WO2021217426A1 - Methods and reagents for high-throughput detection of viral sequences in single cells - Google Patents

Abstract

The purpose of the present disclosure is to provide methods and reagents for high-throughput detection of the viral sequence at single cell level. We use probe binding to virus sequence combined with oligo-dT to capture host mRNA and virus nucleotide in a single cell. The probe sequence is subsequently used to capture said RNA and prime reverse transcription of the RNA to cDNA. The resulting cDNA can be amplified and analyzed. The disclosure provides an approach to sequence and quantify the whole transcriptome of single cells together with the viral RNA from the same single cell.

Description

METHODS AND REAGENTS FOR HIGH-THROUGHPUT DETECTION OF VIRAL SEQUENCES IN SINGLE CELLS Technical field

The present disclosure involves methods and reagents for high-throughput detection of expressed viral sequences in host cells at single cell level

Background

There are hundreds of virus species that are known to be able to infect humans and at least three to four new species emerge every year. Many viruses transmitted in human have mammalian or avian animal origins. Indeed, a substantial proportion of mammalian viruses may be capable of crossing the species barrier into humans, although only around half of these are capable of being transmitted by humans and around half again of transmitting well enough to cause major outbreaks [1] . Recently, the 2019 novel coronavirus (2019-nCoV; or severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) ) has spread rapidly since its recent identification in patients with severe pneumonia in Wuhan, China. As of 10 February 2020, SARS-CoV2 has been reported in 25 countries across 4 continents and >40, 000 cases have been confirmed, with an estimated mortality risk of ～2% [2] . Flaviviruses, which include dengue (DENV) and Zika (ZIKV) viruses, infect several hundred million people annually and are associated with severe morbidity and mortality [3-5] .

Virus infection causes approximately 12 %of cancers in the world [3] , Human papilloma virus (HPV) , Epstein-Barr virus (EBV) , hepatitis B virus (HBV) , Kaposi’s sarcoma-associated herpes virus (KSHV) , Merkel cell polyomavirus (MCPyV) , hepatitis C virus (HCV) , Human immunodeficiency virus (HIV) and human T cell lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) are associated with multiple forms of malignancies [4-11] .

High-throughput sequencing next generation sequencing (NGS) has become more common in virus discovery applications. Three main methods based on HTS are currently used for viral RNA sequencing: metatranscriptomics sequencing, target enrichment sequencing and PCR amplicon sequencing [12] . However, these approaches cannot provide accurate information on interaction dynamics between viruses and the host cells.

In the prior art, meta-transcriptomics sequencing has been widely used for virus identification and virus–host interactions analysis [13] . Based on the sequence of the virus, it is possible to analyze the characteristics and evolutionary relationship of the virus, so as to know its pathogenic mechanism. For example, high throughput meta-transcriptomic sequencing can be used to obtain complete viral genome sequence of COVID-19 [14] . It has been proved COVID-19 was approximately 79%similar to SARS-CoV at the nucleotide level based on sequence alignment [15] . Given these close evolutionary relationships, it has been found that COVID-19 uses the SARS-CoV receptor ACE2 for entry [16] .

However, analyses at the cell population level may average and minimize individual cellular differences, potentially masking rare cells or cell subsets with a significant specific phenotype [17] . This can be found in cancer, where heterogeneity in intra-tumor cells at genetic, epigenetic and phenotypic level can lead to resistance in cancer therapies, as well as in infectious diseases where cell heterogeneity can reveal differential susceptibility to infections or different immunological responses [18-19] . Furthermore, such bulk sequencing methods do not take into consideration that it is likely that only a small percentage of cells in a host tissue is infected by virus.

The characterization of cellular heterogeneity due to the activation of different host pathways by viral infection and the progression of viral infection is of great interest. Since viruses usurp the cellular machinery at every stage of their life cycle, a therapeutic strategy is to target host factors essential for viral replication [20] . To this end it is critical to understand the interaction dynamics between viruses and the infected host cells, to identify pro-and antiviral host factors and to monitor their dynamics in the course of viral infection.

Summary

The present disclosure provides a novel method for detection of expressed viral genes and host genes simultaneously at single cell resolution. First, we use probe binding to virus sequence combined with oligo-dT to capture and reverse transcribe expressed viral genes and host mRNA, respectively. The probe and oligo-dT contain the same PCR handle sequence, so that cDNA of virus sequence and host mRNA can be amplified at the same time. Optionally, the probe and oligo-dT can be combined with a oligonucleotide sequence that can act as cell barcode to distinguish single cells  from each other, so that thousands or more of single cells can be analyzed in parallel. This method can also be used in combination with a microfluidic system where each cell in a sample can be partitioned to individual micro-chambers. Single cells can be lysed in the micro-chambers; mRNA and virus sequences can be captured at the same time.

