KR102024576B1 - 퇴행성 신경질환 진단을 위한 ccn3의 단일염기다형성 동정 - Google Patents

Abstract

본 발명은 퇴행성 신경질환의 진단을 위한 신규한 바이오마커에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 CCN3-TSP1 도메인 영역에서 특정 아미노산의 변이를 측정할 수 있는 제제를 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 조성물; 상기 조성물을 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 키트; 및 상기 바이오마커를 이용한 퇴행성 신경질환 진단을 위한 정보 제공방법에 관한 것이다. 본 발명은 CCN3의 TSP1 도메인 영역에 있는 특정 아미노산 잔기의 변이가 CCN3의 비정상적인 세포 내 응집을 유발하고, 이로 인해 세포사멸 유전자인 Anp32a의 발현을 유도한다는 사실을 처음으로 규명함에 따라, 이를 바이오마커로 사용함으로써 알츠하이머병과 같은 퇴행성 신경질환을 조기에 진단할 수 있다.

Description

퇴행성 신경질환 진단을 위한 CCN3의 단일염기다형성 동정{Identification of novel single nucleotide polymorphism in CCN3 for neurodegeneration}

본 발명은 퇴행성 신경질환의 진단을 위한 신규한 바이오마커에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 CCN3-TSP1 도메인 영역에서 특정 아미노산의 변이를 측정할 수 있는 제제를 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 조성물; 상기 조성물을 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 키트; 및 상기 바이오마커를 이용한 퇴행성 신경질환 진단을 위한 정보 제공방법에 관한 것이다.

전 세계적으로 고령인구가 증가하고 있으며, 우리나라도 2000년도에 이미 고령화 사회에 접어들었고, 2010년에는 65세 이상 인구가 차지하는 비율이 11%로 상승했다. 2018년이면 고령 사회, 2026년이면 초고령 사회로 접어들 것이라고 예견되고 있는 상황에서 고령인구의 노인성 질병의 해결이 시급한 사회적 문제로 대두되고 있다. 특히 노인성 치매질환의 약 절반을 차지하는 알츠하이머병은 현재로써는 유효한 치료방법과 예방 방법이 없으며, 고령화 사회에 있어서 가장 시급히 해결해야 할 신경질환 중의 하나이기에 연구가 많이 요구되는 분야이다.

한편, CCN3는 4개의 보존된 도메인(insulin-like growth factor binding protein-like domain, von Willebrand factor C repeat domain, thrombospondin-1 repeat domain, 및 C-terminal domain containing a cysteine knot)으로 구성된, CCN 패밀리 단백질 멤버이다. 사람을 포함한 포유동물의 대뇌피질에서 공통적으로 발현하는 CCN3는 세포밖 분비를 통해 개체의 전주기에 걸쳐 다양한 기능을 수행한다. 특히 CCN3의 분비 조절 실패는 신경세포내 CCN3의 축적으로 이어져 신경세포 분화 이상 및 퇴행으로 이어질 수 있다. 따라서 CCN3의 정상적인 분비 조절 기전을 밝히는 것이 필요하다.

CCN3는 인간을 포함한 고등 포유동물의 발생 중인 태아로부터 노년기에 이르기까지 대뇌피질의 신경세포(뉴런)에서 지속적으로 발현되어 세포 밖으로 분비되는 단백질로서, 이 단백질의 분비에 문제가 생기면 신경세포 내에 축적된다. 이렇게 신경세포 내에 CCN3의 농도가 증가하게 되면, 원래 발현되지 않던 랩25(RAB25)라고 하는 단백질의 발현을 유도하여 정상적인 신경세포의 분화를 억제한다(이전 특허 내용: 한국공개특허 10-2017-0005587호). 또한 이러한 비정상적인 단백질의 세포 내 축적은 일반적으로 세포 사멸을 유도하게 되는데, 문제는 CCN3가 발현되는 세포가 재생이 거의 불가능한 신경세포(뉴런)이라는데 있다. 따라서, 신경세포의 사멸은 알츠하이머 병과 같은 신경질환의 증상이므로, CCN3의 신경세포 내 축적으로 인한 세포 사멸은 퇴행성 신경질환과 깊은 연관성이 있다.

이러한 배경 하에, 본 발명자는 CCN3의 정상적인 분비 조절 기전을 밝히기 위하여 다양한 실험을 진행하였으며, 그 결과 CCN3-TSP1 도메인의 36번째 아미노산 변이가 CCN3의 비정상적인 세포 내 응집을 유발하고, 이로 인해 세포 사멸 유전자인 Anp32a의 발현을 유도한다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

한국공개특허 제10-2014-0130846호 한국공개특허 제10-2017-0009028호

따라서 본 발명의 목적은 바이오마커에 해당하는 특정 아미노산 잔기의 변이를 측정하는 제제를 포함하는, 퇴행성 신경질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 조성물을 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 바이오마커를 이용하여 퇴행성 신경질환을 효과적으로 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 36번째 아미노산 변이를 측정하는 제제를 포함하는, 퇴행성 신경질환 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제제는 상기 제제는 CCN3의 TSP1 도메인의 36번째 아미노산에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 앱타머일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 검사대상 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 36번째 아미노산 서열을 검출하는 단계를 포함하는, 퇴행성 신경질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 36번째 아미노산 서열이 아르기닌에서 글루타민으로 변이된 경우 퇴행성 신경질환이 발병되거나 발병 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 판정할 수 있다.

본 발명은 CCN3의 TSP1 도메인 영역에 있는 특정 아미노산 잔기의 변이가 CCN3의 비정상적인 세포 내 응집을 유발하고, 이로 인해 세포사멸 유전자인 Anp32a의 발현을 유도한다는 사실을 처음으로 규명함에 따라, 이를 바이오마커로 사용함으로써 알츠하이머병과 같은 퇴행성 신경질환을 조기에 진단할 수 있다.

