DE602004001227T2

DE602004001227T2 - Nukleinsäure-biosensor

Info

Publication number: DE602004001227T2
Application number: DE602004001227T
Authority: DE
Inventors: Yi Champaign LU; Juewen Urbana LIU
Original assignee: University of Illinois; University of Illinois at Urbana Champaign
Current assignee: University of Illinois; University of Illinois at Urbana Champaign
Priority date: 2003-03-07
Filing date: 2004-02-02
Publication date: 2007-05-03
Anticipated expiration: 2024-02-03
Also published as: DE602004001227D1; US20040175693A1; ATE330038T1; CA2518423A1; US7612185B2; WO2004081235A1; EP1601790A1; EP1601790B1

Description

HINTERGRUND
Nachdem lange Zeit angenommen wurde, dass DNA ausschließlich das genetische Material darstellt, wurde im Jahr 1994 gezeigt, dass DNA enzymatische Aktivität aufweisen kann (Breaker und Joyce 1994). Ähnlich wie RNAzyme können DNAzyme die Spaltung von Nukleinsäure- und Phosphoramidat-Bindungen, Ligation, Phosphorylierung und Porphyrin-Metallierung katalysieren (Lu 2002). Aufgrund ihrer Stabilität und katalytischen Fähigkeiten könnten DNAzyme in vielen Anwendungsbereichen eine wichtige Rolle spielen (Lu 2002).
Aptamere sind Nukleinsäuren (wie beispielsweise DNA oder RNA), die Zielmoleküle (Targets) mit hoher Affinität und Spezifität erkennen (Ellington und Szostak 1990, Jayasena 1999). Aptazyme (die ebenso als allosterische DNA/RNAzyme oder allosterische (Desoxy)-Ribozyme bezeichnet werden) sind DNA/RNAzyme, die durch einen Effektor (das Zielmolekül) reguliert werden. Sie enthalten typischerweise eine Aptamer-Domäne, die einen Effektor erkennt, und eine katalytische Domäne (Hesselberth et al. 2000, Soukup und Breaker 2000, Tang und Breaker 1997). Der Effektor kann durch spezifische Interaktionen zwischen der Aptamer-Domäne und der katalytischen Domäne die katalytische Aktivität des Aptazyms entweder herabsetzen oder erhöhen. Aus diesem Grund kann die Aktivität des Aptazyms verwendet werden, um die Gegenwart und die Menge des Effektors festzustellen. Diese Strategie wurde verwendet, um Aptazym-Sensoren für diagnostische und sensorische Zwecke auszuwählen und zu konstruieren (Breaker 2002, Robertson und Ellington 1999, Seetharaman et al. 2001). DNA-Aptazyme sind die attraktivsten Kandidaten für die Sensor-Entwicklung, da DNA sehr viel kostengünstiger zu synthetisieren und stabiler ist als RNA. Außerdem sind allgemeine Strategien zum Design von DNA-Aptazymen durch Einführen von Aptamer-Motiven in der Nähe des katalytischen Kerns der DNAzyme verfügbar (Wang et al. 2002). Die hohe Spaltungsaktivität erfordert die Gegenwart von Effektor-Molekülen, die nach der Bindung an das Aptamer-Motiv die Aktivität des katalytischen Kernbereichs des Aptazyms allosterisch modulieren können.
Verfahren der In-vitro-Selektion können verwendet werden, um Aptamere für einen weiten Bereich von Target-Molekülen mit außergewöhnlich hoher Affinität zu erhalten, die hohe Dissoziationskonstanten im Picomolar-Bereich aufweisen (Brody und Gold 2000, Jayasena 1999, Wilson und Szostak 1999). Beispielsweise wurden Aptamere entwickelt, die Metall-Ionen, wie beispielsweise Zn(II) (Ciesiolka et al. 1995) und Ni(II) (Hofmann et al. 1997), Nukleotide, wie beispielsweise Adenosintriphosphat (ATP) (Huizenga und Szostak 1995) und Guanin (Kiga et al. 1998), Co-Faktoren, wie beispielsweise NAD (Kiga et al. 1998) und Flavin (Lauhon und Szostak 1995), Antibiotika, wie beispielsweise Viomycin (Wallis et al. 1997) und Streptomycin (Wallace und Schroeder 1998), Proteine, wie beispielsweise HIV-Reverse-Transkriptase (Chaloin et al. 2002) und Hepatits-C-Virus RNA-abhängige RNA-Polymerase (Biroccio et al. 2002), Toxine, wie beispielsweise das Cholera-Gesamttoxin und Staphylococcus-Enterotoxin-B (Bruno und Kiel 2002), und bakterielle Sporen, wie beispielsweise Anthrax (Bruno und Kiel 1999), erkennen. Im Vergleich zu Antikörpern sind Aptamere auf DNA/RNA-Basis leichter erhältlich und weniger teuer in der Herstellung, da sie in vitro in kurzen Zeiträumen (Tage vs. Monate) und mit begrenzten Kosten erhalten werden können. Außerdem können DNA/RNA-Aptamere viele Male denaturiert und renaturiert werden, ohne dass sie ihre Bioerkennungsfähigkeit verlieren. Diese einzigartigen Eigenschaften machen Aptamere zu einer idealen Plattform zum Kreieren hochsensitiver und hochselektiver Biosensoren (Hesselberth et al. 2000).
Radioisotop- und Fluoreszenz-Signale werden oftmals verwendet, um Aptamer- und Aptazym-Aktivität nachzuweisen. Radioisotop-Markierung besitzt den Vorteil, dass es die Bindungsfähigkeit der Aptamere und Aptazyme nur minimal beeinträchtigt (Rusconi et al. 2002, Seetharaman et al. 2001); jedoch verhindern Probleme bezüglich der Sicherheit und Abfallbeseitigung eine breite Anwendung dieses Verfahrens. Fluoreszenz liefert beträchtliche Signalverstärkung und ermöglicht eine Echtzeit-Überwachung von Konzentrationsschwankungen. Jedoch ist die Bestimmung der effektiven Parameter zur Verwendung von Fluorophoren ineffizient, da es "Trial-and-Error" erfordert. Wenn sie sich zu nahe an der Bindungsstelle befinden, können Fluorophore den Effektor an der Bindung hindern; wenn sie zu weit entfernt sind, wird kein Signal detektiert. Um diese Schwierigkeit bei der Verwendung von Aptameren zu beheben, werden Fluorophore während der Aptamer-Selektion in Nukleotide eingebaut (Jhaveri et al. 2000). Viele Fluorophore werden leicht durch Licht gebleicht.
Eine bedeutende Alternative zur Fluorophor- und Radioisotop-Detektion ist Kolorimetrie (Cao et al. 2001, Rakow und Suslick 2000, Smith et al. 1999). Der kolorimetrische Nachweis minimiert die Detektionskosten und Sicherheitsprobleme und ist für Vor-Ort- und Echtzeit-Detektion gut geeignet. In einem kolorimetrischen Kokain-Sensor auf Aptamer-Basis ersetzt das Kokain einen Farbstoff in der Bindungsstelle eines Kokain-Aptamers (Stojanovic und Landry 2002). Da dieser Farbstoff bei Bindung an das Aptamer veränderte Absorptionseigenschaften aufweist, wird die Gegenwart von Kokain durch eine Farbänderung angezeigt. Jedoch erfordert das Herausfinden eines geeigneten Farbstoffs für ein bestimmtes Aptamer das Screenen einer großen Anzahl von Farbstoffen. Außerdem übersteigt der Extinktionskoeffizient für organische Farbstoffe selten 10⁶ l × mol^–1 × cm^–1, wodurch eine hohe Farbstoffkonzentration für einfache visuelle Beobachtung notwendig wird.
