CN102186974A - 通过在植物或其部分中提高或产生一种或更多活性具有提高产量的植物 - Google Patents

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Abstract

本发明一般涉及植物细胞，其通过在植物中提高或产生一种或更多产量相关蛋白质(YRP)和/或产量和胁迫相关蛋白质(YSRP)的活性得到，所述植物细胞优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞相比具有提高的产量。

Description

通过在植物或其部分中提高或产生一种或更多活性具有提高产量的植物
[0001.1.1.1]此处公开的本发明提供用于产生与相应的野生型植物相比具有提高产量的植物的方法，其包括在植物或其部分中提高或产生一种或更多活性。本发明还涉及增强或改善转基因植物和来自此类植物或部分的细胞、后代、种子和花粉的一个或更多性状的核酸，以及制备和使用此类植物细胞或植物、后代、种子或花粉的方法。特别是，所述改善的性状表现在优选通过改善一种或更多产量相关性状而提高的产量上。
[0002.1.1.1]本发明一般涉及通过在植物中提高或产生产量和胁迫相关蛋白质(YSRP)的一种或更多活性优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应未转化野生型植物细胞相比具有提高产量的植物细胞。
具体而言，本发明涉及经过定制以在暂时和反复的非生物胁迫和/或营养缺乏的条件下生长的植物。
本发明还涉及产生并筛选以及培育此类植物细胞或植物的方法。
[0003.1.1.1]近年来，人口增加和气候变化已经将全球食物、饲料和燃料短缺的可能性带到了尖锐的焦点上。在田地条件下，植物性能，例如生长、发育、生物量累积和种子产生依赖于植物对多种环境状况、变化和胁迫的承受和适应能力。自农业和园艺学开始以来，就需要在农作物栽培中改善植物性状。育种策略培育农作物特性以抵抗生物和非生物胁迫，提高营养利用效率并改变其它内在的农作物特定产量参数，即通过应用技术进步提高产量。植物是固着生物，因此需要应付多种环境胁迫。一方面生物胁迫如植物害虫和病原体和另一方面非生物环境胁迫是植物生长和生产率的主要限制因素，由此限制植物的栽培和地域分布。暴露在不同胁迫中的植物通常具有低产量的植物材料，如种子、果实或其它农产品。非生物和生物胁迫引起的农作物损失和农作物产量损失代表重要的经济和政治因素，并引起特别是许多不发达国家的食品短缺。
[0004.1.1.1]植物在其生命周期中也暴露于热、冷和盐胁迫下。保护策略与干旱抗性的保护策略相似。因为一些土壤中高盐含量导致供细胞吸收的可用水更少，其影响与干旱条件下观察到的那些影响相似。另外，在冰冻温度下，质外体中开始形成冰并从共质体中夺取水分而导致植物细胞损失水分(McKersie和Leshem，1994.Stress and Stress Coping in CultivatedPlants，Kluwer Academic Publishers)。生理学上这些胁迫也相互关联，并可诱导相似的细胞损伤。例如，干旱和盐胁迫主要表现为渗透胁迫，导致细胞中内环境稳定和离子分布遭到破坏(Serrano等，1999；Zhu，2001a；Wang等，2003)。经常伴随高温、盐度或干旱胁迫的氧化胁迫可引起功能或结构蛋白质变性(Smirnoff，1998)。因此，这些非生物胁迫经常激活类似的信号途径(Shinozaki和Ymaguchi-Shinozaki，2000；Knight和Knight，2001；Zhu 2001b，2002)和细胞应答，例如某些胁迫蛋白质、抗氧化剂和相容溶质的产生(Vierling和Kimpel，1992；Zhu等，1997；Cushman和Bohnert，2000)。
干旱、热、冷和盐胁迫具有对植物生长而言重要的共同主题，即水的可用度。植物在其生命周期中通常暴露在环境水可用度减少的条件下。大部分植物已进化出在这些低水或干燥条件下保护自己的策略。然而，如果干旱的严重性太大、持续时间太长的话，对植物发育、生长和大多数农作物产量的影响是极大的。因气候变化，预期这些条件在将来会出现。根据气候变化的一个公认设想，与以前相比不仅天气更加多变，而且平均温度会更高，平均降雨会更少。大多数植物将不能维持其保护策略以适应气候变化。持续暴露于干燥中引起植物新陈代谢的重大改变。新陈代谢的这些重大变化最终导致细胞死亡，因而造成产量损失。
[0005.1.1.1]农业生物技术已经尝试通过遗传修饰植物来满足人类不断增加的需要，所述遗传修饰例如通过赋予对非生物胁迫应答更高的耐受性或通过提高生物量来提高农作物产量。农作物产量此处定义为每英亩收获的相关农业产品(如谷粒、粮草或种子)的蒲式耳数量。农作物产量受非生物胁迫，如干旱、热、盐度和冷胁迫，以及植物大小(生物量)的影响。传统的植物育种策略相对缓慢，并且在赋予对非生物胁迫提高耐受性中一般还未成功过。在玉米中通过传统育种提高谷物产量已经几乎到达了平台。玉米中的收获指数，即收获时产量生物量与总累积生物量的比值在过去的一百年里谷物产量的选择性育种过程中基本保持不变。因此，在玉米中已经发生的近期产量提高是每单位土地面积上提高的总生物量产量。通过增加种植密度已经实现了该提高的总生物量，所述增加的种植密度已经导致适应性表型改变，如叶角度的减小，其可减少较低叶片的遮蔽，和穗大小，其可提高收获指数。
[0006.2.1.1]农业生物技术使用表明转基因对农作物产量潜在影响的其它参数的测量。对于饲料作物，像苜蓿、青贮作物和干草，植物生物量与总产量相关。然而对于谷类作物，其它参数已经用于评估产量，如植物大小，如通过总植物干重、地上干重、地上鲜重、叶片面积、茎体积、植物高度、莲座直径、叶长、根长、根质量、分蘖数目和叶数目测定。早期发育阶段的植物大小通常与发育晚期的植物大小相关。具有较大叶片面积的较大植物通常比较小的植物吸收更多的光和二氧化碳并因此将可能在相同的期间内获得更大重量。植物大小和生长速率具有强的遗传组分，并因此对于不同基因型范围，一种环境条件下植物大小有可能与在另一种环境条件下的大小相关。这样，标准环境用于接近田地中农作物在不同位置和时间遇到的不同环境和动态环境。
[0007.1.1.1]现在，已知许多遗传学和生物技术方法用于获得在非生物胁迫条件下生长的植物。
这些方法一般基于在植物细胞中引入并表达编码不同酶的基因，例如在WO2004011888、WO2006032708、US20050097640、US 20060037108、US20050108791，Serrano等(1999；Scientia Horticulturae 78：261-269)和许多其它文件中公开了所述不同酶。
来自谷氧还蛋白和硫氧还蛋白家族的基因的表达赋予对环境胁迫，尤其是对盐度或寒冷(EP1 529 112 A)的提高的耐受性。这些植物比易感植物具有更高的种子产量、光合作用和干物质产量。对于这些植物在稀少的营养使用条件下的发育是一无所知的。
[0008.1.1.1]因为植物发育和生理学上的不平衡，转化的且具有胁迫抗性的植物经常显示更慢的生长和减少的生物量，因此具有更强的适应性(Kasuga等，1999，Danby和Gehring等，2005)。这导致严重的生物量和产量损失。有时，根/茎干重比值随着植物水胁迫的发展而增加。这种增加主要是因为茎干重的相对减少。种子产量与地上干重的比值在许多环境条件下相对稳定并因此可经常获得植物大小与谷物产量间的稳健相关性。因为大多数谷物生物量依赖于通过植物叶和茎的当前储藏的光合生产力，这些过程是内在关联的。因此，甚至在发育早期阶段选择植物大小已用作未来潜力的指标。
在一些情况(US20060037108)下，通过停止浇水6到8天干旱处理后观察到提高的生物量，主要是更高的茎生物量。
[0009.1.1.1]当土壤水分缺失或如果在干旱期间得不到水，农作物产量则受限制。“干旱”可定义为一组环境条件，在所述环境条件下植物开始经受脱水的影响，如减少的气孔导度和光合作用、降低的生长速率、膨压丧失(萎蔫)或胚珠败育。为此，经历干旱胁迫的植物通常在生物量和产量上显示显著的降低。脱水可能是由缺少降雨或有限灌溉引起。或者，水分短缺也可能是由高温、低湿度、盐土、冰冻温度或水塞土壤引起，它们损伤根并限制茎吸收水分。
[0010.1.1.1]农业生物技术已经尝试开发通过非生物胁迫耐受性提高或通过提高的生物量生产显示提高产量的转基因植物。
但在田地条件下，植物在其生命周期内通常暴露在环境水可用度减少的若干条件周期中。非生物胁迫耐受性或生物量实际上不能满足需要。
[0011.2.1.1]已经表征了在植物中参与胁迫应答、水分利用和/或生物量的一些基因，但迄今为止，已经限制了开发具有提高产量的转基因农作物植物的成功，并且此类植物还没有被商业化。
[0011.3.1.1]因此，需要鉴定赋予对多种组合的胁迫的抗性或在最佳和/或次优生长条件下赋予提高产量的基因。因此，需要鉴定具有提高农作物产量的能力的额外基因。
[0011.4.1.1]需要鉴定在植物中表达的基因，其具有对其宿主植物和其它植物物种赋予对暂时和反复的非生物胁迫提高的抗性的能力，还具有在胁迫周期后赋予缩短的恢复期和在生命周期，特别是在最后收获时赋予提高的产量的能力。
[0011.5.1.1]因此，在一个实施方案中，本发明提供用于产生与相应的野生型植物相比具有提高产量的植物的方法，由此所述方法包括至少以下步骤：在植物中，此处指出的细胞中、细胞质或亚细胞区或细胞器或组织中提高或产生选自以下的一种或更多活性(在下文中称为一种或更多“活性”或一种或更多“所述活性”或对于一种所选活性为“所述活性”)：磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、精氨酸/丙氨酸氨肽酶、D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶、二酰甘油焦磷酸磷酸酶、二酪氨酸转运蛋白、法尼二磷酸法尼基转移酶、NAD+依赖性甜菜碱醛脱氢酶、丝氨酸水解酶、参与赋予酮康唑抗性的转录调节子、尿苷激酶、yal043c-a-蛋白质、ybr071w-蛋白质和ydr445c-蛋白质，例如表I中所示。
[0012.1.1.1]在一个实施方案中，本发明提供通过提供“产量和胁迫相关蛋白质”YSRP产生具有这些性状的转基因植物细胞的方法。
[0012.2.1.1]在其它实施方案中，本发明提供在此处指出的细胞、细胞质或亚细胞区或细胞器或组织中过量表达表I中鉴定的分离的多核苷酸的转基因植物。本发明的转基因植物与植物的野生型变种相比显示改善的产量或提高的产量。术语“改善的产量”或“提高的产量”可互换使用。
[0013.2.1.1]如此处所用，术语“产量”一般指来自植物，特别是农作物的可测量生产。可以许多方式测量产量和产量提高(与未转化的起始或野生型植物相比)，并应该理解技术人员能够在特定实施方案、涉及的特定农作物和涉及的特定目的或应用方面应用正确的意义。
如此处所用，术语“改善的产量”或术语“提高的产量”表示任何测量的植物产品，如谷粒、果实或纤维的产量的任何改善。根据本发明，不同表型性状的改变可改善产量。例如，但不限于，参数如花器官发育、根起始、根生物量、种子数量、种子重量、收获指数、对非生物环境胁迫的耐受性、叶形成、向光性、顶端优势、和果实发育是改善产量的合适量度。产量的任何提高是本发明的改善的产量。例如，产量的改善可包含任何测量参数0.1％、0.5％、1％、3％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高的增加。例如，与相同条件下培育的未处理大豆或玉米的蒲式耳/英亩产量相比，来自包含对表I resp.II的核苷酸和多肽为转基因的植物的农作物的大豆或玉米的蒲式耳/英亩产量的提高是本发明的改善产量。可在缺失或存在胁迫条件下实现提高的或改善的产量。
例如，增加的或提高的“产量”指选自生物量产量、干生物量产量、地上干生物量产量、地下干生物量产量、鲜重生物量产量、地上鲜重生物量产量、地下鲜重生物量产量；可收获部分的增加产量，干重或鲜重或两者、地上或地下部分或两者；农作物果实的增加产量，干重或鲜重或两者、地上或地下部分或两者；和优选地种子的增加产量，干重或鲜重或两者、地上或地下部分或两者的一个或更多产量参数。
[0014.2.1.1]例如，本发明提供通过提高或产生上文提及的一种或更多所述活性来产生转基因植物细胞或植物的方法，所述转基因植物细胞或植物与相应的(例如未转化的)野生型或起始植物相比，显示增加的产量相关性状，例如对环境胁迫的提高耐受性和/或提高的固有产量和/或生物量产生。
[0014.3.1.1]与未转化的起始或野生型植物相比，通常通过增加或改善植物的一个或更多产量相关性状完成本发明的所述提高的产量。导致产量提高的植物此类产量相关性状的改善包括，但不限于植物内在生产力的提高、提高的营养利用效率，和/或提高的胁迫耐受性。
[0015.1.1.1]植物生命周期中水分亏缺的频率随气候变化而变化。这可通过精细分类到CIMMYT使用的大环境中，以指导小麦和玉米中的育种程序。
大环境是具有相似生物和非生物胁迫和耕作系统需求的广泛的非必须连续地理区域。实际上，大环境由农作物生产因素(温度、降雨、日光、纬度、海拔、土壤特性和疾病)、消费者偏好(谷粒的颜色及其怎么使用)和小麦生长习性确定。研究人员为春小麦鉴定了6个大环境，并且3个各自用于兼性(facultative)和冬小麦。
此类大环境对包括农作物的每一植物物种均可行。
本发明的目标是提供当在具有低降雨的大环境，例如小麦大环境ME1、ME4、ME4A、ME4B、ME4C、ME5、ME5B、ME6、ME6B、ME9、ME12或特定植物物种的各自大环境中培育时，优选暂时和反复的非生物胁迫的条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比，具有提高的产量，例如增加的产量相关性状，例如对非生物环境胁迫的增强耐受性，例如提高的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或提高的营养利用效率、固有产量和/或另一提及的产量相关性状的转基因植物细胞、植物或其部分。
[0015.2.1.1]为了比较相同物种植物的产量与环境条件的关联，产量潜力的参数是重要的。产量潜力定义为当在其适应的环境中生长时植物的产量，所述环境中具有不受限制的营养物和水，并具有有效控制的害虫、疾病、杂草、倒伏和其它胁迫。“产量”指最终收获时的产品质量。在田地条件下将不能实现产量潜力。然而，其为在大环境中定义最佳培养条件的参数，因为仅在最佳条件下才会实现产量潜力。
[0016.1.1.1]仍然需要鉴定编码具有活性的多肽的基因，当产生或提高所述活性时，优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下赋予提高的产量，尤其优选在次优生长条件下，优选在缺水条件下赋予提高的产量。本发明的目标是鉴定新的方法以在植物或植物细胞中赋予胁迫耐受性和/或抗性。
本发明的另一目标是提供植物，所述植物是水胁迫抗性的并且额外地在暂时和反复的非生物胁迫，优选在循环干旱条件下显示等同的，优选提高的生物量生产。
[0016.2.1.1]进一步需要鉴定在胁迫耐受植物中表达的基因，所述胁迫耐受植物优选在暂时和反复的非生物胁迫条件，尤其是在与可实现产量潜力的条件不对应的任何次优生长条件下具有赋予提高的产量，例如增加的产量相关性状，例如对非生物环境胁迫的增强耐受性，例如提高的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或提高的营养利用效率、固有产量和/或另一提及的产量相关性状的能力。
[0017.1.1.1]因此，在一个实施方案中，本发明提供通过提高或产生选自以下活性的一种或更多活性产生转基因植物细胞的方法：磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、精氨酸/丙氨酸氨肽酶、D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶、二酰甘油焦磷酸磷酸酶、二酪氨酸转运蛋白、法尼二磷酸法尼基转移酶、NAD+依赖性甜菜碱醛脱氢酶、丝氨酸水解酶、参与赋予对酮康唑抗性的转录调节子、尿苷激酶、yal043c-a-蛋白质、ybr071w-蛋白质和ydr445c-蛋白质，所述转基因植物细胞优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞相比具有提高的产量，例如增加的产量相关性状，例如对非生物环境胁迫的增强耐受性，例如提高的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或提高的营养利用效率、固有产量和/或另一提及的产量相关性状。
[0018.2.1.1]在本发明的一个实施方案中，具有选自以下活性的蛋白质和如表II，第5列和第7列中描述的多肽被称为“产量相关蛋白质”YRP或“产量和胁迫相关蛋白质”YSRP：磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、精氨酸/丙氨酸氨肽酶、D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶、二酰甘油焦磷酸磷酸酶、二酪氨酸转运蛋白、法尼二磷酸法尼基转移酶、NAD+依赖性甜菜碱醛脱氢酶、丝氨酸水解酶、参与赋予对酮康唑抗性的转录调节子、尿苷激酶、yal043c-a-蛋白质、ybr071w-蛋白质和ydr445c-蛋白质。
[0019.1.1.1]在一个实施方案中，术语“提高的产量”指任何生物量增加。
在一个实施方案中，术语“提高的产量，优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下”指提高的产量和对暂时和反复的非生物胁迫条件的提高的抗性，例如对暂时和反复的非生物胁迫的提高的耐受性。
在本发明的一个实施方案中，通过增加选自一种或更多非生物胁迫耐受性的一个或更多产量相关性状来提高植物产量。
一般地，术语“提高的胁迫耐受性”可定义为在胁迫条件下与未转化野生型或起始植物相比植物的存活，和/或更高的产量生产。
为了说明本发明的目的，术语“增强的非生物胁迫耐受性”、“增强的非生物环境胁迫抗性”、“增强的环境胁迫耐受性”、“改善的环境胁迫适应性”和意义类似的其它变型和表述可互换使用，并指但不限于与相应的(未转化)野生型(或起始)植物相比，对此处所述的一种或更多非生物环境胁迫，优选暂时和反复的非生物胁迫的耐受性的改善。
如此处所用，术语“非生物胁迫”指任何次优生长条件，并包括，但不限于与干旱、寒冷或盐度或其组合相关的次优条件。在优选的实施方案中，非生物胁迫是干旱和低水含量。其中干旱胁迫表示导致植物缺水或植物水供应减少的任何环境胁迫。此外，该胁迫是暂时且反复的。
在本发明的一个实施方案中，术语“提高的产量，优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下”涉及提高的水胁迫抗性，所述水胁迫是寒冷，和/或盐的次要胁迫，和/或当然在干旱中作为主要胁迫。
在本发明的一个实施方案中，术语“提高的产量，优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下”涉及优选在水胁迫条件下提高的产量，所述水胁迫是寒冷，和/或盐的次要胁迫，和/或当然是干旱中的主要胁迫。
[0020.1.1.1]如此处所用，术语“次优生长条件”也指有限的营养物可用度和次优可处置性。
在一个实施方案中，有限的营养物可用度是干旱和低水含量。
在一个实施方案中，有限的营养物可用度是选自磷、钾和氮的营养物中次优可处置性。
在一个实施方案中，有限的营养物可用度是氮的次优可处置性。
在一个实施方案中，通过增强的营养利用效率的产量相关性状增加本发明转基因植物的生物量。可通过改善植物的营养物同化的一般效率(例如在改善一般营养物吸收和/或运输方面，改善植物的一般运输机制、同化途径改善等)，和/或通过改善营养物(包括，但不限于磷、钾和氮)的特定营养利用效率来阐明植物营养利用效率的改善或提高。
[0020.2.1.1]所以，也可以通过提高“植物的营养利用效率”，例如通过改善营养物，包括但不限于磷、钾和氮的利用效率来介导提高的植物产量。例如，需要能够更有效地利用氮的植物，使得需要更少的氮用于生长，并因此在氮缺少条件下导致改善的产量水平。此外，可利用当前的或标准的氮利用水平来获得更高的产量。因此，通过提高植物或其部分的氮利用效率(NUE)提高植物产量。因为与农产品的收入相关的氮肥成本高，以及对环境的有害作用，期望开发策略以减少氮输入和/或优化氮吸收和/或给定氮可用度的利用，同时维持植物，优选培育植物，例如农作物的最佳产量、生产力和质量。还期望在相似或甚至更差质量土壤上利用更低肥料输入维持农作物产量和/或更高的产量。
[0020.3.1.1]在一个实施方案中，根据此处描述的方法确定氮利用效率。因此，在一个实施方案中，本发明涉及用于提高产量的方法，其包括以下步骤：
(a)测量土壤中的氮含量，和
(b)确定土壤中的氮含量对起始植物或野生型植物，例如农作物的生长是最佳的还是次优的，和
(c1)如果所述氮含量对起始植物或野生型植物的生长是次优的，那么在所述土壤中培育本发明的植物，或
(c2)如果所述氮含量对起始植物或野生型植物是最佳的，在所述土壤中培育本发明的植物并比较所述产量与标准的起始或野生型植物的产量，选择并培育显示更高的或最高产量的植物。
[0020.4.1.1]植物营养物对植物的生长和发育至关重要，并因此也对植物产品的数量和质量至关重要。因为营养物吸收以及营养物利用的效率对植物产量和产品质量的强烈影响，向土壤中倾倒大量的肥料，以优化植物生长和质量。
在本发明中，例如并优选地根据以下方法确定对有限营养物可用度的增强的耐受性：
为了高通量目的，在含有有限氮供应的琼脂平板上筛选植物的生物量产生(从Estelle和Somerville改进，1987)。该筛选流水线由两个水平构成。如果生物量产生与野生型植物相比显著提高，那么转基因株系经历随后的水平。重复的数量和统计学严格性随各水平提高。
对于播种，通过牙签从Eppendorf管中取出在冰箱(-20℃)中保存的种子并转移到含有有限氮供应(0.05mM KNO3)的上述琼脂平板上。将种子播种后，平板在黑暗中4℃进行成层2-4天。成层后，测试平板在16小时光照、8小时黑暗节律下，20℃，60％大气湿度和大约400ppm的CO2浓度中生长22到25天。所用的光源产生了与太阳光谱相似的光，其具有大约100μE/m2s的光强度。10到11天后，所述植物个体化。在20-25天生长后，通过转基因植物的茎和根生物量产生与野生型对照植物相比来评估在氮限制条件下的改善生长。
与野生型植物相比显示生物量产生显著改善的转基因株系进行后续水平的以下实验：
在拟南芥的情况下，在含有营养耗尽土(“Einheitserde Typ 0”，30％粘土，Tantau，Wansdorf Germany)和沙的1∶1(v∶v)混合物的盆中播种种子。通过在4℃黑暗中4天周期来诱导萌发。随后，植物在标准生长条件(16小时光照和8小时黑暗的光周期，20℃，60％相对湿度，和200μE或大约170μE resp.的光子通量密度)生长。种植并培养所述植物，尤其是每隔一天用氮耗尽的营养液浇水。所述氮耗尽的营养液例如含有beneath水。
矿质营养物 终浓度
KCl 3.00mM
MgSO4 x 7 H2O 0.5mM
CaCl2 x 6 H2O 1.5mM
K2SO4 1.5mM
NaH2PO4 1.5mM
Fe-EDTA 40μM
矿质营养物 终浓度
H3BO3 25μM
MnSO4 x H2O 1μM
ZnSO4 x 7 H2O 0.5μM
Cu2SO4 x 5 H2O 0.3μM
Na2MoO4 x 2 H2O 0.05μM
9到10天后将植物个体化。总计28到31天，优选29到31天后，收获植物并通过植物地上部分的鲜重检定等级。生物量提高被测定为各转基因植物地上部分的鲜重与未转基因野生型植物的鲜重的比值。
因此，在本发明的一个实施方案中，本发明转基因植物在有限营养物，优选氮可用度的胁迫条件下与野生型对照相比表现生物量增加。
[0021.2.1.1]在另一实施方案中，本发明提供可进行上述方法，使得在无营养物不足以及无胁迫条件下产量提高。
[0021.3.1.1]在本发明的一个实施方案中，术语“非生物胁迫”包括甚至没有基本的非生物胁迫。在本发明中，例如并优选地根据以下方法测定生物量增加：
在生长室(例如York，Mannheim，Germany)的盆中栽培转化的植物。在所述植物是拟南芥的情况下，在含有营养丰富土(GS90，Tantau，Wansdorf，Germany)和任选地石英砂的3.5∶1(v∶v)混合物的盆中播种其种子。
[0021.4.1.1]所述方法可进一步包括以下步骤：
用土壤混合物填充盆，并将其置于托盘中。向所述托盘中添加水，使土壤混合物吸收适当量的水用于播种步骤。在植物是拟南芥的情况下，在盆(直径6cm)中播种转基因拟南芥植物及其非转基因野生型对照的种子。然后用透明盖子覆盖填满的托盘并将其转移到预冷(4℃-5℃)且黑暗的生长室中。在4℃-5℃黑暗中3-4天的时间里建立分层。在200℃，60％相对湿度，16小时光周期和大约170μmol/m2s的荧光灯照明的生长条件下开始种子的萌发与生长。播种后7-8天去除盖子。在第10天或第11天(播种后9天或10天)通过从顶部喷洒含有小植株的盆完成BASTA选择。在标准实验中，喷洒一次自来水中BASTA浓缩物(183g/l草铵膦)的0.07％(v/v)溶液，或者喷洒三次BASTA的0.02％(v/v)溶液。仅用自来水喷洒(而不是用在自来水中溶解的BASTA喷洒)野生型对照植物，但其它方面进行相同处理。播种后13-14天通过去除多余的幼苗并在土壤中保留一株幼苗将植物个体化。转基因植物和野生型对照植物均匀分布在生长室中。
在标准实验中去除盖子后每隔一天，或者每天进行浇水。为了测量生物量性能，在收获时间(播种后24-29天)通过切割茎并称重它们测量植物鲜重。当收获时，植物处于开花前阶段和花序生长前阶段。转基因植物与在同一天收获的非转基因野生型对照植物比较。可通过应用“斯氏”t检验(参数：双边，不等方差)计算生物量变化的统计学显著性的显著性值。
可通过称重植物莲座测定生物量产生。生物量增加计算为来自同一实验的转基因植物的平均重量与野生型对照植物的平均重量的比值。
[0021.5.1.1]在植物是拟南芥的情况下，标准生长条件是：16小时光照和8小时黑暗的光周期，60％相对湿度和220μmol/m2s的光子通量密度。种植并培养植物。在植物是拟南芥的情况下，每隔一天对它们进行浇水。13到14天后，将植物个体化。转基因植物和野生型对照植物平均分布在生长室中。在标准实验中去除盖子后每隔一天，或者每天进行浇水。为了测量生物量性能，在收获时间(播种后26-27天)通过切割茎并称重它们测量植物鲜重。或者，收获时间是播种后24-25天。除了称重，在植物不同于野生型对照的情况下加入表型信息。收获时，植物处于开花前阶段和花序生长前阶段。
因此，在本发明的一个实施方案中，本发明的转基因植物在低温胁迫条件下与野生型对照相比显示生物量增加。
[0022.2.1.1]在本发明的另一实施方案中，本发明植物的所述产量相关性状是所述植物提高的低温耐受性，例如包括耐冻性和/或耐冷性。低温影响多种生物学过程。它们延缓或抑制几乎所有的代谢和细胞过程。植物对低温的应答是其生态学范围的重要决定因素。延长生长季节到在高纬度或海拔发现的短夏季之外的需要加剧了应付低温的问题。大多数植物已经进化出在低温条件下保护自身的适应性策略。一般地，对低温的适应可分为耐冷性和耐冻性。
[0022.3.1.1]在本发明的一个实施方案中，术语“提高的产量，优选在暂时和反复的非生物胁迫的条件下”涉及提高的抗冷性。
在本发明的一个实施方案中，术语“提高的抗冷性”涉及低温耐受性，包括耐冻性和/或耐冷性。
另外，改善的或增强的“耐冷性”或其变型指对10℃左右的低温但非冰冻温度，优选1到18℃，更优选4-14℃，并最优选8到12℃，11到12℃之间的温度(下文称作“冷冻温度”)的适应性提高。
改善的或增强的“耐冻性”或其变型指对接近或低于零度的温度，即优选低于4℃，更优选低于3或2℃，并特别优选在0℃或低于0(零)℃或低于-4℃的温度，或甚至低至-10℃或更低的极端低温(下文称作“冰冻温度”)的适应性提高。
更一般性地，对环境胁迫，像低温，例如冰冻和/或冷冻温度的“提高的适应性”指与相应的未转化野生型植物相比提高的生物量生产产。
因此，为了描述本发明目的，关于对植物，优选对农作物的低温胁迫的术语“低温”指如此处所述的任何低温条件，优选如上下文需要，如上文定义的冷冻和/或冰冻温度。应理解技术人员将能够从本说明书具体上下文中识别“低温”指哪个温度或温度范围。
在本发明中，例如并优选根据以下一种方法确定对低温的增强耐受性：
[0022.4.1.1]在标准实验中，土壤制备为营养丰富土(GS90，Tantau，Wansdorf，Germany)和沙的3.5∶1(v/v)混合物。用土壤混合物填充盆，并将其置于托盘中。向所述托盘中添加水，使土壤混合物吸收适当量的水用于播种过程。在植物是拟南芥的情况下，在盆(直径6cm)中播种转基因拟南芥植物的种子。收集盆直至它们填满托盘用于生长室中。然后用透明盖子覆盖填充的托盘并将其转移到预冷(4℃-5℃)的生长室的架子系统中。在4℃-5℃黑暗中2-3天的时间里建立分层。在20℃，60％相对湿度，16小时光周期和大约200μmol/m2s的荧光灯照明的生长条件下开始种子的萌发与生长。播种后7天去除盖子。在播种后第9天通过从顶部喷洒含有小植株的盆完成BASTA选择。因此，喷洒自来水中BASTA浓缩物(183g/l草铵膦)的0.07％(v/v)溶液。转基因植物和野生型对照植物随机分布在生长室中。在播种后第7天工作日改变托盘在生长室中的位置。从托盘中去除盖子后每隔一天进行浇水。在播种后12-13天通过去除盆中多余的幼苗，仅保留一株幼苗来将植物个体化。播种后14天施加寒冷(冷至11℃-12℃)，直至实验结束。为了测量生物量性能，在收获时间(播种后29-36天)，通过切割茎并称重测定植物鲜重。当收获时，植物处在开花前和花序生长前阶段。转基因植物与在同一天收获的非转基因野生型对照植物进行比较。可通过应用”斯氏”t检验(参数：双边，不等方差)计算生物量变化的统计学显著性的显著性值。
可通过称重植物莲座测定生物量生产。生物量增加可计算为来自同一实验的转基因植物的平均重量与野生型对照植物平均重量的比值。
[0022.5.1.1]转化植物在生长室的盆(例如York，Mannheim，Germany)中生长。在植物是拟南芥的情况下，在含营养丰富土(GS90，Tantau，Wansdorf，Germany)的3.5∶1(v∶v)混合物的盆中播种其种子。植物在标准生长条件下生长。在植物是拟南芥的情况下，所述标准生长条件是：16小时光照和8小时黑暗的光周期，20℃，60％相对湿度，和200μmol/m2s的光子通量密度。种植并培养植物。在植物是拟南芥的情况下，每隔一天进行浇水。12到13天后，将植物个体化。在播种后14天施加寒冷(例如冷至11-12℃)，直至实验结束。为了测量生物量性能，在收获时间(播种后29-30天)通过切割茎并称重测定植物鲜重。除了称重，在植物不同于野生型对照的情况下，加入表型信息。
因此，在本发明的一个实施方案中，提高的抗冷性表现在本发明的转基因植物在低温胁迫条件下与野生型对照相比生物量增加。
在本发明的一个实施方案中，术语“提高的产量，优选在暂时和反复的非生物胁迫的条件下”涉及提高的抗冷性，表示低温耐受性，包含耐冻性和/或耐冷性。
在本发明的一个实施方案中，术语“提高的产量，优选在暂时和反复的非生物胁迫的条件下”涉及提高的抗盐性。
[0022.6.1.1]因此，在一个实施方案中，本发明涉及提高产量的方法，其包括以下步骤：
(a)测定种植区域的温度是对起始植物或野生型植物，例如农作物的生长是最佳的还是次优的；和
(b1)如果所述温度对所述区域中生长的起始植物或野生型植物的生长是次优的；在所述土壤中种植本发明的植物；或
(b2)如果所述温度对起始植物或野生型植物是最佳的，在所述土壤中种植本发明的植物并比较所述产量与标准的起始或野生型植物的产量，选择并种植显示更高的或最高产量的植物。
[0023.2.1.1]进一步对于低营养物可用度和低温而言，术语非生物胁迫耐受性指例如低温耐受性、干旱耐受性或改善的水分利用效率(WUE)、热耐受性、盐胁迫耐受性及其它。也使用植物对干旱、渗压休克和温度极限的研究来确定植物对非生物胁迫的耐受性或抗性。
植物中的胁迫耐受性像低温、干旱、热和盐胁迫耐受性可以具有对植物生长而言重要的共同主题，即水的可用度。植物在其生命周期中通常暴露在环境水含量减少的条件下。保护策略与耐冷性的保护策略类似。
因此，在本发明的一个实施方案中，所述产量相关性状与本发明植物提高的水分利用效率和/或本发明植物对干旱条件的提高耐受性相关。水分利用效率(WUE)是通常与干旱耐受性相关的参数。低水分可用度下生物量的增加可能是因为相对改善的生长效率或减少的水分消耗。在选择用于改善农作物的性状中，水分利用减少而无生长改变将在水分输入费用高的灌溉农业系统中具有特殊优点。生长增加而水分利用没有相应上涨将对所有农业系统具有适用性。在水分供应不受限制的许多农业系统中，生长的增加，即使它以水分利用增加为代价也会提高产量。当土壤水分耗尽时或如果在干旱期间不能获得水分，农作物产量会受到限制。如果叶的蒸腾作用超过来自根部的水分供应，那么就会发生植物水分亏缺。可用的水供应与土壤中保持的水分含量以及植物利用其根系统获得水的能力相关。水分从叶的蒸腾与通过气孔光合作用对二氧化碳的固定相关联。两个过程正相关，所以通过光合作用进行的高二氧化碳流入与通过蒸腾作用的水分损失密切关联。因为水分从叶中蒸腾，叶水势降低，并且在水压过程中气孔倾向于关闭，限制光合作用的量。因为农作物产量依赖于光合作用中二氧化碳的固定，水分吸收和蒸腾是农作物产量的贡献因素。能够使用较少的水分固定相等量的二氧化碳的植物或能够在较低的水势正常发挥功能的植物具有进行更多光合作用，并由此在许多农业系统中产生更多的生物量和经济产量的潜力。
干旱胁迫指导致植物缺水或减少植物水供应的任何环境胁迫，包括低温和/或盐的次要胁迫，和/或干旱或热的主要胁迫，例如脱水等。
[0023.3.1.1]在本发明的优选实施方案中，术语“提高的产量，优选在暂时和反复的非生物胁迫的条件下”涉及提高的干旱抗性。
在一个实施方案中，提高的干旱抗性指对干旱周期的抗性，干旱周期意为干旱和再浇水的交替周期。
在本发明中，例如并优选根据以下方法确定对循环干旱的增强耐受性：
转化植物在生长室的盆(例如York，Mannheim，Germany)中生长。在植物是拟南芥的情况下，土壤制备为营养丰富土(GS90，Tantau，Wansdorf，Germany)和石英砂的1∶1(v/v)混合物。用该混合物填充盆(直径6cm)，并将其置于托盘中。向所述托盘中添加水，使土壤混合物吸收适当量的水用于播种过程(第1天)，随后在盆中播种转基因拟南芥植物及其野生型对照的种子。然后用透明盖子覆盖填充的托盘并将其转移到预冷(4℃-5℃)且黑暗的生长室中。在4℃-5℃黑暗中3天或4℃黑暗中4天时间里建立分层。在20℃，60％相对湿度，16小时光周期和大约200μmol/m2s或220μmol/m2s的荧光灯照明的生长条件下开始种子的萌发与生长。播种后7-8天去除盖子。在播种后第10天或第11天(播种后9天或10天)通过从顶部喷洒含有小植株的盆完成BASTA选择。在标准实验中，喷洒一次自来水中BASTA浓缩物(183g/l草铵膦)的0.07％(v/v)溶液，或者喷洒三次BASTA的0.02％(v/v)溶液。仅用自来水喷洒(而不是用在自来水中溶解的BASTA进行喷洒)野生型对照植物，但其它方面进行相同处理。播种后13-14天通过去除多余的幼苗并在土壤中保留一株幼苗将植物个体化。转基因植物和野生型对照植物均匀分布在生长室中。
整个实验过程中限制水供应，并使植物经历干旱和再浇水的循环。在第1天(播种前)、第14或第15天、第21或第22天，最后在第27或28天进行浇水。为了测量生物量性能，在最后浇水后一天(第28或29天)通过切割茎并称重测定植物鲜重。除了称重，如果植物不同于野生型对照，加入表型信息。当收获时，植物处在开花前和花序生长前阶段。通过应用”斯氏”t检验(参数：双边，不等方差)计算生物量改变的统计学显著性的显著性值。
因此，在本发明的一个实施方案中，提高的抗冷性表现在本发明的转基因植物在循环干旱胁迫条件下与野生型对照相比生物量增加。
[0023.4.1.1]因此，在一个实施方案中，本发明涉及提高产量的方法，其包括以下步骤：
(a)确定种植区域中的水供应对起始植物或野生型植物，例如农作物的生长是最佳的还是次优的，和/或确定种植区域中生长的植物损伤的可见症状；和
(b1)如果所述水供应对起始或野生型植物的生长是次优的或在所述区域中生长的标准起始或野生型植物中可发现干旱的可见症状；那么在所述土壤中种植本发明的植物；或
(b2)如果所述水供应对起始植物或野生型植物是最佳的，在所述土壤中种植本发明的植物并比较所述产量与标准的起始或野生型植物的产量，选择并种植所述植物，其显示更高的或最高的产量。
表明一个或两个、三个或更多以下特征任何组合的可见损伤症状：萎蔫；叶变褐；膨压消失，其导致叶或针状茎和花下垂；叶或针叶下垂和/或脱落；叶绿色，但与对照相比叶以轻微的角度朝向地面；叶片开始向内折叠(卷曲)；叶或针叶的过早衰老；叶或针叶中叶绿素损失和/或黄化。
[0025.2.1.1]在本发明的其它实施方案中，本发明植物的所述产量相关性状是所述植物对热条件的提高的耐受性。
[0026.1.1.1]在本发明的其它优选实施方案中，术语“提高的产量，优选在暂时和反复的非生物胁迫的条件下”涉及在暂时和反复的非生物胁迫条件下，尤其在任何次优生长条件下，与未转化的野生型植物相比赋予提高的产量。
在一个实施方案中，次优生长条件是与其中可实现产量潜力的各条件不对应的任何条件。
在一个实施方案中，最佳生长条件是选自以下的条件：
-气候条件和环境条件，因为它们主要在过去的50、25、20、15、10或5年3、6、12个月期间或称为澳大利亚西部的小麦带区域、美国的玉米带(包括爱荷华州、印地安那州、伊利诺斯州、俄亥俄州、南达科他州、内布拉斯加州、堪萨斯州、明尼苏达州、威斯康辛州、密西根州、密苏里州和肯塔基州中的至少一个州)的大环境中的栽培期间。
-气候条件和环境条件，因为它们主要在过去50、25、20、15、10或5年3、6、12个月期间或CIMMYT为玉米和小麦提及的大环境中的栽培期间。
[0026.2.1.1]在本发明的一个实施方案中，术语“提高的产量，优选在暂时和反复的非生物胁迫的条件下”定义为在暂时和反复的非生物胁迫条件下植物比未转化野生型植物更长的存活。
暂时和反复的非生物胁迫条件指水分不足的条件，换言之，植物在水分不足的条件下存活并且其生长比未转化野生型植物更长，而不显示任何损伤症状，如萎蔫和叶变褐和/或卷曲，另一方面，所述植物在视觉上是膨胀的并在颜色上为健康的绿色。
[0026.3.1.1]在本发明的一个实施方案中涉及用于提高每英亩或每栽培面积产量的方法，其包括步骤：
-进行环境条件的分析，以测定土壤中可获得的营养物(包括水)水平或每栽培周期的降雨，
-比较各种条件的值与最佳生长条件下的值的结果，
-在偏离最佳生长条件值5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更高的至少一种测定条件下，根据本发明栽培各种类/属的植物。
[0027.1.1.1]在本发明的一个实施方案中，术语“提高的产量”、“提高的生物量”或“提高的生物量生产”指与相应的未转化野生型植物相比，植物从第一次停止浇水或在收获时显示提高的生长速率。提高的生长速率包含整株植物的生物量产生提高，植物可见部分(例如茎、叶和花序)生物量增加，可见的更高且更大的茎。
在一个实施方案中，提高的产量和/或提高的生物量生产包括更高的种子产量、更快的光合作用和/或更多的干物质产生。
在本发明的一个实施方案中，术语“提高的生物量生产”指与相应的未转化野生型植物相比，植物从停止浇水开始显示延长的生长。延长的生长包含当未转化野生型植物显示可见的损伤症状时，整株植物存活和/或继续生长。
在本发明的一个实施方案中，术语“提高的产量”指与相应的未转化野生型植物相比，植物再浇水后显示增加的恢复期，指不显示任何或更少的损伤症状，如萎蔫和叶变褐和/或卷曲，另一方面所述植物在视觉上膨胀并在颜色上为健康的绿色。
[0027.2.1.1]根据本发明，可通过以下方面显示涉及植物固有产量能力提高的产量相关性状：提高特定(固有)种子产量(例如在增加的种子/谷粒大小、增加的穗数、每穗增加的种子数量、种子填充的改善、种子组成的改善、胚和/或胚乳改善等方面)；植物内在生长和发育机制的修饰和改善(如植物高度、植物生长速率、荚果数量、植物上的荚果位置、节间的数量、荚果落粒的发生率、小结形成和氮固定的效率、碳同化的效率、幼苗活力/早期活力的改善、(胁迫或非胁迫条件下)提高的萌发效率、植物结构的改善、细胞周期修饰、光合作用修饰、多种信号途径修饰、转录调节修饰、翻译调节修饰、酶活性修饰等)；等。
根据本发明，可通过改善植物营养物同化的一般效率(例如，在改善一般营养物吸收和/或运输方面、改善植物的一般运输机制、同化途径改善等)，和/或通过改善营养物(包括但不限于磷、钾和氮)的特定营养利用效率来显示与植物的营养利用效率改善或提高相关的产量相关性状。
根据本发明，可通过改善或提高植物对生物和/或非生物胁迫的耐受性来显示与植物胁迫耐受性改善或提高相关的产量相关性状。在本申请中，生物胁迫一般指植物病原体和植物害虫，其包括但不限于真菌疾病(包括卵菌疾病)、病毒疾病、细菌疾病、昆虫侵袭、线虫侵袭等。在本申请中，非生物胁迫一般指植物通常面临的非生物环境条件，包括通常称为“非生物胁迫”条件的条件，包括但不限于干旱(因改善的水分利用效率实现对干旱的耐受性)、热、低温和寒冷条件(如冰冻和冷冻条件)、盐度、渗透胁迫、阴暗、高植物密度、机械胁迫、氧化胁迫等。
根据本发明，与植物固有产量能力和/或植物对非生物胁迫耐受性提高的产量相关性状的改善是用于增强或改善所述植物产量的特别优选的实施方案。
如此处所用，术语“产量”一般指来自植物，特别是农作物的可测量产品。
可以多种方式测定产量和产量提高(与未转化起始或野生型植物相比)，并且应理解技术人员能够在特定实施方案、涉及的特定农作物和涉及的特定目的或应用方面应用正确的意义。
在此处所述本发明的优选实施方案中，产量的提高指提高的生物量产量、提高的种子产量和/或整株植物或其部分或植物种子的一种或更多特定内含物的提高的产量。
在优选的实施方案中，“产量”指生物量产量，其包含干重生物量产量和/或鲜重生物量产量，根据特定的环境(测试条件、特定的目的农作物、目的应用等)，各自与植物的地上和/或地下部分相关。在各种情况下，生物量产量可计算为鲜重、干重或含水量调节的基础，另一方面以每一植物为基础或与特定面积相关(例如每英亩/平方米/的生物量产量等)。
在其它优选实施方案中，“产量”指可通过一个或更多以下参数测定的种子产量：种子数量或充满种子的数量(每株植物或每面积(英亩/平方米/等))；种子填充率(饱满种子数量与种子总数之间的比值)；每株植物的花数量；种子生物量或总的种子重量(每株植物或每面积(英亩/平方米/等))；千粒重(KTW；从计数的饱满种子的数量及其总重量推断；TKW的增加可能是因增加的种子大小、增加的种子数量、增加的胚大小和/或增加的胚乳引起)；或允许测定种子产量的其它参数。可在干重或鲜重基础上，或通常在含水量调整基础上，例如在15.5％含水量上确定种子产量。
在其它优选的实施方案中，产量指可收获产品的特定含量和/或组成，包括但不限于增加的和/或改善的糖含量或糖组成、增加的或改善的淀粉含量和/或淀粉组成、增加的和/或改善的油含量和/或油组成(如增加的种子油含量)、增加的或改善的蛋白质含量和/或蛋白质组成(如增加的种子蛋白质含量)、增加的和/或改善的维生素含量和/或维生素组成等。
在本申请的优选意义中，如此处所用的“产量”也指植物的可收获产量，其很大程度上取决于特定的目的植物/农作物以及其在各种特定情况中的目的预期应用(如食品生产、饲料生产、加工食品生产、生物燃料、沼气或醇生产等)。因此，产量也可计算为收获指数(表示为各可收获部分的重量除以总生物量的比值)、每面积(英亩、平方米等)可收获部分的重量等。
优选地，可在缺少或存在胁迫条件下实现本发明此处描述的植物的优选增强或改善的产量特征。
因此，“产量”的意思主要依赖于目的农作物和预期应用，并且应理解技术人员在各种特定情况中将理解在说明书的环境中其含义。
[0028.2.1.1]在一个实施方案中，本发明部分满足了鉴定优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下表达或过量表达内源和/或外源基因后能够赋予植物提高的产量的新的独特基因。
[0028.3.1.1]在本发明的其它实施方案中，产量相关性状也可以是提高的盐度耐受性(耐盐性)、渗透胁迫耐受性、提高的阴暗耐受性、提高的高植物密度耐受性、提高的机械胁迫耐受性和/或提高的氧化胁迫耐受性。
在其实施方案中，术语“增强的非生物环境胁迫耐受性”在光合作用活性生物中表示当面临非生物环境胁迫条件时，光合作用活性生物，优选植物与相应的，例如未转化的野生型光合作用活性生物像植物相比显示提高的干生物量产量。
在其实施方案中，术语“增强的非生物环境胁迫耐受性”在光合作用活性生物中表示当面临非生物环境胁迫条件时，光合作用活性生物，优选植物与相应的，例如未转化的野生型光合作用活性生物相比显示提高的地上干生物量产量。
在其实施方案中，术语“增强的非生物环境胁迫耐受性”在植物中表示当面临非生物环境胁迫条件时，所述植物与相应的，例如未转化野生型生物相比显示提高的地下干生物量产量。
在其另一实施方案中，术语“增强的非生物环境胁迫耐受性”在植物中表示当面临非生物环境胁迫条件时，所述植物与相应的，例如未转化的野生型生物相比显示提高的鲜重生物量产量。
在其实施方案中，术语“增强的非生物环境胁迫耐受性”在植物中表示当面临非生物环境胁迫条件时，所述植物与相应的，例如未转化的野生型生物相比显示提高的地上鲜重生物量产量。
在其实施方案中，术语“增强的非生物环境胁迫耐受性”在植物中表示当面临非生物环境胁迫条件时，所述植物与相应的，例如未转化的野生型生物相比显示提高的地下鲜重生物量产量。
在其另一实施方案中，术语“增强的非生物环境胁迫耐受性”在植物中表示当面临非生物环境胁迫条件时，所述植物与相应的，例如未转化的野生型生物相比显示提高的植物可收获部分产量。
在其实施方案中，术语“增强的非生物环境胁迫耐受性”在植物中表示当面临非生物环境胁迫条件时，所述植物与相应的，例如未转化的野生型生物相比显示提高的植物干燥可收获部分产量。
在其实施方案中，术语“增强的非生物环境胁迫耐受性”在植物中表示当面临非生物环境胁迫条件时，所述植物与相应的，例如未转化的野生型生物相比显示提高的植物干燥的地上可收获部分产量。
在其实施方案中，术语“增强的非生物环境胁迫耐受性”在植物中表示当面临非生物环境胁迫条件时，所述植物与相应的，例如未转化的野生型生物相比显示提高的植物干燥的地下可收获部分产量。
在其另一实施方案中，术语“增强的非生物环境胁迫耐受性”在植物中表示当面临非生物环境胁迫条件时，所述植物与相应的，例如未转化的野生型生物相比显示提高的植物鲜重可收获部分产量。
在其实施方案中，术语“增强的非生物环境胁迫耐受性”在植物中表示当面临非生物环境胁迫条件时，所述植物与相应的，例如未转化的野生型生物相比显示提高的植物地上鲜重可收获部分产量。
在其实施方案中，术语“增强的非生物环境胁迫耐受性”在植物中表示当面临非生物环境胁迫条件时，所述植物与相应的，例如未转化的野生型生物相比显示提高的植物地下鲜重可收获部分产量。
在其它实施方案中，术语“增强的非生物环境胁迫耐受性”在植物中表示当面临非生物环境胁迫条件时，所述植物与相应的，例如未转化的野生型生物相比显示提高的农作物果实产量。
在其实施方案中，术语“增强的非生物环境胁迫耐受性”在植物中表示当面临非生物环境胁迫条件时，所述植物与相应的，例如未转化的野生型生物相比显示提高的新鲜农作物果实产量。
在其实施方案中，术语“增强的非生物环境胁迫耐受性”在植物中表示当面临非生物环境胁迫条件时，所述植物与相应的，例如未转化的野生型生物相比显示提高的干燥农作物果实产量。
在其实施方案中，术语“增强的非生物环境胁迫耐受性”在植物中表示当面临非生物环境胁迫条件时，所述植物与相应的，例如未转化的野生型生物相比显示提高的谷粒干重。
在其它实施方案中，术语“增强的非生物环境胁迫耐受性”在植物中表示当面临非生物环境胁迫条件时，所述植物与相应的，例如未转化的野生型生物相比显示提高的种子产量。
在其它实施方案中，术语“增强的非生物环境胁迫耐受性”在植物中表示当面临非生物环境胁迫条件时，所述植物与相应的，例如未转化的野生型生物相比显示提高的鲜重种子产量。
在其它实施方案中，术语“增强的非生物环境胁迫耐受性”在植物中表示当面临非生物环境胁迫条件时，所述植物与相应的，例如未转化的野生型生物相比显示提高的干燥种子产量。
然而例如，植物面临的非生物环境胁迫条件可以是此处提及的任何非生物环境胁迫。优选地，植物是如此处所述的植物。根据本发明产生的植物可以是农作物，例如玉米、大豆、稻、棉花、小麦或油菜(例如，芸苔)或下文列出的农作物。
在一个实施方案中，产生的玉米的提高的氮利用效率涉及玉米种子，特别是用作饲料的玉米种子的改善的或提高的蛋白质含量。在另一实施方案中，提高的氮利用效率涉及每株植物增加的粒大小或更多的粒数量。在一个实施方案中，产生的玉米的提高的水分利用效率涉及与野生型植物相比增加的粒大小或数量。此外，在一个实施方案中，提高的低温耐受性涉及早期活力并允许早期种植和播种根据本发明的方法产生的玉米植物。
在一个实施方案中，产生的大豆植物的提高的氮利用效率涉及大豆种子，特别是用作饲料的大豆种子的改善的或提高的蛋白质含量。在另一实施方案中，提高的氮利用效率涉及增加的粒大小或数量。在一个实施方案中，产生的大豆植物的提高的水分利用效率涉及增加的粒大小或数量。此外，在一个实施方案中，提高的低温耐受性涉及早期活力并允许早期种植和播种根据本发明的方法产生的大豆植物。
在一个实施方案中，产生的OSR植物的提高的氮利用效率涉及OSR种子，特别是用作饲料的OSR种子的改善的或提高的蛋白质含量。在另一实施方案中，提高的氮利用效率涉及每株植物增加的粒大小或数量。在一个实施方案中，产生的OSR的提高的水分利用效率涉及每株植物增加的粒大小或数量。此外，在一个实施方案中，提高的低温耐受性涉及早期活力并允许早期种植和播种根据本发明的方法产生的OSR植物。在一个实施方案中，本发明涉及产生耐寒油菜(具有冬季耐寒性的OSR)的方法，其包括在上文提及的本发明方法中使用耐寒油菜植物。
在一个实施方案中，产生的棉花的提高的氮利用效率涉及棉花种子，特别是用作饲料的棉花种子的改善的蛋白质含量。在另一实施方案中，提高的氮利用效率涉及增加的粒大小或数量。在一个实施方案中，产生的棉花植物的提高的水分利用效率涉及增加的粒大小或数量。此外，在一个实施方案中，提高的低温耐受性涉及早期活力并允许早期种植和播种根据本发明的方法产生的棉花植物。
因此，本发明提供用于产生具有提高产量的转基因植物的方法，所述转基因植物与相应的起始或野生型植物相比显示一个或更多改善的产量相关性状，由此所述方法包括在此处，例如表I中指出的所述植物的亚细胞区室和/或组织中提高或产生选自以下活性的一种或更多活性：磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、精氨酸/丙氨酸氨肽酶、D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶、二酰甘油焦磷酸磷酸酶、二酪氨酸转运蛋白、法尼二磷酸法尼基转移酶、NAD+依赖性甜菜碱醛脱氢酶、丝氨酸水解酶、参与赋予对酮康唑抗性的转录调节子、尿苷激酶、yal043c-a-蛋白质、ybr071w-蛋白质和ydr445c-蛋白质。
[0029.2.1.1]因此，本发明涉及用于产生转基因植物细胞、植物或其部分的方法，所述植物细胞、植物或其部分优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比具有提高的产量，例如增加的产量相关性状，例如对非生物环境胁迫的增强的耐受性，例如提高的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或提高的营养利用效率、固有产量和/或另一提及的产量相关性状，所述方法包括
(a)在植物细胞、植物或其部分中提高或产生选自以下的一种或更多活性：磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、精氨酸/丙氨酸氨肽酶、D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶、二酰甘油焦磷酸磷酸酶、二酪氨酸转运蛋白、法尼二磷酸法尼基转移酶、NAD+依赖性甜菜碱醛脱氢酶、丝氨酸水解酶、参与赋予对酮康唑抗性的转录调节子、尿苷激酶、yal043c-a-蛋白质、ybr071w-蛋白质和ydr445c-蛋白质，和
(b)在允许植物发育的条件下培养植物细胞、植物或其部分，所述植物优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物相比具有提高的产量，例如增加的产量相关性状，例如对非生物环境胁迫的增强的耐受性，例如提高的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或提高的营养利用效率、固有产量和/或另一提及的产量相关性状。
[0029.3.1.1]在优选的实施方案中，本发明涉及产生转基因植物细胞、植物或其部分的方法，所述植物细胞、植物或其部分优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比具有提高的产量，例如增加的产量相关性状，例如对非生物环境胁迫的增强的耐受性，例如提高的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或提高的营养利用效率、固有产量和/或另一提及的产量相关性状，所述方法包括
(a)在植物细胞、植物或其部分中提高或产生选自以下的一种或更多活性：磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、精氨酸/丙氨酸氨肽酶、D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶、二酰甘油焦磷酸磷酸酶、二酪氨酸转运蛋白、法尼二磷酸法尼基转移酶、NAD+依赖性甜菜碱醛脱氢酶、丝氨酸水解酶、参与赋予对酮康唑抗性的转录调节子、尿苷激酶、yal043c-a-蛋白质、ybr071w-蛋白质和ydr445c-蛋白质，和
(b)培养植物细胞、植物或其部分与未转化野生型植物，
(c)优选通过停止重复浇水施加暂时和反复的非生物胁迫，
(d)在未转化野生型植物显示可见的损伤症状后选择植物，所述植物优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物相比具有提高的产量，例如增加的产量相关性状，例如对非生物环境胁迫的增强的耐受性，例如提高的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或提高的营养利用效率、固有产量和/或另一提及的产量相关性状。
在本发明的一个实施方案中，根据以下方法测定并定量对暂时和反复的非生物胁迫的提高的抗性：
转化植物在生长室的盆(例如York，Mannheim，Germany)中生长。在植物是拟南芥的情况下，土壤制备为营养丰富土(GS90，Tantau，Wansdorf，Germany)和石英砂的1∶1(v/v)混合物。用该混合物填充盆(直径6cm)，并将其置于托盘中。向所述托盘中添加水，使土壤混合物吸收适当量的水用于播种过程(第1天)，随后在盆中播种转基因拟南芥植物及其野生型对照的种子。然后用透明盖子覆盖填充的托盘并将其转移到预冷(4℃-5℃)且黑暗的生长室中。在4℃-5℃黑暗中3天或4℃黑暗中4天时间里建立分层。在20℃，60％相对湿度，16小时光周期和200μmol/m2s或者220μmol/m2s的荧光灯照明的生长条件下开始种子的萌发与生长。在第10天或第11天(播种后9天或10天)通过从顶部喷洒含有小植株的盆完成BASTA选择。在标准实验中，喷洒一次自来水中BASTA浓缩物(183g/l草铵膦)的0.07％(v/v)溶液，或者喷洒三次BASTA的0.02％(v/v)溶液。仅用自来水喷洒(而不是用在自来水中溶解的BASTA喷洒)野生型对照植物，但其它方面进行相同处理。播种后13-14天通过去除多余的幼苗并在土壤中保留一株幼苗将植物个体化。转基因植物和野生型对照植物均匀分布在生长室中。
整个实验过程中限制水供应，并使植物经历干旱和再浇水的循环。在第1天(播种前)、第14或第15天、第21或第22天，最后在第27或28天进行浇水。
表明一个或两个、三个或更多个以下特征任何组合的可见损伤症状：
a)萎蔫
b)叶变褐
c)膨压消失，其导致叶或针状茎，和花下垂，
d)叶或针叶下垂和/或脱落，
e)叶绿色，但与对照相比叶以轻微的角度朝向地面，
f)叶片开始向内折叠(卷曲)，
g)叶或针叶的过早衰老，
h)叶或针叶中叶绿素损失和/或黄化。
[0029.4.1.1]在一个实施方案中，本发明涉及用于产生转基因植物细胞、植物或其部分的方法，所述植物细胞、植物或其部分优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比具有提高的产量，例如增加的产量相关性状，例如对非生物环境胁迫的增强的耐受性，例如提高的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或提高的营养利用效率、固有产量和/或另一提及的产量相关性状，所述方法包括
(a)在植物细胞、植物或其部分中提高或产生如表I第5列中所示核酸序列编码的如表II第3列中所示蛋白质的活性，
和
(b)在允许植物发育的条件下种植所述植物细胞、植物或其部分，所述植物在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物相比具有提高的产量。
[0030.2.1.1]因此，本发明涉及用于产生转基因植物细胞、植物或其部分的方法，所述植物细胞、植物或其部分优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比具有提高的产量，例如增加的产量相关性状，例如对非生物环境胁迫的增强的耐受性，例如提高的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或提高的营养利用效率、固有产量和/或另一提及的产量相关性状，所述方法包括
(a)在植物细胞的质体中提高或产生选自以下的一种或更多活性：磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、精氨酸/丙氨酸氨肽酶、D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶、二酰甘油焦磷酸磷酸酶、二酪氨酸转运蛋白、法尼二磷酸法尼基转移酶、NAD+依赖性甜菜碱醛脱氢酶、丝氨酸水解酶、参与赋予对酮康唑抗性的转录调节子、尿苷激酶、yal043c-a-蛋白质、ybr071w-蛋白质和ydr445c-蛋白质，和
(b)在允许植物发育的条件下培养植物细胞，所述植物优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物相比具有提高的产量，例如增加的产量相关性状，例如对非生物环境胁迫的增强的耐受性，例如提高的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或提高的营养利用效率、固有产量和/或另一提及的产量相关性状。
[0030.3.1.1]在一个实施方案中，本发明涉及用于产生转基因植物细胞、植物或其部分的方法，所述植物细胞、植物或其部分优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比具有提高的产量，例如增加的产量相关性状，例如对非生物环境胁迫的增强的耐受性，例如提高的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或提高的营养利用效率、固有产量和/或另一提及的产量相关性状，所述方法包括
(a)在植物细胞的质体中提高或产生如表I第5列或第7列中所示核酸序列编码的如表II第3列中所示蛋白质的活性，
和
(b)在允许植物发育的条件下种植所述植物细胞，所述植物优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物相比具有提高的产量，例如增加的产量相关性状，例如对非生物环境胁迫的增强的耐受性，例如提高的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或提高的营养利用效率、固有产量和/或另一提及的产量相关性状。
[0030.4.1.1]在另一实施方案中，本发明涉及用于产生转基因植物细胞、植物或其部分的方法，所述植物细胞、植物或其部分优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比具有提高的产量，例如增加的产量相关性状，例如对非生物环境胁迫的增强的耐受性，例如提高的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或提高的营养利用效率、固有产量和/或另一提及的产量相关性状，所述方法包括
(a)在植物细胞的细胞器中提高或产生选自以下的一种或更多活性：磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、精氨酸/丙氨酸氨肽酶、D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶、二酰甘油焦磷酸磷酸酶、二酪氨酸转运蛋白、法尼二磷酸法尼基转移酶、NAD+依赖性甜菜碱醛脱氢酶、丝氨酸水解酶、参与赋予对酮康唑抗性的转录调节子、尿苷激酶、yal043c-a-蛋白质、ybr071w-蛋白质和ydr445c-蛋白质，或
(b)在植物细胞中提高或产生如表I第5列或第7列中所示核酸序列编码的如表II第3列中所示蛋白质的活性，所述核酸序列连接编码转运肽的核酸序列；或
(c)在植物细胞中提高或产生如表I第5列或第7列中所示核酸序列编码的如表II第3列中所示蛋白质的活性，所述核酸序列连接编码叶绿体定位序列的核酸序列；和
(d)在允许植物发育的条件下培养植物细胞，所述植物优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型相比具有提高的产量，例如增加的产量相关性状，例如对非生物环境胁迫的增强的耐受性，例如提高的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或提高的营养利用效率、固有产量和/或另一提及的产量相关性状。
[0030.5.1.1]在另一实施方案中，本发明涉及用于产生转基因植物细胞、植物或其部分的方法，所述植物细胞、植物或其部分优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比具有提高的产量，例如增加的产量相关性状，例如对非生物环境胁迫的增强的耐受性，例如提高的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或提高的营养利用效率、固有产量和/或另一提及的产量相关性状，所述方法包括
(a)在植物的细胞器中通过转化所述细胞器提高或产生如表I第5列或第7列中所示核酸序列编码的如表II第3列中所示蛋白质的活性，或(b)在植物，或其一个或更多部分的质体中通过转化所述质体提高或产生如表I第5列或第7列中所示核酸序列编码的如表II第3列中所示蛋白质的活性；和
(c)在允许植物发育的条件下培养植物细胞，所述植物优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物相比具有提高的产量，例如增加的产量相关性状，例如对非生物环境胁迫的增强的耐受性，例如提高的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或提高的营养利用效率、固有产量和/或另一提及的产量相关性状。
