ITRM20060545A1 - Biomarkers per la sclerosi laterale amiotropica sla e loro usi - Google Patents

Description

"Biomarkers per la Sclerosi Laterale Amiotropica (SLA) e loro usi"

DESCRIZIONE

Campo Tecnico Dell'invenzione

La presente invenzione consiste nell'impiego di un gruppo di geni e di pathway correlate, per la diagnosi, prognosi ed il trattamento terapeutico della Sclerosi Laterale Amiotrofica.

Stato della Tecnica anteriore

La Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) è una malattia degenerativa del sistema nervoso che colpisce i motoneuroni della corteccia motoria e del midollo spinale, caratterizzata da debolezza muscolare, atrofia, fascicolazioni, -progressiva paralisi e generalmente sopraggiunta morte per arresto respiratorio. Attualmente la Sclerosi Laterale Amiotrofica è una patologia incurabile con un'incidenza di 1,2 per 100.000 abitanti. Nella maggioranza dei casi la SLA è una malattia sporadica (SSLA), mentre più raramente (circa il 10%) si può osservare una forma familiare (FSLA) con probabile ereditarietà di tipo autosomico dominante. Nel 20% dei casi di FSLA è stata identificata una mutazione funzionale del gene SODI che codifica per l'enzima Cu-Zn superossido dismutasi. Oltre alla mutazione del SODI sono state identificate altre mutazioni geniche tra cui quelle che coinvolgono il gene ALS2 (alsin), SETX (senataxin) e VAPB (vesicle-associated membrane protein-associated protein B).

Mentre le alterazioni genetiche relative alla FSLA sono in corso di definizione, l'identificazione di quelle responsabili della SSLA sono tutt'oggi sconosciute. Nonostante negli ultimi decenni sia stata condotta un'intensa attività di ricerca sulla etiopatogenesi della SLA, attualmente le cause genetiche e i meccanismi molecolari che la sottendono non sono note.

Diversi studi hanno ormai accertato che la SLA è una complessa malattia multifattoriale e poligenica, la cui insorgenza non è attribuibile ad una singola causa ma alla interazione di fattori ambientali con alterazioni multigeniche (Majoor-Krakauer D. et al., Genetic epidemiology of amyotrophic lateral sclerosis. Clin. Genet., 63, 83-101,2003) .

Nell'era genomica la ricerca biomedica è stata rivoluzionata dalla capacità di eseguire studi d'espressione non più limitatamente ad un singolo gene per volta ma simultaneamente sull'intero patrimonio genetico. L'intero genoma, quindi, può essere utilizzato come "sensore" delle alterazioni geniche associate ad una malattia.

Tuttavia a tutt'oggi non esistono in letteratura, studi di genomica della SLA eseguiti su corteccia motoria. La SLA resta dunque una malattia con patogenesi poco nota, incurabile, per la quale non esistono metodi diagnostici, né trattamenti terapeutici di riferimento.

Scopo della presente invenzione è quindi quello di offrire nuovi mezzi per la diagnosi, la prognosi ed il trattamento terapeutico della SLA.

Sommario dell'invenzione

Per studiare il coinvolgimento dei motoneuroni nella patologia della SLA e caratterizzarne le alterazioni geniche, sono stati analizzati i profili d'espressione di 44000 geni nella corteccia motoria di pazienti affetti da SSLA, nonché i profili di espressione di intere classi funzionali di geni {pathway funzionali), ovvero gruppi di geni che codificano proteine con una funzione biologica e/o un ruolo fisiologico e/o una localizzazione subcellulare simile.

Quindi la presente invenzione si basa sull<1,>identificazione di specifici geni e di specifiche classi o pathway funzionali che sono alterati nella SLA e nell'impiego di questi geni e pathway per la diagnosi, prognosi ed il trattamento terapeutico della SLA.

Per questo un primo oggetto dell'invenzione è un metodo di diagnosi o di predisposizione genetica alla SLA comprendente le fasi in cui:

a) si misurano su campioni biologici da analizzare i valori di espressione di un insieme di geni definiti;

b) si confrontano i valori di espressione osservati per ogni singolo gene con i valori del gruppo "controllo", vale a dire il valore medio in persone sane;

c) si rilevano le variazioni di espressione che nel loro insieme definiscono il profilo di espressione genica caratteristico della SLA.

Dove il profilo di espressione genica associato alla SLA è caratterizzato da almeno una delle seguenti condizioni:

(a) da rapporti di espressione SLA/controllo relativi ad un primo gruppo di geni la cui espressione è ridotta (uguale o inferiore a 0.5), e contemporaneamente ad un secondo gruppo di geni la cui espressione è aumentata (uguale o superiore a 2);

(b) dall'alterazione dell'espressione genica di intere pathway (o classi) funzionali rispetto ai controlli (persone sane).

Un secondo oggetto dell'invenzione è l'analisi dei microarray, una piastra sulla quale sono ancorati in disposizione ordinata sequenze di DNA corrispondenti a geni o i loro rispettivi mRNA, la cui espressione è alterata durante la SLA.

Un terzo oggetto dell'invenzione sono kit diagnostici comprendenti tali piastre per analisi microarray e ogni reagente necessario per la diagnosi.

Un quarto oggetto dell'invenzione è rappresentato da sostanze in grado di normalizzare in vivo l'espressione genica di almeno un gene sottoespresso della tabella 2, ovvero di almeno un gene sopra-espresso della tabella 3, come medicamenti nel trattamento terapeutico della SLA. In particolare sono oggetti dell'invenzione cellule umane comprendente un vettore di espressione contenente il cDNA, o il corrispondente mRNA, di almeno uno dei geni sottoespressi e capace di esprimere in vivo la corrispondente proteina; agonisti di una proteina espressa da almeno uno dei geni sottoespressi così come repressori di espressione o antagonisti o anticorpi neutralizzanti la proteina codificata dal gene sovra-espresso.

Ulteriori oggetti dell'invenzione sono animali geneticamente modificati ed integranti nel loro genoma almeno un gene scelto dal gruppo di geni elencati in tabella 2 e 3 come modelli per la valutazione dell'efficienza di trattamenti terapeutici della SLA.

Sono infine oggetti ulteriori dell'invenzione metodi di prognosi e di monitoraggio dell'efficacia terapeutica della SLA caratterizzati dal fatto che il profilo di espressione genica osservato durante il trattamento terapeutico della SLA, o al suo termine, è comparato a quello caratteristico della SLA e/o a quello di controllo in persone sane.

