DE112009001994T5

DE112009001994T5 - Pflanzen mit erhöhtem Ertrag durch Erhöhen oder Erzeugen einer oder mehrerer Aktivitäten in einer Pflanze oder einem Teil davon

Info

Publication number: DE112009001994T5
Application number: DE112009001994T
Authority: DE
Inventors: Oliver Dr. Bläsing; Dr. Thimm Oliver; Dr. Puzio Piotr
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2008-08-19
Filing date: 2009-08-19
Publication date: 2012-01-19
Also published as: CN102186974B; WO2010020654A3; BRPI0917855A2; MX2011001899A; CN103923892A; CN102186974A; AR074177A1; AU2009284172A1; WO2010020654A2; AU2009284172A2; CA2734347A1; US20110154530A1; EP2352822A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein eine Pflanze mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischen Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle vom Wildtyp durch Erhöhen oder Erzeugen einer oder mehrerer Aktivitäten von mit Ertrag in Zusammenhang stehenden Proteinen (Yield-Related Proteins, YRP) und/oder mit Ertrag und Stress in Zusammenhang stehenden Proteinen (Yield and Stress-Related Proteins, YSRP) in Pflanzen.

Description

Die vorliegende, hier offenbarte Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag verglichen mit einer entsprechenden Pflanze vom Wildtyp bereit, bei dem man eine oder mehrere Aktivitäten in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Nukleinsäuren, die eines oder mehrere Merkmale einer transgenen Pflanze verstärken oder verbessern, und Zellen, Nachkommen, Samen und Pollen, die sich von diesen Pflanzen oder Teilen ableiten, sowie Herstellungsverfahren und Verfahren zur Anwendung solcher Pflanzenzellen bzw. Pflanzen, Nachkommen, Samen oder Pollen. Dieses verbesserte Merkmal/diese verbesserten Merkmale zeigt/zeigen sich insbesondere in einem erhöhten Ertrag, vorzugsweise durch die Verbesserung eines oder mehrerer Ertragsmerkmale.
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein eine Pflanze mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle vom Wildtyp durch Erhöhen oder Erzeugen einer oder mehrerer Aktivitäten von mit Ertrag und Stress in Zusammenhang stehenden Proteinen (Yield and Stress-Related Proteins, YSRP) in Pflanzen.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Pflanzen, die so beschaffen sind, dass sie unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress und/oder Nährstoffmangel wachsen.
Die Erfindung betrifft außerdem Verfahren zur Herstellung und zum Screening auf und zum Züchten solcher Pflanzenzellen oder Pflanzen.
Das Ansteigen der Bevölkerung und der Klimawandel haben in den jüngsten Jahren die Möglichkeit einer weltweiten Nahrungsmittel-, Futter- und Treibstoffknappheit deutlich vor Augen geführt. Unter Freilandbedingungen hängt die Leistung von Pflanzen zum Beispiel hinsichtlich Wachstum, Entwicklung, Aufbau von Biomasse und Samenbildung von der Fähigkeit der Pflanze, zahlreiche Umweltbedingungen, -veränderungen und -stressfaktoren zu tolerieren bzw. sich daran anzupassen, ab. Seit Anbeginn der Landwirtschaft und des Gartenbaus besteht ein Bedarf, bei der Kultivierung von Pflanzen Pflanzenmerkmale zu verbessern. Durch Zuchtstrategien werden die Kulturpflanzeneigenschaften zum Widerstehen gegen biotische und abiotische Stressfaktoren, zur Verbesserung der Effizienz der Nährstoffausnutzung und zur Veränderung anderer den Pflanzen eigener kulturpflanzenspezifischer Ertragsparameter gefördert, d. h. die Erhöhung des Ertrags durch die Anwendung von technischen Fortschritten. Pflanzen sind sesshafte Organismen und müssen infolgedessen dazu fähig sein, mit verschiedenen Umweltstressfaktoren zu leben. Biotische Stressfaktoren wie Pflanzenschädlinge und Pathogene einerseits und abiotische Umweltstressfaktoren andererseits sind bedeutende limitierende Faktoren des Wachstums und der Produktivität von Pflanzen, die so der Kultivierung und der geographischen Verteilung von Pflanzen Grenzen setzen. Den verschiedenen Stressfaktoren ausgesetzte Pflanzen haben typischerweise geringe Erträge an Pflanzenmaterial wie Samen, Früchten oder anderen Produkten. Durch abiotische und biotische Stressfaktoren bewirkte Verluste an Kulturpflanzen und Kulturpflanzenertragsverluste stellen einen wichtigen ökonomischen und politischen Faktor dar und tragen insbesondere in vielen unterentwickelten Ländern zu Nahrungsmittelknappheit bei.
Pflanzen sind während ihres Lebenszyklus auch Hitze-, Kälte- und Salzstress ausgesetzt. Die Schutzstrategien sind ähnlich denen bei der Trockenresistenz. Da ein hoher Salzgehalt in einigen Böden zu weniger für die Aufnahme in die Zelle verfügbarem Wasser führt, sind die Auswirkungen ähnlich denen, die man bei Dürrebedingungen beobachtet. Auch bei Frosttemperaturen verlieren Pflanzenzellen aufgrund der Eisbildung, die im Apoplast einsetzt und dem Symplast Wasser entzieht, Wasser (McKersie und Leshem, 1994. Stress and Stress Coping in Cultivated Plants, Kluwer Academic Publishers). Auch physiologisch stehen diese Stressfaktoren in Zusammenhang miteinander, und sie können ähnliche Zellschäden induzieren. So treten zum Beispiel Dürre- und Salzstress hauptsächlich als osmotischer Stress in Erscheinung, was eine Störung der Homöostase und der Ionenverteilung in der Zelle zur Folge hat (Serrano et al., 1999; Zhu, 2001a; Wang et al., 2003). Oxidativer Stress, der häufig Stress durch hohe Temperaturen, Versalzungsstress oder Dürrestress begleitet, kann eine Denaturierung von funktionellen Proteinen oder Strukturproteinen bewirken (Smirnoff, 1998). Infolgedessen aktivieren diese abiotischen Stressfaktoren häufig ähnliche Signalpfade (Shinozaki und Ymaguchi-Shinozaki, 2000; Knight und Knight, 2001; Zhu 2001b, 2002) und zelluläre Reaktionen, z. B. die Produktion bestimmter Stressproteine, Antioxidantien und kompatibler gelöster Stoffe (Vierling und Kimpel, 1992; Zhu et al., 1997; Cushman und Bohnert, 2000).
Dürre-, Hitze-, Kälte- und Salzstress haben eine gemeinsame, für das Pflanzenwachstum wichtige Komponente – die Verfügbarkeit von Wasser. Pflanzen sind während ihres Lebenszyklus typischerweise Bedingungen mit einer verminderten Verfügbarkeit von Wasser in der Umwelt ausgesetzt. Die meisten Pflanzen haben Strategien entwickelt, um sich gegen diese Wassermangel- bzw. Trockenheitsbedingungen zu schützen. Sind jedoch Ausmaß und Dauer der Dürrebedingungen zu groß bzw. lang, so sind bei den meisten Kulturpflanzen die Auswirkungen auf Entwicklung, Wachstum und Ertrag der Pflanzen tiefgreifend. Von solchen Bedingungen ist in der Zukunft aufgrund des Klimawandels auszugehen. Nach einem anerkannten Szenario der Klimaveränderung wird nicht nur das Wetter wechselhafter werden, sondern auch die Durchschnittstemperaturen höher und die durchschnittlichen Niederschläge geringer ausfallen als in der Vergangenheit. Den meisten Pflanzen wird es nicht möglich sein, ihre Schutzstrategien fortwährend an den Klimawandel anzupassen. Sind die Pflanzen einer anhaltenden Dürre ausgesetzt, so kommt es zu einschneidenden Veränderungen bei ihrem Stoffwechsel. Diese großen metabolischen Veränderungen führen letztlich zum Absterben von Zellen und als Folge davon zu Ertragsverlusten.
Die Agrarbiotechnologie hat versucht, dem steigenden Bedarf der Menschheit durch genetische Modifikationen von Pflanzen gerecht zu werden, die zum Beispiel durch Vermitteln einer besseren Toleranz gegenüber abiotischen Stressreaktionen oder durch Erhöhen der Biomasse den Kulturpflanzenertrag steigern könnten. Der Kulturpflanzenertrag wird im vorliegenden Zusammenhang als diejenige Anzahl Bushel des entsprechenden Agrarprodukts (wie Korn, Futter oder Samen), die pro Acre geerntet wird, definiert. Der Kulturpflanzenertrag wird von abiotischen Stressfaktoren wie Trocken-, Hitze-, Salinitäts- und Kältestress und von der Größe (Biomasse) der Pflanze beeinflusst. Traditionelle Pflanzenzüchtungsstrategien sind relativ langsam und sind bei der Vermittlung einer erhöhten Toleranz gegenüber abiotischen Stressfaktoren im Allgemeinen nicht erfolgreich gewesen. Beim Mais haben die durch die traditionelle Züchtung erzielten Kornertragsverbesserungen beinahe ein Plateau erreicht. Der Harvest Index, d. h. das Verhältnis des Biomasseertrags zu der gesamten kumulativen Biomasse zum Erntezeitpunkt, ist beim Mais während der selektiven Züchtung auf Kornertrag über die letzten hundert Jahre im Wesentlichen unverändert geblieben. Dementsprechend sind die jüngsten Ertragsverbesserungen, die beim Mais erzielt wurden, das Ergebnis einer erhöhten Gesamtbiomasseproduktion pro Kulturflächeneinheit. Diese erhöhte Gesamtbiomasse wurde durch eine erhöhte Saatstärke erzielt, die zu adaptiven phänotypischen Veränderungen, wie Reduktion des Blattwinkels, was die Beschattung der unteren Blätter reduzieren kann, und Farnengröße, was den Harvest Index erhöhen kann, geführt hat.
Die Agrarbiotechnologen bedienen sich auch Messungen von anderen Parameter, die den möglichen Einfluss eines Transgens auf den Kulturpflanzenertrag angeben. Für Futterkulturen wie Luzerne, Silomais und Heu korreliert die pflanzliche Biomasse mit dem Gesamtertrag. Bei Kornfrüchten jedoch hat man zum Abschätzen des Ertrags andere Parameter verwendet, wie die Pflanzengröße gemessen als Gesamtpflanzentrockengewicht, oberirdisches Trockengewicht, oberirdisches Frischgewicht, Blattfläche, Stängelvolumen, Pflanzenhöhe, Rosettendurchmesser, Blattlänge, Wurzellänge, Wurzelmasse, Anzahl der Bestockungstriebe und Anzahl der Blätter. Die Pflanzengröße zu einem frühen Entwicklungsstadium wird typischerweise mit der Pflanzengröße später während der Entwicklung korrelieren. Eine größere Pflanze mit einer größeren Blattfläche kann typischerweise mehr Licht und Kohlendioxid als eine kleinere Pflanze absorbieren und wird daher wahrscheinlich während desselben Zeitraums gewichtsmäßig mehr zunehmen. Bei der Pflanzengröße und der Wachstumsrate besteht eine starke genetische Komponente, und die Pflanzengröße unter einer Umweltbedingung wird für verschiedene Genotypen vermutlich mit der Größe unter einer anderen Umweltbedingung korrelieren. So verwendet man eine Standardumwelt, um die verschiedenen und dynamischen Umwelten, die von den Kulturpflanzen im Feld an unterschiedlichen Orten und zu unterschiedlichen Zeitpunkten angetroffen werden, nachzuahmen.
Momentan sind viele genetische und biotechologische Ansätze bekannt, mit denen sich Pflanzen erhalten lassen, die unter Bedingungen von abiotischem Stress wachsen.
Diese Ansätze beruhen im Allgemeinen auf der Einführung und Expression von für verschiedene Enzyme kodierenden Genen in Pflanzenzellen, wie beispielsweise in WO 2004011888 , WO 2006032708 , US 20050097640 , US 20060037108 , US20050108791 , Serrano et al. (1999; Scientia Horticulturae 78: 261–269) und vielen anderen Publikationen offenbart.
Die Expression von Genen aus der Glutaredoxin- und Thioredoxin-Familie verleiht erhöhte Toleranz gegen Umweltstress, insbesondere gegen Versalzung oder Kälte ( EP1 529 112 A ). Diese Pflanzen hatten höhere Samenerträge, Photosynthese und Trockenmasseproduktion als empfindliche Pflanzen. Über die Entwicklung dieser Pflanzen unter Bedingungen von Nährstoffarmut ist nichts bekannt.
Häufig zeigen die transformierten und stressresistenten Pflanzen ein langsameres Wachstum und eine verminderte Biomasse aufgrund eines Ungleichgewichts bei der Entwicklung und Physiologie der Pflanze, was somit beträchtlichen Fitnesskosten entspricht (Kasuga et al., 1999, Danby und Gehring et al., 2005). Dies hat ernste Verluste an Biomasse und Ertrag zur Folge. Manchmal nimmt das Trockengewichtsverhältnis von Wurzel/Spross zu, wenn es zu Pflanzenwasserstress kommt. Die Zunahme ist zum größten Teil auf eine relative Abnahme des Trockengewichts des Sprosses zurückzuführen. Das Verhältnis von Samenertrag zum Trockengewicht der oberirdischen Teile der Pflanze ist unter vielen Umweltbedingungen relativ stabil, und es lässt sich somit oft eine robuste Korrelation zwischen der Größe der Pflanze und dem Kornertrag erzielen. Diese Prozesse sind intrinsisch miteinander verbunden, da der Großteil der Kornbiomasse von der gegenwärtig gespeicherten photosynthetischen Produktivität durch die Blätter und den Stängel der Pflanze abhängt. Eine Selektion nach Pflanzengröße selbst in frühen Entwicklungsstadien wurde daher als Indikator für das zukünftige Potential herangezogen.
In einigen Fällen ( US20060037108 ) wurde nach einer Dürrebehandlung durch 6- bis 8-tägigen Wasserentzug eine erhöhte Biomasse, hauptsächlich eine größere Biomasse des Sprosses, beobachtet.
Wenn das Bodenwasser erschöpft ist oder wenn Wasser während Dürreperioden nicht zur Verfügung steht, sind die Kulturpflanzenerträge begrenzt. Man kann „Dürre” als eine Reihe von Umweltbedingungen definieren, unter denen eine Pflanze beginnt, an den Auswirkungen von Wassermangel zu leiden, wie verminderte Stomataleitfähigkeit und Photosynthese, verminderte Wachstumsrate, Nachlassen des Turgors (Welken) oder Abbruch der Embryonalentwicklung. Aus diesen Gründen zeigen Pflanzen, die Dürrestress ausgesetzt sind, typischerweise eine signifikante Abnahme an Biomasse und Ertrag. Wassermangel kann auf unzureichende Niederschläge oder eingeschränkte Bewässerung zurückzuführen sein. Alternativ dazu kann Wassermangel auch durch hohe Temperaturen, niedrige Feuchtigkeit, Böden mit hohem Salzgehalt, Frost oder wassergesättigte Böden, die die Wurzeln schädigen und die Aufnahme von Wasser in den Trieb einschränken, verursacht werden.
Agrarbiotechnologen haben versucht, transgene Pflanzen zu entwickeln, die einen erhöhten Ertrag zeigen, entweder durch eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Stress oder durch eine erhöhte Biomasseproduktion.
Unter Feldbedingungen sind Pflanzen jedoch während ihres Lebenszyklus typischerweise mehreren Perioden einer reduzierten Verfügbarkeit von Wasser aus der Umwelt ausgesetzt. Eine Erhöhung der Toleranz gegenüber abiotischem Stress oder der Biomasse befriedigt diese Ansprüche nicht effektiv.
Einige Gene, die an Stressreaktionen, Wassernutzung und/oder Biomasse in Pflanzen beteiligt sind, wurden bereits charakterisiert, bislang war der Erfolg bei der Entwicklung von transgenen Kulturpflanzen mit einem verbesserten Ertrag jedoch begrenzt, und keine dieser Pflanzen wird kommerziell genutzt.
Es besteht somit ein Bedarf, Gene zu identifizieren, die Resistenz gegenüber verschiedenen Kombinationen an Stressfaktoren verleihen oder die Arten verbesserten Ertrag unter optimalen und/oder suboptimalen Wachstumsbedingungen verleihen. Es besteht daher ein Bedarf, zusätzliche Gene zu identifizieren, die dazu fähig sind, den Ertrag von Kulturpflanzen zu erhöhen.
Es besteht ein Bedarf, Gene zu identifizieren, die über die Fähigkeit verfügen, bei einer Expression in Pflanzen ihren Wirtspflanzen und anderen Pflanzenarten eine erhöhte Resistenz gegenüber vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress zu verleihen, und zusätzlich die erforderliche Erholungszeit nach der Stressperiode zu verkürzen und den Ertrag über den Lebenszyklus zu erhöhen, insbesondere bei der abschließenden Ernte.
Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung somit ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, verglichen mit einer entsprechenden Pflanze vom Wildtyp, bereit, welches wenigstens den folgenden Schritt umfasst: Erhöhen oder Erzeugen einer oder mehrerer Aktivitäten in einer Pflanze (im Folgenden als eine oder mehrere „Aktivitäten” oder eine oder mehrere „dieser Aktivitäten” oder bei einer ausgewählten Aktivität als „diese Aktivität” bezeichnet) ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Phosphoenolpyruvatcarboxylkinase, Arginin/Alanin-Aminopeptidase, D-Alanyl-D-alanincarboxypeptidase, Diacylglycerolpyrophosphatphosphatase, Dityrosintransporter, Farnesyldiphosphatfarnesyltransferase, NAD+-abhängiger Betainaldehyddehydrogenase, Serinhydrolase, dem an der Übertragung von Ketoconazolresistenz beteiligten transkriptionellen Regulator, Uridinkinase, dem yal043c-a-Protein, dem ybr071w-Protein und dem ydr445c-Protein in einer Zelle, im Zytoplasma oder in einem hier angeführten subzellulären Kompartiment oder einer Organelle oder einem Gewebe, z. B. wie in Tabelle I gezeigt.
Gemäß einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanzenzelle mit diesen Merkmalen bereit, indem man das „Yield and Stress Related Protein” YSRP verfügbar macht.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die ein in Tabelle I aufgeführtes isoliertes Polynukleotid in einer Zeile, dem Zytoplasma oder einem hier angeführten subzellulären Kompartiment oder einer Organelle oder einem Gewebe überexprimiert. Die erfindungsgemäße transgene Pflanze zeigt einen verbesserten Ertrag oder einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer Wildtypsorte der Pflanze. Die Begriffe „verbesserter Ertrag” und „erhöhter Ertrag” können austauschbar verwendet werden.
Der Begriff „Ertrag” bezieht sich, so wie er hier verwendet wird, allgemein auf ein messbares Produkt von einer Pflanze, insbesondere einer Kulturpflanze. Ertrag und Ertragszunahme (im Vergleich zu einer nicht transformierten Ausgangspflanze bzw. einer Pflanze vom Wildtyp) lässt sich auf eine Reihe von Arten messen, und es versteht sich, dass es einem Fachmann möglich ist, angesichts der jeweiligen Ausführungsformen, der jeweils betroffenen Kulturpflanze und dem speziellen betreffenden Zweck bzw. der betreffenden Anwendung die korrekte Bedeutung zu bestimmen.
Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Begriff „verbesserter Ertrag” oder der Begriff „erhöhter Ertrag” jegliche Ertragsverbesserung von jeglichem vermessenen Pflanzenprodukt wie Korn, Frucht oder Faser. Erfindungsgemäß können Veränderungen bei unterschiedlichen phänotypischen Merkmalen den Ertrag verbessern. So sind zum Beispiel, jedoch ohne Einschränkung, Parameter wie Blütenorganentwicklung, Wurzelinitiation, Wurzelbiomasse, Anzahl der Samen, Samengewicht, Harvest Index, Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, Blattbildung, Phototropismus, Apikaldominanz und Fruchtentwicklung geeignete Maße für einen verbesserten Ertrag. Jegliche Ertragserhöhung ist erfindungsgemäß ein verbesserter Ertrag. So kann zum Beispiel die Ertragsverbesserung einen Anstieg von 0,1%, 0,5%, 1%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% oder mehr bei jeglichem gemessenen Parameter umfassen. Zum Beispiel ist eine Erhöhung des Sojabohnen- oder Maisertrags in Bushel/Acre, der von einer Kultur abstammt, welche Pflanzen umfasst, die für die Nukleotide und Polypeptide von Tabelle I bzw. 11 transgen sind, im Vergleich zu dem Ertrag in Bushel/Acre von unbehandelten Sojabohnen oder unbehandeltem Mais, die/der unter denselben Bedingungen herangezogen wurde(n), erfindungsgemäß ein verbesserter Ertrag. Der erhöhte oder verbesserte Ertrag kann in Gegenwart oder Abwesenheit von Stressbedingungen erzielt werden.
Gesteigerter oder erhöhter „Ertrag” bezieht sich zum Beispiel auf einen oder mehrere Ertragsparameter, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Biomasseertrag, Ertrag an Trockenbiomasse, Ertrag an oberirdischer Trockenbiomasse, Ertrag an unterirdischer Trockenbiomasse, Ertrag an Frischgewichtbiomasse, Ertrag an oberirdischer Frischgewichtbiomasse, Ertrag an unterirdischer Frischgewichtbiomasse, gesteigertem Ertrag an Erntegut, entweder Trockengewicht oder Frischgewicht oder beides, entweder oberirdisch oder unterirdisch oder beides, gesteigertem Ertrag an Kulturpflanzenfrüchten, entweder Trockengewicht oder Fischgewicht oder beides, entweder oberirdisch oder unterirdisch oder beides, und vorzugsweise gesteigertem Ertrag an Samen, entweder Trockengewicht oder Frischgewicht oder beides, entweder oberirdisch oder unterirdisch oder beides.
So stellt die vorliegende Erfindung zum Beispiel Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzenzellen oder Pflanzen bereit, die ein erhöhtes Ertragsmerkmal zeigen können, z. B. eine erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder eine erhöhte der Pflanze eigene Biomasseproduktion verglichen mit einer entsprechenden (z. B. nicht transformierten) Pflanze vom Wildtyp oder Ausgangspflanze, bei dem man eine oder mehrere der oben erwähnten Aktivitäten erhöht oder erzeugt.
Dieser erhöhte Ertrag gemäß der vorliegenden Erfindung lässt sich typischerweise erzielen, indem man ein oder mehrere Ertragsmerkmale einer Pflanze im Vergleich zu einer nicht transformierten Ausgangspflanze oder Pflanze vom Wildtyp steigert oder verbessert. Zu diesen Ertragsmerkmalen einer Pflanze, deren Verbesserung zu einem erhöhten Ertrag führt, zählen, ohne dass dies eine Einschränkung bedeuten soll, die Erhöhung der intrinsischen Ertragskapazität einer Pflanze, eine verbesserte Effizienz der Nährstoffausnutzung und/oder eine verbesserte Stresstoleranz.
Die Häufigkeit von Wassermangel während des Lebenszyklus einer Pflanze variiert je nach Klima. Dieses lässt sich in „Mega-Environments” unterteilen, die von CIMMYT bei der Durchführung ihrer Zuchtprogramme mit Weizen und Mais verwendet werden.
Ein Mega-Environment ist eine große, nicht notwendigerweise zusammenhängende geographische Region mit ähnlichen biotischen und abiotischen Stressfaktoren und Anforderungen an das Anbausystem. Ein Mega-Environment ist vielmehr durch Kulturpflanzenproduktionsfaktoren (Temperatur, Niederschlag, Sonnenlicht, geographische Breite, Höhenlage, Bodencharakteristika und Krankheiten), Präferenzen der Konsumenten (die Farbe des Korns und dessen vorgesehene Verwendung) und die Weizenwuchsform definiert. Die Forscher haben sechs Mega-Environments für Frühlingsweizen und jeweils drei für Wechselweizen und Winterweizen identifiziert. Solche Mega-Environments kann man für alle Pflanzenarten einschließlich Kulturpflanzen definieren.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine transgene Pflanzenzelle, eine Pflanze oder einen Teil davon mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel einer gesteigerten Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Toleranz gegenüber Dürre und/oder niedrigen Temperaturen und/oder einer erhöhten Effizienz der Nährstoffausnutzung, einem erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder einem anderen erwähnten Ertragsmerkmal, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon bei einem Anbau in Mega-Environments mit geringen Niederschlägen wie zum Beispiel den Weizen-Mega-Environments ME1, ME4, ME4A, ME4B, ME4C, ME5, ME5B, ME6, ME6B, ME9, ME12 oder dem entsprechenden Mega-Environment für die betreffende Pflanzenart bereitzustellen.
Bei einem Vergleich des Ertrags von Pflanzen der gleichen Art in Korrelation mit den Umweltbedingungen ist der Parameter des Ertragspotentials von Bedeutung. Ertragspotential ist definiert als der Ertrag einer Pflanze bei einer Kultivierung in einer Umwelt, an die sie angepasst ist, wobei Nährstoffe und Wasser uneingeschränkt zur Verfügung stehen und Schädlinge, Krankheiten, Unkräuter, Lagern und andere Stressfaktoren wirksam bekämpft werden. „Ertrag” bezieht sich auf die Masse des Produkts bei der letztendlichen Ernte.
Unter Feldbedingungen wird das Ertragspotential nicht erreicht. Nichtsdestotrotz handelt es sich hierbei um einen Parameter, der die optimalen Kultivierungsbedingungen in einem Mega-Environment definiert, da das Ertragspotential nur unter optimalen Bedingungen erreicht wird.
Es besteht immer noch ein Bedarf zur Identifizierung von Genen, die für Polypeptide mit einer Aktivität kodieren, die, wenn sie erzeugt oder erhöht wird, einen erhöhten Ertrag verleiht, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, speziell um einen erhöhten Ertrag vorzugsweise unter suboptimalen Wachstumsbedingungen, vorzugsweise unter Bedingungen eines Wassermangels zu verleihen. Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Verfahren zur Verleihung von Stresstoleranz und/oder -resistent in Pflanzen oder Pflanzenzellen zu identifizieren.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Pflanzen, die wasserstressresistent sind und zusätzlich unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, vorzugsweise zyklischer Dürre, eine gleichbleibende, vorzugsweise eine erhöhte, Biomasseproduktion zeigen.
Es besteht weiterhin ein Bedarf, Gene zu identifizieren, die, wenn sie in stresstoleranten Pflanzen exprimiert werden, dazu fähig sind, einen erhöhten Ertrag zu verleihen, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder niedrigen Temperaturen und/oder eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein erhöhtes anderes erwähntes Ertragsmerkmal, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, speziell unter allen suboptimalen Wachstumsbedingungen, die nicht den Bedingungen entsprechen, bei denen sich das Ertragspotential erzielen lässt.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung gemäß einer Ausführungsform ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanzenzelle mit einem erhöhten Ertrag, z. B. einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel einer gesteigerten Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Toleranz gegenüber Dürre und/oder niedrigen Temperaturen und/oder einer erhöhten Effizienz der Nährstoffausnutzung, einem erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder einem erhöhten anderen erwähnten Ertragsmerkmal, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle vom Wildtyp, durch Erhöhen oder Erzeugen einer oder mehrerer Aktivitäten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Phosphoenolpyruvatcarboxylkinase, Arginin/Alanin-Aminopeptidase, D-Alanyl-D-alanincarboxypeptidase, Diacylglycerolpyrophosphatphosphatase, Dityrosintransporter, Farnesyldiphosphatfarnesyltransferase, NAD+-abhängiger Betainaldehyddehydrogenase, Serinhydrolase, dem an der Übertragung von Ketoconazolresistenz beteiligten transkriptionellen Regulator, Uridinkinase, dem yal043c-a-Protein, dem ybr071w-Protein und dem ydr445c-Protein bereit.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung werden die Proteine mit einer Aktivität ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Phosphoenolpyruvatcarboxylkinase, Arginin/Alanin-Aminopeptidase, D-Alanyl-D-alanincarboxypeptidase, Diacylglycerolpyrophosphatphosphatase, Dityrosintransporter, Farnesyldiphosphatfarnesyltransferase, NAD+-abhängiger Betainaldehyddehydrogenase, Serinhydrolase, dem an der Übertragung von Ketoconazolresistenz beteiligten transkriptionellen Regulator, Uridinkinase, dem yal043c-a-Protein, dem ybr071w-Protein und dem ydr445c-Protein und die in Tabelle II, Spalten 5 und 7 gezeigten Polypeptide als „Yield Related Protein” YRP oder „Yield and Stress Related Protein” YSRP bezeichnet.
Gemäß einer Ausführungsform bezieht sich der Begriff „erhöhter Ertrag” auf eine erhöhte Biomasse.
Gemäß einer Ausführungsform bezieht sich der Begriff „erhöhter Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress” auf einen erhöhten Ertrag und eine erhöhte Resistenz gegenüber Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, z. B. einer erhöhten Toleranz gegenüber vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Pflanzenertrag erhöht, indem man ein oder mehrere Ertragsmerkmale ausgewählt aus einer oder mehreren Toleranzen gegenüber abiotischem Stress erhöht.
Allgemein kann der Begriff „erhöhte Toleranz gegenüber Stress” als das Überleben von Pflanzen und/oder eine höhere Ertragsproduktion unter Stressbedingungen verglichen mit einer nicht transformierten Pflanze vom Wildtyp oder Ausgangspflanze definiert werden.
Für die Zwecke der Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden die Begriffe „gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress”, „gesteigerte Resistenz gegenüber abiotischem Umweltstress”, „gesteigerte Toleranz gegenüber Umweltstress”, „verbesserte Anpassung an Umweltstress” und andere Variationen und Ausdrücke mit ähnlicher Bedeutung austauschbar verwendet und beziehen sich ohne Einschränkung auf eine Verbesserung der Toleranz gegenüber einem oder mehreren wie hier beschriebenen abiotischen Umweltstressfaktoren, vorzugsweise vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, jeweils verglichen mit einer entsprechenden (nicht transformierten) Pflanze vom Wildtyp (bzw. Ausgangspflanze).
So, wie er hier verwendet wird, bezieht sich der Begriff „abiotischer Stress” auf alle suboptimalen Wachstumsbedingungen und schließt mit Dürre, Kälte oder Salinität assoziierte suboptimale Bedingungen ein, ist jedoch nicht darauf beschränkt. Bei bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich bei dem abiotischen Stress um Dürre und niedrigen Wassergehalt, wobei mit Dürrestress alle Umweltstressfaktoren gemeint sind, die einen Mangel an Wasser in Pflanzen oder eine verminderte Wasserversorgung von Pflanzen zur Folge haben. Weiterhin ist dieser Stress vorübergehend und tritt wiederholt auf.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung bezieht sich der Begriff „erhöhter Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress” auf eine erhöhte Resistenz gegenüber Wasserstress, der als Sekundärstress durch Kälte und/oder Salz hervorgerufen wird, und/oder natürlich als Primärstress während einer Dürre.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung bezieht sich der Begriff „erhöhter Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress” auf einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von Wasserstress, der als Sekundärstress durch Kälte und/oder Salz hervorgerufen wird, und/oder natürlich als Primärstress während einer Dürre.
So, wie er hier verwendet wird, bezieht sich der Begriff „suboptimale Wachstumsbedingungen” auch auf eine eingeschränkte Verfügbarkeit von Nährstoffen und ein suboptimales Vorhandensein.
Gemäß einer Ausführungsform handelt es sich bei einer eingeschränkten Verfügbarkeit von Nährstoffen um Dürre und niedrigen Wassergehalt.
Gemäß einer Ausführungsform handelt es sich bei einer eingeschränkten Verfügbarkeit von Nährstoffen um ein suboptimales Vorhandensein von aus der aus Phosphor, Kalium und Stickstoff bestehenden Gruppe ausgewählten Nährstoffen.
Gemäß einer Ausführungsform handelt es sich bei einer eingeschränkten Verfügbarkeit von Nährstoffen um ein suboptimales Vorhandensein von Stickstoff.
Gemäß einer Ausführungsform wird die Biomasse der transgenen Pflanzen der Erfindung durch das Ertragsmerkmal einer gesteigerten Effizienz der Nährstoffausnutzung erhöht. Eine Verbesserung oder Erhöhung der Effizienz der Nährstoffausnutzung einer Pflanze kann sich in einer Verbesserung der allgemeinen Effizienz der Nährstoffassimilation einer Pflanze (z. B. in einer Verbesserung der allgemeinen Nährstoffaufnahme und/oder des allgemeinen Nährstofftransports, der Verbesserung der allgemeinen Transportmechanismen einer Pflanze, Verbesserungen bei den Assimilierungspfaden und dergleichen), und/oder in einer Verbesserung der spezifischen Effizienz der Nährstoffausnutzung von Nährstoffen einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Phosphor, Kalium und Stickstoff manifestieren.
Die Erhöhung des Ertrags der Pflanze kann somit auch vermittelt werden, indem man die „Effizienz der Nährstoffausnutzung einer Pflanze” erhöht, z. B. indem man die Nutzungseffizienz von Nährstoffen einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Phosphor, Kalium und Stickstoff, verbessert. Es besteht zum Beispiel ein Bedarf an Pflanzen, die dazu fähig sind, Stickstoff effizienter zu nutzen, so dass für das Wachstum weniger Stickstoff benötigt wird, was somit zu einem verbesserten Ertragsniveau unter Stickstoffmangelbedingungen führt. Weiterhin lassen sich mit den gegenwärtigen bzw. standardgemäßen Niveaus an Stickstoffaufwand höhere Erträge erzielen. Dementsprechend wird der Pflanzenertrag erhöht, indem man die Effizienz der Stickstoffausnutzung (Nitrogen Use Efficiency, NUE) einer Pflanze oder eines Teils davon erhöht. Aufgrund der hohen Stickstoffdüngerkosten im Verhältnis zu den Einkommen aus Agrarprodukten und darüber hinaus seiner abträglichen Wirkung auf die Umwelt ist es wünschenswert, Strategien zu entwickeln, um den Stickstoffaufwand zu reduzieren und/oder die Stickstoffaufnahme und/oder die Verwertung des zur Verfügung stehenden Stickstoffs zu optimieren und gleichzeitig einen optimalen Ertrag, eine optimale Produktivität und eine optimale Qualität von Pflanzen, vorzugsweise kultivierten Pflanzen, z. B. Kulturpflanzen, zu bewahren. Ebenfalls wünschenswert ist es, den gleichen Kulturpflanzenertrag mit einem geringeren Düngemitteleinsatz und/oder einen höheren Ertrag auf Böden mit ähnlicher oder sogar schlechterer Qualität zu erzielen.
Gemäß einer Ausführungsform wird die Stickstoffnutzungseffizienz nach dem hierin beschriebenen Verfahren bestimmt. Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung gemäß einer Ausführungsform ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags, welches die folgenden Schritte umfasst:

(a) Messen des Stickstoffgehalts im Boden und
(b) Bestimmen, ob der Stickstoffgehalt im Boden für das Wachstum einer ursprünglichen Pflanze oder einer Wildtyppflanze, z. B. einer Kulturpflanze, optimal oder suboptimal ist, und
(c1) wenn der Stickstoffgehalt für das Wachstum der ursprünglichen Pflanze oder der Wildtyppflanze suboptimal ist, Heranziehen der erfindungsgemäßen Pflanze in diesem Boden, oder
(c2) wenn der Stickstoffgehalt für die ursprüngliche Pflanze oder die Wildtyppflanze optimal ist, Heranziehen der erfindungsgemäßen Pflanze in dem Boden und Vergleichen des Ertrags mit dem Ertrag eines Standards, einer ursprünglichen Pflanze oder einer Wildtyppflanze, Selektieren und Heranziehen der Pflanze, die einen höheren oder den höchsten Ertrag aufweist.

Die Pflanzennahrung ist wesentlich für das Wachstum und die Entwicklung von Pflanzen und daher auch für die Quantität und Qualität von Pflanzenprodukten. Aufgrund des starken Einflusses der Nährstoffaufnahme sowie der Nährstoffausnutzung auf den Pflanzenertrag und die Produktqualität werden gewaltige Mengen an Düngemitteln in den Boden eingebracht, um Pflanzenwachstum und -qualität zu optimieren.
In der vorliegenden Erfindung lässt sich die gesteigerte Toleranz gegenüber einer eingeschränkten Verfügbarkeit zum Beispiel und bevorzugt nach der folgenden Methode bestimmen:
Um einen hohen Durchsatz zu erzielen, werden Pflanzen auf Agarplatten mit einem begrenzten Stickstoffvorrat (adaptiert von Estelle und Somerville, 1987) auf Biomasseproduktion gescreent. Diese Screening-Pipeline umfasst zwei Ebenen. Transgene Linien werden auf einer nächsten Ebene getestet, wenn die Produktion von Biomasse im Vergleich zu Pflanzen vom Wildtyp signifikant verbessert ist. Bei jeder Ebene wird die Anzahl an Wiederholungstests und die statistische Stringenz erhöht.
Beim Aussäen werden die Samen, die im Kühlschrank (bei –20°C) aufbewahrt werden, mit Hilfe eines Zahnstochers aus den Eppendorf-Röhrchen entnommen und auf die obenerwähnten Agarplatten mit begrenztem Stickstoffvorrat (0,05 mM KNO₃) gegeben. Nach dem Säen der Samen werden die Platten 2–4 Tage lang im Dunkeln bei 4°C stratifiziert. Nach dem Stratifizieren werden die Testpflanzen 22 bis 25 Tage lang bei einem 16-h-Licht, 8-h-Dunkelheit-Rhythmus bei 20°C, einer Luftfeuchtigkeit von 60% und einer CO₂-Konzentration von ungefähr 400 ppm herangezogen. Die verwendeten Lichtquellen erzeugen ein Licht, das dem Farbspektrum der Sonne ähnelt, mit einer Lichtintensität von ungefähr 100 μE/m²s. Nach 10 bis 11 Tagen werden die Pflanzen vereinzelt. Ein verbessertes Wachstum unter Stickstoffmangelbedingungen wird nach 20–25 Tagen Wachstum anhand der Biomasseproduktion von Sprossen und Wurzeln der transgenen Pflanzen im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollpflanzen bewertet.

Transgene Linien, die eine signifikant verbesserte Biomasseproduktion im Vergleich zu Pflanzen vom Wildtyp zeigen, werden auf der nächsten Stufe dem folgenden Experiment unterzogen:
Im Fall von Arabidopsis thaliana werden Samen in Töpfe ausgesät, die eine 1:1 (v:v) Mischung von nährstoffarmem Boden (”Einheitserde Typ 0”, 30% Lehm, Tantau, Wansdorf, Deutschland) und Sand enthalten. Die Keimung wird durch eine 4-tägige Dunkelperiode bei 4°C induziert. Anschließend werden die Pflanzen unter Standardwachstumsbedingungen (Photoperiode mit 16 h Licht und 8 h Dunkelheit, 20°C, 60% relative Feuchtigkeit und eine Photonenflussdichte von 200 μE beziehungsweise ungefähr 170 μE) herangezogen. Die Pflanzen werden herangezogen und kultiviert, unter anderem werden sie jeden zweiten Tag mit einer stickstoffarmen Nährstofflösung gegossen. Die stickstoffarme Nährstofflösung enthält z. B. neben Wasser

Mineralnährstoff	Endkonzentration
KCl	3,00 mM
MgSO₄ × 7H₂O	0,5 mM
CaCl₂ × 6H₂O	1,5 mM
K₂SO₄	1,5 mM
NaH₂PO₄	1,5 mM
Fe-EDTA	40 μM
H₃BO₃	25 μM
MnSO₄ × H₂O	1 μM
ZnSO₄ × 7H₂O	0,5 μM
Cu₂SO₄ × 5H₂O	0,3 μM
Na₂MoO₄ × 2H₂O	0,05 μM

Nach 9 bis 10 Tagen werden die Pflanzen vereinzelt. Nach einer Gesamtzeit von 28 bis 31 Tagen, vorzugsweise 29 bis 31 Tagen, werden die Pflanzen geerntet und anhand des Frischgewichts der oberirdischen Teile der Pflanzen eingestuft. Die Zunahme an Biomasse wird als Verhältnis des Frischgewichts der oberirdischen Teile der betreffenden transgenen Pflanze und der nicht transgenen Pflanze vom Wildtyp gemessen.
Dementsprechend manifestiert gemäß einer Ausführungsform der Erfindung die transgene Pflanze der Erfindung eine Zunahme der Biomasse verglichen mit einer Kontrolle vom Wildtyp unter der Stressbedingung einer eingeschränkten Verfügbarkeit von Nährstoffen, vorzugsweise Stickstoff.
Gemäß einer anderen Ausführungsform ermöglicht die Erfindung die Durchführung der obigen Verfahren in einer solchen Weise, dass der Ertrag in Abwesenheit von Nährstoffmängeln sowie in Abwesenheit von Stressbedingungen erhöht ist.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung umfasst der Begriff „abiotischer Stress” selbst die Abwesenheit von beträchtlichem abiotischem Stress. In der vorliegenden Erfindung kann die Biomasse zum Beispiel und bevorzugt nach der folgenden Methode bestimmt werden:
Transformierte Pflanzen werden in Töpfen in einer Wachstumskammer (z. B. York, Mannheim, Deutschland) herangezogen. Handelt es sich bei den Pflanzen um Arabidopsis thaliana, so werden die Samen davon in Töpfe eingesät, die eine 3,5:1 (v:v) Mischung an nährstoffreichem Boden (GS90, Tantau, Wansdorf, Deutschland) und gegebenenfalls Quarzsand enthalten.
Die Pflanzen werden unter standardmäßigen Wachstumsbedingungen wachsen gelassen.
Die Methode kann weiterhin die folgenden Schritte umfassen: Töpfe werden mit Erdgemisch befüllt und in Wannen gebracht. Wasser wird den Wannen zugesetzt, damit die Erdmischung eine angemessene Menge an Wasser für die Aussaat-Prozedur aufnehmen kann. Handelt es sich bei den Pflanzen um Arabidopsis thaliana, so werden die Samen für transgene A. thaliana-Pflanzen und ihre nicht transgenen Wildtypkontrollen in Töpfe (6 cm Durchmesser) eingesät. Dann wird die gefüllte Wanne mit einer transparenten Haube abgedeckt und in eine vorgekühlte (4°C–5°C) und abgedunkelte Wachstumskammer überführt. Die Stratifikation wird während eines Zeitraums von 3–4 Tagen im Dunklen bei 4°C–5°C etabliert. Die Keimung der Samen und das Wachstum werden bei einer Wachstumsbedingung von 20°C, 60% relative Feuchtigkeit, 16-h-Lichtperiode und Beleuchtung mit Fluoreszenzlicht bei ungefähr 170 μmol/m²s initiiert. Die Hauben werden 7–8 Tage nach dem Säen entfernt. Die BASTA-Selektion wird am Tag 10 oder Tag 11 (9 oder 10 Tage nach der Aussaat) durch Besprühen der Töpfe mit den Pflänzchen von oben vorgenommen. Im Standardexperiment wird eine 0,07%ige (v/v) Lösung von BASTA-Konzentrat (183 g/l Glufosinat-Ammonium) in Leitungswasser einmal versprüht, oder alternativ dazu wird eine 0,02%ige (v/v) BASTA-Lösung dreimal versprüht. Die Wildtyp-Kontrollpflanzen werden nur mit Leitungswasser (anstelle von in Leitungswasser gelöstem BASTA) besprüht, aber ansonsten identisch behandelt. Die Pflanzen werden 13–14 Tage nach der Aussaat durch Entfernen des Überschusses an Keimlingen, wobei nur ein Keimling im Boden belassen wird, vereinzelt. Transgene Ereignisse und Wildtyp-Kontrollpflanzen sind gleichmäßig in der Kammer verteilt.
Das Bewässern erfolgt in einem Standardexperiment alle zwei Tage nach dem Entfernen der Hauben oder alternativ dazu jeden Tag. Zum Messen der Biomasseleistung wurde das Pflanzenfrischgewicht zur Erntezeit (24–29 Tage nach der Aussaat) durch Abschneiden der Sprosse und Wägen derselben ermittelt. Die Pflanzen sind bei der Ernte im Stadium vor dem Aufblühen und vor dem Wachstum des Blütenstands. Transgene Pflanzen werden mit am gleichen Tag geernteten nicht transgenen Kontrollpflanzen vom Wildtyp verglichen. Signifikanzwerte für die statistische Signifikanz der Biomasse-Änderungen lassen sich durch Anwenden des t-Tests nach Student (Parameter: zweiseitige, ungleiche Varianz) berechnen. Die Biomasseproduktion kann durch Wägen der Pflanzenrosetten gemessen werden. Die Zunahme an Biomasse lässt sich als das Verhältnis des Durchschnittgewichts von transgenen Pflanzen verglichen mit dem Durchschnittsgewicht von Kontrollpflanzen vom Wildtyp aus dem gleichen Experiment berechnen.
Handelt es sich bei den Pflanzen um Arabidopsis thaliana, so sind die Standardwachstumsbedingungen wie folgt: Photoperiode 16 h Licht und 8 h Dunkelheit, 20°C, 60% relative Feuchtigkeit und eine Photonenflussdichte von 220 μmol/m²s. Die Pflanzen werden herangezogen und kultiviert. Handelt es sich bei den Pflanzen um Arabidopsis thaliana, so werden sie jeden zweiten Tag gewässert. Nach 13 bis 14 Tagen werden die Pflanzen vereinzelt. Transgene Ereignisse und Wildtyp-Kontrollpflanzen sind gleichmäßig in der Kammer verteilt. Das Bewässern erfolgt in einem Standardexperiment alle zwei Tage nach dem Entfernen der Hauben oder alternativ dazu jeden Tag. Zum Messen der Biomasseleistung wird das Pflanzenfrischgewicht zur Erntezeit (26–27 Tage nach der Aussaat) durch Abschneiden der Sprosse und Wägen derselben ermittelt. Alternativ dazu ist der Erntezeitpunkt 24–25 Tage nach der Aussaat. Zusätzlich zum Wägen kann bei Pflanzen, die sich von der Wildtypkontrolle unterscheiden, eine Phänotyp-Information hinzugefügt werden. Die Pflanzen können zum Erntezeitpunkt im Vorblütestadium und vor dem Wachstum des Blütenstands sein.
Dementsprechend manifestiert gemäß einer Ausführungsform der Erfindung die transgene Pflanze der Erfindung eine Zunahme der Biomasse verglichen mit einer Kontrolle vom Wildtyp unter der Stressbedingung niedriger Temperaturen.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei diesem Ertragsmerkmal der erfindungsgemäßen Pflanze um eine erhöhte Toleranz dieser Pflanze gegenüber niedrigen Temperaturen, wozu z. B. Frosttoleranz und eine Toleranz gegenüber kühlen Temperaturen zählt. Niedrige Temperaturen beeinträchtigen eine Vielzahl von biologischen Vorgängen. Sie verzögern oder inhibieren nahezu alle metabolischen und zellulären Vorgänge. Die Reaktion von Pflanzen auf niedrige Temperaturen ist eine wichtige Determinante ihres ökologischen Bereichs. Das Problem, die niedrigen Temperaturen ertragen zu müssen, wird dadurch verschlimmert, dass es erforderlich ist, die Wachstumsperiode über den in hohen Breitengraden oder großen Höhen anzutreffenden kurzen Sommer hinaus zu verlängern. Die meisten Pflanzen haben Anpassungsstrategien entwickelt, um sich gegen niedrige Temperaturen zu schützen. Im Allgemeinen kann man die Anpassung an niedrige Temperaturen in eine Toleranz gegenüber kühlen Temperaturen und eine Frosttoleranz unterteilen.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung bezieht sich der Begriff „erhöhter Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress” auf eine erhöhte Kälteresistenz.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung bezieht sich der Begriff „erhöhte Kälteresistenz auf eine Toleranz gegenüber niedrigen Temperaturen, wozu Frosttoleranz und eine Toleranz gegenüber kühlen Temperaturen zählen.
Dementsprechend bezieht sich eine verbesserte oder gesteigerte „Toleranz gegenüber kühlen Temperaturen”, oder Abwandlungen hiervon, auf eine verbesserte Anpassung an niedrige, jedoch Nicht-Frost-Temperaturen um 10°C, vorzugsweise Temperaturen zwischen 1 bis 18°C, weiter bevorzugt 4–14°C, und am stärksten bevorzugt 8 bis 12°C, 11 bis 12°C; was hierin nachstehend als eine „kühle Temperatur” bezeichnet wird.
Eine verbesserte oder gesteigerte ”Frosttoleranz”, oder Abwandlungen hiervon, bezieht sich auf eine verbesserte Anpassung an Temperaturen nahe oder unter null, nämlich vorzugsweise Temperaturen unterhalb von 4°C, weiter bevorzugt unter 3 oder 2°C, und besonders bevorzugt bei oder unter 0 (null) °C oder unterhalb von –4°C, oder sogar extrem niedrige Temperaturen bis hinab zu –10°C oder tiefer, was hierin als „Frosttemperatur” bezeichnet wird.
Allgemeiner bezieht sich „verbesserte Anpassung” an Umweltstress wie niedrige Temperaturen, z. B. Frosttemperaturen und/oder kühle Temperaturen auf eine erhöhte Biomasseproduktion verglichen mit einer entsprechenden nichttransformierten Pflanze vom Wildtyp.
Dementsprechend bezieht sich für die Zwecke der Beschreibung der vorliegenden Erfindung der Begriff „niedrige Temperatur” hinsichtlich eines Niedertemperaturstresses auf eine Pflanze und vorzugsweise eine Kulturpflanze auf eine beliebige der hier beschriebenen Niedertemperaturbedingungen, vorzugsweise wie oben definierte kühle Temperaturen und/oder Frosttemperaturen, je nach Zusammenhang. Es versteht sich, dass ein Fachmann dazu in der Lage sein wird, aus dem jeweiligen Zusammenhang in der vorliegenden Beschreibung zu erkennen, welche Temperatur oder welcher Temperaturbereich mit „niedriger Temperatur” gemeint ist.
In der vorliegenden Erfindung lässt sich eine gesteigerte Toleranzgegenüber niedrigen Temperaturen zum Beispiel und bevorzugt nach einer der folgenden Methoden bestimmen:
In einem Standardexperiment wird Erdboden als eine Mischung von 3,5:1 (v/v) an nährstoffreicher Erde (GS90, Tantau, Wansdorf, Deutschland) und Sand zubereitet. Töpfe werden mit dem Erdgemisch befüllt und in Wannen gebracht. Wasser wird den Wannen zugesetzt, damit die Erdmischung eine angemessene Menge an Wasser für die Aussaat-Prozedur aufnehmen kann. Handelt es sich bei den Pflanzen um Arabidopsis thaliana, so werden die Samen für transgene A. thaliana-Pflanzen in die Töpfe (6 cm Durchmesser) eingesät. Die Töpfe werden gesammelt, bis sie eine Wanne für die Wachstumskammer füllen. Dann wird die gefüllte Wanne mit einer transparenten Haube abgedeckt und in das Regalsystem der vorgekühlten (4°C–5°C) Wachstumskammer überführt. Die Stratifikation wird während eines Zeitraums von 2–3 Tagen im Dunklen bei 4°C–5°C etabliert. Die Keimung der Samen und das Wachstum werden bei einer Wachstumsbedingung von 20°C, 60% relative Feuchtigkeit, 16-h-Lichtperiode und Beleuchtung mit Fluoreszenzlicht bei ungefähr 200 μmol/m²s initiiert. Die Hauben werden 7 Tage nach dem Säen entfernt. Die BASTA-Selektion wird am Tag 9 nach der Aussaat durch Besprühen der Töpfe mit den Pflänzchen von oben vorgenommen. Demgemäß wird eine Lösung von 0,07% (v/v) BASTA-Konzentrat (183 g/l Glufosinat-Ammonium) in Leitungswasser versprüht. Transgene Ereignisse und Wildtyp-Kontrollpflanzen sind zufallsgemäß in der Kammer verteilt. Die Anordnung der Wannen innerhalb der Kammern wird an Arbeitstagen ab Tag 7 nach dem Einsäen verändert. Das Bewässern erfolgt alle zwei Tage nach dem Entfernen der Hauben von den Wannen. Die Pflanzen werden 12–13 Tage nach der Aussaat durch Entfernen des Überschusses an Keimlingen, wobei jeweils nur ein Keimling im Topf belassen wird, vereinzelt. Kälte (Kühlen auf 11°C–12°C) wird 14 Tage nach der Aussaat bis zum Ende des Experiments angewandt. Zum Messen der Biomasseleistung wird das Pflanzenfrischgewicht zur Erntezeit (29–36 Tage nach der Aussaat) durch Abschneiden der Sprosse und Wägen derselben ermittelt. Die Pflanzen sind bei der Ernte im Stadium vor dem Aufblühen und vor dem Wachstum des Blütenstands. Transgene Pflanzen werden mit am gleichen Tag geernteten nicht transgenen Kontrollpflanzen vom Wildtyp verglichen. Signifikanzwerte für die statistische Signifikanz der Biomasse-Änderungen lassen sich durch Anwenden des t-Tests nach Student (Parameter: zweiseitige, ungleiche Varianz) berechnen.
Die Biomasseproduktion kann durch Wägen der Pflanzenrosetten gemessen werden. Die Zunahme an Biomasse lässt sich als das Verhältnis des Durchschnittgewichts von transgenen Pflanzen verglichen mit dem Durchschnittsgewicht von Kontrollpflanzen vom Wildtyp aus dem gleichen Experiment berechnen.
Transformierte Pflanzen werden in Töpfen in einer Wachstumskammer (z. B. York, Mannheim, Deutschland) herangezogen. Handelt es sich bei den Pflanzen um Arabidopsis thaliana, so werden die Samen davon in Töpfe eingesät, die eine 3,5:1 (v:v) Mischung an nährstoffreichem Boden (GS90, Tantau, Wansdorf, Deutschland) enthalten. Die Pflanzen werden unter standardmäßigen Wachstumsbedingungen wachsen gelassen. Handelt es sich bei den Pflanzen um Arabidopsis thaliana, so sind die Standardwachstumsbedingungen wie folgt: Photoperiode 16 h Licht und 8 h Dunkelheit, 20°C, 60% relative Feuchtigkeit und eine Photonenflussdichte von 200 μmol/m²s. Die Pflanzen werden herangezogen und kultiviert. Handelt es sich bei den Pflanzen um Arabidopsis thaliana, so werden sie jeden zweiten Tag gewässert. Nach 12 bis 13 Tagen werden die Pflanzen vereinzelt. Kälte (z. B. Kühlen auf 11–12°C) wird 14 Tage nach der Aussaat bis zum Ende des Experiments angewendet. Zum Messen der Biomasseleistung wurde das Pflanzenfrischgewicht zur Erntezeit (29–30 Tage nach der Aussaat) durch Abschneiden der Sprosse und Wägen derselben ermittelt. Zusätzlich zum Wägen wurde bei Pflanzen, die sich von der Wildtypkontrolle unterscheiden, eine Phänotyp-Information hinzugefügt.
Dementsprechend manifestiert sich gemäß einer Ausführungsform der Erfindung die erhöhte Kälteresistenz in einer Zunahme der Biomasse der erfindungsgemäßen transgenen Pflanze verglichen mit einer Kontrolle vom Wildtyp unter der Stressbedingung niedriger Temperaturen.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung bezieht sich der Begriff „erhöhter Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress” auf eine erhöhte Kälteresistenz, womit eine Toleranz niedriger Temperaturen gemeint ist, die eine Toleranz gegenüber Frosttemperaturen und/oder eine Toleranz gegenüber kühlen Temperaturen einschließt.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung bezieht sich der Begriff „erhöhter Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress” auf eine erhöhte Resistenz gegenüber Salz.
Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung gemäß einer Ausführungsform ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags, welches die folgenden Schritte umfasst:

(a) Bestimmen, ob die Temperatur in der Region, in der gepflanzt werden soll, optimal oder suboptimal für das Wachstum der ursprünglichen Pflanze oder einer Pflanze vom Wildtyp, z. B. einer Kulturpflanze, ist; und
(b1) wenn die Temperatur für das Wachstum einer in der Region wachsenden ursprünglichen Pflanze oder Wildtyppflanze suboptimal niedrig ist, Heranziehen der erfindungsgemäßen Pflanze in diesem Boden, oder
(b2) wenn die Temperatur für eine ursprüngliche Pflanze oder Wildtyppflanze optimal ist, Heranziehen der erfindungsgemäßen Pflanze in dem Boden und Vergleichen des Ertrags mit dem Ertrag eines Standards, einer ursprünglichen Pflanze oder einer Wildtyppflanze, Selektieren und Heranziehen der Pflanze, die einen höheren oder den höchsten Ertrag aufweist.

Neben der geringen Verfügbarkeit von Nährstoffen und niedrigen Temperaturen bezieht sich der Begriff Toleranz gegenüber abiotischen Stressfaktoren zum Beispiel auch auf Toleranz gegenüber niedrigen Temperaturen, Toleranz gegenüber Dürre oder Wassernutzungseffizienz (Water Use Efficiency, WUE), Toleranz gegenüber Hitze, Toleranz gegenüber Salzstress und andere. Untersuchungen zur Reaktion einer Pflanze auf Austrocknen, osmotischen Schock und extreme Temperaturen werden ebenfalls zur Bestimmung der Toleranz oder Resistenz einer Pflanze gegenüber abiotischen Stressfaktoren herangezogen.
Stresstoleranz in Pflanzen wie Toleranz gegenüber Stress durch niedrige Temperaturen, Dürre, Hitze und Salz können ein gemeinsames, für das Pflanzenwachstum wichtiges Element, nämlich die Verfügbarkeit von Wasser, haben. Pflanzen sind während ihres Lebenszyklus typischerweise Bedingungen von verringertem Wassergehalt in der Umwelt ausgesetzt. Die Schutzstrategien sind ähnlich denen für die Toleranz gegenüber kühlen Temperaturen.
Dementsprechend bezieht sich dieses Ertragsmerkmal gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung auf eine erhöhte Wassernutzungseffizienz der erfindungsgemäßen Pflanze und/oder eine erhöhte Toleranz der erfindungsgemäßen Pflanze gegenüber Dürrebedingungen. Bei der Wassernutzungseffizienz (Water Use Efficiency, WUE) handelt es sich um einen Parameter, der häufig mit Dürretoleranz korreliert ist. Eine Erhöhung der Biomasse bei schlechter Wasserverfügbarkeit kann auf einer relativ verbesserten Wachstumseffizienz oder einem reduzierten Wasserverbrauch beruhen. Beim Selektieren von Merkmalen für die Verbesserung von Kulturpflanzen würde eine Erniedrigung der Wassernutzung ohne Veränderung des Wachstums insbesondere in einem bewässerten Agrarsystem, wo die Wasseraufwandkosten hoch sind, von Bedeutung sein. Eine Erhöhung des Wachstums ohne entsprechendes sprungartiges Ansteigen der Wassernutzung wäre bei allen Agrarsystemen anwendbar. In vielen Agrarsystemen, wo die Wasserzufuhr nicht limitierend ist, erhöht ein erhöhtes Wachstum den Ertrag auch dann, wenn dabei mit einer Erhöhung der Wassernutzung zu rechnen sein muss.
Wenn der Boden wasserarm ist, bzw. wenn Wasser während Dürreperioden nicht verfügbar ist, sind die Kulturpflanzenerträge beschränkt. Ein Wasserdefizit bei Pflanzen entsteht dann, wenn die Transpiration der Blätter das Wasserangebot von den Wurzeln übersteigt. Das verfügbare Wasserangebot steht mit der in dem Boden gehaltenen Wassermenge sowie der Fähigkeit der Pflanze, dieses Wasser mit ihrem Wurzelsystem zu erreichen, in Zusammenhang. Die Transpiration von Wasser von den Blättern steht mit der Fixierung von Kohlendioxid durch die Photosynthese durch die Stomata in Zusammenhang. Die beiden Vorgänge sind positiv miteinander korreliert, so dass ein hoher Kohlendioxidinflux durch die Photosynthese eng mit dem transpirationsbedingten Wasserverlust in Zusammenhang steht. Entweicht Wasser transpirationsbedingt aus dem Blatt, so wird das Blattwasserpotential reduziert, und die Stomata neigen dazu, sich hydraulisch zu schließen, wodurch die Photosyntheserate limitiert wird. Da der Kulturpflanzenertrag von der Fixierung von Kohlendioxid während der Photosynthese abhängig ist, stellen die Wasseraufnahme und Transpiration Faktoren dar, die zum Kulturpflanzenertrag beitragen. Pflanzen, die fähig sind, zum Fixieren derselben Kohlendioxidmenge weniger Wasser zu verbrauchen, oder die fähig sind, bei einem niedrigeren Wasserpotential normal zu funktionieren, weisen das Potential auf, mehr Photosynthese zu machen und dadurch in vielen Agrarsystemen mehr Biomasse und ökonomischen Ertrag zu produzieren.
Dürrestress bedeutet ein beliebiger Umweltstress, der zu einem Wassermangel in Pflanzen oder einer Verminderung der Wasserversorgung von Pflanzen führt, einschließlich eines Sekundärstresses durch niedrige Temperaturen und/oder Salz, und/oder eines Primärstresses während einer Dürre oder Hitzewelle, z. B. Austrocknung usw.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung bezieht sich der Begriff „erhöhter Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress” auf eine erhöhte Resistenz gegenüber Dürre.
Gemäß einer Ausführungsform bezieht sich erhöhte Resistenz gegenüber Dürre auf Resistenz gegenüber Dürrezyklen, womit abwechselnde Perioden von Dürre und erneuter Bewässerung gemeint sind.
In der vorliegenden Erfindung lässt sich eine gesteigerte Toleranz gegenüber zyklischer Dürre zum Beispiel und bevorzugt nach der folgenden Methode bestimmen: Transformierte Pflanzen werden in Töpfen in einer Wachstumskammer (z. B. York, Mannheim, Deutschland) herangezogen. Handelt es sich bei den Pflanzen um Arabidopsis thaliana, so wird der Boden als eine 1:1 (v:v) Mischung an nährstoffreichem Boden (GS90, Tantau, Wansdorf, Deutschland) und Quarzsand zubereitet. Töpfe (6 cm Durchmesser) werden mit diesem Gemisch gefüllt und in Wannen gestellt. In die Wannen wird Wasser gegeben, so dass das Bodengemisch eine angemessene Menge Wasser für das Säverfahren aufnehmen kann (Tag 1), und anschließend werden Samen von transgenen A. thaliana-Pflanzen und ihre Wildtypkontrollen in Töpfe gesät. Dann wird die gefüllte Wanne mit einem transparenten Deckel abgedeckt und in eine vorgekühlte (4°C–5°C) und abgedunkelte Wachstumskammer überführt. Die Stratifizierung wird über einen Zeitraum von 3 Tagen im Dunkeln bei 4°C–5°C oder alternativ für 4 Tage im Dunkeln bei 4°C etabliert. Die Keimung der Samen und das Wachstum wird bei Wachstumsbedingungen von 20°C, 60% relativer Feuchtigkeit, 16 h Photoperiode und Belichtung mit Fluoreszenzlicht bei 200 μmol/m²s oder alternativ dazu bei 220 μmol/m²s eingeleitet. Die Deckel werden 7–8 Tage nach der Aussaat abgenommen. Eine BASTA-Selektion kann am Tag 10 oder Tag 11 (9 oder 10 Tage nach der Aussaat) durch Besprühen der Töpfe mit den Pflänzchen von oben erfolgen. Im Standardexperiment wird eine 0,07%ige (v/v) Lösung von BASTA-Konzentrat (183 g/l Glufosinat-Ammonium) in Leitungswasser einmal versprüht oder alternativ dazu wird eine 0,02%ige (v/v) BASTA-Lösung dreimal versprüht. Die Wildtyp-Kontrollpflanzen werden nur mit Leitungswasser (anstelle von in Leitungswasser gelöstem BASTA) besprüht, aber ansonsten identisch behandelt. Die Pflanzen werden 13–14 Tage nach der Aussaat vereinzelt, indem die überschüssigen Keimlinge entfernt werden und ein Keimling im Boden belassen wird. Die transgenen Ereignisse und die Wildtyp-Kontrollpflanzen werden gleichmäßig über die Kammer verteilt.
Die Wasserversorgung während des Experiments ist eingeschränkt, und die Pflanzen werden Zyklen von Dürre und einer erneuten Bewässerung ausgesetzt. Bewässert wird an Tag 1 (vor der Aussaat), Tag 14 oder Tag 15, Tag 21 oder Tag 22 und schließlich Tag 27 oder Tag 28. Zum Messen der Biomasseproduktion wird das Pflanzenfrischgewicht einen Tag nach der letzten Bewässerung (Tag 28 oder Tag 29) durch Abschneiden der Sprosse und Wägen derselben ermittelt. Zusätzlich zum Wägen wurde bei Pflanzen, die sich von der Wildtypkontrolle unterscheiden, eine Phänotyp-Information hinzugefügt. Die Pflanzen sind bei der Ernte im Stadium vor dem Aufblühen und vor dem Wachstum des Blütenstands. Signifikanzwerte für die statistische Signifikanz der Biomasse-Änderungen lassen sich durch Anwenden des t-Tests nach Student (Parameter: zweiseitige, ungleiche Varianz) berechnen.
Dementsprechend manifestiert sich gemäß einer Ausführungsform der Erfindung die erhöhte Kälteresistenz in einer Zunahme der Biomasse der erfindungsgemäßen transgenen Pflanze verglichen mit einer Kontrolle vom Wildtyp unter der Stressbedingung von zyklischer Dürre.
Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung gemäß einer Ausführungsform ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags, welches die folgenden Schritte umfasst:

(a) Bestimmen, ob die Wasserversorgung in der Region, in der gepflanzt werden soll, optimal oder suboptimal für das Wachstum der ursprünglichen Pflanze oder einer Pflanze vom Wildtyp, z. B. einer Kulturpflanze, ist; und/oder Bestimmen der sichtbaren Symptome einer Schädigung von Pflanzen, die in der Region, in der gepflanzt werden soll, wachsen; und
(b1) wenn die Wasserversorgung für das Wachstum einer in der Region wachsenden ursprünglichen Pflanze oder Wildtyppflanze suboptimal ist oder sichtbare Symptome von Dürre bei einer ursprünglichen Pflanze oder Wildtyppflanze standardgemäß angetroffen werden, Heranziehen der erfindungsgemäßen Pflanze in diesem Boden, oder
(b2) wenn die Wasserversorgung für die ursprüngliche Pflanze oder Wildtyppflanze optimal ist, Heranziehen der erfindungsgemäßen Pflanze in dem Boden und Vergleichen des Ertrags mit dem Ertrag eines Standards, einer ursprünglichen Pflanze oder einer Wildtyppflanze, Selektieren und Heranziehen der Pflanze, die einen höheren Ertrag oder den höchsten Ertrag aufweist.

Zu den sichtbaren Schadigungssymptomen gehören eines oder eine beliebige Kombination von zwei, drei oder mehreren der folgenden Merkmale: Welken; Braunfärbung der Blätter; Abnahme des Turgordrucks, was ein Herunterhängen von Blättern bzw. Nadelstängeln und Blüten zur Folge hat; Herunterhängen und/oder Abwerfen von Blättern oder Nadeln; die Blätter sind grün, aber im Vergleich zu den Kontrollen leicht zum Boden hin abgewinkelt; die Blattkanten haben begonnen, sich nach innen zu falten (einzudrehen); vorzeitiges Abwerfen von Blättern oder Nadeln; Verlust von Chlorophyll in den Blättern oder Nadeln und/oder Vergilbung.
Bei einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei diesem Ertragsmerkmal der erfindungsgemäßen Pflanze um eine erhöhte Toleranz dieser Pflanze gegenüber Bedingungen von Hitze.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung bezieht sich der Begriff „erhöhter Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress” auf das Verleihen eines erhöhten Ertrages, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, speziell unter einer beliebigen suboptimalen Wachstumsbedingung, verglichen mit einer nicht transformierten Pflanze vom Wildtyp.
Gemäß einer Ausführungsform handelt es sich bei einer suboptimalen Wachstumsbedingung um eine beliebige Bedingung, die nicht der jeweiligen Bedingung entspricht, unter der sich das Ertragspotential erreichen lässt.
Gemäß einer Ausführungsform sind optimale Wachstumsbedingungen Bedingungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

– Klima- und Umweltbedingungen, wie sie hauptsächlich in den letzten 50, 25, 20, 15, 10 oder 5 Jahren über einen Zeitraum von 3, 6, 12 Monaten oder über eine Anbauperiode in den als Wheatbelt Region in West-Australien und Corn Belt in den USA (umfassend wenigstens einen der Staaten Iowa, Indiana, Illinois, Ohio, South Dakota, Nebraska, Kansas, Minnesota, Wisconsin, Michigan, Missouri und Kentucky) bekannten Mega-Environments vorherrschten;
– Klima- und Umweltbedingungen, wie sie hauptsächlich in den letzten 50, 25, 20, 15, 10 oder 5 Jahren über einen Zeitraum von 3, 6, 12 Monaten oder über eine Anbauperiode in den von CIMMYT aufgeführten Mega-Environments für Mais und Weizen vorherrschten.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist der Begriff „erhöhter Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress” definiert als ein längeres Überleben von Pflanzen unter vorübergehenden und wiederholten abiotischem Stressbedingungen als bei einer nicht transformierten Pflanze vom Wildtyp.
Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress bedeutet unter Bedingungen von Wassermangel; in anderen Worten, die Pflanzen überleben und wachsen unter Bedingungen von Wassermangel länger als eine nicht transformierte Pflanze vom Wildtyp, ohne dass sie irgendwelche Symptome einer Schädigung wie Welken und Braunfärbung und/oder Einrollen der Blätter zeigen, wobei die Pflanzen andererseits sichtbar angeschwollen und von einer gesunden grünen Farbe sind.
Gemäß einer Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen des Ertrags pro Acre oder pro kultivierter Fläche, welches die folgenden Schritte umfasst:

– Durchführen einer Analyse der Umweltbedingungen zum Messen der im Boden verfügbaren Konzentrationen an Nährstoffen (einschließlich Wasser) oder des Niederschlags pro Anbauzyklus,
– Vergleichen des Ergebnisses mit dem Wert der entsprechenden Bedingung mit dem Wert unter einer optimalen Wachstumsbedingung
– Anbau einer erfindungsgemäßen Pflanze der entsprechenden Klasse/Gattung, wenn wenigstens eine gemessene Bedingung um 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% oder mehr von dem Wert unter einer optimalen Wachstumsbedingung abweicht.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung bedeuten die Begriffe „erhöhter Ertrag”, „erhöhte Biomasse” oder „erhöhte Biomasseproduktion”, dass die Pflanzen verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanze vom Wildtyp eine erhöhte Wachstumsrate vom Beginn des ersten Wasserentzugs oder zur Erntezeit zeigen. Eine erhöhte Wachstumsrate schließt eine erhöhte Biomasseproduktion der gesamten Pflanze, eine erhöhte Biomasse des sichtbaren Teils der Pflanze, z. B. von Stängel und Blättern und Blüten und einen sichtbar höheren und größeren Stängel ein.
Gemäß einer Ausführungsform schließen erhöhter Ertrag und/oder erhöhte Biomasseproduktion einen höheren Samenertrag, eine höhere Photosynthese und/oder eine höhere Trockenmasseproduktion ein.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung bedeutet der Begriff „erhöhte Biomasseproduktion”, dass die Pflanzen verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanze vom Wildtyp ein längeres Wachstum vom Beginn des Wasserentzugs zeigen. Ein längeres Wachstum schließt das Überleben und/oder ein weiteres Wachstum der gesamten Pflanze zu einem Zeitpunkt, wenn die nicht transformierte Pflanze vom Wildtyp sichtbare Symptome einer Schädigung zeigt, ein.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung bedeutet der Begriff „erhöhter Ertrag”, dass die Pflanzen nach einer erneuten Bewässerung eine erhöhte Konvaleszenzperiode verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanze vom Wildtyp zeigen, das heißt, ohne dass sie irgendwelche oder weniger Symptome einer Schädigung wie Welken und Braunfärbung und/oder Einrollen der Blätter zeigen, wobei die Pflanzen andererseits sichtbar angeschwollen und von einer gesunden grünen Farbe sind.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können sich eine Erhöhung der der Pflanze eigenen Ertragskapazität betreffende Ertragsmerkmale in einer Verbesserung des spezifischen (intrinsischen) Samenertrags (z. B. hinsichtlich einer erhöhten Samen-/Korngröße, einer erhöhten Ährenzahl, einer erhöhten Anzahl an Samen pro Ähre, einer Verbesserung der Samenfüllung, einer Verbesserung der Samenzusammensetzung, Embryo- und/oder Endospermverbesserungen oder dergleichen); Modifikation und Verbesserung der inhärenten Wachstums- und Entwicklungsmechanismen einer Pflanze (wie Pflanzenhöhe; Pflanzenwachstumsrate, Anzahl an Schoten, Position der Schoten an der Pflanze, Anzahl an Internodien, Häufigkeit von Aufplatzen der Schoten, Effizienz der Nodulation und Stickstofffixierung, Effizienz der Kohlenstoffassimilation, Verbesserung der Wachstumskraft der Keimlinge/der frühen Wachstumskraft, verbesserte Keimungseffizienz (unter Stress- oder Nicht-Stress-Bedingungen); Verbesserung der Pflanzenarchitektur, Zellzyklusmodifikationen, Photosynthesemodifikationen, verschiedene Signalpfadmodifikationen, Modifikation der Steuerung der Transkription, Modifikation der Steuerung der Translation, Modifikation von Enzymaktivitäten und dergleichen); und/oder dergleichen zeigen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können sich Ertragsmerkmale, die eine Verbesserung oder Erhöhung bei der Effizienz der Nährstoffausnutzung einer Pflanze betreffen, in einer verbesserten allgemeinen Effizienz der Nährstoffassimilation einer Pflanze (z. B. hinsichtlich einer Verbesserung der allgemeinen Nährstoffaufnahme und/oder des allgemeinen Nährstofftransports, einer Verbesserung der allgemeinen Transportmechanismen einer Pflanze, Verbesserungen bei den Assimilationspfaden und dergleichen), und/oder durch Verbesserungen bei der Effizienz der Nährstoffausnutzung von spezifischen Nährstoffen einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Phosphor, Kalium und Stickstoff, zeigen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können sich Ertragsmerkmale, die eine Verbesserung oder Erhöhung der Stresstoleranz einer Pflanze betreffen, manifestieren, indem sie die Toleranz einer Pflanze gegenüber biotischem und/oder abiotischem Stress verbessern oder erhöhen. In der vorliegenden Anmeldung bezieht sich biotischer Stress im Allgemeinenauf pflanzenpathogene und Pflanzeschädlinge, zu denen – ohne dass dies als Einschränkung gilt – Pilzkrankheiten (einschließlich Oomycetenkrankheiten), Viruskrankheiten, bakterielle Krankheiten, Insektenbefall, Nematodenbefall und dergleichen zählen. In der vorliegenden Anmeldung bezieht sich abiotischer Stress im Allgemeinen auf abiotische Umweltbedingungen, denen eine Pflanze typischerweise ausgesetzt ist, einschließlich Bedingungen, die typischerweise als Bedingungen von „abiotischem Stress” bezeichnet werden, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Dürre (Toleranz gegenüber Dürre lässt sich als Ergebnis einer verbesserten Effizienz der Wasserausnutzung erzielen), Bedingungen von Hitze, niedrigen Temperaturen und Kälte (wie Frostbedingungen und Bedingungen bei kühlen Temperaturen), Versalzung, osmotischer Stress, Schatten, hohe Pflanzendichte, mechanischer Stress, oxidativer Stress und dergleichen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Verbesserung der Ertragsmerkmale, die einer Erhöhung der einer Pflanze eigenen Ertragskapazität und/oder der Toleranz einer Pflanze gegenüber abiotischem Stress entsprechen, eine besonders bevorzugte Ausführungsform zur Erhöhung bzw. Verbesserung des Ertrags dieser Pflanze.
Der Begriff „Ertrag” bezieht sich, so wie er hier verwendet wird, allgemein auf ein messbares Produkt einer Pflanze, insbesondere einer Kulturpflanze.
Ertrag und Ertragszunahme (im Vergleich zu einer nicht transformierten Ausgangspflanze bzw. einer Pflanze vom Wildtyp) lässt sich auf eine Reihe von Wegen messen, und es versteht sich, dass es einem Fachmann möglich ist, angesichts der jeweiligen Ausführungsformen, der jeweils betroffenen Kulturpflanze und dem speziellen betreffenden Zweck bzw. der betreffenden Anwendung die korrekte Bedeutung zu bestimmen.
Bei den hier beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung bezieht sich Erhöhung des Ertrags auf einen erhöhten Biomasseertrag, einen erhöhten Samenertrag und/oder einen erhöhten Ertrag hinsichtlich eines oder mehrerer spezieller Inhaltsstoffe einer ganzen Pflanze oder von Teilen davon oder Pflanzensamen.
Bei bevorzugten Ausführungsformen bezieht sich „Ertrag” auf einen Biomasseertrag, der den Trockengewichts-Biomasseertrag und/oder den Frischgewichts-Biomasseertrag umfasst, jeweils in Hinblick auf die oberirdischen und/oder unterirdischen Teile einer Pflanze, je nach den speziellen Umständen (Testbedingungen, die spezielle interessierende Kulturpflanze, die interessierende Anwendung und dergleichen). In jedem Fall kann der Biomasseertrag als Frischgewicht, als Trockengewicht oder auf einer feuchtigkeitsangepassten Basis oder andererseits auf einer Pro-Pflanze-Basis oder bezogen auf eine spezielle Fläche (z. B. Biomasseertrag pro Acre/Quadratmeter oder dergleichen) berechnet werden.
Bei anderen bevorzugten Ausführungsformen bezieht sich „Ertrag” auf den Samenertrag, der sich anhand eines oder mehrerer der folgenden Parameter bestimmen lässt: Anzahl an Samen oder Anzahl an gefüllten Samen (pro Pflanze oder pro Fläche (Acre/Quadratmeter oder dergleichen)); Samenfüllrate (Verhältnis zwischen der Anzahl an gefüllten Samen und der Gesamtanzahl an Samen); Anzahl an Blüten pro Pflanze; Samenbiomasse oder Gesamtsamengewicht (pro Pflanze oder pro Fläche (Acre/Quadratmeter oder dergleichen); Tausendkorngewicht (TKW; extrapoliert aus der Anzahl gezählter gefüllter Samen und deren Gesamtgewicht; eine Erhöhung des TKW kann auf eine erhöhte Samengröße, ein erhöhtes Samengewicht, eine erhöhte Embryogröße und/oder einen erhöhten Endosperm zurückzuführen sein); oder anderer Parameter, die eine Messung des Samenertrags erlauben. Der Samenertrag lässt sich auf Trockengewichtsbasis oder auf Frischgewichtsbasis oder typischerweise auf einer feuchtigkeitsangepassten Basis, z. B. bei einer Feuchtigkeit von 15,5 Prozent, bestimmen.
Bei weiteren bevorzugten Ausführungsformen bezieht sich Ertrag auf den spezifischen Gehalt und/oder die spezifische Zusammensetzung eines erntbaren Produkts einschließlich, ohne Einschränkung, eines erhöhten und/oder verbesserten Zuckergehalts oder einer erhöhten und/oder verbesserten Zuckerzusammensetzung, eines erhöhten und/oder verbesserten Stärkegehalts und/oder einer erhöhten oder verbesserten Stärkezusammensetzung, eines erhöhten und/oder verbesserten Ölgehalts und/oder einer erhöhten oder verbesserten Ölzusammensetzung (wie eines verbesserten Samenölgehalts), eines erhöhten und/oder verbesserten Proteingehalts und/oder einer erhöhten oder verbesserten Proteinzusammensetzung (wie eines verbesserten Samenproteingehalts), eines erhöhten und/oder verbesserten Vitamingehalts und/oder einer erhöhten und/oder verbesserten Vitaminzusammensetzung, oder dergleichen.
Bei einer bevorzugten Bedeutung gemäß der vorliegenden Erfindung kann sich „Ertrag”, so wie hier beschrieben, auch auf den erntbaren Ertrag einer Pflanze beziehen, der zum größten Teil von der betreffenden Pflanze/Kulturpflanze von Interesse sowie deren jeweils vorgesehener Verwendung (wie Nahrungsmittelproduktion, Futterproduktion, der Produktion von verarbeiteten Nahrungsmitteln, der Produktion von Biotreibstoff, Biogas oder Alkohol oder dergleichen) von Interesse abhängt. Ertrag kann somit auch als Ernteindex (ausgedrückt als Verhältnis des Gewichts der entsprechenden erntbaren Teile dividiert durch die Gesamtbiomasse), das Gewicht der erntbaren Teile pro Fläche (Acre, Quadratmeter oder dergleichen); und dergleichen berechnet werden.
Vorzugsweise lassen sich die hier beschriebenen verstärkten oder verbesserten Ertragscharakteristika einer hier erfindungsgemäß beschriebenen Pflanze in Abwesenheit oder Gegenwart von Stressbedingungen erzielen.
Die Bedeutung von „Ertrag” hängt somit vor allem von der interessierenden Kulturpflanze und der vorgesehenen Verwendung ab, und es versteht sich, dass der Fachmann sich in jedem betreffenden Fall von den Einzelheiten der Beschreibung her darüber klar sein wird, was gemeint ist.
Gemäß einer Ausführungsform befriedigt die vorliegende Erfindung teilweise den Bedarf der Identifizierung neuer, einzigartiger Gene, die dazu in der Lage sind, Pflanzen bei der Expression oder Überexpression von endogenen und/oder exogenen Genen einen erhöhten Ertrag zu verleihen, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann es sich bei diesem Ertragsmerkmal auch um eine erhöhte Salinitätstoleranz (Salztoleranz), eine Toleranz gegenüber osmotischem Stress, eine erhöhte Schattentoleranz, eine erhöhte Toleranz gegenüber einer hohen Pflanzendichte, eine erhöhte Toleranz gegenüber mechanischen Stressfaktoren und/oder eine erhöhte Toleranz gegenüber oxidativem Stress handeln.
Gemäß einer Ausführungsform davon bedeutet der Begriff „gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” in einem photosynthetisch aktiven Organismus, dass der photosynthetisch aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, wenn er Bedingungen von abiotischem Umweltstress ausgesetzt wird, verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, photosynthetisch aktiven Organismus vom Wildtyp, wie einer Pflanze, einen gesteigerten Trockenbiomasseertrag zeigt.
Gemäß einer Ausführungsform davon bedeutet der Begriff „gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” in einem photosynthetisch aktiven Organismus, dass der photosynthetisch aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, wenn er Bedingungen von abiotischem Umweltstress ausgesetzt wird, verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, photosynthetisch aktiven Organismus vom Wildtyp einen gesteigerten oberirdischen Trockenbiomasseertrag zeigt.
Gemäß einer Ausführungsform davon bedeutet der Begriff „gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” in einer Pflanze, dass die Pflanze, wenn sie Bedingungen von abiotischem Umweltstress ausgesetzt wird, verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten Organismus vom Wildtyp einen gesteigerten unterirdischen Trockenbiomasseertrag zeigt.
Gemäß einer anderen Ausführungsform davon bedeutet der Begriff „gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” in einer Pflanze, dass die Pflanze, wenn sie Bedingungen von abiotischem Umweltstress ausgesetzt wird, verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten Organismus vom Wildtyp einen gesteigerten Frischgewichtbiomasseertrag zeigt.
Gemäß einer Ausführungsform davon bedeutet der Begriff „gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” in einer Pflanze, dass die Pflanze, wenn sie Bedingungen von abiotischem Umweltstress ausgesetzt wird, verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten Organismus vom Wildtyp einen gesteigerten oberirdischen Frischgewichtbiomasseertrag zeigt.
Gemäß einer Ausführungsform davon bedeutet der Begriff „gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” in einer Pflanze, dass die Pflanze, wenn sie Bedingungen von abiotischem Umweltstress ausgesetzt wird, verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten Organismus vom Wildtyp einen gesteigerten unterirdischen Frischgewichtbiomasseertrag zeigt.
Gemäß einer anderen Ausführungsform davon bedeutet der Begriff „gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” in einer Pflanze, dass die Pflanze, wenn sie Bedingungen von abiotischem Umweltstress ausgesetzt wird, verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten Organismus vom Wildtyp einen gesteigerten Ertrag an erntbaren Pflanzenteilen zeigt.
Gemäß einer Ausführungsform davon bedeutet der Begriff „gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” in einer Pflanze, dass die Pflanze, wenn sie Bedingungen von abiotischem Umweltstress ausgesetzt wird, verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten Organismus vom Wildtyp einen gesteigerten Ertrag an trockenen erntbaren Pflanzenteilen zeigt.
Gemäß einer Ausführungsform davon bedeutet der Begriff „gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” in einer Pflanze, dass die Pflanze, wenn sie Bedingungen von abiotischem Umweltstress ausgesetzt wird, verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten Organismus vom Wildtyp einen gesteigerten Ertrag an trockenen oberirdischen erntbaren Pflanzenteilen zeigt.
Gemäß einer Ausführungsform davon bedeutet der Begriff „gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” in einer Pflanze, dass die Pflanze, wenn sie Bedingungen von abiotischem Umweltstress ausgesetzt wird, verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten Organismus vom Wildtyp einen gesteigerten Ertrag an unterirdischen trockenen erntbaren Pflanzenteilen zeigt.
Gemäß einer anderen Ausführungsform davon bedeutet der Begriff „gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” in einer Pflanze, dass die Pflanze, wenn sie Bedingungen von abiotischem Umweltstress ausgesetzt wird, verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten Organismus vom Wildtyp einen gesteigerten Frischgewichtertrag an erntbaren Pflanzenteilen zeigt.
Gemäß einer Ausführungsform davon bedeutet der Begriff „gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” in einer Pflanze, dass die Pflanze, wenn sie Bedingungen von abiotischem Umweltstress ausgesetzt wird, verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten Organismus vom Wildtyp einen gesteigerten Frischgewichtertrag an oberirdischen erntbaren Pflanzenteilen zeigt.
Gemäß einer Ausführungsform davon bedeutet der Begriff „gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” in einer Pflanze, dass die Pflanze, wenn sie Bedingungen von abiotischem Umweltstress ausgesetzt wird, verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten Organismus vom Wildtyp einen gesteigerten Frischgewichtertrag an unterirdischen erntbaren Pflanzenteilen zeigt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform bedeutet der Begriff „gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” in einer Pflanze, dass die Pflanze, wenn sie Bedingungen von abiotischem Umweltstress ausgesetzt wird, verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten Organismus vom Wildtyp einen gesteigerten Kulturpflanzenfruchtertrag zeigt.
Gemäß einer Ausführungsform davon bedeutet der Begriff „gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” in einer Pflanze, dass die Pflanze, wenn sie Bedingungen von abiotischem Umweltstress ausgesetzt wird, verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten Organismus vom Wildtyp einen gesteigerten Frischkulturpflanzenfruchtertrag zeigt.
Gemäß einer Ausführungsform davon bedeutet der Begriff „gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” in einer Pflanze, dass die Pflanze, wenn sie Bedingungen von abiotischem Umweltstress ausgesetzt wird, verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten Organismus vom Wildtyp einen gesteigerten Trockenkulturpflanzenfruchtertrag zeigt.
Gemäß einer Ausführungsform davon bedeutet der Begriff „gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” in einer Pflanze, dass die Pflanze, wenn sie Bedingungen von abiotischem Umweltstress ausgesetzt wird, verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten Organismus vom Wildtyp ein gesteigertes Korntrockengewicht zeigt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform bedeutet der Begriff „gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” in einer Pflanze, dass die Pflanze, wenn sie Bedingungen von abiotischem Umweltstress ausgesetzt wird, verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten Organismus vom Wildtyp einen gesteigerten Samenertrag zeigt.
Gemäß einer Ausführungsform davon bedeutet der Begriff „gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” in einer Pflanze, dass die Pflanze, wenn sie Bedingungen von abiotischem Umweltstress ausgesetzt wird, verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten Organismus vom Wildtyp einen gesteigerten Frischgewichtsamenertrag zeigt.
Gemäß einer Ausführungsform davon bedeutet der Begriff „gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” in einer Pflanze, dass die Pflanze, wenn sie Bedingungen von abiotischem Umweltstress ausgesetzt wird, verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten Organismus vom Wildtyp einen gesteigerten Trockensamenertrag zeigt.
Bei den Bedingungen von abiotischem Umweltstress, denen die Pflanze ausgesetzt wird, kann es sich jedoch zum Beispiel um beliebige der hier erwähnten abiotischen Umweltstressfaktoren handeln. Vorzugsweise ist eine wie hier beschriebene Pflanze. Bei einer gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugten Pflanze kann es sich um eine Kulturpflanze, z. B. Mais, Sojabohne, Reis, Baumwolle, Weizen oder Raps (zum Beispiel Canola) oder wie unten aufgeführt, handeln.
Gemäß einer Ausführungsform bezieht sich eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz des erzeugten Maises auf einen verbesserten oder erhöhten Proteingehalt des Maissamens, insbesondere in Maissamen, der als Futtermittel verwendet wird. Gemäß einer weiteren Ausführungsform bezieht sich erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz auf eine erhöhte Korngröße oder -zahl pro Pflanze. Gemäß einer Ausführungsform bezieht sich eine erhöhte Wassernutzungseffizienz des erzeugten Maises auf eine erhöhte Korngröße oder -zahl verglichen mit einer Pflanze vom Wildtyp. Weiterhin bezieht sich gemäß einer Ausführungsform eine erhöhte Toleranz gegenüber niedrigen Temperaturen auf Jungpflanzenwüchsigkeit und gestattet das frühe Auspflanzen und Säen einer gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren erzeugten Maispflanze.
Gemäß einer Ausführungsform bezieht sich eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz der erzeugten Sojabohnenpflanze auf einen verbesserten oder erhöhten Proteingehalt des Sojabohnensamens, insbesondere in Sojabohnensamen, der als Futtermittel verwendet wird. Gemäß einer weiteren Ausführungsform bezieht sich erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz auf eine erhöhte Samengröße oder -zahl. Gemäß einer Ausführungsform bezieht sich eine erhöhte Wassernutzungseffizienz der erzeugten Sojabohnenpflanze auf eine erhöhte Samengröße oder -zahl. Weiterhin bezieht sich gemäß einer Ausführungsform eine erhöhte Toleranz gegenüber niedrigen Temperaturen auf Jungpflanzenwüchsigkeit und gestattet das frühe Auspflanzen und Säen einer gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren erzeugten Sojabohnenpflanze.
Gemäß einer Ausführungsform bezieht sich eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz der erzeugten Rapspflanze auf einen verbesserten oder erhöhten Proteingehalt des Rapssamens, insbesondere in Rapssamen, der als Futtermittel verwendet wird. Gemäß einer weiteren Ausführungsform bezieht sich erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz auf eine erhöhte Samengröße oder -zahl pro Pflanze. Gemäß einer Ausführungsform bezieht sich eine erhöhte Wassernutzungseffizienz der erzeugten Rapspflanze auf eine erhöhte Samengröße oder -zahl pro Pflanze. Weiterhin bezieht sich gemäß einer Ausführungsform eine erhöhte Toleranz gegenüber niedrigen Temperaturen auf Jungpflanzenwüchsigkeit und gestattet das frühe Auspflanzen und Säen einer gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren erzeugten Rapspflanze. Gemäß einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von winterfestem Raps (winterhartem Raps), bei dem man eine winterfeste Rapspflanze in dem obenerwähnten erfindungsgemäßen Verfahren verwendet.
Gemäß einer Ausführungsform bezieht sich eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz der erzeugten Baumwollpflanze auf einen verbesserten Proteingehalt des Baumwollsamens, insbesondere in Baumwollsamen, der als Futtermittel verwendet wird. Gemäß einer weiteren Ausführungsform bezieht sich erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz auf eine erhöhte Samengröße oder -zahl. Gemäß einer Ausführungsform bezieht sich eine erhöhte Wassernutzungseffizienz der erzeugten Baumwollpflanze auf eine erhöhte Samengröße oder -zahl. Weiterhin bezieht sich gemäß einer Ausführungsform eine erhöhte Toleranz gegenüber niedrigen Temperaturen auf Jungpflanzenwüchsigkeit und gestattet das frühe Auspflanzen und Säen einer gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren erzeugten Baumwollpflanze.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, die verglichen mit der entsprechenden ursprünglichen Pflanze oder Pflanze vom Wildtyp ein oder mehrere verbesserte Ertragsmerkmale zeigt, bereit, wobei das Verfahren das Erhöhen oder Erzeugen einer oder mehrerer Aktivitäten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Phosphoenolpyruvatcarboxylkinase, Arginin-/Alaninaminopeptidase, D-Alanyl-D-alanincarboxypeptidase, Diacylglycerolpyrophosphatphosphatase, Dityrosintransporter, Farnesyldiphosphatfarnesyltransferase, NAD+-abhängiger Betainaldehyddehydrogenase, Serinhydrolase, dem an der Übertragung von Ketoconazolresistenz beteiligten transkriptionellen Regulator, Uridinkinase, dem yal043c-a-Protein, dem ybr071w-Protein und dem ydr445c-Protein im wie hier z. B in Tabelle I angeführten subzellulären Kompartiment und/oder Gewebe dieser Pflanze umfasst.
Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanzenzelle oder Pflanze oder eines Teils davon mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Toleranz gegenüber Dürre und/oder niedrigen Temperaturen und/oder einer erhöhten Effizienz der Nährstoffausnutzung, einem erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder einem erhöhten anderen Ertragsmerkmal, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, bei dem man

