本发明的肽或多肽的 结构还可提供用于设计模拟分子的支架。
可递送肽和肽多聚体
本发明的一个实施方案包括一种将本发明的肽引入至动物细胞 如人细胞中的方法。适用于所述方法的被称为“可递送”或“细胞可递 送”或“细胞靶向”肽或多肽的组合物包含根据本发明的生物活性肽， 优选地CSP-4、或其功能衍生物、或其肽多聚体，其连接至或与充当 “内化序列”或细胞递送系统的另一组分缔合。术语“与…缔合”可包括 如在混合物中化学键合或偶联(无论是通过共价还是其它键或力)或 组合。如本文所用，“递送”是指使肽/多肽在细胞中内化，本文所考 虑的递送分子包括由其它分子用于实现细胞进入的肽/多肽。参见， 例如Morris等,Nature Biotechnology,19:1173-6,2001)。优选地策略是如下：使本发明的抑制细胞凋亡的(“生物活性”)肽与特别设计的肽键 合或混合，所述特别设计的肽有助于其进入细胞，优选地人细胞。这 种递送系统不需要递送肽融合或化学偶联至生物活性肽或多肽(虽然 这样是优选的)，生物活性肽或多肽也不必须在递送或内化过程之前 变性。早期递送系统的缺点是对于在递送之前“有效负载”蛋白质的变 性和随后的细胞内复性的需求。这些实施方案是基于用于促进蛋白质 易位至细胞中的已知方法。
促进易位/内化的一种类型的“递送”肽/多肽包括HIV-TAT蛋白 (Frankel,AD等,Cell 55:1189-93(1998)，以及来自触角足同源域的第 三个α螺旋(Derossi等,J.Biol.Chem.269:10444-50(1994)；Lindgren, M等,Trends Pharm.Sci.21:99-103(2000)；Lindgren等,Bioconjug Chem.(2000)；Maniti O等,PLoS ONE 5e15819(2010)。还被称为“穿 膜肽”的后者肽是具有野生型序列RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:6)的16个氨基酸的肽或指定为W48F (RQIKIFFQNRRMKWKK，SEQ ID NO:7)和W56F (RQIKIWFQNRRMKFKK，SEQ ID NO:8)的两种类似物/变体(Christiaens B等,Eur J Biochem 2002,269:2918-2926)。具有以上突变 中的两者的另一种变体是RQIKIFFQNRRMKFKK(SEQ ID NO:9)。 转运肽(一种细胞穿透肽)是27个氨基酸长的肽，其含有来自通过添 加的Lys残基连接至肥大脱粒肽的序列的神经肽甘丙肽的N末端的 12个功能性氨基酸(Pooga,M等,FASEB J.12:67-77(1998))。转运肽的 序列是GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL(SEQ ID NO:10)。 穿膜肽和转运肽的类似物由Lindgren等,Bioconjug Chem.2000描述。
另一种蛋白质(家族)包括VP22，一种具有细胞间转运的显著特 性并且将蛋白质分配至许多周围细胞的单纯疱疹病毒蛋白(Elliott,G 等,1997,Cell 88:223-33；O’Hare等,美国专利6,017,735)。例如，VP22 连接至p53(Phelan,A.等,1998,Nat Biotechnol 16:440-3)或胸苷激酶 (Dilber,MS等,1999,Gene Ther 6:12-21)，从而有助于连接的蛋白质体 外扩散至周围细胞。还有用的是其它疱疹病毒中的VP22同源物，如 与HSV-1VP22具有同源性的禽类马立克氏病病毒(MDV)蛋白 UL49(Koptidesova等,1995,Arch Virol.140:355-62)并且已经显示能够 在外源应用之后细胞间转运(Dorange等,2000,J Gen Virol.81:2219)。 所有这些蛋白质共有细胞间扩散的特性，所述蛋白质提供用于增强本 发明的肽、变体和多聚体的细胞摄取的方法。
还包括以上细胞间扩散或“递送”“递送”或“内化”蛋白和肽如 HIV-TAT或VP22的“功能衍生物”，所述功能衍生物包括同源氨基酸 取代变体、片段或化学衍生物，所述术语在本文针对生物活性肽。功 能衍生物保留可测量的易位或细胞间扩散(VP22样)活性，所述活性 促进所需多肽的进入，从而促进本发明的生物活性肽(例如)用于治疗 的效用。“功能衍生物”涵盖变体(优选保守性取代变体)和片段，而不 管所述术语是结合使用还是单独使用。
因为上述转运蛋白据说在缀合或以其它方式结合至它们所转运 的肽(如CSP-4或其变体或多聚体)时作用最佳，所以使用它们存在许 多缺点。可与生物活性肽混合并且不需要针对其作用化学键合的更有 效的递送多肽描述于Morris等,同上中，如“Pep-1”，其具有两亲性 氨基酸序列KETWWETWWTEWSQPKKKRKV(SEQ ID NO:11)。 Pep-1由三个结构域组成：
(1)含有五个Trp残基的疏水性富含Trp的基序 KETWWETWWTEW(以上SEQ ID NO:11的残基1-12)。此基序是 对于有效靶向细胞膜并且对于进入与蛋白质的疏水相互作用来说合 意的或所需的。
(2)亲水性富含Lys的结构域KKKRKV(SEQ ID NO:11的6个 C末端残基)，其来源于SV40病毒大T抗原的核定位序列并且改进细 胞内递送和肽溶解度；以及
(3)间隔区“结构域”SQP(SEQ ID NO:12的3个内部残基)，其使 上述两个活性结构域分隔并且包括改进疏水结构域和亲水结构域两 者的柔性和完整性的Pro。
因此，本发明的另一个实施方案是如上所述的包含CSP-4或其功 能衍生物的可递送肽或多肽，以及与其结合或与其缔合的递送或易位 分子或部分。所述递送分子可以是肽或多肽，例如，
(a)HIV-TAT蛋白或其易位活性衍生物，
(b)具有序列RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:8)的穿膜 肽，
(c)具有序列RQIKIFFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:7)的穿膜 肽变体W48F
(d)具有序列RQIKIWFQNRRMKFKK，SEQ ID NO:13)的穿膜 肽变体W56F
(e)具有序列RQIKIWFQNRRMKFKK，SEQ ID NO:16)的穿膜 肽变体
(f)具有序列GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL(SEQ ID NO:10)的转运肽
(g)单纯疱疹病毒蛋白VP22或来自不同疱疹病毒的其易位活性 同源物如MDV蛋白UL49；或
(h)Pep-1，具有序列KETWWETWWTEWSQPKKKRKV(SEQ ID NO:9)。
当递送部分(如以上所讨论的肽和蛋白质)缀合或融合至本发明 的生物活性肽时，优选的是所述递送部分是经N末端缀合或融合至 所述生物活性肽。
组合物的体外测试