Metallische Partikel besitzen Extinktionskoeffizienten, die drei Größenordnungen über denen der organischen Farbstoffe liegen (Link et al. 1999). Für einen effektiven Nachweis können sie in niedrigen Konzentrationen (nanomolar) als Detektions-Agenzien mit Aptameren verwendet werden.
ZUSAMMENFASSUNG
In einem ersten Aspekt ist die Erfindung auf ein Sensorsystem zum Detektieren eines Effektors gerichtet, welches ein Nukleinsäure-Enzym (welches ein Aptamer umfasst, das eine Bindungsstelle für den Effektor enthält), ein Substrat für das Nukleinsäure-Enzym und Partikel mit einem zweiten Polynukleotid, welches zumindest teilweise komplementär zu dem Substrat ist, umfasst. Bei dem Enzym kann es sich um DNA handeln; der Effektor kann das Enzym aktivieren oder inhibieren; die Partikel können Goldpartikel oder andere Metall-Kolloide oder Polstyrol-Latex-Partikel sein. Der Effektor kann Adenosin, Anthrax, ein von Anthrax abgeleitetes Molekül, Pocken, ein von Pocken abgeleitetes Molekül, HIV, ein von HIV abgeleitetes Molekül, ein Antibiotikum oder Kokain sein. Das Nukleinsäure-Enzym kann sowohl SEQ ID NO: 5 als auch 6, sowohl SEQ ID NO: 8 als auch 9 oder SEQ ID NO: 1 sein; das Substrat kann SEQ ID NO: 4, 7 oder 2 sein. Das Sensorsystem kann mit einer Probe zum Nachweis eines Effektors gemischt werden. Ebenso können Mg(II) und Pb(II) zu der Probe gegeben werden. Beim Detektieren eines Effektors kann ebenso ein Schritt enthalten sein, bei dem das Sensorsystem erhitzt wird, um eine Paarung zwischen den Polynukleotiden zu zerstören. Die Gegenwart eines Effektors wird durch eine Farbänderung in der Probe oder von aggregierten Partikeln, die in der Probe ausfallen können, angezeigt.
In einem zweiten Aspekt ist die Erfindung auf ein Sensorsystem zum Detektieren eines Effektors gerichtet, welches ein Nukleinsäure-Enzym aus DNA (welches ein Aptamer umfasst, welches eine Bindungsstelle für den Effektor enthält), ein Substrat für das Nukleinsäure-Enzym, Goldpartikel mit einem zweiten Polynukleotid, welches wenigstens teilweise komplementär zu dem Substrat ist, und Mg(II) aufweist. Das Sensorsystem kann außerdem Pb(II) enthalten. Dieses Sensorsystem kann verwendet werden, um einen Effektor nachzuweisen, indem es mit einer Probe gemischt wird.
In einem dritten Aspekt ist die Erfindung auf Verfahren zum Detektieren eines Effektors gerichtet, bei dem die Bestandteile einer Probe, ein Nukleinsäure-Enzym (mit einem Aptamer, welches eine Bindungsstelle für den Effektor enthält), ein Substrat für das Nukleinsäure-Enzym und Partikel mit einem Polynukleotid, welches wenigstens teilweise komplementär zu dem Substrat ist, gemischt werden. Die Bestandteile können in verschiedenen Reihenfolgen gemischt werden. Bei den Nukleinsäure-Enzymen kann es sich sowohl um SEQ ID NO: 5 als auch 6, sowohl SEQ ID NO: 8 als auch 9 oder SEQ ID NO: 1 handeln; das Substrat kann SEQ ID NO: 4, 7 oder 2 sein.
In einem vierten Aspekt ist die Erfindung auf Kits zum Detektieren eines Effektors, ein Sensorsystem zum Detektieren eines Effektors gerichtet, welches ein Nukleinsäure-Enzym (umfassend ein Aptamer, welches eine Bindungsstelle für den Effektor enthält), ein Substrat für das Nukleinsäure-Enzym und Partikel, die ein zweites Polynukleotid aufweisen, das wenigstens teilweise komplementär zu dem Substrat ist, aufweist. Bei den Partikeln kann es sich um Goldpartikel oder andere Metall-Kolloide oder Polystyrol-Latex-Partikel handeln. Der Effektor kann Adenosin, Anthrax, ein von Anthrax abgeleitetes Molekül, Pocken, ein von Pocken abgeleitetes Molekül, HIV, ein von HIV abgeleitetes Molekül, ein Antibiotikum oder Kokain sein. Das Nukleinsäure-Enzym kann sowohl SEQ ID NO: 5 als auch 6, sowohl SEQ ID NO: 8 als auch 9 oder SEQ ID NO: 1 sein; das Substrat kann SEQ ID NO: 4, 7 oder 2 sein. Das Sensorsystem kann zum Nachweis eines Effektors mit einer Probe gemischt werden. Ebenso können Mg(II) und Pb(II) zu der Probe gegeben werden. Die Gegenwart eines Effektors wird durch eine Farbänderung in der Probe oder durch aggregierte Partikel, die in der Probe ausfallen können, angezeigt.
Der Kit kann derart bereitgestellt werden, dass das Substrat, die Partikel und das Nukleinsäure-Enzym in getrennten Behältnissen geliefert werden, oder dass Substrat, Partikel und Nukeinsäure-Enzym in einem einzigen Behältnis bereitgestellt werden. Außerdem kann der Kit derart bereitgestellt werden, dass das Substrat, die Partikel und das Nukeinsäure-Enzym als Aggregat geliefert werden. Der Kit kann außerdem Kontroll-Lösungen, wie beispielsweise eine Lösung, die eine bekannte Konzentration eines Effektors aufweist, enthalten. Ebenso kann eine Farbtafel enthalten sein, in der die Farben eine Konzentration des Effektors anzeigen, um die Quantifizierung zu erleichtern.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt ein Beispiel für ein Nukleinsäure-Enzym und sein Substrat.
2 zeigt ein Adenosin-Aptazym; rA bezeichnet ein einzelnes Adenosin-Ribonukleotid.
3 ist eine schematische Darstellung der kolorimetrischen Detektion von Adenosin. Das Aptazym-System kann als Linker für DNA-gebundene Goldpartikel wirken, um Aggregationen zu bilden, welche eine blaue Farbe aufweisen (Reaktion A). In Gegenwart von Adenosin und Metall-Ionen kann das Substrat gespalten werden (Reaktion B). Das gespaltene Substrat kann nicht länger als Linker für Partikel dienen, und die Farbe bleibt rot (Reaktion C).
4 zeigt die Extinktionsspektren von getrennten Goldpartikeln mit 13 nm Durchmesser (durchgezogene Linie) und von Aptazym-vermittelter Goldpartikel-Aggregation (gestrichelte Linie) im sichtbaren Bereich. Die durch DNA-Linker induzierte Aggregation verschiebt den Peak der Oberflächen-Plasmon-Bande von 522 nm auf 540 nm.
5 zeigt die Schmelzkurve der Aptazym-kombinierten Goldpartikel in 25 mM Tris-Acetat-Puffer, pH 7,2, 300 mM NaCl.
6 zeigt die Beziehung zwischen der Substratmenge und dem Aggregationsgrad der Goldpartikel. Die vertikale Achse ist das Verhältnis der Extinktion zwischen 522 nm und 700 nm. Der Pfeil zeigt 6 pmol Substrat an.
7 zeigt die Kinetiken einer Farbänderung des Aptazym-Goldpartikel-Sensors.
8 zeigt die Quantifizierung der Adenosin-Konzentration unter Verwendung von UV-VIS-Spektroskopie.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung macht sich die Entdeckung zunutze, dass die Spaltung eines Nukleinsäure-Substrats durch ein Aptazym nach Bindung eines Effektors kolorimetrisch detektiert werden kann. In Gegenwart des Effektors wird das Substrat gespalten und Partikel, die an Polynukleotide gebunden sind, die mit dem Substratstrang hybridisieren können, werden dispergiert, was zu einer Farbänderung führt. Dieses System kombiniert den Vorteil von Elementen, die jedes gewünschte Molekül erkennen können, mit der hohen Sensitivität und der einfachen Anwendung, die durch kolorimetrische Detektion bereitgestellt werden.
