DE68929385T2 - Verfahren zur Bestimmung eines Analyten unter Verwendung einer replizierbare RNS enthaltenden Sonde - Google Patents
Verfahren zur Bestimmung eines Analyten unter Verwendung einer replizierbare RNS enthaltenden SondeInfo
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Description
- Die vorliegende Anmeldung betrifft den Nachweis von Organismen in klinischer Umgebung und in der Umgebung von Lebensmitteln und insbesondere neue RNA-Matrizen-Sonden- Konstruktionen, die in RNA-gerichteten RNA-Polymerase-Amplifikations-Hybridisierungs- Assays verwendet werden.
- Die Notwendigkeit, niedrige Konzentrationen an pathogenen Organismen in Körperflüssigkeiten und Lebensmitteln nachzuweisen, ist bei der Diagnose, Behandlung und Prävention einer Krankheit von grundsätzlicher Bedeutung. Derzeitige Methoden zum Nachweis solcher Organismen umfassen ihre Isolierung und in-vitro-Kultivierung oder den direkten Nachweis eines für den Organismus spezifischen Analyten. Solche Analyten können entweder das Nukleinsäuregenom des Organismus, eine Ribonukleinsäure, die durch Transkription seines Genoms während der Fortpflanzung produziert wird, oder Proteine oder Metaboliten sein, die durch den infizierenden Organismus im Wirt spezifisch produziert oder hervorgerufen werden.
- Verfahren, um das Vorliegen von spezifischen Nukleinsäuren in einer Probe nachzuweisen, sind gut bekannt und basieren auf demselben allgemeinen Prinzip: der hochaffinen Wechselwirkung zwischen einem Nukleinsäurestrang, der eine spezifische Sequenz von Nukleotiden trägt, und einem anderen Nukleinsäurestrang, der die komplementäre Sequenz besitzt, um ein Hybrid oder eine Doppelstrang-Struktur zu bilden. Die Bildung solcher Hybride kann durch Einstellung der Bedingungen, unter denen diese Hybridisierung stattfindet, hochspezifisch ("stringent") gemacht werden, so dass keine Hybridisierung stattfinden wird, wenn die Sequenzen nicht genau komplementär sind. Wenn die gesamte Nukleinsäure aus der Probe an einem festen Träger, (z. B. eine Nitrocellulosemembran), immobilisiert ist, kann das Vorliegen einer spezifischen "Ziel"-Sequenz in der Probe durch die Bindung einer komplementären Nukleinsäure-"Sonde", die eine nachweisbare Gruppe trägt, bestimmt werden. Solche Gruppen können radioaktive Kerne, fluoreszierende Verbindungen oder Liganden sein, die durch Proteinkonjugate erkannt werden, welche katalytische Aktivitäten haben und die gefärbte, lumineszierende oder fluoreszierende Produkte bilden können. Nach Entfernen einer nichthybridisierten Sonde durch Waschen des Trägers wird die Menge der Zielsverbindung durch die vorliegende Menge an nachweisbaren Gruppen bestimmt.
- In der Praxis ist die Empfindlichkeit solcher Essays durch die Zahl markierter Gruppen, die man physikalisch in die Sonden-Nukleinsäure einbauen kann, begrenzt. Im Fall von radioaktiv markierten Sonden liegt die praktische Grenze bei etwa 104 Zielmolekülen. Um diese Empfindlichkeit zu erreichen, sind allerdings Sonden mit einer sehr hohen spezifischen Aktivität erforderlich, die ungünstigerweise eine sehr begrenzte verwendbare Lebenszeit haben und mit einem Nachweisschritt (d. h. Autoradiografie), der mehrere Tage beansprucht, verbunden sind. Andere Markierungsverfahren, die eine fluoreszierende, chemilumineszierende oder enzymatische Detektion anwenden, übertreffen, obgleich sie schneller sind, üblicherweise die Empfindlichkeit von isotopisch markierten Sonden nicht. Da die meisten Organismen, die von klinischem Interesse sind, nicht mehr als 50.000 Kopien einer Nukleinsäure, die zur Verwendung als Ziel geeignet ist, enthalten, ist die Anwendbarkeit solcher Verfahren auf den Nachweis großer Organismenzahlen beschränkt. Die Konzentration infektiöser Agenzien in klinischen Proben oder Lebensmitteln übersteigt allerdings oft wenige (1-10) pro Probe nicht. Somit existiert ein Bedarf an Verfahren mit denen niedrige Konzentrationen nachgewiesen werden können.
- Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in der Verbesserung der Empfindlichkeit von Nukleinsäure-Hybridisierung-Assays.
- Ein Ansatz zum Nachweis geringer Konzentrationen an DNA wendet eine DNA-abhängige DNA-Polymerase an, um die Ziel-DNA direkt zu replizieren, um ihre Zahl auf leicht nachweisbare Konzentrationen zu erhöhen. Dieser Ansatz wird "Polymerase-Kettenreaktion" (PCR) bezeichnet. Saiki, R. K., Scharf, S., Faloona, F., Mullis; K. B., Horn, G. T., Erlich, H. A., und Arnheim, N., "Enzymatic Amplification of Beta-globin Genomic Sequences and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia", Science 230: 1350-1354 (1985); Saiki, R. K., Gelfand, D. H., Stoffel; S., Scharf, S. J., Higuchi, R., Horn, G. T., Mullis, K. B., und Erlich, H. A., "Primer-directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase", Science 239: 487-491 (1988); Erlich, H. A., Gelfand, D. H., und Saiki, R. K., "Specific DNA Amplification", Nature 331: 461- (1988); und Mullis et al., Europäische Patentanmeldungen Nr. 200362 und 201184 (siehe auch die US-Patente 4,683,195 und 4,683,202). Beim PCR-Verfahren werden zwei DNA-Oligonukleotide an spezifischen, getrennten Stellen an die komplementären Stränge der Ziel-DNA hybridisiert und durch Wärmebehandlung getrennt. Die aufgeschmolze(nen) Sonde(n) wird/werden dann zum Starten der Synthese des/der komplementären Strangs/Stränge) mit einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase verwendet, wobei Doppelstrang-Kopien des Ziels erhalten werden. Nach der Synthese werden die Stränge in den resultierenden Doppelstrang-DNA-Produkten durch Wärmebehandlung wieder getrennt; die Oligonukleotidsonden (in großem Überschuss vorhanden) wieder an den Zielstrang und den replizierten Strang reassozilert und weiter mit der Polymerase inkubiert. Da sowohl die Ziel-DNA wie auch die DNA-Stränge, die durch enzymatische Extension der Oligonukleotidsonden gebildet wurden, als Matrizen für die Primer-gerichtete Replikation dienen, verdoppelt sich die Menge an spezifischer Produkt-DNA mit jedem Durchgang, bis eine große Anzahl von Produktsträngen (z. B. 1 Million Kopien) gebildet sind.
- In der Praxis ist diese Technik durch das Erfordernis limitiert, dass das Ziel zur Amplifikation DNA (statt RNA) sein muss und das falsch-positive Ergebnisse auftreten, die durch Hybridisierung von Sonden an homologe Stellen in Nicht-Ziel-DNA, die zufällig ähnliche Replikationsprodukte bilden, gebildet werden. Obgleich Ziel-DNA mit sehr hoher Empfindlichkeit nachgewiesen werden kann, ist die Zahl von Zielen, die in der Probe vorliegen, schwer zu bestimmen, ohne dass die Komplexität des Essays erhöht wird. Da die Anzahl der infektiösen Agenzien bei der Beurteilung des Behandlungsprotokolls für eine Erkrankung auch wichtig ist, ist dieses Amplifikationsverfahren ungünstigerweise limitiert, da es eher qualitative als quantitative Resultate liefert.
- Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Bereitstellung von Verfahren und Sonden, die sich in quantitativen Assays vorteilhafter eignen.
- Ein weitere Ansatz zur Verbesserung der Empfindlichkeit des Nukleinsäure-Nachweises ist die Verwendung einer Hybridisierungs-Sonde, die mit einem RNA-Molekül gekuppelt ist oder in dieses eingearbeitet ist, das durch eine (d. h. ist eine Matrize für) RNA-gerichtete RNA-Polymerase repliziert werden kann. Eine Reihe von Mitteln zur Erzeugung von RNA- Sonden durch Derivatisierung von MDV-1-RNA, einer 221-Nukleotid-RNA-Matrize für die RNA-abhängige RNA-Polymerase, Q-beta-Replikase, werden z. B. von Chu, B. C. F., Kramer, F. R. und Orgel, L. E., "Synthesis of an Amplifiable Reporter RNA for Bioassays", Nucl. Acids Res. 14: 5591-5603 (1986); Lizardi, P. M., Guerra, C. E., Lomeli, H., Tussie-Lung, I. und Kramer, F. R., "Exponential Amplification of Recombinant-RNA Hybridization Probes", Bil/Technology 6: 1197-1203 (Oktober 1988); und der europäischen Patentanmeldung 266399 (EP-Anmeldung Nr. 87903131.8) bereitgestellt. Das replizierbare RNA-Sonden-Konstrukt kann vorteilhafterweise in einem empfindlichen Hybridisierungs-Assay, z. B. in dem, der von Ranki et al., US 4,563,419; Soderlund, G. B., US 2,169,403; Stabinsky, US 4,751,177; und Syvanenen et al., Nucl. Acids Res. 14: 5037-5048 beschrieben wird, verwendet werden. Nach einer Hybridisierung wird das RNA-Sonden-Chimäre, das mit dem Ziel assoziiert ist, repliziert, wobei RNA-Mengen gebildet werden, die durch eine Reihe von Mitteln einfach nach gewiesen werden können (z. B. durch Fluoreszenz unter Verwendung eines Farbstoffs, z. B. Ethdiumbromid oder Propidiumiodid). Da die MDV-1-RNA-Matrize für Q-beta-Replikase in vitro alle 20 Sekunden zahlenmäßig verdoppelt wird, tritt eine exponentielle Zunahme (z. B. eine milliardenfache) der Anzahl der RNA-Moleküle innerhalb weniger Minuten bei einer einzigen Temperatur auf und schreitet mit dieser Geschwindigkeit fort, bis die Anzahl der Matrizen die Zahl an aktiven Enzymmolekülen in der Reaktion übersteigt. Nach diesem Zeitpunkt nimmt die Menge an Matrizen-RNA linear mit der Zeit zu. Als Folge wird in Reaktionen, denen ausreichend Zeit gegeben wird, um diese lineare Phase zu erreichen (z. B. 15 Minuten für 100 Moleküle), die Menge an amplifizierter Produkt-RNA in direkter Beziehung zum Logarithmus der Zahl ursprünglich zugesetzter RNAs stehen (Lizardi et al. oben). Da die anfängliche Anzahl an Matrizensonden proportional zur Menge der Ziele ist, kann die Zahl der Ziele, die in der untersuchten Probe vorhanden sind, vorteilhafterweise über einen sehr breiten Bereich quantitativ bestimmt werden, was im Gegensatz zu den so genannten PCR- Amplifikationstechniken steht.
- Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht darin, die Eigenschaften solcher RNA-Matrizen für die RNA-abhängige RNA-Polymerase Q-beta-Replicase auszunutzen.