도 1a는 마우스 CCN3-R239 돌연변이를 간략하게 도식화한 것이다.
도 1b는 Neuro2a 세포에서 CCN3-R239 돌연변이의 웨스턴 블랏 분석 결과를 나타낸 것이다(CM: conditioned media, WCL: whole cell lysates). 열린 화살촉은 CCN3 모노머를 가리키며, 닫힌 화살촉은 CCN3의 응집된 형태를 가리킨다.
도 1c는 CCN3-R239Q 돌연변이의 발현에 따른 뇌량투사 형성에 대한 생체 내(in vivo) 분석 결과를 나타낸 것이다. E14.5(embryonic day 14.5) 단계에서 CCN3-R239Q 및 GFP 발현 플라스미드를 이용하여 In utero 일렉트로포레이션을 수행하였다. 열린 화살촉은 L1 양성의 말단 축삭 돌기의 정상 경로를 나타낸다. 대조적으로, 닫힌 화살촉은 CCN3-R239Q 과발현 뉴런의 경로를 나타낸다. Scale bar, 2 mm. Ctx; Cortex, CC; Corpus callosum.
도 2는 Neuro2a 세포에서 CCN3-R239Q 과발현에 의한 세포사멸 관련된 유전자들의 발현 수준을 측정한 결과이다. Anti-apoptotic (Xnip, Mcl-1, Bcl-2, Bcl2-like 1, and Bcl2-like 2) 및 pro-apoptotic (Puma, Diablo, Casp2, 3, 6, 7, 9, Bok, Bnip-like, Bim, Bid, Bax, Bak1, Bad, and Apaf) mRNA 수준은 CCN3-R239Q 돌연변이체로 형질전환된 Neuro2a 세포에서 실시간 qPCR을 수행하여 측정하고, GAPDH를 기준으로 표준화하여 상대적인 발현량으로 나타내었다. 결과는 독립적으로 3번복 실시하여 평균±표준편차로 나타내었다.
도 3a는 마이크로 어레이를 위하여 CCN3-R239Q 과발현 피질 조직으로부터 총 RNA를 분리하기 위한 접근법을 간략하게 도식화한 것이다. P0(postnatal day 0) 시점에 3개의 독립적인 Gfp 및 Gfp/CCN3-R239Q 일렉트로포레이션된 마우스 뇌로부터 GFP 양성 피질 조직을 분리하였다.
도 3b는 CCN3-R239Q 과발현에 의해 고도로 조절되는 60개 유전자의 계층적 클러스터링을 보여주는 것이다. 이중 5 종의 세포사멸 관련 유전자(S100a9, Nts, Lyz2, Anp32a 및 Zic1)는 CCN3-R239Q 과발현 피질 조직에서 적어도 1.5 배의 상향조절을 보였다. 노란색과 파란색은 상대적으로 높고 낮은 발현 정도를 가리키는 것이다.
도 4a는 qPCR을 사용하여 CCN3-R239Q 과발현시 5종의 세포사멸 관련 유전자(S100a9, Nts, Lyz2, Anp32a 및 Zic1)의 발현 증대 수준을 확인한 결과이다. 3개의 독립적인 결과를 보여준다.
도 4b는 qPCR의 밴드 강도를 정량적으로 분석한 결과이다. 결과 값은 평균±표준편차로 나타내었다.

본 발명은 퇴행성 신경질환 진단을 위한 바이오커에 관한 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어 "퇴행성 신경질환(neurodegenerative disease)"이란, ‘신경퇴행성질환’이라고도 하며, 광의로는 신경세포(nerve cell)가 퇴행하는 병태 전부를 포함하지만 일반적으로는 뇌혈관장해, 외상(外傷), 대사이상 등, 뚜렷한 신경계세포 외의 요인이 될 수 있는 것은 포함하지 않는다. 예를 들어, 상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 루게릭 질환, 헌팅톤 질환, 근위축성 측석 경화증, 다발성 경화증, 면역계이상 뇌기능 부전, 진행성 신경퇴행질환, 대사성 뇌질환, 니만-픽병, 뇌 허혈 및 뇌출혈로 인한 치매 등을 예시할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "진단"이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 진단은 퇴행성 신경질환의 진행 또는 발병 여부를 확인하는 것으로 해석될 수 있다.

본 발명자는 이전 연구에서 CCN3의 정상적인 분비 조절 기전을 밝히기 위하여 4개의 도메인의 기능을 규명하였으며, 그 결과 CCN3의 TSP1 도메인 영역이 중요한 역할을 함을 규명하였다. 간략하게는, CCN3 및 세포 내 기능에서 각 도메인의 기능 규명을 위하여 개별적인 결실 돌연변이를 구축하였으며, 그 결과 Neuro2a 세포에서 발현 후, 오직 CCN3-△TSP1 돌연변이에서 CCN3가 세포 외로 분비되지 않는 것을 확인하였다(결과 미도시). 이러한 결과를 통해 TSP1 도메인 영역이 CCN3의 분비에 중요한 역할을 한다는 것을 최초로 규명하였다.

이에, 본 발명에서는 추가적인 실험을 통해 TSP1 도메인 영역에서 어느 부분이 CCN3 분비에 중요한지를 확인하였으며, 그 결과 TSP1 도메인의 36번째 아미노산 변이가 CCN3의 비정상적인 세포 내 응집을 유발하고, 이로 인해 세포 사멸 유전자인 Anp32a의 발현을 유도한다는 사실을 최초로 규명하였다.

따라서, 본 발명은 CCN3-TSP1 도메인의 36번째 아미노산(또는, CCN3단백질의 239번째 아미노산)의 신경 퇴행을 진단할 수 있는 바이오마커로의 용도에 관한 것이다.

본 발명에서 ‘CCN3’란 NOV (nephroblastoma overexpressed)로도 알려져 있으며 인간에서 NOV 유전자에 의해 코딩되는 모세포 단백질(Matricellular protein)을 의미한다.

하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 36번째 아미노산 변이를 측정하는 제제를 포함하는, 퇴행성 신경질환 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 퇴행성 신경질환 진단용 바이오마커로서 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 36번째 아미노산은 정상조직에서는 아르기닌(Arginine)에 해당되나 상기 아미노산이 글루타민(Glutamine)으로 변이된 경우 CCN3의 비정상적인 세포 내 응집을 유발하고, 이로 인해 세포사멸 유전자인 Anp32a의 발현을 유도한다는 사실을 확인하였다.

이러한 결과를 통하여, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 36번째 아미노산이 CCN3의 정상적인 세포밖 분비에 있어서 결정적인 역할을 함을 확인할 수 있었고, 본 발명의 상기 아미노산 변이를 측정할 수 있는 제제를 이용하면 퇴행성 신경질환을 효과적으로 진단할 수 있음을 알 수 있었다.

따라서 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 36번째 아미노산 변이를 측정하는 제제를 포함하는, 퇴행성 신경질환 진단용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 일구체예에서, 상기 제제는 CCN3의 TSP1 도메인의 36번째 아미노산에 특이적으로 결합할 수 있는 펩타이드, 항체 또는 앱타머일 수 있다.

본 발명의 용어 "항체"란, 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미하는데, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라, 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 36번째 아미노산을 포함하는 특정 폴리펩티드 서열(KQTRLCM, Lys Gln Thr Arg Leu Cys Met)에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 될 수 있다.