(a) eine oder mehrere Aktivitäten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Phosphoenolpyruvatcarboxylkinase, Arginin/Alanin-Aminopeptidase, D-Alanyl-D-alanincarboxypeptidase, Diacylglycerolpyrophosphatphosphatase, Dityrosintransporter, Farnesyldiphosphatfarnesyltransferase, NAD+-abhängiger Betainaldehyddehydrogenase, Serinhydrolase, dem an der Übertragung von Ketoconazolresistenz beteiligten transkriptionellen Regulator, Uridinkinase, dem yal043c-a-Protein, dem ybr071w-Protein und dem ydr445c-Protein in einer Pflanzenzelle oder Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt, und
(b) die Pflanzenzelle, eine Pflanze oder einen Teil davon unter Bedingungen heranzieht, die die Entwicklung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Toleranz gegenüber Dürre und/oder niedrigen Temperaturen und/oder einer erhöhten Effizienz der Nährstoffausnutzung, einem erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder einem erhöhten anderen Ertragsmerkmal, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanze vom Wildtyp erlauben.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanzenzelle oder Pflanze oder eines Teils davon mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Toleranz gegenüber Dürre und/oder niedrigen Temperaturen und/oder einer erhöhten Effizienz der Nährstoffausnutzung, einem erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder einem erhöhten anderen Ertragsmerkmal, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, bei dem man

(a) eine oder mehrere Aktivitäten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Phosphoenolpyruvatcarboxylkinase, Arginin/Alanin-Aminopeptidase, D-Alanyl-D-alanincarboxypeptidase, Diacylglycerolpyrophosphatphosphatase, Dityrosintransporter, Farnesyldiphosphatfarnesyltransferase, NAD+-abhängiger Betainaldehyddehydrogenase, Serinhydrolase, dem an der Übertragung von Ketoconazolresistenz beteiligten transkriptionellen Regulator, Uridinkinase, dem yal043c-a-Protein, dem ybr071w-Protein und dem ydr445c-Protein in einer Pflanzenzelle oder Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt, und
(b) die Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einen Teil davon zusammen mit nicht transformierten Pflanzen vom Wildtyp heranzieht,
c) einen vorübergehenden und wiederholten abiotischen Stress einwirken lässt, vorzugsweise indem man nicht mehr wiederholt wässert,
d) nachdem die nicht transformierten Pflanzen vom Wildtyp sichtbare Symptome einer Schädigung zeigen, die Pflanze mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Toleranz gegenüber Dürre und/oder niedrigen Temperaturen und/oder einer erhöhten Effizienz der Nährstoffausnutzung, einem erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder einem erhöhten anderen Ertragsmerkmal, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanze vom Wildtyp, auswählt.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird die erhöhte Resistenz gegenüber vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress nach der folgenden Methode bestimmt und quantifiziert:
Transformierte Pflanzen werden in Töpfen in einer Wachstumskammer (z. B. York, Mannheim, Deutschland) herangezogen. Handelt es sich bei den Pflanzen um Arabidopsis thaliana, so wird der Boden als eine 1:1 (v:v) Mischung an nährstoffreichem Boden (GS90, Tantau, Wansdorf, Deutschland) und Quarzsand zubereitet. Töpfe (6 cm Durchmesser) werden mit diesem Gemisch gefüllt und in Wannen gestellt. In die Wannen wird Wasser gegeben, so dass das Bodengemisch eine angemessene Menge Wasser für das Säverfahren aufnehmen kann (Tag 1), und anschließend werden Samen von transgenen A. thaliana-Pflanzen und ihre Wildtypkontrollen in Töpfe gesät. Dann wird die gefüllte Wanne mit einem transparenten Deckel abgedeckt und in eine vorgekühlte (4°C–5°C) und abgedunkelte Wachstumskammer überführt. Die Stratifizierung wird über einen Zeitraum von 3 Tagen im Dunkeln bei 4°C–5°C oder alternativ für 4 Tage im Dunkeln bei 4°C etabliert. Die Keimung der Samen und das Wachstum wird bei Wachstumsbedingungen von 20°C, 60% relativer Feuchtigkeit, 16 h Photoperiode und Belichtung mit Fluoreszenzlicht bei 200 μmol/m²s oder alternativ dazu bei 220 μmol/m²s eingeleitet. Die Deckel werden 7–8 Tage nach der Aussaat abgenommen. Eine BASTA-Selektion kann am Tag 10 oder Tag 11 (9 oder 10 Tage nach der Aussaat) durch Besprühen der Töpfe mit den Pflänzchen von oben erfolgen. Im Standardexperiment wird eine 0,07%ige (v/v) Lösung von BASTA-Konzentrat (183 g/l Glufosinat-Ammonium) in Leitungswasser einmal versprüht oder alternativ dazu wird eine 0,02%ige (v/v) BASTA-Lösung dreimal versprüht. Die Wildtyp-Kontrollpflanzen werden nur mit Leitungswasser (anstelle von in Leitungswasser gelöstem BASTA) besprüht, aber ansonsten identisch behandelt. Die Pflanzen werden 13–14 Tage nach der Aussaat vereinzelt, indem die überschüssigen Keimlinge entfernt werden und ein Keimling im Boden belassen wird.
Die transgenen Ereignisse und die Wildtyp-Kontrollpflanzen werden gleichmäßig über die Kammer verteilt.
Die Wasserversorgung während des Experiments ist eingeschränkt, und die Pflanzen werden Zyklen von Dürre und einer erneuten Bewässerung ausgesetzt. Bewässert wird an Tag 1 (vor der Aussaat), Tag 14 oder Tag 15, Tag 21 oder Tag 22 und schließlich Tag 27 oder Tag 28.
Zu den sichtbaren Schädigungssymptomen gehören z. B. eines oder eine beliebige Kombination von zwei, drei oder mehreren der folgenden Merkmale:

a) Welken
b) Braunfärbung der Blätter
c) Abnahme des Turgordrucks, was ein Herunterhängen von Blättern bzw. Nadelstängeln und Blüten zur Folge hat,
d) Herunterhängen und/oder Abwerfen von Blättern oder Nadeln,
e) die Blätter sind grün, aber im Vergleich zu den Kontrollen leicht zum Boden hin abgewinkelt,
f) die Blattkanten haben begonnen, sich nach innen zu falten (einzudrehen),
g) vorzeitiges Abwerfen von Blättern oder Nadeln,
h) Verlust von Chlorophyll in den Blättern oder Nadeln und/oder Vergilbung.

Gemäß einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanzenzelle oder Pflanze oder eines Teils davon mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Toleranz gegenüber Dürre und/oder niedrigen Temperaturen und/oder einer erhöhten Effizienz der Nährstoffausnutzung, einem erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder einem erhöhten anderen Ertragsmerkmal, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, bei dem man

(a) die Aktivität eines wie in Tabelle II, Spalte 3 gezeigten Proteins, kodiert durch die wie in Tabelle I, Spalte 5 gezeigten Nukleinsäuresequenzen, in einer Pflanzenzelle oder Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt, und
(b) die Pflanzenzelle, eine Pflanze oder einen Teil davon unter Bedingungen heranzieht, die die Entwicklung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanze vom Wildtyp erlauben.

Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanzenzelle oder Pflanze oder eines Teils davon mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Toleranz gegenüber Dürre und/oder niedrigen Temperaturen und/oder einer erhöhten Effizienz der Nährstoffausnutzung, einem erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder einem erhöhten anderen Ertragsmerkmal, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, bei dem man

(a) eine oder mehrere Aktivitäten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Phosphoenolpyruvatcarboxylkinase, Arginin/Alanin-Aminopeptidase, D-Alanyl-D-alanincarboxypeptidase, Diacylglycerolpyrophosphatphosphatase, Dityrosintransporter, Farnesyldiphosphatfarnesyltransferase, NAD+-abhängiger Betainaldehyddehydrogenase, Serinhydrolase, dem an der Übertragung von Ketoconazolresistenz beteiligten transkriptionellen Regulator, Uridinkinase, dem yal043c-a-Protein, dem ybr071w-Protein und dem ydr445c-Protein in dem Plastid einer Pflanzenzelle erhöht oder erzeugt, und
(b) die Pflanzenzelle unter Bedingungen heranzieht, die die Entwicklung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Toleranz gegenüber Dürre und/oder niedrigen Temperaturen und/oder einer erhöhten Effizienz der Nährstoffausnutzung, einem erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder einem erhöhten anderen Ertragsmerkmal, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanze vom Wildtyp, erlauben.

(a) die Aktivität eines wie in Tabelle II, Spalte 3 gezeigten Proteins, kodiert durch die wie in Tabelle I, Spalte 5 oder 7 gezeigten Nukleinsäuresequenzen, im Plastid einer Pflanzenzelle erhöht oder erzeugt, und
(b) die Pflanzenzelle unter Bedingungen heranzieht, die die Entwicklung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Toleranz gegenüber Dürre und/oder niedrigen Temperaturen und/oder einer erhöhten Effizienz der Nährstoffausnutzung, einem erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder einem erhöhten anderen Ertragsmerkmal, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanze vom Wildtyp, erlauben.

Gemäß einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanzenzelle oder Pflanze oder eines Teils davon mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Toleranz gegenüber Dürre und/oder niedrigen Temperaturen und/oder einer erhöhten Effizienz der Nährstoffausnutzung, einem erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder einem erhöhten anderen Ertragsmerkmal, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, bei dem man

(a) eine oder mehrere Aktivitäten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Phosphoenolpyruvatcarboxylkinase, Arginin/Alanin-Aminopeptidase, D-Alanyl-D-alanincarboxypeptidase, Diacylglycerolpyrophosphatphosphatase, Dityrosintransporter, Farnesyldiphosphatfarnesyltransferase, NAD+-abhängiger Betainaldehyddehydrogenase, Serinhydrolase, dem an der Übertragung von Ketoconazolresistenz beteiligten transkriptionellen Regulator, Uridinkinase, dem yal043c-a-Protein, dem ybr071w-Protein und dem ydr445c-Protein in einer Organelle einer Pflanzenzelle erhöht oder erzeugt oder
(b) die Aktivität eines wie in Tabelle II, Spalte 3 gezeigten Proteins, kodiert durch die wie in Tabelle I, Spalte 5 oder 7 gezeigten Nukleinsäuresesequenzen, die mit einer Nukleinsäuresesequenz verbunden sind, die für ein Transitpeptid kodiert, in einer Pflanzenzelle erhöht oder erzeugt; oder
(c) die Aktivität eines wie in Tabelle II, Spalte 3 gezeigten Proteins, kodiert durch die wie in Tabelle I, Spalte 5 oder 7 gezeigten Nukleinsäuresesequenzen, die mit einer Nukleinsäuresesequenz verbunden sind, die für eine Chloroplastenlokalisierungssequenz kodiert, in einer Pflanzenzelle erhöht oder erzeugt, und
(d) die Pflanzenzelle unter Bedingungen heranzieht, die die Entwicklung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Toleranz gegenüber Dürre und/oder niedrigen Temperaturen und/oder einer erhöhten Effizienz der Nährstoffausnutzung, einem erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder einem erhöhten anderen Ertragsmerkmal, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nichttransformierten Pflanze vom Wildtyp, erlauben.

(a) die Aktivität eines wie in Tabelle II, Spalte 3 gezeigten Proteins, kodiert durch die wie in Tabelle I, Spalte 5 oder 7 gezeigten Nukleinsäuresesequenzen, in einer Organelle einer Pflanze durch die Transformation der Organelle erhöht oder erzeugt; oder
(b) die Aktivität eines wie in Tabelle II, Spalte 3 gezeigten Proteins, kodiert durch die wie in Tabelle I, Spalte 5 oder 7 gezeigten Nukleinsäuresesequenzen, im Plastid einer Pflanze durch die Transformation des Plastids erhöht oder erzeugt; und
(c) die Pflanzenzelle unter Bedingungen heranzieht, die die Entwicklung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Toleranz gegenüber Dürre und/oder niedrigen Temperaturen und/oder einer erhöhten Effizienz der Nährstoffausnutzung, einem erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder einem erhöhten anderen Ertragsmerkmal, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanze vom Wildtyp, erlauben.

Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung gemäß bevorzugten Ausführungsformen ein Verfahren zur Herstellung eines transgenen Pflanzenzellkerns; einer transgenen Pflanzenzelle; von einer Pflanze/Pflanzen, die eine(n) oder mehrere solcher transgenen Kerne oder Pflanzenzellen enthalten; von Nachkommenschaft, Samen und/oder Pollen, die aus einer solchen Pflanzenzelle und/oder solchen transgenen Pflanze(n) gewonnen wurden; die jeweils einen erhöhten Ertrag verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp zeigen, bereit, bei dem man eine oder mehrere Aktivitäten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Phosphoenolpyruvatcarboxylkinase, Arginin/Alanin-Aminopeptidase, D-Alanyl-D-alanincarboxypeptidase, Diacylglycerolpyrophosphatphosphatase, Dityrosintransporter, Farnesyldiphosphatfarnesyltransferase, NAD+-abhängiger Betainaldehyddehydrogenase, Serinhydrolase, dem an der Übertragung von Ketoconazolresistenz beteiligten transkriptionellen Regulator, Uridinkinase, dem yal043c-a-Protein, dem ybr071w-Protein und dem ydr445c-Protein erhöht oder erzeugt.
Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung einen transgenen Pflanzenzellkern; eine transgene Pflanzenzelle; eine Pflanze/Pflanzen, die eine(n) oder mehrere solcher transgenen Kerne oder Pflanzenzellen enthalten; Nachkommenschaft, Samen und/oder Pollen, die aus einer solchen Pflanzenzelle und/oder solchen transgenen Pflanze(n) gewonnen wurden; die jeweils einen erhöhten Ertrag verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp zeigen, durch Erhöhen oder Erzeugen einer oder mehrerer Aktivitäten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Phosphoenolpyruvatcarboxylkinase, Arginin/Alanin-Aminopeptidase, D-Alanyl-D-alanincarboxypeptidase, Diacylglycerolpyrophosphatphosphatase, Dityrosintransporter, Farnesyldiphosphatfarnesyltransferase, NAD+-abhängiger Betainaldehyddehydrogenase, Serinhydrolase, dem an der Übertragung von Ketoconazolresistenz beteiligten transkriptionellen Regulator, Uridinkinase, dem yal043c-a-Protein, dem ybr071w-Protein und dem ydr445c-Protein bereit.
Im Prinzip kann die für ein Transitpeptid kodierende Nukleinsäuresequenz aus einem beliebigen Organismus wie Mikroorganismen wie Algen oder Pflanzen, die Plastide, vorzugsweise Chloroplasten, enthalten, isoliert werden. Bei einem „Transitpeptid” handelt es sich um eine Aminosäuresequenz, deren kodierende Nukleinsäuresequenz zusammen mit dem entsprechenden Strukturgen translatiert wird. Dies bedeutet, dass das Transitpeptid ein integraler Teil des translatierten Proteins ist und eine aminoterminale Verlängerung des Proteins bildet. Beide werden als sogenanntes „Präprotein” translatiert. Im Allgemeinen wird das Transitpeptid während oder unmittelbar nach dem Importieren des Proteins in die korrekte Zellorganelle wie z. B. ein Plastid vom Präprotein abgespalten, wodurch man das reife Protein erhält. Das Transitpeptid sorgt für die korrekte Lokalisierung des reifen Proteins, indem es den Transport des Proteins durch intrazelluläre Membranen vermittelt. Bevorzugte für ein Transitpeptid kodierende Nukleinsäuresequenzen stammen aus einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein kodiert, welches letztlich im Plastid residiert und aus einem Organismus ausgewählt aus der aus den Gattungen
Acetabularia, Arabidopsis, Brassica, Capsicum, Chlamydomonas, Cururbita, Dunaliella, Euglena, Flaveria, Glycine, Helianthus, Hordeum, Lemna, Lolium, Lycopersion, Malus, Medicago, Mesembryanthemum, Nicotiana, Oenotherea, Oryza, Petunia, Phaseolus, Physcomitrella, Pinus, Pisum, Raphanus, Silene, Sinapis, Solanum, Spinacea, Stevia, Synechococcus, Triticum und Zea bestehenden Gruppe stammt.
Vorteilhaft sind solche Transitpeptide, die im erfindungsgemäßen Verfahren förderlich zur Anwendung gelangen, von einer Nukleinsäuresequenz abgeleitet, die für ein Protein, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
Ribulosebisphosphatcarboxylase/oxygenase, 5-Enolpyruvylshikimate-3-phosphatsynthase, Acetolactatsynthase, dem ribosomalen Chloroplastenprotein CS17, dem Cs-Protein, Ferredoxin, Plastocyanin, Ribulosebisphosphatcarboxylaseactivase, Tryptophansynthase, dem Acylträgerprotein, dem Chaperonin-60 aus Plastiden, Cytochrom c₅₅₂, dem 22-kDA Hitzeschockprotein, dem 33-kDa Oxygen-Evolving Enhancer Protein 1, der γ-Untereinheit von ATP-Synthase, der δ-Untereinheit von ATP-Synthase, dem chlorophyll-a/b-bindenden Protein II-1, dem Oxygen-Evolving Enhancer Protein 2, dem Oxygen-Evolving Enhancer Protein 3, dem Photosystem I: P21, dem Photosystem I: P28, dem Photosystem I: P30, dem Photosystem I: P35, dem Photosystem I: P37, Glycerin-3-phosphatacyltransferasen, dem chlorophyll-a/b-bindenden Protein, dem CAB2-Protein, Hydroxymethylbilansynthase, Pyruvatorthophosphatdikinase, dem CAB3-Protein, dem Ferritin aus Plastiden, Ferritin, dem Early Light-Inducible Protein, Glutamat-1-semialdehydaminotransferase, Protochlorophyllidreduktase, der stärkekorngebundenen Amylasesynthase, dem lichtsammelnden chlorophyll-a/b-bindenden Protein des Photosystems II, dem Majorpollenallergen Lol p 5a, der ClpB ATP-abhängigen Protease aus Plastiden, Superoxiddismutase, Ferredoxin-NADP-oxidoreduktase, dem 28-kDa Ribonukleoprotein, dem 31-kDa Ribonukleoprotein, dem 33-kDa Ribonukleoprotein, Acetolactatsynthase, der CF₀-Untereinheit 1 der ATP-Synthase, der CF₀-Untereinheit 2 der ATP-Synthase, der CF-Untereinheit 3 der ATP-Synthase, der CF-Untereinheit 4 der ATP-Synthase, Cytochrom f, ADP-Glucosepyrophosphorylase, Glutaminsynthase, Glutaminsynthase 2, Carboanhydrase, dem GapA-Protein, dem Hitzeschockprotein hsp21, dem Phosphattranslokator, der ClpA ATP-abhängigen Protease aus Plastiden, dem ribosomalen Protein CL24 aus Plastiden, dem ribosomalen Protein CL9 aus Plastiden, dem ribosomalen Protein PsCL18 aus Plastiden, dem ribosomalen Protein PsCL25 aus Plastiden, DAHP-Synthase, Stärkephosphorylase, dem Acylträgerprotein II aus Wurzeln, Betainaldehyddehydrogenase, dem GapB-Protein, Glutaminsynthetase 2, Phosphoribulokinase, Nitritreduktase, dem ribosomalen Protein L12, dem ribosomalen Protein L13, dem ribosomalen Protein L21, dem ribosomalen Protein L35, dem ribosomalen Protein L40, dem Triosephosphat-3-phosphoglyeratphosphattranslokator, der ferredoxinabhängigen Glutamatsynthase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, der NADP-abhängigen Malatdecarboxylase und NADP-Malatdehydrogenase, kodiert.
Besonders bevorzugt leitet sich die für ein Transitpeptid kodierende Nukleinsäuresequenz von einer Nukleinsäuresequenz ab, die für ein Protein kodiert, das letztlich im Plastid residiert und aus einem Organismus, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Spezies:
Acetabularia mediterranes, Arabidopsis thaliana, Brassica campestris, Brassica napus, Capsicum annuum, Chlamydomonas reinhardtii, Cururbita moschata, Dunaliella salina, Dunaliella tertiolecta, Euglena gracilis, Flaveria trinervia, Glycine max, Helianthus annuus, Hordeum vulgare, Lemna gibba, Lolium perenne, Lycopersion esculentum, Malus domestica, Medicago falcata, Medicago sativa, Mesembryanthemum crystallinum, Nicotiana plumbaginifolia, Nicotiana sylvestris, Nicotiana tabacum, Oenotherea hookeri, Oryza sativa, Petunia hybrida, Phaseolus vulgaris, Physcomitrella patens, Pinus tunbergii, Pisum sativum, Raphanus sativus, Silene pratensis, Sinapis alba, Solanum tuberosum, Spinacea oleracea, Stevia rebaudiana, Synechococcus, Synechocystis, Triticum aestivum und Zea mays stammt.
Noch mehr bevorzugte Nukleinsäuresequenzen sind die für die von Heijne et al. [Plant Molecular Biology Reporter, Band 9 (2), 1991: 104–126] offenbarten Transitpeptide kodierenden, die hiermit durch Verweis Bestandteil der vorliegenden Erfindung werden. In Tabelle V sind einige Beispiele für die von Heijne et al. offenbarten Transitpeptidsequenzen gezeigt. Gemäß der Offenbarung der Erfindung, insbesondere in den Beispielen, ist es dem Fachmann möglich, andere von Heijne et al. offenbarte Nukleinsäuresequenzen mit den in Tabelle I, Spalte 5 und 7 gezeigten Nukleinsäuresequenzen in Verbindung zu setzen. Die am meisten bevorzugten für Transitpeptide kodierenden Nukleinsäuresequenzen leiten sich von der Gattung Spinacia ab, wie das Chlorplast 30S-ribosomale Protein PSrp-1, das Acylträgerprotein II aus Wurzeln, das Acylträgerprotein, die γ-Untereinheit der ATP-Synthase, die δ-Untereinheit der ATP-Synthese, Cytochrom f, Ferredoxin I, Ferredoxin-NADP-oxidoreduktase (= FNR), Nitritreduktase, Phosphoribulokinase, Plastocyanin oder Carboanhydrase. Dem Fachmann wird bewusst sein, dass sich verschiedene andere für Transitproteine kodierende Nukleinsäuresequenzen leicht aus in Plastiden befindlichen Proteinen, die als Vorstufen von nuklearen Genen exprimiert werden und dann in die Plastide wandern, isolieren lassen. Solche für Transitproteine kodierende Sequenzen lassen sich für die Konstruktion anderer Expressionskonstrukte verwenden. Die im erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhaft verwendeten Transitpeptide, die zu den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen und Proteinen zählen, haben typischerweise eine Länge von 20 bis 120 Aminosäuren, vorzugsweise 25 bis 110, 30 bis 100 oder 35 bis 90 Aminosäuren, besonders bevorzugt 40 bis 85 Aminosäuren und ganz besonders bevorzugt 45 bis 80 Aminosäuren und wirken posttranslational, indem sie das Protein zum Plastid, vorzugsweise dem Chloroplast, dirigieren. Die für solche Transitpeptide kodierenden Nukleinsäuresequenzen befinden sich upstream von der Nukleinsäuresequenz, die für das reife Protein kodiert. Für die korrekte molekulare Anbindung der für das Transitpeptid kodierenden Nukleinsäure an die für das Targetprotein kodierende Nukleinsäure ist es manchmal erforderlich, zusätzliche Basenpaare an der benachbarten Position einzuführen, die Sequenzen bilden, die von Restriktionsenzymen erkannt werden, was für die molekulare Anbindung der verschiedenen Nukleinsäuremoleküle von Nutzen ist. Diese Vorgehensweise kann dazu führen, dass am N-Terminus des reifen importierten Proteins einige wenige zusätzliche Aminosäuren vorhanden sind, die gewöhnlich und vorzugsweise die Funktion des Proteins nicht beeinträchtigen. In jedem Fall sind die zusätzlichen Basenpaare an der angrenzenden Position, die Sequenzen bilden, die von Restriktionsenzymen erkannt werden, mit Vorsicht auszuwählen, um die Bildung von Stoppkodons oder Kodons, die für Aminosäuren mit einem starken Einfluss auf die Proteinfaltung wie z. B. Prolin, kodieren, zu vermeiden. Vorzugsweise kodieren diese zusätzlichen Kodons für kleine, strukturell flexible Aminosäuren wie Glycin oder Alanin.
Wie oben erwähnt können die für die wie in Tabelle II, Spalte 3 gezeigten Proteine und ihre wie in Tabelle I, Spalte 5 und 7 offenbarten Homologa kodierenden Nukleinsäuresequenzen mit einer Nukleinsäuresequenz verbunden werden, die für ein Transitpeptid kodiert. Diese für ein Transitpeptid kodierende Nukleinsäuresequenz sorgt für den Transport des Proteins zum Plastid. Die Nukleinsäuresequenz des zu exprimierenden Gens und die für das Transitpeptid kodierende Nukleinsäuresequenz sind operativ miteinander verbunden. Das Transitpeptid ist daher im Leserahmen an die für die wie in Tabelle II, Spalte 3 gezeigten Proteine und ihre wie in Tabelle I, Spalte 5 und 7 offenbarten Homologa kodierende Nukleinsäuresequenz kondensiert.
Erfindungsgemäß steht der Begriff „Organelle” zum Beispiel für „Mitochondrien” oder vorzugsweise „Plastid” (in der gesamten Erfindung schließt der Plural den Singular mit ein und umgekehrt). Erfindungsgemäß soll der Begriff „Plastid” verschiedene Formen an Plastiden mit umfassen, einschließlich Proplastiden, Chloroplasten, Chromoplasten, Gerontoplasten, Leukoplasten, Amyloplasten, Elaioplasten und Etioplasten, vorzugsweise Chloroplasten. Alle haben als gemeinsamen Vorfahren die obenerwähnten Proplasten.
Andere Transitpeptide wurden von Schmidt et al. [J. Biol. Chem., Band 268, Nr. 36, 1993: 27447–27457], Della-Cioppa et al. [Plant. Physiol. 84, 1987: 965–968], de Castro Silva Filho et al. [Plant Mol. Biol., 30, 1996: 769–780], Zhao et al. [J. Biol. Chem. Band 270, Nr. 11, 1995: 6081–6087], Römer et al. [Biochem. Biophys. Res. Commun., Band 196, Nr. 3, 1993: 1414–1421], Keegstra et al. [Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 40, 1989: 471–501], Lubben et al. [Photosynthesis Res., 17, 1988: 173–194] und Lawrence et al. [J. Biol. Chem., Band 272, Nr. 33, 1997: 20357–20363] offenbart. Ein allgemeiner Übersichtsartikel über Targeting wurde von Kermode Allison R. in Critical Reviews in Plant Science 15 (4): 285–423 (1996) unter dem Titel „Mechanisms of Intracellular Protein Transport and Targeting in Plant Cells" veröffentlicht.
Bevorzugte Transitpeptidsequenzen, die beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Anwendung kommen und die zu den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen zählen, sind im Allgemeinen reich an hydroxylierten Aminosäureresten (Serin und Threonin), wobei diese beiden Reste im Allgemeinen 20–35% des Ganzen ausmachen. Sie haben häufig eine aminoterminale Region ohne Gly und Pro und ohne geladene Reste. Weiterhin weisen sie eine Reihe kleiner hydrophober Aminosäuren wie Valin und Alanin auf, und im Allgemeinen fehlen saure Aminosäuren. Darüber hinaus haben sie im Allgemeinen eine mittlere Region, die reich an Ser, Thr, Lys und Arg ist. Insgesamt haben sie sehr häufig eine positive Nettoladung.
Alternativ dazu können für die Transitpeptide kodierende Nukleinsäuresequenzen entweder teilweise oder ganz chemisch synthetisiert werden, gemäß der Struktur von im Stand der Technik offenbarten Transitpeptidsequenzen. Diese natürlichen oder chemisch synthetisierten Sequenzen können direkt oder über eine Linker-Nukleinsäuresequenz, die typischerweise eine Länge von weniger als 500 Basenpaaren, vorzugsweise weniger als 450, 400, 350, 300, 250 oder 200 Basenpaaren, besonders bevorzugt weniger als 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40 oder 30 Basenpaaren und ganz besonders bevorzugt weniger als 25, 20, 15, 12, 9, 6 oder 3 Basenpaaren aufweist und sich im Leserahmen mit der kodierenden Sequenz befindet, an die für das reife Protein kodierenden Sequenzen gebunden werden. Weiterhin bevorzugte, für Transitpeptide kodierende Nukleinsäuresequenzen können Sequenzen umfassen, die aus mehr als einer biologischen und/oder chemischen Quelle stammen, und können eine Nukleinsäuresequenz einschließen, die sich von der aminoterminalen Region des reifen Proteins ableitet, das in seinem nativen Zustand an das Transitpeptid gebunden ist. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung hat diese aminoterminale Region des reifen Proteins typischerweise eine Länge von weniger als 150 Aminosäuren, vorzugsweise weniger als 140, 130, 120, 110, 100 oder 90 Aminosäuren, besonders bevorzugt weniger als 80, 70, 60, 50, 40, 35, 30, 25 oder 20 Aminosäuren und ganz besonders bevorzugt weniger als 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 oder 10 Aminosäuren. Es sind jedoch auch noch kürzere oder längere Abschnitte möglich. Darüber hinaus können auch Targetsequenzen, die den Transport von Proteinen zu anderen Zellkompartimenten wie der Vakuole, dem endoplasmischen Retikulum, dem Golgi-Komplex, Glyoxysomen, Peroxisomen oder Mitochondrien vermitteln, Teil der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz sein. Bei den aus diesen erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen translatierten Proteinen handelt es sich um eine Art von Fusionsproteinen, was bedeutet, dass die Nukleinsäuresequenzen, die für das Transitpeptid, zum Beispiel eines der in Tabelle V gezeigten, vorzugsweise das letzte der Tabelle, kodieren, mit den in Tabelle I, Spalte 5 und 7 gezeigten Nukleinsäuresequenzen verbunden sind. Dem Fachmann ist es möglich, diese Sequenzen funktionell zu verbinden. Vorteilhafterweise wird der Transitpeptidteil während des Transports, vorzugsweise in die Plastiden, von dem in Tabelle II, Spalte 5 und 7 gezeigten Teil des Proteins abgespalten. Alle der in der letzten Zeile der Tabelle V gezeigten Produkte der Spaltung des bevorzugten Transitpeptids haben vorzugsweise die N-terminalen Aminosäuresequenzen QIA CSS oder QIA EFQLTT vor dem Start-Methionin des in Tabelle II, Spalte 5 und 7 erwähnten Proteins. Es können sich auch andere kurze Aminosäuresequenzen mit einem Bereich von 1 bis 20 Aminosäuren, vorzugsweise 2 bis 15 Aminosäuren, besonders bevorzugt 3 bis 10 Aminosäuren, ganz besonders bevorzugt 4 bis 8 Aminosäuren, vor dem Start-Methionin des in Tabelle II, Spalte 5 und 7 erwähnten Proteins befinden. Bei der Aminosäuresequenz QIA CSS stammen die drei Aminosäuren vor dem Start-Methionin aus der LIC-Kassette (LIC = ligatation independent cloning). Diese kurze Aminosäuresequenz wird für die Expression von E. coli-Genen bevorzugt. Bei der Aminosäuresequenz QIA EFQLTT stammen die sechs Aminosäuren vor dem Start-Methionin aus der LIC-Kassette. Diese kurze Aminosäuresequenz wird für die Expression von S. cerevisiae-Genen bevorzugt. Dem Fachmann ist bekannt, dass sich auch andere kurze Sequenzen für die Expression der in Tabelle I, Spalte 5 und 7 erwähnten Gene eignen. Weiterhin ist sich der Fachmann der Tatsache bewusst, dass es bei der Expression der Gene dieser kurzen Sequenzen nicht bedarf.
Tabelle V: Beispiele für von Heijne et al. offenbarte Transitpeptide
Alternativ zum Targeting der in Tabelle II, Spalte 5 und 7 gezeigten Sequenzen, vorzugsweise von Sequenzen, die allgemein im Kern kodiert sind mit Hilfe der zum Beispiel in Tabelle V erwähnten Targetingsequenzen alleine oder in Kombination mit anderen Targetingsequenzen, vorzugsweise in die Plastide, können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren direkt in das Plastidgenom eingeführt werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform. werden die in Tabelle I, Spalte 5 und 7 gezeigten Nukleinsäuresequenzen daher direkt in Plastide eingeführt und dort exprimiert.
Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung bedeutet der Begriff „eingeführt” das Einführen einer Nukleinsäuresequenz in den Organismus mittels einer „Transfektion”, „Transduktion” oder vorzugsweise durch „Transformation”.
Ein Plastid wie z. B. ein Chloroplast wurde durch eine exogene (vorzugsweise fremde) Nukleinsäuresequenz „transformiert”, wenn die Nukleinsäuresequenz in das Plastid eingeführt wurde, was bedeutet, dass diese Sequenz die Membran bzw. die Membranen des Plastids durchdrungen hat. Die fremde DNA kann in die das Genom des Plastids bildende Plastid-DNA integriert sein (kovalent damit verbunden sein) oder nicht integriert bleiben (z. B. indem sie einen Chloroplasten-Replikationsursprung einschließen). „Stabil” integrierte DNA-Sequenzen sind die, die über Plastidreplikation weitervererbt werden, wodurch neue Plastide mit den Merkmalen der integrierten DNA-Sequenz an die Nachkommenschaft weitergegeben werden.
Für die Expression ist der Fachmann mit verschiedenen Methoden zur Einführung der Nukleinsäuresequenzen in verschiedene Organellen wie die bevorzugten Plastide vertraut. Solche Methoden wurden zum Beispiel von Pal Maiga (Annu. Rev. Plant Biol., 2004, 55: 289–313), Thomas Evans ( WO 2004/040973 ), Kevin E. McBride et al. ( US 5,455,818 ), Henry Daniell et al. ( US 5,932,479 und US 5,693,507 ) und Jeffrey M. Straub et al. ( US 6,781,033 ) offenbart. Eine bevorzugte Methode ist die Transformation von aus Mikrosporen gewonnenem Hypokotyl- oder Kotyledongewebe (die grün sind und zahlreiche Plastide enthalten) Blattgewebe und die anschließende Regeneration von Sprossen aus diesem transformierten Pflanzenmaterial auf einem selektiven Medium. Als Methoden zur Transformation sind die Bombardierung des Pflanzenmaterials oder der Einsatz von unabhängig replizierenden Shuttle-Vektoren dem Fachmann gut bekannt. Eine durch PEG vermittelte Transformation der Plastide oder eine Agrobacterium-Transformation mit binären Vektoren ist jedoch ebenfalls möglich. Nützliche Marker für die Transformation von Plastiden sind positive Selektionsmarker, zum Beispiel die Gene für Chloramphenicol-, Streptomycin-, Kanamycin-, Neomycin-, Amikamycin-, Spectinomycin-, Triazin- und/oder Lincomycinresistenz. Für eine weitere Selektion eignen sich als zusätzliche Marker in der Literatur häufig als sekundäre Marker angeführte Gene, die für eine Resistenz gegen Herbizide wie Phosphinothricin (= Glufosinat, BASTA^TM, Liberty^TM, kodiert durch das bar-Gen), Glyphosat (= N-(Phosphonomethyl)glycin, Roundup Ready^TM, kodiert durch das 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthasegen = epsps), Sulfonylharnstoff (= Staple, kodiert durch das Acetolactatsynthasegen), Imidazolinon [= IMI, Imazethapyr, Imazamox, Clearfield^TM, kodiert durch das Acetohydroxysäuresynthasegen (AHAS-Gen), das auch als Acetolactatsynthasegen (ALS-Gen) bekannt ist], oder Bromoxynil (= Buctril^TM, kodiert durch das oxy-Gen) kodieren, oder Gene, die für Antibiotika wie Hygromycin oder G418 kodieren. Solche sekundären Marker eignen sich in den Fällen, bei denen die meisten Genomkopien transformiert sind. Darüber hinaus sind auch negative Selektionsmarker wie die bakterielle Cytosindeaminase (kodiert durch das codA-Gen) für die Transformation von Plastiden geeignet.
Um die Möglichkeiten zur Identifizierung von Transformanten zu erhöhen, ist es außerdem wünschenswert, Reportergene zu verwenden, bei denen es sich nicht um die obenerwähnten Resistenzgene handelt, oder diese zusätzlich zu diesen Genen zu verwenden. Reportergene sind zum Beispiel die Gene für β-Galactosidase, β-Glucuronidase (GUS), alkalische Phosphatase und/oder für das grün fluoreszierende Protein (green-fluorescent protein, GFP).
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es von großem Vorteil, dass durch die Transformierung der Plastide der spezifische Transgenfluss zwischen Arten blockiert ist, da viele Arten wie Mais, Baumwolle und Reis eine streng maternale Vererbung von Plastiden aufweisen. Dadurch, dass man die in Tabelle I, Spalte 5 und 7 angeführten Gene oder aktive Fragmente davon in die Plastide von Pflanzen gibt, kommen diese Gene nicht in den Pollen dieser Pflanzen vor.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung von sogenannten „Chloroplastlokalisierungssequenzen”, bei denen eine erste RNA-Sequenz bzw. ein erstes RNA-Molekül dazu fähig ist, eine zweite RNA-Sequenz wie z. B. eine von den in Tabelle I, Spalte 5 und 7 gezeigten Sequenzen transkribierte RNA-Sequenz oder eine für ein wie in Tabelle II, Spalte 5 und 7 gezeigtes Protein kodierende Sequenz von einer externen Umgebung in eine Zelle oder von außerhalb eines Plastids in einen Chloroplast zu transportieren bzw. zu begleiten (”chaperoning”). Gemäß einer Ausführungsform ist das Chloroplastlokalisierungssignal im Wesentlichen ähnlich oder komplementär zu einer vollständigen bzw. intakten Viroidsequenz. Das Chloroplastlokalisierungssignal kann durch eine DNA-Sequenz kodiert sein, die in die Chloroplastlokalisierung-RNA transkribiert wird. Der Begriff „Viroid” bezieht sich auf ein natürlich vorkommendes einzelsträngiges RNA-Molekül (Flores, C R Acad Sci III. 2001 Okt; 324(10): 943–52). Viroide enthalten in der Regel etwa 200–500 Nukleotide und liegen im Allgemeinen als kreisförmige Moleküle vor. Beispiele für Viroide, die Chloroplastlokalisierungssignale enthalten, schließen ASBVd, PLMVd, CChMVd und ELVd ein, sind jedoch nicht hierauf beschränkt. Die Viroidsequenz oder ein funktioneller Teil davon kann so mit den in Tabelle I, Spalte 5 und 7 gezeigten Sequenzen oder einer für ein wie in Tabelle II, Spalte 5 und 7 gezeigtes Protein kodierenden Sequenz kondensiert sein, dass die Viroidsequenz eine aus einer der wie in Tabelle I, Spalte 5 und 7 gezeigten Sequenzen oder einer für ein wie in Tabelle II, Spalte 5 und 7 gezeigtes Protein kodierenden Sequenz transkribierte Sequenz in die Chloroplasten transportiert. Bei einer bevorzugten Ausführungsform verwendet man ein modifiziertes ASBVd (Navarro et al., Virology. 1. März 2000; 268(1): 218–25).
Gemäß einer weiteren besonderen Ausführungsform wird das in den Plastiden zu exprimierende Protein, wie z. B. eines der in Tabelle II, Spalte 5 und 7 gezeigten Proteine, durch verschiedene Nukleinsäuren kodiert. Eine solche Methode ist in WO 2004/040973 , die hiermit durch Verweis Bestandteil der vorliegenden Anmeldung wird, offenbart. WO 2004/040973 lehrt eine Methode, die die Translokation einer einem Gen oder Genfragment entsprechenden RNA in das Chloroplast mittels einer Chloroplastlokalisierungssequenz betrifft. Die Gene, die in der Pflanze oder den Pflanzenzellen exprimiert werden sollen, werden in Nukleinsäurefragmente gespalten, die in verschiedene Kompartimente in der Pflanze, z. B. den Kern, die Plastiden und/oder die Mitochondrien, eingeführt werden. Zusätzlich werden Pflanzenzellen beschrieben, bei denen der Chloroplast ein Ribozym enthält, das an einem Ende mit einer RNA fusioniert ist, die für ein Fragment eines im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Proteins kodiert, so dass das Ribozym die translozierte Fusions-RNA zu der für das Genfragment kodierenden RNA trans-spleißen kann, zur Bildung und je nach Fall Wiedervereinigung der Nukleinsäurefragmente zu einer intakten, für ein funktionelles, zum Beispiel wie in Tabelle II, Spalte 5 und 7 offenbartes Protein kodierenden mRNA.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die wie in Tabelle I, Spalte 5 und 7 gezeigten, im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Nukleinsäuresequenzen in Plastide transformiert, die metabolisch aktiv sind. Diese Plastide sollten vorzugsweise in der betreffenden Pflanze bzw. im betreffenden Pflanzengewebe, ganz besonders bevorzugt in den in grünem Pflanzengewebe wie Blättern oder Kotyledonen oder in Samen anzutreffenden Chloroplasten, eine hohe Kopienzahl aufrechterhalten.
Um eine gute Expression in den Plastiden zu erzielen, werden die wie in Tabelle I, Spalte 5 und 7 gezeigten Nukleinsäuresequenzen vorzugsweise unter Verwendung eines Promotors und eines Terminators, die in Plastiden aktiv sind, bevorzugt eines Chloroplastenpromotors, in eine Expressionskassette eingeführt. Beispiele für solche Promotoren schließen den psbA-Promotor aus dem Gen von Spinat oder Erbse, den rbcL-Promotor und den atpB-Promotor aus Mais ein.
Für die Zwecke der Beschreibung der vorliegenden Erfindung sind die Begriffe „zytoplasmatisch” und „nicht gezielt” austauschbar und sollen bedeuten, dass die erfindungsgemäße Nukleinsäure ohne Zusatz einer nicht-natürlichen, für ein Transitpeptid kodierenden Sequenz exprimiert wird. Eine nicht-natürliche, für ein Transitpeptid kodierende Sequenz ist eine Sequenz, die nicht ein natürlicher Teil der erfindungsgemäßen Nukleinsäure, z. B. der in Tabelle I Spalte 5 oder 7 gezeigten Nukleinsäuren, ist, sondern vielmehr durch Schritte molekularer Manipulation wie zum Beispiel in den Beispielen unter „plastid targeted expression” beschrieben angefügt wurde. Die Begriffe „zytoplasmatisch” und „nicht gezielt” sollen daher eine gezielte Lokalisation in einem Zellkompartiment für die Produkte der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen aufgrund der Eigenschaften ihrer natürlich vorkommenden Sequenz vor dem Hintergrund des transgenen Organismus nicht ausschließen. Die subzelluläre Lokation des von den angefügten Sequenzen abgeleiteten reifen Polypeptids lässt sich von einem Fachman für den Organismus (die Pflanze) unter Anwendung von Softwareprogrammen wie TargetP (Emanuelsson et al., (2000), Predicting subcellular localization of Proteins based an their N-terminal amino acid sequence., J. Mol. Biol. 300, 1005–1016.), ChloroP (Emanuelsson et al. (1999), ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites., Protein Science, 8: 978–984) oder anderen prädiktiven Softwareprogrammen (Emanuelsson et al. (2007), Locating Proteins in the cell using TargetP, Signale, and related tools., Nature Protocols 2, 953–971) vorhersagen.
Umfasst/umfassend und grammatikalische Variationen davon sind, wenn sie in der vorliegenden Beschreibung verwendet werden, so zu verstehen, dass sie das Vorhandensein von angegebenen Merkmalen, Integern, Schritten oder Komponenten oder Gruppen davon spezifizieren, jedoch das Vorhandensein oder den Zusatz eines oder mehrerer anderer Merkmale, Integer, Schritte, Komponenten oder Gruppen davon nicht ausschließen.
Gemäß der Erfindung bezieht sich der Begriff „Pflanzenzelle” bzw. der Begriff „Organismus”, so wie er hier verstanden wird, immer auf eine Pflanzenzelle oder eine Organelle davon, vorzugsweise ein Plastid, besonders bevorzugt einen Chloroplasten.
So, wie der Begriff hier verwendet wird, soll „Pflanze” nicht nur eine ganze Pflanze sondern auch Teile davon einschließen, d. h. eine oder mehrere Zellen und Gewebe einschließlich zum Beispiel Blättern, Stängeln, Sprossen, Wurzeln, Blüten, Früchten und Samen.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass die transgene Expression des wie in Tabelle II, Spalte 3 gezeigten Saccaromyces cerevisiae-Proteins und/oder die transgene Expression des wie in Tabelle II, Spalte 3 gezeigten E. coli-Proteins in einer Pflanze wie zum Beispiel Arabidopsis thaliana transgen eine Pflanzenzelle, eine Pflanze oder einen Teil davon mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verlieh.
Dementsprechend wird gemäß einer Ausführungsform, wenn man die Aktivität des Escherichia coli-Nukleinsäuremoleküls oder eines die Nukleinsäure SEQ ID NO.: 63 beziehungsweise das Polypeptid SEQ ID NO.: 64 umfassenden Polypeptids erhöht oder erzeugt, z. B. wenn man die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, in jeweils der gleichen Zeile wie SEQ ID NO.: 63 beziehungsweise SEQ ID NO.: 64 gezeigt umfasst, erhöht oder erzeugt, oder wenn man die Aktivität „NAD+-abhängige Betainaldehyddehydrogenase” in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt, ein erhöhter Ertrag, vorzugsweise hinsichtlich wenigstens eines Ertragsmerkmals, bevorzugt hinsichtlich Toleranz und/oder Resistenz gegenüber Umweltstress, und eine erhöhte Biomasseproduktion verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon verliehen. Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung plastidisch.
Dementsprechend wird gemäß einer Ausführungsform, wenn man die Aktivität des Escherichia coli-Nukleinsäuremoleküls oder eines die Nukleinsäure SEQ ID NO.: 623 beziehungsweise das Polypeptid SEQ ID NO.: 624 umfassenden Polypeptids erhöht oder erzeugt, z. B. wenn man die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, 11 oder IV, Spalte 7, in jeweils der gleichen Zeile wie SEQ ID NO.: 623 beziehungsweise SEQ ID NO.: 624 gezeigt umfasst, erhöht oder erzeugt, oder wenn man die Aktivität „D-Alanyl-D-alanincarboxypeptidase” in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt, ein erhöhter Ertrag, vorzugsweise hinsichtlich wenigstens eines Ertragsmerkmals, bevorzugt hinsichtlich Toleranz und/oder Resistenz gegenüber Umweltstress, und eine erhöhte Biomasseproduktion verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon verliehen. Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung zytoplasmatisch.
Dementsprechend wird gemäß einer Ausführungsform, wenn man die Aktivität des Saccharomyces cerevisiae-Nukleinsäuremoleküls oder eines die Nukleinsäure SEQ ID NO.: 724 beziehungsweise das Polypeptid SEQ ID NO.: 725 umfassenden Polypeptids erhöht oder erzeugt, z. B. wenn man die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, in jeweils der gleichen Zelle wie SEQ ID NO.: 724 beziehungsweise SEQ ID NO.: 725 gezeigt umfasst, erhöht oder erzeugt, oder wenn man die Aktivität „yal043c-a-Protein” in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt, ein erhöhter Ertrag, vorzugsweise hinsichtlich wenigstens eines Ertragsmerkmals, bevorzugt hinsichtlich Toleranz und/oder Resistenz gegenüber Umweltstress, und eine erhöhte Biomasseproduktion verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon verliehen. Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung zytoplasmatisch.
Dementsprechend wird gemäß einer Ausführungsform, wenn man die Aktivität des Saccharomyces cerevisiae-Nukleinsäuremoleküls oder eines die Nukleinsäure SEQ ID NO.: 728 beziehungsweise das Polypeptid SEQ ID NO.: 729 umfassenden Polypeptids erhöht oder erzeugt, z. B. wenn man die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, in jeweils der gleichen Zeile wie SEQ ID NO.: 728 beziehungsweise SEQ ID NO.: 729 gezeigt umfasst, erhöht oder erzeugt, oder wenn man die Aktivität „ybr071w-Protein” in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt, ein erhöhter Ertrag, vorzugsweise hinsichtlich wenigstens eines Ertragsmerkmals, bevorzugt hinsichtlich Toleranz und/oder Resistenz gegenüber Umweltstress, und eine erhöhte Biomasseproduktion verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon verliehen. Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung plastidisch.
Dementsprechend wird gemäß einer Ausführungsform, wenn man die Aktivität des Saccharomyces cerevisiae-Nukleinsäuremoleküls oder eines die Nukleinsäure SEQ ID NO.: 732 beziehungsweise das Polypeptid SEQ ID NO.: 733 umfassenden Polypeptids erhöht oder erzeugt, z. B. wenn man die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, in jeweils der gleichen Zeile wie SEQ ID NO.: 732 beziehungsweise SEQ ID NO.: 733 gezeigt umfasst, erhöht oder erzeugt, oder wenn man die Aktivität „Dityrosintransporter„ in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt, ein erhöhter Ertrag, vorzugsweise hinsichtlich wenigstens eines Ertragsmerkmals, bevorzugt hinsichtlich Toleranz und/oder Resistenz gegenüber Umweltstress, und eine erhöhte Biomasseproduktion verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon verliehen. Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung zytoplasmatisch.
Dementsprechend wird gemäß einer Ausführungsform, wenn man die Aktivität des Saccharomyces cerevisiae-Nukleinsäuremoleküls oder eines die Nukleinsäure SEQ ID NO.: 764 beziehungsweise das Polypeptid SEQ ID NO.: 765 umfassenden Polypeptids erhöht oder erzeugt, z. B. wenn man die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, in jeweils der gleichen Zeile wie SEQ ID NO.: 764 beziehungsweise SEQ ID NO.: 765 gezeigt umfasst, erhöht oder erzeugt, oder wenn man die Aktivität „Diacylglycerolpyrophosphatphosphatase” in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt, ein erhöhter Ertrag, vorzugsweise hinsichtlich wenigstens eines Ertragsmerkmals, bevorzugt hinsichtlich Toleranz und/oder Resistenz gegenüber Umweltstress, und eine erhöhte Biomasseproduktion verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon verliehen. Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung zytoplasmatisch.
Dementsprechend wird gemäß einer Ausführungsform, wenn man die Aktivität des Saccharomyces cerevisiae-Nukleinsäuremoleküls oder eines die Nukleinsäure SEQ ID NO.: 814 beziehungsweise das Polypeptid SEQ ID NO.: 815 umfassenden Polypeptids erhöht oder erzeugt, z. B. wenn man die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, in jeweils der gleichen Zeile wie SEQ ID NO.: 814 beziehungsweise SEQ ID NO.: 815 gezeigt umfasst, erhöht oder erzeugt, oder wenn man die Aktivität „ydr445c-Protein” in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt, ein erhöhter Ertrag, vorzugsweise hinsichtlich wenigstens eines Ertragsmerkmals, bevorzugt hinsichtlich Toleranz und/oder Resistenz gegenüber Umweltstress, und eine erhöhte Biomasseproduktion verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon verliehen. Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung zytoplasmatisch.
Dementsprechend wird gemäß einer Ausführungsform, wenn man die Aktivität des Saccharomyces cerevisiae-Nukleinsäuremoleküls oder eines die Nukleinsäure SEQ ID NO.: 818 beziehungsweise das Polypeptid SEQ ID NO.: 819 umfassenden Polypeptids erhöht oder erzeugt, z. B. wenn man die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, in jeweils der gleichen Zeile wie SEQ ID NO.: 818 beziehungsweise SEQ ID NO.: 819 gezeigt umfasst, erhöht oder erzeugt, oder wenn man die Aktivität „Arginin-/Alaninaminopeptidase” in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt, ein erhöhter Ertrag, vorzugsweise hinsichtlich wenigstens eines Ertragsmerkmals, bevorzugt hinsichtlich Toleranz und/oder Resistenz gegenüber Umweltstress, und eine erhöhte Biomasseproduktion verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon verliehen. Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung zytoplasmatisch.
Dementsprechend wird gemäß einer Ausführungsform, wenn man die Aktivität des Saccharomyces cerevisiae-Nukleinsäuremoleküls oder eines die Nukleinsäure SEQ ID NO.: 925 beziehungsweise das Polypeptid SEQ ID NO.: 926 umfassenden Polypeptids erhöht oder erzeugt, z. B. wenn man die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, in jeweils der gleichen Zeile wie SEQ ID NO.: 925 beziehungsweise SEQ ID NO.: 926 gezeigt umfasst, erhöht oder erzeugt, oder wenn man die Aktivität Farnesyldiphosphatfarnesyltransferase” in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt, ein erhöhter Ertrag, vorzugsweise hinsichtlich wenigstens eines Ertragsmerkmals, bevorzugt hinsichtlich Toleranz und/oder Resistenz gegenüber Umweltstress, und eine erhöhte Biomasseproduktion verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon verliehen. Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung plastidisch.
Dementsprechend wird gemäß einer Ausführungsform, wenn man die Aktivität des Saccharomyces cerevisiae-Nukleinsäuremoleküls oder eines die Nukleinsäure SEQ ID NO.: 1021 beziehungsweise das Polypeptid SEQ ID NO.: 1022 umfassenden Polypeptids erhöht oder erzeugt, z. B. wenn man die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, in jeweils der gleichen Zeile wie SEQ ID NO.: 1021 beziehungsweise SEQ ID NO.: 1022 gezeigt umfasst, erhöht oder erzeugt, oder wenn man die Aktivität „Serinhydrolase” in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt, ein erhöhter Ertrag, vorzugsweise hinsichtlich wenigstens eines Ertragsmerkmals, bevorzugt hinsichtlich Toleranz und/oder Resistenz gegenüber Umweltstress, und eine erhöhte Biomasseproduktion verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon verliehen. Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung zytoplasmatisch.
Dementsprechend wird gemäß einer Ausführungsform, wenn man die Aktivität des Saccharomyces cerevisiae-Nukleinsäuremoleküls oder eines die Nukleinsäure SEQ ID NO.: 1157 beziehungsweise das Polypeptid SEQ ID NO.: 1158 umfassenden Polypeptids erhöht oder erzeugt, z. B. wenn man die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, in jeweils der gleichen Zeile wie SEQ ID NO.: 1157 beziehungsweise SEQ ID NO.: 1158 gezeigt umfasst, erhöht oder erzeugt, oder wenn man die Aktivität „Phosphoenolpyruvatcarboxylkinase” in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt, ein erhöhter Ertrag, vorzugsweise hinsichtlich wenigstens eines Ertragsmerkmals, bevorzugt hinsichtlich Toleranz und/oder Resistenz gegenüber Umweltstress, und eine erhöhte Biomasseproduktion verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon verliehen. Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung zytoplasmatisch.
Dementsprechend wird gemäß einer Ausführungsform, wenn man die Aktivität des Saccharomyces cerevisiae-Nukleinsäuremoleküls oder eines die Nukleinsäure SEQ ID NO.: 1352 beziehungsweise das Polypeptid SEQ ID NO.: 1353 umfassenden Polypeptids erhöht oder erzeugt, z. B. wenn man die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, in jeweils der gleichen Zeile wie SEQ ID NO.: 1352 beziehungsweise SEQ ID NO.: 1353 gezeigt umfasst, erhöht oder erzeugt, oder wenn man die Aktivität „Uridinkinase” in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt, ein erhöhter Ertrag, vorzugsweise hinsichtlich wenigstens eines Ertragsmerkmals, bevorzugt hinsichtlich Toleranz und/oder Resistenz gegenüber Umweltstress, und eine erhöhte Biomasseproduktion verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon verliehen. Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung zytoplasmatisch.
Dementsprechend wird gemäß einer Ausführungsform, wenn man die Aktivität des Saccharomyces cerevisiae-Nukleinsäuremoleküls oder eines die Nukleinsäure SEQ ID NO.: 1423 beziehungsweise das Polypeptid SEQ ID NO.: 1424 umfassenden Polypeptids erhöht oder erzeugt, z. B. wenn man die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, in jeweils der gleichen Zeile wie SEQ ID NO.: 1423 beziehungsweise SEQ ID NO.: 1424 gezeigt umfasst, erhöht oder erzeugt, oder wenn man die Aktivität „an der Übertragung von Ketoconazolresistenz beteiligter transkriptioneller Regulator” in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt, ein erhöhter Ertrag, vorzugsweise hinsichtlich wenigstens eines Ertragsmerkmals, bevorzugt hinsichtlich Toleranz und/oder Resistenz gegenüber Umweltstress, und eine erhöhte Biomasseproduktion verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon verliehen. Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung plastidisch.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere eine erhöhte Toleranz gegenüber niedrigen Temperaturen, verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp verliehen, wenn man die Aktivität eines Polypeptids, welches das in SEQ ID NO. 725 gezeigte Polypeptid umfasst oder durch ein Nukleinsäuremolekül kodiert wird, welches das in SEQ ID NO. 724 gezeigte Nukleinsäuremolekül umfasst, oder eines Homologs dieses Nukleinsäuremoleküls bzw. Polypeptids erhöht oder erzeugt. Man erhöht oder erzeugt zum Beispiel die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches sich von Saccharomyces cerevisiae ableitet, und welches vorzugsweise das in SEQ ID NO. 724 gezeigte Nukleinsäuremolekül beziehungsweise das in SEQ ID NO. 725 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfasst. Zum Beispiel wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere eine erhöhte Toleranz gegenüber niedrigen Temperaturen, verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp verliehen, wenn die Aktivität „yal043c-a-Protein” oder wenn man die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, in jeweils der gleichen Zeile wie SEQ ID NO.: 724 beziehungsweise SEQ ID NO.: 725 gezeigt umfasst, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt. Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung zytoplasmatisch.
Insbesondere wird eine Ertragserhöhung von 1,1-fach bis 1,389-fach, zum Beispiel plus wenigstens 100% davon, unter Niedertemperaturbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere eine erhöhte Toleranz gegenüber niedrigen Temperaturen, verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp verliehen, wenn man die Aktivität eines Polypeptids, welches das in SEQ ID NO. 729 gezeigte Polypeptid umfasst oder durch ein Nukleinsäuremolekül kodiert wird, welches das in SEQ ID NO. 728 gezeigte Nukleinsäuremolekül umfasst, oder eines Homologs dieses Nukleinsäuremoleküls bzw. Polypeptids erhöht oder erzeugt. Man erhöht oder erzeugt zum Beispiel die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches sich von Saccharomyces cerevisiae ableitet, und welches vorzugsweise das in SEQ ID NO. 728 gezeigte Nukleinsäuremolekül beziehungsweise das in SEQ ID NO. 729 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfasst. Zum Beispiel wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere eine erhöhte Toleranz gegenüber niedrigen Temperaturen, verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp verliehen, wenn die Aktivität „ybr071w-Protein” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, in jeweils der gleichen Zeile wie SEQ ID NO.: 728 beziehungsweise SEQ ID NO.: 729 gezeigt umfasst, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt. Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung plastidisch.
Insbesondere wird eine Ertragserhöhung von 1,1-fach bis 1,350-fach, zum Beispiel plus wenigstens 100% davon, unter Niedertemperaturbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere eine erhöhte Toleranz gegenüber niedrigen Temperaturen, verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp verliehen, wenn man die Aktivität eines Polypeptids, welches das in SEQ ID NO. 733 gezeigte Polypeptid umfasst oder durch ein Nukleinsäuremolekül kodiert wird, welches das in SEQ ID NO. 732 gezeigte Nukleinsäuremolekül umfasst, oder eines Homologs dieses Nukleinsäuremoleküls bzw. Polypeptids erhöht oder erzeugt. Man erhöht oder erzeugt zum Beispiel die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches sich von Saccharomyces cerevisiae ableitet, und welches vorzugsweise das in SEQ ID NO. 732 gezeigte Nukleinsäuremolekül beziehungsweise das in SEQ ID NO. 733 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfasst. Zum Beispiel wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere eine erhöhte Toleranz gegenüber niedrigen Temperaturen, verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp verliehen, wenn die Aktivität „Dityrosintransporter” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, in jeweils der gleichen Zeile wie SEQ ID NO.: 732 beziehungsweise SEQ ID NO.: 733 gezeigt umfasst, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt. Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung zytoplasmatisch.
Insbesondere wird eine Ertragserhöhung von 1,1-fach bis 1,374-fach, zum Beispiel plus wenigstens 100% davon, unter Niedertemperaturbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere eine erhöhte Toleranz gegenüber niedrigen Temperaturen, verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp verliehen, wenn man die Aktivität eines Polypeptids, welches das in SEQ ID NO. 765 gezeigte Polypeptid umfasst oder durch ein Nukleinsäuremolekül kodiert wird, welches das in SEQ ID NO. 764 gezeigte Nukleinsäuremolekül umfasst, oder eines Homologs dieses Nukleinsäuremoleküls bzw. Polypeptids erhöht oder erzeugt. Man erhöht oder erzeugt zum Beispiel die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches sich von Saccharomyces cerevisiae ableitet, und welches vorzugsweise das in SEQ ID NO. 764 gezeigte Nukleinsäuremolekül beziehungsweise das in SEQ ID NO. 765 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfasst. Zum Beispiel wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere eine erhöhte Toleranz gegenüber niedrigen Temperaturen, verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp verliehen, wenn die Aktivität „Diacylglycerolpyrophosphatphosphatase” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, in jeweils der gleichen Zeile wie SEQ ID NO.: 764 beziehungsweise SEQ ID NO.: 765 gezeigt umfasst, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt. Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung zytoplasmatisch. Insbesondere wird eine Ertragserhöhung von 1,1-fach bis 1,500-fach, zum Beispiel plus wenigstens 100% davon, unter Niedertemperaturbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere eine erhöhte Toleranz gegenüber niedrigen Temperaturen, verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp verliehen, wenn man die Aktivität eines Polypeptids, welches das in SEQ ID NO. 1158 gezeigte Polypeptid umfasst oder durch ein Nukleinsäuremolekül kodiert wird, welches das in SEQ ID NO. 1157 gezeigte Nukleinsäuremolekül umfasst, oder eines Homologs dieses Nukleinsäuremoleküls bzw. Polypeptids erhöht oder erzeugt. Man erhöht oder erzeugt zum Beispiel die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches sich von Saccharomyces cerevisiae ableitet, und welches vorzugsweise das in SEQ ID NO. 1157 gezeigte Nukleinsäuremolekül beziehungsweise das in SEQ ID NO. 1158 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfasst. Zum Beispiel wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere eine erhöhte Toleranz gegenüber niedrigen Temperaturen, verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp verliehen, wenn die Aktivität „Phosphoenolpyruvatcarboxylkinase” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, in jeweils der gleichen Zeile wie SEQ ID NO.: 1157 beziehungsweise SEQ ID NO.: 1158 gezeigt umfasst, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt. Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung zytoplasmatisch.
Insbesondere wird eine Ertragserhöhung von 1,1-fach bis 1,799-fach, zum Beispiel plus wenigstens 100% davon, unter Niedertemperaturbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp.
Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung mitochondrisch.
Insbesondere wird eine Ertragserhöhung von 1,1-fach bis 1,533-fach, zum Beispiel plus wenigstens 100% davon, unter Niedertemperaturbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere eine erhöhte Toleranz gegenüber niedrigen Temperaturen, verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp verliehen, wenn man die Aktivität eines Polypeptids, welches das in SEQ ID NO. 1353 gezeigte Polypeptid umfasst oder durch ein Nukleinsäuremolekül kodiert wird, welches das in SEQ ID NO. 1352 gezeigte Nukleinsäuremolekül umfasst, oder eines Homologs dieses Nukleinsäuremoleküls bzw. Polypeptids erhöht oder erzeugt. Man erhöht oder erzeugt zum Beispiel die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches sich von Saccharomyces cerevisiae ableitet, und welches vorzugsweise das in SEQ ID NO. 1352 gezeigte Nukleinsäuremolekül beziehungsweise das in SEQ ID NO. 1353 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfasst. Zum Beispiel wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere eine erhöhte Toleranz gegenüber niedrigen Temperaturen, verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp verliehen, wenn die Aktivität „Uridinkinase” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, in jeweils der gleichen Zeile wie SEQ ID NO.: 1352 beziehungsweise SEQ ID NO.: 1353 gezeigt umfasst, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt. Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung zytoplasmatisch.
Insbesondere wird eine Ertragserhöhung von 1,1-fach bis 1,399-fach, zum Beispiel plus wenigstens 100% davon, unter Niedertemperaturbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp verliehen, wenn man die Aktivität eines Polypeptids, welches das in SEQ ID NO. 64 gezeigte Polypeptid umfasst oder durch ein Nukleinsäuremolekül kodiert wird, welches das in SEQ ID NO. 63 gezeigte Nukleinsäuremolekül umfasst, oder eines Homologs dieses Nukleinsäuremoleküls bzw. Polypeptids erhöht oder erzeugt. Man erhöht oder erzeugt zum Beispiel die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches sich von Escherichia coli ableitet, und welches vorzugsweise das in SEQ ID NO. 63 gezeigte Nukleinsäuremolekül beziehungsweise das in SEQ ID NO. 64 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfasst. Zum Beispiel wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon verliehen, wenn man die Aktivität „NAD+-abhängige Betainaldehyddehydrogenase” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, in jeweils der gleichen Zeile wie SEQ ID NO. 63 beziehungsweise SEQ ID NO. 64 gezeigt umfasst, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt. Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung plastidisch. Gemäß einer Ausführungsform wird eine erhöhte Effizienz der Stickstoffausnutzung verliehen.
Insbesondere wird eine Ertragserhöhung von 1,05-fach bis 1,180-fach, zum Beispiel plus wenigstens 100% davon, unter Stickstoffmangelbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp verliehen, wenn man die Aktivität eines Polypeptids, welches das in SEQ ID NO. 725 gezeigte Polypeptid umfasst oder durch ein Nukleinsäuremolekül kodiert wird, welches das in SEQ ID NO. 724 gezeigte Nukleinsäuremolekül umfasst, oder eines Homologs dieses Nukleinsäuremoleküls bzw. Polypeptids erhöht oder erzeugt. Man erhöht oder erzeugt zum Beispiel die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches sich von Saccharomyces cerevisiae ableitet, und welches vorzugsweise das in SEQ ID NO. 724 gezeigte Nukleinsäuremolekül beziehungsweise das in SEQ ID NO. 725 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfasst. Zum Beispiel wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon verliehen, wenn man die Aktivität „yal043c-a-Protein” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, in jeweils der gleichen Zeile wie SEQ ID NO. 724 beziehungsweise SEQ ID NO. 725 gezeigt umfasst, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt. Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung zytoplasmatisch. Gemäß einer Ausführungsform wird eine erhöhte Effizienz der Stickstoffausnutzung verliehen. Insbesondere wird eine Ertragserhöhung von 1,05-fach bis 1,292-fach, zum Beispiel plus wenigstens 100% davon, unter Stickstoffmangelbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp verliehen, wenn man die Aktivität eines Polypeptids, welches das in SEQ ID NO. 733 gezeigte Polypeptid umfasst oder durch ein Nukleinsäuremolekül kodiert wird, welches das in SEQ ID NO. 732 gezeigte Nukleinsäuremolekül umfasst, oder eines Homologs dieses Nukleinsäuremoleküls bzw. Polypeptids erhöht oder erzeugt. Man erhöht oder erzeugt zum Beispiel die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches sich von Saccharomyces cerevisiae ableitet, und welches vorzugsweise das in SEQ ID NO. 732 gezeigte Nukleinsäuremolekül beziehungsweise das in SEQ ID NO. 733 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfasst. Zum Beispiel wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon verliehen, wenn man die Aktivität „Dityrosintransporter” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, in jeweils der gleichen Zeile wie SEQ ID NO. 732 beziehungsweise SEQ ID NO. 733 gezeigt umfasst, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt. Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung zytoplasmatisch. Gemäß einer Ausführungsform wird eine erhöhte Effizienz der Stickstoffausnutzung verliehen. Insbesondere wird eine Ertragserhöhung von 1,05-fach bis 1,739-fach, zum Beispiel plus wenigstens 100% davon, unter Stickstoffmangelbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp verliehen, wenn man die Aktivität eines Polypeptids, welches das in SEQ ID NO. 765 gezeigte Polypeptid umfasst oder durch ein Nukleinsäuremolekül kodiert wird, welches das in SEQ ID NO. 764 gezeigte Nukleinsäuremolekül umfasst, oder eines Homologs dieses Nukleinsäuremoleküls bzw. Polypeptids erhöht oder erzeugt. Man erhöht oder erzeugt zum Beispiel die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches sich von Saccharomyces cerevisiae ableitet, und welches vorzugsweise das in SEQ ID NO. 764 gezeigte Nukleinsäuremolekül beziehungsweise das in SEQ ID NO. 765 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfasst. Zum Beispiel wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon verliehen, wenn man die Aktivität „Diacylglycerolpyrophosphatphosphatase” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, in jeweils der gleichen Zeile wie SEQ ID NO. 764 beziehungsweise SEQ ID NO. 765 gezeigt umfasst, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt. Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung zytoplasmatisch. Gemäß einer Ausführungsform wird eine erhöhte Effizienz der Stickstoffausnutzung verliehen.
Insbesondere wird eine Ertragserhöhung von 1,05-fach bis 1,352-fach, zum Beispiel plus wenigstens 100% davon, unter Stickstoffmangelbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp verliehen, wenn man die Aktivität eines Polypeptids, welches das in SEQ ID NO. 815 gezeigte Polypeptid umfasst oder durch ein Nukleinsäuremolekül kodiert wird, welches das in SEQ ID NO. 814 gezeigte Nukleinsäuremolekül umfasst, oder eines Homologs dieses Nukleinsäuremoleküls bzw. Polypeptids erhöht oder erzeugt. Man erhöht oder erzeugt zum Beispiel die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches sich von Saccharomyces cerevisiae ableitet, und welches vorzugsweise das in SEQ ID NO. 814 gezeigte Nukleinsäuremolekül beziehungsweise das in SEQ ID NO. 815 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfasst. Zum Beispiel wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon verliehen, wenn man die Aktivität „ydr445c-Protein” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, in jeweils der gleichen Zeile wie SEQ ID NO. 814 beziehungsweise SEQ ID NO. 815 gezeigt umfasst, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt. Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung zytoplasmatisch. Gemäß einer Ausführungsform wird eine erhöhte Effizienz der Stickstoffausnutzung verliehen. Insbesondere wird eine Ertragserhöhung von 1,05-fach bis 1,197-fach, zum Beispiel plus wenigstens 100% davon, unter Stickstoffmangelbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp verliehen, wenn man die Aktivität eines Polypeptids, welches das in SEQ ID NO. 926 gezeigte Polypeptid umfasst oder durch ein Nukleinsäuremolekül kodiert wird, welches das in SEQ ID NO. 925 gezeigte Nukleinsäuremolekül umfasst, oder eines Homologs dieses Nukleinsäuremoleküls bzw. Polypeptids erhöht oder erzeugt. Man erhöht oder erzeugt zum Beispiel die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches sich von Saccharomyces cerevisiae ableitet, und welches vorzugsweise das in SEQ ID NO. 925 gezeigte Nukleinsäuremolekül beziehungsweise das in SEQ ID NO. 926 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfasst. Zum Beispiel wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon verliehen, wenn man die Aktivität „Farnesyldiphosphatfarnesyltransferase” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, in jeweils der gleichen Zeile wie SEQ ID NO. 925 beziehungsweise SEQ ID NO. 926 gezeigt umfasst, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt. Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung plastidisch. Gemäß einer Ausführungsform wird eine erhöhte Effizienz der Stickstoffausnutzung verliehen.
Insbesondere wird eine Ertragserhöhung von 1,05-fach bis 1,181-fach, zum Beispiel plus wenigstens 100% davon, unter Stickstoffmangelbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp verliehen, wenn man die Aktivität eines Polypeptids, welches das in SEQ ID NO. 1022 gezeigte Polypeptid umfasst oder durch ein Nukleinsäuremolekül kodiert wird, welches das in SEQ ID NO. 1021 gezeigte Nukleinsäuremolekül umfasst, oder eines Homologs dieses Nukleinsäuremoleküls bzw. Polypeptids erhöht oder erzeugt. Man erhöht oder erzeugt zum Beispiel die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches sich von Saccharomyces cerevisiae ableitet, und welches vorzugsweise das in SEQ ID NO. 1021 gezeigte Nukleinsäuremolekül beziehungsweise das in SEQ ID NO. 1022 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfasst. Zum Beispiel wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon verliehen, wenn man die Aktivität „Serinhydrolase” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, in jeweils der gleichen Zeile wie SEQ ID NO. 1021 beziehungsweise SEQ ID NO. 1022 gezeigt umfasst, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt. Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung zytoplasmatisch. Gemäß einer Ausführungsform wird eine erhöhte Effizienz der Stickstoffausnutzung verliehen. Insbesondere wird eine Ertragserhöhung von 1,05-fach bis 1,255-fach, zum Beispiel plus wenigstens 100% davon, unter Stickstoffmangelbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp verliehen, wenn man die Aktivität eines Polypeptids, welches das in SEQ ID NO. 1158 gezeigte Polypeptid umfasst oder durch ein Nukleinsäuremolekül kodiert wird, welches das in SEQ ID NO. 1157 gezeigte Nukleinsäuremolekül umfasst, oder eines Homologs dieses Nukleinsäuremoleküls bzw. Polypeptids erhöht oder erzeugt. Man erhöht oder erzeugt zum Beispiel die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches sich von Saccharomyces cerevisiae ableitet, und welches vorzugsweise das in SEQ ID NO. 1157 gezeigte Nukleinsäuremolekül beziehungsweise das in SEQ ID NO. 1158 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfasst. Zum Beispiel wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon verliehen, wenn man die Aktivität „Phosphoenolpyruvatcarboxylkinase” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, in jeweils der gleichen Zeile wie SEQ ID NO. 1157 beziehungsweise SEQ ID NO. 1158 gezeigt umfasst, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt.
Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung zytoplasmatisch. Gemäß einer Ausführungsform wird eine erhöhte Effizienz der Stickstoffausnutzung verliehen. Insbesondere wird eine Ertragserhöhung von 1,05-fach bis 1,313-fach, zum Beispiel plus wenigstens 100% davon, unter Stickstoffmangelbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp.
Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung mitochondrisch. Gemäß einer Ausführungsform wird eine erhöhte Effizienz der Stickstoffausnutzung verliehen.
Insbesondere wird eine Ertragserhöhung von 1,05-fach bis 1,264-fach, zum Beispiel plus wenigstens 100% davon, unter Stickstoffmangelbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp verliehen, wenn man die Aktivität eines Polypeptids, welches das in SEQ ID NO. 1353 gezeigte Polypeptid umfasst oder durch ein Nukleinsäuremolekül kodiert wird, welches das in SEQ ID NO. 1352 gezeigte Nukleinsäuremolekül umfasst, oder eines Homologs dieses Nukleinsäuremoleküls bzw. Polypeptids erhöht oder erzeugt. Man erhöht oder erzeugt zum Beispiel die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches sich von Saccharomyces cerevisiae ableitet, und welches vorzugsweise das in SEQ ID NO. 1352 gezeigte Nukleinsäuremolekül beziehungsweise das in SEQ ID NO. 1353 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfasst. Zum Beispiel wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon verliehen, wenn man die Aktivität „Uridinkinase” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, in jeweils der gleichen Zeile wie SEQ ID NO. 1352 beziehungsweise SEQ ID NO. 1353 gezeigt umfasst, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt. Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung zytoplasmatisch. Gemäß einer Ausführungsform wird eine erhöhte Effizienz der Stickstoffausnutzung verliehen. Insbesondere wird eine Ertragserhöhung von 1,05-fach bis 1,194-fach, zum Beispiel plus wenigstens 100% davon, unter Stickstoffmangelbedingungen verliehen, verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere ein erhöhter intrinsischer Ertrag, verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp verliehen, wenn man die Aktivität eines Polypeptids, welches das in SEQ ID NO. 64 gezeigte Polypeptid umfasst oder durch ein Nukleinsäuremolekül kodiert wird, welches das in SEQ ID NO. 63 gezeigte Nukleinsäuremolekül umfasst, oder eines Homologs dieses Nukleinsäuremoleküls bzw. Polypeptids erhöht oder erzeugt. Man erhöht oder erzeugt zum Beispiel die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches sich von Escherichia coli ableitet, und welches vorzugsweise das in SEQ ID NO. 63 gezeigte Nukleinsäuremolekül beziehungsweise das in SEQ ID NO. 64 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfasst. Zum Beispiel wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere ein erhöhter intrinsischer Ertrag, verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp verliehen, wenn die Aktivität „NAD+-abhängige Betainaldehyddehydrogenase” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, in jeweils der gleichen Zeile wie SEQ ID NO.: 63 beziehungsweise SEQ ID NO.: 64 gezeigt umfasst, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt. Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung plastidisch. Insbesondere wird eine Ertragserhöhung von 1,05-fach bis 1,353-fach, zum Beispiel plus wenigstens 100% davon, unter Standardbedingungen, z. B. in Abwesenheit von Nährstoffmangel und/oder Stressbedingungen, verglichen mit einer entsprechenden Kontrolle, z. B. einer nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp verliehen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere ein erhöhter intrinsischer Ertrag, verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp verliehen, wenn man die Aktivität eines Polypeptids, welches das in SEQ ID NO. 725 gezeigte Polypeptid umfasst oder durch ein Nukleinsäuremolekül kodiert wird, welches das in SEQ ID NO. 724 gezeigte Nukleinsäuremolekül umfasst, oder eines Homologs dieses Nukleinsäuremoleküls bzw. Polypeptids erhöht oder erzeugt. Man erhöht oder erzeugt zum Beispiel die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches sich von Saccharomyces cerevisiae ableitet, und welches vorzugsweise das in SEQ ID NO. 724 gezeigte Nukleinsäuremolekül beziehungsweise das in SEQ ID NO. 725 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfasst. Zum Beispiel wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere ein erhöhter intrinsischer Ertrag, verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp verliehen, wenn die Aktivität „yal043c-a-Protein” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, in jeweils der gleichen Zeile wie SEQ ID NO.: 724 beziehungsweise SEQ ID NO.: 725 gezeigt umfasst, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt. Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung zytoplasmatisch.
Insbesondere wird eine Ertragserhöhung von 1,05-fach bis 1,411-fach, zum Beispiel plus wenigstens 100% davon, unter Standardbedingungen, z. B. in Abwesenheit von Nährstoffmangel und/oder Stressbedingungen, verglichen mit einer entsprechenden Kontrolle, z. B. einer nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp verliehen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere ein erhöhter intrinsischer Ertrag, verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp verliehen, wenn man die Aktivität eines Polypeptids, welches das in SEQ ID NO. 733 gezeigte Polypeptid umfasst oder durch ein Nukleinsäuremolekül kodiert wird, welches das in SEQ ID NO. 732 gezeigte Nukleinsäuremolekül umfasst, oder eines Homologs dieses Nukleinsäuremoleküls bzw. Polypeptids erhöht oder erzeugt. Man erhöht oder erzeugt zum Beispiel die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches sich von Saccharomyces cerevisiae ableitet, und welches vorzugsweise das in SEQ ID NO. 732 gezeigte Nukleinsäuremolekül beziehungsweise das in SEQ ID NO. 733 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfasst. Zum Beispiel wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere ein erhöhter intrinsischer Ertrag, verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp verliehen, wenn die Aktivität „Dityrosintransporter” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, in jeweils der gleichen Zeile wie SEQ ID NO.: 732 beziehungsweise SEQ ID NO.: 733 gezeigt umfasst, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt. Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung zytoplasmatisch. Insbesondere wird eine Ertragserhöhung von 1,05-fach bis 1,449-fach, zum Beispiel plus wenigstens 100% davon, unter Standardbedingungen, z. B. in Abwesenheit von Nährstoffmangel und/oder Stressbedingungen, verglichen mit einer entsprechenden Kontrolle, z. B. einer nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp verliehen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere ein erhöhter intrinsischer Ertrag, verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp verliehen, wenn man die Aktivität eines Polypeptids, welches das in SEQ ID NO. 819 gezeigte Polypeptid umfasst oder durch ein Nukleinsäuremolekül kodiert wird, welches das in SEQ ID NO. 818 gezeigte Nukleinsäuremolekül umfasst, oder eines Homologs dieses Nukleinsäuremoleküls bzw. Polypeptids erhöht oder erzeugt. Man erhöht oder erzeugt zum Beispiel die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches sich von Saccharomyces cerevisiae ableitet, und welches vorzugsweise das in SEQ ID NO. 818 gezeigte Nukleinsäuremolekül beziehungsweise das in SEQ ID NO. 819 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfasst. Zum Beispiel wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere ein erhöhter intrinsischer Ertrag, verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp verliehen, wenn die Aktivität „Arginin-/Alaninaminopeptidase” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, in jeweils der gleichen Zeile wie SEQ ID NO.: 818 beziehungsweise SEQ ID NO.: 819 gezeigt umfasst, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt. Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung zytoplasmatisch. Insbesondere wird eine Ertragserhöhung von 1,05-fach bis 1,179-fach, zum Beispiel plus wenigstens 100% davon, unter Standardbedingungen, z. B. in Abwesenheit von Nährstoffmangel und/oder Stressbedingungen, verglichen mit einer entsprechenden Kontrolle, z. B. einer nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp verliehen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere ein erhöhter intrinsischer Ertrag, verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp verliehen, wenn man die Aktivität eines Polypeptids, welches das in SEQ ID NO. 1158 gezeigte Polypeptid umfasst oder durch ein Nukleinsäuremolekül kodiert wird, welches das in SEQ ID NO. 1157 gezeigte Nukleinsäuremolekül umfasst, oder eines Homologs dieses Nukleinsäuremoleküls bzw. Polypeptids erhöht oder erzeugt. Man erhöht oder erzeugt zum Beispiel die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches sich von Saccharomyces cerevisiae ableitet, und welches vorzugsweise das in SEQ ID NO. 1157 gezeigte Nukleinsäuremolekül beziehungsweise das in SEQ ID NO. 1158 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfasst. Zum Beispiel wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere ein erhöhter intrinsischer Ertrag, verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp verliehen, wenn die Aktivität „Phosphoenolpyruvatcarboxylkinase” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, in jeweils der gleichen Zeile wie SEQ ID NO.: 1157 beziehungsweise SEQ ID NO.: 1158 gezeigt umfasst, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt. Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung mitochondrisch. Insbesondere wird eine Ertragserhöhung von 1,05-fach bis 1,619-fach, zum Beispiel plus wenigstens 100% davon, unter Standardbedingungen, z. B. in Abwesenheit von Nährstoffmangel und/oder Stressbedingungen, verglichen mit einer entsprechenden Kontrolle, z. B. einer nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp verliehen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere ein erhöhter intrinsischer Ertrag, verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp verliehen, wenn man die Aktivität eines Polypeptids, welches das in SEQ ID NO. 1353 gezeigte Polypeptid umfasst oder durch ein Nukleinsäuremolekül kodiert wird, welches das in SEQ ID NO. 1352 gezeigte Nukleinsäuremolekül umfasst, oder eines Homologs dieses Nukleinsäuremoleküls bzw. Polypeptids erhöht oder erzeugt. Man erhöht oder erzeugt zum Beispiel die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches sich von Saccharomyces cerevisiae ableitet, und welches vorzugsweise das in SEQ ID NO. 1352 gezeigte Nukleinsäuremolekül beziehungsweise das in SEQ ID NO. 1353 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfasst. Zum Beispiel wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere ein erhöhter intrinsischer Ertrag, verglichen mit einer entsprechenden nicht modifizierten, z. B. einer nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp verliehen, wenn die Aktivität „Uridinkinase” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, in jeweils der gleichen Zeile wie SEQ ID NO.: 1352 beziehungsweise SEQ ID NO.: 1353 gezeigt umfasst, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt. Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung zytoplasmatisch. Insbesondere wird eine Ertragserhöhung von 1,05-fach bis 1,314-fach, zum Beispiel plus wenigstens 100% davon, unter Standardbedingungen, z. B. in Abwesenheit von Nährstoffmangel und/oder Stressbedingungen, verglichen mit einer entsprechenden Kontrolle, z. B. einer nicht modifizierten, z. B. nicht transformierten, Pflanze vom Wildtyp verliehen.
Für die Zwecke der Erfindung soll der Plural in der Regel den Singular einschließen und umgekehrt.
Wenn nicht anderweitig angegeben, sind die Begriffe „Polynukleotide”, „Nukleinsäure” und „Nukleinsäuremolekül” im vorliegenden Kontext austauschbar. Wenn nicht anderweitig angegeben, sind die Begriffe „Peptid”, „Polypeptid” und „Protein” im vorliegenden Kontext austauschbar. Der Begriff „Sequenz” kann Polynukleotide, Nukleinsäuren, Nukleinsäuremoleküle, Peptide, Polypeptide und Proteine betreffen, abhängig vom Zusammenhang, in dem der Begriff „Sequenz” verwendet wird. Die Begriffe „Gen(e)”, „Polynukleotid”, „Nukleinsäuresequenz”, „Nukleotidsequenz” oder „Nukleinsäuremolekül(e)”, wie hierin verwendet, beziehen sich auf eine polymere Form von Nukleotiden von beliebiger Länge, entweder Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide. Die Begriffe betreffen lediglich die Primärstruktur des Moleküls.
So schließen die Begriffe „Gen(e)”, „Polynukleotid^„, „Nukleinsäuresequenz”, „Nukleotidsequenz” oder „Nukleinsäuremolekül(e)”, wie hierin verwendet, doppel- und einzelsträngige DNA und/oder RNA ein. Sie beinhalten außerdem bekannte Arten von Modifikationen, zum Beispiel Methylierung, „Caps” und Substitutionen von einem oder mehreren der natürlich vorkommenden Nukleotide mit einem Analog. Vorzugsweise umfasst die DNA- oder RNA-Sequenz eine kodierende Sequenz, die das hierin definierte Polypeptid kodiert.
Eine „kodierende Sequenz” ist eine Nukleotidsequenz, welche in eine RNA transkribiert wird, z. B. eine regulatorische RNA, wie eine miRNA, eine ta-siRNA, ein Cosuppressionsmolekül, eine RNAi, ein Ribozym etc., oder in eine mRNA, die in ein Polypeptid translatiert wird, wenn sie unter die Steuerung von geeigneten regulatorischen Sequenzen gebracht wird. Die Grenzen der kodierenden Sequenz werden von einem Translations-Startcodon am 5'-Terminus und einem Translations-Stoppcodon am 3'-Terminus festgelegt. Eine kodierende Sequenz kann, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, mRNA, cDNA, rekombinante Nukleotidsequenzen oder genomische DNA einschließen, während Introns unter gewissen Umständen ebenfalls vorhanden sein können.
Wie im vorliegenden Kontext verwendet, kann ein Nukleinsäuremolekül auch die untranslatierte Sequenz umfassen, die sich am 3'-Ende und am 5'-Ende der kodierenden Genregion befindet, beispielsweise mindestens 500, vorzugsweise 200, besonders bevorzugt 100 Nukleotide der Sequenz stromaufwärts vom 5'-Ende der kodierenden Region, und mindestens 100, vorzugsweise 50, besonders bevorzugt 20 Nukleotide der Sequenz stromabwärts vom 3'-Ende der kodierenden Genregion. Für den Fall, dass zum Beispiel die Technologie mit Antisense, RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, Cosuppressionsmolekül, Ribozym etc. angewandt wird, können sowohl kodierende Regionen als auch die 5'- und/oder 3'-Regionen vorteilhaft verwendet werden.
Allerdings ist es häufig vorteilhaft, für Klonierungs- und Expressionszwecke lediglich die kodierende Region zu wählen.
”Polypeptid” bezieht sich auf ein Aminosäurepolymer (Aminosäuresequenz) und bezieht sich nicht auf eine spezifische Länge des Moleküls. Somit fallen Peptide und Oligopeptide mit unter die Definition von Polypeptid. Dieser Begriff betrifft oder beinhaltet auch post-translationale Modifikationen des Polypeptids, zum Beispiel Glykosylierungen, Acetylierungen, Phosphorylierungen und dergleichen. Innerhalb der Definition sind beispielsweise Polypeptide, die ein oder mehrere Analoge einer Aminosäure enthalten (einschließlich zum Beispiel unnatürlicher Aminosäuren, etc.), und Polypeptide mit substituierten Bindungen sowie sonstigen im Fachgebiet bekannten, sowohl natürlich vorkommenden als auch nicht-natürlich vorkommenden, Modifikationen inbegriffen.
Es versteht sich, dass der in dieser Beschreibung verwendete Begriff „Tabelle I” den Inhalt von Tabelle I A und Tabelle I B bezeichnet. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff „Tabelle II” soll herangezogen werden, um den Inhalt von Tabelle II A und Tabelle II B zu bezeichnen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff „Tabelle I A” soll herangezogen werden, um den Inhalt von Tabelle I A zu bezeichnen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff „Tabelle I B” soll den Inhalt von Tabelle I B bezeichnen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff „Tabelle II A” soll den Inhalt von Tabelle II A bezeichnen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff „Tabelle II B” soll den Inhalt von Tabelle II B bezeichnen. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff „Tabelle I” die Tabelle I B. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff „Tabelle II” die Tabelle II B.
Die Begriffe „umfassen” oder „umfassend” und grammatikalische Variationen davon, falls in dieser Beschreibung verwendet, verstehen sich zur Bezeichnung des Vorliegens der angegebenen Merkmale, ganzen Zahlen, Schritte oder Komponenten oder Gruppen davon, aber schließen das Vorliegen oder die Hinzufügung von einem oder mehreren anderen Merkmalen, ganzen Zahlen, Schritten, Komponenten oder Gruppen davon nicht aus.
Gemäß der Erfindung hat ein Protein oder Polypeptid die „Aktivität eines wie in Tabelle II, Spalte 3, gezeigten Proteins”, wenn seine de novo-Aktivität oder seine erhöhte Expression direkt oder indirekt zu einem erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter erhöhtem Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon führt und diese verleiht und das Protein die obenerwähnten Aktivitäten eines wie in Tabelle II, Spalte 3, gezeigten Proteins hat. In der gesamten Beschreibung ist die Aktivität oder vorzugsweise die biologische Aktivität eines solchen Proteins oder Polypeptids oder eines für ein solches Protein oder Polypeptid kodierenden Nukleinsäuremoleküls bzw. einer für ein solches Protein oder Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz identisch oder ähnlich, wenn es noch über die biologische oder enzymatische Aktivität eines wie in Tabelle II, Spalte 3, gezeigten Proteins oder wenigstens 10% der ursprünglichen enzymatischen Aktivität, vorzugsweise 20%, besonders bevorzugt 30%, ganz besonders bevorzugt 40% verfügt, verglichen mit einem wie in Tabelle II, Spalte 3, gezeigten Protein von E. coli oder Saccharomyces cerevisiae.
Die Begriffe „erhöht”, „gesteigert”, „ausgeweitet”, „verstärkt”, „verbessert” oder „erweitert” beziehen sich auf eine entsprechende Veränderung einer Eigenschaft in einer Pflanze, einem Organismus, einem Teil eines Organismus wie einem Gewebe, Samen, Wurzeln, Blättern, Blüten usw. oder in einer Zelle und sind austauschbar. Vorzugsweise ist die Gesamtaktivität im Volumen erhöht oder verstärkt in Fällen, bei denen die Erhöhung bzw. Verstärkung mit der Erhöhung bzw. Verstärkung einer Aktivität eines Genprodukts in Zusammenhang steht, unabhängig davon, ob die Menge an Genprodukt oder die spezifische Aktivität des Genprodukts oder beide erhöht oder verstärkt sind oder ob die Menge, Stabilität oder Translationseffizienz der für das Genprodukt kodierenden Nukleinsäuresequenz bzw. des für das Genprodukt kodierenden Gens erhöht oder verstärkt ist.
Der Begriff „Erhöhung” bezieht sich auf eine entsprechende Veränderung einer Eigenschaft in einem Organismus oder in einem Teil einer Pflanze, einem Organismus wie einem Gewebe, Samen, Wurzeln, Blättern, Blüten usw. oder in einer Zelle.
Vorzugsweise ist die Gesamtaktivität im Volumen erhöht in Fällen, bei denen die Erhöhung mit der Erhöhung einer Aktivität eines Genprodukts in Zusammenhang steht, unabhängig davon, ob die Menge an Genprodukt oder die spezifische Aktivität des Genprodukts oder beide erhöht oder verstärkt sind oder ob die Menge, Stabilität oder Translationseffizienz der für das Genprodukt kodierenden Nukleinsäuresequenz bzw. des für das Genprodukt kodierenden Gens erhöht oder verstärkt ist.
Unter „Veränderung einer Eigenschaft” versteht man, dass die Aktivität, das Expressionsniveau oder die Menge eines Genprodukts oder der Metabolitengehalt in einem spezifischen Volumen im Verhältnis zu einem entsprechenden Volumen einer Kontrolle, einer Referenz oder eines Wildtyps verändert ist, einschließlich der de novo-Erzeugung der Aktivität oder Expression.
Der Begriff „Erhöhung” schließt die Veränderung dieser Eigenschaft nur in Teilen des Gegenstands der vorliegenden Erfindung ein; so kann sich die Modifikation zum Beispiel in einem Kompartiment einer Zelle wie einer Organelle oder in einem Teil einer Pflanze wie Gewebe, Samen, Wurzeln, Blättern, Blüten usw. finden, jedoch nicht nachweisbar sein, wenn man den gesamten Gegenstand, d. h. die gesamte Zelle oder Pflanze, untersucht.
Dementsprechend bedeutet der Begriff „Erhöhung”, dass die spezifische Aktivität eines Enzyms sowie die Menge einer Verbindung oder eines Metaboliten, z. B. eines Polypeptids, eines Nukleinsäuremoleküls der Erfindung oder einer kodierenden mRNA oder DNA vom Volumen her erhöht sein kann.
Die Begriffe „Wildtyp”, „Kontrolle” oder „Referenz” sind austauschbar und können eine Zelle oder ein Teil von Organismen, wie eine Organelle wie z. B. ein Chloroplast oder ein Gewebe, oder ein Organismus, insbesondere eine Pflanze, sein, welche(r) nicht gemäß dem hierin beschriebenen Verfahren gemäß der Erfindung modifiziert oder behandelt worden ist. Dementsprechend entspricht die Zelle oder ein Teil von Organismen wie eine Organelle wie z. B. ein Chloroplast oder ein Gewebe, oder ein Organismus, insbesondere eine Pflanze, die/der als Wildtyp, Kontrolle oder Referenz verwendet wird, der Zelle, dem Organismus, der Pflanze oder dem Teil davon soweit wie möglich und ist in jeder anderen Eigenschaft mit Ausnahme des Ergebnisses des erfindungsgemäßen Verfahrens mit dem Gegenstand der Erfindung so identisch wie möglich. Daher wird der Wildtyp, die Kontrolle oder die Referenz identisch oder bestmöglich identisch behandelt, womit besagt wird, dass nur Bedingungen oder Eigenschaften verschieden sein könnten, welche die Qualität der getesteten Eigenschaft nicht beeinflussen.
Vorzugsweise wird jeder Vergleich unter analogen Bedingungen durchgeführt. Der Begriff „analoge Bedingungen” bedeutet, dass alle Bedingungen wie zum Beispiel Kultivierungs- bzw. Wachstumsbedingungen, Boden, Nährstoff, Wassergehalt des Bodens, Temperatur, Feuchtigkeit oder Umgebungsluft oder Boden, Assaybedingungen (wie Pufferzusammensetzung, Temperatur, Substrate, Pathogenstamm, Konzentrationen und dergleichen) zwischen den zu vergleichenden Experimenten gleichgehalten werden.
Bei der „Referenz”, „Kontrolle” oder dem „Wildtyp” handelt es sich vorzugsweise um ein Subjekt, z. B. eine Organelle, eine Zelle, ein Gewebe, einen Organismus, insbesondere eine Pflanze, das nicht gemäß dem hierin beschriebenen Verfahren der Erfindung modifiziert oder behandelt worden ist und in jedweder anderen Eigenschaften so ähnlich zum Subjekt der Erfindung ist, wie möglich. Die Referenz, Kontrolle oder der Wildtyp ist hinsichtlich seines Genoms, Transkriptoms, Proteoms oder Metaboloms so ähnlich wie möglich zum Subjekt der vorliegenden Erfindung. Vorzugsweise bezieht sich der Begriff „Referenz-”, „Kontroll-” oder „Wildtyp-”Organelle, -Zelle, -Gewebe oder -Organismus, insbesondere -Pflanze, auf eine Organelle, Zelle, ein Gewebe oder einen Organismus, insbesondere eine Pflanze, welche(s, r) zu der Organelle, Zelle, dem Gewebe oder Organismus, insbesondere Pflanze, der vorliegenden Erfindung, oder einem Teil davon, beinahe genetisch identisch ist, und zwar vorzugsweise zu 95%, weiter bevorzugt zu 98%, noch weiter bevorzugt zu 99,00%, insbesondere 99,10%, 99,30%, 99,50%, 99,70%, 99,90%, 99,99%, 99,999% oder mehr. Am meisten bevorzugt handelt, es sich bei der „Referenz”, der „Kontrolle” bzw. dem „Wildtyp” um einen Gegenstand, z. B. eine Organelle, eine Zelle, ein Gewebe oder einen Organismus, insbesondere eine Pflanze, die/das/der genetisch identisch ist mit dem Organismus, insbesondere der Pflanze, der Zelle, einem Gewebe, oder einer Organelle, der/die/das gemäß dem Verfahren der Erfindung verwendet wird, wobei allerdings die verantwortlichen bzw. Aktivität verleihenden Nukleinsäuremoleküle oder das durch sie kodierte Genprodukt gemäß dem Verfahren der Erfindung ergänzt, manipuliert, ausgetauscht oder eingeführt ist/sind.
Kann eine Kontrolle, eine Referenz bzw. ein Wildtyp, die bzw. der sich vom Gegenstand der vorliegenden Erfindung nur dadurch unterscheidet, dass sie/er nicht Gegenstand des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, nicht bereitgestellt werden, so kann es sich bei einer Kontrolle, einer Referenz bzw. einem Wildtyp um einen Organismus handeln, bei dem die Ursache für die Modulation einer den im Vergleich zu einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter erhöhtem Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verleihenden Aktivität oder die Expression des wie hier beschriebenen Nukleinsäuremoleküls der Erfindung zurück- oder abgeschaltet worden ist, z. B. durch Eliminieren der Expression des verantwortlichen Genprodukts, z. B. durch Antisense-Inhibierung, durch Deaktivierung eines Aktivators oder Agonisten, durch Aktivierung eines Inhibitors oder Antagonisten, durch Inhibierung durch Zugabe hemmender Antikörper, durch Zugabe von Wirkstoffen wie z. B. Hormonen, durch Einführung negativ dominanter Mutanten usw. Eine Genproduktion kann zum Beispiel eliminiert werden, indem man deaktivierende Punktmutationen einführt, die eine Inhibierung der enzymatischen Aktivität oder eine Destabilisierung oder eine Inhibierung der Fähigkeit zur Bindung von Kofaktoren usw. zur Folge haben.
Folglich ist das bevorzugte Referenzsubjekt das Ausgangssubjekt des vorliegenden Verfahrens der Erfindung. Vorzugsweise werden die Referenz und der Gegenstand der Erfindung nach Standardisierung und Normalisierung z. B. auf die Menge an Gesamt-RNA, -DNA oder -Protein oder der Aktivität oder Expression von Referenzgenen wie Haushaltsgenen wie z. B. Ubiquitin, Aktin oder ribosomalen Proteinen miteinander verglichen.
Die Erhöhung bzw. Modulation gemäß der vorliegenden Erfindung kann konstitutiv sein, z. B. aufgrund einer stabilen permanenten transgenen Expression oder einer stabilen Mutation in dem entsprechenden endogenen Gen, das für das Nukleinsäuremolekül der Erfindung kodiert, oder einer Modulation der Expression oder des Verhaltens eines Gens, das die Expression des Polypeptids der Erfindung verleiht, oder transient, z. B. aufgrund einer transienten Transformation oder eines zeitweiligen Zusatzes eines Modulators wie einem Agonisten oder Antagonisten, oder induzierbar, z. B. nach einer Transformation mit einem induzierbaren Konstrukt, das das Nukleinsäuremolekül der Erfindung unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors trägt, und Zugabe des Induktors, z. B. Tetracyclin, oder wie hier unten beschrieben.
Die Erhöhung in der Aktivität des Polypeptids beläuft sich in einer Zelle, einem Gewebe, einer Organelle, einem Organ oder einem Organismus oder einem Teil davon bevorzugt auf wenigstens 5%, vorzugsweise auf wenigstens 20% oder auf wenigstens 50%, besonders bevorzugt auf wenigstens 70%, 80%, 90% oder mehr, ganz besonders bevorzugt auf wenigstens 200%, 300% oder 400%, am meisten bevorzugt auf wenigstens 500% oder mehr im Vergleich zur Kontrolle, zur Referenz bzw. zum Wildtyp.
Gemäß einer Ausführungsform bedeutet der Begriff Erhöhung die Erhöhung der Menge in Bezug auf das Gewicht des Organismus oder eines Teils davon (w/w).
Gemäß einer Ausführungsform tritt die Erhöhung der Aktivität des Polypeptids in einer Organelle wie einem Plastid auf.
Die spezifische Aktivität eines durch ein Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung kodierten Polypeptids oder des Polypeptids der vorliegenden Erfindung lässt sich wie in den Beispielen beschrieben untersuchen. Insbesondere die Expression eines betreffenden Proteins in einer Zelle, z. B. einer Pflanzenzelle, im Vergleich zu einer Kontrolle ist ein einfacher Test und kann wie im Stand der Technik beschrieben durchgeführt werden.
Der Begriff „Erhöhung” schließt ein, dass eine Verbindung oder eine Aktivität de novo in eine Zelle oder ein subzelluläres Kompartiment oder eine Organelle eingeführt wird, oder dass die Verbindung zuvor nicht nachweisbar war, also in anderen Worten „erzeugt” wurde.
Dementsprechend umfasst im Folgenden der Begriff „Erhöhen” auch den Begriff „Erzeugen” oder „Stimulieren”. Die erhöhte Aktivität manifestiert sich in einer Steigerung des erhöhten Ertrags, vorzugsweise unter erhöhtem Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon.
Die Sequenz von B0312 aus Escherichia coli, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt, wurde veröffentlicht [Sequenzen aus Saccharomyces cerevisiae wurden in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546–547, 1996 veröffentlicht, Sequenzen aus Escherichia coli wurden in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453–1474 (1997) veröffentlicht und ihre Aktivität wurde als NAD+-abhängige Betainaldehyddehydrogenase beschrieben veröffentlicht.
Dementsprechend umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung gemäß einer Ausführungsform die Erhöhung oder Erzeugung der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität einer „NAD+-abhängigen Betainaldehyddehydrogenase” aus Escherichia coli oder einem funktionellen Äquivalent davon oder einem Homolog davon, z. B. die Erhöhung