- Bisher existierte eine begrenzte Anzahl von Mitteln zur Bindung replizierbarer RNA an eine Sonde. Um verwendbar zu sein, müssen solche Sonden-RNA-Konstrukte entweder direkt als Matrizen für die Replicase dienen oder die Entfernung der Sondengruppe vor der Replikation zulassen. In einem Verfahren wird die Sonde über eine Cysteamin-Gruppe, die eine Disulfid (-S-S-)-Bindung enthält, welche vor der Replikation gespalten werden kann, an die RNA gekoppelt (Chu et al., oben). Allerdings krankt dieses Verfahren an der Notwendigkeit mehrerer Synthesestufen, die die Laborkosten bei der Herstellung solcher Sonden erhöhen. Außerdem, wie von Fachleuten auf dem Gebiet leicht zu erkennen, werden solche Disulfidbindungen vorzeitig durch Reduktionsmittel gespalten (z. B. Glutathion), das natürlicherweise in vielen biologischen Proben vorkommt.
- Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht darin, die Beschränkungen, die durch solche Disulfid-Bindungs-Konstruktionen auferlegt werden, zu vermeiden.
- In einem anderen Ansatz kann die Sondensequenz in die Sequenz der replizierbaren RNA (Lizardi et al., oben) eingearbeitet sein. Allerdings beeinflusst die fremde RNA-Sequenz in vielen solchen Konstrukten entweder die Fähigkeit der RNA, effizient repliziert zu werden, nachteilig, oder wird spontan während der Replikation deletiert. In einer Sammlung von acht solchen Konstrukten wurden z. B. zwei originalgetreu repliziert, sechs wurden entweder schlecht repliziert oder unterlagen einer Deletion der Sondensequenz während der Replikation. Da solche Deletionsereignisse die Replikationsrate beeinträchtigen und statistisch mit der Zeit auftreten, kann die Konzentration der RNA-Produkte, die in der linearen Phase der Amplifikation erhalten werden, nicht benutzt werden, um die Zielkonzentration zu bestimmen. Darüber hinaus kann für viele Zielorganismen wegen eines hohen Grads an Sequenzhomologie zwischen dem Ziel und Nukleinsäuren im nicht-infizierten Material nur eine begrenzte Anzahl an Sequenzen (z. B. eine oder zwei) als Hybridisierungsziele verwendet werden. Somit limitiert die zusätzliche Anforderung, dass die Sondensequenz stabil und effizient repliziert werden muss, die allgemeine Anwendbarkeit dieses Verfahrens.
- Noch ein weitere Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von Sonde- Matrize-RNA-Konstruktionen und Verfahren, die diese Beschränkung überwinden.
- Es wurde beschrieben, dass eine Bindung der Sondensequenz entweder an das 3'- oder 5'-Ende von Matrizen-RNA über die Phosphodiesterbindung, die normalerweise in RNAs vorgefunden wird, obgleich sie durch eine Reihe anderer Mittel einfach erreicht werden kann, eine Replikation stark inhibiert. Beispielsweise macht die Ligation eines kurzen Oligoribonukleotids, A&sub1;&sub0;, an das 5'-Nukleotid von MDV-1-RNA die RNA unfähig, exponenziell zu replizieren (Miele, Ph. D., thesis, Columbia University, 1982). Eine Anheftung zusätzlicher Nukleotide an das 3'-Ende anderer Matrizen-RNA hemmt in ähnlicher Weise ihre Replikation durch Q-beta- Replikase. Beispielsweise schafft der Zusatz von zwischen 10 und 20 Cytidylat-Resten an das 3'-Ende von Qβ-Phagen-RNA ihre Matrizenaktivität ab (Gillis E., Devos, R. und Seurinck- Opsomer, C., Arch. Int. Physiol. Biochem. 84: 392-393 (1976)); eine Anfügung eines kurzen Oligoadenylat-Trakts hat eine ähnliche Wirkung (Gilvarg, C. Jockusch, H. und Weissmann, C., Biochem. Biophys. Acta 414, 313-8 (1975); siehe auch Devos, R., van-Emmelo, J., Seurinck-Opsomer, C., Gillis, E. und Fiers, W., Biochim. Biophys. Acta. 447: 319-27 (1976)). WO 87/06270 von Chu et al deutet an, dass die Anheftung eines Affinitätsmoleküls an die RNA-Matrize möglich sein könnte, vorausgesetzt, sie erfolgt durch eine Purinbindung, so dass sie einem Säure-Entpurinierungs-Spaltungsverfahren vor einer Replikation unterzogen werden kann. Im Fachgebiet ist gezeigt worden, dass diese Technik nicht funktioniert. Dieses Verfahren wurde nicht als Mittel zur Anheftung einer Sondensequenz an die replizierbare RNA eingesetzt.
- Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung neuer Sonden und Verfahren zu ihrer Verwendung, die eine größere Flexibilität der Anordnung der Nukleinsäure-Sonden-Sequenzen in Verbindung mit den autokatalytischen RNA-Polymerase- Matrizen gestatten.
- Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung replizierbarer RNA-Matrizen, die Ziel-spezifische Nukleinsäure-Sonden-Sequenzen verwenden, welche an das 5'-Ende der replizierbaren RNA gebunden sind.
- Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Sonden und Verfahren zu ihrer Verwendung, die zielspezifische Nukleinsäure-Sonden an das 3'-Ende einer Qbeta-replizierbaren RNA gebunden umfassen.
- Foster und Symons (Cell, 50: 9-16 (1987)) und Uhlenbeck (Nature, 328: 596-600 (1987)) haben RNA-Sequenzen beschrieben, die in Pflanzenvirusoiden und anderswo gefunden werden und die einzigartige Eigenschaft besitzen, in Gegenwart von zweiwertigen Kationen autokatalytisch gespalten zu werden. Eine derartige Struktur, die jetzt als die "Hammerkopf"-Struktur bezeichnet wird, beinhaltet die Verbindung von drei Doppelstrang-Helices in einer Region mit definierter und absoluter Sequenzkonservierung. Uhlenbeck hat gezeigt, dass die "Domänen" dieser Struktur an getrennten RNA-Molekülen sein können, vorausgesetzt, dass sie sich durch Hybridisierung miteinander kombinieren können. W. Gerlach (Adelaide, Australien), hat eine RNA verwendet, die einen Teil mit einer derartigen Struktur trägt, um eine andere völlig unverwandte RNA, welche die Restelemente trägt, zu spalten, was zeigt, dass die Botschaft für Chloramphenicolacetyl-Transferase als Ziel für eine Spaltung dienen kann, indem geeignete RNA-Sequenzen zur Bildung der geeigneten Struktur ausgewählt werden.
- Diese "hammerkopf" artigen Strukturen haben den Namen "Ribozyme", den hier verwendeten Namen, bekommen, da eine der zwei RNAs in der Reaktion wie ein echter Katalysator während der Reaktion nicht verbraucht wird und verwendet werden kann, um eine unbegrenzte Anzahl der Substrat-RNAs zu spalten.
- Dem Fachmann auf diesem Gebiet wird klar sein, dass jeder Versuch, bei dem eine Hybridisierungssonde amplifiziert wird, durch den Hintergrund, der durch Replikation von Sondenmolekülen, die durch das Hybridisierungsverfahren ungeachtet des Vorliegens eines Ziels erfolgt, begrenzt ist, da eine so geringe Menge wie ein einzelnes Matrizen RNA-Molekül zu einem nachweisbaren Produkt führen kann. In einem Hybridisierungs-Assay, bei dem eine replizierbare RNA-Sonde verwendet wird, wobei viel Nukleinsäure an Nitrocellulose immobilisiert war, wurde z. B. gefunden, dass 105 Sondenmoleküle gebunden wurden, ungeachtet der Tatsache, ob ein Ziel vorhanden war oder nicht (Lizardi et al. oben). Ein solcher Hintergrund limitiert die Empfindlichkeit solcher Assays, da Ziele, die in einer Anzahl vorliegen, die dieser Menge gleicht oder darunter liegt, nicht deutlich zur Ausbeute an amplifiziertem Produkt beitragen und somit nicht zuverlässig bestimmt werden.
- Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Bereitstellung eines RNA- Matrize-Sonde-Konstrukts und Verfahren, die hinsichtlich des Hintergrunds weniger empfindlich sind.
- Ein Ansatz, diesen Hintergrund zu reduzieren, beruht auf einem Verfahren, bei dem der Ziel- Sonde-Komplex reversibel an einen Träger gebunden wird ("reversibles Ziel-Einfangen"). Nach Hybridisierung und Immobilisierung wird der Komplex vom Träger eluiert, welcher dann mit der nicht spezifisch gebundenen Sonde verworfen wird. Der Komplex wird dann erneut von einem frischen Träger eingefangen. Dieses Verfahren kann mehrmals wiederholt werden, um eine signifikante Reduzierung (z. B. 109-fach) der Menge an nicht-hybridisierter Sonde zu erreichen (siehe Collins, Europäische Patentanmeldung Nr. 87309308.2 bezüglich einer detaillierten Beschreibung dieser Ziel-Cycling-Technik).
- Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Bereitstellung von Konstrukten und Sonden, die für eine solche reversible Ziel-Einfang-Technik eingesetzt werden können.
- In Übereinstimmung mit den Grundlagen und Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden neue Sonden bereitgestellt, die replizierbare RNA-Matrizen in Verbindung mit Zielspezifischen Sondensequenzen, die entweder an das 5'- und/oder 3'-Ende der RNA-Matrize geheftet sind, verwenden.
- In der vorliegenden Erfindung wird ein Sondenpaar konstruiert, daß an benachbarte Stellen in der Zielnukleinsäure bindet. Eine Sonde des Sondenpaars umfasst vorzugsweise eine Q-beta- RNA-Matrize, die entweder eine 3'- oder 5'-Extension hat, die ein Sondensequenzelement trägt, das von der replizierbaren RNA durch eine Spacer-Sequenz getrennt ist. Die zweite Sonde umfasst idealerweise ein Oligonukleotid, das an ein Freisetzungsmittel gebunden ist, das eine Nuklease umfasst (oder ein Affinitätsmittel, das wiederum eine Nuklease binden kann), welche eine endonukleolytische Spaltung innerhalb der Spacersequenz der ersten Sonde durchführen kann. Die Nuklease ist idealerweise ein Mitglied einer Klasse von Nukleasen, die inaktiv sind, bis ein für ihre Aktivität essentieller Cofaktor zugesetzt wird. Vorteilhafterweise können beide Sonden in einem Hybridisierungs-Assay verwendet werden, indem die Ziel-Nukleinsäure zusammen mit den gebundenen Sonden immobilisiert wird. Nach dem Wegwaschen der Masse der ungebundenen Sonden wird der Cofaktor, der für die Aktivität der Nukleasen notwendig ist, zugesetzt, was eine Spaltung und Freisetzung der replizierbaren RNA, die eine große Extension trägt, in Lösung verursacht. Diese RNA kann dann günstigerweise durch Q-beta-Replikase amplifiziert w erden.