Dieses System umfasst zumindest drei Teile:

(1) Ein Enzym auf Nukleinsäure-Basis mit einer Effektor-Bindungsstelle (wie beispielsweise in Aptameren) und einem Co-Faktor, wie beispielsweise Metall-Ionen, welche die Substratspaltung katalysieren;
(2) Ein Nukleinsäure-Substrat für das Enzym auf Nukleinsäure-Basis, wobei innen gelegene Abschnitte der Substratsequenz komplementär zu Abschnitten der Enzymsequenz sind; und
(3) Partikel, die an Polynukleotide gebunden sind, die komplementär zu den 3'- und 5'-Enden des Substrats sind.

Um den Ziel-Effektor nachzuweisen, werden die komplementären Abschnitte der Polynukleotide (die Polynukleotide, die an die Partikel gebunden sind, die komplementär zu den 3'- und 5'-Enden des Substratstrangs sind, und die 5'- und 3'-Enden des Enzyms auf Nukleinsäure-Basis, die komplementär zu innen gelegenen Sequenzen des Substratstrangs sind) in Gegenwart einer Probe, von der vermutet wird, dass sie den gesuchten Effektor enthält, hybridisiert (annealed). Bei Abwesenheit des Effektors ist das Aptazym entweder inaktiv oder zeigt wesentlich reduzierte Aktivität, was zu keiner oder nur geringer Substratspaltung und somit zur Aggregation der Partikel führt. Bei Anwesenheit des Effektors wird das Enzym aktiv und spaltet das Substrat, wodurch Aggregatbildung verhindert wird, da die Verbindung zwischen den Partikeln durch den enzymatischen Spaltungsschritt aufgebrochen wird. Im Fall von Goldpartikeln zeigt der aggregierte Zustand eine blaue Farbe, während der dispergierte Zustand (oder Nicht-Aggregat-Zustand) eine rote Farbe aufweist. Die Gegenwart des Ziel-Analyten als Effektor kann auf der Grundlage des Auftretens der Farbe des Sensorsystems nachgewiesen werden.
Zudem kann, was noch wichtiger ist, die Konzentration oder die Menge des Ziel-Analyten als Effektor durch den Grad der Farbdeviation von Blau oder Rot quantifiziert werden. Beispielsweise führt eine geringe Konzentration des Effektors zu einem kleinen Prozentsatz an Substratspaltung, einem kleinen Prozentsatz von Partikeln im nicht aggregierten Zustand, einer kleinen Deviation von der blauen Farbe, wodurch ein Purpurrot beobachtet werden kann. Andererseits führt eine hohe Konzentration des Effektors zu einem großen Prozentsatz an Substratspaltung, einem großen Prozentsatz von Partikeln im nicht aggregierten Zustand, einer großen Deviation von der blauen Farbe, wodurch ein Pink/Rot beobachtet werden kann. Für eine genauere quantitative Analyse kann Spektrometrie, wie beispielsweise das Extinktionsverhältnis zwischen 522 nm und 700 nm, verwendet werden. Der Analyt als Effektor kann ebenso die Aptazym-Aktivität herabsetzen oder inhibieren anstatt sie zu erhöhen. In diesem Fall sind die Wirkung und die Farbänderungen entgegengesetzt zu den oben beschriebenen. Die Wirkung kann ebenso durch andere Verfahren, wie beispielsweise Aggregat-Präzipitation, detektiert werden. Bei Abwesenheit des Effektors findet keine Spaltung statt.
Durch Ersetzen der Aptamer-Domäne durch Aptamere, die vorher ausgewählte Effektoren erkennen, können kolorimetrische Sensoren für jegliche gewünschte Effektoren leicht hergestellt und verwendet werden.
Definitionen
Ein "Effektor" ist ein Molekül, das, wenn es an ein Enzym mit einer Effektor-Bindungsstelle gebunden ist, Enzymkatalyse verstärken oder inhibieren kann. Eine "Effektor-Bindungsstelle" kann "spezifisch" sein, das heißt, es wird lediglich ein Effektor-Molekül in Gegenwart anderer Effektor-Moleküle gebunden. Effektor-Bindungsstellen-Spezifität liegt beispielsweise vor, wenn lediglich Zn(II)-Ionen in Gegenwart vieler anderer Ionen, wie beispielsweise Mn(II), Mg(II) oder Pb(II), binden. Alternativ kann eine Effektor-Bindungstelle "teilweise" spezifisch (es wird lediglich eine Molekül-Klasse gebunden) oder "nicht spezifisch" (mit molekularer Promiskuität) sein. Zu Beispielen für Effektoren zählen Metall-Ionen, Anthrax, von Anthrax abgeleitete Moleküle, Pocken oder von Pocken abgeleitete Moleküle, Schadstoffe (wie beispielsweise Stickstoff-Düngemittel, toxische Moleküle usw.), Kokain, das humane Immunschwächevirus (HIV) und von HIV abgeleitete Moleküle.
Ein "Enzym auf Nukleinsäure-Basis" ist ein Enzym, das im wesentlichen Nukleinsäuren, wie beispielsweise Ribozyme (RNAzyme), Desoxyribozyme (DNAzyme) und Aptazyme, enthält. Die Nukleinsäuren können natürliche, künstliche oder modifizierte Nukleinsäuren sein. Ebenso gehören Peptid-Nukleinsäuren (PNAs) dazu. Ein Enzym auf Nukleinsäure-Basis erfordert einen Metall-"Co-Faktor" für effiziente Substratspaltung und/oder spezifische Effektor-Bindung. Zu üblichen Co-Faktoren zählen Mg(II) und Pb(II).
"Polynukleotid" bezeichnet eine Nukleinsäure-Sequenz mit mindestens zwei oder mehr Nukleotiden. Polynukleotide können natürlich vorkommende Nukleotide und modifizierte Nukleotide enthalten. PNA-Moleküle fallen ebenso unter diesen Ausdruck.
"Sensitivität" bezieht sich auf die Detektionsgrenzen einer analytischen Vorrichtung. Im Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen Sensoren auf Aptazym-Basis bezieht sich die Sensitivität auf die geringste Konzentration und die höchste Konzentration eines Effektors, die durch den Sensor detektiert werden kann.
"Basenpaarung" bezeichnet die Fähigkeit eines Polynukleotids, zumindest eine Wasserstoffbrückenbindung mit einem Nukleotid unter wenig stringenten Bedingungen auszubilden. Das Nukleotid kann in einem zweiten Polynukleotid vorliegen, oder es kann sich um ein Nukleotid handeln, das sich innerhalb des ersten Polynukleotids befindet. Ein Polynukleotid ist teilweise komplementär zu einem zweiten Polynukleotid, wenn das erste Polynukleotid wenigstens eine Wasserstoffbrückenbindung mit dem zweiten Polynukleotid ausbilden kann. Ein teilweise komplementäres Polynukleotid kann Bereiche aufweisen, in denen sich keine Basenpaarungen bilden können, die von Bereichen mit Basenpaarungen umgeben sind, wodurch Schleifen (loops), Stammschleifen (stemloops) und andere Sekundärstrukturen ausgebildet werden.