La caratterizzazione delle alterazioni geniche associate alla malattia, oltre a consentire una tassonomia molecolare del processo neurodegenerativo, rappresenta un punto di partenza per lo sviluppo di diagnosi precise, prognosi più dettagliate, e protocolli terapeutici individualizzati.

Breve Descrizione delle Figure e delle Tabelle Tabella 1: La tabella elenca i geni identificati la cui espressione risulta significativamente alterata durante la SLA. La prima colonna (Fold Change) riporta i rapporti di espressione SLA/controllo. Il gruppo "controllo" rappresenta il valore mediano dell'espressione di tutti i campioni sani; la seconda colonna riporta il p-value (che indica la probabilità che le misure effettuate non siano statisticamente significative); la terza colonna riporta il nome ufficiale del gene; la quarta, il simbolo col quale il gene è riconosciuto; la quinta, il numero di accesso della banca dati "Unigene"; la sesta, il numero di accesso del corrispondente RNA.

Tabella 2: la tabella elenca i geni la cui espressione è ridotta nella SLA.

Tabella 3: La tabella elenca i geni la cui espressione è aumentata nella SLA.

Tabella 4: la tabella elenca le classi funzionali ridotte nella SLA.

Tabella 5: La tabella elenca le classi funzionali aumentate nella SLA.

Tabella 6: La tabella riporta i dati di 20 campioni (11 pazienti affetti da SLA e 9 controlli) sui quali è stata eseguita un'analisi del profilo d'espressione genica in corteccia motoria. Là prima colonna indica il numero di riconoscimento; la seconda il tipo di campione biologico prelevato; la terza il codice di riconoscimento; la quarta la malattia principale di cui soffriva il paziente; la quinta la causa di morte; la sesta, settima e ottava, l'età, il genere e la razza; la nona indica l'intervallo post-mortem (PMI) prima dal prelievo.

Figura 1: Geni le cui espressione è alterata nella corteccia motoria di pazienti con SLA.

La figura 1 mostra le variazione d'espressione genica nella corteccia motoria di pazienti affetti da SLA. Si tratta di un cluster gerarchico in cui sono rappresentati 57 geni (40 ridotti, 17 aumentati) le cui variazioni d'espressione sono statisticamente significative: SLA/controllo < 0,5 o > 2, p<0,05 mediante ANOVA (Welch's t-test, seguito da Benjamini e Hochberg False Discovery Rate) . I dati sono organizzati in una matrice: ciascuna linea rappresenta un singolo gene e ciascuna colonna rappresenta un paziente. Ogni quadrato della matrice è colorato con tonalità diverse di verde, nero, o rosso (o con toni diversi di grigio, dal grigio chiaro che corrisponde al verde al grigio scuro che corrisponde al rosso) che rappresentano rispettivamente il livello d'espressione minore, uguale o superiore alla mediana di tutti i campioni. L'intensità del colore indica quanto il livello d'espressione si discosta dal valore della mediana.

Figura 2 : Classi funzionali principali là cui espressione è alterata nella corteccia motoria dei pazienti con SLA.

Le pathway funzionali o classi funzionali (Gene Ontology, GO) alterate nella SLA sono raffigurate in rosso (processi biologici), verde (funzioni molecolari), o blu (componenti cellulari). Esse sono denominate: metabolismo energetico [energy metabolismi , omeostasi ionica e trasporto dei soluti ( ion homeostasis and solute transport) , trasduzione del segnale del meccanismo di difesa (defense signaling) , modificazione proteica e turnover (protein modification and turnover) , citoscheletro ( cytoskeleton) , e glicolisi (glycolysis) . Le pathway sono arrangiate all'interno del compartimento sub-cellulare in cui la proteina codificata è localizzata. L'aumento (→), la diminuzione (←), lo Z score (che indica la casualità della percentuale di geni che soddisfano i criteri di selezione), il p-value, il numero assoluto e la percentuale dei geni coinvolti in ciascuna pathway sono indicati.

Descrizione dettagliata dell'invenzione

La presente invenzione si fonda su un'analisi dei profili d'espressione genica della corteccia motoria eseguita su 11 pazienti affetti da SLA e 9 controlli (Tabella 6).

Lo studio è stato condotto su 44.233 geni analizzati simultaneamente, dei quali 19.431 hanno superato i controlli di qualità (i criteri di selezione applicati sono i seguenti: gli "spot" hanno un livello di saturazione < 3%; gli "spot" con bassa qualità (bad) sono rimossi; gli " spot " hanno un intensità relativamente uniforme e un background uniforme (Rgn R<2>635/532 > 0.6); l'intensità degli "spot" supera l'intensità del background (rapporto segnale/background > 3). Tra questi, utilizzando analisi statistiche stringenti ben note all'esperto, descritte nella parte sperimentale, sono stati identificati 57 geni (circa 0,3%) la cui espressione è alterata significativamente (p-value <0,05), con differenze maggiori o minori di 2 volte, nei pazienti con SLA (Figura 1 e Tabella 1) rispetto ai valori di controllo. Tali geni, elencati in Tabella 1, sono tutti noti e classificati in banche dati pubbliche e liberamente disponibili.

Il grado di significatività dell'alterazione, rappresentato in Tabella 1 come " Fold Change", è espresso in termini normalizzati come rapporto (SLA/controllo) tra il livello medio di espressione di un dato gene negli 11 pazienti affetti da SLA ed il livello di espressione medio totale dello stesso gene in persone sane (gruppo controllo). Essendo stato scelto come limite di significatività un valore di espressione aumentato o diminuito di almeno due volte rispetto al controllo, il rapporto

SLA/controllo sarà uguale o minore di 0,5 per i geni sottoespressi (Tabella 2) ovvero uguale o superiore a 2 per i geni sopraespressi (Tabella 3). La misurazione dei loro trascritti (RNA) o delle proteine da loro codificate consente quindi di identificare e misurare le variazioni geniche che nel loro insieme definiscono il profilo di espressione genica caratteristico della SLA e che predispongono o causano la malattia stessa.

La presente invenzione ha inoltre evidenziato che oltre a questi 57 geni, esistono altri geni la cui espressione è singolarmente alterata in pazienti affetti da SLA, se pur con alterazioni non significative nei termini sopra definiti.