使用本文所述和/或举例说明的测定或本领域中已知的其它测 定，将本发明的化合物针对其生物活性进行测试，所述生物活性例如 抗纤维化活性、其影响uPA、uPAR和PAI-1mRNA的表达、抑制肺 成纤维细胞的增殖的能力等。
组合物的体内测试
化合物(如NTL类似物或CSP-4变体或衍生物或肽多聚体)抑制 BLM处理的小鼠中的肺纤维化的能力是用于评定化合物的功能活性 的优选测试。还可使用本领域中已知的测量相同类型的活性的其它测 试。
预防或治疗肺损伤和纤维化的方法
本文所述的化合物和组合物用于方法中以在体外或体内抑制 MDM2与p53蛋白的相互作用，并且治疗与ALI和肺纤维化/IPF相 关的疾病或病状
药物和治疗性组合物及其施用
可在本发明的药物组合物中采用的化合物包括NTL和以上所述 的所有肽化合物以及这些化合物的药学上可接受的盐。“药学上可接 受的盐”是指保留本发明的化合物的生物有效性和特性并且是由适合 的无毒有机或无机酸或有机或无机碱形成的常规酸加成盐或碱加成 盐。酸加成盐的实例包括由如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、氨基磺 酸、磷酸和硝酸的无机酸获得的盐、以及由如对甲苯磺酸、水杨酸、 甲烷磺酸、草酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸等的有机 酸获得的盐。碱加成盐的实例包括由铵、钾、钠和季铵氢氧化物，例 如像氢氧化四甲铵获得的盐。将药物化合物(即，药物)化学改性成盐 是药物化学家熟知的用于获得化合物的改进的物理和化学稳定性、吸 湿性、流动性和溶解度的技术。参见，例如H.Ansel等,Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(第6版1995)第196和 1456-1457页。
如以上所述，本发明的化合物具有抑制MDM2与p53蛋白的相 互作用的能力并且用于治疗急性肺损伤，且具体地说，肺纤维化。
本发明的化合物以及其药学上可接受的盐可并入至常规剂型，如 胶囊、浸渍干胶片、片剂或优选地可注射制剂中。可采用固体或液体 药学上可接受的载体。“药学上可接受的”如药学上可接受的载体、赋 形剂等意指药理学上可接受并且对具体化合物所施用的受试者实质 上无毒。
固体载体包括淀粉、乳糖、硫酸钙二水合物、白土、蔗糖、滑石、 明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁和硬脂酸。液体载体包括糖 浆、花生油、橄榄油、盐水、水、右旋糖、甘油等。类似地，载体或 稀释剂可包括任何延长释放物质，如单独或与蜡组合的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。当使用液体载体时，制剂可呈糖浆、酏剂、乳 液、软明胶胶囊、无菌可注射液体(例如溶液)如安瓿或水性或非水性 液体悬浮液形式。这类药物组合物的总结可例如在Gennaro,AR, Remington:The Science and Practice of Pharmacy,LippincottWilliams &Wilkins Publishers；第21版,2005(或最新版本)中找到。
按照药物化学的常规技术制备药物制剂，所述常规技术涉及如混 合、制粒和压缩(当需要用于片剂形式时)，或混合、填充和溶解成分 (在适当时)等步骤，以得到用于口服、胃肠外、局部、经皮、阴道 内、阴茎内、鼻内、支气管内、颅内、眼内、耳内和直肠施用的所需产品。所述药物组合物还可含有少量无毒助剂物质如润湿或乳化剂、 pH缓冲剂等。
本发明可用于治疗任何多种动物属和种，并且同样适用于人或兽 医医学实践。因此，所述药物组合物可用于治疗家养和商业动物，包 括鸟类且更优选哺乳动物，最优选人。
术语“全身施用”是指以导致将组合物引入受试者的循环系统或 以其它方式允许所述组合物在全身扩散的方式如静脉内(ⅳ)注射或 输注来施用组合物或药剂如本文所述的NTL或肽。“区域性”施用是 指施用至特定且较为有限的解剖空间，如滴注在肺中(优选的途径)或 胸膜内、腹膜内、鞘内、硬膜下或施用至特定器官。其它实例包括鼻 内(其是对应于滴注在肺中的一种途径)、支气管内、耳内或眼内等。 术语“局部施用”是指将组合物或药物施用至受限制的或局限性解剖 空间，如皮下(s.c.)注射、肌内(i.m.)注射。本领域的技术人员将理解， 局部施用或区域性施用经常还导致组合物进入循环系统，即，以使得 皮下或肌内也是用于全身性施用的途径。可制备呈常规形式的可滴 注、可注射或可输注制剂，作为溶液或悬浮液、适合用于在注射或输 注之前在液体中溶解或悬浮的固体形式或作为乳液。虽然优选的区域 性施用途径是至肺中，但药物组合物可与滴注至肺中分开地或同时地 全身或局部或经皮施用。
用于本发明的组合物的其它药学上可接受的载体是脂质体，其中 包含于药物组合物中的活性多肽分散于或以不同方式存在于由粘附 至脂质层的水性同心层组成的小体中。所述活性多肽优选地存在于水 层中并且存在于脂质层中内部或外部，或者在任何情况下存在于一般 被称为脂质体悬浮液的非同质系统中。疏水层或脂质层通常但不排他 地包含磷脂如卵磷脂和鞘磷脂、类固醇如胆固醇、或多或少离子表面 活性物质如联十六烷基磷酸酯、硬脂胺或磷脂酸，和/或其它疏水性 质的材料。本领域技术人员将了解本发明的脂质体制剂的其它适合的 实施方案。
所施用的治疗剂量是治疗上有效的量，如本领域的技术人员所已 知或可容易地确定。剂量还取决于接受者的年龄、健康状况和体重， 同步治疗的种类(如果存在)，治疗的频率和所需作用的性质。
治疗方法
本发明的方法可用于治疗有需要的受试者中的肺纤维化或IPF。 术语“治疗”被广泛地定义为包括至少以下：抑制、减少、改善、预防 所治疗或预防的疾病或病状的症状，减少所治疗或预防的疾病或病状 的症状的发生或复发(包括复发频率和/或时间)或降低所治疗或预防 的疾病或病状的症状的严重性。这可能作为抑制上皮细胞死亡、抑制 成纤维细胞增殖、本文所公开的如与IPF相关或是IPF的原因的任何 其它生物学或生物化学机制的结果而发生。
所述NTL、NTL类似物或肽或肽衍生物或其药学上可接受的盐 优选地以如上所述的药物组合物的形式施用。
所述化合物的剂量优选地包括包含有效量的NTL或肽的药物剂 量单元。剂量单元形式是指适合作为用于哺乳动物受试者的单一剂量 的物理上离散单元；每个单元含有经计算可产生所需治疗作用的与所 需药物载体缔合的预定量的活性物质。本发明的剂量单元形式的规格 受支配于并且直接依赖于(a)活性物质的独特特征和待实现的特定治 疗作用，和(b)混配所述活性化合物以用于治疗个体受试者中敏感性 的技术领域中固有的限制因素
有效量意指足以实现区域浓度或体内稳态浓度的量，所述量导致 任何相关疾病参数中可测量的减少。
待施用的活性化合物的量取决于所选择的NTL、NTL衍生物、 肽或其衍生物、确切的疾病或病状、施用途径、接受者的健康状况和 体重、其它同步治疗(如果存在)的存在、治疗的频率、所需的作用的 性质以及熟练从业者的判断。
