KR20170005587A - 뇌발달 장애의 진단을 위한 정보제공방법 및 이를 위한 진단용 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 CCN3 또는 이의 다운스트림 작동인자(downstream effector)인 RAB25의 뇌발달 장애 진단용 마커로서의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 CCN3 또는 RAB25를 이용한 뇌발달 장애의 진단을 위한 정보제공방법, 뇌발달 장애 진단용 조성물 및 키트에 관한 것이다. CCN3의 세포내 발현양 증가는 신경세포 축삭의 성장을 억제하며, 나아가 RAB25의 발현을 증가시키고, 발현이 증가된 RAB25 역시 신경세포들의 신경축삭 성장을 저해하므로, 본 발명의 CCN3와 RAB25는 뇌발달 장애의 위험성을 예측 및 진단할 수 있는 진단마커로 사용될 수 있다.

Description

뇌발달 장애의 진단을 위한 정보제공방법 및 이를 위한 진단용 키트{Method of providing information for diagnosis of neurodevelopmental disorder and diagnostic kit}

본 발명은 CCN3 또는 이의 다운스트림 작동인자(downstream effector)인 RAB25의 뇌발달 장애 진단용 마커로서의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 CCN3 또는 RAB25를 이용한 뇌발달 장애의 진단을 위한 정보제공방법, 뇌발달 장애 진단용 조성물 및 키트에 관한 것이다.

포유동물 뇌의 뇌량(corpus callosum)은, 주로 IIIV층 피라미드 뉴런(layer IIIV pyramidal neurons)으로부터 유래한 투사(projection)를 포함하는, 두 개의 대뇌 반구(cerebral hemispheres)를 연결하는 잘 특징지어진 교련투사(commissural projection)이다[D.P. Leone, et al. The determination of projection neuron identity in the developing cerebral cortex, Curr. Opin. Neurobiol. 18 (2008) 28-35]. 뇌량의 비정상적인 발달은 자폐 스펙트럼 장애(autism spectrum disorder), 오피츠 증후군(Opitz syndrome) 및 난독증(dyslexia)과 같은 신경발달장애 및 정신질환과 관련이 있다[C.M. Freitag, et al. Thompson, A.W. Toga, C. Krick, C. Konrad, Total brain volume and corpus callosum size in medication-naadolescents and young adults with autism spectrum disorder, Biol. Psychiatry. 66 (2009) 316-319]. 교량의 구조는 고유의 유전적 요인과 대뇌피질 발달 동안의 다양한 외부적 신호에 대한 세포의 반응에 기초하여 형성된다. 지금까지 뇌량 발달에 중요한 여러 인자들이 발견되었는데, 가령 SATB2 (special AT-rich sequence-binding protein 2) 전사인자는 뇌량 투사 뉴런(callosal projection neuron specification)에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었으며[E.A. Alcamo, L. Chirivella, M. Dautzenberg, G. Dobreva, I. Fari, R. Grosschedl, S.K. McConnell, Satb2 regulates callosal projection neuron identity in the developing cerebral cortex, Neuron. 57 (2008) 364-377], 세포골격 리모델링 인자 Midline-1 [T. Lu, et al. Bartlett, L. Xu, J. Zhang, B. Lu, M. Wu, Q. Shen, Y. Liu, L.J. Richards, Z. Xiong, X-linked microtubule-associated protein, Mid1, regulates axon development, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110 (2013) 19131-19136]과 다양한 Eph 수용체들(B13 및 A4) 및 에프린(ephrins) (B1-3)은 액손 발달과 관련된 인자들로 알려져 있다[S.W. Mendes, M. Henkemeyer, D.J. Liebl, Multiple Eph receptors and B-class ephrins regulate midline crossing of corpus callosum fibers in the developing mouse forebrain, J. Neurosci. 26 (2006) 882-892]. 그러나 뇌량 투사 뉴런(callosal projection neurons)이 어떻게 대측 대뇌 반구(contralateral hemisphere)에 적절히 위치하고 확장되는지는 아직까지 명확히 밝혀져 있지 않다.

신경발달 과정에 관여하는 한 가지 흥미로운 단백질은 과발현된 신아세포종(nephroblastoma)으로도 알려진 CCN3 (cysteine-rich 61/connective tissue growth factor 3)이다. 이 단백질은 여러 기초적인 생물학적 프로세스에 관여하는 것으로 알려져 있다[A. Leask, D.J. Abraham, All in the CCN family: essential matricellular signaling modulators emerge from the bunker, J. Cell. Sci. 119 (2006) 4803-4810]. 몇몇 연구결과들에 의하면 CCN3는 뉴런 발달을 조절하는 역할을 하는 것으로 보이나[M. Laurent, et al. Temporal and spatial expression of CCN3 during retina development, Devl. Neurobio. 72 (2012) 1363-1375], 피질 피라미드 뉴런(cortical pyramidal neurons)에서의 기능은 아직 구체적으로 밝혀지지 않았다.

CCN3는 4개의 보존된 도메인(insulin-like growth factor binding protein-like domain, von Willebrand factor C repeat domain, thrombospondin-1 repeat domain, 및 C-terminal domain containing a cysteine knot)으로 구성된, CCN 패밀리 단백질 멤버이다[K.P. Holbourn, K.R. Acharya, B. Perbal, The CCN family of proteins: structure-function relationships, Trends. Biochem. Sci. 33 (2008) 461-473]. CCN3 유전자는 병아리의 신아세포종(nephroblastoma)에서 발견되었으며, 조류의 신장에서 CCN3의 높은 발현은 비정상적인 증식 및 분화를 유도하는 것으로 보고되었다[V. Joliot, C. Martinerie, et al. Proviral rearrangements and overexpression of a new cellular gene (nov) in myeloblastosis-associated virus type 1-induced nephroblasomas, Mol. Cell. Biol. 12 (1992) 10-21]. CCN3 단백질의 수준은, platelet-derived growth factor, fibroblast growth factor 2 및 transforming growth factor ß1과 같은 다양한 성장인자들을 포함한 세포 밖 환경의 자극에 의해 조절된다[J.I. Jun, L.F. Lau, Taking aim at the extracellular matrix: CCN proteins as emerging therapeutic targets, Nat. Rev. Drug Discov. 10 (2011) 945-963]. 그러나 세포내 CCN3 수준의 조절장애가 중추신경계에서 뉴런 발달에 미치는 영향과 CCN3에 의해 영향 받는 다운스트림(downstream) 분자들에 미치는 영향은 아직 잘 알려져 있지 않다.

