ES2377785B2 - Composición farmacéutica para el tratamiento del ojo seco. - Google Patents

Composición farmacéutica para el tratamiento del ojo seco. Download PDF

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Abstract

Composición farmacéutica para el tratamiento del ojo seco.#La invención se relaciona con composiciones terapéuticas para el tratamiento del ojo seco y, más concretamente, con composiciones que comprenden un ligando agonista del receptor TRPM8.

Description

Composiciónfarmacéuticaparael tratamientodelojo seco.
Campo técnico de la invención
La invención se relaciona con composiciones terapéuticas para el tratamiento del ojo secoy, más concretamente, con composiciones que comprenden un ligando agonista del receptor TRPM8.
Antecedentes de la invención
El gradode humedaddela superficie ocularyde las mucosasexternas se mantiene estable graciasala producción continua de fluido acuoso por glándulas exocrinas. La interrupción de este proceso determina el desarrollo síndromes de sequedad ocular,bucaly vaginal,que son altamenteprevalentes, especialmente en ancianos (Moss,S.E., et al. 2008. Optom.Vis. Sci. 85:668-674; Barker, K. E.&Savage, N.W. 2005. Aust. Dent. J. 50:220-223; Leiblum, S. R., et al. 2009.J.Sex Med 6:2425-2433).Enel ojo,el flujo lagrimal producido en ausenciadefactores emocionalesode estímulosirritantesexógenos (secreción lagrimal “basal”)estáajustadoalas condiciones ambientalesyala frecuencia de parpadeo (Dartt, D. A. 2009. Prog. Retin. Eye Res. 28:155-177). La lagrimación también aumenta de manera significativa tras la irritación de la superficie ocular (Acosta, M. C. et al. 2004.Invest Ophthalmol.Vis. Sci. 45:23332336). Los estímulos irritantes son detectados por las terminaciones nerviosas mecano-nociceptorasy polimodales del trigémino, que son sensibles a fuerzas de intensidad lesiva, al calor nocivo y a irritantes químicos, evocando dolor (Belmonte, C., et al. 2004. Exp. Eye Res. 78:513-525)ylagrimación refleja. Sin embargo, no se conocen las estructuras neurales responsablesdela deteccióndelgradode sequedad ocular implicadasenlaregulacióndelatasa de lagrimación basal.
Respectoal síndromede sequedadocularoxeroftalmía,éstaes una enfermedaddelosojos caracterizadaporla sequedad persistentedelaconjuntivayopacidaddela córnea.
Existen múltiples causasque pueden producirlaxeroftalmía, siendomás frecuenteen personas con edad. Entrelas enfermedadesque producenxeroftalmía encontramos: deficienciade vitaminaA, síndromede Sjögren, artritis reumatoideyotras enfermedades reumatológicas, quemaduras químicaso térmicasyfármacos comoatenolol, clorfeniramina, hidroclorotiazida, isotretinoína,ketorolaco,ketotifeno,levocabastina,levofloxacina, oxibutinina, tolterodina.
Los tratamientos utilizadospara tratarlaxeroftalmía incluyen corticoidesquepuedenser eficacesenfases iniciales dela enfermedad, suplementosde vitaminaAyla pilocarpinaqueesun fármacoque aumentala producción lacrimal. Entre los preparados que mejoran la sequedad (lágrimas artificiales) se utilizan las soluciones de hipromelosaylos geles de carbómero que se aplican sobre la conjuntiva. Sin embargo, estos tratamientos tienen claras limitaciones respectoasu eficaciaytoxicidad.Porlotantoexistela necesidadde proporcionar nuevos tratamientosmejoradospara el tratamientodelaxeroftalmíala sequedadvaginalyel síndromede boca seca.
Sumario de la invención
En un primer aspecto la invención se relaciona con el uso de un agonista de TRPM8 o de combinaciones de los mismos para la elaboración de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una enfermedad seleccionada dexeroftalmía, sequedadvaginalysíndromede boca ardiente.
En un segundo aspecto, la invención se relaciona con una composición que comprende al menos un agonista de TRPM8yal menosunfármacoútilparael tratamientodeunaomásdelas enfermedadesseleccionadasdexeroftalmía, sequedadvaginalysíndromede boca ardiente,y,si se desea, unvehículofarmacéuticamente aceptable.
Descripción de las figuras de la invención
Figura 1. Característicasdelarespuestadelas terminaciones nerviosas sensiblesal fríodela córneadelratón.
a. Actividadde impulsos nerviosos (NTI) en respuestaa pulsosde enfriamientoy calentamiento,yal mentol.Los trazados, de arriba abajo, representan: Frecuencia media de disparo (Mean freq., en Hz), frecuencia instantánea (Inst. Freq., en Hz), registro directo de la actividad eléctrica (Imp. ampl., en µV), temperatura de la solución de perfusión (Temp.,enºC).b. Frecuenciapromediodedisparo(Meanfreq.,en impulsos/s)de55 terminaciones corneales sensibles al frío en respuesta a una rampa de enfriamiento. Los datos son la media ± el error estándar, c. Distribución de los umbrales de frío (representado como el cambio desde la temperatura basal, -ΔT, en ºC) de 55 terminales termosensibles. d. Cambio de la frecuencia de disparo con la temperatura, determinado en las mismas 55 terminales sensibles al frío.Para cada terminalseharepresentadoel cambiode frecuencia (Meanfreq.,en impulses/s) entrela temperatura umbralyaquellaalaquese alcanzala frecuenciapico.Lalíneagruesa representaelvalormediodelas55pendientes individuales, e.Actividad eléctrica de una terminación nerviosa sensible al frío en respuesta al enfriamiento escalonado. Los trazados muestras la frecuencia media de disparo (Mean freq., Hz), la frecuencia instantánea (Inst. Freq., Hz), el número de impulsos por ráfaga de potenciales de acción (Impulses/Bursa)y la temperatura de la solución de perfusión (Temp., ºC). f. Frecuencia media de disparo (Mean frequency, en impulsos/s) de 10 terminales termo-sensibles durante el enfriamiento escalonado. Se observó un aumento significativo de la frecuencia media de disparo tanto durantelafasedinámica(30s inicialesdecada escalóndetemperatura) como durantelafase estática (últimos 30 s del escalón) del estímulo, siendo en ambos casos proporcional a la disminución de la temperatura (Respuesta dinámica: Coeficiente de correlación de Pearson = -0.98, p=0.002; Respuesta estática: Coeficiente de correlación de Pearson = -0.96, p=0.014).
Figura 2. Inmunohistoquímica de las fibras nerviosas corneales del ratón TRPM8-EYFP.a,b,y c son ejemplos de filetes nerviosos entrando en la córnea periférica para formar el plexo estromal. En a, todas las fibras nerviosas sensoriales del filete nervioso se han teñido con un anticuerpo contra la beta-tubulina clase III específica de neuronas (Tuj-1), mientras que enbsólo se han teñido aquellas fibras del filete nervioso que reaccionaron frente al anticuerpo contrala proteínaverde fluorescente (GFP).c muestra una doble tinciónde inmunofluorescenciade los nervios estro-males, conanticuerpos contraTuj-1 (panel superior)ycontraGFP (panelintermedio),así comola imagen superpuesta (panel inferior), mostrando la reducida proporción de fibras sensibles al frío de entre la población general de fibras sensoriales corneales,d,eyfmuestranla arquitectura característicade las fibras nerviosas que discurren bajola capa basal del epitelio corneal (plexo subbasal), donde aparecen como fibras arrosariadas rectasymáso menos paralelas (fibras en pincel) que trascurren desde la cornea periférica hacia el centro durante largas distancias. En d, aparecen teñidastodaslas fibrasdelplexo subbasal(positivasparaTuj-1), mientrasqueene,sólosehan teñidolaspositivas para GFP.Enf semuestra una doble tinción contraTuj-1(gris)yGFP (blanco) para ilustrarla escasez de axones presumiblemente positivos para TRPM8.gyh muestrana mayor aumentolas áreas enmarcadas endye, respectivamente, mostrando en más detalle la morfología de las fibras arrosariadas subbasales, así como sus ramificaciones que ascienden perpendicularmente desde las capasbasales del epitelio corneal hacia las mássuperficiales, presentando ocasionalmente terminaciones nerviosas en la capa subbasal.Para mostrar el aspecto de las terminaciones nerviosas intraepiteliales, eni(todas las terminaciones nerviosas epiteliales,Tuj-1positivas)yj(supuestas terminales nerviosas sensiblesal frío, positivas para GFP) se muestran las mismas zonasdegyh, pero enfocando en un plano más superficial.La diferente morfologíayel bajo gradode ramificaciónde las terminales presumiblementepositivas para TRPM8 se muestran también enk, utilizando microscopíaverticalde fluorescencia.En1 se muestra un barridode focos compilados en una sola imagen para ilustrar la trayectoria de los axones en su recorrido desde el estroma hasta la superficie corneal, donde finalmente originan racimos de terminaciones relativamente agrupadas (cuadrado enmarcado, que corresponde a la zona mostrada en k). En la zona superior derecha de la figura se muestra un dibujo para mostrar esquemáticamente la localización de los nervios sensoriales en las distintas zonas de la córnea,y su correspondencia con los diferentespaneles que conforman la figura.A-Ccorresponde al tercio anterior del estroma, donde se ubican lostroncos nerviosos estromales,D-H representan las fibras del plexo subbasal,eI-K, las terminaciones nerviosas entre las capas más superficiales del epitelio corneal. Las escalas representan 70 µm (a-c), 150 µm (d, e) o 40 µm (f-1).