[0031.2.1.1]因此，在优选的实施方案中，本发明提供用于产生转基因植物细胞核；转基因植物细胞；包含一个或更多此类转基因细胞核或植物细胞的植物；来自此植物细胞和/或转基因植物的后代、种子和/或花粉的方法；各自与相应的未转化野生型植物细胞或植物相比显示提高的产量，所述方法包括提高或产生选自以下的一种或更多活性：磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、精氨酸/丙氨酸氨肽酶、D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶、二酰甘油焦磷酸磷酸酶、二酪氨酸转运蛋白、法尼二磷酸法尼基转移酶、NAD+依赖性甜菜碱醛脱氢酶、丝氨酸水解酶、参与赋予对酮康唑抗性的转录调节子、尿苷激酶、yal043c-a-蛋白质、ybr071w-蛋白质和ydr445c-蛋白质。
此外，本发明提供转基因植物细胞核；转基因植物细胞；包含一个或更多此类转基因细胞核或植物细胞的植物；来自此植物细胞和/或转基因植物的后代、种子和/或花粉；各自与相应的未转化野生型植物细胞或植物相比显示提高的产量，所述方法包括提高或产生选自以下的一种或更多活性：磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、精氨酸/丙氨酸氨肽酶、D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶、二酰甘油焦磷酸磷酸酶、二酪氨酸转运蛋白、法尼二磷酸法尼基转移酶、NAD+依赖性甜菜碱醛脱氢酶、丝氨酸水解酶、参与赋予对酮康唑抗性的转录调节子、尿苷激酶、yal043c-a-蛋白质、ybr071w-蛋白质和ydr445c-蛋白质。
[0032.1.1.1]原则上，可从每一生物，如微生物，如含有质体优选叶绿体的藻类或植物中分离编码转运肽的核酸序列。“转运肽”是氨基酸序列，其编码核酸序列与相应的结构基因一起进行翻译。这表示所述转运肽是翻译蛋白质的整体部分，并形成蛋白质的氨基末端延伸。两者均翻译成所谓的“前蛋白”。一般而言，转运肽在蛋白质运输到正确的细胞器如质体的过程中或之后从所述前蛋白上切割掉，以产生成熟的蛋白质。转运肽通过促进蛋白质经过细胞内膜转运保证成熟蛋白质的正确定位。编码转运肽的优选核酸序列来自编码最终定位在质体中的蛋白质并起源于选自以下属的生物的核酸序列：
[0032.2.1.1]伞藻属(Acetabularia)、拟南芥属(Arabidopsis)、芸苔属(Brassica)、辣椒属(Capsicum)、衣藻属(Chlamydomonas)、南瓜属(Cururbita)、杜氏藻属(Dunaliella)、裸藻属(Euglena)、黄花菊属(Flaveria)、大豆属(Glycine)、向日葵属(Helianthus)、大麦属(Hordeum)、浮萍属(Lemna)、黑麦草属(Lolium)、番茄属(Lycopersion)、苹果属(Malus)、苜蓿属(Medicago)、日中花属(Mesembryanthemum)、烟草属(Nicotiana)、月见草属(Oenotherea)、稻属(Oryza)、牵牛属(Petunia)、菜豆属(Phaseolus)、剑叶藓属(Physcomitrella)、松属(Pinus)、豌豆属(Pisum)、萝卜属(Raphanus)、蝇子草属(Silene)、芥属(Sinapis)、茄属(Solanum)、菠菜属(Spinacea)、甜菊属(Stevia)、集球藻属(Synechococcus)、小麦属(Triticum)和玉蜀黍属(Zea)。
[0033.1.1.1]有利地用于本发明方法的这类转运肽来自编码选自以下的蛋白质的核酸序列：
[0033.2.1.1]核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶、5-烯醇丙酮酰基-莽草酸-3-磷酸合酶、乙酰乳酸合酶、叶绿体核糖体蛋白CS17、Cs蛋白质、铁氧还蛋白、质体蓝素、核酮糖二磷酸羧化酶激活酶、色氨酸合酶、酰基载体蛋白、质体伴侣蛋白60、细胞色素c552、22-kDA热激蛋白、33-kDa氧释放增强子蛋白1、ATP合酶γ亚基、ATP合酶δ亚基、叶绿素-a/b-结合蛋白质II-1、氧释放增强子蛋白2、氧释放增强子蛋白3、光系统I：P21、光系统I：P28、光系统I：P30、光系统I：P35、光系统I：P37、甘油-3-磷酸酰基转移酶、叶绿素a/b结合蛋白质、CAB2蛋白质、羟甲基胆汁烷合酶、丙酮酸-正磷酸二激酶、CAB3蛋白质、质体铁蛋白、铁蛋白、早期光诱导蛋白质、谷氨酸-1-半醛转氨酶、原叶绿素还原酶、淀粉颗粒结合淀粉酶合酶、光系统II的集光叶绿素a/b结合蛋白质、主要花粉变应原Lol p 5a、质体ClpB ATP依赖性蛋白酶、超氧化物歧化酶、铁氧还蛋白NADP氧化还原酶、28-kDa核糖核蛋白、31-kDa核糖核蛋白、33-kDa核糖核蛋白、乙酰乳酸合酶、ATP合酶CF0亚基1、ATP合酶CF0亚基2、ATP合酶CF亚基3、ATP合酶CF亚基4、细胞色素f、ADP-葡糖焦磷酸化酶、谷氨酰胺合酶、谷氨酰胺合酶2、碳酸酐酶、GapA蛋白、热激蛋白hsp21、磷酸易位蛋白、质体ClpA ATP依赖性蛋白酶、质体核糖体蛋白CL24、质体核糖体蛋白CL9、质体核糖体蛋白PsCL18、质体核糖体蛋白PsCL25、DAHP合酶、淀粉磷酸化酶、根酰基载体蛋白质II、甜菜碱脱氢酶、GapB蛋白、谷氨酰胺合酶2、磷酸核酮糖激酶、亚硝酸盐还原酶、核糖体蛋白L12、核糖体蛋白L13、核糖体蛋白L21、核糖体蛋白L35、核糖体蛋白L40、丙糖磷酸-3-磷酸甘油磷酸易位蛋白、铁氧还蛋白依赖性谷氨酸合酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、NADP依赖性苹果酸酶和NADP苹果酸脱氢酶。
[0034.1.1.1]更优选地，编码转运肽的核酸序列来自编码最终定位在质体内的蛋白质并来自选自以下种的生物的核酸序列：
[0035.1.1.1]地中海伞藻(Acetabularia mediterranea)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、芸苔(Brassica campestris)、欧洲油菜(Brassicanapus)、辣椒(Capsicum annuum)、雷氏衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、南瓜(Cururbita moschata)、盐生杜氏藻(Dunaliellasalina)、杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)、细小裸藻(Euglena gracilis)、Flaveria trinervia、大豆(Glycine max)、向日葵(Helianthus annuus)、大麦(Hordeum vulgare)、浮萍(Lemna gibba)、黑麦草(Lolium perenne)、番茄(Lycopersion esculentum)、苹果(Malus domestica)、野苜蓿(Medicagofalcata)、紫苜蓿(Medicago sativa)、冰叶日中花(Mesembryanthemumcrystallinum)、白花丹叶烟草(Nicotiana plumbaginifolia)、美花烟草(Nicotiana sylvestris)、烟草(Nicotiana tabacum)、月见草(Oenothereahookeri)、稻(Oryza sativa)、碧冬茄(Petunia hybrida)、菜豆(Phaseolusvulgaris)、展叶剑叶藓(Physcomitrella patens)、黑松(Pinus tunbergii)、豌豆(Pisum sativum)、萝卜(Raphanus sativus)、白花蝇子草(Silenepratensis)、白芥(Sinapis alba)、马铃薯(Solanum tuberosum)、菠菜(Spinacea oleracea)、甜菊(Stevia rebaudiana)、聚球藻属(Synechococcus)、集胞藻属(Synechocystis)、小麦(Triticum aestivum)和玉米(Zea mays)。
[0036.1.1.1]甚至更优选的核酸序列编码如von Heijne等[PlantMolecular Biology Reporter、第9卷(2)、1991：104-126]公开的转运肽，所述文献特此引入作为参考。表V显示了von Heijne等公开的转运肽序列的一些实例。根据本发明的公开内容，尤其是根据实施例中的公开内容，技术人员能够将von Heijne等公开的其它核酸序列与表I第5列和第7列中所示的核酸序列连接起来。编码转运肽的最优选核酸序列来自菠菜属，如叶绿体30S核糖体蛋白PSrp-1、根酰基载体蛋白II、酰基载体蛋白、ATP合酶：γ亚基、ATP合酶：δ亚基、细胞色素f、铁氧还蛋白I、铁氧还蛋白NADP氧化还原酶(＝FNR)、亚硝酸盐还原酶、磷酸核酮糖激酶、质体蓝素或碳酸酐酶。技术人员认为可从质体定位的蛋白质中容易地分离编码转运肽的多种其它核酸序列，所述质体定位的蛋白质从核基因表达为前体，然后靶向质体。这类转运肽编码序列可用于构建其它表达构建体。有利地用于本方法的并且是本发明核酸序列和蛋白质的一部分的转运肽长度通常为20到120个氨基酸，优选25到110、30到100或35到90个氨基酸，更优选40到85个氨基酸，并且最优选45到80个氨基酸，并在翻译后发挥功能，以指导蛋白质运到质体，优选运到叶绿体。编码这类转运肽的核酸序列定位在编码成熟蛋白质的核酸序列的上游。为了使转运肽编码核酸与编码待靶定蛋白质的核酸进行正确的分子连接，有时必须在连接位置处引入额外的碱基对，其形成用于不同核酸分子进行分子连接的限制性酶识别序列。该操作可导致在成熟输入蛋白质N末端处具有很少的额外氨基酸，其一般并优选不干扰蛋白质的功能。无论如何，需要慎重选择在连接位置形成限制性酶识别序列的额外碱基对，以避免终止密码子或编码对蛋白质折叠具有强烈影响的氨基酸(像，例如脯氨酸)的密码子的形成。优选这类额外密码子编码小的结构柔性氨基酸，如甘氨酸或丙氨酸。
[0037.1.1.1]如上所述，编码如表II第3列中所示蛋白质的核酸序列以及表I第5列和第7列中公开的其同源物可与编码转运肽的核酸序列连接。编码转运肽的这种核酸序列保证蛋白质转运到质体中。待表达基因的核酸序列与编码转运肽的核酸序列有效连接。因此，所述转运肽与编码如表II第3列中所示蛋白质的核酸序列以及表I第5列和第7列中公开的其同源物在框内融合。
[0038.1.1.1]本发明的术语“细胞器”应指例如“线粒体”或优选“质体”(说明书中，“复数”应包含“单数”，并且反之亦然)。本发明的术语“质体”旨在包括多种形式的质体，包括前质体、叶绿体、色质体、gerontoplasts、白色体、造粉体、造油体和黄色体，优选叶绿体。它们均具有上述前质体的共同祖先。
[0039.1.1.1]Schmidt等[J.Biol.Chem.，第268卷，36号，1993：27447-27457]、Della-Cioppa等[Plant.Physiol.84，1987：965-968]、de Castro SilvaFilho等[Plant Mol.Biol.，30，1996：769-780]、Zhao等[J.Biol.Chem.第270卷，11号，1995：6081-6087]、
Figure BDA0000055835940000361
等[Biochem.Biophys.Res.Commun.，第196卷，3号，1993：1414-1421]、Keegstra等[Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，40，1989：471-501]、Lubben等[Photosynthesis Res.，17，1988：173-194]和Lawrence等[J.Biol.Chem.，第272卷，33号，1997：20357-20363]公开了其它转运肽。Kermode Allison R.在Critical Reviews in Plant Science 15(4)：285-423(1996)标题“Mechanisms of Intracellular Protein Transport and Targeting in PlantCells.”下公开了关于靶定的综述。
[0040.1.1.1]用于本方法方法并形成本发明核酸序列一部分的有利的转运肽序列一般富含羟基化氨基酸残基(丝氨酸和苏氨酸)，这两个残基一般构成了总体的20-35％。它们通常具有无Gly、Pro和荷电残基的氨基末端区。此外，它们具有许多小的疏水性氨基酸，如缬氨酸和丙氨酸，并一般缺少酸性氨基酸。此外，它们一般具有富含Ser、Thr、Lys和Arg的中间区。整体而言，它们很经常地带有正的净电荷。
[0041.1.1.1]或者，部分或完全根据现有技术中公开的转运肽序列的结构经化学合成编码转运肽的核酸序列。所述天然的或化学合成的序列可直接与编码成熟蛋白质的序列连接，或经过接头核酸序列与其连接，所述接头核酸序列的长度通常少于500个碱基对，优选少于450、400、350、300、250或200个碱基对，更优选少于150、100、90、80、70、60、50、40或30个碱基对，并最优选少于25、20、15、12、9、6或3个碱基对，并与所述编码序列在框内。此外，编码转运肽的有利的核酸序列可包含来自多于一种生物和/或化学来源的序列，并可包括来自成熟蛋白质的氨基末端区的核酸序列，所述成熟蛋白质在天然状态中与转运肽相连。在本发明的优选实施方案中，成熟蛋白质的所述氨基末端区长度通常少于150个氨基酸，优选少于140、130、120、110、100或90个氨基酸，更优选少于80、70、60、50、40、35、30、25或20个氨基酸，并最优选少于19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个氨基酸。但是甚至更短或更长的延伸也是可以的。此外，利于蛋白质向其它细胞区室如液泡、内质网、高尔基体、乙醛酸循环体、过氧化物酶体或线粒体转运的靶序列也可以是本发明核酸序列的一部分。从所述本发明核酸序列翻译的蛋白质是一种融合蛋白质，这表示编码转运肽(例如在表V中所示的转运肽，优选该表中的最后一个)的核酸序列与表I第5列和第7列中所示的核酸序列相连。本领域技术人员能够以有功能的方式将所述序列相连。有利地，所述转运肽部分在优选转运到质体的过程中从表II第5列和第7列中所示的蛋白质部分上切割掉。表V最后一行中所示的优选转运肽切割的所有产物在表II第5列和第7列中提及的蛋白质的起始甲硫氨酸前面优选具有N末端氨基酸序列QIACSS或QIA EFQLTT。范围在1到20个氨基酸，优选2到15个氨基酸，更优选3到10个氨基酸，最优选4到8个氨基酸内的其它短氨基酸序列也可以位于表II第5列和第7列中提及的蛋白质的起始甲硫氨酸前面。在氨基酸序列QIA CSS的情况下，起始甲硫氨酸前面的三个氨基酸来自LIC(＝连接独立的克隆)盒。在大肠杆菌(E.coli)基因表达的情况下，优选所述短氨基酸序列。在氨基酸序列QIA EFQLTT的情况下，起始甲硫氨酸前面的六个氨基酸来自LIC盒。在酿酒酵母(S.cerevisiae)基因表达的情况下，优选所述短氨基酸序列。技术人员知道其它短序列也可用于表I第5列和第7列中提及的基因的表达。此外，技术人员知道这样的事实，在表达基因中不需要这类短序列。
表V：von Heijne等公开的转运肽的实例
Figure BDA0000055835940000381
Figure BDA0000055835940000391
Figure BDA0000055835940000401
Figure BDA0000055835940000421
[0042.1.1.1]或者，表II第5列和第7列中所示序列，优选通常在核中编码的序列在例如表V中提及的靶向序列单独或与其它靶向序列组合的帮助下优选靶向质体，本发明的核酸可直接引入质体基因组中。因此，在优选的实施方案中，在质体中直接引入并表达表I第5列和第7列中所示核酸序列。
在该说明书的上下文中，术语“引入”应表示核酸序列通过“转染”、“转导”或优选通过“转化”插入生物内。
如果核酸序列已经引入了质体，那么质体，如叶绿体已经“转化”了外源(优选外来)核酸序列，这表示该序列已经穿过了膜或质体膜。所述外来DNA可整合(共价连接)到构成质体基因组的质体DNA中，或者其可保持未整合(例如通过包括叶绿体复制起点)。“稳定”整合的DNA序列是通过质体复制遗传的那些DNA序列，由此将具有整合DNA序列特征的新质体转移到后代。
[0043.1.1.1]对于表达，本领域技术人员熟悉向不同细胞器如优选的质体中引入核酸序列的不同方法。这些方法例如由Pal Maiga(Annu.Rev.Plant Biol.，2004，55：289-313)、Thomas Evans(WO 2004/040973)，KevinE.McBride等(US 5,455,818)、Henry Daniell等(US 5,932,479和US5,693,507)和Jeffrey M.Straub等(US 6,781,033)公开。优选的方法是转化小孢子来源的下胚轴或子叶组织(其为绿色的并因此含有许多质体)叶组织，然后在选择性培养基上从所述转化植物材料再生茎。作为转化方法，轰击植物材料或使用独立复制的穿梭载体为技术人员所熟知。但PEG介导转化质体或利用双元载体进行农杆菌转化也是可能的。用于转化质体的有用标记是阳性选择标记，例如氯霉素、链霉素、卡那霉素、新霉素、丁胺卡那霉素、壮观霉素、三嗪和/或林可霉素抗性基因。作为文献中通常命名为二级标记的额外标记，编码对除草剂如膦丝菌素(＝草铵膦，BASTATM，LibertyTM，由bar基因编码)、草甘膦(＝N-(膦酰甲基)甘氨酸，RoundupReadyTM，5-烯醇式丙酮酰基莽草酸-3-磷酸合酶基因编码＝epsps)、磺酰脲(＝StapleTM，由乙酰乳酸合酶基因编码)、咪唑啉酮[＝IMI，咪草烟，imazamox，ClearfieldTM，由乙酰羟酸合酶(AHAS)基因编码，也称作乙酰乳酸合酶(ALS)基因]或溴草腈(＝BuctrilTM，由oxy基因编码)具有抗性的基因或编码抗生素如潮霉素或G418的基因用于进一步的选择。这类二级标记用于转化大多数基因组拷贝的情况中。此外，阴性选择标记如细菌胞嘧啶脱氨酶(由codA基因编码)也用于转化质体。
[0044.1.1.1]为了增加鉴定转化体的可能性，也期望使用除上述抗性基因外的报告基因，或除所述基因外还使用报告基因。报告基因为例如β半乳糖苷酶、β葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、碱性磷酸酶和/或绿色荧光蛋白基因(GFP)。
[0045.1.1.1]对于本发明方法，因为许多物种如玉米、棉花和稻具有严格的质体母系遗传，通过转化质体，种内特异转基因流动被阻断具有巨大优势。通过将表I第5列和第7列中指定的基因或其活性片段置于植物质体中，这些基因将不存在于所述植物的花粉中。
本发明的其它优选实施方案涉及所谓的“叶绿体定位序列”的用途，其中第一个RNA序列或分子能够从细胞内或质体外的外环境向叶绿体转运或“陪伴”第二个RNA序列，如从表I第5列和第7列中所述的序列转录的RNA序列，或编码如表II第5列和第7列中所述蛋白质的序列。在一个实施方案中，所述叶绿体定位信号与完全的或完整的类病毒序列基本上类似或互补。所述叶绿体定位信号可由DNA序列编码，所述DNA序列转录成叶绿体定位RNA。术语“类病毒”指天然发生的单链RNA分子(Flores，CR Acad Sci III.2001 Oct；324(10)：943-52)。类病毒通常含有约200-500个核苷酸，并一般以环形分子存在。含有叶绿体定位信号的类病毒的实例包括，但不限于ASBVd、PLMVd、CChMVd和ELVd。类病毒序列或其功能部分可与表I第5列和第7列中所述的序列或编码如表II第5列和第7列中所述蛋白质的序列以这样的方式融合：类病毒序列将从表I第5列和第7列中所述的序列或编码如表II第5列和第7列中所述蛋白质的序列转录的序列转运至叶绿体中。优选的实施方案使用修饰的ASBVd(Navarro等，Virology.2000 Mar 1；268(1)：218-25)。
在其它特定实施方案中，待在质体中表达的蛋白质，如在表II第5列和第7列中所示的蛋白质由不同核酸编码。这类方法公开于WO2004/040973中，将其引入作为参考。WO 2004/040973教导了一种方法，其涉及对应基因或基因片段的RNA通过叶绿体定位序列转运至叶绿体中。将应在植物或植物细胞中表达的基因分成核酸片段，将其引入植物的不同区室内，例如细胞核、质体和/或线粒体中。额外描述了植物细胞，其中叶绿体含有核酶，其在一端融合编码用于本发明方法的蛋白质片段的RNA，使得所述核酶可将易位融合RNA反式剪接成编码待形成的基因片段的RNA，并且如此可将核酸片段再连接到编码如表II第5列和第7列中公开的功能蛋白质的完整mRNA上。
[0046.1.1.1]在本发明优选的实施方案中，将如表I第5列和第7列中所示用于本发明方法中的核酸序列转化到质体中，其为代谢活性的。那些质体在目的植物或植物组织，最优选地在绿色植物组织(如叶子或子叶)中发现的叶绿体，或在种子中应优选保持高拷贝数。
[0047.1.1.1]为了在质体中良好表达，优选使用在质体中有活性的启动子和终止子(优选叶绿体启动子)将如表I第5列和第7列中所示的核酸序列引入表达盒中。这类启动子的实例包括来自菠菜或豌豆基因的psbA启动子、rbcL启动子和来自玉米的atpB启动子。
[0047.2.1.1]为描述本发明的目的，术语“细胞质的”和“非靶向的”是可以交换的，并表示本发明的核酸在未添加非天然转运肽编码序列的情况下表达。非天然转运肽编码序列是这样的序列，其并非本发明的核酸，例如在表I第5列或第7列中所示的核酸的天然部分，但通过例如在“质体靶向表达”下实施例中描述的分子操作步骤进行添加。因此术语“细胞质的”和“非靶向的”将不排除本发明核酸序列的产物通过其在转基因生物背景中天然发生的序列性质靶向定位到任何细胞区室内。技术人员可通过使用软件工具像TargetP(Emanuelsson等，(2000)，Predicting subcellular localization ofproteins based on their N-terminal amino acid sequence.，J.Mol.Biol.300，1005-1016.)、ChloroP(Emanuelsson等(1999)ChloroP，a neuralnetwork-based method for predicting chloroplast transit peptides and theircleavage sites.，Protein Science，8：978-984.)或其它预测软件工具(Emanuelsson等(2007)，Locating proteins in the cell using TargetP，SignalP，and related tools.，Nature Protocols 2，953-971)预测生物(植物)中来自所附序列的成熟多肽的亚细胞定位。
[0048.1.1.1]当用于该说明书时，用包含/含有及其语法变型说明所述特征、整数、步骤或组分或其组的存在，但不排除一种或更多种特征、整数、步骤或组分或其组的存在或添加。
[0049.1.1.1]根据本发明，本文所理解的术语“植物细胞”或术语“生物”通常指植物细胞或其细胞器，优选质体，更优选叶绿体。
如此处所用，“植物”指包括但不限于整株植物，但也指其部分，即一个或更多个细胞和组织，包括例如，叶、茎、苗、根、花、果实和种子。
[0050.1.1.1]令人惊奇地发现，如表II第3列中所示的酿酒酵母蛋白质和/或如表II第3列中所示的大肠杆菌蛋白质在植物，如拟南芥中的转基因表达优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比，例如赋予转基因植物细胞、植物或其部分提高的产量。
[0051.2.1.1]因此，在一个实施方案中，如果在植物细胞、植物或其部分中提高或产生分别包含核酸SEQ ID NO.：63或多肽SEQ ID NO.：64的大肠杆菌核酸分子或多肽的活性，例如如果提高或产生分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与SEQ ID NO.：63或SEQ ID NO.：64处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者如果提高或产生“NAD+依赖性甜菜碱醛脱氢酶”的活性，那么与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量，优选至少一个产量相关性状，优选环境胁迫的耐受性和/或抗性和提高的生物量生产。优选地，在质体中发生所述提高。
因此，在一个实施方案中，如果在植物细胞、植物或其部分中提高或产生分别包含核酸SEQ ID NO.：623或多肽SEQ ID NO.：624的大肠杆菌(Escherichia coli)核酸分子或多肽的活性，例如如果提高或产生分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与SEQ ID NO.：623或SEQ ID NO.：624处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者如果提高或产生“D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶”的活性，那么与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量，优选至少一个产量相关性状，优选环境胁迫的耐受性和/或抗性和提高的生物量生产。优选地，在细胞质中发生所述提高。
因此，在一个实施方案中，如果在植物细胞、植物或其部分中提高或产生分别包含核酸SEQ ID NO.：724或多肽SEQ ID NO.：725的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)核酸分子或多肽的活性，例如如果提高或产生分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与SEQ ID NO.：724或SEQ IDNO.：725处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者如果提高或产生“yal043c-a-蛋白质”的活性，那么与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量，优选至少一个产量相关性状，优选环境胁迫的耐受性和/或抗性和提高的生物量生产。优选地，在细胞质中发生所述提高。
因此，在一个实施方案中，如果在植物细胞、植物或其部分中提高或产生分别包含核酸SEQ ID NO.：728或多肽SEQ ID NO.：729的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性，例如如果提高或产生分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与SEQ ID NO.：728或SEQ ID NO.：729处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者如果提高或产生“ybr071w-蛋白质”的活性，那么与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量，优选至少一个产量相关性状，优选环境胁迫的耐受性和/或抗性和提高的生物量生产。优选地，在质体中发生所述提高。
因此，在一个实施方案中，如果在植物细胞、植物或其部分中提高或产生分别包含核酸SEQ ID NO.：732或多肽SEQ ID NO.：733的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性，例如如果提高或产生分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与SEQ ID NO.：732或SEQ ID NO.：733处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者如果提高或产生“二酪氨酸转运蛋白”的活性，那么与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量，优选至少一个产量相关性状，优选环境胁迫的耐受性和/或抗性和提高的生物量生产。优选地，在细胞质中发生所述提高。
因此，在一个实施方案中，如果在植物细胞、植物或其部分中提高或产生分别包含核酸SEQ ID NO.：764或多肽SEQ ID NO.：765的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性，例如如果提高或产生分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与SEQ ID NO.：764或SEQ ID NO.：765处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者如果提高或产生“二酰甘油焦磷酸磷酸酶”的活性，那么与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量，优选至少一个产量相关性状，优选环境胁迫的耐受性和/或抗性和提高的生物量生产。优选地，在细胞质中发生所述提高。
因此，在一个实施方案中，如果在植物细胞、植物或其部分中提高或产生分别包含核酸SEQ ID NO.：814或多肽SEQ ID NO.：815的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性，例如如果提高或产生分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与SEQ ID NO.：814或SEQ ID NO.：815处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者如果提高或产生“ydr445c-蛋白质”的活性，那么与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量，优选至少一个产量相关性状，优选环境胁迫的耐受性和/或抗性和提高的生物量生产。优选地，在细胞质中发生所述提高。
因此，在一个实施方案中，如果在植物细胞、植物或其部分中提高或产生分别包含核酸SEQ ID NO.：818或多肽SEQ ID NO.：819的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性，例如如果提高或产生分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与SEQ ID NO.：818或SEQ ID NO.：819处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者如果提高或产生“精氨酸/丙氨酸氨肽酶”的活性，那么与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量，优选至少一个产量相关性状，优选环境胁迫的耐受性和/或抗性和提高的生物量生产。优选地，在细胞质中发生所述提高。
因此，在一个实施方案中，如果在植物细胞、植物或其部分中提高或产生分别包含核酸SEQ ID NO.：925或多肽SEQ ID NO.：926的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性，例如如果提高或产生分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与SEQ ID NO.：925或SEQ ID NO.：926处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者如果提高或产生“法尼二磷酸法尼基转移酶”的活性，那么与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量，优选至少一个产量相关性状，优选环境胁迫的耐受性和/或抗性和提高的生物量生产。优选地，在质体中发生所述提高。
因此，在一个实施方案中，如果在植物细胞、植物或其部分中提高或产生分别包含核酸SEQ ID NO.：1021或多肽SEQ ID NO.：1022的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性，例如如果提高或产生分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与SEQ ID NO.：1021或SEQ ID NO.：1022处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者如果提高或产生“丝氨酸水解酶”的活性，那么与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量，优选至少一个产量相关性状，优选环境胁迫的耐受性和/或抗性和提高的生物量生产。优选地，在细胞质中发生所述提高。
因此，在一个实施方案中，如果在植物细胞、植物或其部分中提高或产生分别包含核酸SEQ ID NO.：1157或多肽SEQ ID NO.：1158的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性，例如如果提高或产生分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与SEQ ID NO.：1157或SEQ ID NO.：1158处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者如果提高或产生“磷酸烯醇丙酮酸羧激酶”的活性，那么与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量，优选至少一个产量相关性状，优选环境胁迫的耐受性和/或抗性和提高的生物量生产。优选地，在细胞质中发生所述提高。
因此，在一个实施方案中，如果在植物细胞、植物或其部分中提高或产生分别包含核酸SEQ ID NO.：1352或多肽SEQ ID NO.：1353的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性，例如如果提高或产生分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与SEQ ID NO.：1352或SEQ ID NO.：1353处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者如果提高或产生“尿苷激酶”的活性，那么与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量，优选至少一个产量相关性状，优选环境胁迫的耐受性和/或抗性和提高的生物量生产。优选地，在细胞质中发生所述提高。
因此，在一个实施方案中，如果在植物细胞、植物或其部分中提高或产生分别包含核酸SEQ ID NO.：1423或多肽SEQ ID NO.：1424的酿酒酵母核酸分子或多肽的活性，例如如果提高或产生分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与SEQ ID NO.：1423或SEQ ID NO.：1424处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者如果提高或产生“参与赋予对酮康唑抗性的转录调节子”的活性，那么与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量，优选至少一个产量相关性状，优选环境胁迫的耐受性和/或抗性和提高的生物量生产。优选地，在质体中发生所述提高。
[0051.3.1.1]在其它实施方案中，如果提高或产生包含SEQ ID NO.725中所示多肽的多肽，或包含SEQ ID NO.724中所示核酸分子的核酸分子编码的多肽，或所述核酸分子或多肽的同源物的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予提高的非生物环境胁迫耐受性，特别是提高的低温耐受性。例如，提高或产生来自酿酒酵母的相应的核酸分子或多肽的活性，所述核酸分子或多肽优选分别包含SEQ ID NO.724中所示的核酸分子或SEQ ID NO.725中所示的多肽或其同源物。如果在植物或其部分中提高或产生“yal043c-a-蛋白质”活性或分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与SEQ ID NO.：724或SEQ ID NO.：725处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予例如提高的非生物环境胁迫耐受性，特别是提高的低温耐受性。优选地，在细胞质中发生所述提高。
特别是，在低温条件下与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予1.1倍到1.389倍的产量提高，例如加上其至少100％的产量提高。
在其它实施方案中，如果提高或产生包含SEQ ID NO.729中所示多肽的多肽，或包含SEQ ID NO.728中所示核酸分子的核酸分子编码的多肽，或所述核酸分子或多肽的同源物的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予提高的非生物环境胁迫耐受性，特别是提高的低温耐受性。例如，提高或产生来自酿酒酵母的相应的核酸分子或多肽的活性，所述核酸分子或多肽优选分别包含SEQ ID NO.728中所示的核酸分子或SEQ ID NO.729中所示的多肽或其同源物。如果在植物或其部分中提高或产生“ybr071w-蛋白质”活性或分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与SEQ ID NO.：728或SEQ ID NO.：729处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予例如提高的非生物环境胁迫耐受性，特别是提高的低温耐受性。优选地，在质体中发生所述提高。
特别是，在低温条件下与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予1.1倍到1.350倍的产量提高，例如加上其至少100％的产量提高。
在其它实施方案中，如果提高或产生包含SEQ ID NO.733中所示多肽的多肽，或包含SEQ ID NO.732中所示核酸分子的核酸分子编码的多肽，或所述核酸分子或多肽的同源物的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予提高的非生物环境胁迫耐受性，特别是提高的低温耐受性。例如，提高或产生来自酿酒酵母的相应的核酸分子或多肽的活性，所述核酸分子或多肽优选分别包含SEQ ID NO.732中所示的核酸分子或SEQ ID NO.733中所示的多肽或其同源物。如果在植物或其部分中提高或产生“二酪氨酸转运蛋白”活性或分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与SEQ ID NO.：732或SEQ ID NO.：733处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予例如提高的非生物环境胁迫耐受性，特别是提高的低温耐受性。优选地，在细胞质中发生所述提高。
特别是，在低温条件下与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予1.1倍到1.374倍的产量提高，例如加上其至少100％的产量提高。
在其它实施方案中，如果提高或产生包含SEQ ID NO.765中所示多肽的多肽，或包含SEQ ID NO.764中所示核酸分子的核酸分子编码的多肽，或所述核酸分子或多肽的同源物的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予提高的非生物环境胁迫耐受性，特别是提高的低温耐受性。例如，提高或产生来自酿酒酵母的相应的核酸分子或多肽的活性，所述核酸分子或多肽优选分别包含SEQ ID NO.764中所示的核酸分子或SEQ ID NO.765中所示的多肽或其同源物。如果在植物或其部分中提高或产生“二酰甘油焦磷酸磷酸酶”活性或分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与SEQ ID NO.：764或SEQ ID NO.：765处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予例如提高的非生物环境胁迫耐受性，特别是提高的低温耐受性。优选地，在细胞质中发生所述提高。
特别是，在低温条件下与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予1.1倍到1.500倍的产量提高，例如加上其至少100％的产量提高。
在其它实施方案中，如果提高或产生包含SEQ ID NO.1158中所示多肽的多肽，或包含SEQ ID NO.1157中所示核酸分子的核酸分子编码的多肽，或所述核酸分子或多肽的同源物的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予提高的非生物环境胁迫耐受性，特别是提高的低温耐受性。例如，提高或产生来自酿酒酵母的相应的核酸分子或多肽的活性，所述核酸分子或多肽优选分别包含SEQ ID NO.1157中所示的核酸分子或SEQ ID NO.1158中所示的多肽或其同源物。如果在植物或其部分中提高或产生“磷酸烯醇丙酮酸羧激酶”活性或分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与SEQ ID NO.：1157或SEQ ID NO.：1158处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予例如提高的非生物环境胁迫耐受性，特别是提高的低温耐受性。优选地，在细胞质中发生所述提高。
特别是，在低温条件下与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予1.1倍到1.799倍的产量提高，例如加上其至少100％的产量提高。
优选地，在线粒体中发生所述提高。
特别是，在低温条件下与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予1.1倍到1.533倍的产量提高，例如加上其至少100％的产量提高。
在其它实施方案中，如果提高或产生包含SEQ ID NO.1353中所示多肽的多肽，或包含SEQ ID NO.1352中所示核酸分子的核酸分子编码的多肽，或所述核酸分子或多肽的同源物的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予提高的非生物环境胁迫耐受性，特别是提高的低温耐受性。例如，提高或产生来自酿酒酵母的相应的核酸分子或多肽的活性，所述核酸分子或多肽优选分别包含SEQ ID NO.1352中所示的核酸分子或SEQ ID NO.1353中所示的多肽或其同源物。如果在植物或其部分中提高或产生“尿苷激酶”活性或分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与SEQ ID NO.：1352或SEQ ID NO.：1353处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予例如提高的非生物环境胁迫耐受性，特别是提高的低温耐受性。优选地，在细胞质中发生所述提高。
特别是，在低温条件下与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予1.1倍到1.399倍的产量提高，例如加上其至少100％的产量提高。
[0051.4.1.1]在其它实施方案中，如果提高或产生包含SEQ ID NO.64中所示多肽的多肽，或包含SEQ ID NO.63中所示核酸分子的核酸分子编码的多肽，或所述核酸分子或多肽的同源物的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予提高的营养利用效率。例如，提高或产生来自大肠杆菌的相应的核酸分子或多肽的活性，所述核酸分子或多肽优选分别包含SEQ ID NO.63中所示的核酸分子或SEQ ID NO.64中所示的多肽或其同源物。如果在植物或其部分中提高或产生“NAD+依赖性甜菜碱醛脱氢酶”活性或分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与SEQ ID NO.：63或SEQ ID NO.：64处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予例如提高的非生物环境胁迫耐受性，特别是提高的营养利用效率。优选地，在质体中发生所述提高。在一个实施方案中，赋予提高的氮利用效率。
特别是，在氮不足条件下与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予1.05倍到1.180倍的产量提高，例如加上其至少100％的产量提高。
在其它实施方案中，如果提高或产生包含SEQ ID NO.725中所示多肽的多肽，或包含SEQ ID NO.724中所示核酸分子的核酸分子编码的多肽，或所述核酸分子或多肽的同源物的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予提高的营养利用效率。例如，提高或产生来自酿酒酵母的相应的核酸分子或多肽的活性，所述核酸分子或多肽优选分别包含SEQ ID NO.724中所示的核酸分子或SEQ ID NO.725中所示的多肽或其同源物。如果在植物或其部分中提高或产生“yal043c-a-蛋白质”活性或分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与SEQ ID NO.：724或SEQID NO.：725处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予例如提高的非生物环境胁迫耐受性，特别是提高的营养利用效率。优选地，在细胞质中发生所述提高。在一个实施方案中，赋予提高的氮利用效率。
特别是，在氮不足条件下与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予1.05倍到1.292倍的产量提高，例如加上其至少100％的产量提高。
在其它实施方案中，如果提高或产生包含SEQ ID NO.733中所示多肽的多肽，或包含SEQ ID NO.732中所示核酸分子的核酸分子编码的多肽，或所述核酸分子或多肽的同源物的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予提高的营养利用效率。例如，提高或产生来自酿酒酵母的相应的核酸分子或多肽的活性，所述核酸分子或多肽优选分别包含SEQ ID NO.732中所示的核酸分子或SEQ ID NO.733中所示的多肽或其同源物。如果在植物或其部分中提高或产生“二酪氨酸转运蛋白”活性或分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与SEQ ID NO.：732或SEQID NO.：733处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予例如提高的非生物环境胁迫耐受性，特别是提高的营养利用效率。优选地，在细胞质中发生所述提高。在一个实施方案中，赋予提高的氮利用效率。
特别是，在氮不足条件下与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予1.05倍到1.739倍的产量提高，例如加上其至少100％的产量提高。
在其它实施方案中，如果提高或产生包含SEQ ID NO.765中所示多肽的多肽，或包含SEQ ID NO.764中所示核酸分子的核酸分子编码的多肽，或所述核酸分子或多肽的同源物的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予提高的营养利用效率。例如，提高或产生来自酿酒酵母的相应的核酸分子或多肽的活性，所述核酸分子或多肽优选分别包含SEQ ID NO.764中所示的核酸分子或SEQ ID NO.765中所示的多肽或其同源物。如果在植物或其部分中提高或产生“二酰甘油焦磷酸磷酸酶”活性或分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与SEQ ID NO.：764或SEQ ID NO.：765处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予例如提高的非生物环境胁迫耐受性，特别是提高的营养利用效率。优选地，在细胞质中发生所述提高。在一个实施方案中，赋予提高的氮利用效率。
特别是，在氮不足条件下与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予1.05倍到1.352倍的产量提高，例如加上其至少100％的产量提高。
在其它实施方案中，如果提高或产生包含SEQ ID NO.815中所示多肽的多肽，或包含SEQ ID NO.814中所示核酸分子的核酸分子编码的多肽，或所述核酸分子或多肽的同源物的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予提高的营养利用效率。例如，提高或产生来自酿酒酵母的相应的核酸分子或多肽的活性，所述核酸分子或多肽优选分别包含SEQ ID NO.814中所示的核酸分子或SEQ ID NO.815中所示的多肽或其同源物。如果在植物或其部分中提高或产生“ydr445c-蛋白质”活性或分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与SEQ ID NO.：814或SEQID NO.：815处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予例如提高的非生物环境胁迫耐受性，特别是提高的营养利用效率。优选地，在细胞质中发生所述提高。在一个实施方案中，赋予提高的氮利用效率。
特别是，在氮不足条件下与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予1.05倍到1.197倍的产量提高，例如加上其至少100％的产量提高。
在其它实施方案中，如果提高或产生包含SEQ ID NO.926中所示多肽的多肽，或包含SEQ ID NO.925中所示核酸分子的核酸分子编码的多肽，或所述核酸分子或多肽的同源物的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予提高的营养利用效率。例如，提高或产生来自酿酒酵母的相应的核酸分子或多肽的活性，所述核酸分子或多肽优选分别包含SEQ ID NO.925中所示的核酸分子或SEQ ID NO.926中所示的多肽或其同源物。如果在植物或其部分中提高或产生“法尼二磷酸法尼基转移酶”活性或分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与SEQ ID NO.：925或SEQ ID NO.：926处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予例如提高的非生物环境胁迫耐受性，特别是提高的营养利用效率。优选地，在质体中发生所述提高。在一个实施方案中，赋予提高的氮利用效率。
特别是，在氮不足条件下与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予1.05倍到1.181倍的产量提高，例如加上其至少100％的产量提高。
在其它实施方案中，如果提高或产生包含SEQ ID NO.1022中所示多肽的多肽，或包含SEQ ID NO.1021中所示核酸分子的核酸分子编码的多肽，或所述核酸分子或多肽的同源物的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予提高的营养利用效率。例如，提高或产生来自酿酒酵母的相应的核酸分子或多肽的活性，所述核酸分子或多肽优选分别包含SEQ ID NO.1021中所示的核酸分子或SEQ ID NO.1022中所示的多肽或其同源物。如果在植物或其部分中提高或产生“丝氨酸水解酶”活性或分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与SEQ ID NO.：1021或SEQID NO.：1022处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予例如提高的非生物环境胁迫耐受性，特别是提高的营养利用效率。优选地，在细胞质中发生所述提高。在一个实施方案中，赋予提高的氮利用效率。
特别是，在氮不足条件下与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予1.05倍到1.255倍的产量提高，例如加上其至少100％的产量提高。
在其它实施方案中，如果提高或产生包含SEQ ID NO.1158中所示多肽的多肽，或包含SEQ ID NO.1157中所示核酸分子的核酸分子编码的多肽，或所述核酸分子或多肽的同源物的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予提高的营养利用效率。例如，提高或产生来自酿酒酵母的相应的核酸分子或多肽的活性，所述核酸分子或多肽优选分别包含SEQ ID NO.1157中所示的核酸分子或SEQ ID NO.1158中所示的多肽或其同源物。如果在植物或其部分中提高或产生“磷酸烯醇丙酮酸羧激酶”活性或分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与SEQ ID NO.：1157或SEQ ID NO.：1158处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予例如提高的非生物环境胁迫耐受性，特别是提高的营养利用效率。
优选地，在细胞质中发生所述提高。在一个实施方案中，赋予提高的氮利用效率。
特别是，在氮不足条件下与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予1.05倍到1.313倍的产量提高，例如加上其至少100％的产量提高。
优选地，在线粒体中发生所述提高。在一个实施方案中，赋予提高的氮利用效率。
特别是，在氮不足条件下与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予1.05倍到1.264倍的产量提高，例如加上其至少100％的产量提高。
在其它实施方案中，如果提高或产生包含SEQ ID NO.1353中所示多肽的多肽，或包含SEQ ID NO.1352中所示核酸分子的核酸分子编码的多肽，或所述核酸分子或多肽的同源物的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予提高的营养利用效率。例如，提高或产生来自酿酒酵母的相应的核酸分子或多肽的活性，所述核酸分子或多肽优选分别包含SEQ ID NO.1352中所示的核酸分子或SEQ ID NO.1353中所示的多肽或其同源物。如果在植物或其部分中提高或产生“尿苷激酶”活性或分别包含如表I、II或IV笫7列中描述的分别与SEQ ID NO.：1352或SEQ IDNO.：1353处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予例如提高的非生物环境胁迫耐受性，特别是提高的营养利用效率。优选地，在细胞质中发生所述提高。在一个实施方案中，赋予提高的氮利用效率。
特别是，在氮不足条件下与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予1.05倍到1.194倍的产量提高，例如加上其至少100％的产量提高。
[0051.5.1.1]在其它实施方案中，如果提高或产生包含SEQ ID NO.64中所示多肽的多肽，或包含SEQ ID NO.63中所示核酸分子的核酸分子编码的多肽，或所述核酸分子或多肽的同源物的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予提高的非生物环境胁迫耐受性，特别是提高的固有产量。例如，提高或产生来自大肠杆菌的相应的核酸分子或多肽的活性，所述核酸分子或多肽优选分别包含SEQ ID NO.63中所示的核酸分子或SEQ ID NO.64中所示的多肽或其同源物。如果在植物或其部分中提高或产生“NAD+依赖性甜菜碱醛脱氢酶”活性或分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与SEQ ID NO.：63或SEQ ID NO.：64处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予例如提高的非生物环境胁迫耐受性，特别是提高的固有产量。优选地，在质体中发生所述提高。
特别是，在标准条件，例如缺少营养物不足和/或胁迫条件下与相应的对照，例如未修饰的，例如未转化野生型植物相比赋予1.05倍到1.353倍的产量提高，例如加上其至少100％的产量提高。
在其它实施方案中，如果提高或产生包含SEQ ID NO.725中所示多肽的多肽，或包含SEQ ID NO.724中所示核酸分子的核酸分子编码的多肽，或所述核酸分子或多肽的同源物的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予提高的非生物环境胁迫耐受性，特别是提高的固有产量。例如，提高或产生来自酿酒酵母的相应的核酸分子或多肽的活性，所述核酸分子或多肽优选分别包含SEQ ID NO.724中所示的核酸分子或SEQ ID NO.725中所示的多肽或其同源物。如果在植物或其部分中提高或产生“yal043c-a-蛋白质”活性或分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与SEQ ID NO.：724或SEQ ID NO.：725处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予例如提高的非生物环境胁迫耐受性，特别是提高的固有产量。优选地，在细胞质中发生所述提高。
特别是，在标准条件，例如缺少营养物不足和/或胁迫条件下与相应的对照，例如未修饰的，例如未转化野生型植物相比赋予1.05倍到1.411倍的产量提高，例如加上其至少100％的产量提高。
在其它实施方案中，如果提高或产生包含SEQ ID NO.733中所示多肽的多肽，或包含SEQ ID NO.732中所示核酸分子的核酸分子编码的多肽，或所述核酸分子或多肽的同源物的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予提高的非生物环境胁迫耐受性，特别是提高的固有产量。例如，提高或产生来自酿酒酵母的相应的核酸分子或多肽的活性，所述核酸分子或多肽优选分别包含SEQ ID NO.732中所示的核酸分子或SEQ ID NO.733中所示的多肽或其同源物。如果在植物或其部分中提高或产生“二酪氨酸转运蛋白”活性或分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与SEQ ID NO.：732或SEQ ID NO.：733处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予例如提高的非生物环境胁迫耐受性，特别是提高的固有产量。优选地，在细胞质中发生所述提高。
特别是，在标准条件，例如缺少营养物不足和/或胁迫条件下与相应的对照，例如未修饰的，例如未转化野生型植物相比赋予1.05倍到1.449倍的产量提高，例如加上其至少100％的产量提高。
在其它实施方案中，如果提高或产生包含SEQ ID NO.819中所示多肽的多肽，或包含SEQ ID NO.818中所示核酸分子的核酸分子编码的多肽，或所述核酸分子或多肽的同源物的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予提高的非生物环境胁迫耐受性，特别是提高的固有产量。例如，提高或产生来自酿酒酵母的相应的核酸分子或多肽的活性，所述核酸分子或多肽优选分别包含SEQ ID NO.818中所示的核酸分子或SEQ ID NO.819中所示的多肽或其同源物。如果在植物或其部分中提高或产生“精氨酸/丙氨酸氨肽酶”活性或分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与SEQ ID NO.：818或SEQ ID NO.：819处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予例如提高的非生物环境胁迫耐受性，特别是提高的固有产量。优选地，在细胞质中发生所述提高。
特别是，在标准条件，例如缺少营养物不足和/或胁迫条件下与相应的对照，例如未修饰的，例如未转化野生型植物相比赋予1.05倍到1.179倍的产量提高，例如加上其至少100％的产量提高。
在其它实施方案中，如果提高或产生包含SEQ ID NO.1158中所示多肽的多肽，或包含SEQ ID NO.1157中所示核酸分子的核酸分子编码的多肽，或所述核酸分子或多肽的同源物的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予提高的非生物环境胁迫耐受性，特别是提高的固有产量。例如，提高或产生来自酿酒酵母的相应的核酸分子或多肽的活性，所述核酸分子或多肽优选分别包含SEQ ID NO.1157中所示的核酸分子或SEQ ID NO.1158中所示的多肽或其同源物。如果在植物或其部分中提高或产生“磷酸烯醇丙酮酸羧激酶”活性或分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与SEQ ID NO.：1157或SEQ ID NO.：1158处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予例如提高的非生物环境胁迫耐受性，特别是提高的固有产量。优选地，在线粒体中发生所述提高。
特别是，在标准条件，例如缺少营养物不足和/或胁迫条件下与相应的对照，例如未修饰的，例如未转化野生型植物相比赋予1.05倍到1.619倍的产量提高，例如加上其至少100％的产量提高。
在其它实施方案中，如果提高或产生包含SEQ ID NO.1353中所示多肽的多肽，或包含SEQ ID NO.1352中所示核酸分子的核酸分子编码的多肽，或所述核酸分子或多肽的同源物的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予提高的非生物环境胁迫耐受性，特别是提高的固有产量。例如，提高或产生来自酿酒酵母的相应的核酸分子或多肽的活性，所述核酸分子或多肽优选分别包含SEQ ID NO.1352中所示的核酸分子或SEQ ID NO.1353中所示的多肽或其同源物。如果在植物或其部分中提高或产生“尿苷激酶”活性或分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与SEQ ID NO.：1352或SEQ ID NO.：1353处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，那么与相应的未修饰，例如未转化野生型植物相比赋予例如提高的非生物环境胁迫耐受性，特别是提高的固有产量。优选地，在细胞质中发生所述提高。
特别是，在标准条件，例如缺少营养物不足和/或胁迫条件下与相应的对照，例如未修饰的，例如未转化野生型植物相比赋予1.05倍到1.314倍的产量提高，例如加上其至少100％的产量提高。
