ES2416719T3 - Modulación por IVIG de quimioquinas para el tratamiento de la esclerosis múltiple, la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson - Google Patents

Abstract

Método para verificar la eficacia de un tratamiento intravenoso con inmunoglobulina (IVIG) de exacerbaciones agudas de esclerosis múltiple recurrente-remitente en un sujeto, comprendiendo el método los pasos de: (a) Poner en contacto una primera muestra biológica del sujeto tratado con IVIG con un reactivo que se une específicamente a una secuencia de ácido nucleico del factor 1 de regulación transcripcional (TRERF1); (b) Medir la expresión génica del TRERF1; (c) Comparar la expresión génica del TRERF1 en la primera muestra procedente del sujeto tratado con IVIG con la expresión génica del TRERF1 presente en una muestra de referencia procedente del sujeto obtenida con anterioridad al tratamiento con IVIC; y (d) Determinar si el TRERF1 está o no sobreexpresado o infraexpresado en la muestra procedente del sujeto tratado con IVIG en comparación con la expresión génica del marcador en la muestra de referencia, verificando así la eficacia del tratamiento con IVIG de la esclerosis múltiple en el sujeto.

Description

Modulacion por IVIG de quimioquinas para el tratamiento de la esclerosis multiple, la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

La esclerosis multiple (EM) es la enfermedad autoinmune inflamatoria mas habitual del sistema nervioso central. Se caracteriza por lesiones desmielinizantes de la sustancia blanca del sistema nervioso central, cuyas consecuencias son deficits neurologicos (Sospedra M. y Martin R., Immunology of Multiple Sclerosis. Annu Rev Immunol., 23: 683-747 (2005)). La patogenesis de la enfermedad esta asociada con la infiltracion en el cerebro de celulas inmunes y, especialmente, de celulas T activadas (Sospedra M. y Martin R., Annu Rev Immunol., 23: 683-747 (2005)). Esta infiltracion va acompafada de una disrupcion de la barrera hematoencefalica (van Horssen J. y col., J Neuropathol Exp Neurol., 66: 321-8 (2007)).

Las inmunoglobulinas intravenosas (IVIG) han demostrado ser efectivas en el tratamiento de diversas enfermedades autoimmunes, incluyendo EM (Sospedra M. y Martin R., Immunology of Multiple Sclerosis. Annu Rev Immunol., 23: 683747 (2005)), pero no se ha conseguido explicar por completo el mecanismo exacto de accion que subyace bajo la actividad inmunomoduladora de las IVIG. Existen diversos modelos que tratan de explicar la eficacia de las IVIG en pacientes que padecen enfermedades autoinmunes e inflamatorias (Kazatchkine M.D. y col., Mult Scler, 2:24-6; 33:2426 (2000); Trebst C. and Stange M., Curr. Pharm. Design, 12:241-2493 (2006)). Estos modelos incluyen la inmunomodulacion mediada por los receptores Fcy (Sorensen P.S., Neurol Sci, 4:227-230 (2003)), la modulacion de las redes idiotipo-antiidiotipo (Samuelsson A. y col., Science, 291:484-6 (2001)), la eliminacion de productos microbianos inmunoestimulantes (Dalakas M.C., Ann Intern Med, 126:721-30 (1997)) y la neutralizacion de los anticuerpos que actuan contra las citoquinas y quimioquinas (Bayry J. y col., Transfus Clin Biol., 10:165-9 (2003)). Tambien se ha demostrado el potencial de las IVIG para modificar el equilibrio entre la inmunoreactividad de las celulas Th1 y Th2 e inhibir la formacion de complejos anticuerpo/complemento (Andersson U. y col., Immunol Rev, 139: 21-42 (1994); Bayry

J. y col., Intravenous immunoglobulin in autoimmune disorders: An insight into the immunregulatory mechanisms).

Los efectos beneficiosos de las IVIG en pacientes que padecen EM fueron demostrados mediante una serie de ensayos clinicos abiertos (Basta M. y col., Blood, 77: 376-80 (1991)) y mediante cuatro ensayos clinicos aleatorios doble ciego (Sorensen P.S. y col., Eur J. Neurol, 9: 557-563 (2002); Strasser-Fuchs S. y col., Mult Scler, 2: 9-13 (2000); Sorensen

P.S. y col., Neurology, 50: 1273-1281 (1998); Lewanska M. y col., Eur J. Neurol, 9: 565-572 (2002)). Las IVIG redujeron la frecuencia de recaida en pacientes de EM, asi como el numero de lesiones realzadas con gadolinio observadas en el diagnostico por imagen de resonancia magnetica (MRI) (Dudesek A. y Zettl U.K., J. Neurol, 253; V/50-V/58)). Asimismo, se demostro que la IVIG suprimia la proliferacion de las celulas T perifericas activadas (Bayry J. y col., Neurol Sci, 4: 217-221 (2003); Stange M. y Gold R., Nervenarzt, (2005)). Las celulas T perifericas auto-reactivas pueden atravesar la barrera hematoencefalica y se cree que son las principales celulas efectoras responsables de la inflamacion cerebral (Sospedra M. y Martin R., Annu Rev Immunol., 23: 683-747 (2005); Helling N. y col., Immunol Res. 1: 27-51 (2002)). Por tanto, una modulacion de la funcion cerebral T mediante IVIG podria explicar el efecto beneficioso desde el punto de vista terapeutico de las IVIG observado en los pacientes de EM.

Recientemente se ha observado que las IVIG son un tratamiento alternativo eficaz para aquellos pacientes que sufren esclerosis multiple recurrente-remitente (EMRR) (Elovaara l. y col., Intravenous Immunoglobulin is effective and well tolerated in the treatment of MS Relapse, manuscript submitted). Debido a que se cree que las celulas T perifericas auto-reactivas son las responsables de la inflamacion cerebral en la EM, se asume la tarea de identificar los genes que estan regulados de forma diferencial en las celulas T perifericas de pacientes con EM en grado de exacerbacion aguda tratados con IVIG. Se llego a la conclusion de que las diferencias en los perfiles de expresion genica podrian facilitar informacion importante sobre los potenciales mecanismos de accion del tratamiento con IVIG.

Ademas, los cambios observados en los perfiles de expresion genetica podrian facilitar marcadores de pronostico que predijesen el exito del tratamiento. Dichos marcadores podrian tambien ayudar a identificar los objetivos de desarrollo de nuevos agentes terapeuticos.

El documento WO 02/059604 se refiere a metodos y composiciones para la deteccion, diagnostico y pronostico de la esclerosis multiple, asi como para controlar la eficacia de diversos tratamientos. El documento WO 02/059604 tambien se refiere a la identificacion de aquellos pacientes con una mayor probabilidad de respuesta a un tratamiento terapeutico especifico.

El documento WO 2005/027733 se refiere a marcadores biologicos de la esclerosis multiple y a su utilizacion para el diagnostico y aplicaciones clinicas de la enfermedad.

Asimismo, un numero cada vez mayor de evidencias sugieren que la inflamacion cerebral tiene una funcion especifica no solo en el caso de la EM, sino tambien en la patogenesis de la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson (vease, por ejemplo, Wilms y col., Curr. Pharm. Des. 13: 1925 (2007)). En microglias especificas, las celulas inmunes innatas residentes desempefan un papel principal en los procesos inflamatorios del cerebro y se sabe que estan asociadas no solo a la EM, sino tambien a la Enfermedad de Alzheimer y la Enfermedad de Parkinson (veanse, por ejemplo, Yamamoto y col., Am. J. Pathology 166: 1475 (2006); Huang y col., FASEB 19: 761 (2005); Kim y col., Exp.

And Mol. Med. 38: 333 (2006)). Asi, la presente invencion proporciona nuevos marcadores de pronostico que predicen el exito del tratamiento asociado a la administracion de un tratamiento con inmunoglobulina por via intravenosa, asi como nuevas dianas terapeuticas que pueden utilizarse para el tratamiento de la EM, por ejemplo esclerosis multiple recurrente-remitente (EMRR), o de la enfermedad de Parkinson o de Alzheimer.

BREVE SUMARIO DE LA INVENCION

La presente invencion proporciona un metodo para estudiar la eficacia del tratamiento de la esclerosis multiple segun la reivindicacion 1.

El reactivo puede ser un acido nucleico, incluyendo un oligonucleotido o un conjunto de cebadores de RT-PCR. En otros aspectos, la muestra es una muestra de sangre que puede contener celulas T. La muestra puede ser tambien liquido cerebroespinal.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1:

muestra el desarrollo de las puntuaciones EDSS en 10 pacientes de EMRR durante el tratamiento con IVIG. Los trazos de los recuadros, que contienen la mediana, los percentiles 25 y 75, la minima y la maxima, muestran las puntuaciones EDSS de los pacientes durante la remision, asi como antes y despues del tratamiento con IVIG durante la fase de relapso.

Figura 2:

muestra que el tratamiento con IVIG no altera la composicion celular de celulas obtenidas por aislamiento de ARN. Se muestran los datos de expresion genica relativa obtenidos por analisis de microarray para CD3, CD4, CD8 y CD14. A la expresion gecnica se asigna el dia 0 el valor 1 y se compara con la expresion gecnica el dia 6 (A) y el dia 26 (B). Cada punto representa un paciente individual.

Figura 3:

PCR en tiempo real, mostrando la expresion de genes representativos. Los graficos de los recuadros contienen la mediana, los percentiles 25 y 75, la minima y la maxima, muestran la expresion relativa de los genes indicados. La expresion genica se normalizo con respecto a un control endogeno (gliceraldehido-3-fosfato-deshidrogenasa). Los experimentos PCR en tiempo real se llevaron a cabo en tripletes, confirmandose al menos en dos ocasiones en diferentes dias.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

En terminos generales, la esclerosis multiple (EM) se refiere a una enfermedad inflamatoria desmielinizante que afecta al sistema nervioso central (SNC). Durante la evolucion de la EM, la mielina que rodea los axones neuronales se degenera, lo que resulta en una subsecuente degeneracion axonal. Se cree que la patogenesis de la EM implica una respuesta autoinmune en la cual las celulas T atacan partes del sistema nervioso central, desencadenando respuestas inflamatorias, resultando en una estimulacion de otras celulas inmunes y en la secrecion de factores solubles tales como citoquinas y anticuerpos. Los procesos inflamatorios desencadenados por las celulas T generan fugas en la barrera hematoencefalica, formada por celulas endoteliales. A su vez, estas fugas en la barrera hematoencefalica generan otros efectos perjudiciales, como inflamacion cerebral, activacion de macrofagos y secrecion adicional de citoquinas y otras proteinas proteoliticas, como metaloproteinasas de matriz. El resultado final de estos procesos patologicos es la desmielinizacion neuronal (vease, por ejemplo, Calabresi, P.A., American Family Physician, 70: 1935-1944 (2004).

A medida que avanza la EM, gradualmente se produce una desmielinizacion y una transeccion de los axones neuronales en placas en el cerebro y la medula espinal. Por ello, el termino esclerosis multiple se refiere a las multiples cicatrices (o esclerosis) que se encuentran en el recubrimiento de mielina de los pacientes afectados. Esta cicatrizacion causa sintomas que pueden variar ampliamente en funcion del alcance de las cicatrices y de los circuitos neuronales que se han visto interrumpidos.

Entre los sintomas y manifestaciones de la EM se incluyen alteraciones de la sensibilidad (hipoestesia), debilidad muscular, espasmos musculares anormales, dificultades en el movimiento; dificultades de coordinacion y equilibrio (ataxia); trastornos del habla (disartria) o de la deglucion (disfagia), problemas visuales (nistagmo, neuritis optica o diplopia), fatiga y sindrome doloroso agudo o cronico, trastornos de la vejiga o los intestinos, trastornos cognitivos o sintomatologia emocional (por ejemplo, depresion).

Los sintomas iniciales mas comunes comunicados son: trastornos de la sensibilidad en brazos, piernas o rostro (33%), perdida de vision total o parcial (neuritis optica) (16%), debilidad (13%), vision doble (7%), inseguridad al caminar (5%) y problemas de equilibrio (3%) (vease Navarro y col., Rev Neurol 41: 601-3 (2005); Jongen P., J. Neurol Sci 245: 59-62 (2006)). En algunos pacientes, el ataque inicial de EM viene precedido de una infeccion, trauma o de un esfuerzo fisico extenuante.

En la actualidad se utilizan diversos tests diagnosticos para diagnosticar la EM. Estos tests incluyen la presentacion clinica de dos episodios independientes de sintomas neurologicos caracteristicos de la EM, junto con el descubrimiento de anormalidades consitentes en el examen fisico. Alternativamente, a menudo se utiliza el diagnostico por imagen de resonancia magnetica (MRI) del cerebro y de la columna para evaluar aquellos individuos sospechos de padecer EM. La MRI revela zonas de desmielinizacion y lesiones brillantes en las imagenes T2-ponderadas o en secuencias FLAIR (recuperacion de inversion atenuada por liquido). Puede utilizarse un contraste de Gadolinio para mostrar las placas activas en las imagenes T1-ponderadas.

Comprobar el liquido cerebroespinal (CSF) puede aportar evidencias de inflamacion cronica del sistema nervioso central, una caracteristica de la EM. En tales pruebas se comprueba la existencia de bandas oligoclonales en el CSF, que son inmunoglobulinas encontradas en una proporcion entre el 85% y el 95% de los individuos que padecen EM definida. Cuando se combina con una MRI y con los datos clinicos, la presencia de bandas oligoclonales puede ayudar a elaborar un diagnostico definido de EM.

Debido a que el cerebro de los individuos afectados por EM suele responder de forma menos activa a la estimulacion del nervio optico y de los nervios sensoriales, tambien se puede utilizar la medida de dichas respuestas cerebrales como herramienta de diagnostico. Estas respuestas cerebrales pueden examinarse utilizando potenciales visuales evocados (VEP) y potenciales somatosensoriales evocados (SEP). La disminucion de la actividad en cualquiera de los tests puede revelar una desmielinizacion, que de otro modo podria resultar asintomatica. Junto con otros datos, estos examenes podrian ayudar a desvelar la amplia implicacion nerviosa para un diagnostico definido de EM.

Se han descrito diversos subtipos o patrones de progresion de la EM. En 1996, la United States National Multiple Sclerosis Society normalizo las cuatro siguientes definiciones de subtipo, como se describe seguidamente.

La EM recurrente-remitente (EMRR) se refiere a un subtipo caracterizado por ataques impredecibles (relapsos) seguidos por periodos de meses o afos de relativa calma (remision) donde no se dan nuevos signos de actividad de la enfermedad. Los deficits sufridos durante los ataques pueden resolverse o adquirir caracter permanente. La recurrenciaremision describe el curso inicial del 85% al 90% de los individuos con EM.

La EM secundaria progresiva se describe aproximadamente ell 80% de las personas con EM recurrente-remitente inicial, que posteriormente empiezan a experimentar un declive neurologico entre sus ataques agudos sin periodo de remision definido. Este declive puede incluir nuevos sintomas neurologicos, empeoramiento de la funcion cognitiva u otros deficits. La EM secundaria progresiva es el tipo mas comun de EM y provoca la mayor incapacidad.

La EM primaria progresiva describe aproximadamente al 10% de los individuos que nunca han experimentado una remision tras sus sintomas de EM inicial. El declive se produce de forma continua sin ataques claros. El subtipo primario progresivo tiende a afectar a las personas de mas edad en el momento de aparicion de la enfermedad.

La EM recurrente progresiva describe aquellos individuos que presentan, desde la aparicion de la EM, un constante declive neurologico, pero que tambien sufren ataques superpuestos; es el menos comun de todos los subtipos.

Aunque actualmente no se dispone de una cura definitiva para la EM, se han desarrollado diversas terapias destinadas a recuperar las funciones despues de un ataque, a impedir nuevos ataques o a prevenir la incapacidad. Asi, se utilizan diferentes terapias para aquellos pacientes que sufren ataques agudos; para aquellos del subtipo recurrente-remitente; para quienes padecen los subtipos progresivos; para aquellos no diagnosticados de EM pero que han tenido episodios de desmielinizacion; y para gestionar las diversas consecuencias de los ataques de EM.

Entre los agentes farmacologicos actualmente utilizados para la EM se encuentran los interferones, que se han aprobado para su utilizacion con tipos recurrentes de EM secundaria progresiva; acetato de glatiramer, un farmaco sintetico compuesto por cuatro aminoacidos que se encuentran en la mielina y que estimula a las celulas T a segregar agentes antiinflamatorios que reducen la inflamacion en los sitios de lesion; mitoxantrona, un agente utilizado para el tratamiento de la EM progresiva, progresiva-remitente y recurrente-remitente con empeoramiento; y Natalizumab, un anticuerpo monoclonal que reconoce la integrina-a4.