Tuttavia tali geni sono collocati all'interno di pathway funzionali (classi funzionali) e l'alterazione della loro espressione, se pur singolarmente non significativa, risulta in una alterazione significativa dell'intera classe. Per ottenere maggiori informazioni di carattere funzionale e per avere una visione globale delle variazioni d'espressione genica associate alla SLA, sono state correlate le caratteristiche funzionali relative a processi biologici, funzioni molecolari e componenti cellulari ai dati d'espressione genica (Gene Ontology, GOs). Le variazioni d'espressione genica sono state analizzate e statisticamente testate all'interno di oltre 5100 classi o pathway biologiche/funzionali note e sono state identificate 6 classi funzionali principali in cui sia i "processi biologici", che i "componenti cellulari", che le "funzioni molecolari" sono omogeneamente alterate (ridotte o aumentate) nella SLA. Queste sono: il metabolismo energetico mitocondriale; la trasduzione del segnale del meccanismo di difesa; l'omeostasi ionica e il trasporto di soluti; il citoscheletro; la modificazione proteica; la glicolisi (Figura 2).

Il profilo d'espressione e l'analisi comparativa di queste pathway forniscono quindi un preciso ritratto molecolare della SLA.

Il lavoro è stato eseguito analizzando la regolazione dell'espressione di tutte le classi funzionali nella corteccia motoria di pazienti affetti da SLA rispetto ai controlli (Tabelle 4 e 5). A questo scopo, è stata misurata l'espressione differenziale di 19.431 geni, dei quali 8.457 sono correlati a classi funzionali.

Per analizzare le variazioni d'espressione genica all'interno di classi funzionali note è stato utilizzato il software Gene Map Annotator and Pathway Profiler (GenMAPP) 2.0 (www.GenMAPP.org).

La breve lista di 19.431 geni, estratti dall'insieme dei nostri dati, è stata importata in GenMaPP fornendo un numero identificativo corrispondente al UniGene cluster IDs, il valore della variazione d'espressione ed il p-value (Welch's t-test) dei campioni contro i controlli. Se più geni erano rappresentati dallo stesso UniGene cluster IDs, il gene con il più basso pvalue è stato utilizzato. GenMaPP collega dinamicamente i dati d'espressione alle classi funzionali (gene ontology, GO): processi biologici, componenti cellulari e funzioni molecolari. Includendo tutti i geni nelle principali classi funzionali, per ciascuna delle categorie GO, GenMaPP identifica i geni che soddisfano i criteri di selezione [variazione d'espressione ≥ 1.2 volte]. Il numero totale di geni analizzati, il numero di geni collocati in ciascuna classe funzionale ed il corrispondente numero di geni che incontrano i criteri di selezione sono utilizzati per calcolare il valore "z" che indica la casualità della percentuale di geni che soddisfano i criteri di selezione (valore z positivo). Inoltre viene calcolato il p-value "corretto" attraverso l'analisi della permutazione dei dati (200 permutazioni) mediante il test Westfall-Young. L'analisi della permutazione consente di interpretare dati estremamente significativi, così che per valori non corretti di p<0.0005 sono considerati pari a zero. Nella nostra analisi sono considerati solo le classi funzionali con valore "z" positivo, valore corretto di p <0.05.

Come riportato nella TABELLA 4 e TABELLA 5 le classi sono selezionate in base all'aumento o alla riduzione dell'espressione (rispettivamente tabella 4 e tabella 5), sono inoltre selezionate mediante il p-value corretto (la prima classe elencata ha il valore piu basso) e dal valore z (la prima classe elencata ha il valore più alto).

Tabella 4: in cui: CC significa "componente cellulare"; MF significa "funzione molecolare" e BP significa "processo biologico"

Questi sorprendenti risultati hanno permesso la realizzazione di un metodo di diagnosi della Sclerosi Laterale Amiotropìca umana o della predisposizione genetica alla Sclerosi Laterale Amiotropìca umana fino ad oggi non disponibili. Il metodo prevede le seguenti fasi: a) si misurano su campioni biologici da analizzare i valori di espressione di un insieme di geni definiti, b) si confrontano i valori di espressione osservati per ogni singolo gene con i valori del gruppo controllo (valore medio in persona sana), c) si rilevano le variazioni di espressione che nel loro insieme definiscono il profilo di espressione genica caratteristico della SLA.

Preparazione del campione

Il campione biologico sottoposto ad analisi è qualsiasi campione di tessuto o cellula nervosa centrale (corteccia motoria) o periferica (neuroni della mucosa gastrointestinale, nervo surale).

Il campione è sottoposto ad estrazione dell'RNA totale con metodi noti, per esempio con l'uso di Trizol oppure estrazione delle proteine espresse totali.

I trascritti di RNA o le proteine corrispondenti sono sottoposti a purificazione e se necessario a marcatura con una varietà di molecole reporter capaci di essere evidenziate, quali enzimi, molecole fluorescenti, molecole chemiluminescenti o elementi radioattivi ben noti nel settore. Tali molecole sono normalmente incorporate nel materiale purificato mediante PCR, ricombinazione, o tecniche enzimatiche. La sintesi di materiale marcato consiste nell'incorporazione di un nucleotide marcato con sostanze radioattive (P<32>-dNTP o S<35>-dNTP), fluorescenti (Cy3-dNTP o Cy5-dNTP) o chemioluminescenti.

Per la valutazione dei livelli di espressione dei singoli geni e quindi l'identificazione dei profili d'espressione genica associati alla SLA esistono varie e sperimentate tecniche a disposizione dell'esperto. La misurazione può essere condotta mediante la tecnologia dei microarray o mediante altre tecniche analitiche alternative che possono essere utilizzate singolarmente o in combinazione ai microarray quali: "la polimerase chain reaction (PCR) " (Mullis K.B. et all. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction, Methods Enzymol 1987;155:335-50;)/- "differential display " (Lìang P. and Pardee A.B. Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of thè polymerase chain reaction, Science 257, 967-971 (1992)); "genome mismatch scanning" (Nelson S. F. et all., Genomic mismatch scanning - A new approach to genetic-linnkage mapping, Nat. Genet. 4, 11-18, 1994);

"representational discriminant analisis" (William E. Spangler et all. Choosing Data-Mining Methods for Multiple Classification: Representational and Performance Measurement Implications for Decision Support, Journal of Management Information Systems Volume 16 (1) 1999); "transcript imaging" (Bachem Christian B.et all., Transcript Imaging with cDNA-AFLP: A Step-by-Step Protocol,Plant Molecular Biology Reporter 16: 157-173, 1998).