[0052.1.1.1]为了本发明目的，通常复数旨在包括单数，并且反之亦然。除非另有说明，术语“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在该上下文中可互换。除非另有说明，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在该上下文中可互换。根据术语“序列”使用的上下文，术语“序列”可涉及多核苷酸、核酸、核酸分子、肽、多肽和蛋白质。此处使用的术语“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、或“核酸分子”指任何长度的核苷酸的多聚体形式，可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。所述术语仅指分子的一级结构。
因此，此处使用的术语“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、或“核酸分子”包括双链和单链DNA和/或RNA。它们还包括已知类型的修饰，例如甲基化、“帽”、类似物对一个或更多个天然发生的核苷酸的替代。优选地，所述DNA或RNA序列包含编码此处定义的多肽的编码序列。
“编码序列”是核苷酸序列，其转录成RNA，例如调节RNA，如miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、RNAi、核酶等，或转录成mRNA，当其置于适当调节序列的控制下时翻译成多肽。编码序列的边界由5’末端的翻译起始密码子和3’末端的翻译终止密码子决定。编码序列可包括，但不限于mRNA、cDNA、重组核苷酸序列或基因组DNA，同时在特定环境下也可存在内含子。
如该上下文中所用，核酸分子也可包括位于编码基因区3’和5’末端的非翻译序列，例如编码基因区5’末端序列上游的至少500，优选200，尤其优选100个核苷酸，以及编码基因区3’末端序列下游的至少100，优选50，尤其优选20个核苷酸。例如在使用反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶等技术的情况下，可有利地使用编码区以及5’和/或3’区。
然而，仅经常有利地选择编码区用于克隆及表达目的。
“多肽”指氨基酸(氨基酸序列)的聚合物，并非指特定长度的分子。因此，在多肽的定义中包括肽和寡肽。该术语也指或包括多肽的翻译后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。定义中包括的是，例如，含有氨基酸(包括，例如非天然氨基酸等)的一个或更多个类似物的多肽、具有替代连接以及本领域已知的天然发生的和非天然发生的其它修饰的多肽。
该说明书中使用的术语“表I”用于指定表IA和表IB的内容。该说明书中使用的术语“表II”用于指定表IIA和表IIB的内容。该说明书中使用的术语“表IA”用于指定表IA的内容。该说明书中使用的术语“表IB”用于指定表IB的内容。该说明书中使用的术语“表IIA”用于指定表IIA的内容。该说明书中使用的术语“表IIB”用于指定表IIB的内容。在一个优选实施方案中，术语“表I”表示表IB。在一个优选实施方案中，术语“表II”表示表IIB。
当用于该说明书时，术语“包含”或“含有”及其语法变体用于指定所述的特征、整数、步骤或组分或其组的存在，但不排除一个或更多个特征、整数、步骤或组分或其组的存在或添加。
[0053.2.1.1]根据本发明，如果优选在提高的产量下，优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比，其从头活性，或其增强的表达直接或间接导致并赋予提高的产量，那么蛋白质或多肽“具有如表II第3列中所示蛋白质的活性”，并且所述蛋白质具有如表II第3列中所示蛋白质的上述活性。在整个说明书中，如果其仍然具有如表II第3列中所示蛋白质的生物学或酶促活性，或者其与表II第3列中所示大肠杆菌或酿酒酵母的蛋白质相比具有至少10％，优选20％，特别优选30％，最特别优选40％的初始酶促活性，那么这类蛋白质或多肽或核酸分子或编码这类蛋白质或多肽的序列的活性或优选生物学活性是相同或类似的。
[0054.1.1.1]术语“提高”、“升高”、“延长”、“增强”、“改善”或“扩大”涉及植物、生物、生物的部分，如组织、种子、根、叶、花等中，或细胞中性质的相应改变，并且可互换。优选地，如果提高或增强与基因产物活性的提高或增强相关，而不依赖于基因产物的量或基因产物的比活性，或两者是否提高或增强，或者编码基因产物的核酸序列或基因的量、稳定性或翻译效率是否提高或增强，那么体积内的总体活性提高或增强。
术语“提高”涉及生物中，或植物、生物的部分，如组织、种子、根、叶、花等中，或细胞中性质的相应改变。优选地，如果提高与基因产物活性的提高相关，而不依赖于基因产物的量或基因产物的比活性，或两者是否提高或产生，或者编码基因产物的核酸序列或基因的量、稳定性或翻译效率是否增加，那么体积内的总体活性提高。
在“性质的改变”之下，应理解相对于对照、参照或野生型的相应体积，特定体积中基因产物的活性、表达水平或量或代谢物含量改变了，包括活性或表达的从头产生。
术语“提高”包括仅部分本发明受试者中所述性质的改变，例如，可在细胞区室，像细胞器中，或在植物部分，像组织、种子、根、叶、花等中发现修饰，但如果检测总体受试者，即完整的细胞或植物，那么检测不到所述修饰。
因此，术语“提高”表示酶的比活性以及本发明化合物或代谢物例如多肽、核酸分子或编码mRNA或DNA的量可以在体积上增加。
[0055.1.1.1]术语“野生型”、“对照”或“参照”可互换并可以是细胞或生物的一部分，如细胞器，像叶绿体或组织，或生物，特别是植物，其未被本发明在本文中所述的方法修饰或处理。因此，用作野生型、对照或参照的细胞或生物的一部分，如细胞器，像叶绿体或组织，或生物，特别是植物尽可能地对应于细胞、生物、植物或其部分，并且是任何其它性质，但本发明方法的结果与本发明主题尽可能相同。因此，野生型、对照或参照进行相同或尽可能相同的处理，即仅条件或性质可以不同，其不影响所测性质的质量。
优选地，在相似条件下进行任何比较。术语“相似条件”表示在待比较的实验之间保持所有条件相同，所述条件为例如培养或生长条件、土壤含水量、温度、湿度或环境空气或土壤、测定条件(如缓冲液组成、温度、底物、病原体品系、浓度等)。
术语“参照”、“对照”或“野生型”优选为受试者，例如细胞器、细胞、组织、生物，尤其是植物，其未被本发明在本文中所述的方法修饰或处理，并且是与本发明主题尽可能类似的任何其它性质。参照、对照或野生型处于尽可能与本发明主题类似的其基因组、转录组、蛋白质组或代谢物组中。优选地，术语“参照”、“对照”或“野生型”细胞器、细胞、组织或生物，尤其是植物涉及细胞器、细胞、组织或生物，尤其是植物，其与本发明的细胞器、细胞、组织或生物，尤其是植物或其部分在遗传上几乎相同，具有优选95％，更优选98％，甚至更优选99,00％，特别是99,10％、99,30％、99,50％、99,70％、99,90％、99,99％、99,999％或更高的同一性。最优选的，“参照”、“对照”或“野生型”是受试者，例如细胞器、细胞、组织、生物，其与根据本发明方法使用的生物、细胞或细胞器在遗传上相同，只是根据本发明方法改正、操作、交换或引入了应负责核酸分子或活性赋予核酸分子或由它们编码的基因产物。
[0056.2.1.1]如果不能提供仅因不是本发明方法的主题而不同于本发明主题的对照、参照或野生型，那么对照、参照或野生型可以是这样的生物，其中例如通过敲除负责基因产物的表达、例如通过反义抑制、通过失活激活剂或激动剂、激活抑制剂或拮抗剂、通过加入抑制性抗体进行抑制、加入活性化合物例如激素、引入负显性突变体等恢复或关闭活性调节的原因或如此处所述本发明核酸分子的表达，所述活性的调节与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比，优选在提高的产量，优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下赋予提高的产量。例如通过引入失活点突变敲除基因产生，其导致对酶活性的抑制或对结合辅因子等的能力的去稳定话或抑制。
[0057.1.1.1]因此，优选的参照受试者是本发明方法的起始受试者。优选地，在例如对总RNA、DNA或蛋白质或参照基因的活性或表达，像持家基因，如泛素、肌动蛋白或核糖体蛋白进行标准化并归一化后比较本发明的参照和主题。
[0058.1.1.1]本发明的提高或调节可以是瞬时的，例如由于稳定持久的转基因表达或在编码本发明核酸分子的相应内源基因中的稳定突变或对赋予本发明多肽表达的基因的表达或行为的调节，本发明的提高或调节可以是组成型的；例如由于调节物如激动剂或拮抗剂的瞬时转化或短暂添加；例如在用携带诱导型启动子控制下的本发明核酸分子的诱导型构建体转化并添加诱导物，例如四环素或如下文所述后。
[0059.1.1.1]与对照、参照或野生型相比，细胞、组织、细胞器、器官或生物或其部分中多肽活性量的提高优选达到至少5％，优选至少20％或至少50％，尤其优选至少70％、80％、90％或更高，特别尤其优选至少200％、300％或400％，最优选至少500％或更高。在一个实施方案中，术语提高表示与生物或其部分的重量相关的量的增加(w/w)。
在一个实施方案中，在细胞器如质体中多肽的活性量增加。
[0060.1.1.1]可如实施例中描述来检测本发明核酸分子编码的多肽或本发明多肽的比活性。具体而言，正在讨论的蛋白质在细胞，例如植物细胞中相比于对照的表达是容易的检测并可如本领域中描述的来进行。
[0061.1.1.1]术语“提高”包括，向细胞或亚细胞区室或细胞器中从头引入化合物或活性，或之前未曾检测到所述化合物或活性，换言之“产生”所述化合物或活性。
因此，在下文中，术语“提高”也包含术语“产生”或“刺激”。提高的活性本身表现在优选在提高的产量下，优选暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比提高的产量。
[0062.1.1.1]例如表I第5列中所示来自大肠杆菌的B0312的序列[已经在Goffeau等，Science 274(5287)，546-547，1996中发表了来自酿酒酵母的序列，已经在Blattner等，Science 277(5331)，1453-1474(1997)中发表了来自大肠杆菌的序列]，及其活性发表描述为NAD+依赖性甜菜碱醛脱氢酶。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括如所提及地优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比，在植物细胞中提高或产生具有来自大肠杆菌的“NAD+依赖性甜菜碱醛脱氢酶”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物的活性，例如增加
(a)基因的基因产物，所述基因包含在表I第5列中所示并与所述B0312同一行中描述的核酸分子或表I第7列中描述的其功能等同物或同源物，优选如表IB第7列中描述的同源物或功能等同物，并与所述B0312处于同一行中描述的核酸分子；或
(b)多肽，其包含表II第5列中描述并与所述B0312分别处于同一行的多肽、共有序列或多肽基序或表II或IV第7列中描述的其功能等同物或同源物，优选如表IIB第7列中描述的同源物或功能等同物并与所述B0312处于同一行中描述，用于提高的产量。
因此，在一个实施方案中，活性待在本发明方法中提高的分子是具有描述为“NAD+依赖性甜菜碱醛脱氢酶”的活性的基因产物，其优选为该段(a)或(b)部分的分子。
在一个实施方案中，在质体中增加所述分子，其活性待在本发明方法中提高并且其为具有“NAD+依赖性甜菜碱醛脱氢酶”的活性的基因产物。
例如表I第5列中所示来自大肠杆菌的B3182的序列[已经在Goffeau等，Science 274(5287)，546-547，1996中发表了来自酿酒酵母的序列，已经在Blattner等，Science 277(5331)，1453-1474(1997)中发表了来自大肠杆菌的序列]，及其活性发表描述为D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括如所提及地优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比，在植物细胞中提高或产生具有来自大肠杆菌的“D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物的活性，例如增加
(a)基因的基因产物，所述基因包含在表I第5列中所示并与所述B3182同一行中描述的核酸分子或表I第7列中描述的其功能等同物或同源物，优选如表IB第7列中描述的同源物或功能等同物，并与所述B3182处于同一行中描述的核酸分子；或
(b)多肽，其包含表II第5列中描述并与所述B3182分别处于同一行的多肽、共有序列或多肽基序或表II或IV第7列中描述的其功能等同物或同源物，优选如表IIB第7列中描述的同源物或功能等同物并与所述B3182处于同一行中描述，用于提高的产量。
因此，在一个实施方案中，活性待在本发明方法中提高的分子是具有描述为“D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶”的活性的基因产物，其优选为该段(a)或(b)部分的分子。
在一个实施方案中，在细胞质中增加所述分子，其活性待在本发明方法中提高并且其为具有“D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶”的活性的基因产物。
例如表I第5列中所示来自酿酒酵母的Yal043c-a的序列[已经在Goffeau等，Science 274(5287)，546-547，1996中发表了来自酿酒酵母的序列，已经在Blattner等，Science 277(5331)，1453-1474(1997)中发表了来自大肠杆菌的序列]，及其活性发表描述为yal043c-a-蛋白质。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括如所提及地优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比，在植物细胞中提高或产生具有来自酿酒酵母的“yal043c-a-蛋白质”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物的活性，例如增加
(a)基因的基因产物，所述基因包含在表I第5列中所示并与所述Yal043c-a同一行中描述的核酸分子或表I第7列中描述的其功能等同物或同源物，优选如表IB第7列中描述的同源物或功能等同物，并与所述Yal043c-a处于同一行中描述的核酸分子；或
(b)多肽，其包含表II第5列中描述并与所述Yal043c-a分别处于同一行的多肽、共有序列或多肽基序或表II或IV第7列中描述的其功能等同物或同源物，优选如表IIB第7列中描述的同源物或功能等同物并与所述Yal043c-a处于同一行中描述，用于提高的产量。
因此，在一个实施方案中，活性待在本发明方法中提高的分子是具有描述为“yal043c-a-蛋白质”的活性的基因产物，其优选为该段(a)或(b)部分的分子。
在一个实施方案中，在细胞质中增加所述分子，其活性待在本发明方法中提高并且其为具有“yal043c-a-蛋白质”的活性的基因产物。
例如表I第5列中所示来自酿酒酵母的Ybr071w的序列[已经在Goffeau等，Science 274(5287)，546-547，1996中发表了来自酿酒酵母的序列，已经在Blattner等，Science 277(5331)，1453-1474(1997)中发表了来自大肠杆菌的序列]，及其活性发表描述为ybr071w-蛋白质。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括如所提及地优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比，在植物细胞中提高或产生具有来自大肠杆菌的“ybr071w-蛋白质”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物的活性，例如增加
(a)基因的基因产物，所述基因包含在表I第5列中所示并与所述Ybr071w同一行中描述的核酸分子或表I第7列中描述的其功能等同物或同源物，优选如表IB第7列中描述的同源物或功能等同物，并与所述Ybr071w处于同一行中描述的核酸分子；或
(b)多肽，其包含表II第5列中描述并与所述Ybr071w分别处于同一行的多肽、共有序列或多肽基序或表II或IV第7列中描述的其功能等同物或同源物，优选如表IIB第7列中描述的同源物或功能等同物并与所述Ybr071w处于同一行中描述，用于提高的产量。
因此，在一个实施方案中，活性待在本发明方法中提高的分子是具有描述为“ybr071w-蛋白质”的活性的基因产物，其优选为该段(a)或(b)部分的分子。
在一个实施方案中，在质体中增加所述分子，其活性待在本发明方法中提高并且其为具有“ybr071w-蛋白质”的活性的基因产物。
例如表I第5列中所示来自酿酒酵母的Ybr180w的序列[已经在Goffeau等，Science 274(5287)，546-547，1996中发表了来自酿酒酵母的序列，已经在Blattner等，Science 277(5331)，1453-1474(1997)中发表了来自大肠杆菌的序列]，及其活性发表描述为二酪氨酸转运蛋白。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括如所提及地优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比，在植物细胞中提高或产生具有来自酿酒酵母的“二酪氨酸转运蛋白”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物的活性，例如增加
(a)基因的基因产物，所述基因包含在表I第5列中所示并与所述Ybr180w同一行中描述的核酸分子或表I第7列中描述的其功能等同物或同源物，优选如表IB第7列中描述的同源物或功能等同物，并与所述Ybr180w处于同一行中描述的核酸分子；或
(b)多肽，其包含表II第5列中描述并与所述Ybr180w分别处于同一行的多肽、共有序列或多肽基序或表II或IV第7列中描述的其功能等同物或同源物，优选如表IIB第7列中描述的同源物或功能等同物并与所述Ybr180w处于同一行中描述，用于提高的产量。
因此，在一个实施方案中，活性待在本发明方法中提高的分子是具有描述为“二酪氨酸转运蛋白”的活性的基因产物，其优选为该段(a)或(b)部分的分子。
在一个实施方案中，在细胞质中增加所述分子，其活性待在本发明方法中提高并且其为具有“二酪氨酸转运蛋白”的活性的基因产物。
例如表I第5列中所示来自酿酒酵母的Ydr284c的序列[已经在Goffeau等，Science 274(5287)，546-547，1996中发表了来自酿酒酵母的序列，已经在Blattner等，Science 277(5331)，1453-1474(1997)中发表了来自大肠杆菌的序列]，及其活性发表描述为二酰甘油焦磷酸磷酸酶。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括如所提及地优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比，在植物细胞中提高或产生具有来自大肠杆菌的“二酰甘油焦磷酸磷酸酶”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物的活性，例如增加
(a)基因的基因产物，所述基因包含在表I第5列中所示并与所述Ydr284c同一行中描述的核酸分子或表I第7列中描述的其功能等同物或同源物，优选如表IB第7列中描述的同源物或功能等同物，并与所述Ydr284c处于同一行中描述的核酸分子；或
(b)多肽，其包含表II第5列中描述并与所述Ydr284c分别处于同一行的多肽、共有序列或多肽基序或表II或IV第7列中描述的其功能等同物或同源物，优选如表IIB第7列中描述的同源物或功能等同物并与所述Ydr284c处于同一行中描述，用于提高的产量。
因此，在一个实施方案中，活性待在本发明方法中提高的分子是具有描述为“二酰甘油焦磷酸磷酸酶”的活性的基因产物，其优选为该段(a)或(b)部分的分子。
在一个实施方案中，在细胞质中增加所述分子，其活性待在本发明方法中提高并且其为具有“二酰甘油焦磷酸磷酸酶”的活性的基因产物。
例如表I第5列中所示来自酿酒酵母的Ydr445c的序列[已经在Goffeau等，Science 274(5287)，546-547，1996中发表了来自酿酒酵母的序列，已经在Blattner等，Science 277(5331)，1453-1474(1997)中发表了来自大肠杆菌的序列]，及其活性发表描述为ydr445c-蛋白质。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括如所提及地优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比，在植物细胞中提高或产生具有来自酿酒酵母的“ydr445c-蛋白质”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物的活性，例如增加
(a)基因的基因产物，所述基因包含在表I第5列中所示并与所述Ydr445c同一行中描述的核酸分子或表I第7列中描述的其功能等同物或同源物，优选如表IB第7列中描述的同源物或功能等同物，并与所述Ydr445c处于同一行中描述的核酸分子；或
(b)多肽，其包含表II第5列中描述并与所述Ydr445c分别处于同一行的多肽、共有序列或多肽基序或表II或IV第7列中描述的其功能等同物或同源物，优选如表IIB第7列中描述的同源物或功能等同物并与所述Ydr445c处于同一行中描述，用于提高的产量。
因此，在一个实施方案中，活性待在本发明方法中提高的分子是具有描述为“ydr445c-蛋白质”的活性的基因产物，其优选为该段(a)或(b)部分的分子。
在一个实施方案中，在细胞质中增加所述分子，其活性待在本发明方法中提高并且其为具有“ydr445c-蛋白质”的活性的基因产物。
例如表I第5列中所示来自酿酒酵母的Yhr047c的序列[已经在Goffeau等，Science 274(5287)，546-547，1996中发表了来自酿酒酵母的序列，已经在Blattner等，Science 277(5331)，1453-1474(1997)中发表了来自大肠杆菌的序列]，及其活性发表描述为精氨酸/丙氨酸氨肽酶。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括如所提及地优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比，在植物细胞中提高或产生具有来自酿酒酵母的“精氨酸/丙氨酸氨肽酶”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物的活性，例如增加
(a)基因的基因产物，所述基因包含在表I第5列中所示并与所述Yhr047c同一行中描述的核酸分子或表I第7列中描述的其功能等同物或同源物，优选如表IB第7列中描述的同源物或功能等同物，并与所述Yhr047c处于同一行中描述的核酸分子；或
(b)多肽，其包含表II第5列中描述并与所述Yhr047c分别处于同一行的多肽、共有序列或多肽基序或表II或IV第7列中描述的其功能等同物或同源物，优选如表IIB第7列中描述的同源物或功能等同物并与所述Yhr047c处于同一行中描述，用于提高的产量。
因此，在一个实施方案中，活性待在本发明方法中提高的分子是具有描述为“精氨酸/丙氨酸氨肽酶”的活性的基因产物，其优选为该段(a)或(b)部分的分子。
在一个实施方案中，在细胞质中增加所述分子，其活性待在本发明方法中提高并且其为具有“精氨酸/丙氨酸氨肽酶”的活性的基因产物。
例如表I第5列中所示来自酿酒酵母的Yhr190w的序列[已经在Goffeau等，Science 274(5287)，546-547，1996中发表了来自酿酒酵母的序列，已经在Blattner等，Science 277(5331)，1453-1474(1997)中发表了来自大肠杆菌的序列]，及其活性发表描述为法尼二磷酸法尼基转移酶。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括如所提及地优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比，在植物细胞中提高或产生具有来自酿酒酵母的“法尼二磷酸法尼基转移酶”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物的活性，例如增加
(a)基因的基因产物，所述基因包含在表I第5列中所示并与所述Yhr190w同一行中描述的核酸分子或表I第7列中描述的其功能等同物或同源物，优选如表IB第7列中描述的同源物或功能等同物，并与所述Yhr190w处于同一行中描述的核酸分子；或
(b)多肽，其包含表II第5列中描述并与所述Yhr190w分别处于同一行的多肽、共有序列或多肽基序或表II或IV第7列中描述的其功能等同物或同源物，优选如表IIB第7列中描述的同源物或功能等同物并与所述Yhr190w处于同一行中描述，用于提高的产量。
因此，在一个实施方案中，活性待在本发明方法中提高的分子是具有描述为“法尼二磷酸法尼基转移酶”的活性的基因产物，其优选为该段(a)或(b)部分的分子。
在一个实施方案中，在质体中增加所述分子，其活性待在本发明方法中提高并且其为具有“法尼二磷酸法尼基转移酶”的活性的基因产物。例如表I第5列中所示来自酿酒酵母的Ykl094w的序列[已经在Goffeau等，Science 274(5287)，546-547，1996中发表了来自酿酒酵母的序列，已经在Blattner等，Science 277(5331)，1453-1474(1997)中发表了来自大肠杆菌的序列]，及其活性发表描述为丝氨酸水解酶。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括如所提及地优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比，在植物细胞中提高或产生具有来自酿酒酵母的“丝氨酸水解酶”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物的活性，例如增加
(a)基因的基因产物，所述基因包含在表I第5列中所示并与所述Ykl094w同一行中描述的核酸分子或表I第7列中描述的其功能等同物或同源物，优选如表IB第7列中描述的同源物或功能等同物，并与所述Ykl094w处于同一行中描述的核酸分子；或
(b)多肽，其包含表II第5列中描述并与所述Ykl094w分别处于同一行的多肽、共有序列或多肽基序或表II或IV第7列中描述的其功能等同物或同源物，优选如表IIB第7列中描述的同源物或功能等同物并与所述Ykl094w处于同一行中描述，用于提高的产量。
因此，在一个实施方案中，活性待在本发明方法中提高的分子是具有描述为“丝氨酸水解酶”的活性的基因产物，其优选为该段(a)或(b)部分的分子。
在一个实施方案中，在细胞质中增加所述分子，其活性待在本发明方法中提高并且其为具有“丝氨酸水解酶”的活性的基因产物。
例如表I第5列中所示来自酿酒酵母的Ykr097w的序列[已经在Goffeau等，Science 274(5287)，546-547，1996中发表了来自酿酒酵母的序列，已经在Blattner等，Science 277(5331)，1453-1474(1997)中发表了来自大肠杆菌的序列]，及其活性发表描述为磷酸烯醇丙酮酸羧激酶。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括如所提及地优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比，在植物细胞中提高或产生具有来自酿酒酵母的“磷酸烯醇丙酮酸羧激酶”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物的活性，例如增加
(a)基因的基因产物，所述基因包含在表I第5列中所示并与所述Ykr097w同一行中描述的核酸分子或表I第7列中描述的其功能等同物或同源物，优选如表IB第7列中描述的同源物或功能等同物，并与所述Ykr097w处于同一行中描述的核酸分子；或
(b)多肽，其包含表II第5列中描述并与所述Ykr097w分别处于同一行的多肽、共有序列或多肽基序或表II或IV第7列中描述的其功能等同物或同源物，优选如表IIB第7列中描述的同源物或功能等同物并与所述Ykr097w处于同一行中描述，用于提高的产量。
因此，在一个实施方案中，活性待在本发明方法中提高的分子是具有描述为“磷酸烯醇丙酮酸羧激酶”的活性的基因产物，其优选为该段(a)或(b)部分的分子。
在一个实施方案中，在细胞质中增加所述分子，其活性待在本发明方法中提高并且其为具有“磷酸烯醇丙酮酸羧激酶”的活性的基因产物。
例如表I第5列中所示来自酿酒酵母的Ynr012w的序列[已经在Goffeau等，Science 274(5287)，546-547，1996中发表了来自酿酒酵母的序列，已经在Blattner等，Science 277(5331)，1453-1474(1997)中发表了来自大肠杆菌的序列]，及其活性发表描述为尿苷激酶。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括如所提及地优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比，在植物细胞中提高或产生具有来自酿酒酵母的“尿苷激酶”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物的活性，例如增加
(a)基因的基因产物，所述基因包含在表I第5列中所示并与所述Ynr012w同一行中描述的核酸分子或表I第7列中描述的其功能等同物或同源物，优选如表IB第7列中描述的同源物或功能等同物，并与所述Ynr012w处于同一行中描述的核酸分子；或
(b)多肽，其包含表II第5列中描述并与所述Ynr012w分别处于同一行的多肽、共有序列或多肽基序或表II或IV第7列中描述的其功能等同物或同源物，优选如表IIB第7列中描述的同源物或功能等同物并与所述Ynr012w处于同一行中描述，用于提高的产量。
因此，在一个实施方案中，活性待在本发明方法中提高的分子是具有描述为“尿苷激酶”的活性的基因产物，其优选为该段(a)或(b)部分的分子。
在一个实施方案中，在细胞质中增加所述分子，其活性待在本发明方法中提高并且其为具有“尿苷激酶”的活性的基因产物。
例如表I第5列中所示来自酿酒酵母的Ypl133c的序列[已经在Goffeau等，Science 274(5287)，546-547，1996中发表了来自酿酒酵母的序列，已经在Blattner等，Science 277(5331)，1453-1474(1997)中发表了来自大肠杆菌的序列]，及其活性发表描述为参与赋予对酮康唑抗性的转录调节子。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括如所提及地优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比，在植物细胞中提高或产生具有来自酿酒酵母的“参与赋予对酮康唑抗性的转录调节子”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物的活性，例如增加
(a)基因的基因产物，所述基因包含在表I第5列中所示并与所述Ypl133c同一行中描述的核酸分子或表I第7列中描述的其功能等同物或同源物，优选如表IB第7列中描述的同源物或功能等同物，并与所述Ypl133c处于同一行中描述的核酸分子；或
(b)多肽，其包含表II第5列中描述并与所述Ypl133c分别处于同一行的多肽、共有序列或多肽基序或表II或IV第7列中描述的其功能等同物或同源物，优选如表IIB第7列中描述的同源物或功能等同物并与所述Ypl133c处于同一行中描述，用于提高的产量。
因此，在一个实施方案中，活性待在本发明方法中提高的分子是具有描述为“参与赋予对酮康唑抗性的转录调节子”的活性的基因产物，其优选为该段(a)或(b)部分的分子。
在一个实施方案中，在质体中增加所述分子，其活性待在本发明方法中提高并且其为具有“参与赋予对酮康唑抗性的转录调节子”的活性的基因产物。
[0062.2.1.1]与野生型对照相比，观察到在拟南芥中提高或产生表VIIIa中所示YRP基因，例如来自表VIIIa中所示核酸分子的核酸分子的活性赋予提高的营养利用效率，例如提高的氮利用效率。因此，在一个实施方案中，在本发明方法中使用如表VIIIa中指出的核酸分子或如表I中指出的其同源物或表达产物来提高植物与野生型对照相比的营养利用效率，例如提高氮利用效率。
[0062.3.1.1]与野生型对照相比，进一步观察到在拟南芥中提高或产生表VIIIb中所示YRP基因，例如来自表VIIIb中所示核酸分子的核酸分子的活性赋予提高的胁迫耐受性，例如提高的低温耐受性。因此，在一个实施方案中，在本发明方法中使用如表VIIIb中指出的核酸分子或如表I中指出的其同源物或表达产物来提高植物与野生型对照相比的胁迫耐受性，例如提高低温耐受性。
[0062.4.1.1]与野生型对照相比，进一步观察到在拟南芥中提高或产生表VIIIc中所示YRP基因，例如来自表VIIIc中所示核酸分子的核酸分子的活性赋予提高的胁迫耐受性，例如提高的循环干旱耐受性。因此，在一个实施方案中，在本发明方法中使用如表VIIIc中指出的核酸分子或如表I中指出的其同源物或表达产物来提高植物与野生型对照相比的胁迫耐受性，例如提高循环干旱耐受性。
[0062.5.1.1]与野生型对照相比，进一步观察到在拟南芥中提高或产生表VIIId中所示YRP基因，例如来自表VIIId中所示核酸分子的核酸分子的活性赋予提高的固有产量，例如标准条件下提高的生物量，例如非缺乏或非胁迫条件下提高的生物量。因此，在一个实施方案中，与野生型对照相比，在本发明方法中使用如表VIIId中指出的核酸分子或如表I中指出的其同源物或表达产物来提高植物的固有产量，例如在标准条件下提高植物的产量，例如非缺失或非胁迫条件下提高植物的生物量。
[0063.2.1.1]令人惊奇的是，优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物相比，在转化植物中观察到在拟南芥中提高或产生赋予选自以下活性的至少一个基因或包含表I第5列中描述核酸序列的基因赋予提高的产量：磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、精氨酸/丙氨酸氨肽酶、D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶、二酰甘油焦磷酸磷酸酶、二酪氨酸转运蛋白、法尼二磷酸法尼基转移酶、NAD+依赖性甜菜碱醛脱氢酶、丝氨酸水解酶、参与赋予对酮康唑抗性的转录调节子、尿苷激酶、yal043c-a-蛋白质、ybr071w-蛋白质和ydr445c-蛋白质。
[0064.2.1.1]观察到优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与野生型对照相比，在拟南芥中提高或产生具有“NAD+依赖性甜菜碱醛脱氢酶”活性的基因产物的活性赋予如实施例中所示1.1％到1.577倍提高的产量，所述NAD+依赖性甜菜碱醛脱氢酶由包含核酸序列SEQ ID NO.：63的基因编码。
观察到优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与野生型对照相比，在拟南芥中提高或产生具有“D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶”活性的基因产物的活性赋予如实施例中所示1.1％到1.200倍提高的产量，所述D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶由包含核酸序列SEQ ID NO.：623的基因编码。
观察到优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与野生型对照相比，在拟南芥中提高或产生具有“yal043c-a-蛋白质”活性的基因产物的活性赋予如实施例中所示1.1％到1.570倍提高的产量，所述yal043c-a-蛋白质由包含核酸序列SEQ ID NO.：724的基因编码。
观察到优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与野生型对照相比，在拟南芥中提高或产生具有“ybr071w-蛋白质”活性的基因产物的活性赋予如实施例中所示1.1％到1.673倍提高的产量，所述ybr071w-蛋白质由包含核酸序列SEQ ID NO.：728的基因编码。
观察到优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与野生型对照相比，在拟南芥中提高或产生具有“二酪氨酸转运蛋白”活性的基因产物的活性赋予如实施例中所示1.1％到1.381倍提高的产量，所述二酪氨酸转运蛋白由包含核酸序列SEQ ID NO.：732的基因编码。
观察到优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与野生型对照相比，在拟南芥中提高或产生具有“二酰甘油焦磷酸磷酸酶”活性的基因产物的活性赋予如实施例中所示1.1％到1.381倍提高的产量，所述二酰甘油焦磷酸磷酸酶由包含核酸序列SEQ ID NO.：764的基因编码。
观察到优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与野生型对照相比，在拟南芥中提高或产生具有“ydr445c-蛋白质”活性的基因产物的活性赋予如实施例中所示1.1％到1.299倍提高的产量，所述ydr445c-蛋白质由包含核酸序列SEQ ID NO.：814的基因编码。
观察到优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与野生型对照相比，在拟南芥中提高或产生具有“精氨酸/丙氨酸氨肽酶”活性的基因产物的活性赋予如实施例中所示1.1％到1.320倍提高的产量，所述精氨酸/丙氨酸氨肽酶由包含核酸序列SEQ ID NO.：818的基因编码。
观察到优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与野生型对照相比，在拟南芥中提高或产生具有“法尼二磷酸法尼基转移酶”活性的基因产物的活性赋予如实施例中所示1.1％到1.550倍提高的产量，所述法尼二磷酸法尼基转移酶由包含核酸序列SEQ ID NO.：925的基因编码。
观察到优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与野生型对照相比，在拟南芥中提高或产生具有“丝氨酸水解酶”活性的基因产物的活性赋予如实施例中所示1.1％到1.408倍提高的产量，所述丝氨酸水解酶由包含核酸序列SEQ ID NO.：1021的基因编码。
观察到优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与野生型对照相比，在拟南芥中提高或产生具有“磷酸烯醇丙酮酸羧激酶”活性的基因产物的活性赋予如实施例中所示1.1％到1.698倍提高的产量，所述磷酸烯醇丙酮酸羧激酶由包含核酸序列SEQ ID NO.：1157的基因编码。
观察到优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与野生型对照相比，在拟南芥中提高或产生具有“尿苷激酶”活性的基因产物的活性赋予如实施例中所示1.1％到1.377倍提高的产量，所述尿苷激酶由包含核酸序列SEQ IDNO.：1352的基因编码。
观察到优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与野生型对照相比，在拟南芥中提高或产生具有“参与赋予对酮康唑抗性的转录调节子”活性的基因产物的活性赋予如实施例中所示1.1％到1.500倍提高的产量，所述参与赋予对酮康唑抗性的转录调节子由包含核酸序列SEQ ID NO.：1423的基因编码。
[0065.2.1.1]因此，在暂时和反复的非生物胁迫条件下与对照或野生型相比，根据本发明方法在植物细胞、植物或其部分中可实现提高的产量。
因此，在一个实施方案中，如果在生物中提高或产生多肽SEQ ID NO.：64，或包含核酸SEQ ID NO.：63的核酸分子编码的多肽，或所述核酸分子或多肽的同源物的活性，例如分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与核酸分子SEQ ID NO.：63或多肽SEQ ID NO.：64处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或提高或产生“NAD+依赖性甜菜碱醛脱氢酶”的活性，那么优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与野生型对照相比，在所述生物中赋予1.1％到1.577倍优选提高的产量。
因此，在一个实施方案中，如果在生物中提高或产生多肽SEQ ID NO.：624，或包含核酸SEQ ID NO.：623的核酸分子编码的多肽，或所述核酸分子或多肽的同源物的活性，例如分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与核酸分子SEQ ID NO.：623或多肽SEQ ID NO.：624处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或提高或产生“D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶”的活性，那么优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与野生型对照相比，在所述生物中赋予1.1％到1.200倍优选提高的产量。
因此，在一个实施方案中，如果在生物中提高或产生多肽SEQ ID NO.：725，或包含核酸SEQ ID NO.：724的核酸分子编码的多肽，或所述核酸分子或多肽的同源物的活性，例如分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与核酸分子SEQ ID NO.：724或多肽SEQ ID NO.：725处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或提高或产生“yal043c-a-蛋白质”的活性，那么优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与野生型对照相比，在所述生物中赋予1.1％到1.570倍优选提高的产量。
因此，在一个实施方案中，如果在生物中提高或产生多肽SEQ ID NO.：729，或包含核酸SEQ ID NO.：728的核酸分子编码的多肽，或所述核酸分子或多肽的同源物的活性，例如分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与核酸分子SEQ ID NO.：728或多肽SEQ ID NO.：729处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或提高或产生“ybr071w-蛋白质”的活性，那么优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与野生型对照相比，在所述生物中赋予1.1％到1.673倍优选提高的产量。
因此，在一个实施方案中，如果在生物中提高或产生多肽SEQ ID NO.：733，或包含核酸SEQ ID NO.：732的核酸分子编码的多肽，或所述核酸分子或多肽的同源物的活性，例如分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与核酸分子SEQ ID NO.：732或多肽SEQ ID NO.：733处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或提高或产生“二酪氨酸转运蛋白”的活性，那么优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与野生型对照相比，在所述生物中赋予1.1％到1.381倍优选提高的产量。
因此，在一个实施方案中，如果在生物中提高或产生多肽SEQ ID NO.：765，或包含核酸SEQ ID NO.：764的核酸分子编码的多肽，或所述核酸分子或多肽的同源物的活性，例如分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与核酸分子SEQ ID NO.：764或多肽SEQ ID NO.：765处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或提高或产生“二酰甘油焦磷酸磷酸酶”的活性，那么优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与野生型对照相比，在所述生物中赋予1.1％到1.381倍优选提高的产量。
因此，在一个实施方案中，如果在生物中提高或产生多肽SEQ ID NO.：815，或包含核酸SEQ ID NO.：814的核酸分子编码的多肽，或所述核酸分子或多肽的同源物的活性，例如分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与核酸分子SEQ ID NO.：814或多肽SEQ ID NO.：815处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或提高或产生“ydr445c-蛋白质”的活性，那么优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与野生型对照相比，在所述生物中赋予1.1％到1.299倍优选提高的产量。
因此，在一个实施方案中，如果在生物中提高或产生多肽SEQ ID NO.：819，或包含核酸SEQ ID NO.：818的核酸分子编码的多肽，或所述核酸分子或多肽的同源物的活性，例如分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与核酸分子SEQ ID NO.：818或多肽SEQ ID NO.：819处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或提高或产生“精氨酸/丙氨酸氨肽酶”的活性，那么优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与野生型对照相比，在所述生物中赋予1.1％到1.320倍优选提高的产量。
因此，在一个实施方案中，如果在生物中提高或产生多肽SEQ ID NO.：926，或包含核酸SEQ ID NO.：925的核酸分子编码的多肽，或所述核酸分子或多肽的同源物的活性，例如分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与核酸分子SEQ ID NO.：925或多肽SEQ ID NO.：926处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或提高或产生“法尼二磷酸法尼基转移酶”的活性，那么优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与野生型对照相比，在所述生物中赋予1.1％到1.550倍优选提高的产量。
因此，在一个实施方案中，如果在生物中提高或产生多肽SEQ ID NO.：1022，或包含核酸SEQ ID NO.：1021的核酸分子编码的多肽，或所述核酸分子或多肽的同源物的活性，例如分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与核酸分子SEQ ID NO.：1021或多肽SEQ ID NO.：1022处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或提高或产生“丝氨酸水解酶”的活性，那么优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与野生型对照相比，在所述生物中赋予1.1％到1.408倍优选提高的产量。
因此，在一个实施方案中，如果在生物中提高或产生多肽SEQ ID NO.：1158，或包含核酸SEQ ID NO.：1157的核酸分子编码的多肽，或所述核酸分子或多肽的同源物的活性，例如分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与核酸分子SEQ ID NO.：1157或多肽SEQ ID NO.：1158处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或提高或产生“磷酸烯醇丙酮酸羧激酶”的活性，那么优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与野生型对照相比，在所述生物中赋予1.1％到1.698倍优选提高的产量。
因此，在一个实施方案中，如果在生物中提高或产生多肽SEQ ID NO.：1353，或包含核酸SEQ ID NO.：1352的核酸分子编码的多肽，或所述核酸分子或多肽的同源物的活性，例如分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与核酸分子SEQ ID NO.：1352或多肽SEQ ID NO.：1353处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或提高或产生“尿苷激酶”的活性，那么优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与野生型对照相比，在所述生物中赋予1.1％到1.377倍优选提高的产量。
因此，在一个实施方案中，如果在生物中提高或产生多肽SEQ ID NO.：1424，或包含核酸SEQ ID NO.：1423的核酸分子编码的多肽，或所述核酸分子或多肽的同源物的活性，例如分别包含如表I、II或IV第7列中描述的分别与核酸分子SEQ ID NO.：1423或多肽SEQ ID NO.：1424处于同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或提高或产生“参与赋予对酮康唑抗性的转录调节子”的活性，那么优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与野生型对照相比，在所述生物中赋予1.1％到1.500倍优选提高的产量。
[0066.1.1.1]术语“表达”指编码基因区段或基因的转录和/或翻译。通常，所得产物是mRNA或蛋白质。然而，表达产物也可包括功能RNA，例如反义、核酸、tRNAs、snRNAs、rRNAs、RNAi、siRNA、核酶等。表达可以是系统的、局部的或暂时的，例如限制在特定细胞类型、组织器官或细胞器或时间段内。
[0067.2.1.1]在一个实施方案中，本发明的方法包括一个或更多以下步骤
a)稳定蛋白质，优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比，所述蛋白质赋予本发明核酸分子编码的蛋白质或具有此处提及活性的本发明多肽的增强表达，并赋予提高的产量，所述活性选自磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、精氨酸/丙氨酸氨肽酶、D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶、二酰甘油焦磷酸磷酸酶、二酪氨酸转运蛋白、法尼二磷酸法尼基转移酶、NAD+依赖性甜菜碱醛脱氢酶、丝氨酸水解酶、参与赋予对酮康唑抗性的转录调节子、尿苷激酶、yal043c-a-蛋白质、ybr071w-蛋白质和ydr445c-蛋白质；
b)稳定mRNA，其赋予例如编码如(a)中提及的多肽的YRP的增强表达；
c)提高蛋白质的比活性，所述蛋白质赋予例如编码如(a)中提及的多肽的YRP的增强的表达；
d)产生或提高内源或人工转录因子的表达，所述内源或人工转录因子介导例如编码如(a)中提及的多肽的YRP的表达；
e)刺激蛋白质的活性，所述蛋白质赋予例如编码如(a)中提及的多肽的YRP的增强的表达；
f)表达编码蛋白质的转基因，所述蛋白质赋予例如编码如(a)中提及的多肽的YRP的增强表达；和/或
g)增加基因的拷贝数，所述基因赋予例如编码如(a)中提及的多肽的YRP的增强表达；
h)通过加入正表达元件或去除负表达元件增强内源基因的表达，所述内源基因编码YRP，例如(a)中提及的多肽，例如对于植物，同源重组可用于向启动子引入正调节元件像35S增强子或从调节区去除抑制元件。其它基因转化方法可用于破坏抑制元件或增强正元件的活性-可在植物中通过T-DNA或转座子诱变随机引入正元件，并可鉴定其中在本发明基因附近已经整合所述正元件的株系，由此增强所述基因的表达；和/或
i)以这样的方式调节植物的生长状态，使得增强例如编码如(a)中提及的多肽的YRP或蛋白质本身的表达或活性；
j)从天然或诱变资源中选择具有例如编码如(a)中提及的多肽的YRP的特别的高活性的生物并将它们培育成靶生物，例如良种农作物。
[0068.1.1.1]优选地，所述mRNA是本发明的核酸分子和/或蛋白质，优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比，在提高编码多肽的表达或活性或具有如表II第3列中所示蛋白质或其同源物的活性的多肽的活性后，所述蛋白质赋予本发明核酸分子单独编码的蛋白质或连接转运核酸序列或转运肽编码核酸序列所编码的的蛋白质或具有此处提及活性的多肽提高的表达，例如赋予提高的产量。
[0069.1.1.1]一般而言，生物的细胞或区室中mRNA或多肽的量与编码蛋白质的量相关，因此与所述体积中编码蛋白质的总体活性相关。所述相关性并不总是线性的，所述体积中的活性依赖于分子的稳定性或激活或抑制性辅因子的存在。此外，熟知并在教科书例如Stryer，Biochemistry中描述了酶的产物和离析物抑制。
[0070.1.1.1]一般而言，生物的细胞或区室中mRNA、多核苷酸或核酸分子的量与编码蛋白质的量相关，因此与所述体积中编码蛋白质的总体活性相关。所述相关性并不总是线性的，所述体积中的活性依赖于分子的稳定性、分子的降解或激活或抑制性辅因子的存在。此外，例如在Zinser等“Enzyminhibitoren”/Enzyme inhibitors“中熟知酶的产物和离析物抑制。
[0071.1.1.1]可以多种方式提高本发明核酸分子编码的上述蛋白质和/或多肽的活性。例如，通过增加基因产物的数目，例如通过提高表达速率，像引入更强的启动子，或通过提高表达的mRNA的稳定性，因此提高翻译速率，和/或提高基因产物的稳定性，因此减少降解的蛋白质来提高生物或其部分，像细胞中的活性。此外，可以这样的方式影响酶的活性或更新，所述方式实现对反应速率的降低或提高或对底物的亲和力的修饰(降低或提高)的结果。本发明多肽，例如酶的催化中心中的突变可调节酶的更新速率，例如必需氨基酸的敲除可导致酶的活性降低或彻底敲除，或调节子结合位点的缺失或突变可减少负调节，像反馈抑制(或底物抑制，如果所述底物水平也提高)。可提高本发明酶的比活性，使得提高更新速率或改善辅因子的结合。改善编码mRNA或蛋白质的稳定性也可提高基因产物的活性。活性的刺激也在术语“提高的活性”的范围内。
[0072.1.1.1]此外，可修饰上述核酸序列的调节，以便增强基因的表达。这可有利地通过异源调节序列或通过修饰例如突变所存在的天然调节序列来实现。有利的方法也可相互组合。
[0073.1.1.1]一般而言，可通过在所述生物或其部分中增加特定编码mRNA或相应蛋白质的量来提高生物或其部分，特别是植物细胞或植物细胞的细胞器、植物、或植物组织或其部分或微生物中基因产物的活性。“蛋白质或mRNA的量”理解为表示生物、组织、细胞或细胞区室中多肽或mRNA分子的分子数量。蛋白质的量的“增加”表示与野生型、对照或参照相比，生物、组织、细胞或细胞区室如细胞器(像质体或线粒体或其部分)中所述蛋白质的分子数量(例如通过下文描述的一种方法)定量增加。
[0074.1.1.1]分子数量的增加优选总计至少1％，优选高于10％，更优选30％或更高，尤其优选50％、70％或更高，非常尤其优选100％，最优选500％或更高。然而，也认为从头表达是本发明的主题。
[0075.1.1.1]可通过内源或外源因素引起修饰，例如提高。例如，可通过向培养基或营养物中添加基因产物或前体或激活剂或激动剂，或可通过向生物中暂时或稳定引入所述受试体引起生物或其部分中活性的提高。此外，可通过转化和/或靶定分别向例如细胞核或细胞质或质体引入本发明的核酸序列或在正确细胞区室中编码的蛋白质来实现这种提高。
[0076.1.1.1]在一个实施方案中，与相应的未转化野生型植物细胞相比，通过提高本发明多肽的内源水平实现植物或其部分，例如细胞、组织、器官、细胞器等中环境胁迫耐受性和/或抗性的提高或降低。因此，在本发明的一个实施方案中，本发明涉及一种方法，其中增加编码本发明多核苷酸或核酸分子的基因的基因拷贝数。此外，例如可通过修饰多肽的转录或翻译调节提高本发明多肽的内源水平。
[0077.1.1.1]在一个实施方案中，可通过靶定或随机诱变本发明的内源基因改变植物或其部分中对环境胁迫的提高的耐受性和/或抗性。例如同源重组可用于向启动子引入正调节元件(对植物而言，像35S增强子)或从调节区去除抑制元件。此外，基因转换，像Kochevenko和Willmitzer(PlantPhysiol.2003 May；132(1)：174-84)及其中的引用中描述的方法可用于破坏抑制元件或增强正调节元件的活性。
此外，可通过T-DNA或转座子诱变在(植物)基因组中随机引入正元件，并可筛选这样的株系，其中所述正元件已经整合到本发明基因的附近，由此增强其表达。Hayashi等，1992(Science 258：1350-1353)或Weigel等，2000(Plant Physiol.122，1003-1013)及其中引用的其它文献已经描述了通过随机整合增强子元件对植物基因的激活。
在多种情况下已经描述了在目的基因附近鉴定插入(其最终携带激活元件)的反向遗传学策略，例如Krysan等，1999(Plant Cell 1999，11，2283-2290)；Sessions等，2002(Plant Cell 2002，14，2985-2994)；Young等，2001，(Plant Physiol.2001，125，513-518)；Koprek等，2000(Plant J.2000，24，253-263)；Jeon等，2000(Plant J.2000，22，561-570)；Tissier等，1999(Plant Cell 1999，11，1841-1852)；Speulmann等，1999(Plant Cell1999，11，1853-1866)。简言之，收获来自大T-DNA或转座子诱变的植物群体的所有植物的材料，并制备基因组DNA。然后根据例如Krysan等，1999(Plant Cell 1999，11，2283-2290)中描述的特定结构合并所述基因组DNA。然后通过特定的多重PCR反应筛选基因组DNA的库，检测插入诱变剂(例如T-DNA或转座子)和目的基因的组合。因此，用T-DNA或转座子边界引物和基因特异引物的特定组合在DNA库上进行PCR反应。可再次从Krysan等，1999(Plant Cell 1999，11，2283-2290)中获得用于引物设计的一般原则。重新筛选更低水平的DNA库导致对个别植物的鉴定，在所述植物中通过插入诱变剂激活目的基因。
也可通过一般的诱变技术实现正调节元件的增强或负调节元件的破坏或减弱。化学诱变或放射诱变群体的产生是常用的技术，并为技术人员所知。Koorneef等1982及其中的引用和Lightner和Caspar在“Methods inMolecular Biology”第82卷中描述了用于植物的方法。这些技术一般诱导点突变，其可使用如TILLING(Colbert等2001)方法在任何已知基因中鉴定到。
[0078.1.1.1]因此，如果通过同源重组、Tilling方法或基因转换修饰编码赋予本发明多肽增强表达的多肽的内源基因，特别是包含本发明核酸分子的基因，那么可提高表达水平。也可以如上提及向本发明核酸序列中添加靶向序列。
[0079.1.1.1]调节序列(除靶序列或其部分外)可优选有效连接内源蛋白质的编码区并控制其转录和翻译或编码mRNA或表达蛋白质的稳定性或衰退。为了修饰和控制表达，可改变、添加或修改启动子、UTR、剪接位点、加工信号、多腺苷酸化位点、终止子、增强子、抑制子、转录后或翻译后修饰位点。例如，Hayashi等，1992(Science 258：1350-1353)或Weigel等，2000(Plant Physiol.122，1003-1013)及其中引用的其它文献已经描述了通过随机整合增强子元件激活植物基因。例如，可通过用更强的转基因启动子替换内源启动子或用3’UTR(其提供更高的稳定性，但不改变编码区)替换内源3’UTR来调节内源蛋白质的表达水平。此外，可如实施例中所述通过引入人工转录因子调节转录调节。下文中描述了备选启动子、终止子和UTR。
[0080.1.1.1]也可通过引入合成的转录因子(其结合到编码如表II第3列中所示蛋白质的基因编码区附近并激活其转录)增强内源多肽的激活，所述内源多肽具有上述活性，例如具有如表II第3列中所示蛋白质或本发明多肽的活性，其例如优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量。可构建嵌合的锌指蛋白质，其包含特定的DNA结合域和激活域，例如单纯疱疹病毒的VP16结构域。特定结合域可结合编码如表II第3列中所示蛋白质的基因的调节区。生物，特别是植物中的嵌合转录因子的表达导致如表II第3列中所示蛋白质的特异表达，参阅例如WO01/52620，Oriz，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2002，第99卷，13290或Guan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2002，第99卷，13296。
[0081.1.1.1]在本发明方法的一个其它实施方案中，使用这样的生物，其中突变一个上述基因，或一个上述核酸，所述突变以这样的方式进行：与未突变蛋白质相比编码基因产物的活性受细胞因子影响更小或根本不受其影响。例如，酶活性的众所周知的调节机制是底物抑制或反馈调节机制。在下文相应段落及其中列出的参考文献，例如Sambrook等，MolecularCloning，Cold Spring Habour，NY，1989中描述了引入相应序列的一个或更多碱基、核苷酸或氨基酸替换、缺失和添加的方法和技术。本领域技术人员将能够利用现有技术，通过计算机软件方法或通过向核酸分子或蛋白质中引入系统突变并测定导致每体积，特别是每个细胞中比活性提高或活性提高的那些突变来比较本发明核酸分子的序列或其表达产物来鉴定调节子的调节结构域和结合位点，所述计算机软件方法包含用于鉴定结合位点和调节结构域的算法。
[0082.1.1.1]因此有利地在生物中表达本发明的核酸分子或来自进化远源生物的本发明的多肽(例如在真核宿主中使用原核基因)，因为在这些情况中，宿主细胞的调节机制不会削弱基因的活性(细胞活性或比活性)或其表达产物。
[0083.1.1.1]以这样的方法引入突变，其中不会不利地影响优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下提高的产量。