Con frecuencia se administran elevadas dosis de corticoesteroides via intravenosa, como metilprednisolona, para el tratamiento de la EMRR, y se ha demostrado su eficacia a la hora de reducir la duracion de los ataques sintomaticos recurrentes-remitentes. Como se describe en mayor detalle en este documento, tambien se utilizan inmunoglobulinas IgG via intravenosa para el tratamiento de la EM.

Al igual que en el caso de la EM, otras enfermedades tambien se asocian a la inflamacion cerebral, como la Enfermedad de Parkinson y la Enfermedad de Alzheimer, tal y como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, la quimioquina CCL13, aqui descrita, activa el receptor CCR2 de la quimioquina, que se expresa en la microglia y los astrositos. Ambos tipos de celulas se asocian a la Enfermedad de Parkinson y a la Enfermedad de Alzheimer. Por tanto, este y otros de los marcadores aqui descritos resultan utiles para los ensayos de medicamentos, diagnosticos y pronosticos y para el tratamiento terapeutico de la Enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson con ARNsi y anticuerpos.

Se han utilizado satisfactoriamente inmunoglobulinas intravenosas (IVIG) para el tratamiento de diversas enfermedades autoinmunes del sistema nervioso central, incluyendo la esclerosis multiple (EM). No obstante, los mecanismos subyacentes de accion de la IVIG no se han explicado satisfactoriamente. Por ello, se asume la identificacion de los perfiles de expresion gecnica asociados a la actividad inmunomoduladora de la IVIG en pacientes con exacerbaciones agudas en EM recurrente-remitente (EMRR). Como se describe mas adelante, se utilizan microarrays HU-133 de Affymetrix para estudiar los perfiles de expresion gecnica de las celulas T perifericas en 10 pacientes de EMRR antes y despues de su tratamiento con IVIG. Los pacientes tratados con metilprednisolona intravenosa se incluyen como grupo control. La expresion diferencial de los genes representativos se confirmo mediante reaccion en cadena de la polimerasa en tiempo real. Todos los pacientes se analizaron neurologicamente y mediante resonancia magnetica de cerebro y columna antes y despues de la terapia con IVIG.

Como se muestra seguidamente en los Ejemplos, se identificaron 360 genes que se expresaron de forma diferencial durante el tratamiento con IVIG. Algunos de ellos codifican quimioquinas, como CXCL3 y CXCL5, que se sabe se unen a la CXCR2, un receptor esencial para la regulacion de la migracion de oligodendrocitos en el cerebro. Otros codifican proteinas que participan en la transduccion de la sefal, la proliferacion o la apoptosis.

Los estudios aqui descritos indican que, entre los genes que se expresan de forma diferencial, la regulacion de la expresion de la quimioquina en celulas T perifericas es un importante y nuevo mecanismo de accion de la IVIG en pacientes con exacerbaciones agudas de EM. Asi, los genes que aqui se describen pueden servir como marcadores diagnosticos para predecir el exito del tratamiento de la terapia con IVIC y proporcionan nuevas dianas moleculares para el desarrollo de farmacos.

DEFINICIONES

En general, el termino tratamiento con "IgG intravenosa" o "IVIG" se refiere a una composicion de inmunoglobulinas IgG administradas via intravenosa para el tratamiento de diversas enfermedades, como deficiencias del sistema inmune, enfermedades inflamatorias y enfermedades autoimmunes. Las inmunoglobulinas IgG suelen agruparse y prepararse a partir de suero. Pueden utilizarse anticuerpos completos o fragmentos.

En general, el termino "quimioquina" se refiere a una familia de pequefas citoquinas que son segregadas por diversas celulas que promueven la quimiotaxia en las celulas que responden a ellas. Las quimioquinas tambien se conocen por la nomenclatura como familia de citoquinas SIS, SIG, SCY, superfamilia del factor plaquetario-4 o intercrinas. Las celulas que son atraidas por las quimioquinas siguen una sefal de incremento de la concentracion de quimioquina en direccion a la fuente de la quimioquina.

Algunos miembros de la familia de las quimioquinas controlan las celulas del sistema inmune durante el proceso de supervision de la respuesta inmune, por ejemplo dirigiendo a los linfocitos hacia los ganglios linfaticos para permitir que estos sobrevivan a la invasion de patogenos mediante la interaccion con celulas de presentacion del antigeno presentes en estos tejidos. Dichas quimioquinas se conocen como quimioquinas homeostaticas y son producidas y secretadas sin necesidad de estimulacion de sus celulas fuente. Algunas quimioquinas desempefan un papel en el desarrollo, por ejemplo promoviendo la angiogenesis o guiando las celulas hacia tejidos que proporcionan sefales especificas criticas para la maduracion celular. Otras quimioquinas son inflamatorias y son liberadas por muy diversas celulas en respuesta a infecciones bacterianas, virales y agentes que causan dafos fisicos. La liberacion de las quimioquinas inflamatorias a menudo esta estimulada por las citoquinas pro-inflamatorias, tales como interleucina 1. Las quimioquinas inflamatorias operan basicamente como quimioatrayentes para los leucocitos, reclutando monocitos, neutrofilos y otras celulas efectoras desde la sangre a los sitios de infeccion o a los tejidos dafados. Ciertas quimioquinas inflamatorias activan las celulas para iniciar una respuesta inmune o promover la cicatrizacion de heridas. Son liberadas por muchos tipos de celulas diferentes y sirven para guiar las celulas tanto del sistema inmune innato como del sistema inmune adaptativo.

Estructuralmente, las quimioquinas son proteinas pequefas de masa molecular entre 8 y 10 kDa. Las quimioquinas tambien presentan aminoacidos conservados, que son muy importantes para crear estructuras tridimensionales o terciarias, asi como (en la mayoria de los casos) cuatro cisteinas que interactuan entre si dos a dos para crear una forma de greca, caracteristica de esta clase de proteinas; los enlaces intramoleculares disulfuro tipicamente unen el primero con el tercero y el segundo con el cuarto de los residuos cisteina, numerados segun aparecen en la secuencia proteinica de la quimioquina.

Los miembros de la familia de las quimioquinas se categorizan en cuatro grupos segun la separacion de sus dos primeros residuos cisteina. Las quimioquinas CC (o �-quimioquinas) tienen dos cisteinas adyacentes cerca de su terminal amino. Se ha informado de la existencia de al menos 27 miembros diferentes de este subgrupo en los mamiferos, denominados ligandos de quimioquinas CC, (CCL)-1 a -28. Los dos primeros residuos cisteina en las quimioquinas CXC (o a-quimioquinas) se encuentran separados por un aminoacido, representado por "X". En los mamiferos se han descrito 17 quimioquinas CXC diferentes, que se subdividen en dos categorias, aquellas que cuentan con una secuencia de aminoacido especifica (o motivo) de acido glutamico-leucina-arginina (ELR) inmediatamente antes de la primera cisteina del motivo CXC (ELR-positivas) y aquellas que carecen de dicho motivo ELR (ELRnegativas). El tercer grupo de quimioquinas se conoce como quimioquinas C (o y-quimioquinas) y se diferencia del resto de las quimioquinas en que tan solo tiene dos cisteinas: una cisteina en el terminal N y otra aguas abajo. Un tercer grupo cuenta con tres aminoacidos entre las dos cisteinas y se denomina quimioquina CX3C (o 5-quimioquinas).

Los receptores de la quimioquina son receptores acoplados a la proteina G que contienen 7 dominios transmembrana en la superficie de los leucocitos. Hasta la fecha se han caracterizado aproximadamente 19 receptores de la quimioquina diferentes, que se dividen en cuatro familias en funcion del tipo de que enlazan; CXCR, que se enlazan a las quimioquinas CXC, CCR, que se enlazan a las quimioquinas CC, CX3CR1, que se enlaza a la quimioquina CX3C unica (CX3CL1) y XCR1 que se enlazan a las dos quimioquinas XC (XCL1 y XCL2).

En general, la "sefalizacion celular inducida por quimioquinas" se refiere a la capacidad que tienen los receptores de la quimioquina para asociarse a las proteinas G con el fin de transmitir las sefales celulares tras el enlace del ligando. La activacion de las proteinas G mediante los receptores de la quimioquina provoca la posterior activacion de la fosfolipasa C (PLC). La PLC escinde un fosfatidilinositol-4,5-bifosfato (PIP2) en dos segundas moleculas mensajeras, trifosfato de inositol (IP3) y diacilglicerol (DAG), que desencadenan eventos de sefalizacion intracelulares; el DAG activa otra enzima denominada proteina quinasa C (PKC) e IP3 desencadena la liberacion de calcio desde los almacenes intracelulares. Estos eventos promueven la sefalizacion en cascada, como la via de las MAP quinasas, la cual genera respuestas que incluyen quimiotaxias, desgranulacion, liberacion de aniones superoxido y cambios en la avidez de las moleculas de adhesion celular, como las integrinas, en el interior de la celula que alberga el receptor de la quimioquina.

El termino "marcador" o "biomarcador" hace referencia a un acido nucleico que se expresa en una celula y que resulta util para proporcionar un pronostico de esclerosis multiple recurrente-remitente (EMRR) en un paciente tratado con IVIG. Algunos de los biomarcadores que se describen aqui son moleculas que se encuentran sobreexpresadas en individuos con cuadro de esclerosis multiple recurrente-remitente (EMRR) tratados con IVIG, en comparacion con individuos no tratados con IVIG o con pacientes de EMRR con anterioridad a su tratamiento con IVIG, por ejemplo, sobreexpresion de factor 1, sobreexpresion de factor 2, sobreexpresion de factor 3, o mas. Alternativamente, otros biomarcadores son moleculas infraexpresadas en individuos con cuadros de esclerosis multiple recurrente-remitente (EMRR) tratados con IVIG, en comparacion con los individuos no tratados con IVIG o con los pacientes de EMRR con anterioridad a su tratamiento con IVIG, por ejemplo, sobreexpresion de factor 1, sobreexpresion de factor 2, sobreexpresion de factor 3, o mas. Asimismo, un marcador puede ser una molecula sintetizada inadecuadamente en individuos que presentan esclerosis multiple recurrente-remitente (EMRR) tratados con IVIG, en comparacion con los individuos no tratados con IVIG o con los pacientes de EMRR con anterioridad a su tratamiento con IVIG, por ejemplo, una molecula que contenga deleciones, adiciones o mutaciones, en comparacion con la molecula expresada en una celula normal.

Cualquier experto en la materia comprendera que los marcadores pueden utilizarse de forma aislada o en combinacion con otros marcadores para cualquiera de los usos recomendados, por ejemplo, el pronostico del tratamiento con IVIG de la esclerosis multiple recurrente-remitente (EMRR) que se describe en el presente documento.

"Muestra biologica" incluye muestras de fluidos biologicos, como sangre y liquido cerebroespinal, secciones de tejidos, como muestras procedentes de biopsias y autopsias, y secciones congeladas tomadas con fines histologicos. Dichas muestras incluyen sangre y fracciones o derivados sanguineos (por ejemplo, suero, plasma, plaquetas, globulos rojos y similares), fluido cerebroespinal, esputos, fluido cervico-vaginal, linfa y tejidos procedentes de la lengua, celulas cultivadas, por ejemplo, cultivos primarios, explantes, y celulas transformadas, heces, orina, etc. Las muestras biologicas suelen obtenerse de organismos eucarioticos, preferiblemente de mamiferos como primates, por ejemplo, chimpances o seres humanos, vacas, perros, gatos, roedores, por ejemplo, cobayas, ratas, ratones, conejos; o pajaros, reptiles o peces.

Los terminos "sobreexpresar", "sobreexpresion" o "sobreexpresado" o "sobrerregulado" hacen referencia a un acido nucleico (ARN) que se transcribe a un nivel detectablemente superior, en general en caso de aquellos pacientes que padecen esclerosis multiple recurrente-remitente (EMRR) y reciben tratamiento con IVIG, en comparacion con un paciente no sometido a tratamiento con IVIG. El termino incluye la sobreexpresion debida a la transcripcion comparada con un control. La sobreexpresion puede detectarse utilizando tecnicas convencionales para la deteccion de ARNm (es decir, RTPCR, PCR, hibridacion). La sobreexpresion puede ser del 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o superior, en comparacion con una celula normal. En determinados casos, la sobreexpresion es superior en 1, 2, 3, 4 o mas niveles de transcripcion o traduccion en comparacion con un control.

Los terminos "infraexpresar", "infraexpresion" o "infraexpresado" o "reducido" se refieren indistintamente a un acido nucleico que se transcribe a un nivel detectablemente inferior, en general en un paciente que padezca una esclerosis multiple recurrente-remitente (EMRR) tratada con IVIG, en comparacion con un paciente que no este sometido al tratamiento con IVIG. El termino incluye la infraexpresion debida a la transcripcion y la estabilidad del ARN en comparacion con un control. La infraexpresion puede detectarse recurriendo a tecnicas convencionales para la deteccion de ARNm (es decir, RTPCR, PCR, hibridacion). La infraexpresion puede ser del 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o inferior, en comparacion con un control. En determinados casos, la infraexpresion es superior en 1, 2, 3, 4 o mas niveles de transcripcion o traduccion en comparacion con un control.

En el contexto de la presente invencion En general, el termino "diferencialmente expresado" o "diferencialmente regulado" se refiere a un acido nucleico que esta sobreexpresado (aumentado) o infraexpresado (reducido) en una muestra comparada con al menos otra muestra, por lo general en el caso de un paciente de esclerosis multiple recurrente-remitente (EMRR) tratada con IVIG en comparacion con un paciente no sometido a tratamiento con IVIG.

"Tratamiento terapeutico" se refiere a una terapia mediante farmacos, a una terapia hormonal, a una inmunoterapia y a una terapia biologica (dirigida).

En el presente documento, por "cantidad o dosis terapeuticamente efectiva" o "cantidad o dosis suficiente" se entiende una dosis que produce los efectos para los cuales se ha administrado. La dosis exacta dependera de la finalidad del tratamiento y podra ser calculada por cualquier experto en la materia recurriendo a tecnicas conocidas (vease, por ejemp/o, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); y Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott,Williams & Wilkins).

Los terminos "identico" o "identidad" porcentual en el contexto de dos o mas acidos nucleicos o secuencias polipeptidos se refieren a dos o mas secuencias o subsecuencias que son la misma o que tienen un porcentaje especificado de residuos aminoacidos o nucleotidos que son iguales (es decir, en torno a una identidad del 60%, y preferiblemente del 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o superior con respecto a una region especificada, cuando se compara y alinea para una maxima correspondencia con respecto a una ventana de comparacion o region designada) cuando se mide utilizando algoritmos de comparacion de secuencias BLAST o BLAST

2.0 con los parametros predeterminados que se describen a continuacion, o mediante alineacion manual e inspeccion visual (vease, por ejemp/o, la pagina web del NCBI http://www.ncbi.nim.nih.gov/BLAST/ o similares). En ese caso, se dice que dichas secuencias son "sustancialmente identicas". Esta definicion se refiere -o puede aplicarse- tambien al complemento de una secuencia de ensayo. La definicion tambien incluye secuencias donde se han eliminado e insertado elementos, asi como aquellas donde se han introducido sustituciones. Como se describe seguidamente, los algoritmos preferidos pueden tener en cuenta carencias y similares. Preferiblemente existe una identidad a lo largo de una region cuya longitud es de al menos 25 aminoacidos o nucleotidos, o mas preferiblemente en una region cuya longitud oscila entre 50 y 100 aminoacidos o nucleotidos.

A la hora de comparar las secuencias, normalmente una secuencia actua como secuencia de referencia con la que se comparan las secuencias a comprobar. Cuando se utiliza un algoritmo de comprobacion de secuencias, las secuencias de comprobacion y de referencia se introducen en un ordenador, se designan las coordenadas de subsecuencia, si fuese necesario, y se designan los parametros del programa de algoritmo de secuencia. Preferiblemente, pueden utilizarse los parametros predeterminados del programa, aunque pueden designarse parametros alternativos. A continuacion, el algoritmo de comparacion de secuencia calcula los porcentajes de identidad de secuencia correspondientes a las secuencias de prueba en comparacion con la secuencia de referencia en funcion de los parametros del programa.

Tal y como se utiliza en este documento, una "ventana de comparacion" incluye la referencia a un segmento de cualquiera de las diversas posiciones contiguas seleccionadas de entre el grupo consistente entre 20 y 600, en general de entre 50 y 200, mas habitualmente entre 100 y 150 aproximadamente, donde una secuencia se puede comparar con una secuencia de referencia con el mismo numero de posiciones contiguas, despues de que las dos secuencias se hayan alineado de forma optima. Los metodos de alineacion de secuencias para su comparacion son bien conocidos en la tecnica. La alineacion optima de secuencias para su comparacion puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el algoritmo local de homologia de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento de homologia de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante el metodo de busqueda de similitudes de Pearson y Lipman, Proc. Nat'l. Acad Sci. USA 85:2444 (1988), mediante implementaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el paquete de software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante alineamiento manual e inspeccion visual (vease, por ejemp/o, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1987-2005, Wiley Interscience)).