- Somit stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer Ziel-Nukleinsäure mit einer ersten Ziel-Nukleinsäuresequenz und einer zweiten Ziel-Nukleinsäuresequenz bereit, wobei bei dem Verfahren:
- a. eine Probe, die vermutlich die Ziel-Nukleinsäure enthält, in Kontakt gebracht wird mit:
- i. einer ersten Sonde, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, welche im wesentlichen zu der ersten Ziel-Nukleinsäuresequenz komplementär ist und durch eine Spacer- Sequenz an eine RNA-Matrize, die durch eine RNA-gerichtete RNA-Polymerase replizierbar ist, gebunden ist, wobei die Spacer-Sequenz eine Ribonukleotidsequenz umfasst;
- ii. einer zweiten Sonde, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, welche im wesentlichen komplementär zu der zweiten Ziel-Nukleinsäuresequenz ist und an ein Freisetzungsmittel gebunden ist, das die Spacer-Sequenz spalten kann;
- b. Hybridisierungsbedingungen bereitgestellt werden, welche der ersten Sonde die Hybridisierung an die erste Ziel-Nukleinsäuresequenz und der zweiten Sonde die Hybridisierung an die zweite Ziel-Nukleinsäuresequenz gestatten;
- c. das Freisetzungsmittel aktiviert wird;
- d. die RNA-Matrize replizieren gelassen wird und
- e. die von der RNA-Matrize replizierte RNA nachgewiesen wird, wodurch die Ziel- Nukleinsäure nachgewiesen wird.
- Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Nachweis einer Ziel-Nukleinsäure mit einer ersten Ziel-Nukleinsäuresequenz und einer zweiten Ziel-Nukleinsäuresequenz bereit, wobei bei dem Verfahren:
- a. eine Probe, die vermutlich die Ziel-Nukleinsäure enthält, in Kontakt gebracht wird mit:
- i. einer ersten Sonde, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, welche im wesentlichen komplementär zu der ersten Ziel-Nukleinsäuresequenz ist und durch eine Spacer- Sequenz an eine RNA-Matrize, die durch eine RNA-gerichtete RNA-Polymerase replizierbär ist, gebunden ist, wobei die Spacer-Sequenz eine Ribonukleotidsequenz aufweist;
- ii. einer zweiten Sonde, die eine Nukleinsäuresequenz aufweist, welche im wesentlichen komplementär zu der zweiten Ziel-Nukleinsäuresequenz ist und an ein DNA- Oligonukleotid gebunden ist, das eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die im Wesentlichen komplementär zu einer Ribonukleotidsequenz in der Spacer-Sequenz ist und die Spacer- Sequenz bei Zugabe von Ribonuklease H spalten kann;
- b. Hybridisierungsbedingungen bereitgestellt werden, welche der ersten Sonde die Hybridisierung an die erste Ziel-Nukleinsäuresequenz und der zweiten Sonde die Hybridisierung an die zweite Ziel-Nukleinsäuresequenz gestatten;
- c. Ribonuklease H zur Spaltung der Spacer-Sequenz zugegeben wird;
- d. die RNA-Matrize replizieren gelassen wird und
- e. von der RNA-Matrize replizierte RNA nachgewiesen wird, wodurch die Ziel- Nukleinsäure nachgewiesen wird.
- Es werden eine Reihe anderer Ausführungsformen von intelligenten Sondensystemen bereitgestellt, die solche verlängerten Q-beta-Matrizen verwenden.
- Obgleich bei den meisten bevorzugten Sonden der vorliegenden Erfindung zielspezifischen RNA-Sequenzen an sowohl dem 3'- wie auch dem 5'-Ende der RNA-replizierbaren Matrize verwendet werden, wird die vorliegende Erfindung auch mit DNA-Sonden an diesen Stellen funktionieren, allerdings wird es ohne weiteres klar sein, dass es schwieriger sein wird, eine gemischte DNA-RNA-Sonde der vorliegenden Erfindung aufzubauen und herzustellen. Die Sequenzen, die zur Bildung des Ribozyms erforderlich sind, müssen allerdings RNA (und wie in der Ribozymstruktur, die in Fig. 1A gezeigt ist, spezifiziert) sein, damit die Ribozymstruktur zufriedenstellend gebildet wird und einer induzierbaren Spaltung unterzogen werden kann. Eine derartige Spaltung wird in der bevorzugten Ausführungsform in Gegenwart von Magnesium erfolgen, welches auch als Cofaktor für die Q-beta-Replikase-gerichtete Replikation der RNA-Matrize, idealerweise eine Midivariante, dient. Obgleich auch Mangan wirkt, ist es weniger bevorzugt, da die Matrizen-Spezifizität verändert werden kann und daher die Replikation nicht mit der gewünschten Genauigkeit erfolgen kann.
- Die am stärksten bevorzugte RNA-Matrize ist MDV-1 oder die Midivariante, eine 221- Nukleotid-RNA, die von Chu et al. WO 87/06270 beschrieben wird und die in Zellen gefunden wird, die mit Bakteriophagen-Q-beta infiziert sind. MDV-1 ist eine gängige Kontaminante von Q-beta-Replikase-Präparationen. Q-beta-Replikase wirkt auf (z. B. Replikate) RNA- Matrizen, die besondere primäre und sekundäre Strukturen haben, z. B. MDV-1 und andere Strukturen. Obgleich MDV-1 zusammen mit den Q-beta-RNA-Genomen repliziert wird, scheint es keine bekannte Funktion zu haben. Es ist auch bekannt, dass es eine gewisse natürliche Variation am 5'- und 3'-Ende zeigt, die im allgemeinen einfach als eine Zufügung oder Deletion eines GC-Paares auftritt, was in Fig. 1 und 2 zur Erläuterung mit 4 GC-Paaren gezeigt wird und in Fig. 3 und 4 mit 3 GC-Paaren gezeigt wird.
- Für bevorzugtere Sondenausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird eine relativ "kurze" zielspezifische Sondensequenz am 3'-Ende der RNA-Matrize verwendet. Am günstigsten wird diese zielspezifische Sequenz eine Länge von etwa 4 bis etwa 12 Basen und idealerweise eine Länge von etwa 5 Basen haben. Eine derartig kurze Länge ist bevorzugt, da diese nach der Spaltung des Ribozyms eine Disassoziierung der replizierbaren RNA-Matrize von der Zielsequenz bei einer typischen Spaltungstemperatur von etwa 55ºC begünstigen wird.
- Der Fachmann auf diesem Gebiet wird leicht erkennen, dass eine Erhöhung der Länge der zielspezifischen Sondensequenz am 5'-Ende der replizierbaren RNA-Matrize im allgemeinen die Zielspezifität weiter erhöhen wird. Es ist am günstigsten, dass eine derartige Sonde eine ausreichende Länge hat, so dass die angestrebte Replikation der Matrize mit dieser 5'- zielspezifischen Sonde, die noch gebunden ist, zu einem Matrizenzusammenbruch führen wird, was eine weitere Replikation verhindert. Wenn andererseits die 5'- und 3'- zielspezifischen Sonden beide kurze Sonden sind, z. B. nur 5 Nukleotide lang sind, dann hat man in dieser Ausführungsform die Möglichkeit einer konstanten Bildung und eines Turnovers von Ribozymen, was in einer noch schneller Spaltung von replizierbaren RNA-Matrizen resultiert. Der Nachteil dieser Ausführungsform im Vergleich zu der bevorzugtesten Ausführungsform, die eine 5'-terminal-zielspezifische Sequenz mit einer wesentlich größeren Länge verwendet, besteht darin, dass man einen gewissen Verlust bei der Zielspezifität erwarten würde.
- Eine bevorzugte Ausführungsform (in Fig. 2 dargestellt) verwendet einen Sondenaufbau, bei dem die erste Nukleinsäure-Sondensequenz, die für das RNA-Ziel spezifisch ist, an die 5'- Leadersequenz der replizierbaren RNA-Matrize, wie in der bevorzugten Ausführungsform angehängt ist. Anders als in der bevorzugtesten Ausführungsform beinhaltet allerdings das 3'- Ende der replizierbaren RNA-Matrize keine zielspezifische Nukleinsäure-Sondensequenz. Es wird vielmehr eine zweite Sonde, die eine zweite Nukleinsäure-Sondensequenz, die für eine zweite RNA-Zielsequenz spezifisch ist, die Hälfte der Ribozymstruktur, umfasst und eine dritte Nukleinsäure-Sondensequenz die für einen Teil der 5'-RNA-Matrizen Zielsequenz spezifisch ist, verwendet. Wie bei der bevorzugtesten Ausführungsform führt eine Hybridisierung beider Sonden mit dem RNA-Ziel zur Bildung eines spaltbaren Ribozyms, in dem das RNA- Ziel eine erforderliche 5'-GAAA-3'-Sequenz bereitstellt.
- Die bevorzugtesten Verfahren der vorliegenden Erfindung umfassen ein Inkontaktbringen der bevorzugten Sondenkonstruktionen der vorliegenden Erfindung mit Einzelstrang-Zielnukleinsäure unter Bedingungen, welche der ersten und der zweiten Nukleinsäure-Sondensequenz eine Hybridisierung mit der ersten und zweiten Zielsequenz gestatten. Die RNA-Matrize, idealerweise die MDV-1-Midivariante, wird dann vorteilhafterweise aus der Ziel-Nukleinsäure freigesetzt, da die "kurze" zweite Nukleinsäure-Sondensequenz am 3'-Ende der RNA-Matrize eine ausreichende Länge haben wird, um stabil an das RNA-Ziel zu hybridisieren. Die freigesetzte RNA-Matrize kann dann vorteilhafterweise durch Q-beta-Replikase repliziert werden und die replizierte RNA-Matrize als Hinweis für das Vorliegen oder die Abwesenheit der Ziel-Nukleinsäure nachgewiesen werden. Die idealsten Verfahren werden vor Induzierung der Spaltung einen Trennungsschritt beinhalten, wodurch nicht-hybridisierte Sonde entfernt wird und damit nicht als verfügbare Matrize im Amplifikationszyklus durch Q-beta-Replikase teil nehmen kann. Eine Entfernung kann durch eine Vielzahl von Mitteln erfolgen, z. B. durch Immobilisierung des Sonde-Ziel-Hybridisierungs-Komplexes über eine andere insolubilisierte zielspezifische Sonde, die selbst direkt oder indirekt an einer festen Oberfläche, z. B. einer Einfangperle, einem Tauchstift, usw., immobilisiert ist. Derartige sogenannte "Sandwich"- Techniken sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt und brauchen hier nicht detailliert erläutert zu werden.
- Zum weiteren Verständnis der Prinzipien, des Gegenstands und weiterer Aspekte der Erfindung dient das Studium der beigefügten Zeichnungen, von denen:
- Fig. 1A die Hybridisierung einer Midivariante mit einer Ziel-RNA, die das Ribozym (die "kreisförmige" Struktur, die in dem Kästchen enthalten ist) bildet, welches die Spaltungsstelle darstellt, zeigt;
- Fig. 1B die resultierenden Spaltungsprodukte darstellt, die durch Zusatz von zweiwertigem Kation zu dem Sonde-Ziel-Komplex von Fig. 1A erhalten werden;
- Fig. 2 eine alternative Ausführungsform darstellt, bei der eine erste Sonde, die eine RNA- Matrize und eine 5'-terminale zielspezifische Sequenz umfasst, an das RNA-Ziel hybridisiert und eine zweite Sondensequenz sowohl an das RNA-Ziel und eine 5'-Stielsequenz der RNA- Matrize der ersten Sonde hybridisiert, wodurch ein Ribozym gebildet wird;
- Fig. 3 das allgemeine Konstruktionsschema eines cDNA-Klons zur Verwendung bei der Bildung von Sonden der vorliegenden Erfindung graphisch darstellt;
- Fig. 4A und 4B die Verwendung des cDNA-Klons, der in Fig. 3 produziert wurde, in einer Konstruktion eines Vektors zur Produktion der bevorzugtesten Sonde der vorliegenden Erfindung graphisch darstellen; und
- Fig. 5A und 5B die bevorzugteste Ausführungsform graphisch darstellen, die ein Sondenpaar verwendet, von denen eines die Midivariante-1, durch ein abspaltbares Spacerelement an eine zielspezifische Sonde gebunden, umfasst.