본 발명의 용어 "앱타머(aptamer)"란, 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지는 단일 가닥 핵산(DNA, RNA, 또는 변형 핵산)을 의미하는데, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있다. 상기 앱타머의 제조는 일반적인 앱타머의 제조 방법에 따라, 확인하고자 하는 표적 단백질에 대해 선택적이고 높은 결합력을 가지는 올리고뉴클레오티드의 서열을 결정하여 합성한 후, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단이나 3' 말단을 링커의 작용기에 결합할 수 있도록, -SH, -COOH, -OH 또는 -NH2로 변형시킴으로써 이루어질 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 앱타머는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 36번째 아미노산을 포함하는 특정 폴리펩티드 서열(KQTRLCM, Lys Gln Thr Arg Leu Cys Met)에 특이적으로 결합할 수 있는 앱타머가 될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 키트에 관한 것이다.

본 발명의 키트는 퇴행성 신경질환 진단 마커인, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 36번째 아미노산 변이 여부를 측정(확인)함으로써 피험체를 대상으로 하여 퇴행성 신경질환을 진단하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 퇴행성 신경질환 진단용 키트에는 상기 CCN3-TSP1 도메인의 36번째 아미노산 변이를 확인하기 위한 항체 또는 앱타머뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

본 발명의 용어 "시료"란, 퇴행성 신경질환이 발병된 개체에서 분리되어 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 36번째 아미노산 변이를 측정하는 직접적인 대상을 의미하고, 일 예로서 퇴행성 신경질환이 발병된 환자의 신경세포를 포함하는 혈액, 조직시료 등이 될 수 있다.

본 발명의 용어 "개체"란 심혈관계 질환이 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물 등을 제한 없이 포함할 수 있다.

구체적인 일 예로서, 본 발명의 키트는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 36번째 아미노산 변이를 측정하기 위한 ELISA 키트가 될 수 있는데, 상기 키트는 특별히 이에 제한되지 않으나, CCN3-TSP1 도메인의 36번째 아미노산을 포함하는 특정 폴리펩티드 서열(KQTRLCM, Lys Gln Thr Arg Leu Cys Met)의 면역학적 검출을 위하여 기재, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기 기재는 특별히 이에 제한되지 않으나 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 특별히 이에 제한되지 않으나 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있으며, 형광물질은 특별히 이에 제한되지 않으나 FITC, RITC 등이 될 수 있고, 발색 기질액은 특별히 이에 제한되지 않으나 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 될 수 있다.

다른 예로서, 본 발명의 키트는 음성 및 양성 대조군 반응을 수행하는데 필요한 시약 또는 혼성화 반응에 필요한 완충액과 같은 시약을 포함할 수 있다. 특정 반응에서 이용되는 시약의 최적량은 본 명세서의 내용을 파악한 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트는 분리된 패키지 또는 컴파트먼트에 상술한 성분들을 포함할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 마이크로어레이에 관한 것이다.

상기 마이크로어레이는 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 36번째 아미노산 변이를 측정하는 제제를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어질 수 있다.

마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질, 예를 들면, Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 검사대상 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 36번째 아미노산 서열을 검출하는 단계를 포함하는, 퇴행성 신경질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

일 예로서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 36번째 아미노산 서열이 아르기닌 잔기가 다른 아미노산 잔기(예, 글루타민)로 변이된 경우 퇴행성 신경질환이 발병되거나 발병 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 판정할 수 있다.

상기 생물학적 시료는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 퇴행성 신경질환이 발병된 환자의 신경 모세포종를 포함하는 혈액, 조직시료 등이 될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 rs773316453의 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 퇴행성 신경질환 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 구체예에 있어서, rs773316453의 단일염기다형성(SNP)에서 염기가 A인 경우 퇴행성 신경질환 위험이 높은 군으로 판정할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제는 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속 폴리뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있다. 즉, 상기 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제는 상기 총 12개의 단일염기다형성(SNP) 중 1종 이상의 SNP를 포함하는 10-100개의 연속 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열을 증폭시킬 수 있는 프라이머 또는 상기 총 12개의 단일염기다형성(SNP) 중 1종 이상의 SNP를 포함하는 10-100개의 연속 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열을 표적하여 특이적으로 결합할 수 있는 프로브일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드는 10개 이상, 바람직하게는 10 내지 100개, 보다 바람직하게는 10 내지 60개의 연속 염기로 구성될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드는 다형성 서열(polymorphic sequence)이다. 다형성 서열(polymorphic sequenc)이란 뉴클레오티드 서열 중에 단일염기다형을 나타내는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 말한다. 다형성 부위(polymorphic site)란 다형성 서열 중 단일염기다형이 일어나는 부위를 말한다.

본 발명에서 용어, "다형성(polymorphism)"이란 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 말하며 다형성 부위 중에서, 사람에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 10% 또는 20% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다.

본 발명에서 용어, "대립유전자(allele)"는 상동염색체의 동일한 유전자좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 말한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP은 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.

본 발명에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 프라이머 또는 프로브는 대립형질 특이적 (allele-specific) 이다.

대립형질 특이적 (allele-specific) 이란 각 대립형질에 특이적으로 혼성화하는 것, 즉, 다형성 서열 중에 존재하는 다형성 부위의 염기를 특이적으로 구별할 수 있도록 혼성화하는 것을 말한다. 여기에서, 혼성화란 보통 엄격한 조건, 예를 들어 1M 이하의 염 농도 및 25℃ 이상의 온도 하에서 보통 수행될 수 있다.

본 발명에 있어서, 프로브는 혼성화 프로브를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 본 발명의 대립형질 특이적 프로브는 같은 종의 두 개체로부터 유래한 핵산 단편 중에서 다형성 부위가 존재하여, 한 개체로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화 하나, 다른 개체로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립형질 간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여 대립형질 중 하나에만 혼성화되도록 충분히 엄격해야 한다. 이러한 본 발명의 프로브는 중앙 부위가 다형성 서열의 다형성 부위와 정렬하는 것이 바람직하다. 이에 따라 서로 다른 대립형질성 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 본 발명의 프로브는 대립형질을 검출하여 퇴행성 신경질환 질환을 예측하기 위한 마이크로어레이 등의 키트나 예측 방법 등에 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 프라이머는 짧은 자유 3말단 수산화기 (free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 템플레이트 (template)와 염기쌍 (base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 15 내지 30개의 염기로 구성된다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 다형성 부위를 포함하는 DNA 서열에 혼성화하여 다형성 부위를 포함하는 DNA 단편을 증폭시킬 수 있다. 본 발명의 프라이머는 대립형질을 검출하여 퇴행성 신경질환 질환을 예측하기 위한 마이크로어레이 등의 키트나 예측 방법 등에 사용될 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 키트에 관한 것이다.