Un ejemplo de algoritmo preferido que resulta idoneo para determinar el porcentaje de identidad de la secuencia y similitud de la secuencia lo constituyen los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul y col., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977) y Altschul y col., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), respectivamente. BLAST y BLAST

2.0 se utilizan, con los parametros que aqui se describen, para determinar el porcentaje de identidad de secuencia correspondiente a los acidos nucleicos y proteinas de la invencion. El software para realizar los analisis BLAST es publico de National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nhn.nih.gov/). Este algoritmo implica, primero, la identificacion de pares de secuencias de alta puntuacion (HSPs) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta que se ajustan o satisfacen una puntuacion T umbral valorada positivamente al alinearse con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. Se denimona "T" al umbral de puntuacion de palabra adyacente (Altschul y col., vease mas arriba). Estas coincidencias de palabras adyacentes iniciales actuan como semilla para iniciar busquedas de HSPs mas largos que las contengan. Las coincidencias de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia, en la medida en que puede aumentarse la puntuacion de alineamiento acumulada. Las puntuaciones acumuladas se calculan utilizando, para las secuencias de nucleotidos, los parametros M (puntuacion de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre > 0) y N (puntuacion de penalizacion para residuos no coincidentes; siempre < 0). Para las secuencias de aminoacidos, se utiliza una matriz de puntuacion para calcular la puntuacion acumulada. La extension de las coincidencias de palabras en ambas direcciones se detiene cuando: la puntuacion de alineamiento acumulada desciende en una cantidad X con respecto a su valor maximo alcanzado; la puntuacion acumulada pasa a ser cero o inferior, debido a la acumulacion de una o mas alineaciones de residuos de puntuacion negativa; o cuando se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parametros del algoritmo BLAST W, T, y X determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleotidos) utiliza como valores predeterminados una longitud de palabra (W) de 11, una esperanza (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparacion de ambas cadenas. Para secuencias de aminoacidos, el programa BLASTP usa como valores por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una esperanza (E) de 10, y la matriz de puntuacion BLOSUM62 (vease Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:10915 (1989)) unas alineaciones (B) de 50, una esperanza (E) de 10, M=5, N=-4, y una comparacion de ambas cadenas.

"Acido nucleico" se refiere a desoxirribonucleotidos o ribonucleotidos y sus polimeros, en forma de cadena sencilla o doble, asi como a sus complementos. El termino incluye acidos nucleicos que contiene analogos conocidos de nucleotidos o residuos o enlaces modificados de la estructura que son sinteticos, de origen natural y de origen no natural, con unas propiedades de enlace similares a las del acido nucleico de referencia, y que se metabolizan de forma similar a la de los nucleotidos de referencia. Entre los ejemplos de dichos analogos se encuentran, sin limitacion, fosforotioatos, fosforoamidatos, metilfosfonatos, metilfosfonatos quirales, 2-O-metilribonucleotidos, acidos peptidonucleicos (APNs).

"Molecula ARNi" o "ARNsi" se refiere a un acido nucleico que forma un ARN de doble cadena, donde dicho ARN de doble cadena tiene la capacidad de reducir o inhibir la expresion de un gen o una diana cuando el ARNsi se expresa en la misma celula que el gen o gen diana. Asi pues, "ARNsi" se refiere al ARN de doble cadena formado por las cadenas complementarias. Las partes complementarias del ARNsi que se hibridan para formar la molecula de doble cadena suelen gozar de una identidad sustancial o completa. En una realizacion, un ARNsi se refiere a un acido nucleico que presenta una identidad sustancial o completa con un gen diana y que forma un ARNsi de doble cadena. La secuencia del ARNsi puede corresponder al gen diana de longitud total o a una subsecuencia del mismo. Normalmente, el ARNsi tiene una longitud de al menos 15 a 50 nucleotidos (por ejemplo, cada secuencia complementaria del ARNsi de doble cadena tiene una longitud de 15 a 50 nucleotidos y el ARNsi de doble cadena tiene una longitud de en torno a 15-50 pares de bases, preferiblemente en torno a 20-30 nucleotidos base, preferiblemente en torno a 20-25 nucleotidos de longitud, por ejemplo una longitud de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 nucleotidos.

Un polinucleotido "antisentido" es un polinucleotido sustancialmente complementario a un polinucleotido diana y que tiene la capacidad de hibridarse especificamente con el polinucleotido diana.

Las ribozimas son moleculas enzimaticas de ARN que pueden catalizar una escision especifica del ARN. La composicion de las moleculas de ribozima incluye preferiblemente una o mas secuencias complementarias de un ARNm, y la secuencia catalitica, perfectamente conocida, responsable de la escision del ARNm, o una secuencia funcionalmente equivalente (vease, por ejemplo, la US N° 5.093.246, incorporada en su totalidad a este documento por referencia). Las moleculas de ribozima disefadas para escindir cataliticamente los transcriptos de ARNm tambien pueden utilizarse para impedir la traduccion de los ARNm diana.

A menos que se indique en otro sentido, una secuencia especifica de acido nucleico tambien incluye implicitamente variantes de la misma modificadas de forma conservativa (por ejemplo, sustitutos de codones degenerados) y secuencias complementarias, asi como la secuencia explicitamente indicada. Concretamente, las sustituciones de codones degenerados pueden llevarse a cabo mediante la generacion de secuencias donde la tercera posicion de uno o mas (o la totalidad) de los codones seleccionados se sustituye por residuos de base mixta y/o de desoxinosina (Batzer y col., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka y col., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini y col., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). El termino acido nucleico se utiliza indistintamente con los terminos gen, ADNc, ARNm, oligonucleotido y polinucleotido.

Una secuencia especifica de acido nucleico tambien incluye implicitamente "variantes empalmadas" y secuencias de acido nucleico que codifican formas truncadas de una proteina. Igualmente, una proteina especifica codificada por un acido nucleico incluye de forma implicita cualquier proteina codificada mediante una variante empalmada o forma truncada de dicho acido nucleico. "Variantes empalmadas", como su propio nombre sugiere, son productos de empalme alternativo de un gen. Tras la transcripcion, un transcripto inicial de acido nucleico puede empalmarse de forma que los diferentes productos empalmados (alternativos) de acido nucleico codifican distintos polipeptidos. Los mecanismos para la produccion de variantes empalmadas varian, pero incluyen el empalme alternativo de los exones. Los polipeptidos alternativos obtenidos a partir del mismo acido nucleico mediante transcripcion de lectura completa tambien se incluyen en esta definicion. Todos los productos pertenecientes a una reaccion de empalme, incluyendo las formas recombinantes de los productos empalmados, quedan incluidos en esta definicion. Los acidos nucleicos pueden truncarse en el extremo 5' o en el extremo 3'. Los polipeptidos pueden truncarse en el Terminal N o en el Terminal C. Las versiones truncadas del acido nucleico o de las secuencias de polipeptidos pueden darse en estado natural u obtenerse por recombinacion.

Los terminos "polipeptido", "peptido" y "proteina" se utilizan indistintamente en este documento para referirse a un polimero de residuos aminoacidos. Los terminos son de aplicacion a los polimeros de aminoacidos donde uno o mas de los residuos aminoacidos es un producto quimico artificial mimetico del correspondiente aminoacido de origen natural, asi como polimeros de aminoacidos de origen natural y polimeros de aminoacido de origen no natural.

El termino "aminoacido" se refiere a aminoacidos de origen natural y sinteticos, asi como a aminoacidos analogos y aminoacidos mimeticos que funcionan de forma similar a la de los aminoacidos de origen natural. Los aminoacidos de origen natural son aquellos codificados por el codigo genetico, asi como aquellos aminoacidos modificados con posterioridad, por ejemplo, hidroxiprolina, y-carboxiglutamato y O-fosfoserina. El termino analogos de aminoacidos se refiere a compuestos que poseen la misma estructura quimica basica de un aminoacido de origen natural, es decir un carbono alfa unido a un hidrogeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo homoserina, norleucina, sulfoxido de metionina o metionina metil sulfonio. Dichos analogos presentan grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o esqueletos peptidicos modificados, aunque conservan la misma estructura quimica basica que un aminoacido de origen natural. El termino mimetico de aminoacidos se refiere a compuestos quimicos que tienen una estructura diferente a la estructura quimica general de un aminoacido pero que funcionan de forma similar a un aminoacido de origen natural.

Aqui puede hacerse referencia a los aminoacidos por sus simbolos de tres letras bien conocidos o por los simbolos de una letra recomendados por la Comision de Nomenclatura de Bioquimica de la IUPAC-IUB. Igualmente, puede hacerse referencia a los nucleotidos mediante sus codigos de una sola letra habitualmente aceptados.

El termino "Variantes modificadas de forma conservativa" se aplica tanto a las secuencias de aminoacidos como a las de acidos nucleicos. En lo que respecta a las secuencias de acido nucleico especificas, el termino variantes modificadas de forma conservativa se refiere a aquellos acidos nucleicos que codifican secuencias de aminoacidos identicas o esencialmente identicas o, cuando el acido nucleico no codifica una secuencia de aminoacidos, a las secuencias esencialmente identicas. Teniendo en cuenta la degeneracion del codigo genetico, un gran numero de acidos nucleicos funcionalmente identicos genera cualquier proteina dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos ellos el aminoacido alanina. Asi, en todas las posiciones en las cuales una alanina esta especificada mediante un codon, el codon puede alterarse conforme a cualquiera de los correspondientes codones descritos sin alterar el polipeptido codificado. Dichas variaciones del acido nucleico son "variaciones silenciosas", que constituyen una especie de variante modificada de forma conservativa. Cada una de las secuencias de acido nucleico descritas en este documento que codifica un polipeptido tambien describe todas las posibles variaciones silenciosas del acido nucleico. Cualquier experto en la materia reconocera que todos los codones de un acido nucleico (a excepcion del AUG, que suele ser el unico codon de la metionina, y del TGG, que suele ser el unico codon del triptofano) pueden modificarse para obtener una molecula funcionalmente identica. De este modo, todas las variaciones silenciosas de un acido nucleico que codifica un polipeptido se encuentran implicitas en cada una de las secuencias descritas con respecto al producto de expresion, pero no con respecto a las secuencias cebadoras reales.

En lo que se refiere a la secuencia de aminoacidos, el experto en la materia observara que todas las sustituciones, eleciones o adiciones realizadas individualmente en un acido nucleico, peptido, polipeptido o en una secuencia proteinica que alteren, afadan o eliminen un solo aminoacido o un pequefo porcentaje de aminoacidos de la secuencia codificada se consideran una "variante modificada conservada" donde la alteracion tiene como resultado la sustitucion de un aminoacido por un aminoacido quimicamente similar. En la tecnica son bien conocidas las tablas de sustitucion conservadora que proporcionan aminoacidos funcionalmente similares. Dichas variantes modificadas conservadas complementan, pero no excluyen, las variantes polimorficas, homologos interespecie y alelos de la invencion.

Los ocho grupos siguientes contienen aminoacidos que pueden sustituirse entre si de forma conservadora: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Acido aspartico (D), Acido glutamico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (0); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenillalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); y 8) Cisteina (C), Metionina (M). vease, por ejemp/o, Creighton, Proteins (1984).

Una "etiqueta" o "fraccion detectable" es una composicion detectable a traves de medios espectroscopicos, fotoquimicos, bioquimicos, inmunuquimicos, quimicos u otros medios fisicos. Por ejemplo, las etiquetas utiles incluyen32P, tintes fluorescentes, reactivos densos de electrones, enzimas (por ejemplo las que suelen utilizarse habitualmente en los ensayos ELISA), biotina, digoxigenina o haptenos y proteinas que pueden hacerse detectables, por ejemplo, por la incorporacion de una radioetiqueta en el peptido, o que pueden utilizarse para la deteccion de anticuerpos especificamente reactivos con el peptido.

El termino "recombinante", cuando se utiliza haciendo referencia, por ejemplo, a una celula o a un acido nucleico, proteina o vector, indica que la celula, el acido nucleico, la proteina o el vector han sido modificados mediante la introduccion de un acido nucleico o proteina heterologos o mediante la alteracion de un acido nucleico o proteina nativos, o que la celula se ha obtenido a partir de una celula asi modificada. De este modo, por ejemplo, las celulas recombinantes expresan genes que no se encuentran en la forma nativa (no-recombinante) de la celula, o expresan genes nativos que se expresan de forma anormal, o que estan infraexpresados o no expresados en absoluto.

La frase "condiciones de hibridacion estrictas" se refiere a las condiciones en las que una sonda se hibridara conforme a su subsecuencia objetivo, normalmente en una mezcla compleja de acidos nucleicos, pero no conforme a otras secuencias. Las condiciones estrictas son dependientes de la secuencia y seran diferentes en diferentes circunstancias: las secuencias mas largas se hibridan especificamente a temperaturas mas elevadas. Puede encontrarse una amplia guia sobre la hibridacion de los acidos nucleicos en Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). En general, las condiciones estrictas seleccionadas son una temperatura entre 5 y 10°C inferior a la del punto de fusion termica (Tm) para la secuencia especifica con una fuerza ionica y un pH definidos. Tm es la temperatura (bajo una fuerza ionica, pH, y concentracion de acidos nucleicos definidos) a la cual el 50% de las sondas complementarias con la secuencia diana se hibridan con la secuencia diana en equilibrio (como las secuencias diana estan en general presentes en exceso, en Tm, el 50% de las sondas estan ocupadas en equilibrio). Se pueden lograr tambien condiciones estrictas con la adicion de agentes desestabilizantes, tales como formamida. Para una hibridacion selectiva o especifica, una sefal positiva es tipicamente al menos dos veces la hibridacion de fondo, preferentemente 10 veces la hibridacion de fondo. Entre los ejemplos de condiciones estrictas de hibridacion pueden citarse los siguientes: 50% formamida, 5x SSC y 1 % SDS, incubacion a 42°C o 5x SSC, 1% SDS, incubacion a 65°C, con lavado en 0,2 x SSC y 0,1% SDS a 65°C.

Los acidos nucleicos que no se hibridan entre si en condiciones estrictas siguen siendo sustancialmente identicos en el caso de que los polipeptidos que codifican sean sustancialmente identicos. Esto sucede, por ejemplo, cuando se crea una copia de un acido nucleico utilizando la maxima degeneracion del codon permitida por el codigo genetico. En estos casos, los acidos nucleicos suelen hibridarse en condiciones de hibridacion moderadamente estrictas. Entre los ejemplos de "condiciones de hibridacion moderadamente estrictas" se encuentra una hibridacion en solucion tampon de formamida al 40%, NaCI 1M, SDS al 1% a 37°C y lavado en 1X SSC a 45°C. Una hibridacion positiva es al menos dos veces la hibridacion de fondo. Cualquier experto en la materia se dara cuenta rapidamente de que pueden utilizarse condiciones alternativas de hibridacion y lavado para aportar condiciones similarmente estrictas. Pueden encontrarse directrices complementarias para la determinacion de los parametros de hibridacion en numerosas referencias, asi como en Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel u col., anteriormente citado.

Para la PCR, una temperatura de aproximadamente 36°C es tipica para una amplificacion en condiciones poco estrictas, aunque las temperaturas de apareamiento pueden variar entre aproximadamente 32 y 48°C, dependiendo de la longitud de los cebadores. Para una amplificacion PCR de alto rigor, es tipica una temperatura de aproximadamente 62°C, aunque las temperaturas de apareamiento de alto rigor pueden estar comprendidas entre aproximadamente 50°C y aproximadamente 65°C, dependiendo de la longitud de los cebadores y la especificidad. Las condiciones tipicas de los ciclos de amplificacion tanto de alto como de bajo rigor incluyen una fase de desnaturalizacion de entre 90°C y 95°C durante un periodo variable de entre 30 segundos y 2 min., una fase de apareamiento de entre 30 segundos y 2 minutos y una fase de extension de aproximadamente 72°C que dura entre 1 y 2 minutos. Los protocolos y las directrices para las reacciones de amplificacion de bajo y alto rigor estan disponibles, por ejemplo, en Innis y col. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Application Academic Press, N.Y.