이에 본 발명자들은 CCN3와 RAB25의 발현을 분석함으로써 RAB25가 CCN3의 다운스트림 작동인자(downstream effector)임을 밝히고, 이들의 발현 수준이 뇌 발달에 미치는 영향을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

미국특허 제7,780,949호

본 발명의 목적은 CCN3 또는 이의 다운스트림 작동인자(downstream effector)인 RAB25를 바이오마커로 이용하여 뇌발달 장애의 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 CCN3 또는 RAB25를 이용한 뇌발달 장애 진단용 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.

따라서 본 발명은, (a) 피검체로부터 얻은 시료에서 CCN3 또는 RAB25 유전자 또는 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 발현 정도를 정상 시료에서의 해당 유전자 또는 단백질의 발현 정도와 비교하는 단계를 포함하는, 뇌발달 장애의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, (b) 단계의 비교 결과, 피검체 시료의 CCN3 또는 RAB25 유전자 또는 단백질이 정상 대조구 시료에서보다 과발현된 경우 뇌발달 장애의 가능성이 있는 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 CCN3 또는 RAB25 유전자 또는 단백질의 발현 정도를 측정하는 방법은 역전사효소 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소연쇄반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소연쇄반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 분석법(DNA chip technology assay), 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescenceactivated cell sorter analysis), 단백질 칩 분석법(protein chip technology assay) 또는 형광 이미지 분석일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 뇌발달 장애의 가능성이 있는 것으로 판단하는 것은 정상 대조구 시료에 비해 피검체 시료에서 CCN3 또는 RAB25 유전자 수준; 또는 CCN3 또는 RAB25 단백질 수준이 1.2 ~ 2배로 증가되어 있는 경우일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 시료는 임신한 모체 또는 임신 후 유아기까지의 피검체로부터 얻은 혈액 또는 양수 시료일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 뇌발달 장애는 자폐증, 정신분열증, 양극성 장애 및 정신지체를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 CCN3 또는 RAB25 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 뇌발달 장애 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제제는 CCN3 또는 RAB25 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제로서, CCN3 또는 RAB25 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 CCN3 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머는 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 쌍일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 조성물을 포함하는 뇌발달 장애 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 뇌발달 장애는 자폐증, 정신분열증, 양극성 장애 및 정신지체를 포함할 수 있다.

전기자극을 이용한 대뇌피질 신경세포에서의 CCN3의 과발현을 통해, CCN3의 세포내 발현양 증가는 신경세포 축삭의 성장을 억제하며, 나아가 RAB25의 발현을 증가시키고, 발현이 증가된 RAB25 역시 신경세포들의 신경축삭 성장을 저해한다는 사실을 확인하였다. 따라서 본 발명의 CCN3와 RAB25는 뇌발달 장애의 위험성을 예측 및 진단할 수 있는 진단마커로 사용될 수 있다.

도 1은 neuro2a 세포에서 CCN3 과발현이 신경돌기 생성(neurite outgrowth)에 미치는 영향을 나타낸 실험결과이다. (A)는 대뇌피질 발달 과정 동안의 Ccn3 mRNA 발현을 보여주는 결과이며, (B)는 Gapdh(n=3)의 발현에 대해 정규화된 상대적인 mRNA 발현 수준을 나타내며, (C)는 CCN3-V5 재조합 발현을 웨스턴 블랏 분석으로 측정한 결과이며, (D)는 Gfp 리포터 벡터와, Ccn3 또는 빈 벡터로 동시 형질주입(cotransfection)된 neuro2a 세포의 형광 이미지 사진이다. (E)는 신경돌기를 포함하는 세포들을 현미경 이미지로부터 정량한 결과이다.
도 2는 CCN3 과발현의 뇌량 중간선 교차(midline crossing) 억제 효과를 보여준다. (A)는 E14.5에 일측 전기천공 실험에 사용된 발현 벡터의 모식도이다. (B)는 원하는 피질 위치에 삽입된 발현 벡터를 나타내는 P0 뇌의 형광 이미지이다. (C 및 E)는 대조구에서, 뇌량 증간선을 가로질러 대측 대뇌 반구로 투사된 GFP-양성 액손을 나타낸다. (D 및 F)는 중간선을 가로지른 CCN3-과발현 뉴런을 나타낸다. (Ob, olfactory bulb; Ctx, cortex; Mb, midbrain; Cb, cerebellum. 축척 = 500 ).
도 3은 양측 전기천공(bilateral electroporation) 실험 결과이다. (A)는 E14.5에 양측 전기천공 실험에 사용된 발현 벡터의 모식도이다. (B)는 원하는 피질 위치에 삽입된 발현 벡터를 나타내는 P0 뇌의 형광 이미지이다. (C)는 뇌량 액손의 형광 강도를 정량적으로 분석한 결과이다. 점선은 뇌량 중간선을 나타낸다. (D)는 대조구 반구에서 RFP-표지된 상층(upper layer) 피라미드 뉴런으로부터의 투사가 대측 반구까지 확장된 것을 나타낸다(D, d, F, f). 반대로, CCN3를 동시 발현하는 GFP-양성 뉴런으로부터의 투사는 뇌량의 중간선(점선)에서 현저히 감소하였고, 약간의 섬유만이 대측에서 검출되었다(E, e, F, f). 색칠하거나 빈 화살촉은 각각 동측성 피질(ipsilateral cortex) 및 대측의 뇌량 액손을 나타낸다. 화살표는 뇌량 액손의 경로를 나타낸다(f). 축척 = 500
도 4는 생체 외 및 생체 내 실험에서 RAB25 과발현이 나타내는 신경돌기 성장 억제 효과를 보여준다. (A) Neuro2a 세포들을 Gfp 리포터 벡터, 및 Ccn3 또는 Rab25로 동시 형질주입하였다. (B) CCN3-, RAB25-V5 재조합 발현을 웨스턴 블랏으로 측정하였다. (C) 신경돌기를 포함한 세포들을 현미경 이미지로 계량하였다. (D) RAB25 과발현 후 뇌량 중간선을 건너 대측 대뇌 반구로 투사되는 GFP-양성 액손은 관찰되지 않았다(색칠된 화살촉 표시). 반면에, 우성-음성 RAB25-T26N을 발현하는 GFP-양성 액손은 대측 대뇌반구로 투사되었다(색칠된 화살촉 표시). (축척 = 500 )

본 발명은 CCN3 또는 RAB25의 유전자 또는 이들의 단백질 발현 정도를 측정하는 단계를 포함하는 뇌발달 장애의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 "진단"이라는 용어는 분자적 또는 병리학적 상태, 질환 또는 병증을 확인하는 것, 예컨대, 뇌발달 장애를 확인하는 것을 의미하거나, 또는 특정 치료 요법으로부터 이익을 얻을 수 있는 뇌발달 장애 환자를 확인하는 것을 의미한다.