본 발명의 키트는 퇴행성 신경질환 진단용 마커인, 상기 단일염기다형성(rs773316453)를 확인함으로써 퇴행성 신경질환을 진단 또는 예측하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 퇴행성 신경질환 진단용 키트에는 상기 단일염기다형성(rs773316453)을 확인하기 위한 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. PCR 키트는, 상기 SNP 에 대한 특이적인 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액 (pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드 (dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수 (DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 퇴행성 신경질환 위험 예측용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 상기 SNP에 대한 특이적인 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브가 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 핵산을 포함할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 퇴행성 신경질환의 위험 예측용 마이크로어레이에 관한 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 피험자에서 분리된 핵산으로부터, 단일염기다형성(rs773316453) 마커를 확인하는 단계를 포함하는, 한국인의 퇴행성 신경질환 진단을 또는 예측을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

자세하게는, a) 피험자의 검체로부터 핵산 시료를 수득하는 단계; b) 상기 단일염기다형성(rs773316453)를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭하거나 프로브(probe)와 혼성화하는 단계; 및 c) 상기 증폭된 또는 혼성화된 다형성 부위의 염기를 확인하는 단계로 이루어질 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

1. 재료 및 방법

플라스미드 컨스트럭트

돌연변이 CCN3 발현 벡터를 구축하기 위하여, V5 에피토프 태그된 전장 상보적 DNA 서열 코딩하는 마우스 CCN3(BC003774)는 pCAGEN 벡터(Addgene, Cambridge, MA, USA)에 삽입되었으며, overlapping PCR을 이용하여 돌연변이 유발을 수행하였다. CCN3-R239K 구조물인 732bp 프래그먼트는 5'-ATGAGCCTCTTCCTGCGAAAGC-3' (포워드) 및 5'-CCGAACGATGCAGAGCTTAGTCTGTTTTAC-3' (리버스) 프라이머를 이용하여 증폭되었으며, 360bp 프래그먼트는 5'-GTAAAACAGACTAAGCTCTGCATCGTTCGG-3' (포워드) 및 5'-AATTTCTCCTCTGCTTGTCTTC-3' (리버스) 프라이머로 증폭되었다. CCN3-R239Q 구조물인 732bp 프래그먼트는 5'-ATGAGCCTCTTCCTGCGAAAGC-3' (포워드) 및 5'-CCGAACGATGCAGAGTTGAGTCTGTTTTAC-3' (리버스) 프라이머로 증폭되었고, 360 bp는 5'-GTAAAACAGACTCAACTCTGCATCGTTCGG-3' (포워드) 및 5'-AATTTCTCCTCTGCTTGTCTTC-3' (리버스) 프라이머로 증폭되었다. 각각의 돌연변이를 위하여, 2개의 부분적인 상보적 PCR 프래그먼트는 어닐링되고 5'-ATGAGCCTCTTCCTGCGAAAGC-3' (포워드) 및 5'-AATTTCTCCTCTGCTTGTCTTC-3' (리버스) 프라이머를 갖는 다른 PCR에서 템플레이트로 사용되었다. 생성된 점돌연변이(missense mutation)는 SpeI로 분해되고 V5 에피토프를 포함하는 pCAGEN 벡터 내로 클로닝되었다.

세포 배양 및 웨스턴 블랏

Neuro2a 세포는 5% CO₂를 포함하는 humidified 인큐베이터 37℃에서 10% 소태아혈청(Hyclone, Logan, UT, USA), 0.5mM 글루타민, 페니실린-스트렙토마이신(100 mg/mL)이 보충된 Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)에서 배양되었다. 세포는 iN-fect (iNtRON, 성남, 한국)을 이용하여 형질감염시켰다. 24시간 후 세포를 RIPA 완충액(137 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 % NP-40, 10 % glycerol, 500 mM orthovanadate 및 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride)에서 용해시켰다. 총 용해물을 4-12% SDS-PAGE gell(Invitrogen) 상에 로딩한 후 폴리비닐리덴 디플로라이드 멤브레인(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 이동시켰다. 상기 멤브레인은 항-V5(1:3000, Invitrogen) 항체로 면역블랏되었다.

In utero 일렉트로포레이션 및 이뮤노히스토케미스트리

모든 동물실험은 충북대학교 동물시험윤리위원회의 승인 하에 충북대학교 실험동물센터의 표준작업절차에 따라 수행되었다. In utero 일렉트로포레이션은 이전에 개시된 방법을 일부 수정하여 진행되었다(M. Park, I.J. Baek, H. Kim, D.K. Woo, Y.J. Park, S. Shim, CCN3 overexpression inhibits growth of callosal projections via upregulation of RAB25, Biochem. Biophys. Res. Commun. 461 (2015) 456e462.).

간략하게는 뇌를 해부하고 4% 파라포름알데하이드로 4℃에서 하룻밤 동안 고정화한 다음 vibratome (Leica)을 사용하여 절편을 만들었다. 슬라이스를 0.3% Triton X-100, 5% normal donkey serum (Jackson Immunoresearch Labs, PA, USA), 1% 소혈청알부민, 0.2% 글라이신 (Sigma), 및 0.2% lysine(Sigma)을 포함하는 PBS로 블락시켰다. 상기 슬라이스를 pan-neuronal 마커 L1 cell adhesion molecule (L1-CAM) (rat, 1:300, Millipore)를 인식하는 1차 항체로 반응시키고, 블로킹 버퍼 안의 녹색 형광 단백질(GFP; chicken, 1:3,000, Abcam, Cambridge, UK)과 적절한 2차 항체(Jackson Immunoresearch Labs, PA, USA)로 반응시켰다. 시편은 공초점현미경을 이용하여 분석하였다.