由其产生的每日一次给予以用于治疗受试者(优选哺乳动物、更 优选患有或易患IPF)的优选单剂量在约0.2mg/kg与约250mg/kg之 间，优选地在约10mg/kg至约50mg/kg之间，例如通过滴注(通过吸 入)。这种剂量可针对约3天至一个或多个周的任何地方每日施用。 长期施用也是可能的，但是剂量可能需要向下调整，如本领域中所良 好理解。然而，前述范围是建议性的，因为个体治疗方案中的变量的 数目较大，并且预期相当大地偏离于这些优选值。
对于连续施用，例如通过泵系统如在下文所述的一些实验中使用 的渗透泵，用于约1-2周的时程的总剂量优选地在1mg/kg至1g/kg 的范围内，优选地20-300mg/kg，更优选地50-200mg/kg。在这种连 续给药方案之后，活性化合物的总浓度优选地在约0.5至约50μM、 优选地约1至约10μM的范围内。
用于体外抑制或预防细胞凋亡的活性化合物的有效浓度在约0.5 nM至约100nM、更优选地约2nM至约20nM的范围内。有效剂量 和优选剂量范围可使用本文所述的方法体外确定。
现在已经一般性地描述了本发明，通过参考以下实施例将更容易 地理解本发明，所述实施例以说明的方式提供，并且不旨在限制本发 明，除非指明。包括所述实施例以证明本发明的优选实施方案。本领 域技术人员应理解以下实施例中公开的技术表示由本发明人发现的， 在本发明的实践中发挥良好作用的技术，并且因此可被认为构成本发 明实践的优选模式。然而，根据本公开，本领域技术人员应理解，在 不脱离本发明的精神和范围的情况下可在已公开并仍获得类似或相 似结果的特定实施方案中做出许多改变。
实施例I
IPF肺的纤维化病灶中减少的FL成纤维细胞p53表达
用不同试剂(包括通过免疫组织化学)(IHC)染色来自IPF患者和 对照“正常”受试者的肺切片(参见图2A-2I)揭示，IPF组织展示充满 ECM的肺纤维化病灶。分散于富含波形蛋白的病灶中的FL成纤维细 胞显示针对p53和PAI-1抗原的最小染色。然而，针对SP-C、PAI-1、 p53和活性半胱天冬酶-3(未示出)的免疫荧光染色证明，围绕纤维化 病灶的II型肺泡(ATII)细胞显示针对p53和PAI-抗原1的升高的染色， 并且是针对活性半胱天冬酶-3阳性的，从而指示环绕ATII细胞的细 胞凋亡。IHC结果揭示，环绕纤维化病灶的ATII细胞由于增加的p53 和PAI-1表达而连续死亡。这些伤口被活化的成纤维细胞置换，其显 示最小基础p53和PAI-1和升高的ki-67染色，从而指示由于抑制p53 和PAI-1表达所致的增殖。
实施例II
来自IPF肺的人FL成纤维细胞中减少的小窝蛋白-1、p53和PAI以及增加的uPA
将来自NL-和FL成纤维细胞的细胞溶解产物进行免疫印迹以揭 示蛋白质和miRNA中的变化。参见图3A-3B。基础miR-34a表达在 FL成纤维细胞中显著更低，从而指示促成纤维发生的p53-uPA纤溶 系统相互作用中减少的p53表达和随后的变化。这类变化与增加的col-I和miR-34a的抑制相关。所述结果进一步表明，通过miR-34a 介导的人FL成纤维细胞中p53诱导的miR-34a转录增加或p53的稳 定化可减轻肺纤维化。
实施例III
来自IPF和“正常”肺的成纤维细胞的uPA、PAI-1和col-I mRNA的不同表达。
将从来自“正常”受试者和具有IPF的患者的肺组织或从NL-分离 的总RNA通过定量RT-PCR针对uPA、PAI-1和col-I mRNA进行测 试并且标准化至β-肌动蛋白mRNA的对应水平。结果在图4A-4B中 示出。
col-I和PAI-1mRNA的表达在IPF肺组织中显著增加，而uPA mRNA减少。有趣的是，相比于NL-成纤维细胞发现FL成纤维细胞 中的col-I和uPAmRNA和PAI-1(表达水平较低)的mRNA表达有别 于IPF肺组织。uPAR蛋白和mRNA在FL成纤维细胞中也升高。肺 组织中升高的PAI-1归因于肺上皮细胞或巨噬细胞而不是FL(IPF)-成 纤维细胞的增加的PAI-1表达。这与来自IPF肺的FL成纤维细胞中 增加的col-I、uPA和uPAR表达以及减少的PAI-1蛋白一致(参见图 3A)。
实施例IV
来自小鼠的FL-对比NL-成纤维细胞的uPA和PAI-1的差异表达
FL成纤维细胞是在BLM损伤之后21天从小鼠的肺分离的或来 自对照小鼠的NL-成纤维细胞暴露于鼻内盐水，如其它地方所述26。 将来自NL-和FL成纤维细胞的溶解产物进行免疫印迹。通过对NL- 和FL成纤维细胞的细胞溶解产物的免疫印迹来检测p53、uPA、PAI-1和col-I蛋白的表达的变化。(图5A-5D)。从来自具有BLM诱导的纤 维化的小鼠的肺组织的小鼠肺组织NL-和FL成纤维细胞或对照(经盐 水处理的)提取总RNA并且针对uPA、PAI-1和Col-I mRNA进行测 试。对来自小鼠的NL-和FL成纤维细胞的增殖率进行比较。与来自 IPF肺2的FL(IPF)-成纤维细胞一致，鼠FL(BLM)-成纤维细胞的基线 增值率显著高于NL-成纤维细胞(来自经盐水处理的小鼠)的增殖率。 p53抑制uPA基因转录，同时结合PAI-1启动子并且增强PAI-1mRNA 转录33-34。p53还通过去稳定其转录物同时稳定PAI-1转录物来抑制uPA和uPAR的表达23-25。最后，抑制uPA或uPAR增强p53表达和 下游p53介导的PAI-1的诱导，从而增加细胞衰老和细胞凋亡。得出 结论，在转录和转录后水平下uPA纤溶系统的p53介导的调控由于 p53表达的缺乏而在FL成纤维细胞中受损。这导致在这些细胞中增 加的uPA和uPAR、以及PAI-1的抑制。
实施例V
CSP通过诱导FL(IPF)-成纤维细胞中的miR-34a来增强p53表达。
将NL-和FL成纤维细胞用PBS、CSP或CP进行处理并且通过 实时PCR针对miR-34a对RNA进行分析。此外，将FL成纤维细胞 在有或无miR-34a反义(miR-34a-AS)或前体-miR-34a(或对照miRNA) 的情况下在PBS或CSP或CP存在下培养。将来自这些培养物的条 件培养基(CM)针对PAI-1进行免疫印迹并且将细胞溶解产物(CL)针 对p53进行免疫印迹。在一个实验中，将FL成纤维细胞在存在或不 存在miR-34a-AS、前体-miR-34a或对照miR的情况下用PBS或CSP 或CP进行处理。将RNA通过实时PCR针对miR-34a中的变化进行 分析。结果显示在图6A-6C中。
在CSP中进行一系列重叠缺失并且将这些肽片段在FL成纤维细 胞上针对p53、uPA、PAI-1和Col-I的变化进行测试(图6D)。
CSP显著增加FL-但不是NL-成纤维细胞中的miR-34a和p53表 达。通过单独表达前体-miR-34a来模拟并且通过经由miR-34a-AS抑 制miR-34a来消除由CSP诱导p53。这指示p53的诱导通过miR-34a 介导的稳定化发生。
对CSP 20聚体的缺失分析揭示，命名为CSP-4并且具有序列 FTTFTVT(SEQ ID NO:1)的内部7个氨基酸的片段具有全长肽的活 性。这支持以下结论：CSP-4在FL成纤维细胞或具有已形成的肺纤 维化的小鼠中的有益作用(参见图11A-11D)涉及p53和miR-34a表达 的控制。