일반적으로 CCN3는 세포이동(migration), 부착(adhesion), 분화(differentiation)과 같은 다양한 세포의 활동에 관여하는 분비성 다기능 단백질인 CCN 패밀리의 한 구성원이다. 이전 연구에 의하면 CCN3는 발달 중인 랫(rat)의 중추신경계에서 발현하며, 그 발현 증가는 종양 유발과 깊은 연관이 있는 것으로 알려져 왔다. 그러나 생쥐의 대뇌 발달과정에서 CCN3가 어떻게 발현하며, 비정상적인 발현이 어떻게 대뇌 발달에 영향을 미치는가에 대해서는 연구되지 않았다.

이에 본 발명자들은 CCN3가 마우스에서 태아 발달 15일에 발현하기 시작하여 생후 21일까지 지속적으로 증가한다는 사실을 발견하였다(도 1A 및 B 참고). 또한, 단일 혹은 양쪽면 전기자극 실험을 통하여, 대뇌피질 신경세포에서 CCN3의 세포내 발현양 증가는 신경세포 축삭의 성장을 억제한다는 사실을 발견하였다(도 1E). 더 나아가, 전사체 분석법을 이용하여, CCN3의 세포내 과잉발현은 small GTPase 중 하나인 RAB25의 발현을 증가시킨다는 사실을 발견하였으며, RAB25의 생체내 기능을 밝히기 위해, 태아의 대뇌에 전기자극법을 활용하여 RAB25를 발현하는 벡터를 도입하였을 때, RAB25가 과발현하는 신경세포들의 신경축삭 성장 또한 저해 받는다는 것을 확인하였다(도 4). 나아가 RAB25-T26N이라고 하는 RAB25의 기능상실 돌연변이를 제작하여 신경세포에 도입하였을 때 이전에 보여진 신경축삭 저해효과가 사라짐을 확인하였다(도 4D).

이러한 결과들을 토대로 본 발명자들은 CCN3의 정교한 발현조절이 정상적인 뇌 발달 및 신경망 형성에 중요한 역할을 하며, 이러한 정교한 발현조절 실패는 뇌발달 장애로 이어질 수 있다는 것을 알 수 있으며, 나아가 비정상적인 CCN3의 발현은 RAB25 단백질의 세포내 발현 유도를 통해 인간을 포함한 고등 포유동물의 뇌발달 장애를 유발할 수 있음을 시사해 준다.

따라서 본 발명의 CCN3와 RAB25는 그 발현수준 측정을 통해 뇌발달장애의 위험성을 예측 및 진단할 수 있는 진단마커로서 사용될 수 있다.

그러므로 본 발명은 CCN3 또는 RAB25 유전자 발현수준; 또는 CCN3 또는 RAB25의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 뇌발달 장애 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 유전자의 발현 수준은, 바람직하게 상기 유전자가 발현된 mRNA 수준, 즉, mRNA의 양을 의미하며, 상기 수준을 측정할 수 있는 물질로는 상기 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 CCN3 또는 RAB25 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브는 상기 CCN3 또는 RAB25의 유전자 전체 또는 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있으며, 상기 프라이머 또는 프로브는 당업계에 알려진 방법을 통해 디자인할 수 있다. 바람직하게 상기 CCN3 유전자는 서열번호 11로 표시되는 염기서열을 갖는 것일 수 있고, CCN3 단백질은 서열번호 12로 표시되는 펩타이드 서열을 갖는 것일 수 있다.

또한, 바람직하게 상기 RAB25 유전자는 서열번호 13으로 표시되는 염기서열을 갖는 것일 수 있고, RAB25 단백질은 서열번호 14로 표시되는 펩타이드 서열을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 CCN3 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머는 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 쌍이 될 수 있다.

본 발명에서 상기프라이머란 용어는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 바람직하다.

상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.

본 발명에서, 상기프로브라는 용어는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 단백질의 수준을 측정할 수 있는 물질로는 상기 본 발명의 CCN3 또는 RAB25 마커 유전자로부터 발현된 단백질들에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등의 항체를 포함할 수 있다.

상기 “항체”는 당해 기술분야의 일반적 기술자가 공지된 기술을 이용하여 제조된 것을 사용할 수 있는데, 상기 항체의 제조는 예컨대, 다클론 항체의 경우에는 상기 단백질의 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있으며, 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조가능하다. 단일클론 항체의 경우에는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마(hybridoma) 방법(Kohler et al., European Jounral of Immunology, 6, 511-519, 1976)을 이용하여 제조할 수 있거나 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352, 624-628, 1991, Marks et al, J. Mol . Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 뇌발달 장애 진단용키트를 제공한다.

본 발명의 진단용 키트는 상기 마커 유전자인 CCN3 또는 RAB25 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 양을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체를 포함할 수 있으며, 이들의 정의는 앞서 기술된 바와 같다.

본 발명의 진단용 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 간암 진단용 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있으며, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 진단용 마커 또는 상기 진단용 조성물을 포함하는 뇌발달 장애 진단용 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기 마커 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기 기질 상에 배열되고 고정화되며, 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.

한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료가 핵산일 경우에는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화 될 수 있다. 혼성화 조건은 다양할 수 있으며, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

나아가 본 발명은 피검체로부터 얻은 시료에서 CCN3 또는 RAB25 유전자 또는 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및 이를 정상 시료에서의 해당 유전자 또는 단백질의 발현 정도와 비교하는 단계를 포함하는 뇌발달 장애의 진단을 위한 정보제공방법을 제공할 수 있다.