Real-time Quantitative PCR ( qPCR )

RNeasy Mini Kit (QIAGEN)를 이용하여 Neuro2a 세포로부터 총 RNA를 추출하였으며, 제조자의 지시에 따라 HiSenScript RH(-) RT PreMix Kit (iNtRON, Seongnam, South Korea)를 이용하여 cDNA 합성을 진행하였다. qPCR는 HotStarTaq® PreMix DNA polymerase (QIAGEN) 및 하기 표 1의 프라이머 서열을 갖는 SYBR Green Mastermix (BioRad)를 이용하여 수행되었다. 데이터는 GAPDH 발현 수준을 기준으로 표준화되었다. qPCR 생산물은 2.5% 아가로오스 젤에서 분리되었다.

qPCR를 위해 사용된 프라이머

유전자	포워드 프라이머	리버스 프라이머
Xiap	5'-GCTTGCAAGAGCTGGATTTT-3'	5'-TGGCTTCCAATCCGTGAG-3'
Mcl-1	5'-GGTATTTAAGCTAGGGTCATTTGAA-3'	5'-TGCAGCCCTGACTAAAGGTC-3'
Bcl-2	5'-GTACCTGAACCGGCATCTG-3'	5'-GGGGCCATATAGTTCCACAA-3'
Bcl2-like 1	5'-TGACCACCTAGAGCCTTGGA-3'	5'-TGTTCCCGTAGAGATCCACAA-3'
Bcl2-like 2	5'-AGTGCAGGATTGGATGGTG-3'	5'-CCCGTATAGAGCTGTGAACTCC-3'
Puma	5'-TTCTCCGGAGTGTTCATGC-3'	5'-TACAGCGGAGGGCATCAG-3'
Diablo	5'-AGGCTGCCTATCAAACTGGA-3'	5'-GTGACTTCACCAACTGGATGT-3'
Casp9	5'-GTACATCGAGACCTTGGATGG-3'	5'-TCGCAGAAACAGCATTGG-3'
Casp7	5'-CCGTCCACAATGACTGCTC-3'	5'-CCGAGTTGCTGTGGTCCT-3'
Casp6	5'-TGAAATGCTTTAACGACCTCAG-3'	5'-GTGGCTTGAAGTCGACACCT-3'
Casp3	5'-GAGGCTGACTTCCTGTATGCTT-3'	5'-AACCACGACCCGTCCTTT-3'
Casp2	5'-CACAGGAAGGGGCTGATG-3'	5'-TCAGGATGCATTCCACACAC-3'
Bok	5'-AGTGGCAGGCCACATCTT-3'	5'-CCACGGAATACAGGGACACTA-3'
Bnip-like	5'-AACAACAACTGCGAGGAAGG-3'	5'-GTAGCTCCACCCAGGAACTG-3'
Bnip-3	5'-CCTGTCGCAGTTGGGTTC-3'	5'-GAAGTGCAGTTCTACCCAGGAG-3'
Bim	5'-GGAGACGAGTTCAACGAAACTT-3'	5'-AACAGTTGTAAGATAACCATTTGAGG-3'
Bid	5'-GACAGCTAGCCGCACAGTT-3'	5'-GGCCAGGCAGTTCCTTTT-3'
Bax	5'-GTGAGCGGCTGCTTGTCT-3'	5'-GGTCCCGAAGTAGGAGAGGA-3'
Bak1	5'-GGAATGCCTACGAACTCTTCA-3'	5'-CCAGCTGATGCCACTCTTAAA-3'
Bad	5'-GGAGCAACATTCATCAGCAG-3'	5'-TACGAACTGTGGCGACTCC-3'
Apaf1	5'-CTGCTCTTCCCAGCACAACT-3'	5'-CATGGGCTAGAGGCAAAGC-3'
Anp32a	5'-CTGCTCTTCCCAGCACAACT-3'	5'-CATGGGCTAGAGGCAAAGC-3'
Gapdh	5'-ATCACTGCCACCCAGAAGAC-3'	5'-CATGCCAGTGAGCTTCCCGT-3'

Microarray analysis

마이크로 어레이 분석은 이전에 개시된 방법을 일부 수정하여 진행되었다(Park et al., 2015). 간략하게는, RNeasy Plus Kit (QIAGEN)를 사용하여 Gfp 및 CCN3-R239Q이 함께 형질도입된 대뇌 피질 조직으로부터 총 RNA를 추출하였다. 대뇌 피질 조직의 분리는 P0(postnatal day 0) 시점에 형광 현미경 하에서 수행되었다. 전체 마우스 게놈 마이크로 어레이는 Affymetrix GeneChip Mouse Gene 430 (Santa Clara, CA)을 사용하여 수행하였다. 어레이를 스캔한 후 Affymetrix Expression console DAVID를 이용하여 분석하였다. 유전자 선별에 사용된 기준은 empty vector 일렉트로포레이션된 대뇌 피질과 비교하여 CCN3-R239Q의 과발현으로 인해 유의미한 상향조절 또는 하향조절 (> 1.5 배)을 갖는 유전자를 선별하였다.

통계분석

정량적인 데이터는 대표 실험(n=3)의 평균±표준편차로 나타내었다.

2. 결과

CCN3 - R239Q 돌연변이는 비정상적인 응집을 통해 뇌량 투사를 억제함

최근의 ExAC 프로젝트(http://exac.broadinstitute.-org/)를 통해 새로이 발견된 인간 CCN3의 SNP 중, rs773316453은 TSP-1 도메인의 Arg242이 글루타민으로 대체되는 돌연변이이다. 이것은 마우스 CCN3의 Arg239 아미노산과 일치한다(도 1a). 상기 돌연변이로 인해 생물학적 또는 생화학적 변화에 대한 알려진바 없다.

본 발명에서는 인간 CCN3의 SNP로서 rs773316453이 세포에 미치는 영향을 살펴보기 위하여, Neuro2a 세포에서 마우스 CCN3 돌연변이체의 발현을 조사하였다. 이는 Arg239를 글루타민으로 대체함으로써 얻어졌다(도 1a).

그 결과, CCN3-R239K 돌연변이의 경우 CCN3 단백질이 세포로부터 정상적으로 발현되고 분비되는 것으로 나타난 반면, CCN3-R239Q 돌연변이의 경우 CCN3 단백질이 비정상적으로 세포 내에서 응집하며, 이로 인해 세포 외부로 분비되지 않는 것을 확인할 수 있었다(도 1b 참조). 또한 CCN3-R239Q 돌연변이를 갖는 마우스의 피질에서, 뇌량투사 뉴런 형성이 비정상적인 것을 관찰할 수 있었다(도 1c 참조). 흥미롭게도, CCN3-R239Q 과발현 뉴런에서 신경돌기 성장은 두드러지게 감소되었으며, 신경 퇴행이 증명되었다. 상기와 같은 결과는, CCN3의 Arg239 아미노산이 글루타민으로 치환되는 경우 CCN3 단백질이 세포 외로 분비되는 것이 억제될 뿐 아니라, 정상 세포 분화에도 영향을 미친다는 것을 시사한다.