实施例VI
FL(IPF)-成纤维细胞中Mdm2介导的增加的p53蛋白的降解
将来自NL-和FL成纤维细胞的溶解产物针对p53和mdm2进行 免疫印迹或用抗-mdm2抗体进行免疫沉淀并且针对相关的p53蛋白 进行免疫印迹(IB)。所述结果显示NL-成纤维细胞中稳健的mdm2-p53 相互作用，所述相互作用在FL成纤维细胞中不存在(参见图7A-7B)， 尽管在FL成纤维细胞中mdm2水平升高。因此，增加的mdm2介导 的p53蛋白的降解促成FL成纤维细胞中基线p53水平的显著抑制， 从而支持使用本文所公开的治疗性干预靶向mdm2与p53的相互作 用。
实施例VII
FL(IPF)-成纤维细胞中nutlin-3a(NTL)或CSP-4-介导的col-I表达的抑制：p53- 纤溶系统相互作用的作用
使FL成纤维细胞暴露于PBS(对照)、nutlin-3a(10μM)、CSP-4(10 nM)或CP 48小时。将溶解产物针对Col-I、PAI-1、p53和uPA的表 达进行免疫印迹。结果在图8A-8B中示出。将经培养的FL暴露于媒 介物(PBS)或nutlin-3a、CSP-4或CP并且计数以评定增殖。结果显示 nutlin-3a和CSP-4两者均抑制col-I表达和FL成纤维细胞的增殖。所 述过程涉及诱导p53和PAI-1表达，以及uPA的同时抑制。
在另一个实验(图8C中的结果)中，将FL成纤维细胞用表达p53、 PAI-1或小窝蛋白-1的腺病毒载体或适当载体对照转导，并且培养2 天，此时将细胞溶解产物针对Col-I、p53、PAI-1和uPA进行免疫印 迹。用Ad-Cav-1转导来自IPF肺的FL成纤维细胞诱导p53和PAI-1， 同时抑制uPA和col-I表达。通过单独表达p53或PAI-1或小窝蛋白 -1来模拟nutlin-3a或CSP-4对FL成纤维细胞的作用。因此，p53介 导的PAI-1的诱导和uPA表达的抑制促成col-I的抑制。令人感兴趣 的是，用重组PAI-1蛋白处理来自IPF患者或BLM处理的小鼠的肺 的FL成纤维细胞未能诱导细胞凋亡或衰老(未图示)，而升高的外源 性PAI-1在体外和体内诱导ATII细胞凋亡。FL成纤维细胞对外源性 PAI-1的抗性将使得这些细胞在IPF或BLM损伤的肺的富含PAI-1 蛋白的环境中处于活跃状态。
实施例VIII
p53-纤溶系统相互作用在诱导NL-成纤维细胞中的col-I表达中的作用。
将从组织学上“正常”的人肺2(S.Shetty等,1996,同上)分离的 NL-成纤维细胞用携带p53shRNA的慢病毒载体转染以抑制基线p53 表达。将对照细胞用非特异性shRNA类似地处理。将来自培养物的 条件培养基针对PAI-1、uPA和可溶性col-I进行免疫印迹，并且将细 胞溶解产物针对p53和α-SMA进行测试。将从这些成纤维细胞分离 的总RNA通过定量RT-PCR针对uPA、PAI-1和col-I mRNA的表达 的变化进行分析。结果(图9A-9B中)显示抑制NL-成纤维细胞中的p53 表达增强uPA、col-I和α-SMA但抑制PAI-1。这支持在此所描述的 uPA系统中p53介导的变化与纤维发生之间的联系。
实施例IX
Nutlin-3a抑制BLM处理的小鼠中的肺纤维化
将暴露于BLM(或对照中的盐水)14天以诱导肺纤维化的小鼠用 nutlin-3a(10mg/kg体重)(Zhang等,同上)或媒介物对照静脉内注射 以测定并且检查对已形成的肺纤维化的作用。通过CT扫描评价纤维 化并且使用Flexivent系统测量肺功能(顺应性和抗性)。使肺切片经受 三色染色和H&E染色(后者未图示)以评定肺结构和作为纤维化的指 示的胶原沉积。最后，将全肺匀浆针对总胶原(羟基脯氨酸)和锁链素 含量(Bhandary YP等,Am JPhysiol:Lung Cell Mol Physiol 302:L463-73,2012；Bhandary YP等,Am J Pathol,183:131-43 2013)作 为ECM的独立评定来进行分析。所有以上测试的结果(图10A-10D) 指示nutlin-3a对肺纤维化的有益作用。在BLM损伤之后口服施用 Nutlin-3a 14天同样抑制小鼠中的肺纤维化。
实施例X
CSP-4肽抑制已形成的肺纤维化并且改善肺功能。
将小鼠暴露于BLM以诱导肺纤维化。在14天之后，将小鼠用 媒介物或1.5mg/kg体重的CSP-4(SEQ ID NO:1)或1.5mg/kg体重的 对照肽(相同氨基酸的加扰序列；CP，SEQ IDNO:5))静脉内注射，或 将媒介物静脉内注射至14天前暴露于BLM的小鼠中。一周之后， 将小鼠通过CT扫描进行测试以评价肺纤维化。使用定量CT再现在 同一小鼠中测量肺体积。使肺切片经受染色(三色和H&E)以评定作为 肺纤维化的指标的胶原沉积。将全肺匀浆针对总羟基脯氨酸和锁链素 含量(后者结果未图示)进行分析。结果在图11A-11D中。所有测试均显示CSP-4抑制BLM诱导的肺纤维化。与CSP和CSP-4两者对来 自IPF肺的FL成纤维细胞的体外作用(参见图6D)一致，CSP-4在体 内针对已形成的肺纤维化施加有益作用，从而模拟全长肽CSP(SEQ ID NO:3)的有益作用。
实施例XI
CSP-4肽和Nutlin-3a抑制FL成纤维细胞的增殖。
将14天前暴露于BLM的小鼠用CSP-4或其对照(CP)或Nutlin-3a IV处理(如在实施例IX和X中)。七天之后获得肺切片并且使其针对 Ki-67经受IHC以评定细胞增殖(参见图12A)。在纤维化小鼠的肺切 片中观察到的针对ki-67抗原的增加的染色通过用nutlin-3a或CSP-4 处理显著减少。将从这些动物的肺分离的成纤维细胞(如描述于实施 例X中)通过蛋白质印迹法针对col-I、p53和下游uPA以及PAI-1蛋 白的表达中的变化进行测试，并且通过定量RT-PCR针对mRNA进 行测试(参见图12B-12C)。来自具有已形成的BLM诱导的纤维化的 小鼠的FL成纤维细胞显示增加的uPA和col-I mRNA并且将蛋白质 表达与来自无肺损伤的小鼠的NL-成纤维细胞进行比较。这些细胞也 显示最小p53和PAI-1表达。然而，在来自用nutlin-3a处理的小鼠的 成纤维细胞中，uPA和col-I蛋白质和mRNA表达被显著抑制。这些变化与显著诱导p53蛋白和PAI-1蛋白以及mRNA表达相关，从而 指示p53纤溶系统相互作用的恢复减轻纤维化。
实施例XII
通过用CSP-4或Nutlin-3a离体处理来抑制纤维化变化
将小鼠暴露于鼻内BLM持续21天以诱导肺纤维化，处死并切 下其肺，并且切成小片且置于培养基中。之后将这些组织样品用10 nM CSP-4肽、对照肽(CP)或nutlin-3a处理72小时。制备条件培养 基和组织溶解产物并且通过蛋白质印迹法针对col-I和α-SMA中的变 化进行分析。结果(图13)显示，用CSP-4或nutlin-3a处理纤维化肺组 织外植体离体抑制纤维化。全长CSP肽产生col-I和α-SMA的类似 抑制(结果未示出)。Nutlin-3a和CSP-4预期类似地作用以离体影响人 IPF肺组织。本文中和最近报道中提供的本发明人的结果(例如， Bhandary等,2012,2013,同上)有力地支持以下概念：p53介导的uPA 和PAI-1的下游变化调控FL成纤维细胞的存活力。