Enzym auf Nukleinsäure-Basis mit einer Effektor (oder Effektoren)-Bindungsstelle
Es wurden eine Anzahl von Nukleinsäure-Enzymen entdeckt oder entwickelt, die verschiedene katalytische Aktivitäten aufweisen (Tabellen 1 und 2). Die katalytische Funktion der Enzyme ist gewöhnlich abhängig von einem oder mehreren Ionen-Co-Faktoren. Es kann In-vitro-Selektion verwendet werden, um die Selektivität und Sensitivität für ein bestimmtes Ion zu "verstärken". Nukleinsäure-Enzyme, die eine molekulare Assoziation (Ligation, Phosphorylierung und Bildung einer Aminbindung) oder Dissoziation (Spaltung oder Transfer) katalysieren, sind insbesondere geeignet für die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung.
Es wird ein Nukleinsäure-Enzym verwendet, das die Spaltung einer Nukleinsäure in Gegenwart eines Effektors katalysiert. Das Nukleinsäure-Enzym kann RNA (Ribozym), DNA (Desoxyribozym), ein DNA/RNA-Hybrid-Enzym oder ein Peptid-Nukleinsäure-(PNA)-Enzym sein. PNAs umfassen ein Polyamid-Rückgrat und natürlich vorkommende Nukleosid-Basen (beispielsweise erhältlich von Biosearch, Inc., Bedford, MA). Zu Ribozymen, die verwendet werden können, zählen Introns der Gruppe I und II, die RNA-Komponente der bakteriellen Ribonuklease P, Hammerhead, Hairpin, Hepatitis-Delta-Virus und Neurospora-VS-Ribozyme. Ebenso gehören in vitro selektierte Ribozyme dazu, wie beispielsweise die bereits vorher isolierten (Tang und Breaker, 2000). Ribozyme sind weniger stabil als Desoxyribozyme; aus diesem Grund sind Desoxyribozyme bevorzugt. Ebenso sind Desoxyribozyme mit erweiterter chemischer Funktionalität wünschenswert (Santoro et al., 2000).
Verfahren zur Herstellung von Ribozymen und Desoxyribozymen beinhalten chemische Oligonukleotid-Synthese, Polymerase-Kettenreaktion (PCR), DNA-Klonierung und -Replikation oder andere auf dem Gebiet übliche Verfahren. Bevorzugt handelt es sich bei den Nukleinsäure-Enzymen um DNA/RNA-Hybride und PNAs. Ebenso können Nukleotide verwendet werden, die modifizierte Basen, Phosphate oder Zucker enthalten; in einigen Fällen können diese modifizierten Nukleotide für die Stabilität vorteilhaft sein oder Effektor-Spezifität verleihen. Zu Beispielen für modifizierte Basen zählen Inosin, Nebularin, 2-Aminopurin-Ribosid, N⁷-Deazaadenosin und O⁶-Methylguanosin (Earnshow und Gait 1998). Zu modifizierten Zuckern und Phosphaten zählen 2'-Desoxynukleosid, Abasic, Propyl, Phosphorothioat und 2'-O-Allyl-Nukleosid (Earnshow und Gait 1998).
Ein Nukleinsäure-Enzym, das einen Nukleinsäurestrang spaltet, der getrennt von dem Strang vorliegt, der das Enzym umfasst, ist ein trans-agierendes Enzym. Die Verwendung trans-agierender Enzyme ermöglicht mehrfache Durchgänge von Substratspaltungen, da das enzymatische Produkt entfernt wird. Ein Beispiel für ein derartiges Nukleinsäure-Enzym ist 17E (SEQ ID NO: 1); das entsprechende Substrat ist 17DS (SEQ ID NO: 2; r bezeichnet ein einzelnes Ribonukleotid); beide sind in Tabelle 3A wiedergegeben und in 1 dargestellt. In Tabelle 3B sind außerdem weitere Beispiele aufgeführt.
Tabelle 3B Aptamere auf RNA/DNA-Basis und RNA/DNAzyme
Direkte Mutagenese kann verwendet werden, um eine oder mehrere Eigenschaften eines Nukleinsäure-Enzyms oder seines Substrats zu verändern. Beispielsweise kann bei Verwendung von 17E und 17DS die Veränderung der Avidität der zwei Arme des hybridisierten Enzyms und Substrats gewünscht sein. Bei den "Armen" handelt es sich um solche Bereiche, die eine Watson-Crick-Basenpaarung in 1 zeigen. Um die Avidität zu ändern, wird die Länge der Arme verändert. Die Verlängerung der Arme erhöht die Anzahl der Watson-Crick-Bindungen, wodurch die Avidität erhöht wird; eine Verkürzung der Länge setzt die Avidität herab. Das Herab setzen der Avidität der Arme erleichtert das Entfernen des Substrates vom Enzym, wodurch ein schnellerer enzymatischer Umsatz (Turnover) ermöglicht wird.
Ein anderes Verfahren zur Verminderung der Avidität beinhaltet die Erzeugung von fehlerhaften Paarungen (Mismatches) zwischen dem Enzym und dem Substrat. Alternativ kann der G-C-Gehalt der Arme verändert werden. Die Wirkung jeder gerichteten Veränderung sollte beobachtet werden, um sicherzustellen, dass das Enzym die gewünschte Aktivität, einschließlich Ionensensitivität und -selektivität, beibehält. Um zu gewährleisten, dass das mutierte Enzym seine Sensitivität und Selektivität für Adenosin beibehält, wird beispielsweise ein Test durchgeführt, um zu bestimmen, ob das mutierte Enzym in Gegenwart von Adenosin reaktiv bleibt (Sensitivität) und sein herabgesetztes Aktivitätsniveau in Gegenwart anderer Effektoren beibehält (Selektivität).
In-vitro-Selektion von Aptameren
Aptamere und Aptazyme, die an einen gewünschten Effektor binden, können durch In-vitro-Selektion isoliert werden. In-vitro-Selektion ist eine Technik, bei der RNA- oder DNA-Moleküle mit bestimmten Funktionen aus einer großen Anzahl von Sequenzvarianten durch mehrfache Selektions- und Amplifikations-Zyklen isoliert werden (Chapman und Szostak 1994, Joyce 1994). DNAzyme und RNAzyme mit maximierten Aktivitäten oder neuen katalytischen Fähigkeiten sowie Aptamere können beispielsweise unter Anwendung der Technik der systematischen Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung (SELEX) erhalten werden (Tuerk und Gold 1990).
In-vitro-Selektion wird typischerweise mit einer großen Sammlung (Pool) von Zufallssequenzen, welche gewöhnlich 10¹³–10¹⁵ Sequenz-Varianten enthalten, gestartet. Die chemische Synthese eines Satzes degenerierter Polynukleotide unter Verwendung von Standard-Phosphoramidit-Chemie kann verwendet werden, um derartige randomisierte Pools zu erzeugen. Die 3'-Phosphoramidit-Verbindungen der vier Nukleoside (Adenosin, Cytosin, Guanin, Thymidin) werden vorgemischt und zur Synthese der Polynukleotide verwendet; die Zufälligkeit wird durch Regulierung des Verhältnisses der vier Phosphoramidite erzeugt. Ebenso können systematische Fehler (Biases) erreicht werden, sowie das Konstant-Halten eines Phosphoramidits an einer bestimmten Position. Andere Strategien zur Erzeugung randomisierter DNA-Bibliotheken beinhalten mutagene Polymerase-Kettenreaktionen (PCR) und Templa te-gerichtete Mutagenese (Cadwell und Joyce 1992, Cadwell und Joyce 1994, Tsang und Joyce 1996). Wenn eine In-vitro-Selektion von RNA-Molekülen gewünscht ist, werden randomisierte DNA-Bibliotheken zunächst durch In-vitro-Transkription in eine RNA-Bibliothek überführt.