Figura 3. Respuesta a rampas de frío de las terminaciones nerviosas termosensibles corneales registradas en ratones TRPM8(-/-), TRPM8(+/-)y TRPA1(-/-),y enratones silvestres. a. Frecuencia mediade disparo (en impulsos/s, panel superior) durante una rampa de enfriamiento (panel inferior) registrada en 143 terminaciones nerviosas de ratones TRPM8(-/-) (línea delgada), 11 terminales de TRPM8(+/-)(línea discontinua)y12 terminales de ratones silvestres de las mismas carnadas (línea continua), prefundidos con solución control (izquierda)y en presencia de mentol 50 µM(derecha),b. Frecuencia media de disparo de 11 terminaciones termosensibles registradas en córneas de ratonesTRPA1(-/-) (líneadelgada)y en13 terminacionesde córneasde ratonessilvestresdelas mismas carnadas (línea gruesa), durante una rampa de enfriamiento (panel inferior). Los datos son media ± error estándar.
Figura 4. Variación de la tasade secreción lagrimal con la temperatura corneal. a.Tasa basal de lagrimación, expresada comola longitud mediade hilode rojo fenol humedecido durante2minutos, medido en los ojosde ratones anestesiados expuestos a una temperatura ambiente de 24.8±0.9ºCy 42.5±0.4ºC, con una humedad ambiental del 63.7±0.4%ydel 38.2±1.4%, respectivamente, que modificaron la temperatura corneal hasta los valores indicados en la figura. Las columnas llenasylas sombreadas representan, respectivamente, la tasa de lagrimación en los animales expuestos a una temperatura ambiente neutra (24.8ºC) o caliente (42.5ºC). El número de medidas de las sucesivas columnas es 35, 11, 23,9y6observaciones. **p<0.01, ***p<0.001, test de Mann-Whitney).b. Aumento de la tasa de lagrimación medido en animales silvestres (columnas negras)y TRPM8-/-(columnas grises), en respuesta ala aplicación durante30sdeun papelde filtro empapadoen capsaicina1 µM(n=12y15)óalil-isotiocianato 500µM (AITC;n=10y6).Laprimera columnamuestrala respuestaalaaplicacióndelvehículo(DMSOal0.5%ensalino)en animalessilvestres(n=6).Las medidasdela secreciónlagrimalse realizaron1minutosdespuésde retirarelpapelcon la droga. Se encontraron diferencias estadísticamente significativas con respecto a los valores basales de lagrimación, empleandoel testdeWilcoxon(*p<0.05, ***p<0.001). c.Tasa mediade lagrimación,expresada comola longitud de hilo de rojo fenol humedecido durante 15 s, medida en los ojos de voluntarios de ambos sexos a temperaturas ambientes de 18ºC, 25ºCy43ºC, que produjeron una temperatura corneal de 32.4±0.4ºC, 34.2±0.1ºCy36.0±0.2ºC, respectivamente (**p<0.01, ANOVApara medidas repetidas).
Descripción detalladadelainvención
Los inventores de la presente invención han descubierto que, de forma sorprendente, el receptor TRPM8 está implicado en el control de la lagrimacióny que su activación usando agonistas del mismo resulta en un aumento de la lagrimación. En concreto, los inventores de la presente invención han descrito que temorreceptores de frío que inervan la cornea en los mamíferos mantienen una actividad tónica de disparo a la temperatura corneal normal, y son exquisitamente sensibles a pequeñas variaciones térmicas de la superficie ocular, como las resultantes de la evaporación de la película lagrimal precorneal que se da en los intervalos entre parpadeos o durante la exposición a ambientes secos. Esta marcada sensibilidadalfrío es consecuenciadela elevadaexpresiónde canales TRPM8,que de manera crucial determinan una actividad espontánea basalyel aumento de la frecuencia de disparo en respuesta al enfriamiento. Así mismo, los inventores han observado que la eliminación con técnicas genéticas de los canales TRPM8 reduce a la mitad la secreción lagrimal en ratones. Su silenciamiento parcial por calentamiento de la cornea también reduce la secreción lagrimal en humanos.
Por tanto, TRPM8 es un candidato molecular para la detección de la humedad en las fibras nerviosas termorreceptoras de frío que inervan la superficie ocular expuesta en animales terrestres. Los datos mostrados en esta solicitud (véaseejemplo1) indicanqueenlas terminales corneales termosensibles,elTRPM8es críticoparael desarrollotanto de la actividad espontánea como de la evocada por el frío que resulta en la producción de lágrimas. De esta forma, la estimulaciónde TRPM8 aumentala estimulacióndela secreción lagrimalpor partedelas fibras sensiblesal fríopor medio de la activación de TRPM8.
Portanto,lapresenteinvenciónse relacionaconeltratamientodelaxerolftalmía,lasequedadvaginalyel síndrome de boca ardiente mediante el empleo de distintos agentes terapéuticos. Así mismo,los resultados obtenidos por los autores de la presente invención abren la puerta para el tratamiento de la lagrimación excesiva (epifora) mediante el empleo de distintos agentes que inhiben el receptor TRPM8.
Usos terapéuticos de los agonistas de TRPM8
Así, la presente invención se relaciona con el uso de un agonista de TRPM8 o de combinaciones de los mismos para producirun medicamentoparael tratamientoolaprevencióndelaxerolftalmía, sequedadvaginalysíndromede boca ardiente.
El receptor TRPM8o“Transient receptor potentialcation channel subfamilyM member8”, también conocido comoel receptorde fríoy mentol1 (cold and menthol receptor1 o CMR1), es una proteína que en humanos está codificada por el gen TRPM8. (Clapham DE, et al. 2005. Pharmacological Reviews 57 (4): 427-50).
TRPM8 es un canal iónico que tras ser activado permite la entrada de iones de sodio (Na+)ycalcio (Ca2+)a la célula de manera que se genere una depolarización de la misma que lleva a la generación de un cambio en el potencial de membrana.
La proteínaTRPM8seexpresaen neuronas sensorialesyesactivadapor temperaturasfrías(pordebajodeaproximadamente 26ºC), por agentes químicos comoel mentolyporvoltaje. TRPM8 también seexpresa enla próstata,los pulmones, la vejiga sin que su función en estos órganos sea conocida.
Elgen humanode TRPM8está localizadoenel cromosoma2 enlaregión 2p37.1;ycodificapor una proteínade 1104 aminoácidos (NP_076985.4, SEQ ID NO: 1) codificada por la secuencia de nucleótidos NM_024080.4 (SEQ ISNO:2).Elgen TRPM8 presentaseissegmentos trans-membrana estandolos términosCyNterminalenellado citoplasmático. Cuatro subunidades tetramerizan para formar canales activos.
El término “TRPM8”talycomoseusaenesa descripciónnose refiere únicamentealgenyala proteína humanos sino también a los ortólogos de otras especies, como por ejemplo, perro (XP_543296.2), ratón (NP_599013.1), rata (NP_599198.2), etc.
El término “tratar” o “tratamiento” designa tanto tratamiento terapéutico como profiláctico o medidas preventivas, en el que el objeto es prevenir o frenar (reducir) un cambio fisiológico indeseado o trastorno, tal como la sequedad en los ojos,lavaginao enla boca.Parael finde estainvención, resultados clínicos beneficiososo deseados incluyen,sin limitación, alivio de síntomas, reducción de la extensión de la enfermedad, estado patológico estabilizado (concretamenteno empeorado), retardoo frenodela progresióndela enfermedad, mejorao paliacióndel estado patológicoy remisión (tanto parcial como total), tanto detectable como no detectable. Aquellos sujetos que necesitan de tratamiento incluyen aquellos sujetos que sufren ya la afección o trastorno, así como aquellos con tendencia a sufrir la afección o trastorno o aquellos en los que ha de prevenirse la afección o trastorno.
Como “métodode tratamiento”seentiendela administraciónaunindividuoen necesidaddedicho tratamiento,de una composiciónfarmacéutica que comprende un agonistade TRPM8 segúnlainvención.
Por “xeroftalmía o síndrome de ojos secos” se entiende en la presente invención a la enfermedad caracterizada porla sequedad persistentedela conjuntivayopacidaddela córnea. Existen múltiples causas que pueden producirla xeroftalmía, siendo más frecuente en personas conedad. Entre las causasyenfermedades que producenxeroftalmíaencontramos: deficienciade vitaminaA, síndromede Sjögren, artritis reumatoideyotras enfermedades reumatológicas, quemadurasquímicaso térmicas, fármacos como atenolol, clorfeniramina, hidroclorotiazida, isotretinoína,ketorolaco, ketotifeno, levocabastina, levofloxacina, oxibutinina, tolterodina.
Así, en una realización particular, la xeroftalmía está asociada a deficiencia de vitamina A, al síndrome de Sjögren,ala artritis reumatoideyotras enfermedades reumatológicas, aquemaduras químicaso térmicasoa fármacos como atenolol, clorfeniramina, hidroclorotiazida, isotretinoína,ketorolaco,ketotifeno, levocabastina, levofloxacina, oxibutinina, tolterodina.