La tecnica su microarray prevede l'ibridazione di un substrato comprendente un insieme di DNA ordinati in "microarray" con l'RNA estratto da un campione biologico, la formazione di più complessi di ibridazione, la rilevazione e la comparazione dei segnali di ibridazione con quelli di riferimento. Il microarray consiste in una disposizione ordinata di acidi nucleici ancorati su un supporto passivo, per esempio una piastra di vetro, di polimero, di metallo opportunamente disattivato, di silicio o qualsiasi altro idoneo supporto anche opportunamente trattato per facilitare l'ancoraggio. Le sequenze di DNA immobilizzate sul supporto sono quelle dei geni elencati in tabella 1 ovvero quelle riportate in tabella 2 e tabella 3. In alternativa, per la determinazione delle alterazioni dell'espressione di un'intera classe funzionale, si riportano sul supporto di array tutti i geni relativi a questa classe funzionale o comunque un gruppo rappresentativo. Metodi di immobilizzazione su supporto solido di materiale nucleico sono esaurientemente descritti in letteratura (Baldeschweiler et al. (W095/251116), Heller et al. (U.S. Pat. N°5,605,662), Shalon et al.(W095/35505)).

Ibridazione

Le sequenze immobilizzate sul supporto solido sono ibridate con catene di DNA o RNA "target" estratte dal campione biologico da analizzare che possono essere marcate come sopra descritto. La stringenza dell'ibridazione è determinata dal contenuto e dalla lunghezza delle sequenze nucleotidiche, dalla concentrazione salina, e dalla temperatura. In particolare, la stringenza è tanto maggiore quanto più bassa è la concentrazione salina o quanto più alta è la temperatura d'ibridazione. Tamponi e condizioni di ibridazione sono quelle consigliate dal produttore di microarray Agilent preferibilmente utilizzate nell'invenzione. Le temperature di ibridazione variano da 42°C a 65°C per un tempo un'incubazione di circa 16 ore. Un tampone di ibridazione standard contiene normalmente formammide deionizzata, SSC, SDS e DNA denaturato da sperma di salmone.

Dopo l'incubazione i complessi di ibridazione sono lavati ripetutamente su piastra. I lavaggi possono essere eseguiti a bassa o a alta stringenza operando a diverse temperature con tamponi a differenti concentrazioni. I segnali di background possono essere ridotti mediante l'uso di detergenti, come Sarkosyl o Triton X-100, ed un agente bloccante, come il DNA denaturato da sperma di salmone.

Sviluppo del microarray

I supporti ibridati e lavati sono scansionati con idonea strumentazione producendo un'immagine in formato TIFF. Le immagini così ottenute sono poi analizzate utilizzando un software dedicato. La scansione e l'analisi delle immagini sono eseguite secondo procedure ben note all'esperto e descritte di seguito nella parte sperimentale.

Diagnostica

Le variazioni dell'intensità del segnale d'ibridazione registrate come sopra descritto rivelano le differenze d'espressione dei singoli geni. Misurando il livello di espressione di ciascuno dei geni dell'array è possibile identificare in un campione biologico prelevato da un individuo un profilo d'espressione genica utile a determinare la predisposizione alla malattia o a diagnosticarne la presenza e a sviluppare terapie individualizzate. Infatti i risultati rappresentati in figura 1 mostrano come una diminuzione significativa ( fold change < 0.5) dell'espressione di tutti i geni elencati in tabella 2 ed un concomitante significativo aumento ( fold change > 2) dell'espressione di tutti i geni elencati in tabella 3 identifichi il quadro clinico tipico della SLA o della predisposizione alla SLA.

È importante sottolineare che gli insiemi di DNA o RNA individuati nella presente invenzione rappresentano validi strumenti non solo per diagnosticare l'esistenza della malattia e definire quindi un trattamento terapeutico personalizzato, ma possono vantaggiosamente anche essere utilizzati come marker dell'efficacia di un trattamento terapeutico e quindi della prognosi della malattia. Infatti l'efficacia terapeutica può essere valutata comparando durante il trattamento o alla fine dello stesso le variazioni di profili d'espressione genica del campione biologico (soggetto malato) rispetto al campione di riferimento (soggetto sano) o rispetto al profilo iniziale del paziente.

Terapia.

L'insieme di acidi nucleici della presente invenzione può essere usato nella terapia genica. L'RNAm o il corrispondente cDNA può essere introdotto in vettori - come retrovirus, adenovirus, virus herpes simplex - e in plasmidi batterici, o può essere integrato in cellule target, quali per esempio le cellule del midollo osseo o le cellule staminali. In quest'ultimo caso, stabilita l'integrazione - e confermate la trascrizione e/o la traduzione, la cellula può essere reintrodotta nel soggetto. L'espressione della proteina, modulata dal mRNA che ne dirige la traduzione, può correggere lo stato patologico associato alla riduzione, alla perdita, o alla sovraespressione della proteina stessa. Le modalità d'uso della terapia genica nella SLA, i tipi di vettori virali in grado di trasferire geni all'interno di cellule nervose, e gli studi eseguiti in modelli animali di patologie del motoneurone sono dettagliati nelle seguenti pubblicazioni:

-Azzouz M. Gene Therapy for ALS: Progress and prospects. Biochim Biophys Acta. 2006 -VandenDriessche T. Gene therapy flexes muscle.

J Gene Med. 2005 Sep;7(9):1255-6.

-Miller TM, Raspar BK, Kops GJ, Yamanaka K, Christian LJ, Gage FH, Cleveland DW. Virusdelivered small RNA silencing sustains strength in amyotrophic lateral sclerosis. Ann Neurol. 2005 May;57 (5):773-6.

-Azzouz M, Mazarakis N. Non-primate EIAV-based lentiviral vectors as gene delivery System for motor neuron diseases. Curr Gene Ther. 2004 Sep;4(3) :277-86.