CCN3 - R239Q 돌연변이는 신경세포에서 세포사멸 관련된 유전자의 발현을 유 도함

본 실험에서는 비정상적으로 응집된 CCN3을 초래하는 세포에 있어서 CCN3-R239 돌연변이가 어떠한 영향을 미치는지를 조사하였다. 이전의 연구들은 단백질의 비정상적인 응집이 세포 사멸을 일으킬 수 있음을 보여준다. 따라서, 본 실험에서는 먼저 CCN3-R239Q 돌연변이를 과발현하는 Neuro2A 세포에서 세포 사멸 관련 유전자의 발현을 조사하였다.

그 결과 도 2에서 나타낸 바와 같이, 전세포사멸 유전자(pro-apoptotic gene)인 Puma가 가장 많이 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 한편, anti-apoptosis 유전자인 Bcl2-like2도 발현되었지만, Puma의 수준의 절반 정도였다. CCN3-R239Q의 과발현이 카스파제 단백질의 발현을 유도하지는 않았지만, 이는 불멸화된 세포주의 사용으로 인한 것일 수 있다. 상기와 같은 결과는, CCN3-R239Q 돌연변이의 경우 세포 내에서 비정상적으로 응집될 때 항-세포사멸 경로보다는 세포사멸 경로의 유도를 촉진한다는 것을 시사한다.

CCN3 - R239Q 돌연변이는 인비보 ( in vivo ) 상에서 Anp32a의 상향조절을 통하여 세포사멸 경로를 촉진함

본 실험에서는 CCN3-R239Q 돌연변이가 인비보(in vivo) 상에서 특정 세포사멸 유전자의 발현을 유도하는지 여부를 조사했다. CCN3-R239Q 돌연변이는 E14.5(embryonic day 14.5) 단계에 발달한 마우스 피질에서 GFP와 함께 과발현되었다. P0(postnatal day 0) 시점에서 GFP 양성 피질 조직을 분리하고 전사 변이를 마이크로 어레이를 사용하여 분석하였다(도 3a).

그 결과, 48개의 유전자가 1.5 배 이상 증가하고(하기 표 2 및 표 3 참조), 67개의 유전자가 1.5 배 이상 감소(하기 표 4 및 표 5 참조)한 것을 관찰할 수 있었다. 가장 많이 분포하는 상위 60개 변종(CCN3-R239Q 발현에 의해 높은 특이적 조절을 갖는 30개의 유전자 및 고도의 특이적인 하향조절을 갖는 30개의 유전자)의 계층적 클러스터링을 통해 최종적으로 5개의 세포사멸 관련 유전자(S100a9, Nts, Lyz2, Anp32a, and Zic1)가 CCN3-R239Q 돌연변이 발현에 의해 상향조절된다는 것을 확인할 수 있었다(도3b 참조).

확인된 유전자가 실제로 상향조절되는지를 확인하기 위해, qPCR을 사용하여 마이크로 어레이에 사용된 동일한 전체 RNA의 발현 변화를 확인하였다. 그 결과 도 4에서 나타낸 바와 같이, Anp32a 유전자의 발현은 CCN3-R239Q 과발현 피질 조직에서 약 2배 증가하는 것으로 나타났다.

상기와 같은 결과를 통해, 초기 발달 단계에서 성체에 이르는 마우스 피질에서 CCN3 단백질의 Arg239 아미노산이 글루타민으로 변이된 경우 CCN3 단백질의 세포 내 비정상적인 축적 및 응집을 유도할 수 있으며, 결국 Anp32a와 같은 세포사멸 유전자의 이소성 발현에 의해 신경 세포사멸이 유도된다는 것을 알 수 있었다.

CCN3-R239Q 과발현에 의해 상향조절되는 유전자

Gene_Symbol	GeneName	Genbank Accession	Fold change	p-value
Stfa1	stefin A1	NM_001082543	5.145204	0
Stfa2l1	stefin A2 like 1	NM_173869	4.835944	0
S100a9	S100 calcium binding protein A9 (calgranulin B)	NM_001281852	4.424148	0
S100a8	S100 calcium binding protein A8 (calgranulin A)	NM_013650	4.202266	0
Stfa3	stefin A3	NM_025288	4.057922	0
Stfa2	stefin A2	NM_001082545	2.927716	0
Ccl5	chemokine (C-C motif) ligand 5	NM_013653	2.743744	1.06E-07
Zic1	zinc finger protein of the cerebellum 1	NM_009573	2.706655	0
Saa3	serum amyloid A 3	NM_011315	2.611756	5.3E-06
Camp	cathelicidin antimicrobial peptide	NM_009921	2.499788	0
Wdr63	WD repeat domain 63	NM_172864	2.418269	1.9E-05
Anxa1	annexin A1	NM_010730	2.286925	2.33E-06
Nts	neurotensin	NM_024435	2.266371	0
Anxa1	annexin A1	NM_010730	2.236389	3.1E-06
Gjb4	gap junction protein, beta 4	NM_008127	2.225244	0.000247
Lrrc23	leucine rich repeat containing 23	NM_001302555	2.201734	8.89E-07
Dynlrb2	dynein light chain roadblock-type 2	NM_029297	2.153678	2.88E-08
Lyz2	lysozyme 2	AK159276	2.146891	0
Tspan18	tetraspanin 18	NM_183180	2.107689	2.07E-05
Aldh1a3	aldehyde dehydrogenase family 1, subfamily A3	NM_053080	2.041463	0.000527
Lyz1	lysozyme 1	NM_013590	1.970483	0.000155
Anp32a	acidic (leucine-rich) nuclear phosphoprotein 32 family, member A	NM_009672	1.942515	0
Ms4a7	membrane-spanning 4-domains, subfamily A, member 7	NM_001276398	1.925213	9.26E-05
Ddo	D-aspartate oxidase	NM_027442	1.862865	8.96E-05
Mrc1	mannose receptor, C type 1	NM_008625	1.85609	0.007871
Tnfsf13os	tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 13, opposite strand	XR_879970	1.837594	0.030459
Abcc3	ATP-binding cassette, sub-family C (CFTR/MRP), member 3	NM_029600	1.822622	0.014672
Odf3b	outer dense fiber of sperm tails 3B	NM_001013022	1.76207	0.000825
Zic5	zinc finger protein of the cerebellum 5	BB247860	1.747322	2.35E-05
Diap3	diaphanous homolog 3 (Drosophila)	AK006102	1.745702	0.032968
Slc6a4	solute carrier family 6 (neurotransmitter transporter, serotonin), member 4	NM_010484	1.714288	7.53E-05
Chil3	chitinase-like 3	NM_009892	1.710052	3.6E-05
Scn10a	sodium channel, voltage-gated, type X, alpha	NM_009134	1.697602	9.02E-07
Slc35b3	solute carrier family 35, member B3	AK167051	1.684275	9.8E-07
Mast4	microtubule associated serine/threonine kinase family member 4	AK138065	1.66571	0.029144
Syt10	synaptotagmin X	NM_018803	1.659473	2.39E-13
Tm4sf4	transmembrane 4 superfamily member 4	NM_145539	1.646255	0.000833
Serpina3m	serine (or cysteine) peptidase inhibitor, clade A, member 3M	NM_009253	1.633412	0.000245
Fam183b	family with sequence similarity 183, member B	NM_029283	1.623596	3.43E-07