[0084.1.1.1]对基因或其基因产物调节的更少影响理解为对酶活性的减少的调节，导致基因或其产物的比活性或细胞活性提高。酶活性的提高理解为表示酶活性，其与初始生物相比提高至少10％，有利地至少20、30或40％，尤其有利地至少50、60或70％。优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比，这导致提高的产量。
[0085.1.1.1]本发明提供可进行上述方法，以便提高胁迫耐受性。也可能获得胁迫耐受性的降低。
[0086.1.1.1]本发明不限于特定核酸、特定多肽、特定细胞类型、特定宿主细胞、特定条件或特定方法等，因为这些可以变化，并且其中的多种修饰和变型对本领域技术人员而言是显而易见的。也应理解，此处所用的术语仅为描述特定实施方案的目的，并不旨在限制。
[0087.1.1.1]本发明还涉及包含核酸分子的分离的核酸，所述核酸分子选自：
a)编码表IIB第7列中所示多肽的核酸分子；
b)在表IB第7列中所示的核酸分子；
c)核酸分子，因为遗传密码的简并性，其可来自表II第5列或第7列中所述多肽序列并优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量，例如增加的产量相关性状，例如对非生物环境胁迫的增强的耐受性，例如提高的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或提高的营养利用效率、固有产量和/或另一提及的产量相关性状；
d)核酸分子，其与多核苷酸的核酸分子序列(其包含表I第5列或第7列中显示的核酸分子)具有至少30％的同一性，并优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量，例如增加的产量相关性状，例如对非生物环境胁迫的增强的耐受性，例如提高的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或提高的营养利用效率、固有产量和/或另一提及的产量相关性状；
e)核酸分子，其编码与(a)到(c)的核酸分子编码的多肽的氨基酸序列具有至少30％同一性并具有包含表I第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性，并优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量，例如增加的产量相关性状，例如对非生物环境胁迫的增强的耐受性，例如提高的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或提高的营养利用效率、固有产量和/或另一提及的产量相关性状；
f)核酸分子，其在严格杂交条件下与(a)到(c)的核酸分子杂交，并优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量，例如增加的产量相关性状，例如对非生物环境胁迫的增强的耐受性，例如提高的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或提高的营养利用效率、固有产量和/或另一提及的产量相关性状；
g)核酸分子，其编码可在制备的针对(a)到(e)的核酸分子之一编码的多肽的单克隆或多克隆抗体帮助下分离的多肽，并具有包含表I第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性；
h)核酸分子，其编码包含如表IV第7列中所示共有序列或一个或更多多肽基序的多肽，并优选具有包含表II或IV第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性；
h)核酸分子，其编码具有如表II第5列中所述蛋白质代表活性的多肽，并优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量，例如增加的产量相关性状，例如对非生物环境胁迫的增强的耐受性，例如提高的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或提高的营养利用效率、固有产量和/或另一提及的产量相关性状；
i)核酸分子，其包含使用表III第7列中的引物通过扩增cDNA文库或基因组文库获得的多核苷酸并优选具有包含如表II或IV第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性，所述引物不以核苷酸ATA在其5’末端开始；
和
j)核酸分子，其通过在严格杂交条件下利用包含(a)或(b)核酸分子的互补序列的探针或其片段筛选合适的核酸文库获得，所述探针或其片段具有与(a)到(e)中表征的核酸分子序列互补的核酸分子的至少15nt，优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt，并且所述核酸分子编码具有包含如表II第5列中所述多肽的蛋白质代表的活性的多肽；
由此，(a)到(j)的核酸分子至少在一个或更多核苷酸中不同于表IA第5列或第7列中所述的序列，并且其优选编码至少在一个或更多氨基酸中不同于表IIA第5列或第7列中所述的蛋白质序列的蛋白质。
[0088.1.1.1]在一个实施方案中，本发明涉及上述序列同源物，它们可有利地分离自酵母、真菌、病毒、藻类、细菌，例如醋化醋杆菌(Acetobacteraceti，醋杆菌亚属)；Acidithiobacillus ferrooxidans；不动杆菌属(Acinetobacter)；放线杆菌属(Actinobacillus)；杀鲑气单胞菌(Aeromonassalmonicida)；根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)；Aquifex aeolicus；化脓隐秘杆菌(Arcanobacterium pyogenes)；翠菊黄化植原体(Asteryellows phytoplasma)；芽孢杆菌属(Bacillus)；双岐杆菌属(Bifidobacterium)；布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)；扩展短杆菌(Brevibacterium linens)；马尔他布鲁氏菌(Brucella melitensis)；巴克纳氏菌属(Buchnera)；溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)；空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)；新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)；衣原体(Chlamydia sp.)；Chlamydophila sp.；泥生绿菌(栖泥绿菌)(Chlorobiumlimicola)；Citrobacter rodentium；梭菌(梭状芽孢杆菌)(Clostridium sp.)；睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)；棒杆菌(棒状菌)(Corynebacterium sp.)；伯氏考克斯氏体(Q热病原体，伯氏立克次氏体)(Coxiella burnetii)；耐放射异常球菌(Deinococcus radiodurans)；节瘤偶蹄形菌(Dichelobacter nodosus)；鲶鱼爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)；肠杆菌(Enterobacter sp.)；猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)；大肠杆菌(Escherichia coli)；黄杆菌(Flavobacterium sp.)；土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis)；弗兰克氏菌(Frankia sp.CpI1)；具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)；Geobacillus stearothermophilus；氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)；嗜血菌(Haemophilus sp.)；幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)；肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)；乳杆菌(Lactobacillus sp.)；乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)；利斯特氏菌(Listeriasp.)；Mannheimia haemolytica；Mesorhizobium loti；深海噬甲基菌(Methylophaga thalassica)；铜绿微囊蓝细菌(Microcystis aeruginosa)；微颤蓝细菌(Microscilla sp.PRE1)；莫拉氏菌(Moraxella sp.TA144)；分枝杆菌(Mycobacterium sp.)；枝原体(Mycoplasma sp.)；奈瑟氏球菌(Neisseriasp.)；亚硝化单胞菌(Nitrosomonas sp.)；念珠蓝细菌(Nostoc sp.PCC7120)；Novosphingobium aromaticivorans；酒酒球菌(Oenococcus oeni)；柠檬泛菌(Pantoea citrea)；多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)；戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)；坑形席蓝细菌(Phormidiumfoveolarum)；Phytoplasma sp.；Plectonema boryanum；栖瘤胃普雷沃氏菌(Prevotella ruminicola)；丙酸杆菌(Propionibacterium sp.)；普通变形菌(Proteus vulgaris)；假单胞菌(Pseudomonas sp.)；Ralstonia sp.；根瘤菌(Rhizobium sp.)；马红球菌(Rhodococcus equi)；海洋红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus)；立克次氏体(Rickettsia sp.)；鸭瘟立默氏菌(Riemerella anatipestifer)；生黄瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)；沙门氏菌(Salmonella sp.)；反刍月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)；嗜虫沙雷氏菌(Serratia entomophila)；希瓦氏菌(Shigella sp.)；苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)；葡萄球菌(Staphylococcus sp.)；链球菌(Streptococcus sp.)；链霉菌(Streptomyces sp.)；聚球蓝细菌(Synechococcus sp.)；集胞蓝细菌(Synechocystis sp.PCC 6803)；海栖热袍菌(Thermotoga maritima)；密螺旋体(Treponema sp.)；解脲鸟枝原体(Ureaplasma urealyticum)；霍乱弧菌(Vibrio cholerae)；副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)；苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)；耶尔森氏菌(Yersinia sp.)；运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)，优选沙门氏菌(Salmonella)或大肠杆菌或植物，优选分离自酵母，例如分离自酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、球拟酵母属(Torulopsis)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或者植物，如拟南芥、玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、水稻、大麦、大豆、花生、棉花、琉璃苣、向日葵、亚麻子、报春花、油菜籽、芸苔和球茎甘蓝、木薯、胡椒、向日葵、万寿菊；茄科植物包括马铃薯、烟草、茄子、西红柿；蚕豆属物种、豌豆、苜蓿；灌木植物如咖啡、可可、茶；柳属物种；树木如油棕榈、椰子；多年生草本植物如黑麦草和羊茅草；饲料作物如苜蓿和三叶草；以及分离自例如云杉、松或冷杉。更优选地，上述序列的同源物可分离自酿酒酵母、大肠杆菌或植物，优选欧洲油菜、大豆、玉米、棉花或稻。
[0089.1.1.1]本发明的(胁迫相关)蛋白质优选通过重组DNA技术产生。例如，将编码该蛋白的核酸分子克隆进表达载体中，例如克隆进双元载体中，将该表达载体引入宿主细胞，例如拟南芥野生型NASC N906或下文实施例中所述任何其他植物细胞，并在所述宿主细胞中表达胁迫相关蛋白质。双元载体的实例是pBIN19、pBI101、pBinAR、pGPTV、pCAMBIA、pBIB-HYG、pBecks、pGreen或pPZP(Hajukiewicz，P.等，1994，Plant Mol.Biol.，25：989-994和Hellens等，Trends in Plant Science(2000)5，446-451.)。
在一个实施方案中，本发明的(胁迫相关)蛋白质优选在细胞区室(更优选在质体)中产生。将核酸引入质体并在该区室中产生蛋白质的方法为本领域技术人员已知，并描述于本申请中。
[0090.1.1.1]有利地，本发明的核酸序列或基因构建体与至少一个报告基因一起克隆进表达盒中，该表达盒通过载体引入生物中，或者直接引入基因组中。该报告基因应允许通过生长、荧光、化学物质、生物发光或抗性测定或通过光度测量而容易地进行检测。可以提到的报告基因的实例为抗生素或除草剂抗性基因、水解酶基因、荧光蛋白基因、生物发光基因、糖或核苷酸代谢基因或生物合成基因，例如Ura3基因、Ilv2基因、萤光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因、gfp基因、2-去氧葡萄糖-6-磷酸磷酸酶基因、β-葡糖醛酸糖苷酶基因、β-内酰胺酶基因、新霉素磷酸转移酶基因、潮霉素磷酸转移酶基因、突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)基因(也称为乙酰乳酸合酶(ALS)基因)、D-氨基酸代谢酶基因或BASTA(＝草铵膦抗性)基因。这些基因允许容易地测量和定量转录活性，从而测量和定量基因表达。这样，可以鉴定显示不同生产力的基因组位置。
[0091.1.1.1]在一个优选的实施方案中，核酸构建体(例如表达盒)包含编码序列上游(即5’末端)的启动子和下游(即3’末端)的多腺苷酸化信号，以及任选的其他调节元件，它们与具有表I第5列和第7列中所示SEQ ID NO的核酸之一的间插编码序列有效连接。有效连接指启动子、编码序列、终止子和任选的其他调节元件依次排列，以使得每个调节元件可以正确的方式在编码序列的表达中发挥其功能。优选用于有效连接的序列为确保亚细胞定位至质体的靶向序列。然而，也可以利用确保亚细胞定位至线粒体、内质网(＝ER)、细胞核、油小体或其他区室的靶向序列，以及翻译启动子例如烟草花叶病毒的5’前导序列(Gallie等，Nucl.Acids Res.15(1987)，8693-8711)。
[0092.1.1.1]例如，核酸构建体(例如表达盒)可以含有组成型启动子或组织特异性启动子(优选USP或油菜籽蛋白启动子)、待表达基因和ER滞留信号。就ER滞留信号而言，优选使用KDEL氨基酸序列(赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸)或KKX氨基酸序列(赖氨酸-赖氨酸-X-停止，其中X表示每一种其他已知的氨基酸)。
[0093.1.1.1]为在宿主生物(例如植物)中进行表达，有利地将表达盒插入载体中，例如质粒、噬菌体或其他允许该基因在宿主生物中最佳表达的DNA。合适的质粒的实例为：大肠杆菌中的pLG338、pACYC184、pBR系列如pBR322、pUC系列如pUC18或pUC19、M113mp系列、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11或pBdCI；链霉菌中的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361；芽孢杆菌中的pUB110、pC194或pBD214；棒杆菌中的pSA77或pAJ667；真菌中的pALS1、pIL2或pBB116；其他有利的真菌载体描述于Romanos，M.A.等，[(1992)，，Foreign gene expression in yeast：a review“，Yeast 8：423-488]和van den Hondel，C.A.M.J.J.等[(1991)，，Heterologous gene expression infilamentous fungi“以及More Gene Manipulations in Fungi[J.W.Bennet& L.L.Lasure，编辑，396-428页：Academic Press：San Diego]和，，Genetransfer systems and vector development for filamentous fungi“[van denHondel，C.A.M.J.J.& Punt，P.J.(1991)：Applied Molecular Genetics ofFungi，Peberdy，J.F.等，编辑，1-28页，Cambridge University Press：Cambridge]。有利的酵母启动子的实例为2μM、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23。藻类或植物启动子的实例为pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004、pVKH或pDH51(参阅Schmidt，R.和Willmitzer，L.，1988))。上文指出的载体或者上文所指出载体的衍生物仅为可能的质粒中的一部分。其他质粒为本领域技术人员所熟知，并可见于例如”Cloning Vectors”(Pouwels P.H.等编辑Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN 0 444 904018)。合适的植物载体描述于“Methods in Plant MolecularBiology and Biotechnology”(CRC Press，Ch.6/7，71-119页)等。有利的载体已知为能在大肠杆菌和农杆菌中复制的穿梭载体或双元载体。
[0094.1.1.1]载体指除质粒以外本领域技术人员已知的所有其他载体，例如噬菌体；病毒如SV40、CMV、杆状病毒、腺病毒；转座子；IS元件；噬粒；噬菌粒；粘粒；线性或环状DNA。这些载体可在宿主细胞中自主复制或随染色体复制，优选随染色体复制。
[0095.1.1.1]在载体的另一实施方案中，本发明的表达盒还可有利地以线性DNA的形式引入生物中，并通过异源或同源重组整合进宿主生物的基因组中。这种线性DNA可由线性化的质粒构成，或者仅由作为载体的表达盒或本发明核酸序列构成。
[0096.1.1.1]在另一有利的实施方案中，本发明的核酸序列还可以其自身引入生物中。
[0097.1.1.1]如果除了本发明核酸序列外还向生物中引入其他基因，则在单个载体与报告基因一起或者每个基因在载体中带有一个报告基因均可引入，其中不同载体可同时或连续引入。
[0098.1.1.1]所述载体有利地含有至少一个拷贝的本发明核酸序列和/或本发明的表达盒(＝基因构建体)。
[0099.1.1.1]本发明还提供分离的重组表达载体，其包含编码表II第5列和第7列中所示多肽的核酸，其中该载体在宿主细胞中的表达导致与宿主细胞的野生型品种相比对环境胁迫的耐受性提高。本文使用的术语“载体”指能运输与其相连的其他核酸的核酸分子。载体的一种类型是“质粒”，指其中可连接其他DNA区段的双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中其他DNA区段可连接到病毒基因组中。某些载体能在其所引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合进宿主细胞或细胞器的基因组中，从而与宿主或细胞器的基因组一起复制。此外，某些载体能知道与其有效连接的基因表达。这样的载体称为“表达载体”。一般而言，重组DNA技术中使用的表达载体一般为质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最普遍使用的载体形式。然而，本发明旨在包括发挥相同功能的这些其他形式表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
[0100.1.1.1]本发明的重组表达载体包含本发明的核酸，其为适于在宿主细胞中表达该核酸的形式，这意味着，重组表达载体包含基于用于表达的宿主细胞选择的与待表达核酸序列有效连接的一个或多个调节序列。在本文中涉及重组表达载体使用时，“有效连接”旨在表示目的核苷酸序列与调节序列以允许表达该核苷酸序列(例如，在体外转录/翻译系统中或当该载体引入宿主细胞的情况下为在宿主细胞中)的方式连接。术语“调节序列”旨在包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如多腺苷酸化信号)。这些调节序列描述于例如Goeddel，Gene Expression Technology：Methods inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)以及Gruber和Crosby，：Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，Glick和Thompson编辑，第7章，89-108，CRC Press；Boca Raton，Florida，包括其参考文献。调节序列包括指导核苷酸序列在许多宿主细胞类型中组成型表达的调节序列以及指导核苷酸序列仅在某些宿主细胞或在某些条件下表达的调节序列。本领域技术人员应该理解，表达载体的设计可取决于诸如待转化宿主细胞的选择、期望的多肽表达水平等因素。本发明的表达载体可引入宿主细胞中，从而产生本文所述核酸(例如YSRPs、YSRPs的突变体形式、融合多肽等)所编码的多肽或肽，包括融合多肽或肽。
[0101.1.1.1]本发明的重组表达载体可设计成在植物细胞中表达本发明的多肽。例如可在植物细胞中表达NUERP基因(参阅Schmidt，R.和Willmitzer，L.，1988，High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediatedtransformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants，PlantCell Rep.583-586；Plant Molecular Biology and Biotechnology，C Press，Boca Raton，Florida，第6/7章，S.71-119(1993)；F.F.White，B.Jenes等，Techniques for Gene Transfer，in：Transgenic Plants，第1卷，Engineeringand Utilization，编辑.Kung和R.Wu，128-43，Academic Press：1993；Potrykus，1991，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42：205-225及其中引用的参考文献)。合适的宿主细胞还讨论于Goeddel，GeneExpression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press：SanDiego，CA(1990)。或者，重组表达载体可以体外转录和翻译，例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶。
[0102.1.1.1]经常使用含有指导融合或非融合多肽表达的组成型或诱导型启动子的载体在原核生物中表达多肽。融合载体在其中所编码多肽中加入多个氨基酸，一般在重组多肽的氨基端加入，但也可在C端加入，或者融合进多肽的合适区域中。这些融合载体一般用于三个目的：1)提高重组多肽的表达；2)提高重组多肽的溶解度；和3)通过作为亲和纯化中的配体而帮助纯化重组多肽。在融合表达载体中，经常在融合部分与重组多肽的连接处引入蛋白酶切割位点，以允许在纯化融合多肽后将重组多肽与融合部分分离。这些酶及其相应的识别序列包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。
[0103.1.1.1]例如，可将植物表达盒装入pRT转化载体中((a)Toepfer等，1993，Methods Enzymol.，217：66-78；(b)Toepfer等1987，Nucl.Acids.Res.15：5890 ff)。
或者，还可以在体外转录和翻译重组载体(＝表达载体)，例如使用T7启动子和T7 RNA聚合酶。
[0104.1.1.1]用于原核生物的表达载体经常利用含有或不含融合蛋白或融合寡肽的诱导型系统，其中这些融合可同时以N端和C端方式发生，或者在蛋白质的其他有用结构域中发生。这些融合载体一般具有以下目的：i.)提高RNA的表达率；ii.)提高可获得的蛋白质合成率；iii.)提高蛋白质的溶解度；iv.)或通过可用于亲和层析的结合序列来简化纯化。还经常通过融合蛋白引入蛋白酶切割位点，这允许切割融合蛋白部分和纯化。这些蛋白酶识别序列是已知的，例如因子Xa、凝血酶和肠激酶。
[0105.1.1.1]典型的有利融合物和表达载体为pGEX[PharmaciaBiotech Inc；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)Gene 67：31-40]、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其含有谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白或蛋白A。
[0106.1.1.1]在一个实施方案中，将本发明多肽的编码序列克隆进pGEX表达载体中，以产生编码融合多肽的载体，所述融合多肽从N端到C端包含GST-凝血酶切割位点-X多肽。该融合多肽可使用谷胱甘肽-琼脂糖树脂通过亲和层析来纯化。可通过用凝血酶切割融合多肽来回收不融合GST的重组YSRP。
大肠杆菌表达载体的其他实例为pTrc[Amann等，(1988)Gene69：301-315]和pET v载体[Studier等，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，California(1990)60-89；Stratagene，Amsterdam，The Netherlands]。
[0107.1.1.1]从pTrc载体表达靶基因依赖于从杂合trp-lac融合启动子转录宿主RNA聚合酶。从pET 11d载体表达靶基因依赖于由共表达的病毒RNA聚合酶(T7 gn1)介导的从T7gn10-lac融合启动子的转录。该病毒聚合酶由宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)从固有的l原噬菌体提供，其带有lacUV 5启动子转录控制之下的T7 gn1基因。
[0108.1.1.1]在本发明的一个优选的实施方案中，在植物和植物细胞例如单细胞植物细胞(如藻类)(参阅Falciatore等，1999，MarineBiotechnology 1(3)：239-251和其中的参考文献)和来自高等植物(例如种子植物，如作物植物)的植物细胞中表达YSRP。可通过任何方法将编码表II第5列或第7列中所示YSRP的核酸分子“引入”植物细胞中，所述方法包括转染、转化或转导、电穿孔、微粒轰击、农杆菌感染等。本领域技术人员已知的一种转化方法是将开花植物浸入农杆菌溶液中(其中所述农杆菌含有本发明的核酸)，然后对转化的配子进行育种。
[0109.1.1.1]用于转化或转染宿主细胞(包括植物细胞)的其他合适方法可见于Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989以及其他实验手册如Methods in MolecularBiology，1995，Vol.44，Agrobacterium protocols，Gartland和Davey编辑，Humana Press，Totowa，New Jersey。因为生物和非生物胁迫耐受性是希望在多种植物中遗传的一种一般性状，所述植物例如玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、水稻、大麦、大豆、花生、棉花、油菜籽和芸苔、木薯、胡椒、向日葵和万寿菊；茄科植物如马铃薯、烟草、茄子和番茄；蚕豆属物种、豌豆、苜蓿；灌木植物(咖啡、可可、茶)；柳属物种；树木(油棕榈、椰子)；多年生草本植物和饲料作物，这些作物植物也是本发明另一实施方案中遗传改造的优选靶植物。饲料作物包括但不仅限于冰草(wheatrass)、虉草(Canarygrass)、雀麦草(Bromegrass)、披碱草(Wildrye Grass)、早熟禾(Bluegrass)、鸭茅(Orchardgrass)、苜蓿、Salfoin、百脉根(BirdsfootTrefoil)、杂三叶(Alsike clover)、红三叶(red clover)和草木樨(Sweet clover)。
[0110.1.1.1]在本发明的一个实施方案中，通过农杆菌介导的基因转移将编码表II第5列或第7列中所示YSRP的核酸分子转染进植物中。农杆菌介导的植物转化可使用例如GV3101(pMP90)(Koncz和Schell，1986，Mol.Gen.Genet.204：383-396)或LBA4404(Clontech)根癌农杆菌菌株来进行。转化可通过标准转化和再生技术来进行(Deblaere等，1994，Nucl.Acids Res.13：4777-4788；Gelvin，Stanton B.和Schilperoort，Robert A，Plant Molecular Biology Manual，第二版- Dordrecht：Kluwer AcademicPubl.，1995.-在Sect，Ringbuc Zentrale Signatur：BT11-  P ISBN0-7923-2731-4；Glick，Bernard R.；Thompson，John E.，Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology，Boca Raton：CRC Press，1993 360S.，ISBN 0-8493-5164-2)。例如，可通过子叶或下胚轴转化来转化油菜籽(Moloney等，1989，Plant cell Report 8：238-242；De Block等，1989，PlantPhysiol.91：694-701)。用于农杆菌和植物选择的抗生素的使用取决于用于转化的双元载体和农杆菌菌株。一般使用卡那霉素作为植物选择标记来进行油菜籽的选择。可使用如Mlynarova等，1994，Plant Cell Report13：282-285所述技术通过农杆菌介导基因转移进亚麻中。此外，可以使用如欧洲专利号0424 047、美国专利号5,322,783、欧洲专利号0397 687、美国专利号5,376,543或美国专利号5,169,770所述的技术来转化大豆。可通过微粒轰击、聚乙二醇介导的DNA摄取或通过碳化硅纤维技术来实现玉米转化(参阅如Freeling和Walbot“The maize handbook”SpringerVerlag：New York(1993)ISBN 3-540-97826-7)。玉米转化的具体实例可见于美国专利号5,990,387，小麦转化的具体实例可见于PCT申请号WO93/07256。
[0111.1.1.1]根据本发明，如果整合进非染色体自主复制子或整合进植物染色体或细胞器基因组中，则所引入的编码表II第5列或第7列所示YSRP的核酸分子可在植物细胞中稳定维持。或者，所引入的YSRP可存在于染色体外的非复制型载体中，并瞬时表达或具有瞬时活性。
[0112.1.1.1]在一个实施方案中，可以产生其中YSRP已整合进染色体中的异源重组微生物，制备载体，其含有编码表II第5列或第7列所示YSRP的核酸分子的至少一部分，其中引入了缺失、添加或替换，以改变(例如功能性破坏)YSRP基因。优选地，所述YSRP基因是酵母、大肠杆菌基因，但也可以是来自相关植物或甚至来自哺乳动物或昆虫来源的同源物。载体可设计成使得在同源重组时编码表II第5列或第7列所示YSRP的内源核酸分子被突变或以其他方式改变，但仍编码功能性多肽(例如，可以改变上游调节区，从而改变内源YSRP的表达)。在一个优选的实施方案中，本发明蛋白质的生物活性在同源重组后提高。为了通过同源重组产生点突变，可以在称为嵌合修复术(chimeraplasty)的技术中使用DNA-RNA杂交体(Cole-Strauss等，1999，Nucleic acids Research27(5)：1323-1330和Kmiec，1999 Gene therapy American Scientist.87(3)：240-247)。展叶剑叶藓(Physcomitrella paten)中的同源重组操作也是本领域技术人员所熟知的，并考虑用于本文中。
[0113.1.1.1]而在同源重组载体中，编码表II第5列或第7列中所示YSRP的核酸分子中改变的部分在其5’和3’末端的侧翼为额外的YSRP基因核酸分子，以允许在该载体所携带的外源YSRP基因与微生物或植物中的内源YSRP基因之间发生同源重组。所述额外的侧翼YSRP核酸分子为足以与内源基因发生成功的同源重组的长度。载体中一般包含数百个碱基对至数千碱基对的侧翼DNA(5’和3’端都是如此)。对同源重组载体的描述参阅如Thomas，K.R.，和Capecchi，M.R.，1987，Cell 51：503，或者对展叶剑叶藓中基于cDNA的重组参阅Strepp等，1998，PNAS，95(8)：4368-4373。将该载体引入微生物或植物细胞中(例如通过聚乙二醇介导的DNA)，并使用本领域已知的技术选择所引入YSRP基因已与内源YSRP基因发生同源重组的细胞。
[0114.1.1.1]无论是存在于染色体外非复制型载体中还是存在于整合进染色体的载体中，编码表II第5列或第7列中所示YSRP的核酸分子均优选存在于植物表达盒中。植物表达盒优选地含有调节序列，所述调节序列能在植物细胞中驱动与其有效连接的基因表达，以使每个序列可发挥其功能，例如通过聚腺苷酸化信号来终止转录。优选的多腺苷酸化信号是来源于根癌农杆菌t-DNA(例如Ti质粒pTiACH5中称为章鱼碱合酶的基因3)的那些(Gielen等，1984，EMBO J.3：835)或其功能等同物，但在植物中具有功能活性的所有其他终止子也是合适的。由于植物基因表达经常不仅受限于转录水平，因此植物表达盒优选含有其他有效连接的序列，如翻译增强子，如含有提高多肽/RNA比值的烟草花叶病毒5’非翻译前导序列的超驱动序列(Gallie等，1987，Nucl.Acids Research 15：8693-8711)。植物表达载体的实例包括Becker，D.等，1992，New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border，Plant Mol.Biol.20：1195-1197；和Bevan，M.W.，1984，Binary Agrobacterium vectors for plant transformation，Nucl.Acid.Res.12：8711-8721；和Vectors for Gene Transfer in Higher Plants；in：Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，编辑：Kung和R.Wu，Academic Press，1993，S.15-38中详细描述的那些。
[0115.1.1.1]“转化”在本文中定义为将异源DNA引入植物细胞、植物组织或植物的方法。这可在天然或人工条件下使用本领域熟知的多种方法来进行。转化可依赖于将外源核酸序列插入原核或真核宿主细胞的任何已知方法。基于所转化的宿主细胞来选择方法，包括但不仅限于病毒感染、电穿孔、脂转染和微粒轰击。这些“转化”细胞包括稳定转化的细胞，其中所插入的DNA能作为自主复制质粒复制，或作为宿主染色体的一部分复制。它们包括在有限的时间内瞬时表达所插入DNA或RNA的细胞。转化的植物细胞、植物组织或植物应理解为不仅包括转化方法的终产物，而且还包括其转基因后代。
术语“转化的”、“转基因的”和“重组的”指已引入异源核酸分子的宿主生物，例如细菌或植物。所述核酸分子可稳定整合进宿主的基因组中，或者该核酸分子也可作为染色体外的分子存在。这样的染色体外分子可以自主复制。转化的细胞、组织或植物应理解为不仅包括转化方法的终产物，而且还包括其转基因后代。“未转化的”、“非转基因的”或“非重组的”宿主指不含有异源核酸分子的野生型生物，例如细菌或植物。
本文使用的“转基因植物”指含有插入其核基因组或细胞器基因组的外源核苷酸序列的植物。其还包括后代，例如T1、T2和后续世代，或者BC1、BC2和后续世代，及其与非转基因植物或其他转基因植物的杂种。
[0116.1.1.1]宿主生物(＝转基因生物)有利地含有至少一个拷贝的本发明核酸和/或本发明的核酸构建体。
原则上，所有植物均可用作宿主生物。优选的转基因植物为例如选自以下科：槭树科(Aceraceae)、漆树科(Anacadiaceae)、伞形科(Apiaceae)、菊科(Asteraceae)、十字花科(Brassicaceae)、仙人掌科(Cactaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、豆科(Fabaceae)、锦葵科(Malvaceae)、睡莲科(Nymphaeaceae)、罂粟科(Papaveraceae)、蔷薇科(Rosaceae)、杨柳科(Salicaceae)、茄科(Solanaceae)、棕榈科(Arecaceae)、凤梨科(Bromeliaceae)、莎草科(Cyperaceae)、鸢尾科(Iridaceae)、百合科(Liliaceae)、兰科(Orchidaceae)、龙胆科(Gentianaceae)、唇形科(Labiaceae)、木兰科(Magnoliaceae)、毛莨科(Ranunculaceae)、Carifolaceae、茜草科(Rubiaceae)、玄参科(Scrophulariaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、杜鹃花科(Ericaceae)、蓼科(Polygonaceae)、堇菜科(Violaceae)、灯心草科(Juncaceae)或禾本科(Poaceae)并优选来源于选自槭树科、漆树科、十字花科、葫芦科、豆科、罂粟科、蔷薇科、茄科、百合科或禾本科植物。优选作物植物，如有利地选自如下属的植物：花生、欧洲油菜、卡诺拉油菜、向日葵属、红花、橄榄(olive)、芝麻(sesame)、榛子(hazelnut)、扁桃(almond)、鳄梨(avocado)、月桂(bay)、南瓜(pumpkin/squash)、胡麻、大豆(soya)、阿月混子(pistachio)、琉璃苣、玉米、小麦、黑麦、燕麦、高粱(sorghum)和粟(millet)、黑小麦、稻、大麦、木薯(cassava)、马铃薯、甜菜、茄子、苜蓿和多年生草本和饲用植物、油棕榈、蔬菜(芸苔属植物、根用蔬菜、块茎类蔬菜、荚果蔬菜、果类蔬菜、葱蒜类蔬菜、叶用蔬菜和茎用蔬菜)、荞麦(buckwheat)、菊芋(Jerusalem artichoke)、蚕豆(broad bean)、野豌豆(vetches)、小扁豆(lentil)、四季豆(dwarf bean)、羽扇豆、三叶草和紫花苜蓿，此处仅提到它们中的某些。
在本发明的一个实施方案中，转基因植物选自玉米、大豆、油菜(包括芸苔和冬季油菜)、棉花、小麦和稻。
在一个优选的实施方案中，宿主植物选自槭树科、漆树科、伞形科、菊科、十字花科、仙人掌科、葫芦科、大戟科、豆科、锦葵科、睡莲科、罂粟科、蔷薇科、杨柳科、茄科、棕榈科、凤梨科、莎草科、鸢尾科、百合科、兰科、龙胆科、唇形科、木兰科、毛莨科、Carifolaceae、茜草科、玄参科、石竹科、杜鹃花科、蓼科、堇菜科、灯心草科或禾本科并优选来源于选自槭树科、漆树科、十字花科、葫芦科、豆科、罂粟科、蔷薇科、茄科、百合科或禾本科植物。优选作物植物并且特别是本文中以上提到的植物作为宿主植物，如以上提到的科和属，例如优选的物种是腰果(Anacardium occidentale)、金盏花(Calendula officinalis)、红花(Carthamus tinctorius)、菊芋(Cichorium intybus)、洋蓟(Cynara scolymus)、向日葵(Helianthus annus)、香叶万寿菊(Tagetes lucida)、万寿菊(Tagetes erecta)、细叶万寿菊(Tagetes tenuifolia)；胡萝卜(Daucus carota)；欧洲榛(Corylusavellana)、土耳其榛(Corylus colurna)、琉璃苣(Borago officinalis)；欧洲油菜、芜青(Brassica rapa ssp.)、野欧白芥(Sinapis arvensis)、芥菜(Brassica juncea)、芥菜原变种(Brassica juncea var.juncea)、皱叶芥菜(Brassica juncea var.crispifolia)、大叶芥菜(Brassica juncea var.foliosa)、黑芥(Brassica nigra、Brassica sinapioides、Melanosinapis communis)、甘蓝(Brassica oleracea)、拟南芥菜、凤梨(Anana comosus)、Ananas ananas、Bromelia comosa、番木瓜(Carica papaya)、大麻(Cannabis sative)、甘薯(lpomoea batatus)、提琴叶牵牛花(lpomoea pandurata)、Convolvulus batatas、Convolvulus tiliaceus、甘薯(lpomoea fastigiata)、lpomoea tiliacea、三裂叶薯(lpomoea triloba)、Convolvulus panduratus、甜菜(Beta vulgaris)、甜萝卜(Beta vulgaris var.altissima)、甜菜(原变种)(Beta vulgaris var.vulgaris)、沿海甜菜(Beta maritima)、Beta vulgaris var.perennis、Beta vulgaris var.conditiva、Beta vulgaris var.esculenta、笋瓜(Cucurbita mixta)、西葫芦(Cucurbita pepo)、南瓜(Cucurbita moschata)、油橄榄(Olea europaea)、木薯(Manihot utilissima)、Janipha Manihot、Jatropha manihot、Manihot aipil、Manihot dulcis、Manihot manihot、Manihot melanobasis、木薯(Manihot esculenta)、蓖麻(Ricinus communis)、豌豆(Pisum sativum)、饲料豌豆(Pisum arvense)、早生矮豌豆(Pisum humile)、紫花苜蓿(Medicago sativa)、野苜蓿(Medicago falcata)、杂交苜蓿(Medicago varia)、大豆、Dolichos soja、宽叶蔓豆(Glycine gracilis)、Glycine hispida、Phaseolus max、Soja hispida、Soja max、椰子(Cocos nucifera)、茶簏子天竺葵(Pelargonium grossularioides)、Oleum cocoas、月桂(Laurus nobilis)、鳄梨(Persea americana)、花生(Arachis hypogaea)、亚麻(linum usitatissimum)、linum humile、奥地利亚麻(linum austriacum)、linum bienne、窄叶亚麻(linum angustifolium)、泻亚麻(linum catharticum)、金黄亚麻(linum flavum)、大花亚麻(linum grandiflorum、Adenolinum grandiflorum)、刘易斯亚麻(linum lewisii)、那旁亚麻(linum narbonense)、宿根亚麻(linum perenne)、刘易斯宿根亚麻(linum perenne var.lewisii)、linum pratense、linum trigynum、石榴(Punica granatum)、陆地棉Gossypium hirsutum、树棉(Gossypium arboreum)、海岛棉(Gossypium barbadense)、草棉(Gossypium herbaceum)、瑟伯氏棉(Gossypium thurberi)、香蕉(Musa nana)、小果野蕉(Musa acuminata)、大蕉(Musa paradisiaca)、芭蕉(Musa spp.)、油棕(Elaeis guineensis)、东方罂粟(Papaver orientale)、虞美人(Papaver rhoeas)、Papaver dubium、胡麻(Sesamum indicum)、树胡椒(Piper aduncum)、Piper amalago、狭叶胡椒(Piper angustifolium)、Piper auritum、萎叶(Piper betel)、毕澄茄(Piper cubeba)、荜菝(Piper longum)、胡椒(Piper nigrum)、假荜菝(Piper retrofractum)、Artanthe adunca、Artanthe elongata、Peperomia elongata、Piper elongatum、Steffensia elongata、大麦(Hordeum vulgare)、芒颖大麦草(Hordeum jubatum)、鼠大麦(Hordeum murinum)、黑麦状大麦草(Hordeum secalinum)、栽培二棱大麦(Hordeum distichon)、三叉大麦(Hordeum aegiceras)、栽培六棱大麦(Hordeum hexastichon.、Hordeum hexastichum)、Hordeum irregulare、大麦(Hordeum sativum)、黑麦状大麦草(Hordeum secalinum)、燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、野燕麦(原变种)(Avena fatua var.sativa)、杂种野燕麦(Avena hybrida)、双色高粱(Sorghum bicolor)、石茅高粱(Sorghum halepense)、甜高粱(Sorghum saccharatum)、高粱(Sorghum vulgare)、Andropogon drummondii、Holcus bicolor、Holcus sorghum、Sorghum aethiopicum、Sorghum arundinaceum、卡佛尔高粱(Sorghum caffrorum)、垂穗高粱草(Sorghum cernuum)、甜高粱(Sorghum dochna)、Sorghum drummondii、硬高粱草(Sorghum durra)、Sorghum guineense、Sorghum lanceolatum、多脉高粱草(Sorghum nervosum)、甜高粱(Sorghum saccharatum)、Sorghum subglabrescens、Sorghum verticilliflorum、高粱(Sorghum vulgare)、石茅高粱(Holcus halepensis)、黍(Sorghum miliaceum)(谷子(millet))、稷(Panicum militaceum)、玉米、普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、圆柱小麦(Triticum turgidum)、Triticum hybernum、马卡小麦(Triticum macha)、普通小麦(Triticum sativum)或普通小麦(Triticum vulgare)、咖啡(Cofea spp.)、小果咖啡(Coffea arabica)、中果咖啡(Coffea canephora)、大果咖啡(Coffea liberica)、辣椒(Capsicum annuum)、Capsicum annuum var.glabriusculum、小米椒(Capsicum frutescens)、辣椒(Capsicum annuum)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、茄(Solanum melongena)、番茄(Lycopersicon esculentum)、番茄(Lycopersicon lycopersicum.)、梨形番茄(Lycopersicon pyriforme)、红茄(Solanum integrifolium)、番茄(Solanum lycopersicum)、可可树(Theobroma cacao)或大叶茶(Camellia sinensis)。
漆树科如黄连木属(Pistacia)、芒果属(Mangifera)、腰果属(Anacardium)例如物种阿月混子(Pistacia vera)[pistachios、Pistazie]、芒果(Mangifer indica)[Mango]或腰果(Anacardium occidentale)[Cashew]；菊科如金盏花属(Calendula)、红蓝花属(Carthamus)、矢车菊属(Centaurea)、菊苣属(Cichorium)、菜蓟属(Cynara)、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、Locusta、万寿菊属、缬草属(Valeriana)例如物种金盏花[Marigold]、红花[safflower]、矢车菊(Centaurea cyanus)[cornflower]、菊苣(Cichorium intybus)[blue daisy]、洋蓟[Artichoke]、向日葵[sunflower]、莴苣(Lactuca sativa)、皱叶莴苣(Lactuca crispa)、Lactuca esculenta、Lactuca scariola L.ssp.sativa、Lactuca scariola L.var.integrata、Lactuca scariola L.var.integrifolia、Lactuca sativa subsp.romana、Locusta communis、莴苣缬草(Valeriana locusta)[lettuce]、香叶万寿菊、万寿菊或细叶万寿菊[Marigold]；伞形科如胡萝卜属(Daucus)例如物种胡萝卜[carrot]；桦木科(Betulaceae)如榛属(Corylus)例如物种欧洲榛或土耳其榛[hazelnut]；紫草科(Boraginaceae)如琉璃苣属(Borage)例如物种琉璃苣[borage]；十字花科如芸苔属、Melanosinapis、白芥属(Sinapis)、拟南芥菜属例如物种欧洲油菜、芜青[卡诺拉油菜、欧洲油菜、甘蓝型油菜]、野欧白芥、芥菜、芥菜(原变种)、皱叶芥菜、大叶芥菜、黑芥、黑芥(Brassica sinapioides)、黑芥(Melanosinapis communis)[mustard]、甘蓝[fodder beet]或拟南芥菜；凤梨科如the genera凤梨属(Anana)、Bromelia例如物种凤梨、Ananas ananas或Bromelia comosa[菠萝]；番木瓜科如番木瓜属例如物种番木瓜[papaya]；大麻科(Cannabaceae)如大麻属例如物种大麻[hemp]、旋花科(Convolvulaceae)如番薯属、旋花属例如物种甘薯、提琴叶牵牛花、Convolvulus batatas、Convolvulus tiliaceus、甘薯(lpomoea fastigiata)、lpomoea tiliacea、三裂叶薯或Convolvulus panduratus[sweet potato、Man of the Earth、wild potato]、藜科(Chenopodiaceae)如甜菜属即物种甜菜、甜萝卜、甜菜(原变种)、沿海甜菜、Beta vulgaris var.perennis、Beta vulgaris var.conditiva或Beta vulgaris var.esculenta[sugar beet]；葫芦科如南瓜属(Cucurbita)例如物种笋瓜、灰籽南瓜(Cucurbita mixta)、西葫芦或南瓜[pumpkin、squash]；胡颓子科(Elaeagnaceae)如胡颓子属例如物种油橄榄[olive]；杜鹃花科如山月桂属(Kalmia)例如物种宽叶山月桂(Kalmia latifolia)、窄叶山月桂(Kalmia angustifolia)、小叶山月桂(Kalmia microphylla)、沼泽山月桂(Kalmia polifolia)、Kalmia occidentalis、Cistus chamaerhodendros或Kalmia lucida[American laurel、阔叶月桂、calico bush、spoon wood、sheep laurel、alpine laurel、bog laurel、western bog-laurel、swamp-laurel]；大戟科如木薯属、Janipha、麻疯树属(Jatropha)、蓖麻属(Ricinus)例如物种木薯、Janipha manihot、Jatropha manihot、Manihot aipil、Manihot dulcis、Manihot manihot、Manihot melanobasis、Manihot esculenta[Manihot、arrowroot、tapioca、cassava]或蓖麻[castor bean、Castor Oil Bush、Castor Oil plant、Palma Christi、Wonder Tree]；豆科如豌豆属(Pisum)、合欢属(Albizia)、Cathormion、Feuillea、因加属(Inga)、围涎树属(Pithecolobium)、金合欢属(Acacia)、含羞草属(Mimosa)、苜蓿属(Medicago)、大豆属(Glycine)、扁豆属(Dolichos)、菜豆属(Phaseolus)、Soja例如物种豌豆、饲料豌豆、早生矮豌豆[pea]、Albizia berteriana、合欢(Albizia julibrissin)、大叶合欢(Albizia lebbeck)、Acacia berteriana、Acacia littoralis、Albizia berteriana、Albizzia berteriana、Cathormion berteriana、Feuillea berteriana、Inga fragrans、Pithecellobium berterianum、Pithecellobium fragrans、Pithecolobium berterianum、Pseudalbizzia berteriana、Acacia julibrissin、Acacia nemu、Albizia nemu、Feuilleea julibrissin、Mimosa julibrissin、Mimosa speciosa、Sericanrda julibrissin、Acacia lebbeck、Acacia macrohylla、Albizia lebbek、Feuilleea lebbeck、Mimosa lebbeck、Mimosa speciosa[bastard logwood、silk tree、East Indian Walnut]、紫花苜蓿、野苜蓿、杂交苜蓿[苜蓿]、大豆、Dolichos soja、宽叶蔓豆、Glycine hispida、Phaseolus max、Soja hispida或Soja max[大豆]；牻牛儿苗科如天竺葵属(Pelargonium)、椰子属(Cocos)、Oleum例如物种椰子、茶簏子天竺葵或Oleum cocois[椰子]；禾本科如甘蔗属例如物种甘蔗(Saccharum officinarum)；核桃科(Juglandaceae)如核桃属、Wallia例如物种核桃(Juglans regia)、Juglans ailanthifolia、山核桃Juglanssieboldiana、灰核桃(Juglans cinerea)、Wallia cinerea、Juglans bixbyi、加州黑核桃(Juglans californica)、印度黑核桃(Juglans hindsii)、Juglansintermedia、Juglans jamaicensis、大核桃(Juglans major)、Juglansmicrocarpa、黑核桃(Juglans nigra)或Wallia nigra[胡桃、黑胡桃、common walnut、Persian walnut、白胡桃、灰胡桃、黑胡桃]；樟科如鳄梨属、月桂属例如物种月桂[bay、laurel、bay laurel、sweet bay]、鳄梨、鳄梨(Persea gratissima)或鳄梨(Persea persea)[avocado]；豆科如落花生属(Arachis)例如物种花生[peanut]；亚麻科(Linaceae)如亚麻属(Linum)、Adenolinum例如物种亚麻(linum usitatissimum)、linum humile、奥地利亚麻(linum austriacum)、linum bienne、窄叶亚麻(linum angustifolium)、泻亚麻(linum catharticum)、金黄亚麻(linum flavum)、大花亚麻(linum grandiflorum、Adenolinum grandiflorum)、刘易斯亚麻(linum lewisii)、那旁亚麻(linum narbonense)、宿根亚麻(linum perenne)、刘易斯宿根亚麻(linum perenne var.lewisii)、linum pratense、linum trigynum[亚麻属、胡麻]；Lythrarieae 如石榴属(Punica)例如物种石榴[pomegranate]；锦葵科如棉花属(Gossypium)例如物种陆地棉、树棉、海岛棉、草棉或瑟伯氏棉(Gossypium thurberi)[棉花]；芭蕉科(Musaceae)如芭蕉属(Musa)例如物种香蕉、小果野蕉、大蕉、芭蕉[banana]；柳叶菜科(Onagraceae)如Camissonia、月见草属(Oenothera)例如物种月见草(Oenothera biennis)或Camissonia brevipes[primose、evening primose]；棕榈科如油棕属(Elacis)例如物种油棕榈(Elaeis guineensis)[oil plam]；罂粟科如罂粟属(Papaver)例如物种东方罂粟、虞美人、长果罂粟(Papaver dubium)[poppy、oriental poppy、corn poppy、field poppy、shirley poppies、field poppy、long-headed poppy、long-pod poppy]；胡麻科(Pedaliaceae)如胡麻属例如物种胡麻[sesame]；胡椒科(Piperaceae)如胡椒属(Piper)、Artanthe、草胡椒属(Peperomia)、Steffensia例如物种树胡椒、Piper amalago、狭叶胡椒、Piper auritum、萎叶、毕澄茄、荜菝、胡椒、假荜菝、Artanthe adunca、Artanthe elongata、Peperomia elongata、Piper elongatum、Steffensia elongata[Cayenne pepper、wild pepper]；禾本科如大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、燕麦属(Avena)、高粱属(Sorghum)、须芒草属(Andropogon)、绒毛草属(Holcus)、黍(Panicum)、稻属(Oryza)、玉蜀黍属、小麦属(Triticum)例如物种大麦、芒颖大麦草、鼠大麦、黑麦状大麦草、栽培二棱大麦、三叉大麦、栽培六棱大麦、栽培六棱大麦(Hordeum hexastichum)、Hordeum irregulare、大麦(Hordeum sativum)、黑麦状大麦草[barley、pearl barley、foxtail barley、wall barley、meadow barley]、黑麦(Secale cereale)[rye]、燕麦、野燕麦、比赞燕麦、野燕麦(原变种)、杂种野燕麦、双色高粱、石茅高粱(Sorghum halepense)、甜高粱(Sorghum saccharatum)、高粱(Sorghum vulgare)、Andropogon drummondii、Holcus bicolor、Holcus sorghum、Sorghumaethiopicum、Sorghum arundinaceum、卡佛尔高粱、垂穗高粱草、甜高粱(Sorghum dochna)、Sorghum drummondii、硬高粱草、Sorghum guineense、Sorghum lanceolatum、多脉高粱草、甜高粱、Sorghum subglabrescens、Sorghum verticilliflorum、高粱、石茅高粱(Holcus halepensis)、黍(Sorghum miliaceum millet)、稷(Panicum militaceum)[Sorghum、millet]、稻、玉米[corn、maize]、普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦、圆柱小麦、Triticum hybernum、马卡小麦、普通小麦(Triticum sativum)或普通小麦(Triticum vulgare)[wheat、bread wheat、common wheat]、山龙眼科(Proteaceae)如澳洲坚果黍(Macadamia)例如物种澳洲坚果(Macadamia intergrifolia)[macadamia]；茜草科如咖啡属例如物种咖啡(Cofea spp.)、小果咖啡(Coffea arabica)、中果咖啡(Coffea canephora)或大果咖啡(Coffea liberica)[coffee]；玄参科如毛蕊花属(Verbascum)例如物种毛瓣毛蕊花(Verbascum blattaria)、南欧毛蕊花(Verbascum chaixii)、Verbascum densiflorum、Verbascum lagurus、Verbascum longifolium、Verbascum lychnitis、Verbascum nigrum、奥林匹克毛蕊花(Verbascum olympicum)、Verbascum phlomoides、紫花毛蕊花(Verbascum phoenicum)、Verbascum pulverulentum或毛蕊花(Verbascumthapsus)[mullein、white moth mullein、nettle-leaved mullein、密花毛蕊花(dense-flowered mullein)、silver mullein、长叶毛蕊花、white mullein、dark mullein、希腊毛蕊花(greek mullein)、橙色毛蕊花(orange mullein)、紫花毛蕊花(purple mullein)、hoary mullein、great mullein]；茄科如辣椒属、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、番茄属(Lycopersicon)例如物种辣椒、Capsicum annuum var.glabriusculum、小米椒[辣椒]、辣椒[红辣椒(paprika)]、烟草、花烟草(Nicotiana alata)、Nicotiana attenuate、光烟草(Nicotiana glauca)、Nicotiana langsdorffii、Nicotiana obtusifolia、Nicotiana quadrivalvis、Nicotiana repanda、黄花烟草(Nicotiana rustica)、林烟草(Nicotiana sylvestris)[烟草]、马铃薯[potato]、茄[egg-plant]、番茄、番茄、梨形番茄、红茄或番茄[番茄]；梧桐科(Ste rculiaceae)如可可属例如物种可可树[可可]；山茶科(Theaceae)如山茶属(Camellia)例如物种茶(Camellia sinensis)[茶]。