-Boillee S, Cleveland DW. Gene therapy for ALS delivers. Trends Neurosci. 2004 May;27(5):235-8. -Wang LJ, Lu YY, Muramatsu S, Ikeguchi K, Fujimoto K, Okada T, Mizukami H,Matsushita T, Hanazono Y, Kume A, Nagatsu T, Ozawa K, Nakano I. Neuroprotective effects of glial celi line-derived neurotrophic factor mediateci by an adeno-associated virus vector in a transgenic animai model of amyotrophic lateral sclerosis. J Neurosci. 2002 Aug 15;22 (16):6920-8.

-Acsadi G, Anguelov RA, Yang H, Toth G, Thomas R, Jani A, Wang Y, Ianakova E, Mohammad S, Lewis RA, Shy ME. Increased survival and function of SODI mice after glial cell-derived neurotrophic factor gene therapy. Hum Gene Ther. 2002 Jun 10;13 (9):1047-59.

-Alisky JM, Davidson BL. Gene therapy for amyotrophic lateral sclerosis and other motor neuron diseases. Hum Gene Ther. 2000 Nov 20;11 (17):2315-29.

Inoltre, ciascuna delle proteine codificate dai geni associati alla SLA caratterizzati nella presente invenzione è un bersaglio terapeutico nel trattamento della malattia. In particolare ogni molecola capace di modulare l'espressione genica o l'attività delle proteine codificate dai geni, può essere impiegata nella terapia. Tali molecole possono essere "induttori" o "inibitori" che modulano l'espressione genica (RNA-antisenso); "agonisti" o "antagonisti", che rispettivamente aumentano o diminuiscono l'attività della proteina codificata.

Vari esempi di ligandi farmacologici specifici per alcuni geni associati alla SLA sono descritti in letteratura.

Un primo esempio sono le sostanze Calyculin-A e Genistein, inibitori specifici della proteina espressa dal gene SLC12A5 (J.A. Kim, Y.S. Kang, Y.S. Lee, Involvement of K(+)-CI(-)-cotransport in thè apoptosis induced by N-ethylmaleimide in HepG2 human hepatoblastoma cells, Eur. J. Pharmacol. 418 (2001) 1-5). Altri antagonisti sono le sostanze Bicuculline, N-methylbicuculline, Picrotoxin, mentre esempi di agonisti sono le sostanze 4,5,6,7-tetrahydroisoxazolo- [5,4-c]-pyridin-3-ol, GABA, Isoguvacine, Muscimol, Progabide, THIP, tutte descritte in letteratura come ligandi specifici per la proteina espressa dal gene CABRAI.

Infine le sostanze Taxol e Vinblastina sono specifici inibitori della proteina espressa dal gene TUBB2B (K. Xu et al., Celi Motil. Cytoskeleton 53 (2002) 39-52 e C. Walss-Bass et al., Invest New Drugs 21 (2003) 15-20).

Le suddette molecole agoniste o antagoniste possono essere utilizzate in combinazione con altri agenti terapeutici. La selezione dei farmaci appropriati nella terapia combinata può essere realizzata seguendo le indicazioni farmaceutiche convenzionali. Con questo tipo di approccio l'efficacia terapeutica di ogni farmaco può essere conseguita con dosaggi più bassi, riducendo la probabilità d'insorgenza di eventuali effetti collaterali.

Preparazione delle proteine codificate

Le proteine codificate dai geni identificati nella presente invenzione possono essere ottenute, seguendo procedure ben note all'esperto, clonando i cDNA dell'invenzione in vettori e successivamente trasformando i vettori in cellule ospiti competenti. Oltre a garantire un'amplificazione del gene, le cellule ospiti offrono l'apparato biosintetico necessario per consentirne l'espressione, ovvero la sìntesi del prodotto proteico che queste codificano. Per esempio l'espressione eterologa della Metallotionina 1 in E. coli è stata eseguita come descritto da Tio L, Villarreal L, Atrian S, Capdevila M. " Functional differentiatìon in thè mammalian metallothionein gene family: metalbinding features of mouse MT4 and comparison with its paralog MT1. " J Biol Chem. 2004 Jun 4;279(23):24403-13.

Le cellule ospiti più idonee sono: le cellule di mammifero come chinese hamster ovary (CHO) e le cellule umane 293, le cellule di insetto come Sf9, le cellule di piante come Nicotiana tabacum, le cellule di lievito come il Saccharomyces cerevisiae, ed i batteri come E. coli. Per ciascuno di questi sistemi cellulari, il più utile vettore d'espressione include, Un'origine di replicazione, ed uno o due marker che consentano la selezione di batteri ed ospiti eucariotici trasformati. I vettori espressi in ospiti eucariotici possono richiedere l'addizione di una coda poli A 3' se il DNA ne è privo.

Inoltre, il vettore può contenere promotori e amplificatori dell'espressione genica. I promotori più utilizzati sono: SV40 promotori per le cellule CHO; T7 promotori per ospiti batterici; promotori virali ed amplificatori per le piante; promotori PGH per il lievito. I vettori Adenovirali con l'enhancer del virus del Sarcoma di Rous, o i vettori retro-virali con promoter terminali ripetuti, possono essere impiegati nello studio dell'espressione proteica in linee cellulari di mammiferi. Dopo aver ottenuto culture omogenee di cellule ricombinanti, grandi quantità di proteine possono essere estratte e poi recuperate mediante metodi cromatografici. Le proteine prodotte con questi metodi possono essere usate come composizione farmaceutica per il trattamento della SLA.

Utilizzo delle proteine per l'identificazione di ligrandi

Le proteine codificate dagli RNA messaggeri caratterizzati nella presente invenzione, sono impiegate in metodi di screening per l'identificazione di specifici ligandi, e nella purificazione di una molecola o composto proveniente da un campione. La proteina impiegata in tale screening può essere libera nella soluzione, posta su un substrato, o localizzata a livello endocellulare. Per esempio, alcuni test di screening si avvalgono dell'uso di cellule ospiti procariotiche, vitali o fissate, stabilmente trasformate con acidi nucleici ricombinanti, che hanno espresso e hanno posizionato una proteina sulla loro superficie cellulare. Le cellule sono poste a contatto con molteplici potenziali ligandi e la specificità del legame o la formazione dei complessi tra la proteina espressa ed il ligando può essere misurata. Il ligando può essere un frammento di DNA, RNA, agonisti, antagonisti, anticorpi, immunoglobuline, inibitori, peptidi, agenti farmaceutici, proteine, o qualunque altra molecola che lega specificatamente la proteina.