(a) eines Genprodukts eines Gens, das das Nukleinsäuremolekül, welches wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt ist und in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses B0312 steht, oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon wie in Spalte 7 von Tabelle I gezeigt, vorzugsweise ein Homolog oder funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle I B gezeigt, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses B0312 steht, umfasst; oder
(b) eines ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie in Spalte 5 von Tabelle II gezeigt umfassenden Polypeptids, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses B0312 steht, oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon wie in Spalte 7 von Tabelle II oder IV gezeigt, vorzugsweise ein Homolog oder funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle II B gezeigt, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses B0312 steht,

Dementsprechend umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung gemäß einer Ausführungsform die Erhöhung oder Erzeugung der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität einer „NAD+-abhängigen Betainaldehyddehydrogenase” beschriebenen Aktivität; bevorzugt handelt es sich dabei um das in Abschnitt (a) oder (b) dieses Absatzes beschriebene Molekül.
Gemäß einer Ausführungsform wird das Molekül, dessen Aktivität bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zu erhöhen ist und bei dem es sich um das Genprodukt mit einer als „NAD+-abhängige Betainaldehyddehydrogenase” beschriebenen Aktivität handelt, plastidisch erhöht.
Die Sequenz von B3182 aus Escherichia coli, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt, wurde veröffentlicht [Sequenzen aus Saccharomyces cerevisiae wurden in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546–547, 1996 veröffentlicht, Sequenzen aus Escherichia coli wurden in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453–1474 (1997) veröffentlicht und ihre Aktivität wurde als D-Alanyl-D-alanincarboxypeptidase beschrieben veröffentlicht.
Dementsprechend umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung gemäß einer Ausführungsform die Erhöhung oder Erzeugung der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität einer „D-Alanyl-D-alanincarboxypeptidase” aus Escherichia coli oder einem funktionellen Äquivalent davon oder einem Homolog davon, z. B. die Erhöhung

(a) eines Genprodukts eines Gens, das das Nukleinsäuremolekül, welches wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt ist und in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses B3182 steht, oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon wie in Spalte 7 von Tabelle I gezeigt, vorzugsweise ein Homolog oder funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle I B gezeigt, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses B3182 steht, umfasst; oder
(b) eines ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie in Spalte 5 von Tabelle II gezeigt umfassenden Polypeptids, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses B3182 steht, oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon wie in Spalte 7 von Tabelle II oder IV gezeigt, vorzugsweise ein Homolog oder funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle II B gezeigt, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses B3182 steht,

Dementsprechend handelt es sich bei einer Ausführungsform bei dem Molekül, dessen Aktivität im erfindungsgemäßen Verfahren zu erhöhen ist, um das Genprodukt mit einer als „D-Alanyl-D-alanincarboxypeptidase” beschriebenen Aktivität; bevorzugt handelt es sich dabei um das in Abschnitt (a) oder (b) dieses Absatzes beschriebene Molekül.
Gemäß einer Ausführungsform wird das Molekül, dessen Aktivität bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zu erhöhen ist und bei dem es sich um das Genprodukt mit einer als „D-Alanyl-D-alanincarboxypeptidase” beschriebenen Aktivität handelt, zytoplasmatisch erhöht.
Die Sequenz von Yal043c-a aus Saccharomyces cerevisiae, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt, wurde veröffentlicht [Sequenzen aus Saccharomyces cerevisiae wurden in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546–547, 1996 veröffentlicht, Sequenzen aus Escherichia coli wurden in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453–1474 (1997) veröffentlicht und ihre Aktivität wurde als yal043c-a-Protein beschrieben veröffentlicht. Dementsprechend umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung gemäß einer Ausführungsform die Erhöhung oder Erzeugung der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität eines „yal043c-a-Proteins” aus Saccharomyces cerevisiae oder einem funktionellen Äquivalent davon oder einem Homolog davon, z. B. die Erhöhung

(a) eines Genprodukts eines Gens, das das Nukleinsäuremolekül, welches wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt ist und in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Yal043c steht, oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon wie in Spalte 7 von Tabelle I gezeigt, vorzugsweise ein Homolog oder funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle I B gezeigt, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Yal043c-a steht, umfasst; oder
(b) eines ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie in Spalte 5 von Tabelle II gezeigt umfassenden Polypeptids, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Yal043c-a steht, oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon wie in Spalte 7 von Tabelle II oder IV gezeigt, vorzugsweise ein Homolog oder funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle II B gezeigt, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Yal043c-a steht,

Dementsprechend handelt es sich bei einer Ausführungsform bei dem Molekül, dessen Aktivität im erfindungsgemäßen Verfahren zu erhöhen ist, um das Genprodukt mit einer als „yal043c-a-Protein” beschriebenen Aktivität; bevorzugt handelt es sich dabei um das in Abschnitt (a) oder (b) dieses Absatzes beschriebene Molekül.
Gemäß einer Ausführungsform wird das Molekül, dessen Aktivität bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zu erhöhen ist und bei dem es sich um das Genprodukt mit einer als „yal043c-a-Protein” beschriebenen Aktivität handelt, zytoplasmatisch erhöht.
Die Sequenz von Ybr071w aus Saccharomyces cerevisiae, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt, wurde veröffentlicht [Sequenzen aus Saccharomyces cerevisiae wurden in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546–547, 1996 veröffentlicht, Sequenzen aus Escherichia coli wurden in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453–1474 (1997) veröffentlicht und ihre Aktivität wurde als ybr071w-Protein beschrieben veröffentlicht. Dementsprechend umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung gemäß einer Ausführungsform die Erhöhung oder Erzeugung der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität eines „ybr071w-Proteins” aus Saccharomyces cerevisiae oder einem funktionellen Äquivalent davon oder einem Homolog davon, z. B. die Erhöhung

(a) eines Genprodukts eines Gens, das das Nukleinsäuremolekül, welches wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt ist und in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Ybr071w steht, oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon wie in Spalte 7 von Tabelle I gezeigt, vorzugsweise ein Homolog oder funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle I B gezeigt, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Ybr071w steht, umfasst; oder
(b) eines ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie in Spalte 5 von Tabelle II gezeigt umfassenden Polypeptids, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Ybr071w steht, oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon wie in Spalte 7 von Tabelle II oder IV gezeigt, vorzugsweise ein Homolog oder funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle II B gezeigt, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Ybr071w steht,

Dementsprechend handelt es sich bei einer Ausführungsform bei dem Molekül, dessen Aktivität im erfindungsgemäßen Verfahren zu erhöhen ist, um das Genprodukt mit einer als „ybr071w-Protein” beschriebenen Aktivität; bevorzugt handelt es sich dabei um das in Abschnitt (a) oder (b) dieses Absatzes beschriebene Molekül. Gemäß einer Ausführungsform wird das Molekül, dessen Aktivität bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zu erhöhen ist und bei dem es sich um das Genprodukt mit einer als „ybr071w-Protein” beschriebenen Aktivität handelt, plastidisch erhöht.
Die Sequenz von Ybr180w aus Saccharomyces cerevisiae, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt, wurde veröffentlicht [Sequenzen aus Saccharomyces cerevisiae wurden in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546–547, 1996 veröffentlicht, Sequenzen aus Escherichia coli wurden in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453–1474 (1997) veröffentlicht und ihre Aktivität wurde als Dityrosintransporter beschrieben veröffentlicht.
Dementsprechend umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung gemäß einer Ausführungsform die Erhöhung oder Erzeugung der Aktivität eines Genprodukts mit der. Aktivität eines „Dityrosintransporters” aus Saccharomyces cerevisiae oder einem funktionellen Äquivalent davon oder einem Homolog davon, z. B. die Erhöhung

(a) eines Genprodukts eines Gens, das das Nukleinsäuremolekül, welches wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt ist und in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Ybr180w steht, oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon wie in Spalte 7 von Tabelle I gezeigt, vorzugsweise ein Homolog oder funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle I B gezeigt, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Ybr180w steht, umfasst; oder
(b) eines ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie in Spalte 5 von Tabelle II gezeigt umfassenden Polypeptids, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Ybr180w steht, oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon wie in Spalte 7 von Tabelle II oder IV gezeigt, vorzugsweise ein Homolog oder funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle II B gezeigt, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Ybr180w steht,

Dementsprechend handelt es sich bei einer Ausführungsform bei dem Molekül, dessen Aktivität im erfindungsgemäßen Verfahren zu erhöhen ist, um das Genprodukt mit einer als „Dityrosintransporter” beschriebenen Aktivität; bevorzugt handelt es sich dabei um das in Abschnitt (a) oder (b) dieses Absatzes beschriebene Molekül. Gemäß einer Ausführungsform wird das Molekül, dessen Aktivität bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zu erhöhen ist und bei dem es sich um das Genprodukt mit einer als „Dityrosintransporter” beschriebenen Aktivität handelt, zytoplasmatisch erhöht.
Die Sequenz von Ydr284c aus Saccharomyces cerevisiae, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt, wurde veröffentlicht [Sequenzen aus Saccharomyces cerevisiae wurden in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546–547, 1996 veröffentlicht, Sequenzen aus Escherichia coli wurden in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453–1474 (1997) veröffentlicht und ihre Aktivität wurde als Diacylglycerolpyrophosphatphosphatase beschrieben veröffentlicht.
Dementsprechend umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung gemäß einer Ausführungsform die Erhöhung oder Erzeugung der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität einer „Diacylglycerolpyrophosphatphosphatase” aus Saccharomyces cerevisiae oder einem funktionellen Äquivalent davon oder einem Homolog davon, z. B. die Erhöhung

(a) eines Genprodukts eines Gens, das das Nukleinsäuremolekül, welches wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt ist und in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Ydr284c steht, oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon wie in Spalte 7 von Tabelle I gezeigt, vorzugsweise ein Homolog oder funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle I B gezeigt, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Ydr284c steht, umfasst; oder
(b) eines ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie in Spalte 5 von Tabelle II gezeigt umfassenden Polypeptids, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Ydr284c steht, oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon wie in Spalte 7 von Tabelle II oder IV gezeigt, vorzugsweise ein Homolog oder funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle II B gezeigt, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Ydr284c steht,

Dementsprechend handelt es sich bei einer Ausführungsform bei dem Molekül, dessen Aktivität im erfindungsgemäßen Verfahren zu erhöhen ist, um das Genprodukt mit einer als „Diacylglycerolpyrophosphatphosphatase” beschriebenen Aktivität; bevorzugt handelt es sich dabei um das in Abschnitt (a) oder (b) dieses Absatzes beschriebene Molekül.
Gemäß einer Ausführungsform wird das Molekül, dessen Aktivität bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zu erhöhen ist und bei dem es sich um das Genprodukt mit einer als „Diacylglycerolpyrophosphatphosphatase” beschriebenen Aktivität handelt, zytoplasmatisch erhöht.
Die Sequenz von Ydr445c aus Saccharomyces cerevisiae, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt, wurde veröffentlicht [Sequenzen aus Saccharomyces cerevisiae wurden in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546–547, 1996 veröffentlicht, Sequenzen aus Escherichia coli wurden in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453–1474 (1997) veröffentlicht und ihre Aktivität wurde als Ydr445c-Protein beschrieben veröffentlicht. Dementsprechend umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung gemäß einer Ausführungsform die Erhöhung oder Erzeugung der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität eines „Ydr445c-Proteins” aus Saccharomyces cerevisiae oder einem funktionellen Äquivalent davon oder einem Homolog davon, z. B. die Erhöhung

(a) eines Genprodukts eines Gens, das das Nukleinsäuremolekül, welches wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt ist und in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Ydr445c steht, oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon wie in Spalte 7 von Tabelle I gezeigt, vorzugsweise ein Homolog oder funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle I B gezeigt, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Ydr445c steht, umfasst; oder
(b) eines ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie in Spalte 5 von Tabelle II gezeigt umfassenden Polypeptids, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Ydr445c steht, oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon wie in Spalte 7 von Tabelle II oder IV gezeigt, vorzugsweise ein Homolog oder funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle II B gezeigt, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Ydr445c steht,

Dementsprechend handelt es sich bei einer Ausführungsform bei dem Molekül, dessen Aktivität im erfindungsgemäßen Verfahren zu erhöhen ist, um das Genprodukt mit einer als „ydr445c-Protein” beschriebenen Aktivität; bevorzugt handelt es sich dabei um das in Abschnitt (a) oder (b) dieses Absatzes beschriebene Molekül. Gemäß einer Ausführungsform wird das Molekül, dessen Aktivität bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zu erhöhen ist und bei dem es sich um das Genprodukt mit einer als „ydr445c-Protein” beschriebenen Aktivität handelt, zytoplasmatisch erhöht.
Die Sequenz von Yhr047c aus Saccharomyces cerevisiae, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt, wurde veröffentlicht [Sequenzen aus Saccharomyces cerevisiae wurden in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546–547, 1996 veröffentlicht, Sequenzen aus Escherichia coli wurden in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453–1474 (1997) veröffentlicht und ihre Aktivität wurde als Arginin/Alaninaminopeptidase beschrieben veröffentlicht.
Dementsprechend umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung gemäß einer Ausführungsform die Erhöhung oder Erzeugung der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität einer „Arginin/Alaninaminopeptidase” aus Saccharomyces cerevisiae oder einem funktionellen Äquivalent davon oder einem Homolog davon, z. B. die Erhöhung

(a) eines Genprodukts eines Gens, das das Nukleinsäuremolekül, welches wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt ist und in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Yhr047c steht, oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon wie in Spalte 7 von Tabelle I gezeigt, vorzugsweise ein Homolog oder funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle I B gezeigt, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Yhr047c steht, umfasst; oder
(b) eines ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie in Spalte 5 von Tabelle II gezeigt umfassenden Polypeptids, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Yhr047c steht, oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon wie in Spalte 7 von Tabelle II oder IV gezeigt, vorzugsweise ein Homolog oder funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle II B gezeigt, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Yhr047c steht,

Dementsprechend handelt es sich bei einer Ausführungsform bei dem Molekül, dessen Aktivität im erfindungsgemäßen Verfahren zu erhöhen ist, um das Genprodukt mit einer als „Arginin-/Alaninaminopeptidase” beschriebenen Aktivität; bevorzugt handelt es sich dabei um das in Abschnitt (a) oder (b) dieses Absatzes beschriebene Molekül. Gemäß einer Ausführungsform wird das Molekül, dessen Aktivität bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zu erhöhen ist und bei dem es sich um das Genprodukt mit einer als „Arginin-/Alaninaminopeptidase” beschriebenen Aktivität handelt, zytoplasmatisch erhöht.
Die Sequenz von Yhr190w aus Saccharomyces cerevisiae, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt, wurde veröffentlicht [Sequenzen aus Saccharomyces cerevisiae wurden in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546–547, 1996 veröffentlicht, Sequenzen aus Escherichia coli wurden in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453–1474 (1997) veröffentlicht und ihre Aktivität wurde als Farnesyldiphosphatfarnesyltransferase beschrieben veröffentlicht.
Dementsprechend umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung gemäß einer Ausführungsform die Erhöhung oder Erzeugung der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität einer „Farnesyldiphosphatfarnesyltransferase” aus Saccharomyces cerevisiae oder einem funktionellen Äquivalent davon oder einem Homolog davon, z. B. die Erhöhung

(a) eines Genprodukts eines Gens, das das Nukleinsäuremolekül, welches wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt ist und in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Yhr190w steht, oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon wie in Spalte 7 von Tabelle I gezeigt, vorzugsweise ein Homolog oder funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle I B gezeigt, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Yhr190w steht, umfasst; oder
(b) eines ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie in Spalte 5 von Tabelle II gezeigt umfassenden Polypeptids, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Yhr190w steht, oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon wie in Spalte 7 von Tabelle II oder IV gezeigt, vorzugsweise ein Homolog oder funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle II B gezeigt, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Yhr190w steht,

Dementsprechend handelt es sich bei einer Ausführungsform bei dem Molekül, dessen Aktivität im erfindungsgemäßen Verfahren zu erhöhen ist, um das Genprodukt mit einer als „Farnesyldiphosphatfarnesyltransferase” beschriebenen Aktivität; bevorzugt handelt es sich dabei um das in Abschnitt (a) oder (b) dieses Absatzes beschriebene Molekül.
Gemäß einer Ausführungsform wird das Molekül, dessen Aktivität bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zu erhöhen ist und bei dem es sich um das Genprodukt mit einer als „Farnesyldiphosphatfarnesyltransferase” beschriebenen Aktivität handelt, plastidisch erhöht.
Die Sequenz von Ykl094w aus Saccharomyces cerevisiae, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt, wurde veröffentlicht [Sequenzen aus Saccharomyces cerevisiae wurden in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546–547, 1996 veröffentlicht, Sequenzen aus Escherichia coli wurden in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453–1474 (1997) veröffentlicht und ihre Aktivität wurde als Serinhydrolase beschrieben veröffentlicht. Dementsprechend umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung gemäß einer Ausführungsform die Erhöhung oder Erzeugung der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität einer „Serinhydrolase” aus Saccharomyces cerevisiae oder einem funktionellen Äquivalent davon oder einem Homolog davon, z. B. die Erhöhung

(a) eines Genprodukts eines Gens, das das Nukleinsäuremolekül, welches wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt ist und in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Ykl094w steht, oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon wie in Spalte 7 von Tabelle I gezeigt, vorzugsweise ein Homolog oder funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle I B gezeigt, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Ykl094w steht, umfasst; oder
(b) eines ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie in Spalte 5 von Tabelle II gezeigt umfassenden Polypeptids, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Ykl094w steht, oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon wie in Spalte 7 von Tabelle II oder IV gezeigt, vorzugsweise ein Homolog oder funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle II B gezeigt, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Ykl094w steht,

Dementsprechend handelt es sich bei einer Ausführungsform bei dem Molekül, dessen Aktivität im erfindungsgemäßen Verfahren zu erhöhen ist, um das Genprodukt mit einer als „Serinhydrolase” beschriebenen Aktivität; bevorzugt handelt es sich dabei um das in Abschnitt (a) oder (b) dieses Absatzes beschriebene Molekül.
Gemäß einer Ausführungsform wird das Molekül, dessen Aktivität bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zu erhöhen ist und bei dem es sich um das Genprodukt mit einer als „Serinhydrolase” beschriebenen Aktivität handelt, zytoplasmatisch erhöht.
Die Sequenz von Ykr097w aus Saccharomyces cerevisiae, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt, wurde veröffentlicht [Sequenzen aus Saccharomyces cerevisiae wurden in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546–547, 1996 veröffentlicht, Sequenzen aus Escherichia coli wurden in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453–1474 (1997) veröffentlicht und ihre Aktivität wurde als Phosphoenolpyruvatcarboxylkinase beschrieben veröffentlicht.
Dementsprechend umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung gemäß einer Ausführungsform die Erhöhung oder Erzeugung der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität einer „Phosphoenolpyruvatcarboxylkinase” aus Saccharomyces cerevisiae oder einem funktionellen Äquivalent davon oder einem Homolog davon, z. B. die Erhöhung

(a) eines Genprodukts eines Gens, das das Nukleinsäuremolekül, welches wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt ist und in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Ykr097w steht, oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon wie in Spalte 7 von Tabelle I gezeigt, vorzugsweise ein Homolog oder funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle I B gezeigt, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Ykr097w steht, umfasst; oder
(b) eines ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie in Spalte 5 von Tabelle II gezeigt umfassenden Polypeptids, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Ykr097w steht, oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon wie in Spalte 7 von Tabelle II oder IV gezeigt, vorzugsweise ein Homolog oder funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle II B gezeigt, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Ykr097w steht,

Dementsprechend handelt es sich bei einer Ausführungsform bei dem Molekül, dessen Aktivität im erfindungsgemäßen Verfahren zu erhöhen ist, um das Genprodukt mit einer als „Phosphoenolpyruvatcarboxylkinase” beschriebenen Aktivität; bevorzugt handelt es sich dabei um das in Abschnitt (a) oder (b) dieses Absatzes beschriebene Molekül.
Gemäß einer Ausführungsform wird das Molekül, dessen Aktivität bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zu erhöhen ist und bei dem es sich um das Genprodukt mit einer als „Phosphoenolpyruvatcarboxylkinase” beschriebenen Aktivität handelt, zytoplasmatisch erhöht.
Die Sequenz von Ynr012w aus Saccharomyces cerevisiae, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt, wurde veröffentlicht [Sequenzen aus Saccharomyces cerevisiae wurden in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546–547, 1996 veröffentlicht, Sequenzen aus Escherichia coli wurden in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453–1474 (1997) veröffentlicht und ihre Aktivität wurde als Uridinkinase beschrieben veröffentlicht. Dementsprechend umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung gemäß einer Ausführungsform die Erhöhung oder Erzeugung der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität einer „Uridinkinase” aus Saccharomyces cerevisiae oder einem funktionellen Äquivalent davon oder einem Homolog davon, z. B. die Erhöhung

(a) eines Genprodukts eines Gens, das das Nukleinsäuremolekül, welches wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt ist und in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Ynr012w steht, oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon wie in Spalte 7 von Tabelle I gezeigt, vorzugsweise ein Homolog oder funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle I B gezeigt, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Ynr012w steht, umfasst; oder
(b) eines ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie in Spalte 5 von Tabelle II gezeigt umfassenden Polypeptids, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Ynr012w steht, oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon wie in Spalte 7 von Tabelle II oder IV gezeigt, vorzugsweise ein Homolog oder funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle II B gezeigt, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Ynr012w steht,

Dementsprechend handelt es sich bei einer Ausführungsform bei dem Molekül, dessen Aktivität im erfindungsgemäßen Verfahren zu erhöhen ist, um das Genprodukt mit einer als „Uridinkinase” beschriebenen Aktivität; bevorzugt handelt es sich dabei um das in Abschnitt (a) oder (b) dieses Absatzes beschriebene Molekül. Gemäß einer Ausführungsform wird das Molekül, dessen Aktivität bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zu erhöhen ist und bei dem es sich um das Genprodukt mit einer als „Uridinkinase” beschriebenen Aktivität handelt, zytoplasmatisch erhöht.
Die Sequenz von Ypl133c aus Saccharomyces cerevisiae, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt, wurde veröffentlicht [Sequenzen aus Saccharomyces cerevisiae wurden in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546–547, 1996 veröffentlicht, Sequenzen aus Escherichia coli wurden in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453–1474 (1997) veröffentlicht und ihre Aktivität wurde als an der Übertragung von Ketoconazolresistenz beteiligter transkriptioneller Regulator beschrieben veröffentlicht. Dementsprechend umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung gemäß einer Ausführungsform die Erhöhung oder Erzeugung der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität eines „an der Übertragung von Ketoconazolresistenz beteiligten transkriptionellen Regulators” aus Saccharomyces cerevisiae oder einem funktionellen Äquivalent davon oder einem Homolog davon, z. B. die Erhöhung

(a) eines Genprodukts eines Gens, das das Nukleinsäuremolekül, welches wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt ist und in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Ypl133c steht, oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon wie in Spalte 7 von Tabelle I gezeigt, vorzugsweise ein Homolog oder funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle I B gezeigt, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Ypl133c steht, umfasst; oder
(b) eines ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv wie in Spalte 5 von Tabelle II gezeigt umfassenden Polypeptids, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Ypl133c steht, oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon wie in Spalte 7 von Tabelle II oder IV gezeigt, vorzugsweise ein Homolog oder funktionelles Äquivalent wie in Spalte 7 von Tabelle II B gezeigt, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie dieses Ypl133c steht,

Dementsprechend handelt es sich bei einer Ausführungsform bei dem Molekül, dessen Aktivität im erfindungsgemäßen Verfahren zu erhöhen ist, um das Genprodukt mit einer als „an der Übertragung von Ketoconazolresistenz beteiligter transkriptioneller Regulator„ beschriebenen Aktivität; bevorzugt handelt es sich dabei um das in Abschnitt (a) oder (b) dieses Absatzes beschriebene Molekül.
Gemäß einer Ausführungsform wird das Molekül, dessen Aktivität bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zu erhöhen ist und bei dem es sich um das Genprodukt mit einer als „an der Übertragung von Ketoconazolresistenz beteiligter transkriptioneller Regulator” beschriebenen Aktivität handelt, plastidisch erhöht.
Es wurde beobachtet, dass man durch Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines in Tabelle Villa gezeigten YRP-Gens, z. B. eines von dem in Tabelle Villa gezeigten Nukleinsäuremoleküls abgeleiteten Nukleinsäuremoleküls A. thaliana eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung, z. B. eine erhöhte Effizienz der Stickstoffausnutzung, verglichen mit der Kontrolle vom Wildtyp verlieh. Somit wird gemäß einer Ausführungsform ein in Tabelle Villa aufgeführtes Nukleinsäuremolekül oder sein wie in Tabelle I gezeigtes Homolog oder das Expressionsprodukt im Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt, um die Effizienz der Nährstoffausnutzung, z. B. um die Effizienz der Stickstoffausnutzung, einer Pflanze verglichen mit der Kontrolle vom Wildtyp zu erhöhen.
Es wurde weiterhin beobachtet, dass man durch Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines in Tabelle VIIIb gezeigten YRP-Gens, z. B. eines von dem in Tabelle VIIIb gezeigten Nukleinsäuremoleküls abgeleiteten Nukleinsäuremoleküls A. thaliana eine erhöhte Stresstoleranz, z. B. eine erhöhte Toleranz gegenüber niedrigen Temperaturen, verglichen mit der Kontrolle vom Wildtyp verlieh. Somit wird gemäß einer Ausführungsform ein in Tabelle VIIIb aufgeführtes Nukleinsäuremolekül oder sein wie in Tabelle I gezeigtes Homolog oder das Expressionsprodukt im Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt, um die Stresstoleranz, z. B. die Toleranz gegenüber niedrigen Temperaturen, einer Pflanze verglichen mit der Kontrolle vom Wildtyp zu erhöhen.
Es wurde weiterhin beobachtet, dass man durch Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines in Tabelle VIIIc gezeigten YRP-Gens, z. B. eines von dem in Tabelle VIIIc gezeigten Nukleinsäuremoleküls abgeleiteten Nukleinsäuremoleküls A. thaliana eine erhöhte Stresstoleranz, z. B. eine erhöhte Toleranz gegenüber zyklischer Dürre, verglichen mit der Kontrolle vom Wildtyp verlieh. Somit wird gemäß einer Ausführungsform ein in Tabelle VIIIc aufgeführtes Nukleinsäuremolekül oder sein wie in Tabelle I gezeigtes Homolog oder das Expressionsprodukt im Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt, um die Stresstoleranz, z. B. die Toleranz gegenüber zyklischer Dürre, einer Pflanze verglichen mit der Kontrolle vom Wildtyp zu erhöhen.
Es wurde weiterhin beobachtet, dass man durch Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines in Tabelle VIIId gezeigten YRP-Gens, z. B. eines von dem in Tabelle VIIId gezeigten Nukleinsäuremoleküls abgeleiteten Nukleinsäuremoleküls A. thaliana einen erhöhten intrinsischen Ertrag, z. B. eine erhöhte Biomasse unter Standardbedingungen, z. B. eine erhöhte Biomasse unter Nicht-Mangel- oder Nicht-Stress-Bedingungen, verglichen mit der Kontrolle vom Wildtyp verlieh. Somit wird gemäß einer Ausführungsform ein in Tabelle VIIId aufgeführtes Nukleinsäuremolekül oder sein wie in Tabelle I gezeigtes Homolog oder das Expressionsprodukt im Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt, um den intrinsischen Ertrag, z. B. die Biomasse unter Standardbedingungen, z. B. die Biomasse unter Nicht-Mangel- oder Nicht-Stress-Bedingungen, einer Pflanze verglichen mit der Kontrolle vom Wildtyp zu erhöhen.
Überraschenderweise wurde beobachtet, dass man durch Erhöhen oder Erzeugen wenigstens eines Gens, welches eine Aktivität ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Phosphoenolpyruvatcarboxylkinase, Arginin/Alanin-Aminopeptidase, D-Alanyl-D-alanincarboxypeptidase, Diacylglycerolpyrophosphatphosphatase, Dityrosintransporter, Farnesyldiphosphatfarnesyltransferase, NAD+-abhängiger Betainaldehyddehydrogenase, Serinhydrolase, dem an der Übertragung von Ketoconazolresistenz beteiligten transkriptionellen Regulator, Uridinkinase, dem yal043c-a-Protein, dem ybr071w-Protein und dem ydr445c-Protein verleiht, oder eines Gens, welches eine in Spalte 5 von Tabelle I beschriebene Nukleinsäuresequenz umfasst, Arabidopsis thaliana einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, in den transformierten Pflanzen verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanze von Wildtyp verlieh.
Es wurde beobachtet, dass man durch Erhöhen bzw. Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität einer „NAD+-abhängigen Betainaldehyddehydrogenase^„, kodiert durch ein Gen, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO.: 63 umfasst, Arabidopsis thaliana einen zwischen 1,1% und 1,577-fach erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit der Kontrolle vom Wildtyp, verlieh, wie in den Beispielen gezeigt.
Es wurde beobachtet, dass man durch Erhöhen bzw. Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität einer „D-Alanyl-D-alanincarboxypeptidase”, kodiert durch ein Gen, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO.: 623 umfasst, Arabidopsis thaliana einen zwischen 1,1% und 1,200-fach erhöhten. Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit der Kontrolle vom Wildtyp, verlieh, wie in den Beispielen gezeigt.
Es wurde beobachtet, dass man durch Erhöhen bzw. Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität eines „yal043c-a-Proteins”, kodiert durch ein Gen, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO.: 724 umfasst, Arabidopsis thaliana einen zwischen 1,1% und 1,570-fach erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit der Kontrolle vom Wildtyp, verlieh, wie in den Beispielen gezeigt.
Es wurde beobachtet, dass man durch Erhöhen bzw. Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität eines „ybr071w-Proteins”, kodiert durch ein Gen, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO.: 728 umfasst, Arabidopsis thaliana einen zwischen 1,1% und 1,673-fach erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit der Kontrolle vom Wildtyp, verlieh, wie in den Beispielen gezeigt.
Es wurde beobachtet, dass man durch Erhöhen bzw. Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität eines „Dityrosintransporters”, kodiert durch ein Gen, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO.: 732 umfasst, Arabidopsis thaliana einen zwischen 1,1% und 1,381-fach erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit der Kontrolle vom Wildtyp, verlieh, wie in den Beispielen gezeigt.
Es wurde beobachtet, dass man durch Erhöhen bzw. Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität einer „Diacylglycerolpyrophosphatphosphatase”, kodiert durch ein Gen, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO.: 764 umfasst, Arabidopsis thaliana einen zwischen 1,1% und 1,381-fach erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit der Kontrolle vom Wildtyp, verlieh, wie in den Beispielen gezeigt.
Es wurde beobachtet, dass man durch Erhöhen bzw. Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität eines „ydr445c-Proteins”, kodiert durch ein Gen, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO.: 814 umfasst, Arabidopsis thaliana einen zwischen 1,1% und 1,299-fach erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit der Kontrolle vom Wildtyp, verlieh, wie in den Beispielen gezeigt.
Es wurde beobachtet, dass man durch Erhöhen bzw. Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität einer „Arginin-/Alaninaminopeptidase”, kodiert durch ein Gen, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO.: 818 umfasst, Arabidopsis thaliana einen zwischen 1,1% und 1,320-fach erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit der Kontrolle vom Wildtyp, verlieh, wie in den Beispielen gezeigt.
Es wurde beobachtet, dass man durch Erhöhen bzw. Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität einer „Farnesyldiphosphatfarnesyltransferase”, kodiert durch ein Gen, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO.: 925 umfasst, Arabidopsis thaliana einen zwischen 1,1% und 1,550-fach erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit der Kontrolle vom Wildtyp, verlieh, wie in den Beispielen gezeigt.
Es wurde beobachtet, dass man durch Erhöhen bzw. Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität einer „Serinhydrolase”, kodiert durch ein Gen, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO.: 1021 umfasst, Arabidopsis thaliana einen zwischen 1,1% und 1,408-fach erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit der Kontrolle vom Wildtyp, verlieh, wie in den Beispielen gezeigt.
Es wurde beobachtet, dass man durch Erhöhen bzw. Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität einer „Phosphoenolpyruvatcarboxylkinase”, kodiert durch ein Gen, das die Nukleinsäuresequenz. SEQ ID NO.: 1157 umfasst, Arabidopsis thaliana einen zwischen 1,1% und 1,698-fach erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit der Kontrolle vom Wildtyp, verlieh, wie in den Beispielen gezeigt.
Es wurde beobachtet, dass man durch Erhöhen bzw. Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität einer „Uridinkinase”, kodiert durch ein Gen, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO.: 1352 umfasst, Arabidopsis thaliana einen zwischen 1,1% und 1,377-fach erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit der Kontrolle vom Wildtyp, verlieh, wie in den Beispielen gezeigt.
Es wurde beobachtet, dass man durch Erhöhen bzw. Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts mit der Aktivität eines „an der Übertragung von Ketoconazolresistenz beteiligten transkriptionellen Regulators”, kodiert durch ein Gen, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO.: 1423 umfasst, Arabidopsis thaliana einen zwischen 1,1% und 1,500-fach erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit der Kontrolle vom Wildtyp, verlieh, wie in den Beispielen gezeigt.
So lässt sich gemäß dem Verfahren der Erfindung ein erhöhter Ertrag unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon verglichen mit einer Kontrolle oder einem Wildtyp erzielen.
Dementsprechend wird bei einer Ausführungsform, wenn man die Aktivität eines Polypeptids gemäß der Polypeptid-SEQ ID NO.: 64 oder kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, welches die Nukleinsäure-SEQ ID NO.: 63 umfasst, oder eines Homologs dieses Nukleinsäuremoleküls bzw. Polypeptids erhöht oder erzeugt, z. B. wenn man die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 in jeweils der gleichen Zeile wie das Nukleinsäuremolekül SEQ ID NO.: 63 beziehungsweise das Polypeptid SEQ ID NO.: 64 gezeigt umfasst, erhöht oder erzeugt, oder wenn man die Aktivität „NAD+-abhängige Betainaldehyddehydrogenase” in einem Organismus erhöht oder erzeugt, vorzugsweise dem Organismus ein zwischen 1,1% und 1,577-fach erhöhter Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit der Kontrolle vom Wildtyp verliehen.
Dementsprechend wird bei einer Ausführungsform, wenn man die Aktivität eines Polypeptids gemäß der Polypeptid-SEQ ID NO.: 624 oder kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, welches die Nukleinsäure-SEQ ID NO.: 623 umfasst, oder eines Homologs dieses Nukleinsäuremoleküls bzw. Polypeptids erhöht oder erzeugt, z. B. wenn man die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 in jeweils der gleichen Zeile wie das Nukleinsäuremolekül SEQ ID NO.: 623 beziehungsweise das Polypeptid SEQ ID NO.: 624 gezeigt umfasst, erhöht oder erzeugt, oder wenn man die Aktivität „D-Alanyl-D-alanincarboxypeptidase” in einem Organismus erhöht oder erzeugt, vorzugsweise dem Organismus ein zwischen 1,1% und 1,200-fach erhöhter Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit der Kontrolle vom Wildtyp verliehen.
Dementsprechend wird bei einer Ausführungsform, wenn man die Aktivität eines Polypeptids gemäß der Polypeptid-SEQ ID NO.: 725 oder kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, welches die Nukleinsäure-SEQ ID NO.: 724 umfasst, oder eines Homologs dieses Nukleinsäuremoleküls bzw. Polypeptids erhöht oder erzeugt, z. B. wenn man die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 in jeweils der gleichen Zeile wie das Nukleinsäuremolekül SEQ ID NO.: 724 beziehungsweise das Polypeptid SEQ ID NO.: 725 gezeigt umfasst, erhöht oder erzeugt, oder wenn man die Aktivität „yal043c-a-Protein” in einem Organismus erhöht oder erzeugt, vorzugsweise dem Organismus ein zwischen 1,1% und 1,570-fach erhöhter Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit der Kontrolle vom Wildtyp verliehen.
Dementsprechend wird bei einer Ausführungsform, wenn man die Aktivität eines Polypeptids gemäß der Polypeptid-SEQ ID NO.: 729 oder kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, welches die Nukleinsäure-SEQ ID NO.: 728 umfasst, oder eines Homologs dieses Nukleinsäuremoleküls bzw. Polypeptids erhöht oder erzeugt, z. B. wenn man die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 in jeweils der gleichen Zeile wie das Nukleinsäuremolekül SEQ ID NO.: 728 beziehungsweise das Polypeptid SEQ ID NO.: 729 gezeigt umfasst, erhöht oder erzeugt, oder wenn man die Aktivität „ybr071w-Protein” in einem Organismus erhöht oder erzeugt, vorzugsweise dem Organismus ein zwischen 1,1% und 1,673-fach erhöhter Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit der Kontrolle vom Wildtyp verliehen.
Dementsprechend wird bei einer Ausführungsform, wenn man die Aktivität eines Polypeptids gemäß der Polypeptid-SEQ ID NO.: 733 oder kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, welches die Nukleinsäure-SEQ ID NO.: 732 umfasst, oder eines Homologs dieses Nukleinsäuremoleküls bzw. Polypeptids erhöht oder erzeugt, z. B. wenn man die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 in jeweils der gleichen Zeile wie das Nukleinsäuremolekül SEQ ID NO.: 732 beziehungsweise das Polypeptid SEQ ID NO.: 733 gezeigt umfasst, erhöht oder erzeugt, oder wenn man die Aktivität „Dityrosintransporter” in einem Organismus erhöht oder erzeugt, vorzugsweise dem Organismus ein zwischen 1,1% und 1,381-fach erhöhter Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit der Kontrolle vom Wildtyp verliehen.
Dementsprechend wird bei einer Ausführungsform, wenn man die Aktivität eines Polypeptids gemäß der Polypeptid-SEQ ID NO.: 765 oder kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, welches die Nukleinsäure-SEQ ID NO.: 764 umfasst, oder eines Homologs dieses Nukleinsäuremoleküls bzw. Polypeptids erhöht oder erzeugt, z. B. wenn man die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 in jeweils der gleichen Zeile wie das Nukleinsäuremolekül SEQ ID NO.: 764 beziehungsweise das Polypeptid SEQ ID NO.: 765 gezeigt umfasst, erhöht oder erzeugt, oder wenn man die Aktivität „Diacylglycerolpyrophosphatphosphatase” in einem Organismus erhöht oder erzeugt, vorzugsweise dem Organismus ein zwischen 1,1% und 1,381-fach erhöhter Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit der Kontrolle vom Wildtyp verliehen.
Dementsprechend wird bei einer Ausführungsform, wenn man die Aktivität eines Polypeptids gemäß der Polypeptid-SEQ ID NO.: 815 oder kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, welches die Nukleinsäure-SEQ ID NO.: 814 umfasst, oder eines Homologs dieses Nukleinsäuremoleküls bzw. Polypeptids erhöht oder erzeugt, z. B. wenn man die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 in jeweils der gleichen Zeile wie das Nukleinsäuremolekül SEQ ID NO.: 814 beziehungsweise das Polypeptid SEQ ID NO.: 815 gezeigt umfasst, erhöht oder erzeugt, oder wenn man die Aktivität „ydr445c-Protein” in einem Organismus erhöht oder erzeugt, vorzugsweise dem Organismus ein zwischen 1,1% und 1,299-fach erhöhter Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit der Kontrolle vom Wildtyp verliehen.
Dementsprechend wird bei einer Ausführungsform, wenn man die Aktivität eines Polypeptids gemäß der Polypeptid-SEQ ID NO.: 819 oder kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, welches die Nukleinsäure-SEQ ID NO.: 818 umfasst, oder eines Homologs dieses Nukleinsäuremoleküls bzw. Polypeptids erhöht oder erzeugt, z. B. wenn man die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 in jeweils der gleichen Zeile wie das Nukleinsäuremolekül SEQ ID NO.: 818 beziehungsweise das Polypeptid SEQ ID NO.: 819 gezeigt umfasst, erhöht oder erzeugt, oder wenn man die Aktivität „Arginin-/Alaninaminopeptidase” in einem Organismus erhöht oder erzeugt, vorzugsweise dem Organismus ein zwischen 1,1% und 1,320-fach erhöhter Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit der Kontrolle vom Wildtyp verliehen.
Dementsprechend wird bei einer Ausführungsform, wenn man die Aktivität eines Polypeptids gemäß der Polypeptid-SEQ ID NO.: 926 oder kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, welches die Nukleinsäure-SEQ ID NO.: 925 umfasst, oder eines Homologs dieses Nukleinsäuremoleküls bzw. Polypeptids erhöht oder erzeugt, z. B. wenn man die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 in jeweils der gleichen Zeile wie das Nukleinsäuremolekül SEQ ID NO.: 925 beziehungsweise das Polypeptid SEQ ID NO.: 926 gezeigt umfasst, erhöht oder erzeugt, oder wenn man die Aktivität „Farnesyldiphosphatfarnesyltransferase” in einem Organismus erhöht oder erzeugt, vorzugsweise dem Organismus ein zwischen 1,1% und 1,550-fach erhöhter Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit der Kontrolle vom Wildtyp verliehen.
Dementsprechend wird bei einer Ausführungsform, wenn man die Aktivität eines Polypeptids gemäß der Polypeptid-SEQ ID NO.: 1022 oder kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, welches die Nukleinsäure-SEQ ID NO.: 1021 umfasst, oder eines Homologs dieses Nukleinsäuremoleküls bzw. Polypeptids erhöht oder erzeugt, z. B. wenn man die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 in jeweils der gleichen Zeile wie das Nukleinsäuremolekül SEQ ID NO.: 1021 beziehungsweise das Polypeptid SEQ ID NO.: 1022 gezeigt umfasst, erhöht oder erzeugt, oder wenn man die Aktivität „Serinhydrolase” in einem Organismus erhöht oder erzeugt, vorzugsweise dem Organismus ein zwischen 1,1% und 1,408-fach erhöhter Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit der Kontrolle vom Wildtyp verliehen.
Dementsprechend wird bei einer Ausführungsform, wenn man die Aktivität eines Polypeptids gemäß der Polypeptid-SEQ ID NO.: 1158 oder kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, welches die Nukleinsäure-SEQ ID NO.: 1157 umfasst, oder eines Homologs dieses Nukleinsäuremoleküls bzw. Polypeptids erhöht oder erzeugt, z. B. wenn man die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 in jeweils der gleichen Zeile wie das Nukleinsäuremolekül SEQ ID NO.: 1157 beziehungsweise das Polypeptid SEQ ID NO.: 1158 gezeigt umfasst, erhöht oder erzeugt, oder wenn man die Aktivität „Phosphoenolpyruvatcarboxylkinase” in einem Organismus erhöht oder erzeugt, vorzugsweise dem Organismus ein zwischen 1,1% und 1,698-fach erhöhter Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit der Kontrolle vom Wildtyp verliehen.
Dementsprechend wird bei einer Ausführungsform, wenn man die Aktivität eines Polypeptids gemäß der Polypeptid-SEQ ID NO.: 1353 oder kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, welches die Nukleinsäure-SEQ ID NO.: 1352 umfasst, oder eines Homologs dieses Nukleinsäuremoleküls bzw. Polypeptids erhöht oder erzeugt, z. B. wenn man die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 in jeweils der gleichen Zeile wie das Nukleinsäuremolekül SEQ ID NO.: 1352 beziehungsweise das Polypeptid SEQ ID NO.: 1353 gezeigt umfasst, erhöht oder erzeugt, oder wenn man die Aktivität „Uridinkinase” in einem Organismus erhöht oder erzeugt, vorzugsweise dem Organismus ein zwischen 1,1% und 1,377-fach erhöhter Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit der Kontrolle vom Wildtyp verliehen.
Dementsprechend wird bei einer Ausführungsform, wenn man die Aktivität eines Polypeptids gemäß der Polypeptid-SEQ ID NO.: 1424 oder kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, welches die Nukleinsäure-SEQ ID NO.: 1423 umfasst, oder eines Homologs dieses Nukleinsäuremoleküls bzw. Polypeptids erhöht oder erzeugt, z. B. wenn man die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, welches die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv wie in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 in jeweils der gleichen Zeile wie das Nukleinsäuremolekül SEQ ID NO.: 1423 beziehungsweise das Polypeptid SEQ ID NO.: 1424 gezeigt umfasst, erhöht oder erzeugt, oder wenn man die Aktivität „an der Übertragung von Ketoconazolresistenz beteiligter transkriptioneller Regulator” in einem Organismus erhöht oder erzeugt, vorzugsweise dem Organismus ein zwischen 1,1% und 1,500-fach erhöhter Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit der Kontrolle vom Wildtyp verliehen.
Der Begriff „Expression” bezieht sich auf die Transkription und/oder Translation eines codogenen Gensegmentes oder Gens. In der Regel handelt es sich bei dem erhaltenen Produkt um eine mRNA oder ein Protein. Expressionsprodukte können jedoch auch funktionelle RNA wie zum Beispiel Antisense, Nukleinsäuren, tRNA, snRNA, rRNA, RNAi, siRNA, Ribozyme usw. einschließen. Die Expression kann systemisch, lokal oder zeitweilig erfolgen, zum Beispiel eingeschränkt auf bestimmte Zelltypen, Gewebe, Organe oder Organellen oder Zeitperioden.
Gemäß einer Ausführungsform umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung einen oder mehrere der folgenden Schritte

a) die Stabilisierung eines Proteins, das die erhöhte Expression eines durch das Nukleinsäuremolekül der Erfindung kodierten Proteins oder des Polypeptids der Erfindung mit der hier erwähnten Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Phosphoenolpyruvatcarboxylkinase, Arginin/Alanin-Aminopeptidase, D-Alanyl-D-alanincarboxypeptidase, Diacylglycerolpyrophosphatphosphatase, Dityrosintransporter, Farnesyldiphosphatfarnesyltransferase, NAD+-abhängiger Betainaldehyddehydrogenase, Serinhydrolase, dem an der Übertragung von Ketoconazolresistenz beteiligten transkriptionellen Regulator, Uridinkinase, dem yal043c-a-Protein, dem ybr071w-Protein und dem ydr445c-Protein verleiht und einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verleiht;
b) die Stabilisierung einer mRNA, die die erhöhte Expression eines YRP, welches z. B. für ein wie in (a) erwähntes Polypeptid kodiert, verleiht;
c) die Erhöhung der spezifischen Aktivität eines Proteins, welches die erhöhte Expression eines YRP, welches z. B. für ein wie in (a) erwähntes Polypeptid kodiert, verleiht;
d) die Erzeugung oder Erhöhung der Expression eines endogenen oder künstlichen Transkriptionsfaktors, der die Expression eines YRP vermittelt, welches z. B. für ein wie in (a) erwähntes Polypeptid kodiert;
e) die Stimulierung der Aktivität eines Proteins, welches die erhöhte Expression eines YRP, welches z. B. für ein wie in (a) erwähntes Polypeptid kodiert, verleiht;
f) die Expression eines transgenen Gens, das für ein Protein kodiert, welches die erhöhte Expression eines YRP, welches z. B. für ein wie in (a) erwähntes Polypeptid kodiert, verleiht; und/oder
g) die Erhöhung der Kopienzahl eines Gens, welches die erhöhte Expression eines YRP, welches z. B. für ein wie in (a) erwähntes Polypeptid kodiert, verleiht;
h) die Erhöhung der Expression des endogenen Gens, das für das YRP, z. B. ein wie in (a) erwähntes Polypeptid, kodiert, durch Zugabe von positiven Expressionselementen oder durch Entfernen von negativen Expressionselementen; so lassen sich z. B. mit homologer Rekombination entweder positive Regulationselemente, wie für Pflanzen der 35S-Enhancer, in den Promotor einführen oder Repressorelemente aus regulatorischen Regionen entfernen. Weiterhin lassen sich Methoden zur Genumwandlung anwenden, um Repressorelemente zu stören oder um die Aktivität positiver Elemente zu steigern – positive Elemente lassen sich durch T-DNA oder Transposonmutagenese ungezielt in Pflanzen einführen, und die Linien, bei denen die positiven Elemente in der Nähe eines erfindungsgemäßen Gens integriert worden sind und deren Expression daher gesteigert ist, können identifiziert werden; und/oder
i) die Modulierung der Wachstumsbedingungen der Pflanze derart, dass die Expression oder Aktivität des YRP, welches z. B. für ein wie in (a) erwähntes Polypeptid kodiert, oder das Protein selbst gesteigert ist;
j) die Auswahl von Organismen mit besonders hoher Aktivität des YRP, welches z. B. für ein wie in (a) erwähntes Polypeptid kodiert, aus natürlichen oder aus mutagenisierten Quellen und deren Züchtung in die Zielorganismen, z. B. die Elite-Kulturpflanzen.