- Bei der Untersuchung der Resultate von Miele (oben) und anderen wurde ein Satz rekombinierter MDV-1-RNAs, die 3'-terminale Extensionen verschiedener Längen tragen, durch Transkription eines cDNA-Klons, der von Lizardi et al (oben) beschrieben wurde und der auf verschiedene Weise mit Restriktionsenzymen gespalten wurde, wobei die Spaltungsstellen stromabwärts der MDV-cDNA liegen, erzeugt. Überraschenderweise wurde gefunden, dass im Gegensatz zu generellen Lehrmeinung in der Literatur ein 3'-Anhängsel mit einer Länge von 183 Nukleotiden am 3'-Ende der rekombinierten RNA-Matrize eine ausreichende Replikation erlaubte und damit amplifizierte RNA-Produkte nachgewiesen werden konnten, wenn nur 104 Moleküle, die solche 3'-Extensionen tragen, zur Initiierung einer Q-beta-Replikase- Reaktion verwendet würden. Die amplifizierten Produkt-RNAs waren in der Größe mit der RNA, der eine 3'-Extension fehlte, identisch, was anzeigt, dass die 3'-Extension nicht mit dem Matrizenteil des Moleküls repliziert wurde. Dieses überraschende und völlig unerwartete Resultat hat deutliche Auswirkungen auf die Anwendung von replizierbaren RNAs als Sonden in amplifizierten Hybridisierungs-Assays, da es für eine größere Flexibilität bei der Plazierung von Sondensequenzen an der replizierbaren RNA sorgt.
- Das in Fig. 1 dargestellte RNA-Konstrukt wird durch das folgende Verfahren hergestellt. Zwei synthetische Oligonukleotid-Primer werden nach Verfahren, die dem Fachmann auf diesem Gebiet geläufig sind, produziert. Der erste enthält einen Strang aus einer Reihe von Erkennungssequenzen der Restriktionsendonukleasen, die für nachfolgende Konstruktionen (siehe Fig. 4A) verwendet werden, gebunden an einen Teil, der zu der Sequenz komplementär ist, die zu dem letzten 3'-Nukleotid, A), des Plus-Strangs von Midivarianten-RNA, eine Matrize für das Enzym Q-beta-Replikase, proximal ist, diese aber nicht enthält. Wie es dem Fachmann auf diesen Gebiet verständlich sein wird, muss die exakte Länge einer Sequenz, die zu dieser Region der RNA komplementär ist, ausreichend lang sein, um ein intermolekulares Hybrid zu bilden und die intramolekulare Basenpaarung, die in der Midivarianten-RNA in dieser Region vorliegt, zu ersetzen. Das zweite Oligonukleotid enthält, in der Reihenfolge vom 5'-Ende zum 3'-Ende, die Sequenz, die einen Strang des Promotors für eine DNAabhängige RNA-Polymerase umfasst, die im selben Sinn wie die Transkriptionsrichtung gelesen wird. In diesem Fall ist der Promotor der für die RNA-Polymerasen, der durch Bakteriophagen T7 kodiert wird, ein hochwirksames Enzym, obgleich es dem Fachmann auf diesem Gebiet klar sein wird, dass auch Promotoren für andere RNA-Polymerase verwendet werden können. Diesem Sequenzelement folgt in der 3'-Richtung eine Spaltungsstelle für eine Restriktions-Endonuklease, die einen versetzten Bruch in der Doppelstrang-DNA produziert und die eine vorstehende einzelsträngige 3'-terminale Extension zurücklässt. In diesem Beispiel ist dieses Enzym Apa I und seine Sequenz ist so gemacht, dass sie partiell mit dem Promotor für T7-RNA-Polymerase überlappt. Auf diese Stelle folgt eine Erkennungssequenz für eine Restriktions-Endonuklease, die ein Glied einer Enzymklasse sein kann, die eine Sequenz erkennen und die DNA in einer Region 3' zu diesem Sequenzelement spalten und die eine versetzte Spaltung und eine vorstehende einzelstrangige 5'-terminale Extension zurücklassen. Diese Erkennungssequenz ist so plaziert, dass sie die Spaltung des End-DNA-Vektorkonstrukts zu einem Strang lenkt, der unmittelbar vor der Sequenz ist, die für die Midivarianten-RNA kodiert. In diesem Beispiel (siehe Fig. 4A) ist die Stelle für die Restriktions-Endonuklease Ear I, die die Sequenz CTCTTCN erkennt, worin N irgendein Nukleotid ist, und die die DNA in demselben Strang nach dem Nukleotid N und drei Nukleotide weiter im komplementären Strang spaltet. Schließlich folgt auf diese Sequenz eine weitere Sequenz, die zu der Sequenz homolog ist, die dem 5'-Ende der Midivarianten-RNA (MDV-1-RNA) benachbart ist und diese einschließt; diese Sequenz ist ausreichend lang, um die Synthese eines zweiten Strangprodukts, wie es unten beschrieben wird, außer dass Desoxyribonukleotide die in MDV-1 gefundenen Ribonukleotide ersetzen, zu starten.
- Das erste Oligonukleotid wird als ein Primer für die Synthese einer cDNA von Midivarianten- RNA verwendet, die in Fig. 3 dargestellt ist. MDV-1 wird aus einer Q-beta-Replikase- Reaktion erhalten, die ohne exogene Matrizen-RNA initiiert wird. Dies wird reichliche Level an MDV-1-RNA erzeugen, da alle Präparationen von Q-beta-Replikase-Holoenzym, die nach einem beliebigen einer Reihe von Verfahren hergestellt sind, typischerweise durch geringe Level dieser RNA kontaminiert sind. Ein Picomol des ersten Oligonukleotids, das oben beschrieben ist, und MDV-1-RNA werden vermischt und durch Erhitzen verschmolzen, dann wird das Gemisch langsam abkühlen gelassen. Diese Primer-Matrize-Kombination wird zur Initiierung einer reversen Transkriptase-Reaktion in der Art, wie sie von Maniatis et al, A Cloning Manual beschrieben ist, verwendet. Nach Beendigung der Synthese des ersten Strangs wird die Midivarianten-RNA durch milde Alkalibehandlung oder alternativ durch RNase H zerstört. Der zweite komplementäre Strang wird durch Aufschmelzen des Produktes dieser Reaktion auf das zweite Oligonukleotid, das oben beschrieben ist, und Extension mit einer zweiten DNA-abhängigen DNA-Polymerase erzeugt. Das Produkt kann dann in einen selektierbaren, replizierbaren DNA-Vektor geklont werden, wie es von Maniatis et al beschrieben ist. Potentielle Klone werden nach konventionellen Methoden auf das Vorliegen jeder der Restriktions-Endonukleasestellen, die in den Oligonukleotiden enthalten sind, durchmustert.
- Nach Vermehrung in und Reinigung aus Bakterien wird die klonierte cDNA mit der Restriktions-Endonuklease Apa I und Kpn I gespalten. Das kleinere Fragment wird elektrophoretisch gereinigt und mit der Restriktions-Endonuklease Hinf I gespalten. Dieses Enzym spaltet die cDNA an der Stelle, die Position 65 in MDV-1 entspricht. In der natürlich auftretenden Population von MDV-1-RNAs tritt diese Stelle allerdings nur in einer Fraktion der Moleküle auf. Somit muss eine Zahl von Klonen nach solchen, die die geeignete Sequenz besitzen, durchgemustert werden. Wenn diese erhalten wurden, werden die Hinf-Subfragmente an Oligonukleotid 5'-pGA&sub1;&sub0;-3', das an das Oligonukleotid 5-pCT&sub1;&sub0;-3' geschmolzen ist, ligasiert. Dieses Ligationsgemisch wird mit Apa I und Kpn I abgebaut. Das resultierende Gemisch wird in das große Fragment ligasiert, das aus dem Abbau des oben produzierten Vektors mit Apa I und Kpn I resultiert. Dies wird ein Klon erzeugen, in dem die DNA-Sequenz, die für die Midivariante kodiert, durch einen Trakt aus A-Resten unterbrochen ist. Für den A10-Trakt, der in diesem Beispiel verwendet wird, kann eine Reihe von Sequenzen eingesetzt werden. Von A10 ist bekannt, dass er während der Replikation der Midivarianten-RNA beibehalten wird, wie dies von Miele et al (J. Mol. Biol. (1983) 281-295) gezeigt wird.
- Nach Vermehrung in und Reinigung aus Bakterien wird die klonierte DNA aus der obigen Konstruktion in zwei getrennten Reaktionen gespalten (siehe Fig. 4A). In der ersten von diesen wird das Segment, das die komplette Midivarianten-RNA-cDNA trägt, mit den Enzymen Ear I und Sma I ausgeschnitten. Dieses Abbauprodukt wird mit T4-DNA-Polymerase in Gegenwart von Thymidintriphosphat behandelt, um drei Nukleotide vom 3-Ende des Strangs, der die Sequenz im selben Sinn wie der MDV-1-plus-Strang (z. B. der in Fig. 1 dargestellte Strang, sein Komplement ist der Minusstrang, auch eine replizierbare RNA-Matrize) trägt, zu entfernen. Das resultierende modifizierte Fragment wird durch Elektrophorese mit Polyacrylamid-Gelen gereinigt. Der zweite Restriktionsabbau erfolgt mit den Enzymen Apa I und Kpn I. Das größere der zwei Fragmente wird durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt.
- Zwei Oligonukleotide werden synthetisiert. Das erste dieser enthält vorteilhafterweise die Sequenz 5'-CCCCTGANGA-3', gefolgt von mindestens vier Nukleotiden, die zu der Sequenz in der Ziel-RNA 5'- bis 5'-GAAA-3'-Element komplementär sind und in der Sequenz 5'-GATC- 3' enden. Das zweite Oligonukleotid enthält idealerweise die Sequenz 5'-CCCGA-3', gefolgt von mindestens 4 Nukleotiden der Sequenz 3' bis zum 5'-GAAA-3'-Element im Ziel, außer dass Desoxyribonukleotide die Ribonukleotide des Ziels ersetzen. Auf dieses Element folgt vorteilhafterweise unmittelbar das Element 5'-GGGG-3'. Jedes der Oligonukleotide wird an seinem 5'-Ende durch T4-Polynukleotidkinase phosphoryliert.
- Beide Oligonukleotide werden an das große Fragment, das durch Kpn I, Apa I-Abbau von Vektor-DNA produziert wurde, in einer Reaktion, die T4-DNA-Ligase und ATP enthält, wie dies von Maniatis et al (ibid) beschrieben ist, ligasiert. Das Ligationsprodukt (siehe Fig. 4B) wird durch Gelfiltration von nicht-ligasierten Oligonukleotiden gereinigt. Das Ligationsprodukt wird dann an das kleine Ear I, Sma I-Fragment, das das modifizierte Ende trägt, ligasiert. Das resultierende "gapped" Molekül wird durch Behandlung mit einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase vollständig doppelsträngig gemacht. Dieses Produkt kann vorteilhafterweise in Bakterien eingeführt und dort vermehrt werden.