Utilizzo delle proteine per la produzione di anticorpi .

Un'ulteriore applicazione delle proteine codificate dai geni identificati dall'invenzione è la loro utilizzazione per la produzione di anticorpi specifici. Gli anticorpi possono essere prodotti usando un oligopeptide o una porzione della proteina con attività immunologiche. Molte tecniche sono note in letteratura per la produzione di anticorpi. Le principali sono: 1) inoculazione nell'animale (solitamente capre, conigli, topi) di uria proteina o di un oligopeptide antigenicamente efficace, capace di indurre una risposta immunologica; 2) progettazione di ibridomi per produrre anticorpi monoclonali; 3) induzione della produzione in vivo della popolazione linfocitaria; o 4) screening di library di immunoglobuline ricombinanti.

Gli anticorpi ottenuti usando le proteine dell'invenzione possono essere utilizzati per la diagnosi della SLA e/o monitorare l'efficacia di trattamenti terapeutici.

Sviluppo di modelli animali

L'analisi dell'espressione genica condotta su culture cellulari, su tessuti in vitro o su modelli animali fornisce un rapido metodo di screening di potenziali farmaci. L'invenzione fornisce quindi un mezzo per determinare rapidamente l'attività molecolare di un farmaco e le sue potenziali applicazioni nel trattamento della SLA.

I modelli animali che riproducono le alterazioni riscontrate a carico dei geni identificati nella presente invenzione, possono essere adoperati per sviluppare nuovi metodi diagnostici e nuove strategie terapeutiche (come per esempio già riportato da Shaw P.J. et al., Molecular and cellular pathways of neurodegeneration in motor, neurone disease, J.Neurol .Neurosurg. Psychiatry 76(8):1046-57, Aug 2005; ed J. Eyer et al., Pathogenesis of two axonopathies does not require axonal neurofilaments, Nature 391, 584-587, 1998). II modello animale più comune è il mammifero; ma analisi tossicologiche, studi con agenti Infettanti, carcinomi,- e farmaci sono eseguiti generalmente su roditori, o su topi, per il loro basso costo, per la disponibilità, il potenziale riproduttivo, e l'abbondante letteratura di riferimento. Ceppi di roditori "inbred" e "outbred" forniscono un modello opportuno per l'analisi delle risposte fisiologiche alle variazioni d'espressione dei geni "target".

I roditori transgenici inbred che sovraesprimono o sottoesprimono un gene di interesse possono essere usati come modello di patologie umane o impiegati per testare agenti terapeutici o tossici. In alcuni casi, il gene introdotto può essere attivato in un tessuto specifico durante la fase di sviluppo fetale o post-natale. L’espressione del transgene è monitorata dall'analisi del fenotipo, dall'espressione di mRNA tessutospecifico, o dal livello proteico, nel siero e nei tessuti di animali transgenici, prima, durante, e dopo il trattamento terapeutico sperimentale. Le Cellule staminali embrionali rappresentano un valido mezzo per la produzione di animali modificati. Le cellule staminali embrionali (ES) isolate dagli embrioni di roditori mantengono la capacità di formare tessuti embrionali. Quando le cellule ES come il topo 129/linea cellulare SvJ sono collocate in blastocisti del ceppo C57BL/6 di topo, riprendono il normale sviluppo e contribuiscono alla formazione dei tessuti nell’animale neonato. Le cellule ES sono preferibilmente utilizzate in modelli knockout sperimentali e knockin animali. La metodica prevede: l'introduzione del DNA in un vettore; la trasformazione del vettore all'interno di cellule ES; l'identificazione delle cellule trasformate e l'inoculazione in blastocisti di topo; il trasferimento chirurgico delle blastocisti in madri gravide. La progenia risultante è genotipizzata e allevata per produrre ceppi eterozigoti o omozigoti.

Il gene integrato nel genoma del modello animale può essere knockout o knockin.

Nell'analisi di un gene knockout, una porzione del gene è enzimaticamente modificata dalla inclusione di una sequenza sintetica come il gene della neomicina fosfotrasferasi . Il gene modificato è trasformato in culture di cellule ES ed integrato nel genoma endogeno con una ricombinazione omologa. La sequenza inserita interrompe la trascrizione del gene endogeno.

Le cellule ES possono essere usate per creare animali knockin umanizzati o modelli animali transgenici di malattie umane. Con la tecnologia knockin, una regione di un gene è introdotta in cellule animali ES ed integrata nel genoma cellulare. La progenie transgenica o le linee inbred sono studiate e sono trattate con potenziali agenti farmaceutici per ottenere informazioni sulla progressione ed il trattamento della condizione umana analoga.

ESEMPI

Esempio 1 : preparazione del campione biologico È stato eseguita un'analisi del profilo d'espressione genica in 20 campioni di corteccia motoria (11 pazienti affetti da SLA e 9 controlli) come riportato in tabella 6.

I campioni congelati di corteccia motoria umana (sezioni del giro precentrale) forniti dal "Miami Brain e Tissue Bank", sono stati selezionati tra quelli il cui intervallo post-mortem (PMI) al congelamento non superava le 24 ore. Tutti i campioni provenivano da pazienti affetti da SLA, di età compresa tra 68.2±7.6, ed il PMI era di 15.518.0 ore. I campioni controllo erano pazienti di età compresa 68 .7111.0, avevano un PMI di 11.416.9 ore, e le cause della morte non erano correlate alla SLA.

A - Brain and Tissue Bank for Developmental

Disorders (Miami, FL, USA)

B - Ambion, Ine, (Austin, TX, USA)

n/a - non disponibile

ALS - Sclerosi laterale Amiotrofica

ESEMPIO 2: Preparazione dei campioni, estrazione di SNA, tecniche di marcatura e d'ibridazione

2.1 Estrazione del RNA totale dal tessuto mediante Trizol :

I campioni di tessuto cerebrale sono pesati ed omogeneizzati in 1 ml di Trizol per 50-100 mg di tessuto mediante Polytron homogenizer. Durante l'omogeneizzazione e lisi del campione l'RNA rimane integro mentre vengono distrutte le cellule e i suoi componenti.

2.2 Separazione delle fasi:

Si aggiungono 0.2 mi di cloroformio ogni millilitro di Trizol iniziale e poi si centrifuga a 12000 x g per 15 min. a 4°C. La centrifugazione separa la fase inferiore fenolocloroformica dalla fase superiore acquosa contenente l'RNA che viene recuperata e trasferita in un'altra RNAse-Free Microfuge Tube.