Vorzugsweise handelt es sich bei der mRNA um das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung, und/oder das Protein, das die erhöhte Expression eines durch das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung alleine oder in Verbindung mit einer Transitnukleinsäuresequenz bzw. einer für das Transitpeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz kodierten Proteins oder des Polypeptids mit der hier erwähnten Aktivität verleiht, z. B. einen gesteigerten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon nach Erhöhen der Expression oder Aktivität des kodierten Polypeptids verleiht oder die Aktivität eines Polypeptids mit einer Aktivität wie das wie in Tabelle II, Spalte 3, gezeigte Protein II oder dessen Homolog hat.
Im Allgemeinen korreliert die Menge an mRNA oder Polypeptid in einer Zelle oder einem Kompartiment eines Organismus mit der Menge an kodiertem Protein und somit mit der Gesamtaktivität des kodierten Proteins in diesem Volumen. Diese Korrelation ist nicht immer linear, und die Aktivität in dem Volumen hängt von der Stabilität der Moleküle oder dem Vorhandensein aktivierender oder inhibierender Cofaktoren ab. Weiterhin sind Produkt- und Eduktinhibierungen von Enzymen gut bekannt und in Lehrbüchern, z. B. Stryer, Biochemistry, beschrieben.
Im Allgemeinen korreliert die Menge an mRNA, Polynukleotid oder Nukleinsäuremolekül in einer Zelle oder einem Kompartiment eines Organismus mit der Menge an kodiertem Protein und somit mit der Gesamtaktivität des kodierten Proteins in diesem Volumen. Diese Korrelation ist nicht immer linear, sondern die Aktivität in dem Volumen ist abhängig von der Stabilität der Moleküle, dem Abbau der Moleküle oder der Gegenwart von aktivierenden oder inhibierenden Cofaktoren. Weiterhin sind Produkt- und Eduktinhibierungen von Enzymen gut bekannt, z. B. Zinser et al. "Enzyminhibitoren"/„Enzyme inhibitors".
Die Aktivität der obenerwähnten Proteine und/oder Polypeptide, die durch das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung kodiert werden, lässt sich auf verschiedene Weisen erhöhen. So wird zum Beispiel die Aktivität in einem Organismus oder in einem Teil davon wie einer Zelle erhöht, indem man die Anzahl an Genprodukten erhöht, z. B. durch Erhöhen der Expressionsrate, wie der Einführung eines stärkeren Promotors, oder durch Erhöhen der Stabilität der exprimierten mRNA, wodurch die Translationsrate erhöht wird, und/oder durch Erhöhen der Stabilität des Genprodukts, wodurch die Anzahl der zerfallenen Proteine reduziert wird. Weiterhin kann man die Aktivität oder den Umsatz von Enzymen so beeinflussen, dass eine Abnahme oder Zunahme der Reaktionsrate oder eine Modifikation (Abnahme oder Zunahme) der Affinität zu den Substratergebnissen erreicht wird. Eine Mutation im katalytischen Zentrum eines Polypeptids der Erfindung, z. B. als Enzym, kann die Umsatzrate des Enzyms modulieren, ein Eliminieren einer essentiellen Aminosäure zum Beispiel kann eine verminderte oder vollständig abgeschaltete Aktivität des Enzyms zur Folge haben, oder die Deletion oder Mutation von Regulator-Bindungsstellen kann eine negative Regulation wie eine Rückkopplungsinhibierung (oder eine Substratinhibierung, wenn die Substratkonzentration ebenfalls erhöht wird) reduzieren. Die spezifische Aktivität eines Enzyms der vorliegenden Erfindung lässt sich so erhöhen, dass die Umsatzrate erhöht ist oder die Bindung eines Cofaktors verbessert ist. Durch eine Verbesserung der Stabilität der kodierenden mRNA oder des Proteins lässt sich auch die Aktivität eines Genprodukts erhöhen. Die Stimulierung der Aktivität fällt ebenfalls unter den Umfang des Ausdrucks „erhöhte Aktivität”.
Außerdem kann man die Regulation der obenerwähnten Nukleinsäuresequenzen so modifizieren, dass die Genexpression erhöht wird. Dies lässt sich vorteilhaft mit Hilfe von heterologen regulatorischen Sequenzen erreichen, oder indem man die vorhandenen natürlichen regulatorischen Seqenzen modifiziert, zum Beispiel mutiert. Die vorteilhaften Methoden können auch miteinander kombiniert werden.
Im Allgemeinen lässt sich eine Aktivität eines Genprodukts in einem Organismus oder einem Teil davon, insbesondere in einer Pflanzenzelle oder einer Organelle einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Pflanzengewebe oder einem Teil davon oder in einem Mikroorganismus erhöhen, indem man die Menge an spezifisch kodierender mRNA oder des entsprechenden Proteins in diesem Organismus oder einem Teil davon erhöht. „Menge an Protein oder mRNA” ist so zu verstehen, dass damit die Molekülzahl an Polypeptiden oder mRNA-Molekülen in einem Organismus, insbesondere einer Pflanze, einem Gewebe, einer Zelle oder einem Zellkompartiment gemeint ist. Eine „Erhöhung” der Menge eines Proteins bedeutet die quantitative Erhöhung der Molekülzahl dieses Proteins in einem Organismus, insbesondere einer Pflanze, einem Gewebe, einer Zelle oder einem Zellkompartiment wie einer Organelle wie z. B. einem Plastid oder Mitochondrien oder einem Teil davon – zum Beispiel durch eine der hier unten beschriebenen Methoden – im Vergleich zu einem Wildtyp, einer Kontrolle oder einer Referenz.
Die Erhöhung der Molekülzahl beläuft sich vorzugsweise auf mindestens 1%, vorzugsweise auf mehr als 10%, besonders bevorzugt auf 30% oder mehr, insbesondere bevorzugt auf 50%, 70% oder mehr, ganz insbesondere bevorzugt auf 100%, ganz besonders bevorzugt auf 500% oder mehr. Eine de-novo-Expression wird jedoch ebenfalls als Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrachtet.
Eine Modifikation, d. h. eine Erhöhung, kann durch endogene oder exogene Faktoren bewirkt werden. So kann zum Beispiel eine Erhöhung der Aktivität in einem Organismus oder einem Teil davon herbeigeführt werden, indem man ein Genprodukt oder eine Vorstufe davon oder einen Aktivator oder einen Agonisten zum Medium oder der Nahrung gibt, oder sie kann herbeigeführt werden, indem man diese Gegenstände transient oder stabil in einen Organismus einführt. Weiterhin lässt sich eine solche Erhöhung durch die Einführung der erfinderischen Nukleinsäuresequenz oder des kodierten Proteins in das korrekte Zellkompartiment, zum Beispiel in den Kern oder das Zytoplasma oder in Plastide entweder durch Transformation und/oder durch Targeting erzielen.
Gemäß einer Ausführungsform erreicht man die Zunahme oder Abnahme der Toleranz und/oder der Resistenz gegenüber Umweltstress, verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle in der Wildtyppflanze oder einem Teil davon, z. B. in einer Zelle, einem Gewebe, einem Organ, einem Organell usw., indem man die endogene Konzentration des Polypeptids der Erfindung erhöht. Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren, bei dem man die Genkopienzahl eines für das Polynukleotid oder Nukleinsäuremolekül der Erfindung kodierenden Gens erhöht. Weiterhin lässt sich die endogene Konzentration des Polypeptids der Erfindung zum Beispiel erhöhen, indem man die transkriptionelle oder translationale Regulation des Polypeptids modifiziert.
Gemäß einer Ausführungsform lässt sich die Zunahme oder Abnahme der Toleranz und/oder der Resistenz gegenüber Umweltstress in der Pflanze oder einem Teil davon durch gezielte oder zufällige Mutagenese der endogenen erfindungsgemäßen Gene verändern. So lassen sich zum Beispiel mit homologer Rekombination entweder positive Regulationselemente, wie für Pflanzen der 35S-Enhancer, in den Promotor einführen oder Repressorelemente aus regulatorischen Regionen entfernen. Darüber hinaus können bei der Genumwandlung wie z. B. von Kochevenko und Willmitzer (Plant Physiol. 2003 Mai; 132(1): 174–84) und in den darin angeführten Literaturstellen beschriebene Methoden angewendet werden, um Repressorelemente zu stören oder um die Aktivität positiver regulatorischer Elemente zu steigern.
Weiterhin lassen sich positive Elemente durch T-DNA oder Transposonmutagenese ungezielt in (Pflanzen-)Genome einführen, und die Linien, bei denen die positiven Elemente in der Nähe eines erfindungsgemäßen Gens integriert worden sind und deren Expression daher gesteigert ist, können identifiziert werden. Die Aktivierung von Pflanzengenen durch statistische Integrationen von Enhancer-Elementen wurde von Hayashi et al., 1992 (Science 258: 1350–1353) oder Weigel et al., 2000 (Plant Physiol. 122, 1003–1013) und anderen dort Zitierten beschrieben.
Reverse genetische Strategien zur Identifizierung von Insertionen (die gegebenenfalls die Aktivierungselemente tragen) in der Nähe der interessierenden Gene wurden verschiedentlich beschrieben, z. B. Krysan et al., 1999 (Plant Cell 1999, 11, 2283–2290); Sessions et al., 2002 (Plant Cell 2002, 14, 2985-2994); Young et al., 2001, (Plant Physiol. 2001, 125, 513–518); Koprek et al., 2000 (Plant J. 2000, 24, 253–263); Jeon et al., 2000 (Plant J. 2000, 22, 561–570); Tissier et al., 1999 (Plant Cell 1999, 11, 1841–1852); Speulmann et al., 1999 (Plant Cell 1999,11, 1853–1866). Kurz gesagt wird Material aus allen Pflanzen einer großen durch T-DNA oder Transposon mutagenisierten Pflanzenpopulation geerntet und genomische DNA wird präpariert. Die genomische DNA wird dann nach spezifischen Architekturen wie zum Beispiel in Krysan et al., 1999 (Plant Cell 1999, 11, 2283–2290), beschrieben gepoolt. Die Pools der genomischen DNAs werden dann mittels spezifischer Multiplex-PCR-Reaktionen, mit denen die Kombination des insertierten Mutagens (z. B. T-DNA oder Transposon) und des interessierenden Gens nachgewiesen wird, gescreent. Daher werden PCR-Reaktionen an den DNA-Pools mit spezifischen Kombinationen von T-DNA- oder Transposon-Border-Primern und genspezifischen Primern ausgeführt. Allgemeine Richtlinien für die Entwicklung von Primern finden sich wiederum bei Krysan et al., 1999 (Plant Cell 1999, 11, 2283–2290). Ein erneutes Screening von DNA-Pools mit geringeren Konzentrationen führt zur Identifizierung von einzelnen Pflanzen, bei denen das interessierende Gen durch das insertierte Mutagen aktiviert ist. Die Verstärkung von positiven regulatorischen Elementen oder die Störung oder Schwächung von negativen regulatorischen Elementen lässt sich auch durch herkömmliche Mutagenesetechniken erreichen: Die Herstellung von chemisch oder durch Strahlung mutierten Populationen ist ein herkömmliches, dem Fachmann bekanntes Verfahren. Methoden für Pflanzen wurden von Koorneef et al. 1982 und in den darin angeführten Literaturstellen und von Lightner und Caspar in „Methods in Molecular Biology”, Band 82, beschrieben. Bei diesen Techniken induziert man gewöhnlich Punktmutationen, die sich in jedem bekannten Gen unter Anwendung von Methoden wie TILLING (Colbert et al. 2001) identifizieren lassen.
Dementsprechend lässt sich das Expressionsniveau erhöhen, wenn die endogenen Gene, die für ein Polypeptid kodieren, das eine erhöhte Expression des Polypeptids der vorliegenden Erfindung verleiht, insbesondere Gene, die das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung umfassen, durch homologe Rekombination, Tilling-Ansätze oder Genumwandlung modifiziert werden. Es ist außerdem möglich, wie hier erwähnt den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen Targetingsequenzen zuzufügen.
Regulatorische Sequenzen vorzugsweise zusätzlich zu einer Targetsequenz oder einem Teil davon können operativ an die kodierende Region eines endogenen Proteins gebunden sein und dessen Transkription und Translation oder die Stabilität bzw. den Abbau der kodierenden mRNA oder des exprimierten Proteins steuern. Zum Modifizieren und zur Steuerung der Expression kann man Promotor, UTRs, Spleißstellen, Verarbeitungssignale, Polyadenylierungsstellen, Terminatoren, Enhancer, Repressoren, posttranskriptionelle oder posttranslationale Modifikationstellen verändern, hinzufügen oder ergänzen. Die Aktivierung von Pflanzengenen durch statistische Integrationen von Enhancer-Elementen zum Beispiel wurde von Hayashi et al., 1992 (Science 258: 1350–1353) oder Weigel et al., 2000 (Plant Physiol. 122, 1003–1013) und anderen dort Zitierten beschrieben. Man kann zum Beispiel die Expressionsniveaus des endogenen Proteins modulieren, indem man den endogenen Promotor durch einen stärkeren transgenen Promotor ersetzt oder die endogene 3'UTR durch eine 3'UTR ersetzt, die für eine bessere Stabilität sorgt, ohne dabei die kodierende Region zu ändern. Weiterhin lässt sich die transkriptionelle Regulation wie in den Beispielen beschrieben durch Einführen eines künstlichen Transkriptionsfaktors modulieren. Alternative Promotor, Terminatoren und UTR sind unten beschrieben.
Die Aktivierung eines endogenen Polypeptids mit der obenerwähnten Aktivität, z. B. mit der Aktivität eines wie in Tabelle II, Spalte 3, gezeigten Proteins oder des Polypeptids der Erfindung, z. B. die Verleihung des erhöhten Ertrags, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, nach einer Expressionserhöhung oder Aktivitätserhöhung im Zytosol und/oder in einer Organelle wie z. B. einem Plastid lässt sich auch erhöhen, indem man einen synthetischen Transkriptionsfaktor einführt, der in unmittelbarer Nähe zur kodierenden Region des für das wie in Tabelle II, Spalte 3, gezeigte Protein kodierenden Gens bindet und dessen Transkription aktiviert. Es lässt sich ein chimäres Zinkfingerprotein konstruieren, welches eine spezifische DNA-bindende Domäne und eine Aktivierungsdomäne z. B. die VP16-Domäne des Herpes-Simplex-Virus umfasst. Die spezifische Bindungsdomäne kann an die regulatorische Region des für das wie in Tabelle II, Spalte 3, gezeigte Protein kodierenden Gens binden. Die Expression des chimären Transkriptionsfaktors in einem Organismus, insbesondere in einer Pflanze, hat eine spezifische Expression des wie in Tabelle II, Spalte 3, gezeigten Proteins zur Folge, siehe z. B. in WO 01/52620 , Oriz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, Band 99, 13290 oder Guan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, Band 99, 13296.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung werden Organismen verwendet, bei denen eines der obenerwähnten Gene, oder eine der obenerwähnten Nukleinsäuren, auf eine Weise mutiert ist, dass die Aktivität des kodierten Genprodukts verglichen mit den nicht mutierten Proteinen weniger oder überhaupt nicht durch zelluläre Faktoren beeinflusst wird. Gut bekannte Regulationsmechanismen der Enzymaktivität sind zum Beispiel Substratinhibierung oder Rückkopplungsregulationsmechanismen. Wege und Techniken zur Einführung von Substitutionen, Deletierungen und Additionen einer oder mehrerer Basen, Nukleotide oder Aminosäuren einer entsprechenden Sequenz sind hier unten in den entsprechenden Absätzen und den dort angeführten Literaturstellen beschrieben, z. B. in Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour, NY, 1989. Dem Fachmann wird es möglich sein, Regulationsdomänen und Bindungsstellen von Regulatoren zu identifizieren, indem er die Sequenz des Nukleinsäuremoleküls der vorliegenden Erfindung oder des Expressionsprodukts davon mit Hilfe von Computersoftware, die Algorithmen zur Identifizierung von Bindungsstellen und regulatorischen Domänen umfasst, mit dem Stand der Technik vergleicht oder indem er systematisch Mutationen in ein Nukleinsäuremolekül oder in ein Protein einführt und Assays auf diese Mutationen, die eine erhöhte spezifische Aktivität oder eine erhöhte Aktivität pro Volumen, insbesondere pro Zelle, bewirken, durchführt.
Es kann daher von Vorteil sein, in einem Organismus ein von einem evolutionär entfernt verwandten Organismus abgeleitetes Nukleinsäuremolekül der Erfindung oder ein Polypeptid der Erfindung zu exprimieren, wie z. B. bei der Verwendung eines prokaryontischen Gens in einem eukaryontischen Wirt, da in diesen Fällen die Regulationsmechanismen der Wirtszelle die Aktivität (zellular oder spezifisch) des Gens oder seines Expressionsprodukts nicht abschwächen.
Die Mutation wird so eingeführt, dass die gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress und/oder die Ertragserhöhung nicht beeinträchtigt werden.
Weniger Einfluss auf die Regulation eines Gens oder dessen Genprodukt ist so zu verstehen, dass damit eine verminderte Regulation der enzymatischen Aktivität gemeint ist, die eine erhöhte spezifische oder zelluläre Aktivität des Gens bzw. dessen Produkts zur Folge hat. Eine Erhöhung der enzymatischen Aktivität ist so zu verstehen, dass damit eine enzymatische Aktivität gemeint ist, die im Vergleich zum Ausgangsorganismus um mindestens 10%, vorteilhafterweise mindestens 20, 30 oder 40%, besonders vorteilhaft um mindestens 50, 60 oder 70% erhöht ist. Dies manifestiert sich in einem gesteigerten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon.
Durch die Erfindung ist es möglich, die obigen Methoden so durchzuführen, dass die Stresstoleranz erhöht wird. Es ist außerdem möglich, die Stresstoleranz zu vermindern.
Die Erfindung ist nicht auf spezifische Nukleinsäuren, spezifische Polypeptide, spezifische Zelltypen, spezifische Wirtszellen, spezifische Bedingungen oder spezifische Methoden usw. als solche eingeschränkt, sondern kann variieren, und zahlreiche Modifikationen und Variationen davon werden dem Fachmann offensichtlich sein. Es versteht sich außerdem, dass die hier verwendete Terminologie lediglich zum Zweck der Beschreibung spezifischer Ausführungsformen dient und nicht einschränkend verstanden werden soll.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem isolierte Nukleinsäuren, die ein Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

a) einem Nukleinsäuremolekül, das für das Polypeptid gemäß Spalte 7 von Tabelle II B kodiert;
b) einem Nukleinsäuremolekül gemäß Spalte 7 von Tabelle I B;
c) einem Nukleinsäuremolekül, welches als Folge der Degeneration des genetischen Codes von einer Polypeptidsequenz gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle II gezeigt abgeleitet sein kann und einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder niedrigen Temperaturen und/oder eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein erhöhtes anderes erwähntes Ertragsmerkmal, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verleiht;
d) einem Nukleinsäuremolekül mit mindestens 30% Identität mit der Nukleinsäuremolekülsequenz eines Polynukleotids, das das Nukleinsäuremolekül gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle I umfasst und einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder niedrigen Temperaturen und/oder eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein erhöhtes anderes erwähntes Ertragsmerkmal, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verleiht;
e) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid mit mindestens 30% Identität mit der Aminosäuresequenz des Polypeptids, das von dem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) kodiert wird, kodiert und die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül wiedergegeben wird, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 von Tabelle I umfasst und einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder niedrigen Temperaturen und/oder eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein erhöhtes anderes erwähntes Ertragsmerkmal, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verleiht;
f) einem Nukleinsäuremolekül, welches unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) hybridisiert und einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder niedrigen Temperaturen und/oder eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein erhöhtes anderes erwähntes Ertragsmerkmal, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verleiht;
g) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das mit Hilfe von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern gegen ein Polypeptid, das von einem der Nukleinsäuremoleküle von (a) bis (e) kodiert wird und die Aktivität aufweist, die durch das Nukleinsäuremolekül wiedergegeben wird, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 von Tabelle I umfasst, isoliert werden kann;
h) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das die Konsensussequenz oder ein oder mehrere Polypeptidmotive gemäß Spalte 7 von Tabelle IV umfasst und vorzugsweise die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül wiedergegeben wird, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 von Tabelle II oder IV umfasst;
h) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aktivität aufweist, die durch ein Protein gemäß Spalte 5 von Tabelle II wiedergegeben wird, und einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder niedrigen Temperaturen und/oder eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein erhöhtes anderes erwähntes Ertragsmerkmal, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verleiht;
i) einem Nukleinsäuremolekül, welches ein Polynukleotid umfasst, das man erhält, indem man eine cDNA-Bibliothek oder eine genomische Bibliothek unter Verwendung der Primer aus Spalte 7 von Tabelle III, die nicht an ihrem 5'-Ende mit den Nukleotiden ATA beginnen, amplifiziert, und vorzugsweise die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 von Tabelle II oder IV umfasst, wiedergegeben wird; und
j) einem Nukleinsäuremolekül, welches erhältlich ist, indem man eine geeignete Nukleinsäurebibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde, die eine komplementäre Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls von (a) oder (b) umfasst, oder mit einem Fragment davon, mit mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt, eines Nukleinsäuremoleküls, das komplementär zu einer in (a) bis (e) charakterisierten Nukleinsäuremolekülsequenz ist und für ein Polypeptid kodiert, das die Aktivität aufweist, die durch ein ein Polypeptid gemäß Spalte 5 von Tabelle II umfassendes Protein wiedergegeben wird;

Gemäß einer Ausführungsform betrifft die Erfindung Homologe der obenerwähnten Sequenzen, die sich vorteilhaft zum Beispiel aus Hefe, Pilzen, Viren, Algen, Bakterien wie Acetobacter (subgen. Acetobacter) aceti; Acidithiobacillus ferrooxidans; Acinetobacter sp.; Actinobacillus sp; Aeromonas salmonicida; Agrobacterium tumefaciens; Aquifex aeolicus; Arcanobacterium pyogenes; Aster yellows phytoplasma; Bacillus sp.; Bifidobacterium sp.; Borrelia burgdorferi; Brevibacterium linens; Brucella melitensis; Buchnera sp.; Butyrivibrio fibrisolvens; Campylobacter jejuni; Caulobacter crescentus; Chlamydia sp.; Chlamydophila sp.; Chlorobium limicola; Citrobacter rodentium; Clostridium sp.; Comamonas testosteroni; Corynebacterium sp.; Coxiella burnetii; Deinococcus radiodurans; Dichelobacter nodosus; Edwardsiella ictaluri; Enterobacter sp.; Erysipelothrix rhusiopathiae; E. coli; Flavobacterium sp.; Francisella tularensis; Frankia sp. Cpl1; Fusobacterium nucleatum; Geobacillus stearothermophilus; Gluconobacter oxydans; Haemophilus sp.; Helicobacter pylori; Klebsiella pneumoniae; Lactobacillus sp.; Lactococcus lactis; Listeria sp.; Mannheimia haemolytica; Mesorhizobium loti; Methylophaga thalassica; Microcystis aeruginosa; Microscilla sp. PRE1; Moraxella sp. TA144; Mycobacterium sp.; Mycoplasma sp.; Neisseria sp.; Nitrosomonas sp.; Nostoc sp. PCC 7120; Novosphingobium aromaticivorans; Oenococcus oeni; Pantoea citrea; Pasteurella multocida; Pediococcus pentosaceus; Phormidium foveolarum; Phytoplasma sp.; Plectonema boryanum; Prevotella ruminicola; Propionibacterium sp.; Proteus vulgaris; Pseudomonas sp.; Ralstonia sp.; Rhizobium sp.; Rhodococcus equi; Rhodothermus marinus; Rickettsia sp.; Riemerella anatipestifer; Ruminococcus flavefaciens; Salmonella sp.; Selenomonas ruminantium; Serratia entomophila; Shigella sp.; Sinorhizobium meliloti; Staphylococcus sp.; Streptococcus sp.; Streptomyces sp.; Synechococcus sp.; Synechocystis sp. PCC 6803; Thermotoga maritima; Treponema sp.; Ureaplasma urealyticum; Vibrio cholerae; Vibrio parahaemolyticus; Xylella fastidiosa; Yersinia sp.; Zymomonas mobilis, vorzugsweise Salmonella sp. oder E. coli, oder Pflanzen, vorzugsweise aus Hefen wie aus den Gattungen Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenula, Torulopsis oder Schizosaccharomyces oder Pflanzen wie A. thaliana, Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Sojabohne, Erdnuss, Baumwolle, Borretsch, Sonnenblume, Lein, Schlüsselblume, Raps, Canola und Ölrübsen, Maniok, Pfeffer, Sonnenblume, Tagetes, nachtschattenartigen Pflanzen wie Kartoffel, Tabak, Aubergine und Tomate, Vicia-Arten, Erbse, Luzerne, buschartigen Pflanzen wie Kaffee, Kakao, Tee, Salix-Arten, Bäumen wie Ölpalme, Kokosnuss, ausdauernden Gräser wie Roggengras und Schwingel, und Futterpflanzen wie Luzerne und Klee und aus Fichte, Kiefer oder Tanne isolieren lassen. Besonders bevorzugt lassen sich Homologe der obenerwähnten Sequenzen aus S. cerevisiae, E. coli oder Synechocystis sp. oder Pflanzen, vorzugsweise Brassica napus, Glycine max, Zea mays, Baumwolle oder Oryza sativa, isolieren.
Die (Stress-)Proteine der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt. So wird zum Beispiel ein für das Protein kodierendes Nukleinsäuremolekül in einen Expressionsvektor kloniert, zum Beispiel in einen binären Vektor, der Expressionsvektor wird in eine Wirtszelle eingeführt, zum Beispiel den A. thaliana-Wildtyp NASC N906 oder eine andere wie unten in den Beispielen beschriebene Pflanzenzelle, und das Protein wird in dieser Wirtszelle exprimiert. Beispiele für binäre Vektoren sind pBlN19, pBl101, pBinAR, pGPTV, pCAMBIA, pBIB-HYG, pBecks, pGreen oder pPZP (Hajukiewicz, P. et al., 1994, Plant Mol. Biol., 25: 989–994 und Hellens et al., Trends in Plant Science (2000) 5, 446–451).
Gemäß einer Ausführungsform wird das (Stress-)Protein der vorliegenden Erfindung vorzugsweise in einem Kompartiment der Zelle, z. B. in den Plastiden, produziert. Wege zur Einführung von Nukleinsäuren in Plastide und zur Produktion von Proteinen in diesem Kompartiment sind dem Fachmann bekannt und werden ebenfalls in der vorliegenden Anmeldung beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder das Genkonstrukt werden/wird vorteilhafterweise zusammen mit mindestens einem Reportergen in eine Expressionskassette kloniert, die mittels eines Vektors oder direkt in das Genom in den Organismus eingeführt wird. Dieses Reportergen sollte ein leichtes Nachweisen über einen Wachstums-Assay, einen Fluoreszenz-Assay, einen chemischen Assay, einen Biolumineszenz-Assay oder einen Toleranz-Assay, oder über eine photometrische Messung ermöglichen. Zu Beispielen für Reportergene, die zu erwähnen sind, zahlen Gene für Toleranz gegenüber Antibiotika oder Herbiziden, Hydrolasegene, Fluoreszenzproteingene, Biolumineszenzgene, Zuckermetabolismusgene oder Nukleotidmetabolismusgene, oder Biosynthesegene wie das Ura3-Gen, das IIv2-Gen, das Luziferasegen, das β-Galactosidasegen, das gfp-Gen, das 2-Desoxyglucose-6-Phosphat-phosphatase-Gen, das β-Glucuronidasegen, das β-Lactamasegen, das Neomycinphosphotransferasegen, das Hygromycinphosphotransferasegen, ein Gen für eine mutierte Acetohydroxysäuresynthase (AHAS), das auch als Acetolactatsynthasegen (ALS-Gen) bekannt ist, ein Gen für ein D-Aminosäuren metabolisierendes Enzym oder das BASTA-Gen (= Glufosinattoleranzgen). Diese Gene ermöglichen die einfache Messung und Quantifizierung der Transkriptionsaktivität und somit der Expression der Gene. Auf diese Weise lassen sich Genompositionen identifizieren, die eine abweichende Produktivität zeigen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform enthält ein Nukleinsäurekonstrukt, zum Beispiel eine Expressionskassette, upstream, d. h. am 5'-Ende der kodierenden Sequenz, einen Promotor, und downstream, d. h. am 3'-Ende, ein Polyadenylierungssignal, und gegebenenfalls noch andere regulatorische Elemente, die operativ an die dazwischenliegende kodierende Sequenz mit einer der wie in Tabelle I, Spalten 5 und 7, gezeigten Nukleinsäure-SEQ ID NO gebunden sind. Mit operativer Bindung ist die aufeinanderfolgende Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls anderen regulatorischen Elementen in einer solchen Weise, dass alle der regulatorischen Elemente ihre Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz in angemessener Weise erfüllen können, gemeint. Die für die operative Bindung bevorzugten Sequenzen sind Erkennungssequenzen, mit denen die subzelluläre Lokalisierung in Plastiden sichergestellt wird. Es können jedoch auch Erkennungssequenzen, mit denen die subzelluläre Lokalisierung im Mitochondrium, im endoplasmischen Retikulum (= ER), im Zellkern, in Ölkörperchen oder in anderen Kompartimenten sichergestellt wird, eingesetzt werden, ebenso wie Translationspromotoren wie die 5'-Leitsequenz im Tabakmosaikvirus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693–8711).
Ein Nukleinsäurekonstrukt, zum Beispiel eine Expressionskassette, kann zum Beispiel einen konstitutiven Promotor oder einen gewebespezifischen Promotor (vorzugsweise den USP- oder Napin-Promotor) des zu exprimierenden Gens und das ER-Retentionssignal enthalten. Für das ER-Retentionssignal verwendet man vorzugsweise die KDEL-Aminosäuresequenz (Lysin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Leucin) oder die KKX-Aminosäuresequenz (Lysin-Lysin-X-Stop, wobei X jede andere bekannte Aminosäure bedeutet).
Zur Expression in einem Wirtsorganismus, zum Beispiel einer Pflanze, insertiert man die Expressionskassette vorteilhafterweise in einen Vektor wie beispielsweise ein Plasmid, einen Phagen oder andere DNA, die eine optimale Expression von Genen in dem Wirtsorganismus erlaubt. Beispiele für geeignete Plasmide sind: in E. coli pLG338, pACYC184, die pBR-Reihe wie z. B. pBR322, die pUC-Reihe wie z. B. pUC18 oder pUC19, die M113mp-Reihe, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III¹¹³-B1, λgt11 oder pBdCl; in Streptomyces plJ101, plJ364, plJ702 oder plJ361; in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214; in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667; in Pilzen pALS1, pIL2 oder pBB116; andere vorteilhafte Pilzvektoren wurden von Romanos, M. A. et al., [(1992) „Foreign gene expression in yeast: a review", Yeast 8: 423–488] und von van den Hondel, C. A. M. J. J. et al. [(1991) „Heterologous gene expression in filamentous fungi" sowie in More Gene Manipulations in Fungi [J. W. Bennet & L. L. Lasure, Hrsg., S. 396–428: Academic Press: San Diego] und in „Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi" [van den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt, P. J. (1991) in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J. F. et al., Hrsg., S. 1–28, Cambridge University Press: Cambridge] beschrieben. Beispiele für vorteilhafte Hefepromotoren sind 2 μM, pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23. Beispiele für Algen- oder Pflanzenpromotoren sind pLGV23, pGHlac⁺, pBIN19, pAK2004, pVKH oder pDH51 (siehe Schmidt, R. und Willmitzer, L., 1988). Die oben angeführten Vektoren bzw. Derivate der oben angeführten Vektoren sind eine kleine Auswahl aus den möglichen Plasmiden. Weitere Plasmide sind dem Fachmann gut bekannt und finden sich zum Beispiel in dem Buch Cloning Vektors (Hrsg. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018). Geeignete Pflanzenvektoren sind unter anderem in „Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Kap. 6/7, S. 71–119 beschrieben. Vorteilhafte Vektoren sind als Shuttle-Vektoren oder binäre Vektoren bekannt, die in E. coli und Agrobacterium replizieren.
Mit Vektoren sind mit Ausnahme von Plasmiden alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren gemeint, wie zum Beispiel Phagen, Viren wie SV40, CMV, Baculovirus, Adenovirus, Transposonen, IS-Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert werden oder chromosomal repliziert werden, wobei die chromosomale Replikation bevorzugt ist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des Vektors kann die erfindungsgemäße Expressionskassette auch vorteilhaft in Form einer linearen DNA in die Organismen eingeführt und durch heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann sich aus einem linearisierten Plasmid oder nur aus der Expressionskassette als Vektor oder den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen zusammensetzen.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform kann die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz auch alleine in einen Organismus eingeführt werden.
Wenn zusätzlich zu der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz weitere Gene in den Organismus eingeführt werden sollen, können jeweils alle zusammen mit einem Reportergen in einem einzelnen Vektor oder jedes einzelne Gen mit einem Reportergen in einem Vektor in den Organismus eingeführt werden, wobei die verschiedenen Vektoren gleichzeitig oder nacheinander eingeführt werden können.
Der Vektor enthält vorteilhafterweise wenigstens eine Kopie der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen und/oder der erfindungsgemäßen Expressionskassette (= Genkonstrukt).
Die Erfindung stellt weiterhin einen isolierten rekombinanten Expressionsvektor bereit, der eine für ein wie in Tabelle II, Spalte 5 oder 7, gezeigtes Polypeptid kodierende Nukleinsäure enthält, wobei die Expression des Vektors in einer Wirtszelle zu einer erhöhten Toleranz gegenüber Umweltstress verglichen mit einer Wirtszellensorte vom Wildtyp führt. So, wie er hier verwendet wird, bezieht sich der Begriff „Vektor” auf ein Nukleinsäuremolekül, das dazu in der Lage ist, eine andere Nukleinsäure, an die es gebunden ist, zu transportieren. Ein Typ von Vektor ist ein „Plasmid^„, was sich auf eine zirkuläre doppelsträngige DNA-Schleife bezieht, in die zusätzliche DNA-Segmente ligiert werden können. Ein anderer Vektortyp ist ein viraler Vektor, bei dem zusätzliche DNA-Segmente in das virale Genom ligiert werden können. Bestimmte Vektoren sind zur autonomen Replikation in einer Wirtszelle, in die sie eingeführt worden sind, in der Lage (z. B. bakterielle Vektoren mit einem bakteriellen Replikationsursprung und episomale Säugetiervektoren). Andere Vektoren (z. B. nicht-episomale Säugetiervektoren) werden, wenn sie in die Wirtszelle eingebracht werden, in das Genom einer Wirtszelle oder einer Organelle integriert, und sie replizieren sich somit zusammen mit dem Genom des Wirts bzw. der Organelle. Außerdem sind bestimmte Vektoren dazu fähig, die Expression von Genen, mit denen sie operativ verbunden sind, zu steuern. Solche Vektoren werden hier als „Expressionsvektoren” bezeichnet. Im Allgemeinen liegen Expressionsvektoren, die bei rekombinanten DNA-Techniken von Nutzen sind, häufig in Form von Plasmiden vor. In der vorliegenden Beschreibung können „Plasmid” und „Vektor” austauschbar verwendet werden, da es sich bei dem Plasmid um die am häufigsten verwendete Form von Vektor handelt. Die Erfindung soll jedoch auch solche anderen Formen von Expressionsvektoren wie virale Vektoren (z. B. replikationsdefektive Retroviren, Adenoviren und adenoassoziierte Viren), die äquivalente Funktionen erfüllen, einschließen.
Die rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung enthalten eine Nukleinsäure der Erfindung in einer Form, die für die Expression der Nukleinsäure in einer Wirtszelle geeignet ist, was heißt, dass die rekombinanten Expressionsvektoren eine oder mehrere auf Grundlage der für die Expression zu verwendenden Wirtszellen ausgewählte regulatorische Sequenzen einschließen, die operativ mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verbunden sind. So, wie der Begriff hier in Bezug auf einen rekombinanten Expressionsvektor verwendet wird, soll „operativ gebunden” bedeuten, dass die Nukleotidsequenz von Interesse auf eine Weise an die regulatorische(n) Sequenz(en) gebunden ist, die die Expression der Nukleotidsequenz (z. B. in einem in-vitro-Transkriptions/Translationssystem oder, wenn der Vektor in eine Wirtszelle eingeführt wird, in einer Wirtszelle) erlaubt. Der Begriff „regulatorische Sequenz” soll Promotoren, Enhancer und andere Elemente zur Steuerung der Expression (z. B. Polyadenylierungssignale) einschließen. Solche regulatorischen Sequenzen sind zum Beispiel in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) und Gruber und Crosby, in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Hrsg. Glick und Thompson, Kapitel 7, 89–108, CRC Press: Boca Raton, Florida, einschließlich den darin aufgeführten Literaturstellen beschrieben. Zu den regulatorischen Sequenzen zählen die, die in vielen Arten von Wirtszellen die konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz steuern, und die, die die Expression der Nukleotidsequenz nur in bestimmten Wirtszellen oder unter bestimmten Bedingungen steuern. Dem Fachmann wird klar sein, dass die Entwicklung des Expressionsvektors von Faktoren wie der Wahl der zu transformierenden Wirtszelle, dem gewünschten Expressionsniveau des Polypeptids usw. abhängen kann. Die Expressionsvektoren der Erfindung können in Wirtszellen eingeführt werden, um so Polypeptide oder Peptide einschließlich Fusionspolypeptide oder -peptide zu produzieren, die durch wie hier beschriebene Nukleinsäuren kodiert werden (z. B. YSRPs, mutierte Formen von YSRPs, Fusionspolypeptide usw.).
Die rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung können für die Expression des Polypeptids der Erfindung in Pflanzenzellen entwickelt sein. So können zum Beispiel YSRP-Gene in Pflanzenzellen exprimiert werden (siehe Schmidt R., und Willmitzer, L., 1988, High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants, Plant Cell Rep. 583–586; Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, Kapitel 6/7, S. 71–119 (1993); F. F. White, B. Jenes et al., Techniques für Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. Kung und R. Wu, 128-43, Academic Press: 1993; Potrykus, 1991, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42: 205–225 und die darin angeführten Literaturstellen). Geeignete Wirtszellen werden weiter in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press: San Diego, CA (1990) diskutiert. Alternativ dazu kann man den rekombinanten Expressionsvektor in vitro transkribieren und translatieren, zum Beispiel unter Einsatz von regulatorischen Sequenzen des T7-Promotors und T7-Polymerase.
Die Expression von Polypeptiden in Prokaryonten wird am häufigsten mit Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten, die die Expression entweder von Fusions- oder von Nicht-Fusionspolypeptiden steuern, durchgeführt. Fusionsvektoren addieren eine gewisse Anzahl an Aminosäuren an ein darin kodiertes Polypeptid, gewöhnlich am Aminoterminus des rekombinanten Polypeptids, jedoch auch am C-Terminus oder fusioniert in geeigneten Regionen in den Polypeptiden. Solche Fusionsvektoren dienen typischerweise drei Zwecken: 1) zur Erhöhung der Expression eines rekombinanten Polypeptids; 2) zur Erhöhung der Löslichkeit eines rekombinanten Polypeptids und 3) zur Unterstützung bei der Aufreinigung eines rekombinanten Polypeptids, indem sie als Ligand bei der Affinitätsaufreinigung wirken. Häufig wird bei Fusionsexpressionsvektoren eine Stelle für die proteolytische Spaltung an dem Verbindungspunkt zwischen der Fusionseinheit und dem rekombinanten Polypeptid eingeführt, um die Abtrennung des rekombinanten Polypeptids von der Fusionseinheit im Anschluss an die Aufreinigung des Fusionspolypeptids zu ermöglichen. Solche Enzyme und ihre entsprechenden Erkennungssequenzen schließen Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase ein.
Die Pflanzenexpressionskassette kann beispielsweise in dem pRT-Transformationsvektor ((a) Toepfer et al., 1993, Methods Enzymol., 217: 66–78; (b) Toepfer et al. 1987, Nucl. Acids. Res. 15: 5890 ff.) installiert werden.
Alternativ dazu kann man einen rekombinanten Vektor (= Expressionsvektor) auch in vitro transkribieren und translatieren, z. B. unter Verwendung des T7-Promotors und der T7-RNA-Polymerase.
In Prokaryonten eingesetzte Expressionsvektoren bedienen sich häufig induzierbarer Systeme mit und ohne Fusionsproteinen oder Fusionsoligopeptiden, wobei diese Fusionen sowohl N-terminal als auch C-terminal oder in anderen brauchbaren Domänen eines Proteins erfolgen können. Solche Fusionsvektoren dienen gewöhnlich den folgenden Zwecken: 1) zur Erhöhung der RNA-Expressionsrate; 2) zur Erhöhung der erzielbaren Proteinsyntheserate; 3) zur Erhöhung der Löslichkeit des Proteins; 4) oder zur Vereinfachung der Aufreinigung mittels einer Bindungssequenz, die sich für die Affinitätschromatographie verwenden lässt. Stellen für eine proteolytische Spaltung werden häufig auch über Fusionsproteine eingeführt, was es erlaubt, einen Teil des Fusionsproteins abzuspalten und aufzureinigen. Solche Erkennungssequenzen für Proteasen werden erkannt, z. B. Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase.
Typische vorteilhafte Fusions- und Expressionsvektoren sind pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith D. B. und Johnson K. S., Gene 67, 31–40 (1988)), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), die Glutathion-S-transferase (GST), das maltosebindende Protein bzw. Protein A enthalten.
Gemäß einer Ausführungsform wird die kodierende Sequenz des Polypeptids der Erfindung in einen pGEX-Expressionsvektor kloniert, wodurch ein Vektor geschaffen wird, der für ein Fusionspolypeptid kodiert, welches, vom N-Terminus zum C-Terminus, GST-Thrombinspaltstelle-X-Polypeptid enthält. Das Fusionspolypeptid kann durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von Glutathion-Agarose-Harz aufgereinigt werden. Rekombinante YSRP unfusioniert von GST lässt sich durch Spaltung des Fusionspolypeptids mit Thrombin zurückgewinnen.
Andere Beispiele für E. coli-Expressionsvektoren sind pTrc [Amann et al., (1988) Gene 69: 301–315] und pET-Vektoren [Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990) 60–89; Stratagene, Amsterdam, Niederlande].
Die Expression des Target-Gens vom pTrc-Vektor beruht auf der Wirts-RNA-Polymerasetranskription von einem Hybrid-trp-lac-Fusionspromotor. Die Expression des Target-Gens vom pET 11d-Vektor beruht auf der Transkription von einem T7 gn10-lac-Fusionspromotor, vermittelt durch eine gemeinsam exprimierte virale RNA-Polymerase (T7 gn1). Diese virale Polymerase wird durch den Wirtsstamm BL21(DE3) oder HMS174(DE3) aus einem residierenden I-Prophagen, der ein T7 gn1-Gen unter der transkriptionellen Kontrolle des lacUV 5-Promotors trägt, bereitgestellt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die YSRPs in Pflanzen und Pflanzenzellen wie einzelligen Pflanzenzellen (z. B. Algen) (siehe Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology 1(3): 239–251 und die darin aufgeführten Literaturstellen) und Pflanzenzellen aus höheren Pflanzen (z. B. die Spermatophyten, wie Kulturpflanzen) exprimiert, zum Beispiel um Pflanzen aus den Pflanzenzellen zu regenerieren. Ein wie in Tabelle II, Spalte 5 oder 7, gezeigtes, für YSRP kodierendes Nukleinsäuremolekül lässt sich auf beliebige Weise einschließlich Transfektion, Transformation oder Transduction, Elektroporation, Bombardierung mit Partikeln, Agroinfektion und dergleichen in eine Pflanzenzelle „einführen”. Eine dem Fachmann bekannte Transformationsmethode ist das Eintauchen einer blühenden Pflanze in eine Agrobacteria-Lösung, wobei das Agrobacterium die Nukleinsäure der Erfindung enthält, gefolgt vom Züchten der transformierten Gameten.
Andere geeignete Methoden zur Transformierung oder Transfizierung von Wirtszellen einschließlich Pflanzenzellen finden sich in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, und anderen Laborhandbüchern wie Methods in Molecular Biology, 1995, Band 44, Agrobacterium protocols, Hrsg.: Gartland und Davey, Humana Press, Totooma, New Jersey. Da eine Toleranz gegenüber biotischem und abiotischem Umweltstress ein allgemeines Merkmal ist, das in einer Vielzahl verschiedener Pflanzen wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Sojabohne, Erdnuss, Baumwolle, Raps und Canola, Maniok, Pfeffer, Sonnenblume und Tagetes, nachtschattenartige Pflanzen wie Kartoffel, Tabak, Aubergine und Tomate, Vicia-Arten, Erbse, Luzerne, buschartigen Pflanzen (Kaffee, Kakao, Tee), Salix-Arten, Bäumen (Ölpalme, Kokosnuss), ausdauernden Gräsern und Futterpflanzen vererbt werden soll, sind diese Kulturpflanzen auch die bevorzugten Target-Pflanzen für einen genetischen Eingriff als eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Zu den Futterkulturpflanzen zählen, wobei diese Aufzählung nicht einschränkend ist, Weizengras, Kanarisches Glanzgras, Holub/Sumpftrespe, Deutsches Weidelgras, Wiesenrispengras, Wiesenknäuelgras, Luzerne, Salfoin, Gewöhnlicher Hornklee, Schweden-Klee, Wiesenklee/Roter Klee und Honigklee.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Transfektion eines für YSRP wie in Tabelle II, Spalte 5 oder 7, gezeigt kodierenden Nukleinsäuremoleküls in eine Pflanze durch einen durch Agrobacterium vermittelten Gentransfer erzielt. Die durch Agrobacterium vermittelte Pflanzentransformation kann zum Beispiel unter Verwendung des GV3101(pMP90)-(Koncz und Schell, 1986, Mol. Gen. Genet. 204: 383–396) oder LBA4404-(Clontech) Stamms von Agrobacterium tumefaciens durchgeführt werden. Die Transformation kann gemäß Standardtransformations- und -regenerationstechniken erfolgen (Deblaere et al., 1994, Nucl. Acids Res. 13: 4777–4788; Gelvin, Stanton B. und Schilperoort, Robert A, Plant Molecular Biology Manual, 2. Aufl. – Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995. – in Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-PISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R.; Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993 360 S., ISBN 0-8493-5164-2). Raps zum Beispiel kann durch Kotyledon- oder Hypokotyltransformation (Moloney et al., 1989, Plant cell Report 8: 238–242; De Block et al., 1989, Plant Physiol. 91: 694–701) transformiert werden. Die Verwendung von Antibiotika für Agrobacterium und Pflanzenselektion hängt von dem für die Transformation verwendeten binären Vektor und dem Agrobacterium-Stamm ab. Die Rapsselektion erfolgt normalerweise unter Einsatz von Kanamycin als selektierbarem Pflanzenmarker. Ein durch Agrobacterium vermittelter Gentransfer auf Flachs kann zum Beispiel unter Anwendung einer von Mlynarova et al., 1994, Plant Cell Report 13: 282–285 beschriebenen Technik durchgeführt werden. Darüber hinaus kann die Transformation von Sojabohne zum Beispiel unter Anwendung einer in der europäischen Patentschrift Nr. 0424 047 , US-Patentschrift Nr. 5,322,783 , europäischen Patentschrift Nr. 0397 687 , US-Patentschrift Nr. 5,376,543 oder US-Patentschrift Nr. 5,169,770 beschriebenen Technik durchgeführt werden. Die Transformation von Mais lässt sich durch Partikelbombardierung, polyethylenglykolvermittelte DNA-Aufnahme oder durch die Siliziumcarbidfasertechnik (siehe zum Beispiel Freeling und Walbot „The maize handbook" Springer Verlag: New York (1993) ISBN 3-540-97826-7) erreichen. Ein spezielles Beispiel einer Mais-Transformation findet sich in der US-Patentschrift Nr. 5,990,387 , und ein spezielles Beispiel einer Weizen-Transformation findet sich in der PCT-Anmeldung Nr. WO 93/07256 .
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das eingeführte, für YSRP wie in Tabelle II, Spalte 5 oder 7, gezeigt kodierende Nukleinsäuremolekül in der Pflanzenzelle stabil gehalten werden, wenn es in ein nicht chromosomales autonomes Replikon eingebaut oder in die Pflanzenchromosomen oder das Genom der Organelle integriert wird. Alternativ dazu kann das eingeführte YSRP auf einem extrachromosomalen, nicht replizierenden Vektor vorliegen und transient exprimiert werden bzw. transient aktiv sein.
Gemäß einer Ausführungsform kann man einen homologen rekombinanten Mikroorganismus herstellen, bei dem das YSRP in ein Chromosom integriert ist, ein Vektor wird hergestellt, welcher wenigstens einen Teil eines für YSRP wie in Tabelle II, Spalte 5 oder 7, gezeigt kodierenden Nukleinsäuremoleküls enthält, in den eine Deletion, Addition oder Substitution eingeführt wurde, um so das YSRP-Gen zu verändern, z. B. funktionell zu stören. Vorzugsweise handelt es sich bei dem YSRP-Gen um ein Hefegen E. coli-Gen, es kann jedoch auch ein Homolog aus einer verwandten Pflanze oder sogar aus einer Säugetier- oder Insektenquelle sein. Der Vektor kann so beschaffen sein, dass bei der homologen Rekombination das endogene, für YSRP wie in Tabelle II, Spalte 5 oder 7, gezeigt kodierende Nukleinsäuremolekül mutiert oder anderweitig verändert ist, aber immer noch für ein funktionelles Polypeptid kodiert (z. B. kann die upstream befindliche regulatorische Region verändert sein, wodurch die Expression des endogenen YSRP geändert wird). Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die biologische Aktivität des Proteins der Erfindung bei der homologen Rekombination erhöht. Zur Bildung einer Punktmutation über eine homologe Rekombination kann man bei einer als Chimeraplastie bekannten Technik DNA-RNA-Hybride einsetzen (Cole-Strauss et al., 1999, Nucleic Acids Research 27(5): 1323–1330 und Kmiec, 1999 Gene therapy American Scientist. 87(3): 240–247). Vorschriften für die homologe Rekombination in Physcomitrella patens sind ebenfalls im Stand der Technik gut bekannt und werden hier für eine Verwendung in Betracht gezogen.
Dahingegen wird der veränderte Teil des für YSRP wie in Tabelle II, Spalte 5 oder 7, gezeigt kodierenden Nukleinsäuremoleküls im Vektor für die homologe Rekombination an seinem 5'- und 3'-Ende durch ein zusätzliches Nukleinsäuremolekül des YSRP-Gens flankiert, um zu ermöglichen, dass eine homologe Rekombination zwischen dem auf dem Vektor befindlichen exogenen YSRP-Gen und einem endogenen YSRP-Gen in einem Mikroorganismus oder einer Pflanze stattfinden kann. Das zusätzliche flankierende YSRP-Nukleinsäuremolekül weist eine Länge auf, die für eine erfolgreiche homologe Rekombination mit dem endogenen Gen ausreicht. Typischerweise schließt der Vektor mehrere hundert Basenpaare bis zu Kilobasen flankierender DNA ein (sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende). Siehe z. B. Thomas, K. R., und Capecchi, M. R., 1987, Cell 51: 503 für eine Beschreibung von Vektoren für die homologe Rekombination oder Strepp et al., 1998, PNAS, 95 (8): 4368–4373 zur cDNA-basierten Rekombination in Physcomitrella patens. Der Vektor wird in einen Mikroorganismus oder eine Pflanzenzelle eingeführt (z. B. durch polyethylenglykolvermittelte DNA), und Zellen, in denen sich das eingeführte YSRP-Gen homolog mit dem endogenen YSRP-Gen rekombiniert hat, werden nach im Stand der Technik bekannten Methoden selektiert.
Ob es in einem extrachromosomalen, nicht replizierenden Vektor oder einem in ein Chromosom integrierten Vektor vorliegt – das für YSRP wie in Tabelle II, Spalte 5 oder 7, gezeigt kodierende Nukleinsäuremolekül residiert vorzugsweise in einer Pflanzenexpressionskassette. Eine Pflanzenexpressionskassette enthält vorzugsweise regulatorische Sequenzen, die dazu in der Lage sind, die Genexpression in Pflanzenzellen zu steuern, die operativ gebunden sind, so dass jede Sequenz ihre Funktion erfüllen kann, zum Beispiel die Termination der Transkription durch Polyadenylierungssignale. Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind diejenigen, die aus Agrobacterium tumefaciens t-DNA stammen, wie das als Octopinsynthase bekannte Gen 3 des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., 1984, EMBO J. 3: 835) oder funktionelle Äquivalente davon, es eignen sich jedoch auch alle anderen in Pflanzen funktionell aktiven Terminatoren. Da die Expression von Pflanzengenen sehr häufig nicht auf die transkriptionellen Ebenen beschränkt ist, enthält eine Pflanzen-Expressionskassette vorzugsweise auch andere funktionsfähig verbundene Sequenzen wie Translationsenhancer, beispielsweise die Overdrive-Sequenz, welche die 5'-untranslatierte Leader-Sequenz aus Tabakmosaikvirus, die das Polypeptid/RNA-Verhältnis erhöht, enthält (Gallie et al., 1987, Nucl. Acids Research 15: 8693–8711). Beispiele für Pflanzenexpressionsvektoren schließen die, die in: Becker, D. et al., 1992, New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border, Plant Mol. Biol. 20: 1195–1197; und Bevan, M. W., 1984, Binary Agrobacterium vectors for plant transformation, Nucl. Acid. Res. 12: 8711–8721; und Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38 ausführlich beschrieben sind, ein.
”Transformation” ist hier als ein Verfahren zur Einführung von heterologer DNA in eine Pflanzenzelle, in Pflanzengewebe oder in eine Pflanze definiert. Sie kann unter natürlichen oder künstlichen Bedingungen stattfinden, unter Einsatz verschiedener im Stand der Technik gut bekannter Methoden. Transformation kann auf einer beliebigen bekannten Methode zur Insertion fremder Nukleinsäuresequenzen in eine prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle beruhen. Die Methode wird entsprechend der zu transformierenden Wirtszelle ausgewählt und kann, wobei dies nicht ausschließend ist, eine virale Infektion, eine Elektroporation, eine Lipofektion und eine Bombardierung mit Partikeln einschließen. Zu diesen „transformierten” Zellen zählen stabil transformierte Zellen, bei denen die insertierte DNA dazu in der Lage ist, entweder als ein autonom replizierendes Plasmid oder als Teil des Wirtschromosoms zu replizieren. Sie können auch Zellen einschließen, die die insertierte DNA oder RNA über begrenzte Zeiträume transient exprimieren. Transformierte Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzen sind so zu verstehen, dass sie nicht nur das Endprodukt des Transformationsprozesses umfassen, sondern auch die transgene Nachkommenschaft davon.
Die Begriffe „transformiert,” „transgen” und „rekombinant” beziehen sich auf einen Wirtsorganismus, z. B. ein Bakterium oder eine Pflanze, in den ein heterologes Nukleinsäuremolekül eingeführt wurde. Das Nukleinsäuremolekül kann stabil in das Genom des Wirts integriert sein oder das Nukleinsäuremolekül kann auch als extrachromosomales Molekül vorliegen. Ein solches extrachromosomales Molekül kann autoreplizierend sein. Transformierte Zellen, Gewebe oder Pflanzen sind so zu verstehen, dass sie nicht nur das Endprodukt des Transformationsprozesses umfassen, sondern auch die transgene Nachkommenschaft davon. Ein „nicht transformierter”, „nicht transgener” oder „nicht rekombinanter” Wirt bezieht sich auf einen Organismus vom Wildtyp, z. B. ein Bakterium oder eine Pflanze, der das heterologe Nukleinsäuremolekül nicht enthält.
Der Begriff „transgene Pflanze” bezieht sich, so wie er hier verwendet wird, auf eine Pflanze, die eine fremde Nukleotidsequenz enthält, die entweder in ihr nukleares Genom oder ein organellares Genom insertiert ist. Er umfasst weiterhin die Nachkommengenerationen, d. h. die T1-, T2- und sich daran anschließende Generationen oder die BC1-, BC2- und sich daran anschließende Generationen sowie Kreuzungen davon mit nicht transgenen oder anderen transgenen Pflanzen.
Der Wirtsorganismus (= transgene Organismus) enthält vorteilhafterweise wenigstens eine Kopie der erfindungsgemäßen Nukleinsäure und/oder des erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukts.
Im Prinzip lassen sich alle Pflanzen als Wirtsorganismus verwenden. Bevorzugte transgene Pflanzen sind zum Beispiel ausgewählt aus den Familien Aceraceae, Anacardiaceae, Apiaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Cactaceae, Cucurbitaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Malvaceae, Nymphaeaceae, Papaveraceae, Rosaceae, Salicaceae, Solanaceae, Areeaceae, Bromeliaceae, Cyperaceae, Iridaceae, Liliaceae, Orchidaceae, Gentianaceae, Labiaceae, Magnoliaceae, Ranunculaceae, Carifolaceae, Rubiaceae, Scrophulariaceae, Caryophyllaceae, Ericaceae, Polygonaceae, Violaceae, Juncaceae oder Poaceae, und vorzugsweise aus einer Pflanze, gewählt aus der Gruppe der Familien Apiaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Cucurbitaceae, Fabaceae, Papaveraceae, Rosaceae, Solanaceae, Liliaceae oder Poaceae. Bevorzugt werden Nutzpflanzen, wie etwa Pflanzen, die in vorteilhafter Weise ausgewählt werden aus der Gruppe der Gattung Erdnuss, Ölraps, Canola, Sonnenblume, Saflor, Olive, Sesam, Haselnuss, Mandel, Avocado, Lorbeer, Gartenkürbis/Kürbis, Leinsamen, Soja, Pistazie, Borretsch, Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Sorghum und Hirse, Triticale, Reis, Gerste, Cassava bzw. Maniokstrauch, Kartoffel, Zuckerrübe, Aubergine, Alfalfa und winterharten Gräsern und Viehfutterpflanzen, Ölpalme, Gemüsepflanzen (Kohlarten, Wurzelgemüse, Knollengemüse, Bohnengemüse bzw. Hülsenfrüchte, Fruchtgemüse, Zwiebelgemüse, Blattgemüse und Stängelgemüse), Buchweizen, Jerusalm-Artischocke, Saubohne, Wicken, Linse, Buschbohne, Lupine, Klee und Luzerne, um nur einige von ihnen zu erwähnen.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung sind transgene Pflanzen aus der aus Mais, Soja, Raps (einschließlich Canola und Winterraps), Baumwolle, Weizen und Reis bestehenden Gruppe ausgewählt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtspflanze aus den Familien Aceraceae, Anacardiaceae, Apiaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Cactaceae, Cucurbitaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Malvaceae, Nymphaeaceae, Papaveraceae, Rosaceae, Salicaceae, Solanaceae, Arecaceae, Bromeliaceae, Cyperaceae, Iridaceae, Liliaceae, Orchidaceae, Gentianaceae, Labiaceae, Magnoliaceae, Ranunculaceae, Carifolaceae, Rubiaceae, Scrophulariaceae, Caryophyllaceae, Ericaceae, Polygonaceae, Violaceae, Juncaceae oder Poaceae und vorzugsweise aus einer Pflanze, ausgewählt aus der Gruppe der Familien Apiaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Cucurbitaceae, Fabaceae, Papaveraceae, Rosaceae, Solanaceae, Liliaceae oder Poaceae, ausgewählt. Bevorzugt als Wirtspflanzen sind Kulturpflanzen und insbesondere die obenerwähnten Pflanzen, wie die obenerwähnten Familien und Gattungen, zum Beispiel bevorzugt die Arten Anacardium occidentale, Calendula officinalis, Carthamus tinctorius, Cichorium intybus, Cynara scolymus, Helianthus annus, Tagetes lucida, Tagetes erecta, Tagetes tenuifolia; Daucus carota; Corylus avellana, Corylus colurna, Borago officinalis; Brassica napus, Brassica rapa ssp., Sinapis arvensis Brassica juncea, Brassica juncea var. juncea, Brassica juncea var. crispifolia, Brassica juncea var. foliosa, Brassica nigra, Brassica sinapioides, Melanosinapis communis, Brassica oleracea, Arabidopsis thaliana, Anana comosus, Ananas ananas, Bromelia comosa, Carica papaya, Cannabis sative, Ipomoea batatus, Ipomoea pandurata, Convolvulus batatas, Convolvulus tiliaceus, Ipomoea fastigiata, Ipomoea tiliacea, Ipomoea triloba, Convolvulus panduratus, Beta vulgaris, Beta vulgaris var. altissima, Beta vulgaris var. vulgaris, Beta maritime, Beta vulgaris var. perennis, Beta vulgaris var. conditiva, Beta vulgaris var. esculenta, Cucurbita maxima, Cucurbita mixta, Cucurbita pepo, Cucurbita moschata, Olea europaea, Manihot utilissima, Janipha manihot „Jatropha manihot., Manihot aipil, Manihot dulcis, Manihot manihot, Manihot melanobasis, Manihot esculenta, Ricinus communis, Pisum sativum, Pisum arvense, Pisum humile, Medicago sativa, Medicago falcata, Medicago varia, Glycine max Dolichos soja, Glycine gracilis, Glycine hispida, Phaseolus max, Soja hispida, Soja max, Cocos nucifera, Pelargonium grossularioides, Oleum cocoas, Laurus nobilis, Persea americana, Arachis hypogaea, Linum usitatissimum, Linum humile, Linum austriacum, Linum bienne, Linum angustifolium, Linum catharticum, Linum flavum, Linum grandiflorum, Adenolinum grandiflorum, Linum lewisii, Linum narbonense, Linum perenne, Linum perenne var. lewisii, Linum pratense, Linum trigynum, Punica granatum, Gossypium hirsutum, Gossypium arboreum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum, Gossypium thurberi, Muse nana, Muse acuminata, Musa paradisiaca, Musa spp., Elaeis guineensis, Papaver orientale, Papaver rhoeas, Papaver dubium, Sesamum indicum, Piper aduncum, Piper amalago, Piper angustifolium, Piper auritum, Piper betel, Piper cubeba, Piper longum, Piper nigrum, Piper retrofractum, Artanthe adunca, Artanthe elongata, Peperomia elongata, Piper elongatum, Steffensia elongata, Hordeum vulgare, Hordeum jubatum, Hordeum murinum, Hordeum secalinum, Hordeum distichon Hordeum aegiceras, Hordeum hexastichon., Hordeum hexastichum, Hordeum irregulare, Hordeum sativum, Hordeum secalinum, Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida, Sorghum bicolor, Sorghum halepense, Sorghum saccharatum, Sorghum vulgare, Andropogon drummondii, Holcus bicolor, Holcus sorghum, Sorghum aethiopicum, Sorghum arundinaceum, Sorghum caffrorum, Sorghum cernuum, Sorghum dochna, Sorghum drummondii, Sorghum durra, Sorghum guineense, Sorghum lanceolatum, Sorghum nervosum, Sorghum saccharatum, Sorghum subglabrescens, Sorghum verticilliflorum, Sorghum vulgare, Holcus halepensis, Sorghum miliaceum millet, Panicum militaceum, Zea mays, Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum oder Triticum vulgare, Cofea spp., Coffea arabica, Coffea canephora, Coffea liberica, Capsicum annuum, Capsicum annuum var. glabriusculum, Capsicum frutescens, Capsicum annuum, Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum, Solanum melongena, Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum., Lycopersicon pyriforme, Solanum integrifolium, Solanum lycopersicum, Theobroma cacao oder Camellia sinensis.
Anacardiaceae wie die Gattungen Pistacia, Mangifera, Anacardium, z. B. die Spezies Pistacia vera [Pistazie], Mangifer indica [Mango] oder Anacardium occidentale [Cashew]; Asteraceae wie die Gattungen Calendula, Carthamus, Centaurea, Cichorium, Cynara, Helianthus, Lactuca, Locusta, Tagetes, Valeriana, z. B. die Spezies Calendula officinalis [Ringelblume], Carthamus tinctorius [Färberdistel, Saflor], Centaurea cyanus [Kornblume], Cichorium intybus [Gemeine Wegwarte], Cynara scolymus [Artischocke], Helianthus annus [Sonnenblume], Lactuca sativa, Lactuca crispa, Lactuca esculenta, Lactuca scariola L. ssp. sativa, Lactuca scariola L. var. integrata, Lactuca scariola L. var. integrifolia, Lactuca sativa subsp. romana, Locusta communis, Valeriana locusta [Feldsalat], Tagetes lucida, Tagetes erecta oder Tagetes tenuifolia [Gewürztagetes]; Apiaceae wie die Gattungen Daucus, z. B. die Spezies Daucus carota [Karotte]; Betulaceae wie die Gattungen Corylus, z. B. die Spezies Corylus avellana oder Corylus colurna [Haselnuss]; Boraginaceae wie die Gattungen Borago, z. B. die Spezies Borago officinalis [Borretsch]; Brassicaceae wie die Gattungen Brassica, Melanosinapis, Sinapis, Arabadopsis, z. B. die Spezies Brassica napus, Brassica rapa ssp. [Canola, Ölsamenraps, Rübsamen], Sinapis arvensis Brassica juncea, Brassica juncea var. juncea, Brassica juncea var. crispifolia, Brassica juncea var. foliosa, Brassica nigra, Brassica sinapioides, Melanosinapis communis [Senf], Brassica oleracea [Futterrübe] oder Arabidopsis thaliana; Bromeliaceae, wie die Gattung Anana, Bromelia, z. B. die Spezies Anana comosus, Ananas ananas oder Bromelia comosa [Ananas]; Caricaceae, wie die Gattung Carica, z. B. die Spezies Carica papaya [Papaya]; Cannabaceae, wie die Gattung Cannabis, z. B. die Spezies Cannabis sative [Hanf], Convolvulaceae, wie die Gattung Ipomea, Convolvulus, z. B. die Spezies Ipomoea batatus, Ipomoea pandurata, Convolvulus batatas, Convolvulus tiliaceus, Ipomoea fastigiata, Ipomoea tiliacea, Ipomoea triloba oder Convolvulus panduratus [Süsskartoffel, Prunkwinde, Wildkartoffel], Chenopodiaceae, wie die Gattung Beta, d. h. die Spezies Beta vulgaris, Beta vulgaris var. altissima, Beta vulgaris var. Vulgaris, Beta maritima, Beta vulgaris var. perennis, Beta vulgaris var. conditiva oder Beta vulgaris var. esculenta [Zuckerrübe]; Cucurbitaceae wie die Gattungen Cucubita, z. B. die Spezies Cucurbita maxima, Cucurbita mixta, Cucurbita pepo oder Cucurbita moschata [Kürbis]; Elaeagnaceae wie die Gattungen Elaeagnus, z. B. die Spezies Olea europaea [Olive]; Ericaceae wie die Gattung Kalmia, z. B. die Spezies Kalmia latifolia, Kalmia angustifolia, Kalmia microphylla, Kalmia polifolia, Kalmia occidentalis, Cistus chamaerhodendros oder Kalmia lucida [Berglorbeer, Breitblättrige Lorbeerrose, Schmalblättrige Lorbeerrose, Poleiblättrige Lorbeerrose, Sumpf-Kalmie, Alpen-Lorbeerrose]; Euphorbiaceae wie die Gattungen Manihot, Janipha, Jatropha, Ricinus, z. B. die Spezies Manihot utilissima, Janipha manihot, Jatropha manihot., Manihot aipil, Manihot dulcis, Manihot manihot, Manihot melanobasis, Manihot esculenta [Maniok, Pfeilwurz, Tapioka, Cassava] oder Ricinus communis [Rizinusbohne, Hundsbaum, Läusebaum, Kreuzbaum, Christuspalme, Wunderbaum]; Fabaceae wie die Gattungen Pisum, Albizia, Cathormion, Feuillea, Inga, Pithecolobium, Acacia, Mimosa, Medicajo, Glycine, Dolichos, Phaseolus, Soja, z. B. die Spezies Pisum sativum, Pisum arvense, Pisum humile [Erbse], Albizia berteriana, Albizia julibrissin, Albizia lebbeck, Acacia berteriana, Acacia littoralis, Albizia berteriana, Albizzia berteriana, Cathormion berteriana, Feuillea berteriana, Inga fragrans, Pithecellobium berterianum, Pithecellobium fragrans, Pithecolobium berterianum, Pseudalbizzia berteriana, Acacia julibrissin, Acacia nemu, Albizia nemu, Feuilleea julibrissin, Mimosa julibrissin, Mimosa speciosa, Sericanrda julibrissin, Acacia lebbeck, Acacia macrophylla, Albizia lebbek, Feuilleea lebbeck, Mimosa lebbeck, Mimosa speciosa [Federbaum, Schirmakazie, Seidenakazie], Medicago sativa, Medicago falcata, Medicago varia [Luzerne] Glycine max Dolichos soja, Glycine gracilis, Glycine hispida, Phaseolus max, Soja hispida oder Soja max [Sojabohne]; Geraniaceae wie die Gattungen Pelargonium, Cocos, Oleum, z. B. die Spezies Cocos nucifera, Pelargonium grossularioides oder Oleum cocois [Kokosnuss]; Gramineae wie die Gattungen Saccharum, z. B. die Spezies Saccharum officinarum; Juglandaceae wie die Gattungen Juglans, Wallia, z. B. die Spezies Juglans regia, Juglans ailanthifolia, Juglans sieboldiana, Juglans cinerea, Wallia cinerea, Juglans bixbyi, Juglans californica, Juglans hindsii, Juglans intermedia, Juglans jamaicensis, Juglans major, Juglans microcarpa, Juglans nigra oder Wallia nigra [Echte Walnuss, Schwarznuss, Gemeine Walnuss, Persische Walnuss, Weiße Walnuss, Butternuss, Schwarze Walnuss]; Lauraceae wie die Gattungen Persea, Laurus, z. B. die Spezies Laurus nobilis [Lorbeer], Persea americana Persea americana, Persea gratissima oder Persea Persea [Avocado]; Leguminosae wie die Gattungen Arachis, z. B. die Spezies Arachis hypogaea [Erdnuss]; Linaceae wie die Gattungen Linum, Adenolinum, z. B. die Spezies Linum usitatissimum, Linum humile, Linum austriacum, Linum bienne, Linum angustifolium, Linum catharticum, Linum flavum, Linum grandiflorum, Adenolinum grandiflorum, Linum lewisii, Linum narbonense, Linum perenne, Linum perenne var. lewisii, Linum pratense oder Linum trigynum [Flachs, Lein]; Lythrarieae wie die Gattungen Punica, z. B. die Spezies Punica granatum [Granatapfel]; Malvaceae wie die Gattungen Gossypium, z. B. die Spezies Gossypium hirsutum, Gossypium arboreum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum oder Gossypium thurberi [Baumwolle]; Musaceae wie die Gattungen Musa, z. B. die Spezies Musa nana, Musa acuminata, Musa paradisiaca, Musa spp. [Banane]; Onagraceae, wie die Gattung Camissonia, Oenothera, z. B. die Spezies Oenothera biennis oder Camissonia brevipes [Primel, Nachtkerze]; Palmae, wie die Gattung Elacis, z. B. die Spezies Elaeis guineensis [Ölpalme]; Papaveraceae, wie die Gattung Papaver, z. B. die Spezies Papaver orientale, Papaver rhoeas, Papaver dubium [Mohn, Türkenmohn, Klatschmohn, Mohnblume, Feldmohn, Klatschrose, Feldmohn, Saat-Mohn, Ackermohn]; Pedaliaceae, wie die Gattung Sesamum, z. B. die Spezies Sesamum indicum [Sesam]; Piperaceae, wie die Gattung Piper, Artanthe, Peperomia, Steffensia, z. B. die Spezies Piper aduncum, Piper amalago, Piper angustifolium, Piper auritum, Piper betel, Piper cubeba, Piper longum, Piper nigrum, Piper retrofractum, Artanthe adunca, Artanthe elongata, Peperomia elongata, Piper elongatum, Steffensia elongata. [Cayenne-Pfeffer, Wilder Pfeffer]; Poaceae, wie die Gattung Hordeum, Secale, Avena, Sorghum, Andropogon, Holcus, Panicum, Oryza, Zea, Triticum, z. B. die Spezies Hordeum vulgare, Hordeum jubatum, Hordeum murinum, Hordeum secalinum, Hordeum distichon Hordeum aegiceras, Hordeum hexastichon., Hordeum hexastichum, Hordeum irregulare, Hordeum sativum, Hordeum secalinum [Gerste, Graupen, Mähnengerste, Mäusegerste, Wiesengerste], Secale cereale [Roggen], Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida [Hafer], Sorghum bicolor, Sorghum halepense, Sorghum saccharatum, Sorghum vulgare, Andropogon drummondii, Holcus bicolor, Holcus sorghum, Sorghum aethiopicum, Sorghum arundinaceum, Sorghum caffrorum, Sorghum cernuum, Sorghum dochna, Sorghum drummondii, Sorghum durra, Sorghum guineense, Sorghum lanceolatum, Sorghum nervosum, Sorghum saccharatum, Sorghum subglabrescens, Sorghum verticilliflorum, Sorghum vulgare, Holcus halepensis, Sorghum miliaceum Hirse, Panicum militaceum [Sorghum, Hirse], Oryza sativa, Oryza latifolia [Reis], Zea mays [corn, Mais] Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum oder Triticum vulgare [Weizen, Ackerweizen, Gemeiner Weizen], Proteaceae, wie die Gattung Macadamia, z. B. die Spezies Macadamia intergrifolia [Macademia]; Rubiaceae, wie die Gattung Coffea, z. B. die Spezies Cofea spp., Coffea arabica, Coffea canephora oder Coffea liberica [Kaffee]; Scrophulariaceae, wie die Gattung Verbascum, z. B. die Spezies Verbascum blattaria, Verbascum chaixii, Verbascum densiflorum, Verbascum lagurus, Verbascum longifolium, Verbascum lychnitis, Verbascum nigrum, Verbascum olympicum, Verbascum phlomoides, Verbascum phoenicum, Verbascum pulverulentum oder Verbascum thapsus [Königskerze, Schaben-Königskerze, Chaix-Königskerze, Großblütige Königskerze, Seidenhaar-Königskerze, Langblättrige Königskerze, Mehlige Königskerze, Schwarze Königskerze, Kandelaber-Königskerze, Windblumen-Königskerze, Violette Königskerze, Flockige Königskerze, Himmelbrand]; Solanaceae, wie die Gattung Capsicum, Nicotiana, Solanum, Lycopersicon, z. B. die Spezies Capsicum annuum, Capsicum annuum var. glabriusculum, Capsicum frutescens [Pfeffer], Capsicum annuum [Paprika], Nicotiana tabacum, Nicotiana alata, Nicotiana attenuata, Nicotiana glauca, Nicotiana langsdorffii, Nicotiana obtusifolia, Nicotiana quadrivalvis, Nicotiana repanda, Nicotiana rustica, Nicotiana sylvestris [Tabak], Solanum tuberosum [Kartoffel], Solanum melongena [Aubergine] (Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum., Lycopersicon pyriforme, Solanum integrifolium oder Solanum lycopersicum [Tomate]; Sterculiaceae, wie die Gattung Theobroma, z. B. die Spezies Theobroma cacao [Kakao]; Theaceae, wie die Gattung Camellia, z. B. die Spezies Camellia sinensis) [Tee].
Die Einführung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, der Expressionskassette oder des Vektors in Organismen, zum Beispiel Pflanzen, kann im Prinzip nach allen dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen. Die Einführung der Nukleinsäuresequenzen führt zur Entstehung von rekombinanten bzw. transgenen Organismen.
Wenn nicht anders angegeben sind die Begriffe „Polynukleotide”, „Nukleinsäure” und „Nukleinsäuremolekül”, so wie sie hier verwendet werden, austauschbar. Außer es ist anderslautend angegeben, sind die Begriffe „Peptid”, „Polypeptid” und „Protein” im vorliegenden Kontext austauschbar. Der Begriff „Sequenz” kann Polynukleotide, Nukleinsäuren, Nukleinsäuremoleküle, Peptide, Polypeptide und Proteine betreffen, abhängig vom Zusammenhang, in dem der Begriff „Sequenz” verwendet wird. Die Begriffe „Gen(e)”, „Polynukleotid”, „Nukleinsäuresequenz”, „Nukleotidsequenz” oder „Nukleinsäuremolekül(e)”, wie hierin verwendet, beziehen sich auf eine polymere Form von Nukleotiden von beliebiger Länge, entweder Ribonukleotide oder Desoxyribonucleotide. Die Begriffe betreffen lediglich die Primärstruktur des Moleküls.
Somit schließen die Begriffe „Gen(e)”, „Polynukleotid”, „Nukleinsäuresequenz”, „Nukleotidsequenz” bzw. „Nukleinsäuremolekül(e)”, so wie sie hier verwendet werden, doppel- und einzelsträngige DNA und/oder RNA ein. Sie beinhalten außerdem bekannte Arten von Modifikationen, zum Beispiel Methylierung, „Caps” und Substitutionen von einem oder mehreren der natürlich vorkommenden Nukleotide mit einem Analog. Vorzugsweise umfasst die erfindungsgemäße DNA- bzw. RNA-Sequenz eine kodierende Sequenz, die für ein hier definiertes Polypeptid kodiert.
Die erfindungsgemäßen Gene, die für eine Aktivität ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Phosphoenolpyruvatcarboxylkinase, Arginin/Alanin-Aminopeptidase, D-Alanyl-D-alanincarboxypeptidase, Diacylglycerolpyrophosphatphosphatase, Dityrosintransporter, Farnesyldiphosphatfarnesyltransferase, NAD+-abhängiger Betainaldehyddehydrogenase, Serinhydrolase, dem an der Übertragung von Ketoconazolresistenz beteiligten transkriptionellen Regulator, Uridinkinase, dem yal043c-a-Protein, dem ybr071w-Protein und dem ydr445c-Protein kodieren, werden auch als „YSRP-Gene” oder „YRP-Gene” bezeichnet.
Eine „kodierende Sequenz” ist eine Nukleotidsequenz, die in mRNA transkribiert wird und/oder in ein Polypeptid translatiert wird, wenn sie sich unter der Kontrolle von entsprechenden regulatorischen Sequenzen befindet. Die Grenzen der kodierenden Sequenzen werden von einem Translations-Startcodon am 5'-Terminus und einem Translations-Stoppcodon am 3'-Terminus festgelegt. Eine kodierende Sequenz kann, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, mRNA, cDNA, rekombinante Nukleotidsequenzen oder genomische DNA einschließen, während Introns unter gewissen Umständen ebenfalls vorhanden sein können.
Der Transfer von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird Transformation genannt. Bei der Ausführung derselbigen werden Verfahren, welche für die Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen beschrieben wurden, für transiente oder stabile Transformation eingesetzt. Geeignete Methoden sind die Protoplasttransformation durch poly(ethylenglykol)-induzierte DNA-Aufnahme, die „biolistische” Methode unter Einsatz der Genkanone – die als Partikelbombardierungsmethode bezeichnet wird, die Elektroporation, die Inkubation von getrockneten Embryos in DNA-Lösung, die Mikroinjektion und der durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer. Diese Methoden sind beispielhaft in Jenes B. et al., Techniques für Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128–143 und in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205–225) beschrieben. Die zu exprimierenden Nukleinsäuren bzw. das zu exprimierende Konstrukt werden/wird vorzugsweise in einen Vektor kloniert, der sich für die Transformation von Agrobacterium tumefaciens eignet, zum Beispiel pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Durch einen derartigen Vektor transformierte Agrobakterien können dann auf die bekannte Weise für die Transformation von Pflanzen, insbesondere von Nutzpflanzen, wie zum Beispiel Tabakpflanzen, verwendet werden, beispielsweise durch Baden von zerstampften Blättern oder zerhackten Blättern in einer Agrobakterienlösung und danach Kultivieren derselben in geeigneten Medien. Die Transformation von Pflanzen mittels Agrobacterium tumefaciens ist beispielsweise von Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 beschrieben oder ist unter anderem aus F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. S.D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38 bekannt.
Durch einen erfindungsgemäßen Expressionsvektor transformierte Agrobakterien können gleichermaßen in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen wie Testpflanzen wie z. B. Arabidopsis oder Kulturpflanzen wie Getreide, Mais, Hafer, Roggen, Gerste, Weizen, Sojabohne, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffeln, Tabak, Tomaten, Karotten, Paprika, Raps, Tapioka, Cassava, Pfeilwurz, Tagetes, Luzerne, Salat und den verschiedenen Baum-, Nuss und Kletterpflanzenarten, insbesondere ölhaltigen Kulturpflanzen wie Sojabohne, Erdnuss, der Rizinusölpflanze, Sonnenblume, Mais, Baumwolle, Flachs, Raps, Kokosnuss, Ölpalme, Färberdistel (Carthamus tinctorius) oder Kakaobohne oder insbesondere in Mais, Weizen, Sojabohne, Reis, Baumwolle und Canola eingesetzt werden, zum Beispiel indem man gestoßene Blätter oder gehackte Blätter in einer Agrobakterium-Lösung badet und sie dann in geeigneten Medien kultiviert.
Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können nach allen dem Fachmann bekannten Methoden regeneriert werden. Geeignete Methoden finden sich in den oben angeführten Publikationen von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer.
Dementsprechend betrifft ein weiterer Aspekt der Erfindung transgene Organismen, die durch wenigstens eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, wenigstens eine erfindungsgemäße Expressionskassette oder wenigstens einen erfindungsgemäßen Vektor transformiert sind, sowie Zellen, Zellkulturen, Gewebe, Teile – wie zum Beispiel Blätter, Wurzeln usw. im Fall von Pflanzenorganismen – oder von solchen Organismen gewonnenes Reproduktionsmaterial. Die Begriffe „Wirtsorganismus”, „Wirtszelle”, „rekombinanter (Wirts)Organismus” und „transgene (Wirts)Zelle” werden hier austauschbar verwendet. Natürlich beziehen sich diese Begriffe nicht nur auf den betreffenden Wirtsorganismus oder die betreffende Target-Zelle, sondern auch auf die Nachkommen oder potentiellen Nachkommen dieser Organismen bzw. Zellen. Da aufgrund von Mutation oder Umwelteinflüssen in nachfolgenden Generationen bestimmte Modifikationen auftreten können, müssen diese Nachkommen nicht notwendigerweise mit der Elternzelle identisch sein, fallen jedoch dennoch unter den Begriff, so wie er hier verwendet wird.
Für die Zwecke der Erfindung bedeutet „transgen” oder „rekombinant” in Bezug zum Beispiel auf eine Nukleinsäuresequenz, eine Expressionskassette (= Genkonstrukt, Nukleinsäurekonstrukt) oder einen Vektor, die/der die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz enthält, oder einen durch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, die erfindungsgemäße Expressionskassette oder den erfindungsgemäßen Vektor transformierten Organismus alle die Konstruktionen, die durch gentechnische Methoden hergestellt wurden und in denen man entweder

a) die in Tabelle I, Spalte 5 oder 7, gezeigte Nukleinsäuresequenz oder ihre Derivate oder Teile davon oder
b) eine funktionell an die unter (a) beschriebene Nukleinsäuresequenz gebundene genetische Kontrollsequenz, zum Beispiel eine 3'- und/oder 5'-genetische Kontrollsequenz wie einen Promotor oder Terminator, oder
c) (a) und (b)