实施例XIII
FL成纤维细胞中的p53表达和uPA-纤溶系统的下游逆转在体内减轻肺纤维化。
本文和其它地方(Bhandary YP等,2012,同上)Shetty SK等,Am J Respir CellMol Biol 47:474-83,2012)所报道的结果显示，在BLM之 后第14天开始的野生型(WT)小鼠中腹膜内或静脉内施用CSP或 CSP-4(图11A-11D)、或静脉内或口服施用nutlin-3a(图10A-10D)减 轻已形成的肺纤维化。因此，mdm2介导的p53蛋白的降解和下游 p53-uPA系统相互作用的损失体内增加FL成纤维细胞存活力和ECM 的产生，从而导致肺结构的破坏和肺功能的损失。因为患者经常呈现 IPF的晚期阶段(在初始诊断时)，所以评价nutlin-3a和CSP-4抑制已 形成的肺纤维化的机制并且鉴别nutlin-3a和CSP-4的下游靶标。这 些研究利用来自IPF患者和由于BLM肺损伤而具有晚期肺纤维化的 小鼠的肺组织。p53-uPA系统相互作用的贡献和特异性通过使用 uPA-、uPAR-、PAI-1-和p53-缺陷的小鼠得以证实。
A.使用FL(IPF)组织离体测定nutlin-3a和CSP-4处理对纤维化 的作用。
将来自IPF患者的新鲜解剖的FL肺组织用nutlin-3a(10μM)或 CSP-4(10nM)处理3至7天(参见图13)。将肺组织均质化并且针对 ECM(羟基脯氨酸和锁链素)中的变化进行测试。对照包括来自用媒介 物或对照肽处理的IPF患者的纤维化肺(FL)组织，CP或天然肺组织 维持在培养基中。其它对照包括从组织学上“正常”的肺切除的NL组 织。不适合于移植和捐献用于医学研究的去识别患者(“正常”和IPF) 肺通过IIAM(Edison,NJ)和NDRI(Philadelphia,PA)获得并且用于离 体研究。成纤维细胞分离自这些组织并且针对p53、uPA、uPAR和 PAI-1表达、ECM的产生和存活力的变化进行分析。还测量ECM合 成速率的变化。当与来自对照受试者的NL-组织的切片中的表达水平 相比时，来自具有IPF的患者的FL组织外植体具有升高的ECM合 成。然而，当与那些保持未处理或暴露于单独媒介物或CP相比时， 用nutlin-3a或CSP-4处理的FL肺外植体显示显著降低的ECM合成 速率。从用nutlin-3a或CSP-4处理的IPF外植体分离的成纤维细胞 显示升高水平的p53、miR-34a和PAI-1，以及减少的uPA和uPAR 表达。Akt的磷酸化和PDGFR-βmRNA和蛋白质的表达在来自用nutlin-3a或CSP-4处理的IPF外植体的成纤维细胞中也减少。增殖速 率和这些成纤维细胞的ECM的产生显著低于来自未处理的或媒介物 或CP处理的对照的FL成纤维细胞，而与从NL-组织分离的成纤维 细胞相当。
B.p53和miR-34a在控制肺纤维化中的作用。
基于以上结果，预测FL成纤维细胞的p53和miR-34a表达的缺 乏促成肺纤维化并且通过诱导miR-34a来恢复nutlin-3a或CSP-4的 基线p53表达减轻肺纤维化。因为最大肺纤维化在BLM损伤之后 14-28天之间发生(Bhandary YP等,2012,同上；Bhandary YP等,2013, 同上；并且数据呈现在此)，所以在BLM肺损伤之后第14天和21天 通过静脉内注射含有proα2(I)胶原启动子与前体-miR-34a的慢病毒 (LV)来在小鼠肺成纤维细胞中表达前体-miR-34a。28天之后评价肺纤 维化。miR-34a在nutlin-3a或CSP-4介导的肺纤维化减轻中的作用通 过在纤维化肺中使用proα2(I)启动子，成纤维细胞中miR-34a-AS的 LV表达得以证实。
p53在针对肺纤维化的有益作用中的作用通过使用含有proα(I) 胶原启动子的LV或Ad-p53在有或无miR-34a抑制的情况下在具有 已形成的纤维化的小鼠的肺成纤维细胞中表达p53直接证实。例如在 BLM损伤之后28天评价肺纤维化和miR-34a表达。或者或另外，在 具有BLM诱导的肺纤维化的WT小鼠中使用LV shRNA或使用具有 已形成的肺纤维化的p53缺陷型小鼠，p53受抑制(Davis DW等,J Exp Med 192:857-869,2000)。然后使这些小鼠暴露于nutlin-3a或CSP-4， 例如，在BLM损伤之后第14和21天。使具有肺纤维化的对照小鼠暴露于非特异性shRNA或天然WT小鼠并且用nutlin-3a或CSP-4处 理。将小鼠针对肺纤维化和miR-34a表达进行测试，例如在BLM损 伤开始后第28天。通过以下方式证实P53-uPA系统相互作用的贡献： 使WT、p53-、uPA-、uPAR和PAI-1缺陷型小鼠暴露于BLM持续14-21 天以诱导肺纤维化，如上所述改变成纤维细胞中的miR-34a表达，并 且测试对纤维化的作用，例如在BLM损伤之后第28天。
C.通过nutlin-3a或CSP-4恢复p53表达和下游p53-uPA纤溶 系统相互作用抑制肺纤维化。
在小鼠中通过nutlin-3a和CSP-4，p53-uPA纤溶系统相互作用在 减轻肺纤维化中的贡献通过从这些小鼠分离成纤维细胞得以证实，例 如在BLM损伤之后第28天。将这些细胞针对p53、uPA、uPAR和 PAI-1表达和ECM的产生的变化进行测试。预期发现从具有BLM损伤的小鼠的肺分离的FL成纤维细胞将显示升高的uPA和uPAR、存 活力以及ECM产生。相较于来自未损伤肺的NL-成纤维细胞，这些 FL成纤维细胞显示最小p53和PAI-1表达。然而，来自暴露于nutlin-3a 或CSP-4的具有BLM诱导的纤维化的小鼠的肺的成纤维细胞显示升 高的p53。这些细胞增殖性较低，具有最小ECM产生。相较于从BLM 损伤的小鼠获得的FL成纤维细胞，uPA和uPAR表达减少，而PAI-1 增加。经BLM+nutlin-3a或BLM+CSP-4处理的小鼠的肺成纤维细胞 中的uPA、uPAR和PAI-1水平与从未损伤的小鼠分离的NL-成纤维 细胞相当。
为了证实p53-uPA系统相互作用的参与，将从BLM损伤小鼠肺 提取的FL成纤维细胞用Ad-p53转导。来自暴露于nutlin-3a或CSP-4 的BLM损伤肺的成纤维细胞是阳性对照，而暴露于CP或Ad-EV的 那些是阴性对照。将细胞针对uPA、uPAR和PAI-1中的变化进行测试。
Ad-p53的转导或用nutlin-3a或CSP-4处理增强PAI-1并且抑制 uPA和uPAR表达。相较于暴露于CP或Ad-EV的FL成纤维细胞， 这些细胞抑制ECM的产生和增殖速率。来自BLM小鼠的FL成纤维 细胞表达显著较低水平的小窝蛋白-1并且小窝蛋白-1的表达减轻 ECM的过量产生。因此，将FL成纤维细胞用Ad-Cav-1转导，以观 察p53和p53介导的uPA纤溶系统的下游变化、ECM和细胞存活力 是否相较于用Ad-EV处理的那些降低。