Die randomisierten Bibliotheken werden dann auf Moleküle gescreent, die eine gewünschte Funktion aufweisen, wie beispielsweise das Binden des Ziel-Effektors; diese werden dann isoliert. Die Auftrennung kann unter Verwendung von Affinitäts-Säulenchromatographie (z. B. unter Verwendung des Ziel-Effektors), Gelelektrophorese oder selektive Amplifikation eines markierten („tagged") Reaktionszwischenprodukts erreicht werden. Die selektierten Moleküle werden amplifiziert, beispielsweise unter Verwendung von PCR bei DNA oder isothermischer Amplifikationsreaktion bei RNA. Diese selektierten, amplifizierten Moleküle werden dann, beispielsweise unter Verwendung mutagener PCR, mutiert (wodurch wieder Diversität eingeführt wird), um zu versuchen, Moleküle mit noch höherer Aktivität zu selektieren. Diese drei Schritte, Selektion, Amplifikation und Mutation, werden wiederholt, oftmals mit ansteigender Selektionsstringenz, bis Sequenzen mit der gewünschten Aktivität im Pool vorherrschen.
Neue Nukleinsäure-Enzyme, die aus den Zufallssequenzen in vitro isoliert wurden, erweiterten das katalytische Repertoire von RNA und DNA (Tabelle 1). Desoxyribozyme katalysieren weniger Reaktionstypen im Vergleich zu Ribozymen (Tabelle 2). Die katalytische Geschwindigkeit (k_cat) der meisten Desoxyribozyme ist vergleichbar mit der von Ribozymen, die die gleiche Reaktion katalysieren. In bestimmten Fällen übersteigt die katalytische Effizienz (k_cat/K_m) von Nukleinsäure-Enzymen sogar die katalytische Effizienz von Protein-Enzymen.
In-vitro-Selektion kann verwendet werden, um die Ionen-Spezifität oder Bindungsaffinität der bestehenden Nukleinsäure-Enzyme zu verändern oder Nukleinsäure-Enzyme zu erhalten, die spezifisch für gewünschte Substrate sind. Beispielsweise wurde die Mg²⁺-Konzentration, die für eine optimale Aktivität des Hammerhead-Ribozyms erforderlich ist, unter Verwendung von In-vitro-Selektion herabgesetzt, um die Enzymleistung unter physiologischen Bedingungen zu verbessern (Conaty et al. 1999, Zillmann et al. 1997).
Oftmals weisen Nukleinsäure-Enzyme, die für einen spezifischen Effektor durch In-vitro-Selektion entwickelt wurden, Aktivität in Gegenwart anderer Moleküle auf. Beispielsweise wurde 17E-Desoxyribozym durch In-vitro-Selektion für eine Aktivität in Gegenwart von Zn²⁺ entwickelt. Jedoch zeigte das Enzym eine höhere Aktivität in Gegenwart von Pb²⁺ als von Zn²⁺. Obwohl 17E in einem Verfahren hergestellt wurde, das auf Zn²⁺-bezogene Aktivität abzielte, kann 17E als sensitiver und selektiver Sensor für Pb²⁺ verwendet werden. Um Nukleinsäure-Enzyme mit höherer Selektivität herzustellen, kann ein negativer Selektionsschritt eingeführt werden.
Andere Polynukleotid-Sequenzen sind geeignet, einschließlich der, die in der U.S.-Patentanmeldung Nr. 09/605,558, hinterlegt am 27. Juni 2000, beschrieben sind, auf deren Inhalt hiermit Bezug genommen wird (Lu und Liu).
Aptazym-Struktur
Das Aptazym (2) besteht aus einer Sequenz, die komplementär zu einem 3'-Bereich der Spaltungsstelle des Substrats ist, einem konservierten katalytischen DNAzym-Kern, einem variablen Bereich, der mit dem 3'-Terminus des Kerns verbunden ist (tatt (SEQ ID NO: 3) durch "*" in 2 gekennzeichnet), der Effektor-Bindungsstelle (2, "Aptamer-Motiv") und einer 3'-Sequenz, die komplementär zu einem 5'-Bereich der Substrat-Spaltungsstelle ist. Der variable Bereich kann 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr Nukleotide länger sein; bevorzugt weist er eine Länge von 3 bis 6 Nukleotiden auf. Durch Variieren der Länge des variablen Bereichs können die enzymatische Aktivität und/oder die Effektor-Bindung (Selektivität und/oder Avidität) verbessert werden.
Das in 2 dargestellte Aptazym ist spezifisch für Adenosin. Die Nukleotidsequenz für das DNAzym ist SEQ ID NO: 8; die Sequenz für das Polynukleotid, welches das Aptamer enthält, ist SEQ ID NO: 9; und die Nukleotidsequenz für den Substratstrang ist SEQ ID NO: 4.
Partikel, die mit Polynukleotiden markiert („tagged") sind, die komplementär zu den 3'- und 5'-Termini des Nukleinsäure-Enzym-Substrats sind
Damit der Sensor die enzymatische Aktivität anzeigen kann, muss eine nachweisbare Änderung nach einer Veränderung bezüglich der Aggregation der Partikel, an die die Polynukleotide gebunden sind, stattfinden. Außerdem muss die Zusammensetzung der Partikel derart sein, dass sie nicht störend in die Substratspaltung eingreifen. Die Partikel können aus einem Metall, Halbleiter und magnetischen Kolloiden, Zns, ZnO, TiO₂, Agl, AgBr, Hgl₂, PbS, PbSe, ZnTe, CdTe, In₂S₃, In₂Se₃, Cd₃P₂, Cd₃As₂, InAs und GaAs (z. B. Mirkin et al. 2002) bestehen; es kann sich auch um Goldpartikel handeln (z. B. kommerziell erhältlich von Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, und Nanoprobes, Inc, Yaphank NY). Ebenso können nichtmetallische Partikel, wie beispielsweise Polystyrol-Latex-Partikel oder Latexpartikel, die einen Farbstoff enthalten, verwendet werden.
Bevorzugt sind kolloidale Goldpartikel. Kolloidale Goldpartikel weisen hohe Extinktionskoeffizienten für die Banden auf, die ihre intensiven Farben hervorrufen. Diese Farben können mit der Partikelgröße, Konzentration, dem Abstand zwischen den Partikeln, dem Aggregationsgrad und der Form der Aggregate variieren. Beispielsweise führt die Hybridisierung von Polynukleotiden, die an Golpartikel gebunden sind, zu einer unmittelbaren Farbänderung, die mit bloßem Auge sichtbar ist (siehe z. B. Mirkin et al. 2002).
Die Goldpartikel, Polynukleotide oder beide werden für die Bindung der Polynukleotide derivatisiert. Beispielsweise binden Polynukleotide, die an ihren 3'- oder 5'-Enden mit Alkanthiolen derivatisiert sind, ohne weiteres an Goldpartikel (Whitesides 1995). Ein Verfahren zum Anbringen von 3'-Thiol-DNA an flachen Goldoberflächen kann ebenso verwendet werden, um Polynukleotide an Partikel zu binden (Mucic et al. 1996). Alkanthiol-derivatisierte Partikel können verwendet werden, um Polynukleotide zu befestigen. Zu anderen funktionellen Gruppen zum Befestigen von Polynukleotiden an festen Oberflächen zählen Phosphorothioate zur Befestigung von Polynukleotiden an Goldoberflächen (Beebe und Rabke-Clemmer 1995), substituierte Alkylsiloxane zum Binden von Polynukleotiden an Quarz- und Glasoberflächen und Aminoalkylsiloxane und Mercaptoalkylsiloxane (Grabar et al. 1995). Polynukleotide, die mit einem 5'-Thionukleosid oder einem 3'-Thionukleosid enden, können ebenso verwendet werden, um Polynukleotide an festen Oberflächen zu befestigen. Einige Verfahren zum Befestigen von Polynukleotiden sind in Tabelle 4 dargestellt.