CCN3-R239Q 과발현에 의해 상향조절되는 유전자

Gene_Symbol	GeneName	Genbank Accession	Fold change	p-value
Cd52	CD52 antigen	NM_013706	1.61404	0.022593
Zic3	zinc finger protein of the cerebellum 3	NM_009575	1.607911	2.88E-08
Dmrt2	doublesex and mab-3 related transcription factor 2	NM_145831	1.588109	0.001116
Clec4a2	C-type lectin domain family 4, member a2	NM_001170333	1.56268	0.016997
Iqcg	IQ motif containing G	NM_178378	1.552682	0.000712
Cbln2	cerebellin 2 precursor protein	NM_172633	1.544009	2.11E-06
Ntf3	neurotrophin 3	NM_001164034	1.532557	8.82E-06
Ano1	anoctamin 1, calcium activated chloride channel	NM_178642	1.522399	0.008541
Rspo3	R-spondin 3 homolog (Xenopus laevis)	NM_028351	1.501159	4.56E-06

CCN3-R239Q 과발현에 의해 하향조절되는 유전자

Gene_Symbol	GeneName	Genbank Accession	Fold change	p-value
Camk2d	calcium/calmodulin-dependent protein kinase II, delta	NM_001025439	-1.511411	0.02649607
Palmd	palmdelphin	AK136939	-1.5292	0.00627675
Krt12	keratin 12	NM_010661	-1.543799	0.00215208
Chrnb4	cholinergic receptor, nicotinic, beta polypeptide 4	NM_148944	-1.550094	0.00671317
Sult2b1	sulfotransferase family, cytosolic, 2B, member 1	NM_017465	-1.551646	0.00630997
P2ry12	purinergic receptor P2Y, G-protein coupled 12	NM_027571	-1.554228	0.02358777
Sowaha	sosondowah ankyrin repeat domain family member A	NM_183173	-1.558557	0.01216882
Pde11a	phosphodiesterase 11A	XM_006499453	-1.56304	0.00091746
Atp6ap1l	ATPase, H+ transporting, lysosomal accessory protein 1-like	NM_001145879	-1.564406	0.00026388
Zfhx3	zinc finger homeobox 3	NM_007496	-1.570922	0.00011902
Cpne6	copine VI	NM_009947	-1.571937	6.0777E-07
Zmat4	zinc finger, matrin type 4	NM_177086	-1.582468	0.00024451
Tgfa	transforming growth factor alpha	NM_031199	-1.588923	0.04058594
Pou6f2	POU domain, class 6, transcription factor 2	AK044498	-1.618126	0.04310425
Arc	activity regulated cytoskeletal-associated protein	NM_018790	-1.633795	0.00130757
Dach1	dachshund 1 (Drosophila)	NM_007826	-1.648225	8.7652E-08
Calb1	calbindin 1	NM_009788	-1.652259	1.5969E-08
Meis1	Meis homeobox 1	NM_001193271	-1.653075	3.5679E-08
Wdr86	WD repeat domain 86	NM_001081441	-1.65743	0.04519084
Pbx3	pre B cell leukemia homeobox 3	NM_016768	-1.662086	3.0669E-08
Ptpn14	protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 14	NM_008976	-1.663941	0.04074607
Rasal1	RAS protein activator like 1 (GAP1 like)	NM_013832	-1.672648	1.487E-05
Nrp2	neuropilin 2	NM_001077403	-1.677654	3.4507E-10
Wdr86	WD repeat domain 86	NM_001081441	-1.682711	0.00168183
Filip1	filamin A interacting protein 1	NM_001081243	-1.695877	0.02764107
Tac1	tachykinin 1	NM_009311	-1.704479	6.0777E-07
St18	suppression of tumorigenicity 18	NM_173868	-1.723543	3.4138E-05
Espn	espin	NM_207687	-1.727993	2.7151E-06
Klhl7	kelch-like 7	AK082520	-1.733294	6.1515E-05
Meis1	Meis homeobox 1	AK032947	-1.743548	0.01519809
Ogn	osteoglycin	NM_008760	-1.755058	0.04108464
Krt12	keratin 12	NM_010661	-1.776791	0.03247224
Zfhx3	zinc finger homeobox 3	NM_007496	-1.793334	0.00614089
Tac1	tachykinin 1	NM_009311	-1.802612	9.1038E-13
Htr1b	5-hydroxytryptamine (serotonin) receptor 1B	AK039736	-1.867355	0.00020437
Nat3	N-acetyltransferase 3	NM_008674	-1.868156	0.03291756
Pgam2	phosphoglycerate mutase 2	NM_018870	-1.89417	0.00440745
Gpr88	G-protein coupled receptor 88	NM_022427	-1.933841	1.4693E-16
Htr2c	5-hydroxytryptamine (serotonin) receptor 2C	NM_008312	-1.936042	0.00189328