2.3 Precipitazione e lavaggio dell 'UNA:

L'RNA è precipitato dalla fase acquosa superiore aggiungendo circa 0.5 mi di isopropanolo per ogni millilitro iniziale di reagente Trizol e incubato a 4 C°per 10 minuti. Successivamente si centrifuga a 12000 x g per 10 minuti a 4°C, si rimuove il surnatante e si lava il pellet con 500 μl di etanolo al 70%. Infine, si centrifuga a 12000 x g per 5 minuti a 4°C, e dopo aver eliminato l'etanolo si lascia asciugare il pellet per almeno 10 minuti in cappa sterile a flusso laminare.

2.4 Quantizzazione dell 'RNA:

L'RNA è risospeso ad una concentrazione finale di circa 1 μg/μl in H20 L'RNA totale così ottenuto viene valutato qualitativamente mediante elettroforesi su gel, {gli RNA ribosomiali devono essere chiaramente distinguibili approssimativamente a 1.9 e 5 kb, senza presentare strisce indicative di degradazione o bande ad elevato peso molecolare indicative di contaminazione di DNA) e quantitativamente mediante spettrofotometro, misurando l'assorbanza UV a 260 e 280 nm. L'RNA estratto non utilizzato in successivi esperimenti, deve essere conservato a 80°C.

2.5 Sintesi di cRSA fluorescente :

La sintesi di cRNA fluorescente è stata condotta mediante "Low RNA Input Fluorescent Linear Amplification kit" seguendo il protocollo suggerito dal produttore (Agilent)

• Si aggiungono a 0.5-5 μg di RNA totale 1.2-5 μl di T7 primer promoter portando il volume a 11.5 μl con H20.

• si denatura incubando a 65 °C x 10 min

• si incuba in ghiaccio per 5 min

• si aggiungono 8.5 μl di master mix composta da:

4 μl di first Strand buffer 5X; 2 μl di 0.1 M DDT; lui di 10 mM dNTP mix; 1ul di MMLVRT; 0.5 μl di RNaseOUT. Incubare a 40 °C per 2h.

• si denatura a 65 °C x 15 min

• si incubare in ghiaccio per 5 min

■ si aggiungono 2,4 μl di cyanine 3 o cyanine 5 (Perkin Elmer) (eccitabili ad una lunghezza d'onda di 532 nm o 633 nm)

• si aggiungono 57,6 μl di transcription master mix composta da: 15,3 μl di H20; 20 μl di transcription buffer 4X; 6 μl di 0.1 M DDT; 8 μl di NTP mix; 6,4 μl di PEG; 0,5 μl di RNaseOUT; 0,6 μl di Pyrophosphatase; 0,8 μl di T7 RNA polimerasi.

• si incuba a 40 °C per 2h.

2.6 Purificazione:

Il cRNA è purificato con l'utilizzo del kit Qiagen "RNeasy mini kit" secondo le istruzioni fornite dal produttore.

2.7 Quantizzazione:

Al temine della purificazione viene calcolata la frequenza di incorporazione delle molecole fluorescenti nel cRNA mediante uno spettrofotometro con l'uso di cuvette standard. Tipicamente la resa di cRNA marcato è di 0.2-1 μg per 50 pg di RNA di partenza.

2.8 Ibridazione:

Le reazioni di ibridazione sono condotte mediante l'impiego di due molecole fluorescenti, Cy3 e Cy5, che consentono l'ibridazione simultanea di due campioni (per esempio un campione di riferimento ed il campione d'interesse) sullo stesso microarray (Agilent). La soluzione di ibridazione (composta da: 0,75 del campione di riferimento marcato con Cy3; 0,75 del campione target marcato con Cy5; 50 μl di control target 10X; H20 fino ad un volume di 240 μl; 10 μl di fragmentation buffer 25X e 250 μΐ di buffer d'ibridazione 2X) viene dispensata sul microarray, opportunamente sigillato nella camera d'ibridazione secondo la procedura indicata dal produttore, ed incubata alla temperatura di 65 °C per un tempo di 16 ore. Al termine dell'ibridazione i vetrini vengono sottoposti ai successivi cicli di lavaggio .

2.9 Lavaggi:

I lavaggi sono condotti nelle seguenti soluzioni rispettivamente a bassa ed alta stringenza. Il vetrino è immerso 10 min a temperatura ambiente nella soluzione soluzione a bassa stringenza (Per 1 litro di: 700 mi di H20; 300 mi di SSC 20X; 0,5 mi di Triton X-102), e 5 min nella soluzione soluzione ad alta stringenza (Per 1 litro di: 995 ml di H20; 5 mi di SSC 20X; 0,5 mi di Triton X-102) alla temperatura di 4 °G.

ESEMPIO 3: Analisi dei profili d'espressione

I vetrini ibridati e lavati sono scansionati producendo un'immagine in formato TIFF. Le immagini così ottenute sono poi analizzate utilizzando un software dedicato (GenePix Pro v.4.0 , Axon Instruments, Union City, CA). La scansione e l'analisi delle immagini sono eseguite secondo le seguenti procedure:

1. Il voltaggio applicato al fotomoltiplicatore corrispondente alla lunghezza d'onda di 532 nm (Cy3) è stato mantenuto costante, mentre quello del fotomoltiplicatore corrispondente alla lunghezza d'onda di 635 nm (Cy5) è stato opportunamente modulato in modo da ottenere un corretto bilanciamento fra i due canali.

2. Ciascuna immagine generata è stata ottenuta mediando tre distinte scansioni, in modo tale da minimizzare eventuali variazioni legate al fluttuare della potenza dei laser deputati all'eccitazione dei fluorofori.

3. Ciascuna coppia d'immagini ottenuta, infine, è stata analizzata in modo dettagliato, al fine di rimuovere gli spot aventi bassa qualità ( flagging ) , sia sfruttando le procedure automatiche implementate nel software d'analisi, sia ispezionando visivamente le immagini per rimuovere manualmente gli spot di bassa qualità sfuggiti alle procedure automatiche.

I dati grezzi sono normalizzati e successivamente filtrati da test statistici quali Welch's t-test (Anova), seguito dalle procedure Benjamini and Hochberg False Discovery Rate (multiple testing correction).