Los acidos nucleicos de los genes diferencialmente expresados de la presente invencion o de sus polipeptidos codificados se refieren a todos los tipos de acidos nucleicos (por ejemplo genes, pre-ARNm, ARNm) o proteinas, sus variantes polimorficas, alelos, mutantes y homologos interespecies que (en relacion con el acido nucleico o la proteina):

(1)

incluyen una secuencia de aminoacidos con una identidad de secuencia de aminoacidos superior al 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, y preferiblemente una identidad de secuencia del 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o superior, preferiblemente en una region de al menos unos 25, 50, 100, 200, 500, 1.000 o mas aminoacidos, a un polipeptido codificado por un acido nucleico de referencia o una secuencia de aminoacidos descrita en este documento;

(2)

se unen especificamente a anticuerpos, por ejemplo anticuerpos policlonales levantados contra un inmunogen que comprende una secuencia de aminoacidos referenciada, fragmentos inmunogenicos de la misma y sus variantes modificadas conservadas; (3) se hibridan especificamente en condiciones estrictas de hibridacion con un acido nucleico que codifica una secuencia de aminoacidos referenciada y sus variantes modificadas de forma conservada; (4) tienen una secuencia de acido nucleicos cuya identidad de secuencia de nucleotidos es mayor a aproximadamente un 95%, preferiblemente superior a aproximadamente un 96%, 97%, 98%, 99%, o superior, preferiblemente en una region de al menos 25, 50, 100, 200, 500, 1.000 o mas nucleotidos, a la correspondiente a una secuencia de acido nucleico de referencia. Una secuencia de polinucleotido o polipeptido suele proceder de un mamifero, incluyendo, sin limitacion, primates, por ejemplo seres humanos, roedores, como, ratas, ratones, hamsters; vacas, cerdos, caballos, ovejas o cualquier mamifero. Los acidos nucleicos y proteinas de la invencion incluyen tanto moleculas de origen natural como recombinantes. La definicion tambien incluye las formas de estos antigenos truncadas y empalmadas de forma alternativa.

La frase "se une especificamente (o selectivamente)" en referencia a un acido nucleico se refiere a una reaccion de enlace que es determinante de la presencia del acido nucleico, como los genes diferencialmente expresados de la presente invencion, a menudo en presencia de una poblacion heterogenea de acidos nucleicos y otros productos biologicos.

"Determinacion del efecto funcional" significa la realizacion de ensayos para determinar un compuesto que incrementa o disminuye un parametro que se encuentra directa o indirectamente bajo la influencia de un biomarcador conforme a la invencion, por ejemplo la medida de los efectos fisicos, quimicos o fenotipicos. Dichos efectos funcionales pueden medirse por cualquier metodo conocido por los expertos en la materia, por ejemplo cambios en las caracteristicas espectroscopicas (como fluorescencia, absorbencia, indice de refraccion); hidrodinamicas (por ejemplo, forma), cromatograficas; o propiedades de solubilidad de la proteina; ensayos de enlace de ligando, por ejemplo, union con anticuerpos; medicion de marcadores inducibles o activacion transcripcional del marcador; medicion de los cambios experimentados en la actividad enzimatica; capacidad de aumentar o reducir la proliferacion celular, apoptosis, detencion del ciclo celular, medicion de los cambios observados en los marcadores de la superficie celular. Los efectos funcionales pueden evaluarse de acuerdo con multiples metodos conocidos por el experto en la materia, por ejemplo, microscopia, para la realizacion de medidas cuantitativas o cualitativas de las alteraciones de las caracteristicas morfologicas, la medicion de cambios en los niveles de ARN o de proteina para otros genes expresados en celulas sensibles a la quimioquina, la medicion de la estabilidad del ARN, la identificacion de la expresion del gen posterior o gen indicador (CAT, luciferasa, n-gal, GFP y similares), por ejemplo, por quimioluminiscencia, fluorescencia, reacciones colorimetricas, enlaces de anticuerpos, marcadores inducibles, etc.

Los terminos "Inhibidores", "activadores" y "moduladores" de los marcadores se utilizan para referirse a la activacion, inhibicion o modulacion de las moleculas identificadas utilizando ensayos in vitro e in vivo de biomarcadores sensibles al tratamiento mediante IVIG de la esclerosis multiple recurrente-remitente (EMRR). Los inhibidores son compuestos que, por ejemplo, se unen a, bloquean total o parcialmente la actividad de, disminuyen, impiden, demoran la activacion, desactivan, desensibilizan o reducen la actividad o expresion de biomarcadores sensibles al tratamiento mediante IVIG de la esclerosis multiple recurrente-remitente (EMRR). "Activadores" son aquellos compuestos que aumentan, abren, activan, facilitan, mejoran la activacion, sensibilizan, agonizan, o regulan al alza la actividad de los biomarcadores sensibles al tratamiento mediante IVIG de la esclerosis multiple recurrente-remitente (EMRR), por ejemplo, agonistas. Los inhibidores, activadores o moduladores tambien incluyen versiones geneticamente modificadas de los biomarcadores sensibles al tratamiento mediante IVIG de la esclerosis multiple recurrente-remitente (EMRR), por ejemplo, versiones con actividad alterada, asi como ligandos de origen natural y sintetico, antagonistas, agonistas, anticuerpos, peptidos, peptidos ciclicos, acidos nucleicos, moleculas antisentido, ribozimas, moleculas ARNi, pequefas moleculas organicas y similares. Dichos ensayos de inhibidores y activadores incluyen, por ejemplo, la expresion de biomarcadores sensibles a la IVIG. El tratamiento de la esclerosis multiple recurrente-remitente (EMRR) in vitro, en celulas o extractos de celulas, la aplicacion de compuestos moduladores putativos y la posterior determinacion de los efectos funcionales sobre la actividad, como se ha descrito anteriormente.

Se compara una serie de muestras o ensayos que comprenden biomarcadores que responden al tratamiento mediante IVIG de la esclerosis multiple recurrente-remitente (EMRR), y que han sido tratadas con un activador, inhibidor o modulador potencial, con muestras de control sin el activador, inhibidor o modulador, para examinar el alcance de la inhibicion. A las muestras de control (no tratadas con inhibidores) se les asigna un valor relativo de actividad de la proteina del 100%. La inhibicion de los biomarcadores sensibles al tratamiento mediante IVIG de la esclerosis multiple recurrente-remitente (EMRR) se logra cuando el valor de la actividad, comparado con el producto de control, se situa en torno al 80%, preferiblemente en el 50%, mas preferiblemente entre un 25% y un 0%. La activacion de los biomarcadores sensibles al tratamiento mediante IVIG de la esclerosis multiple recurrente-remitente (EMRR) se logra cuando el valor de la actividad, comparado con el producto de control (sin tratar mediante activadores) es superior en un 110%, mas preferiblemente en un 150%, mas preferiblemente del 200-500% (es decir, de dos a cinco veces mas elevada en comparacion con el producto de control), y mas preferiblemente en un 1.000-3.000%.

El termino "compuesto de ensayo" o "farmaco candidato" o "modulador" o sus equivalentes gramaticales, tal y como se utilizan en este documento, describe cualquier molecula de origen natural o sintetico, por ejemplo, en el caso de una proteina, oligopeptido (por ejemplo, con una longitud de entre 5 y aproximadamente 25 aminoacidos, preferiblemente entre 10 y 20 o 12 y 18 aminoacidos de longitud y preferiblemente con una longitud de 12, 15, o 18 aminoacidos), pequefas moleculas organicas, polisacaridos, peptidos, peptidos circulares, lipidos, acidos grasos, ARNsi, polinucleotidos, oligonucleotidos, etc; cuya capacidad para modular directa o indirectamente los biomarcadores que responden al tratamiento mediante IVIG de la esclerosis multiple recurrente-remitente (EMRR) va a comprobarse. El compuesto de ensayo puede presentarse en forma de liberria de compuestos de ensayo, como una libreria combinatoria o aleatorizada que facilite un grado de diversidad suficiente. Opcionalmente, los compuestos de ensayo se unen a un socio de fusion, por ejemplo, compuestos diana, compuestos de rescate, compuestos de dimerizacion, compuestos de estabilizacion, compuestos direccionables y otras fracciones funcionales. Convencionalmente, las nuevas entidades quimicas con propiedades utiles se generan mediante la identificacion de un compuesto de ensayo (denominado un "compuesto de partida") con algunas propiedades o actividades deseables, por ejemplo, actividad inhibidora, creacion de variantes del compuesto de partida, y evaluacion de las propiedades y de la actividad de dichas variantes del compuesto. Frecuentemente se utilizan para dicho analisis metodos de screening (cribado) de alto rendimiento (HTS).

"Molecula organica pequefa" se refiere a una molecula organica de origen natural o sintetico con un peso molecular superior a aproximadamente 50 dalton e inferior a aproximadamente 2.500 dalton, preferiblemente inferior a unos 2.000 dalton y mas preferiblemente de entre 100 y unos 1.000 dalton, en especial de de entre 200 y 500 dalton.

M�TODOS DE PRONOSTICO

La presente invencion facilita metodos para facilitar un pronostico del tratamiento con IVIG de la esclerosis multiple, incluyendo esclerosis multiple recurrente-remitente (EMRR), por deteccion de la expresion de marcadores sobreexpresados o infraexpresados en pacientes tratados con IVIG. La facilitacion de un pronostico implica la determinacion del nivel de uno o mas polinucleotidos biomarcadores sensibles a las IVIG en un paciente o muestra de un paciente, y su posterior comparacion con una linea o rango de referencia. Normalmente, el valor de referencia es representativo de los niveles del acido nucleico en un paciente que padezca esclerosis multiple recurrente-remitente (EMRR) con anterioridad al tratamiento con IVIG treatment, medidos utilizando una muestra biologica, como una muestra de fluido corporal (por ejemplo sangre o liquido cerebroespinal). La variacion de los niveles de un polinucleotido conforme a la invencion, con respecto a la linea de referencia (bien al alza o a la baja) indica que el paciente esta sometiendose ventajosamente al tratamiento mediante IVIG de la esclerosis multiple recurrente-remitente (EMRR).

Tal como se utiliza en este documento, el termino "facilitar un pronostico" se refiere a facilitar una prediccion del probable curso y resultado del tratamiento de un paciente que padezca esclerosis multiple, incluyendo esclerosis multiple recurrente-remitente (EMRR), con IVIG. Los metodos tambien pueden utilizarse para disefar una terapia alternativa o adicional para el tratamiento de la esclerosis multiple, incluyendo esclerosis multiple recurrente-remitente (EMRR). por ejemplo mediante la indicacion del fallo del tratamiento con IVIG para aliviar la esclerosis multiple, incluyendo esclerosis multiple recurrente-remitente (EMRR). El pronostico puede tambien utilizarse para ajustar la dosis

o la frecuencia de administracion de la IVIG.

Pueden utilizarse moleculas que se unen al acido nucleico como sondas, oligonucleotidos, matrices de oligonucleotidos y cebadores para detectar la expresion del ARN diferencial en las muestras de los pacientes, por ejemplo por RT-PCR. En una realizacion, se utiliza una RT-PCR de acuerdo con los metodos estandar conocidos en la tecnica. En otra realizacion, pueden utilizarse ensayos PCR, como los ensayos Taqman® disponibles, por ejemplo, de Applied Biosystems, para detectar acidos nucleicos y sus variantes. En otras realizaciones pueden utilizarse micromatrices qPCR y de acido nucleico para detetar los acidos nucleicos. Los reactivos que se unen a los biomarcadores seleccionados pueden obtenerse de acuerdo con metodos conocidos por el experto en la materia o adquirirse en el comercio.

El analisis de los acidos nucleicos puede llevarse a cabo recurriendo a tecnicas rutinarias, como analisis Southern, reaccion en cadena de la polimerasa-transcriptasa inversa (RT-PCR) o cualquier otro metodo basado en la hibridacion de una secuencia de acido nucleico complementaria de una parte de la secuencia codificadora del marcador (por ejemplo, hibridacion de transferencia por ranuras o slot blot) que tambien se encuentre dentro del ambito de la presente invencion. Las tecnicas de amplificacion PCR aplicables se describen, por ejemplo, en Ausubel y col. e Innis y col., mencionados mas arriba. Se describen metodos generales de hibridacion de acidos nucleicos en Anderson, "Nucleic Acid Hybridization", BIOS Scientific Publishers, 1999. Tambien se puede llevar a cabo la amplificacion o la hibridacion de una pluralidad de secuencias de acido nucleico (por ejemplo, ADN genomico, ARNm o ADNc) a partir de secuencias de ARNm o ADNc dispuestas en una micromatriz. Los metodos de micromatriz se describen en general en Hardiman, "Microarrays Methods and Applications: Nuts & Bolts", DNA Press, 2003; y en Baldi y col., "DNA Microarrays and Gene Expression: From Experiments to Data Analysis and Modeling", Cambridge University Press, 2002.

El analisis de los marcadores de acidos nucleicos y sus variantes puede llevarse a cabo por tecnicas conocidas en el sector, incluyendo, sin limitacion, micromatrices, analisis basados en la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), analisis de secuencias y analisis electroforeticos. Un ejemplo no limitativo de analisis basado en la PCR incluye un ensayo de discriminacion alelica Taqman® disponible de Applied Biosystems. Entre los ejemplos no limitativos de analisis de secuencias destacan la secuenciacion de Maxam-Gilbert, la secuenciacion de Sanger, la secuenciacion de ADN en matrices capilares, la secuenciacion de ciclo termico (Sears y col., Biotechniques, 13:626-633 (1992)), la secuenciacion en fase solida (Zimmerman y col., Methods Mol. Cell Biol., 3:39-42 (1992)), la secuenciacion con espectrometria de masas, como Ionizacion SELDI, ionizacion laser inducida en superficie, ionizacion por espectrometria de masas, ionizacion por desorcion laser asistida por una matriz con un analizador de tiempo de vuelo; (MALDITOF/EM; Fu y col., Nat Biotechnol., 16:381-384 (1998)), y la secuenciacion por hibridacion, Chee y col., Science, 274:610-614 (1996); Drmanac y col., Science, 260:1649-1652 (1993); Drmanac y col., Nat. Biotechnol., 16:54-58 (1998). Entre los ejemplos no limitativos de analisis electroforetico se incluye la electroforesis en gel en placa, como electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida, electroforesis capilar y electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacion. Otros metodos de deteccion de variantes de acido nucleico incluyen, por ejemplo, la prueba INVADER® de Third Wave Technologies, Inc., el analisis de Polimorfismo de longitud de fragmentos de restriccion (RFLP), hibridacion del nucleotido especifica del alelo, ensayos de movilidad heteroduplex, analisis del polimorfismo conformacional de cadena unica (SSCP), extension de cebador con un unico nucleotido (SNUPE) y pirosecuenciacion.

Puede utilizarse una fraccion detectable para los ensayos que se describen en este documento. Puede utilizarse una amplia gama de fracciones detectables donde la seleccion de la etiqueta depende de la sensibilidad requerida, de la facilidad de conjugacion con el anticuerpo, de requisitos de estabilidad y de la instrumentacion disponible y las disposiciones en materia de eliminacion de residuos. Fracciones detectables adecuadas incluyen, sin limitacion, radionucleidos, tintes fluorescentes (por ejemplo fluoresceina, isotiocianato de fluoresceina (FITC), Oregon GreenTM, rodamina, rojo de Texas, isotiocianato de tetrarodimina (TRITC), Cy3, Cy5, etc.), marcadores fluorescentes (por ejemplo proteina verde fluorescente (GFP), ficoeritrina, etc.), compuestos fluorescentes automaticamente desactivados activados por proteasas asociadas a tumores, enzimas (por ejemplo luciferasa, peroxidasa del rabano, fosfatasa alcalina, etc.), nanoparticulas, biotina, digoxigenina y similares.

Los formatos fisicos utiles comprenden superficies que cuentan con una pluralidad de emplazamientos discretos y direccionables para la deteccion de una pluralidad de diferentes marcadores. Dichos formatos incluyen micromatrices y determinados dispositivos capilares (vease, por ejemplo, Ng y col., J. Cell Mol. Med, 6:329-340 (2002); Patente US N° 6.019.944). En estas realizaciones, cada emplazamiento discreto superficial puede comprender anticuerpos para la inmovilizacion de uno o mas marcadores para su deteccion en cada uno de los emplazamientos. Alternativamente, las superficies pueden comprender una o mas particulas discretas (por ejemplo microparticulas o nanoparticulas) inmovilizadas en puntos discretos de una superficie, incluyendo dichas microparticulas anticuerpos para la inmovilizacion de uno o mas marcadores para su deteccion.

El analisis puede llevarse a cabo en diversos formatos fisicos. Por ejemplo, podria recurrirse a la utilizacion de placas de microtitulacion o automatizacion para facilitar el procesamiento de grandes cantidades de muestras de prueba. Alternativamente, podrian desarrollarse formatos de muestra unica para facilitar un pronostico puntual.

Alternativamente, las sondas de acido nucleico de la invencion pueden aplicarse a secciones de biopsias de pacientes inmovilizadas en placas de microscopio. El patron de hibridacion in situ resultante puede visualizarse utilizando cualquiera de los diferentes metodos microscopicos luminosos o fluorescentes conocidos en la tecnica.