D.nutlin-3a或CSP-4介导的Akt磷酸化的抑制在减轻肺纤维化 中的作用。
FL成纤维细胞展示升高的Akt磷酸化和PDGFR-β表达，其提供 存活信号(Stambolic V等Mol Cell 8:317-25,2001；Li J等J Environ Pathol Toxicol Oncol 23:253-66,2004；Hoyle GW等Am J Pathol 154:1763-75,1999；Meinecke AK等Blood 14:119:5931-42,2012)。此 外，p53增强PTEN的表达(Stambolic等,同上；Mayo LD,等J Biol Chem277:5484-89,2002)并且抑制PDGFR-β(Widau RC等,Mol Cell Biol 32:4270-82,2012；Thornton JD等,Cell Cycle 4:1316-9,2005)，而 PAI-1抑制Akt磷酸化(Shetty SK等,2012,同上；Stambolic等,同上, Malinowsky K等Transl Oncol 5:98-104,2012)。用Ad-Cav-1转导FL 成纤维细胞通过增加的PTEN活性抑制Akt的磷酸化(Tourkina E等 OpenRheumatol J.6:116-22,2012；Wang XM等J Exp Med 203:2895- 906,2006；Xia H等Am JPathol 176:2626-37,2010)
本文提供的结果表明，nutlin-3a和CSP-4增强p53且抑制FL成 纤维细胞中的ECM的产生，并且减轻BLM诱导的肺纤维化。因此， 本发明者设想由于诱导p53和p53-uPA纤溶系统相互作用中的变化所 致的FL成纤维细胞中Akt和PDGFR-β存活信号的抑制减轻纤维化。为了测试这一点，将来自BLM损伤小鼠肺的FL成纤维细胞针对Akt 的磷酸化和PDGFR-β的表达进行测试。将反应与从在BLM损伤后 用nutlin-3a或CSP-4或CP处理的小鼠提取的成纤维细胞进行比较。 来自BLM损伤小鼠的FL成纤维细胞预期具有最低基线p53表达和 升高的Akt磷酸化。PDGFR-β表达预期在FL成纤维细胞中增加。P53 应该在来自用nutlin-3a或CSP-4处理的小鼠的成纤维细胞中增强， 从而导致抑制Akt磷酸化和PDGFR-β表达。由于来自BLM损伤小 鼠的FL成纤维细胞表达更多的uPA和uPAR，因此相较于来自用BLM 加nutlin-3a或CSP-4处理的小鼠的成纤维细胞，这些成纤维细胞将 显现增加的活力和ECM。然而，相较于Ad-EV处理的对照细胞，用 Ad-p53或Ad-Cav-1转导来自BLM小鼠的FL成纤维细胞将降低Akt磷酸化和PTEN、PDGFR-β表达、细胞存活力和ECM的产生。使用 shRNA抑制p53将抑制暴露于Ad-Cav-1或nutlin-3a或CSP-4的FL 成纤维细胞的ECM产生、PDGFR-β表达和存活力。相较于在对照 shRNA存在下用Ad-Cav-1或nutlin-3a或CSP-4转导的FL成纤维细 胞，这些细胞将显示升高的uPA和uPAR与最小PAI-1。
根据本发明，因为IPF患者经常在诊断时呈现晚期纤维化疾病， 所以靶向FL成纤维细胞具有超过预防ATII细胞凋亡或上皮间质转化 的临床优点。相较于NL-成纤维细胞或损伤肺中的ATII细胞， Nutlin-3a和CSP-4仅在FL成纤维细胞中有效地诱导p53以获得FL成纤维细胞中明显降低的基线p53和升高的mdm2表达。在ATII细 胞小窝蛋白-1和p53表达的情况下尤其如此，所述表达在具有IPF的 患者或具有BLM肺损伤的小鼠的肺中显著增加。基于此经验，进一 步诱导ATII细胞中的p53预期由于BLM或IPF肺中升高的基线水平 而不会响应于nutlin-3a或CSP-4。确实，本发明人和同事发现CSP 或CSP-4通过经由与小窝蛋白-1竞争阻断ATM激酶介导p53的丝氨 酸15磷酸化来抑制BLM或香烟烟雾诱导的ATII细胞p53表达和细 胞凋亡(Bhandary等,2012,2013,同上；Shetty SK等,Am J Respir Cell MolBiol 47:474-83,2012)，其否则由于BLM损失针对蛋白磷酸酶 2A-C在ATII细胞中诱导(Volonte D等,.J Biol Chem 284:5462-66, 2009)。此外，nutlin-3a对中性粒细胞和巨噬细胞的作用可通过p53 介导的NF-κB DNA结合活性的抑制和促炎细胞因子的产生而具有针对炎症的有益作用(Liu G等,J Immunol 182:5063-71,2009)。
因此，nutlin-3a和CSP-4干预的益处超过任何潜在有害或脱靶作 用。在小鼠中在BLM诱导的肺纤维化之后使用LV，由FL成纤维细 胞过度增殖和产生proα(I)胶原应导致FL成纤维细胞中前体-miR-34a 和miR-34a反义的有效表达(Liu X等,Am J Physiol:LungCell Mol Physiol 298:L819-29,2010；Merkel O等,Cell Cycle 9:2764-8,2010)。
用Ad-cav-1转导BLM损伤肺(Wang XM等J Exp Med 203:2895-906,2006)抑制纤维化，尽管在BLM损伤期间ATII细胞的 小窝蛋白-1表达增加。这表明，p53、前体-miR-34和miR-34a反义 的表达仍然应该是有效的，即使它们在具有已形成的肺纤维化的小鼠 中转导NL-成纤维细胞以及FL成纤维细胞。
以上所引用的参考文献全部以引用的方式并入本文，无论是否具 体地并入。
现在已经充分描述了本发明，本领域的技术人员应理解，本发明 可在广泛范围的等效参数、浓度和条件下进行，而不会偏离本发明的 精神和范围，并且无需过多的实验。
序列表
<110> 得克萨斯州大学系统董事会（Board of Regents, The University of TexasSystem）
<120> 用Nutlin-3a和肽抑制肺纤维化
<130> SHETTY-2A/PCT
<140> (待分配)
<141> 2014-03-17
<150> US 61/800,117
<151> 2013-03-15
<160> 11
<170> PatentIn 3.2版
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 1
Phe Thr Thr Phe Thr Val Thr
1 5
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽 - 人小窝蛋白-1的支架结构域
<400> 2
Asp Gly Ile Trp Lys Ala Ser Phe Thr Thr Phe Thr Val Thr Lys Tyr
1 5 10 15
Trp Phe Tyr Arg
20
<210> 3
<211> 178