Por “sequedad vaginal” se entiende a la disminución en la cantidad de fluidos producidos en la vagina. Esta sequedad puede provocar malestar, como picores, irritaciónysensación de quemazón en la zona genital, además de dolor enlas relacionessexuales.Estafaltade lubricaciónpuede estarmotivadapor causasorgánicasopor causas psíquicas. Entre las causas orgánicas, la más habitual es la insuficiente cantidad de estrógenos por ejemplo durante la menopausia. Otras causasqueprovocan sequedadvaginal sonlavaginitis,queesla inflamacióndelos tejidosvaginalesola diabetes. En el caso de las mujeres con diabetes en las que la lubricación vaginal puede estar disminuida, particularmenteen aquellas conun control deficientedela glucosa sanguínea, esta pérdidade lubricaciónpuede asociarseados complicaciones:la neuropatía, que puede disminuirla respuestaal estímulo sexual,yel dañoa losvasos sanguíneos, que limita el flujo sanguíneo en la pared vaginal disminuyendo la cantidad de flujo lubricante.
Otrofactora consideraresel estrés,queprovocaun aumentoenla liberaciónde cortisolenla sangre,queasuvez produceun desequilibrioenlas demás hormonas.Tambiénel tabaco interfiereenlas funciones estrogénicasypor tanto puede disminuirla lubricaciónvaginal.Un efecto similar puede producirse por acción del alcoholydela marihuana. Ciertos medicamentos hormonales, como las pastillas anticonceptivas o los fármacos utilizados para el tratamiento del cáncer de mama, de ovario o de útero, pueden producir sequedad vaginal. Los antidepresivos tricíclicos, algunos antiulcerosos o ciertos antihipertensivos pueden tener como efecto secundario la disminución de la secreción vaginal. Otros medicamentos que también pueden ser causantes de este problema son los antihistamínicos.
Así, en una realización particular, la sequedad vaginal está asociada a insuficiente cantidad de estrógenos, a diabetes, al estrés o al consumo de alcohol, marihuana o fármacos como fármacos utilizados para el tratamiento del cáncerde mama,deovarioode útero,pueden producir sequedadvaginal.Los antidepresivos tricíclicos, antiulcerosos, antihipertensivos o antihistamínicos.
Por “síndrome de boca ardiente” en la presente invención se entiende la enfermedad denominada estomatodinia. Esta enfermedades debidaa múltiples causas.El consumo inadecuadosde ciertasverduraso carneque aportan hierro, ácidofólicoovitaminaB12,pueden contribuiraanemias carencialesquecontribuyanaeste síndromedebocaardiente. Así mismo, algunas enfermedades endocrinas, como el hipotiroidismo o la diabetes, o digestivas, como el reflujo gastroesofágico, también contribuyen.
Otro aspecto que influye en la aparición de esta enfermedad es el consumo crónico de ciertos fármacos tales como betabloqueantes, antihipertensivosyantidiabéticos.
En una realización particular preferida, la enfermedad es la xeroftalmía.
En la presente invención se entiende por “agonista del receptor TRPM8” a cualquier molécula que se une específicamenteal receptor TRPM8yqueal unirse es capazde causar un aumentodela actividad del canal TRPM8, es decir que aumenteel flujode sodioycalcioa través del canal causando una despolarizacióndela célula. Estos agonistas aumentan la estimulación de la secreción lagrimal por parte de las fibras sensibles al frío. Existe una amplia variedad de ensayos disponibles para detectarla actividadde agonistas del receptor TRPM8, tales como losexperimentosde electrofisiológicos dePatch-clamp de célula entera citados en los ejemplos de la presente invención (véase Ejemplo 1), los métodos de microscopia de calcio (Bodding et al., 2007, Cell Calcium, 42, 618-628)ylos métodos basados en la detección de fluorescencia en placa “fluorometric imaging plate reader assay” (Behrendt et al., 2004. J. Pharmacol. 141, 737-745), entre otros.
Ejemplosdeagonistasdel receptorTRPM8 adecuadosparasuusoenla presenteinvenciónincluyen,sin limitación, las moléculas descritas enlaTabla1.
TABLA1
Agonistas de TRPM8
TABLA2
Resumen de agonistas de TRPM8
En una realización particular, el agonista usado en el primer uso de la invención es un agonista seleccionado de WS-5(Etil 3-(p-mentane-3-carboxamido), CPS369, CPS368, CPS125, Frescolat MGA-2Isómero, Coolant Agent 10, (-)-Isopulegol (CoolactP®), (+)-cis&(-)-transp-Mentane-3,8-diol Ratio ∼ 62:38 (Coolact 38D®), (-)-Cubebol, “Hasegawa’s Cooling Compound”, “IFF’s New GRAS Cooling Material”, Icilina,5-metil-4-(1-pirrolidinil)-3-[2H]furanona, 4,5-dimetil-3-(1-pirrolidinil)-2-[5H]-furanona,4-methyl-3-(1-pirrolidinil)-2-[5H]-furanona,N-etil-p-mentane-3-carboxamida, WS-11 (ácido 2-isopropil-5-metil-ciclohexanecarboxílico (2-hidroxi-1,1-dimetil-etil)-Amida), WS-12 (ácido 2-isopropil-5-metil-ciclohexanecarboxílico (4-methoxiphenil)-amida), WS-14 (ácido 2-isopropil-5-metil-ciclohexanecarboxílico tert-butilamida), WS-23 (2-isopropil-N-2,3-trimetilbutiramida), WS-30 (ácido 2-isopropil-5-methil-ciclohexanecarboxílico ester 2,3-dihidroxi-propilo), WS-148 (1-(di-sec-butil-fosfinoil)-heptano),Mentol, Geraniol, Linallol, Eucaliptol, Hidroxil-citronellal, PMD-38 (p-mentane-3,8-diol), Anticuerpos agonistas específicos para TRPM8y variantes constitutivamente activasde TRPM8,o combinacionesdelos mismos.
En una realización preferida, el agonista usado en el primer uso de la invención es un agonista distinto al mentol
oa un derivado del mismo. Así, en una realización preferida el agonista de TRPM8 se selecciona de icilina,AG3-5, WS-23, WS-148, hidroxil-citronellal, 5-metil-4-(1-pirrolidinil)-3[2H]-furanona; 4,5-metil-3-(1-pirrolidinil)-2-[5H]furanonay4-methyl-3-(1-pirrolidinil)-2-[5H]-furanona.
En una realización más preferida,el agonista usado enelprimer usodelainvención es un agonista específico para TRPM8 seleccionadodelos compuestos1 a4dela tablaI(WS-5, CPS369, CPS368, CPS125), compuesto19(WS12, BeckaB. 2007, Cell Calcium 41(3):285-294)yanticuerpos agonistasde TRPM8.
En otra realización preferida,el agonistase seleccionade aquellosque poseenunEC50 menorde7(véase tabla II)tales comoelCoolingAgent10,FrescolatMGA, FrescolatML, CPS-369, CPS-113,WS-23,WS-11,WS-30,WS148, WS-3, WS-12 e Icilina.
Por “agonistaespecífico” se entiende enla presenteinvención aquellos agonistas que activan TRPM8 sin activara otros canalesdelamismafamiliaoqueactivenaTRPM8conuna eficaciadeal menos50,100,1000,2000vecesmás respectoa otro canaldelamismafamilia.
Los métodos que pueden ser usados para medir la especificidad de un agonista de TRPM8 son similares a los descritos anteriormente para medir la actividad agonista de un compuesto, tales como métodos electrofisiológicos, métodos de microscopia de calcio, etc.
Anticuerpos agonista del receptor TRPM8
Un agonista de TRPM8 para su uso en la presente invención puede ser un anticuerpo agonista de TRPM8, o un fragmentodel mismo capazde unirse específicamenteal receptor TRPM8y,más particularmente,al dominioextracelulardedichoreceptor,e inducirlaactivacióndelmismo.El anticuerpoagonistapuedeunirsedeformaespecíficay activarel receptor TRPM8humanooa un ortólogo del receptor TRPM8 homólogo.
Así, en una realización particular, el agonista del receptor TRPM8 es un anticuerpo agonista anti-receptor TRPM8 el cuál, puede serde cualquier claseo subclasede inmunoglobulinas, tales comoIgG,IgM,IgA,IgD eIgE.Enuna realización particular, al menos uno de dichos anticuerpos agonistas anti-receptor TRPM8 es una inmunoglobulina del tipo IgG-2A.
Enlapresenteinvención,el término “anticuerpo”hade ser interpretadode forma ampliae incluye anticuerpos policlonales, monoclonales, multiespecíficosyfragmentosde los mismos(F(ab’)2.Fab), siempre que sean capaces de reconocer al antígeno de interés, es capaz de unirse específicamente al receptor TRPM8 o al dominio extracelular de dicho receptor. Ejemplosde anticuerpos que pueden emplearse enel contextodea presenteinvención son,por ejemploysinlimitación, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos recombinantes, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos totalmente humanos, etc.
En la presente invención, se entiende por “anticuerpo agonista del receptor TRPM8” todo aquel anticuerpo que es que es capaz de unirse específicamente al receptor TRPM8, o al dominio extracelular de dicho receptor, e inducir la activación del canalde manera que se genere un aumento del flujode sodioycalcioa través delcanal. Métodos para adecuados parala detecciónde un anticuerpo agonista se basan enla capacidadde activarTRPM8 taly comose describe en detalle anteriormente en el contexto de los usos terapéuticos de los agonistas de acuerdo a la invención.