En otro formato, los diversos marcadores de la invencion tambien facilitan reactivos para tecnicas de diagnostico por imagen in vivo, por ejemplo, imagenes de reactivos etiquetados que detectan los acidos nucleicos de los biomarcadores de la invencion.

PREPARACIONES Y ADMINISTRACION DE LA IVIG

Se han descrito composiciones de IVIG que comprenden anticuerpos completos para el tratamiento de ciertas condiciones autoinmunes (vease, por ejemplo, las Publicaciones de Patente US 2002/0114802, 2003/0099635 y 2002/0098182). Las composiciones de IVIG descritas en dichas referencias incluyen anticuerpos policlonales.

Las preparaciones de inmunoglobulina segun la presente invencion se pueden preparar a partir de cualquier material de partida adecuado. Por ejemplo, pueden obtenerse preparaciones de inmunoglobulina a partir de suero de un donante o de inmunoglobulinas monoclonales o recombinantes. En un ejemplo tipico, se recoge sangre procedente de donantes sanos. En general, la sangre se extrae de la misma especie animal que el sujeto al que va a administrarse la preparacion de inmunoglobulina (normalmente denominadas inmunoglobulinas "homologas"). Las inmunoglobulinas se aislan de la sangre mediante una serie de procedimientos adecuados, por ejemplo fraccionamiento de Cohn, ultracentrifugacion, preparacion electroforetica, cromatografia de intercambio ionico, cromatografia de afinidad, cromatografia de inmunoafinidad, fraccionamiento con polietilenglicol o similares (vease, por ejemplo, Cohn y col., J. Am. Chem. Soc. 68:459-75 (1946); Oncley y col., J. Am. Chem. Soc. 71:541-50 (1949); Barundern y col., Vox Sang. 7:157-74 (1962); Koblet y col., Vox Sang. 13:93-102 (1967); Patentes US N° 5.122.373 y 5.177.194).

En ciertas realizaciones, la inmunoglobulina se prepara a partir de productos que contienen gamma-globulina obtenidos a partir de procesos de fraccionamiento alcoholico y/o de metodos cromatograficos de intercambio ionico o afinidad bien conocidos por el experto en la materia. Habitualmente se emplea Fraccion II de Cohn purificada. La pasta de partida de la Fraccion II de Cohn tipicamente contiene un 95% de IgG e incluye los cuatro subtipos de IgG. Los diferentes subtipos estan presentes en la Fracion II en aproximadamente la misma proporcion en que se encuentran en los pools de plasma humano a partir de los que se obtienen. La Fraccion II se purifica ademas antes de ser formulada en forma de producto a administrar. Por ejemplo, la pasta de Fraccion II se puede disolver en una solucion acuosa alcoholica purificada fria y las impurezas se eliminan mediante precipitacion y filtracion. Tras una filtracion final, la suspension de inmunoglobulina puede ser dializada o diafiltrada (por ejemplo empleando membranas de ultrafiltracion con un limite nominal de peso molecular inferior o igual a 100.000 dalton) para eliminar el alcohol. La solucion se puede concentrar o diluir para obtener la concentracion proteica deseada y puede adicionalmente purificarse mediante tecnicas bien conocidsa por el experto en la materia.

Se pueden aplicar pasos preparativos para entiquecer un isotipo o subtipo de inmunoglobulina. Por ejemplo, se puede emplear una cromatografia de proteina A, proteina G o proteina H sefarosa para enriquecer una mezcla de inmunoglobulinas en relacion a la IgG o a subtipos especificos de IgG (vease Harlow y Lane, Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999); Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); Patente US N° 5.180.810).

Tambien pueden emplearse fuentes comerciales de inmunoglobulinas. Tales fuentes incluyen, sin limitarse a, Gammagard S/D® (Baxter Healthcare); BayRho-D® products (Bayer Biological); Gamimune N®, 5% (Bayer Biological); Gamimune N®, 5% Solvent/Detergent Treated (Bayer Biological); Gamimune N®, 10% (Bayer Biological); Sandoglobulin I.V.® (Novartis); Polygam S/D® (American Red Cross); Venoglobulin-S® 5% Solution Solvent Detergent Treated (Alpha Therapeutic); Venoglobulin-S® 10% Solution Solvent Detergent/Treated (Alpha Therapeutic); and VZIG® (American Red Cross). La fuente commercial empleada en la preparacion de immunoglobulina para su uso en los metodos de la presente invencion no es critica.

Una alternativa es emplear fragmentos de anticuerpos, como fragmentos Fc de immunoglobulinas. Una preparacion de Fc incluye fragmentos Fc de immunoglobulinas. El termino "fragmento de Fc" se refiere a una parte de una region constante de cadena pesada de una inmunoglobulina que contiene al menos un dominio pesado de region constante (por ejemplo CH2, CH3 y/o CH4) o una parte antigenica del mismo, exluyendo las regiones variables de la immunoglobulina (tal como se emplea aqui, una region variable se refiere a una region de la immunoglobulina que se une a un antigeno, pero excluye los dominios CH1 y CL). La prepracion de Fc puede contener fragmentos completes de Fc y/o partes de los mismos (por ejemplo uno o mas dominios pesados de region constante o partes de los mismos que incluyen epitopes enlazados por factores reumatoides). Opcionalmente, un fragmento de Fc puede incluir una region bisagra de inmunoglobulina, un dominio de cadena pesada CH1 y/o un dominio de cadena pesada unido a un dominio CL de cadena ligera.

Una preparacion de Fc incluye fragmentos Fc de al menos un isotipo de Fc y puede incluir una mezcla de fragmentos Fc de immunoglobulina de diferentes isotipos (por ejemplo IgA, IgD, IgE, IgG y/o IgM). La preparacion de Fc tambien puede contener predominantemente (al menos un 60%, 75%, 90%, 95% o un 99%) de fragmentos Fc de un isotipo de inmunoglobulina asi como cantidades menores de los otros subtipos. Por ejemplo, una preparacion de Fc puede incluir al menos aproximadamente un 75%, al menos aproximadamente un 90%, un 95% o un 99% de fragmentos Fc de IgG. Ademas, la preparacion de Fc puede comprender un unico subtipo de IgG o una mezcla de dos o mas subtipos de IgG. Subtipos de IgG adecuados incluyen IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En una realizacion especifica, la prepracion de Fc comprende fragmentos de Fc de IgG1.

La preparacion de Fc esta esencialmente libre de fragmentos F(ab')2 (esto es de regiones de cadena vriable ligeras y pesadas primera constante y una parte de la region bisagra, que pueden obtenerse por digestion con pepsina de la molecula anticuerpo); fragmentos Fab' (esto es fragmentos Fab' que pueden obtenerse por reduccion de los puentes disulfuro del fragmento F(ab')2) o fragmentos Fab (esto es que pueden obtenerse por tratamiento de la molecula de anticuerpo con papaina y un agente reductor). En este contexto, "esencialmente libre" significa que la preparacion de Fc contiene menos de aproximadamente un 30%, menos de aproximadamente un 20%, menos de aproximadamente un 10%, menos de aproximadamente un 5% o menos de aproximadamente un 1% de fragmentos F(ab')2, Fab' o Fab. En otra realizacion, la preparacion de Fc contiene fragmentos de Fc que estan esencialmente libres de fragmentos F(ab')2, Fab' o Fab. Tipicamente, las preparaciones de Fc estan esencialmente libres de inmunoglobulinas completos (es decir de longitud total). En este contexto, "sustancialmente libre" significa que menos de aproximadamente un 25% o menos de aproximadamente un 10% o menos de aproximadamente un 5% o menos de aproximadamente un 2%, menos de aproximadamente un 1% estan libres de inmunoglobulinas de longitud completa.

Las immunoglobulinas puexden segmentarse en cualquier momento adecuado surante la prepracion para separar los fragmentos de Fc de los de Fab, F(ab') y/o F(ab')2 fragments. Una enzima adecuada para ello es, por ejemplo, papaina, pepsina o plasmina (vease por ejemplo Harlow y Lane, Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999); Plan y Makula, Vox Sanguinis 28:157-75 (1975)). Despues de la segmentacion, las partes de Fc se pueden separar de los framentos de Fab, F(ab') y/o F(ab')2 por ejemplo mediante cromatografia de afinidad de intercambio ionico, filtracion en gel y similares. En un ejemplo especifico, las immunoglobulinasson digeridas con papaina para separar el fragmento de Fc de los fragmentos Fab. La mezcla de digestion se somete entonces a una cromatografia de intercambio cationico para separar los fragmentos de Fc de los de Fab.

La Inmunoglobulina o los fragmentos Fc tambien pueden prepararse a partir de hibridomas u otros sistemas de cultivo que expresen anticuerpos monoclonales (vease, por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature 256:495-97 (1975); Hagiwara y Yuasa, Hum. Antibodies Hibridomas 4:15-19 (1993); Kozbor y col., Immunology Today 4:72 (1983); Cole y col., en Anticuerpos monoclonales and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985)). Los anticuerpos monoclonales humanos pueden obtenerse, por ejemplo, a partir de hibridomas humanos (vease, por ejemplo, Cote y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA 80:2026-30 (1983)) o mediante la transformacion de celulas humanas B con el virus EBV in vitro (vease, por ejemplo, Cole y col., supra). Los anticuerpos monoclonales elaborados a partir de hibridomas se pueden purificar y los fragmentos Fc pueden separarse de los fragmentos Fab, F(ab') y/o F(ab')2 tal como se describe aqui o como es conocido por el experto en la materia.

La inmunoglobulina o los fragmentos Fc tambien pueden producirse a traves de metodos recombinantes, por ejemplo, a partir de sistemas de cultivo de celulas eucarioticas. Por ejemplo, se puede producir de forma recombinante un fragmento Fc de una inmunoglobulina con celulas ovaricas de hamster chino (CHO) transfectadas con un vector que contiene una secuencia de ADN que codifica el fragmento Fc. Los metodos de creacion de dichas celulas recombinantes de mamifero se describen, por ejemplo, en Sambrook y Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (New York) 2001) y en Ausubel y col., Short Protocols in Molecular Biology, 4a ed. (John Wiley & Sons, Inc. (New York) 1999), y son bien conocidos por el experto en la materia. El Fc recombinante tambien puede obtenerse a partir de otras lineas celulares de mamiferos, como celulas renales de crias de hamster (BHK). Tambien se conocen en la tecnica metodos de cultivo de celulas recombinantes para la obtencion de proteinas recombinantes.

Pueden utilizarse otros muchos sistemas de expresion para expresar las inmunoglobulinas o los fragmentos Fc recombinantes. Entre ellos se encuentran, con caracter no limitativo, sistemas celulares de insectos y microorganismos, como levaduras o bacterias, que han sido transfectados o transformados mediante un casete de expresion que codifica el fragmento Fc deseado. En ciertas realizaciones, el microorganismo puede opcionalmente disefarse de forma que reproduzca los patrones de glicosilacion de los fragmentos Fc humanos o mamiferos.

En determinadas realizaciones puede recurrirse a fases adicionales de preparacion para obtener una preparacion de inmunoglobulina o Fc que resulte segura para su utilizacion con los metodos de la presente invencion. Dichas fases pueden incluir, por ejemplo, tratamiento con disolventes/detergentes, pasteurizacion y esterilizacion. Pueden utilizarse otras fases adicionales de preparacion para garantizar la seguridad de la preparacion Fc. Dichas fases de preparacion pueden incluir, por ejemplo, hidrolisis enzimatica, modificacion quimica por reduccion y alquilacion, sulfonacion, tratamiento con �-propiolactona, tratamiento a pH bajo o similares. Tambien pueden encontrarse descripciones de los metodos adecuados, por ejemplo, en las patentes US n° 4.608.254; 4.687.664; 4.640.834; 4.814.277; 5.864.016;

5.639.730 y 5.770.199; Romer y col., Vox Sang. 42:62-73 (1982); Romer y col., Vox Sang. 42:74-80 (1990); y Rutter, J. Neurosurg. Psychiat. 57 (Suppl.): 2-5 (1994).

Se administra al sujeto una cantidad efectiva de una inmunoglobulina o de una preparacion de Fc generalmente via intravenosa. El termino "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad de una preparacion de inmunoglobulina o Fc que tiene como resultado una mejoria o alivio de la EMRR en el sujeto. La cantidad efectiva a administrar al sujeto puede ser determinada por un medico teniendo en cuenta las diferencias individuales de edad, peso, gravedad de la enfermedad y respuesta a la terapia. En determinadas realizaciones, puede administrarse una preparacion de inmunoglobulina o Fc a un sujeto a razon de aproximadamente entre 5 mg/kilogramo y aproximadamente 500 mg/kilogramo diarios. En realizaciones adicionales, puede administrarse una preparacion de inmunoglobulina o Fc en cantidades de al menos unos 10 mg/kilogramo, al menos 15 mg/kilogramo, al menos 20 mg/kilogramo, al menos 25 mg/kilogramo, al menos 30 mg/kilogramo al menos 50 mg/kilogramo. En realizaciones adicionales, puede administrarse a un sujeto una preparacion de inmunoglobulina o Fc a unas dosis diarias de hasta unos 100 mg/kilogramo, unos 150 mg/kilogramo, unos 200 mg/kilogramo, unos 250 mg/kilogramo, unos 300 mg/kilogramo, unos 400 mg/kilogramo. En otras realizaciones, las dosis de la preparacion de inmunoglobulina o Fc pueden ser mayores o menores. La preparacion de inmunoglobulina o Fc puede administrarse en una o mas dosis diarias.

De acuerdo con la presente invencion, el tiempo requerido para completar un ciclo de tratamiento puede ser determinado por un medico y puede variar entre un dia y mas de un mes. En ciertas realizaciones, un ciclo de tratamiento puede variar entre 1 y 6 meses.

COMPOSICIONES, KITS Y SISTEMAS INTEGRADOS

La invencion proporciona composiciones, kits y sistemas integrados para la realizacion de los ensayos descritos en este documento utilizando acidos nucleicos especificos de los polinucleotidos de la invencion.

Normalmente, los kits para la realizacion de las pruebas diagnosticas de la invencion suelen incluir una sonda que comprende una secuencia de acido nucleico que se une especificamente a los polinucleotidos de la invencion y una etiqueta para detectar la presencia de la sonda. Los kits pueden incluir diversas secuencias de polinucleotidos.

M �TODOS PARA LA IDENTIFICACION DE LOS COMPUESTOS

Pueden utilizarse diversos metodos para la identificacion de compuestos que prevengan o sirvan para el tratamiento de la esclerosis multiple, incluyendo la esclerosis multiple recurrente-remitente (EMRR). Normalmente, se adapta un ensayo que facilita un parametro facilmente medible para su realizacion en los pocillos de placas de multiples pocillos, a fin de facilitar la deteccion de los elementos de una liberia de compuestos de prueba conforme a lo aqui descrito. Asi, en una realizacion, puede disponerse un numero adecuado de celulas, por ejemplo de celulas T, en los pocillos de una placa de multiples pocillos, pudiendo determinarse el efecto de un compuesto de prueba sobre la expresion de un biomarcador de la esclerosis multiple recurrente-remitente (EMRR) sensible a las IVIG.

Los compuestos a ensayar pueden ser cualquier compuesto quimico de pequefas dimensiones o una macromolecula, como una proteina, azucar, acido nucleico o lipido. Normalmente, los compuestos de prueba consistiran en moleculas quimicas y peptidos de reducidas dimensiones. Esencialmente puede utilizarse cualquier compuesto quimico en este aspecto de la invencion, aunque con frecuencia se utilicen compuestos que pueden disolverse en soluciones acuosas u organicas (especialmente, los basados en DMSO). Los ensayos estan disefados para detectar liberias quimicas de gran tamafo mediante la automatizacion de las fases del ensayo y la facilitacion de compuestos obtenidos a partir de cualquier fuente adecuada para los ensayos, que normalmente se realizan en paralelo (por ejemplo, en formatos de microtitulacion o en placas de microtitulacion en ensayos roboticos). Se observara que existen multitud de proveedores de compuestos quimicos, incluyendo Sigma (St. Louis, MO), Aldrich (St. Louis, MO), Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), Fluka Chemika-Biochemica Analytika (Buchs Switzerland) y similares.

En una realizacion preferente, se utilizan metodos de deteccion de alto rendimiento, que implican la utilizacion de una libreria combinatoria quimica o de peptidos que contenga un gran numero de posibles compuestos terapeuticos. Dcihas "liberias quimicas combinatorias" o "liberias de ligandos" se detectan posteriormente en uno o mas ensayos segun lo aqui descrito para identificar aquellos integrantes de la liberia (especies o subclases quimicas especificas) que tienen la actividad caracteristica deseada. En esta fase se detecta en dichos compuestos su capacidad para reducir o incrementar la expresion de los biomarcadores de la esclerosis multiple recurrente-remitente (EMRR) de la invencion.