CCN3-R239Q 과발현에 의해 하향조절되는 유전자

Gene_Symbol	GeneName	Genbank Accession	Fold change	p-value
Lamc2	laminin, gamma 2	NM_008485	-1.938201	1.0711E-07
Itpka	inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase A	NM_146125	-1.989589	2.0876E-17
Baiap3	BAI1-associated protein 3	NM_001163270	-1.997525	1.2541E-05
Gpr6	G protein-coupled receptor 6	XM_006512533	-2.076073	2.0442E-06
Naa25	N(alpha)-acetyltransferase 25, NatB auxiliary subunit	AK052060	-2.114818	0.01147132
Ppil4	peptidylprolyl isomerase (cyclophilin)-like 4	AK049634	-2.115223	1.655E-07
Rarb	retinoic acid receptor, beta	NM_001289760	-2.138683	2.8781E-08
Hrh1	histamine receptor H1	NM_001252643	-2.140807	1.487E-05
Pcp4l1	Purkinje cell protein 4-like 1	NM_025557	-2.173378	5.9292E-14
Ikzf1	IKAROS family zinc finger 1	NM_001025597	-2.180378	3.7789E-06
Adora2a	adenosine A2a receptor	NM_009630	-2.209132	5.2989E-11
Col6a1	collagen, type VI, alpha 1	NM_009933	-2.287557	1.3855E-09
Strip2	striatin interacting protein 2	NM_177204	-2.335482	3.4338E-16
Nexn	nexilin	NM_199465	-2.338665	1.0711E-07
Rarb	retinoic acid receptor, beta	NM_011243	-2.355103	1.6488E-25
Zfp503	zinc finger protein 503	NM_145459	-2.40674	9.2886E-10
P2ry1	purinergic receptor P2Y, G-protein coupled 1	NM_008772	-2.596054	2.1668E-15
Six3	sine oculis-related homeobox 3	NM_011381	-2.811971	6.1189E-08
Rxrg	retinoid X receptor gamma	NM_009107	-2.886848	3.0489E-48
Isl1	ISL1 transcription factor, LIM/homeodomain	NM_021459	-2.936935	6.799E-07
Ebf1	early B cell factor 1	BQ569914	-2.966906	1.1523E-30
Isl1	ISL1 transcription factor, LIM/homeodomain	NM_021459	-3.248901	7.5087E-16
Slc35d3	solute carrier family 35, member D3	NM_029529	-3.35006	1.7791E-07
Ebf1	early B cell factor 1	NM_001290711	-3.36535	1.7721E-25
Crabp1	cellular retinoic acid binding protein I	NM_001284507	-3.37021	8.3081E-53
Ebf1	early B cell factor 1	NM_001290711	-3.416742	1.376E-37
Crabp1	cellular retinoic acid binding protein I	NM_013496	-3.805273	3.9799E-23
Nexn	nexilin	NM_199465	-3.824223	1.2521E-27

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

TSP1: thrombospondin type-1
CT: cysteine-knot-containing module
GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
WCL: whole cell lysates
CM: conditioned media
Anp32a: Acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32 family member A

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Identification of novel single nucleotide polymorphism in CCN3 for neurodegeneration <130> NPDC-70093 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP1 domain polypeptide sequence <400> 1 Ile Glu Gln Thr Thr Glu Trp Ser Ala Cys Ser Lys Ser Cys Gly Met 1 5 10 15 Gly Val Ser Thr Arg Val Thr Asn Arg Asn Arg Gln Cys Glu Met Val 20 25 30 Lys Gln Thr Arg Leu Cys Ile Val Arg Pro Cys Glu 35 40 <210> 2 <211> 354 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CCN3 polypeptide sequence <400> 2 Met Ser Leu Phe Leu Arg Lys Arg Cys Leu Cys Leu Gly Phe Leu Leu 1 5 10 15 Phe His Leu Leu Ser Gln Val Ser Ala Ser Leu Arg Cys Pro Ser Arg 20 25 30 Cys Pro Pro Lys Cys Pro Ser Ile Ser Pro Thr Cys Ala Pro Gly Val 35 40 45 Arg Ser Val Leu Asp Gly Cys Ser Cys Cys Pro Val Cys Ala Arg Gln 50 55 60 Arg Gly Glu Ser Cys Ser Glu Met Arg Pro Cys Asp Gln Ser Ser Gly 65 70 75 80 Leu Tyr Cys Asp Arg Ser Ala Asp Pro Asn Asn Gln Thr Gly Ile Cys 85 90 95 Met Val Pro Glu Gly Asp Asn Cys Val Phe Asp Gly Val Ile Tyr Arg 100 105 110 Asn Gly Glu Lys Phe Glu Pro Asn Cys Gln Tyr Phe Cys Thr Cys Arg 115 120 125 Asp Gly Gln Ile Gly Cys Leu Pro Arg Cys Gln Leu Asp Val Leu Leu 130 135 140 Pro Gly Pro Asp Cys Pro Ala Pro Arg Lys Val Ala Val Pro Gly Glu 145 150 155 160 Cys Cys Glu Lys Trp Thr Cys Gly Ser Asp Glu Gln Gly Thr Gln Gly 165 170 175 Thr Leu Gly Gly Leu Ala Leu Pro Ala Tyr Arg Pro Glu Ala Thr Val 180 185 190 Gly Val Glu Val Ser Asp Ser Ser Ile Asn Cys Ile Glu Gln Thr Thr 195 200 205 Glu Trp Ser Ala Cys Ser Lys Ser Cys Gly Met Gly Val Ser Thr Arg 210 215 220 Val Thr Asn Arg Asn Arg Gln Cys Glu Met Val Lys Gln Thr Arg Leu 225 230 235 240 Cys Ile Val Arg Pro Cys Glu Gln Glu Pro Glu Glu Val Thr Asp Lys 245 250 255 Lys Gly Lys Lys Cys Leu Arg Thr Lys Lys Ser Leu Lys Ala Ile His 260 265 270 Leu Gln Phe Glu Asn Cys Thr Ser Leu Tyr Thr Tyr Lys Pro Arg Phe 275 280 285 Cys Gly Val Cys Ser Asp Gly Arg Cys Cys Thr Pro His Asn Thr Lys 290 295 300 Thr Ile Gln Val Glu Phe Gln Cys Leu Pro Gly Glu Ile Ile Lys Lys 305 310 315 320 Pro Val Met Val Ile Gly Thr Cys Thr Cys Tyr Ser Asn Cys Pro Gln 325 330 335 Asn Asn Glu Ala Phe Leu Gln Asp Leu Glu Leu Lys Thr Ser Arg Gly 340 345 350 Glu Ile

Claims (6)

1. 퇴행성 신경질환 진단용 조성물로서,
   상기 조성물은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 36번째 아미노산 변이를 측정하는 제제를 포함하고,
   상기 아미노산 변이는 아르기닌에서 글루타민으로 변이인 것을 특징으로 하는, 퇴행성 신경질환 진단용 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 제제는 CCN3의 TSP1 도메인의 36번째 아미노산에 특이적으로 결합할 수 있는 펩타이드, 항체 또는 앱타머인 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병인 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 키트.
5. 퇴행성 신경질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법으로서,
   상기 방법은 검사대상 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 36번째 아미노산 서열을 검출하는 단계를 포함하고,
   상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 36번째 아미노산 서열이 아르기닌에서 글루타민으로 변이된 경우 퇴행성 신경질환이 발병되거나 발병 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 판정하는, 퇴행성 신경질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
6. 삭제

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