US 5,565,350

WO 00/15815

Geeignete Organismen bzw. Wirtsorganismen für die Nukleinsäure, die Expressionskassette oder den Vektor gemäß der Erfindung sind vorteilhafterweise im Prinzip alle Organismen, die sich für die Expression von wie oben beschriebenen rekombinanten Genen eignen. Als weitere Beispiele können Pflanzen wie Arabidopsis, Asteraceae wie Calendula oder Kulturpflanzen wie Sojabohne, Erdnuss, Rizinusölpflanze, Sonnenblume, Flachs, Mais, Baumwolle, Flachs, Raps, Kokosnuss, Ölpalme, Färberdistel (Carthamus tinctorius) oder Kakaobohne erwähnt werden.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung sind die Wirtspflanzen für die Nukleinsäure, die Expressionskassette oder den Vektor gemäß der Erfindung ausgewählt aus der Gruppe, die Mais, Soja, Raps (einschließlich Canola und Winterraps), Baumwolle, Weizen und Reis umfasst.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung eines Nukleinsäurekonstrukts, z. B. einer Expressionskassette, das DNA-Sequenzen, die für in Tabelle II gezeigte Polypeptide kodieren, oder damit hybridisierende DNA-Sequenzen zur Transformation von Pflanzenzellen, Geweben oder Teilen von Pflanzen enthält.
Hierbei können je nach gewähltem Promotor die in Tabelle I gezeigten Sequenzen spezifisch in den Blättern, in den Samen, in den Nodi, in Wurzeln, im Stängel oder in anderen Teilen der Pflanze exprimiert werden. Diese transgenen Pflanzen, die die z. B. wie in Tabelle I gezeigten Sequenzen überproduzieren, und das reproduktive Material davon sind zusammen mit den Pflanzenzellen, Geweben oder Teilen davon ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Die erfindungsgemäße Expressionskassette oder die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder das erfindungsgemäße Konstrukt mit Sequenzen gemäß Tabelle I kann/können außerdem zur Transformation der oben beispielhaft angeführten Organismen wie Bakterien, Hefen, filamentösen Pilze und Pflanzen eingesetzt werden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezieht sich erhöhte Toleranz und/oder Resistenz gegenüber Umweltstress zum Beispiel auf das künstlich erworbene Merkmal einer erhöhten Toleranz gegenüber Umweltstress aufgrund einer funktionellen Überexprimierung von Polypeptidsequenzen der Tabelle II, die durch die entsprechenden wie in Tabelle I, Spalte 5 oder 7 gezeigten Nukleinsäuremoleküle kodiert werden, und/oder Homologen in den erfindungsgemäßen Organismen, vorteilhafterweise in den transgenen erfindungsgemäßen Pflanzen, im Vergleich zu den nicht genetisch modifizierten Ausgangspflanzen wenigstens für die Dauer wenigstens einer Pflanzengeneration.
Eine konstitutive Expression der Polypeptidsequenzen der Tabelle II, kodiert durch das entsprechende, wie in Tabelle I, Spalte 5 oder 7, gezeigte Nukleinsäuremolekül und/oder Homologe ist außerdem vorteilhaft. Andererseits könnte auch eine induzierbare Expression wünschenswert sein. Die Expression der Polypeptidsequenzen der Erfindung kann entweder direkt in das Zytoplasma oder in die Organellen, vorzugsweise die Plastide der Wirtszellen, vorzugsweise der Pflanzenzellen, erfolgen.
Die Effizienz der Expression der Sequenzen der Tabelle II, kodiert durch das entsprechende, wie in Tabelle I, Spalte 5 oder 7, gezeigte Nukleinsäuremolekül und/oder Homologe lässt sich zum Beispiel in vitro durch Sprossmeristempropagierung bestimmen. Darüber hinaus lassen sich eine Expression der Sequenzen der Tabelle II, kodiert durch das entsprechende, wie in Tabelle I, Spalte 5 oder 7, gezeigte Nukleinsäuremolekül und/oder in der Art und dem Niveau modifizierte Homologe und ihre Wirkung auf die Stoffwechselpfadleistung an Testpflanzen in Gewächshausversuchen untersuchen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung umfasst transgene Organismen wie transgene Pflanzen, die durch eine Expressionskassette transformiert wurden, die wie in Tabelle I, Spalte 5 oder 7, gezeigte erfindungsgemäße Sequenzen oder damit hybridisierende DNA-Sequenzen enthält, sowie transgene Zellen, Gewebe, Teile und Reproduktionsmaterial solcher Pflanzen. Besonders bevorzugt sind in diesem Fall transgene Kulturpflanzen wie beispielsweise Gerste, Weizen, Roggen, Hafer, Mais, Sojabohne, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Raps und Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Distel, Kartoffeln, Tabak, Tomaten, Tapioka, Cassava, Pfeilwurz, Luzerne, Salat und die verschiedenen Baum-, Nuss- und Kletterpflanzenarten.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung sind transgene Pflanzen, die durch eine Expressionskassette transformiert wurden, die wie in Tabelle I, Spalte 5 oder 7 gezeigte erfindungsgemäße Sequenzen oder damit hybridisierende DNA-Sequenzen enthält, aus der Mais, Soja, Raps (einschließlich Canola und Winterraps), Baumwolle, Weizen und Reis umfassenden Gruppe ausgewählt.
Für die Zwecke der Erfindung sind Pflanzen mono- und dikotyledone Pflanzen, Moose oder Algen.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform sind wie oben beschriebene transgene Pflanzen, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurekonstrukt oder eine erfindungsgemäße Expressionskassette enthalten.
Transgen bedeutet jedoch auch, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren sich in ihrer natürlichen Position im Genom eines Organismus befinden, dass die Sequenz jedoch im Vergleich zur natürlichen Sequenz modifiziert worden ist und/oder dass die regulatorischen Sequenzen der natürlichen Sequenzen modifiziert wurden. Vorzugsweise ist transgen/rekombinant so zu verstehen, dass damit gemeint ist, dass die Transkription der in Tabelle I gezeigten erfindungsgemäßen Nukleinsäuren an einer nicht-natürlichen Position im Genom auftritt, das heißt, dass die Expression der Nukleinsäuren homolog oder vorzugsweise heterolog erfolgt. Diese Expression kann transient oder von einer stabil in das Genom integrierten Sequenz aus erfolgen.
Der gemäß der Erfindung verwendete Begriff „transgene Pflanzen” bezieht sich auch auf die Nachkommenschaft einer transgenen Pflanze, zum Beispiel die T₁, T₂, T₃ und darauf folgende Pflanzengenerationen oder die BC₁, BC₂, BC₃ und darauf folgende Pflanzengenerationen. Somit können die transgenen Pflanzen gemäß der Erfindung aufgezogen bzw. kultiviert und geselbstet oder mit anderen Individuen gekreuzt werden, um weitere transgene Pflanzen gemäß der Erfindung zu erhalten. Transgene Pflanzen können ebenfalls erhalten werden, indem man transgene Pflanzenzellen vegetativ vermehrt. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem transgenes Pflanzenmaterial, welches aus einer transgenen Pflanzenpopulation gemäß der Erfindung abgeleitet werden kann. Derartiges Material umfasst Pflanzenzellen und bestimmte Gewebe, Organe und Teile von Pflanzen in allen ihren Ausprägungen, wie etwa Samen, Blätter, Antheren, Fasern, Knollen, Wurzeln, Wurzelhaare, Stängel bzw. Halme, Embryo, Kalli, Kotyledonen, Petiolen, abgeemtetes Material, Pflanzengewebe, Fortpflanzungsgewebe und Zellkulturen, welche aus der eigentlichen transgenen Pflanze abgeleitet sind und/oder zum Hervorbringen der transgenen Pflanze verwendet werden können.
Jedwede gemäß der Erfindung erhaltene transformierte Pflanze kann in einem herkömmlichen Züchtungsschema oder in einer In-vitro-Pflanzenvermehrung verwendet werden, um mehr transformierte Pflanzen mit den gleichen Charakteristika herzustellen, und/oder kann verwendet werden, um das gleiche Charakteristikum in anderen Varietäten derselben oder einer verwandten Spezies einzuführen. Derartige Pflanzen sind ebenfalls Teil der Erfindung. Aus den transformierten Pflanzen erhaltene Samen umfassen genetisch ebenfalls dasselbe Charakteristikum und sind Teil der Erfindung. Wie bereits erwähnt ist die vorliegende Erfindung im Prinzip auf alle Pflanzen einschließlich Kulturpflanzen anwendbar, die sich mit einer dem Fachmann bekannten Transformationsmethode transformieren lassen.
Vorteilhafte induzierbare Pflanzenpromotoren sind beispielsweise der PRP1-Promotor [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22(1993), 361–366], ein durch Benzolsulfonamid induzierbarer Promotor ( EP 388 186 ), ein durch Tetracyclin induzierbarer Promotor [Gatz et al., (1992) Plant J. 2,397–404], ein durch Salicylsäure induzierbarer Promotor ( WO 95/19443 ), ein durch Abscidinsäure induzierbarer Promotor ( EP 335 528 ) und ein durch Ethanol oder Cyclohexanon induzierbarer Promotor ( WO 93/21334 ). Andere Beispiele für Pflanzenpromotoren, die vorteilhaft eingesetzt werden können, sind der Promotor der zytoplasmatischen FBPase aus Kartoffel, der ST-LSI-Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989) 2445–245), der Promotor von Phosphoribosylpyrophosphatamidotransferase aus Glycine max (siehe auch Genbank-Zugangsnummer U87999) oder ein nodienspezifischer Promotor, wie in EP 249 676 beschrieben. Besonders vorteilhaft sind die Promotoren, die eine Expression beim frühen Einsetzen von Umweltstress wie zum Beispiel Dürre oder Kälte sicherstellen.
Gemäß einer Ausführungsform können für monokotyledone oder dikotyledone Pflanzen samenspezifische Promotoren verwendet werden.
Im Prinzip kann man alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen verwenden, wie die oben namentlich für die erfindungsgemäße Expressionskassette und die erfindungsgemäße Methode erwähnten. Darüber hinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft zur Anwendung gelangen.
Bei der Herstellung einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente so manipuliert werden, dass man eine Nukleotidsequenz erhält, die brauchbar in der richtigen Richtung liest und mit einem korrekten Leserahmen ausgestattet ist. Zum Verbinden der DNA-Fragmente (= erfindungsgemäße Nukleinsäuren) miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angebunden werden.
Die Promotor- und die Terminatorregionen können zweckmäßigerweise in der Transkriptionsrichtung mit einem Linker oder Polylinker bereitgestellt werden, der einen oder mehrere Restriktionsstellen für die Insertierung dieser Sequenz enthält. Im Allgemeinen hat der Linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6, Restriktionsstellen. Im Allgemeinen beträgt die Größe des Linkers in der regulatorischen Region weniger als 100 bp, häufig weniger als 60 bp, jedoch wenigstens 5 bp. Der Promotor kann zum Wirtsorganismus, zum Beispiel zur Wirtspflanze, sowohl nativ bzw. homolog als auch fremd bzw. heterolog sein. In der 5'-3'-Transkriptionsrichtung enthält die Expressionskassette den Promotor, eine in Tabelle I gezeigte DNA-Sequenz und eine Region für die Termination der Transkription. Verschiedene Terminationsregionen können in jeder gewünschten Weise gegeneinander ausgetauscht werden.
So, wie sie hier auch verwendet werden, sollen die Begriffe „Nukleinsäure” und „Nukleinsäuremolekül” DNA-Moleküle (z. B. cDNA oder genomische DNA) und RNA-Moleküle (z. B. mRNA) und unter Verwendung von Nukleotidanaloga erzeugte Analoga der DNA oder RNA einschließen. Dieser Begriff umfasst auch nicht translatierte Sequenzen, die sich sowohl am 3'- als auch am 5'-Ende der kodierenden Region des Gens befinden: wenigstens etwa 1000 Nukleotide der Sequenz upstream vom 5'-Ende der kodierenden Region und wenigstens etwa 200 Nukleotide der Sequenz downstream vom 3'-Ende der kodierenden Region des Gens. Das Nukleinsäuremolekül kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein, ist jedoch vorzugsweise doppelsträngige DNA.
Ein „isoliertes” Nukleinsäuremolekül ist eines, das im Wesentlichen von anderen Nukleinsäuremolekülen, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure vorhanden sind, getrennt ist. Dies bedeutet, dass andere Nukleinsäuremoleküle in einer Menge von weniger als 5%, bezogen auf das Gewicht der gewünschten Nukleinsäure, vorzugsweise weniger als 2 Gew.-%, besonders bevorzugt weniger als 1 Gew.-%, ganz besonders bevorzugt weniger als 0,5 Gew.-%, vorhanden sind. Vorzugsweise ist eine „isolierte” Nukleinsäure frei von einigen der Sequenzen, die die Nukleinsäure natürlich flankieren (d. h. Sequenzen, die sich an dem 5'- und 3'-Ende der Nukleinsäure befinden) in der genomischen DNA des Organismus, von dem sich die Nukleinsäure ableitet. So kann zum Beispiel in verschiedenen Ausführungsformen das isolierte, für das Stressprotein kodierende Nukleinsäuremolekül weniger als etwa 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb Nukleotidsequenzen, die das Nukleinsäuremolekül in der genomischen DNA der Zelle, aus der sich die Nukleinsäure ableitet, natürlich flankieren, enthalten. Außerdem kann ein „isoliertes” Nukleinsäuremolekül, wie ein cDNA-Molekül, frei von einigen der anderen zellulären Materialien, mit denen es natürlich assoziiert ist, oder Kulturmedium, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt wurde, oder chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien, wenn es chemisch synthetisiert wurde, sein.
Ein Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung, z. B. ein Nukleinsäuremolekül, das für ein YSRP oder einen Teil davon kodiert, welches Toleranz und/oder Resistenz gegenüber Umweltstress und eine erhöhte Biomasseproduktion in Pflanzen verleiht, kann unter Anwendung von molekularbiologischen Standardtechniken und den hier bereitgestellten Sequenzinformationen isoliert werden. So kann zum Beispiel eine für ein Stressprotein aus Arabidopsis thaliana kodierende cDNA aus einer A. thaliana-c-DNA-Bibliothek isoliert werden, oder eine für das Stressprotein aus Synechocystis sp., Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa kodierende cDNA kann aus einer Synechocystis sp.-, Brassica napus-, Glycine max-, Zea mays- bzw. Oryza sativa-c-DNA-Bibliothek isoliert wobei alle oder ein Teil einer der in Tabelle I gezeigten Sequenzen verwendet werden. Außerdem lässt sich ein Nukleinsäuremolekül, das alle oder einen Teil einer der in Tabelle I gezeigten Sequenzen umfasst, durch die Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von auf dieser Sequenz basierend entwickelten Oligonukleotidprimern isolieren. So kann man zum Beispiel mRNA aus Pflanzenzellen isolieren (z. B. durch die Guanidiniumthiocyanat-Extraktionsvorschrift von Chirgwin et al., 1979 Biochemistry 18: 5294–5299), und cDNA lässt sich unter Verwendung von reverser Transkriptase (z. B. Moloney MLV reverse Transkriptase, erhältlich von Gibco/BRL, Bethesda, MD; oder AMV reverse Transkriptase, erhältlich von Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL) herstellen. Synthetische Oligonukleotidprimer für die Amplifikation durch Polymerasekettenreaktion lassen sich auf Basis einer der in Tabelle I gezeigten Nukleotidsequenzen entwickeln. Ein Nukleinsäuremolekül der Erfindung kann mit cDNA oder alternativ dazu mit genomischer DNA als Schablone und entsprechenden Oligonukleotidprimem gemäß Standard-PCR-Amplifikationstechniken amplifiziert werden. Das so amplifizierte Nukleinsäuremolekül kann in einen geeigneten Vektor kloniert und durch DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Weiterhin lassen sich einer für das YSRP kodierenden Nukleotidsequenz entsprechende Oligonukleotide durch synthetische Standardtechniken, z. B. unter Einsatz eines automatischen DNA-Synthesizers, herstellen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein isoliertes Nukleinsäuremolekül der Erfindung eine der in Tabelle I gezeigten, für das YSRP kodierenden Nukleotidsequenzen oder -moleküle (d. h. die „kodierende Region”), sowie eine 5'-untranslatierte Sequenz und 3'-untranslatierte Sequenz.
Außerdem kann das Nukleinsäuremolekül der Erfindung nur einen Teil der kodierenden Region einer der Sequenzen oder Moleküle der Nukleinsäure von Tabelle I, zum Beispiel ein Fragment, das als Sonde oder Primer verwendet werden kann, oder ein Fragment, das für einen biologisch aktiven Teil eines YSRP kodiert, umfassen.
Teile von Proteinen, die durch die YSRP-kodierenden Nukleinsäuremoleküle der Erfindung kodiert werden, sind vorzugsweise die hier beschriebenen biologisch aktiven Teile. So, wie er hier verwendet wird, soll der Begriff „biologisch aktiver Teil von” einem YSRP einen Teil, z. B. eine Domäne/ein Motiv, eines Stressprotein einschließen, das zu einer Stresstoleranz und/oder Resistenzreaktion in einer Pflanze beiträgt. Um herauszufinden, ob ein YSRP oder ein biologisch aktiver Teil davon zu einer erhähten Stresstoleranz in einer Pflanze führt, kann man eine Stressanalyse einer das YSRP enthaltenden Pflanze durchführen. Solche Analysemethoden sind dem Fachmann gut bekannt, wie in den Beispielen im Detail ausgeführt. Genauer gesagt kann man für biologisch aktive Teile eines YSRP kodierende Nukleinsäurefragmente herstellen, indem man einen Teil einer der Sequenzen der Nukleinsäure aus Tabelle I isoliert, der den kodierten Teil des YSRP oder Peptids exprimiert (z. B. durch rekombinante Expression in vitro) und die Aktivität des kodierten Teils des YSRP bzw. Peptids feststellt.
Biologisch aktive Teile eines YSRP fallen unter den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung und schließen Peptide ein, die Aminosäuresequenzen enthalten, die sich von der Aminosäuresequenz eines für das YSRP kodierenden Gens oder der Aminosäuresequenz eines zum YSRP homologen Proteins ableiten, die weniger Aminosäuren einschließen als das vollständige YSRP bzw. das zu einem YSRP homologe Volllängenprotein und mindestens einen Teil der enzymatischen oder biologischen Aktivität eines YSRP zeigt. Typischerweise umfassen biologisch aktive Teile (z. B. Peptide mit einer Länge von zum Beispiel 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 oder mehr Aminosäuren) eine Domäne oder ein Motiv mit mindestens einer Aktivität eines YSRP. Außerdem lassen sich andere biologisch aktive Teile, in denen andere Regionen des Proteins deletiert sind, durch rekombinante Techniken herstellen und auf eine oder mehrere der hier beschriebenen Aktivitäten auswerten. Vorzugsweise schließen die biologisch aktiven Teile eines YSRP eine oder mehrere ausgewählte Domänen/Motive oder Teile davon mit biologischer Aktivität ein.
Der Begriff „biologisch aktiver Teil” oder „biologische Aktivität” bezeichnet ein wie in Tabelle II, Spalte 3, gezeigtes Polypeptid oder einen Teil dieses Polypeptids, der immer noch über wenigstens 10% oder 20%, vorzugsweise 20%, 30%, 40% oder 50%, besonders bevorzugt 60%, 70% oder 80% der enzymatischen oder biologischen Aktivität des natürlichen bzw. Ausgangsenzyms bzw. -proteins verfügt.
In dem Verfahren gemäß der Erfindung können Nukleinsäuresequenzen oder -moleküle verwendet werden, welche, falls geeignet, synthetische, nicht-natürliche oder modifizierte Nukleotidbasen enthalten, die in DNA oder RNA eingebaut werden können. Die synthetischen, nicht-natürlichen oder modifizierten Basen können zum Beispiel die Stabilität des Nukleinsäuremoleküls außerhalb oder innerhalb einer Zelle erhöhen. Die Nukleinsäuremoleküle der Erfindung können die gleichen Modifikationen wie obenerwähnt enthalten.
So, wie er im vorliegenden Zusammenhang verwendet wird, kann der Begriff „Nukleinsäuremolekül” auch die/das am 3'- und am 5'-Ende der kodierenden Genregion befindliche nicht translatierte Sequenz/Molekül, zum Beispiel wenigstens 500, vorzugsweise 200, besonders bevorzugt 100, Nukleotide der Sequenz upstream vom 5'-Ende der kodierenden Region und wenigstens 100, vorzugsweise 50, besonders bevorzugt 20, Nukleotide der Sequenz downstream vom 3'-Ende der kodierenden Genregion, einschließen. Es ist häufig vorteilhaft, für Klonierungs- und Expressionzwecke nur die kodierende Region auszuwählen.
Vorzugsweise ist das im Verfahren gemäß der Erfindung verwendete Nukleinsäuremolekül oder das Nukleinsäuremolekül der Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül.
Ein „isoliertes” Polynukleotid oder Nukleinsäuremolekül ist von anderen Polynukleotiden oder Nukleinsäuremolekülen getrennt, welche in der natürlichen Quelle des Nukleinsäuremoleküls vorhanden sind. Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül kann ein chromosomales Fragment von mehreren kb, oder, vorzugsweise, ein Molekül, das nur die kodierende Region des Gens umfasst, sein. Dementsprechend kann ein isoliertes Nukleinsäuremolekül der Erfindung chromosomale Regionen umfassen, die an 5' und 3' angrenzen, oder weitere angrenzende chromosomale Regionen, umfasst jedoch vorzugsweise keine solchen Sequenzen, die die Nukleinsäuremolekülsequenz im genomischen oder chromosomalen Kontext im Organismus, aus dem das Nukleinsäuremolekül stammt, natürlich flankieren (zum Beispiel Sequenzen, die an die für die 5'- und 3'-UTRs des Nukleinsäuremoleküls kodierenden Regionen angrenzen). In verschiedenen Ausführungsformen kann das im Verfahren gemäß der Erfindung verwendete, isolierte Nukleinsäuremolekül zum Beispiel weniger als ungefähr 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb Nukleotidsequenzen umfassen, welche in natürlicher Weise das Nukleinsäuremolekül in der genomischen DNA der Zelle flankieren, aus der das Nukleinsäuremolekül stammt.
Die in dem Verfahren verwendeten Nukleinsäuremoleküle, zum Beispiel die Polynukleotide der Erfindung oder ein Teil davon, lassen sich unter Anwendung von molekularbiologischen Standardtechniken und der hier bereitgestellten Sequenzinformationen isolieren. Außerdem können beispielsweise eine homologe Sequenz oder homologe, konservierte Sequenzregionen auf DNA- oder Aminosäure-Ebene mit Hilfe von Vergleichsalgorithmen identifiziert werden. Erstere kann/können als Hybridisierungssonden unter standardmäßigen Hybridisierungstechniken (zum Beispiel den in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) zum Isolieren weiterer Nukleinsäuresequenzen verwendet werden, welche in diesem Verfahren nützlich sind.
Ein eine komplette Sequenz des im Verfahren eingesetzten Nukleinsäuremoleküls, zum Beispiel des Polynukleotids der Erfindung, umfassendes Nukleinsäuremolekül oder ein Teil davon lässt sich zusätzlich durch die Polymerasekettenreaktion isolieren, wobei auf dieser Sequenz oder Teilen davon basierende Oligonukleotidprimer verwendet werden. So kann man zum Beispiel ein die komplette Sequenz oder einen Teil davon umfassendes Nukleinsäuremolekül durch Polymerasekettenreaktion unter Einsatz von Oligonukleotidprimern, die auf Grundlage dieser Sequenz selbst erzeugt wurden, isolieren. Zum Beispiel lässt sich mRNA aus Zellen isolieren (zum Beispiel mittels der Guanidiniumthiocyanat-Extraktionsmethode von Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18: 5294–5299) und die cDNA lässt sich unter Verwendung von reverser Transkriptase (z. B. Moloney MLV reverse Transkriptase, erhältlich von Gibco/BRL, Bethesda, MD; oder AMV reverse Transkriptase, erhältlich von Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL) herstellen.
Synthetische Oligonukleotidprimer für die Amplifikation, z. B. wie in Tabelle III, Spalte 7 gezeigt, lassen sich mittels einer Polymerasekettenreaktion auf Basis der hier gezeigten Sequenz, zum Beispiel der in Tabelle I, Spalten 5 und 7, gezeigten Sequenz oder den von Tabelle II, Spalten 5 und 7 abgeleiteten Sequenzen, herstellen.
Außerdem ist es möglich, konserviertes Protein zu identifizieren, indem man Proteinsequenzabgleichungen mit dem durch die Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung kodierten Polypeptid, insbesondere mit den durch das wie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, gezeigte Nukleinsäuremolekül, von dem sich konservierte Regionen und daraus wiederum degenerierte Primer ableiten lassen, kodierten Sequenzen durchführt.
Konservierte Regionen sind diejenigen, welche eine sehr geringe Variation an der Aminosäure in einer jeweiligen Position von mehreren Homologen unterschiedlicher Herkunft aufzeigen. Die in Spalte 7 von Tabelle IV gezeigte(n) Konsensussequenz und Polypeptidmotive werden aus diesen Alignments hergeleitet. Außerdem ist es möglich, konservierte Regionen von verschiedenen Organismen zu identifizieren, indem man Proteinsequenzabgleichungen mit dem durch die Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung kodierten Polypeptid, insbesondere mit den durch das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II gezeigte Polypeptidmolekül, von dem sich konservierte Regionen und daraus wiederum degenerierte Primer ableiten lassen, kodierten Sequenzen durchführt.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform wird in der Methode der vorliegenden Erfindung die Aktivität eines Polypeptids erhöht, das eine Konsensussequenz oder ein in Tabelle IV, Spalte 7 gezeigtes Polypeptidmotiv umfasst bzw. daraus besteht, und in einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Polypeptid, das eine Konsensussequenz oder ein in Tabelle IV, Spalte 7 gezeigtes Polypeptidmotiv umfasst bzw. daraus besteht, wobei 20 oder weniger, vorzugsweise 15 oder 10, vorzugsweise 9, 8, 7, oder 6, besonders bevorzugt 5 oder 4, noch mehr bevorzugt 3, noch mehr bevorzugt 2, noch mehr bevorzugt 1 und am meisten bevorzugt 0 der angegebenen Aminosäurepositionen durch eine beliebige Aminosäure ersetzt werden können. Gemäß einer Ausführungsform sind nicht mehr als 15%, vorzugsweise 10%, noch mehr bevorzugt 5%, 4%, 3%, oder 2%, am meisten bevorzugt 1% oder 0% der durch einen Buchstaben bezeichneten Aminosäureposition durch eine andere Aminosäure ersetzt. Gemäß einer Ausführungsform sind 20 oder weniger, vorzugsweise 15 oder 10, vorzugsweise 9, 8, 7, oder 6, besonders bevorzugt 5 oder 4, noch mehr bevorzugt 3, noch mehr bevorzugt 2, noch mehr bevorzugt 1 und am meisten bevorzugt 0 Aminosäuren in eine Konsensussequenz oder ein Proteinmotiv insertiert.
Die Konsensussequenz wurde aus einem Mehrfach-Alignment der Sequenzen, wie sie in Tabelle II aufgelistet sind, abgeleitet. Die Buchstaben stehen für den Ein-Buchstaben-Aminosäurekode und zeigen, dass die Aminosäuren in wenigstens 80% der abgeglichenen Proteine konserviert sind, während der Buchstabe X für Aminosäuren steht, die nicht in wenigstens 80% der abgeglichenen Sequenzen konserviert sind. Die Konsensussequenz beginnt mit der ersten konservierten Aminosäure im Alignment und endet mit der letzten konservierten Aminosäure im Alignment der betrachteten Sequenzen. Die Anzahl von angezeigten X gibt die Distanzen zwischen konservierten Aminosäureresten an, wobei Y-x(21,23)-F beispielsweise bedeutet, dass konservierte Tyrosin- und Phenylalaninreste beim Alignment durch minimal 21 und maximal 23 Aminosäurereste beim Alignment in allen betrachteten Sequenzen voneinander getrennt sind.
Konservierte Domänen wurden aus allen Sequenzen identifiziert und sind unter Anwendung einer Untergruppe der standardmäßigen Prosite-Notation beschrieben, wobei z. B. das Muster Y-x(21,23)-[FW] bedeutet, dass ein konserviertes Tyrosin durch minimal 21 und maximal 23 Aminosäurereste von entweder einem Phenylalanin oder Tryptophan getrennt ist. Die Muster mussten mit wenigstens 80% der untersuchten Proteine übereinstimmen.
Konservierte Muster wurden mit dem Softwareprogramm MEME Version 3.5.1 oder per Hand identifiziert. MEME wurde von Timothy L. Bailey und Charles Elkan, Dept. of Computer Science and Engineering, University of California, San Diego, USA entwickelt und wurde von Timothy L. Bailey und Charles Elkan [Fitting a mixture model by expectation maximization to discover motifs in biopolymers, Proceedings of the Second International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology, S. 28–36, AAAI Press, Menlo Park, Kalifornien, 1994] beschrieben. Der Quelltext für das Standalone-Programm ist vom San Diego Supercomputer Center (http://meme.sdsc.edu) öffentlich verfügbar.
Zum Identifizieren von gemeinsamen Motiven in allen Sequenzen mit dem Software-Tool MEME wurden die folgenden Einstellungen verwendet: -maxsize 500000, -nmotifs 15, -evt 0.001, -maxw 60, -distance 1e-3, -minsites, Anzahl von Sequenzen, die für die Analyse verwendet werden. Die Eingabesequenzen für MEME waren nicht-alignierte Sequenzen im Fasta-Format. Andere Parameter wurden in den Standardeinstellungen in dieser Softwareversion verwendet.
Prosite-Muster für konservierte Domänen wurden mit dem Software-Werkzeug Pratt, Version 2.1, oder manuell erzeugt. Pratt wurde von Inge Jonassen, Dept. of Informatics, Universität Bergen, Norwegen, entwickelt und wurde von Jonassen et al. (I. Jonassen, J. F. Collins und D. G. Higgins, Finding flexible patterns in unaligned Protein sequences, Protein Science 4 (1995), S. 1587–1595; I. Jonassen, Efficient discovery of conserved patterns using a pattern graph, eingereicht bei CABIOS Febr. 1997] beschrieben. Der Quelltext (ANSI C) für das Standalone-Programm ist öffentlich verfügbar, z. B. bei etablierten Bioinformatik-Zentren, wie dem EBI (Europäisches Bioinformatik-Institut).
Zum Erzeugen von Mustern mit dem Software-Tool Pratt wurden die folgenden Einstellungen verwendet: PL (max. Muster-Länge): 100, PN (max. Anz. an Mustersymbolen): 100, PX (max. Anz. aufeinanderfolgender x's): 30, FN (max. Anz. flexibler Spacer): 5, FL (max. Flexibilität): 30, FP (max. Flex. Produkt): 10, ON (max. Anzahl an Mustern): 50. Die Eingabesequenzen für Pratt waren einzelne Regionen der Proteinsequenzen, welche eine hohe Ähnlichkeit aufwiesen, wie identifiziert mit dem Software-Werkzeug MEME. Die Minimumanzahl an Sequenzen, welche mit den erzeugten Mustern übereinstimmen müssen (CM, min. Anz. von Seq., die Übereinstimmung zeigen müssen) wurde auf mindestens 80% der eingegebenen Sequenzen eingestellt. Hier nicht angeführte Parameter wurden in ihren vorgegebenen Einstellungen verwendet.
Mit den Prosite-Mustern der konservierten Domänen kann man nach Proteinsequenzen, die diesem Muster entsprechen, suchen. Verschiedene etablierte Bioinformationszentren bieten öffentliche Internetportale an, bei denen man mit diesen Muster Datenbanksuchen durchführen kann (z. B. PIR [Protein Information Resource, am Georgetown University Medical Center] oder ExPASy [Expert Protein Analysis System]). Alternativ dazu ist Standalone-Software verfügbar, wie etwa das Programm Fuzzpro, welches ein Teil des EMBOSS Software-Pakets ist. Beispielsweise gestattet das Programm Fuzzpro nicht nur die Suche nach einer exakten Muster-Protein-Übereinstimmung, sondern ermöglicht es auch, verschiedene Mehrdeutigkeiten bei der durchgeführten Suche vorzugeben bzw. einzustellen.
Die Abgleichung erfolgte mit der Software ClustalW (Version 1.83) und wurde von Thompson et al. [Thompson, J. D., Higgins, D. G. und Gibson, T. J. (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22: 4673–4680] beschrieben. Der Quelltext für das Standalone-Programm ist vom European Molecular Biology Laboratory; Heidelberg, Deutschland, öffentlich verfügbar. Die Analyse wurde unter Verwendung der Standardparameter von ClustalW v1.83 durchgeführt (Lücken-Öffnungs-Strafwert: 10,0; Lücken-Erweiterungs-Strafwert: 0,2; Proteinmatrix: Gonnet; Protein/DNA endgap: -1; Protein/DNA-Lückendistanz: 4).
Degenerierte Primer können dann in der PCR zur Amplifizierung von Fragmenten neuer Proteine mit der obenerwähnten Aktivität, die z. B. den erhöhten Ertrag vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon verleihen, nach Erhöhen der Expression oder Aktivität oder mit der Aktivität eines wie in Tabelle II, Spalte 3, gezeigten Proteins oder weiteren funktionellen Homologen des Polypeptids der Erfindung aus anderen Organismen Verwendung finden.
Diese Fragmente können dann als Hybridisierungssonde zum Isolieren der vollständigen Gensequenz verwendet werden. Als Alternative können die fehlenden 5'- und 3'-Sequenzen mit Hilfe von RACE-PCR isoliert werden. Ein Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung kann unter Verwendung von cDNA oder, als Alternative, genomischer DNA als Matrize und von geeigneten Oligonukleotid-Primern unter Befolgung von standardmäßigen PCR-Amplifikationstechniken amplifiziert werden. Das derartig amplifizierte Nukleinsäuremolekül kann in einen geeigneten Vektor kloniert und mittels DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Oligonukleotide, welche einem der im Verfahren verwendeten Nukleinsäuremoleküle entsprechen, können durch standardmäßige Syntheseverfahren, zum Beispiel unter Verwendung eines automatischen DNA-Synthesizers, erzeugt werden.
Nukleinsäuremoleküle, welche für das Verfahren gemäß der Erfindung vorteilhaft sind, können basierend auf ihrer Homologie zu den hierin offenbarten Nukleinsäuremolekülen unter Verwendung der Sequenzen oder eines Teils davon oder für die Erzeugung einer Hybridisierungssonde und gemäß Standardhybridisierungstechniken unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden. In diesem Zusammenhang ist es zum Beispiel möglich, ein oder mehrere isolierte Nukleinsäuremoleküle mit einer Länge von wenigstens 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60 oder mehr Nukleotiden, vorzugsweise wenigstens 15, 20 oder 25 Nukleotiden, die unter stringenten Bedingungen mit den oben beschriebenen Nukleinsäuremolekülen hybridisieren, insbesondere mit denen, die eine Nukleotidsequenz des Nukleinsäuremoleküls, das im Verfahren der Erfindung verwendet wird oder für ein in der Erfindung verwendetes Protein kodiert, oder des Nukleinsäuremoleküls der Erfindung umfassen, einzusetzen. Nukleinsäuremoleküle mit 30, 50, 100, 250 oder mehr Nukleotiden können ebenfalls verwendet werden.
Der Begriff „Homologie” bedeutet, dass die jeweiligen Nukleinsäuremoleküle oder kodierten Proteine funktionell und/oder strukturell äquivalent sind. Die Nukleinsäuremoleküle, welche homolog zu den oben beschriebenen Nukleinsäuremolekülen sind und welche Derivate der Nukleinsäuremoleküle sind, sind beispielsweise Variationen der Nukleinsäuremoleküle, welche Modifikationen mit der gleichen biologischen Funktion repräsentieren, insbesondere Proteine mit der gleichen oder im Wesentlichen der gleichen biologischen Funktion kodieren. Sie können natürlich vorkommende Variationen, wie Sequenzen aus anderen Pflanzenvarietäten oder -spezies, oder Mutationen sein. Diese Mutationen können natürlich vorkommen oder sie können durch Mutagenesetechniken erhalten werden. Die allelischen Variationen können natürlich vorkommende allelische Varianten sowie synthetisch hergestellte oder gentechnisch erzeugte Varianten sein. Strukturelle Äquivalente lassen sich zum Beispiel identifizieren, indem man die Bindung des Polypeptids an Antikörper testet, oder durch computergestützte Vorhersagen. Strukturäquivalente weisen ähnliche immunologische Charakteristika auf, wobei sie zum Beispiel ähnliche Epitope enthalten.
Mit „Hybridisieren” ist gemeint, dass derartige Nukleinsäuremoleküle unter herkömmlichen Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, hybridisieren, wie z. B. beschrieben von Sambrook (Molecular Cloning; A Laborstory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)) oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1–6.3.6.
Gemäß der Erfindung können sowohl DNA- als auch RNA-Moleküle der Nukleinsäure der Erfindung als Sonden verwendet werden. Ferner können, als Matrize zur Identifizierung von funktionellen Homologen, sowohl Northern-Blot-Assays als auch Southern-Blot-Assays durchgeführt werden. Der Northern-Blot-Assay liefert vorteilhafterweise weitere Informationen über das exprimierte Genprodukt: z. B. Expressionsmuster, Auftreten der Verabreitungsschritte wie Spleißen und Capping, usw. Der Southern-Blot-Assay liefert zusätzliche Informationen über die chromosomale Lokalisierung und Organisation des für das Nukleinsäuremolekül der Erfindung kodierenden Gens.
Ein bevorzugtes, nicht einschränkendes Beispiel für stringente Hydridisierungsbedingungen sind Hybridisierungen in 6 × Natriumchlorid/Natriumcitrat (= SSC) bei ungefähr 45°C, gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten in 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 50 bis 65°C, zum Beispiel bei 50°C, 55°C oder 60°C. Der Fachmann weiß, dass diese Hybridisierungsbedingungen sich in Abhängigkeit vom Typ der Nukleinsäure unterscheiden und, zum Beispiel wenn organische Lösungsmittel vorhanden sind, hinsichtlich der Temperatur und der Konzentration des Puffers. Die Temperatur unter „Standard-Hybridisierungsbedingungen” liegt zum Beispiel in Abhängigkeit vom Typ der Nukleinsäure zwischen 42°C und 58°C, vorzugsweise zwischen 45°C und 50°C in einem wässrigen Puffer mit einer Konzentration von 0,1 ×, 0,5 ×, 1 ×, 2 ×, 3 ×, 4 × oder 5 × SSC (pH 7,2). Wenn organische(s) Lösungsmittel im oben erwähnten Puffer vorhanden ist/sind, beispielsweise 50% Formamid, beläuft sich die Temperatur unter Standardbedingungen auf ungefähr 40°C, 42°C oder 45°C. Die Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride sind beispielsweise bevorzugt 0,1 × SSC und 20°C, 25°C, 30°C, 35°C, 40°C oder 45°C, vorzugsweise zwischen 30°C und 45°C. Die Hybridisierungsbedingungen für DNA:RNA-Hybride sind beispielsweise bevorzugt 0,1 × SSC und 30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C oder 55°C, vorzugsweise zwischen 45°C und 55°C. Die oben erwähnten Hybridisierungstemperaturen werden zum Beispiel für eine Nukleinsäure von ungefähr 100 bp (= Basenpaare) Länge und mit einem G + C-Gehalt von 50% in Abwesenheit von Formamid ermittelt. Der Fachmann weiß, wie man die erforderlichen Hybridisierungsbedingungen mit der Hilfe von Lehrbüchern ermittelt, zum Beispiel denjenigen, welche oben erwähnt wurden, oder aus den folgenden Lehrbüchern: Sambrook et al., „Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laborstory, 1989; Hames und Higgins (Hrsg.) 1985, „Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach", IRL Press bei Oxford University Press, Oxford; Brown (Hrsg.) 1991, „Essential Molecular Biology: A Practical Approach", IRL Press bei Oxford University Press, Oxford.
Ein weiteres Beispiel einer derartigen stringenten Hybridisierungsbedingung ist die Hybridisierung bei 4 × SSC bei 65°C, gefolgt von Waschen in 0,1 × SSC bei 65°C während einer Stunde. Alternativ dazu erfolgt eine beispielhafte stringente Hybridisierungsbedingung in 50% Formamid, 4 × SSC bei 42°C. Ferner können die Bedingungen während des Waschschrittes aus dem Bereich von Bedingungen ausgewählt werden, der von Niederstringenzbedingungen (ungefähr 2 × SSC bei 50°C) und Hochstringenzbedingungen (ungefähr 0,2 × SSC bei 50°C, vorzugsweise bei 65°C) begrenzt wird (20 × SSC: 0,3M Natriumcitrat, 3M NaCl, pH 7,0). Zusätzlich kann die Temperatur während des Waschschritts von niederstringenten Bedingungen bei Raumtemperatur, ungefähr 22°C, auf höherstringente Bedingungen bei ungefähr 65°C erhöht werden. Die Parameter Salzkonzentration und Temperatur können beide gleichzeitig variiert werden, oder ansonsten kann einer der beiden Parameter konstant gehalten werden, während man den anderen variiert. Denaturierungsmittel, zum Beispiel Formamid oder SDS, können ebenfalls während der Hybridisierung verwendet werden. In Gegenwart von 50% Formamid erfolgt die Hybridisierung vorzugsweise bei 42°C. Relevante Faktoren wie i) Dauer der Behandlung, ii) Salzbedingungen, iii) Tensidbedingungen, iv) Kompetitor-DNAs, v) Temperatur und vi) gewählte Sonde können von Fall zu Fall kombiniert werden, so dass hier nicht alle Möglichkeiten aufgeführt werden können. So werden in einer bevorzugten Ausführungsform Northern-Blots mit Rothi-Hybri-Quick-Puffer (Roth, Karlsruhe) 2 h bei 68°C vorhybridisiert. Die Hybridsierung mit einer radioaktiv markierten Sonde erfolgt über Nacht bei 68°C. Die anschließenden Waschschritte werden bei 68°C mit 1 × SSC durchgeführt.
Bei den Southern-Blot-Assays wird die Membran 2 h bei 68°C mit Rothi-Hybri-Quick-Puffer (Roth, Karlsruhe) vorhybridisiert. Die Hybridisierung mit einer radioaktiv markierten Sonde erfolgt über Nacht bei 68°C. Anschließend wird der Hybridisierungspuffer verworfen und der Filter kurz mit 2 × SSC; 0,1% SDS gewaschen. Nachdem der Waschpuffer verworfen wurde, wird neuer 2 × SSC; 0,1% SDS-Puffer zugegeben, und es wird 15 Minuten lang bei 68°C inkubiert. Dieser Waschschritt wird zweimal durchgeführt, worauf sich ein zusätzlicher 10-minütiger Waschschritt mit 1 × SSC; 0,1% SDS bei 68°C anschließt.
Einige Beispiele für Bedingungen der DNA-Hybridisierung (Southern Blot-Assays) und Waschschritte sind unten gezeigt:

(1) Hybridisierungsbedingungen können zum Beispiel aus den folgenden Bedingungen ausgewählt werden: a) 4 × SSC bei 65°C, b) 6 × SSC bei 45°C, c) 6 × SSC, 100 mg/ml DNA aus denaturiertem fragmentiertem Fischsperma bei 68°C, d) 6 × SSC, 0,5% SDS, 100 mg/ml DNA aus denaturiertem Lachssperma bei 68°C, e) 6 × SSC, 0,5% SDS, 100 mg/ml DNA aus denaturiertem fragmentiertem Lachssperma; 50% Formamid bei 42°C, f) 50% Formamid, 4 × SSC bei 42°C, g) 50% (v/v) Formamid, 0,1% Rinderserumalbumin, 0,1% Ficoll, 0,1% Polyvinylpyrrolidon, 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 6,5, 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C, h) 2 × oder 4 × SSC bei 50°C (niederstringente Bedingung) oder i) 30 bis 40% Formamid, 2 × oder 4 × SSC bei 42°C (niederstringente Bedingung).
(2) Waschschritte können beispielsweise aus den folgenden Bedingungen ausgewählt sein: a) 0,015 M NaCl/0,0015 M Natriumcitrat/0,1% SDS bei 50°C. b) 0,1 × SSC bei 65°C. c) 0,1 × SSC, 0,5% SDS bei 68°C. d) 0,1 × SSC, 0,5% SDS, 50% Formamid bei 42°C. e) 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 42°C. f) 2 × SSC bei 65°C (niederstringente Bedingung).

Polypeptide mit der obenerwähnten Aktivität, d. h. Polypeptide, die die Erhöhung des Ertrags vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon verleihen, die aus anderen Organismen abgeleitet sind, können durch andere DNA-Sequenzen kodiert sein, die mit den in Tabelle I, Spalten 5 und 7, gezeigten Sequenzen unter niederstringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren und die bei der Expression für Peptide kodieren, die den erhöhten Ertrag vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon verleihen.
Weiterhin müssen einige Anwendungen bei niederstringenten Hybridisierungsbedingungen durchgeführt werden, ohne dass sich dadurch irgendwelche Konsequenzen für die Spezifität der Hybridisierung ergeben. So könnte man zum Beispiel für eine Southern-Blot-Analyse der Gesamt-DNA als Sonde ein Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung verwenden und niederstringent waschen (55°C in 2×SSPE, 0,1% SDS). Die Hybridisierungsanalyse könnte ein einfaches Muster nur mit Genen, die für Polypeptide der vorliegenden Erfindung oder für im Verfahren der Erfindung verwendete Polypeptide kodieren, z. B. mit der hier erwähnten Aktivität der Erhöhung der Toleranz und/oder Resistenz gegenüber Umweltstress und der Biomasseproduktion verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon. Ein weiteres Beispiel für solche niederstringenten Hybridisierungsbedingungen ist 4 × SSC bei 50°C oder die Hybridisierung mit 30 bis 40% Formamid bei 42°C. Solche Moleküle schließen die ein, bei denen es sich um Fragmente, Analoga oder Derivate des Polypeptids der Erfindung oder des im Verfahren der Erfindung verwendeten Polypeptids handelt und die sich zum Beispiel in Bezug auf eine oder mehrere Aminosäuren- und/oder Nukleotiddeletionen, -insertionen, -substitutionen, -additionen und/oder -rekombinationen oder andere im Stand der Technik bekannte Modifikationen entweder alleine oder in Kombination von den oben beschriebenen Aminosäuresequenzen oder ihrer/ihren zugrundeliegenden Nukleotidsequenz(en) unterscheiden. Bevorzugt wendet man jedoch hochstringente Hybridisierungsbedingungen an.
Die Hybridisierung sollte in vorteilhafter Weise mit Fragmenten von mindestens 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 oder 40 bp, vorteilhafterweise mindestens 50, 60, 70 oder 80 bp, vorzugsweise mindestens 90, 100 oder 110 bp durchgeführt werden. Am stärksten bevorzugt sind Fragmente mit wenigstens 15, 20, 25 oder 30 bp. Bevorzugt sind auch Hybridisierungen mit mindestens 100 bp oder 200, insbesondere bevorzugt mindestens 400 bp Länge. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sollte die Hybridisierung mit der gesamten Nukleinsäuresequenz bei den oben beschriebenen Bedingungen durchgeführt werden.
Die Begriffe „Fragment”, „Fragment einer Sequenz” oder „Teil einer Sequenz” bedeuten eine trunkierte bzw. verkürzte Sequenz der betreffenden Originalsequenz. Die gekürzte Sequenz (Nukleinsäure- oder Proteinsequenz) kann in ihrer Länge stark schwanken; die Mindestgröße ist eine Sequenz mit einer Größe, die ausreicht, um eine Sequenz bereitzustellen, die wenigstens eine vergleichbare Funktion und/oder Aktivität der betreffenden Originalsequenz bzw. des betreffenden Originalmoleküls aufweist oder mit dem Nukleinsäuremolekül der Erfindung oder dem im Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuremolekül unter stringenten Bedingungen hybridisiert, während die maximale Größe nicht kritisch ist. Bei einigen Anwendungen ist die maximale Größe nicht wesentlich größer als die, die erforderlich ist, um die gewünschte Aktivität und/oder Funktion(en) der Originalsequenz bereitzustellen.
Typischerweise wird das trunkierte Aminosäuremolekül im Bereich von etwa 5 bis etwa 310 Aminosäuren Länge liegen. Noch typischer wird die Sequenz jedoch eine Länge von maximal etwa 250 Aminosäuren, vorzugsweise maximal etwa 200 oder 100 Aminosäuren, aufweisen. Es ist gewöhnlich wünschenswert, Sequenzen mit wenigstens etwa 10, 12 oder 15 Aminosäuren, bis zu einem Maximum von etwa 20 oder 25 Aminosäuren, auszuwählen.
Der Begriff „Epitop” bezieht sich auf spezifische immunreaktive Stellen innerhalb eines Antigens, welche ebenfalls als antigene Determinanten bekannt sind. Diese Epitope können eine lineare Anordnung von Monomeren in einer polymeren Zusammensetzung – wie etwa Aminosäuren in einem Protein – sein oder aus einer komplexeren Sekundär- oder Tertiärstruktur bestehen, oder diese umfassen. Der Fachmann wird erkennen, dass Immunogene (d. h. Substanzen, die zum Hervorrufen einer Immunantwort befähigt sind) Antigene sind; allerdings sind manche Antigene, wie etwa Haptene, keine Immunogene, sondern können durch Kopplung an ein Trägermolekül immunogen gemacht werden. Der Begriff „Antigen” beinhaltet Bezugnahmen auf eine Substanz, gegen die ein Antikörper erzeugt werden kann und/oder gegen die der Antikörper spezifisch immunreaktiv ist.
Gemäß einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Epitop des Polypeptids der vorliegenden Erfindung bzw. des im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Polypeptids und verleiht einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon.
Der Begriff „eine oder mehrere Aminosäuren” bezieht sich auf wenigstens eine Aminosäure, jedoch nicht mehr als die Anzahl an Aminosäuren, die eine Homologie von unter 50% Identität zur Folge haben würde. Vorzugsweise ist die Identität mehr als 70% oder 80%, weiter bevorzugt sind 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% oder 95%, noch weiter bevorzugt sind 96%, 97%, 98% oder 99% Identität.
Weiterhin umfasst das Nukleinsäuremolekül der Erfindung ein Nukleinsäuremolekül, bei dem es sich um ein Komplement zu einer der Nukleotidsequenzen der obenerwähnten Nukleinsäuremoleküle oder eines Teils davon handelt. Ein Nukleinsäuremolekül oder seine Sequenz, das/die komplementär zu einer der in Tabelle I, Spalten 5 und 7, gezeigten Nukleotidmoleküle bzw. -sequenzen ist, ist eines/eine, das/die ausreichend komplementär zu einer der in Tabelle I, Spalten 5 und 7, gezeigten Nukleotidmoleküle bzw. -sequenzen ist, so dass es/sie mit einer der in Tabelle I, Spalten 5 und 7, gezeigten Nukleotidsequenzen unter Bildung eines stabilen Duplex hybridisieren kann. Vorzugsweise wird die Hybridisierung unter stringenten Hybridisierungsbedingungen durchgeführt. Allerdings ist ein Komplement von einer der hierin offenbarten Sequenzen vorzugsweise ein Sequenzkomplement dazu, in Übereinstimmung mit der dem Fachmann gut bekannten Basenpaarung von Nukleinsäuremolekülen. So paaren sich zum Beispiel die Basen A und G mit den Basen T und U bzw. C, und umgekehrt. Modifikationen der Basen können den Basenpaarungs-Partner beeinflussen.
Das Nukleinsäuremolekül der Erfindung umfasst eine Nukleotidsequenz, die wenigstens etwa 30%, 35%, 40% oder 45%, vorzugsweise wenigstens etwa 50%, 55%, 60% oder 65%, besonders bevorzugt wenigstens etwa 70%, 80% oder 90%, und ganz besonders bevorzugt wenigstens etwa 95%, 97%, 98%, 99% oder mehr homolog zu einer in Tabelle I, Spalten 5 und 7, gezeigten Nukleotidsequenz oder einem Teil davon ist und vorzugsweise die obenerwähnte Aktivität aufweist, insbesondere Toleranz und/oder Resistenz gegenüber Umweltstress und eine die Biomasseproduktion erhöhende Aktivität, nach der Erhöhung der Aktivität oder einer Aktivität eines wie in Tabelle II, Spalte 3, gezeigten Genprodukts, zum Beispiel durch Expression entweder im Zytosol oder Zytoplasma oder in einer Organelle wie einem Plastid oder Mitochondrien oder beiden, vorzugsweise in Plastiden.
Das Nukleinsäuremolekül der Erfindung umfasst eine Nukleotidsequenz bzw. ein Nukleotidmolekül, die/das mit einer der in Tabelle I, Spalten 5 und 7, gezeigten Nukleotidsequenzen oder einem Teil davon vorzugsweise unter wie hier definierten stringenten Bedingungen hybridisiert und für ein Protein mit der obenerwähnten Aktivität kodiert, z. B. einen erhöhten Ertrag verleiht, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, zum Beispiel durch Expression entweder im Zytosol oder in einer Organelle wie einem Plastid oder Mitochondrien oder beiden, vorzugsweise in Plastiden, und gegebenenfalls die Aktivität ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Phosphoenolpyruvatcarboxylkinase, Arginin/Alanin-Aminopeptidase, D-Alanyl-D-alanincarboxypeptidase, Diacylglycerolpyrophosphatphosphatase, Dityrosintransporter, Farnesyldiphosphatfarnesyltransferase, NAD+-abhängiger Betainaldehyddehydrogenase, Serinhydrolase, dem an der Übertragung von Ketoconazolresistenz beteiligten transkriptionellen Regulator, Uridinkinase, dem yal043c-a-Protein, dem ybr071w-Protein und dem ydr445c-Protein verleiht.
Außerdem kann das Nukleinsäuremolekül der Erfindung nur einen Teil der kodierenden Region einer der in Tabelle I, Spalten 5 und 7, gezeigten Sequenzen aufweisen, zum Beispiel ein Fragment, das als Sonde oder Primer verwendet werden kann oder ein Fragment, das für einen biologisch aktiven Teil des Polypeptids der vorliegenden Erfindung oder eines im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Polypeptids kodiert, d. h. eines Polypeptids mit der obenerwähnten Aktivität, das z. B. eine erhöhte Toleranz und/oder Resistenz gegenüber Umweltstress und eine erhöhte Biomasseproduktion verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon verleiht, wenn dessen Aktivität erhöht wird, zum Beispiel durch Expression entweder im Zytosol oder in einer Organelle wie einem Plastid oder Mitochondrien oder beiden, vorzugsweise in Plastiden. Die durch Klonieren des für das vorliegende, für das erfindungsgemäße Protein kodierenden Gens bestimmten Nukleotidsequenzen ermöglichen die Herstellung von Sonden und Primern, die auf die Identifizierung und/oder Klonierung ihrer Homologe in anderen Zelltypen und Organismen zugeschnitten sind. Die Sonde/der Primer umfasst typischerweise im Wesentlichen gereinigtes Oligonukleotid. Das Oligonukleotid umfasst typischer weise eine Region einer Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit wenigstens etwa 12, 15, vorzugsweise etwa 20 oder 25, besonders bevorzugt etwa 40, 50 oder 75, aufeinanderfolgenden Nukleotiden eines Sense-Strangs einer der z. B. in Tabelle I, Spalten 5 und 7, angeführten Sequenzen, einer Antisense-Sequenz einer der z. B. in Tabelle I, Spalten 5 und 7, angeführten Sequenzen oder natürlich vorkommenden Mutanten davon hybridisiert. Auf einem Nukleotid der Erfindung basierende Primer können in PCR-Reaktionen zum Klonieren von Homologen des Polypeptids der Erfindung oder des im Verfahren der Erfindung verwendeten Polypeptids verwendet werden, z. B. als die in den Beispielen der vorliegenden Erfindung beschriebenen Primer, z. B. wie in den Beispielen gezeigt. Eine PCR mit den in Tabelle III, Spalte 7, gezeigten Primern führt zu einem Fragment des wie in Tabelle II, Spalte 3, gezeigten Genprodukts.
Primersets sind austauschbar. Dem Fachmann ist bekannt, wie man diese Primer kombiniert, um zu dem gewünschten Produkt zu gelangen, z. B. in einem Klon der vollständigen Länge oder einer Teilsequenz. Auf den Sequenzen des Nukleinsäuremoleküls der Erfindung oder des im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäuremoleküls basierende Sonden lassen sich einsetzen, um Transkripte oder für diese kodierende genomische Sequenzen oder homologe Proteine nachzuweisen. Die Sonde kann ferner eine daran gebundene Markierungsgruppe umfassen, wobei die Markierungsgruppe z. B. ein radioaktives Isotop, eine fluoreszierende Verbindung, ein Enzym oder ein Enzym-Cofaktor sein kann. Solche Sonden können als Teil eines Testkits für genomische Marker zur Identifizierung von Zellen, die ein Polypeptid der Erfindung oder ein im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendetes Polypeptid exprimieren, verwendet werden, wie z. B. durch die Messung einer Konzentration eines kodierenden Nukleinsäuremoleküls in einer Probe von Zellen, z. B. indem man mRNA-Konzentrationen nachweist oder bestimmt, ob ein die Sequenz des Polynukleotids der Erfindung oder des in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Polynukleotids enthaltendes genomisches Gen mutiert oder deletiert worden ist.
Das Nukleinsäuremolekül der Erfindung kodiert für ein Polypeptid oder einen Teil davon, der eine Aminosäuresequenz einschließt, die ausreichend homolog mit der in Tabelle II, Spalten 5 und 7, gezeigten Aminosäuresequenz ist, so dass das Protein oder der Teil davon die Fähigkeit beibehält, zur Erhöhung der Toleranz und/oder Resistenz gegenüber Umweltstress und der Erhöhung der Biomasseproduktion, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, beizutragen; dies schließt insbesondere die Erhöhung der wie oben erwähnten oder wie in den Beispielen beschriebenen Aktivität in Pflanzen ein.
So, wie er hier verwendet wird, bezieht sich der Begriff „ausreichend homolog” auf Proteine oder Teile davon mit Aminosäuresequenzen, die eine Mindestzahl an mit einer in Tabelle II, Spalten 5 und 7, gezeigten Aminosäuresequenz identischen oder äquivalenten Aminosäureresten (z. B. einen Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette wie ein Aminosäurerest in einer der Sequenzen des Polypeptids der vorliegenden Erfindung) einschließen, so dass das Protein oder der Teil davon dazu fähig ist, zur Erhöhung der Toleranz und/oder Resistenz gegenüber Umweltstress und der Erhöhung der Biomasseproduktion, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, beizutragen. Für Beispiele mit der Aktivität eines wie in Tabelle II, Spalte 3, gezeigten und wie hier beschriebenen Proteins.
Gemäß einer Ausführungsform umfasst das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung eine Nukleinsäure, die für einen Teil des Proteins der vorliegenden Erfindung kodiert. Das Protein ist wenigstens etwa 30%, 35%, 40%, 45% oder 50%, vorzugsweise wenigstens etwa 55%, 60%, 65% oder 70%, und besonders bevorzugt wenigstens etwa 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93% oder 94% und ganz besonders bevorzugt wenigstens etwa 95%, 97%, 98%, 99% oder mehr homolog zu einer ganzen Aminosäuresequenz aus Tabelle II, Spalten 5 und 7 und hat die obenerwähnte Aktivität, z. B. verleiht sie einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, zum Beispiel durch Expression entweder im Zytosol oder in einer Organelle wie einem Plastid oder Mitochondrien oder beiden, vorzugsweise in Plastiden.
Teile von durch das Nukleinsäuremolekül der Erfindung kodierten Proteinen sind vorzugsweise biologisch aktiv, vorzugsweise mit der obenerwähnten kommentierten Aktivität, z. B. indem sie nach Erhöhung der Aktivität eine erhöhte Toleranz und/oder Resistenz gegenüber Umweltstress und eine erhöhte Biomasseproduktion, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon verleihen.
Wie hier erwähnt soll der Begriff „biologisch aktiver Teil” einen Teil, z. B. eine Domäne/ein Motiv, einschließen, der eine erhöhte Toleranz und/oder Resistenz gegenüber Umweltstress und eine erhöhte Biomasseproduktion, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verleiht oder eine immunologische Aktivität hat, so dass er an einen Antikörper bindet, der spezifisch an das Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder ein im Verfahren der vorliegenden Erfindung für einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon verwendetes Polypeptid bindet.
Die Erfindung betrifft weiterhin Nukleinsäuremoleküle, die sich aufgrund der Degeneration des genetischen Kodes von einer der in Tabelle I A, Spalten 5 und 7, gezeigten Nukleotidsequenzen (und Teilen davon) unterscheiden und somit für ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung, insbesondere ein Polypeptid mit der obenerwähnten Aktivität, z. B. wie die durch die in Tabelle II, Spalten 5 und 7, gezeigte Sequenz wiedergegebenen Polypeptide oder die funktionellen Homologe kodieren. Vorteilhafterweise umfasst, oder gemäß einer anderen Ausführungsform hat, das Nukleinsäuremolekül der Erfindung eine Nukleotidsequenz, die für ein Protein, welches eine in Tabelle II, Spalten 5 und 7, gezeigte Aminosäuresequenz umfasst, oder gemäß einer anderen Ausführungsform hat, oder die funktionellen Homologen kodiert. Gemäß noch einer weiteren Ausführungsform kodiert das Nukleinsäuremolekül der Erfindung für ein Protein vollständiger Länge, das im Wesentlichen homolog zu einer in Tabelle II, Spalten 5 und 7, gezeigten Aminosäuresequenz oder den funktionellen Homologen ist. In einer bevorzugten Ausführungsform jedoch besteht das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung nicht aus der in Tabelle I, vorzugsweise Tabelle IA, Spalten 5 und 7, gezeigten Sequenz.
Darüber hinaus wird es der Fachmann auf dem Gebiet richtig verstehen, dass die DNA-Sequenzpolymorphismen, welche zu Änderungen in den Aminosäuresequenzen führen, innerhalb einer Population vorkommen können. Solche genetischen Polymorphismen beim für das Polypeptid der Erfindung kodierenden oder das Nukleinsäuremolekül der Erfindung enthaltenden Gen können aufgrund der natürlichen Variation zwischen Individuen in einer Population vorhanden sein.
So, wie sie hier verwendet werden, beziehen sich die Begriffe „Gen” und „rekombinantes Gen” auf Nukleinsäuremoleküle, die einen offenen Leserahmen enthalten, der für das Polypeptid der Erfindung kodiert, oder die das Nukleinsäuremolekül der Erfindung umfassen oder die für das im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendete Polypeptid kodieren, vorzugsweise aus einer Kulturpflanze oder aus einem Mikroorganismus, der sich für das Verfahren der Erfindung eignet. Solche natürlichen Variationen können typischerweise eine 1–5%ige Varianz in der Nukleotidsequenz des Gens zur Folge haben. Alle diese Nukleotidvariationen und die resultierenden Aminosäurepolymorphismen in Genen, die für ein Polypeptid der Erfindung kodieren oder ein Nukleinsäuremolekül der Erfindung umfassen, die auf die natürliche Variation zurückzuführen sind und die die beschriebene funktionelle Aktivität nicht verändern, sollen mit in den Schutzumfang der Erfindung fallen.
Nukleinsäuremoleküle, die den natürlichen Variantenhomologen eines Nukleinsäuremoleküls der Erfindung entsprechen und bei denen es sich auch um eine cDNA handeln kann, können auf Grundlage ihrer Homologie mit den hier offenbarten Nukleinsäuremolekülen isoliert werden, wobei man das Nukleinsäuremolekül der Erfindung oder einen Teil davon als eine Hybridisierungssonde gemäß den Standard-Hybridisierungtechniken unter stringenten Hybridisierungsbedingungen verwendet.
Dementsprechend hat gemäß einer anderen Ausführungsform ein Nukleinsäuremolekül der Erfindung eine Länge von wenigstens 15, 20, 25 oder 30 Nukleotiden. Vorzugsweise hybridisiert es unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz des Nukleinsäuremoleküls der vorliegenden Erfindung oder des im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäuremoleküls, z. B. vorzugsweise die in Tabelle I, Spalten 5 und 7, gezeigte Sequenz, umfasst. Das Nukleinsäuremolekül hat vorzugsweise eine Länge von wenigstens 20, 30, 50, 100, 250 oder mehr Nukleotiden.
Der Begriff „hybridisiert unter stringenten Bedingungen” ist oben stehend definiert. Gemäß einer Ausführungsform soll der Begriff „hybridisiert unter stringenten Bedingungen” Hybridisierungs- und Waschbedingungen beschreiben, bei denen Nukleotidsequenzen, die wenigstens 30%, 40%, 50% oder 65% identisch zueinander sind, typischerweise miteinander hybridisiert bleiben. Vorzugsweise sind die Bedingungen so, dass die Sequenzen, die wenigstens etwa 70%, besonders bevorzugt wenigstens etwa 75% oder 80%, und ganz besonders bevorzugt wenigstens etwa 85%, 90% oder 95% oder mehr identisch zueinander sind, typischerweise miteinander hybridisiert bleiben.
Vorzugsweise entspricht das Nukleinsäuremolekül der Erfindung, das unter stringenten Bedingungen mit einer in Tabelle I, Spalten 5 und 7, gezeigten Sequenz hybridisiert, einem natürlich vorkommenden Nukleinsäuremolekül der Erfindung. So wie hier verwendet bezieht sich „natürlich vorkommendes” Nukleinsäuremolekül auf ein RNA- oder DNA-Molekül mit einer in der Natur vorkommenden Nukleotidsequenz (die z. B. für ein natürliches Protein kodiert). Vorzugsweise kodiert das Nukleinsäuremolekül für ein natürliches Protein mit der obenerwähnten Aktivität, das nach der Erhöhung der Expression oder Aktivität davon oder der Aktivität eines Proteins der Erfindung oder eines im Verfahren der Erfindung verwendeten Proteins, zum Beispiel durch Expression der Nukleinsäuresequenz des Genprodukts im Zytosol und/oder in einer Organelle wie einem Plastid oder Mitochondrien, vorzugsweise in Plastiden, z. B. eine erhöhte Toleranz und/oder Resistenz gegenüber Umweltstress und eine erhöhte Biomasseproduktion verleiht.
Dem Fachmann wird weiterhin bewusst sein, dass zusätzlich zu den natürlich vorkommenden Varianten der Sequenzen des Polypeptids oder Nukleinsäuremoleküls der Erfindung sowie des im Verfahren der Erfindung verwendeten Polypeptids oder Nukleinsäuremoleküls, die in der Population vorhanden sein können, Veränderungen durch Mutation in eine Nukleotidsequenz des Nukleinsäuremoleküls, das für das Polypeptid der Erfindung oder das im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendete Polypeptid kodiert, eingeführt werden können, wodurch es zu Veränderungen in der Aminosäuresequenz des kodierten Polypeptids kommt, ohne dass die funktionelle Fähigkeit des Polypeptids beeinträchtig wird und vorzugsweise die Aktivität nicht abnimmt.
So kann man zum Beispiel in einer Sequenz des Nukleinsäuremoleküls der Erfindung oder eines im Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuremoleküls, z. B. wie in Tabelle I, Spalten 5 und 7, gezeigt, Nukleotidsubstitutionen vornehmen, die zu Aminosäuresubstitutionen bei „nicht essentiellen” Aminosäureresten führen.
Ein „nicht essentieller” Aminosäurerest ist ein Rest, der in der Wildtyp-Sequenz geändert werden kann, ohne dass sich die Aktivität des Polypeptids ändert, während ein „essentieller” Aminosäurerest für eine wie obenerwähnte Aktivität benötigt wird, was z. B. zu einer Erhöhung der Toleranz und/oder Resistenz gegenüber Umweltstress und einer Erhöhung der Biomasseproduktion, verglichen mit einer entsprechenden nichttransformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon in einem Organismus führt, nachdem die Aktivität des Polypeptids erhöht wurde. Andere Aminosäurereste jedoch (z. B. die, die in der Domäne mit der besagten Aktivität nicht konserviert oder nur teilweise konserviert sind) können nicht essentiell für die Aktivität sein und sind daher wahrscheinlich Veränderungen zugänglich, ohne dass dabei die Aktivität verändert wird.
Ferner weiß der Fachmann auf dem Gebiet, dass sich die Codon-Verwendung zwischen Organismen unterscheiden kann. Daher kann er die Codon-Verwendung im Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung an die Verwendung des Organismus oder des Zellkompartiments, zum Beispiel des Plastids oder der Mitochondrien, in dem/in denen das Polynukleotid bzw. Polypeptid exprimiert wird, anpassen.
Dementsprechend betrifft die Erfindung Nukleinsäuremoleküle, die für ein Polypeptid mit der obenerwähnten Aktivität kodieren, in einem Organismus oder Teilen davon, zum Beispiel durch Expression entweder im Zytosol oder in einer Organelle wie einem Plastid oder Mitochondrien oder beiden, vorzugsweise in Plastiden, die Veränderungen bei den Aminosäureresten enthalten, die nicht essentiell für diese Aktivität sind. Solche Polypeptide unterscheiden sich in der Aminosäuresequenz von einer in den in Tabelle II, Spalten 5 und 7, gezeigten Sequenzen enthaltenen Sequenz, haben aber immer noch die hier beschriebene Aktivität. Das Nukleinsäuremolekül kann eine für ein Polypeptid kodierende Nukleotidsequenz umfassen, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die wenigstens etwa 50% identisch zu einer in Tabelle II, Spalten 5 und 7, gezeigten Aminosäuresequenz ist und nach der Erhöhung ihrer Aktivität dazu in der Lage ist, zur Erhöhung des Ertrags, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, beizutragen, z. B. dessen Expression zum Beispiel durch Expression entweder im Zytosol oder in einer Organelle wie einem Plastid oder Mitochondrien oder beiden, vorzugsweise in Plastiden. Vorzugsweise ist das durch das Nukleinsäuremolekül kodierte Protein wenigstens etwa 60% identisch mit der in Tabelle II, Spalten 5 und 7, gezeigten Sequenz, besonders bevorzugt wenigstens etwa 70% identisch mit einer der in Tabelle II, Spalten 5 und 7, gezeigten Sequenzen, noch mehr bevorzugt wenigstens etwa 80%, 90%, 95% homolog zu der in Tabelle II, Spalten 5 und 7, gezeigten Sequenz, und ganz besonders bevorzugt wenigstens etwa 96%, 97%, 98% oder 99% identisch mit der in Tabelle II, Spalten 5 und 7, gezeigten Sequenz.
Zur Bestimmung der prozentualen Homologie (= Identität, hier austauschbar verwendet) von zwei Aminosäuresequenzen oder von zwei Nukleinsäuremolekülen werden die Sequenzen für einen optimalen Vergleich untereinander geschrieben (man kann zum Beispiel Lücken in die Sequenz eines Proteins oder einer Nukleinsäure einfügen, um eine optimale Ausrichtung mit dem anderen Protein bzw. der anderen Nukleinsäure zu erzielen).
Dann werden die Aminosäurereste oder Nukleinsäuremoleküle an den entsprechenden Aminosäurepositionen bzw. Nukleotidpositionen verglichen. Ist eine Position in einer Sequenz durch den gleichen Aminosäurerest bzw. das gleiche Nukleinsäuremolekül wie die entsprechende Position in der anderen Sequenz belegt, so sind die Moleküle in dieser Position homolog (d. h. Aminosäure- oder Nukleinsäure”homologie” wie im vorliegenden Zusammenhang verwendet entspricht einer Aminosäure- bzw. Nukleinsäure ”identität”). Die prozentuale Homologie zwischen den beiden Sequenzen ist eine Funktion der Zahl an identischen Positionen, die von den Sequenzen geteilt werden (d. h. % Homologie = Anzahl an identischen Positionen/Gesamtanzahl an Positionen × 100). Die Begriffe „Homologie” und „Identität” sind somit als Synonyme anzusehen.
Zur Bestimmung der prozentualen Homologie (= Identität) von zwei oder mehr Aminosäuren oder von zwei oder mehr Nukleotidsequenzen wurden mehrere Computersoftware-Programme entwickelt. Die Homologie von zwei oder mehr Sequenzen lässt sich zum Beispiel mit der fasta-Software berechnen, die in der vorliegenden Erfindung in Version fasta 3 verwendet wurde (W. R. Pearson und D. J. Lipman, Improved Tools für Biological Sequence Comparison. PNAS 85, 2444–2448 (1988); W. R. Pearson, Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASIA, Methods in Enzymology 183, 63–98 (1990); W. R. Pearson und D. J. Lipman, Improved Tools for Biological Sequence Comparison. PNAS 85, 2444–2448 (1988); W. R. Pearson, Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASIA, Methods in Enzymology 183, 63–98 (1990)). Ein anderes nützliches Programm für die Berechnung von Homologien verschiedener Sequenzen ist das standardmäßige Blast-Programm, welches in der Biomax-Pedant-Software (Biomax, München, Bundesrepublik Deutschland) enthalten ist. Dieses führt unglücklicherweise manchmal zu suboptimalen Ergebnissen, da Blast nicht immer vollständige Sequenzen der Datenbanksequenz (Subject) und der Suchsequenz (Query) beinhaltet. Da dieses Programm nichtsdestoweniger sehr effizient ist, kann es für den Vergleich einer gewaltigen Anzahl von Sequenzen verwendet werden. Die folgenden Einstellungen werden typischerweise für einen derartigen Vergleich von Sequenzen verwendet:
-p Program Name [String]; -d Database [String]; default = nr; -i Query File [File In]; default = stdin; -e Expectation value (E) [Real]; default = 10.0; -m alignment view options: 0 = pairwise; 1 = query-anchored showing identities; 2 = query-anchored no identities; 3 = flat query-anchored, show identities; 4 = flat query-anchored, no identities; 5 = query-anchored no identities and blunt ends; 6 = flat query-anchored, no identities and blunt ends; 7 = XML Blast output; 8 = tabular; 9 tabular with comment lines [Integer]; default = 0; -o BLAST report Output File [File Out] Optional; default = stdout; -F Filter query sequence (DUST with blastn, SEG with others) [String]; default = T; -G Cost to open a gap (zero invokes default behavior) [Integer]; default = 0; -E Cost to extend a gap (zero invokes default behavior) [Integer]; default = 0; -X X dropoff value for gapped alignment (in bits) (zero invokes default behavior); blastn 30, megablast 20, tblastx 0, all others 15 [Integer]; default = 0; -I Show GI's in deflines [T/F]; default = F; -q Penalty for a nucleotide mismatch (blastn only) [Integer]; default = -3; -r Reward for a nucleotide match (blastn only) [Integer]; default = 1; -v Number of database sequences to show one-line descriptions for (V) [Integer]; default = 500; -b Number of database sequence to show alignments for (B) [Integer]; default = 250; -f Threshold for extending hits, default if zero; blastp 11, blastn 0, blastx 12, tblastn 13; tblastx 13, megablast 0 [Integer]; default = 0; -g Perfom gapped alignment (not available with tblastx) [T/F]; default = T; -Q Query Genetic code to use [Integer]; default = 1; -D DB Genetic code (for tblast[nx] only) [Integer]; default = 1; -a Number of processors to use [Integer]; default = 1; -O SeqAlign file [File Out] Optional; -J Believe the query defline [T/F]; default = F; -M Matrix [String]; default = BLOSUM62; -W Word size, default if zero (blastn 11, megablast 28, all others 3) [Integer]; default = 0; -z Effective length of the database (use zero for the real size) [Real]; default = 0; -K Number of best hits from a region to keep (off by default, if used a value of 100 is recommended) [Integer]; default = 0; -P 0 for multiple hit, 1 for single hit [Integer]; default = 0; -Y Effective length of the search space (use zero for the real size) [Real]; default = 0; -S Query strands to search against database (for blast[nx], and tblastx); 3 is both, 1 is top, 2 is bottom [Integer]; default = 3; -T Produce HTML output [T/F]; default = F; -I Restrict search of database to list of GI's [String] Optional; -U Use lower case filtering of FASTA sequence [T/F] Optional; default = F; -y X dropoff value for ungapped extensions in bits (0.0 invokes default behavior); blastn 20, megablast 10, all others 7 [Real]; default = 0.0; -Z X dropoff value for final gapped alignment in bits (0.0 invokes default behavior); blastn/megablast 50, tblastx 0, all others 25 [Integer]; default = 0; -R PSI-TBLASTN checkpoint file [File In] Optional; -n MegaBlast search [T/F]; default = F; -L Location on query sequence [String] Optional; -A Multiple Hits window size, default if zero (blastn/megablast 0, all others 40 [Integer]; default = 0; -w Frame shift penalty (OOF algorithm for blastx) [Integer]; default = 0; -t Length of the largest intron allowed in tblastn for linking HSPs (0 disables linking) [Integer]; default = 0.
Ergebnisse von hoher Qualität werden durch Verwenden des Algorithmus von Needleman und Wunsch oder Smith und Waterman erreicht. Deshalb werden Programme, die auf den genannten Algorithmen basieren, bevorzugt. Vorteilhafterweise können die Vergleiche von Sequenzen mit dem Programm PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351 (1987), Higgins et al., CABIOS 5, 151 (1989)) oder vorzugsweise mit den Programmen „Gap” und „Needle”, welche beide auf den Algorithmen von Needleman und Wunsch basieren (J. Mol. Biol. 48; 443 (1970)), sowie „BestFit”, welches auf dem Algorithmus von Smith und Waterman basiert (Adv. Appl. Math. 2; 482 (1981)), durchgeführt werden. „Gap” and „BestFit” sind Teil des GCG-Software-Pakets [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991); Altschul et al. (Nucleic Acids Res. 25, 3389) (1997)), „Needle” ist Teil der The European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS) (Trends in Genetics 16 (6), 276 (2000)). Deshalb werden die Berechnungen zur Bestimmung der Prozentsätze der Sequenzhomologie vorzugsweise mit den Programmen „Gap” oder „Needle” über den gesamten Bereich der Sequenzen hinweg durchgeführt. Die folgenden Standardeinstellungen für den Vergleich von Nukleinsäuresequenzen wurden für „Needle” verwendet: Matrix: EDNAFULL, Gap_penalty: 10.0, Extend_penalty: 0.5. Die folgenden Standardeinstellungen für den Vergleich von Nukleinsäuresequenzen wurden für „Gap” verwendet: Lücken-Gewichtung: 50, Längen-Gewichtung: 3, mittlere Übereinstimmung: 10,000, mittlere Fehlpaarung: 0,000.
So ist zum Beispiel eine Sequenz, die 80% Homologie mit der Sequenz SEQ ID NO: 63 auf der Nukleinsäureebene hat, so zu verstehen, dass hiermit eine Sequenz gemeint ist, die beim Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO: 63 mittels des obigen Programms „Needle” mit dem obigen Parametersatz 80% Homologie aufweist.
Homologie zwischen zwei Polypeptiden ist so zu verstehen, dass damit die Identität der Aminosäuresequenz über jeweils die gesamte Sequenzlänge gemeint ist, die durch Vergleich mit Hilfe des obigen „Needle”-Programms unter Verwendung von Matrix: EBLOSUM62, Gap_penalty: 8.0, Extend_penalty: 2.0 berechnet wird.
Zum Beispiel versteht es sich, dass eine Sequenz, welche eine 80%ige Homologie mit der Sequenz SEQ-ID NO.: 64 auf dem Proteinniveau aufweist, eine Sequenz bedeutet, welche bei einem Vergleich zur Sequenz SEQ-ID NO.: 64 mittels des obigen Programms „Needle” mit dem obigen Parametersatz 80% Homologie aufweist.
Von der wie in Tabelle II, Spalten 5 und 7, gezeigten erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion abgeleitete funktionelle Äquivalente haben eine Homologie von wenigstens 30%, 35%, 40%, 45% oder 50%, vorzugsweise wenigstens 55%, 60%, 65% oder 70%, bevorzugt wenigstens 80%, besonders bevorzugt wenigstens 85% oder 90%, 91%, 92%, 93% oder 94%, ganz besonders bevorzugt wenigstens 95%, 97%, 98% oder 99% mit einem der wie in Tabelle II, Spalten 5 und 7, gezeigten erfindungsgemäßen Polypeptide und kodieren für Polypeptide mit im Wesentlichen den gleichen Eigenschaften wie das wie in Tabelle II, Spalten 5 und 7, gezeigte Polypeptid.
Funktionelle Äquivalente, die sich durch Substitution, Insertion oder Deletion von einem der wie in Tabelle I, Spalten 5 und 7, gezeigten erfindungsgemäßen Polypeptide ableiten, haben eine Homologie von wenigstens 30%, 35%, 40%, 45% oder 50%, vorzugsweise wenigstens 55%, 60%, 65% oder 70%, bevorzugt wenigstens 80%, besonders bevorzugt wenigstens 85% oder 90%, 91%, 92%, 93% oder 94%, ganz besonders bevorzugt wenigstens 95%, 97%, 98% oder 99% mit einem der wie in Tabelle II, Spalten 5 und 7, gezeigten erfindungsgemäßen Polypeptide und zeichnen sich durch im Wesentlichen die gleichen Eigenschaften wie das wie in Tabelle II, Spalten 5 und 7, gezeigte Polypeptid aus.
”Im Wesentlichen die gleichen Eigenschaften” eines funktionellen Äquivalents ist vor allem so zu verstehen, dass das funktionelle Äquivalent die obenerwähnte Aktivität hat, zum Beispiel bei der Expression entweder im Zytosol oder in einer Organelle wie einem Plastid oder Mitochondrien oder beiden, vorzugsweise in Plastiden, und dabei die Menge an Protein, die Aktivität oder die Funktion dieses funktionellen Äquivalents in einem Organismus, z. B. einem Mikroorganismus, einer Pflanze oder pflanzlichem oder tierischem Gewebe, Pflanzen- oder Tierzellen oder einem Teil davon erhöht.
Ein Nukleinsäuremolekül, das für ein Homolog zu einer Proteinsequenz aus Tabelle II, Spalten 5 und 7 kodiert, lässt sich erzeugen, indem man eine oder mehrere Nukleotidsubstitutionen, -additionen oder -deletionen in eine Nukleotidsequenz des Nukleinsäuremoleküls der vorliegenden Erfindung einführt, insbesondere aus Tabelle I, Spalten 5 und 7, so dass eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -additionen bzw. -deletionen in das kodierte Protein eingeführt werden. Mutationen lassen sich durch Standardtechniken wie zielgerichtete Mutagenese und PCR-vermittelte Mutagenese in die kodierenden Sequenzen von Tabelle I, Spalten 5 und 7 einführen.
Vorzugsweise führt man bei einem oder mehren der vorhergesagten nicht essentiellen Aminosäurereste konservative Aminosäuresubstitutionen durch. Eine „konservative Aminosäuresubstitution” ist eine solche, bei welcher der Aminosäurerest mit einem Aminosäurerest ersetzt wird, der eine ähnliche Seitenkette enthält. Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten sind im Stand der Technik definiert. Diese Familien schließen Aminosäuren mit basischen Seitenketten (z. B. Lysin, Arginin, Histidin), sauren Seitenketten (z. B. Asparaginsäure, Glutaminsäure), ungeladenen polaren Seitenketten (z. B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein), nicht polaren Seitenketten (z. B. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan), beta-verzweigten Seitenketten (z. B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatischen Seitenketten (z. B. Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin) ein.
Somit wird ein vorhergesagter nicht essentieller Aminosäurerest in einem Polypeptid der Erfindung oder einem im Verfahren der Erfindung verwendeten Polypeptid vorzugsweise durch einen anderen Aminosäurerest aus der gleichen Familie ersetzt. Alternativ dazu kann man gemäß einer anderen Ausführungsform Mutationen zufällig entlang einer kodierenden Sequenz oder einem Teil davon eines Nukleinsäuremoleküls der Erfindung oder eines im Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuremoleküls einführen, wie z. B. durch Sättigungsmutagenese, und die erhaltenen Mutanten können auf die hier beschriebene Aktivität gescreent werden, um Mutanten zu identifizieren, die die obenerwähnte Aktivität beibehalten oder sogar erhöht haben, z. B. einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon verleihen.
Nach der Mutagenese einer der hier gezeigten Sequenzen kann das kodierte Protein rekombinant exprimiert werden, und die Aktivität des Proteins kann zum Beispiel unter Anwendung von hier beschriebenen Assays (siehe Beispiele) bestimmt werden.
Die größte Homologie des im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuremoleküls wurde für die folgenden Dateieinträge durch eine Gap-Suche gefunden.
Homologe der verwendeten Nukleinsäuresequenzen mit der in Tabelle I, Spalten 5 und 7, gezeigten Sequenz umfassen auch allelische Varianten mit wenigstens ungefähr 30%, 35%, 40% oder 45% Homologie, vorzugsweise wenigstens ungefähr 50%, 60% oder 70%, besonders bevorzugt wenigstens ungefähr 90%, 91%, 92%, 93%, 94% oder 95% und besonders bevorzugt wenigstens ungefähr 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Homologie mit einer der gezeigten Nukleotidsequenzen oder der obenerwähnten abgeleiteten Nukleinsäuresequenzen oder ihren Homologen, Derivaten oder Analoga oder Teilen von diesen. Allelische Varianten umfassen insbesondere funktionelle Varianten, die sich durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden der gezeigten Sequenzen, vorzugsweise aus Tabelle I, Spalten 5 und 7, oder von den abgeleiteten Nukleinsäuresequenzen erhalten lassen, wobei jedoch die Enzymaktivität oder die biologische Aktivität der resultierenden synthetisierten Proteine vorteilhafterweise erhalten oder erhöht werden sollte.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Nukleinsäuremolekül der Erfindung oder das im Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuremolekül die in einer der Spalten 5 und 7 von Tabelle I gezeigten Sequenzen. Vorzugsweise umfasst das Nukleinsäuremolekül so wenig wie möglich andere, nicht in einer der Spalten 5 und 7 von Tabelle I gezeigte Nukleotide. Gemäß einer Ausführungsform umfasst das Nukleinsäuremolekül weniger als 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50 oder 40 weitere Nukleotide. Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst das Nukleinsäuremolekül weniger als 30, 20 oder 10 weitere Nukleotide. Gemäß einer Ausführungsform ist das im Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuremolekül identisch mit den in Tabelle I, Spalten 5 und 7, gezeigten Sequenzen.
Ebenfalls bevorzugt kodiert das im Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuremolekül für ein Polypeptid, das die in Tabelle II, Spalten 5 und 7, gezeigte Sequenz umfasst. Gemäß einer Ausführungsform kodiert das Nukleinsäuremolekül für weniger als 150, 130, 100, 80, 60, 50, 40 oder 30 weitere Aminosäuren. Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst das kodierte Polypeptid weniger als 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6 oder 5 weitere Aminosäuren. Gemäß einer im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Ausführungsform ist das kodierte Polypeptid identisch zu den in Tabelle II, Spalten 5 und 7, gezeigten Sequenzen.
Gemäß einer Ausführungsform kodiert das Nukleinsäuremolekül der Erfindung oder das im Verfahren verwendete Nukleinsäuremolekül für ein Polypeptid, das die in Tabelle II, Spalten 5 und 7, gezeigte Sequenz umfasst, mit weniger als 100 weiteren Nukleotiden. Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst dieses Nukleinsäuremolekül weniger als 30 weitere Nukleotide. Gemäß einer Ausführungsform ist das in dem Verfahren verwendete Nukleinsäuremolekül identisch zu einer kodierenden Sequenz der in Tabelle I, Spalten 5 und 7, gezeigten Sequenzen.
Polypeptide (= Proteine), die noch über die essentielle biologische oder enzymatische Aktivität des Polypeptids der vorliegenden Erfindung verfügen und, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verleihen, d. h. deren Aktivität im Wesentlichen nicht reduziert ist, sind Polypeptide mit wenigstens 10% oder 20%, vorzugsweise 30% oder 40%, besonders bevorzugt 50% oder 60%, ganz besonders bevorzugt 80% oder 90% oder mehr der biologischen Aktivität bzw. Enzymaktivität des Wildtyps; vorteilhafterweise ist die Aktivität im Vergleich mit der Aktivität eines in Tabelle II, Spalten 5 und 7, gezeigten Polypeptids, exprimiert unter identischen Bedingungen, im Wesentlichen nicht reduziert.
Homologe von Tabelle I, Spalten 5 und 7 oder von den abgeleiteten Sequenzen von Tabelle II, Spalten 5 und 7 schließen auch gekürzte Sequenzen, cDNA, einzelsträngige DNA oder RNA der kodierenden und nicht kodierenden DNA-Sequenz ein. Homologe dieser Sequenzen sind auch so zu verstehen, dass damit Derivate gemeint sind, die nicht kodierende Regionen enthalten, wie zum Beispiel UTRs, Terminatoren, Enhancer oder Promotorvarianten. Die Promotoren upstream von den angegebenen Nukleotidsequenzen können durch eine oder mehrere Nukleotidsubstitutionen, -insertionen und/oder -deletionen modifiziert sein, ohne dass jedoch die Funktionalität oder Aktivität der Promotoren, der offenen Leserahmen (open reading frame, ORF) oder der 3'-regulatorischen Region wie Terminatoren oder andere 3'-regulatorische Regionen, die weit von ORF entfernt sind, beeinträchtigt ist. Es ist weiterhin möglich, dass die Aktivität der Promotoren durch die Modifikation ihrer Sequenz erhöht ist, oder dass sie vollständig durch aktivere Promotoren ersetzt sind, selbst Promotoren aus heterologen Organismen. Geeignete Promotoren sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und sind hierin nachstehend erwähnt.
Zusätzlich zu den für die oben beschriebenen YSRPs kodierenden Nukleinsäuremolekülen betrifft ein anderer Aspekt der Erfindung negative Regulatoren der Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls, ausgewählt aus der Gruppe gemäß Tabelle I, Spalten 5 und/oder 7, vorzugsweise Spalte 7. Man nimmt an, dass Antisense-Polynukleotide dazu die herunterregulierende Aktivität dieser negativen Regulatoren inhibieren, indem sie sich spezifisch an das Target-Polynukleotid binden und Transkription, Spleißen, Transport, Translation und/oder Stabilität des Target-Polynukleotids stören. Methoden zum Targeting des Antisense-Polynukleotids auf die chromosomale DNA, auf ein primäres RNA-Transkript oder auf eine prozessierte mRNA sind im Stand der Technik beschrieben. Vorzugsweise schließen die Target-Regionen Spleißstellen, Translationsinitiationscodons, Translationsterminationscodons und andere Sequenzen im offenen Leserahmen ein.
Der Begriff „antisense” bezieht sich für die Zwecke der Erfindung auf eine Nukleinsäure, die ein Polynukleotid umfasst, das ausreichend komplementär zu einem ganzen oder einem Teil eines Gens, primären Transkripts oder prozessierter mRNA ist, so dass die Expression des endogenen Gens gestört wird. „Komplementäre” Polynukleotide sind solche, die zur Rasenpaarung gemäß den Standard-Komplementaritätsregeln von Watson-Crick fähig sind. Spezifisch bilden Purine Basepaare mit Pyrimidinen unter Bildung einer Kombination von Guanin gepaart mit Cytosin (G:C) und Adenin gepaart mit entweder Thymin (A:T) im Fall von DNA oder Adenin gepaart mit Uracil (A:U) im Fall von RNA. Es versteht sich, dass zwei Polynukleotide miteinander hybridisieren können, selbst wenn sie nicht vollständig komplementär zueinander sind, vorausgesetzt, dass jedes wenigstens eine Region aufweist, die im Wesentlichen komplementär zu der anderen ist. Der Begriff „Antisense-Nukleinsäure” schließt einzelsträngige RNA sowie doppelsträngige DNA-Expressionskassetten ein, die transkribiert werden können, wodurch man eine Antisense-RNA erhält. „Aktive” Antisense-Nukleinsäuren sind Antisense-RNA-Moleküle, die dazu in der Lage sind, selektiv mit einem negativen Regulator der Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls, das für ein Polypeptid mit wenigstens 80% Sequenzidentität mit dem aus der Gruppe gemäß Tabelle II, Spalten 5 und/oder 7, vorzugsweise Spalte 7, ausgewählten Polypeptid kodiert, zu hybridisieren.
Die Antisense-Nukleinsäure kann komplementär zu einem ganzen negativen Regulatorstrang oder zu nur einem Teil davon sein. Gemäß einer Ausführungsform ist das Antisense-Nukleinsäuremolekül antisense zu einer „nicht kodierenden Region” des kodierenden Strangs einer für ein YSRP kodierenden Nukleotidsequenz. Der Begriff „nicht kodierende Region” bezieht sich auf die kodierende Region flankierende 5'- und 3'-Sequenzen, die nicht in Aminosäuren translatiert werden (d. h. die auch als 5'- und 3'-untranslatierte Regionen bezeichnet werden). Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann komplementär zu nur einem Teil der nicht kodierenden Region der YSRP-mRNA sein. So kann das Antisense-Oligonukleotid zum Beispiel komplementär zur die Translation-Startstelle der YSRP-mRNA umgebenden Region sein. Ein Antisense-Oligonukleotid kann zum Beispiel eine Länge von etwa 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Nukleotiden haben. Typischerweise enthalten die Antisense-Moleküle der vorliegenden Erfindung eine RNA mit 60–100% Sequenzidentität mit wenigstens 14 aufeinanderfolgenden Nukleotiden einer nicht kodierenden Region einer der Nukleinsäuren aus Tabelle I. Vorzugsweise beträgt die Sequenzidentität wenigstens 70%, besonders bevorzugt wenigstens 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% und ganz besonders bevorzugt 99%.
Eine Antisense-Nukleinsäure der Erfindung lässt sich durch chemische Synthese und enzymatische Ligationsreaktionen unter Anwendung von im Stand der Technik bekannnten Vorschriften konstruieren. So kann eine Antisense-Nukleinsäure (z. B. ein Antisense-Oligonukleotid) zum Beispiel unter Verwendung von natürlich vorkommenden Nukleotiden oder verschieden modifizierten Nukleotiden, die so beschaffen sind, dass sie die biologische Stabilität der Moleküle erhöhen oder die physikalische Stabilität der zwischen den Antisense- und Sense-Nukleinsäuren gebildeten Duplex erhöhen, chemisch synthetisiert werden; man kann z. B. Phosphorothioatderivate und acridinsubstituierte Nukleotide einsetzen. Beispiele für modifizierte Nukleotide, die zur Bildung der Antisense-Nukleinsäure verwendet werden können, schließen 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, beta-D-Galactosylcheosin, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, beta-D-Mannosylcheosin, 5'-Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6 isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure (v), Wybutoxosin, Pseudouracil, Cheosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure (v), 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil, (acp3)w und 2,6-Diaminopurin ein. Alternativ dazu kann man die Antisense-Nukleinsäure biologisch mit einem Expressionsvektor herstellen, in den eine Nukleinsäure in einer Antisense-Richtung subkloniert wurde (d. h. die von der insertierten Nukleinsäure transkribierte RNA hat eine Antisense-Orientierung zu einer betreffenden Target-Nukleinsäure, im nächsten Unterabschnitt eingehender beschrieben).
Gemäß noch einer anderen Ausführungsform handelt es sich bei dem Antisense-Nukleinsäuremolekül der Erfindung um ein alpha-anomeres Nukleinsäuremolekül. Ein alpha-anomeres Nukleinsäuremolekül bildet spezifisch doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, bei welchen, im Gegensatz zu den gewöhnlichen b-Einheiten, die Stränge parallel zueinander verlaufen (Gaultier et al., 1987, Nucleic Acids. Res. 15: 6625–6641). Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann auch ein 2'-o-Methylribonukleotid (Inoue et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 6131–6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analogon (Inoue et al., 1987, FERS Lett. 215:327–330) enthalten.
Die Antisense-Nukleinsäuremoleküle der Erfindung werden typischerweise an eine Zelle verabreicht oder in situ erzeugt, so dass sie mit zellulärer mRNA und/oder genomischer DNA hybridisieren oder daran binden. Die Hybridisierung kann durch herkömmliche Nukleotidkomplementarität unter Bildung eines stabilen Duplex erfolgen oder, zum Beispiel im Fall eines Antisense-Nukleinsäuremoleküls, das an DNA-Duplexe bindet, über spezifische Wechselwirkungen in der großen Furche der Doppelhelix. Das Antisense-Molekül kann so modifiziert sein, dass es spezifisch an einen Rezeptor oder ein auf einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiertes Antigen bindet, z. B. indem man das Antisense-Nukleinsäuremolekül an ein Peptid oder einen Antikörper bindet, das/der an einen Zelloberflächenrezeptor oder -antigen bindet. Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann auch mit den hier beschriebenen Vektoren an Zellen verabreicht werden. Um ausreichende intrazelluläre Konzentrationen der Antisense-Moleküle zu erreichen, sind Vektorkonstrukte, in denen sich das Antisense-Nukleinsäuremolekül unter der Kontrolle eines starken prokaryontischen, viralen oder eukaryontischen (einschließlich Pflanzen-)Promotors befindet, bevorzugt.
Als Alternative zu Antisense-Polynukleotiden kann man Ribozyme, Sense-Polynukleotide oder doppelsträngige RNA (dsRNA) einsetzen, um die Expression eines YSRP-Polypeptids zu reduzieren. Mit „Ribozym” ist ein katalytisches Enzym auf RNA-Basis mit Ribonukleaseaktivität gemeint, das dazu in der Lage ist, eine einzelsträngige Nukleinsäure, wie eine mRNA, zu der es eine komplementäre Region aufweist, zu spalten. Ribozyme (z. B. in Haselhoff und Gerlach, 1988, Nature 334: 585–591 beschriebene Hammerkopf-Ribozyme) lassen sich verwenden, um YSRP-mRNA-Transkripte katalytisch zu spalten und somit die Translation von YSRP-mRNA zu inhibieren. Ein Ribozym mit Spezifität für eine für das YSRP kodierende Nukleinsäure lässt sich auf Grundlage der wie hier offenbarten Nukleotidsequenz einer YSRP-cDNA oder auf Grundlage einer gemäß in der vorliegenden Erfindung gelehrter Methoden isolierten heterologen Sequenz entwickeln. So kann man zum Beispiel ein Derivat einer Tetrahymena L-19 IVS-RNA konstruieren, bei der die Nukleotidsequenz des aktiven Zentrums komplementär zur zu spaltenden Nukleotidsequenz in einer für das YSRP kodierenden mRNA ist, siehe z. B. die US-Patentschriften Nr. 4,987,071 und 5,116,742 an Cech et al. Alternativ dazu kann man mit YSRP-mRNA eine katalytische RNA mit einer spezifischen Ribonukleaseaktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen selektieren, siehe z. B. Bartel, D. und Szostak, J. W., 1993, Science 261: 1411–1418. Bei bevorzugten Ausführungsformen enthält das Ribozym einen Teil mit wenigstens 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 oder 20 Nukleotiden und besonders bevorzugt 7 oder 8 Nukleotiden, der 100% komplementär zu einem Teil der Target-RNA ist. Methoden zur Herstellung von Ribozymen sind dem Fachmann bekannt, siehe z. B. die US-Patentschriften Nr. 6,025,167 ; 5,773,260 und 5,496,698 .
Der Begriff „dsRNA” bezieht sich, so wie er hier verwendet wird, auf RNA-Hybride, die zwei Stränge RNA umfassen. Die dsRNAs können in der Struktur linear oder zirkulär sein. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die dsRNA spezifisch für ein Polynukleotid, das entweder für das Polypeptid gemäß Tabelle II oder ein Polypeptid mit wenigstens 70% Sequenzidentität mit einem Polypeptid gemäß Tabelle II kodiert. Die hybridisierenden RNAs können im Wesentlichen oder vollständig komplementär sein. Mit „im Wesentlichen komplementär” ist gemeint, dass, wenn die beiden hybridisierenden RNAs unter Verwendung des BLAST-Programms wie oben beschrieben optimal ausgerichtet sind, die hybridisierenden Teile wenigstens 95% komplementär sind. Vorzugsweise hat die dsRNA eine Länge von wenigstens 100 Basenpaaren. Typischerweise haben die hybridisierenden RNAs die gleiche Länge, ohne überhängende 5'- oder 3'-Enden und ohne Lücken. Es können jedoch bei den Methoden der Erfindung dsRNAs mit 5'- oder 3'-Überhängen von bis zu 100 Nukleotiden verwendet werden.
Die dsRNA kann Ribonukleotide oder Ribonukleotidanaloga wie 2'-O-Methylribosylreste oder Kombinationen davon enthalten, siehe z. B. die US-Patentschriften Nr. 4,130,641 und 4,024,222 . Eine dsRNA-Polyriboinosinsäure:Polyribocytidylsäure ist in der US-Patentschrift 4,283,393 beschrieben. Methoden zur Herstellung und Anwendung von dsRNA sind im Stand der Technik bekannt. Eine Methode beinhaltet die gleichzeitige Transkription von zwei komplementären DNA-Strängen entweder in vivo oder in einer einzelnen in-vitro-Reaktionsmischung, siehe z. B. die US-Patentschrift Nr. 5,795,715 . Gemäß einer Ausführungsform kann dsRNA direkt durch Standard-Transformationsvorschriften in eine Pflanze oder Pflanzenzelle eingeführt werden. Alternativ dazu kann dsRNA in einer Pflanzenzelle exprimiert werden, indem man zwei komplementäre RNAs transkribiert.
Andere Methoden zur Inhibierung der endogenen Genexpression wie die Tripelhelixbildung (Moser et al., 1987, Science 238: 645–650 und Cooney et al., 1988, Science 241: 456–459) und Kosuppression (Napoli et al., 1990, The Plant Cell 2: 279–289) sind im Stand der Technik bekannt. Teil-cDNAs und vollständige cDNAs wurden für die Kosuppression von endogenen Pflanzengenen verwendet, siehe z. B. die US-Patentschriften Nr. 4,801,340 , 5,034,323 , 5,231,020 , und 5,283,184 ; Van der Kroll et al., 1990, The Plant Cell 2: 291–299; Smith et al., 1990, Mol. Gen. Genetics 224: 477–481 und Napoli et al., 1990, The Plant Cell 2: 279–289.
Man nimmt an, dass bei der Sense-Suppression durch die Einführung eines Sense-Polynukleotids die Transkription des entsprechenden Target-Gens blockiert wird. Das Sense-Polynukleotid hat eine Sequenzidentität von wenigstens 65% mit dem Gen oder der RNA der Target-Pflanze. Vorzugsweise beträgt die prozentuale Identität wenigstens 80%, 90%, 95% oder mehr. Das eingeführte Sense-Polynukleotid braucht, bezogen auf das Target-Gen oder -Transkript, nicht die volle Länge aufzuweisen.
Vorzugsweise hat das Sense-Polynukleotid eine Sequenzidentität von wenigstens 65% mit wenigstens 100 aufeinanderfolgenden Nukleotiden einer der wie in Tabelle I gezeigten Nukleinsäuren. Die Identitätsregionen können Introns und/oder Exons und nicht translatierte Regionen umfassen. Das eingeführte Sense-Polynukleotid kann transient in der Pflanzenzelle vorhanden sein oder stabil in ein Pflanzenchromosom oder ein extrachromosomales Replikon integriert sein.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Expressionsvektor, der ein Nukleinsäuremolekül umfasst, welches ein Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

a) einem Nukleinsäuremolekül, das für das Polypeptid gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle II kodiert;
b) einem Nukleinsäuremolekül gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle I;
c) einem Nukleinsäuremolekül, welches als Folge der Degeneration des genetischen Codes von einer Polypeptidsequenz gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle II gezeigten abgeleitet sein kann und einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder niedrigen Temperaturen und/oder eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein erhöhtes anderes erwähntes Ertragsmerkmal, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verleiht;
d) einem Nukleinsäuremolekül mit mindestens 30% Identität mit der Nukleinsäuremolekülsequenz eines Polynukleotids, das das Nukleinsäuremolekül gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle I umfasst und einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder niedrigen Temperaturen und/oder eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein erhöhtes anderes erwähntes Ertragsmerkmal, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verleiht;
e) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid mit mindestens 30% Identität mit der Aminosäuresequenz des Polypeptids, das von dem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) kodiert wird, kodiert und die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül wiedergegeben wird, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 von Tabelle I umfasst und einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder niedrigen Temperaturen und/oder eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein erhöhtes anderes erwähntes Ertragsmerkmal, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verleiht;
f) einem Nukleinsäuremolekül, welches unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) hybridisiert und einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder niedrigen Temperaturen und/oder eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein erhöhtes anderes erwähntes Ertragsmerkmal, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehende m und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verleiht;
g) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das mit Hilfe von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern gegen ein Polypeptid, das von einem der Nukleinsäuremoleküle von (a) bis (e) kodiert wird und die Aktivität aufweist, die durch das Nukleinsäuremolekül wiedergegeben wird, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 von Tabelle I umfasst, isoliert werden kann;
h) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das die Konsensussequenz oder ein oder mehrere Polypeptidmotive gemäß Spalte 7 von Tabelle IV umfasst und vorzugsweise die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül wiedergegeben wird, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 von Tabelle II oder IV umfasst;
i) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aktivität aufweist, die durch ein Protein gemäß Spalte 5 von Tabelle II wiedergegeben wird, und einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder niedrigen Temperaturen und/oder eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein erhöhtes anderes erwähntes Ertragsmerkmal, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verleiht;
j) einem Nukleinsäuremolekül, welches ein Polynukleotid umfasst, das man erhält, indem man eine cDNA-Bibliothek oder eine genomische Bibliothek unter Verwendung der Primer aus Spalte 7 von Tabelle III, die nicht an ihrem 5'-Ende mit den Nukleotiden ATA beginnen, amplifiziert, und vorzugsweise die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 von Tabelle II oder IV umfasst, wiedergegeben wird; und
k) einem Nukleinsäuremolekül, welches erhältlich ist, indem man eine geeignete Nukleinsäurebibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde, die eine komplementäre Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls von (a) oder (b) umfasst, oder mit einem Fragment davon, mit mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt, eines Nukleinsäuremoleküls, das komplementär zu einer in (a) bis (e) charakterisierten Nukleinsäuremolekülsequenz ist und für ein Polypeptid kodiert, das die Aktivität aufweist, die durch ein ein Polypeptid gemäß Spalte 5 von Tabelle II umfassendes Protein wiedergegeben wird;