[0117.1.1.1]原则上，可通过本领域技术人员已知的所有方法向生物(如植物)中引入本发明的核酸、表达盒或载体。核酸序列的引入产生了重组生物或转基因生物。
[0118.1.1.1]除非另外指明，否则术语“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在本文中可互换使用。除非另外指明，否则术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用。术语“序列”可涉及多核苷酸、核酸、核酸分子、肽、多肽和蛋白质，这取决于使用术语“序列”的上下文。本文使用的术语“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸分子”指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。该术语仅涉及分子的一级结构。
[0119.1.1.1]因此，本文使用的术语“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸分子”包括双链和单链的DNA和RNA。它们还包括已知类型的修饰，例如甲基化、“加帽”、将一个或多个天然核苷酸替换为类似物。优选地，本发明的DNA或RNA序列包含编码本文所述多肽的编码序列。
[0119.2.1.1]编码选自以下活性的本发明基因也称为“YSRP基因”或“YRP基因”：磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、精氨酸/丙氨酸氨肽酶、D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶、二酰甘油焦磷酸磷酸酶、二酪氨酸转运蛋白、法尼二磷酸法尼基转移酶、NAD+依赖性甜菜碱醛脱氢酶、丝氨酸水解酶、参与赋予对酮康唑抗性的转录调节子、尿苷激酶、yal043c-a-蛋白质、ybr071w-蛋白质和ydr445c-蛋白质。
[0120.1.1.1]“编码序列”是核苷酸序列，其在置于适当调节序列控制之下时转录成mRNA和/或翻译成多肽。编码序列的边界由5’端的翻译起始密码子和3’端的翻译终止密码子决定。编码序列可包括但不仅限于mRNA、cDNA、重组核苷酸序列或基因组DNA，在某些情况下也可存在内含子。
[0121.1.1.1]将外源基因转移进植物基因组中称为转化。为此，使用就转化植物组织或植物细胞并再生植物方面描述的方法进行瞬时或稳定转化。合适的方法是通过聚乙二醇诱导的DNA摄取进行的原生质体转化、使用基因枪进行的“生物射弹”法(称为微粒轰击法)电穿孔、干胚在DNA溶液中温育、显微注射和农杆菌介导的基因转移。所述方法描述于例如B.Jenes等，Techniques for Gene Transfer，in：Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，编辑S.D.Kung和R.Wu，Academic Press(1993)128-143和Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)。优选将待表达的核酸或构建体克隆进适用于转化根癌农杆菌的载体(例如pBin19)中(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。转化有这些载体的农杆菌接着可以已知方式用于转化植物，特别是作物植物，例如烟草植物，例如通过将擦伤或剪断的叶浸泡在农杆菌溶液中，接着在合适的培养基中培养它们。通过根癌农杆菌进行的植物转化描述于例如和Willmitzer在Nucl.Acid Res.(1988)16，9877，或者可从F.F.White，Vectors for Gene Transfer in Higher Plants；in Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，编辑S.D.Kung和R.Wu，Academic Press，1993，第15-38页等中获知。
[0122.1.1.1]通过本发明表达载体转化的农杆菌可类似地以已知方式(例如将擦伤或剪断的叶浸泡在农杆菌溶液中，接着在合适的培养基中培养它们)用于转化植物，例如实验植物如拟南芥，或者作物植物如谷类作物、玉米、燕麦、黑麦、大麦、小麦、大豆、稻、棉花、甜菜、芸苔、向日葵、亚麻、大麻、马铃薯、烟草、番茄、胡萝卜、红辣椒、油菜、树薯、木薯、竹芋、万寿菊、苜蓿、莴苣和多种树木、坚果和藤本物种，特别是含油作物植物，例如大豆、花生、蓖麻植物、向日葵、玉米、棉花、亚麻、油菜、椰子、油棕榈、红花(Carthamus tinctorius)或可可豆。
可以通过本领域技术人员已知的所有方法产生经遗传修饰的植物细胞。合适的方法可见于上文提到的S.D.Kung和R.Wu，Potrykus或
Figure BDA0000055835940001122
和Willmitzer的出版物。
[0123.1.1.1]因此，本发明的另一方面涉及以至少一种本发明的核酸序列、表达盒或载体转化的转基因生物，以及来自这些生物的细胞、细胞培养物、组织、部分(例如对于植物生物的情况为叶、根等)或繁殖材料。术语“宿主生物”、“宿主细胞”、“重组(宿主)生物”和“转基因(宿主)细胞”可互换使用。当然，这些术语不仅涉及特定的宿主生物或具体的靶细胞，而且还涉及这些生物或细胞的后代或潜在后代。由于突变或环境效应，可以在后续世代中产生某些改变，因此这些后代不一定与亲本细胞相同，但仍包括在本文使用的该术语中。
就本发明目的而言，“转基因”或“重组”指例如含有本发明核酸序列的核酸序列、表达盒(＝基因构建体、核酸构建体)或载体，或者以本发明核酸序列、表达盒或载体转化的生物，所有通过遗传工程方法产生的构建体，其中
a)表I第5列或第7列中所示核酸序列或其衍生物或部分；或
b)与(a)所述核酸序列有效连接的遗传控制序列，例如3’和/或5’遗传控制序列，例如启动子或终止子，或
c)(a)和(b)
不在其天然遗传环境中，或者已通过重组方法进行了修饰，所述修饰可以是例如替换、添加、缺失、倒位或插入一个或多个核苷酸残基。天然遗传环境指来源生物或宿主生物中的天然基因组或染色体基因座或者在基因组文库中存在。对于基因组文库的情况，核酸序列的天然遗传环境优选至少在一定程度上保留。该环境在核酸序列的至少一侧，并且序列长度为至少50bp，优选至少500bp，更优选至少1000bp，最优选至少5000bp。天然表达盒(例如本发明核酸序列的天然启动子与相应δ-8-去饱和酶、δ-9-延伸酶和/或δ-5-去饱和酶基因的天然组合)在所述基因经非天然合成(“人工”)方法(例如诱变)修饰时成为转基因表达盒。已经描述了这样的方法，例如US 5,565,350或WO 00/15815。
[0124.1.1.1]用于本发明核酸、表达盒或载体的合适的生物或宿主生物有利地为基本上所有适于表达上述重组基因的生物。可以提到的其他实例为植物，例如拟南芥，紫菀科例如金盏花，或者作物植物如大豆、花生、蓖麻油植物、向日葵、亚麻、玉米、棉花、亚麻、油菜、椰子、油棕榈、红花(Carthamus tinctorius)或可可豆。
在本发明的一个实施方案中，用于本发明核酸、表达盒或载体的宿主植物选自玉米、大豆、油菜(包括芸苔和冬季油菜)、棉花、小麦和稻。
[0125.1.1.1]本发明的另一目的涉及核酸构建体(例如表达盒)用于转化植物细胞、组织或植物部分的用途，所述核酸构建体含有编码表II中所示多肽的DNA序列或者与其杂交的DNA序列。
为此，取决于启动子的选择，可以在叶、种子、根瘤、根、茎或其他植物部分中特异性表达表I所示序列。这些过量产生表I所示序列的转基因植物、其繁殖材料及其植物细胞、组织或部分是本发明的另一目的。此外，含有根据表I的序列的本发明表达盒或核酸序列或构建体还可用于转化例如上文提到的生物，例如细菌、酵母、丝状真菌和植物。
[0126.1.1.1]在本发明框架内，对环境胁迫的提高耐受性和/或抗性表示，例如在至少一代植物的时间内，通过与未经遗传修饰的原始植物相比，人工获得的提高的环境胁迫抗性，其归因于在本发明生物(有利地在本发明的转基因植物)中对例如由表I第5列或第7列中所示相应核酸分子和/或同源物编码的表II的多肽序列的功能性过表达。
[0127.1.1.1]此外，组成型表达由表I第5列或第7列中所示相应核酸分子和/或同源物编码的表II多肽序列是有利的。然而，另一方面，也可能期望诱导型表达。本发明多肽序列的表达可导向宿主细胞(优选植物细胞)的胞质或细胞器，优选质体。
可通过如嫩枝分生组织繁殖来测定由表I第5列或第7列中所示相应核酸分子和/或同源物编码的表II序列的表达效率。此外，可在温室试验中对测试植物测试在性质和水平上发生了改变的由表I第5列或第7列中所示核酸分子和/或同源物编码的表II序列的表达及其对代谢途径性能的影响。
[0128.1.1.1]本发明的另一目的包括转化有包含根据本发明的表I第5列或第7列中所示序列或与其杂交之DNA序列的表达盒的转基因生物，例如转基因植物，以及这些植物的转基因细胞、组织、部分和繁殖材料。这种情况下特别优选转基因作物植物，例如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、大豆、稻、棉花、甜菜、油菜和芸苔、向日葵、亚麻、大麻、大蓟、马铃薯、烟草、番茄、树薯、木薯、竹芋、苜蓿、莴苣以及多种树木、坚果和藤本物种。
在本发明的一个实施方案中，转化有含有根据本发明的表I第5列或第7列中所示序列或与其杂交之DNA序列的表达盒的转基因植物选自玉米、大豆、油菜(包括芸苔和冬季油菜)、棉花、小麦和稻。
[0129.1.1.1]就本发明的目的而言，植物是单子叶植物和双子叶植物、藓类或藻类。
本发明的另一对象是如上述的转基因植物，其含有本发明的核酸序列或构建体或者本发明的表达盒。
[0129.2.1.1]然而，转基因也指本发明的核酸位于其在生物基因组中的天然位置，但该序列与天然序列相比进行了修饰和/或天然序列的调节序列进行了修饰。优选地，转基因/重组应理解为指本发明的并且显示于表I中的核酸的转录存在于基因组中非天然的位置，也就是说，该核酸的表达是同源的，或者优选是异源的。这种表达可以是瞬时的，或者是稳定整合进基因组的序列的表达。
本发明使用的术语“转基因植物”还指转基因植物的后代，例如T1、T2、T3和后续的植物世代或者BC1、BC2、BC3和后续的植物世代。因此，可以产生本发明的转基因植物，并且自交或者与其他个体杂交，以获得其他本发明的转基因植物。还可通过无性繁殖转基因植物细胞来获得转基因植物。本发明还涉及来自于本发明转基因植物群的转基因植物材料。这些材料包括植物细胞和某些组织、器官和植物部分的所有表现形式，例如种子、叶、花药、纤维、块茎、根、根毛、茎、胚、愈伤组织、子叶、叶柄、收获材料、植物组织、繁殖组织和细胞培养物，它们来自于实际的转基因植物和/或可用于产生转基因植物。
根据本发明获得的任何转化植物可用于常规育种方案或体外植物繁殖，以产生更多具有相同特征的转化植物和/或可用于将同一特征引入相同或相关物种的其他变种中。这些植物也可以是本发明的一部分。得自转化植物的种子一般也含有相同的特征，并且也是本发明的一部分。如上文所述，本发明基本上可用于可以本领域技术人员已知的任何转化方法进行转化的任何植物和作物。
[0130.1.1.1]有利的诱导型植物启动子为例如PRP1启动子[Ward等，Plant.Mol.Biol.22(1993)，361-366]、苯磺酰胺诱导型启动子(EP 388 186)、四环素诱导型启动子[Gatz等，(1992)Plant J.2，397-404]、水杨酸诱导型启动子(WO 95/19443)、脱落酸诱导型启动子(EP 335 528)或乙醇或环己酮诱导型启动子(WO 93/21334)。可以有利地使用的植物启动子的其他实例为来自马铃薯的胞质溶胶FBPase启动子、来自马铃薯的ST-LSI启动子(Stockhaus等，EMBO J.8(1989)2445-245)、来自大豆的磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶启动子(还参阅gene bank登记号U87999)或)EP 249 676所述的nodiene特异性启动子。特别有利的是在环境胁迫，例如干旱或寒冷早期开始后保证表达的那些启动子。
在一个实施方案中，种子特异性启动子可用于单子叶或双子叶植物。
[0131.1.1.1]原则上，所有带有其调节序列的天然启动子均可使用，例如上文针对本发明表达盒和本发明方法所描述的那些。除此以外，还可以有利地使用合成启动子。
在表达盒的制备中，可以操作多种DNA片段以获得核苷酸序列，其有用地以正确方向阅读并带有正确的读码框。为了将DNA片段(＝本发明核酸)彼此连接，可在片段上附着衔接头或接头。
启动子和终止子区可以有用地在转录方向上带有接头或多聚接头，其包含用于插入此序列中的一个或多个限制性位点。接头一般含有1至10个、常为1至8个、优选2至6个限制酶位点。一般而言，调节区中的接头的大小小于100bp，经常小于60bp，但至少为5bp。启动子可以与宿主生物(例如宿主植物)是天然或同源的，是外源或异源的也可。在5’-3’转录方向上，表达盒含有启动子、表I所示DNA序列以及用于终止转录的区域。不同的终止区可以任何期望的方式彼此交换。
[0132.1.1.1]本文使用的术语“核酸”和“核酸分子”旨在包括DNA分子(如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(如mRNA)以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物。该术语还包括位于基因编码区3’和5’末端的非翻译序列——基因编码区5’末端上游至少约1000个核苷酸的序列以及编码区3’末端下游至少约200个核苷酸的序列。核酸分子可以是单链的或双链的，但优选双链DNA。
“分离的”核酸分子是与该核酸天然来源中存在的其他核酸分子基本分开的核酸分子。这意味着，所存在的其他核酸分子为所需核酸重量的少于5％，优选少于2％重量，更优选少于1％重量，最优选少于0.5％重量。优选地，“分离的”核酸不含该核酸来源生物的基因组DNA中天然位于该核酸侧翼的一些序列(即位于该核酸5’和5’末端的序列)。例如，在多个实施方案中，分离的胁迫相关蛋白的编码核酸分子可含有该核酸来源细胞的基因组DNA中天然位于该核酸分子侧翼的少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb核苷酸序列。此外，“分离的”核酸分子(例如cDNA分子)可不含与其天然相关的其他细胞材料，或者在通过重组技术产生的情况下不含培养基，或者在化学合成的情况下不含化学前体或其他化学物质。
[0133.1.1.1]可以使用标准分子生物学技术和本文提供的序列信息来分离本发明的核酸分子，例如编码YSRP或其部分的核酸分子，其在植物中赋予对环境胁迫的耐受性和/或抗性和提高的生物量生产。例如，可以使用表I所示序列之一的全部或部分，从拟南芥cDNA文库中分离拟南芥胁迫相关蛋白的编码cDNA，或者从集胞藻、欧洲油菜、大豆、玉米或水稻的cDNA文库中分别分离集胞藻、欧洲油菜、大豆、玉米或水稻的胁迫相关蛋白的编码cDNA。此外，可以使用基于表I序列设计的寡核苷酸引物，通过聚合酶链式反应分离包含表I序列的全部或部分的核酸分子。例如，可以从植物细胞中分离mRNA(例如通过Chirgwin等，Biochemistry 18，5294(1979)的硫氰酸胍提取法)，并可使用逆转录酶(例如Moloney MLV逆转录酶，可得自Gibco/BRL，Bethesda，MD；或者AMV逆转录酶，可得自Seikagaku America，Inc.，St.Petersburg，FL)制备cDNA。可以基于表I所示核苷酸序列之一设计用于聚合酶链式反应扩增的合成的寡核苷酸引物。可以使用cDNA或基因组DNA作为模板，并使用适当的寡核苷酸引物根据标准PCR扩增技术来扩增本发明的核酸分子。这样扩增的核酸分子可克隆进适当的载体中，并通过DNA序列分析进行表征。此外，可以通过标准合成技术(如使用自动化DNA合成仪)来制备对应于YSRP编码核苷酸序列的寡核苷酸。
在一个优选的实施方案中，本发明的分离的核酸分子包含编码YSRP的表I所示核苷酸序列之一(即“编码区”)以及5’非翻译序列和3’非翻译序列。
此外，本发明的核酸分子可仅包含表I核酸序列之一的编码区的一部分，例如可用作探针或引物的片段或者编码YSRP的生物活性部分的片段。
[0134.1.1.1]本发明YSRP编码核酸分子编码的蛋白质的部分优选是此处描述的生物学活性部分。本文所用的术语YSRP的“生物活性部分”旨在包括部分，例如胁迫相关蛋白质的结构域/基序，其在植物中参与胁迫耐受性和/或抗性应答。为了测定YSRP或其生物学活性部分是否在植物中产生增加的胁迫耐受性，可进行包含所述YSRP的植物的胁迫分析。此类分析方法为本领域技术人员所熟知，如在实施例中详细描述。更具体地，可以如下制备编码YSRP之生物活性部分的核酸片段：分离表I核酸序列之一的一部分，表达所编码的YSRP或肽的部分(例如通过体外重组表达)，以及评估所编码的YSRP或肽的部分的活性。
YSRP的生物活性部分包括在本发明之中，并包括含有来自YSRP编码基因之氨基酸序列的氨基酸序列或者与YSRP同源之蛋白质的氨基酸序列的肽，其包含比全长YSRP或与YSRP同源的全长蛋白更少的氨基酸，并显示YSRP的至少某种酶活性或生物活性。一般地，生物活性部分(例如长度为5，10，15，20，30，35，36，37，38，39，40，50，100或更多个氨基酸的肽)包含具有至少一种YSRP活性的结构域或基序。此外，可以通过重组技术制备缺失了该蛋白质中另一些部分的其他生物活性部分，并评估本文所述的一种或多种活性。优选地，YSRP的生物活性部分包括其具有生物活性的一种或多种选定的结构域/基序或其部分。
术语“生物活性部分”或“生物活性”指表II第3列所示多肽，或者所述多肽中仍具有该天然或起始酶或蛋白之酶活性或生物活性的至少10％或20％，优选30％、40％、或50％，特别优选60％、70％或80％的部分。
[0135.1.1.1]在本发明的方法中，可以使用适当时含有可掺入DNA或RNA中的合成、非天然或修饰核苷酸碱基的核酸序列。例如，所述合成、非天然或修饰碱基可提高该核酸分子在细胞外或细胞内的稳定性。本发明的核酸分子可含有与上述相同的修饰。
[0136.1.1.1]本文使用的术语“核酸分子”还可包含位于基因编码区3’和5’末端的非翻译序列，例如编码区5’末端上游至少500个、优选200个、特别优选100个核苷酸的序列，以及基因编码区3’下游至少100个、优选50个、特别优选20个核苷酸的序列。仅选择编码区用于克隆和表达目的经常是有利的。
[0137.1.1.1]优选地，用于本发明方法的核酸分子或本发明的核酸分子是分离的核酸分子。
[0138.1.1.1]“分离的”多核苷酸或核酸分子与该核酸分子天然来源中所存在的其他多核苷酸或核酸分子分开。分离的核酸分子可以是若干kb的染色体片段，或者优选是仅包含基因编码区的分子。因此，本发明的分离的核酸分子可包含5’和3’的相邻染色体区或其他相邻染色体区，但优选不包含该核酸来源生物的基因组或染色体环境中天然位于该核酸分子序列侧翼的这些序列(例如编码该核酸分子5’和3’UTR的区域附近的序列)。例如，在多个实施方案中，用于本发明方法的分离的核酸分子可以包含该核酸分子来源细胞的基因组DNA中天然位于该核酸分子侧翼的少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列。
[0139.1.1.1]用于本方法的核酸分子(例如本发明的多核苷酸或其部分)可使用分子生物学标准技术和本文提供的序列信息来分离。还可以例如借助于比较算法来鉴定在DNA或氨基酸水平上的同源序列或同源保守序列区。前者可在标准杂交技术中用作杂交探针(例如Sambrook等，MolecularCloning：A Laboratory Manual.第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989所述)，用于分离可用于该方法的其他核酸序列。
[0140.1.1.1]还可以通过聚合酶链式反应分离包含本方法所用核酸分子(例如本发明的多核苷酸)的完整序列或其部分的核酸分子，其中使用基于该序列或其部分的寡核苷酸引物。例如，可以使用基于该特定序列产生的寡核苷酸引物，通过聚合酶链式反应分离包含完整序列或其部分的核酸分子。例如，可以从细胞中分离mRNA(例如通过Chirgwin等(1979)Biochemistry 18：5294-5299所述的硫氰酸胍提取法)，并可通过逆转录酶(例如Moloney MLV逆转录酶，可得自Gibco/BRL，Bethesda，MD，或者AMV逆转录酶，可得自Seikagaku America，Inc.，St.Petersburg，FL)产生cDNA。
[0141.1.1.1]用于通过聚合酶链式反应进行扩增的合成寡核苷酸引物(例如表III第7列中所示)可基于本文所示序列产生，例如基于表I第5列和第7列中所示序列或者衍生自表II第5列和第7列的序列。
[0142.1.1.1]此外，可以通过与本发明核酸分子所编码多肽(特别是与表I第5列或第7列中所示核酸分子所编码的序列)进行蛋白质序列比对来鉴定保守蛋白，由此可以产生保守区并进而产生简并引物。
保守区是在来自不同来源的若干同源物中一个特定位置上的氨基酸极少显示变异的区域。表IV第7列中所示共有的序列和多肽基序来自于所述比对。此外，可以通过与本发明核酸所编码的多肽(特别是与表II第5列或第7列中所示多肽分子所编码的序列)进行蛋白质序列比对来从多种生物中鉴定保守区，由此可以产生保守区并进而产生简并引物。
在一个有利的实施方案中，在本发明方法中提高了多肽的活性，所述多肽包含表IV申请1第7列中所示共有序列或多肽基序或者由其组成，在另一实施方案中，本发明涉及多肽，其包含表IV申请1第7列中所示共有序列或多肽基序或者由其组成，其中所标明氨基酸位置中20或更少，优选15或10，优选9、8、7或6，更优选5或4，甚至更优选3，甚至更优选2，甚至更优选1，最优选0个可被任何氨基酸替换。在一个实施方案中，以一字母标出的氨基酸位置中的不高于15％，优选10％，甚至更优选5％、4％、3％或2％，最优选1％或0％被另一氨基酸替换。在一个实施方案中，共有序列或蛋白质基序中插入了不高于15％，优选10％，甚至更优选5％、4％、3％或2％，最优选1％或0％个氨基酸。
共有序列来自于表II中所列序列的多重比对。字母代表单字母氨基酸代码并且指出氨基酸在至少80％的比对蛋白质中是保守的，而字母X代表氨基酸，其在至少80％的序列中不是保守的。共有序列从比对中第一个保守的氨基酸开始，到所研究的序列的比对中最后一个保守的氨基酸结束。给定的X数字指出保守氨基酸残基之间的距离，例如Y-x(21，23)-F表示比对中保守的酪氨酸和苯丙氨酸残基在所有研究的序列的比对中通过最少21最多23个氨基酸残基彼此隔开。
保守结构域从所有序列中鉴定，并且使用标准Prosite记法的子集描述，例如图谱Y-x(21，23)-[FW]表示保守的酪氨酸与苯丙氨酸或色氨酸通过最少21最多23个氨基酸残基隔开。图谱必须匹配至少80％的研究蛋白质。保守性图谱使用软件工具MEME3.5.1版鉴定，或者人工鉴定。MEME由美国加利福尼亚大学圣地亚哥分校计算机科学与工程学院的Timothy L.Bailey和Charles Elkan开发，并由Timothy L.Bailey和Charles Elkan描述(Fitting a mixture model by expectation maximization to discover motifs in biopolymers，Proceedings of the Second International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology，28-36页，AAAI Press，Menlo Park，California，1994)。公众可在圣地亚哥超级计算机中心(http://meme.sdsc.edu)获得该独立程序的源代码。
为了使用软件工具MEME鉴定所有序列中的共有基序，使用以下设置：-maxsize 500000，-nmotifs 15，-evt 0.001，-maxw 60，-distance 1e-3，-minsites分析中所用的序列数。MEME的输入序列是Fasta格式的非比对序列。其他参数可以本版软件中的默认设置使用。
保守性结构域的Prosite图谱使用软件工具Pratt 2.1版产生，或者人工产生。Pratt由挪威Bergen大学信息学院的Inge Jonassen开发，并由Jonassen等描述(I.Jonassen，J.F.Collins和D.G.Higgins，Finding flexiblepatterns in unaligned protein sequences，Protein Science 4(1995)，1587-1595页；I.Jonassen，Efficient discovery of conserved patterns using apattern graph，Submitted to CABIOS Febr.1997]。该独立程序的源代码(ANSI C)是公众可获得的，例如在已建立的生物信息学中心如EBI(欧洲生物信息学研究所)。
为了使用软件工具Pratt产生图谱，使用以下设置：PL(最大Pattern 长度)：100，PN(最大图谱标记数)：100，PX(最大连续x数)：30，FN(最大柔性间隔区数)：5，FL(最高柔性)：30，FP(最高柔性产物)：10，ON(最大图谱数)：50。Pratt的输入序列是由软件工具MEME鉴定的显示高度相似性的蛋白质序列的不同区域。必须与所产生图谱匹配的最小序列数(CM，最小匹配序列数)设置为所提供序列的至少80％。此处未提及的参数以其默认设置使用。
可以使用保守性结构域的Prosite图谱来检索与该图谱匹配的蛋白质序列。多个已建立的生物信息学中心提供在数据库检索中使用这些图谱的公众互联网入口(例如PIR(Protein Information Resource，位于乔治城大学医学中心)或ExPASy(Expert Protein Analysis System))。或者，有独立软件可以使用，如Fuzzpro程序，它是EMBOSS软件包的一部分。例如，Fuzzpro程序不仅允许检索准确的图谱-蛋白质匹配，还允许在所进行的检索中设置多种模糊度。
比对使用ClustalW软件(1.83版)进行，并描述于Thompson等[Thompson，J.D.，Higgins，D.G.和Gibson，T.J.(1994)CLUSTAL W：improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting，positions-specific gap penalties and weight matrix choice.Nucleic Acids Research，22：4673-4680]。公众可从德国海德堡的欧洲分子生物学实验室获得该独立程序的源代码。使用ClustalWv1.83的默认参数进行分析(缺口罚分：10.0；缺口延伸罚分：0.2；蛋白质矩阵：Gonnet；蛋白质/DNA endgap：-1；蛋白质/DNA gapdist：4)。
[0143.1.1.1]接着可以使用简并引物通过PCR扩增新的蛋白质的片段，所述蛋白质具有上述活性，或具有如表II第3列中所示蛋白质或来自其它生物的本发明多肽其它功能同源物的活性，例如在提高表达或活性后，优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量。
[0144.1.1.1]接着，这些片段可作为杂交探针用于分离完整基因序列。或者，可以通过RACE-PCR分离缺少的5’和3’序列。可以使用cDNA或基因组DNA作为模板，使用合适的引物，按照标准PCR扩增技术来扩增本发明的核酸分子。这样扩增的核酸分子可克隆进合适的载体中，并通过DNA序列分析进行表征。可以通过标准合成法(例如使用自动化DNA合成仪)产生对应于本方法所用核酸分子之一的寡核苷酸。
[0145.1.1.1]有利地用于本发明方法的核酸分子可基于其与本文所述核酸分子的同源性来分离，其中使用该序列或其部分作为杂交探针，并遵循标准杂交技术在严格杂交条件下进行。在这种情况下，可以使用例如在严格条件下与上述核酸分子杂交(特别是与这样的核酸分子杂交：其包含本发明方法所用核酸分子的核苷酸序列，或者编码本发明所用蛋白质的核苷酸序列，或者本发明核酸分子的核苷酸序列)的长度为至少15、20、25、30、35、40、50、60或更多个核苷酸(优选至少15、20或25个核苷酸)的分离的核酸分子。还可以使用含有30、50、100、250或更多个核苷酸的核酸分子。
[0146.1.1.1]术语“同源性”指各个核酸分子或所编码的蛋白质在功能和/或结构上是等同的。例如，与上述核酸分子同源或者作为所述核酸分子之衍生物的核酸分子是所述核酸分子的变异，其中代表具有相同生物功能(特别是编码具有相同或基本相同的生物功能的蛋白质)的修饰。它们可以是天然的变异，例如来自其他植物变种或物种的序列，或者是突变。这些突变可天然发生，或者可通过诱变技术获得。等位基因变异可以天然的等位基因变异以及合成产生的或遗传工程产生的变体。例如，结构等同物可通过测试所述多肽与抗体的结合或者通过基于计算机的预测来鉴定。结构等同物具有相似的免疫学特征，例如包含相似的表位。
[0147.1.1.1]“杂交”指这些核酸分子在常规杂交条件下杂交，优选在严格条件下杂交，如Sambrook(Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989))或Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6所述。
[0148.1.1.1]根据本发明，可使用本发明核酸的DNA和RNA分子作为探针。此外，作为用于鉴定功能同源物的模板，可以进行Northern印迹测定和Southern印迹测定。Northern印迹测定有利地提供了关于所表达基因产物的进一步信息：例如表达谱、加工步骤(如剪接和加帽)的存在情况等。Southern印迹测定提供了关于编码本发明核酸分子之基因染色体定位和组织的进一步信息。
[0149.1.1.1]严格杂交条件的一个优选的非限制性实例为在约45℃下在6×氯化钠/柠檬酸钠(＝SSC)中杂交，然后在50至65℃(例如50℃、55℃或60℃)下在0.2×SSC、0.1％ SDS中进行一次或多次洗涤步骤。本领域技术人员了解，这些杂交条件作为核酸类型的函数而变化，并且例如在存在有机溶剂时随温度和缓冲液浓度而变化。例如，“标准杂交条件”下的温度作为核酸类型的函数在0.1×、0.5×、1×、2×、3×、4或5×SSC(pH 7.2)浓度的水性缓冲液中可为42℃至58℃不等，优选45℃和50℃。如果上述缓冲液中存在有机溶剂，例如50％甲酰胺，则标准条件下的温度约为40℃、42℃或45℃。DNA:DNA杂交分子的杂交条件优选为0.1×SSC和20℃、25℃、30℃、35℃、40℃或45℃，优选30℃至45℃。DNA:RNA杂交分子的杂交条件优选为例如0.1xSSC和30℃、35℃、40℃、45℃、50℃或55℃，优选45℃到55℃。上述杂交温度是在例如不存在甲酰胺的情况下对长度约100bp(＝碱基对)且G+C含量为50％的核酸确定的。本领域技术人员了解借助于教科书来确定杂交条件，所述教科书为例如上文提到的那些，或者以下教科书：Sambrook等，”Molecular Cloning”，Cold Spring Harbor Laboratory，1989；Hames和Higgins编辑1985，”Nucleic Acids Hybridization：A Practical Approach”，IRL Press at Oxford University Press，Oxford；Brown编辑1991，”Essential Molecular Biology：A Practical Approach”，IRL Press at Oxford University Press，Oxford。
[0150.1.1.1]一个这种严格杂交条件的另一实例是在65℃下在4×SSC中杂交，其后在65℃下以0.1×SSC洗涤1小时。或者，一个示例性严格杂交条件为50％甲酰胺、4×SSC，42℃。此外，洗涤步骤过程中的条件可以在划分为低严格条件(约2×SSC，50℃)至高严格条件(约0.2×SSC，50℃，优选65℃)的范围内选择(20×SSC：0.3M柠檬酸钠、3M NaCl，pH 7.0)。此外，洗涤步骤过程中的温度可从室温(约22℃)下的低严格条件提高至约65℃的高严格条件。盐浓度和温度这两个参数可同时改变，或者可将这两个参数之一保持恒定而改变另一个。杂交过程中还可以使用变性剂，例如甲酰胺或SDS。在50％甲酰胺存在下，杂交优选在42℃下进行。可在各个情况下组合相关的因素例如1)处理的长度、2)盐条件、3)洗涤剂条件、4)竞争DNA、5)温度和6)探针的选择，因此本文无法提及所有的可能性。
因此，在一个优选的实施方案中，在68℃下将Northern印迹在Rothi-Hybri-Quick缓冲液(Roth，Karlsruhe)中预杂交2小时。与放射性标记探针的杂交在68℃进行过夜。其后在68℃下用1×SSC进行洗涤步骤。对于Southern印迹测定，在68℃下将膜在Rothi-Hybri-Quick缓冲液(Roth，Karlsruhe)中预杂交2小时。与放射性标记探针的杂交在68℃进行过夜。其后弃去杂交缓冲液，并用2×SSC、0.1％SDS短暂地洗涤滤器。弃去洗涤缓冲液后，加入新的2×SSC、0.1％SDS缓冲液并在68℃下孵育15分钟。将该洗涤步骤进行两次，其后在68℃下使用1×SSC、0.1％SDS进行10分钟的额外洗涤步骤。
[0151.1.1.1]用于DNA杂交(Southern印迹测定)和洗涤步骤的一些条件实例在下文给出：
(1)杂交条件可选自例如以下条件：
a)4×SSC，65℃，
b)6×SSC，45℃，
c)6×SSC，100mg/ml变性的片段化鱼精DNA，68℃，
d)6×SSC，0.5％ SDS，100mg/ml变性的鲑精DNA，68℃，
e)6×SSC，0.5％ SDS，100mg/ml变性的片段化鲑精DNA，50％甲酰胺，42℃，
f)50％甲酰胺，4×SSC，42℃，
g)50％(v/v)甲酰胺，0.1％牛血清白蛋白，0.1％ Ficoll，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，50mM磷酸钠缓冲液pH 6.5，750mM NaCl，75mM柠檬酸钠，42℃，
h)2×或4×SSC，50℃(低严格条件)，或
i)30到40％甲酰胺，2×或4×SSC，42℃(低严格条件)。
(2)洗涤步骤可选自例如以下条件：
a)0.015M NaCl/0.0015M柠檬酸钠/0.1％SDS，50℃。
b)0.1×SSC，65℃。
c)0.1×SSC，0.5％SDS，68℃。
d)0.1×SSC，0.5％ SDS，50％甲酰胺，42℃。
e)0.2×SSC，0.1％ SDS，42℃。
f)2×SSC，65℃(低严格条件)。
[0152.1.1.1]其它DNA序列可编码具有上述活性，即优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量的多肽，所述其它DNA序列与表I第5列和第7列中所示序列在松弛条件下进行杂交并编码肽的表达，其优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量。
[0153.1.1.1]此外，一些应用必须在低严格杂交条件下进行，而对杂交特异性无任何影响。例如，可以用本发明核酸分子检测总DNA的Southern印迹分析，并低严格洗涤(55℃下，2×SSPE、0.1％ SDS)。杂交分析可仅显示出编码本发明多肽或本发明方法所用多肽(即具有本文所述与相应的例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比提高对环境胁迫耐受性和/或抗性和提高生物量生产的活性)的基因的简单图谱。这些低严格杂交条件的另一实例是4×SSC，50℃，或者在42℃下用30至40％甲酰胺进行杂交。这些分子包括这样的分子：其为本发明多肽或本发明方法所用多肽的片段、类似物或衍生物，其差异为氨基酸和/或核苷酸的缺失、插入、替换、添加和/或重组或者本领域技术人员已知的单独或组合地对上述氨基酸序列或其内在核苷酸序列的任何其他修饰。然而，优选使用高严格杂交条件。
[0154.1.1.1]杂交应有利地以至少5、10、15、20、25、30、35或40bp的片段进行，有利地为至少50、60、70或80bp，优选至少90、100或110bp。最优选至少15、20、25或30bp的片段。还优选至少100bp或200bp、更特别优选至少400bp长度的杂交。在一个特别优选的实施方案中，杂交应以上述条件用整个核酸序列进行。
[0155.1.1.1]术语“片段”、“序列片段”或“序列部分”表示所指代原始序列的截短序列。截短序列(核酸或蛋白质序列)的长度可广泛变化，最小尺寸是这样的序列，其大小足以为序列提供与所指代原始序列至少相当的功能和/或活性，或者在严格杂交条件下与本发明核酸分子或本发明方法所用核酸分子杂交，而最大尺寸则不是关键性的。在一些应用中，最大尺寸一般不显著大于提供原始序列的期望活性和/或功能所需的大小。
[0156.1.1.1]截短的氨基酸序列的长度一般为约5至约310个氨基酸。然而，更一般地，序列长度最高将约为250个氨基酸，优选最高约200或100个氨基酸。经常期望选择至少约10、12或15个氨基酸上至最高约20或25个氨基酸的序列。
[0157.1.1.1]术语“表位”涉及抗原中的特异性免疫反应性位点，也称为抗原决定簇。这些表位可以是多聚组合物中单体(如蛋白质中的氨基酸)的线性排列，或者包含更复杂的二级结构或三级结构或者由其组成。本领域技术人员会认识到，免疫原(即能引发免疫应答的物质)是抗原，但一些抗原(如半抗原)则不是免疫原，而是可能通过与载体分子偶联而具有免疫原性。术语“抗原”包括提及可对针对其产生抗体和/或抗体对其具有特异免疫反应性的物质。
[0158.1.1.1]在一个实施方案中，本发明涉及本发明多肽或用于本发明方法中的多肽的表位，并优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量。
[0159.1.1.1]术语“一个或多个氨基酸”指至少一个氨基酸，但不多于将导致同源性低于50％同一性的氨基酸数。优选地，同一性高于70％或80％，更优选85％、90％、91％、92％、93％、94％或95％，甚至更优选96％、97％、98％或99％的同一性。
[0160.1.1.1]此外，本发明的核酸分子包括作为上述核酸分子的核苷酸序列之一或其部分之互补序列的核酸分子。与表I第5列和第7列中所示核苷酸序列之一互补的核酸分子是这样的核酸分子，其与表I第5列和第7列中所示核苷酸序列之一充分互补，以使其能与表I第5列和第7列中所示核苷酸序列之一杂交，从而形成稳定的双链体。优选地，所述杂交在严格条件下进行。然而，本文所述序列之一的互补序列优选是根据本领域技术人员熟知的核酸分子碱基配对与其互补的序列。例如，碱基A和G分别与碱基T以及U或C碱基配对，反之亦然。对碱基的修饰可能影响碱基配对的配偶体。
[0161.1.1.1]本发明的核酸分子包括这样的核苷酸序列，其与表I第5列和第7列中所示核苷酸序列或其部分具有至少约30％、35％、40％或45％的同源性，优选至少约50％、55％、60％或65％，更优选至少约70％、80％或90％，甚至更优选至少约95％、97％、98％、99％或更高的同源性，并且优选地具有上述活性，特别是通过例如在胞质溶胶或细胞器(如质体或线粒体或这两者，优选质体)中表达而提高表I第3列中所示基因产物的活性后具有对环境胁迫的耐受性和/或抗性和提高生物量生产的活性。
[0162.2.1.1]本发明的核酸分子包含核苷酸序列，其优选在此处定义的严格条件下与表I第5列和第7列中所示的核苷酸序列之一或其部分杂交，并编码蛋白质，其具有上述活性，通过例如在胞质溶胶或细胞器如质体或线粒体或两者，优选在质体中的表达，优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高产量，并任选地具有选自以下的活性：磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、精氨酸/丙氨酸氨肽酶、D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶、二酰甘油焦磷酸磷酸酶、二酪氨酸转运蛋白、法尼二磷酸法尼基转移酶、NAD+依赖性甜菜碱醛脱氢酶、丝氨酸水解酶、参与赋予对酮康唑抗性的转录调节子、尿苷激酶、yal043c-a-蛋白质、ybr071w-蛋白质和ydr445c-蛋白质。
[0163.1.1.1]此外，本发明的核酸分子可以仅包含表I第5列和第7列中所示序列之一的一部分编码区，例如可用作探针或引物的片段或者编码本发明多肽或本发明方法中所用多肽的生物活性部分的片段，即具有上述活性，例如通过如在胞质溶胶或细胞器(如质体或线粒体或这两者，优选质体)中表达而赋予与相应未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比对环境胁迫提高的耐受性和/或抗性和提高的生物量生产。从本发明蛋白质编码基因的克隆中测定的核苷酸序列允许产生用于在其他细胞类型和生物中鉴定和/或克隆其同源物的探针和引物。所述探针/引物一般包含基本纯化的寡核苷酸。该寡核苷酸一般包含这样的核苷酸序列区域，其在严格条件下与(例如表I第5列和第7列中)所示序列之一的有义链、(例如表I第5列和第7列中)所示序列之一的反义链、或其天然存在的突变体的至少约12、15个、优选至少约20或25个、更优选约40、50或75个连续核苷酸杂交。基于本发明核苷酸的引物可用于PCR反应中来克隆本发明多肽或本发明方法所用多肽的同源物，例如作为本发明实施例中所述的引物，例如实施例中所示。用表III第7列中所示引物进行的PCR将产生表II第3列中所示基因产物的片段。
[0164.1.1.1]引物组可互换。本领域技术人员了解组合所述引物来产生期望的产物，例如全长克隆或部分序列。基于本发明核酸分子或本发明方法中所用核酸分子的探针可用于检测编码相同或同源蛋白质的转录物或基因组序列。探针还可包含其上附着的标记基团，例如所述标记基团可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。这些探针可作为基因组标志物试剂盒的一部分，用于鉴定表达本发明多肽或本发明方法中所用多肽的细胞(例如通过测量细胞样品中编码核酸分子的水平(例如检测mRNA水平))，或者用于确定包含本发明多核苷酸序列或本发明方法中所用多核苷酸序列的基因组基因是否已突变或缺失。
[0165.1.1.1]本发明的核酸分子编码多肽或其部分，其包括与表II申请号1第5列和第7列中所示氨基酸序列充分同源的氨基酸序列，从而该蛋白质或其部分保持参与与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比提高对环境胁迫的耐受性和/或抗性提高和生物量生产的能力，特别是在所述植物中提高上文所述活性或实施例中所述活性。
[0166.1.1.1]本文使用的术语“充分同源”指蛋白质或其部分，其具有这样的氨基酸序列，其包含最少数目的与表II第5列和第7列中所示氨基酸序列相同或等同的氨基酸残基(例如与本发明多肽序列之一中的氨基酸残基具有相似侧链的氨基酸残基)，以使该蛋白质或其部分能参与与相应未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比提高对环境胁迫的耐受性和/或抗性并提高生物量产生。例如，具有表II第3列中所示和本文所述的蛋白质的活性。
[0167.1.1.1]在一个实施方案中，本发明的核酸分子包括编码本发明蛋白质的一部分的核酸。所述蛋白质与表II第5列和第7列中所示完整氨基酸序列具有至少约30％、35％、40％、45％或50％的同源性，优选至少约55％、60％、65％或70％，更优选至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％或94％，最优选至少约95％、97％、98％、99％或更高的同源性，并且具有上述活性，例如通过如在胞质溶胶或细胞器(如质体或线粒体或这两者，优选质体)中表达而赋予与相应例如未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下提高的产量。
[0168.1.1.1]本发明核酸分子编码的蛋白质的部分优选具有生物学活性，优选具有上文提及的注释活性，例如在提高活性后与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予对环境胁迫提高的耐受性和/或抗性和提高的生物量生产。
[0169.1.1.1]如此处提及，术语“生物学活性部分”旨在包括部分，例如结构域/基序，其与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予对环境胁迫提高的耐受性和/或抗性和提高的生物量生产，或具有免疫活性，使得其结合特异性结合本发明的多肽或用于本发明方法中的多肽的抗体，用于优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比提高产量。
[0170.1.1.1]本发明还涉及这样的核酸分子，其由于遗传密码的简并性而不同于表IA第5列和第8列中所示核苷酸序列之一(及其部分)，并因而编码本发明的多肽，特别是具有上述活性的多肽，例如表II第5列和第7列中所示序列表示的多肽或其功能同源物。有利地，本发明的核酸分子包含(或在另一些方案中具有)编码蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质包含(或在另一些实施方案中具有)表II第5列和第7列所示氨基酸序列或其功能同源物。在另一些实施方案中，本发明的核酸分子编码全长蛋白，其与表II第5列和第7列中所示氨基酸序列或功能同源物基本同源。然而，在一个优选的实施方案中，本发明的核酸分子不由表I(优选表IA第5列和第7列)中所示序列组成。
[0171.1.1.1]此外，本领域技术人员会理解，在种群中可能存在导致氨基酸序列改变的DNA序列多态性。编码本发明多肽或包含本发明核酸分子的基因中的这种遗传多态性可由于天然变异而在种群的个体中存在。
[0172.1.1.1]本文使用的术语“基因”和“重组基因”指这样的核酸分子，其包含编码本发明多肽的可读框，或者包含本发明的核酸分子，或者编码本发明方法中所用的多肽，优选来自作物植物或者来自可用于本发明方法的微生物。这些天然变异一般可导致基因的核苷酸序列中1至5％的变异。本发明范围中旨在包括编码本发明多肽或包含本发明核酸分子的基因中的任何及所有核苷酸变异及其引起的氨基酸多态性，这些变异由于天然变异而产生，并且不改变所述功能活性。
[0173.1.1.1]可以基于其与本文所述核酸分子的同源性，使用本发明核酸分子或其部分作为杂交探针，根据标准杂交技术在严格杂交条件下分离与本发明核酸分子同源之天然变体的相应核酸分子，其也可以是cDNA。
[0174.1.1.1]因此，在另一实施方案中，本发明的核酸分子长度至少为15、20、25或30个核苷酸。优选地，其在严格条件下与包含本发明核酸分子或本发明方法中所用核酸分子之核苷酸序列(例如包含表I第5列和第7列中所示序列)的核酸分子杂交。所述核酸分子的长度优选为至少20、30、50、100、250或更多个核苷酸。
[0175.1.1.1]上文定义了术语“在严格条件下杂交”。在一个实施方案中，术语“在严格条件下杂交”旨在描述这样的杂交和洗涤条件，在所述条件下彼此具有至少30％、40％、50％或65％同一性的核苷酸序列一般保持彼此杂交。优选地，该条件使得彼此具有至少约70％、更优选至少约75％或80％、甚至更优选至少约85％、90％或95％或更高同一性的序列一般保持彼此杂交。
[0176.1.1.1]优选地，在严格条件下与表I第5列和第7列中所示序列杂交的本发明核酸分子对应于本发明的天然核酸分子。本文使用的术语“天然”核酸分子指具有在自然界中存在的核苷酸序列(例如编码天然蛋白质)的RNA或DNA分子。优选地，该核酸分子编码具有上述活性的天然蛋白质，所述活性为例如在提高其表达或活性或者通过如在胞质溶胶或细胞器(如质体或线粒体或这两者，优选质体)中表达基因产物的核酸序列提高本发明蛋白质或本发明方法中所用蛋白质之活性后赋予赋予对环境胁迫提高的耐受性和/或抗性和提高的生物量生产。
[0177.1.1.1]除了本发明多肽或核酸分子以及本发明方法中所用多肽或核酸分子之序列的天然变体以外，本领域技术人员会认识到，可通过突变向编码本发明多肽或本发明方法中所用多肽的核酸分子的核苷酸序列中引入改变，从而导致编码所述多肽的氨基酸序列的改变，而不改变该多肽的功能能力，优选不降低所述活性。
[0178.1.1.1]例如，可以在本发明核酸分子或本发明方法中所用核酸分子(例如表I第5列和第7列中所示)的序列中产生导致在“非关键”氨基酸残基处发生氨基酸替换的核苷酸替换。
[0179.1.1.1]“非关键”氨基酸残基是在野生型序列中发生变化而不改变所述多肽之活性的残基，而“关键”氨基酸残基是上述活性(例如在提高该多肽的活性后导致与相应未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比对环境胁迫的耐受性和/或抗性提高和生物量产生提高)所需的氨基酸残基。然而，其他氨基酸残基(例如在具有所述活性的结构域中不保守或仅半保守的残基)可能不是活性所必需的，因此很可能适于进行改变而不改变所述活性。
[0180.1.1.1]此外，本领域技术人员了解，生物之间的密码子使用可能不同。因此，可以使本发明核酸分子中的密码子使用适用于表达所述多核苷酸或多肽的生物或细胞区室(例如质体或线粒体)中的使用。
[0181.1.1.1]因此，本发明涉及编码多肽的核酸分子，所述多肽通过如在胞质溶胶或细胞器(如质体或线粒体或这两者，优选质体)中表达而在生物或其部分中具有上述活性，并在所述活性的非关键氨基酸残基中含有改变。这些多肽在氨基酸序列上不同于表II第5列和第7列中所示序列中含有的序列，但仍保留本文所述活性。所述核酸分子可包含编码多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包含与表II第5列和第7列中所示氨基酸序列具有至少约50％同一性的氨基酸序列，并且能在通过如在胞质溶胶或细胞器(如质体或线粒体或这两者，优选质体)中表达而提高其活性(例如其表达)后参与(优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下)与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比提高产量。优选地，该核酸分子所编码的蛋白质与表II第5列和第7列中所示序列具有至少约60％的同一性，更优选与表II第5列和第7列中所示序列之一具有至少约70％的同一性，甚至更优选与表II第5列和第7列所示序列具有至少约80％、90％、95％的同源性，最优选与表II第5列和第7列中所示序列具有至少约96％、97％、98％或99％的同一性。
[0182.1.1.1]为了测定两氨基酸序列或两核酸分子之间的百分比同源性(＝同一性，本文中可互换使用)，将序列一个写在另一个下方用于最佳比较(例如，可以向蛋白质或核酸中插入缺口，以产生与另一蛋白质或另一核酸的最佳比对)。
[0183.1.1.1]接着比较相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核酸分子。如果一个序列中的位置被与另一序列中相应位置上相同的氨基酸残基或相同的核酸分子占据，则所述分子在此位置上是同源的(即，本文中使用的氨基酸或核酸“同源性”对应于氨基酸或核酸“同一性”)。两序列间的百分比同源性是所述序列间共有的相同位置数的函数(即，％同源性＝相同位置数/总位置数×100)。因此，术语“同源性”和“同一性”应认为是同义的。
[0184.1.1.1]为了确定两个或更多个氨基酸或者两个或更多个核苷酸序列之间的百分比同源性(＝同一性)，已经开发了若干计算机软件程序。两个或更多个序列的同一性可以使用例如fasta软件来计算，该软件目前使用的版本是fasta3(W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)，Improved Tools forBiological Sequence Comparison.PNAS 85：2444-2448；W.R.Pearson(1990)Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP andFASTA，Methods in Enzymology 183：63-98；W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)Improved Tools for Biological Sequence Comparison.PNAS85：2444-  2448；W.R.Pearson(1990)；Rapid and Sensitive SequenceComparison with FASTP and FASTAMethods in Enzymology 183：63-98)。另一种可用于计算不同序列间同源性的程序是标准blast程序，其包括在Biomax pedant软件中(Biomax，Munich，Federal Republic ofGermany)。遗憾的是，这有时产生非最优的结果，因为blast不总是包括主题和查询的完整序列。尽管如此，该程序非常高效，可用于比较大量序列。一般在这样的序列比较中使用以下设置：-p程序名[字符串]；-d数据库[字符串]；默认＝nr；-i检索文件[File In]；默认＝stdin；-e期望值(E)[实数]；默认＝10.0；-m  比对视图选项：0＝配对；1＝查询固定，显示名称；2＝查询固定，无名称；3＝平查询固定，显示名称；4＝平查询固定，无名称；5＝查询固定，无名称，平末端；6＝平查询固定，无名称，平末端；7＝XML Blast输出；8＝列表；9有注解行的表[整数]；默认＝0；-o BLAST报告输出文件[File Out]可选；默认＝stdout；-F过滤查询序列(DUST使用blastn，SEG使用其他)[字符串]；默认＝T；-G打开缺口的消耗(0调用默认行为)[整数]；默认＝0；-E  延伸缺口的消耗(0调用默认行为)[整数]；默认＝0；-X X缺口比对的降低值(比特)(0调用默认行为)；blastn 30，megablast 20，tblastx 0，其他均为15[整数]；默认＝0；-I Show GI′s indeflines[T/F]；默认＝F；-q核苷酸错配罚分(仅用于blastn)[整数]；默认＝-3；-r核苷酸匹配奖分(仅用于blastn)[整数]；默认＝1；-v对(V)显示一行描述的数据库序列数[整数]；默认＝500；-b对(B)显示比对的数据库序列数[整数]；默认＝250；-f延伸命中的阈值，0为默认；blastp 11，blastn 0，blastx 12，tblastn 13；tblastx 13，megablast 0[整数]；默认＝0；-g  进行缺口比对(tblastx不提供)[T/F]；默认＝T；-Q使用的查询遗传密码[整数]；默认＝1；-D  DB遗传密码(仅用于tblast[nx])[整数]；默认＝1；-a使用的处理器数[整数]；默认＝1；-O序列比对文件[File Out]可选；-J相信查询defline[T/F]；默认＝F；-M矩阵[字符串]；默认＝BLOSUM62；-W字号，0为默认(blastn 11，megablast 28，其他均为3)[整数]；默认＝0；-z数据库有效长度(实际大小使用0)[实数]；默认＝0；-K区域中保留的最佳命中数(默认关闭，如果使用则推荐值为100)[整数]；默认＝0；-P多个命中使用0，单个命中使用1[整数]；默认＝0；-Y检索空间有效长度(实际大小使用0)[实数]；默认＝0；-S针对数据库检索的查询链(用于blast[nx]和tblastx)；3为都是，1为上，2为下[整数]；默认＝3；-T产生HTML输出[T/F]；默认＝F；-l将数据库检索限制在GI列表[字符串]可选；-U使用FASTA序列的小写过滤[T/F]可选；默认＝F；-y  无缺口延伸的X降低值(比特)(0.0调用默认行为)；blastn 20，megablast 10，其他均为7[实数]；默认＝0.0；-Z最终缺口比对的X降低值(比特)(0.0调用默认行为)；blastn/megablast 50，tblastx 0，其他均为25[整数]；默认＝0；-R PSI-TBLASTN checkpoint file[File In]可选；-n MegaBlast search[T/F]；默认＝F；-L查询序列上的位置[字符串]可选；-A多重命中的窗口大小，0为默认(blastn/megablast 0，其他均为40[整数]；默认＝0；-w移码罚分(blastx使用OOF算法)[整数]；默认＝0；-ttblastn中用于连接HSP的最大允许内含子长度(0不进行连接)[整数]；默认＝0。
[0185.1.1.1]使用Needleman和Wunsch或者Smith或Waterman的算法得到了高质量的结果。因此，优选基于所述算法的程序。有利地，序列比较可以使用PileUp程序(J.Mol.Evolution.，25，351(1987)，Higgins等，CABIOS 5，151(1989))或优选使用“Gap”和“Needle”程序来进行，它们都基于Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.48；443(1970))，还有“BestFit”，它基于Smith和Waterman的算法(Adv.Appl.Math.2；482(1981))。“Gap”和“BestFit”是GCG软件包的一部分(Genetics ComputerGroup，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711(1991)；Altschul等，(Nucleic Acids Res.25，3389(1997))，“Needle”是The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite(EMBOSS)的一部分(Trends inGenetics 16(6)，276(2000))。因此，优选地，在完整序列范围内使用“Gap”或“Needle”程序进行用于确定序列同源性百分比的计算。对“Needle”使用以下标准调整用于核酸序列比较：矩阵：EDNAFULL，缺口罚分：10.0，延伸罚分：0.5。对“Gap”使用以下标准调整用于核酸序列比较：缺口权重：50，长度权重：3，评价匹配：10.000，评价错配：0.000。
[0186.1.1.1]例如，在核酸水平上与序列SEQ ID NO：63具有80％同源性的序列应理解为在以上述参数组通过上述程序“Needle”与序列SEQID NO：63比较后具有80％的同一性。
[0187.1.1.1]两多肽间的同源性应理解为完整序列长度上氨基酸序列的同一性，通过借助上述程序“Needle”进行比较来计算，其中使用矩阵：EBLOSUM62，缺口罚分：8.0，延伸罚分：2.0。
[0188.1.1.1]例如，在蛋白质水平上与序列SEQ ID NO：64具有80％同源性的序列应理解为在以上述参数通过上述程序“Needle”与序列SEQID NO：64比较后具有80％的同一性。
[0189.1.1.1]来自本发明表II第5列和第7列中所示的多肽之一的功能等同物通过替换、插入或缺失与本发明表II第5列和第7列中所示的多肽之一具有至少30％、35％、40％、45％或50％，优选至少55％、60％、65％或70％，优选至少80％，尤其优选至少85％或90％、91％、92％、93％或94％，非常尤其优选至少95％、97％、98％或99％的同源性，并因与表II第5列和第7列中所示的多肽具有基本相同的性质进行区分。
[0190.1.1.1]通过对根据本发明表I第5列和第7列中所示核酸序列进行替换、插入或缺失而产生的功能等同物与根据本发明表II第5列和第7列中所示多肽之一具有至少30％、35％、40％、45％或50％，优选至少55％、60％、65％或70％，优选至少80％，特别优选至少85％或90％、91％、92％、93％或94％，非常特别优选至少95％、97％、98％或99％的同源性，并且编码与表II第5列和第7列中所示多肽具有基本相同特性的多肽。
[0191.1.1.1]功能等同物的“基本相同的特性”首先应理解为指该功能等同物具有上述活性，例如在胞质溶胶或细胞器(如质体或线粒体或这两者，优选质体)中表达而提高所述功能等同物在生物(如微生物、植物或植物组织或动物组织、植物或动物细胞或其部分)中的蛋白量、活性或功能。
[0192.1.1.1]可以这样产生编码表II第5列和第7列之蛋白质序列的同源物的核酸分子：向本发明核酸分子(特别是表I第5列和第7列)的核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸替换、添加或缺失，以使所编码蛋白质中引入一个或多个氨基酸替换、添加或缺失。可以通过标准技术(如定点诱变和PCR介导的诱变)向表I第5列和第7列的编码序列中引入突变。
[0193.1.1.1]优选地，在一个或多个预测的非关键氨基酸残基处产生保守性氨基酸替换。“保守性氨基酸替换”是这样的氨基酸替换，其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换。具有相似测量的氨基酸残基家族已在本领域中定义。这些家族包括带有以下侧链的氨基酸：碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