Per l'analisi delle variazioni funzionali di intere classi funzionali, i dati di espressione genica sono analizzati all'interno di classi funzionali, o di pathway biologiche, note mediante l'uso di Gene Microarray Pathway Profilar (GenMAPP) 2.0 software package (www.GenMAPP.org). I 19.431 geni, estratti dall'insieme dei nostri dati, sono importati in GenMaPP fornendo un numero identificativo corrispondente al UniGene cluster IDs, il valore della variazione d'espressione ed il p-value (Welch's t-test) dei campioni contro i controlli. Includendo tutti i geni nelle principali classi funzionali, per ciascuna delle categorie G0, GenMaPP identifica i geni che soddisfano i criteri di selezione [variazione d'espressione ≥ 1.2 volte]. Il numero totale di geni analizzati, il numero di geni collocati in ciascuna classe funzionale ed il corrispondente numero di geni che incontrano i criteri di selezione sono utilizzati per calcolare lo " z score" . Nella nostra analisi sono considerati solo le classi funzionali con valore "z" positivo, valore corretto di p <0.05.

Claims (18)

1. RIVENDICAZIONI 1, Metodo di diagnosi in vitro della Sclerosi Laterale Amiotropica (SLA) umana o della predisposizione genetica alla Sclerosi Laterale Amiotropica umana comprendente le fasi in cui: (SLA) a) si misurano su campioni biologici da analizzare i valori di espressione di un insieme di geni definiti; b) si confrontano i valori di espressione osservati per ogni singolo gene con i valori di controllo (valore medio in persona sana); c) si rilevano le variazioni di espressione che nel loro insieme definiscono il profilo di espressione genica caratteristico della SLA.
2. 2. Metodo di diagnosi secondo la rivendicazione 1, in cui il profilo genico associato alla SLA è caratterizzato da almeno una delle seguenti condizioni: (a) da rapporti di espressione SLA/controllo relativi a tutti i singoli geni di un primo gruppo di geni ad espressione depressa uguali o inferiori a 0.5 e, contemporaneamente, di un secondo gruppo di geni ad espressione aumentata uguali o superiori a 2; (b) dall'alterazione dell'espressione genica di classi funzionali rispetto alla situazione di controllo.
3. 3. Metodo di diagnosi secondo la rivendicazione 2 in cui il primo gruppo di geni con espressione depressa in caso di SLA comprende i geni elencati in tabella 2, mentre il secondo gruppo di geni ad espressione aumentata in caso SLA comprende i seguenti geni elencati in tabella 3.
4. 4. Metodo di diagnosi secondo la rivendicazione 2 in cui almeno una delle seguenti classi funzionali principali presenta espressione genica globale alterata: - metabolismo energetico mitocondriale, trasduzione del segnale del meccanismo di difesa, omeostasi ionica e trasporto di soluti, - citoscheletro, - modificazione proteica, glicolisi. L
5. 5. Metodo di diagnosi secondo la rivendicazione 2 in cui almeno una delle classi funzionali elencate in tabella 4 presenta espressione genica globale aumentata, oppure almeno una della classi funzionali elencate in tabella 5 presenta espressione genica globale depressa.
6. 6. Metodo di diagnosi secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 5 in cui la caratterizzazione del profilo di espressione genica associata alla SLA è eseguita mediante tecnica di microarray, PCR, differential display, gel elettroforesi, scansione dei mismatch genomici, representation discriminant analisi, transcription imaging.
7. 7. Metodo secondo la rivendicazione 6 in cui la caratterizzazione del profilo di espressione genica associata alla SLA è eseguito attraverso ibridazione dell'RNA estratto dal campione da analizzare con l'insieme di geni immobilizzati su un supporto per microarray.
8. 8. Metodo secondo la rivendicazione 7 in cui l'RNA estratto da campione biologico è marcato con una molecola reporter capace d'essere evidenziata.
9. 9. Metodo di diagnosi secondo le rivendicazioni 4 o 5 in cui la caratterizzazione dell'espressione genica di classi funzionali complete è eseguita mediante tecnica di microarray con analisi dei risultati condotta con idonei programma. di calcolatore.
10. 10. Piastra per microarray comprendente sequenze nucleotidiche complementari ai geni elencati in tabella 1, o loro rispettivi RNA, immobilizzati in disposizione ordinata su un supporto solido.
11. 11. Piastra per microarray comprendente sequenze nucleotidiche complementari ai geni, o loro rispettivi RNA, che definiscono almeno una della classi funzionali elencate in tabella 4 o 5 immobilizzati in disposizione ordinata su un supporto solido.
12. 12. Kit diagnostico per la diagnosi della SLA o della predisposizione alla SLA comprendente piastre da microarray secondo le rivendicazioni 10 o 11 ed idonei reagenti per l'esecuzione del saggio.
13. 13. Animale geneticamente modificato per la valutazione dell'efficienza di trattamenti terapeutici della SLA caratterizzato dal fatto di integrare nel suo genoma almeno un gene umano scelto dal gruppo di geni elencati in tabella 1.
14. 14. Prodotto di espressione o di trascrizione (RNA) di almeno uno dei geni elencati in tabella 1 per uso nel trattamento terapeutico della SLA.
15. 15. Agonista del prodotto secondo la rivendicazione 14 capace di normalizzare in vivo l'espressione genica di almeno un gene sotto-espresso scelto tra i geni di tabella 2.
16. 16. Agonista secondo la rivendicazione 15 caratterizzato dal fatto d'essere una cellula umana comprendente un vettore di espressione contenente il cDNA, o il corrispondente mRNA, di almeno uno dei geni sottoespressi e capace di esprimere in vivo la corrispondente proteina.
17. 17. Antagonista del prodotto secondo la rivendicazione 14 capace di normalizzare in vivo l'espressione genica di almeno un gene sopraespresso scelto tra i geni di tabella 3, caratterizzata dal fatto d'essere un inibitore/repressore di espressione oppure o un anticorpo neutralizzante la proteina espressa dal gene sovra-espresso.
18. 18. Metodo di prognosi della SLA caratterizzato dal fatto che il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 9 è ripetuto una o più volte durante il trattamento terapeutico della SLA e che il profilo di espressione genica osservato è comparato a quello caratteristico della SLA e/o a quello di controllo in persone sane.