- Dem Fachmann auf diesem Gebiet wird klar sein, dass diese Reihe an Manipulationen DNA- Klone erzeugen wird, in denen der MDV-cDNA-Teil bezüglich der Transkriptionsrichtung durch T7-RNA-Polymerase in seiner normalen wie auch in umgekehrter Orientierung insertiert ist. Die Klone, die die MDV-cDNA in Plus-Strang-Orientierung enthalten (so orientiert, dass eine Transkription eine RNA produziert, die den Plus-Strang von MDV-1 enthält), werden bestimmt, indem auf Restriktions-Endonukleasefragmente geeigneter Größe durchgemustert wird, von denen bekannt ist, dass sie innerhalb der MDV-1-cDNA-Sequenz spalten.
- Die DNA, die aus einem Klon mit MDV-1 in der Plus-Strang-Orientierung hergestellt wurde, wird an der Restriktionsstelle, distal zu dem zweiten Sondenelement bezüglich des Promotors, gespalten. In diesem Fall ist dies die Restriktions-Endonuklease Dra I. Diese abgebaute DNA wird in vitro vorteilhafterweise durch T7-RNA-Polymerase unter Bedingungen, wie sie von Milligan et al (Nucl. Acid. Res. (1987) 15: 8783-8798) beschrieben sind, unter Bildung der RNA-Sonde abgebaut.
- Der cDNA-Klon, wie er in Beispiel 1 beschrieben ist, wird mit den Enzymen Apa I und Ear I gespalten und das große Fragment wird idealerweise von dem oben beschriebenen kleinen Fragment gereinigt. Ein Oligonukleotid mit der Sequenz 5'-CCCGA-3', gefolgt von 4-50 Nukleotiden, die zu der Sequenz 3' bis zu einem 5'-GAAA-3'-Element im Ziel identisch sind, wiederum gefolgt von der Sequenz 5'-GGCC-3', wird nach einem einer Reihe von Verfahren, die dem Fachmann auf diesem Gebiet geläufig sind, synthetisiert. Dieses Oligonukleotid wird an das große Restriktionsfragment ligasiert und die resultierende einzelsträngige "gap"-Region wird durch die Wirkung einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase doppelsträngig gemacht. Diese DNA wird in Bakterien eingeführt und dort vermehrt. Nach Reinigung aus den Bakterien kann sie mit der Restriktions-Endonuklease Sma I gespalten werden und dann als Matrize in einer in vitro-Transkriptionsreaktion unter Verwendung von Bakteriophagen-T7-RNA- Polymerase als Matrize eingesetzt werden.
- Die zweite Sequenzsonde kann durch Aufbau einer synthetischen DNA-Matrize für T7-RNA- Polymerase gebildet werden, was von Milligan et al (Nucl. Acid. Res. (1987) 15: 8783-8798) beschrieben wird. Ein Strang dieser Matrize beginnt an seinem 5'-Ende mit mindestens 4 Nukleotiden der Sequenz aus der Region 5' bis zum 5'-GAAA-3'-Element im Ziel, außer dass Desoxyribonukleotide die Ribonukleotide, die im Ziel gefunden werden, ersetzen, gefolgt von der Sequenz 5'-TCNTCAGGGGGCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3' in der N irgendein Nukleotid anzeigt. Der andere Strang der Matrize ist ein Oligonukleotid mit der Sequenz 5'- TAATACGACTCACTATAG-3'. Diese zwei Oligonukleotide werden vorzugsweise vermischt und in vitro transkribiert, wie es von Milligan et al (ibid) beschrieben wird. Das Produkt kann in einfacher Weise nach einem einer Reihe bekannter Verfahren, die dem Fachmann auf diesem Gebiet geläufig sind, gereinigt werden.
- Der cDNA-Klon von MDV-1 - ähnlich dem in Beispiel 1 beschriebenen - wurde von F. R. Kramer vom Public Health Research Institute, New York City erhalten und enthielt einen Promotor für T7-RNA-Polymerase und eine modifizierte MDV-1-cDNA-Sequenz, in der das Element 5'-CTCTAGATCTCGAGACTAACATAGGTCTTAACTTGACTAACATCGAGGC CTGCTAGAG-3' das 3-Nukleotid-Segment, das für die Nukleotide 64-66 der natürlich auftretenden MDV-1- RNA kodiert, ersetzte, gefolgt von der Sequenz 5'-GGGAATTC-3'. Diese gesamte Sequenz wurde zwischen die Hind III-Stelle und die EcoRI-Stelle von pSP64 kloniert (Melton et al., Nucl. Acid. Res., Vol. 12, 7035-7056). Dieses Plasmid wurde getrennt mit den Restriktions- Endonukleasen Sma I, EcoRl, Alu I und Pvu II gespalten und jede der gespaltenen Präparationen in vitro durch T7-RNA-Polymerase unter Bedingungen, die von Milligan et al beschrieben wurden, in vitro transkribiert. Die in diesen Reaktionen produzierten RNAs wurden durch denaturierende Polyacrylamidegel-Elektrophorese gereinigt. Dieses Verfahren führte zur Bildung von modifizierten MDV-1-Molekülen, die entweder keine Extension hinter dem 3'- Ende, was in der natürlich auftretenden MDV-1-RNA gefunden wird, eine 7-Nukleotid-3'- Extension, eine 24-Nukleotid-3'-Extension oder eine 183-Nukleotid-3'-Extension tragen.
- Die gereinigten RNAs wurden reihenverdünnt und 104 Moleküle zum Primen einer Q-beta- Replikasereaktion, wie sie von Chu et al, (Nucl. Acid. Res. (1986) 14: 5591-603) beschrieben wird, außer dass die Q-beta-Replikase die war, die aus dem Expressionsklon der Replikase, die von Biebricher et al (Nature (1986) 321: 89-91) beschrieben wird, und physikalisch von C. Biebricher (Max Planck Institut) erhalten wird, gereinigt wurde. Nach 30 Minuten wurden zwei ul jeder Reaktion mit 18 ul 95%-igem Formamid vermischt, 5 Minuten auf 100ºC erwärmt und durch Elektrophorese an einem 8%-Polyacrylamidgel, das 8,3 M Harnstoff enthielt, getrennt. Die replizierten rekombinierten RNAs wurden von der MDV-1-RNA, die die Enzympräparation kontaminiert und auch repliziert wird, durch ihre größere Größe, welche aus der größeren Sequenz resultiert, die die Nukleotide 64-66 ersetzt, was wiederum zu einer geringeren elektrophoretischen Mobilität führt, getrennt. Das rekombinierte RNA-Produkt, das etwa 50%, 86%, 72% und 15% der gesamten RNA repräsentierte, wenn die Reaktion mit den modifizierten MDV-1-RNAs, die entweder keine 3'-Extension, die 7-Nukleotid-Extension, die 24-Nukleotid-Extension bzw. die 183-Nukleotid-Extension tragen, initiiert wurde. Die rekombinierten RNAs, die jeweils produziert wurden, hatten dieselbe Größe wie die rekombinierte RNA, der die 3'-terminale Extension fehlte, was anzeigt, dass die 3'-Extension selbst nicht mit dem Rest des Moleküls repliziert wurde. Dieses Experiment wurde mit einer Reihe von 3'-terminalen Extensionen unterschiedlicher Sequenz mit vergleichbaren Resultaten wiederholt.
- Es werden zwei Desoxyribooligonukleotide mit der folgenden Sequenz synthetisiert: 5'-CCCGAGGATCACCAGCAATATTCCAAAGTAGCATGACAAAAATCTTGGCC-3' und 5'-CCCCCTTGACGACATCCCGATC-3'. Diese werden in den in Beispiel 1 beschriebenen cDNA-Vektor kloniert und die gereinigte klonierte DNA mit T7-RNA-Polymerase nach Spaltung mit der Restriktions-Endonuklease Dra I transkribiert. Das RNA-Produkt der korrekten Größe wird durch denaturierende Polyacrylamidgel-Elektrophorese gereinigt.
- Ein Picomol (10-12 mol) dieser RNA wird an humanes Vollblut von Patienten, die mit humanem Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) infiziert sind, normales humanes Blut, oder eine Probe, die auf Vorliegen von HIV-1 untersucht werden soll, in einem Sandwich-Hybridisierungs-Assay, wie er von Ranki et al (ibid) beschrieben ist, in Gegenwart von 2,5 M Guanidinthiocyanat und einem Picomol eines synthetischen Desoxyribooligonukleotids mit der Sequenz 5'-GGAAGCACATTGTACTGATATCTAATCCCTGGTGGTCTCATA150-3' hybridisiert. Unter allgemeiner Bezugnahme auf Fig. IN das Hybrid wird durch Hybridisierung des dA150-Trakts im Oligonukleotid an einen festen Träger gebunden, z. B. an immobilisiertes Polydesoxythymidin, z. B. in der Vertiefung einer Polystyrol-Mikrotiterplatte (oder einer Einfangperle, wie in Fig. 1A dargestellt), die mit dT&sub3;&sub0;&sub0;&sub0; nach den Verfahren von Collins et al beschichtet ist (EP-A-0265244 und EP-A-0328829).
- Die Platte wird für 30 Minuten bei 37ºC inkubiert, wonach die Inhalte, die nicht-gebundene Sonden enthalten, abgesaugt und verworfen werden und die Vertiefung wiederholt mit einem Puffer, der 0,5 M Guanidinthiocyanat enthält, gewaschen wird. Die Vertiefung wird dann mit einem Puffer, der 90 mM Tris HCl (pH 7,5) enthält, gewaschen, und 50 ul desselben Puffers, außer dass er 14 mM MgCl&sub2; enthält, werden in die Vertiefung gegeben und 15 Minuten bei 50ºC inkubiert, um eine Ribozymspaltung zu induzieren. Die Inhalte der Vertiefung, die die gespaltene und freigesetzte Sonde enthält (siehe Fig. 1B), werden zur Replikation in einer andere Vertiefung transferiert. 5 ul einer Lösung, die jeweils 4 mM ATP, GTP, CTP und UTP, 10 uCl a-³²P-CTP enthält, und 1 ug Q-beta-Replikase werden zugesetzt und die Platte wird bei 37ºC 25 Minuten lang inkubiert. 2 ul der Vertiefungsinhalte werden entfernt und zu 18 ul 95%-igem Formamid, 0,05% Xylolcyanol, 0,05% Bromphenol blau gegeben, um die Replikation zu stoppen. S ul davon werden in die Vertiefung eines denaturierenden 8% Polyacrylamidgel gegeben und die replizierten RNAs durch Elektrophorese getrennt, bis der Xylolcyanol-Farbstoff die Länge des Gels durchwandert hat. Ein Röntgenfilm wird 3 Stunden auf das Gel belichtet und dann als Endstufe des Nachweises entwickelt. Das größere RNA- Produkt einer Länge, die gleich der Anzahl der Nukleotide zwischen der Sequenz, die dem nicht hinzugefügten 5'-Ende der natürlich auftretenden MDV-1-RNA entspricht, und dem nicht hinzugefügten 3'-Ende der MDV-1-RNA entspricht und die Länge des Sequenzelements beinhaltet, das in die Hinf-Stelle, wie in Beispiel 1 beschrieben (in diesem Fall 10 Nukleotide) einschließt, zeigt das Vorliegen von HIV-1-Virus oder seiner Messenger-RNA in der Blutprobe an. Es ist auch leicht zu erkennen, dass eine Korrelation zwischen der Menge an replizierter RNA und der Menge an Ziel-RNA in der ursprünglichen Probe unter Erhalt quantitativer Resultate aufgestellt werden kann, indem man die Replikationsphase zeitlich sorgfältig steuert und die Resultate mit einer geeigneten Kontrolle vergleicht.