Tabelle 4 Systeme zum Befestigen von Polynukleotiden an Partikeln
Bevorzugt ist das Substrat modifiziert, beispielsweise durch Verlängerung der 3'- und 5'-Enden durch eine Anzahl von Basen, die als "sticky ends" wirken, um das Hybridisieren (Annealing) an den komplementären, mit den Partikeln verbundenen Polynukleotidstrang zu erleichtern. Die Substrat-Modifikation ermöglicht die Bildung von Komplexen, die Substrat-gebundene Partikel umfassen, ohne dass die Nukleinsäure-Enzym/Substrat-Interaktion inhibiert wird. Wenn jedoch das Substrat Bereiche enthält, die nicht entscheidend für eine Interaktion mit dem Nukleinsäure-Enzym sind, muß eine Modifikation nicht notwendig sein.
Um den Ziel-Effektor zu detektieren, werden das Nukleinsäure-Enzym, das Substrat und die markierten Partikel in Gegenwart einer Probe, von der angenommen wird, dass sie einen Ziel-Effektor, wie beispielsweise Adenosin, auf den das Enzym sensitiv reagiert, enthält, vereinigt (3). In Gegenwart des Effektors spaltet das Enzym das Substrat, wodurch Aggregatbildung verhindert wird. In einigen Fällen kann das Erhitzen des Sensorsystems auf eine Temperatur über dem Schmelzpunkt des Komplexes notwendig sein. In diesem Fall ermöglicht die Gegenwart des Effektors die Spaltung des Substrats durch das Enzym, wodurch eine Aggregation des Komplexes verhindert wird.
Verschiedene Aggregations-Zustände der Partikel führen zu verschiedenen Farben. Beispielsweise zeigt ein hoher Aggregationsgrad der Partikel eine Färbung Bereich nahe blau, während ein geringer Aggregationsgrad der Partikel zu Färbungen Bereich nahe rot führt. Außerdem ist die Menge der Substratspaltung und somit der Aggregationsgrad abhängig von der Konzentration des Effektors. Eine geringe Effektor-Konzentration führt nur zu teilweiser Substratspaltung, die zu einer Mi schung aus einzelnen Partikeln und Aggregaten führt, wodurch halb-quantitative oder qualitative Assays ermöglicht werden. Die Farbdifferenz kann zur Verbesserung der Sensitivität verstärkt werden. Für eine quantitative Messung werden die optischen Spektren der Assay-Mischung bestimmt. Zusätzlich zu der Farbänderung können ebenso die Bildung von Aggregaten durch die Partikel oder die Präzipitation aggregierter Partikel überwacht werden. Die Farbänderungen können mit bloßem Auge oder spektroskopisch beobachtet werden. Die Bildung von Aggregaten kann durch Elektronen-Mikroskopie oder durch Nephelometrie beobachtet werden; und die Präzipitation von aggregierten Partikeln kann mit bloßem Auge oder mikroskopisch beobachtet werden.
Um die Beobachtung einer Farbänderung zu erleichtern, wird die Farbe auf einem Hintergrund mit einer Kontrastfarbe beobachtet. Bei Verwendung von Goldpartikeln wird die Beobachtung einer Farbänderung dadurch erleichtert, dass eine Probe der Hybridisierungslösung auf einer festen weißen Oberfläche (beispielsweise Silica- oder Aluminiumoxid-TLC-Platten, Filterpapier, Zellulosenitrat-Membranen und Nylon-Membranan) aufgetragen und der Punkt getrocknet wird. Anfänglich weist der Punkt die Farbe der Hybridisierungslösung auf (welche im Bereich von pink/rot bei Abwesenheit von Aggregation bis purpurähnlich-rot/purpurrot bei Aggregation der Goldpartikel liegt). Beim Trocknen entwickelt sich ein blauer Punkt, wenn Aggregation vor dem Auftragen vorliegt; ein rosafarbener Punkt entsteht, wenn Dispersion vorliegt. Die blauen und rosafarbenen Punkte sind stabil und verändern sich nicht beim anschließenden Abkühlen oder Erhitzen, auch nicht mit der Zeit. Sie liefern eine bequeme permanente Aufzeichnung des Tests. Es sind keine weiteren Schritte notwendig, um die Farbänderung zu beobachten.
Alternativ können die Testergebnisse sichtbar gemacht werden, indem eine Probe auf einen Glasfaserfilter (z. B. Borosilikat-Microfaser-Filter, 0,7 μm Porengröße, Grad FG75,), bei Verwendung mit 13-nm-Goldpartikeln, aufgetragen wird. Nach Spülen mit Wasser wird ein Punkt, welcher die Aggregate umfasst, beobachtet. Ebenso sind andere Verfahren für die Visualisierung von Testergebnissen verfügbar (Mirkin et al. 2002).
Der gesuchte Effektor kann in einer Vielzahl von Proben, einschließlich Körperflüssigkeiten, nachgewiesen werden. Zusammen mit der unbekannten Probe können Standards, welche bekannte Mengen des Effektors enthalten, untersucht und die Farbänderungen verglichen werden. Alternativ können Standard-Farbtafeln, ähnlich denen, die bei pH-Papieren verwendet werden, bereitgestellt werden.
Kits
Die Erfindung stellt ebenso Kits zum Detektieren von Analyten als Effektoren zur Verfügung. In einer Ausführungsform umfasst der Kit zumindest ein Behältnis, wobei das Behältnis wenigstens einen Partikeltyp mit daran gebundenen Polynukleotiden, ein Substrat und ein Nukleinsäure-Enzym enthält. Die an die Partikel gebundenen Polynukleotide weisen eine Sequenz auf, die komplementär zu der Sequenz wenigstens eines ersten und eines zweiten Abschnitts des Substrats ist. Der erste und zweite Abschnitt des Substrats sind durch einen dritten Abschnitt des Substrats getrennt, der durch das Nukleinsäure-Enzym in Gegenwart des Analyten gespalten wird.
Ein Kit kann ebenso zumindest zwei Partikeltypen mit daran gebundenen Polynukleotiden umfassen. An einen ersten Partikeltyp sind Polynukleotide gebunden, die eine Sequenz komplementär zu der Sequenz eines ersten Abschnitts des Substrats aufweisen. An einen zweiten Partikeltyp sind Polynukleotide gebunden, die eine Sequenz komlementär zu der Sequenz eines zweiten Abschnitts des Substrats aufweisen. Der erste und zweite Abschnitt des Substrats sind durch einen dritten Abschnitt des Substrats voneinander getrennt, der durch das Nukleinsäure-Enzym in Gegenwart des Effektors gespalten wird.
Bei Bereitstellung eines Kits können die verschiedenen Komponenten der Zusammensetzung in getrennten Behältnissen verpackt und unmittelbar vor Verwendung zugemischt werden. Derartiges getrenntes Verpacken der Komponenten kann eine Langzeitlagerung der aktiven Komponenten ermöglichen. Beispielsweise werden ein oder mehrere der Partikel mit den daran gebundenen Polynukleotiden, das Substrat und das Nukleinsäure-Enzym in getrennten Behältnissen geliefert.
Die in den Kits enthaltenen Reagenzien können in Behältnissen jeglicher Art bereitgestellt werden, derart, dass die Haltbarkeit der verschiedenen Komponenten bewahrt wird und sie nicht durch die Materialien des Behältnisses adsorbiert oder verändert werden. Beispielsweise können abgedichtete Glasampullen ein oder mehrere Reagenzien oder Puffer enthalten, die unter einem neutralen, nicht reagierenden Gas, wie beispielsweise Stickstoff, verpackt wurden. Die Ampullen können aus jeglichem geeigneten Material, wie beispielsweise Glas, organischen Polymeren, wie beispielsweise Polycarbonat, Polystyrol usw., Keramik, Metall oder irgendeinem anderen Material, das typischerweise zum Aufbewahren ähnlicher Reagenzien verwendet wird, bestehen. Zu anderen Beispielen für geeignete Behältnisse zählen einfache Flaschen, die aus ähnlichen Substanzen wie die Ampullen hergestellt sein können, und Hüllen, die ein Folien-ausgekleidetes Inneres umfassen, beispielsweise aus Aluminium oder einer Legierung. Zu weiteren Behältnissen zählen Teströhrchen, Glasfläschchen, Kolben, Flaschen, Spritzen und ähnliches. Die Behältnisse können eine sterile Zugangsöffnung aufweisen, wie beispielsweise eine Flasche mit einem Stopfen, der durch eine hypodermische Injektionsnadel durchstochen werden kann. Andere Behältnisse können zwei Abschnitte aufweisen, die durch eine leicht entfernbare Membran getrennt sind, die nach ihrer Entfernung das Mischen der Komponenten ermöglicht. Entfernbare Membranen können aus Glas, Kunststoff, Gummi usw. bestehen.