Una libreria quimica combinatoria es una recopilacion de diversos compuestos quimicos generados por sintesis quimica

o biologica combinando diversos "bloques funcionales" quimicos como reactivos. Por ejemplo, se forma una liberia quimica combinatoria lineal, como una liberia de polipeptidos, mediante la combinacion de un conjunto de bloques quimicos funcionales (aminoacidos) en cualquier forma posible para una longitud de compuesto determinada (es decir, el numero de aminoacidos que se encuentran en un compuesto polipeptido). Pueden sintetizarse millones de compuestos quimicos mediante dicha mezcla combinatoria de bloques funcionales quimicos.

La preparacion y deteccion de las liberias quimicas combinatorias son bien conocidas para el experto en la materia. Dichas liberias quimicas combinatorias incluyen, de forma no limitativa, liberias de peptidos (vease, por ejemplo, la patente US 5.010.175, Furka, Int. J. Pept. Prot. Res., 37:487-493 (1991) y Houghton y col., Nature, 354:84-88 (1991)). Pueden utilizarse otras sustancias para obtener liberias de diversidad quimica. Dichas sustancias incluyen, sin limitacion, peptoides (por ejemplo, Publicacion PCT N° WO 91/19735), peptidos codificados (por ejemplo, Publicacion PCT N° WO 93/20242), bio-oligomeros aleatorios (por ejemplo, Publicacion PCT N° WO 92/00091), benzodiazepinas (por ejemplo, Patente US N° 5.288.514), diversomeros, como hidantoinas, benzodiazepinas y dipeptidos (Hobbs y col., PNAS USA, 90:6909-6913 (1993)), polipeptidos vinilogos (Hagihara y col., J. Amer. Chem. Soc., 114:6568 (1992)), mimeticos de peptidos no peptidicos con estructura de glucosa (Hirschmann y col., J. Amer. Chem. Soc., 114:9217-9218 (1992)), sintesis organicas analogas de librerias de pequefos compuestos (Chen y col., J. Amer. Chem. Soc., 116:2661 (1994)), oligocarbamatos (Cho y col., Science, 261:1303 (1993)) y/o peptidilfosfonatos (Campbell y col., J. Org. Chem.,

59:658 (1994)), librerias de acidos nucleicos (vease Ausubel, Berger y Sambrook, todos ellos citados anteriormente), librerias de acidos nucleicos peptidos (vease, por ejemplo, la patente US N° 5.539.083), librerias de anticuerpos (vease, por ejemplo, Vaughn y col., Nature Biotechnology, 14(3):309-314 (1996) y PCT/US96/10287), librerias de hidratos de carbono (vease, por ejemplo, Liang y col., Science, 274:1520-1522 (1996) y la patente US N° 5.593.853), librerias de pequefas moleculas organicas (veanse, por ejemplo, benzodiazepinas, Baum C&EN, Jan 18, pagina 33 (1993); isoprenoides, patente US N° 5.569.588; tiazolidinonas y metatiazanonas, patente US N° 5.549.974; pirrolidinas, patentes US N° 5.525.735 y 5.519.134; compuestos morfolino, patente US N° 5.506.337; benzodiazepinas, 5.288.514, y similares).

Los dispositivos para la preparacion de librerias combinatorias se encuentran disponibles en el comercio (vease, por ejemplo, 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MA). Por otra parte, tambien se encuentran disponibles comercialmente numerosas librerias combinatorias (vease, por ejemplo, ComGenex, Princeton, N.J., Asinex, Moscu, Rusia, Tripos, Inc., St. Louis, MO, ChemStar, Ltd, Moscu, Rusia, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD, etc.)

En los ensayos de alto rendimiento de la invencion, es posible detectar hasta varios miles de diferentes moduladores o ligandos en un solo dia. Concretamente, cada uno de los pocillos de una placa de microtitulacion puede utilizarse para llevar a cabo un ensayo independiente relativo a un posible modulador seleccionado o, en el caso de que lo que van a observarse son los efectos de la concentracion o del tiempo de incubado, se puede comprobar un solo modulador cada 5-10 pocillos. De este modo, con una sola placa de microtitulacion estandar se pueden ensayar alrededor de 96 moduladores. Si se utilizan placas de 1.536 pocillos, con una sola placa se podran ensayar entre unos 100 y unos 1.500 compuestos diferentes. Es posible someter a ensayo muchas placas por dia; es posible realizar ensayos de deteccion de unos 6.000, 20.000, 50.000 o 100.000 o mas compuestos diferentes utilizando los sistemas integrados de la invencion.

M �TODOS PARA LA INHIBICION O ACTIVACION DE LAS PROTEiNAS DEL BIOMARCADOR O LA FUNCION DE RECEPCION DEL BIOMARCADOR UTILIZANDO ANTICUERPOS

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Pueden utilizarse diversos acidos nucleicos, como acidos nucleicos antisentido, ARNsi o ribozimas, para inhibir la funcion de los marcadores de la presente invencion. Las ribozimas que escinden el ARNm en secuencias de reconocimiento especificas de emplazamiento se pueden utilizar para destruir ARNms diana, especialmente utilizando ribozimas en cabeza de martillo. Las ribozimas en cabeza de martillo escinden los ARNms en una serie de emplazamientos dictados por las regiones de flanqueo que forman pares de bases complementarios con el ARNm diana. Preferiblemente, el ARNm diana tiene la siguiente secuencia de dos bases: 5'-UG-3'. La construccion y produccion de las ribozimas en cabeza de martillo es bien conocida en la tecnica.

Las ribozimas diana geneticas contienen necesariamente una region de hibridacion complementaria de dos regiones, cada una de las cuales tiene una longitud de al menos 5 y preferiblemente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleotidos contiguos de un ARNm diana. Asimismo, las ribozimas poseen una actividad endoribonucleasa altamente especifica, que escinde de forma autocatalitica el ARNm sentido diana.

En lo que respecta al antisentido, pueden utilizarse oligonucleotidos de ARNsi o ribozimas u oligonucleotidos fosforotioato. Las modificaciones del enlace fosfodiester, asi como las del heterociclo o del azucar pueden facilitar una mayor eficacia. Se utiliza el fosforotioato para modificar el enlace fosfodiester. Se ha descrito que un enlace fosforamidato N3'-P5' estabiliza los oligonucleotidos en las nucleasas y aumenta los enlaces con el ARN. La union del acido peptido-nucleico (APN) sustituye por completo la estructura formada por ribosa y el fosfodiester y es estable ante las nucleasas, aumenta la afinidad del enlace con el ARN y no permite la escision por la RNAsa-H. Su estructura basica tambien puede tratarse mediante modificaciones que pueden permitir su optimizacion como componente antisentido. En lo que respecta a las modificaciones del heterociclo, se ha demostrado que algunas modificaciones del heterociclo aumentan los efectos antisentido sin interferir en la actividad de la RNAsa-H. Un ejemplo de dicha modificacion lo constituye la modificacion C-5 tiazol. Por ultimo, tambien puede tenerse en cuenta la modificacion del azucar. Las modificaciones de 2'-O-propil y de 2'-metoxietoxi-ribosa estabilizan los oligonucleotidos en las nucleasas, tanto en cultivos celulares como in vivo.

Los oligonucleotidos inhibidores pueden administrarse a una celula mediante transfeccion directa o mediante transfeccion y expresion a traves de un vector de expresion. Entre los vectores de expresion adecuados se incluyen los vectores de expresion mamiferos y vectores virales, donde se ha clonado un oligonucleotido inhibidor con las secuencias reguladoras adecuadas, incluyendo un promotor, para obtener como resultado la expresion del ARN antisentido en una celula huesped. Los promotores adecuados pueden ser promotores constitutivos o especificos de desarrollo. La transfeccion puede llevarse a cabo a traves de reactivos de transfeccion liposomales, bien conocidos en la tecnica (por ejemplo, el reactivo de transfeccion Xtreme, Roche, Alameda, CA; las formulaciones de Lipofectamine, Invitrogen, Carlsbad, CA). La administracion mediada por liposomas cationicos, vectores retrovirales y la administracion directa tambien ha demostrado ser eficaz. Otra posible forma de administracion es la seleccion mediante la utilizacion de anticuerpos de los marcadores de la superficie celular para las celulas diana.

Para la transfeccion, una composicion que comprenda una o mas moleculas de acido nucleico (con o sin vectores) puede comprender un vehiculo de administracion, incluyendo liposomas, para su administracion a un sujeto, vehiculos y disolventes y sus sales, y/o puede encontrarse presente en formulaciones farmaceuticamente aceptables. Los metodos de administracion de las moleculas de acido nucleico se describen, por ejemplo, en Gilmore y col., Curr Drug Delivery (2006) 3:147-5 y Patil y col., AAPS Journal (2005) 7:E61-E77. La administracion de las moleculas de ARNsi tambien se describe en diversas publicaciones de patentes estadounidenses, incluyendo por ejemplo 2006/0019912; 2006/0014289; 2005/0239687; 2005/0222064 y 2004/0204377. Las moleculas de acido nucleico pueden administrarse a las celulas mediante diversos metodos conocidos por el experto en la materia, incluyendo, sin limitacion, encapsulacion en liposomas, iontoforesis, electroporacion o su incorporacion a otros vehiculos, incluyendo polimeros biodegradables, hidrogeles, ciclodextrinas (vease, por ejemplo, Gonzalez y col., 1999, Bioconjugate Chem., 10, 1068-1074; Wang y col., las publicaciones Internacionales PCT N° WO 03/47518 y WO 03/46185), microesferas de acido poli(lactico-co-glicolico) (PLGA) y PLCA (vease, por ejemplo, la patente US N° 6.447.796. y la publicacion de la solicitud de patente US N° 2002/130430), nanocapsulas biodegradables, y microesferas bioadhesivas, o mediante vectores proteinico-acuosos (O'Hare y Normand, publicacion internacional PCT N° WO 00/53722). En otra realizacion, las moleculas de acido nucleico de la invencion tambien pueden formularse o constituirse en complejos con polietileneimina y sus derivados, como polietileneimina-polietilenglicol-N-acetilgalactosamina (PEI-PEG-GAL) o derivados de polietileneiminapolietilenglicol-tri-N-acetilgalactosamina (PEI-PEG-triGAL).

Ejemplos de reactivos de transfeccion liposomal a utilizar en esta invencion son, por ejemplo, CellFectin, la formulacion del liposoma 1:1.5 (M/M) del lipido cationico N,NI,NII,NIII-tetrametil-N,NI,NII,NIII-tetrapalmit-y-espermina y dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) (GIBCO BRL); CItofectina GSV, la formulacion del liposoma 2:1 (M/M) de un lipido cationico y DOPE (Glen Research); DOTAP (N41-(2,3-dioleoiloxi)-N,N,N-tri-metil-amoniometilsulfato) (Boehringer Manheim); Lipofectamina, la formulacion del liposoma 3:1 (M/M) del lipido policationico DOSPA y el lipido neutro DOPE (GIBCO BRL); y (5) siPORT (Ambion); HiPerfect (0iagen); X-treme GENE (Roche); RNAicarrier (Epoch Biolabs) y TransPass (New England Biolabs).

En algunas realizaciones, las secuencias antisentido, ARNsi o ribozimas se administran a la celula a traves de un vector de expresion mamifero. Por ejemplo, vectores de expresion mamiferos adecuados para la expresion del ARNsi se encuentran disponibles comercialmente, por ejemplo Ambion (por ejemplo, vectores pSilencer), Austin, TX; Promega (por ejemplo, GeneClip, siSTRIKE, SiLentGene), Madison, WI; Invitrogen, Carlsbad, CA; InvivoGen, San Diego, CA; e Imgenex, San Diego, CA. Normalmente, los vectores de expresion para la transcripcion de las moleculas ARNsi tendran un promotor U6.

En algunas realizaciones, las secuencias antisentido, ARNsi o de ribozimas se administran a las celulas a traves de un vector de expresion viral. Los vectores virales adecuados para la administracion de dichas moleculas a las celulas incluyen vectores adenovirales, vectores adenoasociados y vectores retrovirales (incluyendo vectores lentivirales). Por ejemplo, los vectores virales desarrollados para la administracion y expresion de oligonucleotidos siRNA se encuentran comercialmente disponibles de, por ejemplo, GeneDetect, Bradenton, FL; Ambion, Austin, TX; Invitrogen, Carlsbad, CA; Open BioSystems, Huntsville, AL; e Imgenex, San Diego, CA.

Ejempios

Los ejemplos siguientes tienen caracter ilustrativo y no limitativo de la invencion reivindicada.

Ejempio 1: Metodos y �Materiaies

Pacientes participantes en e/ estudio

Se incluyeron 10 pacientes consecutivos con EM aguda recurrente clasificados de acuerdo con los criterios de McDonald (McDonald W.I. y col., Ann Neurol, 50:121-27 (2001)). El diagnostico de la EM definida se basa en los criterios de McDonald (Kurtzke J.F., Neurology, 33:1444-1452 (1983)). La EDSS (Dastidar P. y col., Med Biol Eng Comput, 37:104-7 (1999)) y la MRI cerebral volumetrica se evaluaron con respecto al valor de referencia (en el momento de la recurrencia, inmediatamente antes del tratamiento) y 3 semanas despues de la finalizacion de la terapia con IVIG (Elovaara I. y col., Intravenous Immunoglobuline is effective and well tolerated in the treatment of EM Relapse, Manuscrito remitido). El primer resultado del estudio represento un cambio de la puntuacion EDSS con respecto al valor de referencia hasta la semana 3 tras el inicio de la terapia con IVIG el dia 21. Las medidas secundarias obtenidas supusieron cambios en los volumenes de T1, T2, Flair y lesiones realzadas por gadolinio (Gd), en el numero de lesiones realzadas por Gd y volumenes cerebrales (Elovaara I. y col., Intravenous Immunoglobuline is effective and well tolerated in the treatment of EM Relapse, Manuscrito remitido; Dastidar P. y col., Med Biol Eng Comput, 37:104-7 (1999)).

Las caracteristicas de los pacientes se incluyen en la Tabla 1. Antes de incorporarse al estudio, todos los pacientes firmaron un impreso de autorizacion. El estudio recibio la aprobacion del Comite de �tica de la Universidad de Tampere, Finlandia.

Se excluyo a aquellos pacientes que habian recibido tratamiento con inmunosupresores en los nueve meses anteriores y a los que se les habian administrado corticoesteroides en las 8 semanas anteriores. Todos los pacientes recibieron 0,4 g/kg/dia de Endobulina (Baxter AG, Viena, Austria) durante 5 dias. La evaluacion clinica de los pacientes se llevo a cabo con anterioridad al tratamiento con IVIG, 1 dia despues de la finalizacion de la terapia al cabo de 21 dias. La evaluacion clinica incluyo un examen neurologico, la determinacion de la puntuacion EDSS, el indice-brazo o el indice ambulatorio. Un grupo de control formado por cinco pacientes recibio un tratamiento estandar de 100 mg/dia de IVMP durante 3 dias.

Tabia 1 Caracteristicas�de �ios �pacientes�inciuidos �en ei�estudio

Caracteristicas

Pacientes tratados con IVIC Pacientes tratados con IVMP (control)

Numero de pacientes Edad (afos, promedio ± Desv. Est.) Sexo (varon/mujer) Duracion de la enfermedad (afos, promedio ± Desv. Est.) Tiempo actual / Recaida anterior (meses, promedio ± Desv. Est.) Puntuacion EDSS durante la remision (promedio ± Desv. Est.) Puntuacion EDSS en el momento de la recaida aguda (promedio ± Desv. Est.)

10 40 ± 10,6 3 vs 7 5,6 ± 3,5 17,6 ± 21,0 2,3 ± 0,95 3,7 ± 1,1 5 35,3 ± 8,8 0 vs 5 5,2 ± 3,6 5 ± 3,2 3,2 ± 2,4 4,2 ± 2,0

5 Ana/isis MRI

Los examenes mediante MRI cerebral se llevaron a cabo utilizando una unidad de MRI de 1,5 Teslas (Philips Gyroscan ACS NT Intera, Best, Holanda) de acuerdo con lo descrito (Kurtzke J.F., Neurology, 33:1444-1452 (1983)). El protocolo MRI incluyo un localizador sagital T1 (recuperacion de inversion atenuada por liquido) (FLAIR), contraste por transferencia de magnetizacion (MTC) T1, eco de spin T1 (SE), eco de spin turbo T2 (TSE) (3mm de espesor y 10 separacion de 0mm) y secuencias MTC T1 realzadas por gadolinio. Se utilizaron las secuencias T1 axial SE (3mm de espesor y separacion de 0mm) y FLAIR axial (5mm de espesor y 1mm de separacion) para el analisis volumetrico de las placas. Los analisis computerizados volumetrico y de segmentacion semiautomatica se llevaron a cabo utilizando el software Anatomatic, operando en un entorno Windows. Se informa de la variabilidad inter-e intra-observador de los resultados volumetricos (Dastidar P. y col., Med Biol Eng Comput, 37:104-7 (1999); Heinonen T. y col., J Med Eng

15 Technol, 22:173-8 (1998)).

La exactitud volumetrica del programa anatomico se analizo de acuerdo con lo descrito (Dastidar P. y col., Med Biol Eng Comput, 37:104-7 (1999)). Se controlo el adecuado reposicionamiento de las cabezas utilizando la misma bobina cefalica, las mismas ubicaciones anatomicas y el mismo paquete de imagenes en diferentes secuencias de MRI. Las medulas espinales completas se escanearon separandolas en su parte superior e inferior. Se utilizo el mismo scanner

20 para todos los examenes por resonancia magnetica.