<212> PRT
<213> 人小窝蛋白-1
<400> 3
Met Ser Gly Gly Lys Tyr Val Asp Ser Glu Gly His Leu Tyr Thr Val
1 5 10 15
Pro Ile Arg Glu Gln Gly Asn Ile Tyr Lys Pro Asn Asn Lys Ala Met
20 25 30
Ala Asp Glu Leu Ser Glu Lys Gln Val Tyr Asp Ala His Thr Lys Glu
35 40 45
Ile Asp Leu Val Asn Arg Asp Pro Lys His Leu Asn Asp Asp Val Val
50 55 60
Lys Ile Asp Phe Glu Asp Val Ile Ala Glu Pro Glu Gly Thr His Ser
65 70 75 80
Phe Asp Gly Ile Trp Lys Ala Ser Phe Thr Thr Phe Thr Val Thr Lys
85 90 95
Tyr Trp Phe Tyr Arg Leu Leu Ser Ala Leu Phe Gly Ile Pro Met Ala
100 105 110
Leu Ile Trp Gly Ile Tyr Phe Ala Ile Leu Ser Phe Leu His Ile Trp
115 120 125
Ala Val Val Pro Cys Ile Lys Ser Phe Leu Ile Glu Ile Gln Cys Ile
130 135 140
Ser Arg Val Tyr Ser Ile Tyr Val His Thr Val Cys Asp Pro Leu Phe
145 150 155 160
Glu Ala Val Gly Lys Ile Phe Ser Asn Val Arg Ile Asn Leu Gln Lys
165 170 175
Glu Ile
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 4
Asn Tyr His Tyr Leu Glu Ser Ser Met Thr Ala Leu Tyr Thr Leu Gly
1 5 10 15
His
<210> 5
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 5
Trp Gly Ile Asp Lys Ala Phe Phe Thr Thr Ser Thr Val Thr Tyr Lys
1 5 10 15
Trp Phe Arg Tyr
20
<210> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽- - 源自触角足同源域的第三个α螺旋的穿膜肽
<400> 6
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
<210> 7
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 7
Arg Gln Ile Lys Ile Phe Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
<210> 8
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 8
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Phe Lys Lys
1 5 10 15
<210> 9
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 9
Arg Gln Ile Lys Ile Phe Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Phe Lys Lys
1 5 10 15
<210> 10
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽 - 转运肽
<400> 10
Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu
1 5 10 15
Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu
20 25
<210> 11
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 11
Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys
1 5 10 15
Lys Lys Arg Lys Val
20

Claims (32)

1.一种增加纤维化肺(FL)成纤维细胞中的p53蛋白水平、减少尿激酶纤溶酶原活化剂(uPA)和uPA受体(uPAR)且增加纤溶酶原活化剂抑制剂-1(PAI-1)表达的肽，所述肽选自由以下组成的组：
(a)指定为CSP-4的肽，所述肽的序列是FTTFTVT(SEQ ID NO:1)；
(b)为所述CSP-4肽的最多约20个氨基酸长度的添加变体的肽，所述肽不是SEQ ID NO:3的小窝蛋白-1(Cav-1)的支架结构域；
(c)(a)的所述CSP-4肽的经共价修饰的化学衍生物，
(d)(b)的所述变体的经共价修饰的化学衍生物，
所述变体或化学衍生物在体外或体内测定中具有至少20％的所述CSP-4肽的生物或生物化学活性。
2.如权利要求1所述的肽，其是FTTFTVT(SEQ ID NO:1)。
3.一种包含至少两个单体的肽多聚体，每个单体是如权利要求1或2中任一项所述的所述CSP-4肽、所述变体或所述化学衍生物，所述多聚体：
(a)具有式P1 n，其中
(i)P1是所述肽、变体或化学衍生物，以及
(ii)n＝2-5，或
(b)具有式(P1-Xm)n-P2，其中
(i)P1和P2各自独立地是所述肽、变体或化学衍生物，
(ii)P1和P2各自是相同或不同的肽、变体或衍生物
(iii)X是C1-C5烷基、C1-C5烯基、C1-C5炔基、含有最多4个氧原子的C1-C5聚醚；
(iv)m＝0或1；以及
(v)n＝1-7，或
(c)具有式(P1-Glyz)n-P2，其中：
(i)P1和P2各自独立地是所述肽、变体或衍生物，
(ii)P1和P2各自是相同或不同的肽或变体或衍生物；
(iii)z＝0-6；以及
(iv)n＝1-25，
其中所述肽多聚体在体外或体内测定中具有至少20％的所述CSP-4肽的生物活性。
4.一种可递送肽或多肽组合物，其包含：
(a)如权利要求1至3中任一项所述的肽、多肽或多聚体，以及
(b)与其结合或与其缔合的递送或易位分子或部分。
5.如权利要求4所述的可递送肽或多肽组合物，其中所述递送或易位分子或部分选自由以下组成的组：
(i)HIV-TAT蛋白或其易位活性衍生物；