Los anticuerpos policlonales son originalmente mezclas heterogéneas de moléculas de anticuerpos producidas en el suero de animales que han sido inmunizados con un antígeno. Incluyen también anticuerpos policlonales monoespecíficos obtenidos a partir de las mezclas heterogéneas, por ejemplo, mediante cromatografía en una columna con péptidosde un único epítopodel antígenode interés.
Un anticuerpo monoclonal es una población homogénea de anticuerpos específicos para un único epítopo del antígeno. Estos anticuerpos monoclonales pueden prepararse mediante técnicas convencionales ya descritas, por ejemplo en Köhler andMilstein [Nature, 1975; 256:495-397]o Harlow and Lane [“Using Antibodies.ALaboratory Manual” de E. HarlowyD. Lane, Editor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NewYork; 1998 (ISBN 978-0879695439)].
Un anticuerpo quimérico es un anticuerpo monoclonal construido mediante clonación o recombinación de anticuerpos procedentes de distintas especies animales. En una configuración típica pero no limitativa de la invención, el anticuerpo quimérico incluye una parte de un anticuerpo monoclonal, generalmente la región variable (Fv) que incluye los sitios para reconocimientoyuniónal antígeno,yla otra parte correspondiente a un anticuerpo humano, generalmentela parte que incluyela región constanteyla constante adyacente.
Un anticuerpo totalmente humano es un anticuerpooanticuerpos que han sido producidos en animales transgénicos con sistema inmune humanoo por inmunización in vitro de células inmunes humanas (incluyendo tanto inmunización genética como tradicional cono sin adyuvantesy antígeno puroo no;o mediante cualquier métododeexposición del antígeno al sistema inmune) o mediante bibliotecas nativas/sintéticas producidas desde células inmunes humanas. Estos anticuerpos pueden obtenerseyseleccionarse desde animales transgénicos (por ejemplo ratones) en los quese han clonado genesdelas inmunoglobulinas humanasyque son inmunizados conel antígeno objetivo(enla presente invención con el receptor TRPM8). Estos anticuerpos pueden obtenerse por selección de regiones variables de cadena simple (scFv)ode uniónalantígeno(Fab) humanas presentadas en bibliotecasdefagos (phage display)yposterior clonacióne injertoenun anticuerpo humanoo mediante cualquierotro métodode producciónypresentación (display) conocido porelexperto enla materia,de laslibrerías generadas por clonaciónde las regionesvariablesde ambas cadenasyposterior combinación/mutaciónde éstas para generar libreríasde anticuerpos.
Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo monoclonal construido mediante clonación e injerto de las regiones hipervariables determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo monoclonal murino en un anticuerpo humano en sustitución de sus propias regiones hipervariables CDR.
Así,en una realización particulardela composicióndelainvención,al menos,un anticuerpo agonista anti-receptor TRPM8 es un anticuerpo humanizado.
Ejemplosde anticuerpos agonistas específicos parael receptor TRPM8 se han descrito en MahieuF et al. (2007.J Biol Chem 282(5):3325-36.)y en ObataK et al. (2005.JClinInvest. 115(9):2393-2401).
Por otro lado, en el contexto de la presente invención, dentro del término “anticuerpo” también se incluyen variantes con un patrón de glucosilación alterado, taly como se ha descrito enWO2006088447 así como fragmentos de anticuerpos, obtenidos a partir de la proteína o mediante tecnología recombinante, glicosilados o no glicosilados, que pueden consistir(i)en zonasvariablesdelos anticuerpos unidas entresíporun péptidode unión(scFv),(ii)enla zonavariablejuntoala constanteCH1dela cadenapesada(Fd)unidaalacadenaligeramediantecisteínasomediante péptidosde uniónypuente disulfuro (scFab), (iii) nuevasvariantes, como cadenas pesadas solas,o(iv) cualquier modificación que se haga de los fragmentos de anticuerpo con el fin de hacerlos más afines, menos inmunogénicos (humanizados)omás estables en fluidos biológicosyquetengan capacidadde producirla activacióndel receptor TRPM8.
Los anticuerpos agonistas del receptor TRPM8descritos en la presente invención pueden obtenerse por medio de técnicas convencionalesde ingeniería genéticao recombinante,deproducciónde anticuerpos,deextracciónypurificacióna partirde fluidoso tejidos biológicos,opor cualquier otra técnica convencional parala obtenciónde proteínas yanticuerpos las cuales, son ampliamente conocidas por el experto en la materia. Cuando los agonistas del receptor TRPM8 son anticuerpos, para su producción pueden utilizarse, sin que esto suponga limitación alguna, entre otras: técnicasde inmunizaciónen animales, incluidosanimales transgénicosparagenesdeinmunoglobulinas humanas,producciónde monoclonalesmediante hibridomas, producción mediante libreríasde anticuerpos,que pueden ser nativas, sintéticasoderivadasdeorganismos inmunizadosfrenteal antígenode interésyque podrían ser seleccionadas mediantemuy diferentes métodosde presentacióno “display” (phage display, ribosome display, etc.)yposteriormente, mediante técnicasdeingeniería genética podrían ser rediseñadasy expresadasenvectores diseñados parala producción de anticuerpos recombinantes de diferentes tamaños, composiciónyestructura. Una revisión delos principales métodosparala producciónypurificacióndelos anticuerpospuede encontrarse,porejemplo,en:
“Handbook of Therapeutic Antibodies”, de S. Dübel. Editor: Wiley-VCH, 2007, Vol: I a III (ISBN 978-3527314539);
“Antibodies: Volume 1: Production and Purification” de G. Subramanian Ed., Editor: Springer, 1st Ed, 2004 (ISBN 978-0306482458);
“Antibodies:Volume 2: NovelTechnologies and Therapeutic Use”, de G. Subramanian Ed., Editor: Springer, primera edición, 2004 (ISBN978-0306483158);
“Molecular Cloning:a Laboratory manual”,deJ. SambrookyD.W. Russel Eds., Publisher: Cold Spring Harbor Laboratory Press, tercera edición, 2001 (ISBN 978-0879695774).
Más específicamente, para la producción y obtención de anticuerpos que se unen específicamente al receptor TRPM8 pueden utilizarse cualquiera de los métodos descritos enWO98/16249,WO2004/010947, US2004/0109847 yUS2005/0013811, cuyo contenido se incluye en su integridad como referencia.
Variantes constitutivamente activas de TRPM8
Dentro de los agonistas de TRPM8 en la presente invención también se incluyen aquellas variantes constitutivamente activas del receptor TRPM8 o una variante funcionalmente equivalente del mismo.
Por “variantes constitutivamente activas del receptor TRPM8” se entienden aquellas secuencias pepíticas derivadas de la secuencia de TRPM8 que al ser expresada en una célula provocan que los canales mixtos TRPM8 formados porsubunidadesde TRPM8 nativoyde dichavariante constitutivamente activas resultenen canalesque están continuamente activados.La definiciónde“variantefuncionalmenteequivalentede unavariante constitutivamente activas del receptor TRPM8” se entiende en la presente invención a cualquier polipéptido cuya secuencia se pueda obtener medianteinserción, sustitucióno eliminaciónde unoomás aminoácidosdelas secuenciasdela secuenciadevariantes constitutivamente activas del receptor TRPM8yque conserve al menos parcialmente la capacidad de formar canales activados constitutivamente.Para determinar si un canal es constitutivamente activo se pueden utilizar técnicas de electrofisiología comolas mencionadas anteriormente. Preferiblemente,lasvariantesdelligandonaturalde4-1BB tienen una identidad de secuencia con dicho ligando de al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%,al menos98%oal menos99%.La determinacióndelgradode identidad entrelasvariantesy elligando natural sellevaacabo usando métodosyalgoritmos informáticosampliamente conocidosparaelexpertoenla materia.Preferentemente, la identidad entre dos secuencias de amino ácidos se determina usando el algoritmo BLASTP (BLAST Manual, Altschul, S., et al, NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990).
Elexperto enla materia entiende que, mutaciones enla secuenciade nucleótidosdelavariante funcionalmente equivalente de una variante constitutivamente activas delreceptor TRPM8 que dan lugar a sustituciones conservativas de aminoácidos en posiciones no críticas para la funcionalidad de la proteína, son mutaciones evolutivamente neutras que no afectan a su estructura global ni a su funcionalidad.
Primera composición de la invención
Como entiende el experto en la materia, los agonistas de TRMP-8pueden ser usados en combinación con otros fármacos útilesparael tratamientodelaxeroftalmía,la sequedadvaginalyel síndromedeboca ardiente.Así,enotro aspecto, la invención se relaciona con una composición que comprende al menos un agonista de TRPM8yal menos un fármaco útilparael tratamientode unao másde las enfermedades seleccionadasdexeroftalmía, sequedadvaginal ysíndromede boca ardiente,y,si se desea, unvehículofarmacéuticamente aceptable.
Los agonistas de TRPM8 adecuados para su uso en las composiciones de la presente invención así como los vehículosfarmacéuticamente aceptables han sido descritos con anterioridad.
Medicamentosútiles parael tratamientodelaxeroftalmía son, entre otros corticoides, vitaminaA, pilocarpina, soluciones de hipromelosa, los geles de carbómero, la ciclosporina, las gotas lubricantes conteniendo glicerina, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroximetilcelulosa, Carboxilmetilcelulosa, polietilenglicol, polivinilalcohol, ácido hialurónico, aceitede castoryaceitemineral.
Medicamentos útiles para el tratamiento de la sequedad vaginal son, entre otros, los lubricantes de base hídrica, vitamina E, estrógenos, isoflavonas agliconas, ácido hialurónico, moduladores selectivos del receptor de estrógenos como el raloxifeno, etc.