[0194.1.1.1]因此，本发明多肽或本发明方法所用多肽中预测的非关键氨基酸残基优选被来自同一家族的另一氨基酸残基替换，或者，在另一实施方案中，可在本发明核酸分子或本发明方法所用核酸分子的编码序列的全部或部分中随机引入突变，例如通过饱和诱变引入，并可在所得突变体中筛选本文所述活性，以鉴定保留或甚至提高上述活性(例如优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量)的突变体。
[0195.1.1.1]在诱变本文所示序列之一后，可以重组表达所编码的蛋白质并可使用如本文所述的测定(见实施例)来测定蛋白质的活性。
[0196.1.1.1]通过Gap检索在以下数据库条目中发现本发明方法所用核酸分子的最高同源性。
[0197.1.1.1]具有表I第5列和第7列中所示序列的所用核酸序列的同源物还包括等位基因变体，其与所示核苷酸序列之一或上述衍生的核酸序列或其同源物、衍生物或类似物或其部分具有至少约30％、35％、40％或45％，优选至少约50％、60％或70％，更优选至少约90％、91％、92％、93％、94％或95％，甚至更优选至少96％、97％、98％或99％的同源性。特别地，等位基因变体包括功能变体，其可通过在所示序列(优选表I第5列和第7列中所示或衍生的核酸序列)中缺失、插入或替换核苷酸来获得，然而，其目的是所合成的蛋白质的酶活性或生物活性有利地被保留或提高。
[0198.1.1.1]在本发明的一个实施方案中，本发明的核酸分子或本发明方法所用核酸分子包含表I第5列和第7列任何中所示序列。优选地，该核酸分子包含尽可能少的在表I第5列和第7列任一中未显示的其他核苷酸。在一个实施方案中，所述核酸分子包含少于500、400、300、200、100、90、80、70、60、50或40个其他核苷酸。在另一实施方案中，所述核酸分子包含少于30、20或10个其他核苷酸。在一个实施方案中，本发明方法所用的所述核酸分子与表I第5列和第7列中所示序列相同。
[0199.1.1.1]还优选本发明方法所用核酸分子编码包含表II第5列和第7列中所示序列的多肽。在一个实施方案中，所述核酸分子编码少于150、130、100、80、60、50、40或30个其他氨基酸。在另一实施方案中，所编码的多肽包含少于20、15、10、9、8、7、6或5个其他氨基酸。在用于本发明方法的一个实施方案中，所编码的多肽与表II第5列和第7列中所示序列相同。
[0200.1.1.1]在一个实施方案中，本发明的核酸分子或者本发明方法中所用核酸分子编码包含表II第5列和第7列中所示序列的多肽，并包含少于100个其他核苷酸。在另一实施方案中，所述核酸分子包含少于30个其他核苷酸。在一个实施方案中，本发明方法中所用核酸分子与表I第5列和第7列中所示序列的编码序列相同。
[0201.1.1.1]仍具有本发明多肽的赋予与相应未转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比提高的产量(优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下)之必要生物活性或酶活性(即，其活性基本未降低)的多肽(＝蛋白质)的多肽是具有野生型生物活性或酶活性的至少10％或20％、优选30％或40％、特别优选50％或60％、非常特别优选80％或90或更高的多肽，有利地，该活性与在相同条件下表达的表II第5列和第7列中所示多肽之活性相比基本未降低。
[0202.1.1.1]表I第5列和第7列的同源物或者表II第5列和第7列中所示衍生序列的同源物还指编码和非编码DNA序列的截短序列、cDNA、单链DNA或RNA。所述序列的同源物还应理解为指衍生物，其包含非编码区，例如UTR、终止子、增强子或启动子变体。所述核苷酸序列上游的启动子可通过一个或多个核苷酸替换、插入和/或缺失进行修饰，但却不干扰该启动子、可读框(＝ORF)或远离ORF的3’调节区(如终止子或其他3’调节区)的功能或活性。还可以如下提高启动子的活性：修饰其序列，或者将其完全替换为活性更高的启动子，甚至来自异源生物的启动子。合适的启动子为本领域技术人员已知，并在下文提及。
[0203.1.1.1]除了上述编码YSRP的核酸分子以外，本发明的另一方面涉及对选自根据表I第5列和/或第7列(优选第7列)的核酸分子之活性的负调节物。认为其反义多核苷酸抑制这些负调节物的下调活性，这是通过与靶标多核苷酸特异性结合以及干扰靶标多核苷酸的转录、剪接、转运、翻译和/或稳定性来实现的。本领域中描述了用于将反义多核苷酸靶向至染色体DNA、初级RNA转录物或经加工mRNA的方法。优选地，靶标区包括剪接位点、翻译起始密码子、翻译终止密码子和可读框中的其他序列。
[0204.1.1.1]就本发明目的而言，术语“反义”指这样的核酸，其包括多核苷酸，上述多核苷酸与基因、原始转录物或经加工mRNA的全部或部分充分互补，从而干扰内源基因的表达。“互补”多核苷酸是能根据标准Watson-Crick互补原则碱基配对的多核苷酸。具体而言，嘌呤与嘧啶碱基配对，形成鸟嘌呤与胞嘧啶配对(G:C)和腺嘌呤与胸腺嘧啶(A:T)(DNA的情况)或者腺嘌呤与尿嘧啶(A:U)(RNA的情况)的组合。应该理解，两个多核苷酸即便不彼此完全互补也能彼此杂交，只要各自具有彼此基本互补的至少一个区域即可。术语“反义核酸”包括单链RNA以及能转录产生反义RNA的双链DNA表达盒。“活性”反义核酸是能与核酸分子活性的负调节物选择性杂交的反义RNA分子，所述核酸分子编码与选自根据表II第5列和/或第7列(优选第7列)的多肽具有至少80％序列同一性的多肽。
反义核酸可以与完整的负调节物链互补，或者仅与其一部分互补。在一个实施方案中，反义核酸分子与编码YSRP的核苷酸序列的编码链中的“非编码区”反义。术语“非编码区”指编码区侧翼不翻译成氨基酸的5’和3’序列(即，也称为5’和3’非翻译区)。反义核酸分子可以仅与YSRP mRNA的非编码区的一部分互补。例如，反义寡核苷酸可以与YSRP mRNA翻译起始位点周围的区域互补。例如，反义寡核苷酸的长度可以为约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸。本发明的反义分子一般包含与表I的核酸之一的非编码区中至少14个连续核苷酸具有60-100％序列同一性的RNA。优选地，所述序列同一性将为至少70％，更优选至少75％、80％、85％、90％、95％、98％，最优选99％。
可以使用本领域已知的方法，使用化学合成和酶连接反应来构建本发明的反义核酸。例如，反义核酸(例如反义寡核苷酸)可以使用天然核苷酸或多种修饰核苷酸来化学合成，所述修饰核苷酸设计用于提高分子的生物稳定性或提高反义与有义核酸之间所形成双链体的物理稳定性，例如，可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用于产生反义核酸的修饰核苷酸的实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)-尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基queosine、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基queosine、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)-尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。或者，可以使用已经将核酸以反义方向亚克隆(即，从所插入核酸转录的RNA将为目的靶核酸的反义取向，以下章节中进一步描述)的表达载体通过生物方法产生反义核酸。
[0205.1.1.1]在另一实施方案中，本发明的反义核酸分子是α-端基异构核酸分子。α-端基异构效应核酸分子与互补RNA形成特定的双链杂交体，其中与通常的b单元相反，链彼此平行排列(Gaultier等，1987，NucleicAcids.Res.15：6625-6641)。反义核酸分子还可包含2’-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等，1987，Nucleic Acids Res.15：6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等，1987，FEBS Lett.215：327-330)。
[0206.1.1.1]本发明的反义核酸分子一般对细胞施用或者原位产生，以使其与细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或结合。杂交可通过常规核苷酸互补性进行，以形成稳定双链体，或者例如对于与DNA双链体结合的反义核酸分子的情况，通过双螺旋大沟中的特异性相互作用进行。可以修饰反义分子，以使其特异性结合选定细胞表面上表达的受体或抗原，例如将该反义核酸分子与结合细胞表面受体或抗原的肽或抗体连接在一起。也可以使用本文所述载体将反义核酸分子递送至细胞中。为了实现足够的反义分子胞内浓度，优选其中将反义核酸分子置于强原核、病毒或真核(包括植物)启动子控制之下的载体构建体。
[0207.1.1.1]作为反义多核苷酸的备选，可以使用核酶、有义多核苷酸或双链RNA(dsRNA)以减少YSRP多肽的表达。“核酶”意指具有核糖核酸酶活性的基于催化性RNA的酶，其能够切割与之具有互补区域的单链核酸如mRNA。可以使用核酶(例如Haselhoff和Gerlach，Nature 334，585(1988)所述的锤头状核酶)以催化性切割YSRP mRNA转录物以便因此抑制YSRP mRNA的翻译。对编码YSRP的核酸呈特异性的核酶可以基于如本文中所公开的YSRP cDNA的核苷酸序列或基于根据本发明中已教授的方法而分离的异源序列设计。例如，可以构建四膜虫(Tetrahymena)L-19IVS RNA的衍生物，在其中活性位点的核苷酸序列与编码YSRP的mRNA中待受到切割的核苷酸序列互补。参见例如Cech等的美国专利号4,987,071和5,116,742。备选地，可以使用NUERP mRNA以在RNA分子库内选择具有特异性核糖核酸酶活性的催化性RNA。参阅如Bartel，D.和Szostak，J.W.，1993，Science 261：1411-1418。在优选的实施方案中，核酶将含有具备至少7、8、9、10、12、14、16、18或20个核苷酸并且更优选地7或8个核苷酸的与靶RNA的部分具有100％互补性的部分。用于产生核酶的方法对本领域技术人员为已知。例如参见美国专利号6,025,167；5,773,260和5,496,698。
本文使用的术语“dsRNA”指包含两个RNA链的RNA杂交体。dsRNA的结构可以是线性或环状的。在一个优选的实施方案中，dsRNA对多核苷酸具有特异性，所述多核苷酸编码根据表II的多肽，或者编码与根据表II的多肽具有至少70％序列同一性的多肽。杂交的RNA可以是基本互补或完全互补。“基本互补”意指当使用如上所述的BLAST程序优化比对两种杂交的RNA时，杂交的部分至少95％互补。优选地，dsRNA的长度将是至少100个碱基对。一般地，杂交的RNA长度相同，没有突出的5′或3′端并且没有缺口。然而，达100个核苷酸的具有5′或3′突出端的dsRNA可以用于本发明的方法中。
dsRNA可以包含核糖核苷酸或核糖核苷酸类似物如2′-O-甲基核糖基或其组合。例如，参见美国专利号4,130,641和4,024,222。dsRNA聚核糖次黄苷酸：聚核糖胞苷酸在美国专利4,283,393中描述。用于产生和使用dsRNA的方法在本领域已知。一个方法包括在体内或在体外单个反应混合物内同时转录两条互补的DNA链。例如，参见美国专利号5,795,715。在一个实施方案中，dsRNA可以通过标准技术直接导入植物或植物细胞。或者，dsRNA可以在植物细胞中通过转录两种互补的RNA得到表达。
[0208.1.1.1]用于抑制内源基因表达的其他方法如三螺旋形成(Moser等，1987，Science 238：645-650和Cooney等，1988，Science 241：456-459)和共抑制(Napoli等，1990，The Plant Cell 2：279-289)为本领域已知。已经将部分或全长的cDNA用于共抑制内源植物基因。参阅如美国专利号4,801,340、5,034,323、5,231,020和5,283,184；Van der Kroll等，1990，The Plant Cell2：291-299；Smith等，1990，Mol.Gen.Genetics 224：477-481和Napoli等，1990，The Plant Cell 2：279-289。
对于有义抑制，认为导入有义多核苷酸封闭相应靶基因的转录。有义多核苷酸具有与靶植物基因或靶RNA至少65％的序列同一性。优选地，同一性百分数是至少80％、90％、95％或更高。导入的有义多核苷酸不必在全长上与靶基因或转录物相关。优选地，有义多核苷酸与表I所示核酸之一的至少100个连续核苷酸具有至少65％的序列同一性。同一性的区域可以包含内含子和/或外显子和非翻译区域。导入的有义多核苷酸可以短暂存在于植物细胞中，或可以稳定整合至植物染色体或染色体外复制子。
[0209.1.1.1]此外，本发明的目标是包含核酸分子的表达载体，所述核酸分子包含选自以下的核酸分子：
a)编码表II第5或7列中所示多肽的核酸分子；
b)在表I第5或7列中所示的核酸分子；
c)核酸分子，因为遗传密码的简并性，其可来自表II第5列或第7列中所述多肽序列并优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量，例如增加的产量相关性状，例如对非生物环境胁迫的增强的耐受性，例如提高的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或提高的营养利用效率、固有产量和/或另一提及的产量相关性状；
d)核酸分子，其与多核苷酸的核酸分子序列(其包含表I第5列或第7列中显示的核酸分子)具有至少30％的同一性，并优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量，例如增加的产量相关性状，例如对非生物环境胁迫的增强的耐受性，例如提高的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或提高的营养利用效率、固有产量和/或另一提及的产量相关性状；
e)核酸分子，其编码与(a)到(c)的核酸分子编码的多肽的氨基酸序列具有至少30％同一性并具有包含表I第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性，并优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量，例如增加的产量相关性状，例如对非生物环境胁迫的增强的耐受性，例如提高的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或提高的营养利用效率、固有产量和/或另一提及的产量相关性状；
f)核酸分子，其在严格杂交条件下与(a)到(c)的核酸分子杂交，并优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量，例如增加的产量相关性状，例如对非生物环境胁迫的增强的耐受性，例如提高的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或提高的营养利用效率、固有产量和/或另一提及的产量相关性状；
g)核酸分子，其编码可在制备的针对(a)到(e)的核酸分子之一编码的多肽的单克隆或多克隆抗体帮助下分离的多肽，并具有包含表I第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性；
h)核酸分子，其编码包含如表IV第7列中所示共有序列或一个或更多多肽基序的多肽，并优选具有包含表II或IV第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性；
i)核酸分子，其编码具有如表II第5列中所述蛋白质代表活性的多肽，并优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量，例如增加的产量相关性状，例如对非生物环境胁迫的增强的耐受性，例如提高的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或提高的营养利用效率、固有产量和/或另一提及的产量相关性状；
j)核酸分子，其包含使用表III第7列中的引物通过扩增cDNA文库或基因组文库获得的多核苷酸并优选具有包含如表II或IV第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性，所述引物不以核苷酸ATA在其5’末端开始；
和
k)核酸分子，其通过在严格杂交条件下利用包含(a)或(b)核酸分子的互补序列的探针或其片段筛选合适的核酸文库获得，所述探针或其片段具有与(a)到(e)中表征的核酸分子序列互补的核酸分子的至少15nt，优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt，并且所述核酸分子编码具有包含如表II第5列中所述多肽的蛋白质代表的活性的多肽；
由此，(a)到(k)的核酸分子至少在一个或更多核苷酸中不同于表IA第5列或第7列中所述的序列，并且其优选编码至少在一个或更多氨基酸中不同于表IIA第5列或第7列中所述的蛋白质序列的蛋白质。
[0210.1.1.1]本发明还提供分离的重组表达载体，其包含如上述的胁迫相关蛋白质编码核酸，其中该载体或胁迫相关蛋白质编码核酸分别在宿主细胞中的表达导致与宿主细胞的相应未转化的野生型相比增强的对环境胁迫的耐受性和/或抗性。如本文中所用，术语“载体”指能够转运与之连接的另一种核酸分子的核酸分子。一个类型的载体实例是“质粒”，其指向其中可以连接额外DNA节段的环状双链DNA环。另一类型的载体是病毒载体，其中可以将额外DNA节段连接至病毒的基因组内。其它类型的载可以是线性化的核酸序列，如转座子，其是可以拷贝并自我插入的DNA片段。存在两种类型的已知转座子：称作插入序列的简单转座子以及组合转座子，其可以具有数种基因以及为转座所需要的基因。
某些载体能够在导入这些载体的宿主细胞内自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(非附加型哺乳动物载体)在导入宿主细胞后整合至宿主细胞基因组，并且因此随宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与它们有效连接的基因表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。通常，用于DNA重组技术的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。然而，本发明意图包含表达载体的其它形式，如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)，其发挥等效功能。
[0211.1.1.1]植物表达盒优选地包含调节序列，此类调节序列能够在植物细胞中驱动基因表达并有效地连接以至每一序列可以充分实现它的功能，如通过聚腺苷酸化信号终止转录。优选的聚腺苷酸化信号不但是源自根瘤农杆菌t-DNA如Ti质粒pTiACH5(Gielen等，1984，EMBO J.3：835)中称作章鱼碱合酶的基因3或其功能等同物的那些聚腺苷酸化信号，而且在植物中呈功能活性的所有其它终止子也适合。
由于植物基因表达并不总是在翻译水平受限，因此植物表达盒优选地含有有效连接的其它序列，如转录增强子，如含有来自烟草花叶病毒的5’非翻译前导序列的增强每RNA对多肽比率的超驱动序列(GaINe等，1987，Nucl.Acids Research 15：8693-8711)。
[0212.1.1.1]植物基因表达必须有效地连接至赋予基因以时间、细胞或组织特异性方式表达的适宜启动子。优选的启动子是驱动组成型表达的启动子(Benfey等，1989 EMBO J.8：2195-2202)，如那些衍生自植物病毒如35S CaMV(Franck等，1980 Cell 21：285-294)、19S CaMV(也参阅美国专利号5352605和PCT申请号WO 8402913)的启动子，或植物启动子，如那些在美国专利号4,962,028中所述来自Rubisco小亚基的启动子。
[0213.1.1.1]额外有利的调节序列例如包含在植物启动子如CaMV/35S[Franck等，Cell 21(1980)285-294]、PRP1[Ward等，Plant.Mol.Biol.22(1993)]、SSU、OCS、Iib4、usp、STLS1、B33、LEB4、nos中或者包含在泛蛋白、油菜籽蛋白或菜豆蛋白启动子内。诱导型启动子在本上下文中也有利，如在EP-A-O 388 186(苯磺酰胺诱导型)、Plant J.2，1992：397-404(Gatz等，四环素诱导型)、EP-A-0 335 528(脱落酸诱导型)或WO 93/21334(乙醇或环己酮诱导型)中描述的启动子。额外有利的植物启动子是马铃薯的胞质溶胶FBP酶启动子或马铃薯的ST-LSI启动子(Stockhaus等，EMBO J.8，1989，2445)、大豆的磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶启动子(还参见Genebank登录号U87999)或如EP-A-O 249 676中所述节特异性启动子。额外特别有利的启动子是可以用于单子叶植物或双子叶植物并且在US 5,608,152(来自欧洲油菜的油菜籽蛋白启动子)、WO98/45461(来自拟南芥菜属的油质蛋白启动子)、US 5,504,200(来自菜豆的菜豆蛋白启动子)、WO 91/13980(来自芥属的Bce4启动子)和Baeumlein等，Plant J.，2，2，1992：233-239(来自豆科植物的LEB4启动子)中描述的种子特异性启动子。所述启动子用于双子叶植物中。如下启动子用于例如单子叶植物：来自大麦中Ipt2或Ipt1启动子(WO 95/15389和WO 95/23230)或来自大麦的大麦醇溶蛋白启动子。其它有用的启动子在WO99/16890中描述。
原则上，可以使用具有其调节序列的所有天然启动子，如以上提及的用于新方法的那些天然启动子。除此之外，还可能并且可以有利地使用合成性启动子。
[0214.1.1.1]基因构建体还可含有待插入生物中并例如参与胁迫抗性和生物量生产提高的其他基因。在宿主生物中插入并表达调节基因是可能的并且是有利的，例如编码诱导物、阻遏物或通过其酶活性干预调节作用的酶的基因，或者生物合成途径中一种或多种或全部酶的基因。这些基因在来源上可以是异源或同源的。插入的基因可以具有它们自己的启动子或处于如与表I核酸序列或其同源物的相同启动子控制下。
为了表达存在的其它基因，基因构建体有利地包含根据已选择的宿主生物和基因选择用于最佳表达的3′和/或5′末端调节序列以增强表达。
[0215.1.1.1]这些调节序列用于使如上所述的基因特异性表达和蛋白质表达成为可能。根据宿主生物，这可以意指例如仅在诱导后基因才得以表达或过量表达或基因立即得以表达和/或过量表达。
调节序列或因子还可以优选地有益影响导入的基因的表达并且因此提高表达。有可能通过使用强转录信号，如启动子和/或增强子以这种方式有利地在转录水平增强调节元件。然而，除此此外，还有可能例如通过改善mRNA的稳定性增强翻译。
[0216.1.1.1]优选用于植物基因表达盒的其它序列是指导基因产物进入适宜细胞区室所需要的靶向序列(综述参阅Kermode，1996 Crit.Rev.Plant Sci.15(4)：285-423及其参考文献)，如进入液泡、细胞核、所有类型的质粒如淀粉体、叶绿体、细胞外空间、线粒体、色质体、内质网、油体、过氧化物酶体和植物细胞的其它区室。
植物基因表达还可以通过诱导型启动子进行促进(综述参阅Gatz，1997Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.48：89-108)。当基因表达需要以时间特异性方式发生时，化学诱导型启动子特别合适。
[0217.1.1.1]表VI列出了可用于调节胁迫相关蛋白质的核酸编码序列的转录的一些启动子实例。
表VI：植物中组织特异性和胁迫诱导型启动子的实例
Figure BDA0000055835940001491
[0218.1.1.1]其他启动子例如超级启动子(Ni等，Plant Journal 7，1995：661-676)、泛蛋白启动子(Callis等，J.Biol.Chem.，1990，265：12486-12493；US 5,510,474；US 6,020,190；Kawalleck等，Plant.Molecular Biology，1993，21：673-684)或34S启动子(GenBank登记号M59930和X16673)可类似地用于本发明，并为本领域技术人员已知。
发育阶段优选的启动子在发育的某个阶段优先受到表达。组织和器官优选的启动子包括在特定组织或器官如叶、根、种子或木质部中优先受到表达的那些启动子。组织优选的启动子包括但不限于果实优选的、胚珠优选的、雄性组织优选的、种子优选的、珠被优选的、块茎优选的、柄优选的、果皮优选的和叶优选的、柱头优选的、花粉优选的、花药优选的、花瓣优选的、萼片优选的、花梗优选的、长角果优选的、茎优选的、根优选的启动子等。种子优选的启动子在种子繁育和/或萌发期间优先受到表达。例如，种子优选地启动子可以是胚优选的、胚乳优选和种衣优选的启动子。参阅Thompson等，1989，BioEssays 10：108。种子优选的启动子实例包括但不限于纤维素合成酶(celA)、Cim1、γ-玉米醇溶蛋白、球蛋白-1、玉米19kD玉米醇溶蛋白(cZ19B1)等。
其它在本发明表达盒中有用的启动子包括但不限于主要叶绿素a/b结合蛋白启动子、组蛋白启动子、Ap3启动子、β-伴大豆球蛋白启动子、油菜籽蛋白启动子，大豆凝集素启动子、玉米15kD玉米醇溶蛋白启动子、22kD玉米醇溶蛋白启动子、27kD玉米醇溶蛋白启动子、g-玉米醇溶蛋白启动子、蜡质、萎缩1、萎缩2和青铜色启动子、Zm13启动子(美国专利号5,086,169)、玉米多聚半乳糖醛酸酶启动子(PG)(美国专利号5,412,085和5,545,546)和SGB6启动子(美国专利号5,470,359)以及合成性或其它的天然启动子。
[0219.1.1.1]在植物中控制异源基因表达的额外灵活性可以通过使用来自异源的DNA结合结构域和反应元件(即来自非植物的DNA结合结构域)达到。异源DNA结合结构域的实例是LexA DNA结合结构域(Brent和Ptashne，1985，Cell 43：729-736)。
[0220.1.1.1]本发明还提供包含以反义方向克隆至该表达载体的本发明YSRP DNA分子的重组表达载体。即DNA分子以如此方式有效连接至调节序列，该方式允许(通过DNA分子转录)与YSRP mRNA呈反义的RNA分子表达。可以选择有效地连接至以反义方向克隆的核酸分子的调节序列，其指导反义RNA分子在多种细胞类型中连续表达。例如，可以选择指导反义RNA组成型、组织特异性或细胞类型特异性表达的病毒启动子和/或增强子，或调节序列。反义表达载体可以是重组质粒、噬菌粒或减毒病毒的形式，在其中反义核酸在高效调节区域的控制下产生。调节区域的活性可以通过向其中导入载体的细胞类型加以测定。对于使用反义基因调节基因表达的讨论，参阅Weintraub，H.等，1986，Antisense RNA as a moleculartool for genetic analysis，综述-Trends in Genetics，第1卷(1)，和Mol等，1990，FEBS Letters 268：427-430。
[0221.1.1.1]本发明的另一方面涉及分离的YSRP、及其生物活性部分。“分离的”或“纯化的”多肽或其生物活性部分在通过重组DNA技术产生时基本不含某些细胞性材料，或在通过化学合成时基本不含化学前体或其它化学品。词组“基本不含细胞性材料”包括这样的YSRP制品，在所述YSRP制品中该多肽与从其中天然或重组地产生此多肽的细胞的某些细胞组分分开。在一个实施方案中，词组“基本不含细胞材料”包括这样的YSRP制品，其具有少于大约30％(干重)的非YSRP材料(本文中也称作“杂质多肽”)、优选地少于大约20％的非YSRP材料、仍更优选地少于大约10％的非YSRP材料并且最优选地少于大约5％的非YSRP材料。
[0222.1.1.1]当重组产生YSRP或其生物学活性部分时，它还优选地基本不含培养基，即培养基占蛋白质制品的体积少于大约20％、更优选地少于大约10％并且最优选地少于大约5％。词组“基本不含化学前体或其它化学品”包括YSRP制品，在其中该多肽与参与合成此多肽的化学前体或其它化学品分开。词组“基本不含化学前体或其它化学品”包括YSRP制品，其具有少于大约30％(干重)的化学性前体或非YSRP化学品、更优选地少于大约20％的化学性前体或非YSRP化学品、仍更优选地少于大约10％的化学性前体或非YSRP化学品并且最优选地少于大约5％的化学性前体或非YSRP化学品。在优选的实施方案中，分离的多肽或其生物活性部分没有来自在其中衍生YSRP的同一生物的杂质多肽。这样的多肽一般通过重组表达来产生，例如酿酒酵母、大肠杆菌或欧洲油菜、大豆、玉米或水稻的YSRP在在除了酿酒酵母、大肠杆菌的植物或微生物，如谷氨酸棒杆菌、藻类或真菌中产生。
[0223.1.1.1]本文所述的核酸分子、多肽、多肽同源物、融合多肽、引物、载体和宿主细胞可用于一种或多种以下方法：鉴定酿酒酵母、大肠杆菌或欧洲油菜、大豆、玉米或水稻及相关生物；对酿酒酵母、大肠杆菌相关生物的基因组进行作图；鉴定和定位酿酒酵母、大肠杆菌或欧洲油菜、大豆、玉米或水稻的目的序列；进化研究；确定功能所需的YSRP区；调节YSRP活性；调节一个或多个细胞功能的代谢；调节一种或多种化合物的跨膜转运；调节胁迫抗性；以及调节YSRP核酸的表达。
[0224.1.1.1]本发明的YSRP核酸分子还用于进化和多肽结构研究。本发明分子所参与的代谢过程和转运过程由种类广泛的原核细胞和真核细胞所利用；通过将本发明核酸分子的序列与来自其它生物的编码类似酶的核酸分子的序列比较，可以评估生物的进化相关性。类似地，此类比较研究允许评估序列的哪些区域保守而哪些区域不保守，这可能有助于确定多肽的哪个区域对酶的功能关键。这种类型的确定对于多肽工程研究极有意义并且可以提供多肽可以耐受何种诱变而不丧失功能的线索。
[0225.1.1.1]对本发明YSRP核酸分子的操作可导致产生与野生型YSRP有功能差异的YSRP。这些多肽可具有提高的效率或活性，可以比通常更高的数量存在于细胞中，或者可以具有降低的效率或活性。
有许多本发明的YSRP改变直接影响胁迫应答和/或胁迫耐受性的机制。在植物表达YSRP的情况下，增强的转运可导致在植物组织和器官中改善的盐和/或溶质分配。通过增加从细胞输出离子分子的转运蛋白分子的数量或活性，可以影响细胞的盐和寒冷耐受性。
[0226.1.1.1]可以如下评估植物中的遗传修饰对胁迫耐受性的影响：在比合适更差的条件下培养修饰的植物，接着分析该植物的生长特征和/或代谢。此类分析技术对本领域技术人员而言众所周知，并且包括干重、湿重、多肽合成、糖合成、脂类合成、蒸发蒸腾速率、整体的植物和/或作物产量、开花、繁殖、结种、根生长、呼吸速率、光合作用速率等(Applications ofHPLC in Biochemistry in：Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology，第17卷；Rehm等，1993，Biotechnology，第3卷，第III章：Product recovery and purification，469-714页，VCH：Weinheim；Belter等，1988，Bioseparations：downstream processing for biotechnology，John Wiley和Sons；Kennedy和Cabral，1992，Recovery processes forbiological materials，John Wiley和Sons；Shaeiwitz和Henry，1988，Biochemical separations，in：Ulmann’s Encyclopedia of IndustrialChemistry，第B3卷，第11章，1-27页，VCH：Weinheim；和Dechow，1989，Separation and purification techniques in biotechnology，NoyesPublications)。
例如，可以使用标准方法构建包含本文所述核酸或其片段的酵母表达载体并转化进酿酒酵母中。接着对所得转基因细胞测定对干旱、盐和冷胁迫的耐受性的丧失或改变。类似地，可以使用标准方法构建包含本文所述核酸或其片段的植物表达载体并转化进适当的植物细胞中，例如拟南芥、大豆、油菜、玉米、棉花、稻、小麦、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)等。接着对所得转基因细胞和/或由其产生的植物测定对干旱、盐、冷胁迫的耐受性的丧失或改变。
[0227.1.1.1]对根据表I并编码本发明表II的YSRP的一个或多个基因进行的改造还可产生改变了活性的YSRP，其间接影响藻类、植物、纤毛虫、真菌或其它微生物如谷氨酸棒杆菌的的胁迫应答和/或胁迫耐受性。
[0228.1.1.1]此外，本文所述序列或其片段可用于在多种生物(如细菌、哺乳动物细胞、酵母细胞和植物细胞)的基因组中产生敲除突变(Girke，1998，The Plant Journal 15：39-48)。然后可评估所得敲除细胞耐受多种胁迫条件的能力、其对多种胁迫条件的应答和对突变表型和/或基因型的影响。基因失活的其他方法参阅美国专利号6,004,804“Non-ChimericMutational Vectors”和Puttaraju等，1999，Spliceosome-mediated RNAtrans-splicing as a tool for gene therapy，Nature Biotechnology 17：246-252。
导致胁迫耐受性提高的上述用于YSRP的诱变策略并不意在限制，这些策略的修改对于本领域技术人员来说是很明显的。使用这些策略并结合本文公开的机制，本发明的核酸及多肽分子可用于产生表达突变的YSRP核酸及多肽分子从而提高胁迫耐受性的藻类、纤毛虫、植物、真菌或其它微生物如谷氨酸棒杆菌。
[0228.2.1.1]本发明还提供特异性结合至如由本文中所述的核酸编码的YSRP或其部分的抗体。抗体可以通过众多众所周知的方法产生(参见例如Harlow和Lane，“Antibodies；A Laboratory Manual”，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，(1988))。简而言之，可以将纯化的抗原以足以激发免疫反应的量和间隔期注射至动物。可以直接纯化抗体，或可以自该动物获得脾脏细胞。随后将此细胞与永生细胞系融合并对抗体分泌进行筛选。抗体可用于对核酸克隆文库筛选针分泌抗原的细胞。随后可以将那些阳性克隆测序。参阅如Kelly等，1992，Bio/Technology 10：163-167；Bebbington等，1992，Bio/Technology 10：169-175。
短语与多肽“选择性结合”和“特异性结合”指可确定多肽在异源多肽群体和其它生物中存在的结合反应。因此，在指定的免疫分析条件下，结合至特定多肽的指定抗体不以显著量结合至样品中存在的其它多肽。抗体在如此条件下的选择性结合可能需要因其对特定多肽的特异性而选择的抗体。多种免疫方法可以用于选择与特定多肽选择性结合的抗体。例如固相ELISA免疫分析常规地用于选择与多肽发生选择性免疫反应的抗体。对于可以用于测定选择性结合的免疫方法和条件的描述，参见Harlow和Lane，“Antibodies，A Laboratory Manual，”Cold Spring Harbor Publications，New York，(1988)。
在某些情况下，需要制备来自多种宿主的单克隆抗体。用于制备此类单克隆抗体的技术的描述可以在Stites等编辑，“Basic和ClinicalImmunology，”(Lange Medical Publications，Los Altos，Calif.，第五版和及其中引用的参考文献，和在Harlow和Lane，“Antibodies，A LaboratoryManual，”Cold Spring Harbor Publications，New York，(1988)中找到。
[0229.1.1.1]植物中的基因表达受蛋白质转录因子与基因调节区域内特定核苷酸序列相互作用的调节。转录因子的一个实例是含有锌指(ZF)基序的多肽。每一ZF模块的长度是大约30个氨基酸，在锌离子周围折叠。ZF蛋白质的DNA识别结构域是插入DNA双螺旋大沟内的α-螺旋结构。模块含有结合至DNA的三个氨基酸，每一氨基酸接触靶DNA序列中的单个碱基对。ZF基序以模块重复方式排列以形成一套识别连续DNA序列的指。例如，三指ZF基序将识别DNA的9个bp。已证实数百个蛋白质含有ZF基序，每一蛋白质中有2至37个ZF模块(Isalan M，等，1998Biochemistry 37(35)：12026-33；Moore M，等，2001 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98(4)：1432-1436和1437-1441；美国专利US 6007988和US 6013453)。
植物基因的调节区域含有众多起到识别包括ZF蛋白在内的转录因子的短DNA序列(顺式作用元件)。不同基因中类似的识别结构域允许通过常见转录因子在代谢途径中协同表达数个编码酶的基因。基因家族成员的识别结构域中的变化有利于同一基因家族内部在基因表达的差异，例如在组织和发育阶段以及对环境条件的反应中。
常见ZF蛋白不仅含有DNA识别结构域，还含有使ZF蛋白激活或抑制特定基因转录的功能域。实验上，已经将激活域用于激活靶基因转录(美国专利5789538和专利申请WO9519431)，不过还有可能将转录阻遏物域连接至ZF并且因而抑制转录(专利申请WO00/47754和WO2001002019)。已报道酶的功能如核酸切割可以与ZF联合(专利申请WO 00/20622)。
[0230.1.1.1]本发明提供了使得本领域技术人员能够从植物细胞基因组中分离一种或多种胁迫相关蛋白质编码基因的调节区，并能设计与功能结构域连接的锌指转录因子，所述功能结构域与该基因的调节区相互作用。可以以改变该基因表达的方式来设计锌指蛋白与植物基因的相互作用，并优选由此赋予提高的产量(优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下)。
[0231.1.1.1]具体地，本发明提供了产生含有胁迫相关蛋白质编码核酸的转基因植物的方法，其中该核酸在该植物中的表达导致与野生型植物相比对环境胁迫的耐受性提高，该方法包括：(a)用包含胁迫相关蛋白质编码核酸的表达载体转化植物细胞，和(b)从该植物细胞产生与野生型植物相比具有对环境胁迫提高的耐受性的转基因植物。就这样的植物转化而言，可以使用双元载体，如pBinAR
Figure BDA0000055835940001551
和Willmitzer，1990 Plant Science66：221-230)。其他合适的双元载体为例如pBIN19、pBI101、pGPTV或pPZP(Hajukiewicz，P.等，1994，Plant Mol.Biol.，25：989-994)。
双元载体的构建可以通过将cDNA连接至T-DNA进行。位于该cDNA5′端的植物启动子激活cDNA的转录。聚腺苷酸化序列位于cDNA的3′端。组织特异性表达可以通过使用如上所列的组织特异性启动子实现。此外，可以使用任何其它启动子元件。对于在完整植物中的组成型表达，可以使用CaMV 35S启动子。可以使用信号肽将表达的蛋白质靶向至细胞区室例如质体、线粒体或内质网(Kermode，1996 Crit.Rev.Plant Sci.4(15)：285-423)。将信号肽以符合cDNA读框方式克隆至5’端以实现融和蛋白的亚细胞定位。另外，可以使用应答非生物胁迫的启动子，如拟南芥启动子RD29A。本领域技术人员认识到所用的启动子应当有效地连接至核酸以至该启动子引起核酸的转录，导致合成编码多肽的mRNA。
[0232.1.1.1]另一种转染方法包括通过电穿孔或农杆菌介导的基因转移将DNA直接转移至发育的花中。农杆菌介导的植物转化可以使用例如GV3101(pMP90)(Koncz和Schell，1986 Mol.Gen.Genet.204：383-396)或LBA4404(Ooms等，Plasmid，1982，7：15-29；Hoekema等，Nature，1983，303：179-180)根瘤农杆菌菌株开展。转化可以通过标准转化和再生技术(Deblaere等，1994 Nucl.Acids.Res.13：4777-4788；Gelvin和Schilperoort，《Plant Molecular Biology Manual》第二版，Dordrecht：Kluwer Academic Publ.，1995.-in Sect.，Ringbuc ZentraleSignatur：BT11-P ISBN 0-7923-2731-4；Glick，B R和Thompson，J E，《Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology》，Boca Raton：CRC Press，1993.-360S.，ISBN 0-8493-5164-2)开展。例如，油菜可以通过子叶或下胚轴转化作用加以转化(Moloney等，1989 Plant Cell Reports 8：238-242；De Block等，1989 Plant Physio.91：694-701)。用于农杆菌的抗生素以及植物选择取决于转化所用的双元载体和农杆菌菌株。油菜的选择通常使用作为可选择植物标记的卡那霉素开展。农杆菌介导至亚麻属植物的基因转移可以使用例如由Mlynarova等，1994 Plant Cell Report13：282-285描述的技术开展。此外，大豆的转化可以使用例如由欧洲专利号0424 047、美国专利号5,322,783、欧洲专利号0397 687、美国专利号5,376,543或美国专利号5,169,770描述的技术开展。玉米的转化可以通过粒子轰击、聚乙二醇介导的DNA摄取或碳化硅纤维技术(参阅如Freeling和Walbot《The maize handbook》，Springer Verlag：New York(1993)ISBN 3-540-97826-7)实现。转化玉米的具体实例在美国专利号5,990,387中找到并且转化小麦的具体实例在PCT申请号WO 93/07256中找到。
[0233.1.1.1]在胁迫条件下生长修饰的植物并筛选和分析生长特性和/或代谢活性，以评估植物中遗传修饰对优选暂时和反复的非生物胁迫条件下提高产量的影响。这些分析技术为本领域技术人员所熟知。它们包括筛选(Rompp Lexikon Biotechnologie，Stuttgart/New York：Georg ThiemeVerlag 1992，″screening″701页)干重、湿重、蛋白质合成、糖类合成、脂类合成、蒸腾速率、一般植物和/或农作物产量、开花、繁殖、结籽、根生长、呼吸作用速率、光合作用速率。(《Applications of HPLC inBiochemistry in：Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology》，第17卷；Rehm等，1993《Biotechnology》，第3卷，第III章：《Product recovery and purification》，469-714页，VCH：Weinheim；Belter，P.A.等，1988，《Bioseparations：downstream processing forbiotechnology》，John Wiley和Sons；Kennedy，J.F.和Cabral，J.M.S.，1992，《Recovery processes for biological materials》，John Wiley and Sons；Shaeiwitz，J.A.和Henry，J.D.，1988，《Biochemical separations，in：Ulmann′s Encyclopedia of Industrial Chemistry》，第B3卷，第11章，1-27页，VCH：Weinheim；和Dechow，F.J.，1989，《Separation and purificationtechniques in biotechnology》，Noyes Publications)。
[0234.1.1.1]在一个实施方案中，本发明涉及用于在生物，例如植物的细胞中鉴定基因产物的方法，所述基因产物优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型细胞相比赋予提高的产量，所述方法包括以下步骤：
a)使样品，例如细胞、组织、植物或微生物或核酸文库的一些或所有核酸分子与表I A或B的第5列或第7列中所示的核酸分子或其功能同源物接触，例如杂交，所述样品可含有编码基因产物的候选基因，所述基因产物优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下赋予提高的产量，例如增加的产量相关性状，例如对非生物环境胁迫的增强的耐受性，例如提高的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或提高的营养利用效率、固有产量和/或另一提及的产量相关性状；
b)鉴定核酸分子并任选地分离全长cDNA克隆或完整的基因组克隆，所述核酸分子在松弛严格条件下与所述核酸分子，特别是表I第5列或第7列中所示的核酸分子序列杂交；
c)在宿主细胞，优选植物细胞中鉴定候选核酸分子或其片段；
d)提高宿主细胞中所鉴定的核酸分子的表达，期望优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下从所述表达中获得提高的产量，例如增加的产量相关性状，例如对非生物环境胁迫的增强的耐受性，例如提高的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或提高的营养利用效率、固有产量和/或另一提及的产量相关性状；
e)测定宿主细胞的提高的产量，例如优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下，提高的产量相关性状，例如对非生物环境胁迫的增强的耐受性，例如提高的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或提高的营养利用效率、固有产量和/或另一提及的产量相关性状；和
f)鉴定核酸分子及其基因产物，其提高的表达与野生型相比在宿主细胞中赋予提高的产量，例如优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下，增加的产量相关性状，例如对非生物环境胁迫的增强的耐受性，例如提高的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或提高的营养利用效率、固有产量和/或另一提及的产量相关性状。
松弛杂交条件是：在标准杂交程序后，在低到中等严格条件下进行洗涤步骤，与例如具有0.1％ SDS的60°到68℃的严格洗涤条件相比，所述低到中等严格条件一般具有40°-55℃的洗涤条件和具有0.1％ SDS的2xSSC到0.2x SSC之间的盐条件。可在上文为严格杂交条件列出的参考文献中发现其它实例。一般地，以增加的严格性和长度重复洗涤步骤直至检测到有用信噪比，并且所述洗涤步骤依赖于许多因素，如靶标，例如其纯度、GC含量、大小等、探针，例如其长度、其为RNA还是DNA探针、盐条件、洗涤或杂交温度、洗涤或杂交时间等。
[0234.2.1.1]在另一实施方案中，本发明涉及用于在细胞中鉴定基因产物的方法，所述基因产物的表达优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下赋予提高的产量，例如增加的产量相关性状，例如对非生物环境胁迫的增强的耐受性，例如提高的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或提高的营养利用效率、固有产量和/或另一提及的产量相关性状，所述方法包括步骤：
a)例如通过在数据库中的同源性搜索鉴定生物中的核酸分子，其与编码下述蛋白质的核酸分子具有至少20％，优选25％，更优选30％，甚至更优选35％、40％或50％，甚至更优选60％、70％或80％，最优选90％或95％或更高的同源性，所述蛋白质包含表II第5列或第7列中所示多肽分子或包含表IV第7列中所示共有序列或多肽基序或由包含表I第5列或第7列中所示多核苷酸或此处描述的其同源物的核酸分子编码。
b)增强宿主细胞中所鉴定核酸分子的表达；
c)测定宿主细胞中优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下提高的产量，例如增加的产量相关性状，例如对非生物环境胁迫的增强的耐受性，例如提高的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或提高的营养利用效率、固有产量和/或另一提及的产量相关性状；和
d)鉴定所述宿主细胞，其中宿主细胞中增强的表达与野生型相比，优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下赋予提高的产量，例如增加的产量相关性状，例如对非生物环境胁迫的增强的耐受性，例如提高的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或提高的营养利用效率、固有产量和/或另一提及的产量相关性状。
[0234.3.1.1]此外，本文所述核酸分子(特别是表I A或B第5列或第7列中所示核酸分子)可与相关物种的序列充分同源，从而这些核酸分子可作为标志物用于在相关生物中构建基因组图谱或用于关联作图。此外，本文所述核酸(特别是表IA或B第5列或第7列中所示核酸分子或其同源物)相应的基因组区中的天然变异可导致本文所述蛋白质活性的变异，并因此导致对环境胁迫的耐受性和/或抗性及生物量产生发生自然变异，所述蛋白质尤其是这样的蛋白质，其包含表IIA或B第5列或第7列中所示多肽，或者包含表IV申请号1第7列中所示共有序列或多肽基序及其同源物。
因此，自然变异最终也以更具活性的等位变体的形式存在，其已经导致对环境胁迫的耐受性和/或抗性及生物量产生的相对提高。可鉴定此处公开的核酸分子，特别是包含表IA或B第5列或第7列中所示核酸分子的核酸的不同变体(其对应于不同的环境胁迫耐受性和/或抗性和生物量产生水平)并将其用作标记物辅助育种，用于优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下提高的产量，例如增加的产量相关性状，例如对非生物环境胁迫的增强的耐受性，例如提高的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或提高的营养利用效率、固有产量和/或另一提及的产量相关性状。
[0234.4.1.1]因此，本发明涉及用于培育植物，用于优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下提高产量的方法，其包括：
a)基于此处公开的本发明核酸，特别是包含表IA或B第5列或第7列中所示核酸分子的核酸分子或包含表IIA或B第5列或第7列中所示多肽或包含表IV第7列中所示共有序列或多肽基序的多肽，或如此处所述的其同源物的提高表达选择第一个植物品种，其优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下具有提高的产量，例如增加的产量相关性状，例如对非生物环境胁迫的增强的耐受性，例如提高的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或提高的营养利用效率、固有产量和/或另一提及的产量相关性状；
b)使对环境胁迫的耐受性和/或抗性及生物量产生的水平与编码所述多肽的基因或所述核酸分子的表达水平或基因组结构联系起来；
c)使所述第一个植物品种与第二个植物品种杂交，所述第二个植物品种在对环境胁迫的耐受性和/或抗性及生物量产生的水平上显著地不同于第一个植物品种，和
e)鉴定哪个后代品种已经通过所述多肽或核酸分子的表达水平或编码所述多肽的基因或本发明核酸分子的基因组结构获得了提高水平的环境胁迫耐受性和/或抗性及生物量产生。
在一个实施方案中，提高步骤(b)的基因的表达水平。
[0235.1.1.1]本发明的另一实施方案涉及用于鉴定化合物的方法，所述化合物在植物细胞、植物或其部分中与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下赋予提高的产量，例如增加的产量相关性状，例如对非生物环境胁迫的增强的耐受性，例如提高的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或提高的营养利用效率、固有产量和/或另一提及的产量相关性状，所述方法包括步骤：
a)培养植物细胞；植物或其部分，其维持植物表达表II第5列或第7列中所示或由包含表I第5列或第7列中所示多核苷酸或此处描述的其同源物的核酸分子或编码所述多肽的多核苷酸编码的多肽，所述多肽优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量，例如增加的产量相关性状，例如对非生物环境胁迫的增强的耐受性，例如提高的干旱耐受性和/或低温耐受性和/或提高的营养利用效率、固有产量和/或另一提及的产量相关性状；未转化野生型植物或其部分并提供读出系统，所述读出系统能够在允许多肽与该读出系统在存在化合物或包含大量化合物的样品下相互作用的合适条件下与多肽相互作用，并能够提供应答在允许表达所述读出系统和表II第5列或第7列中所示的或由包含表I第5列或第7列中所示多核苷酸或如此处描述的其同源物的核酸分子编码的蛋白质的条件下化合物结合所述多肽的可检测信号；和
b)如果所述化合物是有效的激动剂，那么通过检测所述读出系统产生的信号的存在或缺失或减少或增加进行鉴定。
所述化合物可以是化学合成的或者是微生物产生的和/或包含于例如来自如植物、动物或微生物(如病原体)的样品(如细胞提取物)中。此外，所述化合物可以是本领域已知的，但还不了解其能够抑制本发明的多肽。反应混合物可以是无细胞提取物，或者可包含细胞或组织培养物。用于鉴定本发明化合物的方法的合适设置为本领域技术人员已知，并且一般性地描述于例如Alberts等，Molecular Biology of the Cell，第三版(1994)，特别是第17章。所述化合物可以例如添加到反应混合物、培养基中，注射到细胞中或者喷洒到植物上。
如果在该方法中鉴定含有化合物的样品，则可以从鉴定为含有与相应未转化的野生型相比能在暂时和反复的非生物胁迫条件下激活或提高产量生产的化合物的原始样品中分离该化合物，或者可以将原始样品进一步细分(例如如果由多种不同化合物组成)，从而减少每个样品中的不同物质数，并以原始样品的细分重复该方法。取决于样品的复杂度，上述步骤可以重复若干次，优选直至根据所述方法鉴定的样品仅含有数目有限的物质或仅含一种物质。优选地，所述样品含有具有相似化学和/或物理特性的物质，最优选地，所述物质是相同的。优选地，将根据上述方法鉴定的化合物或其衍生物进一步配制成适于在植物育种或植物细胞和组织培养中应用的形式。
可根据所述方法测试和鉴定的化合物可以是表达文库(例如cDNA表达文库)、肽、蛋白质、核酸、抗体、小有机化合物、激素、拟肽、PNA等((Milner，Nature Medicine 1(1995)，879-880；Hupp，Cell 83(1995)，237-245；Gibbs，Cell 79(1994)，193-198及上文引用的参考文献)。所述化合物也可以是已知抑制剂或激活剂的功能衍生物或类似物。用于制备化学衍生物和类似物的方法为本领域技术人员所熟知，并描述于例如Beilstein，Handbook of Organic Chemistry，Springer edition New York Inc.，175Fifth Avenue，New York，N.Y.10010 U.S.A.和Organic Synthesis，Wiley，New York，USA。此外，可根据本领域已知的方法测试所述衍生物和类似物的效果。此外，可以使用拟肽和/或计算机辅助设计合适的衍生物或类似物，例如根据上文所述的方法。该方法中可使用的细胞或组织为上文实施方案中所述的本发明宿主细胞、植物细胞或植物组织。
因此，在另一实施方案中，本发明涉及可根据用于鉴定本发明激动剂的方法获得或鉴定的化合物，所述化合物是本发明多肽的拮抗剂。
因此，在一个实施方案中，本发明还涉及通过用于鉴定本发明化合物的方法鉴定的化合物。
[0235.2.1.1]在一个实施方案中，本发明涉及特异性识别本发明化合物或激动剂的抗体。
[0235.3.1.1]本发明还涉及诊断组合物，其包含至少一种上述本发明核酸分子、反义核酸分子、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶、载体、蛋白质、抗体或化合物，并任选地包含合适的检测手段。
本发明的诊断组合物适用于从细胞中分离mRNA，并在杂交条件下使这样获得的mRNA接触包含上述核酸探针的探针，检测与该探针杂交的mRNA的存在情况，从而检测细胞中该蛋白质的表达。检测本发明蛋白质存在与否的其他方法包括本领域熟知的免疫技术，例如酶联免疫吸附测定。此外，可以在植物育种中使用本发明的核酸分子作为分子标记或引物。合适的检测方法为本领域技术人员所熟知，例如，描述于Sambrook等的用于杂交测定的缓冲液和溶液(例如上述溶液和缓冲液)以及用于Southern、Western、Northern等印迹的方法是已知的。在一个实施方案中，诊断组合物含有PCR引物，其设计成特异性检测待在本发明方法中降低的核酸分子(例如本发明的核酸分子)的存在或表达水平，或者设计成区分本发明核酸分子的不同变体或等位基因或者待在本发明方法中降低其活性的变体或等位基因。
[0235.4.1.1]在另一实施方案中，本发明涉及试剂盒，其包含核酸分子、载体、宿主细胞、多肽或反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子或核酶分子或病毒核酸分子、抗体、植物细胞、植物或植物组织、可收获部分、繁殖材料和/或根据本发明方法鉴定的化合物和/或激动剂。
本发明试剂盒中的化合物可包装在容器(例如小瓶)中，任选地与缓冲液和/或溶液一起或者在缓冲液和/或溶液中。如果合适，所述组分的一种或多种可以包装在一个和相同的容器中。作为补充或替代，可将一种或多种所述组分吸附至固相支持体，例如硝酸纤维素滤膜、玻璃板、芯片或尼龙膜或其微量滴定板的孔。该试剂盒可用于任何本文所述方法和实施方案，例如用于产生宿主细胞、转基因植物、药物组合物；检测同源序列；鉴定拮抗剂或激动剂；作为食品或饲料或其补充剂；或者作为处理植物的补充剂等。
此外，该试剂盒可包含将该试剂盒用于任何所述实施方案的说明书。
在一个实施方案中，所述试剂盒还包含编码一种或多种所述蛋白质的核酸分子，和/或抗体、载体、宿主细胞、反义核酸、植物细胞或植物组织或植物。在另一实施方案中，所述试剂盒包含用于检测和区分待在本发明方法中降低的核酸分子(例如本发明核酸分子)的PCR引物。
[0235.5.1.1]在另一实施方案中，本发明涉及用于产生农用组合物的方法，所述农用组合物提供用于本发明方法的核酸分子，本发明的核酸分子，本发明的载体，本发明的反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶或抗体，本发明的病毒核酸分子或本发明的多肽；或者包含用于鉴定所述化合物或激动剂的本发明方法的步骤；以及制备本发明的核酸分子、载体或多肽；或者根据本发明方法鉴定或可用于本发明主题的激动剂或化合物，它们均为可用作植物农用组合物的形式。
[0235.6.1.1]在另一实施方案中，本发明涉及用于产生植物培养组合物的方法，其包括本发明方法的步骤，以及将所鉴定的化合物制备成可用作农用组合物的形式。
“可用作农用组合物”应理解为这样的组合物符合规定杀真菌剂、植物养分、除草剂等含量的法律。优选地，这样的组合物对所保护的植物和所喂饲的动物(包括人)无任何害处。
[0236.1.1.1]在本申请中，参考了多篇出版物。这些出版物以及这些出版物中引用的参考文献的公开内容作为参考整体并入本文，以更完整地描述本发明所属领域的现状。
应该理解，上文涉及本发明的一些优选实施方案，可对其进行大量改变和更改，而不偏离本发明的范围。还通过以下实施例展示本发明，它们不应理解为以任何方式进行限制。相反，应该清楚地理解，本领域技术人员在阅读本说明书后能提出多种其他实施方案、其修改和等同方案，而不偏离本发明的构思和/或权利要求的范围。
[0236.2.1.1]在一个实施方案中，提高的产量导致特定成分的产生提高，包括，但不限于提高的和/或改善的糖含量或糖组成、提高的或改善的淀粉含量和/或淀粉组成、提高的和/或改善的油含量或油组成(如提高的种子油含量)、提高的或改善的蛋白质含量和/或蛋白质组成(如提高的种子蛋白质含量)、提高的和/或改善的维生素含量或维生素组成等。
此外，在一个实施方案中，本发明的方法包括收获产生或种植的植物或植物的部分并用所收获的植物或其部分或从其中产生燃料。此外，在一个实施方案中，本发明的方法包括收获用于淀粉分离的植物部分并从该植物部分分离淀粉，其中所述植物是用于淀粉产生的植物，例如马铃薯。此外，在一个实施方案中，本发明的方法包括用于油分离的植物部分并从该植物部分分离油，其中所述植物是用于油产生的植物，例如油菜或芸苔、棉花、大豆或向日葵。
例如，在一个实施方案中，提高玉米种子中的油含量。因此，本发明涉及每英亩油含量(可收获的油)提高的植物的产生。
例如，在一个实施方案中，提高大豆种子中的油含量。因此，本发明涉及每英亩油含量(可收获的油)提高的大豆植物的产生。
例如，在一个实施方案中，提高OSR种子中的油含量。因此，本发明涉及每英亩油含量(可收获的油)提高的OSR植物的产生。
例如，本发明涉及每英亩油含量(可收获的油)提高的棉花植物的产生。
通过并非意为限制的以下实施例阐明本发明。
为本发明目的，通常复数旨在包括单数，反之亦然。
[0236.3.1.1]在一个实施方案中，本发明的主题是用于通过提高或产生选自以下的一种或更多活性产生转基因植物细胞、植物或其部分的方法：磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、精氨酸/丙氨酸氨肽酶、D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶、二酰甘油焦磷酸磷酸酶、二酪氨酸转运蛋白、法尼二磷酸法尼基转移酶、NAD+依赖性甜菜碱醛脱氢酶、丝氨酸水解酶、参与赋予对酮康唑抗性的转录调节子、尿苷激酶、yal043c-a-蛋白质、ybr071w-蛋白质和ydr445c-蛋白质，所述转基因植物细胞、植物或其部分优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比具有提高的产量。
在所述方法的其它实施方案中，提高或产生至少一种多肽的活性，所述多肽包含选自以下的多肽：
(i)分别包含表II或表IV第5列或第7列中所述多肽、共有序列或至少一个多肽基序的多肽；或
(ii)包含表I第5列或第7列中所述多核苷酸的核酸分子的表达产物，
(iii)或(i)或(ii)的功能等同物。
在本发明方法的一个实施方案中，提高或产生至少一种核酸分子的表达，所述核酸分子包含选自以下的核酸分子：
a)编码如表II第5列或第7列中所示多肽的核酸分子；
b)如表I第5列或第7列中所示的核酸分子；