- Es wird leicht klar sein, dass andere Verfahren zum Nachweis der replizierten RNA angewendet werden können, einschließlich immunologischer Verfahren, die Antikörper verwenden, die für RNA-DNA-Hybride spezifisch sind (z. B. den Zusatz von DNA-Oligonukleotiden erfordern, die für eine replizierte RNA-Sequenz spezifisch sind), oder indem alternativ Ethidiumbromid verwendet wird, dessen Fluoreszenz durch das Vorliegen von RNA-Polymeren verstärkt wird.
- (1A) 5'-GTGTGTGTGTAAGATGTTCAGCCTGATCTCTTACCTGTCCTATAATTTTCG-3';
- (1B) 5'-AATTCGAAAATTATAGGACAGGTAAGAGATCAGGCTGAACATCTTACACAC ACAC-3;
- (2A) 5'-GGGCGGTCGCGCGAAAAAGATGTTCAGCCTGATCTCTTACCTGTCCTATAA TITI'CG-3; und
- (2B) 5'AATTCGAAAATTATAGGACAGGTAAGAGATCAGGCTGAACATCTITFFCGC GCGACCGCCC-3'.
- Jedes dieser Oligonukleotidpaare (1A und 1B; 2A und 2B) wurde hitzebehandelt und getrennt zwischen die EcoRI-Stelle und die Sma I-Stelle des Plasmids, das im obigen Experiment verwendet wurde, kloniert. Nach der Klonierung wurden die gereinigten Plasmid-DNAs mit EcoRI restriktionsverdaut und mit T7-RNA-Polymerase transkribiert, um zwei RNAs zu erzeugen, die 3'-Extensionen tragen, die teilweise zu derselben Sequenz in HIV-1 komplementär waren. In der RNA, die durch den Klon produziert wurde, der mit dem ersten Oligonukleotidpaar erhalten wurde, waren die Sequenz der replizierbaren RNA und die Sondensequenz durch das Spacer-Sequenzelement 5'-GUGUGUGUGU-3' getrennt. Im zweiten Klon wurde ein Spacer der Sequenz 5'-GGGCGGUCGCGCGAAA-3' erzeugt. Jede der RNAs wurde reihenverdünng und Aliquots wurden zur Initiierung von Q-beta-Replikasereaktionen, die 1 ug Q-beta-Replikase, 90 mM Tris HCl, 14 mM MgCl&sub2; und jeweils 400 uM ATP, GTP, CTP und UTP enthielten, verwendet. Nach 30 Minuten bei 37ºC wurden die Reaktionen durch Zusatz von 20 mM EDTA und 1 ug/ml Ethidiumbromid gestoppt. Die Fluoreszenz der Ethidiumbromid-RNA-Komplexe wurde mit einem Ultraviolett-Transilluminator betrachtet. Amplifizierte Produkt-RNA wurde in Reaktionen beobachtet, die mit mindestens 104 Molekülen, die durch den ersten Klon erzeugt wurden, und 102 Molekülen, die durch den zweiten Klon erzeugt wurden, initiiert wurden. Diese Resultate geben an, dass die Sequenzregion, die unmittelbar an das 3'-Ende der replizierbaren RNA-Sequenz (d. h. den Spacer) angrenzt, die Empfindlichkeit einer Sondendetektion stark beeinflusst. Nachfolgende Experimente zeigten, dass eine Erhöhung der Reaktionszeit die endgültige Verdünnungsausbeute eines nachweisbaren Produktes durch Fluoreszenz nicht beeinträchtigt.
- Diese Resultate liefern praktische Leitlinien für die Verwendung replizierbarer RNAs, die 3'- Sequenzextensionen tragen, als Sonden für den empfindlichen Nachweis von Nukleinsäuren. Durch geeignete Auswahl der Spacersequenz können in günstiger Weise RNA-Sonden erzeugt werden, denen eine größere Empfindlichkeit bei der Detektion von Ziel-Nukleinsäuren innewohnt. Umgekehrt kann für einige Ziel-Nukleinsäuren, die in einem infektiösen Agens in hohen Konzentrationen vorliegen (d. h. ribosomale RNA, die in bis zu 50.000 Kopien pro Organismus vorliegt), eine Spacerregion, die relativ schlechte Detektionsgrenzen verleiht, verwendet werden, um den Hintergrund, der andernfalls durch die Amplifikaton geringerer Konzentrationen nicht spezifisch gebundener Sonden erzeugt wird, zu vermeiden. Wenn z. B. die Anzahl auf Konzentrationen mindestens in der Größenordnung unter der Nachweisgrenze unter Verwendung von Hintergrundreduzierungsverfahren, z. B. Collins (oben), reduziert wird, werden nicht spezifisch gebundene Sonden kein nachweisbares Signal produzieren. Somit können die erfindungsgemäßen Sonden, die geeignete Spacersequenzen enthalten, in günstiger Weise zur Verringerung der Kosten, der Komplexität und der Häufigkeit falsch-positiver Reaktionen in solchen Assays eingesetzt werden.
- Es solte nun klar sein, dass eine Reihe von Mitteln eingesetzt werden können, um solche Konstrukte zu erzeugen, einschließlich der Verwendung von T4-RNA-Ligase (Stefano, oben) und der Verwendung von cDNA-Klonen, wie sie im obigen Beispiel beschrieben wurden. Es sollte klar sein, dass die Verwendung von T4-RNA-Ligase vorteilhafterweise die Erzeugung von Konstrukten erlaubt, in denen die Sondenextension entweder RNA oder DNA ist.
- Da Q-beta-Replikase die Synthese des Tochterstrangs am 3'-Ende der MDV-1-RNA-Matrize initiiert und im allgemeinen mit dem Kopieren der Matrize in 3'- zu 5'-Richtung (der Matrize) fortsetzt, bis das 5'-Ende erreicht ist, werden Matrizenmoleküle, die 5'-Extensionen tragen, Tochterstrangprodukte erzeugen (z. B. ein Minus-Strang der Matrize), die 3'-Extensionen tragen, welche wiederum wie oben beobachtet repliziert werden (z. B. wird die Q-beta-Replikase die am Ende angefügten 3'-Sequenzen ignorieren). Wie es dem Fachmann auf diesem Gebiet klar sein wird, können solche Sonden auch in Hybridisierungs-Assays verwendet werden. Wie es außerdem klar sein wird, kann der Effekt der Spacersequenz in ähnlicher Weise verwendet werden, um die Empfindlichkeit solcher Sonden vorteilhaft einzustellen.
- Ein wichtiger Vorteil, den die vorliegende Erfindung bietet, besteht in der zusätzlichen Anwendung für intelligente Sondensysteme, die die zielgerichtete Spaltung der 5'- oder 3'- Sequenzextensionen ausnutzen, da in solchen Verfahren nicht für die genaue und vollständige Entfernung dieser Sequenzen gesorgt werden muß. Wie oben ausgeführt wurde, kann z. B. eine Sonde gebildet werden, die sowohl 3'- wie auch 5'-Extensionen trägt, deren Hybridisierung an ein Ziel eine Ribozymstruktur erzeugt, welche eine Spaltung der 5'-Extension von der RNA steuert. Eine kurze 3'-Extension bleibt am Molekül zurück.
- Die bevorzugteste Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist in den Fig. 5A und 5B graphisch dargestellt, worin ein Sondenmolekül, das eine Extension trägt, in Lösung an ein Ziel hybridisiert wird. Kurz vorher, nachher oder gleichzeitig damit hybridisiert eine zweite Oligonukleotid-Sonde neben der ersten Sonde an das Ziel. Die zweite Oligonukleotid-Sonde ist idealerweise an eine Nuklease gebunden, die einen Cofaktor (z. B. ein zweiwertiges Kation) für ihre Aktivität benötigt. Nach einer Hybridisierung wird der Komplex an einem festen Träger eingefangen, wie dies von Ranki et al (oben), Soderlund (oben), Stabinsky (oben) und/oder Syvanenen (oben) beschrieben wird. Nach der Trennung, z. B. durch Wegwaschen der Masse der nicht spezifisch gebundenen Sonden, wird der Cofaktor für Nukleaseaktivität zugesetzt. Die Nuklease, die an das Ende der Sonde, proximal zu der ersten Sonde, gebunden ist, wenn sie an ihr Ziel hybridisiert wurde, spaltet den Spacer an der ersten Sonde ab, wodurch eine replizierbare Gruppierung in die Lösung freigesetzt wird. Wie vorher angegeben wird, kann die Spacersequenz vorteilhafterweise so gewählt werden, dass sie die Replikation maximal hemmt, bis eine Spaltung auftritt. Andere Variationen dieses Versuchs werden offensichtlich sein. Beispielsweise kann ein solches Sondenpaar anstatt eine 5'-Extension eine replizierbare RNA und eine Nuklease-gebundene Sonde umfassen, worin die Ribozymsequenz bezüglich des Sondensequenzelements am 5' liegt.
- Als Spaltungsagens kann vorteilhafterweise eine beliebige einer Reihe von Nukleasen eingesetzt werden. Beispielsweise kann Micrococcus-Nuklease verwendet werden, da sie MDV-1- RNA nicht spaltet (Hill & Blumenthal (1983) Nature 301, 350-352). Corey & Schultz (1987) Science 238: 1401-1403), lehrt den Aufbau solcher Oligonukleotid-Micrococcus-Nuklease- Konjugaten. In der bevorzugtesten Ausführungsform wird eines aus einer Reihe von Ribozymen mit endonukleolytischer Spaltungsaktivität verwendet, z. B. die, die von Haselhoff & Gerlach (Nature 334: 585-591 (1988)), Zhlenbeck (1987) Nature 328, 596-600, Cech (Europäische Patentanmeldung WO 88/04300, 16. Juni 1988), Sharmeen et al (1989) J. Virol. 63, 1428-1430; oder Hampel & Tritz (1988) J. Cell. Biochem., Suppl. 12D, Abst. #N212, S. 31, beschrieben sind. Ribozyme besitzen den bedeutenden Vorteil, dass die zweite Sonde, die das Ribozym trägt, effizient in einer einzelnen Stufe durch Transkription eines DNA- Oligonukleotids geeigneter Sequenz produziert werden kann, wie es z. B. von Mulligan (oben) beschrieben ist, wodurch die Kosten und die Arbeit, die zur Erzeugung solcher Reagenzien notwendig sind, verringert werden. Darüber hinaus produzieren diese bevorzugten Reagenzien vorteilhafterweise spezifische Spaltungsereignisse, was zu einer Produkt-RNA mit definierten Replikationseigenschaften führt.