상기 정보제공방법은, 상기 비교 결과, 피검체 시료의 CCN3 또는 RAB25 유전자 또는 단백질이 정상 대조구 시료에서보다 과발현된 경우, 뇌발달 장애의 가능성이 있는 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 "피검체로부터 얻은 시료"란 뇌발달의 진행 정도에 따른 상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 수준이 정상 대조군과는 다른, 생체로부터 채취된 시료를 말하며, 상기 시료로는 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등이 포함될 수 있으며 나아가 임신한 모체 또는 임신 후 유아기, 바람직하게는 7세까지의 피검체로부터 얻은 혈액 또는 양수 시료일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 유전자의 발현 수준 측정은 바람직하게는 mRNA의 수준을 측정하는 것이며, mRNA의 수준을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블럿 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 상기 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 웨스턴 블럿, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있다.

따라서 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여, 대조군의 마커 유전자의 mRNA 발현 양 또는 단백질의 양과 뇌발달 장애 이상 환자 또는 의심환자에서의 마커 유전자의 mRNA 발현 양 또는 단백질의 양을 확인할 수 있고, 상기 발현 양의 정도를 대조군과 비교함으로써 뇌발달 장애 발병여부, 진행단계 또는 예후 등을 예측 및 진단할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 정상 대조구 시료에 비해 피검체 시료에서 CCN3 또는 RAB25의 유전자 발현 수준; 또는 CCN3 또는 RAB25의 단백질 수준이 1.2 ~ 2배로 양적 증가되어 있는 경우 뇌발달 장애가 발생된 것으로 판단할 수 있다.

종래까지 뇌발달 장애 여부를 정확하면서도 간단하게 분석할 수 있는 방법이 부재하여 뇌발달 장애 여부를 사전에 확인할 수 없었으나, 본 발명에서는 뇌발달 장애의 발생여부, 진행예후 등을 간단하게 확인할 수 있는 방법을 제시함과 동시에 발병 여부, 이상 가능성 및 예후 등을 정상에 비해 CCN3 또는 RAB25의 유전자 또는 단백질 수준이 1.2~2배 이상으로 발현되어 있다면 위험 가능성이 있는 것으로 분석할 수 있음을 제시하였다.

나아가 본 발명에 따른 상기 뇌발달 장애는 자폐증, 정신분열증, 양극성 장애, 정신지체, 주의력 결핍 과잉행동장애(Attention Deficit Hyperactivity Disorder, ADHD), 자폐스펙트럼장애(Autism Spectrum Disorder, ASD), 레트 증후군, 소아기 붕괴성 장애 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1>

실험재료 및 방법

<1-1> 실험동물

실험동물로 ICR 마우스(timed-pregnant ICR mice)를 사용하였다. 질전(vaginal plug)이 발견된 날의 12 pm을 태아일(embryonic day) 0.5 (E0.5)로, 출생일을 생후일(postnatal day) 0 (P0)으로 정의하였다.

<1-2> 플라스미드 제작

Ccn3 및 리포터 유전자들을 발현시키기 위하여, V5 에피토프(epitope), GFP (green fluorescent protein), 또는 RFP (red fluorescent protein)가 표지된 마우스 Ccn3 (BC003774)를 암호화하는 전장(full-length) 상보적 DNA(complementary DNA) 서열을 pCAGEN (Addgene, Cambridge, MA, USA) 포유동물 발현벡터에 삽입하였다. 상기 발현벡터는 변형된 병아리 베타-액틴 프로모터(chick β-actin promoter)를 가진 cytomegalovirus immediate early enhancer를 포함하여, 장기간 높은 수준의 신경 조직 발현을 가능하게 한다.

Rab25 및 Rab25-T26N 발현벡터는, V5 에피토프(epitope)가 표지된 마우스 Rab25 (BC006624)를 암호화하는 전장(full-length) 상보적 DNA(complementary DNA) 서열을 pCAGEN 벡터에 삽입하여 제작하였고, 이를 오버래핑(overlapping) PCR 방법으로 돌연변이 유발(mutagenesis)에 사용하였다.

Rab25-T26N을 제작하기 위하여, 다음 프라이머들을 사용하여 92 bp 크기의 단편과 577 bp의 단편을 증폭하였다.

- 92 bp 단편 증폭용 프라이머

정방향(Forward): 5’- ATGGGGAATCGAACAGATGA 3’ (서열번호 1) 및

역방향(Reverse): 5’- CGGGACAGCAGATTGTTCTTGCCCACGCCT 3’(서열번호 2).

- 577 bp 단편 증폭용 프라이머

정방향: 5’- AGGCGTGGGCAAGAACAATCTGCTGTCCCG 3’(서열번호 3) 및

역방향: 5’- GAGGCTGATGCAACAGGC 3’(서열번호 4).

상기 두 개의 부분적으로 상보적인 PCR 단편들을 어닐링하여(annealed), 다음 프라이머를 사용하는 또다른 PCR 반응의 주형으로 사용하였다: 5’- ATGGGGAATCGAACAGATGA -3’(서열번호 5) 및 5’- GAGGCTGATGCAACAGGC 3’(서열번호 6).

642-bp의 반응 산물을 SpeI으로 자르고, V5 에피토프 서열을 포함하는 pCAGEN 벡터에 서브클로닝하였다.

<1-3> 세포배양 및 웨스턴 블랏팅

Neuro2a 세포를 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)으로부터 입수하였다. Neuro2a 세포는 10% 소 태아 혈청(fetal bovine serum) (Hyclone, Logan, UT, USA)을 첨가한 DMEM 배지(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)에서 배양하였다. 5 레티노산(RA) (Sigma, St. Louis, MO, USA)을 48시간 동안 처리함으로써 상기 세포들을 분화시켰다. Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 제조사의 지시에 따라 사용하여, 약 90% 컨플루언스(confluence)의 세포들을 트랜스펙션시켰다. 24시간 후에 세포들을 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail) (Sigma)을 포함한 RIPA (radio-immunoprecipitation) 버퍼(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)에서 용해시켰다. 분화를 위하여, 배지를 1% 소 태아 혈청을 첨가한 DMEM 으로 교체하였다. 총 단백질들을 412% 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel) (Invitrogen)에 로딩하고, PVDF 막(polyvinylidene fluoride membrane)으로 이동시켰다(Bio-Rad, Hercules, CA, USA). 필터를 항-V5 (1:3000, Invitrogen) 및 항-액틴(actin) (I-19) 항체(1:1000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)로 면역블랏(immunoblotted)하였다.