Medicamentos útiles para el tratamiento del síndrome de boca ardiente son, entre otros, capsaicina, nystatin (Mycostatin)o fluconazole (Diflucan), anticonvulsivos comogabapentin (Neurontin), sedantes enlafamiliadebenzodiazepinas como clonazepam (Klonopin), antidepresivos, antiepilepticosy anticonvulsivantes como amitriptilina, carbamazepina,Mexiletina, Lamotrigina, Fenitoina,N-feniletilamitriptilina,Desipramina, Gabapentina,o nortriptilina (Pamelor,Aventyl).
Tal como se usa en el presente documento, “vehículofarmacéuticamente aceptable” incluye aditivos, tales como conservantes, excipientes, cargas, agentes humectantes, aglutinantes, disgregantes, tampones que pueden estar presentes en las composicionesdelainvención.Tales aditivos pueden ser, por ejemplo carbonatosde magnesioycalcio, carboximetilcelulosa, almidones, azúcares, gomas, estearatode magnesioocalcio, agentes coloranteso aromatizantes. Existe una ampliavariedadde aditivosfarmacéuticamente aceptables paralas formasde dosificaciónfarmacéuticasy la selecciónde aditivos apropiadoses una materiade rutina paralosexpertosenla técnicadela formulaciónfarmacéutica.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso de una primera composición de la invención para la elaboración de un médicamenteparael tratamientodeunaomásdelas enfermedades seleccionadasdexeroftalmía, sequedadvaginal ysíndrome de boca ardiente.
En otro aspecto, la invención se refiere a una primera composición de la invención para el tratamiento de una o másde las enfermedades seleccionadasdexeroftalmía, sequedadvaginalysíndromede boca ardiente.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método para el tratamiento de una o más de las enfermedades seleccionadasdexeroftalmía, sequedadvaginalysíndromedeboca ardienteenunsujetoque comprendela administración a dicho sujeto de una primera composición de la invención.
La administración de la composición de la invención se puede efectuar por diferentes vías, por ejemplo, por vía intravenosa,intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica, intradérmica, intranasal o intrabronquial,y se puede administrarlocalo sistémicamenteo directamentealsitioobjetivo.Unarevisióndelas distintasvíasde administración de principioactivos,delosexcipientesautilizarydesus procedimientosdefabricaciónpuede encontrarseenelTratado deFarmacia Galénica,C.FaullíiTrillo, Luzán5, S.A.de Ediciones, 1993yen Remington’s Pharmaceutical Sciencies
(A.R. Gennaro, Ed.), 20ª edición,Williams&WilkinsPA, USA (2000).
El régimen de dosificación lo determinará el médico y los factores clínicos. Como se sabe bien en medicina, las dosificaciones dependende muchosfactores que incluyen las características físicas del paciente(edad, tamaño, sexo),la víadeadministración utilizada,la gravedaddela enfermedad,el compuesto particularempleadoydelas propiedadesfarmacocinéticas del individuo.
La composición de la invención puede contener una cantidad de agentes agonistas de TRPM8 que pueden variar dentro de un amplio intervalo, pero siempre en cantidades terapéuticamente eficaces.
En la presente invención se entiende por “cantidad terapéuticamente eficaz” a la cantidad de un agonista del receptor TRPM8 suficiente para provocar un aumento en el lagrimeo, la secreción vaginal o la secreción salivar en el paciente.
Así, la composición de la invención puede contener una cantidad de agonista del receptor TRPM8 que oscila entre 0,1y2.000mg, preferiblemente enelrangode0,5a500mgy,aúnmáspreferiblemente,entre1y200mg.Dosis apropiadas de las composiciones pueden oscilar entre 0,01y100 mg/kg de peso corporal, preferiblemente entre0,1 a50mg/kgdepeso corporal,más preferiblemente, entre0,5y20mg/kgdepeso corporal.La composiciónsepuede administrar un númerovariabledevecesal día, particularmentede1 a4dosisal día.
Como el experto en la materia entiende, tanto el agonista de TRPM8 como el fármaco útil para el tratamiento de unao másde las enfermedades seleccionadasdexeroftalmía, sequedadvaginalysíndromedeboca ardiente puede estar presente en unvehículofarmacéuticamente aceptable.
Excipientes o vehículos preferidos para su uso en la presente invención incluyen azúcares, almidones, celulosas, gomasyproteínas.En una realización particular,la composiciónfarmacéuticadelainvenciónse formularáen unaformafarmacéuticade administración sólida(por ejemplo comprimidos, cápsulas, grageas,gránulos, supositorios, sólidos estériles cristalinos o amorfos que pueden reconstituirse para proporcionar formas líquidas etc.), líquida (por ejemplo soluciones, suspensiones, emulsiones, elixires, lociones, ungüentos etc.)osemisólida (geles, pomadas, cremasysimilares). Las composicionesfarmacéuticas de la invención pueden ser administradas por cualquier ruta, incluyendo, sin ser limitante, oral, intravenosa, intramuscular, intrarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutánea, intraperitoneal, intranasal, entérica, tópica, sublingualo rectal. Una revisiónde las distintas formasde administraciónde principios activos,de losexcipientesa utilizaryde sus procedimientosdefabricación puede encontrarseenelTratadodeFarmaciaGalénica,C.FaulíiTrillo, Luzán5, S.A.de Ediciones, 1993y en Remington’s Pharmaceutical Sciences(A.R. Gennaro, Ed.), 20ª edición,Williams&WilkinsPA,USA(2000).
Como entiende el experto en la materia, la composición de la invención que comprenden, al menos, un agonista del receptor TRPM8, estarán formuladas de acuerdo a la vía de administración que vaya a emplearse. Así, en una realización particular, la composición de la invención que comprende, al menos, un agonista del receptor TRPM8, estará formulada de forma adecuada para su administración por vía oftálmica.
En otra realización particular, la composición de la invención que comprende, al menos, un agonista del receptor TRPM8, estará formulada de forma adecuada para su administración por vía vaginal.
En otra realización particular, la composición de la invención que comprende, al menos, un agonista del receptor TRPM8, estará formuladade forma adecuada para su administración por víabucal.
En una realización particular, el agonista usado en el primer uso de la invención es un agonista seleccionado deWS-5(Etil 3-(p-mentane-3-carboxamido), CPS369, CPS368, CPS125, Frescolat MGA-2Isómero, Coolant Agent 10, (-)-Isopulegol (CoolactP®), (+)-cis&(-)-transp-Mentane-3,8-diol Ratio ∼ 62:38 (Coolact 38D®), (-)-Cubebol, “Hasegawa’sCooling Compound”, “IFF’sNewGRAS Cooling Material”, Icilina, 5-metil-4-(1-pirrolidinil)-3-[2H]-furanona, 4,5-dimetil-3-(1-pirrolidinil)-2[5H]-furanona,4-methyl-3-(1-pirrolidinil)-2[5H]-furanona,N-etil-p-mentane3-carboxamida, WS-11 (ácido 2-isopropil-5-metil-ciclohexanecarboxílico (2-hidroxi-1,1-dimetil-etil)-Amida), WS12 (ácido 2-isopropil-5-metil-ciclohexanecarboxílico (4-methoxiphenil)-amida), WS-14 (ácido 2-isopropil-5-metilciclohexanecarboxílico tert-butilamida),WS-23(2-isopropil-N-2,3-trimetilbutiramida),WS-30 (ácido2-isopropil-5methil-ciclohexanecarboxílico ester 2,3-dihidroxi-propilo), WS-148 (1-(di-sec-butil-fosfinoil)-heptano), Mentol, Geraniol, Linallol, Eucaliptol, Hidroxil-citronellal, PMD-38 (p-mentane-3,8-diol), Anticuerpos agonistas específicos para TRPM8y variantes constitutivamente activasde TRPM8,o combinacionesde losmismos.
En una realización preferida, el agonista usado en el primer uso de la invención no es mentol o un derivado del mismo. Así, en una realización preferida el agonista de TRPM8 se selecciona de icilina,AG3-5, WS-23, WS148, hidroxil-citronellal,5-metil-4-(1-pirrolidinil)-3[2H]-furanona; 4,5-metil-3-(1-pirrolidinil)-2-[5H]-furanonay4methyl-3-(1-pirrolidinil)-2-[5H]-furanona. En una realización más preferida, el agonista usado en el primer uso de la invenciónesun agonista específicopara TRPM8 seleccionadode: compuestos1 a4dela tablaI(WS-5, CPS369, CPS368, CPS125), compuesto 20 (WS-12, Becka B. 2007, Cell Calcium 41(3):285-294) anticuerpos agonista de TRPM8.
Enotra realizaciónpreferida,elagonistase seleccionadeaquellosqueposeenunEC50menorde7(véasetabla2) tales como Cooling Agent 10, Frescolat MGA, Frescolat ML, CPS-369, CPS-113, WS-23, WS-11, WS-30, WS-148, WS-3, WS-12 e Icilina.
Como entiende el experto en la materia, en el caso de que el agonista de TRPM8 sea un anticuerpo o una variante constitutivamente activa de TRPM8, otra manera de poner en práctica la presente invención consiste en la administración de un vector que comprende las secuencias de nucleótidos que codifican dichos agonistas del receptor TRPM8.