Die Erfindung stellt weiterhin einen isolierten rekombinanten Expressionsvektor bereit, der eine für ein Stressprotein kodierende Nukleinsäure wie oben beschrieben enthält, wobei die Expression des Vektors bzw. der für das Stressprotein kodierenden Nukleinsäure in einer Wirtszelle zu einer erhöhten Toleranz und/oder Resistenz gegenüber Umweltstress verglichen mit dem entsprechenden nicht transformierten Wildtyp der Wirtszelle führt. So, wie er hier verwendet wird, bezieht sich der Ausdruck „Vektor” auf ein Nukleinsäuremolekül, das dazu in der Lage ist, eine andere Nukleinsäure, an die es gebunden ist, zu transportieren. Ein Typ von Vektor ist ein „Plasmid”, was sich auf eine zirkuläre doppelsträngige DNA-Schleife bezieht, in die zusätzliche DNA-Segmente ligiert werden können. Ein anderer Vektortyp ist ein viraler Vektor, bei dem zusätzliche DNA-Segmente in das virale Genom ligiert werden können. Weitere mögliche Typen von Vektoren sind linearisierte Nukleinsäuresequenzen wie Transposons, bei denen es sich um Teile von DNA handelt, die sich kopieren und insertieren können. Es wurden 2 Typen von Transposons gefunden: einfache Transposons, die als Insertionssequenzen bekannt sind, und zusammengesetzte Transposons, die mehrere Gene zusätzlich zu den für die Transposition erforderlichen Genen aufweisen können.
Bestimmte Vektoren sind zu einer autonomen Replikation in einer Wirtszelle, in die sie eingeführt wurden, fähig (z. B. bakterielle Vektoren mit einem bakteriellen Replikationsursprung und episomale Säugetiervektoren). Andere Vektoren (z. B. nicht-episomale Säugetiervektoren) werden bei der Einführung in eine Wirtszelle in das Genom der Wirtszelle integriert und werden somit zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert. Außerdem sind bestimmte Vektoren dazu fähig, die Expression von Genen, mit denen sie operativ verbunden sind, zu steuern. Solche Vektoren werden hier als „Expressionsvektoren” bezeichnet. Im Allgemeinen liegen Expressionsvektoren, die bei rekombinanten DNA-Techniken von Nutzen sind, häufig in Form von Plasmiden vor. In der vorliegenden Beschreibung können „Plasmid” und „Vektor” austauschbar verwendet werden, da es sich bei dem Plasmid um die am häufigsten verwendete Form von Vektor handelt. Die Erfindung soll jedoch auch solche anderen Formen von Expressionsvektoren wie virale Vektoren (z. B. replikationsdefektive Retroviren, Adenoviren und adenoassoziierte Viren) einschließen, die äquivalente Funktionen erfüllen.
Eine Pflanzen-Expressionskassette enthält vorzugsweise regulatorische Sequenzen, die dazu in der Lage sind, die Genexpression in Pflanzenzellen zu steuern und die operativ gebunden sind, so dass jede Sequenz ihre Funktion erfüllen kann, zum Beispiel die Terminierung der Transkription durch Polyadenylierungssignale. Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind die, die aus Agrobacterium tumefaciens-t-DNA stammen, wie das als Octopinsynthase bekannte Gen 3 des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., 1984 EMBO J. 3:835) oder funktionelle Äquivalente davon, es eignen sich jedoch auch alle anderen Terminatoren, die in Pflanzen funktionell aktiv sind.
Da die Pflanzengenexpression sehr häufig nicht auf die transkriptionellen Ebenen beschränkt ist, enthält eine Pflanzenexpressionskassette vorzugsweise andere operativ gebundene Sequenzen wie Translations-Enhancer wie z. B. die Overdrive-Sequenz, die die 5'-untranslatierte Leitsequenz aus dem Tabakmosaikvirus enthält und das Protein:RNA-Verhältnis verbessert (Gallie et al., 1987 Nucl. Acids Research 15: 8693–8711).
Die Pflanzengenexpression muss operativ mit einem geeigneten Promotor verbunden sein, der für die Genexpression in einer zeit-, zell oder gewebespezifischen Weise verantwortlich ist. Bevorzugt sind Promotoren, die für eine konstitutive Expression (Benfey et al., 1989 EMBO J. 8: 2195–2202) sorgen, wie die, die sich von Pflanzenviren wie 35S CaMV (Franck et al., 1980 Cell 21: 285–294) oder 19S CaMV (siehe auch US-Patentschrift Nr. 5352605 und PCT-Anmeldung Nr. WO 8402913 ) ableiten, oder Pflanzenpromotoren wie die aus der kleinen Untereinheit von Rubisco, beschrieben in der US-Patentschrift Nr. 4,962,028 .
Zusätzliche vorteilhafte regulatorische Sequenzen befinden sich zum Beispiel in Pflanzenpromotoren wie CaMV/35S [Franck et al., Cell 21 (1980) 285–294], PRP1 [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993)], SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, LEB4, nos oder im Ubiquitin-, Napin- oder Phaseolin-Promotor. Ebenfalls vorteilhaft in diesem Zusammenhang sind induzierbare Promotoren wie die in EP-A-0388 186 (benzylsulfonamidinduzierbar), Plant J. 2, 1992: 397–404 (Gatz et al., tetracyclininduzierbar), EP-A-0 335 528 (abszisinsäureinduzierbar) oder WO 93/21334 (ethanol- oder cyclohexenolinduzierbar) beschriebenen Promotoren. Weitere brauchbare Pflanzenpromotoren sind der zytoplasmatische FBPase-Promotor oder der ST-LSI-Promotor der Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8, 1989, 2445), der Phosphoribosylpyrophosphatamidotransferase-Promotor von Glycine max (Genbank Zugangs-Nr. U87999) oder der in EP-A-0 249 676 beschriebene knotenspezifische Promotor. Weitere besonders vorteilhafte Promotoren sind samenspezifische Promotoren, die für Monokotyledone oder Dikotyledone verwendet werden können und in US 5,608,152 (Napin-Promotor aus Raps), WO 98/45461 (Phaseolin-Promotor aus Arabidopsis), US 5,504,200 (Phaseolin-Promotor aus Phaseolus vulgaris), WO 91/13980 (Bce4-Promotor aus Brassica) und Baeumlein et al., Plant J., 2, 2, 1992: 233–239 (LEB4-Promotor aus Leguminosen) beschrieben sind. Diese Promotoren eignen sich für dikotyledone Pflanzen. Die folgenden Promotoren eignen sich zum Beispiel für Monokotyledone: der Ipt-2- oder Ipt-1-Promotor aus Gerste (WO 95/15389 und WO 95/23230 ) oder der Hordein-Promotor aus Gerste. Andere brauchbare Promotoren sind in WO 99/16890 beschrieben.
Im Prinzip können alle natürlichen Promotoren mit ihren regulatorischen Sequenzen wie die obenerwähnten für das neue Verfahren verwendet werden. Es ist außerdem möglich und vorteilhaft, zusätzlich synthetische Promotoren einzusetzen.
Das Genkonstrukt kann auch weitere Gene umfassen, die in die Organismen zu insertieren sind und die zum Beispiel an der Toleranz gegenüber Stress und der Erhöhung des Ertrags beteiligt sind. Es ist möglich und vorteilhaft, regulatorische Gene wie Gene für Induktoren, Repressoren oder Enzyme, die durch ihrer enzymatische Aktivität in die Regulation eingreifen, oder eines oder mehrere oder alle Gene eines Biosynthesepfades in Wirtsorganismen zu insertieren und exprimieren. Diese Gene können vom Ursprung her heterolog oder homolog sein. Die insertierten Gene können ihren eigenen Promotor haben oder sich ansonsten unter der Kontrolle des gleichen Promotors wie die Sequenzen der Nukleinsäure von Tabelle I oder ihrer Homologe befinden.
Das Genkonstrukt umfasst vorteilhafterweise, für die Expression der anderen vorhandenen Gene, zusätzliche 3'- und/oder 5'-terminale regulatorische Sequenzen zur Steigerung der Expression, die je nach ausgewähltem Wirtsorganismus und Gen oder ausgewählten Genen für eine optimale Expression ausgewählt sind.
Diese regulatorischen Sequenzen sollen wie oben erwähnt eine spezifische Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann je nach Wirtsorganismus zum Beispiel bedeuten, dass das Gen erst nach einer Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.
Die regulatorischen Sequenzen oder Faktoren können außerdem vorzugsweise eine vorteilhafte Wirkung auf die Expression der eingeführten Gene haben und sie somit erhöhen. Es ist auf diese Weise möglich, die regulatorischen Elemente vorteilhaft auf der Ebene der Transkription zu verstärken, indem man starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder Enhancer einsetzt. Zusätzlich ist es auch möglich, die Translation zu verstärken, indem man zum Beispiel die Stabilität der mRNA verbessert.
Andere bevorzugte Sequenzen für eine Verwendung in Pflanzengenexpressionskassetten sind Erkennungssequenzen, die benötigt werden, um das Genprodukt in sein entsprechendes Zellkompartiment (ein Übersichtsartikel findet sich bei Kermode, 1996 Crit. Rev. Plant Sci. 15(4): 285–423 und den darin angeführten Literaturstellen) wie die Vakuole, den Kern, alle Typen von Plastiden wie Amyloplaste, Chloroplaste, Chromoplaste, den extrazellulären Raum, Mitochondrien, das endoplasmatische Retikulum, Ölkörperchen, Peroxisome und andere Kompartimente von Pflanzenzellen zu lenken.
Die Pflanzengenexpression kann auch durch einen induzierbaren Promotor (ein Übersichtsartikel findet sich bei Gatz, 1997 Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 89–108) begünstigt werden. Chemisch induzierbare Promotoren sind dann insbesondere geeignet, wenn die Genexpression auf eine zeitspezifische Weise erfolgen soll.

In Tabelle VI sind mehrere Beispiele für Promotoren aufgeführt, die zur Regulation der Transkription der kodierenden Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Tab. VI: Beispiele für gewebespezifische und induzierbare Promotoren in Pflanzen

Expression	Literaturstelle
Cor78- kälte-, dürre-, salz-, ABA-, wundinduzierbar	Ishitani, et al., Plant Cell 9: 1935–1949 (1997). Yamaguchi-Shinozaki und Shinozaki, Plant Cell 6: 251–264 (1994).
Rci2A – kälte-, dehydratationsinduzierbar	Capel et al., Plant Physiol 115: 569–576 (1997)
Rd22 – Dürre, Salz	Yamaguchi-Shinozaki und Shinozaki, Mol Gen Genet 238: 17–25 (1993).
Cor15A – Kälte, Dehydratation, ABA	Baker et al., Plant Mol. Biol. 24: 701–713 (1994).
GH3- auxininduzierbar	Liu et al., Plant Cell 6: 645–657 (1994)
ARSK1-Wurzel, salzinduzierbar	Hwang und Goodman, Plant J 8: 37–43 (1995).
PtxA – Wurzel, salzinduzierbar	GenBank Zugangsnr. X67427
SbHRGP3 – wurzelspezifisch	Ahn et al., Plant Cell 8: 1477–1490 (1998).
KST1 – wächterzellenspezifisch	Plesch et al., Plant Journal. 28(4): 455–64, (2001)
KATZ – wächterzellenspezifisch	Plesch et al., Gene 249: 83–89 (2000) Nakamura et al., Plant Physiol. 109: 371–374 (1995)
salicylsäureinduzierbar	PCT-Anmeldung Nr. WO 95/19443
tetracyclininduzierbar	Gatz et al. Plant J. 2: 397–404 (1992)
ethanolinduzierbar	PCT-Anmeldung Nr. WO 93/21334
pathogeninduzierbar PRP1	Ward et al., 1993 Plant. Mol. Biol. 22: 361–366
hitzeinduzierbar hsp80	US-Patentschrift Nr. 5187267
kälteinduzierbar alpha-Amylase	PCT-Anmeldung Nr. WO 96/12814
wundinduzierbar pinll	europäische Patentschrift Nr. 375091
RD29A – salzinduzierbar	Yamaguchi-Shinozalei et al. (1993) Mol. Gen. Genet. 236: 331–340
plastidspezifische virale RNA-Polymerase	PCT-Anmeldung Nr. WO 95/16783 und WO 97/06250

Andere Promotoren, z. B. der Superpromotor (Ni et al,., Plant Journal 7, 1995: 661–676), der Ubiquitin-Promotor (Kallis et al., J. Biol. Chem., 1990, 265: 12486–12493; US 5,510,474 ; US 6,020,190 ; Kawalleck et al., Plant. Molecular Biology, 1993, 21: 673–684) oder der 34S-Promotor (GenBank Zugangsnummern M59930 und X16673) haben sich in ähnlicher Weise als brauchbar für die vorliegende Erfindung erwiesen und sind dem Fachmann bekannt.
Promotoren mit Entwicklungsstadiumpräferenz werden vorzugsweise in bestimmten Entwicklungsstadien exprimiert. Promotoren mit Präferenz für Gewebe und Organe schließen die ein, die vorzugsweise in bestimmten Geweben oder Organen wie Blättern, Wurzeln, Samen oder Xylem exprimiert werden. Beispiele für Promotoren mit Präferenz für Gewebe und Organe schließen, wobei diese Aufzählung nicht einschränkend ist, Promotoren mit Präferenz für Früchte, Promotoren mit Präferenz für das Ovolum, Promotoren mit Präferenz für männliche Gewebe, Promotoren mit Präferenz für Samen, Promotoren mit Präferenz für das Integument, Promotoren mit Präferenz für die Knolle, Promotoren mit Präferenz für den Stängel, Promotoren mit Präferenz für das Pericarp und Promotoren mit Präferenz für das Blatt, Promotoren mit Präferenz für die Stigmata, Promotoren mit Präferenz für die Pollen, Promotoren mit Präferenz für die Antheren, Promotoren mit Präferenz für die Petalen, Promotoren mit Präferenz für die Sepalen, Promotoren mit Präferenz für die Blütenstiele, Promotoren mit Präferenz für die Schoten, Promotoren mit Präferenz für die Stiele, Promotoren mit Präferenz für die Wurzeln und dergleichen ein. Promotoren mit Präferenz für die Samen werden vorzugsweise während der Samenentwicklung und/oder -keimung exprimiert. Promotoren mit Präferenz für die Samen können zum Beispiel Promotoren mit Präferenz für die Embryonen, für das Endosperm und für die Samenhülle sein, siehe Thompson et al., 1989, BioEssays 10:108. Zu Beispielen für Promotoren mit Präferenz für die Samen zählen, jedoch ohne Einschränkung, Cellulosesynthase (celA), Cim1, gamma-Zein, Globulin-1, Mais 19 kD-Zein (cZ19B1), und dergleichen.
Andere für die Expressionskassetten der Erfindung brauchbare Promotoren schließen, wobei diese Aufzählung nicht einschränkend ist, den Promotor des Major Chlorophyll a/b Binding Proteins, den Histon-Promotor, den Ap3-Promotor, den β-Conglycin-Promotor, den Napin-Promotor, den Lectin-Promotor aus der Sojabohne, den 15kD-Zein-Promotor aus Mais, den 22kD-Zein-Promotor, den 27kD-Zein-Promotor, den g-Zein-Promotor, die Waxy-, Shrunken-1-, Shrunken-2- und Bronze-Promotor, den Zm13-Promotor ( US-Patentschrift Nr. 5,086,169 ), den Polygalacturonase-Promotor (PG) aus Mais ( US-Patent Nr. 5,412,085 und 5,545,546 ), und den SGB6-Promotor ( US-Patent Nr. 5,470,359 ), sowie synthetische oder andere natürliche Promotoren ein.
Eine zusätzliche Flexibilität bei der Steuerung der heterologen Genexpression in Pflanzen lässt sich durch die Verwendung von DNA-bindenden Domänen und Reaktionselementen aus heterologen Quellen (d. h. DNA-Bindungsdomänen aus nicht pflanzlichen Quellen) erzielen. Ein Beispiel für eine solche heterologe DNA-Bindungsdomäne ist die LexA-DNA-Bindungsdomäne (Brent und Ptashne, 1985, Cell 43: 729–736).
Die Erfindung stellt weiterhin einen rekombinanten Expressionsvektor bereit, der ein YSRP-DNA-Molekül der Erfindung umfasst, das in einer Antisense-Orientierung in den Expressionsvektor kloniert ist. Das heißt, das DNA-Molekül ist operativ mit einer regulatorischen Sequenz auf eine Weise verbunden, die die Expression (durch Transkription des DNA-Moleküls) eines RNA-Moleküls, das antisense zu einer YSRP-mRNA ist, erlaubt. Es können regulatorische Sequenzen ausgewählt werden, die operativ an ein Nukleinsäuremolekül gebunden sind, das in der Antisense-Orientierung kloniert wurde, und die die kontinuierliche Expression des Antisense-RNA-Moleküls in verschiedenen Zelltypen steuern. So können zum Beispiel virale Promotoren und/oder Enhancer, oder regulatorische Sequenzen ausgewählt werden, die die konstitutive, gewebespezifische oder zelltypspezifische Expression von Antisense-RNA steuern. Der Antisense-Expressionsvektor kann in Form eines rekombinanten Plasmids, Phagemids oder eines attenuierten Virus vorliegen, in welchem Antisense-Nukleinsäuren unter der Kontrolle einer hocheffizienten regulatorischen Region produziert werden. Die Aktivität der regulatorischen Region lässt sich mit dem Zelltyp bestimmen, in den der Vektor eingeführt wird. Eine Diskussion der Steuerung der Genexpression mit Antisense-Genen findet sich bei Weintraub, H. et al., 1986, Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews – Trends in Genetics, Band 1(1), und Mol et al., 1990, FERS Letters 268: 427–430.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft isolierte YSRPs und biologisch aktive Teile davon. Ein „isoliertes” oder „aufgereinigtes” Polypeptid oder ein biologisch aktiver Teil davon ist frei von einigem des zellulären Materials, wenn die Produktion durch rekombinante DNA-Techniken erfolgte, oder chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien, wenn es chemisch synthetisiert wurde. Der Begriff „im Wesentlichen frei von zellulärem Material” schließt Präparate von YSRP ein, bei denen das Polypeptid von einigen der zellulären Komponenten der Zelle, in denen es natürlich oder rekombinant produziert wird, abgetrennt ist. Gemäß einer Ausführungsform schließt der Begriff „im Wesentlichen frei von zellulärem Material” Zubereitungen von YSRP mit weniger als etwa 30% (Trockengewicht) an Nicht-YSRP-Material (hier auch als ein „kontaminierendes Polypeptid” bezeichnet), besonders bevorzugt weniger als etwa 20% an Nicht-YSRP-Material, weiter besonders bevorzugt weniger als etwa 10% an Nicht-YSRP-Material, und ganz besonders bevorzugt weniger als etwa 5% an Nicht-YSRP-Material, ein.
Wird das YSRP oder der biologisch aktive Teil davon rekombinant produziert, so ist es ebenfalls vorzugsweise im Wesentlichen frei von Kulturmedium, d. h. das Kulturmedium macht weniger als etwa 20%, besonders bevorzugt weniger als etwa 10%, und ganz besonders bevorzugt weniger als etwa 5% des Volumens der Polypeptidzubereitung aus. Der Begriff „im Wesentlichen frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien” schließt Zubereitungen eines YSRP ein, in denen das Polypeptid von chemischen Vorstufen oder anderen an der Synthese des Polypeptids beteiligten Chemikalien abgetrennt ist. Gemäß einer Ausführungsform schließt der Begriff „im Wesentlichen frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien” Zubereitungen eines YSRP mit weniger als etwa 30% (Trockengewicht) an chemischen Vorstufen oder Nicht-YSRP-Chemikalien, besonders bevorzugt weniger als etwa 20% an chemischen Vorstufen oder Nicht-YSRP-Chemikalien, weiter besonders bevorzugt weniger als etwa 10% an chemischen Vorstufen oder Nicht-YSRP-Chemikalien, und ganz besonders bevorzugt weniger als etwa 5% an chemischen Vorstufen oder Nicht-YSRP-Chemikalien ein. Bei bevorzugten Ausführungsformen sind in den isolierten Polypeptiden oder biologisch aktiven Teilen davon keine kontaminierenden Polypeptide aus dem gleichen Organismus, aus dem das YSRP abgeleitet ist, vorhanden. Typischerweise werden solche Polypeptide durch rekombinante Expression von zum Beispiel einem S. cerevisiae-, E. coli- oder Brassica napus-, Glycine max-, Zea mays- oder Oryza sativa-YSRP in Pflanzen, bei denen es sich nicht um Saccharomyces cerevisiae, E. coli handelt, oder Mikroorganismen wie C. glutamicum, Wimperntierchen, Algen oder Pilzen produziert.
Die hier beschriebenen Nukleinsäuremoleküle, Polypeptide, Polypeptidhomologe, Fusionspolypeptide, Primer, Vektoren und Wirtszellen können bei einer oder mehreren der folgenden Methoden zur Anwendung kommen: Identifizierung von S. cerevisiae, E. coli oder Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa und verwandten Organismen; Kartierung von Genomen von mit S. cerevisiae, E. coli verwandten Organismen; Identifizierung und Lokalisierung von interessierenden S. cerevisiae-, E. coli- oder Brassica napus-, Glycine max-, Zea mays- oder Oryza sativa-Sequenzen; Evolutionsstudien; Bestimmung der für die Funktion erforderlichen YSRP-Regionen; Modulation einer YSRP-Aktivität; Modulation des Metabolismus einer oder mehrerer Zellfunktionen; Modulation des transmembranen Transports einer oder mehrerer Verbindungen; Modulation der Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress und/oder des Ertrags; und Modulation der Expression von YSRP-Nukleinsäuren.
Die YSRP-Nukleinsäuremoleküle der Erfindung eignen sich auch für Evolutionsstudien und Polypeptidstrukturuntersuchungen. Die metabolischen Vorgänge und Transportprozesse, bei denen die Moleküle der Erfindung eine Rolle spielen, werden von einer Vielzahl verschiedener prokaryontischer und eukaryontischer Zellen genutzt; durch einen Vergleich der Sequenzen der Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung mit denen, die für ähnliche Enzyme aus anderen Organismen kodieren, kann man die evolutionären Verwandtschaftsbeziehungen der Organismen bewerten. In ähnlicher Weise erlaubt ein solcher Vergleich eine Abschätzung davon, welche Regionen der Sequenz konserviert sind und welche nicht, was dabei helfen kann, die Regionen des Polypeptids zu bestimmen, die für die Funktion des Enzyms wesentlich sind. Diese Art von Bestimmung ist bei Polypeptidentwicklungsstudien von Nutzen und kann darauf hindeuten, was das Polypeptid hinsichtlich einer Mutagenese tolerieren kann, ohne die Funktionsfähigkeit zu verlieren.
Eine Manipulation der YSRP-Nukleinsäuremoleküle der Erfindung kann zur Folge haben, dass YSRPs produziert werden, die sich in ihrer Funktion von den YSRPs des Wildtyps unterscheiden. Diese Polypeptide können eine verbesserte Effizienz oder Aktivität aufweisen, in einer größeren Anzahl als gewöhnlich in der Zelle vorhanden sein oder eine verminderte Effizienz oder Aktivität aufweisen.
Es gibt eine Reihe von Mechanismen, durch die eine Abänderung eines YSRP der Erfindung einen direkten Einfluss auf die Stressreaktion und/oder Stresstoleranz haben kann. Exprimieren die Pflanzen YSRPs, so kann ein erhöhter Transport eine bessere Verteilung von Salz und/oder gelöstem Stoff im Pflanzengewebe und in den Pflanzenorganen zur Folge haben. Indem man entweder die Anzahl oder die Aktivität von Transportermolekülen, die ionische Moleküle aus der Zelle exportieren, erhöht, kann es möglich sein, die Salz- und Kältetoleranz der Zelle zu modulieren.
Die Auswirkung der genetischen Modifikation in Pflanzen auf Stresstoleranz lässt sich abschätzen, indem man die modifizierte Pflanze unter weniger als geeigneten Bedingungen heranzieht und dann die Wachstumscharakteristika und/oder den Metabolismus der Pflanze analysiert. Solche Analysetechniken sind dem Fachmann gut bekannt und schließen Trockengewicht, Frischgewicht, Polypeptidsynthese, Kohlenhydratsynthese, Lipidsynthese, Evapotranspirationsraten, allgemeine Erträge an Pflanze und/oder Erntegut, Blühleistung, Reproduktion, Samenansatz, Wurzelwachstum, Respirationsraten, Photosyntheseraten usw. ein (Applications of HPLC in Biochemistry in: Laborstory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Band 17; Rehm et al., 1993 Biotechnology, Band 3, Kapitel III: Product recovery and purification, Seite 469–714, VCH: Weinheim; Belter P. A. et al., 1988, Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy J. F., und Cabral J. M. S., 1992, Recovery processes for biological materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz J. A. und Henry J. D., 1988, Biochemical separations, in Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Band B3, Kapitel 11, Seite 1–27, VCH: Weinheim; und Dechow F. J., 1989, Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).
So kann man zum Beispiel Hefe-Expressionsvektoren, die die hier offenbarten Nukleinsäuren oder Fragmente davon umfassen, unter Anwendung von Standardprotokollen konstruieren und in Saccharomyces cerevisiae transformieren. Die erhaltenen transgenen Zellen können dann auf Ausfall oder Veränderung ihrer Toleranz gegenüber Dürre-, Salz- und Kältestress untersucht werden. In ähnlicher Weise können Pflanzen-Expressionsvektoren, die die hier offenbarten Nukleinsäuren oder Fragmente davon umfassen, unter Anwendung von Standardprotokollen konstruiert und in eine geeignete Pflanzenzelle wie Arabidopsis, Soja, Raps, Mais, Baumwolle, Reis, Weizen, Medicago truncatula usw. transformiert werden. Die erhaltenen transgenen Zellen und/oder daraus abgeleiteten Pflanzen können dann auf Ausfall oder Veränderung ihrer Toleranz gegenüber Dürre-, Salz- und Kältestress untersucht werden.
Die Entwicklung eines oder mehrerer Gene gemäß Tabelle I, die für das YSRP von Tabelle II der Erfindung kodieren, kann auch zu YSRPs mit abgeänderten Aktivitäten führen, was eine indirekte und/oder direkte Auswirkung auf die Stressreaktion und/oder Stresstoleranz von Algen, Pflanzen, Wimperntierchen oder Pilzen oder anderen Mikroorganismen wie C. glutamicum hat.
Darüber hinaus kann man mit den hier offenbarten Sequenzen oder Fragmenten davon Knockout-Mutationen in den Genomen verschiedener Organismen wie Bakterien, Säugetierzellen, Hefezellen und Pflanzenzellen produzieren (Girke, T., 1998, The Plant Journal 15: 39–48). Die erhaltenen Knockout-Zellen können dann auf ihre Fähigkeit bzw. Kapazität zur Tolerierung von Stressbedingungen, ihre Reaktion auf verschiedene Stressbedingungen und die Auswirkung auf den Phänotyp und/oder Genotyp der Mutation untersucht werden. Zu anderen Methoden der Gendesaktivierung siehe die US-Patentschrift Nr. 6,004,804 „Non-Chimeric Mutational Vectors” und Puttaraju et al., 1999, Spliceosome-mediated RNA trans-splicing as a tool for gene therapy, Nature Biotechnology 17: 246–252.
Die obenerwähnten Mutagenesestrategien für YSRPs, die zu einer erhöhten Stressresistenz führen, sollen nicht einschränkend sein; Variationen dieser Strategien werden für den Fachmann offensichtlich sein. Durch Anwendung solcher Strategien und unter Einbau der hier offenbarten Mechanismen können die Nukleinsäure- und Polypeptidmoleküle der Erfindung eingesetzt werden, um Algen, Wimperntierchen, Pflanzen, Pilze oder andere Mikroorganismen wie C. glutamicum, die mutierte YSRP-Nukleinsäure- und Polypeptidmoleküle exprimieren, zu erzeugen, so dass die Stresstoleranz verbessert wird.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem Antikörper bereit, die spezifisch an ein durch eine hier beschriebene Nukleinsäure kodiertes YSRP oder einen Teil davon binden. Antikörper lassen sich nach vielen gut bekannten Methoden herstellen (siehe z. B. Harlow und Lane, „Antibodies; A Laborstory Manual," Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor, New York, (1988)). Kurz gesagt kann aufgereinigtes Antigen einem Tier in einer Menge und in zeitlichen Abständen, die ausreichen, um eine Immunreaktion auszulösen, injiziert werden. Antikörper können entweder direkt aufgereinigt werden, oder man kann aus dem Tier Milzzellen gewinnen. Die Zellen können dann mit einer unsterblichen Zelllinie fusioniert und auf Antikörpersekretion gescreent werden. Mit den Antikörpern kann man Bibliotheken von Nukleinsäureklonen auf das Antigen sezernierende Zellen screenen. Diese positiven Klone können dann sequenziert werden. Siehe zum Beispiel Kelly et al., 1992, Bio/Technology 10: 163–167; Bebbington et al., 1992, Bio/Technology 10: 169–175.
Die Begriffe „selektiv binden” und „spezifisch binden” beziehen sich beim Polypeptid auf eine Bindungsreaktion, die in Gegenwart des Polypeptid in einer heterogenen Population von Polypeptiden und anderen Biologika determinativ ist. Somit binden unter festgelegten Immunoassaybedingungen die spezifizierten, an ein bestimmtes Polypeptid gebundenen Antikörper nicht in signifikanter Menge an andere in der Probe vorhandene Polypeptide. Für eine selektive Bindung eines Antikörpers unter solchen Bedingungen kann ein Antikörper erforderlich sein, der auf Basis seiner Spezifität für ein bestimmtes Polypeptid ausgewählt wurde. Für die Auswahl von selektiv an ein bestimmtes Polypeptid bindenden Antikörpern stehen verschiedene Immunoassayformate zur Verfügung. So werden zum Beispiel Festphasen-ELISA-Immunoassays routinemäßig zur Selektion von mit einem Polypeptid selektiv immunoreaktiven Antikörpern eingesetzt. Siehe Harlow und Lane, „Antibodies, A Laborstory Manual,” Cold Spring Harbor Publications, New York, (1988) für eine Beschreibung von Immunoassayformaten und Bedingungen, die angewendet werden können, um eine selektive Bindung zu bestimmen.
In einigen Fällen ist es wünschenswert, monoklonale Antikörper aus verschiedenen Wirten herzustellen. Eine Beschreibung von Techniken zur Herstellung solcher monoklonalen Antiköper findet sich in Stites et al., Hrsg. „Basic and Clinical Immunology,” (Lange Medical Publications, Los Altos, Kalif., 4. Auflage) und den darin angeführten Literaturstellen, und in Harlow und Lane, „Antibodies, A Laborstory Manual,” Cold Spring Harbor Publications, New York (1988).
Die Genexpression in Pflanzen wird reguliert durch die Wechselwirkung von Proteintranskriptionsfaktoren mit spezifischen Nukleotidsequenzen innerhalb der regulatorischen Region eines Gens. Ein Beispiel für Transkriptionsfaktoren sind Polypeptide, die Zinkfingermotive (ZF-Motive) enthalten. Jedes ZF-Modul ist ungefähr 30 Aminosäuren lang und um ein Zinkion herum gefaltet. Die DNA-Erkennungsdomäne eines ZF-Proteins ist eine α-helikale Struktur, die sich in die große Furche der DNA-Doppelhelix einschiebt. Das Modul enthält drei Aminosäuren, die an die DNA binden, wobei jede Aminosäure mit einem einzelnen Basenpaar in der Target-DNA-Sequenz in Kontakt steht. ZF-Motive sind in einer modular wiederholten Weise unter Ausbildung eines Satzes von Fingern, die eine benachbarte DNA-Sequenz erkennen, angeordnet. So erkennt zum Beispiel ein dreifingriges ZF-Motiv 9 Bp an DNA. Es wurde gezeigt, dass Hunderte von Proteinen ZF-Motive enthalten, mit zwischen 2 und 37 ZF-Modulen in jedem Protein (Isalan M, et al., 1998 Biochemistry 37(35): 12026–33; Moore M, et al., 2001 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98(4): 1432–1436 und 1437–1441; US-Patentschriften US 6007988 und US 6013453 ).
Die regulatorische Region eines Pflanzengens enthält viele kurze DNA-Sequenzen (cis-acting elements), die als Erkennungsdomänen für Transkriptionsfaktoren einschließlich ZF-Proteinen dienen. Ähnliche Erkennungsdomänen in verschiedenen Genen ermöglichen die koordinierte Expression mehrerer für Enzyme in einem metabolischen Pfad kodierender Gene durch gemeinsame Transkriptionsfaktoren. Durch Variationen bei den Erkennungsdomänen zwischen Mitgliedern einer Genfamilie kommt es zu Unterschieden bei der Genexpression in der gleichen Genfamilie, zum Beispiel zwischen Geweben und Entwicklungsstadien und als Reaktion auf Umwelteinflüsse.
Typische ZF-Proteine enthalten nicht nur eine DNA-Erkennungsdomäne, sondern auch eine funktionelle Domäne, die es dem ZF-Protein ermöglicht, die Transkription eines spezifischen Gens zu aktivieren oder zu unterdrücken. Experimentell wurde mit einer Aktivierungsdomäne die Transkription des Target-Gens aktiviert ( US-Patentschrift 5,789,538 und Patentanmeldung WO95/19431 ), es ist jedoch auch möglich, eine Transkriptionsrepressordomäne an den ZF anzubinden und somit die Transkription zu inhibieren (Patentanmeldungen WO00/47754 und WO01/002019 ). Es wurde beschrieben, dass eine enzymatische Funktion wie Nukleinsäurespaltung an den ZF gebunden werden kann (Patentanmeldung WO00/20622 ).
Die Erfindung stellt eine Methode bereit, die es dem Fachmann ermöglicht, die regulatorische Region eines oder mehrerer für das Stressprotein kodierender Gene aus dem Genom einer Pflanzenzelle zu isolieren und an eine funktionelle Domäne, die mit der regulatorischen Region des Gens in Wechselwirkung tritt, gebundene Zinkfinger-Transkriptionfaktoren zu entwickeln. Die Wechselwirkung des Zinkfingerproteins mit dem Pflanzengen kann so zugeschnitten sein, dass die Expression des Gens abgeändert ist, wodurch vorzugsweise ein erhöhter Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verliehen wird.
Die Erfindung stellt insbesondere eine Methode zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit einer für ein Stressprotein kodierenden Nukleinsäure bereit, wobei die Expression der Nukleinsäure(n) in der Pflanze zu einer erhöhten Toleranz gegenüber Umweltstress verglichen mit einer Pflanze vom Wildtyp führt, bei dem man:
(a) eine Pflanzenzelle mit einem Expressionsvektor, der eine für ein Stressprotein kodierende Nukleinsäure umfasst, transformiert, und (b) aus der Pflanzenzelle eine transgene Pflanze mit einer erhöhten Toleranz gegenüber Umweltstress verglichen mit einer Pflanze vom Wildtyp erzeugt. Für eine solche Pflanzentransformation kann man sich binärer Vektoren wie pBinAR bedienen (Höfgen und Willmitzer, 1990 Plant Science 66: 221–230). Geeignete binäre Vektoren sind außerdem zum Beispiel pBIN19, pBI101, pGPTV oder pPZP (Hajukiewicz, P. et al., 1994, Plant Mol. Biol., 25: 989–994).
Die Konstruktion der binären Vektoren kann durch Ligation der cDNA in die t-DNA erfolgen. 5' zur cDNA aktiviert ein Pflanzenpromotor die Transkription der cDNA. Eine Polyadenylierungssequenz befindet sich 3' zur cDNA. Eine gewebespezifische Expression kann durch Einsatz eines wie oben angeführten gewebespezifischen Promotors erreicht werden. Darüber hinaus kann man auch alle anderen Promotorelemente verwenden. Für eine konstitutive Expression in der gesamten Pflanze kann man sich des CaMV 35S-Promotors bedienen. Das exprimierte Protein kann mit einem Signalpeptid gezielt in einem zellulären Kompartiment exprimiert werden, zum Beispiel in Plastiden, Mitochondrien oder dem endoplasmatischen Retikulum (Kermode, 1996 Crit. Rev. Plant Sci. 4(15): 285–423). Das Signalpeptid wird 5' im Leserahmen in die cDNA kloniert, um eine subzelluläre Lokalisierung des Fusionsproteins zu erreichen. Zusätzlich kann man auf abiotischen Stress reagierende Promotoren wie den Arabidopsis-Promotor RD29A verwenden. Dem Fachmann wird bewusst sein, dass der verwendete Promotor operativ an die Nukleinsäure gebunden sein sollte, so dass der Promotor die Transkription der Nukleinsäure bewirkt, was die Synthese einer mRNA zur Folge hat, die für ein Polypeptid kodiert.
Alternative Methoden zur Transfektion schließen den direkten Transfer von DNA in sich entwickelnde Blumen mittels Elektroporation oder durch Agrobacterium vermittelten Gentransfer ein. Die durch Agrobacterium vermittelte Pflanzentransformation kann zum Beispiel unter Verwendung des GV3101(pMP90)(Koncz und Schell, 1986 Mol. Gen. Genet. 204: 383–396) oder LBA4404-(Doms et al., Plasmid, 1982, 7: 15–29; Hoekema et al., Nature, 1983, 303: 179–180) Stamms von Agrobacterium tumefaciens durchgeführt werden. Die Transformation kann gemäß Standardtransformations- und -regenerationstechniken erfolgen (Deblaere et al., 1994 Nucl. Acids. Res. 13: 4777–4788; Gelvin und Schilperoort, Plant Molecular Biology Manual, 2. Aufl. – Dordrecht Kluwer Academic Publ., 1995. – in Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, B R und Thompson, J E, Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993.–360 S., ISBN 0-8493-51642). Raps zum Beispiel kann durch Kotyledon- oder Hypokotyltransformation (Moloney et al., 1989 Plant Cell Reports 8: 238–242; De Block et al., 1989 Plant Physiol. 91: 694–701) transformiert werden. Die Verwendung von Antibiotika für Agrobacterium und Pflanzenselektion hängt von dem für die Transformation verwendeten binären Vektor und dem Agrobacterium-Stamm ab. Die Rapsselektion erfolgt normalerweise unter Einsatz von Kanamycin als selektierbarem Pflanzenmarker. Ein durch Agrobacterium vermittelter Gentransfer auf Flachs kann zum Beispiel unter Anwendung einer von Mlynarova et al., 1994 Plant Cell Report 13: 282–285 beschriebenen Technik durchgeführt werden. Darüber hinaus kann die Transformation von Sojabohne zum Beispiel unter Anwendung einer in der europäischen Patentschrift Nr. 0424 047 , US-Patentschrift Nr. 5,322,783 , europäischen Patentschrift Nr. 0397 687 , US-Patentschrift Nr. 5,376,543 oder US-Patentschrift Nr. 5,169,770 beschriebenen Technik durchgeführt werden. Die Transformation von Mais lässt sich durch Partikelbombardierung, polyethylenglykolvermittelte DNA-Aufnahme oder durch die Siliciumcarbidfasertechnik (siehe zum Beispiel Freeling und Walbot „The maize handbook" Springer Verlag: New York (1993) ISBN 3-540-97826-7) erreichen. Ein spezielles Beispiel einer Mais-Transformation findet sich in der US-Patentschrift Nr. 5,990,387 , und ein spezielles Beispiel einer Weizen-Transformation findet sich in der PCT-Anmeldung Nr. WO 93/07256 .
Durch Heranziehen der modifizierten Pflanzen unter Stressbedingungen und anschließendes Screening und Analysieren der Wachstumscharakteristika und/oder metabolischen Aktivität kann man die Wirkung der genetischen Modifikation in Pflanzen auf eine Erhöhung des Ertrags, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress untersuchen. Solche Analysetechniken sind dem Fachmann gut bekannt. Sie schließen neben Screening (Römpp Lexikon Biotechnologie, Stuttgart/New York: Georg Thieme Verlag 1992, „screening" S. 701) Trockengewicht, Frischgewicht, Proteinsynthese, Kohlenhydratsynthese, Lipidsynthese, Evapotranspirationsraten, allgemeine Erträge an Pflanze und/oder Erntegut, Blühleistung, Reproduktion, Samenansatz, Wurzelwachstum, Respirationsraten, Photosyntheseraten usw. ein (Applications of HPLC in Biochemistry in: Laborstory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Band 17; Rehm et al., 1993 Biotechnology, Band 3, Kapitel III: Product recovery and purification, Seite 469–714, VCH: Weinheim; Belter, P. A. et al., 1988 Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy J. F. und Cabral J. M. S., 1992 Recovery processes for biological materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz J. A. und Henry J. D., 1988 Biochemical separations, in: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Band B3, Kapitel 11, Seite 1–27, VCH: Weinheim; und Dechow F. J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).
Gemäß einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Methode zur Identifizierung eines Genprodukts, welches, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Zelle vom Wildtyp in einer Zelle eines Organismus, zum Beispiel einer Pflanze, einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verleiht, welches die folgenden Schritte umfasst:

a) In-Kontakt-Bringen, z. B. Hybridisieren, einiger oder aller Nukleinsäuremoleküle einer Probe, z. B. Zellen, Gewebe, Pflanzen oder Mikroorganismen oder einer Nukleinsäurebibliothek, welche ein Kandidatengen enthalten kann, das für ein Genprodukt kodiert, das einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedrigen Temperaturen und/oder eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein erhöhtes anderes erwähntes Ertragsmerkmal, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verleiht, mit einem wie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I A oder B gezeigten Nukleinsäuremolekül oder einem funktionellen Homolog davon;
b) Identifizieren der Nukleinsäuremoleküle, welche unter gelockerten stringenten Bedingungen mit dem Nukleinsäuremolekül hybridisieren, insbesondere an die Nukleinsäuremolekülsequenz, wie aufgeführt in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, und gegebenenfalls Isolieren des Volllängen-cDNA-Klons oder vollständigen genomischen Klons;
c) Identifizieren der Kandidaten-Nukleinsäuremoleküle oder eines Fragments davon in Wirtszellen, vorzugsweise in einer Pflanzenzelle;
d) Erhöhen der Expression der identifizierten Nukleinsäuremoleküle in den Wirtszellen, für die ein erhöhter Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedrigen Temperaturen und/oder eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein erhöhtes anderes erwähntes Ertragsmerkmal, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress gewünscht werden;
e) Untersuchung des Ausmaßes an erhöhtem Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedrigen Temperaturen und/oder eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein erhöhtes anderes erwähntes Ertragsmerkmal, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress bei den Wirtszellen; und
f) Identifizieren des Nukleinsäuremoleküls und seines Genprodukts, welches der Wirtszelle verglichen mit dem Wildtyp einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedrigen Temperaturen und/oder eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein erhöhtes anderes erwähntes Ertragsmerkmal, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verleiht.

Entspannte Hybridisierungsbedingungen sind wie folgt: nach den Standard-Hybridisierungsvorschriften können Waschschritte bei nieder- bis mittelstringenten Bedingungen gewöhnlich mit Waschbedingungen von 40°–55°C und Salzbedingungen zwischen 2 × SSC und 0,2 × SSC mit 0,1% SDS im Vergleich zu stringenten Waschbedingungen wie z. B. 60° bis 68°C mit 0,1% SDS durchgeführt werden. Weitere Beispiele können in den oben aufgeführten Bezugsstellen für die stringenten Hybridisierungsbedingungen gefunden werden. Gewöhnlich werden Waschschritte mit zunehmender Stringenz und Dauer wiederholt, bis man ein brauchbares Signal:Rausch-Verhältnis feststellt, und hängen von vielen Faktoren wie dem Target, z. B. dessen Reinheit, GC-Gehalt, Größe usw., der Sonde, z. B. deren Länge, ob es eine RNA- oder eine DNA-Sonde ist, den Salzbedingungen, der Wasch- oder Hybridisierungstemperatur, der Wasch- oder Hybridisierungsdauer usw. ab.
Gemäß einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Methode zur Identifizierung eines Genprodukts, dessen Expression einer Zelle einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedrigen Temperaturen und/oder eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein erhöhtes anderes erwähntes Ertragsmerkmal, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verleiht, welches die folgenden Schritte umfasst:

a) Identifizieren eines Nukleinsäuremoleküls in einem Organismus, das mindestens 20%, vorzugsweise 25%, stärker bevorzugt 30%, noch stärker bevorzugt 35%, 40% oder 50%, noch stärker bevorzugt 60%, 70% oder 80%, am stärksten bevorzugt 90% oder 95% oder mehr homolog ist zu dem Nukleinsäuremolekül, das für ein Protein kodiert, das das Polypeptidmolekül gemäß Spalte 5 oder 7 aus Tabelle II umfasst oder das eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv gemäß Spalte 7 von Tabelle IV umfasst oder das von einem Nukleinsäuremolekül umfassend ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle I kodiert wird, oder ein Homolog davon wie hierin beschrieben, zum Beispiel mittels Homologiesuche in einer Datenbank;
b) Steigern der Expression der identifizierten Nukleinsäuremoleküle in den Wirtszellen;
c) Untersuchungen des Ausmaßes eines erhöhten Ertrags, z. B. eines erhöhten Ertragsmerkmals, zum Beispiel einer gesteigerten Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Toleranz gegenüber Dürre und/oder niedrigen Temperaturen und/oder einer erhöhten Effizienz der Nährstoffausnutzung, eines erhöhten intrinsischen Ertrags und/oder eines anderen erhöhten Ertragsmerkmals, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress bei den Wirtszellen; und
d) Identifizieren der Wirtszelle, welcher die gesteigerte Expression in der Wirtszelle im Vergleich zu einem Wildtyp einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder niedrigen Temperaturen und/oder eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erhöhtes Ertragsmerkmal, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verleiht.

Ferner kann das hierin offenbarte Nukleinsäuremolekül, insbesondere das Nukleinsäuremolekül, gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle I A oder B, ausreichend homolog zu den Sequenzen aus verwandten Arten sein, sodass diese Nukleinsäuremoleküle als Marker für die Konstruktion einer genomischen Karte in verwandten Organismen oder für Assoziationskartierung dienen können. Weiterhin können natürliche Variationen in den genomischen Regionen, die den hier offenbarten Nukleinsäuren, insbesondere dem Nukleinsäuremolekül gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle I A oder B, oder Homologen davon entsprechen, zu Variationen bei der Aktivität der hier offenbarten Proteine führen, insbesondere den Proteinen, die Polypeptide gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle II A oder B umfassen oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv gemäß Spalte 7 von Tabelle IV umfassen, und ihren Homologen, und in Folge zu natürlichen Variationen bei der Toleranz und/oder Resistenz gegenüber Umweltstress und Biomasseproduktion führen.
Als Folge kommt es schließlich auch zu natürlichen Variationen in Form von stärker aktiven Allelvarianten, die bereits zu einer relativen Erhöhung bei der Toleranz und/oder Resistenz gegenüber Umweltstress und Biomasseproduktion führen. Verschiedene Varianten des hier offenbarten Nukleinsäuremoleküls, insbesondere der Nukleinsäure, die das Nukleinsäuremolekül gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle I A oder B umfasst, die verschiedenen Niveaus bezüglich einer unterschiedlichen Toleranz und/oder Resistenz gegenüber Umweltstress und Biomasseproduktion entsprechen, lassen sich identifizieren und für die markergestützte Züchtung auf einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder niedrigen Temperaturen und/oder eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erhöhtes Ertragsmerkmal, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, anwenden.
Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Züchtung von Pflanzen zur. Erhöhung des Ertrags, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, beim dem man

a) eine erste Pflanzensorte mit einem erhöhten Ertrag, z. B. einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel einer gesteigerten Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Toleranz gegenüber Dürre und/oder niedrigen Temperaturen und/oder einer erhöhten Effizienz der Nährstoffausnutzung, einem erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder einem anderen erhöhten Ertragsmerkmal, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress basierend auf einer erhöhten Expression einer wie hier offenbarten Nukleinsäure der Erfindung, insbesondere von einem Nukleinsäuremolekül, welches ein Nukleinsäuremolekül gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle I A oder B umfasst, oder einem Polypeptid, welches ein Polypeptid gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle II A oder B umfasst oder eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv gemäß Spalte 7 von Tabelle IV umfasst, oder einem Homolog davon wie hier beschrieben, auswählt;
b) das Ausmaß der Steigerung der Toleranz und/oder Resistenz gegenüber Umweltstress und der Biomasseproduktion mit dem Expressionsniveau oder der genomischen Struktur eines für dieses Polypeptid oder dieses Nukleinsäuremolekül kodierenden Gens assoziiert;
c) die erste Pflanzensorte mit einer zweiten Pflanzesorte kreuzt, die in dem Ausmaß der Steigerung ihrer Toleranz und/oder Resistenz gegenüber Umweltstress und der Biomasseproduktion signifikant verschieden ist; und
e) anhand des Expressionsniveaus des Polypeptids oder Nukleinsäuremoleküls oder der genomischen Struktur der Gene, die für dieses Polypeptid oder Nukleinsäuremolekül der Erfindung kodieren, feststellt, welche der Nachkommenschaftssorten ein erhöhtes Ausmaß an Toleranz und/oder Resistenz gegenüber Umweltstress und Biomasseproduktion hat.

Gemäß einer Ausführungsform ist das Expressionsniveau des Gens gemäß Schritt (b) erhöht.
Noch eine andere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder niedrigen Temperaturen und/oder eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erhöhtes Ertragsmerkmal, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teile davon in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon verleiht, welches die folgenden Schritte umfasst:

a) Kultivieren einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder eines Teils davon, wodurch man eine Pflanze erhält, die das Polypeptid gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle II kodiert, oder von einem Nukleinsäuremolekül umfassend ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle I oder ein Homolog davon wie hierin beschrieben oder ein Polynukleotid kodierend für dieses Polypeptid exprimiert und einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder niedrigen Temperaturen und/oder eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erhöhtes Ertragsmerkmal, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon verleiht, und Bereitstellen eines Ablesesystems, das dazu in der Lage ist, unter geeigneten Bedingungen, die eine Wechselwirkung des Polypeptids mit diesem Ablesesystem in Gegenwart einer chemischen Verbindung oder einer Probe, die eine Mehrzahl an chemischen Verbindungen enthält, erlauben, mit dem Polypeptid in Wechselwirkung zu treten und dazu in der Lage ist, ein nachweisbares Signal als Reaktion auf die Bindung einer chemischen Verbindung an das Polypeptid bereitzustellen, unter Bedingungen, die die Expression dieses Ablesesystems und des Proteins gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder des von einem Nukleinsäuremolekül, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle I umfasst, kodierten Proteins oder eines Homolog davon wie hierin beschrieben ermöglichen; und
b) Feststellen, ob es sich bei der chemischen Verbindung um einen wirksamen Agonisten handelt, indem man das Vorhandensein oder das Fehlen oder die Verminderung oder Zunahme eines durch dieses Ablesesystem produzierten Signals detektiert.

Die Verbindung kann chemisch synthetisiert oder mikrobiologisch hergestellt und/oder beispielsweise in Proben enthalten sein, z. B. Zellextrakten aus z. B. Pflanzen, Tieren oder Mikroorganismen, z. B. Pathogenen. Ferner kann/können die Verbindung(en) im Fachgebiet bekannt sein, wobei von ihr/ihnen jedoch bislang nicht bekannt war, dass sie fähig zum Unterdrücken des Polypeptids der vorliegenden Erfindung ist/sind. Die Reaktionsmischung kann ein zellfreier Extrakt sein oder kann eine Zell- oder Gewebekultur umfassen. Geeignete Anlagen für das Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung der Erfindung sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und sind zum Beispiel allgemein in Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, dritte Auflage (1994), insbesondere Kapitel 17, beschrieben. Die Verbindungen können z. B. der Reaktionsmischung, dem Kulturmedium, zugesetzt werden, in die Zelle injiziert werden oder auf die Pflanze aufgesprüht werden.
Wird in dem Verfahren eine Probe identifiziert, die eine Verbindung enthält, so ist es entweder möglich, die Verbindung aus der Originalprobe, von der festgestellt wurde, dass sie die Verbindung enthält, die dazu in der Lage ist, die Ertragsproduktion unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einem entsprechenden nicht transformierten Wildtyp zu aktivieren oder zu steigern, zu isolieren, oder man kann die Originalprobe weiter unterteilen, zum Beispiel, wenn sie aus mehreren verschiedenen Verbindungen besteht, um die Anzahl verschiedener Substanzen pro Probe zu verringern, und die Methode mit den Unterteilungen der Originalprobe wiederholen. Abhängig von der Komplexität der Proben können die oben beschriebenen Schritte mehrmals durchgeführt werden, vorzugsweise bis die gemäß dem Verfahren identifizierte Probe nur eine beschränkte Anzahl an Substanzen oder nur noch eine Substanz enthält. Vorzugsweise enthält die Probe Substanzen mit ähnlichen chemischen und/oder physikalischen Eigenschaften, und am stärksten bevorzugt sind die Substanzen identisch. Vorzugsweise wird die gemäß dem oben beschriebenen Verfahren identifizierte Verbindung, oder ihr Derivat, ferner in einer Form aufbereitet, die für die Anwendung in der Pflanzenzucht oder der Zell- und Gewebekultur von Pflanzen geeignet ist.
Bei den Verbindungen, die gemäß diesem Verfahren getestet und identifziert werden können, kann es sich um Expressionsbibliotheken, z. B. cDNA-Expressionsbibliotheken, Peptide, Proteine, Nukleinsäuren, Antikörper, kleine organische Verbindungen, Hormone, Peptidomimetika, PNAs oder dergleichen handeln (Milner, Nature Medicine 1 (1995), 879–880; Hupp, Cell 83 (1995), 237–245; Gibbs, Cell 79 (1994), 193–198, und oben angeführte Literaturstellen). Die Verbindungen können außerdem funktionale Derivate oder Analoga von bekannten Inhibitoren oder Aktivatoren sein. Methoden zur Herstellung chemischer Derivate und Analoga sind dem Fachmann gut bekannt und zum Beispiel in Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer, New York Inc., 175 Fifth Avenue, New York, N. Y. 10010 U. S. A. und Organic Synthesis, Wiley, New York, USA, beschrieben. Ferner können die Derivate und Analoga hinsichtlich ihrer Effekte gemäß im Fachgebiet bekannter Methoden getestet werden. Darüber hinaus können Peptidomimetika und/oder computerunterstütztes Design von passenden Derivaten und Analoga, zum Beispiel gemäß der oben beschriebenen Methoden, eingesetzt werden. Die Zelle oder das Gewebe, welches im Verfahren verwendet werden kann, ist vorzugsweise eine Wirtszelle, Pflanzenzelle oder ein Pflanzengewebe der Erfindung, welche(s) in den Ausführungsformen hierin oben beschrieben ist.
Somit betrifft die Erfindung gemäß einer weiteren Ausführungsform eine gemäß der Methode zur Identifizierung eines Agonisten der Erfindung erhaltene oder identifizierte Verbindung, wobei es sich bei dieser Verbindung um einen Antagonisten des Polypeptids der vorliegenden Erfindung handelt.
Folglich betrifft die vorliegende Erfindung, gemäß einer Ausführungsform, ferner eine Verbindung, identifiziert durch die Methode zum Identifizieren einer Verbindung der vorliegenden Erfindung.
Gemäß einer Ausführungsform betrifft die Erfindung einen Antikörper, der spezifisch die Verbindung oder den Agonisten der vorliegenden Erfindung erkennt.
Die Erfindung betrifft außerdem eine diagnostische Zusammensetzung, die mindestens eines aus den/dem/der zuvor erwähnten Nukleinsäuremolekülen, Antisense-Nukleinsäuremolekül, RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, Cosuppressionsmolekül, Ribozym, Vektoren, Proteinen, Antikörpern oder Verbindungen der Erfindung, und gegebenenfalls geeignete Nachweismittel umfasst.
Die diagnostische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist für die Isolierung von mRNA aus einer Zelle und das Inkontaktbringen der so erhaltenen mRNA mit einer Sonde, einschließlich eine Nukleinsäuresonde, wie oben beschrieben, unter Hybridisierungsbedingungen, das Nachweisen der Gegenwart von an die Sonde hybridisierter mRNA, und dadurch das Nachweisen der Expression des Proteins in der Zelle geeignet. Weitere Methoden zum Nachweis der Gegenwart eines Proteins gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen im Fachgebiet allgemein bekannte Immuntechniken, zum Beispiel den Enzyme-Linked-Immunoadsorbent-Assay. Ferner ist es möglich, die Nukleinsäuremoleküle gemäß der Erfindung als molekulare Marker oder Primer in der Pflanzenzucht zu verwenden. Geeignete Nachweismittel sind einem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt, z. B. Puffer und Lösungen für Hybridisierungs-Assays, z. B. die obenerwähnten Lösungen und Puffer, und ferner sind Mittel für Southern-, Western-, Northern- etc. -Blots, wie z. B. beschrieben in Sambrook et al., bekannt. In einer Ausführungsform enthält die diagnostische Zusammensetzung PCR-Primer, entworfen zum spezifischen Nachweisen der Gegenwart oder der Expressionshöhe des Nukleinsäuremoleküls, das im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, z. B. des Nukleinsäuremoleküls der Erfindung, oder zum Unterscheiden zwischen verschiedenen Varianten oder Allelen des Nukleinsäuremoleküls der Erfindung, oder desjenigen, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll.
Gemäß einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Kit, welches das Nukleinsäuremolekül, den Vektor, die Wirtszelle, das Polypeptid, oder das Antisense, die RNAi, die snRNA, die dsRNA, die siRNA, die miRNA, die ta-siRNA, das Kosuppressionsmolekül oder das Ribozymmolekül, oder das virale Nukleinsäuremolekül, den Antikörper, die Pflanzenzelle, die Pflanze oder das Pflanzengewebe, den erntbaren Teil, das Fortpflanzungsmaterial und/oder die Verbindung und/oder den Agonisten, identifiziert gemäß der Methode der Erfindung, umfasst.
Die Verbindungen des Kits der vorliegenden Erfindung können in Behältern, wie Ampullen, gegebenenfalls mit/in Puffern und/oder Lösung, verpackt sein. Geeignetenfalls könnten eine oder mehrere der Komponenten in ein und demselben Behälter verpackt sein. Zusätzlich dazu oder alternativ dazu könnten eine oder mehrere der Komponenten an einem festen Träger, wie z. B. einem Nitrozellulosefilter, einer Glasplatte, einem Chip oder einer Nylonmembran oder an die Vertiefung einer Mikrotiterplatte, absorbiert sein. Das Kit kann für ein(e) beliebige(s) hierin beschriebenen Verfahren und Ausführungsformen, z. B. für die Herstellung der Wirtszellen, transgenen Pflanzen, pharmazeutischen Zusammensetzungen, den Nachweis von homologen Sequenzen, die Identifizierung von Antagonisten oder Agonisten, als Nahrungsmittel oder Futtermittel oder als Ergänzung davon, oder als Zusatz zum Behandeln von Pflanzen etc., zur Anwendung kommen.
Weiterhin kann das Kit Anweisungen zur Anwendung des Kits bei einer dieser Ausführungsformen enthalten.
Gemäß einer Ausführungsform umfasst das Kit ferner ein Nukleinsäuremolekül, kodierend für ein oder mehrere des zuvor erwähnten Proteins und/oder einen Antikörper, einen Vektor, eine Wirtszelle, eine Antisense-Nukleinsäure, eine Pflanzenzelle oder Pflanzengewebe oder eine Pflanze. Gemäß einer anderen Ausführungsform umfasst das Kit PCR-Primer zum Nachweis und zur Unterscheidung des im Verfahren der Erfindung zu vermindernden Nukleinsäuremoleküls, z. B. des Nukleinsäuremoleküls der Erfindung.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Methode zur Herstellung einer landwirtschaftlichen Zusammensetzung, die das Nukleinsäuremolekül zur Verwendung gemäß dem Verfahren der Erfindung, das Nukleinsäuremolekül der Erfindung, den Vektor der Erfindung, das Antisense, die RNAi, die snRNA, die dsRNA, die siRNA, die miRNA, die ta-siRNA, das Kosuppressionsmolekül, das Ribozym oder den Antikörper der Erfindung, das virale Nukleinsäuremolekül der Erfindung oder das Polypeptid der Erfindung bereitstellt oder die die Schritte der erfindungsgemäßen Methode zur Identifizierung dieser Verbindung oder dieses Agonisten umfasst; und die Formulierung des Nukleinsäuremoleküls, des Vektors oder des Polypeptids der Erfindung oder des Agonisten, oder der gemäß den Methoden bzw. Verfahren der vorliegenden Erfindung oder unter Verwendung des Gegenstands der vorliegenden Erfindung identifizierten Verbindung in einer als landwirtschaftliche Zusammensetzung für Pflanzen anwendbaren Form bereitstellt.
Gemäß einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Methode zur Herstellung der Kulturzusammensetzung für Pflanzen, welche die Schritte der Methode der vorliegenden Erfindung umfasst; und die Formulierung der identifizierten Verbindung in einer als landwirtschaftliche Zusammensetzung annehmbaren Form.
Unter „als landwirtschaftliche Zusammensetzung annehmbar” versteht man, dass eine derartige Zusammensetzung in Übereinstimmung mit den Gesetzen steht, welche den Gehalt an Fungiziden, Pflanzennährstoffen, Herbiziden etc., regulieren. Vorzugsweise ist eine derartige Zusammensetzung für geschützte Pflanzen sowie Tiere (einschließlich Menschen), welche diese aufnehmen, gefahrlos.
In dieser Anmeldung wird auf verschiedene Veröffentlichungen verwiesen. Die Offenbarungen aller dieser Veröffentlichungen und der in diesen Veröffentlichungen angeführten Literaturstellen werden hiermit in ihrer Gesamtheit durch Verweis zur eingehenderen Beschreibung des Stands der Technik, auf den sich diese Erfindung bezieht, Bestandteil der vorliegenden Anmeldung.
Es versteht sich außerdem, dass das Obengesagte bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung betrifft und dass zahlreiche Änderungen und Variationen daran vorgenommen werden können, ohne den Schutzbereich der Erfindung zu verlassen. Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, wobei diese in keiner Weise als einschränkend ausgelegt werden sollen. Es versteht sich vielmehr klar im Gegenteil, dass verschiedene andere Ausführungsformen, Modifikationen und Äquivalente davon, die für den Fachmann nach dem Lesen der vorliegenden Beschreibung naheliegend sind, nicht vom Gedanken der vorliegenden Erfindung und/oder dem Umfang der Ansprüche abweichen.
Gemäß einer Ausführungsform hat der erhöhte Ertrag eine erhöhte Produktion eines spezifischen Inhaltsstoffs zur Folge, einschließlich, ohne Einschränkung, eines erhöhten und/oder verbesserten Zuckergehalts oder einer erhöhten und/oder verbesserten Zuckerzusammensetzung, eines erhöhten und/oder verbesserten Stärkegehalts oder einer erhöhten und/oder verbesserten Stärkezusammensetzung, eines erhöhten und/oder verbesserten Ölgehalts oder einer erhöhten und/oder verbesserten Ölzusammensetzung (wie eines verbesserten Samenölgehalts), eines erhöhten und/oder verbesserten Proteingehalts oder einer erhöhten und/oder verbesserten Proteinzusammensetzung (wie eines verbesserten Samenproteingehalts), eines erhöhten und/oder verbesserten Vitamingehalts oder einer erhöhten und/oder verbesserten Vitaminzusammensetzung, oder dergleichen. Gemäß einer Ausführungsform umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung weiterhin das Ernten der erzeugten oder angebauten Pflanze oder eines Teils der erzeugten oder angebauten Pflanze und das Herstellen von Treibstoff mit oder aus der geernteten Pflanze oder einem Teil davon. Weiterhin umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung in einer Ausführungsform das Ernten eines Pflanzenteils, der sich für das Isolieren von Stärke eignet, und das Isolieren von Stärke aus diesem Pflanzenteil, wobei es sich bei der Pflanze um eine Pflanze handelt, die sich für die Stärkeproduktion eignet, z. B. die Kartoffel. Weiterhin umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung in einer Ausführungsform das Ernten eines Pflanzenteils, der sich für das Isolieren von Öl eignet, und das Isolieren von Öl aus diesem Pflanzenteil, wobei es sich bei der Pflanze um eine Pflanze handelt, die sich für die Ölproduktion eignet, zum Beispiel um Raps oder Canola, Baumwolle, Soja oder Sonnenblume. So zum Beispiel ist gemäß einer Ausführungsform der Ölgehalt im Maissamen erhöht. Die vorliegende Erfindung betrifft somit die Erzeugung von Pflanzen mit einem erhöhten Ölgehalt pro Acre (erntbares Öl).
So zum Beispiel ist gemäß einer Ausführungsform der Ölgehalt im Sojasamen erhöht. Die vorliegende Erfindung betrifft somit die Erzeugung von Sojapflanzen mit einem erhöhten Ölgehalt pro Acre (erntbares Öl).
So zum Beispiel ist gemäß einer Ausführungsform der Ölgehalt im Rapssamen erhöht. Die vorliegende Erfindung betrifft somit die Erzeugung von Rapspflanzen mit einem erhöhten Ölgehalt pro Acre (erntbares Öl).
Zum Beispiel betrifft die vorliegende Erfindung die Erzeugung von Baumwollpflanzen mit einem erhöhten Ölgehalt pro Acre (erntbares Öl).
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, die nicht als Einschränkung zu verstehen sind.
Für die Zwecke der Erfindung umfasst der Plural im Allgemeinen den Singular und umgekehrt.
Gemäß einer Ausführungsform ist der Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanzenzelle oder Pflanze oder eines Teils davon mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, durch Erhöhen oder Erzeugen einer oder mehrerer Aktivitäten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Phosphoenolpyruvatcarboxylkinase, Arginin/Alanin-Aminopeptidase, D-Alanyl-D-alarincarboxypeptidase, Diacylglycerolpyrophosphatphosphatase, Dityrosintransporter, Farnesyldiphosphatfarnesyltransferase, NAD+-abhängiger Betainaidehyddehydrogenase, Serinhydrolase, dem an der Übertragung von Ketoconazolresistenz beteiligten transkriptionellen Regulator, Uridinkinase, dem yal043c-a-Protein, dem ybr071w-Protein und dem ydr445c-Protein.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird bei diesem Verfahren die Aktivität wenigstens eines Polypeptids, welches ein Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(i) einem Polypeptid, welches ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder wenigstens ein Polypeptidmotiv gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle II beziehungsweise Tabelle IV umfasst; oder
(ii) einem Expressionsprodukt eines Nukleinsäuremoleküls, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle I umfasst,
(iii) oder einem funktionellen Äquivalent von (i) oder (ii);

Gemäß einer Ausführungsform wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Expression wenigstens eines Nukleinsäuremoleküls, welches ein Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

a) einem Nukleinsäuremolekül, das für das Polypeptid gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle II kodiert;
b) einem Nukleinsäuremolekül gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle I;
c) einem Nukleinsäuremolekül, welches als Folge der Degeneration des genetischen Codes von einer Polypeptidsequenz gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle II gezeigten abgeleitet sein kann und einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verleiht;
d) einem Nukleinsäuremolekül mit mindestens 30% Identität mit der Nukleinsäuremolekülsequenz eines Polynukleotids, das das Nukleinsäuremolekül gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle I umfasst und einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verleiht;
e) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid mit mindestens 30% Identität mit der Aminosäuresequenz des Polypeptids, das von dem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) kodiert wird, kodiert und die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül wiedergegeben wird, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 von Tabelle I umfasst und einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verleiht;
f) einem Nukleinsäuremolekül, welches unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) hybridisiert und einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verleiht;
g) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das mit Hilfe von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern gegen ein Polypeptid, das von einem der Nukleinsäuremoleküle von (a) bis (e) kodiert wird und die Aktivität aufweist, die durch das Nukleinsäuremolekül wiedergegeben wird, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 von Tabelle I umfasst, isoliert werden kann;
h) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das die Konsensussequenz oder ein oder mehrere Polypeptidmotive gemäß Spalte 7 von Tabelle IV umfasst und vorzugsweise die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül wiedergegeben wird, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 von Tabelle II oder IV umfasst;
i) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aktivität aufweist, die durch ein Protein gemäß Spalte 5 von Tabelle II wiedergegeben wird, und einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verleiht;
j) einem Nukleinsäuremolekül, welches ein Polynukleotid umfasst, das man erhält, indem man eine cDNA-Bibliothek oder eine genomische Bibliothek unter Verwendung der Primer aus Spalte 7 von Tabelle III ampliflziert, und vorzugsweise die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 von Tabelle II oder IV umfasst, wiedergegeben wird; und
k) einem Nukleinsäuremolekül, welches erhältlich ist, indem man eine geeignete Nukleinsäurebibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde, die eine komplementäre Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls von (a) oder (b) umfasst, oder mit einem Fragment davon, mit mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt, eines Nukleinsäuremoleküls, das komplementär zu einer in (a) bis (e) charakterisierten Nukleinsäuremolekülsequenz ist und für ein Polypeptid kodiert, das die Aktivität aufweist, die durch ein ein Polypeptid gemäß Spalte 5 von Tabelle II umfassendes Protein wiedergegeben wird;

Gemäß einer Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf eine transgene Pflanzenzelle oder Pflanze oder einen Teil davon mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, hergestellt durch das wie oben beschriebene Verfahren der Erfindung.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform stammt die transgene Pflanzenzelle oder Pflanze oder der Teil davon von einer monokotyledonen Pflanze oder von einer dikotyledonen Pflanze oder von einer gymnospermen Pflanze, vorzugsweise eine Fichte, Kiefer oder Tanne.
Gemäß einer anderen Ausführungsform stammt die wie oben offenbarte erfindungsgemäße transgene Pflanzenzelle oder Pflanze oder der Teil davon von einer Pflanze ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Sojabohne, Erdnuss, Baumwolle, Raps einschließlich Canola und Winterraps, Mais, Maniok, Pfeffer, Sonnenblume, Flachs, Borretsch, Färberdistel, Lein, Primel, Raps, Rübsen, Tagetes, Nachtschattengewächsen, Kartoffel, Tabak, Aubergine, Tomate, Vicia-Arten, Erbse, Luzerne, Kaffee, Kakao, Tee, Salix-Arten, Ölpalme, Kokosnuss, mehrjährigen Gräsern, Futterkulturen und Arabidopsis thaliana.
Gemäß einer Ausführungsform ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung ein durch eine transgene Pflanze der vorliegenden Erfindung produzierter Samen, wobei der Samen genetisch homozygot für ein Transgen ist, welches einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verleiht, was einen erhöhten Ertrag unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanze vom Wildtyp, zur Folge hat.
Gemäß einer Ausführungsform ist der Gegenstand der Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches ein Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

a) einem Nukleinsäuremolekül, das für das Polypeptid gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle II B kodiert;
b) einem Nukleinsäuremolekül gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle I B;
c) einem Nukleinsäuremolekül, welches als Folge der Degeneration des genetischen Codes von einer Polypeptidsequenz gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle II gezeigten abgeleitet sein kann und einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verleiht;
d) einem Nukleinsäuremolekül mit mindestens 30% Identität mit der Nukleinsäuremolekülsequenz eines Polynukleotids, das das Nukleinsäuremolekül gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle I umfasst und einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verleiht;
e) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid mit mindestens 30% Identität mit der Aminosäuresequenz des Polypeptids, das von dem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) kodiert wird, kodiert und die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül wiedergegeben wird, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 von Tabelle I umfasst und einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verleiht;
f) einem Nukleinsäuremolekül, welches unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) hybridisiert und einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verleiht;
g) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das mit Hilfe von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern gegen ein Polypeptid, das von einem der Nukleinsäuremoleküle von (a) bis (e) kodiert wird und die Aktivität aufweist, die durch das Nukleinsäuremolekül wiedergegeben wird, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 von Tabelle I umfasst, isoliert werden kann;
h) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das die Konsensussequenz oder ein oder mehrere Polypeptidmotive gemäß Spalte 7 von Tabelle IV umfasst und vorzugsweise die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül wiedergegeben wird, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 von Tabelle II oder IV umfasst;
i) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aktivität aufweist, die durch ein Protein gemäß Spalte 5 von Tabelle II wiedergegeben wird, und einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verleiht;
j) einem Nukleinsäuremolekül, welches ein Polynukleotid umfasst, das man erhält, indem man eine cDNA-Bibliothek oder eine genomische Bibliothek unter Verwendung der Primer aus Spalte 7 von Tabelle III amplifiziert, und vorzugsweise die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 von Tabelle II oder IV umfasst, wiedergegeben wird; und
k) einem Nukleinsäuremolekül, welches erhältlich ist, indem man eine geeignete Nukleinsäurebibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde, die eine komplementäre Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls von (a) oder (b) umfasst, oder mit einem Fragment davon, mit mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt, eines Nukleinsäuremoleküls, das komplementär zu einer in (a) bis (e) charakterisierten Nukleinsäuremolekülsequenz ist und für ein Polypeptid kodiert, das die Aktivität aufweist, die durch ein ein Polypeptid gemäß Spalte 5 von Tabelle II umfassendes Protein wiedergegeben wird;

Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist der Gegenstand der Erfindung ein Nukleinsäurekonstrukt, das die Expression eines Nukleinsäuremoleküls verleiht, welches ein Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

l) einem Nukleinsäuremolekül, das für das Polypeptid gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle II B kodiert;
m) einem Nukleinsäuremolekül gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle I B;
n) einem Nukleinsäuremolekül, welches als Folge der Degeneration des genetischen Codes von einer Polypeptidsequenz gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle II gezeigten abgeleitet sein kann und einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verleiht;
o) einem Nukleinsäuremolekül mit mindestens 30% Identität mit der Nukleinsäuremolekülsequenz eines Polynukleotids, das das Nukleinsäuremolekül gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle I umfasst und einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verleiht;
p) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid mit mindestens 30% Identität mit der Aminosäuresequenz des Polypeptids, das von dem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) kodiert wird, kodiert und die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül wiedergegeben wird, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 von Tabelle I umfasst und einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verleiht;
q) einem Nukleinsäuremolekül, welches unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) hybridisiert und einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verleiht;
r) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das mit Hilfe von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern gegen ein Polypeptid, das von einem der Nukleinsäuremoleküle von (a) bis (e) kodiert wird und die Aktivität aufweist, die durch das Nukleinsäuremolekül wiedergegeben wird, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 von Tabelle I umfasst, isoliert werden kann;
s) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das die Konsensussequenz oder ein oder mehrere Polypeptidmotive gemäß Spalte 7 von Tabelle IV umfasst und vorzugsweise die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül wiedergegeben wird, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 von Tabelle II oder IV umfasst;
t) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aktivität aufweist, die durch ein Protein gemäß Spalte 5 von Tabelle II wiedergegeben wird, und einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verleiht;
u) einem Nukleinsäuremolekül, welches ein Polynukleotid umfasst, das man erhält, indem man eine cDNA-Bibliothek oder eine genomische Bibliothek unter Verwendung der Primer aus Spalte 7 von Tabelle III amplifiziert, und vorzugsweise die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 von Tabelle II oder IV umfasst, wiedergegeben wird; und
v) einem Nukleinsäuremolekül, welches erhältlich ist, indem man eine geeignete Nukleinsäurebibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde, die eine komplementäre Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls von (a) oder (b) umfasst, oder mit einem Fragment davon, mit mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt, eines Nukleinsäuremoleküls, das komplementär zu einer in (a) bis (e) charakterisierten Nukleinsäuremolekülsequenz ist und für ein Polypeptid kodiert, das die Aktivität aufweist, die durch ein ein Polypeptid gemäß Spalte 5 von Tabelle II umfassendes Protein wiedergegeben wird;

Gemäß einer Ausführungsform ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung ein Vektor, der ein wie oben offenbartes Nukleinsäuremolekül oder das wie oben offenbarte Nukleinsäurekonstrukt umfasst, wobei die Expression der Nukleinsäure in einer Wirtszelle zu einem erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, führt.
Gemäß einer Ausführungsform ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung eine Wirtszelle, die mit dem wie oben offenbarten Vektor oder dem wie oben offenbarten Nukleinsäuremolekül oder dem wie oben offenbarten Nukleinsäurekonstrukt stabil oder transient transformiert wurde und die aufgrund der Transformation einen erhöhten Ertrag zeigt, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon.
Gemäß einer Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptid, wobei das Polypeptid in einer wie oben offenbarten Wirtszelle exprimiert wird.
Dieses durch das wie oben offenbarte Verfahren hergestellte oder durch das wie oben offenbarte Nukleinsäuremolekül kodierte Polypeptid oder kann sich von der Sequenz gemäß Tabelle II in einer oder mehreren Aminosäuren unterscheiden.
Gemäß einer Ausführungsform ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung ein Antikörper, der spezifisch an das oben beschriebene Polypeptid bindet.
Gemäß einer Ausführungsform ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung ein Pflanzengewebe, Fortpflanzungsmaterial, Erntegut oder eine Pflanze, das/die die wie oben beschriebene Wirtszelle umfasst.
Gemäß einer Ausführungsform ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon, einer Pflanze oder einem Teil davon einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, welches die folgenden Schritte umfasst:

k) Kultivieren einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder eines Teils davon, wodurch man eine Pflanze erhält, die das durch das wie oben offenbarte erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül kodierte Polypeptid exprimiert, welches einen erhöhten Ertrag unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon verleiht; eine nicht transformierte Pflanze vom Wildtyp oder ein Teil davon und ein Ablesesystem, das dazu in der Lage ist, unter geeigneten Bedingungen, die eine Wechselwirkung des Polypeptids mit diesem Ablesesystem in Gegenwart einer Verbindung oder einer Probe, die eine Mehrzahl an Verbindungen enthält, erlauben, mit dem Polypeptid in Wechselwirkung zu treten und dazu in der Lage ist, ein nachweisbares Signal als Reaktion auf die Bindung einer Verbindung an das Polypeptid bereitzustellen, unter Bedingungen, die die Expression dieses Ablesesystems und des durch das wie oben offenbarte erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül kodierten Polypeptids ermöglichen, wodurch einer nicht transformierten Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon ein erhöhter Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verliehen wird;
l) Feststellen, ob es sich bei der Verbindung um einen wirksamen Agonisten handelt, indem man das Vorhandensein oder das Fehlen oder die Zunahme eines durch dieses Ablesesystem produzierten Signals detektiert.