Brief description of drawings

Figure 1 Schematic diagram of the present disclosure.

Figure 2 Schematic diagram of the embodiment of the present disclosure where cell barcoding capture magnetic bead is used to capture host mRNA and Viral RNA.

Figure 3 shows sequence of synthetic SARS-COV-2 RNA

Figure 4 shows the proption of sequence read assign host gene and viral genome.

Figure 5 shows the cell number contain different rate of viral read.

Figure 6 shows the cell sorted by the expression of COVID-19.

Detailed description

To overcome the drawbacks of the current virus–host interactions analysis methods, we use probe binding to virus sequence combine with oligo-dT to capture both host mRNA and virus nucleotide. The probe and oligo-dT contain the same PCR handle sequence, which can act as priming site for RT reactions and PCR amplification reactions.

One embodiment of the present disclosure is to add probe binding to virus sequence and oligo-dT to the Magnetic capture beads. This way one can capture and reverse transcribe both mRNA and virus sequence. With unique cell barcodes in conjunction with the oligo-dT and probe sequence, cDNA molecules from the same single cell can be labeled and a group of single cells can be processed in parallel. The disclosure provides an approach to sequence and quantify the whole transcriptome of single cells together with the viral RNA from the same cell. By correlating gene expression with virus level in the same cell, we can identify several cellular functions involved in virus replication.

GEXSCOPE Single Cell RNAseq Library Construction kit (Singleron Biotechnologies) was used to demonstrate the technical feasibility and the utility of the present disclosure in massively parallel single cell virus-RNA sequencing. The  experiment was conducted according to manufacturer’s instructions with modifications described below.

Cell barcoding Magnetic bead synthesis:

The primers on all beads comprise a common sequence used for PCR amplification, a bead-specific cell barcode, a unique 8 molecular identifier (UMI) , a oligo-dT sequence for capturing polyadenylated mRNAs and probe sequence annealing to COVID-19 sequence for capturing COVID-19 RNA.

The sequence of the Probe is as follows:

Round3-nCov1:

Round3-nCov2:

Round3-nCov3:

Round3-nCov4:

Round3-nCov5:

Briefly, we synthesized RNA of part of COVID-19 viral genome sequence with in vitro transcription method. (Figure 3) Single cell suspension of PC9 was first loaded onto the microchip to partition single cells into individual wells on the chip. Cell barcoding magnetic beads were then loaded to the microchip and washed. Only one bead can fall into each well on the microchip based on the diameters of the beads and well (about 25um and 40um, respectively) . We then loaded 100ul cell lysis buffer which contains 10ng COVID-19 RNA into the chip and let incubate at room temperature for 20 minutes to lyse cells and capture RNAs. After 20 minutes, the magnetic beads, together with captured RNAs, were taken out of the microchip and subject to RT, template switching, cDNA amplification, and a part of cDNA was used to construct gene expression library using reagents from the GEXSCOPE kit and following manufacturer’s instructions. The resulting single cell RNAseq library was sequenced on Illumina NovaSeq with PE150 mode and analyzed with scopeTools bioinformatics workflow (Singleron Biotechnologies) .

Figure 3 shows that the present disclosure can detect PC9 gene and COVID-19 gene at the same time. We also can sort cells based on the expression of  COVID-19. (Figure 5; Figure 6) .

The basic principles, main features and advantages of the present disclosure are verified and described above. All technical solutions obtained by this principle fall within the protection scope of the present disclosure.

Reference

[1] Mark W., et al. Human viruses: discovery and emergence. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2012, 367 (1604) : 2864–2871.

[2] Guangdi Li., Erik De Clercq. Therapeutic options for the 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) . Nat. Rev. Drug Discov. 2020.

[3] S Bhatt., et al. The global distribution and burden of dengue. Nature. 2013, 496: 504–507.

[4] Rasmussen., et al. Zika Virus and Birth Defects -Reviewing the Evidence for Causality [J] . New England Journal of Medicine, 2016, NEJMsr1604338.

[5] María G Guzman, Gustavo Kouri. Dengue and dengue hemorrhagic fever in the Americas: Lessons and challenges [J] . Journal of Clinical Virology, 2003, 27 (1) : 1-13.