La secuencia de nucleótidos que codifica a dichos agonistas puede estar clonada precedidas por secuencias reguladorasdelaexpresión estando operativamente unidasaestas.Tal como se utiliza en esta descripción,laexpresión “operativamente unida” significa que las secuencias de nucleótidos están en el marco de lectura correcto para su expresión bajoel controldedichas secuencias reguladoras.
Las secuencias reguladoras de utilidad para la presente invención pueden ser secuencia promotores nucleares o, alternativamente, secuencias potenciadoras (“enhancer”) y/o otras secuencias reguladoras que aumentan la expresión de la secuencia heteróloga de ácido nucleico. El promotor puede ser constitutivo o inducible. Si se desea expresión constante dela secuencia heteróloga de ácido nucleico, entonces se usa un promotor constitutivo. Ejemplos depromotores constitutivos bien conocidos incluyen el promotor temprano inmediato del citomegalovirus (CMV), promotor del virusdel sarcomade Rous,ysimilares.Numerosos otros ejemplosde promotores constitutivos son bien conocidos enla técnicay se pueden emplear enla prácticadelainvención.Si desealaexpresión controladadela secuencia heteróloga de ácido nucleico, entonces se debe utilizar un promotor inducible. En un estado no inducido, el promotor inducible está “silencioso”. Mediante “silencioso” se quiere decir que en ausencia de un inductor se detecta poca o ninguna expresión de la secuencia heteróloga de ácido nucleico; en presencia de un inductor, sin embargo, se produce la expresión de la secuencia heteróloga de ácido nucleico. Con frecuencia, se puede controlar el nivel de expresión variando la concentración del inductor. Controlando la expresión, por ejemplo variando la concentración del inductor de modo que un promotor inducible se estimula de forma más fuerte o más débil, se puede afectar la concentración del producto transcrito de la secuencia heteróloga de ácido nucleico. En el caso en el que la secuencia heteróloga de ácido nucleico codifica un gen, se puede controlarla cantidaddeproteína quese sintetiza.De esta manera, es posible variar la concentración del producto terapéutico. Ejemplos de promotores inducibles bien conocidos son: un promotor de estrógeno o andrógeno, un promotor de metalotioneína, o un promotor que responde a ecdisona. Otros ejemplos numerosos son bien conocidos enla técnicay se pueden utilizarenla prácticadelainvención. Ademásde los promotores constitutivos e inducibles (que suelen funcionar en una gran variedad de tipos de células o tejidos), se pueden utilizar promotores específicos de tejido para alcanzar expresión de la secuencia heteróloga de ácido nucleico específica en células o tejidos. Ejemplos bien conocidos de promotores específicos de tejido incluyen varios promotores específicos de músculo incluyendo: el promotor de la α-actina esquelética, el promotor de la actina cardiaca, promotor dela troponinaCesquelética, promotordela troponinaCcardiacadede contracción lenta,yel promotor/potenciador de la creatina quinasa.Existen numerosos promotores específicos de músculo que son bien conocidos en la técnica yque se pueden emplear en la práctica de la invención (para una revisión en promotores específicos de músculo ver Miller et al., (1993) Bioessays 15: 191-196).
En una realización particular, anticuerpo agonista de TRMP8 es una inmunoglobulina deltipo IgG-2A.
En otra realización particular, anticuerpo agonista de TRMP8 es un anticuerpo humanizado.
Así mismo, se contempla la posibilidad es que el vector contenga un polinucleótido que codifique una variante constitutivamente activa del receptor TRPM8. De este modo, cuando el vector se exprese en el organismo receptor, producirá las correspondientes proteínas que ejercerán el efecto terapéutico anteriormente comentado para el tratamientode las enfermedades comolaxeroftalmía,la sequedadvaginalyel síndromede boca ardiente.
En el ámbito de la presente invención, preferentemente el vector utilizado es un vector viral o no viral adecuado parasu empleo en terapia génica;a modo ilustrativo, no limitativo, dichosvectores pueden servectores virales basados en retrovirus, adenovirus, etc., o en caso de los no virales, los vectores pueden ser complejos ADN-liposoma, ADN-polímero, ADN-polímero-liposoma, etc. [véase “NonviralVectors for Gene Therapy”, editado porHuang, Hungy Wagner, Academic Press (1999)]. Dichosvectores, viralesy no virales, que contienenla secuencia que codifica al agonista de TRPM8, pueden ser administrados directamente al cuerpo humano o animal por métodos convencionales. Alternativamente, dichosvectorespueden ser utilizados para transformar, transfectaro infectar células, por ejemplo, células de mamíferos, incluido el hombre, ex vivo,y, posteriormente implantarlas en elcuerpo humano o animal para obtener el efecto terapéutico deseado. Para su administración al sujeto, dichas células se formularán en un medio adecuado que no afecte adversamente a su viabilidad.
El siguiente Ejemplo ilustralainvencióny no debe ser considerado limitativo del alcancedela misma.
Ejemplo
Para definir funcionalmente la sensibilidad térmica y la capacidad de codificación de las terminales nerviosas termosensibles, se registró in vitro la actividad de impulsos nerviosos (NTI) en la cornea de ratones silvestres (Brock,
J. A., et al., 1998. J. Physiol 512:211-217). Las terminaciones nerviosas termorreceptoras se identificaron por su disparo espontáneo de impulsos nerviosos a 34ºC cuya frecuencia aumentaba con el enfriamiento y se silenciaba al volver a calentar, así como por su respuesta a la aplicación de mentol (Figura 1A) (Schafer, K., et al., 1986. J. Gen. Physiol 88:757-776). El 72% de las terminaciones sensibles al frío también respondieron a los pulsos de calor (respuesta paradójica) (Long,R.R. 1977.J. Neurophysiol. 40:489-502). (Figura1A)y ala capsaicina100nM(el 65%).
La frecuencia espontáneadedisparode las terminaciones nerviosas sensiblesal fríoala temperatura basal (34ºC) fue de 4.0±0.4 impulsos/s(n=55). Las terminalesde frío dispararon espontáneamente, tantospotenciales único como, ocasionalmente, en ráfagas de dos o más potenciales de acción a intervalos regulares. Los pulsos de frío desde 34ºC hasta 20ºC evocaron una descarga de impulsos que aumentaba progresivamente con la reducción de la temperatura, alcanzando una frecuencia picoydisminuyendola frecuenciade disparoo silenciándose más tarde,al alcanzarlos valores de temperatura más bajos (Figuras 1Ay1B). El curso temporal de la frecuenta media de disparoydel decremento de temperatura durante las rampas de enfriamiento, registrados en un total de55 terminales sensibles al frío, se muestra enla Figura 1B. Los umbralesde temperatura necesarios paraevocar un aumentodela frecuenciade disparo durante las rampas de enfriamiento fueron menores de 2ºC (valor medio: -1.5±0.2ºC, Figura 1C). Alrededor del30%delas unidades termosensiblesaumentaron significativamentesufrecuenciade disparo con disminucionesde temperaturade1ºCo incluso menores.Elvalor mediodela frecuenciapico durantela rampade enfriamientofuede 37.6±1.8 imp/s (n=55).
La sensibilidadtérmica de los termorreceptores de frío corneales, expresada como el cambio en la frecuencia de disparo por cada grado centígrado de decremento de temperatura durante una rampa de enfriamiento continuo, varió entre las unidades registradas. La pendiente media fue 6.3±1.0 impulsos/s/ºC (n=55) (línea roja en la Figura 1D). También se evaluó la capacidad de las terminales termosensibles para codificar valores sostenidos de temperatura, realizando para ello escalones de temperatura de -2.5ºC, entre 34ºCy 24ºC (Figura 1E). La disminución inicial de temperatura produjo unincremento transitoriodela frecuenciade disparo, que se adaptabaa continuacióna un nuevo valor estable. Las terminales corneales sensibles al frío codificaron la temperatura estática en un amplio rango de temperatura. Las respuesta a las bajas temperaturas se caracterizaron por un aumento de la frecuencia de disparo; un marcado cambioenel patrónde disparo,que pasabaa serenráfagasenlamayoríadelos casos (Figura1E;Tabla1),y una modificación transitoria de la forma de los potenciales registrados (Brock, J. A., et al., 1998. J. Physiol 512:211217).La figura1F resume los cambios mediosde frecuenciade disparo estáticosydinámicosde10 termorreceptores ymuestra la notable sensibilidad de estos receptores sensoriales corneales a pequeños cambios de temperatura.