Gemäß einer Ausführungsform ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer landwirtschaftlichen Zusammensetzung, welches die Schritte des oben offenbarten Verfahrens zur Identifikation einer einen erhöhten Ertrag verleihenden Verbindung und das Formulieren der in diesem Verfahren identifizierten Verbindung in einer für die Anwendung in der Landwirtschaft geeigneten Form umfasst.
Gemäß einer Ausführungsform ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung eine Zusammensetzung, die das wie oben offenbarte Nukleinsäuremolekül, das wie oben offenbarte Polypeptid, das wie oben offenbarte Nukleinsäurekonstrukt, den wie oben offenbarten Vektor, die wie oben offenbarte Verbindung, den wie oben offenbarten Antikörper und gegebenenfalls einen landwirtschaftlich geeigneten Träger umfasst.
Gemäß einer Ausführungsform ist ein Gegenstand der Erfindung ein isoliertes Polypeptid gemäß Tabelle II, vorzugsweise Tabelle II B, ausgewählt aus Hefe, vorzugsweise Saccharomyces cerevisiae, oder E. coli.
Gemäß einer Ausführungsform ist ein Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanzenzelle oder Pflanze oder eines Teils davon mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, wobei der erhöhte Ertrag unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress durch die Expression eines Polypeptids, welches durch eine wie oben offenbarte erfindungsgemäße Nukleinsäure kodiert wird und zu einem erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, führt, bei dem man

m) eine Pflanzenzelle oder einen Teil einer Pflanze mit einem wie oben offenbarten erfindungsgemäßen Expressionsvektor transformiert und
n) aus der Pflanzenzelle oder dem Teil einer Pflanze eine transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanze vom Wildtyp, erzeugt.

Gemäß einer Ausführungsform ist ein Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanze vom Wildtyp, vorzugsweise unter Bedingungen von Umweltstress, durch Erhöhen oder Erzeugen einer oder mehrerer Aktivitäten ausgewählt aus der Gruppe der Yield-Related Proteins (YRP) oder Yield and Stress-Related Proteins (YSRP) bestehend aus:
Phosphoenolpyruvatcarboxylkinase, Arginin/Alanin-Aminopeptidase, D-Alanyl-D-alanincarboxypeptidase, Diacylglycerolpyrophosphatphosphatase, Dityrosintransporter, Farnesyldiphosphatfarnesyltransferase, NAD+-abhängiger Betainaldehyddehydrogenase, Serinhydrolase, dem an der Übertragung von Ketoconazolresistenz beteiligten transkriptionellen Regulator, Uridinkinase, dem yal043c-a-Protein, dem ybr071w-Protein und dem ydr445c-Protein.
Gemäß einer Ausführungsform ist ein Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanze vom Wildtyp, vorzugsweise unter Bedingungen von Umweltstress, bei dem man

aa) eine Pflanzenzelle oder einen Teil einer Pflanze mit einem wie oben offenbarten erfindungsgemäßen Expressionsvektor transformiert und
bb) aus der Pflanzenzelle oder dem Teil einer Pflanze eine transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanze vom Willdtyp, erzeugt.

Gemäß einer Ausführungsform ist ein Gegenstand der Erfindung die Verwendung eines für ein YRP oder YSRP kodierenden Nukleinsäuremoleküls ausgewählt aus der Gruppe, die die wie oben offenbarte erfindungsgemäße Nukleinsäure und Teile davon umfasst, zur Herstellung einer Pflanzenzelle mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit einer nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil einer Pflanze.
Gemäß einer Ausführungsform ist ein Gegenstand der Erfindung die Verwendung eines für ein YRP oder YSRP kodierenden Nukleinsäuremoleküls ausgewählt aus der Gruppe, die die wie oben offenbarte erfindungsgemäße Nukleinsäure und Teile davon umfasst, als Marker für die Selektion von Pflanzen oder Pflanzenzellen mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle vom Wildtyp, einer nicht transformierten Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon.
Gemäß einer Ausführungsform ist ein Gegenstand der Erfindung die Verwendung eines für ein YRP oder YSRP kodierenden Nukleinsäuremoleküls ausgewählt aus der Gruppe, die die wie oben offenbarte erfindungsgemäße Nukleinsäure und Teile davon umfasst, als Marker für den Nachweis von Stress in Pflanzen oder Pflanzenzellen.
Gemäß einer Ausführungsform ist ein Gegenstand der Erfindung eine wie oben offenbarte erfindungsgemäße transformierte Pflanzenzelle, wobei der vorrübergehende und wiederholte abiotischen Umweltstress aus der aus Salinitätsstressfaktoren, Dürrestressfaktoren, Temperaturstressfaktoren, Metallstressfaktoren, chemischen, pathogenen und oxidativen Stressfaktoren oder Kombinationen davon bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Gemäß einer Ausführungsform ist ein Gegenstand der Erfindung eine wie oben offenbarte erfindungsgemäße transformierte Pflanzenzelle, wobei es sich bei dem vorübergehenden und wiederholten abiotischen Umweltstress um Dürre, vorzugsweise zyklische Dürre, handelt.
Gemäß einer Ausführungsform ist ein Gegenstand der Erfindung eine transgene Pflanzenzelle, welche ein Nukleinsäuremolekül umfasst, welches für ein Polypeptid mit einer Aktivität ausgewählt aus der Gruppe der Yield-Related Proteins (YRP) oder Yield and Stress-Related Proteins (YSRP) bestehend aus:
Phosphoenolpyruvatcarboxylkinase, Arginin/Alanin-Aminopeptidase, D-Alanyl-D-alanincarboxypeptidase, Diacylglycerolpyrophosphatphosphatase, Dityrosintransporter, Farnesyldiphosphatfarnesyltransferase, NAD+-abhängiger Betainaldehyddehydrogenase, Serinhydrolase, dem an der Übertragung von Ketoconazolresistenz beteiligten transkriptionellen Regulator, Uridinkinase, dem yal043c-a-Protein, dem ybr071w-Protein und dem ydr445c-Protein kodiert, wobei dieses Polypeptid einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon verleiht, vorzugsweise wenn das Polypeptid überexprimiert wird.
Gemäß einer Ausführungsform ist ein Gegenstand der Erfindung eine wie oben offenbarte erfindungsgemäße Pflanze, die

i) einen erhöhten Ertrag unter vorübergehenden und wiederholten Bedingungen mit eingeschränkten Nährstoffen, wobei die Bedingungen für das Wachstum einer nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon einschränkend wären, zeigt,
ii) einen erhöhten Ertrag unter Bedingungen, bei denen Wasser für das Wachstum einer nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon einschränkend wäre, zeigt,
iii) einen erhöhten Ertrag unter Bedingungen von Dürre, vorzugsweise zyklische Dürre, wobei diese Bedingungen für das Wachstum einer nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon einschränkend wären, zeigt, und/oder
iv) einen erhöhten Ertrag unter Bedingungen von niedriger Feuchtigkeit, wobei diese Bedingungen für das Wachstum einer nichttransformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon einschränkend wären, zeigt.

Gemäß einer Ausführungsform ist ein Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags pro Acre in Mega-Environments, in denen die Pflanzen nicht oder nicht mehr ihr Ertragspotential erreichen, bei dem man eine wie oben offenbarte Pflanze der entsprechenden Klasse/Gattung kultiviert.
Gemäß einer Ausführungsform ist ein Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags pro Acre in Mega-Environments, welches die folgenden Schritte umfasst:

– Durchführen einer Bodenanalyse zur Messung der im Boden verfügbaren Nährstoffkonzentrationen,
– Vergleichen des Ergebnisses mit dem Wert, der zum Erreichen des Ertragspotential einer Klasse/Gattung einer Pflanze erforderlich ist,
– Kultivieren einer wie oben offenbarten Pflanze der entsprechenden Klasse/Gattung, wenn wenigstens einer der Nährstoffe nur eingeschränkt zur Verfügung steht.

Gemäß einer Ausführungsform ist ein Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags pro Acre in Mega-Environments, welches die folgenden Schritte umfasst:

– Messen des Niederschlags über einen Zeitraum von wenigstens einer Pflanzengeneration,
– Vergleichen des Ergebnisses mit dem Wert, der zum Erreichen des Ertragspotential einer Klasse/Gattung einer Pflanze erforderlich ist,
– Kultivieren einer wie oben offenbarten Pflanze der entsprechenden Klasse/Gattung, wenn der Niederschlag vermindert ist.

– Messen der Zeiträume zwischen Niederschlägen über einen Zeitraum von wenigstens einer Pflanzengeneration,
– Vergleichen des Ergebnisses mit dem Wert, der zum Erreichen des Ertragspotential einer Klasse/Gattung einer Pflanze erforderlich ist,
– Kultivieren einer wie oben offenbarten Pflanze der entsprechenden Klasse/Gattung, wenn die Trockenzeit verlängert ist.

Beispiel
Gentechnische Herstellung stresstoleranter Arabidopsis-Pflanzen durch Überexprimieren von für YRP oder YSRP kodierenden Genen.
Klonieren der erfindungsgemäßen Sequenzen gemäß Tabelle I, Spalte 5 zur Expression in Pflanzen Wenn nicht anders angegeben, werden die in Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschriebenen Standardverfahren angewendet.
Die in der Tabelle I, Spalte 5 und 7 gezeigten erfindungsgemäßen Sequenzen wurden mittels PCR amplifiziert, wie in dem Protokoll für die Pfu Ultra-, Pfu Turbo- oder Herculase-DNA-Polymerase (Stratagene) beschrieben.
Die Zusammensetzung für das Protokoll der Pfu Ultra-, Pfu Turbo- oder Herculase-DNA-Polymerase war wie folgt: 1 × PCR-Puffer (Stratagene), jeweils 0,2 mM der dNTP, 100 ng genomische DNA von Saccharomyces cerevisiae (Stamm S288C; Research Genetics, Inc., jetzt Invitrogen), E. coli (Stamm MG1655; Escherichia coli Genetic Stock Center), 50 pmol Vorwärts-Primer, 50 pmol Revers-Primer, 2,5 u Pfu Ultra-, Pfu Turbo- oder Herculase-DNA-Polymerase.
Die Amplifikationszyklen waren wie folgt:
1 Zyklus von 2–3 Minuten bei 94–95°C, gefolgt von 25–36 Zyklen von jeweils 30–60 Sekunden bei 94–95°C, 30–45 Sekunden bei 50–60°C, und 210–480 Sekunden bei 72°C, gefolgt von 1 Zyklus von 5–10 Minuten bei 72°C, dann 4°C.
ORF-spezifische Primer-Paare für die zu exprimierenden Gene sind in Tabelle III, Spalte 7 aufgeführt. Die folgenden Adaptersequenzen wurden für Klonierungszwecke zu Saccharomyces cerevisiae-spezifischen Primern (siehe Tabelle III) hinzugefügt:

i) Vorwärts-Primer: 5'-GGAATTCCAGCTGACCACC-3' SEQ ID NO: 1
ii) Revers-Primer: 5'-GATCCCCGGGAATTGCCATG-3' SEQ ID NO: 2 Die Adaptersequenzen gestatten es, das ORF in die verschiedenen Vektoren, die die Resgen-Adapter enthalten, zu klonieren; siehe Tabelle VII.

Die folgenden Adaptersequenzen wurden für Klonierungszwecke zu Escherichia coli ORF-spezifischen Primern hinzugefügt:

iii) Vorwärts-Primer: 5'-TTGCTCTTCC-3' SEQ ID NO: 3
iiii) Revers-Primer: 5'-TTGCTCTTCG-3' SEQ ID NO: 4 Die Adaptersequenzen gestatten es, das ORF in die verschiedenen Vektoren, die die Colic-Adapter enthalten, zu klonieren; siehe Tabelle VII.

Zur Amplifikation und Klonierung von Saccharomyces cerevisiae SEQ ID NO: 724 wurde daher ein Primer, bestehend aus der Adaptersequenz i) und der ORF-spezifischen Sequenz SEQ ID NO: 726, und ein zweiter Primer, bestehend aus der Adaptersequenz ii) und der ORF-spezifischen Sequenz SEQ ID NO: 727, verwendet.
Zur Amplifikation und Klonierung von Echerischia coli SEQ ID NO: 63 wurde daher ein Primer, bestehend aus der Adaptersequenz iii) und der ORF-spezifischen Sequenz SEQ ID NO: 615, und ein zweiter Primer, bestehend aus der Adaptersequenz iiii) und der ORF-spezifischen Sequenz SEQ ID NO: 616, verwendet.
Anhand dieser Beispiele kann jede Sequenz, die in Tabelle I, vorzugsweise Spalte 5, beschrieben ist, kloniert werden, und zwar dadurch, dass man die Adaptersequenzen mit den jeweiligen spezifischen Primersequenzen, wie sie in Tabelle III, Spalte 7, offenbart sind, fusioniert.

Tabelle VII. Übersicht über die unterschiedlichen Vektoren, die für die Klonierung der ORFs verwendet werden, und zeigt ihre SEQ-IDs (Spalte A), ihre Vektorbezeichnungen (Spalte B), die Promotoren, die sie für die Expression der ORFs enthalten (Spalte C), die zusätzliche künstliche Zielsteuerungssequenz (Spalte D), die Adaptersequenz (Spalte E), die von dem Promoter gemäß Spalte B vermittelte Expressionsart (Spalte F) und die Nummer der Figur (Spalte G).

A	B	C	D	E	F	G
Se qID	Bezeichnung des Vektors	Bezeichnung des Promotors	Zielsteuerungssequenz	Adapter - sequen z	Expressionsart	Figur
9	pMTX027 0p	Super		Colic	nichtzielgerichtete konstitutive Expression vorzugsweise in grünen Geweben	6
31	pMTX155	Big35S		Resgen	nichtzielgerichtete konstitutive Expression vorzugsweise in grünen Geweben	7
32	VC-MME354-1QCZ	Super	FNR	Resgen	plastidgerichtete konstitutive Expression vorzugsweise in grünen Geweben	3
34	VC-MME356-1QCZ	Super	IVD	Resgen	auf die Mitochondrien gerichtete konstitutive Expression vorzugsweise in grünen Geweben	8
36	VC-MME301-1QCZ	USP		Resgen	nichtzielgerichtete Expression vorzugsweise in Samen	9
37	pMTX461 korrp	USP	FNR	Resgen	plastidgerichtete Expression vorzugsweise in Samen	10
39	VC-MME462-1QCZ	USP	IVD	Resgen	auf die Mitochondrien gerichtete Expression vorzugsweise in Samen	11
41	VC-MME220-1qcz	Super		Colic	nichtzielgerichtete konstitutive Expression vorzugsweise in grünen Geweben	1
42	VC-MME432-1qcz	Super	FNR	Colic	plastidgerichtete konstitutive Expression vorzugsweise in grünen Geweben	4
44	VC-MME431-1qcz	Super	IVD	Colic	auf die Mitochondrien gerichtete konstitutive Expression vorzugsweise in grünen Geweben	12
46	VC-MME221-1qcz	PcUbi		Colic	nichtzielgerichtete konstitutive Expression vorzugsweise in grünen Geweben	2
47	pMTX447 korr	PcUbi	FNR	Colic	plastidgerichtete konstitutive Expression vorzugsweise in grünen Geweben	13
49	VC-MME445-1qcz	PcUbi	IVD	Colic	auf die Mitochondrien gerichtete konstitutive Expression vorzugsweise in grünen Geweben	14
51	VC-MME289-1qcz	USP		Colic	nichtzielgerichtete Expression vorzugsweise in Samen	15
52	VC-MME464-1qcz	USP	FNR	Colic	plastidgerichtete Expression vorzugsweise in Samen	16
54	VC-EMM465-1qcz	USP	IVD	Colic	auf die Mitochondrien gerichtete Expression vorzugsweise in Samen	17
56	VC-MME489-1QCZ	Super		Resgen	nichtzielgerichtete konstitutive Expression vorzugsweise in grünen Geweben	5

Konstruktion binärer Vektoren für die nichtzielgerichtete Expression von Proteinen.
„Nichtzielgerichtete” Expression bedeutet in diesem Zusammenhang, dass dem zu exprimierenden ORF keine zusätzliche Targeting-Sequenz angehängt wurde.
Für die nichtzielgerichtete Expression in vorzugsweise grünen Geweben wurden die folgenden binären Vektoren zum Klonieren verwendet: pMTX155, VC-MME220-1qcz, VC-MME221-1qcz, VC-MME489-1QCZ.
Bei VC-MME489-1QCZ kann man die Superpromotorsequenz (Ni et al., Plant Journal 7, 661 (1995) durch die Sequenz des verbesserten 35S-Promotors (Comai et al., Plant Mol Biol 15, 373–383 (1990) ersetzen, was zu ähnlichen Ergebnissen wie unten in Tabelle 1 gezeigt führt.
Amplifikation der Targeting-Sequenz des Gens FNR aus Spinacia oleracea und Konstruktion eines Vektors für die plastidgerichtete Expression in vorzugsweise grünen Geweben oder vorzugsweise in Samen.
Zur Amplifikation der Targeting-Sequenz des FNR-Gens aus S. oleracea wurde genomische DNA aus den Blättern von 4 Wochen alten S. oleracea-Pflanzen extrahiert (DNeasy Plant Mini Kit, Qiagen, Hilden). Die gDNA wurde als Matrize für eine PCR verwendet.
Zur Ermöglichung der Klonierung der Transitsequenz in den Vektoren VC-MME489 1QCZ und VC-MME301-1QCZ wurde eine EcoRI-Restriktionsenzym-Erkennungssequenz sowohl zu dem Vorwärts- als auch zu dem Revers-Primer hinzugefügt, wohingegen zur Klonierung in den Vektoren pMTX0270p, VC-MME220-qgcz, VC-MME221-1qcz und VC-MME289-1qcz eine Pmel-Restriktionsenzym-Erkennungssequenz zu dem Vorwärts-Primer und eine NcoI-Stelle zu dem Revers-Primer hinzugefügt wurde.
Die aus genomischer DNA von Spinat amplifizierte, resultierende Sequenz SEQ ID NO: 29 umfasste eine 5'UTR (bp 1-165), und die kodierende Region (bp 166-273 und 351-419). Die kodierende Sequenz ist durch eine Intronsequenz von bp 274 bis bp 350 unterbrochen.
SEQ ID NO: 29
Das mit den Primern FNR5EcoResgen und FNR3EcoResgen hergeleitete PCR-Fragment wurde mit EcoRI gespalten und in die Vektoren VC-MME489-1QCZ und VC-MME301-1QCZ ligiert, die ebenfalls mit EcoRI gespalten worden waren. Die korrekte Orientierung der FNR-Targeting-Sequenz wurde durch Sequenzierung überprüft. Die in diesem Ligationsschritt erzeugten Vektoren waren VC-MME354-1QCZ beziehungsweise pMTX461korrp.
Das mit den Primern FNR5PmeColic und FNR3NcoColic hergeleitete PCR-Fragment wurde mit PmeI und NcoI gespalten und in die Vektoren pMTX0270p (6) SEQ ID NO: 9, VC-MME220-1qcz, VC-MME221-1qcz und VC-MME289-1qcz ligiert, die mit SmaI und Nco gespalten worden waren. Die in diesem Ligationsschritt erzeugten Vektoren waren VC-MME432-1qcz SEQ ID NO: 42 (4) VC-MME464-1qcz beziehungsweise pMTX447korr.
Für die plastidgerichtete konstitutive Expression in vorzugsweise grünen Geweben wurde ein künstlicher Promotor, der A(ocs)3AmasPmas-Promotor (Superpromotor) (Ni et al,. Plant Journal 7, 661 (1995), WO 95/14098 ), zusammen mit dem Vektor VC-MME354-1QCZ für ORFs aus Saccharomyces cerevisiae und zusammen mit dem Vektor VC-MME432-1qcz für ORFs aus Escherichia coli verwendet, was jeweils zu einer „in-frame”-Fusion der FNR-Targeting-Sequenz mit den ORFs führte.
Für die plastidgerichtete Expression vorzugsweise in Samen wurde der USP-Promotor (Bäumlein et al., Mol Gen Genet. 225(3): 459–67 (1991)) entweder zusammen mit dem Vektor pMTX461korrp für ORFs aus Saccharomyces cerevisiae oder zusammen mit dem Vektor VC-MME464-1qcz für ORFs aus Escherichia coli verwendet, was jeweils zu einer „in-frame”-Fusion der FNR-Targeting-Sequenz mit den ORFs führte.
Für die plastidgerichtete konstitutive Expression in vorzugsweise grünen Geweben und Samen wurde der PcUbi-Promotor zusammen mit dem Vektor pMTX447korr für ORFs aus Saccharomyces cerevisiae oder Escherichia coli verwendet, was jeweils zu einer „in-frame”-Fusion der FNR-Targeting-Sequenz mit den ORFs führte.
Konstruktion binärer Vektoren für die auf die Mitochondrien gerichtete Expression von Proteinen
Amplifikation der mitochondrialen Targeting-Sequenz des Gens IVD aus Arabidopsis thaliana und Konstruktion eines Vektors für die auf die Mitochondrien gerichtete Expression in vorzugsweise grünen Geweben oder vorzugsweise in Samen.
Zur Amplifikation der Targeting-Sequenz des IVD-Gens aus A. thaliana wurde genomische DNA aus den Blättern von A. thaliana-Pflanzen extrahiert (DNeasy Plant Mini Kit, Qiagen, Hilden). Die gDNA wurde als Matrize für eine PCR verwendet.
Zur Ermöglichung der Klonierung der Transitsequenz in den Vektoren VC-MME489-1QCZ und VC-MME301-1QCZ wurde eine EcoRI-Restriktionsenzym-Erkennungssequenz sowohl zu dem Vorwärts- als auch zu dem Revers-Primer hinzugefügt, wohingegen zur Klonierung in den Vektoren VC-MME220-1qcz, VC-MME221-1qcz und VC-MME289-1qcz eine Pmel-Restriktionsenzym-Erkennungssequenz zu dem Vorwärts-Primer und eine NcoI-Stelle zu dem Revers-Primer hinzugefügt wurde.
Die aus genomischer DNA von A. thaliana mit IVD5EcoResgen und IVD3EcoResgen amplifizierte, resultierende Sequenz (SEQ ID NO: 61) umfasste 81 bp:
Die aus genomischer DNA von A. thaliana mit IVD5PmeColic und IVD3NcoColic amplifizierte, resultierende Sequenz (SEQ ID NO: 62) umfasste 89 bp:
Das mit den Primern IVD5EcoResgen und IVD3EcoResgen hergeleitete PCR-Fragment wurde mit EcoRI gespalten und in die Vektoren VC-MME489-1QCZ und VC-MME301-1QCZ ligiert, die ebenfalls mit EcoRI gespalten worden waren. Die korrekte Orientierung der IVD Targeting-Sequenz wurde durch Sequenzierung überprüft. Die in diesem Ligationsschritt erzeugten Vektoren waren VC-MME356-1QCZ beziehungsweise VC-MME462-1QCZ.
Das mit den Primern IVD5PmeColic und IVD3NcoColic hergeleitete PCR-Fragment wurde mit Pmel und Ncol gespalten und in die Vektoren VC-MME220-1qcz, VC-MME221-1qcz und VC-MME289-1qcz ligiert, die mit SmaI und NcoI gespalten worden waren. Die in diesem Ligationsschritt erzeugten Vektoren waren VC-MME431-1qcz, VC-MME465-1qcz beziehungsweise VC-MME445-1qcz.
Für die auf die Mitochondrien gerichtete konstitutive Expression vorzugsweise in grünen Geweben wurde ein künstlicher Promotor, der A(ocs)3AmasPmas-Promotor (Superpromotor) (Ni et al,. Plant Journal 7, 661 (1995), WO 95/14098 ), zusammen mit dem Vektor VC-MME356-1QCZ für ORFs aus Saccharomyces cerevisiae und zusammen mit dem Vektor VC-MME431-1gcz für ORFs aus Escherichia coli verwendet, was jeweils zu einer „in-frame”-Fusion der IVD-Sequenz mit den betreffenden ORFs führte.
Für die auf die Mitochondrien gerichtete konstitutive Expression vorzugsweise in Samen wurde der USP-Promotor (Bäumlein et al., Mol Gen Genet. 225(3): 459–67 (1991)) zusammen mit dem Vektor VC-MME462-1QCZ für ORFs aus Saccharomyces cerevisiae und zusammen mit dem Vektor VC-MME465-1qcz für ORFs aus Escherchia coli verwendet, was jeweils zu einer „in-frame”-Fusion der IVD-Sequenz mit den betreffenden ORFs führte.
Für die auf die Mitochondrien gerichtete konstitutive Expression vorzugsweise in grünen Geweben und Samen wurde der PcUbi-Promotor zusammen mit dem Vektor VC-MME445-1qcz für ORFs aus Saccharomyces cerevisiae und Escherichia coli verwendet, was jeweils zu einer „in-frame”-Fusion der IVD-Sequenz mit den betreffenden ORFs führte.
Andere geeignete binäre Vektoren sind dem Fachmann bekannt; ein Übersichtsartikel zu binären Vektoren und ihrer Verwendung findet sich in Hellens R., Mullineaux P. und Klee H., (Trends in Plant Science, 5 (10), 446 (2000)). Solche Vektoren müssen ebenfalls mit entsprechenden Promotoren und Targeting-Sequenzen ausgestattet sein.
Klonieren der erfindungsgemäßen Sequenzen gemäß Tabelle I, Spalte 5 in die verschiedenen Expressionsvektoren.
Zum Klonieren des ORF der SEQ ID NO: 724 aus S. cerevisiae in die Resgen-Adaptorsequenz enthaltende Vektoren wurde die entsprechende Vektor-DNA mit dem Restriktionsenzym NcoI behandelt. Zum Klonieren der ORFs aus Saccharomyces cerevisiae in die Colic-Adaptorsequenz enthaltende Vektoren wurde die entsprechende Vektor-DNA mit den Restriktionsenzymen PacI und NcoI gemäß der Standardvorschrift (MBI Fermentas) behandelt. Zum Klonieren der ORFs aus Escherichia coli wurde die Vektor-DNA mit den Restriktionsenzymen PacI und NcoI gemäß der Standardvorschrift (MBI Fermentas) behandelt. In allen Fällen wurde die Reaktion durch 20minütige Desaktivierung bei 70°C gestoppt und gemäß der Standardvorschrift an QIAquick- oder NucleoSpin Extract II-Säulen (Qiagen bzw. Macherey-Nagel) aufgereinigt.
Dann wurde das PCR-Produkt, das den amplifizierten ORF mit den entsprechenden Adaptersequenzen und die Vektor-DNA darstellt, gemäß der Standardvorschrift (MBI Fermentas) mit T4 DNA-Polymerase behandelt, so dass Einzelstrangüberhänge erhalten wurden, und zwar mit den Parametern 1 Einheit T4 DNA-Polymerase bei 37°C für 2–10 Minuten für den Vektor und 1–2 Einheiten T4 DNA-Polymerase bei 15–17°C für 10–60 Minuten für das die SEQ ID NO: 724 darstellende PCR-Produkt.
Die Reaktion wurde durch Zugabe von Hochsalzpuffer abgestoppt und über QlAquick- oder NucleoSpin Extract II-Säulen gemäß der Standardvorschrift (Qiagen bzw. Macherey-Nagel) aufgereinigt.
Der Fachmann kann nach diesem Beispiel sämtliche in Tabelle I, vorzugsweise Spalte 5, aufgeführten Sequenzen klonieren.
Etwa 30–60 ng präparierter Vektor und eine definierte Menge des präparierten Amplifikats wurden gemischt und 15 Minuten lang bei 65°C und anschließend 37°C 0,1°C/1 Sekunde, anschließend 10 Minuten lang bei 37°C, anschließend 0,1°C/1 Sekunde, dann 4–10°C hybridisiert.
Die ligierten Konstrukte wurden in dem gleichen Reaktionsgefäß durch Zugabe kompetenter E. coli-Zellen (Stamm DH5alpha) und 20minütige Inkubation bei 1°C, und einem anschließenden 90 Sekunden langen Hitzeschock bei 42°C sowie Abkühlen auf 1–4°C transformiert. Dann wurde Vollmedium (SOC) zugegeben, und das Gemisch wurde für 45 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Das gesamte Gemisch wurde anschließend auf eine Agarplatte mit 0,05 mg/ml Kanamycin plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.
Das Ergebnis des Klonierungsschritts wurde durch Amplifikation mit Hilfe von Primern verifiziert, die stromaufwärts und stromabwärts der Integrationsstelle binden, so dass die Amplifikation der Insertion ermöglicht wurde. Die Amplifikationen erfolgten wie in der Vorschrift für Taq DNA-Polymerase (Gibco-BRL) beschrieben.
Die Amplifikationszyklen waren wie folgt: 1 Zyklus von 1–5 Minuten bei 94°C, gefolgt von 35 Zyklen von jeweils 15–60 Sekunden bei 94°C, 15–60 Sekunden bei 50–66°C und 5–15 Minuten bei 72°C, gefolgt von 1 Zyklus von 10 Minuten bei 72°C, dann 4–16°C.
Mehrere Kolonien wurden überprüft, jedoch wurde nur die Kolonie, für die ein PCR-Produkt mit der erwarteten Größe nachgewiesen wurde, in den folgenden Schritten verwendet.
Ein Teil dieser positiven Kolonie wurde in ein Reaktionsgefäß überführt, das mit Vollmedium (LB), das mit Kanamycin angereichert war, gefüllt war, und über Nacht bei 37°C inkubiert.
Die Plasmidpräparation wurde wie in der Qiaprep- oder NucleoSpin Multi-96 Plus-Standardvorschrift (Qiagen bzw. Macherey-Nagel) beschrieben durchgeführt.
Herstellung transgener Pflanzen, die SEQ ID NO: 63 oder eine andere, in Tabelle I, vorzugsweise Spalte 5, aufgeführte Sequenz exprimieren
1–5 ng isolierte Plasmid-DNA wurde durch Elektroporation oder Transformation in kompetente Zellen von Agrobacterium tumefaciens, Stamm GV 3101 pMP90 (Koncz und Schell, Mol. Gen. Gent. 204, 383–396, 1986), transformiert. Danach wurde Vollmedium (YEP) zugegeben und das Gemisch wurde für 3 Stunden bei 28°C in ein frisches Reaktionsgefäß überführt. Anschließend wurde das gesamte Reaktionsgemisch auf YEP-Agarplatten plattiert, die mit den entsprechenden Antibiotika, beispielsweise Rifampicin (0,1 mg/ml), Gentamycin (0,025 mg/ml) und Kanamycin (0,05 mg/ml), angereichert waren, und 48 Stunden lang bei 28°C inkubiert.
Die Agrobakterien, die das Plasmidkonstrukt enthielten, wurden dann zur Transformation von Pflanzen verwendet.
Mit Hilfe einer Pipettenspitze wurde eine Kolonie von der Agarplatte gepickt und in 3 ml flüssigem TB-Medium aufgenommen, das ebenfalls geeignete Antibiotika, wie oben beschrieben, enthielt. Die Vorkultur wurde 48 Std. bei 28°C und 120 U/min gezüchtet.
400 ml LB-Medium, das die gleichen Antibiotika wie oben enthielt, wurde für die Hauptkultur verwendet. Die Vorkultur wurde in die Hauptkultur überführt. Sie wurde 18 Std. bei 28°C und 120 U/min gezüchtet. Nach Zentrifugation bei 4000 U/min wurde das Pellet in Infiltrationsmedium (MS-Medium, 10% Saccharose) resuspendiert.
Zum Anziehen der Pflanzen für die Transformation wurden Wannen (Piki Saat 80, grün, mit Siebboden versehen, 30 × 20 × 4,5 cm, von Wiesauplast, Kunststofftechnik, Deutschland) bis zur Hälfte mit einem GS 90-Substrat (Standardboden, Werkverband E. V., Deutschland) gefüllt. Die Wannen wurden über Nacht mit 0,05% Proplant-Lösung (Chimac-Apriphar, Belgien) gegossen. Samen von Arabidopsis thaliana C24 (Nottingham Arabidopsis Stock Centre, UK; NASC Stock N906) wurden über die Wanne verteilt, und zwar etwa 1000 Samen pro Wanne. Die Wannen wurden mit einer Haube abgedeckt und in der Stratifikationseinheit (8 h, 110 μmol/m²/s^–1, 22°C; 16 h, Dunkelheit, 6°C) untergebracht. Nach 5 Tagen wurden die Wannen in einer Kammer mit kurztaggesteuerter Umgebung (8 h, 130 μmol/m²/s^–1, 22°C; 16 Std., Dunkelheit 20°C) untergebracht, wo sie etwa 10 Tage verblieben, bis sich die ersten echten Blätter gebildet hatten.
Die Keimlinge wurden in Töpfe überführt, die das gleiche Substrat enthielten (Teku Töpfe, 7 cm, LC Serie, hergestellt von Pöppelmann GmbH & Co, Deutschland). Für jeden Topf wurden fünf Pflanzen ausgestochen. Die Töpfe wurden dann in die Kammer mit kurztaggesteuerter Umgebung zurückgestellt, damit die Pflanzen weiter wachsen konnten.
Nach 10 Tagen wurden die Pflanzen in das Gewächshaus (ergänzende Beleuchtung 16 h, 340 μE, 22°C; 8 h, Dunkelheit, 20°C) überführt, wo sie weitere 17 Tage wachsen konnten.
Für die Transformation wurden 6 Wochen alte Arabidopsis-Pflanzen, die gerade zu blühen begonnen hatten, 10 Sekunden lang in die vorstehend beschriebene Agrobakteriensuspension getaucht, die vorher mit 10 μl Silwett 177 (Crompton S. A., Osi Specialties, Schweiz) behandelt worden war. Das entsprechende Verfahren ist in Clough und Bent, 1998 (Clough, JC und Bent, AF. 1998 Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana, Plant J. 16: 735–743) beschrieben.
Die Pflanzen wurden anschließend 18 Stunden lang in einer Feuchtkammer untergebracht. Danach wurden die Töpfe zurück in das Gewächshaus gestellt, damit die Pflanzen weiter wachsen konnten. Die Pflanzen verblieben weitere 10 Wochen im Gewächshaus, bis die Samen erntereif waren.
Je nach dem Resistenzmarker, der zur Selektion der transformierten Pflanzen verwendet wurde, wurden die geernteten Samen im Gewächshaus ausgepflanzt und einer Sprühselektion unterzogen oder ansonsten zuerst sterilisiert und dann auf Agarplatten gezüchtet, die mit dem entsprechenden Selektionsmittel angereichert waren. Da der Vektor das Bar-Gen als Toleranzmarker enthielt, wurden die Jungpflanzen viermal in einem Abstand von 2 bis 3 Tagen mit 0,02% BASTA^® besprüht, und man ließ die transformierten Pflanzen Samen bilden.
Die Samen transgener A. thaliana-Pflanzen wurden in einem Gefrierschrank (bei –20°C) aufbewahrt.
In dem zyklischen Dürre-Assay werden Pflanzen wiederholtem Stress ausgesetzt, ohne dass dieser zur Austrocknung führt. In einem Standardversuch wird Böden als 1:1 (v/v)-Mischung aus nährstoffreichem Boden (GS90, Tantau, Wansdorf, Deutschland) und Quartzsand hergestellt. Töpfe (Durchmesser 6 cm) wurden mit dieser Mischung befüllt und in Wannen gestellt. Die Wannen wurden mit Wasser versetzt, damit die Erdmischung eine angemessene Menge Wasser für das Aussäen (Tag 1) aufnimmt, und anschließend wurden Samen von transgenen A. thaliana-Pflanzen und ihren Wildtypkontrollen in Töpfe gesät. Die gefüllten Wannen wurden dann mit einem transparenten Deckel abgedeckt und in eine vorgekühlte (4°C–5°C) und verdunkelte Wachstumskammer umgestellt. Eine Stratifikation erfolgte für einen Zeitraum von 3 Tagen im Dunkeln bei 4°C–5°C oder alternativ dazu 4 Tage im Dunkeln bei 4°C. Samenkeimen und Wachstum werden bei einer Wachstumsbedingung von 20°C, 60% relative Luftfeuchtigkeit, 16 h-Fotoperiode und Beleuchtung mit Fluoreszenzlicht bei ungefähr 200 μmol/m²s oder alternativ 220 μmol/m2s initiiert. 7–8 Tage nach dem Säen wurden die Hauben entfernt. Eine Selektion mit BASTA erfolgte am 10. oder 11. Tag (9 oder 10 Tage nach dem Säen) durch Besprühen der Töpfe mit den Pflänzchen von oben. In dem Standardversuch wurde eine 0,07%ige (v/v) Lösung von BASTA-Konzentrat (183 g/l Glufosinate-Ammonium) in Leitungswasser einmal oder alternativ dazu eine 0,02%ige (v/v) Lösung von BASTA dreimal versprüht. Die Wildtypkontrollpflanzen werden nur mit Leitungswasser (statt dass sie mit in Leitungswasser gelöstem BASTA besprüht werden) besprüht, jedoch ansonsten identisch behandelt. Die Pflanzen wurden 13–14 Tage nach dem Aussäen dadurch vereinzelt, dass man die überschüssigen Keimlinge entfernte und nur einen Keimling in der Erde beließ. Transgene Events und Wildtypkontrollpflanzen wurden gleichmäßig über die Kammer verteilt.
Die Wasserzufuhr wurde während des ganzen Versuchs limitiert, und die Pflanzen wurden Zyklen von Dürre und erneutem Gießen ausgesetzt. Das Gießen erfolgte am 1. Tag (vor dem Aussäen), 14. Tag oder 15. Tag, 21. Tag oder 22. Tag und schließlich 27. Tag oder 28. Tag. Zum Messen der Biomasseproduktion wurde das Pflanzenfrischgewicht einen Tag nach dem letzten Gießen (28. Tag oder 29. Tag) bestimmt, und zwar dadurch, dass man die Sprosse abschnitt und sie wog. Zusätzlich zu dem Wägen wurde bei Pflanzen, die sich von der Wildtypkontrolle unterscheiden, eine Phänotyp-Information hinzugefügt. Die Pflanzen befanden sich zum Erntezeitpunkt im Vorblütestadium und vor dem Wachstum des Blütenstands. Die Signifikanzwerte für die statistische Signifikanz der Biomasseveränderungen wurden durch Anwendung von Student's t-Test berechnet (Parameter: zweiseitig, ungleiche Varianz).
Drei aufeinanderfolgende Experimente wurden nach einer Standardvorschrift durchgeführt. Beim ersten Experiment wurde ein Individuum jeder transformierten Linie/jedes transformierten Ereignisses getestet.
Beim zweiten Experiment wurden die Ereignisse, die im ersten Experiment als tolerant oder resistent gegenüber zyklischer Dürre bestimmt worden waren, d. h. einen erhöhten Ertrag, in diesem Fall eine erhöhte Biomasseproduktion, verglichen mit dem Wildtyp, zeigten, einem Bestätigungstest nach der gleichen experimentellen Vorgehensweise unterzogen. Bei diesem Experiment wurden max. 10 Pflanzen jedes toleranten oder resistenten Ereignisses wie oben herangezogen, behandelt und gemessen.
In den ersten beiden Experimenten wurden Resistenz oder Toleranz gegenüber zyklischer Dürre und Biomasseproduktion mit Pflanzen von Wildtyp verglichen.
Im dritten Experiment wurden bis zu 20 Replikate jedes bestätigten toleranten Ereignisses, d. h. der, die beim zweiten Experiment als tolerant oder resistent beurteilt worden waren, wie oben herangezogen, behandelt und gemessen. Die Ergenisse davon sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

Tabelle Villa: Biomasseproduktion von transgenen A. thaliana, Entwicklung unter Wachstumsbedingungen mit zyklischer Dürre. Die Biomasseproduktion wurde durch Wägen der Pflanzenrosetten gemessen. Die Biomasseerhöhung wurde als Verhältnis des durchschnittlichen Gewichts von transgenen Pflanzen zu dem durchschnittlichen Gewicht von Wildtypkontrollpflanzen desselben Versuchs berechnet. Die innerhalb der Gruppe von transgenen Events gefundene minimale und maximale Biomasseerhöhung ist für einen Locus angegeben, wobei alle Events einen Signifikanzwert von ≤ 0,1 und eine Biomasseerhöhung von ≥ 10% (Verhältnis ≥ 1,1) aufweisen. Tabelle VIII-A:

SeqID	Ziel	Genort	Zunahme an Biomasse
63	plastidisch	B0312	1,577
623	zytoplasmatisch	B3182	1,200
724	zytoplasmatisch	Yal043c-a	1,570
728	plastidisch	Ybr071w	1,673
732	zytoplasmatisch	Ybr180w	1,381
764	zytoplasmatisch	Ydr284c	1,381
814	zytoplasmatisch	Ydr445c	1,299
818	zytoplasmatisch	Yhr047c	1,320
925	plastidisch	Yhr190w	1,550
1021	zytoplasmatisch	Ykl094w	1,408
1157	zytoplasmatisch	Ykr097w	1,698
1352	zytoplasmatisch	Ynr012w	1,377
1423	plastidisch	Ypl133c	1,500