c)核酸分子，其因为遗传密码的简并性，可来自表II第5列或第7列中所述多肽序列并优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量；
d)核酸分子，其与包含表I第5列或第7列中所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少30％的同一性，并优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量；
e)核酸分子，其编码与(a)到(c)的核酸分子编码的多肽的氨基酸序列具有至少30％同一性的多肽并具有包含表I第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性，并优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量；
f)核酸分子，其在严格杂交条件下与(a)到(c)的核酸分子杂交，并优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量；
g)核酸分子，其编码可在针对(a)到(e)的一个核酸分子编码的多肽制备的单克隆或多克隆抗体帮助下分离的多肽，并具有包含表I第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性；
h)核酸分子，其编码包含如表IV第7列中所示共有序列或一个或更多多肽基序的多肽，并优选具有包含表II或IV第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性；
i)核酸分子，其编码具有如表II第5列中所述蛋白质代表活性的多肽，并优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量；
j)核酸分子，其包含使用表III第7列中的引物通过扩增cDNA文库或基因组文库获得的多核苷酸并优选具有包含如表II或IV第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性；
和
k)核酸分子，通过在严格杂交条件下利用含(a)或(b)核酸分子的互补序列或其片段的探针筛选合适的核酸文库可获得所述核酸分子并且其编码具有包含如表II第5列中所述多肽的蛋白质代表的活性的多肽，所述探针或其片段具有与(a)到(e)中表征的核酸分子序列互补的核酸分子的至少15nt，优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt。
在一个实施方案中，本发明涉及通过如上描述的本发明方法产生的转基因植物细胞、植物或其部分，其优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比具有提高的产量。
在其它实施方案中，所述转基因植物细胞、植物或其部分来自单子叶植物或来自双子叶植物或来自裸子植物，优选云杉、松树和冷杉。
在其它实施方案中，如上公开的本发明的转基因植物细胞、植物或其部分来自选自以下的植物：玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、油菜、包括芸苔和冬季油菜、玉米、木薯、胡椒、向日葵、亚麻、琉璃苣、红花、亚麻子、报春花、油菜籽、萝卜、万寿菊、茄科植物、马铃薯、烟草、茄子、番茄、蚕豆属物种、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳属物种，油椰、椰子、多年生草本植物、饲料作物和拟南芥。
在一个实施方案中，本发明的其它主题是本发明转基因植物产生的种子，其中所述种子对转基因是遗传纯合的，优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下，与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量，在暂时和反复的非生物胁迫条件下，与相应的未转化野生型植物相比导致产量提高。
在一个实施方案中，本发明的主题是分离的核酸分子，其包含选自以下的核酸分子：
a)编码如表IIB第5列或第7列中所示多肽的核酸分子；
b)如表IB第5列或第7列中所示的核酸分子；
c)核酸分子，其因为遗传密码的简并性，可来自表II第5列或第7列中所述多肽序列并优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量；
d)核酸分子，其与包含表I第5列或第7列中所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少30％的同一性，并优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量；
e)核酸分子，其编码与(a)到(c)的核酸分子编码的多肽的氨基酸序列具有至少30％同一性的多肽并具有包含表I第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性，并优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量；
f)核酸分子，其在严格杂交条件下与(a)到(c)的核酸分子杂交，并优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量；
g)核酸分子，其编码可在针对(a)到(e)的一个核酸分子编码的多肽制备的单克隆或多克隆抗体帮助下分离的多肽，并具有包含表I第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性；
h)核酸分子，其编码包含如表IV第7列中所示共有序列或一个或更多多肽基序的多肽，并优选具有包含表II或IV第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性；
i)核酸分子，其编码具有如表II第5列中所述蛋白质代表活性的多肽，并优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量；
j)核酸分子，其包含使用表III第7列中的引物通过扩增cDNA文库或基因组文库获得的多核苷酸并优选具有包含如表II或IV第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性；
和
k)核酸分子，通过在严格杂交条件下利用含(a)或(b)核酸分子的互补序列或其片段的探针筛选合适的核酸文库可获得所述核酸分子并且其编码具有包含如表II第5列中所述多肽的蛋白质代表的活性的多肽，所述探针具有与(a)到(e)中表征的核酸分子序列互补的核酸分子的至少15nt，优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt；
其中，(a)到(k)的核酸分子至少在一个或更多核苷酸上不同于表IA第5列或第7列中所述的序列，并且其优选编码至少在一个或更多氨基酸上不同于表II A第5列或第7列中所述的蛋白质序列的蛋白质。
在其它实施方案中，本发明的主题是核酸构建体，其赋予包含选自以下核酸分子的核酸分子的表达：
a)编码如表II B第5列或第7列中所示多肽的核酸分子；
b)如表I B第5列或第7列中所示的核酸分子；
c)核酸分子，其因为遗传密码的简并性，可来自表II第5列或第7列中所述多肽序列并优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量；
d)核酸分子，其与包含表I第5列或第7列中所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少30％的同一性，并优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量；
e)核酸分子，其编码与(a)到(c)的核酸分子编码的多肽的氨基酸序列具有至少30％同一性的多肽并具有包含表I第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性，并优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量；
f)核酸分子，其在严格杂交条件下与(a)到(c)的核酸分子杂交，并优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量；
g)核酸分子，其编码可在针对(a)到(e)的一个核酸分子编码的多肽制备的单克隆或多克隆抗体帮助下分离的多肽，并具有包含表I第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性；
h)核酸分子，其编码包含如表IV第7列中所示共有序列或一个或更多多肽基序的多肽，并优选具有包含表II或IV第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性；
i)核酸分子，其编码具有如表II第5列中所述蛋白质代表活性的多肽，并优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量；
j)核酸分子，其包含使用表III第7列中的引物通过扩增cDNA文库或基因组文库获得的多核苷酸并优选具有包含如表II或IV第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性；
和
k)核酸分子，通过在严格杂交条件下利用含(a)或(b)核酸分子的互补序列或其片段的探针筛选合适的核酸文库可获得所述核酸分子并且其编码具有包含如表II第5列中所述多肽的蛋白质代表的活性的多肽，所述探针具有与(a)到(e)中表征的核酸分子序列互补的核酸分子的至少15nt，优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt；
其中，在一个实施方案中，(a)至(k)的核酸分子至少在一个或多个核苷酸上与表IA第5列或第7列中所述的序列有所不同，并优选编码与表IIA第5列或第7列中所述蛋白质序列至少在一个或多个氨基酸上不同的蛋白质，并且所述核酸构建体包含一个或更多调控元件，由此优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植株或其部分相比，在宿主细胞中核酸的表达导致产量提高。
在一个实施方案中，本发明的另一主题为载体，所述载体包含如上公开的核酸分子或如上公开的核酸构建体，由此优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植株或其部分相比，在宿主细胞中所述编码核酸的表达导致产量提高。
在一个实施方案中，本发明的其它主题为宿主细胞，其已稳定或瞬时转化有如上公开的载体或如上公开的核酸分子或如上公开的核酸构建体，并且优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植株或其部分相比，该宿主细胞由于转化显示出提高的产量。
在一个实施方案中，本发明涉及产生多肽的方法，其中在如上公开的宿主细胞中表达该多肽。
如上公开的方法产生的或由如上公开的核酸分子编码的所述多肽可在一个或多个氨基酸上与表II中所示的序列区分开。
在一个实施方案中，本发明的其它主题为抗体，其特异结合上述多肽。
在一个实施方案中，本发明的其它主题为包含如上公开的宿主细胞的植物组织、繁殖材料、收获材料或植物。
在一个实施方案中，本发明的其它主题为鉴定化合物的方法，优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比，该化合物在植物细胞、植物或其部分中赋予提高的产量，所述方法包括以下步骤：
a)培养植物细胞、植物或其部分，其维持植物表达由如上公开的本发明核酸分子编码的多肽，在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量；未转化野生型植物或其部分并提供读出系统，所述读出系统能够在允许多肽与该读出系统在存在化合物或包含大量化合物的样品下相互作用的合适条件下与多肽相互作用，并能够提供应答在允许表达所述读出系统和上文公开的核酸分子编码的蛋白质的条件下化合物结合所述多肽的可检测信号；和
b)通过检测由所述读出系统产生的信号的存在或不存在或增加来进行鉴定化合物是否为有效激动剂。
在一个实施方案中，本发明的其它主题为产生农业组合物的方法，所述方法包括如上公开的方法中鉴定赋予提高产量的化合物并以农业应用可接受的形式配制在该方法中鉴定的化合物的步骤。
在一个实施方案中，本发明的的另一其它主题为组合物，所述组合物包含如上公开的核酸分子、如上公开的多肽、如上公开的核酸构建体、如上公开的载体、如上公开的化合物、如上公开的抗体和任选地农业上可接受的载体。
在一个实施方案中，本发明的主题为如表II，优选表II B中所述的分离的多肽，其选自酵母，优选酿酒酵母或大肠杆菌。
在一个实施方案中，本发明的主题为用于产生转基因植物细胞、植物或其部分的方法，所述转基因植物细胞、植物或其部分优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比具有提高的产量，其中通过表达由本发明如上公开的核酸编码的多肽在暂时和反复的非生物胁迫条件下提高产量，并优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比导致产量提高，所述方法包括
a)用如上公开的本发明的表达载体转化植物细胞或植物部分，并
b)从植物细胞或植物部分中产生转基因植物，其优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物相比具有提高的产量。
在一个实施方案中，本发明的主题为通过提高或产生一种或更多活性产生转基因植物的方法，所述转基因植物优选在环境胁迫条件下与相应的未转化野生型植物相比具有提高的产量，所述活性选自由如下蛋白质组成的组的胁迫相关蛋白质(YRP)或产量及胁迫相关蛋白质(YSRP)：
磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、精氨酸/丙氨酸氨肽酶、D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶、二酰甘油焦磷酸磷酸酶、二酪氨酸转运蛋白、法尼二磷酸法尼基转移酶、NAD+依赖性甜菜碱醛脱氢酶、丝氨酸水解酶、参与赋予对酮康唑抗性的转录调节子、尿苷激酶、yal043c-a-蛋白质、ybr071w-蛋白质和ydr445c-蛋白质。
在一个实施方案中，本发明的主题为产生转基因植物的方法，所述转基因植物优选在环境胁迫条件下与相应的未转化野生型植物相比具有提高的产量，所述方法包括
a)用如上公开的本发明的表达载体转化植物细胞或植物部分，并
b)从植物细胞或植物部分中产生转基因植物，其优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物相比具有提高的产量。
在一个实施方案中，本发明的主题是选自如上公开的本发明核酸的YRP或YSRP编码核酸分子用于制备植物细胞的用途，所述植物细胞优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型细胞、植物或植物部分相比具有提高的产量。
在一个实施方案中，本发明的主题是选自如上公开的本发明核酸的YRP或YSRP编码核酸分子或其部分作为标记物用于筛选植物或植物细胞的用途，所述植物或植物细胞优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型细胞、未转化野生型植物或其部分相比具有提高的产量。
在一个实施方案中，本发明的主题是选自如上公开本发明核酸的YRP或YSRP编码核酸分子或其部分作为标记物用于在植物或植物细胞进行胁迫检测的用途。
在一个实施方案中，本发明的主题是如上公开的本发明的转化的植物细胞，其中暂时和反复非生物环境胁迫选自盐度、干旱、温度、金属、化学物质、病原体和氧化胁迫或其组合。
在一个实施方案中，本发明的主题是如上公开的本发明的转化的植物细胞，其中暂时和反复非生物环境胁迫为干旱，优选循环干旱。
在一个实施方案中，本发明的主题是转基因植物细胞，其包含编码具有选自产量相关蛋白质(YRP)或产量及胁迫相关蛋白质(YSRP)组成的组的活性的多肽的核酸分子，所述相关蛋白质(YRP)或产量及胁迫相关蛋白质(YSRP)组成为：磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、精氨酸/丙氨酸氨肽酶、D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶、二酰甘油焦磷酸磷酸酶、二酪氨酸转运蛋白、法尼二磷酸法尼基转移酶、NAD+依赖性甜菜碱醛脱氢酶、丝氨酸水解酶、参与赋予对酮康唑抗性的转录调节子、尿苷激酶、yal043c-a蛋白质、ybr071w蛋白质和ydr445c蛋白质，其中所述多肽优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量(优选当所述多肽过表达时)。
在一个实施方案中，本发明的主题是如上公开的本发明植物，其具有
i)在暂时和反复的营养物限制条件下提高的产量，其中所述条件对未转化野生型植物细胞、植物或其部分的生长而言是限制性的，
ii)在其中水对未转化野生型植物细胞、植物或其部分的生长而言是限制性的条件下提高的产量，
iii)在干旱，优选循环干旱的条件下提高的产量，其中所述条件对未转化野生型植物细胞、植物或其部分的生长而言是限制性的
和/或
iv)在低湿度条件下提高的产量，其中所述条件对未转化野生型植物细胞、植物或其部分的生长而言是限制性的。
在一个实施方案中，本发明的主题是在大环境中通过栽培如上公开的各种纲/属的植物提高每英亩产量的方法，在所述大环境中植物不实现或不再实现其产量潜力。
在一个实施方案中，本发明的主题是在大环境中提高每英亩产量的方法，其包括步骤：
-进行土壤分析以测定土壤中可用的营养物水平，
-与所述结果与实现植物纲/属的产量潜力所必需的比较值，
-在至少一种营养物受限的情况下培养如上公开的各纲/属的植物。
在一个实施方案中，本发明的主题是在大环境中提高每英亩产量的方法，其包括步骤：
-测定至少一个植物世代的时间期限内的降水，
-与用于实现植物纲/属的产量潜力的值比较，
-在降水减少的情况下培养如上公开的各纲/属的植物。
在一个实施方案中，本发明的主题是在大环境中提高每英亩产量的方法，其包括步骤：
-测定至少一个植物世代的时间期限内的降雨间的时间段，
-与用于实现植物纲/属的产量潜力的值比较，
在旱季增加的情况下培养如上公开的各纲/属的植物。
[0237.1.1.1]实施例1
通过过表达编码YRP或YSRP的基因改造胁迫耐受的拟南芥植物
[0237.2.1.1]克隆如表I第5列中所示本发明序列用于植物中表达
除非另外指明，否则使用Sambrook等，Mo-lecular Cloning：Alaboratory manual，Cold Spring Harbor 1989，Cold Spring HarborLaboratory Press中所述的标准方法。
[0237.3.1.1]通过如Pfu Ultra、Pfu Turbo或Herculase DNA聚合酶(Stratagene)的方案中描述的PCR来扩增表I第5列和第7列中所示的本发明序列。
Pfu Ultra、Pfu Turbo或Herculase DNA聚合酶方案的组成如下：1×PCR缓冲液(Stratagene)，0.2mM每种dNTP，100ng酿酒酵母(菌株S288C；Research Genetics，Inc.，现在的Invitrogen)、或大肠杆菌(菌株MG1655；E.coli Genetic Stock Center)基因组DNA，50pmol正向引物，50pmol反向引物，2.5u Pfu Ultra、Pfu Turbo或Herculase DNA聚合酶。
扩增循环如下：
94-95℃下2-3分钟进行一个循环，随后每个循环94-95℃下30-60秒、50-60℃下30-45秒及72℃下210-480秒进行25-36循环，随后在72℃下5-10分钟进行1个循环，然后4℃。
[0238.1.1.1]在表III第7列中显示了用于待表达基因的ORF特异性引物对。将以下接头序列加至酿酒酵母ORF特异性引物(见表III)中用于克隆目的：
i)正向引物：5′-GGAATTCCAGCTGACCACC-3′
SEQ ID NO：1
ii)反向引物：5′-GATCCCCGGGAATTGCCATG-3′
SEQ ID NO：2
这些接头序列允许ORF克隆至含Resgen接头的多个载体中，见表VII。
将以下接头序列加入至大肠杆菌的ORF特异性引物中用于克隆目的：
iii)正向引物：5′-TTGCTCTTCC-3′
SEQ ID NO：3
iiii)反向引物：5`-TTGCTCTTCG-3′
SEQ ID NO：4
所述接头序列允许ORF克隆至含Colic接头的多个载体中，见表VII。
因此，为了扩增和克隆酿酒酵母SEQ ID NO：724，使用由接头序列i)和ORF特异性序列SEQ ID NO：726组成的一种引物以及由接头序列ii)和ORF特异性序列SEQ ID NO：727组成的另一种引物。
为了扩增和克隆大肠杆菌SEQ ID NO：63，使用由接头序列iii)和ORF特异性序列SEQ ID NO：615组成的一种引物以及由接头序列iiii)和ORF特异性序列SEQ ID NO：616组成的另一种引物。
遵照这些实施例，可以通过将接头序列与表III第7列所公开相应特异性引物序列进行融合来克隆表I(优选第5列)所公开的每个序列。
表VII.用于克隆ORF的不同载体的概况，并显示其SEQID(A列)、其载体名称(B列)、其包含的用于表达所述ORF的启动子(C列)、额外的人工靶向序列(D列)、接头序列(E列)、由B列中提及的启动子赋予的表达类型(F列)和附图编号(G列)。
Figure BDA0000055835940001771
Figure BDA0000055835940001781
[0239.1.1.1]构建用于蛋白质非靶向表达的双元载体
在本文中“非靶定”表达表示不向待表达的ORF加入任何额外靶向序列。
对于优先在绿色组织中的非靶向表达，使用以下双元载体用于克隆：pMTX155、VC-MME220-1qcz、VC-MME221-1qcz、VC-MME489-1QCZ。
在VC-MME489-1QCZ的情况下，可用增强的35S启动子序列(Comai等，Plant Mol Biol 15，373-383(1990))替换超级启动子序列(Ni等.PlantJournal 7，661(1995))，产生如下文表1中所示的类似结果。
[0240.1.1.1]扩增来自菠菜(Spinacia oleracea)的FNR基因的靶向序列并构建用于优先在绿色组织中或优先在种子中的质体靶向表达的载体
为了扩增来自菠菜的FNR基因的靶向序列，从4周龄的菠菜植株叶片中提取基因组DNA(DNeasy Plant Mini Kit，Qiagen，Hilden)。将gDNA用作PCR模板。
为了将转运序列克隆至载体中VC-MME489-1QCZ和VC-MME301-1QCZ，将EcoRI限制酶识别序列加入正向和反向引物中，而对于在pMTX0270p、VC-MME220-1qcz、VC-MME221-1qcz和VC-MME289-1qcz载体中的克隆，将PmeI限制酶识别序列加入到正向引物中并将NcoI位点加入到反向引物中。
FNR5EcoResgen  ATA GAA TTC GCA TAA ACT TAT CTT CAT AGT
TGC C SEQ ID NO：5
FNR3EcoResgen  ATA GAA TTC AGA GGC GAT CTG GGC CCT
SEQ ID NO：6
FNR5PmeColic   ATA GTT TAA ACG CAT AAA CTT ATC TTC ATA
GTT GCC SEQ ID NO：7
FNR3NcoColic   ATA CCA TGG AAG AGC AAG AGG CGA TCT GGG
CCC T SEQ ID NO：8
从菠菜基因组DNA扩增的所获序列SEQ ID NO：29包含5′UTR(bp1-165)和编码区(bp 166-273和351-419)。通过bp 274至bp 350的内含子序列中断编码序列。
gcataaacttatcttcatagttgccactccaatttgctccttgaatctcctccacccaatacataatccactcctccatcacccacttcactactaaatc
SEQ ID NO：29
用EcoRI消化通过引物FNR5EcoResgen和FNR3EcoResgen获得的PCR片段并将其连接到同样已经EcoRI消化的载体VC-MME489-1QCZ或VC-MME301-1QCZ中。通过测序检测FNR靶向序列的正确方向。在该连接步骤中产生的载体分别为VC-MME354-1QCZ和pMTX461korrp。
用PmeI和NcoI消化通过引物FNR5PmeColic和FNR3NcoColic获得的PCR片段并将其连接到已经SmaI和NcoI消化的载体pMTX0270p(图6)SEQ ID NO：9、VC-MME220-1qcz、VC-MME221-1qcz和VC-MME289-1qcz中。在该连接步骤中产生的载体分别为VC-MME432-1qcz SEQ ID NO：42(图4)、VC-MME464-1qcz和pMTX447korr。
对于优先在绿色组织中质体靶向的组成型表达，在载体VC-MME354-1QCZ的背景中对来自酿酒酵母的ORF及在载体VC-MME432-1qcz的背景中对来自大肠杆菌的ORF使用人工启动子A(ocs)3 AmasPmas启动子(超级启动子)(Ni等，Plant Journal 7，661(1995)，WO 95/14098)，导致每种情况下FNR靶向序列与ORF的“框内”融合。
对于优先在种子中质体靶向的表达，在载体pMTX461korrp的背景中对来自酿酒酵母的ORF或在载体VC-MME464-1qcz的背景中对来自大肠杆菌的ORF使用USP启动子(等，Mol Gen Genet.225(3)：459-67(1991))，每种情况下导致FNR靶向序列与ORF的“框内”融合。
对于优先在绿色组织和种子中质体靶向的组成型表达，在载体pMTX447korr的背景中对来自酿酒酵母或大肠杆菌的ORF使用PcUbi启动子，每种情况下导致FNR靶向序列与ORF发生“框内”融合。
[0240.2.1.1]构建用于蛋白质的线粒体靶向表达的双元载体扩增来自拟南芥的基因IVD的线粒体靶向序列并构建优先在绿色组织中或优先在种子中线粒体靶向表达的载体。
为了从拟南芥中扩增IVD基因的靶向序列，从拟南芥植株叶片中提取基因组DNA(DNeasy Plant Mini Kit，Qiagen，Hilden)。将gDNA用作PCR模板。
为了将转运序列克隆至载体VC-MME489-1QCZ和
VC-MME301-1QCZ中，将EcoRI限制酶识别序列加入至正向和反向引物中，而对于在载体VC-MME220-1qcz、VC-MME221-1qcz和
VC-MME289-1qcz中的克隆，将PmeI限制酶识别序列加入至正向引物中并将NcoI位点加入至反向引物中。
IVD5EcoResgen  ATA GAA TTC ATG CAG AGG TTT TTC TCC GC
SEQ ID NO：57
IVD3EcoResgen    ATAg AAT TCC gAA gAA CgA gAA gAg AAA g
SEQ ID NO：58
IVD5PmeColic     ATA GTT TAA ACA TGC AGA GGT TTT TCT CCG C
SEQ ID NO：59
IVD3NcoColic     ATA CCA TGG AAG AGC AAA GGA GAG ACG AAG
AAC GAG
SEQ ID NO：60
用IVD5EcoResgen和IVD3EcoResgen从拟南芥基因组DNA中扩增到的序列(SEQ ID NO：61)包含81bp：
atgcagaggtttttctccgccagatcgattctcggttacgccgtcaagacgcggaggaggtctttctcttctcgttcttcg
SEQ ID NO：61
用IVD5PmeColic和IVD3NcoColic从拟南芥基因组DNA中扩增到的序列(SEQ ID NO：62)包含89bp：
atgcagaggtttttctccgccagatcgattctcggttacgccgtcaagacgcggaggaggtctttctcttctcgttcttcgtctctcct
SEQ ID NO：62
用EcoRI消化通过引物IVD5EcoResgen和IVD3EcoResgen获得的PCR片段并将其连接至已用EcoRI消化的载体VC-MME489-1QCZ和VC-MME301-1QCZ中。通过测序验证IVD靶向序列的正确方向。在该连接步骤中产生的载体分别为VC-MME356-1QCZ和VC-MME462-1QCZ。
用PmeI和NcoI消化通过引物IVD5PmeColic和IVD3NcoColic获得的PCR片段并将其连接至已用SmaI和NcoI消化的载体VC-MME220-1qcz、VC-MME221-1qcz和VC-MME289-1qcz中。在该连接步骤中产生的载体分别为VC-MME431-1qcz、VC-MME465-1qcz和VC-MME445-1qcz。
对于优先在绿色组织中线粒体靶向的组成型表达，在载体VC-MME356-1QCZ的背景中对来自酿酒酵母的ORF及在载体VC-MME431-1qcz的背景中对来自大肠杆菌的ORF使用人工启动子A(ocs)3AmasPmas启动子(超级启动子)(Ni等.Plant Journal 7，661(1995)，WO 95/14098)，每种情况下导致IVD序列与各ORF发生“框内”融合。
对于优先在种子中线粒体靶向的组成型表达，在载体VC-MME462-1QCZ的背景中对来自酿酒酵母的ORF及在载体VC-MME465-1qcz的背景中对大肠杆菌的ORF使用USP启动子
Figure BDA0000055835940001821
等，Mol Gen Genet.225(3)：459-67(1991))，每种情况下导致IVD序列与各ORF发生“框内”融合。
对于优先在绿色组织中和种子中线粒体靶向的组成型表达，在载体VC-MME445-1qcz的背景中对来自酿酒酵母和大肠杆菌的ORF使用PcUbi启动子，每种情况下导致IVD序列与各ORF发生“框内”融合。
其它有用的双元载体对于技术人员是公知的；可在Hellens R.，Mullineaux P.和Klee H.，(Trends in Plant Science，5(10)，446(2000))中发现双元载体及其用途的概述。此类载体需要同样装配适合的启动子和靶向序列。
[0241.1.1.1]在不同表达载体中克隆表I第5列中显示的本发明序列对于将来自酿酒酵母的SEQ ID NO：724 ORF克隆至含Resgen接头序列的载体中，用限制性内切酶NcoI处理各个载体DNA。对于将来自酿酒酵母的ORF克隆至含Colic接头序列的载体中，按照标准方案用限制性内切酶PacI和NcoI处理各个载体DNA(MBI Fermentas)。对于来自大肠杆菌的ORF的克隆，按照标准方案用限制性内切酶PacI和NcoI处理载体DNA(MBI Fermentas)。在所有情况中，通过在70℃失活20分钟来停止反应并按标准方案经QIAquick或NucleoSpin Extract II柱(Qiagen或Macherey-Nagel)进行纯化。
然后按标准方案用T4 DNA聚合酶(MBI Fermentas)处理代表具有各个接头序列的扩增ORF的PCR产物和载体DNA，以产生单链突出端，对于载体所用参数为1单位T4 DNA聚合酶在37℃处理2-10分钟，对于代表SEQ ID NO：724的PCR产物所用参数为1-2单位的T4 DNA聚合酶在15-17℃处理10-60分钟。
通过加入高盐缓冲液终止反应并按标准方案经QIAquick或NucleoSpin Extract II柱(Qiagen或Macherey-Nagel)纯化。
根据本实施例，本领域技术人员能够克隆表I(优选第5列)所公开的全部序列。
[0242.1.1.1]将约30-60ng的制备的载体与确定量的所制备扩增物混合，并在以下条件下杂交：65℃ 15分钟，其后为37℃ 0.1℃/1秒，其后为37℃ 10分钟，然后为0.1℃/1秒，然后为4-10℃。
通过以下步骤在同一反应容器中转化连接的构建体：加入感受态大肠杆菌细胞(菌株DH5α)，然后1℃孵育20分钟，然后42℃热激90秒，并冷却至1-4℃。然后加入完全培养基(SOC)并将混合物在37℃下孵育45分钟。然后将全部混合物置于含有0.05mg/ml卡那霉素的琼脂平板上，并在37℃孵育过夜。
[0243.1.1.1]通过以下步骤验证克隆步骤的结果：借助于结合整合位点上游及下游的引物进行扩增，从而允许扩增插入片段。根据Taq DNA聚合酶(Gibco-BRL)的方案进行扩增。
扩增循环如下：94℃ 1-5分钟，1个循环，随后每个循环94℃ 15-60秒，50-66℃ 15-60秒并在72℃ 5-15分钟，35个循环，随后72℃ 10分钟，1个循环，然后4-16℃。
[0244.1.1.1]检查了若干菌落，但仅使用检测到预计大小的PCR产物的1个菌落用于下述步骤。
将一部分该阳性菌落转移至充满补充卡那霉素的完全培养基(LB)的反应容器中并在37℃温育过夜。
如Qiaprep或NucleoSpin Multi-96 Plus标准方案(Qiagen或Macherey-Nagel)中详细说明来进行质粒制备。
[0245.1.1.1]产生表达SEQ ID NO：63或表I(优选第5列)所示任何其他序列的转基因植物
通过电穿孔或转化将1-5ng分离的质粒DNA转化进菌株GV 3101pMP90(Koncz和Schell，Mol.Gen.Gent.204，383-396，1986)根癌农杆菌感受态细胞。其后，加入完全培养基(YEP)并将混合物转移至新的反应容器中，28℃3小时。其后，将全部反应混合物接种到含有相应抗生素(如利福平(0.1mg/ml)、庆大霉素(0.025mg/ml)和卡那霉素(0.05mg/ml))的YEP琼脂平板，并在28℃孵育48小时。
接着将含有该质粒构建体的农杆菌用于转化植物。
[0246.1.1.1]用移液器尖端从琼脂平板上挑取菌落并置于也含有上述合适抗生素的3ml液体TB培养基中。将预培养物在28℃和120rpm下培养48小时。
将含有相同抗生素的400ml LB培养基用于主要培养。将预培养物转移至主培养物。在28℃和120rpm下培养18小时。4000rpm离心后，将沉淀重悬于渗透培养基(MS培养基，10％蔗糖)。
[0247.1.1.1]为了培养用于转化的植物，在盘(Piki Saat 80，绿色，具有网格底，30×20×4.5cm，来自Wiesauplast，Kunststofftechnik，Germany)半充入GS 90基质(标准土，Werkverband E.V.，Germany)。将盘用0.05％Proplant溶液(Chimac-Apriphar，Belgium)浇水过夜。将拟南芥C24种子(Nottingham Arabidopsis Stock Centre，UK；NASC Stock N906)洒在盘中，每盘约1000个种子。用罩罩上盘，并置于分层设备中(8小时，110μmol/m2/s-1，22℃；16小时，黑暗，6℃)。5天后，将盘置于短日照受控环境箱中(8小时，130μmol/m2/s-1，22℃；16小时，黑暗，20℃)，保持约10天直至形成第一片真叶。
[0248.1.1.1]将苗转移至含有相同基质的盆(Teku盆，7cm，LC系列，生产商
Figure BDA0000055835940001841
GmbH & Co，Ger-many)中。从每个盘中挑出5株植物。然后将盆返回短日照受控环境箱中使植物继续生长。
10天后，将植物转移至温室(补充光照，16小时，340μE，22℃；8小时，黑暗，20℃)，让其再生长17天。
[0249.1.1.1]为进行转化，将刚开始开花的6周龄拟南芥植株浸入上述已用10μl Silwett L77(Crompton S.A.，Osi Specialties，Switzerland)处理的农杆菌悬液中10秒。该方法描述于Clough和Bent，1998(Clough，JC和Bent，AF.1998 Floral dip：a simplified method forAgrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana，Plant J.16：735-743)。
然后将植物置于加湿箱中18小时。其后，将盆放回温室中使植物继续生长。将植物在温室中再保持10周，直至可收获种子。
[0250.1.1.1]取决于用于选择转化植物的抗性标记，将收获的种子种植于温室中并进行喷洒选择，或者先消毒然后在补充了相应选择剂的琼脂平板上培养。由于载体含有bar基因作为抗性标记，因此以2至3天的间隔向小植物喷洒0.02％
Figure BDA0000055835940001851
并使转化植物结籽。
将转基因拟南芥植物的种子保存于冰箱(-20℃)中。
[0251.1.1.1]在循环干旱测定中，向植物施用重复胁迫，但不导致干旱。在标准实验中，土壤制备为营养丰富土(GS90，Tantau，Wansdorf，Germany)和石英砂的1∶1(v/v)混合物。将盆(6cm直径)中装满该混合物并置于盘中。向盘中加水，以使土壤混合物吸收足量的水用于播种步骤(第1天)，然后将转基因拟南芥植物和野生型对照的种子播种在盆中。然后将装满的盘用透明盖盖上，并转移至预冷(4℃至5℃)的黑暗培养箱中。在黑暗中在4℃至5℃3天建立分层，或者在黑暗中在4℃下4天进行分层。在以下条件下起始种子萌发和生长：20℃，60％相对湿度，16小时光周期，用荧光灯以200μmol/m2s或220μmol/m2s照明。播种后7-8天除去盖子。在第10或11天(播种后第9或10天)通过从上方向盆中对小植株进行喷洒来进行BASTA选择。在标准实验中，喷洒自来水中BASTA浓缩物(183g/L草铵膦)的0.07％(v∶v)溶液一次，或者喷洒0.02％(v/v)的BASTA溶液3次。野生型对照植物仅喷洒自来水(而不是喷洒溶于自来水中的BASTA)，但其他处理均相同。播种后13-14天通过除去多余的苗而在土中留下一个苗对植物进行分盆。将转基因事件和野生型对照植物均匀分布在培养箱中。
[0252.1.1.1]实验全程中的供水都是有限的，并且对植物施加干旱与再浇水的循环。浇水在第1天(播种前)、第14或15天、第21或22天以及最后第27或28天进行。为了测量生物量产生，在最后一次浇水(第28或第29天)之后一天，通过剪下嫩枝并称重来测定植物鲜重。除了称重以外，在植物与野生型对照不同的情况下加入表型信息。植物在收获时为开花之前和长出花序之前的阶段。通过应用”斯氏”t检验(参数：双边，不等方差)计算生物量改变的统计学显著性的显著性值。
[0253.1.1.1]在标准方法中，进行三个连续实验。在第一个实验中，检测每一转化株系/事件的一个独立植株。
[0253.2.1.1]在第二个实验中，在第一个实验中已评定为循环耐旱或抗旱的株系(即与野生型相比显示出增加的产量生产，该情况下为提高的生物量生产)按照相同的实验程序进行验证筛选。在该实验中，如前培养、处理并测定每一耐受性或抗性事件的最多10株植株。
[0254.1.1.1]在前两个实验中，与野生型植株比较循环干旱抗性或耐受性和生物量产生。
[0255.1.1.1]在第三次实验中，如前培育、处理并评定每一验证的耐受性事件的多达20个重复植株，即在第二次实验中已评定为耐受性或抗性的那些植株。在表1中汇总了其结果。
[0256.1.1.1]表VIIIa：循环干旱生长条件下发育的转基因拟南芥的生物量产生。通过称重植物莲座测定生物量产生。生物量增加计算为来自同一实验的转基因植物的平均重量与野生型对照植物的平均重量的比值。为一个基因座给出了转基因事件组内见到的最大生物量增加，所述基因座的所有那些事件显示出显著性值≤0.1且生物量增加≥10％(比值≥1.1)。
表VIII-A：
    SeqI     靶标     基因座     生物量增加
    D
    63     质体     B0312     1.577
    623     细胞质     B3182     1.200
    724     细胞质     Yal043c-a     1.570
    728     质体     Ybr071w     1.673
    732     细胞质     Ybr180w     1.381
    764     细胞质     Ydr284c     1.381
    814     细胞质     Ydr445c     1.299
    818     细胞质     Yhr047c     1.320
    925     质体     Yhr190w     1.550
    1021     细胞质     Ykl094w     1.408
    1157     细胞质     Ykr097w     1.698
    1352     细胞质     Ynr012w     1.377
    1423     质体     Ypl133c     1.500
[0257.1.1.1]实施例2
通过使用胁迫诱导型启动子和组织特异性启动子过表达来自酿酒酵母或大肠杆菌的胁迫相关蛋白质编码基因来改造优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下具有提高产量的拟南芥植物。
如实施例1中产生转基因拟南芥植物，以在组织特异性或胁迫诱导型启动子的控制下表达编码胁迫相关蛋白质的转基因。
在两次实验中产生T2代植株并用干旱胁迫处理。夺取植物水分，直至植物和土壤干燥。在等同程度的干旱胁迫下测定生物量产生，耐受植株比非转基因对照植株产生更多的生物量。
实施例3
来自酿酒酵母或大肠杆菌的胁迫相关基因的过表达提供了对多种非生物胁迫的耐受性。
对一种非生物胁迫显示耐受性的植物经常对另一种环境胁迫也显示出耐受性。这种交叉耐受性现象在机制水平上还不清楚(McKersie和Leshem，1994)。然而，可合理的预期由于表达转基因而显示提高耐旱性的植物可能也对冷或盐和其它非生物胁迫显示耐受性。支持该假设的是，几个基因的表达受多种非生物胁迫因素包括冷、盐、渗压剂、ABA等的上调或下调(例如Hong等.(1992)Developmental and organ-specific expression of anABA-and stress-induced protein in barley.Plant Mol Biol 18：663-674；Jagendorf和Takabe(2001)Inducers of glycinebetaine synthesis in barley.Plant Physiol 127：1827-1835)；Mizoguchi等(1996)A gene encoding amitogen-activated protein kinase is induced simultaneously with genes fora mitogen-activated protein kinase and an S6 ribosomal protein kinase bytouch，cold，and water stress in Arabidopsis thaliana.Proc Natl Acad Sci US A 93：765-769；Zhu(2001)Cell signaling under salt，water and coldstresses.Curr Opin Plant Biol 4：401-406)。
为了测定耐盐性，将拟南芥种子消毒(在100％漂白剂，0.1％ TritonX中5分钟(两次)并用ddH2O冲洗五次)。种子接种在非选择性培养基上(1/2 MS、0.6％植物琼脂、0.5g/L MES、1％蔗糖、2μg/ml benamyl)。允许种子萌发约10天。在4-5叶期，将转基因植物栽在直径为5.5cm的盆中，并允许其生长(22℃，持续光照)大约7天，需要时进行浇水。为了开始测定，向盆下面的托盘中加入2升100mM NaCl和1/8MS。向含有对照植物的托盘中加入3升1/8MS。NaCl补充物的浓度从50mM每4天逐步提高至200mM。在用200mM进行盐处理后，测定植物的鲜重和存活率以及生物量产生。
为了测定耐冷性，萌发转基因株系的种子并如上生长大约10天至4-5叶期。植物然后转移至冷温度(5℃)并可生长至发育的开花和结籽阶段。使用叶绿素荧光测定光合作用作为光合适应性和光合系统完整性的指标。测定存活率和植物生物量产生作为种子产量的指标。
对盐度或寒冷具有耐受性的植株比易感植株具有更高的存活率和生物量产生，包括种子产量和干物质产生。
为了测定干旱耐受性，将幼苗保持不浇水状态至3周的时间，此时植株和土壤均干燥，并测定幼苗的存活和生物量产生。在同等干旱胁迫程度下，耐受植株比易感植株具有更高的存活率和生物量产生，包括种子产量、光合作用及干物质产生。
在循环干旱测定中，在不导致脱水情况下向植株施用重复性胁迫。在整个实验中限制供水并使植株处于干旱和再浇水的循环中。在第1天(播种前)、第14天或第15天、第21天或第22天、和最终第27天或第28天进行浇水。对为测量生物量产生，在最终浇水(第28天或第29天)后一天通过切除苗并对其称重来测定植株鲜重。除称重外，在不同于野生型对照的植物的情况下，加入表型信息。在植株处于开花前或花序生长前的阶段时收获。通过用“斯氏”t检验(参数：双边，不等方差)计算生物量变化的统计学显著性的显著性值。
实施例4
通过过表达来自酿酒酵母或大肠杆菌的胁迫相关基因改造优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下具有提高产量的苜蓿植物
使用(McKersie等，1999 Plant Physiol 119：839-847)的方法再生苜蓿(Medicago sativa)的克隆。苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的，因此需要再生植物。获得再生植物的方法已有描述。例如，它们可选自Rangelander栽培种(Agriculture Canada)或任何其他市售的苜蓿变种，如Brown D.C.W.和Atanassov A.(1985.Plant Cell Tissue Organ Culture 4：111-112)所述。或者选择RA3变种(University of Wisconsin)用于组织培养(Walker等，1978 Am J Bot 65：654-659)。
将叶柄外植体与含有双元载体的根癌农杆菌C58C1 pMP90(McKersie等，1999 Plant Physiol 119：839-847)或LBA4404共培养。已经描述了许多不同的双元载体系统用于植物转化(例如An，G.，Agrobacterium Protocols.Methods in Molecular Biology第44卷，第47-62页，Gartland KMA和MR Davey编辑Humana Press，Totowa，NewJersey)。许多是基于Bevan(Nucleic Acid Research.1984.12：8711-8721)描述的载体pBIN19，其包含植物基因表达盒，其侧翼为来自根癌农杆菌Ti质粒的左侧和右侧边界序列。植物基因表达盒由至少两个基因组成——选择标记基因和调节性状基因的cDNA或基因组DNA转录的植物启动子。可以使用不同的选择标记基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)的拟南芥基因(美国专利5,7673,666和6,225,105)。相似地，可以使用提供组成型、发育、组织或环境调节型基因转录的多种启动子来调节性状基因。在本实施例中，使用34S启动子(GenBank登记号M59930和X16673)来提供性状基因的组成型表达。
在黑暗中将外植体在含有288mg/L Pro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/L K2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基中共培养3天。将外植体在半强度Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤，并接种在相同的SH诱导培养基中，其中不含有乙酰丁香酮，而是含有合适的选择剂和合适的抗生素以抑制农杆菌生长。数周后，将体细胞胚转移到不含生长调节剂、不含抗生素并含有50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基。然后将体细胞胚在半强度Murashige-Skoog培养基中萌发。将生根的苗转移至盆中并在温室中培养。
通过节扦插繁殖T0代转基因植物并在Turface生长培养基中生根。使植物落叶并生长至大约10cm的高度(落叶后大约2周)。植物然后在两次实验中经受干旱胁迫。
对于循环干旱实验，在不导致脱水情况下向植物施用重复性胁迫。在整个实验中限制供水并使植物处于干旱和再浇水的循环中。在第1天(播种前)、第14天或第15天、第21天或第22天、和最终第27天或第28天进行浇水。为测量生物量产生，在最终浇水(第28天或第29天)后一天通过切除苗并对其称重来测定植物鲜重。同等干旱胁迫程度下，耐受植物比易感植物具有更高的存活率和生物量产生，包括种子产量、光合作用及干物质产生。
使用如实施例3中描述的方法测定干旱、盐度和冷的耐受性。对盐度和冷具有耐受性的植物比易感植物具有更高的存活率和生物量产生，包括种子产量、光合作用和干物质产生。
实施例5a
通过过表达来自酿酒酵母或大肠杆菌的胁迫相关基因改造优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下具有提高产量的黑麦植物
使用若干不同黑麦变种的种子作为用于转化的外植体的来源，包括可得自
Figure BDA0000055835940001911
Weibull种子公司的商品变种Gunne以及变种Affinity。将种子依次用1％ Tween-20表面灭菌1分钟，100％漂白剂60分钟，用去离子的蒸馏水洗涤3次，每次5分钟，然后在黑暗中在湿润的无菌滤纸上萌发3-4天。将苗再用1％ Tween-20灭菌1分钟，75％漂白剂5分钟，并用双蒸水洗涤3次，每次5分钟。
将表面灭菌的种子置于含有Mura-shige和Skoog基础盐和维生素、20g/l蔗糖、150mg/l天冬酰胺、500mg/l酪蛋白水解产物、3g/l Phytagel、10mg/l BAP和5mg/l麦草畏的愈伤组织诱导培养基中。将平板在在黑暗中在25℃下孵育4天，以进行种子萌发和胚胎发生愈伤组织的诱导。
在愈伤组织诱导培养基上4周后，剪去苗的嫩枝和根，将愈伤组织转移至新培养基，再培养4周，然后转移至光照下的MSO培养基2周。将几块愈伤组织(11-17周龄)通过10目筛并置于愈伤组织诱导培养基，或者在250ml瓶中100ml液体黑麦愈伤组织诱导培养基(与含有琼脂的愈伤组织诱导培养基相同)中培养。将瓶用铝箔包紧，并在黑暗中在23℃下以175rpm摇动1周。用40目筛将液体培养基过筛，收集细胞。将在筛上收集的级分铺板，并在25℃的黑暗中在固体黑麦愈伤组织诱导培养基上培养1周。接着将愈伤组织转移至含有1％蔗糖的MS培养基并培养2周。
转化可通过农杆菌或微粒轰击法来实现。产生在pUC载体中含有组成型植物启动子和基因cDNA的表达载体。根据生产商的说明，使用Qiagen试剂盒从大肠杆菌细胞中制备质粒DNA。将约2g胚胎发生愈伤组织涂在培养皿中无菌滤纸的中央。向滤纸上添加含有10g/L蔗糖的液体MSO等分试样。根据Sanford等，1993的方法，用质粒DNA包裹金颗粒(大小为1.0μm)，并以以下参数递送至胚胎发生愈伤组织：每次轰击500μg颗粒和2μg DNA，1300psi，停止板到愈伤组织板的靶标距离为8.5cm，每个愈伤组织平板轰击1次。
轰击后，将愈伤组织转移回新的愈伤组织发育培养基，并在黑暗中在室温下培养1周。然后将愈伤组织转移至25℃光照生长条件下，以用合适的选择剂(如250nM Arsenal、5mg/L PPT或50mg/L卡那霉素)起始胚分化。出现了对选择剂有抗性的嫩枝，并在腐烂后转移至土壤。
通过PCR分析原代转基因植物(T0)的样品，以证实T-DNA的存在。通过Southern杂交来验证这些结果，其中将DNA在1％琼脂糖凝胶上电泳并转移至带正电的尼龙膜(Roche Diagnostics)。使用PCR DIG探针合成试剂盒(Roche Diagnostics)通过PCR制备地高辛标记的探针，并根据生产商的推荐使用。
通过剪下分蘖对转基因T0黑麦植物进行无性繁殖。将移植的分蘖在温室中维持2个月，直至建立。脱去嫩枝的叶子并培养2周。
对于循环干旱实验，在不导致脱水情况下向植物施用重复性胁迫。在整个实验中限制供水并使植物处于干旱和再浇水的循环中。对于生物量产生测定，在最终浇水后一天通过切除苗并对其称重来测定植物鲜重。同等干旱胁迫程度下，耐受植物比易感植物具有更高的存活率和生物量产生，包括种子产量、光合作用及干物质产生。
实施例5b
通过过表达来自酿酒酵母或大肠杆菌的胁迫相关基因改造优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下具有提高产量的稻植物
稻转化
用含有本发明表达载体的农杆菌转化水稻植物。将水稻栽培种Nipponbare的成熟干种子脱壳。通过在70％乙醇中孵育1分钟然后在0.2％HgCl2中孵育30分钟来进行灭菌，然后用无菌蒸馏水洗涤6次，每次15分钟。然后使无菌种子在含有2，4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。在黑暗中孵育4周后，剪下胚胎发生的来自盾片的愈伤组织，并在相同培养基上繁殖。2周后，通过在相同培养基上再传代培养2周来繁殖或增殖愈伤组织。在共培养前3天将胚胎发生愈伤组织块在新培养基上传代培养3天(以增强细胞分裂活性)。
使用含有本发明表达载体的农杆菌菌株LBA4404进行共培养。将农杆菌接种在含有适当抗生素的AB培养基上并在28℃下培养3天。然后收集细菌并重悬于液体共培养培养基中至密度(OD600)约为1。然后将悬液转移至培养皿，并将愈伤组织浸没在悬液中15分钟。然后将愈伤组织在滤纸上吸干并转移至固化的共培养培养基，在黑暗中以25℃孵育3天。在选择剂存在下，在黑暗中以28℃将共培养的愈伤组织在含有2，4-D的培养基上培养4周。在此期间，产生了迅速生长的抗性愈伤组织岛。将该材料转移至再生培养基并在光下孵育后，胚胎发生势被释放，并在接下来的4至5周中发育出嫩枝。从愈伤组织上剪下嫩枝并在含有生长素的培养基上培养2至3周，然后转移至土壤。在温室中将变硬的嫩枝在高湿度和短日照下培养。
对一个构建体产生约35个独立的T0水稻转化体。将原代转化体从组织培养室中转移至温室。用定量PCR分析确认T-DNA插入片段的拷贝数后，仅保留对选择剂显示耐性的单拷贝转基因植物用于收获T1种子。然后在将苗移植后3至5个月收获种子。该方法以高于50％的比例获得单基因座转化体(Aldemita和Hodges1996，Chan等1993，Hiei等1994)。
对于循环干旱测定，在不导致脱水情况下向植物施用反复胁迫。在整个实验中限制供水并将植物处于干旱和再浇水的循环中。对于测定生物量产生，在最后浇水后一天通过切除苗并对其称重测定植物鲜重。
实施例6
通过过表达来自酿酒酵母或大肠杆菌的胁迫相关基因改造优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下具有提高产量的大豆植物
根据Texas A&M patent US 5,164,310中描述的方法的以下修饰转化大豆。几种市售大豆品种易于通过该方法进行转化。Jack栽培种(从IllinoisSeed Foundation获得)通常用于转化。种子通过在70％(v/v)乙醇中浸泡6分钟，在添加0.1％(v/v)Tween的25％市售漂白剂(NaOCl)中20分钟，然后用无菌双蒸水冲洗4次来消毒。通过从每株苗上去除胚根、下胚轴和一片子叶来繁殖7天龄的苗。然后，将具有一片子叶的上胚轴转移到培养皿中的新鲜萌发培养基中并在25℃，16小时光周期(约100μE/(m-2s-1))下温育三周。从3-4周龄植物上切下腋生节(长度约4mm)。将腋生节切断并在农杆菌LBA4404培养物中温育。
已经描述了用于植物转化的许多不同的双元载体系统(例如An，G.Agrobacterium Protocols.Methods in Molecular Biology第44卷，第47-62页，Gartland KMA and MR Davey编辑Humana Press，Totowa，New Jersey)。许多是基于Bevan(Nucleic Acid Research.1984.12：8711-8721)描述的载体pBIN19，其包括侧翼为来自根癌农杆菌Ti质粒的左边界和右边界序列的植物基因表达盒。植物基因表达盒由至少两个基因组成-选择标记基因和调节性状基因的cDNA或基因组DNA转录的植物启动子。可使用多种选择标记基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)酶(美国专利57673666和6225105)的拟南芥基因。类似地，多种启动子可用于调节性状基因，以提供基因转录的组成型、发育、组织或环境的调节。在该实施例中，34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)用于提供性状基因的组成型表达。
在共培养处理后，洗涤外植体并转移到补充有500mg/L特美汀的选择培养基中。将茎切断并置于茎伸长培养基上。长于1cm的茎置于生根培养基上2到4周后移植到土壤中。
通过PCR分析原代转基因植物(T0)，以证实T-DNA的存在。通过DNA杂交证实这些结果，在所述杂交中DNA在1％琼脂糖凝胶上进行电泳并转移到带正电的尼龙膜(Roche Diagnostics)上。PCR DIG Probe Synthesis Kit(Roche Diagnostics)用于通过PCR制备洋地黄毒苷标记的探针，并根据制造商的建议使用。
耐受性植物具有更高的种子产量。
使用如实施例3中描述的方法测定对干旱、盐度和冷的耐受性。耐受植物比易感植物具有更高的存活率和生物量生产，包括种子产量、光合作用和干物质产生。
实施例7
通过过表达来自酿酒酵母或大肠杆菌的胁迫相关基因改造优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下具有提高产量的油菜/芸苔植物
5-6天龄幼苗的子叶柄和下胚轴用作组织培养的外植体并根据Babic等(1998，Plant Cell Rep 17：183-188)进行转化。市售栽培种Westar(Agriculture Canada)是用于转化的标准品种，但也可以使用其它品种。
含有双元载体的根癌农杆菌LBA4404可用于芸苔转化。已经描述了用于植物转化的许多不同的双元载体系统(例如An，G.AgrobacteriumProtocols.Methods in Molecular Biology第44卷，第47-62页，GartlandKMA和MR Davey编辑Humana Press，Totowa，New Jersey)。许多基于Bevan(Nucleic Acid Research.1984.12：8711-8721)描述的载体pBIN19，其包括侧翼为来自根癌农杆菌Ti质粒的左边界和右边界序列的植物基因表达盒。植物基因表达盒由至少两个基因组成-选择标记基因和调节性状基因的cDNA或基因组DNA转录的植物启动子。可使用多种选择标记基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)酶(美国专利57673666和6225105)的拟南芥基因。类似地，多种启动子可用于调节性状基因，以提供基因转录的组成型、发育、组织或环境的调节。在该实施例中，34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)用于提供性状基因的组成型表达。
在70％乙醇中2分钟，然后在含一滴Tween-20的30％ Clorox中10分钟，接着用无菌蒸馏水冲洗三次对芸苔种子进行表面消毒。种子然后在不含激素、含有1％蔗糖、0.7％植物激素的半强度MS培养基上，23℃，16小时光照下体外萌发5天。从体外幼苗切除附着子叶的子叶柄外植体，并通过将叶柄外植体的切口端浸入细菌悬浮液中用农杆菌接种。外植体然后在23℃，16小时光照下，在含3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％植物琼脂的MSBAP-3培养基上培养2天。与农杆菌共培养2天后，将叶柄外植体转移到含3mg/l BAP、头孢噻肟、羟苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基上7天，然后在含头孢噻肟、羟苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养，直至茎再生。当茎的长度为5-10mm时，将其切掉并转移到茎伸长培养基(MSBAP-0.5，含有0.5mg/l BAP)上。将长度约2cm的茎转移到生根培养基(MS0)上用于根的诱导。
通过PCR分析原代转基因植物(T0)的样品，以证实T-DNA的存在。通过DNA杂交证实这些结果，在所述杂交中DNA在1％琼脂糖凝胶上进行电泳并转移到带正电的尼龙膜(Roche Diagnostics)上。PCR DIG ProbeSynthesis Kit(Roche Diagnostics)通过PCR制备洋地黄毒苷标记的探针，并根据制造商的建议使用。
使用如前述实施例3中所述方法测定对循环干旱、干旱、盐度和冷的耐受性。耐受植物比易感植物具有更高的存活率和生物量产生，包括种子产量、光合作用和干物质产生。
实施例8
通过过表达来自酿酒酵母或大肠杆菌的胁迫相关基因改造优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下具有提高产量的玉米植物
用Ishida等(1996.Nature Biotech 14745-50)描述方法的修饰进行玉米(Zea mays L.)的转化。转化在玉米中是基因型依赖性的，并且仅特定基因型易于转化和再生。近交系A188(University of Minnesota)或与作为亲本的A188的杂交系是用于转化的供体材料的良好来源(Fromm等1990Biotech 8：833-839)，但也可成功使用其它基因型。当未成熟胚长度约为1到1.2mm时，在授粉后大约11天(DAP)从玉米植物上收获穗。未成熟胚与携带“超级双元”载体的根癌农杆菌共培养，并通过器官发生恢复转基因植物。在WO专利WO94/00977和WO95/06722中描述了日本烟草(JapanTobacco)的超级双元载体系统。如描述的来构建载体。可使用多种选择标记基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)酶(US专利6025541)的玉米基因。类似地，多种启动子可用于调节性状基因，以提供基因转录的组成型、发育、组织或环境的调节。在该实施例中，34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)用于提供性状基因的组成型表达。
切掉的胚在愈伤组织诱导培养基上生长，然后在含有作为选择剂的咪唑啉酮的玉米再生培养基上生长。培养皿在光照下25℃培育2-3周，或直至长出茎。将各个胚上的绿色茎转移到玉米生根培养基上，并在25℃培育2-3周，直至生出根。生根的茎移植到温室的土壤中。从对咪唑啉酮除草剂显示耐受性并且对所述转基因PCR阳性的植物产生T1种子。
随后评估T1转基因植物改善的胁迫耐受性。对于循环干旱测定，在不导致脱水情况下施用反复胁迫。在整个实验中限制供水并将植物进行干旱和再浇水的循环。对于生物量产生测定，在最终浇水后一天通过切除茎并对其称重测定植物鲜重。