El mentol (50 µM), un activador de las terminaciones sensoriales aferentes sensibles al frío bien conocido, (Schafer, K., et al., 1986. J. Gen. Physiol. 88:757-776). aumentó la actividad espontánea en el 98% de las terminaciones estudiadas (Figura 1A) (desde 3.4±0.3 imp/s a 18.4±1.4 imp/s, n=44;p<0.001, test de pares). El porcentaje de terminales que presentaban un patrón de disparo en ráfagas a 34ºC fue casi diez veces más alto durante la perfusión con mentol (44%) que antes del tratamiento (5%). El mentol sensibilizó la respuesta de las terminales al enfriamiento: en presenciade mentol,las rampasde enfriamientoevocaronun mayor aumentodela frecuenciade disparo, alcanzándose lafrecuencia picoa temperaturas más altas (control:26.7±0.5ºC; mentol: 28.6±0.5ºC, n=44;p<0.001, test de pares), ysilenciándose asimismo a temperaturas más altas (control: 23.8±0.4ºC; mentol: 25.2±0.4ºC, n=44;p<0.05, test de pares). El BCTC es un potente bloqueante reversible de los canales iónicos TRPM8 in vitro (Madrid, R. et al. 2006. JNeurosci. 26:12512-12525, Jordt, S. E.et al. 2004. Nature 427:260-265).Se estudióel efectode una concentración saturante de BCTC (10 µM)enlas terminaciones sensoriales.La actividad espontáneaylos incrementosde frecuencia dedisparoevocadosporelfríoyporel mentol disminuyeron gradualmenteycasise silenciaron completamentetras la perfusión con BCTC durante 90 minutos. Estos efectos del BCTC se observaron también en ratones TRPA1 (-/-). El descenso de la actividad fue parcialmente reversible tras retirar el BCTCy no se observó en ausencia dela droga, lo que sugiere que la actividad de las terminales termosensibles depende fundamentalmente de canales TRPM8.A diferencia del efecto estimulante del mentol, el agonista específico TRPA1, alil-isotiocianato (AITC, 100 µM) (Bandell, M. et al. 2004. Neuron 41:849-857) probado en 28 terminales de frío, no modificó la actividad espontánea ni la evocadaporel enfriamientoen24de ellas.Sólo4unidades sensoriales mostraronun aumento significativodelafrecuenciade disparo durantela perfusión con AITCa temperatura basal (datosno mostrados),loque sugierela ausencia
o la expresión reducida de canales TRPA1 en la mayoría de las terminales corneales sensibles al frío. En conjunto, estos resultados apoyanlaexistencia, previamente sugerida,de un solapamientodelaexpresiónde canales TRPM8y TRPA1 (Story, G. M. et al. 2003. Cell 112:819-829).
La IKD es una corriente de potasio activada por voltaje, tipo shaker, que actúa como freno de la excitabilidad en contra de la activación de las neuronas sensoriales inducida por decrementos de temperatura, contribuyendo a determinar el umbral térmico de los termorreceptores sensoriales (Madrid, R., et al. 2009. J. Neurosci. 29:3120-3131). Se empleóel bloqueantedela corriente IKD4-amino-piridina(4-AP, 100 µM) para explorar si esta corriente afectaba la sensibilidad térmicadelas terminaciones nerviosasde frío corneales.En tresdelas nueveunidades estudiadas,la actividadespontánea aumentósignificativamente trasla perfusión con4-AP, peronose encontraron cambios paralelos en el umbral de frío de estas terminales. Por el contrario, la frecuencia pico durante la respuesta al enfriamiento disminuyó un 39±6% en todas las terminales tratadas con4-AP, respectoa losvalores control(p<0.001, n=9). Globalmente, estos datos sugieren que el umbral térmico de las terminaciones nerviosas de frío de la córnea del ratón no está determinado,al menosde manera significativa, por los canalesde potasio tipo shaker Kv1,yque estas terminales pertenecena neuronas termorreceptorasdefríodebajo umbral (Belmonte,C., et al. 2009. Exp Brain Res. 196:13-30).
Acontinuación,se analizóla presencia, morfologíaydensidadde fibras nerviosasque,presumiblemente,expresan el canal sensiblealfrío TRPM8enlacórneade ratón, utilizando ratones modificados genéticamenteparaexpresarla proteínaverde fluorescente(EYFP)bajoel controldelas secuenciasreguladorasdelTRMP8(ratones TRPM8-EYFP) (Figura 2). Las fibras nerviosas presumiblemente positivas para TRPM8 se distribuían homogéneamente por toda la córnea. Los troncos nerviosos estromales se extendían por el tercio externo de la córnea (Figura 2A-C). Aproximadamenteunodecadanueve axonesestromales resultópositivoparaTRPM8(Figura2C).Unavezquelas ramasdel plexo nervioso estromal penetrabanla láminadeBowman, localizada entreel estromayel epitelio corneal, se ramificabanenvarias fibras nerviosas subbasales (fibrasen cinta)que transcurrían paralelas unasa otras haciael centrodela córnea, inmediatamente debajo de las células basales del epitelio (Figura 2D-H). Algunas fibras subbasales positivas para TRPM8 daban ya terminaciones nerviosas en el propio plexo subbasal (Figura 2H, punta de flecha). No obstante, la mayoría de ellas daban colaterales que ascendían hacia las capas más superficiales del epitelio corneal, acabando como racimos asimétricos (Figura 2I-K).Adiferencia de las fibras nerviosas no fluorescentes, que presumiblemente eran fibras polimodalesy mecano-nociceptoras, los axones positivos para TRPM8 se ramificaban escasamente en el epitelio, para acabar en las capas epiteliales más superficiales como un reducido número de terminales en pincel (Figura 2J-L).Tanto las fibras en cinta subbasales como las terminaciones nerviosas intraepiteliales mostraron, en todos los casos, una morfología arrosariada (Figura 2H-K). Utilizando tinción por inmunofluorescencia doble contra la proteínaverde fluorescente (GFP)ycontra los neurofilamentos, se determinó que lassupuestas fibras termorreceptorasde frío representaban alrededor del 12% del número totalde fibras subbasalesyaproximadamenteel 10%delas terminaciones nerviosasintraepiteliales superficiales(ver secciónde Métodos;Figura2C,F,K,L).
Se determinó a continuación la contribución de los canales TRPM8 a la sensibilidad al frío, explorando la descarga de impulsos nerviosos evocada por el enfriamiento en ratones mutantes TRPM8(-/-)-EGFP ki (Dhaka, A. et al. 2007. Neuron 54:371-378). Se intentó registrar la actividad eléctrica de las terminaciones termosensibles al frío en 12 córneas TRPM8(-/-). Sin embargo, en los centenares de intentos de registro, en los que la totalidad de la superficie corneal fue explorada repetidamente con la pipeta de registro, sólo se consiguió registrar actividad espontánea en 14 terminaciones nerviosas (Figura 3A, trazo punteado). En estos casos, la actividad espontánea registrada fue de baja frecuencia (0.6±0.2 imp/s, n=14)ysólo en una de las terminales TRPM8(-/-) se obtuvo un aumento de la frecuencia de disparo durantela rampadeenfriamiento,conun umbralde temperaturade 28.4ºCyuna frecuenciapico durantela rampade3imp/s obtenidaa 24.7ºC.El mentolesun potenteactivadordelos canalesTRPM8(McKemy,D.D., et al. 2002. Nature 416:52-58). La perfusión con mentol 50 µMno indujo ningún aumentodela frecuenciade disparo,niala temperaturabasalde34ºCni durantelas rampasde enfriamiento(n=6) (Figura3A, trazo puntuado).Este resultadoes coherenteconlaexistenciadeuna dependencia entrelaactividad espontáneayaevocadaporelfrío,ylaexpresióndel TRPM8enenlas terminales sensiblesal frío.La capsaicina(100nM), probadaen6delas unidadesactivasregistradas en córneas TRPM8(-/-),evocóel disparode unos pocos impulsosendos terminales(5y8impulsos, respectivamente), yuna vigorosa descarga con una duración de más de 30 s en otra de ellas.
En contraste con la gran inhibición de la actividad espontánea y evocada por frío, observada en los ratones TRPM8(-/-), las terminaciones nerviosas corneales de los ratones TRPA1(-/-) (Kwan, K. Y. et al. 2006. Neuron. 50:277-289) mostraron una frecuenciadedisparoy una respuestaal frío similara lasde los ratones silvestres (Figura 3B). Estos resultados confirman que los canales TRPA1 no son determinantes moleculares críticos para la sensibilidad al enfriamiento de las terminaciones nerviosas corneales sensibles al frío. Los resultados son coherentes asimismo con resultados previos de nuestro grupo, obtenidos en neuronas sensoriales del trigémino en cultivo Madrid, R., et al.(J. Neurosci., 2009, 29:3120-3131).Paraexcluirla posibilidaddequelas terminaciones nerviosas termosensibles estuvieran ausentes en las córneas de los ratones TRPM8(-/-), o presentaran una morfología alterada, éstas se tiñeron con anticuerpos anti-GFP, a fin de visualizar la morfología de las fibras nerviosas que expresaban los canales TRPM8 truncados (Dhaka, A., et al. 2008.J. Neurosci. 28:566-575.La distribuciónde las fibras teñidas en diferentes regiones de la circunferencia corneal fue variable de un animal TRPM8(-/-) a otro. No obstante, la morfología general de las fibrasen cinta sub-basalesylos racimosde terminaciones nerviosas intraepitelialesfueen todoslos casos similaralas de las fibras de los ratones TRPM8-EYFP. Además, no se encontraron diferencias significativas en la densidad total de terminaciones nerviosas,lo queexcluyela posibilidadde quela ausenciade actividadyde respuestaa frío observada en los experimentos de electrofisiología se debiera a que la pipeta de registro no alcanzaba las terminaciones.