Beispiel 2
Gentechnische Herstellung von Arabidopsis-Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress durch Überexpression von für Stressproteine kodierenden Genen aus Saccharomyces cereviesae oder E. coli unter Verwendung von stressinduzierbaren und gewebespezifischen Promotoren.
Transgene Arabidopsis-Pflanzen werden wie in Beispiel 1 erzeugt, so dass sie die für das Stressprotein kodierenden Transgene entweder unter der Kontrolle eines gewebespezifischen oder eines stressinduzierbaren Promotors exprimieren. Die Pflanzen der T2-Generation werden erzeugt und in zwei Experimenten mit Dürrestress behandelt. Den Pflanzen wird solange kein Wasser zur Verfügung gestellt, bis Pflanze und Boden ausgetrocknet sind. Die Biomasseproduktion wird bei einem äquivalenten Grad an Dürrestress bestimmt; tolerante Pflanzen produzierten mehr Biomasse als nicht transgene Kontrollpflanzen.
Beispiel 3
Die Überexpression von Stressgenen aus S. cerevisiae oder E. coli führt zu Toleranz von mehrfachen abiotischen Stressfaktoren
Pflanzen, die eine Toleranz für einen abiotischen Stressfaktor aufweisen, zeigen oft eine Toleranz für einen anderen Umweltstressfaktor. Dieses Phänomen der Kreuztoleranz ist auf der Ebene des Mechanismus noch unklar (McKersie und Leshem, 1994). Trotzdem kann man vernünftigerweise erwarten, dass Pflanzen, die aufgrund der Expression eines Transgens eine gesteigerte Toleranz gegenüber niedrigen Temperaturen, z. B. kühlen Temperaturen und/oder Frosttemperaturen, haben, auch eine Toleranz gegenüber Dürre und/oder Salz und/oder anderen abiotischen Stressfaktoren aufweisen könnten. Diese Hypothese wird dadurch gestützt, dass die Expression mehrerer Gene durch mehrere abiotische Stressfaktoren einschließlich Kälte, Salz, Osmotikum, ABA usw., hinauf- oder herunterreguliert wird (z. B. Hong et al. (1992) Developmental and organ-specific expression of an ABA- and stress-induced Protein in barley. Plant Mol Biol 18: 663–674; Jagendorf und Takabe (2001) Inducers of glycinebetaine synthesis in barley. Plant Physiol 127: 1827–1835); Mizoguchi et al. (1996) A gene encoding a mitogen-activated Protein kinase is induced simultaneously with genes for a mitogen-activated Protein kinase and an S6 ribosomal Protein kinase by touch, cold, and water stress in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A 93: 765–769; Zhu (2001) Cell signaling under salt, water and cold stresses. Curr Opin Plant Biol 4: 401–406).
Zur Bestimmung der Salztoleranz werden Samen von Arabidopsis thaliana sterilisiert (100% Bleichmittel, 0,1% Triton X zweimal für fünf Minuten und fünfmaliges Spülen mit ddH₂O). Die Samen wurden auf nicht-selektive Medien (1/2 MS, 0,6% Phytagar, 0,5 g/l MES, 1% Saccharose, 2 μg/ml Benamyl) ausplattiert. Man ließ die Samen etwa 10 Tage lang auskeimen. Im 4-5-Blattstadium wurden transgene Pflanzen in Töpfe mit 5,5 cm Durchmessereingetopft und man ließ sie etwa sieben Tage lang wachsen (22°C, Dauerlicht), wobei nach Bedarf gewässert wurde. Zu Beginn des Assays werden zwei Liter 100 mM NaCl und 1/8 MS zu der Wanne unter den Töpfen zugegeben. Zu der Wanne, die die Kontrollpflanzen enthält, werden drei Liter 1/8 MS hinzugefügt. Die Konzentrationen der NaCl-Anreicherung werden schrittweise alle 4 Tage um 50 mM bis auf 200 mM erhöht. Nach der Salzbehandlung mit 200 mM werden die Frische und das Überleben und die Biomasseproduktion der Pflanzen bestimmt.
Zur Bestimmung der Kältetoleranz werden Samen der transgenen Linien wie oben zur Keimung gebracht und ungefähr 10 Tage lang bis zum 4-5-Blattstadium wachsen gelassen. Die Pflanzen werden dann auf kalte Temperaturen (5°C) umgesetzt und können über die Blüte- und Samensetzungsstadien hinaus wachsen gelassen werden. Die Photosynthese lässt sich unter Verwendung der Chlorophyllfluoreszenz als Indikator für die photosynthetische Leistungsfähigkeit und Integrität der Photosysteme messen. Es werden Überleben und die Biomasseproduktion der Pflanzen als Indikator für den Samenertrag bestimmt.
Pflanzen mit Toleranz gegenüber Salinität und Kälte haben höhere Überlebensraten und eine höhere Biomasseproduktion einschließlich Samenertrag, Photosynthese und Trockenmasseproduktion als empfindliche Pflanzen.
Zur Bestimmung der Dürretoleranz wird dem Sämlingen über einen Zeitraum von bis zu 3 Wochen kein Wasser zukommen gelassen, worauf die Pflanze und der Boden ausgetrocknet sind und Überleben und Biomasseproduktion der Sprosse bestimmt werden. Bei einem gleichen Grad an Dürrestress haben tolerante Pflanzen höhere Überlebensraten und eine höhere Biomasseproduktion einschließlich Samenertrag, Photosynthese und Trockenmasseproduktion als empfindliche Pflanzen.
In dem Assay mit zyklischen Dürrebedingungen werden die Pflanzen wiederholtem Stress ausgesetzt, ohne dass dies zur Austrocknung führt. Die Versorgung mit Wasser ist während des gesamten Experiments eingeschränkt, und die Pflanzen werden Zyklen mit Dürre und erneuter Bewässerung ausgesetzt. Die Bewässerung erfolgt am Tag 1 (vor der Aussaat), am Tag 14 oder Tag 15, am Tag 21 oder Tag 22 und schließlich am Tag 27 oder Tag 28. Zur Messung der Biomasseproduktion wird das Frischgewicht der Pflanzeneinen Tag nach der abschließenden Bewässerung (am Tag 28 oder Tag 29) bestimmt, indem die Sprosse abgeschnitten und gewogen werden. Neben dem Wiegen wird im Fall von Pflanzen, die sich von der Wildtypkontrolle unterscheiden, phänotypische Information hinzugefügt. Die Pflanzen befinden sich bei der Ernte in einem Stadium vor der Blüte und vor dem Wachstum der Infloreszenz. Signifikanzwerte für die statistische Signifikanz der Biomasse-Änderungen werden durch Anwenden des t-Tests nach Student (Parameter: zweiseitige, ungleiche Varianz) berechnet.
Beispiel 4
Gentechnische Herstellung von Luzerne-Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress durch Überexprimieren von Stressgenen aus Saccharomyces cerevisiae oder E. coli
Ein regenerierender Klon von Luzerne (Medicago sativa) wird unter Anwendung der Methode von (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839–847) transformiert. Die Regeneration und Transformation von Alfalfa ist genotypabhängig, und deswegen wird eine regenerierende Pflanze benötigt. Verfahren zum Erhalten von regenerierenden Pflanzen sind beschrieben worden. Sie können zum Beispiel aus dem Kultivar Rangelender (Agriculture Canada) oder anderen im Handel erhältlichen Luzernesorten wie von Brown DCW und A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112) beschrieben ausgewählt werden. Alternativ dazu wählt man die RA3-Sorte (University of Wisconsin) für die Verwendung in der Gewebekultur (Welker et al., 1978 Am J Bot 65: 654–659).
Blattstielexplantate werden gemeinsam mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839–847) oder LBA4404, die einen binären Vektor enthalten, kultiviert. Für die Pflanzentransformation wurden viele verschiedene binäre Vektorsysteme beschrieben (z. B. An, G. in Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology Band 44, S. 47–62, Gartland KMA und MR Davey Hrsg. Humane Press, Totowa, New Jersey). Viele basieren auf dem von Bevan (Nucleic Acid Research. 1984. 12: 8711–8721) beschriebenen Vektor pBIN19, der eine Pflanzengenexpressionskassette, flankiert von der rechten und linken Grenzsequenz aus dem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens, enthält. Eine Pflanzengenexpressionskassette besteht aus mindestens zwei Genen – einem Selektionsmarkergen und einem Pflanzenpromotor, der die Transkription der cDNA oder der genomischen DNA des Merkmalsgens reguliert. Man kann verschiedene Selektionsmarkergene verwenden, darunter das Arabidopsis-Gen, das für ein mutiertes Acetohydroxysäuresynthaseenzym (AHAS-Enzym) kodiert ( US-Patentschriften 57673666 und 6225105 ). In ähnlicher Weise lässt sich mit verschiedenen Promotoren das Merkmalsgen, welches für eine konstitutive, entwicklungsgesteuerte, Geweb-oder Umwelt-Regulation der Gentranskription sorgt, steuern. Im vorliegenden Beispiel wird mit dem 34S-Promotor (GenBank Zugangsnummern M59930 und X16673) für die konstitutive Expression des Merkmalsgens gesorgt.
Die Explantate werden 3 Tage lang im Dunkeln auf SH-Induktionsmedium, das 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4,35 g/l K₂SO₄ und 100 μm Acetosyringinon enthält, gezüchtet. Die Explantate werden in Murashige-Skoog-Medium (Murashige und Skoog, 1962) von halber Stärke gewaschen und auf dem gleichen SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringinon; aber mit einem geeigneten Selektionsmittel und geeignetem Antibiotikum zum Inhibieren des Wachstums von Agrobacterium, ausplattiert. Nach mehreren Wochen werden somatische Embryos auf BOi2Y-Entwicklungsmedium, das keine Wachstumsregulatoren, keine Antibiotika und 50 g/l Saccharose enthält, überführt. Somatische Embryos werden anschließend auf Murashige-Skoog-Medium von halber Stärke keimen gelassen. Bewurzelte Setzlinge werden in Töpfe überführt und in einem Treibhaus wachsen gelassen.
Die transgenen T0-Pflanzen werden durch Augenstecklinge propagiert und in Turface-Wachstumsmedium Wurzeln schlagen gelassen. Die Pflanzen werden entblättert und bis zu einer Höhe von etwa 10 cm (ungefähr 2 Wochen nach dem Entblättern) wachsen gelassen. Die Pflanzen werden dann in zwei Experimenten Dürrestress ausgesetzt.
Für den Assay mit zyklischen Dürrebedingungen werden die Pflanzen wiederholten Stress ausgesetzt, ohne dass dies zur Austrocknung führt. Die Wasserversorgung während des Experiments ist eingeschränkt, und die Pflanzen werden Zyklen von Dürre und einer erneuten Bewässerung ausgesetzt. Bewässert wird an Tag 1 (vor der Aussaat), Tag 14 oder Tag 15, Tag 21 oder Tag 22 und schließlich Tag 27 oder Tag 28. Zum Messen der Biomasseproduktion wird das Pflanzenfrischgewicht einen Tag nach der letzten Bewässerung (Tag 28 oder Tag 29) durch Abschneiden der Sprosse und Wägen derselben ermittelt. Bei einem gleichen Grad an Stress haben tolerante Pflanzen höhere Überlebensraten und eine höhere Biomasseproduktion einschließlich Samenertrag, Photosynthese und Trockenmasseproduktion als empfindliche Pflanzen.
Die Toleranz gegenüber Dürre, Salinität und Kälte wird unter Anwendung der gleichen Verfahren wie in Beispiel 3 beschrieben gemessen. Pflanzen mit Toleranz gegenüber Salinität und Kälte haben höhere Überlebensraten und eine höhere Biomasseproduktion einschließlich Samenertrag, Photosynthese und Trockenmasseproduktion als empfindliche Pflanzen.
Beispiel 5a
Gentechnische Herstellung von Weidelgraspflanzen mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress durch Überexprimieren von Stressgenen aus Saccharomyces cerevisiae oder E. coli
Als Explantatquellen für die Transformation können Samen von verschiedenen Weidelgrassorten, darunter der im Handel erhältliche Kultivars Gunne, von der Saatfirma Svalöf Weibull, oder die Sorte Affinity, verwendet werden. Die Samen werden nacheinander 1 Minute lang mit 1% Tween-20 und 60 Minuten lang mit 100% Bleichmittel oberflächensterilisiert, 3mal jeweils 5 Minuten lang mit deionisiertem und destilliertem H₂O gespült und anschließend 3–4 Tage lang auf feuchtem, sterilem Filterpapier im Dunkeln keimen gelassen. Die Keimlinge werden weiterhin 1 Minute lang mit 1% Tween-20, 5 Minuten mit 75% Bleichmittel, sterilisiert und dreimal mit dd H₂O jeweils 5 Minuten lang gespült.
Die oberflächensterilisierten Samen werden auf das Kallusinduktionsmedium, das Murashige-und-Skoog-Basalsalze und Vitamine, 20 g/l Saccharose, 150 mg/l Asparagin, 500 mg/l Casein-Hydrolysat, 3 g/l Phytagel, 10 mg/l BAP und 5 mg/l Dicamba enthält, gelegt. Die Platten werden 4 Wochen lang im Dunkeln bei 25°C zwecks Samenkeimung und zur Induktion von embryogenem Kallus inkubiert.
Nach 4 Wochen auf dem Kallusinduktionsmedium werden die Sprosse und Wurzeln der Keimlinge abgeschnitten, der Kallus auf frisches Medium umgesetzt, weitere 4 Wochen lang kultiviert und dann 2 Wochen lang auf MSO-Medium ins Licht umgesetzt. Mehrere (11–17 Wochen alte) Kallusstückchen werden entweder durch ein 10-Mesh-Sieb gesiebt und auf Kallusinduktionsmedium gesetzt oder in 100 ml flüssiges Weidelgras-Kallusinduktionsmedium (dasselbe Medium wie für die Kallusinduktion, mit Agar) in einem 250 ml-Kolben kultiviert. Der Kolben wird in Folie eingewickelt und im Dunkeln bei 23°C eine Woche lang bei 175 U/min geschüttelt. Durch Sieben der Flüssigkultur durch ein 40-Mesh-Sieb werden die Zellen gesammelt. Die auf dem Sieb gesammelte Fraktion wird auf festes Weidelgras-Kallusinduktionsmedium ausplattiert und darauf 1 Woche lang im Dunkeln bei 25°C kultiviert. Der Kallus wird dann auf MS-Medium mit 1% Saccharose umgesetzt und darauf 2 Wochen lang kultiviert.
Die Transformation kann entweder mit Agrobacterium oder mit Teilchenbeschussverfahren durchgeführt werden. Es wird ein Expressionsvektor, der einen konstitutiven Pflanzenpromotor und die cDNA des Gens in einem pUC-Vektor enthält, hergestellt. Die Plasmid-DNA wird aus E. coli-Zellen mit Hilfe des Qiagen-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers präpariert. Ungefähr 2 g embryogener Kallus wird in der Mitte eines sterilen Filterpapiers in einer Petrischale verteilt. Ein Aliquot flüssiges MSO mit 10 g/l Saccharose wird auf das Filterpapier gegeben. Goldpartikel (Größe 1,0 μm) werden mit der Plasmid-DNA entsprechend dem Verfahren von Sanford et al., 1993, beschichtet und in den embryogenen Kallus unter Verwendung der folgenden Parameter eingebracht: 500 μg Teilchen und 2 μg DNA je Schuss, 1300 psi und eine Zieldistanz von 8,5 cm von der Stopping-Platte zur Kallus-Platte, sowie 1 Schuss je Kallus-Platte.
Nach dem Beschuss werden die Kalli zurück auf frisches Kallus-Entwicklungsmedium umgesetzt und während eines Zeitraums von 1 Woche im Dunkeln bei Raumtemperatur gehalten. Der Kallus wird dann in Wachstumsbedingungen im Licht bei 25°C umgestellt, so dass die Differenzierung des Embryos mit dem geeigneten Selektionsmittel, z. B. 250 nM Arsenal, 5 mg/l PPT oder 50 mg/l Kanamycin eingeleitet wird. Sprosse, die gegen das Selektionsmittel resistent sind, erscheinen und werden nach der Bewurzelung in Erde umgesetzt.
Proben der primären transgenen Pflanzen (T0) werden mittels PCR analysiert, um die Gegenwart von T-DNA zu bestätigen. Diese Ergebnisse werden durch Southern-Hybridisierung, in welcher DNA einer Elektrophorese auf einem 1%igen Agarosegel unterzogen und auf eine positiv geladene Nylonmembran (Roche Diagnostics) überführt wird, bestätigt. Das PCR DIG Probe Synthesis-Kit (Roche Diagnostics) wird verwendet, um eine Digoxigenin-markierte Sonde durch PCR herzustellen, wobei es gemäß den Empfehlungen des Herstellers angewandt wird.
Transgene TO-Weidelgraspflanzen werden durch Exzision von Bestockungstrieben vegetativ vermehrt. Die transplantierten Bestockungstriebe werden 2 Monate lang im Gewächshaus gehalten, bis sie sich gut entwickelt haben. Die Schosse werden entlaubt und 2 Wochen lang wachsen gelassen.
In dem zyklischen Dürre-Assay werden Pflanzen wiederholtem Stress ausgesetzt, ohne dass dieser zur Austrocknung führt. Die Wasserversorgung während des Experiments ist eingeschränkt, und die Pflanzen werden Zyklen von Dürre und einer erneuten Bewässerung ausgesetzt. Zum Messen der Biomasseproduktion wird das Pflanzenfrischgewicht einen Tag nach der letzten Bewässerung durch Abschneiden der Sprosse und Wägen derselben ermittelt. Bei einem gleichen Grad an Stress haben tolerante Pflanzen höhere Überlebensraten und eine höhere Biomasseproduktion einschließlich Samenertrag, Photosynthese und Trockenmasseproduktion als empfindliche Pflanzen.
Beispiel 5b
Gentechnische Herstellung von Reispflanzen mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress durch Überexprimieren von Stressgenen aus Saccharomyces cerevisiae oder E. coli
Transformation von Reis
Das Agrobacterium, welches den erfindungsgemäßen Expressionsvektor enthält, wird zum Transformieren von Oryza sativa-Pflanzen verwendet. Reife trockene Samen des Reis-Japonica-Kultivars Nipponbare werden einer Enthülsung unterzogen. Die Sterilisierung wird durch Inkubieren während einer Minute in 70% Ethanol, gefolgt von 30 Minuten in 0,2% HgCl₂, gefolgt von sechsmaligem 15-minütigem Waschen mit sterilem destilliertem Wasser, durchgeführt. Die sterilen Samen werden dann auf einem Medium keimen gelassen, welches 2,4-D enthielt (Kallus-Induktionsmedium). Nach vierwöchiger Inkubation im Dunklen werden embryogene, vom Scutellum abgeleitete Kalli herausgeschnitten und auf dem gleichen Medium vermehrt. Nach zwei Wochen werden die Kalli durch Subkultivieren auf dem gleichen Medium weitere 2 Wochen lang vervielfältigt oder vermehrt. Embryogene Kallus-Stücke werden 3 Tage vor der Cokultivierung auf frischem Medium subkultiviert (zur Steigerung der Zellteilungsaktivität).
Der Agrobacterium-Stamm LBA4404, welcher den erfindungsgemäßen Expressionsvektor enthät, wird für die Co-Kultivierung verwendet. Agrobacterium wird auf AB-Medium mit den geeigneten Antibiotika inokuliert und 3 Tage lang bei 28°C kultiviert. Die Bakterien werden dann abgesammelt und in flüssigem Cokultivierungs-Medium zu einer Dichte (OD₆₀₀) von etwa 1 suspendiert. Die Suspension wird dann in eine Petrischale überführt, und die Kalli werden 15 Minuten lang in der Suspension eingetaucht. Die Kallusgewebe werden dann auf einem Filterpapier trocken getupft und auf verfestigtes Cokultivierungs-Medium überführt und 3 Tage lang im Dunklen bei 25°C inkubiert. Cokultivierte Kalli werden auf 2,4-D-enthaltendem Medium 4 Wochen lang im Dunklen bei 28°C in Gegenwart eines Selektionsmittels wachsen gelassen. Während dieser Periode entwickeln sich rasch wachsende, resistente Kallus-Inseln. Nach dem Übertragen dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation bei Licht wird das embryogene Potential freigesetzt, und Sprosse entwickelten sich in den nächsten vier bis fünf Wochen. Die Sprosse werden aus den Kalli herausgeschnitten und 2 bis 3 Wochen lang auf einem auxinhaltigen Medium inkubiert, von welchem sie in den Erdboden überführt wurden. Gehärtete Sprosse werden unter hoher Feuchtigkeit und bei kurzen Tagen in einem Gewächshaus wachsen gelassen.
Ungefähr 35 unabhängige T0-Reis-Transformanten werden für ein Konstrukt erzeugt. Die primären Transformanten werden aus einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus überführt. Nach einer quantitativen PCR-Analyse zur Bestätigung der Kopienzahl des T-DNA-Inserts werden lediglich transgene Einzelkopie-Pflanzen, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel zeigen, für die Ernte von T1-Samen beibehalten. Die Samen werden dann drei bis fünf Monate nach dem Umpflanzen geerntet. Das Verfahren ergab Einzel-Locus-Transformanten bei einer Rate von über 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994).
In dem zyklischen Dürre-Assay werden Pflanzen wiederholtem Stress ausgesetzt, ohne dass dieser zur Austrocknung führt. Die Wasserversorgung während des Experiments ist eingeschränkt, und die Pflanzen werden Zyklen von Dürre und einer erneuten Bewässerung ausgesetzt. Zum Messen der Biomasseproduktion wird das Pflanzenfrischgewicht einen Tag nach der letzten Bewässerung durch Abschneiden der Sprosse und Wägen derselben ermittelt.
Beispiel 6
Gentechnische Herstellung von Sojabohnenpflanzen mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress durch Überexprimieren von Stressgenen aus Saccharomyces cerevisiae oder E. coli
Sojabohne wird entsprechend der folgenden Modifikation des Verfahrens, das im Texas A&M-Patent US 5,164,310 beschrieben ist, transformiert. Mehrere im Handel erhältliche Sojabohnen-Sorten sind der Transformation durch dieses Verfahren zugänglich. Üblicherweise wird die (von der Illinois Seed Foundation erhältliche) Sorte Jack für die Transformation verwendet. Samen werden sterilisiert, indem sie in 70% (v/v) Ethanol für 6 min und in 25%ige handelsübliche Bleiche (NaOCl), die mit 0,1% (v/v) Tween angereichert ist, für 20 min eingetaucht werden, worauf sie 4 Mal mit sterilem doppelt destilliertem Wasser gespült werden. Sieben Tage alte Keimlinge werden vermehrt, indem die Keimwurzel, das Hypokotyl und ein Keimblatt von jedem Keimling entfernt werden. Dann wird das Epikotyl mit einem Keimblatt auf frisches Keimungsmedium in Petrischalen überführt und drei Wochen lang bei 25°C unter einer 16-ständigen Photoperiode (ca. 100 μE-m-2s-1) inkubiert. Die Achselknoten (mit einer Länge von etwa 4 mm) wurden von 3–4 Wochen alten Pflanzen abgeschnitten. Die Achselknoten werden herauspräpariert und in einer Kultur von Agrobacterium LBA4404 inkubiert.
Für die Pflanzentransformation wurden viele verschiedene binäre Vektorsysteme beschrieben (z. B. An, G. in Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology Band 44, S. 47–62, Gartland KMA und MR Davey Hrsg. Humana Press, Totowa, New Jersey). Viele basieren auf dem von Bevan (Nucleic Acid Research. 1984. 12: 8711–8721) beschriebenen Vektor pBIN19, der eine Pflanzengenexpressionskassette, flankiert von der rechten und linken Grenzsequenz aus dem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens, enthält. Eine Pflanzengenexpressionskassette besteht aus mindestens zwei Genen – einem Selektionsmarkergen und einem Pflanzenpromotor, der die Transkription der cDNA oder der genomischen DNA des Merkmalsgens reguliert. Man kann verschiedene Selektionsmarkergene verwenden, darunter das Arabidopsis-Gen, das für ein mutiertes Acetohydroxysäuresynthaseenzym (AHAS-Enzym) kodiert ( US-Patentschriften 57673666 und 6225105 ). In ähnlicher Weise lässt sich mit verschiedenen Promotoren das Merkmalsgen, welches für eine konstitutive, entwicklungsgesteuerte, Gewebe- oder Umwelt-Regulation der Gentranskription sorgt, steuern. Im vorliegenden Beispiel wird mit dem 34S-Promotor (GenBank Zugangsnummern M59930 und X16673) für die konstitutive Expression des Merkmalsgens gesorgt.
Nach der Cokultivierungsbehandlung werden die Explantate gewaschen und auf Selektionsmedien umgesetzt, die mit 500 mg/l Timentin angereichert sind. Die Sprosse werden herauspräpariert und auf Sprossverlängerungsmedium umgesetzt. Sprosse mit mehr als 1 cm Länge werden vor dem Umsetzen auf Boden zwei bis vier Wochen auf Wurzelmedium gesetzt.
Die primären transgenen Pflanzen (T0) werden mittels PCR analysiert, um das Vorliegen der T-DNA zu bestätigen. Diese Ergebnisse werden durch Southern-Hybridisierung verifiziert, wobei die DNA auf einem 1%igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und auf eine positiv geladene Nylon-Membran (Roche Diagnostics) überführt wird. Das PCR DIG Probe Synthesis-Kit (Roche Diagnostics) wird dazu verwendet, eine Digoxigenin-markierte Sonde mittels PCR herzustellen, und wird wie vom Hersteller empfohlen verwendet.
Tolerante Pflanzen haben höhere Samenerträge.
Die Toleranz gegenüber Dürre, Salinität und Kälte wird unter Anwendung der gleichen Verfahren wie in Beispiel 3 beschrieben gemessen. Tolerante Pflanzen haben höhere Überlebensraten und eine höhere Biomasseproduktion einschließlich Samenertrag, Photosynthese und Trockenmasseproduktion als empfindliche Pflanzen.
Beispiel 7
Gentechnische Herstellung von Raps-/Canolapflanzen mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress durch Überexprimieren von Stressgenen aus Saccharomyces cerevisiae oder E. coli
Keimblatt-Blattstiele und Hypokotyle 5 bis 6 Tage alter junger Keimlinge werden als Explantate für die Gewebekultur verwendet und gemäß Babic et al. (1998, Plant Cell Rep 17: 183–188) transformiert. Der im Handel erhältliche Kultivar Westar (Agriculture Canada) ist die für die Transformation verwendete Standardsorte, es können jedoch auch andere Sorten verwendet werden.
Zur Canola-Transormation kann das einen binären Vektor enthaltende Agrobacterium tumefaciens LBA4404 verwendet werden. Für die Pflanzentransformation wurden viele verschiedene binäre Vektorsysteme beschrieben (z. B. An, G. in Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology Band 44, S. 47–62, Gartland KMA und MR Davey Hrsg. Humana Press, Totowa, New Jersey). Viele basieren auf dem von Bevan (Nucleic Acid Research. 1984. 12: 8711–8721) beschriebenen Vektor pBIN19, der eine Pflanzengenexpressionskassette, flankiert von der rechten und linken Grenzsequenz aus dem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens, enthält. Eine Pflanzengenexpressionskassette besteht aus mindestens zwei Genen – einem Selektionsmarkergen und einem Pflanzenpromotor, der die Transkription der cDNA oder der genomischen DNA des Merkmalsgens reguliert. Man kann verschiedene Selektionsmarkergene verwenden, darunter das Arabidopsis-Gen, das für ein mutiertes Acetohydroxysäuresynthaseenzym (AHAS-Enzym) kodiert ( US-Patentschriften 57673666 und 6225105 ). In ähnlicher Weise lässt sich mit verschiedenen Promotoren das Merkmalsgen, welches für eine konstitutive, entwicklungsgesteuerte, Gewebe- oder Umwelt-Regulation der Gentranskription sorgt, steuern. Im vorliegenden Beispiel wird mit dem 34S-Promotor (GenBank Zugangsnummern M59930 und X16673) für die konstitutive Expression des Merkmalsgens gesorgt.
Canolasamen werden 2 Minuten lang in 70%igem Ethanol und dann 10 Minuten in 30%igem Clorox mit einem Tropfen Tween-20 und anschließendem dreimaligem Spülen mit sterilisiertem destilliertem Wasser oberflächensterilisiert. Die Samen werden dann 5 Tage lang in vitro auf MS-Medium mit halber Stärke ohne Hormone, 1% Saccharose, 0,7% Phytagar bei 23°C, 16 h Licht keimen gelassen. Die Keimblattpetiolenexplantate mit den daran befindlichen Keimblättern werden aus den in-vitro-Keimlingen herauspräpariert und dadurch mit Agrobacterium inokuliert, dass man das Schnittende des Petiolenexplantats in die Bakteriensuspension eintaucht. Die Explantate werden dann 2 Tage lang auf MSBAP-3-Medium mit 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0,7% Phytagar bei 23°C, 16 h Licht kultiviert. Nach zweitägiger Cokultur mit Agrobakterium werden die Petiolenexplantate dann 7 Tage lang auf MSBAP-3-Medium mit 3 mg/l BAP, Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin (300 mg/l) umgesetzt und dann auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin und Selektionsmittel so lange kultiviert, bis Sprosse regenerieren. Wenn die Sprosse eine Länge von 5–10 mm erreicht haben, werden sie abgeschnitten und auf Sprosselongationsmedium (MSBAP-0,5, mit 0,5 mg/l BAP) umgesetzt. Sprosse mit einer Länge von ungefähr 2 cm werden zwecks Wurzelinduktion auf das Bewurzelungsmedium (MS0) umgesetzt.
Proben der primären transgenen Pflanzen (T0) werden mittels PCR analysiert, um die Gegenwart von T-DNA zu bestätigen. Diese Ergebnisse werden durch Southern-Hybridisierung, in der DNA einer Elektrophorese auf einem einprozentigen Agarosegel unterzogen und auf eine positiv geladene Nylonmembran (Roche Diagnostics) überführt wird, bestätigt. Das PCR DIG Synthesis Kit (Roche Diagnostics) wird zur Herstellung einer mit Digoxigenin markierten Sonde mittels PCR gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwendet.
Die Toleranz gegenüber Dürre, Salinität und Kälte wird unter Anwendung der gleichen Verfahren wie in Beispiel 3 beschrieben gemessen. Tolerante Pflanzen haben höhere Überlebensraten und eine höhere Biomasseproduktion einschließlich Samenertrag, Photosynthese und Trockenmasseproduktion als empfindliche Pflanzen.
Beispiel 8
Gentechnische Herstellung von Maispflanzen mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress durch Überexprimieren von Stressgenen aus Saccharomyces cerevisiae oder E. coli
Die Transformation von Mais (Zea Mays L.) wird mit einer Modifikation des von Ishida et al. (1996. Nature Biotech 14745–50) beschriebenen Verfahrens durchgeführt. Die Transformation in Mais ist genotypabhängig, und nur spezielle Genotypen sind für eine Transformation und Regeneration geeignet. Die Inzuchtlinie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als einem Elter sind gute Quellen für Donormaterial für die Transformation (Fromm et al. 1990 Biotech 8: 833–839), aber es können auch andere Genotypen erfolgreich verwendet werden. Kolben werden ungefähr 11 Tage nach der Bestäubung (DAP) von Maispflanzen geerntet, wenn die Länge von unreifen Embryos etwa 1 bis 1,2 mm beträgt. Unreife Embryos werden mit Agrobacterium tumefaciens, welche „superbinäre” Vektoren tragen, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Das super-binäre Vektorsystem von Japan Tobacco ist in den WO-Patenten WO94/00977 und WO95/06722 beschrieben. Vektoren wurden wie beschrieben konstruiert. Verschiedene Selektionsmarkergene können verwendet werden, einschließlich des Maisgens, das ein mutiertes Acetohydroxysäure-Synthase-Enzym (AHAS-Enzym) kodiert ( US-Patent 6,025,541 ). In ähnlicher Weise kann mit verschiedenen Promotoren das Merkmalsgen, welches für eine konstitutive, entwicklungsgesteuerte, Gewebe- oder Umwelt-Regulation der Gentranskription sorgt, gesteuert werden. Im vorliegenden Beispiel wurde mit dem 34S-Promotor (GenBank Zugangsnummern M59930 und X16673) für die konstitutive Expression des Merkmalsgens gesorgt.
Herauspräparierte Embryonen werden auf Kallusinduktionsmedium, dann Maisregenerationsmedium, das Imidazolinon als Selektionsmittel enthält, wachsen gelassen. Die Petrischalen werden im Licht 2–3 Wochen lang bei 25°C oder, bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Mais-Wurzelmedium überführt und 2–3 Wochen lang bei 25°C inkubiert, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden in Erde im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen die Imidazolinon-Herbizide aufweisen und in der PCR positiv für die Transgene sind. Die transgenen T1-Pflanzen werden dann auf ihre verbesserte Stresstoleranz untersucht. In dem zyklischen Dürre-Assay werden Pflanzen wiederholtem Stress ausgesetzt, ohne dass dieser zur Austrocknung führt. Die Wasserversorgung während des Experiments ist eingeschränkt, und die Pflanzen werden Zyklen von Dürre und einer erneuten Bewässerung ausgesetzt. Zum Messen der Biomasseproduktion wird das Pflanzenfrischgewicht einen Tag nach der letzten Bewässerung durch Abschneiden der Sprosse und Wägen derselben ermittelt.
Die T1-Generation von Pflanzen mit Insertionen der T-DNA an einem einzigen Locus spaltet für das Transgen in einem Verhältnis von 3:1 auf. Diejenigen Nachkommenschaften, die eine oder zwei Kopien des Transgens enthalten, sind bezüglich des Imidazolinon-Herbizids tolerant und weisen eine gesteigerte Toleranz gegenüber Dürrestress verglichen mit der Nachkommenschaft, die Transgene nicht enthalten, auf. Tolerante Pflanzen haben höhere Überlebensraten und eine höhere Biomasseproduktion einschließlich Samenertrag, Photosynthese und Trockenmasseproduktion als empfindliche Pflanzen. Homozygote T2-Pflanzen wiesen ähnliche Phänotypen auf. Hybridpflanzen (F1-Nachkommenschaft) homozygoter transgener Pflazen und nicht transgener Pflanzen zeigten ebenfalls eine erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress.
Die Toleranz gegenüber Dürre, Salinität und Kälte wird unter Anwendung der gleichen Verfahren wie in Beispiel 3 beschrieben gemessen. Tolerante Pflanzen haben höhere Überlebensraten und eine höhere Biomasseproduktion einschließlich Samenertrag, Photosynthese und Trockenmasseproduktion als empfindliche Pflanzen.
Beispiel 9
Gentechnische Herstellung von Weizenpflanzen mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress durch Überexpression von Stressgenen aus Saccharomyces cerevisiae oder E. coil
Die Transformation von Weizen wird mit Hilfe des Verfahrens durchgeführt, das von Ishida et al. (1996 Nature Biotech. 14745–50) beschrieben wurde. Bei der Transformation wird gewöhnlich das Kultivar Bobwhite (erhältlich von CYMMIT, Mexiko) verwendet. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, welche „superbinäre” Vektoren tragen, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Das superbinäre Vektorsystem von Japan Tobacco ist in den WO-Patenten WO94/00977 und WO95/06722 beschrieben. Vektoren wurden wie beschrieben konstruiert. Verschiedene Selektionsmarkergene können verwendet werden, einschließlich des Maisgens, das ein mutiertes Acetohydroxysäure-Synthase-Enzym (AHAS-Enzym) kodiert ( US-Patent 6,025,541 ). In ähnlicher Weise lässt sich mit verschiedenen Promotoren das Merkmalsgen, welches für eine konstitutive, entwicklungsgesteuerte, Gewebe- oder Umwelt-Regulation der Gentranskription sorgt, steuern. Im vorliegenden Beispiel wurde mit dem 34S-Promotor (GenBank Zugangsnummern M59930 und X16673) für die konstitutive Expression des Merkmalsgens gesorgt.
Nach Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryonen auf Kallusinduktionsmedium, dann Regenerationsmedium mit Imidazolinon als einem Selektionsmittel, herangezogen. Die Petrischalen werden im Licht 2–3 Wochen lang bei 25°C oder, bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Wurzelmedium überführt und 2–3 Wochen lang bei 25°C inkubiert, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden in Erde im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden von Pflanzen, die eine Toleranz gegen die Imidazolinon-Herbizide aufweisen und in der PCR positiv für die Transgene sind, gewonnen.
Die transgenen T1-Pflanzen werden dann nach dem im obigen Beispiel 3 beschriebenen Verfahren auf ihre gesteigerte Stresstoleranz bewertet. Die T1-Generation mit Insertionen der T-DNA an einem einzigen Locus spaltet für das Transgen im Verhältnis 3:1 auf. Diejenigen Nachkommenschaften, die eine oder zwei Kopien des Transgens enthalten, sind bezüglich des Imidazolinon-Herbizids tolerant und weisen eine gesteigerte Toleranz gegenüber Dürrestress verglichen mit der Nachkommenschaft, die Transgene nicht enthalten, auf. Tolerante Pflanzen haben höhere Überlebensraten und eine höhere Biomasseproduktion einschließlich Samenertrag, Photosynthese und Trockenmasseproduktion als empfindliche Pflanzen. Homozygote T2-Pflanzen wiesen ähnliche Phänotypen auf. Toleranz gegenüber Salinität und Kälte werden mit wie in den vorhergehenden Beispielen beschriebenen Methoden gemessen. Tolerante Pflanzen haben höhere Überlebensraten und eine höhere Biomasseproduktion einschließlich Samenertrag, Photosynthese und Trockenmasseproduktion als empfindliche Pflanzen.
Beispiel 10
Identifikation identischer und heterologer Gene
Gensequenzen können dazu verwendet werden, identische oder heterologe Gene aus cDNA- oder genomischen Bibliotheken zu identifizieren. Identische Gene (z. B. Volllängen-cDNA-Klone) können über Nukleinsäurehybridisierung isoliert werden, wobei zum Beispiel cDNA-Bibliotheken eingesetzt werden. Je nach der Häufigkeit des interessierenden Gens werden 100 000 bis zu 1 000 000 rekombinante Bakteriophagen ausplattiert und auf Nylonmembranen übertragen. Nach Denaturierung mit Alkali wird die DNA auf der Membran immobilisiert, z. B. durch UV-Vernetzung. Die Hybridisierung erfolgt unter hochstringenten Bedingungen. In wässriger Lösung werden Hybridisierung und Waschen bei einer Ionenstärke von 1 M NaCl und einer Temperatur von 68°C durchgeführt. Die Hybridisierungssonden werden z. B. durch radioaktive (³²P) Nick-Transkriptionsmarkierung (High Prime, Roche, Mannheim, Deutschland) hergestellt. Die Signale werden durch Autoradiographie ermittelt.
Teilweise identische oder heterologe Gene, die verwandt, aber nicht identisch sein können, können analog zu dem vorstehend beschriebenen Verfahren unter Verwendung von Hybridisierungs- und Waschbedingungen mit niedriger Stringenz identifiziert werden. Für die wässrige Hybridisierung wird die Ionenstärke in der Regel bei 1M NaCl gehalten werden, während die Temperatur nach und nach von 68 auf 42°C gesenkt wird.
Die Isolation von Gensequenzen mit einer Homologie (oder Sequenzidentität/ähnlichkeit) in nur einer bestimmten Domäne (zum Beispiel 10–20 Aminosäuren) kann unter Verwendung synthetischer radioaktiv markierter Oligonukleotidsonden erfolgen. Radioaktiv markierte Oligonukleotide werden durch Phosphorylierung des 5'-Endes zweier komplementärer Oligonukleotide mit T4-Polynukleotidkinase hergestellt. Die komplementären Oligonukleotide werden aneinander hybridisiert und unter Bildung von Konkatemeren ligiert. Die doppelsträngigen Konkatemere werden dann beispielsweise mittels Nick-Transkription radioaktiv markiert. Die Hybridisierung erfolgt gewöhnlich bei niederstringenten Bedingungen mit hohen Oligonukleotidkonzentrationen.
Oligonukleotid-Hybridisierungslösung:
6 × SSC
0,01 M Natriumphosphat
1 mM EDTA (pH 8)
0,5% SDS
100 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA
0,1% fettfreie Trockenmilch
Während der Hybridisierung wird die Temperatur schrittweise bis auf 5–10°C unter die geschätzte T_m des Oligonukleotids oder bis auf Raumtemperatur gesenkt werden, worauf die Waschschritte und die Autoradiographie durchgeführt werden. Das Waschen erfolgt mit niedriger Stringenz, beispielsweise durch 3 Waschschritte mit 4 × SSC. Weitere Einzelheiten werden von Sambrook, J. et al, 1989, „Molecular Cloning: A Laborstory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory Press, oder Ausubel, F. M. et al., 1994, „Current Protocols in Molecular Biology," John Wiley & Sons, beschrieben.
Beispiel 11
Identifikation von identischen Genen durch Screening von Expressionsbibliotheken mit Antikörpern
Man kann cDNA-Klone dazu verwenden, μm rekombinantes Polypeptid zum Beispiel in E. coli herzustellen (z. B. Qiagen QlAexpress pQE-System). Die rekombinanten Polypeptide können dann gewöhnlich über Ni-NTA-Affinitätschromatographie (Qiagen) affinitätsgereinigt werden. Die rekombinanten Polypeptide können dann für die Herstellung spezifischer Antikörper verwendet werden, indem zum Beispiel Standardtechniken für die Immunisierung von Kaninchen eingesetzt werden. Die Antikörper können unter Verwendung einer Ni-NTA-Säule, die mit dem rekombinanten Antigen gesättigt wurde, wie von Gu et al., 1994, BioTechniques 17: 257–262 beschrieben, affinitätsgereinigt werden. Der Antikörper kann dann für das Screening von Expressions-cDNA-Bibliotheken verwendet werden, so dass identische oder heterologe Gene über ein immunologisches Screening identifiziert werden (Sambrook, J. et al., 1989, „Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laborstory Press oder Ausubel, F. M. et al., 1994, „Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons).
Beispiel 12
In-vivo-Mutagenese
Die in-vivo-Mutagenese von Mikroorganismen kann durch Passage von Plasmid-DNA (oder einer anderen Vektor-DNA) durch E. coli oder andere Mikroorganismen (z. B. Bacillus spp. oder Hefen, wie S. cerevisiae) erfolgen, bei denen die Fähigkeiten, die Unversehrtheit ihrer genetischen Information aufrecht zu erhalten, gestört sind. Übliche Mutator-Stämme haben Mutationen in den Genen für das DNA-Reparatursystem (z. B. mutHLS, mutD, mutT usw.; als Literaturstelle siehe Rupp W. D., DNA repair mechanisms, in: E. coli and Salmonella, S. 2277–2294, ASM, 1996, Washington). Solche Stämme können dem Fachmann gut bekannt sein. Die Verwendung solcher Stämme kann zum Beispiel in Greener A. und Callahan M., 1994, Strategies 7: 32–34 veranschaulicht sein. Der Transfer mutierter DNA-Moleküle in Pflanzen kann vorzugsweise nach einer Selektion und nach Testen in Mikroorganismen erfolgen. Transgene Pflanzen können anhand verschiedener Beispiele im Beispielteil dieses Dokuments hergestellt werden.
Beispiel 13
Gentechnische Herstellung von Arabidopsis-Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress durch Überexpression von für Yield-and-Stress-Related-Protein kodierenden Genen zum Beispiel aus Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa unter Verwendung von stressinduzierbaren und gewebespezifischen Promotoren.
Transgene Arabidopsis-Pflanzen, die für Stressprotein kodierende Gene zum Beispiel aus Brassica napus, Glycine max, Zea mays und Oryza sativa überexprimieren, werden wie in Beispiel 1 beschrieben so erzeugt, dass sie die für das Stressprotein kodierenden Transgene unter der Kontrolle entweder eines gewebespezifischen oder eines stressinduzierbaren Promotors exprimieren. Die stressinduzierbare Expression wird unter Verwendung von aus der Liste oben in Tabelle VI ausgewählten Promotoren erzielt.
Pflanzen der T2-Generation werden hergestellt und Stress ausgesetzt. In dem zyklischen Dürre-Assay werden Pflanzen wiederholtem Stress ausgesetzt, ohne dass dieser zur Austrocknung führt. Die Wasserversorgung während des Experiments ist eingeschränkt, und die Pflanzen werden Zyklen von Dürre und einer erneuten Bewässerung ausgesetzt Zum Messen der Biomasseproduktion wird das Pflanzenfrischgewicht einen Tag nach der letzten Bewässerung durch Abschneiden der Sprosse und Wägen derselben ermittelt. Bei einem gleichen Grad an Dürrestress sind tolerante Pflanzen dazu in der Lage, wieder ein normales Wachstum aufzunehmen, und produzierten mehr Biomasse als nicht transgene Kontrollpflanzen.
Tolerante Pflanzen haben höhere Überlebensraten und eine höhere Biomasseproduktion einschließlich Samenertrag, Photosynthese und Trockenmasseproduktion als empfindliche Pflanzen.
Beispiel 14
Überexpression von Yield-and-Stress-Related-Genen zum Beispiel aus Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa verleiht Toleranz gegenüber einer Mehrzahl von abiotischen Stressfaktoren.
Pflanzen, die eine Toleranz für einen abiotischen Stressfaktor aufweisen, zeigen oft eine Toleranz für einen anderen Umweltstressfaktor. Dieses Phänomen der Kreuztoleranz ist auf der Ebene des Mechanismus noch unklar (McKersie und Leshem, 1994). Trotzdem kann man vernünftigerweise erwarten, dass Pflanzen, die aufgrund der Expression eines Transgens eine gesteigerte Toleranz gegenüber zyklischem Dürrestress haben, auch eine Toleranz gegenüber Dürre, Kälte, Salz und anderen abiotischen Stressfaktoren aufweisen könnten. Diese Hypothese wird dadurch gestützt, dass die Expression mehrerer Gene durch mehrere abiotische Stressfaktoren einschließlich Kälte, Dürre, Salz, Osmotikum, ABA usw., hinauf- oder herunterreguliert wird (z. B. Hong et al. (1992) Developmental and Organ-specific expression of an ABA- and stress-induced Protein in barley. Plant Mol Biol 18: 663–674; Jagendorf und Takabe (2001) Inducers of glycinebetaine synthesis in barley. Plant Physiol 127: 1827–1835); Mizoguchi et al. (1996) A gene encoding a mitogen-activated Protein kinase is induced simultaneously with genes for a mitogen-activated Protein kinase and an S6 ribosomal Protein kinase by touch, cold, and water stress in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A 93: 765–769; Zhu (2001) Cell signaling under salt, water and cold stresses. Curr Opin Plant Biol 4: 401–406).
Transgene Arabidopsis-Pflanzen, die für Stressprotein kodierende Gene zum Beispiel aus Brassica napus, Glycine max, Zea mays und Oryza sativa überexprimieren, werden wie in Beispiel 1 beschrieben erzeugt und auf Stresstoleranz getestet.
In dem Assay mit zyklischen Dürrebedingungen werden die Pflanzen wiederholtem Stress ausgesetzt, ohne dass dies zur Austrocknung führt. Die Versorgung mit Wasser ist während des gesamten Experiments eingeschränkt, und die Pflanzen werden Zyklen mit Dürre und erneuter Bewässerung ausgesetzt. Zur Messung der Biomasseproduktion wird das Frischgewicht der Pflanzen einen Tag nach der abschließenden Bewässerung bestimmt, indem die Sprosse abgeschnitten und gewogen werden.
Zur Bestimmung der Salztoleranz werden Samen von Arabidopsis thaliana sterilisiert (inkubiert mit 100% Bleichmittel, 0,1% Triton × 100 für fünf Minuten (zweimal) und fünfmal gespült mit ddH₂O). Die Samen wurden auf nicht-selektive Medien (1/2 MS, 0,6% Phytagar, 0,5 g/l MES, 1% Saccharose, 2 μg/ml Benamyl) ausplattiert. Man ließ die Samen etwa 10 Tage lang auskeimen. Im 4-5-Blattstadium wurden transgene Pflanzen in Töpfe mit 5,5 cm Durchmesser eingetopft und man ließ sie etwa sieben Tage lang wachsen (22°C, Dauerlicht), wobei nach Bedarf gewässert wurde. Zu Beginn des Assays werden zwei Liter 100 mM NaCl und 1/8 MS zu der Wanne unter den Töpfen zugegeben. Zu der Wanne, die die Kontrollpflanzen enthält, werden drei Liter 1/8 MS hinzugefügt. Die Konzentrationen der NaCl-Anreicherung werden schrittweise alle 4 Tage um 50 mM bis auf 200 mM erhöht. Nach der Salzbehandlung mit 200 mM werden Frisch- und Trockengewicht der Pflanzen sowie die Samenerträge bestimmt. Transgene Pflanzen, die für Stressprotein kodierende Gene zum Beispiel aus Brassica napus, Glycine max, Zea mays und Oryza sativa überexprimieren, zeigen höhere Frisch – und Trockengewichte und einen höheren Samenertrag als Pflanzen vom Wildtyp oder scheintransformierte Pflanzen.
Zur Bestimmung der Kältetoleranz werden Samen der transgenen und Kälte-Linien zur Keimung gebracht und ungefähr 10 Tage lang bis zum 4-5-Blattstadium wachsen gelassen. Die Pflanzen werden dann auf kalte Temperaturen (5°C) umgesetzt. Die Photosynthese lässt sich unter Verwendung der Chlorophyllfluoreszenz als Indikator für die photosynthetische Leistungsfähigkeit und Integrität der Photosysteme messen. Es werden Samenertrag und Trockengewicht der Pflanzen als Indikator für die Biomasseproduktion der Pflanzen bestimmt.
Man findet, dass die Überexpression von Stressgenen zum Beispiel aus Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa Toleranz gegenüber zyklischer Dürre, Salz und Kälte sowie gegenüber Dürre verlieh. Tolerante Pflanzen haben höhere Überlebensraten und eine höhere Biomasseproduktion einschließlich Samenertrag, Photosynthese und Trockenmasseproduktion als empfindliche Pflanzen.
Beispiel 15
Gentechnische Herstellung von Luzernepflanzen mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress durch Überexpression von Yield-and-Stress-Related-Genen zum Beispiel aus Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa
Ein regenerierender Klon von Luzerne (Medicago sativa) wird unter Anwendung der Methode von McKersie et al., (1999 Plant Physiol 119: 839–847) transformiert. Die Regeneration und Transformation von Alfalfa ist genotypabhängig, und deswegen wird eine regenerierende Pflanze benötigt. Verfahren zum Erhalten von regenerierenden Pflanzen sind beschrieben worden. Sie können zum Beispiel aus dem Kultivar Rangelander (Agriculture Canada) oder anderen im Handel erhältlichen Luzernesorten wie von Brown und Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112) beschrieben ausgewählt werden. Alternativ dazu wählt man die RA3-Sorte (University of Wisconsin) für die Verwendung in der Gewebekultur (Walker et al., 1978 Am J Bot 65: 654–659).
Blattstielexplantate werden gemeinsam mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839–847) oder LBA4404, die einen binären Vektor enthalten, kultiviert. Für die Pflanzentransformation wurden viele verschiedene binäre Vektorsysteme beschrieben (z. B. An, G. in Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology Band 44, S. 47–62, Gartland KMA und MR Davey Hrsg. Humana Press, Totowa, New Jersey). Viele basieren auf dem von Bevan (Nucleic Acid Research. 1984. 12: 8711–8721) beschriebenen Vektor pBIN19, der eine Pflanzengenexpressionskassette, flankiert von der rechten und linken Grenzsequenz aus dem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens, enthält. Eine Pflanzengenexpressionskassette besteht aus mindestens zwei Genen – einem Selektionsmarkergen und einem Pflanzenpromotor, der die Transkription der cDNA oder der genomischen DNA des Merkmalsgens reguliert. Man kann verschiedene Selektionsmarkergene verwenden, darunter das Arabidopsis-Gen, das für ein mutiertes Acetohydroxysäuresynthaseenzym (AHAS-Enzym) kodiert ( US-Patentschriften 57673666 und 6225105 ). In ähnlicher Weise lässt sich mit verschiedenen Promotoren das Merkmalsgen, welches für eine konstitutive, entwicklungsgesteuerte, Gewebe- oder Umwelt-Regulation der Gentranskription sorgt, steuern. Im vorliegenden Beispiel wird mit dem 34S-Promotor (GenBank Zugangsnummern M59930 und X16673) für die konstitutive Expression des Merkmalsgens gesorgt.
Die Explantate werden 3 Tage lang im Dunkeln auf SH-Induktionsmedium, das 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4,35 g/l K₂SO₄ und 100 μm Acetosyringinon enthält, gezüchtet. Die Explantate werden in Murashige-Skoog-Medium (Murashige und Skoog, 1962) von halber Stärke gewaschen und auf dem gleichen SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringinon, aber mit einem geeigneten Selektionsmittel und geeignetem Antibiotikum zum Inhibieren des Wachstums von Agrobacterium, ausplattiert. Nach mehreren Wochen werden somatische Embryos auf BOi2Y-Entwicklungsmedium, das keine Wachstumsregulatoren, keine Antibiotika und 50 g/l Saccharose enthält, überführt. Somatische Embryos werden anschließend auf Murashige-Skoog-Medium von halber Stärke keimen gelassen. Bewurzelte Setzlinge werden in Töpfe überführt und in einem Treibhaus wachsen gelassen.
Die transgenen T0-Pflanzen werden durch Augenstecklinge propagiert und in Turface-Wachstumsmedium Wurzeln schlagen gelassen. Die Pflanzen werden entblättert und bis zu einer Höhe von etwa 10 cm (ungefähr 2 Wochen nach dem Entblättern) wachsen gelassen. Die Pflanzen werden dann in zwei Experimenten Dürrestress ausgesetzt.
In dem zyklischen Dürre-Assay werden Pflanzen wiederholtem Stress ausgesetzt, ohne dass dieser zur Austrocknung führt. Die Wasserversorgung während des Experiments ist eingeschränkt, und die Pflanzen werden Zyklen von Dürre und einer erneuten Bewässerung ausgesetzt. Zum Messen der Biomasseproduktion wird das Pflanzenfrischgewicht einen Tag nach der letzten Bewässerung durch Abschneiden der Sprosse und Wägen derselben ermittelt. Bei einem gleichen Grad an Dürrestress sind die toleranten Pflanzen dazu in der Lage, normal zu wachsen, während empfindliche Pflanzen vom Wildtyp abgestorben sind oder eine signifikante Schädigung erlitten haben, was weniger Trockenmasse zur Folge hat.
Die Toleranz gegenüber Salinität und Kälte wird unter Anwendung der gleichen Verfahren wie in Beispiel 3 beschrieben gemessen. Man findet, dass Luzernepflanzen, die Stressgene zum Beispiel aus Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa überexprimieren, resistenter gegenüber Salinität und Kältestress sind als nicht transgene Kontrollpflanzen. Tolerante Pflanzen haben höhere Überlebensraten und eine höhere Biomasseproduktion einschließlich Samenertrag, Photosynthese und Trockenmasseproduktion als empfindliche Pflanzen.
Beispiel 16a
Gentechnische Herstellung von Weidelgraspflanzen mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress durch Überexpression von Yield-and-Stress-Related-Genen zum Beispiel aus Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa
Als Explantatquellen für die Transformation können Samen von verschiedenen Weidelgrassorten, darunter der im Handel erhältlichen Sorte Gunne, von der Saatfirma Svalöf Weibull, oder die Sorte Affinity, verwendet werden. Die Samen werden nacheinander 1 Minute lang mit 1% Tween-20 und 60 Minuten lang mit 100% Bleichmittel oberflächensterilisiert, 3mal jeweils 5 Minuten lang mit deionisiertem und destilliertem H₂O gespült und anschließend 3–4 Tage lang auf feuchtem, sterilem Filterpapier im Dunkeln keimen gelassen. Die Keimlinge werden weiterhin 1 Minute lang mit 1% Tween-20, 5 Minuten mit 75% Bleichmittel, sterilisiert und dreimal mit dd H₂O jeweils 5 Minuten lang gespült.
Die oberflächensterilisierten Samen werden auf das Kallusinduktionsmedium, das Murashige-und-Skoog-Basalsalze und Vitamine, 20 g/l Saccharose, 150 mg/l Asparagin, 500 mg/l Casein-Hydrolysat, 3 g/l Phytagel, 10 mg/l BAP und 5 mg/l Dicamba enthält, gelegt. Die Platten werden 4 Wochen lang im Dunkeln bei 25°C zwecks Samenkeimung und zur Induktion von embryogenem Kallus inkubiert.
Nach 4 Wochen auf dem Kallusinduktionsmedium werden die Sprosse und Wurzeln der Keimlinge abgeschnitten, der Kallus auf frisches Medium umgesetzt, weitere 4 Wochen lang kultiviert und dann 2 Wochen lang auf MSO-Medium ins Licht umgesetzt. Mehrere (11–17 Wochen alte) Kallusstückchen werden entweder durch ein 10-Mesh-Sieb gesiebt und auf Kallusinduktionsmedium gesetzt oder in 100 ml flüssiges Weidelgras-Kallusinduktionsmedium (dasselbe Medium wie für die Kallusinduktion, mit Agar) in einem 250 ml-Kolben kultiviert. Der Kolben wird in Folie eingewickelt und im Dunkeln bei 23°C eine Woche lang bei 175 U/min geschüttelt. Durch Sieben der Flüssigkultur durch ein 40-Mesh-Sieb werden die Zellen gesammelt. Die auf dem Sieb gesammelte Fraktion wird auf festes Weidelgras-Kallusinduktionsmedium ausplattiert und darauf 1 Woche lang im Dunkeln bei 25°C kultiviert. Der Kallus wird dann auf MS-Medium mit 1% Saccharose umgesetzt und darauf 2 Wochen lang kultiviert.
Die Transformation kann entweder mit Agrobacterium oder mit Teilchenbeschussverfahren durchgeführt werden. Es wird ein Expressionsvektor, der einen konstitutiven Pflanzenpromotor und die cDNA des Gens in einem pUC-Vektor enthält, hergestellt. Die Plasmid-DNA wird aus E. coli-Zellen mit Hilfe des Qiagen-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers präpariert. Ungefähr 2 g embryogener Kallus wird in der Mitte eines sterilen Filterpapiers in einer Petrischale verteilt. Ein Aliquot flüssiges MSO mit 10 g/l Saccharose wird auf das Filterpapier gegeben. Goldpartikel (Größe 1,0 μm) werden mit der Plasmid-DNA entsprechend dem Verfahren von Sanford et al., 1993, beschichtet und in den embryogenen Kallus unter Verwendung der folgenden Parameter eingebracht: 500 μg Teilchen und 2 μg DNA je Schuss, 1300 psi und eine Zieldistanz von 8,5 cm von der Stopping-Platte zur Kallus-Platte, sowie 1 Schuss je Kallus-Platte.
Nach dem Beschuss werden die Kalli zurück auf frisches Kallus-Entwicklungsmedium umgesetzt und während eines Zeitraums von 1 Woche im Dunkeln bei Raumtemperatur gehalten. Der Kallus wird dann in Wachstumsbedingungen im Licht bei 25°C umgestellt, so dass die Differenzierung des Embryos mit dem geeigneten Selektionsmittel, z. B. 250 nM Arsenal, 5 mg/l PPT oder 50 mg/l Kanamycin eingeleitet wird. Sprosse, die gegen das Selektionsmittel resistent sind, erscheinen und werden nach der Bewurzelung in Erde umgesetzt.
Proben der primären transgenen Pflanzen (T0) werden mittels PCR analysiert, um die Gegenwart von T-DNA zu bestätigen. Diese Ergebnisse werden durch Southern-Hybridisierung, in welcher DNA einer Elektrophorese auf einem 1%igen Agarosegel unterzogen und auf eine positiv geladene Nylonmembran (Roche Diagnostics) überführt wird, bestätigt. Das PCR DIG Probe Synthesis-Kit (Roche Diagnostics) wird verwendet, um eine Digoxigenin-markierte Sonde durch PCR herzustellen, wobei es gemäß den Empfehlungen des Herstellers angewandt wird.
Transgene T0-Weidelgraspflanzen werden durch Exzision von Bestockungstrieben vegetativ vermehrt. Die transplantierten Bestockungstriebe werden 2 Monate lang im Gewächshaus gehalten, bis sie sich gut entwickelt haben. Die Schosse werden entlaubt und 2 Wochen lang wachsen gelassen.
In dem zyklischen Dürre-Assay werden Pflanzen wiederholtem Stress ausgesetzt, ohne dass dieser zur Austrocknung führt. Die Wasserversorgung während des Experiments ist eingeschränkt, und die Pflanzen werden Zyklen von Dürre und einer erneuten Bewässerung ausgesetzt. Zum Messen der Biomasseproduktion wird das Pflanzenfrischgewicht einen Tag nach der letzten Bewässerung durch Abschneiden der Sprosse und Wägen derselben ermittelt. Bei einem gleichen Grad an Dürrestress sind tolerante Pflanzen dazu in der Lage, wieder ein normales Wachstum aufzunehmen, während empfindliche Pflanzen abgestorben sind oder eine signifikante Schädigung erlitten haben, was kürzere Blätter und weniger Trockenmasse zur Folge hat.
Bei einem zweiten Experiment, bei dem die transgenen Pflanzen Dürrestress ausgesetzt wurden, wurde wie in den vorherigen Beispielen beschrieben mit einer Lösung von PEG behandelt. Die Toleranz gegenüber Salinität und Kälte wird unter Anwendung der gleichen Verfahren wie in Beispiel 3 beschrieben gemessen. Man findet, dass Weidelgrasspflanzen, die Stressgene zum Beispiel aus Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa überexprimieren, resistenter gegenüber Salinität und Kältestress sind als nicht transgene Kontrollpflanzen. Tolerante Pflanzen haben höhere Überlebensraten und eine höhere Biomasseproduktion einschließlich Samenertrag, Photosynthese und Trockenmasseproduktion als empfindliche Pflanzen.
Beispiel 16b
Gentechnische Herstellung von Reispflanzen mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress durch Überexpression von Yield-and-Stress-Related-Genen zum Beispiel aus Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa
Transformation von Reis
Das Agrobacterium, welches den erfindungsgemäßen Expressionsvektor enthält, wird zum Transformieren von Oryza sativa-Pflanzen verwendet. Reife trockene Samen des Reis-Japonica-Kultivars Nipponbare werden einer Enthülsung unterzogen. Die Sterilisierung wird durch Inkubieren während einer Minute in 70% Ethanol, gefolgt von 30 Minuten in 0,2% HgCl₂, gefolgt von sechsmaligem 15-minütigem Waschen mit sterilem destilliertem Wasser, durchgeführt. Die sterilen Samen werden dann auf einem Medium keimen gelassen, welches 2,4-D enthielt (Kallus-Induktionsmedium). Nach vierwöchiger Inkubation im Dunklen werden embryogene, vom Scutellum abgeleitete Kalli herausgeschnitten und auf dem gleichen Medium vermehrt. Nach zwei Wochen werden die Kalli durch Subkultivieren auf dem gleichen Medium weitere 2 Wochen lang vervielfältigt oder vermehrt. Embryogene Kallus-Stücke werden 3 Tage vor der Cokultivierung auf frischem Medium subkultiviert (zur Steigerung der Zellteilungsaktivität).
Der Agrobacterium-Stamm LBA4404, welcher den erfindungsgemäßen Expressionsvektor enthät, wird für die Cokultivierung verwendet. Agrobacterium wird auf AB-Medium mit den geeigneten Antibiotika inokuliert und 3 Tage lang bei 28°C kultiviert. Die Bakterien werden dann abgesammelt und in flüssigem Cokultivierungs-Medium zu einer Dichte (0D₆₀₀) von etwa 1 suspendiert. Die Suspension wird dann in eine Petrischale überführt, und die Kalli werden 15 Minuten lang in der Suspension eingetaucht. Die Kallusgewebe werden dann auf einem Filterpapier trocken getupft und auf verfestigtes Cokultivierungs-Medium überführt und 3 Tage lang im Dunklen bei 25°C inkubiert. Cokultivierte Kalli werden auf 2,4-D-enthaltendem Medium 4 Wochen lang im Dunklen bei 28°C in Gegenwart eines Selektionsmittels wachsen gelassen. Während dieser Periode entwickeln sich rasch wachsende, resistente Kallus-Inseln. Nach dem Übertragen dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation bei Licht wird das embryogene Potential freigesetzt, und Sprosse entwickelten sich in den nächsten vier bis fünf Wochen. Die Sprosse werden aus den Kalli herausgeschnitten und 2 bis 3 Wochen lang auf einem auxinhaltigen Medium inkubiert, von welchem sie in den Erdboden überführt wurden. Gehärtete Sprosse werden unter hoher Feuchtigkeit und bei kurzen Tagen in einem Gewächshaus wachsen gelassen.
Ungefähr 35 unabhängige T0-Reis-Transformanten werden für ein Konstrukt erzeugt. Die primären Transformanten werden aus einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus überführt. Nach einer quantitativen PCR-Analyse zur Bestätigung der Kopienzahl des T-DNA-Inserts werden lediglich transgene Einzelkopie-Pflanzen, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel zeigen, für die Ernte von T1-Samen beibehalten. Die Samen werden dann drei bis fünf Monate nach dem Umpflanzen geerntet. Das Verfahren ergab Einzel-Locus-Transformanten bei einer Rate von über 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994).
In dem zyklischen Dürre-Assay werden Pflanzen wiederholtem Stress ausgesetzt, ohne dass dieser zur Austrocknung führt. Die Wasserversorgung während des Experiments ist eingeschränkt, und die Pflanzen werden Zyklen von Dürre und einer erneuten Bewässerung ausgesetzt. Zum Messen der Biomasseproduktion wird das Pflanzenfrischgewicht einen Tag nach der letzten Bewässerung durch Abschneiden der Sprosse und Wägen derselben ermittelt. Bei einem gleichen Grad an Dürrestress sind tolerante Pflanzen dazu in der Lage, wieder ein normales Wachstum aufzunehmen, während empfindliche Pflanzen abgestorben sind oder eine signifikante Schädigung erlitten haben, was kürzere Blätter und weniger Trockenmasse zur Folge hat.
Beispiel 17
Gentechnische Herstellung von Sojabohnenpflanzen mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress durch Überexpression von Yield-and-Stress-Related-Genen zum Beispiel aus Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa
Sojabohne wird entsprechend der folgenden Modifikation des Verfahrens, das im Texas A&M-Patent US 5,164,310 beschrieben ist, transformiert. Mehrere im Handel erhältliche Sojabohnen-Sorten sind der Transformation durch dieses Verfahren zugänglich. Üblicherweise wird die (von der Illinois Seed Foundation erhältliche) Sorte Jack für die Transformation verwendet. Samen werden sterilisiert, indem sie in 70% (v/v) Ethanol für 6 min und in 25%ige handelsübliche Bleiche (NaOCl), die mit 0,1% (v/v) Tween angereichert ist, für 20 min eingetaucht werden, worauf sie 4 Mal mit sterilem doppelt destilliertem Wasser gespült werden. Sieben Tage alte Keimlinge werden vermehrt, indem die Keimwurzel, das Hypokotyl und ein Keimblatt von jedem Keimling entfernt werden. Dann wird das Epikotyl mit einem Keimblatt auf frisches Keimungsmedium in Petrischalen überführt und drei Wochen lang bei 25°C unter einer 16-ständigen Photoperiode (ca. 100 μE-m-2s-1) inkubiert. Die Achselknoten (mit einer Länge von etwa 4 mm) wurden von 3–4 Wochen alten Pflanzen abgeschnitten. Die Achselknoten werden herauspräpariert und in einer Kultur von Agrobacterium LBA4404 inkubiert.
Für die Pflanzentransformation wurden viele verschiedene binäre Vektorsysteme beschrieben (z. B. An, G. in Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology Band 44, S. 47–62, Gartland KMA und MR Davey Hrsg. Humana Press, Totowa, New Jersey). Viele basieren auf dem von Bevan (Nucleic Acid Research. 1984. 12: 8711–8721) beschriebenen Vektor pBIN19, der eine Pflanzengenexpressionskassette, flankiert von der rechten und linken Grenzsequenz aus dem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens, enthält. Eine Pflanzengenexpressionskassette besteht aus mindestens zwei Genen – einem Selektionsmarkergen und einem Pflanzenpromotor, der die Transkription der cDNA oder der genomischen DNA des Merkmalsgens reguliert. Man kann verschiedene Selektionsmarkergene verwenden, darunter das Arabidopsis-Gen, das für ein mutiertes Acetohydroxysäuresynthaseenzym (AHAS-Enzym) kodiert ( US-Patentschriften 57673666 und 6225105 ). In ähnlicher Weise lässt sich mit verschiedenen Promotoren das Merkmalsgen, welches für eine konstitutive, entwicklungsgesteuerte, Gewebe- oder Umwelt-Regulation der Gentranskription sorgt, steuern. Im vorliegenden Beispiel wird mit dem 34S-Promotor (GenBank Zugangsnummern M59930 und X16673) für die konstitutive Expression des Merkmalsgens gesorgt.
Nach der Cokultivierungsbehandlung werden die Explantate gewaschen und auf Selektionsmedien umgesetzt, die mit 500 mg/l Timentin angereichert sind. Die Sprosse werden herauspräpariert und auf Sprossverlängerungsmedium umgesetzt. Sprosse mit mehr als 1 cm Länge werden vor dem Umsetzen auf Boden zwei bis vier Wochen auf Wurzelmedium gesetzt.
Die primären transgenen Pflanzen (T0) werden mittels PCR analysiert, um das Vorliegen der T-DNA zu bestätigen. Diese Ergebnisse werden durch Southern-Hybridisierung verifiziert, wobei die DNA auf einem 1%igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und auf eine positiv geladene Nylon-Membran (Roche Diagnostics) überführt wird. Das PCR DIG Probe Synthesis-Kit (Roche Diagnostics) wird dazu verwendet, eine Digoxigenin-markierte Sonde mittels PCR herzustellen, und wird wie vom Hersteller empfohlen verwendet.
In dem zyklischen Dürre-Assay werden Pflanzen wiederholtem Stress ausgesetzt, ohne dass dieser zur Austrocknung führt. Die Wasserversorgung während des Experiments ist eingeschränkt, und die Pflanzen werden Zyklen von Dürre und einer erneuten Bewässerung ausgesetzt Zum Messen der Biomasseproduktion wird das Pflanzenfrischgewicht einen Tag nach der letzten Bewässerung durch Abschneiden der Sprosse und Wägen derselben ermittelt. Bei einem gleichen Grad an Dürrestress sind tolerante Pflanzen dazu in der Lage, wieder ein normales Wachstum aufzunehmen, während empfindliche Pflanzen abgestorben sind oder eine signifikante Schädigung erlitten haben, was kürzere Blätter und weniger Trockenmasse zur Folge hat.
Stresstolerante Sojabohnenpflanzen, die Stressgene zum Beispiel aus Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa überexprimieren, haben höhere Samenerträge.
Die Toleranz gegenüber Dürre, Salinität und Kälte wird unter Anwendung der gleichen Verfahren wie in Beispiel 3 beschrieben gemessen. Tolerante Pflanzen haben höhere Überlebensraten und eine höhere Biomasseproduktion einschließlich Samenertrag, Photosynthese und Trockenmasseproduktion als empfindliche Pflanzen.
Beispiel 18
Gentechnische Herstellung von Raps/Canola-Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress durch Überexpression von Yield-and-Stress-Related-Genen zum Beispiel aus Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa
Keimblattpetiolen und Hypokotyle von 5–6 Tage alten jungen Keimpflanzen werden als Explantate für die Gewebekultur verwendet und gemäß Babic et al. (Plant Cell Rep 17, 183 (1998)) transformiert. Der im Handel erhältliche Kultivar Westar (Agriculture Canada) ist die für die Transformation verwendete Standardsorte, es können jedoch andere Sorten verwendet werden.
Agrobakterium tumefaciens LBA4404, das einen binären Vektor enthält, wird für die Transformation von Canola verwendet. Für die Transformation von Pflanzen sind viele unterschiedliche binäre Vektorsysteme beschrieben worden (z. B. An, G., in Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology Band. 44, S. 47–62, Gartland K. M. A. und Davey M. R. Hrsg. Humana Press, Totowa, New Jersey). Viele beruhen auf dem von Bevan (Nucleic Acid Research. 12, 8711–8721 (1984)) beschriebenen Vektor pBIN19, der eine Pflanzengenexpressionskassette, flankiert von der rechten und linken Grenzsequenz aus dem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens, enthält. Eine Pflanzengenexpressionskassette besteht aus mindestens zwei Genen – einem Selektionsmaarkergen und einem Pflanzenpromotor, der die Transkription der cDNA oder der genomischen DNA des Merkmalsgens reguliert. Man kann verschiedene Selektionsmarkergene verwenden, darunter das Arabidopsis-Gen, das für ein mutiertes Acetohydroxysäuresynthaseenzym (AHAS-Enzym) kodiert ( US-Patentschriften 57673666 und 6225105 ). In ähnlicher Weise lässt sich mit verschiedenen Promotoren das Merkmalsgen, welches für eine konstitutive, entwicklungsgesteuerte, Gewebe- oder Umwelt-Regulation der Gentranskription sorgt, steuern. Im vorliegenden Beispiel wird mit dem 34S-Promotor (GenBank Zugangsnummern M59930 und X16673) für die konstitutive Expression des Merkmalsgens gesorgt.
Canolasamen werden 2 Minuten in 70%igem Ethanol und dann 10 Minuten in 30%igem Clorox mit einem Tropfen Tween-20 und anschließendem dreimaligem Spülen mit sterilisiertem destilliertem Wasser oberflächensterilisiert. Die Samen werden dann 5 Tage lang in vitro auf MS-Medium mit halber Stärke ohne Hormone, 1% Saccharose, 0,7% Phytagar bei 23°C, 16 h Licht keimen gelassen. Die Keimblattpetiolenexplantate mit den daran befindlichen Keimblättern werden aus den in-vitro-Keimlingen herauspräpariert und dadurch mit Agrobakterium inokuliert, dass man das Schnittende des Petiolenexplantats in die Bakteriensuspension eintaucht. Die Explantate werden dann 2 Tage lang auf MSBAP-3-Medium mit 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0,7% Phytagar bei 23°C, 16 h Licht kultiviert. Nach zweitägiger Cokultur mit Agrobakterium werden die Petiolenexplantate dann 7 Tage lang auf MSBAP-3-Medium mit 3 mg/l BAP, Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin (300 mg/l) umgesetzt und dann auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin und Selektionsmittel so lange kultiviert, bis Sprosse regenerieren. Wenn die Sprosse 5–10 mm lang sind, können sie abgeschnitten und auf Sprosselongationsmedium (MSBAP-0,5, mit 0,5 mg/l BAP) umgesetzt werden. Sprosse mit einer Länge von ungefähr 2 cm werden zwecks Wurzelinduktion auf das Bewurzelungsmedium (MSO) umgesetzt.
Proben der primären transgenen Pflanzen (T0) werden mittels PCR analysiert, um die Gegenwart von T-DNA zu bestätigen. Diese Ergebnisse werden durch Southern-Hybridisierung, in der DNA einer Elektrophorese auf einem einprozentigen Agarosegel unterzogen und auf eine positiv geladene Nylonmembran (Roche Diagnostics) überführt wird, bestätigt. Das PCR DIG Synthesis Kit (Roche Diagnostics) wird zur Herstellung einer mit Digoxigenin markierten Sonde mittels PCR gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwendet.
In dem zyklischen Dürre-Assay werden Pflanzen wiederholtem Stress ausgesetzt, ohne dass dieser zur Austrocknung führt. Die Wasserversorgung während des Experiments ist eingeschränkt, und die Pflanzen werden Zyklen von Dürre und einer erneuten Bewässerung ausgesetzt. Zum Messen der Biomasseproduktion wird das Pflanzenfrischgewicht einen Tag nach der letzten Bewässerung durch Abschneiden der Sprosse und Wägen derselben ermittelt. Bei einem gleichen Grad an Dürrestress sind tolerante Pflanzen dazu in der Lage, wieder ein normales Wachstum aufzunehmen, während empfindliche Pflanzen abgestorben sind oder eine signifikante Schädigung erlitten haben, was kürzere Blätter und weniger Trockenmasse zur Folge hat.
Die transgenen Pflanzen werden dann nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren auf ihre verbesserte Stresstoleranz untersucht. Man findet, dass transgener Raps/Canola, der Stressgene zum Beispiel aus Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa überexprimiert, toleranter gegenüber Umweltstress ist als nicht transgene Kontrollpflanzen. Tolerante Pflanzen haben höhere Überlebensraten und eine höhere Biomasseproduktion einschließlich Samenertrag, Photosynthese und Trockenmasseproduktion als empfindliche Pflanzen.
Beispiel 19
Gentechnische Herstellung von Maispflanzen mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress durch Überexpression von Yield-and-Stress-Related-Genen zum Beispiel aus Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa
Die Transformation von Mais (Zea Mays L.) wird mit einer Modifikation des von Ishida et al. (1996. Nature Biotech 14745–50) beschriebenen Verfahrens durchgeführt. Die Transformation in Mais ist genotypabhängig, und nur spezielle Genotypen sind für eine Transformation und Regeneration geeignet. Die Inzuchtlinie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als einem Elter sind gute Quellen für Donormaterial für die Transformation (Fromm et al. 1990 Biotech 8: 833–839), aber es können auch andere Genotypen erfolgreich verwendet werden. Kolben werden ungefähr 11 Tage nach der Bestäubung (DAP) von Maispflanzen geerntet, wenn die Länge von unreifen Embryos etwa 1 bis 1,2 mm beträgt. Unreife Embryos werden mit Agrobacterium tumefaciens, welche „superbinäre” Vektoren tragen, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Das super-binäre Vektorsystem von Japan Tobacco ist in den WO-Patenten WO 94/00977 und WO 95/06722 beschrieben. Vektoren wurden wie beschrieben konstruiert. Verschiedene Selektionsmarkergene können verwendet werden, einschließlich des Maisgens, das ein mutiertes Acetohydroxysäure-Synthase-Enzym (AHAS-Enzym) kodiert ( US-Patent 6,025,541 ). In ähnlicher Weise kann mit verschiedenen Promotoren das Merkmalsgen, welches für eine konstitutive, entwicklungsgesteuerte, Gewebe- oder Umwelt-Regulation der Gentranskription sorgt, gesteuert werden. Im vorliegenden Beispiel wurde mit dem 34S-Promotor (GenBank Zugangsnummern M59930 und X16673) für die konstitutive Expression des Merkmalsgens gesorgt.
Herauspräparierte Embryonen werden auf Kallusinduktionsmedium, dann Maisregenerationsmedium, das Imidazolinon als Selektionsmittel enthält, wachsen gelassen. Die Petrischalen werden im Licht 2–3 Wochen lang bei 25°C oder, bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Mais-Wurzelmedium überführt und 2–3 Wochen lang bei 25°C inkubiert, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden in Erde im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen die Imidazolinon-Herbizide aufweisen und in der PCR positiv für die Transgene sind. Die transgenen T1-Pflanzen werden dann nach den in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren auf ihre verbesserte Stresstoleranz untersucht. Die T1-Generation von Pflanzen mit Insertionen der T-DNA an einem einzigen Locus spaltet für das Transgen in einem Verhältnis von 1:2:1 auf. Diejenigen Nachkommenschaften, die eine oder zwei Kopien des Transgens enthalten (3/4 der Nachkommenschaft), sind bezüglich des Imidazolinon-Herbizids tolerant und weisen eine gesteigerte Toleranz gegenüber Dürrestress verglichen mit der Nachkommenschaft, die transgene nicht enthalten, auf. Tolerante Pflanzen haben höhere Samenerträge. Homozygote T2-Pflanzen wiesen ähnliche Phänotypen auf. Hybridpflanzen (F1-Nachkommenschaft) homozygoter transgener Pflanzen und nicht transgener Pflanzen zeigten ebenfalls eine erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress.
In dem zyklischen Dürre-Assay werden Pflanzen wiederholtem Stress ausgesetzt, ohne dass dieser zur Austrocknung führt. Die Wasserversorgung während des Experiments ist eingeschränkt, und die Pflanzen werden Zyklen von Dürre und einer erneuten Bewässerung ausgesetzt. Zum Messen der Biomasseproduktion wird das Pflanzenfrischgewicht einen Tag nach der letzten Bewässerung durch Abschneiden der Sprosse und Wägen derselben ermittelt. Bei einem gleichen Grad an Dürrestress sind tolerante Pflanzen dazu in der Lage, wieder ein normales Wachstum aufzunehmen, während empfindliche Pflanzen abgestorben sind oder eine signifikante Schädigung erlitten haben, was kürzere Blätter und weniger Trockenmasse zur Folge hat.
Die Toleranz gegenüber Salinität und Kälte wird unter Anwendung der wie in Beispiel 3 beschrieben Verfahren gemessen. Wiederum findet man, dass transgene Maispflanzen, die Stressgene zum Beispiel aus Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa überexprimieren, tolerant gegenüber Umweltstressfaktoren sind. Tolerante Pflanzen haben höhere Überlebensraten und eine höhere Biomasseproduktion einschließlich Samenertrag, Photosynthese und Trockenmasseproduktion als empfindliche Pflanzen.
Beispiel 20
Gentechnische Herstellung von Weizenpflanzen erhöhtem Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischem Stress durch Überexpression von Yield-and-Stress-Related-Genen zum Beispiel aus Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa
Die Transformation von Weizen wird mit Hilfe des Verfahrens durchgeführt, das von Ishida et al. (1996 Nature Biotech. 14745–50) beschrieben wurde. Bei der Transformation wird gewöhnlich das Kultivar Bobwhite (erhältlich von CYMMIT, Mexiko) verwendet. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, welche „superbinäre” Vektoren tragen, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Das superbinäre Vektorsystem von Japan Tobacco ist in den WO-Patenten WO94/00977 und WO95/06722 beschrieben. Vektoren wurden wie beschrieben konstruiert. Verschiedene Selektionsmarkergene können verwendet werden, einschließlich des Maisgens, das ein mutiertes Acetohydroxysäure-Synthase-Enzym (AHAS-Enzym) kodiert ( US-Patent 6,025,541 ). In ähnlicher Weise lässt sich mit verschiedenen Promotoren das Merkmalsgen, welches für eine konstitutive, entwicklungsgesteuerte, Gewebe- oder Umwelt-Regulation der Gentranskription sorgt, steuern. Im vorliegenden Beispiel wurde mit dem 34S-Promotor (GenBank Zugangsnummern M59930 und X16673) für die konstitutive Expression des Merkmalsgens gesorgt.
Nach Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryonen auf Kallusinduktionsmedium, dann Regenerationsmedium mit Imidazolinon als einem Selektionsmittel, herangezogen. Die Petrischalen werden im Licht 2–3 Wochen lang bei 25°C oder, bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Wurzelmedium überführt und 2–3 Wochen lang bei 25°C inkubiert, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden in Erde im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden von Pflanzen, die eine Toleranz gegen die Imidazolinon-Herbizide aufweisen und in der PCR positiv für die Transgene sind, gewonnen.
Die transgenen T1-Pflanzen werden dann nach dem in Beispiel 3 oben beschriebenen Verfahren auf ihre verbesserte Stresstoleranz untersucht.
In dem zyklischen Dürre-Assay werden Pflanzen wiederholtem Stress ausgesetzt, ohne dass dieser zur Austrocknung führt. Die Wasserversorgung während des Experiments ist eingeschränkt, und die Pflanzen werden Zyklen von Dürre und einer erneuten Bewässerung ausgesetzt. Zum Messen der Biomasseproduktion wird das Pflanzenfrischgewicht einen Tag nach der letzten Bewässerung durch Abschneiden der Sprosse und Wägen derselben ermittelt. Bei einem gleichen Grad an Dürrestress sind tolerante Pflanzen dazu in der Lage, wieder ein normales Wachstum aufzunehmen, während empfindliche Pflanzen abgestorben sind oder eine signifikante Schädigung erlitten haben, was kürzere Blätter und weniger Trockenmasse zur Folge hat.
Die T1-Generation mit Insertionen der T-DNA an einem einzigen Locus spaltet für das Transgen im Verhältnis 1:2:1 auf. Diejenigen Nachkommenschaften, die eine oder zwei Kopien des Transgens enthalten (3/4 der Nachkommenschaft), sind bezüglich des Imidazolinon-Herbizids tolerant und weisen eine gesteigerte Toleranz gegenüber Dürrestress verglichen mit der Nachkommenschaft, die Transgene nicht enthalten, auf. Tolerante Pflanzen haben höhere Überlebensraten und eine höhere Biomasseproduktion einschließlich Samenertrag, Photosynthese und Trockenmasseproduktion als empfindliche Pflanzen. Homozygote T2-Pflanzen wiesen ähnliche Phänotypen auf. Toleranz gegenüber Salinität und Kälte werden mit wie in den vorhergehenden Beispielen beschriebenen Methoden gemessen. Pflanzen, die Stressgene zum beispiel aus Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa überexprimierten, sind tolerant gegenüber Dürre, Salinität oder Kälte und zeigten höhere Überlebensraten und eine höhere Biomasseproduktion einschließlich Samenertrag, Photosynthese und Trockenmasseproduktion als empfindliche Pflanzen.
Beispiel 21
Identifikation identischer und heterologer Gene
Gensequenzen können dazu verwendet werden, identische oder heterologe Gene aus cDNA- oder genomischen Bibliotheken zu identifizieren. Identische Gene (z. B. Volllängen-cDNA-Klone) können über Nukleinsäurehybridisierung isoliert werden, wobei zum Beispiel cDNA-Bibliotheken eingesetzt werden. Je nach der Häufigkeit des interessierenden Gens werden 100 000 bis zu 1 000 000 rekombinante Bakteriophagen ausplattiert und auf Nylonmembranen übertragen. Nach Denaturierung mit Alkali wird die DNA auf der Membran immobilisiert, z. B. durch UV-Vernetzung. Die Hybridisierung erfolgt unter hochstringenten Bedingungen. in wässriger Lösung werden Hybridisierung und Waschen bei einer Ionenstärke von 1 M NaCl und einer Temperatur von 68°C durchgeführt. Die Hybridisierungssonden werden z. B. durch radioaktive (³²P) Nick-Transkriptionsmarkierung (High Prime, Roche, Mannheim, Deutschland) hergestellt. Die Signale werden durch Autoradiographie ermittelt.
Teilweise identische oder heterologe Gene, die verwandt, aber nicht identisch sein können, können analog zu dem vorstehend beschriebenen Verfahren unter Verwendung von Hybridisierungs- und Waschbedingungen mit niedriger Stringenz identifiziert werden. Für die wässrige Hybridisierung wird die Ionenstärke in der Regel bei 1 M NaCl gehalten werden, während die Temperatur nach und nach von 68 auf 42°C gesenkt wird.
Die Isolation von Gensequenzen mit einer Homologie (oder Sequenzidentität/-ähnlichkeit) in nur einer bestimmten Domäne (zum Beispiel 10–20 Aminosäuren) kann unter Verwendung synthetischer radioaktiv markierter Oligonukleotidsonden erfolgen. Radioaktiv markierte Oligonukleotide werden durch Phosphorylierung des 5'-Endes zweier komplementärer Oligonukleotide mit T4-Polynukleotidkinase hergestellt. Die komplementären Oligonukleotide werden aneinander hybridisiert und unter Bildung von Konkatemeren ligiert. Die doppelsträngigen Konkatemere werden dann beispielsweise mittels Nick-Transkription radioaktiv markiert. Die Hybridisierung erfolgt gewöhnlich bei niederstringenten Bedingungen mit hohen Oligonukleotidkonzentrationen.
Oligonukleotid-Hybridisierungslösung:
6 × SSC
0,01 M Natriumphosphat
1 mM EDTA (pH 8)
0,5% SDS
100 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA
0,1% fettfreie Trockenmilch
Während der Hybridisierung wird die Temperatur schrittweise bis auf 5–10°C unter die geschätzte T_m des Oligonukleotids oder bis auf Raumtemperatur gesenkt werden, worauf die Waschschritte und die Autoradiographie durchgeführt werden. Das Waschen erfolgt mit niedriger Stringenz, beispielsweise durch 3 Waschschritte mit 4 × SSC. Weitere Einzelheiten werden von Sambrook, J. et al., 1989, „Molecular Cloning: A Laborstory Manual," Cold Spring Harbor Laborstory Press, oder Ausubel, F. M. et al., 1994, „Current Protocols in Molecular Biology," John Wiley & Sons, beschrieben.
Beispiel 22
Identifikation identischer oder homologer Gene durch Screening von Expressionsbibliotheken mit Antikörpern
Man kann cDNA-Klone dazu verwenden, rekombinantes Polypeptid zum Beispiel in E. coli herzustellen (z. B. Qiagen QlAexpress pQE-System). Die rekombinanten Polypeptide werden dann gewöhnlich über Ni-NTA-Affinitätschromatographie (Qiagen) affinitätsgereinigt. Die rekombinanten Polypeptide werden dann für die Herstellung spezifischer Antikörper verwendet, indem zum Beispiel Standardtechniken für die Immunisierung von Kaninchen eingesetzt werden. Die Antikörper werden unter Verwendung einer Ni-NTA-Säule, die mit dem rekombinanten Antigen gesättigt wurde, affinitätsgereinigt, wie von Gu et al., 1994, BioTechniques 17: 257–262 beschrieben. Der Antikörper kann dann für das Screening von Expressions-cDNA-Banken verwendet werden, so dass identische oder heterologe Gene über ein immunologisches Screening identifiziert werden (Sambrook, J. et al., 1989, „Molecular Cloning: A Laborstory Manual," Cold Spring Harbor Laborstory Press oder Ausubel, F. M. et al., 1994, „Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons).
Beispiel 23
In-vivo-Mutagenese
Die in-vivo-Mutagenese von Mikroorganismen kann durch Passage von Plasmid-DNA (oder einer anderen Vektor-DNA) durch E. coli oder andere Mikroorganismen (z. B. Bacillus spp. oder Hefen, wie Saccharomyces cerevisiae) erfolgen, bei denen die Fähigkeiten, die Unversehrtheit ihrer genetischen Information aufrechtzuerhalten, gestört sind. Übliche Mutator-Stämme haben Mutationen in den Genen für das DNA-Reparatursystem (z. B. mutHLS, mutD, mutT usw.; als Literaturstelle siehe Rupp, W. D., 1996, DNA repair mechanisms, in: Escherichia coli and Salmonella, S. 2277–2294, ASM: Washington.) Solche Stämme sind dem Fachmann gut bekannt. Die Verwendung solcher Stamme ist zum Beispiel in Greener, A. und Callahan, M., 1994, Strategies 7: 32–34 veranschaulicht. Der Transfer mutierter DNA-Moleküle in Pflanzen erfolgt vorzugsweise nach einer Selektion und nach Testen in Mikroorganismen. Transgene Pflanzen werden anhand verschiedener Beispiele im Beispielteil dieses Dokuments hergestellt.
Pflanzen-Screening auf Wachstum unter Niedertemperatur-Bedingungen
In einem Standardexperiment wurde Erdboden als eine Mischung von 3,5:1 (v/v) an nährstoffreicher Erde (GS90, Tantau, Wansdorf, Deutschland) und Sand zubereitet. Töpfe wurden mit dem Erdgemisch befüllt und in Wannen gebracht. Wasser wurde den Wannen zugesetzt, damit die Erdmischung eine angemessene Menge an Wasser für die Aussaat-Prozedur aufnimmt. Die Samen für transgene A. thaliana-Pflanzen wurden in die Blumentöpfe eingesät (6 cm Durchmesser). Töpfe wurden gesammelt, bis sie eine Wanne für die Wachstumskammer füllten. Dann wurde die gefüllte Wanne mit einer transparenten Haube abgedeckt und in das Regalsystem der vorgekühlten (4°C–5°C) Wachstumskammer überführt. Die Stratifikation wurde während eines Zeitraums von 2–3 Tagen im Dunklen bei 4°C–5°C etabliert. Die Keimung der Samen und das Wachstum wurden bei einer Wachstumsbedingung von 20°C, 60% relative Feuchtigkeit, 16 h-Lichtperiode und Beleuchtung mit Fluoreszenzlicht bei 200 μmol/m²s initiiert. Die Hauben wurden 7 Tage nach dem Säen entfernt. Die BASTA-Selektion wurde am Tag 9 nach der Aussaat durch Besprühen der Blumentöpfe mit den Pflänzchen von oben vorgenommen. Demgemäß wurde eine Lösung von 0,07% (v/v) BASTA-Konzentrat (183 g/l Glufosinat-Ammonium) in Leitungswasser versprüht. Transgene Ereignisse und Wildtyp-Kontrollpflanzen waren zufallsmäßig in der Kammer verteilt. Die Anordnung der Wannen innerhalb der Kammern wurde an Arbeitstagen ab dem Tag 7 nach dem Einsäen verändert. Das Bewässern erfolgte alle zwei Tage, nachdem die Hauben von den Wannen entfernt worden waren. Die Pflanzen wurden 12–13 Tage nach der Aussaat durch Entfernen des Überschusses an Keimlingen, wobei nur ein Keimling in einem Blumentopf übergelassen wurde, vereinzelt. Kälte (Kühlen auf 11°C–12°C) wurde 14 Tage nach der Aussaat bis zum Ende des Experiments angewandt. Zum Messen der Biomasseleistung wurde das Pflanzenfrischgewicht zur Erntezeit (29–36 Tage nach der Aussaat) durch Abschneiden der Sprosse und Wägen derselben ermittelt. Neben dem Wiegen wurde im Falle von Pflanzen, welche von der Wildtypkontrolle abweichen, eine Phänotyp-Information hinzugefügt. Die Pflanzen waren bei der Ernte im Stadium vor dem Aufblühen und vor dem Wachstum des Blütenstands. Signifikanzwerte für die statistische Signifikanz der Biomasse-Änderungen wurden durch Anwenden des t-Tests nach Student (Parameter: zweiseitige, ungleiche Varianz) berechnet.
Bis zu fünf Linien pro transgenem Konstrukt wurden in aufeinanderfolgenden Stufen des Experiments (bis zu 4) getestet. Nur Konstrukte, die eine positive Leistung zeigten, wurden der nächsten Stufe des Experiments unterzogen. Gewöhnlich wurden bei der ersten Stufe fünf Pflanzen pro Konstrukt getestet und bei den folgenden Stufen 30–74 Pflanzen getestet. Die Biomassleistung wurde wie oben beschrieben untersucht. Tabelle VIII-B: Biomasseproduktion von transgenen A. thaliana nach Einwirkung von Stress durch kühle Temperaturen.

Die Biomasseproduktion wurde durch Wägen der Pflanzenrosetten gemessen. Die Zunahme an Biomasse wurde als das Verhältnis des Durchschnittgewichts von transgenen Pflanzen verglichen mit dem Durchschnittsgewicht von Kontrollpflanzen vom Wildtyp aus dem gleichen Experiment berechnet. Die Biomasseproduktion wurde durch Wägen der Pflanzenrosetten gemessen. Die Zunahme an Biomasse wurde als das Verhältnis des Durchschnittgewichts von transgenen Pflanzen verglichen mit dem Durchschnittsgewicht von Kontrollpflanzen vom Wildtyp aus dem gleichen Experiment berechnet. Die maximale Biomasseerhöhung, die für die Gruppe transgener Ereignisse gefunden wurde, ist für Konstrukte mit einem Signifikanzwert von ≤ 0,3 und einer Biomasseerhöhung von ≥ 5% (Verhältnis ≥ 1,05) angeführt. Tabelle VIII-B: (LT)

SeqID	Ziel	Genort	Biomasseerhöhung
724	zytoplasmatisch	Yal043c-a	1,389
728	plastidisch	Ybr071w	1,350
732	zytoplasmatisch	Ybr180w	1,374
764	zytoplasmatisch	Ydr284c	1,500
1157	zytoplasmatisch	Ykr097w	1,799
1157	mitochondrisch	Ykr097w	1,533
1352	zytoplasmatisch	Ynr012w	1,399

Pflanzen-Screening auf Biomasseerhöhung unter standardisierten Wachstumsbedingungen
In diesem Experiment wurde ein Pflanzen-Screening auf Ertragserhöhung (in diesem Fall: Biomasseerhöhung) unter standardisierten Wachstumsbedingungen in Abwesenheit von wesentlichem abiotischem Stress durchgeführt. In einem Standardexperiment wurde Erdboden als eine Mischung von 3,5:1 (v/v) an nährstoffreicher Erde (GS90, Tantau, Wansdorf, Deutschland) und Quarzsand zubereitet. Alternativ dazu wurden die Pflanzen auf nährstoffreichem Boden (GS90, Tantau, Deutschland) ausgesät. Töpfe wurden mit. Erdgemisch befüllt und in Wannen gebracht. Wasser wurde den Wannen zugesetzt, damit die Erdmischung eine angemessene Menge an Wasser für die Aussaat-Prozedur aufnehmen kann. Die Samen für transgene A. thaliana-Pflanzen und ihre nicht transgenen Kontrollen vom Wildtyp wurden in Töpfe (6 cm Durchmesser) eingesät. Dann wurde die gefüllte Wanne mit einer transparenten Haube abgedeckt und in eine vorgekühlte (4°C–5°C) und abgedunkelte Wachstumskammer überführt. Die Stratifikation wurde während eines Zeitraums von 3–4 Tagen im Dunklen bei 4°C–5°C etabliert. Die Keimung der Samen und das Wachstum wurden bei einer Wachstumsbedingung von 20°C, 60% relative Feuchtigkeit, 16 h-Lichtperiode und Beleuchtung mit Fluoreszenzlicht bei ungefähr 170 μmol/m²s initiiert. Die Hauben wurden 7–8 Tage nach dem Säen entfernt. Die BASTA-Selektion wurde am Tag 10 oder Tag 11 (9 oder 10 Tage nach der Aussaat) nach der Aussaat durch Besprühen der Töpfe mit den Pflänzchen von oben vorgenommen. Im Standardexperiment wurde eine 0,07%ige (v/v) Lösung von BASTA-Konzentrat (183 g/l Glufosinat-Ammonium) in Leitungswasser einmal versprüht, oder alternativ dazu wird eine 0,02%ige (v/v) BASTA-Lösung dreimal versprüht. Die Wildtyp-Kontrollpflanzen wurden nur mit Leitungswasser (anstelle von in Leitungswasser gelöstem BASTA) besprüht, aber ansonsten identisch behandelt. Die Pflanzen wurden 13–14 Tage nach der Aussaat durch Entfernen des Überschusses an Keimlingen, wobei nur ein Keimling im Boden belassen wird, vereinzelt. Transgene Ereignisse und Wildtyp-Kontrollpflanzen waren gleichmäßig in der Kammer verteilt. Das Bewässern erfolgte in einem Standardexperiment alle zwei Tage nach dem Entfernen der Hauben oder alternativ dazu jeden Tag. Zum Messen der Biomasseleistung wurde das Pflanzenfrischgewicht zur Erntezeit (24–29 Tage nach der Aussaat) durch Abschneiden der Sprosse und Wägen derselben ermittelt. Die Pflanzen waren bei der Ernte im Stadium vor dem Aufblühen und vordem Wachstum des Blütenstands. Transgene Pflanzen wurden mit am gleichen Tag geernteten nicht transgenen Kontrollpflanzen vom Wildtyp verglichen. Signifikanzwerte für die statistische Signifikanz der Biomasse-Änderungen lassen sich durch Anwenden des t-Tests nach Student (Parameter: zweiseitige, ungleiche Varianz) berechnen.
Pro transgenem Konstrukt wurden 3–4 unabhängige transgene Linien (=Ereignisse) getestet (24–28 Pflanzen pro Konstrukt), und die Biomasseleistung wurde wie oben beschrieben untersucht.
Tabelle VIII-C: Biomasseproduktion von transgenen, unter standardisierten Wachstumsbedingungen herangezogenen A. thaliana.

Die Biomasseproduktion wurde durch Wägen der Pflanzenrosetten gemessen. Die Zunahme an Biomasse wurde als das Verhältnis des Durchschnittgewichts von transgenen Pflanzen verglichen mit dem Durchschnittsgewicht von Kontrollpflanzen vom Wildtyp aus dem gleichen Experiment berechnet. Die maximale Biomasseerhöhung, die für die Gruppe transgener Ereignisse gefunden wurde, ist für Konstrukte mit einem Signifikanzwert von ≤ 0,3 und einer Biomasseerhöhung von ≥ 5% (Verhältnis ≥ 1,05) angeführt.

SeqID	Ziel	Genort	Biomasseerhöhung
63	plastidisch	B0312	1,353
724	zytoplasmatisch	Yal043c-a	1,411
732	zytoplasmatisch	Ybr180w	1,449
818	zytoplasmatisch	Yhr047c	1,179
1157	mitochondrisch	Ykr097w	1,619
1352	zytoplasmatisch	Ynr012w	1,314

Planzen-Screening (Arabidopsis) auf Wachstum bei einsgeschränkter Stickstoffversorgung

Pro transgenem Konstrukt wurden 4 unabhängige transgene Linien (Ereignisse) getestet (23–28 Pflanzen pro Konstrukt). Arabidopsis thaliana-Samen werden in Töpfe ausgesät, die eine 1:1 (v:v) Mischung von nährstoffarmem Boden (”Einheitserde Typ 0”, 30% Lehm, Tantau, Wansdorf Deutschland) und Sand enthalten. Die Keimung wird durch eine 4-tägige Dunkelperiode bei 4°C induziert. Anschließend werden die Pflanzen unter Standardwachstumsbedingungen (Photoperiode mit 16 h Licht und 8 h Dunkelheit, 20°C, 60% relative Feuchtigkeit, und eine Photonenflussdichte von ungefähr 170 μE) herangezogen. Die Pflanzen werden herangezogen und kultiviert, unter anderem werden sie jeden zweiten Tag mit einer stickstoffarmen Nährstofflösung gegossen. Die stickstoffarme Nährstofflösung enthält z. B. neben Wasser

Nach 9 bis 10 Tagen werden die Pflanzen vereinzelt. Nach einer Gesamtzeit von 28 bis 31 Tagen werden die Pflanzen geerntet und anhand des Frischgewichts der oberirdischen Teile der Pflanzen eingestuft. Die Zunahme an Biomasse wird als Verhältnis des Frischgewichts der oberirdischen Teile der betreffenden transgenen Pflanze und der nicht transgenen Pflanze vom Wildtyp gemessen.
Die Ergebnisse der Untersuchung auf Wachstum bei eingeschränkter Stickstoffversorgung sind in Tabelle VIII-D zusammengefasst.
Tabelle VIII-D: Biomasseproduktion von transgenen, unter eingeschränkter Stickstoffversorgung herangezogenen A. thaliana

Die Biomasseproduktion wurde durch Wägen der Pflanzenrosetten gemessen. Die Zunahme an Biomasse wurde als das Verhältnis des Durchschnittgewichts von transgenen Pflanzen verglichen mit dem Durchschnittsgewicht von Kontrollpflanzen vom Wildtyp aus dem gleichen Experiment berechnet. Die maximale Biomasseerhöhung, die für die Gruppe transgener Ereignisse gefunden wurde, ist für Konstrukte mit einem Signifikanzwert von ≤ 0,3 und einer Biomasseerhöhung von ≥ 5% (Verhältnis ≥ 1,05) angeführt. Tabelle VIII-D (NUE)

SeqID	Ziel	Genort	Biomasseerhöhung
63	plastidisch	B0312	1,180
724	zytoplasmatisch	Yal043c-a	1,292
732	zytoplasmatisch	Ybr180w	1,739
764	zytoplasmatisch	Ydr284c	1,352
814	zytoplasmatisch	Ydr445c	1,197
925	plastidisch	Yhr190w	1,181
1021	zytoplasmatisch	Ykl094w	1,255
1157	zytoplasmatisch	Ykr097w	1,313
1157	mitochondrisch	Ykr097w	1,264
1352	zytoplasmatisch	Ynr012w	1,194

Figuren:
1. Vektor VC-MME220-1qcz SEQ ID NO: 41, verwendet für die Klonierung von interessierenden Genen für die nicht zielgerichtete Expression.
2. Vektor VC-MME221-1qcz SEQ ID NO: 46, verwendet für die Klonierung von interessierenden Genen für die nicht zielgerichtete Expression.
3. Vektor VC-MME354-1QCZ SEQ ID NO: 32, verwendet für die Klonierung von interessierenden Genen für die zielgerichtete Expression.
4. Vektor VC-MME432-1qcz SEQ ID NO: 42, verwendet für die Klonierung von interessierenden Genen für die zielgerichtete Expression.
5.Vektor VC-MME489-1QCZ SEQ ID NO: 56, verwendet für die Klonierung von interessierenden Genen für die nicht zielgerichtete Expression und Klonieren einer Targeting-Sequenz.
6. Vektor pMTX0270p SEQ ID NO: 9, verwendet für die Klonierung einer Targeting-Sequenz.
7. Vektor pMTX155 (SEQ ID NO: 31), verwendet für die Klonierung von interessierenden Genen für die nicht zielgerichtete Expression.
8. Vektor VC-MME356-1QCZ (SEQ ID NO: 34), verwendet für die auf Mitochondrien zielende Expression.
9. Vektor VC-MME301-1QCZ (SEQ ID NO: 36), verwendet für die nicht zielgerichtete Expression vorzugsweise in Samen.
10. Vektor pMTX461korrp (SEQ ID NO: 37), verwendet für die auf Plastide zielende Expression vorzugsweise in Samen.
11. Vektor VC-MME462-1QCZ (SEQ ID NO: 39), verwendet für die auf Mitochondrien zielende Expression vorzugsweise in Samen.
12. Vektor VC-MME431-1qcz (SEQ ID NO: 44), verwendet für die auf Mitochondrien zielende Expression.
13. Vektor pMTX447korr (SEQ ID NO: 47), verwendet für die auf Plastide zielende Expression.
14. Vektor VC-MME445-1qcz (SEQ ID NO: 49), verwendet für die auf Mitochondrien zielende Expression.
15. Vektor VC-MME289-1qcz (SEQ ID NO: 51), verwendet für die nicht zielgerichtete Expression vorzugsweise in Samen.
16. Vektor VC-MME464-1qcz (SEQ ID NO: 52), verwendet für die auf Plastide zielende Expression vorzugsweise in Samen.
17. Vektor VC-MME465-1qcz (SEQ ID NO: 54), verwendet für die auf Mitochondrien zielende Expression vorzugsweise in Samen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanzenzelle oder Pflanze oder eines Teils davon mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorrübergehendem und wiederholtem abiotischen Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon durch Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität einer Phosphoenolpyruvatcarboxylkinase.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man die Aktivität wenigstens eines Polypeptids, welches ein Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (i) einem Polypeptid, welches ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder wenigstens ein Polypeptidmotiv gemäß Spalte 5 oder 7, Zeile bzw. Hit 11 von Tabelle II beziehungsweise Tabelle IV umfasst; oder (ii) einem Expressionsprodukt eines Nukleinsäuremoleküls, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 oder 7, Zeile bzw. Hit 11 von Tabelle I umfasst, (iii) oder einem funktionellen Äquivalent von (i) oder (ii) umfasst, erhöht oder erzeugt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem man die Expression wenigstens eines Nukleinsäuremoleküls, welches ein Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) einem Nukleinsäuremolekül, das für das Polypeptid gemäß Spalte 5 oder 7, Zeile bzw. Hit 11 von Tabelle II kodiert; b) einem Nukleinsäuremolekül gemäß Spalte 5 oder 7, Zeile bzw. Hit 11 von Tabelle I; c) einem Nukleinsäuremolekül, welches als Folge der Degeneration des genetischen Codes von einer Polypeptidsequenz gemäß Spalte 5 oder 7, Zeile bzw. Hit 11 von Tabelle II gezeigten abgeleitet sein kann und einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischen Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verleiht; d) einem Nukleinsäuremolekül mit mindestens 30% Identität mit der Nukleinsäuremolekülsequenz eines Polynukleotids, das das Nukleinsäuremolekül gemäß Spalte 5 oder 7, Zeile bzw. Hit 11 von Tabelle I umfasst und einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischen Stress verglichen mit einer entsprechenden nichttransformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verleiht; e) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid mit mindestens 30% Identität mit der Aminosäuresequenz des Polypeptids, das von dem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) kodiert wird, kodiert und die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül wiedergegeben wird, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5, Zeile bzw. Hit 11 von Tabelle I umfasst und einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischen Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verleiht; f) einem Nukleinsäuremolekül, welches unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) hybridisiert und einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischen Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verleiht; g) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das mit Hilfe von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern gegen ein Polypeptid, das von einem der Nukleinsäuremoleküle von (a) bis (e) kodiert wird und die Aktivität aufweist, die durch das Nukleinsäuremolekül wiedergegeben wird, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5, Zeile bzw. Hit 11 von Tabelle I umfasst, isoliert werden kann; h) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das die Konsensussequenz oder ein oder mehrere Polypeptidmotive gemäß Spalte 7, Zeile bzw. Hit 11 von Tabelle IV umfasst und vorzugsweise die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül wiedergegeben wird, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5, Zeile bzw. Hit 11 von Tabelle II oder IV umfasst; i) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid codiert, das die Aktivität aufweist, die durch ein Protein gemäß Spalte 5, Zeile bzw. Hit 11 von Tabelle II wiedergegeben wird, und einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischen Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verleiht; j) einem Nukleinsäuremolekül, welches ein Polynukleotid umfasst, das man erhält, indem man eine cDNA-Bibliothek oder eine genomische Bibliothek unter Verwendung der Primer aus Spalte 7 von Tabelle III amplifiziert, und vorzugsweise die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5, Zeile bzw. Hit 11 von Tabelle II oder IV umfasst, wiedergegeben wird; und k) einem Nukleinsäuremolekül, welches erhältlich ist, indem man eine geeignete Nukleinsäurebibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde, die eine komplementäre Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls von (a) oder (b) umfasst, oder mit einem Fragment davon, mit mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt, eines Nukleinsäuremoleküls, das komplementär zu einer in (a) bis (e) charakterisierten Nukleinsäuremolekülsequenz ist und für ein Polypeptid codiert, das die Aktivität aufweist, die durch ein ein Polypeptid gemäß Spalte 5, Zeile bzw. Hit 11 von Tabelle II umfassendes Protein wiedergegeben wird; umfasst, erhöht oder erzeugt.
Transgene Pflanzenzelle oder Pflanze oder Teil davon mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischen Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, hergestellt durch ein Verfahren nach Anspruch 1.
Transgene Pflanzenzelle oder Pflanze oder Teil davon nach Anspruch 4, wobei die Zelle oder Pflanze oder der Teil davon von einer monokotyledonen Pflanze stammt.
Transgene Pflanzenzelle oder Pflanze oder Teil davon nach Anspruch 4, wobei die Zelle oder Pflanze oder der Teil davon von einer dikotyledonen Pflanze stammt.
Transgene Pflanzenzelle oder Pflanze oder Teil davon nach Anspruch 4, wobei die Pflanze aus der Gruppe bestehend aus Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Sojabohne, Erdnuss, Baumwolle, Raps einschließlich Canola und Winterraps, Mais, Maniok, Pfeffer, Sonnenblume, Flachs, Bonetsch, Färberdistel, Lein, Primel, Raps, Rübsen, Tagetes, Nachtschattengewächsen, Kartoffel, Tabak, Aubergine, Tomate, Vicia-Arten, Erbse, Luzerne, Kaffee, Kakao, Tee, Salix-Arten, Ölpalme, Kokosnuss, mehrjährigen Gräsern, Futterkulturen und Arabidopsis thaliana ausgewählt ist.
Transgene Pflanzenzelle oder Pflanze oder Teil davon nach Anspruch 4, wobei die Zelle oder Pflanze oder der Teil davon von einer gymnospermen Pflanze, vorzugsweise eine Fichte, Kiefer oder Tanne, stammt.
Samen produziert durch eine transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei der Samen genetisch homozygot für ein Transgen ist, welches einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischen Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verleiht, was einen erhöhten Ertrag unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischen Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanze vom Wildtyp, zur Folge hat.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches ein Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) einem Nukleinsäuremolekül, das für das Polypeptid gemäß Spalte 5 oder 7, Zeile bzw. Hit 11 von Tabelle II B kodiert; b) einem Nukleinsäuremolekül gemäß Spalte 5 oder 7, Zeile bzw. Hit 11 von Tabelle I B; c) einem Nukleinsäuremolekül, welches als Folge der Degeneration des genetischen Codes von einer Polypeptidsequenz gemäß Spalte 5 oder 7, Zeile bzw. Hit 11 von Tabelle II gezeigten abgeleitet sein kann und einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischen Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verleiht; d) einem Nukleinsäuremolekül mit mindestens 30% Identität mit der Nukleinsäuremolekülsequenz eines Polynukleotids, das das Nukleinsäuremolekül gemäß Spalte 5 oder 7, Zeile bzw. Hit 11 von Tabelle I umfasst und einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischen Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verleiht; e) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid mit mindestens 30% Identität mit der Aminosäuresequenz des Polypeptids, das von dem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) kodiert wird, kodiert und die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül wiedergegeben wird, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5, Zeile bzw. Hit 11 von Tabelle I umfasst und einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischen Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verleiht; f) einem Nukleinsäuremolekül, welches unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) hybridisiert und einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischen Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verleiht; g) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das mit Hilfe von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern gegen ein Polypeptid, das von einem der Nukleinsäuremoleküle von (a) bis (e) kodiert wird und die Aktivität aufweist, die durch das Nukleinsäuremolekül wiedergegeben wird, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5, Zeile bzw. Hit 11 von Tabelle I umfasst, isoliert werden kann; h) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das die Konsensussequenz oder ein oder mehrere Polypeptidmotive gemäß Spalte 7, Zeile bzw. Hit 11 von Tabelle IV umfasst und vorzugsweise die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül wiedergegeben wird, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5, Zeile bzw. Hit 11 von Tabelle II oder IV umfasst; i) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid codiert, das die Aktivität aufweist, die durch ein Protein gemäß Spalte 5, Zeile bzw. Hit 11 von Tabelle II wiedergegeben wird, und einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischen Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verleiht; j) einem Nukleinsäuremolekül, welches ein Polynukleotid umfasst, das man erhält, indem man eine cDNA-Bibliothek oder eine genomische Bibliothek unter Verwendung der Primer aus Spalte 7 von Tabelle III amplifiziert, und vorzugsweise die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5, Zeile bzw. Hit 11 von Tabelle II oder IV umfasst, wiedergegeben wird; und k) einem Nukleinsäuremolekül, welches erhältlich ist, indem man eine geeignete Nukleinsäurebibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde, die eine komplementäre Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls von (a) oder (b) umfasst, oder mit einem Fragment davon, mit mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt, eines Nukleinsäuremoleküls, das komplementär zu einer in (a) bis (e) charakterisierten Nukleinsäuremolekülsequenz ist und für ein Polypeptid codiert, das die Aktivität aufweist, die durch ein ein Polypeptid gemäß Spalte 5, Zeile bzw. Hit 11 von Tabelle II umfassendes Protein wiedergegeben wird; umfasst, wobei sich das Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (j) in wenigstens einem oder mehreren Nukleotiden von der Sequenz gemäß Spalte 5 oder 7, Zeile bzw. Hit 11 von Tabelle I A unterscheidet und vorzugsweise für ein Protein kodiert, welches sich in wenigstens einer oder mehreren Aminosäuren von den Proteinsequenzen gemäß Spalte 5 oder 7, Zeile bzw. Hit 11 von Tabelle II A unterscheidet.
Nukleinsäurekonstrukt, welches die Expression des Nukleinsäuremoleküls nach Anspruch 10 oder eines Nukleinsäuremoleküls gemäß Anspruch 3, a) bis k), verleiht, wobei das Nukleinsäurekonstrukt ein oder mehrere regulatorische Elemente umfasst, wobei die Expression der Nukleinsäure in einer Wirtszelle zu einem erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischen Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, führt.
Vektor, welcher das Nukleinsäuremoleküls nach Anspruch 10 oder ein Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 3, a) bis k), oder das Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 11 umfasst, wobei die Expression der Nukleinsäure in einer Wirtszelle zu einem erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischen Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, führt.
Wirtszelle, die mit dem Vektor nach Anspruch 12 oder dem Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 10 oder einem Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 3, a) bis k) oder dem Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 11 stabil oder transient transformiert wurde und die aufgrund der Transformation einen erhöhten Ertrag zeigt, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischen Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptid, wobei das Polypeptid in einer Wirtszelle nach Anspruch 13 exprimiert wird.
Polypeptid, hergestellt durch das Verfahren nach Anspruch 14 oder kodiert durch das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 10 oder ein Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 3, a) bis k), wobei sich das Polypeptid von der Sequenz gemäß Tabelle II in einer oder mehreren Aminosäuren unterscheidet.
Antikörper, der spezifisch an das Polypeptid nach Anspruch 15 bindet.
Pflanzengewebe, Fortpflanzungsmaterial, Erntegut oder eine Pflanze, das/die die Wirtszelle nach Anspruch 13 umfasst.
Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon, einer Pflanze oder einem Teil davon einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischen Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, welches die folgenden Schritte umfasst: a) Kultivieren einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder eines Teils davon, wodurch man eine Pflanze erhält, die das durch das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 10 oder ein Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 3, a) bis k), kodierte Polypeptid exprimiert, welches einen erhöhten Ertrag unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischen Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon verleiht; eine nicht transformierte Pflanze vom Wildtyp oder ein Teil davon und ein Ablesesystem, das dazu in der Lage ist, unter geeigneten Bedingungen, die eine Wechselwirkung des Polypeptids mit diesem Ablesesystem in Gegenwart einer Verbindung oder einer Probe, die eine Mehrzahl an Verbindungen enthält, erlauben, mit dem Polypeptid in Wechselwirkung zu treten und dazu in der Lage ist, ein nachweisbares Signal als Reaktion auf die Bindung einer Verbindung an das Polypeptid bereitzustellen, unter Bedingungen, die die Expression dieses Ablesesystems und des durch das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 10 oder ein Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 3, a) bis k), kodierten Polypeptids ermöglichen, wodurch einer nicht transformierten Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon ein erhöhter Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischen Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verliehen wird; b) Feststellen, ob es sich bei der Verbindung um einen wirksamen Agonisten handelt, indem man das Vorhandensein oder das Fehlen oder die Zunahme eines durch dieses Ablesesystem produzierten Signals detektiert.
Verfahren zur Herstellung einer landwirtschaftlichen Zusammensetzung, welches die Schritte des Verfahrens nach Anspruch 18 zur Identifikation einer einen erhöhten Ertrag verleihenden Verbindung und das Formulieren der in Anspruch 18 identifizierten Verbindung in einer für die Anwendung in der Landwirtschaft geeigneten Form umfasst.
Zusammensetzung, die das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 10 oder ein Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 3, a) bis k), das Polypeptid nach Anspruch 15, das Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 11, den Vektor nach Anspruch 12, die Verbindung nach Anspruch 18, den Antikörper nach Anspruch 16 und gegebenenfalls einen landwirtschaftlich geeigneten Träger umfasst.
Isoliertes Polypeptid gemäß Zeile bzw. Hit 11 von Tabelle II, vorzugsweise Tabelle II B, ausgewählt aus Hefe, vorzugsweise Saccharomyces cerevisiae.
Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanzenzelle oder Pflanze oder eines Teils davon mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischen Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, wobei der erhöhte Ertrag unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischen Stress durch die Expression eines Polypeptids, welches durch eine Nukleinsäure nach Anspruch 10 oder ein Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 3, a) bis k), kodiert wird und zu einem erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischen Stress verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, führt, bei dem man a) eine Pflanzenzelle oder einen Teil einer Pflanze mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 12 transformiert und b) aus der Pflanzenzelle oder dem Teil einer Pflanze eine transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischen Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanze vom Wildtyp, erzeugt.
Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanze vom Wildtyp, vorzugsweise unter Bedingungen von Umweltstress, durch Erhöhen oder Erzeugen einer Aktivität einer Phosphoenolpyruvatcarboxylkinase.
Verfahren nach Anspruch 22, bei dem man a) eine Pflanzenzelle oder einen Teil einer Pflanze mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 12 transformiert und b) aus der Pflanzenzelle oder dem Teil einer Pflanze eine transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischen Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanze vom Wildtyp, erzeugt.
Verwendung eines für ein YRP oder YSRP kodierenden Nukleinsäuremoleküls ausgewählt aus der Gruppe, die die Nukleinsäure nach Anspruch 10 oder ein Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 3, a) bis k), umfasst, zur Herstellung einer Pflanzenzelle mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischen Stress, verglichen mit einer nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil einer Pflanze.
Verwendung eines für ein YRP oder YSRP kodierenden Nukleinsäuremoleküls ausgewählt aus der Gruppe, die die Nukleinsäure nach Anspruch 10 oder ein Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 3, a) bis k), und Teile davon umfasst, als Marker für die Selektion von Pflanzen oder Pflanzenzellen mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischen Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle vom Wildtyp, einer nicht transformierten Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon.
Verwendung eines für ein YRP oder YSRP kodierenden Nukleinsäuremoleküls ausgewählt aus der Gruppe, die die Nukleinsäure nach Anspruch 10 oder ein Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 3, a) bis k), und Teile davon umfasst, als Marker für den Nachweis von Stress in Pflanzen oder Pflanzenzellen.
Transformierte Pflanzenzelle nach Anspruch 4, wobei der vorrübergehende und wiederholte abiotischen Umweltstress aus der aus Salinitätsstressfaktoren, Dürrestressfaktoren, Temperaturstressfaktoren, Metallstressfaktoren, chemischen, pathogenen und oxidativen Stressfaktoren oder Kombinationen davon bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Transformierte Pflanzenzelle nach Anspruch 4, wobei es sich bei dem vorrübergehenden und wiederholten abiotischen Umweltstress um Dürre, vorzugsweise zyklische Dürre, handelt.
Transgene Pflanzenzelle, welche ein Nukleinsäuremolekül umfasst, welches für ein Polypeptid mit einer Aktivität einer Phosphoenolpyruvatcarboxylkinase kodiert, wobei dieses Polypeptid einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise unter Bedingungen von vorübergehendem und wiederholtem abiotischen Stress, verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon verleiht, vorzugsweise wenn das Polypeptid überexprimiert wird.
Pflanze nach Anspruch 4 oder 29, die i) einen erhöhten Ertrag unter vorrübergehenden und wiederholten Bedingungen mit eingeschränkten Nährstoffen, wobei die Bedingungen für das Wachstum einer nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon einschränkend wären, zeigt, ii) einen erhöhten Ertrag unter Bedingungen, bei denen Wasser für das Wachstum einer nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon einschränkend wäre, zeigt, iii) einen erhöhten Ertrag unter Bedingungen von Dürre, vorzugsweise zyklische Dürre, wobei diese Bedingungen für das Wachstum einer nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon einschränkend wären, zeigt, und/oder iv) einen erhöhten Ertrag unter Bedingungen von niedriger Feuchtigkeit, wobei diese Bedingungen für das Wachstum einer nicht transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon einschränkend wären, zeigt.
Verfahren zur Erhöhung des Ertrags pro Acre in Mega-Environments, in denen die Pflanzen nicht oder nicht mehr ihr Ertragspotential erreichen, bei dem man Pflanze der entsprechenden Klasse/Gattung nach Anspruch 4 kultiviert.
Verfahren zur Erhöhung des Ertrags pro Acre in Mega-Environments, welches die folgenden Schritte umfasst: – Durchführen einer Bodenanalyse zur Messung der im Boden verfügbaren Nährstoffkonzentrationen, – Vergleichen des Ergebnisses mit dem Wert, der zum Erreichen des Ertragspotential einer Klasse/Gattung einer Pflanze erforderlich ist, – Kultivieren einer Pflanze der entsprechenden Klasse/Gattung nach Anspruch 4, wenn wenigstens einer der Nährstoffe nur eingeschränkt zur Verfügung steht.
Verfahren zur Erhöhung des Ertrags pro Acre in Mega-Environments, welches die folgenden Schritte umfasst: – Messen des Niederschlags über einen Zeitraum von wenigstens einer Pflanzengeneration, – Vergleichen des Ergebnisses mit dem Wert, der zum Erreichen des Ertragspotential einer Klasse/Gattung einer Pflanze erforderlich ist, – Kultivieren einer Pflanze der entsprechenden Klasse/Gattung nach Anspruch 4, wenn der Niederschlag vermindert ist.
Verfahren zur Erhöhung des Ertrags pro Acre in Mega-Environments, welches die folgenden Schritte umfasst: – Messen der Zeiträume zwischen Niederschlägen über einen Zeitraum von wenigstens einer Pflanzengeneration, – Vergleichen des Ergebnisses mit dem Wert, der zum Erreichen des Ertragspotential einer Klasse/Gattung einer Pflanze erforderlich ist, – Kultivieren einer Pflanze der entsprechenden Klasse/Gattung nach Anspruch 4, wenn die Trockenzeit verlängert ist.