<1-4> 일측 및 양측 자궁 내 전기천공법( Uni - and bilateral in utero electroporation )

공지의 방법(S. Shim, K.Y. Kwan, M. Li, V. Lefebvre, N. Sestan, Cis-regulatory control of corticospinal system development and evolution, Nature. 486 (2012) 74-78)을 일부 변형하여 자궁 내 전기천공 실험(in utero electroporation)을 수행하였다. 간략히 설명하면, E14.515.5 시기의 임신한 ICR 마우스 (Orientbio, Seongnam, South Korea)를 케타민(ketamine)/자일라진(xylazine) (80/10 mg/kg, Sigma)으로 마취시키고, 개복수술로 자궁각(uterine horns)을 노출시켰다. 마우스-조절 유리 모세관 마이크로피펫(mouth-controlled glass capillary micropipette)을 광원 아래서 사용하여, 자궁벽을 통하여 DNA (증류수 내 12 μg/μL)를 어느 하나의 측뇌실(lateral ventricles)에 주입하였다. 자궁각을 예열된 식염수로 적신 후에, 태아의 머리를 전극 사이에 조심스럽게 위치시켰다. ECM 830 electro square porator (BTX, Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA)로 다섯 개의 전기자극[진폭, 45 V; 지속시간(duration), 50 ms/pulse; 간격(interval), 950 ms]을 전달하였다. 양측 전기천공(bilateral electroporation) 실험을 위하여, 양쪽 측뇌실(ventricles)에서 DNA 충전은 단일한 한쪽 주입(single monolateral injection)으로 수행되었다. 모든 실험을 위해, 전기천공 후에 자궁각을 복강 내에 재위치시키고, 복벽을 봉합하였다. 일부 실험에서는 RFP (2 μg/μL)를 암호화하는 공지된 플라스미드도 주입하였다.

<1-5> 형광 이미지 관찰

뉴런의 형태 분석을 위하여 neuro2a 세포들을 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정시키고, 실온에서 PBS (phosphate-buffered saline)로 각각 10분간 세 번 세척하였다. 핵을 DAPI (4', 6-diamidino-2-pheylindole dihydrochloride) (Sigma)로 염색하고, VECTASHIELD 마운팅 배지(Vector Labs, Burlingame, CA, USA)를 이용하여 세포들을 슬라이드에 마운팅하였다. 형광 이미지는 ECLIPSE Ti 현미경(Nikon, Tokyo, Japan)을 사용하여 얻었다. 세포체(cell body) 직경의 3배 이상의 길이를 갖는 돌기를 신경돌기(neurites)로 정의하였다. 신경돌기-함유 세포를 정량하기 위하여 40개의 세포를 임의로 선택하였다. 생후(postnatal stages) 0 단계부터의 뇌를 절개하고, 4% PFA에서 오버나잇(4℃)으로 고정한 후, 비브라톰(vibratome) (Leica, Wetzlar, Germany)을 사용하여 박편(section)을 만들었다. DAPI를 포함한 VECTASHIELD 마운팅 배지에서 박편들을 직접 마운트시키고 공초점 현미경으로 형광신호를 분석하였다.

<1-6> RNA 추출 및 semi - quantitative RT - PCR

RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Venlo, The Netherlands)를 사용하여 여러 다른 발달단계(E13.5, E15.5, E18.5, P0, P7, P14, 및 P21)의 마우스로부터 총 RNA를 추출하였다. cDNA 합성은 HiSenScript RH RT PreMix Kit (Intronbio, Seongnam, South Korea)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 수행하였다. Ccn3 cDNA에 대해, 5'-CTGAGATGAGACCCTGTGAC-3' (서열번호 7) 및 5'- TTGTCTCCCTCTGGAACCAT 3' (서열번호 8) 프라이머로 100-bp 스트레치(stretch)를 증폭하였다. Gapdh cDNA에 대해, 5'-ATCACTGCCACCCAGAAGAC-3' (서열번호 9) 및 5'-CATGCCAGTGAGCTTCCCGT-3' (서열번호 10) 프라이머를 사용하여 153-bp 스트레치(stretch)를 증폭하였다. PCR은 HotStarTaq DNA polymerase (QIAGEN)를 사용하여 수행하였으며 반응조건은 다음과 같다: 95℃, 1분의 변성(denaturation) 단계; 60℃, 0.5분의 어닐링(annealing) 단계; 및 72℃, 1.5분의 중합(polymerization) 단계를 이용한 25 사이클의 증폭(amplification). PCR 반응산물은 2% 아가로오스 겔에서 분리하였다.

<1-7> 마이크로어레이

TRIzol 시약(Invitrogen) 및 RNeasy Plus Kit (QIAGEN, Venlo, The Netherlands)를 사용하여, Gfp 및 Ccn3 발현벡터로 동시 형질주입(cotransfection)된 새로 절개한 피질 조질으로부터 총 RNA를 분리하였다. 피질 조직의 절개는 P0에 형광 현미경으로 수행하였다. 총 RNA의 양과 질은 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)로 측정하였다. Affymetrix GeneChip Mouse Gene 430 (Santa Clara, CA)으로 전체 마우스 유전체 마이크로어레이를 수행하였다. 상기 어레이를 스캔한 후에 Affymetrix Expression console DAVID를 사용하여 분석하였다. 유전자를 선택하기 위해 사용된 기준은 빈 벡터로 전기천공된 피질에 비해 CCN3 과발현된 피질에서 상당히 상향조절(up-regulated)되거나 하향조절(down-regulated)되었다(> 1.5 fold).