[3]Bouvard V., et al. A review of human carcinogens–part B: biological agents. Lancet Oncol. 2009, 10 (4) : 321–2.

[4] Mesri EA, Feitelson MA, Munger K. Human viral oncogenesis: a cancer hallmarks analysis. Cell Host Microbe. 2014, 15 (3) : 266–82.

[5] Hourdequin KC., et al. Merkel cell polyomavirus and extrapulmonary small cell carcinoma. Oncol Lett. 2013, 6 (4) : 1049–52. doi: 10.3892/ol. 2013.1483.

[6] Schuster V, Pukrop T. Epstein-Barr virus and nasopharyngeal cancer. N Engl J Med. 1996, 334 (2) : 122–3.

[7] Yip KW., et al. Prognostic significance of the Epstein-Barr virus, p53, Bcl-2, and survivin in nasopharyngeal cancer. Clin Cancer Res. 2006, 12 (19) : 5726–32.

[8] Banks L, Pim D, Thomas M. Human tumour viruses and the deregulation of cell polarity in cancer. Nat Rev Cancer. 2012, 12 (12) : 877–86. doi: 10.1038/nrc3400.

[9] da Silva SR, de Oliveira DE. HIV, EBV and KSHV: viral cooperation in the pathogenesis of human malignancies. Cancer Lett. 2011, 305 (2) : 175–85.

[10] Mueller N. Overview: viral agents and cancer. Environ Health Perspect. 1995, 103 Suppl 8: 259–61.

[11] Perz JF, Armstrong GL, Farrington LA, Hutin YJ, Bell BP. The contributions of hepatitis B virus and hepatitis C virus infections to cirrhosis and primary liver cancer worldwide. J Hepatol. 2006, 45 (4) : 529–38.

[12] Houldcroft., et al. Clinical and biological insights from viral genome sequencing [J] . Nature Reviews Microbiology. 2017, 15 (3) : 183-192.

[13] Zanardo L G , De Souza G B , Alves M S . Transcriptomics of plant–virus interactions: a review [J] . Theoretical and Experimental Plant Physiology, 2019.

[14] Yong-Zhen Zhang, Edward C. Holmes. A Genomic Perspective on the Origin and Emergence of SARS-CoV-2. Cell. 2020, Volume 181, issue 2, P223-227.

[15] Lu R., et al. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. Lancet. 2020, 395: 565-574

[16] Markus Hoffmann., et al. SARS-CoV-2 Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor. Cell. 2020, volume 181, issue 2, P271-280.

[17] Cristinelli S, Ciuffi A . The use of single-cell RNA-Seq to understand virus–host interactions [J] . current opinion in virology, 2018, 29: 39-50.

[18] Sun, Xiao-xiao, Yu, Qiang. Intra-tumor heterogeneity of cancer cells and its implications for cancer treatment [J] . Acta Pharmacologica Sinica, 2015.

[19] Dagogo-Jack I, Shaw A T. Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies [J] . Nature Reviews Clinical Oncology, 2017.

[20] Elena B, Shirit E. Infectious disease. Combating emerging viral threats [J] . science, 2015, 348 (6232) : 282.

Claims (10)

1. A method for analyzing virus sequence, at single cell level, wherein said method comprising:

   a) capture the RNA from a single cell with an oligo-dT primer combined with probe sequence that binding to viral RNA sequence;

   b) reverse transcribe the RNA to cDNA with the oligo-dT primer and virus-recognizing sequence;

   c) amplify cDNA;

   d) analyze amplified cDNA.
2. The method of Claim 1, wherein the primer sequence additionally comprises a sequence that acts as cell barcode that identifies each single cells; a sequence that can be used as PCR primer-binding sequence for amplification of the cDNA.
3. The method of Claim 1, wherein the primer sequence comprise a unique molecular index (UMI) sequence that can be used to quantify cDNA.
4. The method of Claim 1, wherein the probe sequence is added by using an enzyme.
5. The method of Claim 1, wherein the probe sequence is added chemically.
6. The method of Claim 4, wherein the enzyme is a ligase, to add specific sequence to the magnetic capture bead.
7. The method of Claim 4, wherein the enzyme is a DNA polymerase, to add specific sequence to magnetic capture bead.
8. The method of Claim 1, wherein the viral RNA sequence can derived from any RNA virus.
9. The method of Claim 1, wherein the analysis method is sequencing.
10. A product that includes reagents needed to enable the process as described in Claim 1.

Images