- In einem spezifischen Fall, in dem das Ziel RNA ist, kann das Spaltungsagens ein kleines DNA-Oligonukleotid (z. B. 6 Nukleotide) sein, das zu einem Teil der Spacersequenz an der ersten Sonde komplementär ist. In diesem Fall wird die Spaltung idealerweise durch Zusatz von RNase H (die zur Abspaltung von RNA in RNA:DNA-Heterodoppelstränge wirkt) zu der Lösung, die mit dem Träger, der den Komplex trägt, in Kontakt steht, durchgeführt. Natürlich sollten die Mittel zum Einfangen des RNA-Ziels idealerweise die Erzeugung solcher Heterodoppelstränge vermeiden, um für das Spaltungsereignis spezifisch zu sein. Beispielsweise kann eine biotinylierte RNA, die zu einem anderen Teil der Ziel-RNA komplementär ist, zweckdienlicherweise an einem immobilisierten Streptavidinträger eingefangen werden.
- In dem spezifischen Fall, in dem das Ziel DNA ist, kann ein Abbau der Sequenzextension von Hybriden mit dem Ziel direkt durch den Zusatz von RNase H erreicht werden, ohne dass die Notwendigkeit einer zweiten Sonde, die ein solches Oligonukleotid trägt, besteht.
- Ein weitergehendes Verständnis kann durch Studium der folgenden weiteren detaillierten Beispiele erlangt werden.
- Zwei Oligonukleotide der folgenden Sequenzen:
- (1) 5'-AATTCTATGTGATATCAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCT-3; und
- (2) 5'-AATTAGGCCTTTACCCCACCAACTAGCTGATATCACATAG-3'
- wurden verschmolzen und in ein MDV-cDNA-Konstrukt, entsprechend dem von Lizardi (oben) beschriebenen, das mit EcoRI abgebaut worden war, ligasiert. Dieser cDNA-Klon unterschied sich von denen, die von Lizardi et al beschrieben sind, dadurch, dass das innere Insert für eine Bindungsstelle für das Hüllenprotein für Phagen-R17 kodierte. Diese cDNA wurde von F. R. Kramer, Public Health Research Institute, N. Y. erhalten. Die Oligonukleotide wurden in der Orientierung ligasiert, dass bei nachfolgendem Abbau mit EcoRI eine Spaltung stromabwärts des Oligonukleotids bezüglich des Promotors für T7-RNA-Polymerase auftrat. Das abgebaute Plasmid wurde in vitro mit T7-RNA-Polymerase unter den Bedingungen, die von Mulligan et al (oben) beschrieben sind, transkribiert, und das Transkriptionsprodukt korrigierter Länge wurde durch Elektrophorese mit Polyacrylamidgelen, die 8,3 M Harnstoff enthielten, isoliert.
- 5'-TACACCGCTATAAACCCGTAGGCTCATTGCAATTTC-3',
- komplementär zu einer Region in der 16S ribosomalen RNA von Chlamydia (Palmer et al. Chlamydial Infections (Oriel et al. eds) Cambridge Univ. Press, 1986, S. 89-92), wurde synthetisiert und unter Verwendung von terminaler Desoxynukleotidyltransferase (Supertechs) ein Schwanz mit ca. 150 dA-Resten angehängt.
- Verschiedene Anzahlen Formalin-fixierter Elementarkörperchen von Chlamydia trachomatis wurden in einer Lösung von 1,0 mg/ml Proteinase K (Boehringer Mannheim) und 1,6% Sarkosin (Sigma) bei 65ºC in einem Endvolumen von 35 ul 15 Minuten lysiert. Dann wurden 35 ul eines Puffers, der 340 ng/ml Einfang-Oligonukleotid mit Schwanz und 100 ng/ml der Transkriptionsproduktsonde enthielt, zugesetzt und die Lösungsphasen-Hybridisierung 30 Minuten bei 37ºC ablaufen gelassen. 5 ul einer 0,06%igen (Gewicht/Volumen) Suspension Oligo-dT-derivatisierter magnetischer Perlen, die nach Collins (oben) hergestellt worden waren, in 4% BSA, 10 mM EDTA, 0,2% Sarkosin, 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, und 0,05% Bronopol wurden zugesetzt, und es wurde weitere 5 Minuten bei 37ºC inkubiert, um die Ziel- Sonden-Hybride an den Perlen einzufangen.
- Nach dem Einfangen wurde 0,2 ml einer "Waschlösung", die 1 M Guanidinthiocyanat (GuSCH, Fluka), 10 mM EDTA, 0,04 M Tris-HCl, pH 7, 8, 0,5% Sarkosin, 0,2% BSA und 0,1% Antischaummittel (Thomas) enthielt, bei 37ºC zugesetzt. Die Röhrchen wurden verwirbelt und dann in ein Magnetfeld gebracht (vorzugsweise so, wie es in EP-A-317,826 mit dem Titel "Magnetic Separation Device and Methods for Use" beschrieben ist). Die Perlen wurden an die Seite der Röhrchen gezogen und die flüssige Phase durch Absaugen aus den Röhrchen entfernt. Es wurden weitere 0,2 ml warme Waschlösung zugesetzt, worauf die Perlen durch Verwirbeln resuspendiert und dann im Magnetfeld gesammelt wurden. Die Perlen wurden ein weiteres Mal mit einem weiteren Aliquot Waschlösung gewaschen.
- Die gesammelten Perlen, die vom Überstand befreit waren, wurden dann in 50 ul eines Puffers, der 3,25 M GuSCH, 65 mM EDTA, 0,04 M Tris-HCl, pH 7,0, 0,5% Sarkosin und 0,5% BSA enthielt, resuspendiert und 5 Minuten bei 37ºC inkubiert, um die Ziel-MDV-Sonden- Einfangsonden-Hybride freizusetzen. Die magnetischen Perlen wurden wie vorher gesammelt und dann wurden die Überstände entfernt und in einen frischen Satz Röhrchen transferiert, von denen jedes 50 ul einer frischen Perlensuspension enthielt, um die Hybride wie vorstehend beschrieben wieder einzufangen. Diese Perlen wurden in der gleichen Weise wie das erste Set drei Mal gewaschen, die Hybride freigesetzt und mit einem dritten Satz Perlen wieder eingefangen. Dieser Perlensatz wurde dreimal in der gleichen Weise gewaschen und zusätzlich drei Mal mit 0,2 ml einer Lösung, die 0,1 M KCl, 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 8,0, 0,5% NP-40 enthielt, gewaschen.
- Die gesammelten, gewaschenen Perlen wurden in 50 ul eines Puffers, bestehend aus 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA und 0,5% NP-40, resuspendiert und 5 Minuten bei 37ºC inkubiert, um die Komplexe zu eluieren. Die Perlen wurden mit einem Magnetfeld gesammelt und die Überstände, die die eluierten Komplexe enthielten, wurden in einen frischen Röhrchensatz transferiert.
- 10 ul jedes der Perleneluate wurde in einen Satz Röhrchen, die 13 ul einer Lösung aus 173 mM Tris-HCl, pH 7,5, 27 mM MgCl&sub2; und jeweils 0,77 mM ATP, GTP, CTP und UTP (Pharmacia) enthielten, gegeben. 2 ul Q-beta-Replikase (1,2 ug), die nach DiFrancesco (oben) gereinigt worden war, wurden zugesetzt und die Röhrchen wurden 12 Minuten bei 37ºC inkubiert. S ul 20 mM EDTA, 32 ug/ml Propidiumiodid (Sigma) wurden zugesetzt, um die Replikation zu stoppen. 50 ul jeder gestoppten Reaktion wurden zur Trennung in Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit U-Böden (Nung) transferiert. Die Platte wurde über einem Ultraviolett-Transilluminator, dessen Emissionsmaximum 365 nm betrug, auf Polaroidfilm, Typ 667, unter Verwendung eines Wratten #29-Filters fotografiert. Die Belichtung wurde so eingestellt, dass die auftretende Fluoreszenz in einer Kontrollvertiefung, die nur Reaktionspuffer und Propidiumiodid enthielt, möglichst gering war. Der obige Assay wurde mit Dreifachproben für jede Elementarkörperchen-Verdünnung durchgeführt. Die Resultate sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst. Die Anzahl der "+"-Symbole gibt die relative Fluoreszenz, die beobachtet wurde, wieder. "-" gibt an, dass die Fluoreszenz die der Kontrollvertiefungen nicht überstieg. Fluoreszenz
- Wie in dem obigen Experiment beobachtet wurde, hatte der Assay eine Empfindlichkeit von etwa 10³ Elementarkörperchen.
- Der Assay von Beispiel 6 wurde wiederholt, außer dass die Einfangsonde durch drei Sonden ersetzt wurde, die komplementär zu konservierten Regionen in HIV-1-RNA war. Die Detektor-MDV-Sonde war wie in Beispiel 5 beschrieben und enthielt die Spacer-Sequenz 5'- GGGCGGUCGCGCGAAA-3'. Dieser Assay zeigte eine Empfindlichkeit von 1000 HIV-1- RNA-Molekülen.
- Eine Bibliothek von Matrizen-DNAs kann durch Synthese eines Oligonukleotids erzeugt werden, das in der Reihenfolge 5' → 3' aufweist: (1) eine kurze (z. B. 40 Nukleotide) Sequenz, die mit dem Ziel identisch ist, (2) eine kurze statistische Streck-Sequenz (15 Nukleotide), und (3) eine Sequenz, die zu den meisten der 30 3'-Nukleotide von MDV-I-RNA komplementär ist. Das statistische Sequenzelement kann leicht durch Zusatz aller vier blockierten Nukleotide während der Synthese der Oligonukleotide gebildet werden, ein Verfahren, das in einfacher Weise mit den derzeit verfügbaren automatischen Synthesizern durchzuführen ist. Dann wird ein zweites Oligonukleotid synthetisiert, das zu den meisten der 19 5'-Nukleotide des ersten Oligonukleotids komplementär ist. Dies wird an das erste Oligonukleotid aufgeschmolzen und mit einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase verlängert, wodurch ein Doppelstrang-DNA- Fragment produziert wird. Dieses Fragment wird dann mit dem Restriktionsenzym Bst EII gespalten und das Spaltprodukt an ein Fragment eines MDV-cDNA-Klons, der z. B. von Lizardi (oben) beschrieben wurde und der vorher mit Bst EII gespalten worden war, ligasiert. 2 Picomol des Ligationsproduktes werden dann durch T7-RNA-Polymerase transkribiert, um eine Population von RNAs zu erzeugen, die 1012 unterschiedliche Spacer-Sequenzen enthalten.
- Moleküle innerhalb der Population der RNAs, die am wirksamsten eine Replikation initiieren, werden vorteilhafterweise durch eines der folgenden beiden Verfahren selektiert: Elektrophoretische Retardation von Q-beta-Matrizen-RNA, die an ihre im Entstehen begriffene initiierte Tochterstränge (Mills et al., (1980) Biochem 19: 228-236) hybridisiert werden; oder Isolierung des stabilen Komplexes, der zwischen Q-beta-Replikase und Matrizen-RN, die eine gerichtete Initiation eines Tochterstrangs haben, gebildet wurde. Im folgenden wird ein Beispiel des zuletzt genannten Verfahrens beschrieben.