<1-8> 통계분석

정량적 데이터는 대표적인 실험(n = 3)의 평균±표준편차(SD)로 나타내었다. 통계분석은 one-tailed Student’s t-tests를 사용하여 수행하였다. p < 0.05 값을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

< 실시예 2>

대뇌피질 발달 과정에서 CCN3 의 발현 패턴

이전 연구들에 따르면, CCN3는 랫(rat)의 대뇌피질과 소뇌를 포함한 여러 생후(postnatal)의 포유동물 신경조직에서 높게 발현되었으며, 발현 정도는 연령에 비례(age-dependently)하였다[G.L. Dr, A. et al. NOV/CCN3 promotes maturation of cerebellar granule neuron precursors, Mol. Cell. Neurosci. 43 (2010) 60-71 및 B.Y. Su, et al., The expression of ccn3 (nov) RNA and protein in the rat central nervous system is developmentally regulated, Mol. Pathol. 54 (2001) 184-191]. 이에 본 발명자들은 RT(reverse-transcriptase)-PCR을 이용하여 태아 및 생후의 마우스 뇌에서 CCN3의 발현 패턴을 조사하였다.

그 결과, 더 높은 단계의 피질층이 될 뉴런이 형성되는 태아발달 15일(embryonic day 15 (E15.5))에 Ccn3 mRNA는 매우 낮은 수준으로 발현되었고(도 1A 및 B), 생후 7일(postnatal day 7 (P7))부터 21일(P21)까지 유사한 수준으로 (특히, 상층) 피질(cortex)에서 강하게 발현되었다(도 1A 및 B). 이러한 결과는 Ccn3 발현이, 생후 단계에서 더 많이 나타나기는 하지만, 대뇌피질의 신경발생(neurogenesis)(E12.518.5)과 어느 정도 중복된다는 것을 보여준다.

< 실시예 3>

neuro2a 세포에서 CCN3 과발현에 의한 RA -유도성 신경돌기 생성의 저해

neuro2a 세포에서 CCN3 과발현이 신경돌기 생성(neurite outgrowth)에 미치는 영향을 알아보기 위하여, pCAG-GFP 리포터 벡터를 이용한 동시 형질주입(cotransfection)에 의해 neuro2a 세포에서 CCN3 발현을 상향조절(upregulation)하였다.

먼저, V5 에피토프(epitope)가 부착된 재조합 CCN3가 발현 및 분비되는지 확인하기 위하여 웨스턴 블랏팅을 수행하였다(도 1C). Neuro2a 세포들은 레티노산(retinoic acid, RA)이 없는 상태에서는 분화하지 않았지만, RA를 첨가하여 2일간 배양한 후에는 신경돌기(neurites)로 성장하기 시작하였다. 흥미롭게도, CCN3를 과발현하는 RA-처리된 neuro2a 세포들은 RA-처리된 대조군에 비해 훨씬 더 적은 신경돌기를 가졌다(도 1D 및 E).

이러한 결과들은 neuro2a 세포에서 CCN3 과발현이 RA-유도성 신경돌기 생성을 저해한다는 것을 보여준다.

< 실시예 4>

뇌량 투사뉴런( callosal projection neurons )을 통한 CCN3 과발현의 중간선 교차( midline crossing) 억제 효과

다음으로, CCN3 과발현이 대뇌피질에서 상층 피라미드 뉴런(upper layer pyramidal neurons)으로부터의 뇌량 투사(callosal projections)에 영향을 미치는지 여부를 알아보기 위하여, 특정 대뇌피질 뉴런에서 전기천공법(electroporation)을 이용하여 특정 유전자들을 과발현시켰다(도 2A).

그 결과, 대조군에서는 GFP-과발현 뉴런이 성공적으로 뇌량의 중간선(midline)을 교차한 후 대측 대뇌 반구(contralateral hemisphere)로 투사되었지만(도 2B, C, E), CCN3-과발현 제작물(construct)의 경우에는 대조군에 비해 중간선에서 GFP-양성 액손들의 수가 현저히 감소한 것을 확인하였다(도 2B, D, F). 흥미롭게도, 동측성 피질(ipsilateral cortex)의 중간 영역(intermediate zone (IZ))에서 대조군과 CCN3-과발현 뉴런 사이에 액손 형광의 정도에는 유의한 차이가 나타나지 않았다. 또한, 피질하 영역(subcortical areas)으로 확장된 에토픽(ectopic) 액손도 관찰되지 않았다.

이러한 결과들은 CCN3 과발현이 뇌량 투사(callosal projections)의 성장을 제한하지만 에토픽(ectopic)한 피질하 투사를 초래하지는 않는다는 것을 보여준다.

또한, 전기천공법의 타이밍이나 위치선정의 차이로 인한 CCN3-과발현 뉴런에서의 액손 확장 실패 가능성을 배제하기 위해, 이전의 연구에서와 같이[K.Y. Kwan, et al. SOX5 postmitotically regulates migration, postmitogratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (2008) 16021-16026], 양측 전기천공(bilateral electroporation) 실험을 수행하였다(도 3A). GFP 리포터를 포함한 CCN3 과발현 제작물(construct)을 한 쪽 대뇌 반구에 주입하고, 대조군 RFP 제작물을 대측 대뇌 반구(contralateral hemisphere)에 주입하였다. 그 후 자궁벽을 통하여 태아에 전기자극(square electric pulses)을 가하였다.

도 3A에 나타난 바와 같이, 대조군 RFP와 GFP가 함유된 Ccn3 발현 벡터 모두 거의 대칭적으로 대뇌피질에 도입되었다. 뇌량의 투사(callosal projection)를 분석한 결과, CCN3-과발현 GFP-양성 액손 섬유(axon fibers)는 더 짧은 가지들을 발달시키고, 뇌량에서 RFP 대조군 액손보다 훨씬 더 적은 중간선 교차(midline crosses)를 나타냈다. 이러한 결과들은 상기 일측 전기자극(unilateral electroporation) 실험(도 2) 및 neuro2a 세포에서의 신경돌기 성장 측정 결과(도 1D 및 E)와 일치한다. 반면에, 대조군(RFP-양성)과 CCN3-과발현(GFP-양성) 액손 섬유들 사이에 IZ의 차이는 나타나지 않았으며, 이는 CCN3 과발현이 대뇌피질 피라미드 뉴런(cortical pyramidal neurons)의 초기 액손 성장에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다.