Die Kits können ebenso weitere Reagenzien und Gegenstände enthalten, die zum Detektieren des Ziel-Effektors geeignet sind. Die Reagenzien können Standard-Lösungen, die bekannte Mengen des Effektors enthalten, Verdünnungsmittel und andere Puffer, Vorbehandlungs-Reagenzien usw. umfassen. Zu anderen Gegenständen, die als Bestandteil bereitgestellt werden können, zählt eine Unterstützung (zur Visualisierung des Aggregat-Niederschlags), wie beispielsweise eine TLC-Silica-Platte, mikroporöse Materialien, Spritzen, Pipetten, Küvetten und Behältnisse. Es können Standard-Tafeln bereitgestellt werden, die das Auftreten der Partikel in verschiedenen Aggregations-Zuständen, entsprechend der Gegenwart verschiedener Mengen des Effektors während des Tests, anzeigen.
Die Kits können ebenso Anleitungsmaterialien enthalten. Die Anleitungen können auf Papier oder andere Substrate gedruckt sein und/oder als elektronisch lesbares Medium, wie beispielsweise Diskette, CD-Rom, DVD-Rom, Zip-Disc, Videotape, Audiotape usw., bereitgestellt werden. Die detaillierten Anleitungen müssen nicht körperlich mit dem Kit verbunden sei; statt dessen kann ein Anwender auf eine Internet-Webseite, die durch den Hersteller oder Vertreiber des Kits angegeben wird, verwiesen werden, oder als elektronische Post (Email) übermittelt werden.
BEISPIELE
Die vorliegenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der Erfindung. Ein Fachmann auf dem Gebiet ist leicht dazu in der Lage, unbedeutende Veränderungen in den Zusammensetzungen und Verfahren dieser Erfindung vorzunehmen. Die Beispiele sollen die vorliegende Erfindung in keiner Weise einschränken.
Beispielhaft wird ein Aptazym, das für den gerichteten Aufbau von Goldpartikeln zur kolorimetrischen Detektion und Quantifizierung von Adenosin konstruiert wurde, beschrieben. Durch Ersetzen der Aptamer-Domäne, welche Adenosin in dem beispielhaften Adenosin-Biosensor erkennt, durch andere Aptamer-Domänen, welche zuvor ausgewählte Effektoren erkennen, können kolorimetrische Sensoren für jeglichen gewünschten Effektor leicht hergestellt und verwendet werden. Des weiteren können durch Ersetzen des katalytischen Kerns (in diesem Fall des 8-17-Motivs) durch andere katalytische Kerne ähnliche Aptazyme entwickelt werden.
Beispiel 1 Kolorimetrischer Adenosin-Biosensor
Polynukleotide und Reagenzien
Alle Polynukleotide wurden von Integrated DNA Technology Inc. (Coralville, I.A.) bezogen. Adenosin und andere Nukleoside wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) bezogen. Es wurden Goldpartikel mit einem Durchmesser von 13 nm hergestellt und 3'- und 5'-Thiol-modifizierte 12-mer-DNA daran gebunden (Storhoff et al. 1998).
Spaltungsreaktion
Es wurden 38 μl einer Lösung, enthaltend 3 μM Substrat, 6 μM Enzym und 9 μM Regulator-Stränge in 300 mM NaCl, 50 mM Tris-Acetat-Puffer, pH 7,2 (300 mM NTA), bereitgestellt. Dann wurden 2 μl Metall-Ionen-Stocklösung (5 mM Pb(II) und 200 mM Mg (II)) dazugegeben, um die Spaltungsreaktion zu starten. Die Metall-Ionen-Endkonzentration betrug 0,25 mM PB(II) und 10 mM Mg(II). Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden 2-μl-Aliquots in ein Reaktionsgefäß überführt, welches 50 μl Goldpartikel mit 10 μM EDTA enthielt; das EDTA bildet spezifisch mit Pb(II) (5μM) in Lösung ein Chelat, auch in Gegenwart von 0,4 mM Mg(II), da die Bildungskonstante von EDTA für Pb(II) ungefähr 10 Größenordnungen höher liegt als die für Mg(II) (Sillen 1964). In Gegenwart von lediglich 0,4 mM Mg(II) ist die Spaltungsgeschwindigkeit für das Aptazym vernachlässigbar. Somit kann die Reaktion nach Überführung in die Goldpartikel-Lösung als unterdrückt betrachtet werden. Das 2-μl-Aliquot enthielt 6 pmol Substrat, wenn keine Spaltung stattfand. Die Spaltung kann die Menge an Substrat herabsetzen, und dies kann durch den Aggregationsgrad der Partikel widergespiegelt werden.
Goldpartikel-Aggregation
Die mit einem 2-μl-Aliquot gemischte Partikellösung wurde für 3 Minuten auf etwa 70 °C erhitzt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Lösung wurde unter Verwendung von UV-VIS-Extinktionsspektroskopie auf ihre Extinktionseigenschaft untersucht oder auf eine TLC-Platte punktförmig aufgetragen.
2 zeigt die Primärstruktur und angenommene Sekundärstruktur der drei Nukleinsäure-Stränge, die das Adenosin-Aptazym und zwei DNA-gebundene Goldpartikel, hybridisiert mit dem Substratstrang, umfassen. Die zwei Partikel sind derart konstruiert, dass sie an den zwei Enden des Substrats positioniert sind, so dass zwei verschiedene Thio-modifizierte DNA-Moleküle zur Bindung an die Goldpartikel verwendet werden. Eine Sequenz weist eine Thiolgruppe an dem 3'-Ende der DNA auf (3'-DNA_Au), und die andere besitzt ein Thiol am 5'-Ende (5'-DNA_Au). Der Substratstrang ist eine DNA/RNA-Chimäre mit einer einzigen RNA-Verknüpfung, die als Spaltungsstelle dient. Der Strang wird von zwei 12-mer-Überhängen flankiert, die zur Hybridisierung mit der 3'-DNA_Au und der 5'-DNA_Au verwendet werden. Der katalytische Kern des Aptazyms wurde von dem "8-17"-DNAzym (Faulhammer und Famulok 1997, Li et al. 2000, Santoro und Joyce 1997) übernommen und für eine hohe Aktivität in Gegenwart von Pb(II) optimiert (Brown et al., Li et al. 2000). Das 3'-Ende des DNAzyms wird mit der dritten Komponente des Aptazyms hybridisiert, wodurch ein Adenosin-Aptamer-Motiv gebildet wird, welches unter Verwendung des SELEX-Verfahrens (Huizenga und Szostak 1995) erhalten und in ein Aptazym adaptiert wurde (Wang et al. 2002). Die Gegenwart von Adenosin fördert die Bildung der aktiven tertiären DNAzym-Struktur. Dieser Komplex fördert dann die Spaltung des Substratstranges an der einzelnen Ribo-Adenosin-Position. Obwohl die drei Komponenten über Watson-Crick-Basenpaarungen interagieren können, ist ohne Adenosin die katalytische Aktivität sehr viel geringer als in Gegenwart von Adenosin (Wang et al. 2002).