(ii)具有序列RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:6)的穿膜肽；
(iii)具有序列RQIKIFFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:7)的穿膜肽变体W48F；
(iv)具有序列RQIKIWFQNRRMKFKK，SEQ ID NO:8)的穿膜肽变体W56F；
(v)具有序列RQIKIWFQNRRMKFKK，SEQ ID NO:9)的穿膜肽变体；
(vi)具有序列GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL(SEQ ID NO:10)的转运肽；
(vii)单纯疱疹病毒蛋白VP22或来自不同疱疹病毒的其易位活性同源物如MDV蛋白UL49；以及
(viii)Pep-1，具有序列KETWWETWWTEWSQPKKKRKV(SEQ ID NO:11)。
6.一种抗纤维化药物组合物，其包含：
(a)如权利要求1或2中任一项所述的肽、变体或化学衍生物，或如权利要求3所述的肽多聚体；以及
(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
7.一种抗纤维化药物组合物，其包含：
(a)如权利要求4或5中任一项所述的可递送肽或多肽组合物；以及
(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
8.一种抗纤维化药物组合物，其包含以下的组合：
(i)如权利要求6或7所述的药物组合物，以及
(ii)抑制MDM2-p53相互作用的nutlin-3a(NTL)或NTL的手性顺式-咪唑啉类似物，所述类似物在体外或体内测定中具有至少20％的NTL的生物或生物化学活性。
9.如权利要求6至8中任一项所述的抗纤维化药物组合物，其被配制用于注射或肺滴注。
10.如权利要求8所述的抗纤维化药物组合物，其被配制用于肺滴注。
11.一种用于增加FL成纤维细胞中的p53蛋白水平、减少uPA和uPAR且增加PAI-1表达以及降低成纤维细胞增殖的方法，所述方法包括向所述FL成纤维细胞提供有效量的抑制MDM2与p53蛋白的相互作用和MDM2介导的p53的降解的化合物或组合物，其中所述化合物或组合物是：
(a)抑制MDM2-p53相互作用的NTL或NTL的手性顺式-咪唑啉类似物，所述类似物在体外或体内测定中具有至少20％的NTL的生物或生物化学活性；
(b)如权利要求1或2中任一项所述的肽或肽变体；
(c)如权利要求3所述的肽多聚体；
(d)如权利要求4或5中任一项所述的可递送肽、多肽或多聚体组合物；
(e)(a)至(d)中任一项的组合；或
(f)如权利要求6至10中任一项所述的药物组合物。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述化合物是NTL。
13.如权利要求11所述的方法，其中所述化合物是所述CSP4肽FTTFTVT(SEQ ID NO:1)。
14.如权利要求11所述的方法，其中所述化合物是所述肽多聚体。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述肽多聚体包含肽单体，所述肽单体中的每一个皆是CSP-4肽FTTFTVT(SEQ ID NO:1)。
16.如权利要求11所述的方法，其中所述NTL或NTL类似物是NTL。
17.如权利要求11-16中任一项所述的方法，其中所述提供是在体内。
18.一种用于治疗具有以肺纤维化为特征的疾病或病状的哺乳动物受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的通过抑制MDM2-介导的p53蛋白的降解来增加FL成纤维细胞中的p53蛋白水平、降低uPA水平且增加PAI-1表达的化合物或组合物。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述化合物或组合物是：
(a)抑制MDM2-p53相互作用的NTL或NTL的手性顺式-咪唑啉类似物，所述类似物在体外或体内测定中具有至少20％的NTL的生物或生物化学活性；
(b)如权利要求1或2中任一项所述的肽或肽变体；
(c)如权利要求3所述的肽多聚体；
(d)如权利要求4或5中任一项所述的可递送肽、多肽或多聚体组合物；或
(e)(a)至(d)中任一项的组合；或
(f)如权利要求6至9中任一项所述的药物组合物。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述化合物是NTL。
21.如权利要求19所述的方法，其中所述化合物是CSP-4，其序列是FTTFTVT(SEQ IDNO:1)。
22.如权利要求19所述的方法，其中所述化合物是所述肽多聚体。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述肽多聚体包含肽单体，所述肽单体中的每一个皆是所述CSP-4肽FTTFTVT(SEQ ID NO:1)。
24.如权利要求18至21中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
25.化合物或组合物用于治疗肺纤维化的用途，所述化合物抑制MDM2介导的p53蛋白的降解，并且增加FL成纤维细胞中的p53蛋白水平、降低uPA水平且增加PAI-1表达。
26.如权利要求23所述的用途，其中所述化合物是：
(a)抑制MDM2-p53相互作用的NTL或NTL的手性顺式-咪唑啉类似物，所述类似物在体外或体内测定中具有至少20％的NTL的生物或生物化学活性；
(b)如权利要求1或2中任一项所述的肽或肽变体；或
(c)如权利要求3所述的肽多聚体，或
(d)(a)至(c)中任一项的任何化合物的组合。
27.如权利要求25所述的用途，其中所述组合物是如权利要求4或5中任一项所述的可递送肽、多肽或多聚体组合物。
28.如权利要求25所述的用途，其中所述组合物是如权利要求6至10中任一项所述的药物组合物。
29.化合物或组合物用于制造用以治疗肺纤维化的药剂的用途，所述化合物抑制MDM2介导的p53蛋白的降解，并且增加FL成纤维细胞中的p53蛋白水平、降低uPA水平且增加PAI-1表达。
30.如权利要求29所述的用途，其中所述化合物是：
(a)抑制MDM2-p53相互作用的NTL或NTL的手性顺式-咪唑啉类似物，所述类似物在体外或体内测定中具有至少20％的NTL的生物或生物化学活性；
(b)如权利要求1或2中任一项所述的肽或肽变体；或
(c)如权利要求3所述的肽多聚体，或
(d)(a)至(c)的任何化合物的组合。
31.如权利要求29所述的用途，其中所述组合物是如权利要求4或5中任一项所述的可递送肽、多肽或多聚体组合物。
32.如权利要求29所述的用途，其中所述组合物是如权利要求6至10中任一项所述的药物组合物。
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