Adicionalmente se exploró la actividad evocada por el frío en córneas de ratones TRMP8(+/-), en los que presumiblemente la respuesta al enfriamiento debería estar reducida debido a una menor expresión de canales TRPM8.30 En estos animales, el 30% de las terminales presentaban actividad espontánea pero carecían de respuesta al fríoyal mentol, a diferencia de los animales silvestres, en los que era excepcional (7%) encontrar unidades sin sensibilidad al frío que presentaran actividad espontánea. Entre las terminaciones nerviosas activas, la actividad espontánea media a 34ºC fue significativamente más baja que en los animales TRPM8(+/+) (2.2±0.4 imp/s vs. 4.4±0.9 imp/s; n=11; p=0.025, test de Mann-Whitney), mientras que el umbral de temperatura medido durante las rampas de frío esto es, la temperatura necesaria para evocar un aumento de la frecuencia de disparo, se estableció en temperaturas de valores más bajos (30.6±0.5ºC vs. 32.7±0.4ºC; p=0.004, testde Mann-Whitney),yla frecuencia pico durante en enfriamiento fue asimismo significativamente más baja en las corneas de ratones TRMP8(+/-) que en las de ratones silvestres (19.4±3.4 imp/s vs. 33.8±3.5 imp/s; p=0.008,t de Student) (Figura 3A, trazo continuo). En los ratones TRMP8(+/-), el mentol (50 µM)aumentóla frecuenciade disparoa temperatura basal,el umbralde fríoyla frecuencia pico, aunque significativamente menos que en los animales TRMP8(+/+) (Figura 3A, trazo continuo).
Acontinuación, se planteó quesila producción lagrimal está asociadaala actividad neuraldelas fibras termorreceptorasde frío,el flujo basalde lágrimas debe estar disminuido enlos animales TRPM8(-/-), en los quela actividad espontánea está prácticamente ausente. La figura 4A muestra que ese es el caso. El volumen del fluido lagrimal, expresado como la longitud de hilo impregnado con rojo fenol que cambia de color al humedecerse con las lágrimas durante un períodode2minutos, medido en los ratones TRPM8(-/-) en condiciones basales (1.5±0.2 mm, n=23) fue significativamente más bajo que el medido en ratones silvestres (3.7±0.4 mm, n=35;p<0.001). Por el contrario, la lagrimación basal de los ratones TRPA1(-/-) no fue significativamente diferente de la media en animales silvestres (Figura 4A, columnas negras). Por otra parte, la aplicación tópica de capsaicina (1 µM)yAITC (500 µM), dos agentes que activan los canales TRPV1yTRPA1 enlos nociceptores polimodales, aumentaron significativamente el flujo lagrimal tanto en ojos de ratones TRPM8(-/-) como silvestres, mientras que el vehículos de ambas drogas no tuvo ningún efecto significativo (Figura 4B).
Acontinuaciónse tratóde confirmarsila relación entrela temperatura cornealyla tasa basalde lagrimación estaba también presente en el ser humano, para lo que se midió la tasa de lagrimación en 11 voluntarios jóvenes (28.9±1.8 años)expuestos durante10 minutos, en sesiones distintas,a temperaturas ambientesde 18ºC, 25ºCy43ºC conuna humedad constante del 32%. La exposición a esas temperaturas llevó la temperatura de la superficie corneal a unos valores de 32.4±0.4ºC,34.2±0.1ºCy36.0±0.2ºC, respectivamente. Los valores de temperatura medidos en la superficie corneal fueron significativamente diferentes entre sí (p<0.001, ANOVApara medidas repetidas). Por el contrario, sólo con la temperatura ambiente de 43ºC se redujo significativamente la tasa de lagrimación (17.1±1.4 mm, frente a 22.8+1.2 mma25ºCó23.2±2.3 mm a 18ºC;p=0.006) (Figura 4C). Cuando los sujetos se expusieron a 43ºC (temperatura corneal 36.0±0.1ºC) con una humedad ambiental del 62.5%, la reducción de la tasa de lagrimación fue la misma (17.6±2.4mm)queenconla humedaddel32%.Estosexperimentosse remedaronen ratonessilvestresyTRPM8(-/-) anestesiados, ubicándolos en las mismas condiciones ambientales empleadas en los experimentos con humanos, esto es,exponiéndolos a temperaturas ambientales altasy neutras en condicionesde humedad ambiental constante.En los ratones silvestres, cuando la temperatura corneal subía hasta 36.4±0.2ºC (n=11), la lagrimación disminuía hasta 1.8±0.4mm(Figura4A), mientrasqueenun ambientecon temperatura neutra,latemperatura cornealerade27.2±0.1 (n=6)yla tasa de lagrimación era de 4.6±0.8 mm (p=0.017, test de Mann-Whitney). Por el contrario, en los ratones TRPM8(-/-) expuestos a condiciones similares, la tasa de flujo lagrimal no se modificaron significativamente al variar la temperatura de la superficie corneal (Figura 4A).

Claims (10)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Uso de un agonista de TRPM8 o de combinaciones de los mismos para la elaboración de un medicamento para eltratamientoolaprevenciónde una enfermedad seleccionadadexeroftalmía, sequedadvaginalysíndromedeboca ardiente.
  2. 2. Uso según la reivindicación 1, en el que dicha enfermedad es la xeroftalmía.
  3. 3.
    Uso según la reivindicación 2, en el que dicho agonista aumenta la estimulación de la secreción lagrimal por parte de las fibras sensibles al frío por medio de la activación de TRPM8.
  4. 4.Usosegún cualquieradelasreivindicaciones1a3en dondeel agonistade TRPM8se seleccionadelos agonistas descritos enlaTabla1.
  5. 5.
    Uso según la reivindicación 4 en el que dicho agonistas de TRPM8 se selecciona del grupo formado por WS-5(Etil 3-(p-mentane-3-carboxamido), CPS369, CPS368, CPS125, Frescolat MGA-2 Isómero, Coolant Agent 10, (-)-Isopulegol (CoolactP®), (+)-cis&(-)-transp-Mentane-3,8-diol Ratio ∼ 62:38 (Coolact 38D®), (-)-Cubebol, “Hasegawa’sCooling Compound”, “IFF’sNewGRAS Cooling Material”, Icilina, 5-metil-4-(1-pirrolidinil)-3-[2H]-furanona, 4,5-dimetil-3-(1-pirrolidinil)-2[5H]-furanona,4-methyl-3-(1-pirrolidinil)-2[5H]-furanona,N-etil-p-mentane3-carboxamida, WS-11 (ácido 2-isopropil-5-metil-ciclohexanecarboxílico (2-hidroxi-1,1-dimetil-etil)-Amida), WS12 (ácido 2-isopropil-5-metil-ciclohexanecarboxílico (4-methoxiphenil)-amida), WS-14 (ácido 2-isopropil-5-metilciclohexanecarboxílico tert-butilamida),WS-23(2-isopropil-N-2,3-trimetilbutiramida),WS-30 (ácido2-isopropil-5methil-ciclohexanecarboxílico ester 2,3-dihidroxi-propilo), WS-148 (1-(di-sec-butil-fosfinoil)-heptano), Mentol, Geraniol, Linallol, Eucaliptol, Hidroxil-citronellal, PMD-38 (p-mentane-3,8-diol), Anticuerpos agonistas específicos para TRPM8y variantes constitutivamente activasde TRPM8.
  6. 6.
    Composición que comprende al menos un agonista de TRPM8yal menos un fármaco útil para el tratamiento de unaomásdelas enfermedades seleccionadasdexeroftalmía, sequedadvaginalysíndromede boca ardiente,y,si se desea, unvehículofarmacéuticamente aceptable.
  7. 7.
    Composiciónsegúnlareivindicación6en dondeel agonistade TRPM8seseleccionadelos agonistasde TRPM8 mostrados enlaTabla1.
  8. 8.
    Composición según cualquiera de las reivindicaciones6ó7 en el que el agonista de TRPM8 se selecciona de losagonistasdeTRPM8 específicosy/odelos agonistasde TRPM8,en dondedicho agonistaes distintoal mentolo a un derivado del mismo.
  9. 9.
    Composiciónsegún cualquieradelasreivindicaciones6a8,enelque dicho agonistadeTRPM8se seleccionadel grupo formado porWS-5(Etil 3-(p-mentane-3-carboxamido), CPS369, CPS368, CPS125, Frescolat MGA-2 Isómero, Coolant Agent10, (-)-Isopulegol (CoolactP®), (+)-cis&(-)-trans p-Mentane-3,8-diol Ratio ∼ 62:38 (Coolact38D®), (-)-Cubebol, “Hasegawa’s CoolingCompound”, “IFF’s New GRAS Cooling Material”, Icilina,5-metil-4-(1-pirrolidinil)-3-[2H]-furanona, 4,5-dimetil-3-(1-pirrolidinil)-2[5H]-furanona,4-methyl-3-(1-pirrolidinil)-2[5H]-furanona,Netil-p-mentane-3-carboxamida, WS-11(ácido 2-isopropil-5-metil-ciclohexanecarboxílico (2-hidroxi-1,1-dimetil-etil)-Amida), WS-12 (ácido 2-isopropil-5-metil-ciclohexanecarboxílico (4-methoxiphenil)-amida), WS-14 (ácido 2-isopropil-5-metil-ciclohexanecarboxílico tert-butilamida), WS-23 (2-isopropil-N-2,3-trimetilbutiramida), WS-30 (ácido 2-isopropil-5-methil-ciclohexanecarboxílico ester 2,3-dihidroxi-propilo), WS-148 (1-(di-sec-butil-fosfinoil)-heptano), Mentol, Geraniol, Linallol, Eucaliptol, Hidroxil-citronellal, PMD-38 (p-mentane-3,8-diol), Anticuerpos agonistas específicos para TRPM8y variantes constitutivamente activasde TRPM8.
  10. 10.Usode una composiciónsegún cualquieradelasreivindicaciones6a9parala elaboracióndeun medicamento parael tratamientode unaomásdelas enfermedades seleccionadasdexeroftalmía, sequedadvaginalysíndromede boca ardiente.
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