Preparacion de /as muestras de ARN

Las muestras de sangre se obtuvieron utilizando tubos de preparacion celular Vacutainer CPTTM (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Las celulas sanguineas mononucleares perifericas (PBMC) se separaron de la sangre periferica en los 60 min siguientes al muestreo de la sangre por centrifugado en gradiente de densidad (Lymphoprep, Nycomed, 25 Roskilde, DK) conforme al protocolo del fabricante. Las celulas se separaron en celulas T y celulas no T utilizando una mezcla de perlas Dynabeads magneticas no estimulantes anti-CD4+ y antiCD8+ (Dynal Biotech, Oslo, N) a 4°C. Las pellas celulares obtenidas de 5·106 celulas se mezclaron minuciosamente con 1 ml de TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las muestras de ensayo alicuotas se congelaron y almacenaron a -80°C hasta su posterior procesamiento. El ARN total se aislo conforme al protocolo del fabricante. Las pellas de ARN se disolvieron en agua libre de nucleasa (Invitrogen,

30 Carlsbad, CA) y se almacenaron a -80°C.

Ana/isis de micromatrices

Se utilizo el biochip HU-133A Genechip (Affymetrix, Santa Clara, CA), que contenia aproximadamente 33.000 genes humanos. Se transcribieron, etiquetaron e hibridaron 5 Ig de ARN total in vitro en la matriz de acuerdo con el protocolo del fabricante (vease Affymetrix.com). La calidad del ARN se verifico antes de su tratamiento in vitro utilizando un

35 bioanalizador (Agilent Technologies, Palo Alto, CA).

Ana/isis estadfstico de /os Datos de Expresion de/ Gen

El analisis estadistico de los datos de expresion del gen se llevo a cabo en las instalaciones de Tubingen, Eberhard-KarlsUniversity Tubingen, Alemania. Los archivos Affymetrix CHP se importaron en Genespring 7.1 para el analisis estadistico de los datos. Las sefales de cada matriz se dividieron por la mediana de todas las sefales de las matrices, 40 partiendo del punto temporal cero. Posteriormente, se llevo a cabo una normalizacion "por gen" dividiendo todas las

sefales de un gen por la mediana de la sefal de dicho gen. De este modo, las sefales de cada gen se inician en el punto temporal cero alrededor de 1 y muestran los valores superiores a 1 cuando se produce el incremento, y viceversa. Las sefales se sometieron a una transformacion logaritmica y se calcularon los valores de factor de cambio y p (test t de Welch) (Han T. y col., BMC bioinformatics, 7:9 (2006)) para cada gen, realizando comparaciones dos a dos. Se identificaron los conjuntos de sondas con un valor de fold change superior a 2 y un valor p inferior a 0,05 en graficos volcan y se denominaron estadisticamente significativos.

Reaccion en cadena de /a po/imerasa en tiempo rea/

Los datos de expresion genica obtenidos mediante analisis de micromatrices para cuatro genes representativos se confirmaron por reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real cuantitativa. Con este fin, se utilizaron 11 Ig de ARN del total de las celulas T para realizar la transcripcion inversa en ADNc conforme al protocolo del fabricante (MB1 Fermentas, Burlington, Canada). Para cada muestra a analizar, se disolvieron 100 mg ADNc en 5Il de agua libre de nucleasa (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se analizaron cualitativamente utilizando diferentes ensayos personalizados TaqMan y ABPrism 7000 (ambos de Applied Biosystems, Foster City, CA). Los datos se analizaron utilizando el metodo MMCT, que suele utilizarse para realizar la cuantificacion relativa (Livak K.J. y Schmittgen T.D., Methods, 25:402-40 (2001)). Para la normalizacion de los datos de expresion se incluyo gliceraldehido-3-fosfato-deshidrogenasa humana como gen de mantenimiento. Para verificar la normalizacion se utilizo como control un segundo gen de mantenimiento,

�-microglobulina (no se muestran los datos).

Ejempio 2: �Resuitado ciinico dei�tratamiento con IVIG�de ios�pacientes

El analisis de los resultados clinicos del estudio demostro que un ciclo de cinco dias con terapia IVIG tuvo como resultado una reduccion significativa de la puntuacion EDSS en la totalidad de los 10 pacientes (Fig. 1). La eficacia de la terapia con IVIG se vio respaldada por la mejora de la mayoria de las variables de MRI (Tabla 2). Aunque se observaron efectos similares en el grupo de control sometido a tratamiento estandar con IVMP (Tabla 2), los cambios observados en las variables de la MRI del grupo de control no resultaron estadisticamente significativos. El tratamiento con IVIG resulto seguro y fue bien tolerado.

Tabia�2Anaiisis�por�MRI�de�ias�anormaiidades�cerebraies�antes�ydespues�dei�tratamiento�con�IVIG�e�IVMP

Antes trat. con IVIG

Tras trat. con IVIG

Parametro

Vol lesion cm3 Vol lesion cm3

T1 T2 Flair Realzada por Gd Volumen cerebral Gd+lesion N

Media ± SE 1, 76 ± 0,55 5,49 ± 1,09 15,76 ± 2,23 0,32 ± 0,27 1124,94 ± 40,61 2,83 ± 0,71 Media ± SE 1,73 ± 0,59 5,08 ± 1,03* 14,09 ± 1,94** 0,21 ± 0,24** 1120,31± 40,72 2,00 ± 0,60**

Puntuacion EDSS

3,8 ± 0,3 2,6 ± 0,2**

Antes trat. con IVMP

Tras trat. con IVMP

Parametro

Vol lesion cm3 Vol lesion cm3

T1 T2 Flair Realzada por Gd Volumen cerebral Gd+lesion N

Media ± SE 1,41 ± 0,60 11,15 ± 4,59 24,37 ± 8,19 0,70 ± 0,39 1056,32 ± 47,78 3,0 ± 1,5 Media ± SE 1,64 ± 0,84 9,83 ± 4,17 23,18 ± 8,05 0,63 ± 0,37 1045,07 ± 52,53 2,7 ± 1,4

Puntuacion EDSS

4,2 ± 2,0 3,3 ± 2,4

* p<0,05; **p<0,01; EDSS = escala ampliada del estado de discapacidad (EDSS) de Kurtzke; Gd = Volumenes de la lesion realzada por Gadolinio

Ejempio 3: Ei tratamiento con IVIG no aitera significativamente ia composici6n ceiuiar de ias ceiuias obtenidas para�ei aisiamiento �dei �ARN

Las PBMCs obtenidas a partir de la sangre periferica se separaron en celulas T y celulas no T utilizando una mezcla de perlas Dynabeads magneticas no estimulantes anti-CD4+ y antiCD8+ a 4°C. Este procedimiento se selecciono para impedir la estimulacion de las celulas T durante la separacion celular. Para asegurarse de que las posibles diferencias en los perfiles de expresion genica no se debieran a diferencias en la composicion celular de las diversas muestras, se compara la expresion de los genes que codifican CD3, CD4, CD8 y CD14 entre las muestras obtenidas en diferentes puntos temporales para cada paciente. Los resultados indican que la composicion celular de las muestras obtenidas de cada paciente durante diversos dias es similar (Figuras 2A, 2B). No se observaron diferencias estadisticamente significativas.

Ejempio 4: Anaiisis�de�ios�datos �de expresi6n genica�obtenidos de�pacientes sometidos�a�tratamiento�con �IVI�

El analisis estadistico de los datos de expresion genica incluyeron todos los resultados obtenidos en los analisis de micromatrices en tres puntos temporales diferentes (antes del tratamiento, 1 dia y 21 dias despues del comienzo del tratamiento) e incluyo la totalidad de los 10 pacientes tratados con IVIG. Los analisis revelaron que 360 genes de celulas T perifericas habian experimentado significativos cambios de expresion durante el transcurso del tratamiento con IVIG.

5 La expresion de 91 de estos genes cambio entre el dia 0 y el dia 6, la expresion de 147 genes cambio entre el dia 0 y el dia 21, y la expresion de 122 genes cambio entre el dia 6 y el dia 21.

El analisis estadistico del grupo de pacientes de control sometidos a tratamiento con IVMP mostro una expresion diferencial de 583 genes, experimentando los cambios la mayoria (218 genes) entre el dia 0 y el dia 6.

Las Tablas 3a-3d presentan los 20 cambios mas significativos en la expresion genica observados en pacientes 10 sometidos a tratamiento con IVIG e IVMP.

Tabia 3a Los�1� genes �uue�mostraron �ia�mayor�reguiaci6n�ai aiaa en�ceiuias T�perifericas �de�ios pacientes en �ia�terapia �con IVIG

Factor cambio

de Punto temporal Titulo del gen Simbolo del Gen ID Sec Ref

4,37 4,26 4 3,86 3,83 3,54 3,52 3,5 3,41 3,36

21 vs 6 21 vs 0 6 vs 0 21 vs 6. 6 vs 0 21 vs6 21 vs 6 6 vs 0 21 vs 0 21 vs 6 Factor regulador transcripcional 1 TRERFI NM 018415 Marco abierto de lectura 28 del cromosoma 19 C19orf28 NM 174983 Inhibidor IC de la quinasa dependiente de la ciclina (p57, Kip2) CDKNIC NM 000076 Cancer de mama 1, aparicion temprana BRCAI NM 007294 Secuencia del clon 23555 del ARNm -----Proteina 4 de enlace del dominio SH3 SH3BP4 NM 014521 Colageno, tipo Ill, alfa 1 (Sindrome de Ehlers-Danlos tipo IV, dominante atosomal) COL3A1 NM 000090 UDP-Gal;beuGlcNAc polipeptido 2 de la beta 1,3-galactosiltransferasa, B3GALT2 NM 003783 Fosfolipasa DI (glicosil)fosfatidilinositol especifica, GPLDI NM 001503

15

Tabia 3b Los�1� genes �uue�mostraron �ia�mayor�reguiaci6n�a�ia �baja�en�ias�ceiuias�T�perifericas de�ios pacientes en �ia�terapia �con IVIG

Factor cambio

Punto temporal Titulo del gen Simbolo Gen del ID Sec Ref

-4,82

6 vs 0 Proteina 7 relacionada con la miombularina MTMR7 NM 004686

-3,96

6 vs 0 Proteina transmembrana con dominio similar al EGF y dos dominios similares a la follistantina TMEFFI NM 003692

-3,9 -3,89 -3,59 -3,57

21 vs 0 21 vs 6 21 Vs 6 21 vs 6 Subcomplejo 5 de NADH deshidroxigenasa (ubiquinona) 1 alfa, 13kDa Colageno, tipo Ill, alfa 1 (Sindrome Ehlers-Danlos tipo IV, dominante autosomal) Homologo 2 del gen supresor tumoral FAT (Drosophila) Pseudogen RAD52 de la proteina reparadora de los dafos del ADN y de recombinacion NDUFA5 COL3A1 FAT2 - NM 005000 NM 000090 NM 001447 -

-

3,34 21 vs 0 Ligando 5 de la quimioquina (C-X-C motif) CXCL5 NM 002994 -3,34 21 vs 0 Proteina Receptor DSC43 de las celulas madre LOC51333 NM 016643 -3,26 21 vs 6 Receptor del peptido natriuretico C/Guanilato ciclasa NPR3 NM 000908

C (receptor C del peptido atrionatriuretico) -3,22 21 vs 6 Respuesta de crecimiento temprano 2 (Homologo EGR2 NM 000399 Krox-20, Drosophila)

Tabla 3a/b: Puntos temporales: 6 vs) representa genes con una expresion diferente entre el dia 0 y el dia 6: 21 vs 0 representa genes con una expresion diferencial entre el dia 21 y el dia 0; y 21 vs 6 se refiere a los genes con un cambio de expresion entre el dia 6 y el dia 21.

Tabia 3c Los�1� genes �uue�mostraron �ia�mayor�reguiaci6n�ai aiaa en�ias �ceiuias T�perifericas de �ios pacientes en �ia�terapia �con IVMP

Factor cambio

Punto temporal Titulo del gen Simbolo del Gen ID Sec Ref

15,94 9,26 8,91 8,64 8,31 7,94 7,41 7,33 6,48 6

21 vs 6 21 vs 6 21 vs 6 21 vs 6 21 vs 6 21 vs 6 21 vs 6 6 vs 0 6 vs0 6 vs0 Receptor de leucocitos similar al de la inmunoglobulina, subfamilia A (sin dominio TM), elemento 4 prostaglandina D2 sintasa 21 kDa (cerebro) Periostina, factor especifico del osteoblasto miembro 5A de la familia del punto de integracion MMTV wingless prostaglandina D2 sintasa 21 kDa (cerebro) /// prostaglandina D2 sintasa 211 kDa (cerebro) inhibidor IC de la quinasa dependiente de la ciclina (p57. Kip2) inhibidor IC de la quinasa dependiente de la ciclina (p57. Kip2) defensina, afa 1, secuencia mieloide relacionada /// defesina, alfa 3, neutrofilo.especifica Dominio POU, clase 1, factor de transcripcion 1 (Pitl, factor 1 de la hormona del crecimiento) cadherina 13, H-cadherina (corazon) ILT7 PTGDS POSTN WNT5A PTGDS CDKNIC CDKNIC DEFA1 /// POUIF1 CDH13 NM 012276 NM 000954 NM 006475 NM 003392 NM 000954 NM 000076 NM 000076 NM 005217 NM 000306 NM 001257

Tabia 3d Los�1� genes �uue�mostraron �ia�mayor�reguiaci6n�a�ia �baja�en�ias�ceiuias�T�perifericas de�ios pacientes en �ia�terapia �con IVMP

Factor ID Sec Ref cambio

Punto temporal Titulo del gen Simbolo del Gen

Receptor de leucocitos similar al de ILT7 NM 012276 inmunoglobulina, subfamilia A (sin dominio TM), -11,52 6 vs 0 elemento 4 -9,73 6 vs 0 motivo tripartito conteniendo 58 TRIM58 NM 015431 -9,11 21 vs 6 Anticuerpo de Zwilch FLJ10036 NM017975 -8,24 21 vs 0 integrina, alfa 1 PELO NM 015946

-

7,86 21 vs 0 Proteina de dedos de zinc 6(CMPX1) ZNF6 NM 021998 -7,36 21 vs 6 Intersectina 1 (proteina del dominio SH3) ITSNI NM 003024

Proteina 1 inducida por forbol-12-miristato-13-7,3 21 vs 6 acetato PMAIPI NM 021127 -7,28 21 vs 0 Proteina transmembrana 47 TMEM47 NM 031442 -6,84 6 vs 0 -----------6,82 6 vs 0 prostaglandina D2 sintasa 21 kDa (cerebro) PTGDS NM 000954

Tabla 3c/d: Puntos temporales: 6 vs 0 representa genes con una expresion diferente entre el dia 0 y el dia 6: 21 vs 0 representa genes con una expresion diferencial entre el dia 21 y el dia 0; y 21 vs 6 se refiere a los genes con un cambio de expresion entre el dia 6 y el dia 21.

Los genes mas afectados en su expresion por el tratamiento con IVIG incluyen aquellos que codifican proteinas que regulan el ciclo celular (factor regulador transcriptional 1, TRERFI; inhibidor de la quinasa dependiente de la ciclina 1C, CDKN1C; cancer de mama 1, BRCA1; proteina 4 de enlace del dominio, SH3BP4), pero tambien proteinas reguladoras 5 de la inflamacion [quimioquina (C-X-C motif) ligando 5, CXCL5], la adhesion celular (homologo 2 supresor de tumores FAT, FAT2) o la diferenciacion celular (respuesta de crecimiento temprano, EGR2). Otros genes incluidos en la lista codifican proteinas que participan en el transporte de electrones, la fosforilacion, la glicosilacion, el desarrollo estructural

o proteinas cuya funcion no se ha definido aun.