< 실시예 5>

RAB25 과발현의 뇌 발달 저해 효과

대뇌피질의 CCN3 과발현에 의해 조절되는 분자들을 확인하기 위하여 마이크로어레이 분석을 수행하였다. 이를 위해 E14.5에서 Ccn3 과발현 벡터로 전기천공 실험을 수행한 후, 성공적으로 유전자가 도입된 마우스로부터 P0에 현미해부된(microdissected) 대뇌피질 조직에서 유전자 발현을 비교하였다. CCN3 과발현 후에, 104개의 유전자들이 상향조절(upregulation)되었고, 35개의 유전자들이 하향조절(downregulation)되었다(fold change cut-off value 1.5, p < 0.05). 이 중 작은 GTP가수분해효소(small GTPases)들의 Ras 슈퍼패밀리 멤버인 Rab25를 후보 유전자로 정하였다. 최근의 연구 결과에 따르면, 일부 RAB 단백질들은 액손에 위치(localization)하며, 신경돌기 성장에 관여한다[C. Bucci, P. Alifano, L. Cogli, The role of rab proteins in neuronal cells and in the trafficking of neurotrophin receptors, Membranes. 4 (2014) 642-677]. 따라서 본 발명자들은 RAB25가 액손 성장의 음성 조절인자(negative regulator)로 작용하는 CCN3의 다운스트림 작동인자(downstream effector)일 것이라고 가정하였다.

이를 확인하기 위해, neuro2a 세포 및 발달 중인 마우스 뇌에서 각각 동시 형질주입(cotransfection)과 자궁 내 전기천공법(in utero electroporation)을 이용하여 RAB25 과발현의 효과를 조사하였다. CCN3 과발현 실험 결과와 같이, RAB25를 과발현하는 RA-처리된 neuro2a 세포는 훨씬 더 적은 수의 신경돌기(neurites)를 갖고 있는 것을 확인하였다(도 4A, B, C). 이러한 결과는 RAB25 과발현이 neuro2a 세포에서 RA-유도된 신경돌기 성장을 음성적으로 조절한다는 것을 보여준다. 또한, RAB25 과발현에 의해 뇌량에서 훨씬 더 적은 중간선 교차(midline crosses)가 관찰되었다(도 4D). 이와 대조적으로, GTP 결합에 결함이 있는 우성-음성(dominant-negative) 돌연변이 RAB25-T26N의 경우, 전기자극(electroporation)에 의해 유도된 발현이 대뇌피질 뉴런의 뇌량 투사(callosal projections)에 의한 중간선 교차에 결함을 유도하지 않았다(도 4D).