T-DNA的单基因座插入的T1代的该转基因将以3∶1比例中分离。含有转基因的一个或两个拷贝的那些后代对咪唑啉酮除草剂有耐受性，并比缺少转基因的那些后代显示更高的干旱胁迫耐受性。耐受植物比易感植物具有更高的存活率和生物量产生，包括种子产量、光合作用和干物质产生。纯合的T2植物显示相似的表型。纯合转基因植物和未转基因植物的杂交植物(F1后代)也显示出提高的环境胁迫耐受性。
使用前述实施例3中描述的方法测定对干旱、盐和冷的耐受性。耐受植物比易感植物具有更高的存活率和生物量产生，包括种子产量、光合作用和干物质产生。
实施例9
通过过表达来自酿酒酵母或大肠杆菌的胁迫相关基因改造优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下具有提高产量的小麦植物
利用Ishida等(1996 Nature Biotech.14745-50)描述的方法进行小麦的转化。栽培种Bobwhite(从CYMMIT，Mexico获得)通常用于转化。未成熟胚与携带“超级双元”载体的根癌农杆菌共培养，并通过器官发生恢复转基因植物。在WO专利WO94/00977和WO95/06722中描述了日本烟草(Japan Tobacco)的超级双元载体系统。如描述的来构建载体。可使用多种选择标记基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)酶(US专利6025541)的玉米基因。类似地，多种启动子可用于调节性状基因，以提供基因转录的组成型、发育、组织或环境的调节。在该实施例中，34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)用于提供性状基因的组成型表达。
与农杆菌温育后，胚在愈伤组织诱导培养基上生长，然后在含有作为选择剂的咪唑啉酮的玉米再生培养基上生长。培养皿在光照下25℃培育2-3周，或直至长出茎。将各个胚上的绿色茎转移到玉米生根培养基上，并在25℃培育2-3周，直至生出根。生根的茎移植到温室的土壤中。从对咪唑啉酮除草剂显示耐受性并且对所述转基因PCR阳性的植物产生T1种子。
然后根据前述实施例3所述的方法评估T1代转基因植物提高的胁迫耐受性。T-DNA的单基因座插入的T1代的转基因将以3∶1比例分离。含有转基因的一个或两个拷贝的那些后代对咪唑啉酮除草剂有耐受性，并比缺少转基因的那些后代显示更高的干旱胁迫耐受性。耐受植物比易感植物具有更高的存活率和生物量产生，包括种子产量、光合作用和干物质产生。纯合的T2植物显示相似的表型。使用前述实施例中描述的方法测定对盐度和寒冷的耐受性。耐受植物比易感植物显示更高的存活率和生物量产生，包括种子产量、光合作用和干物质产生。
实施例10
鉴定相同基因和异源基因
可使用基因序列来从cDNA或基因组文库中鉴定相同基因或异源基因。例如可使用cDNA文库通过核酸杂交分离相同基因(例如全长cDNA克隆)。根据目的基因的丰度，将100,000最高至1,000,000个重组噬菌体平板接种并转移至尼龙膜上。用碱变性后，DNA例如通过UV交联固定到膜上。在高严格条件下进行杂交。在水溶液中，在1M NaCl的离子强度和68℃温度下进行杂交和洗涤。例如通过放射性(32P)切口转录标记(HighPrime，Roche，Mannheim，Germany)产生杂交探针。通过放射自显影检测信号。
可以用与如上描述方法相似的方式使用低严格的杂交和洗涤条件来鉴定相关但不完全相同的部分相同的基因或异源基因。对于水溶液杂交，离子强度通常保持1M NaCl，而温度从68℃逐渐降低到42℃。
可使用合成的放射性标记寡核苷酸探针进行仅在不同结构域(例如10-20个氨基酸)具有同源性(或序列同一性/相似性)的基因序列的分离。通过用T4多核苷酸激酶对两条互补寡核苷酸的5’端进行磷酸化来制备放射性标记的寡核苷酸。将互补的寡核苷酸退火并连接形成连环体。随后例如通过切口转录对双链连环体进行放射性标记。通常使用高寡核苷酸浓度在低严格条件下进行杂交。
寡核苷酸杂交溶液：
6x SSC
0.01M磷酸钠
1mM EDTA(pH 8)
0.5％SDS
100μg/ml变性鲑精DNA
0.1％脱脂奶粉
在杂交过程中，将温度逐步降低至估计的寡核苷酸Tm值以下5-10℃或低于室温5-10℃，随后进行洗涤步骤和放射自显影。用低严格性如使用4x SSC的3次洗涤步骤进行洗涤。其它细节描述由Sambrook，J.等，1989，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual，”Cold Spring HarborLaboratory Press或Ausubel，F.M.等，1994，“Current Protocols inMolecular Biology，”John Wiley & Sons描述。
实施例11
通过用抗体筛选表达文库鉴定相同的基因
例如在大肠杆菌(例如Qiagen QIAexpress pQE系统)中使用c-DNA克隆来制备重组多肽。重组多肽然后通常经过Ni-NTA亲和层析(Qiagen)进行亲和纯化。然后例如使用用于兔免疫接种的标准技术，使用重组多肽制备特异性抗体。如Gu等，1994，BioTechniques 17：257-262所述，使用以重组抗原饱和的Ni-NTA柱对抗体进行亲和纯化。所述抗体然后可用于筛选表达cDNA文库，以经过免疫筛选鉴定相同基因或异源基因(Sambrook，J.等，1989，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual，”Cold SpringHarbor Laboratory Press或Ausubel，F.M.等，1994，“Current Protocols inMolecular Biology”，John Wiley & Sons)。
实施例12
体内诱变
可通过在大肠杆菌或其它微生物(例如芽孢杆菌或酵母，如酿酒酵母)中传代质粒(或其它载体)DNA来进行微生物的体内诱变，所述微生物维持遗传信息完整性的能力受损。典型的增变株在用于DNA修复系统的基因中具有突变(例如mutHLS、mutD、mutT等；参考见W.D.，1996，DNArepair mechanisms，Escherichia coli and Salmonella，第2277-2294页，ASM：Washington.)。这类菌株为本领域技术人员所熟知。例如在Greener，A.和Callahan，M.，1994，Strategies 7：32-34中说明了这类菌株的用途。优选在微生物中进行选择和测试后完成突变DNA分子向植物的转移。根据本文示例内的多个实例产生转基因植物。
实施例13
使用胁迫诱导型和组织特异性启动子，通过过表达例如来自欧洲油菜、大豆、玉米或稻的产量和胁迫相关蛋白质编码基因来改造优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下具有提高产量的拟南芥植物。
如实施例1中所述，例如产生过表达来自欧洲油菜、大豆、玉米和稻的胁迫相关蛋白质编码基因的转基因拟南芥植物，以在组织特异性或胁迫诱导型启动子控制下表达编码胁迫相关蛋白质的编码转基因。使用选自上文表VI中列出的那些启动子来完成胁迫诱导型表达。
产生T2代植物并用胁迫处理。对于循环干旱测定，在不导致脱水情况下向植物施用重复性胁迫。在整个实验中限制供水并使植物处于干旱和再浇水的循环中。对于生物量产生测定，在最终浇水后一天通过切除茎并对其称重来测定植物鲜重。同等干旱胁迫程度下，耐受植物能够恢复正常生长并产生比非转基因对照植物更多的生物量。
耐受植物比易感植物具有更高的存活率和生物量产生，包括种子产量、光合作用和干物质产生。
实施例14
过表达例如来自欧洲油菜、大豆、玉米或稻的产量和胁迫相关基因例如提供对多种非生物胁迫的耐受性。
对一种非生物胁迫显示出耐受性的植物经常对另一种环境胁迫也显示耐受性。对于这种交叉耐受的现象在机制水平上还不清楚(McKersie和Leshem，1994)。然而，可以合理地预期由于表达转基因而显示提高的循环干旱耐受性的植物可能对干旱、寒冷、盐和其它非生物胁迫也显示出耐受性。支持该假设的是，几个基因的表达受多种非生物胁迫因素包括冷、盐、渗压剂、ABA等的上调或下调(例如Hong等(1992)Developmental andorgan-specific expression of an ABA-and stress-induced protein in barley.Plant Mol Biol 18：663-674；Jagendorf和Takabe(2001)Inducers ofglycinebetaine synthesis in barley.Plant Physiol 127：1827-1835)；Mizoguchi等(1996)A gene encoding a mitogen-activated protein kinase isinduced simultaneously with genes for a mitogen-activated protein kinaseand an S6 ribosomal protein kinase by touch，cold，and water stress inArabidopsis thaliana.Proc Natl Acad Sci U S A 93：765-769；Zhu(2001)Cell signaling under salt，water and cold stresses.Curr Opin Plant Biol 4：401-406)。
如实施例1中所述，例如产生过表达来自欧洲油菜、大豆、玉米和稻的胁迫相关蛋白质编码基因的转基因拟南芥植物并测试胁迫耐受性。
对于循环干旱测定，在不导致脱水的情况下向植物施用反复胁迫。在整个实验中限制供水并使植物处于干旱和再浇水的循环中。对于测定生物量产生，在最终浇水后一天通过切除茎并对其称重来测定植物鲜重。
为了测定耐盐性，将拟南芥种子消毒(在100％漂白剂，0.1％TritonX100中温育5分钟(两次)并用ddH2O冲洗五次)。种子接种在非选择性培养基上(1/2MS、0.6％植物琼脂、0.5g/L MES、1％蔗糖、2μg/mlbenamyl)。允许种子萌发约10天。在4-5叶期，将转基因植物栽在直径为5.5cm的盆中，并允许其生长(22℃，持续光照)大约7天，需要时进行浇水。为了开始测定，向盆下面的托盘中加入2升100mM NaCl和1/8MS。向含有对照植物的托盘中加入3升1/8 MS。NaCl补充物的浓度从50mM每4天逐步提高至200mM。在用200mM进行盐处理后，测定植物的鲜重和干重以及种子产量。过表达来自欧洲油菜、大豆、玉米和稻的胁迫相关蛋白质编码基因的转基因植物相比于野生型或模拟的转化植物例如显示更高的鲜重和干重，以及更高的种子产量。
为了测定耐冷性，如上萌发转基因株系和冷株系的种子并生长大约10天至4-5叶期。然后将植物转移至冷温度(5℃)。使用叶绿素荧光测定光合作用作为光合适应性和光合系统完整性的指标。测定种子产量和植物干重作为植物生物量产生的指标。
发现过表达来自欧洲油菜、大豆、玉米或稻的胁迫相关基因例如提供对循环干旱、盐和寒冷，以及干旱的耐受性。耐受植物比易感植物具有更高的存活率和生物量产生，包括种子产量、光合作用和干物质产生。
实施例15
通过过表达例如来自欧洲油菜、大豆、玉米或稻的产量胁迫相关基因改造优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下具有提高产量的苜蓿植物
使用McKersie等，1999(Plant Physiol 119：839-847)的方法转化苜蓿(紫花苜蓿)的再生克隆。苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的并因此需要再生植物。已经描述了获得再生植物的方法。例如，这些可选自Rangelander栽培种(Agriculture Canada)或如Brown和Atanassov(1985.Plant Cell Tissue Organ Culture 4：111-112)描述的任何其它商业苜蓿变种。或者，已经选择RA3变种(University of Wisconsin)用于组织培养(Walker等，1978 Am J Bot 65：654-659)。
叶柄外植体与含有双元载体的根癌农杆菌C58C1 pMP90(McKersie等，1999 Plant Physiol 119：839-847)或LBA4404的过夜培养物共培养。已经描述了许多不同的双元载体系统用于植物转化(例如An，G.，Agrobacterium Protocols.Methods in Molecular Biology第44卷，第47-62页，Gartland KMA和MR Davey编辑Humana Press，Totowa，NewJersey)。许多基于Bevan(Nucleic Acid Research.1984.12：8711-8721)描述的载体pBIN19，其包括侧翼为来自根癌农杆菌Ti质粒的左边界和右边界序列的植物基因表达盒。植物基因表达盒由至少两个基因组成-选择标记基因和调节性状基因的cDNA或基因组DNA转录的植物启动子。可使用多种选择标记基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)酶(美国专利57673666和6225105)的拟南芥基因。类似地，多种启动子可用于调节提供基因转录组成型、发育、组织或环境调节的性状基因。在该实施例中，34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)用于提供性状基因的组成型表达。
所述外植体在黑暗中，含有288mg/L Pro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/L K2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上共培养3天。在半强度Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤外植体，并接种在不含乙酰丁香酮但具有合适的选择剂和合适的抗生素的相同SH诱导培养基上，以抑制农杆菌生长。几周后，将体细胞胚转移到不含生长调节物、无抗生素，但含有50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基中。体细胞胚随后在半强度Murashige-Skoog培养基上萌发。将生根的苗移植到盆中并在温室中生长。
通过节扦插繁殖T0代转基因植物并在Turface生长培养基中生根。除去植物叶片并生长至大约10cm的高度(除叶后大约2周)。植物然后在两次实验中经受干旱胁迫。
对于循环干旱测定，在不导致脱水情况下向植物施用反复胁迫。在整个实验中限制供水并使植物处于干旱和再浇水的循环中。对于生物量产生测定，在最终浇水后一天通过切除茎并对其称重来测定植物鲜重。同等干旱胁迫程度下，耐受性转基因植物能正常生长而易感野生型植物已死亡或遭受显著伤害，导致更少的干物质。
使用如实施例3中描述的方法测定耐盐性和耐冷性。发现过表达来自欧洲油菜、大豆、玉米或稻的胁迫相关基因的苜蓿植物比非转基因对照植物更抗盐度和冷胁迫。耐受植物比易感植物具有更高的存活率和生物量产生，包括种子产量、光合作用和干物质产生。
实施例16a
通过过表达例如来自芸苔、大豆、玉米或稻的产量和胁迫相关基因改造优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下具有提高产量的黑麦植物
几种不同黑麦变种的种子可用作转化的外植体来源，包括可从SvalofWeibull种子公司获得的市售Gunne变种或Affinity变种。连续用1％Tween-20 1分钟，100％漂白剂60分钟，每次5分钟来将种子表面消毒，用去离子和蒸馏H2O冲洗3次，然后在暗中湿润、无菌滤纸上萌发3-4天。用1％ Tween-20 1分钟，75％漂白剂5分钟将幼苗进一步消毒，并用ddH2O冲洗3次，每次5分钟。
表面消毒的种子置于含Murashige和Skoog基本盐和维生素、20g/l蔗糖、150mg/l天冬酰胺、500mg/l酪蛋白水解物、3g/l植物凝胶、10mg/l BAP和5mg/l麦草畏的愈伤组织诱导培养基上。平板在黑暗中，25℃温育4周，用于种子萌发和胚发生愈伤组织诱导。
在愈伤组织诱导培养基上4周后，将苗的茎和根修剪掉，愈伤组织转移到新鲜培养基中，继续维持培养4周，然后转移到MSO培养基中光照下2周。若干块愈伤组织(11-17周龄)通过10目筛进行过滤并置于愈伤组织诱导培养基上，或在250ml烧瓶中100ml液体黑麦愈伤组织诱导培养基(具有琼脂的与用于愈伤组织诱导相同的培养基)中进行培养。用箔包住烧瓶并在暗中23℃，175rpm摇动1周。用40目筛筛选液体培养物收集细胞。将在筛子上收集的级分平板接种在固体黑麦愈伤组织诱导培养基上并在暗中25℃中培养1周。然后将愈伤组织转移到含1％蔗糖的MS培养基上并培养2周。
可以用农杆菌或微粒轰击方法完成转化。产生含有组成型植物启动子和pUC载体中基因的cDNA的表达载体。使用Qiagen试剂盒根据制造商说明书从大肠杆菌细胞中制备质粒DNA。将约2g胚发生愈伤组织扩散在培养皿中无菌滤纸的中央。向滤纸上加入含有10g/l蔗糖的液体MSO的等分试样。根据Sanford等，1993的方法用质粒DNA包被金颗粒(大小为1.0μm)并以下面的参数向胚发生愈伤组织中递送：每次轰击500μg颗粒和2μg DNA，1300psi和从制动平板到愈伤组织平板8.5cm的靶距离，以及每平板愈伤组织1次轰击。
在轰击后，将愈伤组织转移回新鲜愈伤组织发育培养基中，并在暗中室温下维持1周的时间。然后将愈伤组织转移到光下25℃的生长条件中，用适当选择剂，例如250nM Arsenal、5mg/l PPT或50mg/L卡那霉素启动胚分化。出现对选择剂具抗性的茎，并且一旦生根则转移到土壤中。
通过PCR分析原代转基因植物(T0)的样品，以证实T-DNA的存在。通过DNA杂交证实这些结果，在所述杂交中DNA在1％琼脂糖凝胶上进行电泳并转移到带正电的尼龙膜(Roche Diagnostics)上。PCR DIG ProbeSynthesis Kit(Roche Diagnostics)用于通过PCR制备洋地黄毒苷标记的探针，并根据制造商建议使用。
通过切掉分蘖无性繁殖转基因T0代黑麦植物。移植的分蘖在温室中维持2周，直至生长良好。将茎脱叶并允许生长2周。
对于循环干旱测定，在不导致脱水的情况下向植物施加反复胁迫。在整个实验中限制供水并使植物处于干旱和再浇水的循环中。对于测定生物量产生，在最终浇水后一天通过切除茎并对其称重来测定植物鲜重。在同等程度的干旱胁迫下，耐受植物能恢复正常生长而易感植物已死亡或受到明显损伤，导致更短的叶片和更少的干物质。
在转基因植物上施加干旱胁迫的第二次实验是通过用前述实施例中描述的PEG溶液进行处理。使用如实施例3中描述的方法测定耐盐性和耐冷性。发现过表达来自欧洲油菜、大豆、玉米或稻的胁迫相关基因的黑麦例如比非转基因对照植物对盐度和冷胁迫的抗性更高。耐受植物比易感植物具有更高的存活率和生物量产生，包括种子产量、光合作用和干物质产生。
实施例16b
通过过表达例如来自欧洲油菜、大豆、玉米或稻的产量和胁迫相关基因改造优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下具有提高产量的稻植物
稻转化
用含有本发明表达载体的农杆菌转化水稻植物。将水稻栽培种Nipponbare的成熟干种子脱壳。通过在70％乙醇中孵育1分钟然后在0.2％HgCl2中孵育30分钟来进行灭菌，然后用无菌蒸馏水洗涤6次，每次15分钟。然后使无菌种子在含有2，4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。在黑暗中孵育4周后，剪下胚胎发生的来自盾片的愈伤组织，并在相同培养基上繁殖。2周后，通过在相同培养基上再传代培养2周来繁殖或增殖愈伤组织。在共培养前3天将胚胎发生愈伤组织块在新培养基上传代培养3天(以增强细胞分裂活性)。
使用含有本发明表达载体的农杆菌菌株LBA4404进行共培养。将农杆菌接种在含有适当抗生素的AB培养基上并在28℃下培养3天。然后收集细菌并重悬于液体共培养培养基中至密度(OD600)约为1。然后将悬液转移至培养皿，并将愈伤组织浸没在悬液中15分钟。然后将愈伤组织在滤纸上吸干并转移至固化的共培养培养基，在黑暗中以25℃孵育3天。在选择剂存在下，在黑暗中以28℃将共培养的愈伤组织在含有2，4-D的培养基上培养4周。在此期间，产生了迅速生长的抗性愈伤组织岛。将该材料转移至再生培养基并在光下孵育后，胚胎发生势被释放，并在接下来的4至5周中发育出嫩枝。从愈伤组织上剪下嫩枝并在含有生长素的培养基上培养2至3周，然后转移至土壤。在温室中将变硬的嫩枝在高湿度和短日照下培养。
对一个构建体产生约35个独立的T0水稻转化体。将原代转化体从组织培养室中转移至温室。用定量PCR分析确认T-DNA插入片段的拷贝数后，仅保留对选择剂显示耐性的单拷贝转基因植物用于收获T1种子。然后在将苗移植后3至5个月收获种子。该方法以高于50％的比例获得单基因座转化体(Aldemita和Hodges1996，Chan等1993，Hiei等1994)。
对于循环干旱测定而言，对植物施加重复的胁迫而不导致脱水。实验全程中的供水都是有限的，并且对植物施加干旱与再浇水的循环。为了测量生物量产生，在最后一次浇水之后一天，通过剪下嫩枝并称重来测定植物鲜重。在同等程度的干旱胁迫下，耐性植物能恢复正常生长，而敏感植物已经死亡，或者发生显著损伤，导致叶更短或干物质更少。
实施例17
通过过表达例如来自欧洲油菜、大豆、玉米或稻的产量和胁迫相关基因改造优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下具有提高产量的大豆植物
根据Texas A&M patent US 5,164,310中描述的方法的以下修饰转化大豆。几种市售大豆品种易于通过该方法进行转化。Jack栽培种(从IllinoisSeed Foundation获得)通常用于转化。种子通过在70％(v/v)乙醇中浸泡6分钟，在添加0.1％(v/v)Tween的25％市售漂白剂(NaOCl)中20分钟，然后用无菌双蒸水冲洗4次来消毒。通过从每株苗上去除胚根、下胚轴和一片子叶来繁殖7天龄的苗。然后，将具有一片子叶的上胚轴转移到培养皿中的新鲜萌发培养基中并在25℃，16小时光周期(约100μE/(m-2s-1))下温育三周。从3-4周龄植物上切下腋生节(长度约4mm)。将腋生节切断并在农杆菌LBA4404培养物中温育。
已经描述了用于植物转化的许多不同的双元载体系统(例如An，G.Agrobacterium Protocols.Methods in Molecular Biology第44卷，第47-62页，Gartland KMA and MR Davey编辑Humana Press，Totowa，New Jersey)。许多是基于Bevan(Nucleic Acid Research.1984.12：8711-8721)描述的载体pBIN19，其包括侧翼为来自根癌农杆菌Ti质粒的左边界和右边界序列的植物基因表达盒。植物基因表达盒由至少两个基因组成-选择标记基因和调节性状基因的cDNA或基因组DNA转录的植物启动子。可使用多种选择标记基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)酶(美国专利57673666和6225105)的拟南芥基因。类似地，多种启动子可用于调节性状基因，以提供基因转录的组成型、发育、组织或环境的调节。在该实施例中，34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)用于提供性状基因的组成型表达。
在共培养处理后，洗涤外植体并转移到补充有500mg/L特美汀的选择培养基中。将茎切断并置于茎伸长培养基上。长于1cm的茎置于生根培养基上2到4周后移植到土壤中。
通过PCR分析原代转基因植物(T0)，以证实T-DNA的存在。通过DNA杂交证实这些结果，在所述杂交中DNA在1％琼脂糖凝胶上进行电泳并转移到带正电的尼龙膜(Roche Diagnostics)上。PCR DIG Probe Synthesis Kit(Roche Diagnostics)用于通过PCR制备洋地黄毒苷标记的探针，并根据制造商的建议使用。
对于循环干旱测定，在不导致脱水的情况下向植物施加反复胁迫。在整个实验中限制供水并将植物置于干旱和再浇水的循环中。对于测定生物量产生，在最终浇水后一天通过切除茎并对其称重来测定植物鲜重。在同等程度的干旱胁迫下，耐受性植物能恢复正常生长而易感植物已死亡或受到明显损伤，导致更短的叶片和更少的干物质。
过表达来自例如欧洲油菜、大豆、玉米或稻的胁迫相关基因的耐胁迫大豆植物具有更高的种子产量。
使用如实施例3中描述的方法测定对干旱、盐度和冷的耐受性。耐受植物比易感植物具有更高的存活率和生物量产生，包括种子产量、光合作用和干物质产生。
实施例18
通过过表达例如来自欧洲油菜、大豆、玉米或稻的产量和胁迫相关基因改造优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下具有提高产量的油菜/芸苔植物
5-6天龄幼苗的子叶柄和下胚轴用作组织培养的外植体并根据Babic等(1998，Plant Cell Rep 17：183-188)进行转化。市售栽培种Westar(Agriculture Canada)是用于转化的标准品种，但也可以使用其它品种。
含有双元载体的根癌农杆菌LBA4404可用于芸苔转化。已经描述了用于植物转化的许多不同的双元载体系统(例如An，G.AgrobacteriumProtocols.Methods in Molecular Biology第44卷，第47-62页，GartlandKMA和MR Davey编辑Humana Press，Totowa，New Jersey)。许多基于Bevan(Nucleic Acid Research.1984.12：8711-8721)描述的载体pBIN19，其包括侧翼为来自根癌农杆菌Ti质粒的左边界和右边界序列的植物基因表达盒。植物基因表达盒由至少两个基因组成-选择标记基因和调节性状基因的cDNA或基因组DNA转录的植物启动子。可使用多种选择标记基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)酶(美国专利57673666和6225105)的拟南芥基因。类似地，多种启动子可用于调节性状基因，以提供基因转录的组成型、发育、组织或环境的调节。在该实施例中，34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)用于提供性状基因的组成型表达。
在70％乙醇中2分钟，然后在含一滴Tween-20的30％ Clorox中10分钟，接着用无菌蒸馏水冲洗三次对芸苔种子进行表面消毒。种子然后在不含激素、含有1％蔗糖、0.7％植物激素的半强度MS培养基上，23℃，16小时光照下体外萌发5天。从体外幼苗切除附着子叶的子叶柄外植体，并通过将叶柄外植体的切口端浸入细菌悬浮液中用农杆菌接种。外植体然后在23℃，16小时光照下，在含3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％植物琼脂的MSBAP-3培养基上培养2天。与农杆菌共培养2天后，将叶柄外植体转移到含3mg/l BAP、头孢噻肟、羟苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基上7天，然后在含头孢噻肟、羟苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养，直至茎再生。当茎的长度为5-10mm时，将其切掉并转移到茎伸长培养基(MSBAP-0.5，含有0.5mg/l BAP)上。将长度约2cm的茎转移到生根培养基(MS0)上用于根的诱导。
通过PCR分析原代转基因植物(T0)的样品，以证实T-DNA的存在。通过DNA杂交证实这些结果，在所述杂交中DNA在1％琼脂糖凝胶上进行电泳并转移到带正电的尼龙膜(Roche Diagnostics)上。PCR DIG ProbeSynthesis Kit(Roche Diagnostics)通过PCR制备洋地黄毒苷标记的探针，并根据制造商的建议使用。
对于循环干旱测定，在不导致脱水的情况下向植物施加反复胁迫。在整个实验中限制供水并将植物置于干旱和再浇水的循环中。对于测定生物量产生，在最终浇水后一天通过切除茎并对其称重来测定植物鲜重。在同等程度的干旱胁迫下，耐受植物能恢复正常生长而易感植物已死亡或受到明显损伤，导致更短的叶片和更少的干物质。
然后根据实施例3中描述的方法评估转基因植物提高的胁迫耐受性。发现过表达来自例如欧洲油菜、大豆、玉米或稻的胁迫相关基因的转基因油菜/芸苔比非转基因对照植物对环境胁迫的耐受性更高。耐受植物比易感植物具有更高的存活率和生物量产生，包括种子产量、光合作用和干物质产生。
实施例19
通过过表达例如来自欧洲油菜、大豆、玉米或稻的产量和胁迫相关基因改造优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下具有提高产量的玉米植物用Ishida等(1996.Nature Biotech 14745-50)描述方法的修饰进行玉米(Zea mays L.)的转化。转化在玉米中是基因型依赖性的，并且仅特定基因型易于转化和再生。近交系A188(University of Minnesota)或与作为亲本的A188的杂交系是用于转化的供体材料的良好来源(Fromm等1990Biotech 8：833-839)，但也可成功使用其它基因型。当未成熟胚长度约为1到1.2mm时，在授粉后大约11天(DAP)从玉米植物上收获穗。未成熟胚与携带“超级双元”载体的根癌农杆菌共培养，并通过器官发生恢复转基因植物。在WO专利WO94/00977和WO95/06722中描述了日本烟草(JapanTobacco)的超级双元载体系统。如描述的来构建载体。可使用多种选择标记基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)酶(US专利6025541)的玉米基因。类似地，多种启动子可用于调节性状基因，以提供基因转录的组成型、发育、组织或环境的调节。在该实施例中，34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)用于提供性状基因的组成型表达。
切掉的胚在愈伤组织诱导培养基上生长，然后在含有作为选择剂的咪唑啉酮的玉米再生培养基上生长。培养皿在光照下25℃培育2-3周，或直至长出茎。将各个胚上的绿色茎转移到玉米生根培养基上，并在25℃培育2-3周，直至生出根。生根的茎移植到温室的土壤中。从对咪唑啉酮除草剂显示耐受性并且对所述转基因PCR阳性的植物产生T1种子。
然后根据实施例3所述的方法评估T1代转基因植物提高的胁迫耐受性。单基因座插入T-DNA的T1代对于转基因将以1∶2∶1比例分离。含有一个或两个拷贝转基因的那些后代(后代的3/4)对咪唑啉酮除草剂有耐受性，并比缺少该转基因的那些后代显示更大的干旱耐受性。耐受植物具有更高的种子产量。纯合的T2代显示相似的表型。纯合的转基因植物和非转基因植物的杂交植物(F1后代)也显示提高的环境胁迫耐受性。
对于循环干旱测定，在不导致脱水的情况下向植物施加反复胁迫。在整个实验中限制供水并将植物置于干旱和再浇水的循环中。对于测定生物量产生，在最终浇水后一天通过切除茎并对其称重来测定植物鲜重。在同等程度的干旱胁迫下，耐受植物能恢复正常生长而易感植物已死亡或受到明显损伤，导致更短的叶片和更少的干物质。
使用前述实施例3中描述的方法测定对盐和寒冷的耐受性。再次，发现过表达来自例如欧洲油菜、大豆、玉米或稻的胁迫相关基因的转基因玉米植物对环境胁迫具有耐受性。耐受植物比易感植物具有更高的存活率和生物量产生，包括种子产量、光合作用和干物质产生。
实施例20
通过过表达来自例如欧洲油菜、大豆、玉米或稻的产量和胁迫相关基因改造优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下具有提高产量的小麦植物
利用Ishida等(1996 Nature Biotech.14745-50)描述的方法进行小麦的转化。栽培种Bobwhite(从CYMMIT，Mexico获得)通常用于转化。未成熟胚与携带“超级双元”载体的根癌农杆菌共培养，并通过器官发生恢复转基因植物。在WO专利WO94/00977和WO95/06722中描述了日本烟草(Japan Tobacco)的超级双元载体系统。如描述的来构建载体。可使用多种选择标记基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)酶(US专利6025541)的玉米基因。类似地，多种启动子可用于调节性状基因，以提供基因转录的组成型、发育、组织或环境的调节。在该实施例中，34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)用于提供性状基因的组成型表达。
与农杆菌温育后，胚在愈伤组织诱导培养基上生长，然后在含有作为选择剂的咪唑啉酮的玉米再生培养基上生长。培养皿在光照下25℃培育2-3周，或直至长出茎。将各个胚上的绿色茎转移到玉米生根培养基上，并在25℃培育2-3周，直至生出根。生根的茎移植到温室的土壤中。从对咪唑啉酮除草剂显示耐受性并且对所述转基因PCR阳性的植物产生T1种子。
然后根据前述实施例3所述的方法评估T1代转基因植物提高的胁迫耐受性。
对于循环干旱测定，在不导致脱水的情况下向植物施加反复胁迫。在整个实验中限制供水并将植物置于干旱和再浇水的循环中。对于测定生物量产生，在最终浇水后一天通过切除茎并对其称重来测定植物鲜重。在同等程度的干旱胁迫下，耐受植物能恢复正常生长而易感植物已死亡或受到明显损伤，导致更短的叶片和更少的干物质。
单基因座插入T-DNA的T1代对于该转基因将以1∶2∶1比例分离。含有一个或两个拷贝转基因的那些后代(后代中的3/4)对咪唑啉酮除草剂有耐受性，并比缺少所述转基因的那些后代显示更高的干旱胁迫耐受性。耐受植物具有更高的种子产量。耐受植物比易感植物具有更高的存活率和生物量产生，包括种子产量、光合作用和干物质产生。纯合的T2代显示相似的表型。使用前述实施例中描述的方法测定对盐和寒冷的耐受性。过表达来自例如欧洲油菜、大豆、玉米或稻的胁迫相关基因的植物对干旱、盐或寒冷具有耐受性，并比易感植物显示更高的存活率和生物量产生，包括种子产量、光合作用和干物质产生。
实施例21
鉴定相同基因和异源基因
可使用基因序列来从cDNA或基因组文库中鉴定相同基因或异源基因。例如可使用cDNA文库通过核酸杂交分离相同基因(例如全长cDNA克隆)。根据目的基因的丰度，将100,000最高至1,000,000个重组噬菌体平板接种并转移至尼龙膜上。用碱变性后，DNA例如通过UV交联固定到膜上。在高严格条件下进行杂交。在水溶液中，在1M NaCl的离子强度和68℃温度下进行杂交和洗涤。例如通过放射性(32P)切口转录标记(HighPrime，Roche，Mannheim，Germany)产生杂交探针。通过放射自显影检测信号。
可以用与如上描述方法相似的方式使用低严格的杂交和洗涤条件来鉴定相关但不完全相同的部分相同的基因或异源基因。对于水溶液杂交，离子强度通常保持1M NaCl，而温度从68℃逐渐降低到42℃。
可使用合成的放射性标记寡核苷酸探针进行仅在不同结构域(例如10-20个氨基酸)具有同源性(或序列同一性/相似性)的基因序列的分离。通过用T4多核苷酸激酶对两条互补寡核苷酸的5’端进行磷酸化来制备放射性标记的寡核苷酸。将互补的寡核苷酸退火并连接形成连环体。随后例如通过切口转录对双链连环体进行放射性标记。通常使用高寡核苷酸浓度在低严格条件下进行杂交。
寡核苷酸杂交溶液：
6x SSC
0.01M磷酸钠
1mM EDTA(pH 8)
0.5％SDS
100μg/ml变性鲑精DNA
0.1％脱脂奶粉
在杂交过程中，将温度逐步降低至估计的寡核苷酸Tm值以下5-10℃或低于室温5-10℃，随后进行洗涤步骤和放射自显影。用低严格性如使用4x SSC的3次洗涤步骤进行洗涤。其它细节描述由Sambrook，J.等，1989，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual，”Cold Spring HarborLaboratory Press或Ausubel，F.M.等，1994，“Current Protocols inMolecular Biology，”John Wiley & Sons描述。
实施例22
通过用抗体筛选表达文库鉴定相同或同源的基因
例如在大肠杆菌(例如Qiagen QIAexpress pQE系统)中使用c-DNA克隆来制备重组多肽。重组多肽然后通常经过Ni-NTA亲和层析(Qiagen)进行亲和纯化。然后例如使用用于兔免疫接种的标准技术，使用重组多肽制备特异性抗体。如Gu等，1994，BioTechniques 17：257-262所述，使用以重组抗原饱和的Ni-NTA柱对抗体进行亲和纯化。所述抗体然后可用于筛选表达cDNA文库，以经过免疫筛选鉴定相同基因或异源基因(Sambrook，J.等，1989，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual，”Cold SpringHarbor Laboratory Press或Ausubel，F.M.等，1994，“Current Protocols inMolecular Biology”，John Wiley & Sons)。
实施例23
体内诱变
可通过在大肠杆菌或其它微生物(例如芽孢杆菌或酵母，如酿酒酵母)中传代质粒(或其它载体)DNA来进行微生物的体内诱变，所述微生物维持遗传信息完整性的能力受损。典型的增变株在用于DNA修复系统的基因中具有突变(例如mutHLS、mutD、mutT等；参考见W.D.，1996，DNArepair mechanisms，Escherichia coli and Salmonella，第2277-2294页，ASM：Washington.)。这类菌株为本领域技术人员所熟知。例如在Greener，A.和Callahan，M.，1994，Strategies 7：32-34中说明了这类菌株的用途。优选在微生物中进行选择和测试后完成突变DNA分子向植物的转移。根据本文示例内的多个实例产生转基因植物。
[0258.1.1.1]在低温条件下筛选植物的生长
在标准实验中，土壤制备为营养丰富土(GS90，Tantau，Wansdorf，Germany)和沙的3.5∶1(v/v)混合物。用土壤混合物填充盆，并将其置于托盘中。向所述托盘中添加水，使土壤混合物吸收适量的水用于播种过程。在盆(直径6cm)中播种转基因拟南芥植物的种子。收集盆直至它们填满了托盘用于生长室中。然后用透明盖子盖住填充的托盘并将其转移到预冷(4℃-5℃)的生长室的架子系统中。在4℃-5℃黑暗中2-3天的时间里建立分层。在20℃，60％相对湿度，16小时光周期和大约200μmol/m2s的荧光灯照明的生长条件下开始种子的萌发与生长。播种后7天去除盖子。在播种后第9天通过从顶部喷洒含有小植物的盆完成BASTA选择。因此，喷洒自来水中BASTA浓缩物(183g/l草铵膦)的0.07％(v/v)溶液。转基因事件和野生型对照植物随机分布在生长室中。在播种后第7天工作日改变托盘在生长室中的位置。从托盘中去除盖子后每隔一天进行浇水。在播种后12-13天通过去除盆中多余的幼苗仅保留一株幼苗来将植物个体化。播种后14天施加寒冷(冷至11℃-12℃)，直至实验结束。为了测量生物量性能，在收获时间(播种后29-36天)通过切割茎并称重测定植物鲜重。当收获时，植物处在开花前和花序生长前阶段。转基因植物与在同一天收获的非转基因野生型对照植物比较。可通过应用”斯氏”t检验计算(参数：双边，不等方差)生物量改变的统计学显著性的显著性值。
在连续实验水平上(高达4个水平)检测每个转基因构建体多达5个株系。仅将展示出阳性性能的构建体进行下一个实验水平。通常在第一水平上检测每个构建体五个植物而在后续水平上检测30-74个植物。如上文描述评估生物量性能。
表VIII-B：施加冷胁迫后转基因拟南芥的生物量产生。
通过称重植物莲座来测定生物量产生。生物量增加计算为来自同一实验的转基因植物的平均重量与野生型对照植物的平均重量的比值。通过称重植物莲座测定生物量产生。生物量增加计算为来自同一实验的转基因植物的平均重量与野生型对照植物的平均重量的比值。为显示显著性值≤0.3和生物量增加≥5％(比值≥1.05)的构建体给出转基因事件组内见到的最大生物量增加。
表VIII-B：(LT)
SeqID 靶标 基因座 生物量增加
724 细胞质 Yal043c-a 1.389
728 质体 Ybr071w 1.350
732 细胞质 Ybr180w 1.374
764 细胞质 Ydr284c 1.500
1157 细胞质 Ykr097w 1.799
1157 线粒体 Ykr097w 1.533
1352 细胞质 Ynr012w 1.399
[0259.1.1.1]标准化生长条件下筛选植物的生物量增加
在该实验中，已经在标准化的生长条件下缺少基本非生物胁迫时进行筛选植物的产量提高(在该情况下：生物产量提高)。在标准实验中，土壤制备为营养丰富土(GS90，Tantau，Wansdorf，Germany)和石英砂的3.5∶1(v/v)混合物。备选地，植物播种在营养丰富土(GS90，Tantau，Germany)上。用土壤混合物填充盆，并将其置于托盘中。向所述托盘中添加水，使土壤混合物吸收适当量的水用于播种过程。在盆(直径6cm)中播种转基因拟南芥植物及其非转基因野生型对照的种子。然后用透明盖子覆盖填充的托盘并将其转移到预冷(4℃-5℃)且黑暗的生长室中。在4℃-5℃黑暗中3-4天的时间里建立分层。在20℃，60％相对湿度，16小时光周期和大约170μmol/m2s的荧光灯照明的生长条件下开始种子的萌发与生长。播种后7-8天去除盖子。在第10天或第11天(播种后9天或10天)通过从顶部喷洒含有小植物的盆完成BASTA选择。在标准实验中，喷洒一次自来水中BASTA浓缩物(183g/l草铵膦)的0.07％(v/v)溶液，或者喷洒三次BASTA的0.02％(v/v)溶液。仅用自来水喷洒(而不是用在自来水中溶解的BASTA喷洒)野生型对照植物，但其它方面进行相同处理。播种后13-14天通过去除多余的幼苗并在土壤中保留一株幼苗将植物个体化。转基因事件和野生型对照植物均匀分布在生长室中。
在标准实验中去除盖子后每隔一天，或者每天进行浇水。为了测量生物量性能，在收获时间(播种后24-29天)通过切割茎并称重它们测量植物鲜重。当收获时，植物处于开花前阶段和花序生长前阶段。转基因植物与在同一天收获的非转基因野生型对照植物比较。可通过应用”斯氏”t检验(参数：双边，不等方差)计算生物量改变的统计学显著性的显著性值。
每个转基因构建体检测了3-4个独立的转基因株系(＝事件)(每个构建体24-28棵植物)，并如上所述评估生物量性能。
表VIII-C：标准化的生长条件下转基因拟南芥的生物量产生。
通过称重植物莲座测定生物量产生。生物量增加计算为来自同一实验的转基因植物的平均重量与野生型对照植物的平均重量的比值。为显示显著性值≤0.3和生物量增加≥5％(比值≥1.05)的构建体给出转基因事件组内见到的最大生物量增加。
SeqID 靶标 基因座 生物量增加
63 质体 B0312 1.353
724 细胞质 Yal043c-a 1.411
732 细胞质 Ybr180w 1.449
818 细胞质 Yhr047c 1.179
1157 线粒体 Ykr097w 1.619
1352 细胞质 Ynr012w 1.314
[0260.1.1.1]有限氮供应下筛选植物(拟南芥)的生长每个转基因构建体检测了4个独立的转基因株系(＝事件)(每个构建体23-28棵植物)。在含有营养物缺失土(“Einheitserde Typ 0”，30％粘土，Tantau，Wansdorf Germany)和砂的1∶1(v∶v)混合物的盆中播种拟南芥种子。通过在4℃，黑暗中4天时间诱导萌发。所述植物随后在标准生长条件(16小时光照和8小时黑暗的光周期，20℃，60％相对湿度和170μE的光子通量密度)下生长。栽培并培养所述植物，尤其是用N耗尽的营养液每隔一天对它们浇水。所述N耗尽的营养液例如含有地下水。
Figure BDA0000055835940002181
9到10天后将植物个体化。总共28到31天后收获所述植物并通过植物地上部分的鲜重进行等级评定。生物量增加已经测定为各转基因植物与同一天收获的非转基因野生型植物地上部分的鲜重的比值。
在表VIII-D中总结了在有限氮供应下筛选生长的结果。
表VIII-D：在有限氮供应下生长的转基因拟南芥的生物量产生
通过称重植物莲座测定生物量产生。生物量增加计算为来自同一实验的转基因植物的平均重量与野生型对照植物的平均重量的比值。为显示显著性值≤0.3和生物量增加≥5％(比值≥1.05)的构建体给出转基因事件组内见到的最大生物量增加。
表VIII-D(NUE)
SeqID 靶标 基因座  生物量增加
63 质体 B0312  1.180
724 细胞质 Yal043c-a  1.292
732 细胞质 Ybr180w  1.739
764 细胞质 Ydr284c  1.352
814 细胞质 Ydr445c  1.197
925 质体 Yhr190w  1.181
1021 细胞质 Ykl094w  1.255
1157 细胞质 Ykr097w  1.313
1157 线粒体 Ykr097w  1.264
1352 细胞质 Ynr012w  1.194
[0261.1.1.1]附图：
图1用于克隆进行非靶向表达的目的基因的载体VC-MME220-1 qczSEQ ID NO：41。
图2用于克隆进行非靶向表达的目的基因的载体VC-MME221-1qczSEQ ID NO：46.
图3用于克隆进行靶向表达的目的基因的载体VC-MME354-1QCZSEQ ID NO：32。
图4用于克隆进行靶向表达的目的基因的载体VC-MME432-1qczSEQ ID NO：42。
图5用于克隆进行非靶向表达的目的基因和克隆靶向序列的载体VC-MME489-1QCZ SEQ ID NO：56。
图6用于克隆靶向序列的载体pMTX0270p SEQ ID NO：9。
图7用于克隆进行非靶向表达的目的基因的载体pMTX155(SEQ IDNO：31)。
图8用于线粒体靶向表达的载体VC-MME356-1QCZ(SEQ ID NO：34)。
图9用于优先在种子中非靶向表达的载体VC-MME301-1QCZ(SEQID NO：36)。
图10用于优先在种子中质体靶向表达的载体pMTX461korrp(SEQID NO：37)。
图11用于优先在种子中线粒体靶向表达的载体VC-MME462-1QCZ(SEQ ID NO：39)。
图12用于线粒体靶向表达的载体VC-MME431-1qcz(SEQ ID NO：44)。
图13用于质体靶向表达的载体pMTX447korr(SEQ ID NO：47)。
图14用于线粒体靶向表达的载体VC-MME445-1qcz(SEQ ID NO：49)。
图15用于优先在种子中非靶向表达的载体VC-MME289-1qcz(SEQID NO：51)。
图16用于优先在种子中质体靶向表达的载体VC-MME464-1qcz(SEQ ID NO：52)。
图17用于优先在种子中线粒体靶向表达的载体VC-MME465-1qcz(SEQ ID NO：54)。
Figure BDA0000055835940002211
Figure BDA0000055835940002221
Figure BDA0000055835940002231
Figure BDA0000055835940002241
Figure BDA0000055835940002251
Figure BDA0000055835940002261
Figure BDA0000055835940002271
Figure BDA0000055835940002291
Figure BDA0000055835940002301
Figure BDA0000055835940002311
Figure BDA0000055835940002321
Figure BDA0000055835940002331
Figure BDA0000055835940002341

Claims (35)

1.产生转基因植物细胞、植物或其部分的方法，所述转基因植物细胞、植物或其部分优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比具有提高的产量，所述方法通过提高或产生磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的活性实现。
2.权利要求1的方法，其中提高或产生至少一种多肽的活性，所述多肽包含选自以下的多肽：
(i)分别包含如表II或表IV各第11行第5列或第7列所述的多肽、共有序列或至少一个多肽基序的多肽；或
(ii)包含如表I各第11行第5列或第7列所述多核苷酸的核酸分子的表达产物，
(iii)或(i)或(ii)的功能等同物。
3.权利要求1或2任一项的方法，其中提高或产生至少一种核酸分子的表达，所述核酸分子包含选自以下的核酸分子：
a)编码如表II各第11行第5列或第7列中所示多肽的核酸分子；
b)如表I各第11行第5列或第7列中所示的核酸分子；
c)核酸分子，其由于遗传密码的简并性可来自表II各第11行第5列或第7列中所述多肽序列并优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量；
d)核酸分子，其与包含表I各第11行第5列或第7列中所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少30％的同一性，并优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量；
e)核酸分子，其编码与(a)到(c)的核酸分子编码的多肽的氨基酸序列有至少30％同一性的多肽并具有包含表I各第11行第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性，并优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量；
f)核酸分子，其在严格杂交条件下与(a)到(c)的核酸分子杂交，并优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量；
g)核酸分子，其编码可在针对(a)到(e)的核酸分子之一编码的多肽产生的单克隆或多克隆抗体帮助下分离的多肽，并具有包含表I各第11行第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性；
h)核酸分子，其编码包含如表IV各第11行第7列中所示共有序列或一个或更多多肽基序的多肽，并优选具有包含表II或IV各第11行第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性；
i)核酸分子，其编码具有如表II各第11行第5列中所述蛋白质代表活性的多肽，并优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量；
j)核酸分子，其包含使用表III第7列中的引物通过扩增cDNA文库或基因组文库获得的多核苷酸并优选具有包含如表II或IV各第11行第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性；
和
k)核酸分子，其可通过在严格杂交条件下利用包含(a)或(b)的核酸分子的互补序列的探针或其片段筛选合适的核酸文库获得，所述探针或其片段具有与(a)到(e)中表征的核酸分子序列互补的核酸分子的至少15nt，优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt，并且所述核酸分子编码具有包含如表II各第11行第5列中所述多肽的蛋白质代表的活性的多肽。
4.通过权利要求1的方法产生的转基因植物细胞、植物或其部分，其优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比具有提高的产量。
5.权利要求4的转基因植物细胞、植物或其部分，其来自单子叶植物。
6.权利要求4的转基因植物细胞、植物或其部分，其来自双子叶植物。
7.权利要求4的转基因植物细胞、植物或其部分，其中所述植物选自玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、油菜、包括芸苔和冬季油菜、玉米、木薯、胡椒、向日葵、亚麻、琉璃苣、红花、亚麻子、报春花、油菜籽、萝卜、万寿菊、茄科植物、马铃薯、烟草、茄子、番茄、蚕豆属物种、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳属物种、油椰、椰子、多年生草本植物、饲料作物和拟南芥。
8.权利要求4的转基因植物细胞、植物或其部分，其来自裸子植物，优选云杉、松树和冷杉。
9.权利要求5到8任一项的转基因植物产生的种子，其中所述种子对一种转基因是遗传上纯合的，所述转基因优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量，导致在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物相比提高的产量。
10.分离的核酸分子，其包含选自以下的核酸分子：
a)编码表II B各第11行第5列或第7列中所示多肽的核酸分子；
b)表I B各第11行第5列或第7列中所示的核酸分子；
c)核酸分子，其由于遗传密码的简并性可来自表II各第11行第5列或第7列中所述多肽序列并优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量；
d)核酸分子，其与包含表I各第11行第5列或第7列中所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少30％的同一性，并优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量；
e)核酸分子，其编码与(a)到(c)的核酸分子编码的多肽的氨基酸序列具有至少30％同一性的多肽并具有包含表I各第11行第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性，并优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量；
f)核酸分子，其在严格杂交条件下与(a)到(c)的核酸分子杂交，并优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量；
g)核酸分子，其编码可在针对(a)到(e)的核酸分子之一编码的多肽产生的单克隆或多克隆抗体帮助下分离的多肽，并具有包含表I各第11行第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性；
h)核酸分子，其编码包含如表IV各第11行第7列中所示共有序列或一个或更多多肽基序的多肽，并优选具有包含表II或IV各第11行第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性；
i)核酸分子，其编码具有如表II各第11行第5列中所述蛋白质代表活性的多肽，并优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量；
j)核酸分子，其包含使用表III第7列中的引物通过扩增cDNA文库或基因组文库获得的多核苷酸并优选具有包含如表II或IV各第11行第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性；
和
k)核酸分子，其可通过在严格杂交条件下利用包含(a)或(b)核酸分子的互补序列的探针或其片段筛选合适的核酸文库获得，所述探针或其片段具有与(a)到(e)中表征的核酸分子序列互补的核酸分子的至少15nt，优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt，并且所述核酸分子编码具有包含如表II各第11行第5列中所述多肽的蛋白质代表的活性的多肽，
其中，(a)到(j)的所述核酸分子至少在一个或更多核苷酸上不同于表IA各第11行第5列或第7列中所述的序列，并优选其编码至少在一个或更多氨基酸上不同于表II A各第11行第5列或第7列中所述蛋白质序列的蛋白质。
11.核酸构建体，其赋予权利要求10的所述核酸分子或如权利要求3a)到k)中所述核酸分子的表达，包含一个和更多调节元件，由此优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比，该核酸在宿主细胞中的表达导致提高的产量。
12.载体，其包含如权利要求10中的核酸分子或如权利要求3，a)到k)中所述的核酸分子，或权利要求11的核酸构建体，由此优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比，所述编码核酸在宿主细胞中的表达导致提高的产量。
13.宿主细胞，其已经用如权利要求12中的所述载体或如权利要求10中的所述核酸分子或如权利要求3，a)到k)中所述的核酸分子或权利要求11的核酸构建体稳定或瞬时转化，并且优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比由于所述转化而显示提高的产量。
14.产生多肽的方法，其中在权利要求13的宿主细胞中表达所述多肽。
15.多肽，其由权利要求14所述的方法产生或由权利要求10所述的核酸分子或如权利要求3，a)到k)中所述核酸分子编码，其中所述多肽与表II中所示的序列有一个或多个氨基酸不同。
16.抗体，其特异性结合权利要求15所述的多肽。
17.植物组织、繁殖材料、收获的材料或植物，其包含权利要求13的宿主细胞。
18.用于在植物细胞、植物或其部分中鉴定化合物的方法，所述化合物优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量，所述方法包括步骤：
a)培养植物细胞、植物或其部分，其维持植物表达权利要求10的核酸分子或如权利要求3，a)到k)中所述核酸分子编码的多肽，所述多肽在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量；未转化野生型植物或其部分并提供读出系统，所述读出系统能够在允许多肽与所述读出系统在存在化合物或包含多种化合物的样品下相互作用的合适条件下与该多肽相互作用，并能够提供在一定条件下应答化合物与所述多肽结合的可检测信号，所述条件允许表达所述读出系统和权利要求10的核酸分子或如权利要求3，a)到k)中所述核酸分子编码的多肽进行表达，所述多肽优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比赋予提高的产量；未转化野生型植物细胞、植物或其部分；
b)通过检测所述读出系统产生的信号的存在或缺失或增加鉴定所述化合物是否是有效的激动剂。
19.用于产生农业组合物的方法，其包括权利要求18的方法的步骤并配制可应用到农业的形式的权利要求18中鉴定的所述化合物。
20.组合物，其包含权利要求10的核酸分子或如权利要求3，a)到k)中所述核酸分子、权利要求15的多肽、权利要求11的核酸构建体、权利要求12的载体、权利要求18的化合物、权利要求16的抗体和任选地农业上可接受的载体。
21.如表II、优选II B各第11行中所述的分离的多肽，其选自酵母，优选酿酒酵母。
22.产生转基因植物细胞、植物或其部分的方法，所述转基因植物细胞、植物或其部分优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比具有提高的产量，其中通过表达权利要求10的核酸或如权利要求3，a)到k)中所述核酸分子编码的多肽，提高优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下所述提高的产量，并优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或其部分相比导致提高的产量，所述方法包括
a)用权利要求12的表达载体转化植物细胞或植物的部分，和
b)从植物细胞或植物的部分产生转基因植物，其优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物相比具有提高的产量。
23.产生转基因植物的方法，其通过提高或产生磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的活性实现，所述转基因植物在环境胁迫条件下与相应的未转化野生型植物相比具有提高的产量。
24.权利要求22的方法，其包括
a)用权利要求12的表达载体转化植物细胞或植物的部分和
b)从所述植物细胞或植物的部分产生转基因植物，其优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物相比具有提高的产量。
25.选自权利要求10的核酸或如权利要求3，a)到k)中所述核酸分子的YRP或YSRP编码核酸分子用于制备植物细胞的用途，所述植物细胞优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或植物部分相比具有提高的产量。
26.选自权利要求10的核酸或如权利要求3，a)到k)中所述核酸分子的YRP或YSRP编码核酸分子或其部分作为选择植物或植物细胞的标记物的用途，所述植物或植物细胞优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、未转化野生型植物或其部分相比具有提高的产量。
27.选自权利要求10的核酸或如权利要求3，a)到k)中所述核酸分子的YRP或YSRP编码核酸分子或其部分作为检测植物或植物细胞中胁迫的标记物的用途。
28.权利要求4的转化的植物细胞，其中所述暂时和反复的非生物环境胁迫选自盐度、干旱、温度、金属、化学物质、病原体和氧化胁迫，或其组合。
29.权利要求4的转化的植物细胞，其中所述暂时和反复的非生物环境胁迫是干旱，优选循环干旱。
30.转基因植物细胞，其包含编码具有磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性的多肽的核酸分子，其中优选在暂时和反复的非生物胁迫条件下与相应的未转化野生型植物细胞、植物或植物部分相比，优选当所述多肽过表达时，所述多肽赋予提高的产量。
31.权利要求4或29的植物，其具有
i)在暂时和反复营养物限制条件下提高的产量，其中所述条件对未转化野生型植物细胞、植物或其部分的生长是限制性的，
ii)在一定条件下提高的产量，其中在所述条件下水对未转化野生型植物细胞、植物或其部分的生长是限制性的，
iii)在干旱，优选循环干旱的条件下提高的产量，其中所述条件对未转化野生型植物细胞、植物或其部分的生长是限制性的，
和/或
iv)在低湿度条件下提高的产量，其中所述条件对未转化野生型植物细胞、植物或其部分的生长是限制性的。
32.用于在大环境中提高每英亩产量的方法，其中通过培养权利要求4的各种纲/属的植物，所述植物不会实现或不再实现其产量潜力。
33.用于在大环境中提高每英亩产量的方法，其包括步骤：
-进行土壤分析以测定所述土壤中可用的营养物的水平，
-比较所述结果与实现植物纲/属的产量潜力所必需的值，
-在至少一种营养物受限的情况下培养权利要求4的各纲/属的植物。
34.用于在大环境中提高每英亩产量的方法，其包括步骤：
-测定至少一个植物世代的时间期限内的降水，
-与用于实现植物纲/属的产量潜力的值比较，
-在降水减少的情况下培养权利要求4的各纲/属的植物。
35.用于在大环境中提高每英亩产量的方法，其包括步骤：
-测定至少一个植物世代的时间期限内降雨间的时间段，
-与用于实现植物纲/属的产量潜力的值比较，
-在旱季增加的情况下培养权利要求4的各纲/属的植物。
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