- 2 umol RNA, die statistische Sequenzspacer trägt, wird mit 5 umol (1,2 ug) Q-beta-Replikase 5 Minuten bei 37ºC in 25 ul 100 mM Tris HCl, pH 7,5, 14 mM MgCl&sub2; inkubiert. 5 ul desselben Puffers, der je 2,4 mM GTP und ATP enthält, werden zugesetzt und die Inkubation wird für weitere 5 Minuten fortgesetzt. 5 ul Puffer, die 40 umol MDV-1-RNA enthalten, wird zugegeben und die Inkubation wird 2 Minuten fortgesetzt. Die Reaktion wird auf 0ºC abgeschreckt und oben auf einen 2,2 ml 10-30% Glyzeringradienten in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM MgCl&sub2;, der auf 0ºC vorgekühlt worden war, aufgetragen. Der Gradient wird bei 55 K Upm in einem TLS-55-Rotor (Beckman Instruments, Palo Alto, CA) über 6 Stunden bei 4ºC zentrifugiert. Der Enzym:RNA-Komplex, der sich um 40% schneller als freie RNA absetzt, wird gesammelt, mit Phenol extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Diese Population ist an RNAs angereichert, die effizient durch Q-beta-Replikase repliziert werden können. Um diese Population weiter anzureichern, wird zuerst eine cDNA-Bibliothek dieser Population konstruiert. Es wird ein Oligonukleotid, das zu der Sondenregion komplementär ist, verwendet, um eine Synthese einer Einzelstrang-cDNA-Population unter Verwendung einer reversen Transkriptase zu starten (Maniatis et al. oben). Es wird ein zweites Oligonukleotid synthetisiert, um in 5' → 3'-Reihenfolge zu enthalten: (1) eine Restriktions-Enzymsequenz, die eine Klonierung der Doppelstrang-cDNA gestattet, (2) die Sequenz eines Promotors für T7-RNA-Polymerase und (3) die Sequenz der ersten 22 Nukleotide von MDV-1-RNA. Dieses Nukleotid und das eine, das für die Priming-Synthese des ersten Strang-cDNA-Produktes verwendet wird, werden in einer PCR-Reaktion zur Erzeugung eines Picomols Doppelstrang-DNA, die als Matrize des ersten cDNA-Strangs verwendet wird, zu erzeugen. Dieses Produkt wird durch native Polyacrylamidgel-Elektrophorese gereinigt und mit T7-RNA-Polymerase transkribiert, um eine RNA-Population zu erzeugen, die erneut dem Komplexbildungs-Sedimentations-Protokoll unterworfen wird. Dieses Verfahren kann so oft wie gewünscht wiederholt werden, allerdings wird klar sein, dass es bei einem gewissen Grenzwert der Anreicherung konvergiert. Der Anreicherungsgrad nach jedem Selektionszyklus wird bestimmt, indem die Doppelstrang-cDNAs in Plasmidvektoren kloniert werden und die Nachweisempfindlichkeit der RNAs, die durch Transkription mehrerer (z. B. 12) solcher Klone, die statistisch aus den Produkten jedes Selektionszyklus ausgewählt werden, produziert werden.
- Die Nachweisempfindlichkeit der klonierten RNAs kann wie folgt bestimmt werden. Die Plasmid-DNAs aus jedem Klon werden nach Standardverfahren gereinigt. Jedes ist mit einem Restriktionsenzym unmittelbar stromabwärts der cDNA restriktionsverdaut und wird durch T7-RNA-Polymerase transkribiert, wobei ein RNA-Produkt ohne Vektorsequenz produziert wird. Diese RNA wird entweder durch Gelelektrophorese oder durch Einfangen an magnetischen Oligo dT-Perlen wie in dem in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren mit inem DNA- Oligonukleotid derselben Sequenz wie das Ziel, die einen Schwanz aus dA&sub1;&sub5;&sub0; trägt, außer dass eine sekundäre Einfangsonde weggelassen ist, gereinigt. Jedes der gereinigten Transkripte wird in Wasser serienverdünnt und Aliquots (10 ul) zu Q-beta-Reaktionen gegeben, wie dies in Beispiel 6 beschrieben ist. Die Reaktionen werden 30 Minuten bei 37ºC ablaufen gelassen, beendet und die Mindestzahl an Sonden, die erforderlich ist, um Produkt zu beobachten, wird durch die höchste Verdünnung, die Fluoreszenz produziert, bestimmt. Dieses Ver fahren wird für Klone wiederholt, die aus jeder Runde des Selektionsprozesses erhalten wurden.
- Es ist erkennbar, dass das obige Verfahren auch auf die Isolierung von RNAs angewendet werden kann, die wirksam replizieren, wenn sie an ein Ziel hybridisieren. Dies wird in einfacher Weise durch eine erste Hybridisierung der RNA-Population an ein synthetisches Ziel vor der Bildung von Initiationskomplexen durchgeführt. Es ist auch einzusehen, dass Glieder einer solchen Population Moleküle enthalten können, die effizienter replizieren, wenn sie an ein Ziel hybridisiert sind, als in freier Form. Solche Moleküle werden bevorzugte Sonden zur Verwendung in Hybridisierungs-Assays sein, da die Moleküle, die nicht spezifisch durch das Hybridisierungs-Verfahren getragen werden, von sich aus weniger effizient repliziert werden.
- Es wird ein Oligonukleotid der folgenden Sequenz synthetisiert: 5'-AATTCTTTAAAAAATC ATAGGACAGGTAAGAGATCAAGCTGAACATCTTGGAGGGAAACAGGACTGTCAG GGAACCCCCCTTCGGGGG-3'. Es wird ein zweites Oligonukleotid der folgenden Sequenz synthetisiert: 5'-GTGACCCCCCGAAGGGGGGTTCCCTTTTGTCCTGACAGTCCCTCC AA GATGTTCAGCTTGATCTCTTACCTGTCCTATGATTTTTTAAAG-3'. Die zwei Oligonukleotide werden aufgeschmolzen und in einen cDNA-Klon einer rekombinierten MDV-RNA, wie sie von Lizardi (oben) beschrieben ist und die vorher mit Bst EII und EcoRl abgebaut worden war, ligasiert. Der resultierende Klon wird mit Dra I abgebaut und mit T7-RNA-Polymerase transkribiert. Die Produkt-RNA wird an einem 6% Polyacrylamidgel, das 8,3 M Harnstoff enthält, gereinigt, und nach Sichtbarmachung, entweder durch Autoradiographie oder UV- Schattenbildung eluiert. Ein Matrizen-Oligonukleotid mit der Sequenz: 5'-TACCAG GTAATATACCACAACGTGTGTTTCTCTGGTTGACTTCTCTGTTTGGGGGGGAGACA GCAGTACAAATGGCAGTATTCATCCACAATTTTCCCTATAGTGAGTCGTATTAAT- 3' wird als Ribozym-Sonde synthetisiert. 2 umol dieses Produkts werden an eine äquimolare Menge "T7-Promotor-Primer"-Oligonukleotid (Promega) aufgeschmolzen und durch T7- RNA-Polymerase, wie es von Mulligan (oben) beschrieben ist, transkribiert, außer dass α-³²p CTP (1 Ci/mmol) in der Reaktion enthalten ist, um das Produkt zur Sichtbarmachung durch Autoradiographie zu markieren. Das Transkriptionsprodukt wird an einem 10% Polyacrylamidgel, das 8,3 M Harnstoff enthält, gereinigt und eluiert. 1 ng jeder der obigen KNAs wird zu einem HN-1-Assay - wie in Beispiel 7 beschrieben - gegeben. Nach dem letztmaligen Waschen der Perlen, wie in Beispiel 6 beschrieben, werden die Perlen in 50 ul eines Elutionspuf fers, der 200 mM KCl, 10 mM MgCl&sub2; und 0,5% NP-40 enthält, resuspendiert. Die Perlen werden in diesem Puffer 10 Minuten bei 37ºC inkubiert und dann wieder gesammelt, indem sie in ein magnetisches Feld gebracht wurden. Die flüssige Phase wird gesammelt und in ein frisches Röhrchen transferiert. Die RNA, die in 10 ul dieses Eluats vorliegt, wird in einer Qbeta-Reaktion, wie sie in Beispiel 6 beschrieben ist, amplifiziert.
Claims (5)
1. Verfahren zum Nachweis einer Ziel-Nukleinsäure mit einer ersten
Ziel-Nukleinsäuresequenz und einer zweiten Ziel-Nukleinsäuresequenz, wobei bei dem
Verfahren:
a. eine Probe, die vermutlich die Ziel-Nukleinsäure enthält, in Kontakt
gebracht wird mit:
i. einer ersten Sonde, die eine Nukleinsäuresequenz umfaßt, welche im
wesentlichen zu der ersten Ziel-Nukleinsäuresequenz komplementär ist und durch
eine Spacer-Sequenz an eine RNA-Matrize, die durch eine RNA-gerichtete RNA-
Polymerase replizierbar ist, gebunden ist,
ii. einer zweiten Sonde, die eine Nukleinsäuresequenz umfaßt, welche
im wesentlichen komplementär zu der zweiten Ziel-Nukleinsäuresequenz ist und
an ein Freisetzungsmittel gebunden ist, das die Spacer-Sequenz spalten kann,
b. Hybridisierungsbedingungen vorgesehen werden, welche der ersten Sonde
die Hybridisierung an die erste Ziel-Nukleinsäuresequenz und der zweiten Sonde
die Hybridisierung an die zweite Ziel-Nukleinsäuresequenz gestatten,
c. das Freisetzungsmittel aktiviert wird,
d. die RNA-Matrize replizieren gelassen wird und
e. die von der RNA-Matrize replizierte RNA nachgewiesen wird, wodurch die
Ziel-Nukleinsäure nachgewiesen wird.
2. Verfahren zum Nachweis einer Ziel-Nukleinsäure mit einer ersten
Ziel-Nukleinsäuresequenz und einer zweiten Ziel-Nukleinsäuresequenz, wobei bei dem
Verfahren:
a. eine Probe, die vermutlich die Ziel-Nukleinsäure enthält, in Kontakt
gebracht wird mit:
i. einer ersten Sonde, die eine Nukleinsäuresequenz umfaßt, welche im
wesentlich komplementär zu der ersten Ziel-Nukleinsäuresequenz ist und durch
eine Spacer-Sequenz an eine RNA-Matrize, die durch eine RNA-gerichtete RNA-
Polymerase replizierbar ist, gebunden ist, wobei die Spacer-Sequenz eine
Ribonukleotidsequenz aufweist und
ii. einer zweiten Sonde, die eine Nukleinsäuresequenz umfaßt, welche
im wesentlichen komplementär zu der zweiten Ziel-Nukleinsäuresequenz ist und
an ein DNA-Uligonukleotid gebunden ist, das eine Nukleinsäuresequenz umfaßt,
die im wesentlichen komplementär zur einer Ribonukleotidsequenz in der Spacer-
Sequenz ist und die Spacer-Sequenz bei Zugabe von Ribonuklease H spalten kann,
b. Hybridisierungsbedingungen vorgesehen werden, welche der ersten Sonde
die Hybridisierung an die erste Ziel-Nukleinsäuresequenz und der zweiten Sonde
die Hybridisierung an die zweite Ziel-Nukleinsäuresequenz gestatten,
c. Ribonuklease H zur Spaltung der Spacer-Sequenz zugegeben wird,
d. die RNA-Matrize replizieren gelassen wird und
e. von der RNA-Matrize replizierte RNA nachgewiesen wird, wodurch die
Ziel-Nukleinsäure nachgewiesen wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Freisetzungsmittel Mikrococcus-Nuklease
ist.
4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die RNA-Matrize
MDV-1 ist.
5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die RNA-gerichtete
RNA-Polymerase Q-beta-Replikase ist.
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