상기 결과들은 과발현된 CCN3가 RAB25의 발현을 증가시켜 마우스 대뇌피질의 뇌량 투사를 감소시킨다는 것을 보여준다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 방법으로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Ulsan University <120> Method of providing information for diagnosis of neurodevelopmental disorder and diagnostic kit <130> pn1505-131 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Rab25-T26N 92bp F primer <400> 1 atggggaatc gaacagatga 20 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Rab25-T26N 92bp R primer <400> 2 cgggacagca gattgttctt gcccacgcct 30 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Rab25-T26N 577 bp F primer <400> 3 aggcgtgggc aagaacaatc tgctgtcccg 30 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Rab25-T26N 577bp R primer <400> 4 gaggctgatg caacaggc 18 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> pcr primer seq. no.5 <400> 5 atggggaatc gaacagatga 20 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> pcr primer seq.no.6 <400> 6 gaggctgatg caacaggc 18 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Ccn3 F primer <400> 7 ctgagatgag accctgtgac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Ccn3 R primer <400> 8 ttgtctccct ctggaaccat 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Gapdh F primer <400> 9 atcactgcca 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actcggctct gcatggtgcg gccctgtgaa caagagccag agcagccaac agataagaaa 780 ggaaaaaagt gtctccgcac caagaagtca ctcaaagcca tccacctgca gttcaagaac 840 tgcaccagcc tgcacaccta caagcccagg ttctgtgggg tctgcagtga tggccgctgc 900 tgcactcccc acaataccaa aaccatccag gcagagtttc agtgctcccc agggcaaata 960 gtcaagaagc cagtgatggt cattgggacc tgcacctgtc acaccaactg tcctaagaac 1020 aatgaggcct tcctccagga gctggagctg aagactacca gagggaaaat gtaa 1074 <210> 12 <211> 357 <212> PRT <213> CCN3 aminoacid sequence <400> 12 Met Gln Ser Val Gln Ser Thr Ser Phe Cys Leu Arg Lys Gln Cys Leu 1 5 10 15 Cys Leu Thr Phe Leu Leu Leu His Leu Leu Gly Gln Val Ala Ala Thr 20 25 30 Gln Arg Cys Pro Pro Gln Cys Pro Gly Arg Cys Pro Ala Thr Pro Pro 35 40 45 Thr Cys Ala Pro Gly Val Arg Ala Val Leu Asp Gly Cys Ser Cys Cys 50 55 60 Leu Val Cys Ala Arg Gln Arg Gly Glu Ser Cys Ser Asp Leu Glu Pro 65 70 75 80 Cys Asp Glu Ser Ser Gly Leu Tyr Cys Asp Arg Ser Ala Asp Pro Ser 85 90 95 Asn Gln Thr Gly Ile Cys Thr Ala Val Glu Gly Asp Asn Cys Val Phe 100 105 110 Asp Gly Val Ile Tyr Arg Ser Gly Glu Lys Phe Gln Pro Ser Cys Lys 115 120 125 Phe Gln Cys Thr Cys Arg Asp Gly Gln Ile Gly Cys Val Pro Arg Cys 130 135 140 Gln Leu Asp Val Leu Leu Pro Glu Pro Asn Cys Pro Ala Pro Arg Lys 145 150 155 160 Val Glu Val Pro Gly Glu Cys Cys Glu Lys Trp Ile Cys Gly Pro Asp 165 170 175 Glu Glu Asp Ser Leu Gly Gly Leu Thr Leu Ala Ala Tyr Arg Pro Glu 180 185 190 Ala Thr Leu Gly Val Glu Val Ser Asp Ser Ser Val Asn Cys Ile Glu 195 200 205 Gln Thr Thr Glu Trp Thr Ala Cys Ser Lys Ser Cys Gly Met Gly Phe 210 215 220 Ser Thr Arg Val Thr Asn Arg Asn Arg Gln Cys Glu Met Leu Lys Gln 225 230 235 240 Thr Arg Leu Cys Met Val Arg Pro Cys Glu Gln Glu Pro Glu Gln Pro 245 250 255 Thr Asp Lys Lys Gly Lys Lys Cys Leu Arg Thr Lys Lys Ser Leu Lys 260 265 270 Ala Ile His Leu Gln Phe Lys Asn Cys Thr Ser Leu His Thr Tyr Lys 275 280 285 Pro Arg Phe Cys Gly Val Cys Ser Asp Gly Arg Cys Cys Thr Pro His 290 295 300 Asn Thr Lys Thr Ile Gln Ala Glu Phe Gln Cys Ser Pro Gly Gln Ile 305 310 315 320 Val Lys Lys Pro Val Met Val Ile Gly Thr Cys Thr Cys His Thr Asn 325 330 335 Cys Pro Lys Asn Asn Glu Ala Phe Leu Gln Glu Leu Glu Leu Lys Thr 340 345 350 Thr Arg Gly Lys Met 355 <210> 13 <211> 642 <212> DNA <213> RAB25 cDNA sequence <400> 13 atggggaatg gaactgagga agattataac tttgtcttca aggtggtgct gatcggcgaa 60 tcaggtgtgg ggaagaccaa tctactctcc cgattcacgc gcaatgagtt cagccacgac 120 agccgcacca ccatcggggt tgagttctcc acccgcactg tgatgttggg caccgctgct 180 gtcaaggctc agatctggga cacagctggc ctggagcggt accgagccat cacctcggcg 240 tactatcgtg gtgcagtggg ggccctcctg gtgtttgacc taaccaagca ccagacctat 300 gctgtggtgg agcgatggct gaaggagctc tatgaccatg ctgaagccac gatcgtcgtc 360 atgctcgtgg gtaacaaaag tgacctcagc caggcccggg aagtgcccac tgaggaggcc 420 cgaatgttcg ctgaaaacaa tggactgctc ttcctggaga cctcagccct ggactctacc 480 aatgttgagc tagcctttga gactgtcctg aaagaaatct ttgcgaaggt gtccaagcag 540 agacagaaca gcatccggac caatgccatc actctgggca gtgcccaggc tggacaggag 600 cctggccctg gggagaagag ggcctgttgc atcagcctct ga 642 <210> 14 <211> 213 <212> PRT <213> RAB25 aminoacid sequence <400> 14 Met Gly Asn Gly Thr Glu Glu Asp Tyr Asn Phe Val Phe Lys Val Val 1 5 10 15 Leu Ile Gly Glu Ser Gly Val Gly Lys Thr Asn Leu Leu Ser Arg Phe 20 25 30 Thr Arg Asn Glu Phe Ser His Asp Ser Arg Thr Thr Ile Gly Val Glu 35 40 45 Phe Ser Thr Arg Thr Val Met Leu Gly Thr Ala Ala Val Lys Ala Gln 50 55 60 Ile Trp Asp Thr Ala Gly Leu Glu Arg Tyr Arg Ala Ile Thr Ser Ala 65 70 75 80 Tyr Tyr Arg Gly Ala Val Gly Ala Leu Leu Val Phe Asp Leu Thr Lys 85 90 95 His Gln Thr Tyr Ala Val Val Glu Arg Trp Leu Lys Glu Leu Tyr Asp 100 105 110 His Ala Glu Ala Thr Ile Val Val Met Leu Val Gly Asn Lys Ser Asp 115 120 125 Leu Ser Gln Ala Arg Glu Val Pro Thr Glu Glu Ala Arg Met Phe Ala 130 135 140 Glu Asn Asn Gly Leu Leu Phe Leu Glu Thr Ser Ala Leu Asp Ser Thr 145 150 155 160 Asn Val Glu Leu Ala Phe Glu Thr Val Leu Lys Glu Ile Phe Ala Lys 165 170 175 Val Ser Lys Gln Arg Gln Asn Ser Ile Arg Thr Asn Ala Ile Thr Leu 180 185 190 Gly Ser Ala Gln Ala Gly Gln Glu Pro Gly Pro Gly Glu Lys Arg Ala 195 200 205 Cys Cys Ile Ser Leu 210

Claims (11)

1. (a) 피검체로부터 얻은 시료에서 CCN3 또는 RAB25 유전자 또는 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
   (b) 상기 (a) 단계의 발현 정도를 정상 시료에서의 해당 유전자 또는 단백질의 발현 정도와 비교하는 단계를 포함하는, 뇌발달 장애의 진단을 위한 정보제공방법.
2. 제1항에 있어서,
   (b) 단계의 비교 결과, 피검체 시료의 CCN3 또는 RAB25 유전자 또는 단백질이 정상 대조구 시료에서보다 과발현된 경우 뇌발달 장애의 가능성이 있는 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서,
   상기 CCN3 또는 RAB25 유전자 또는 단백질의 발현 정도를 측정하는 방법은 역전사효소 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소연쇄반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소연쇄반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 분석법(DNA chip technology assay), 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescenceactivated cell sorter analysis), 단백질 칩 분석법(protein chip technology assay) 또는 형광 이미지 분석인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제2항에 있어서,
   뇌발달 장애의 가능성이 있는 것으로 판단하는 것은 정상 대조구 시료에 비해 피검체 시료에서 CCN3 또는 RAB25 유전자 수준; 또는 CCN3 또는 RAB25 단백질 수준이 1.2 ~ 2배로 증가되어 있는 경우인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항에 있어서,
   상기 시료는 임신한 모체 또는 임신 후 유아기까지의 피검체로부터 얻은 혈액 또는 양수 시료인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항에 있어서,
   상기 뇌발달 장애는 자폐증, 정신분열증, 양극성 장애 및 정신지체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. CCN3 또는 RAB25 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 뇌발달 장애 진단용 조성물.
8. 제7항에 있어서,
   상기 제제는 CCN3 또는 RAB25 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제로서, CCN3 또는 RAB25 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 조성물.
9. 제8항에 있어서,
   상기 CCN3 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머는 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 진단용 조성물.
10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 뇌발달 장애 진단용 키트.
11. 제10항에 있어서,
    상기 뇌발달 장애는 자폐증, 정신분열증, 양극성 장애 및 정신지체를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.

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