Otros genes de interes que fueron regulados diferencialmente con el tratamiento con IVIG codificaron proteinas

10 implicadas en la regulacion inmune, como la interleucina 11 (IL11), quimioquina (motivo C) ligando 2 (XCL2), receptor 4 de la prostaglandina E (PTGER4), caspasa 2 (CASP2), receptor similar al de la inmunoglobina de celulas asesinas de cola citoplasmica corta 1 de dos dominios (KIR2DS1), proteina quinasa 2 activada por mitogeno (MAP4K2), ligando 5 (CXCL5) de la quimioquina (motivo C-X-C), ligando 3 (CXCL3) de la quimioquina (motivo C-X-C), elemento E de la familia 4 del dominio de la lectina de tipo C, (CLEC4E), ligando 13 de la quimioquina (motivo C-C) (CCL13) y alfa

15 fetoproteina (AFP) (vease la Tabla 4).

Tabia 4 Genes�diferenciaimente�expresados bajo�tratamiento�con �IVIG�uue codifican�proteinas uue participan en ia�reguiaci6n inmune

(observese que el numero de acceso de CLEC4E deberia ser NM 014358, y no NM 013458 en la Tabla 4).

Factor Punto Titulo del gen Simbolo del ID Sec Ref cambio temporal Gen

2 6 vs 0 Interleucina 11 IL11 NM 000641 2,38 21 vs 0 ligando 2 de la quimioquina (C motif) XCL2 NM 003175 2,28 21 vs 0 receptor 4 de la prostaglandina E (subtipo EP4) PTGER4 NM 000958 2,02 21 vs 0 caspasa 2, cisteina proteasa mediada por apoptosis CASP2 NM 032982

(con expresion de la celula precursora neural) 2,37 21 vs 6 receptor similar al de la inmunoglobina de celulas K1 R2DS1 NM 014512 asesinas de cola citoplasmica corta 1 de dos dominios 2,35 21 vs 0 proteina quinasa quinasa quinasa quinasa 2 MAP4K2 NM 004579

activada por mitogeno -3,34 21 vs 0 ligando 5 de la quimioquina (motivo C-X-C) CXCL5 NM 002994 -2,46 21 vs 0 ligando 3 de la quimioquina (motivo C-X-C) CXCL3 NM 002090 -2,26 21 vs 0 familia 4 del dominio de la lectina tipo C, CLEC4E NM 013458 -3,06 21 vs 6 ligando 13 de la quimioquina (motivo ligando C-C ) CCL13 NM 005408

-

2,53 21 vs 6 alfa-fetoproteina AFP NM 001134

Tabla 4: Puntos temporales: 6 vs 0 representa genes con una expresion diferente entre el dia 0 y el dia 6: 21 vs 0 representa genes con una expresion diferencial entre el dia 21 y el dia 0; y 21 vs 6 se refiere a los genes con un cambio de expresion entre el dia 6 y el dia 21.

Ejempio 5: Comparaci6n de ios Datos de Expresi6n Genica obtenidos de Pacientes tratados con IVIG y pacientes�tratados con�IVMP

Cuando se compararon los datos de expresion genica obtenidos de pacientes tratados con IVIC comparados con los

5 datos de expresion genica obtenidos de pacientes tratados con IVMP, se identificaron 17 genes cuya expresion se alteraba significativamente en ambos grupos de pacientes (Tabla 5). La mayor parte de las proteinas codificadas por estos 17 genes regulan el ciclo celular (HABP4, STAT1, CDKN1, SH3BP4 y ORC1L). Estos resultados indican que la regulacion del ciclo celular podria ser un mecanismo de eficacia terapeutica que tienen en comun ambos farmacos. Los otros genes que resultaron estar regulados diferencialmente tan solo se encontraron en uno de los dos grupos de

10 tratamiento y, por tanto, reflejan mecanismos de accion que son especificos tan solo de uno de los dos farmacos.

Tabia�5 Intersecci6n�de�genes�con�expresi6n�diferenciai�bajo�tratamiento�con�IVIG�y�tratamiento�con�IVMP

Titulo del Gen

Simbolo del gen Descripcion del proceso biologico GO ID de la Sec. de Ref.

cadherin 5, tipo 2. VEcadherin (epitelio vasc.) proteina 4 de enlace de hiaturonano Transductor de sefal y activador de la transcripcion 1, 91kDa Inhibidor IC de la quinasa dependiente de la ciclina (p57, KIp2) actinina, alfa 2 histona 1, H2bh proteina 4 de enlace del dominio SH3 Complejo reconoc. origen, tipo subunidad 1 (levadura) Producto genico KIAA0644 Sulfato de heparano(glucosamina) 3-Osulfotransferasa 1 ropporin, rhophilin, proteina 1B asociada

CDH5 HABP4 STAT1 CDKN1C ACTN2 HIST1 H2BH SH3BP4 ORC11 KIAA0644 HS3ST1 ROPNIB Adherencia celular /// celula --Regulacion de ciclo celular /// regulacion de transcripcion, ADNdependiente /// transcripcion a partir del promotor de ARN de la polimerasa 11 /// activacion de la caspasa /// cascada sefalizacion intracelular /// 1kappaB quinasa/NF-kappaB cascada /// fosf. tirosina Regulacion de la actividad quinasa de la proteina dependiente de la ciclina ///fase GI del ciclo mitotico celular /// ciclo celular/// detencion del ciclo celular/// regulacion negativa de la proliferacion celular /// regulacion negativa del ciclo celular Conjunto del nucleosoma /// Conjunto nucleosoma /// cromosoma y biogenesis (sensu Eucariota) /// ciclo celular Replicacion ADN /// Inicio de la replicacion del ADN --citoquinasis///transduccion de la sefa l/// transduccion de la sefal de la proteina Rho ///espermatogenesis /// reaccion acrosomal /// fusion esperma NM 001795 NM 014282 NM 007315 NM 000078 NM 001103 NM 003524 NM 014521 NM 004153 NM 014817 NM 005114 NM 00101233 7

/ membrana de plasma de huevo /// adherencia celula-celula/// movilidad del esperma

Fibra densa exterior de colas

OOF2 - NM 002540 de esperma 2

proteina desconocida -- 1-acigliocerol-3-fosfato O--

AGPAT7 Metabolismo NM 153813

acetiltransferasa 7 Proteina de dedos de zinc

ZNF804A - NM 194250

804A Dominio de dedos de zinc tipo

TRAFDI - NM 008700 TRAF que contiene 1

Ejempio 6: Confirmaci6n mediante PCR en tiempo reai de ios Datos de Expresi6n Genica obtenidos por anaiisis de�micromatrices

Los datos obtenidos por analisis de micromatrices fueron confirmados mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Para 5 ello se seleccionaron 4 genes que codificaban proteinas de las que se sabia que regulaban la regulacion immune (vease Tabla 4): PTGER4, CXCL5, 111 y CASP2. Los resultados de la PCR en tiempo real se muestran en la Figura 3A-

D. Los resultados obtenidos por PCR en tiempo real confirman los datos obtenidos mediante el analisis de micromatrices (Figura 3A-D, y Tablas 3 y 4).

DISCUSION

10 Este estudio se disefo para identificar genes que tuviesen una expresion diferencial en celulas perifericas T de pacientes con EMRR en fase de exacerbacion aguda con posterioridad al tratamiento con IVIG. Se ha demostrado que las celulas perifericas T (celulas T CD4+ y CD8+) participan en la patogenesis de la enfermedad y especialmente en el proceso de desmielinizacion y degeneracion axonal (Stinissen P. y col.., Mult Scler., 4:203-11 (1998)). Esto se ve respaldado por un reciente estudio en el que se demostro que una serie de genes de celulas sanguineas perifericas de

15 pacientes de EM mostraban una expresion diferencial comparados con los pertenecientes a gemelos sanos (Sarkijarvi

S. y col.., BMC Medical Genetics, 7:11 (2006)).

El analisis de los datos estadisticos revelo 360 genes que estaban regulados al alza o a la baja al menos en un factor de 2 en todos los pacientes tras el tratamiento con IVIG. El efecto del tratamiento con IVIG adquirio mayor prominencia a los 21 dias del comienzo del tratamiento con IVIG. Los genes cuya expresion se ve principalmente afectada por el 20 tratamiento con IVIG incluyeron aquellos que codifican proteinas que regulan el ciclo celular, la transduccion de la sefal, transcripcion, inflamacion, interacciones intracelulares y apoptosis. Es probable que estos procesos participen en la patogenesis de la EM. Cuando comparamos los efectos de la expresion genica causada por el tratamiento con el tratamiento con IVIG con los efectos causados por el tratamiento con IVMP, encontramos 583 genes que se regulaban diferencialmente tras el tratamiento con IVMP. La mayor parte de estos genes tenia su expresion alterada el sexto dia,

25 en comparacion con el dia 0 con posterioridad al comienzo de la terapia. Estos resultados indican que la IVMP podria ser un farmaco de accion mas rapida que la IVIG.

Se han identificado 17 genes cuya expresion se modifico de forma significativa en ambos grupos de pacientes. La mayor parte de las proteinas codificadas por estos 17 genes regulan el ciclo celular. Estos resultados sugieren firmemente que la regulacion de la proliferacion celular, y mas concretamente la regulacion de la proliferacion de las

30 celulas T, es un mecanismo de accion que tienen en comun ambos farmacos. Estos resultados concuerdan con los datos publicados, que indican que la IVIG suprime la proliferacion de las celulas T activadas cuando se administran a pacientes con EM (Andersson U. y col., Immunol Rev, 139:21-42 (1994); Bayry J. y col., Intravenous inmunoglobulina in autoimmune disorders: An insight into the immunregulatory mechanisms).

Un importante mecanismo de accion de la IVIG en la EM parece ser la modulacion de la expresion de la quimioquina.

35 Esta conclusion se basa en el descubrimiento de que una serie de genes que codifican quimioquinas (CXCL3, CXCL5, CCL13 y XCL2) tienen una expresion diferente al recibir tratamiento con IVIG. Estos cambios en la expresion del gen no se han detectado en pacientes tratados con IVMP. Por tanto, se cree que la modulacion de la expresion de la quimioquina en celulas T perifericas podria ser un mecanismo de accion especifico de la IVIG en EM. Diversos estudios han demostrado que las quimioquinas y los receptores de quimioquina participan en la patogenesis de la EM (Trebst C.

40 y Ransohoff R.M., Arch Neurol, 58:1975-80 (2001)). Se ha demostrado que las quimioquinas median en el paso de las celulas inmunes que atraviesan la barrera hematoencefalica y a la hora de dirigir la migracion de las celulas inmunes a los emplazamientos de lesiones activas (Szczucinski A. y Losy J., Acta Neurol Scand, 115:137-146 (2007)). Ademas, se detectaron quimioquinas en lesiones activas y su presencia era muy numerosa en el liquido cerebroespinal de pacientes aquejados de EM durante la recaida (Sindern E. y col., J Neuroimmunol, 131:186-90 (2002)). Se sabe que dos de las quimioquinas (CXCL3 y CXCL5) que estaban significativamente reguladas a la baja en nuestro estudio interactuan especificamente con el receptor de la quimioquina CXCR2 (Omari K. y col., Brain, 128:1003-1015 (2005)). En anteriores estudios se ha demostrado que la CXCR2 no solo se expresa en celulas sanguineas perifericas, como granulocitos, monocitos o linfocitos (Murdoch C. y col., Brain, 128:1003-1015 (2005(?)); Murphy P.M. y col., Pharmacol Rev., 52:14576 (2000)) sino tambien en los oligodendrocitos cerebrales. Los oligodendrocitos son fundamentales para la mielinizacion de los axones en la sustancia blanca del Sistema Nervioso Central, asi como para la remielinizacion de los axones durante la inflamacion en EM (Blakemore W.F., J Neurol Sci., (2007)). Se ha demostrado recientemente que la CXCR2 expresada en los oligodendrocitos es esencial para el desarrollo y el mantenimiento del linaje del oligodendrocito, la mielinizacion y la sustancia blanca en el SNC de los invertebrados (Tsai H.H. y col., Cell, 110:373-83 (2002); Padovani-Claudio D. y col., Glia, 54:471-483 (2006)). La regulacion del desarrollo y la migracion de los oligodendrocitos depende de la expresion localizada de la quimioquina CXCL1 y de su interaccion con la CXCR2 expresada en celulas precursoras del oligodendrocito y en los propios oligodendrocitos (Padovani-Claudio D. y col., Glia, 54:471-483 (2006)). Cualquier evento que interrumpa la interaccion entre CXCL1 y CXCR2 expresado en los oligodendrocitos o la sefalizacion inducida por esta interaccion podrian causar, por tanto, una interrupcion del proceso de remielinizacion de pacientes que sufren EM. En funcion de estos descubrimientos, se proponen las siguientes hipotesis para un nuevo mecanismo de accion de la IVIG en pacientes aquejados de EMRR durante la recaida. Las celulas perifericas T y los monocitos penetran en el SNC en respuesta a las quimioquinas producidas por la inflamacion cerebral. La barrera hematoencefalica alterada (Man S. y col., Brain Pathol., 17:243-50 (2007)) facilita este proceso. Tanto las celulas T como los monocitos producen quimioquinas en el cerebro que interfieren con la estrechamente regulada actividad de las celulas precursoras de oligodendrocitos y los oligodendrocitos. Esta interferencia podria estar causada por una desensibilizacion del receptor CXCR2 expresada en los oligodendrocitos o por una interferencia con la interaccion entre la CXCL1 y CXCR2 expresadas localmente en los oligodendrocitos. La IVIG regula a la baja la expresion de las quimioquinas en las celulas perifericas T, en los monocitos o en ambos. Por consiguiente, se impediria que las quimioquinas producidas por estas celulas interfiriesen en la funcion de los oligodendrocitos y se restableceria el proceso natural remielinizacion inducido por los oligodendrocitos. 0ueda por demostrar si la IVIG modularia no solamente la expresion de las quimioquinas en celulas perifericas T, sino tambien la expresion de las quimioquinas en celulas del SNC, por ejemplo, en los astrocitos.

La intencion del estudio era identificar los genes con mas probabilidades de ser asociados a las respuestas de las celulas T en caso de EM. La estrategia utilizada para la seleccion positiva de las celulas no excluye la posibilidad de que algunos de los genes identificados se asocien con monocitos perifericos en lugar de con celulas T. Esto ha de tenerse en cuenta a la hora de interpretar los datos anteriores. Los genes en los que se ha descubierto una expresion diferencial al recibir tratamiento con IVIG seran confirmados en un segundo ensayo clinico con un grupo de estudio mas amplio. Los genes diferencialmente expresados pueden utilizarse como marcadores de diagnostico de la eficacia terapeutica el tratamiento con IVIG. Asimismo, algunas de las proteinas codificadas por los genes de interes proporcionaran unas dianas adecuadas para el desarrollo de farmacos en el futuro.

LISTADO INFORMAL DE LA SECUENCIA ID SEC. N°: 1: Factor 1 de regulacion de transcripcion de Homo sapiens (TRERFI) (NM 018415)

ID SEC. N°: 2: Factor 1 de regulacion de las transcripciones del Homo sapiens (TRERFI) (NP 060885.1)

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES

   1. Metodo para verificar la eficacia de un tratamiento intravenoso con inmunoglobulina (IVIG) de exacerbaciones agudas de esclerosis multiple recurrente-remitente en un sujeto, comprendiendo el metodo los pasos de:

   (a) Poner en contacto una primera muestra biologica del sujeto tratado con IVIG con un reactivo que se

   5 une especificamente a una secuencia de acido nucleico del factor 1 de regulacion transcripcional (TRERF1);

   (b)

   Medir la expresion genica del TRERF1;

   (c)

   Comparar la expresion genica del TRERF1 en la primera muestra procedente del sujeto tratado con

   IVIG con la expresion genica del TRERF1 presente en una muestra de referencia procedente del 10 sujeto obtenida con anterioridad al tratamiento con IVIC; y

   (d) Determinar si el TRERF1 esta o no sobreexpresado o infraexpresado en la muestra procedente del sujeto tratado con IVIG en comparacion con la expresion genica del marcador en la muestra de referencia, verificando asi la eficacia del tratamiento con IVIG de la esclerosis multiple en el sujeto.
2. 2. Metodo segun la reivindicacion 1, caracterizado porque el reactivo es un acido nucleico.

   15 3. Metodo segun la reivindicacion 1, caracterizado porque el reactivo es un oligonucleotido.

3. 4.

   Metodo segun la reivindicacion 1, caracterizado porque el reactivo es un conjunto de cebadores de PCR RT.

4. 5.

   Metodo segun la reivindicacion 1, caracterizado porque la muestra es una muestra de sangre.

5. 6.

   Metodo segun la reivindicacion 5, caracterizado porque la muestra de sangre comprende celulas T.

6. 7.

   Metodo segun la reivindicacion 1, caracterizado porque la muestra es liquido cerebroespinal.

   Fig. 1

   Fig. 2 A-B Fig. 3 A-D