3 zeigt schematisch die kolorimetrische Detektion von Adenosin auf Grundlage des Aptazym-vermittelten Aufbaus von Goldpartikeln. In Abwesenheit von Adenosin kann der Substratstrang in diesem Aptazym als Linker verwendet werden, um DNA-modifizierte Goldpartikel durch Hybridisierung an die DNA-markierten („tagged") Partikel zusammenzubringen (Reaktion A). Da die Farbe der Goldpartikel von Rot für getrennte Partikel zu Blau für aggregierte Partikel wechselt (Mirkin et al. 1996), wird nach der Hybridisierung eine blaue Farbe beobachtet. Jedoch kann die Gegenwart von Adenosin die Aptazym-Aktivität zur Spaltung des Substratstrangs anschalten (Reaktion B). Das gespaltene Substrat kann nicht länger die Goldpartikel-Aggregate tragen. Somit wird die rote Farbe getrennter Partikel beobachtet (Reaktion C). Da die Geschwindigkeit der Substratspaltung durch die Konzentration von Adenosin, welches an das Aptamer-Motiv bindet, moduliert werden kann, sollte der Anteil der Spaltung zu einem gegebenen Zeitpunkt von der Adenosin-Konzentration abhängig sein. Verschiedene Verhältnisse von gespaltenen zu nicht gespalteten Substraten führen zu verschiedenen Farben, von Rot bis Blau, welche die Adenosin-Konzentration widerspiegeln, die dann quantifiziert werden kann.
Beispiel 2 Demonstration von Aptazym-gelenktem Aufbau von Goldpartikeln
4 zeigt die Extinktionsspektren von Goldpartikeln in Abwesenheit (durchgezogene Linie) und in Gegenwart (gestrichelte Linie) des Substratstrangs. Die Verschiebung des Extinktions-Peaks von 522 nm auf 540 nm und die signifikante Erhöhung der Extinktion im Langwellenlängenbereich zeigt, dass die Gegenwart des Substratstrangs getrennte Goldpartikel (rot) in aggregierte Partikel (blau) überführt. Die Schmelztemperatur des Aggregats wurde in 300 mM NaCl mit 50 °C bestimmt (5). Der scharfe Transitionspunkt des Schmelzens zeigt die Bildung von DNA-verbundenem Goldpartikelaufbau.
Das Bestimmen des optimalen Verhältnisses zwischen dem Substratstrang und den Partikeln, derart, dass jegliche durch die Spaltung induzierte Abnahme der Substratmenge in den optischen Eigenschaften der Partikel-Aggregationen widergespiegelt werden kann, erhöht die Sensitivität des Assays. Wenn das Substrat im Überschuss vorliegt, wird ein kleiner Anteil der Spaltung nicht detektiert werden. Zu einer Mischung gleicher Volumina (25 μl) von 5'-DNA_Au und 3'-DNA_Au, jeweils mit einer Extinktion von 2,2 bei 522 nm, wurden 1 bis 9 pmol Substrat in Gegenwart einer überschüssigen Menge an Enzym und Regulatorsträngen gegeben. Nach dem Hybridisieren (Annealing) wurden die Extinktionseigenschaften der resultierenden Lösungen durch UV-VIS-Spektroskopie bestimmt. Das Extinktionsverhältnis zwischen 522 nm und 700 nm wurde verwendet, um den Aggregationsgrad zu bestimmen. Diese zwei Wellenlängen wurden ausgewählt, um die Menge von getrennt vorliegenden bzw. aggregierten Partikeln darzustellen (6). Ein geringeres Verhältnis zeigt einen höheren Aggregationsgrad an. Dieses Verhältnis ist ebenso ein Maß für die Farbänderungen von Rot zu Blau. Ein hohes Verhältnis wird durch "Rot" und ein niedriges Verhältnis durch "Blau" angezeigt. Das Verhältnis nimmt exponentiell mit ansteigender Quantität des Substratstrangs ab, was zeigt, dass die Zugabe von Substrat die Partikelaggregationen erhöht. Wenn das Substrat mit mehr als 6 pmol vorliegt, ist der Aggregationsgrad nicht länger sensitiv für einen weiteren Anstieg in der Substratmenge. Aus diesem Grund werden 6 pmol an Substrat als Ausgangspunkt zur Aggregationsbildung verwendet. Jegliche Spaltung des Substrats zerstört die Bildung von Aggregaten und erhöht das Extinktionsverhältnis.
Beispiel 3 Die Kinetiken der Farbänderungen des Aptazym-Goldpartikel-Sensors
In Gegenwart von lediglich Mg(II) betrug die Geschwindigkeitskonstante des Aptazyms 3,5 × 10^–3 min^–1 mit 5 mM Adenosin (Wang et al. 2002), wodurch 200 Minuten für eine 50%ige Substratspaltung erforderlich waren. Das "8-17"-DNAzym ist unter den gleichen Bedingungen wenigstens 3000-fach aktiver in Gegenwart von Pb(II) als von Mg(II) (Brown et al., Li und Lu 2000, Li et al. 2000). Pb(II) wurde zusätzlich zu Mg(II) in dem System verwendet, um die Detektionszeit herabzusetzen. 7 zeigt die Kinetiken der Farbänderungen des Aptazym-Golpartikel-Sensors, angezeigt durch das Extinktionsverhältnis zwischen 522 nm und 700 nm in Gegenwart von 5 mM Adenosin. Die Kinetikdaten passen in eine sigmoidale Kurve, was zeigt, dass die Reaktion bis zu einem wesentlichen Umfang innerhalb von 30 Minuten fortgeschritten und nach 60 Minuten beendet ist. Kleine Fehler der Zeitmessung (zum Beispiel unter 1 Minute) während des Messvorgangs sollten nicht zu großen Fehlern bei den beobachteten Partikel-Aggregationen und somit bei den Farbänderungen führen.
Beispiel 4 Sensitivität und Selektivität des Sensors
Als Assay-Zeit wurden 30 Minuten ausgewählt, um die Sensitivität und Selektivität des Sensors zu bestimmen; diese Zeit wurde ausgewählt, um sowohl die Geschwindigkeit als auch die Sensitivität des Sensors auszubalancieren. 8 zeigt die Adenosin-abhängigen Farbänderungen; die Spektren wurden unter Verwendung eines Hewlett-Packard-8453-Spektrophotometers erhalten. Unter diesen Bedingungen ist die Sensitivität des Adenosin-Biosensors 100 μM bis 1 mM. Da der Assay auf einer Kinetik basiert, kann der Detektionsbereich unter Verwendung verschiedener Testzeiten verschoben werden.
Um die Selektivität des Aptazym-Goldpartikel-Sensors zu bestimmen, wurden in dem Assay 5 mM Uridin, Cytosin oder Guanosin verwendet. Unter diesen Bedingun gen wurde lediglich ein Hintergrundsignal beobachtet. Die Farbdifferenz kann bequem durch Spotten der resultierenden Partikel auf TLC-Platten beobachtet werden. In diesem Experiment war eine Farbveränderung von Blau über Purpur bis Rot zu erkennen, was den ansteigenden Adenosin-Konzentrationen entspricht. Jedoch ergeben Tests unter Verwendung von 5 mM Guanosin, Cytidin oder Uridin lediglich eine Blaufärbung, genau wie Assays ohne jegliche Nukleosid-Zugabe.
LITERATURHINWEISE
(Die Referenzen für Tabelle 3B befinden sich weiter unten)

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SEQUENZLISTE

Claims

Sensorsystem zum Detektieren eines Effektors, welcher ein Molekül ist, das, sofern es an ein Enzym gebunden ist, das eine Effektor-Bindungsstelle aufweist, die Katalyse des Enzyms verstärken oder inhibieren kann, umfassend: a) ein Nukleinsäure-Enzym, welches die Spaltung einer Nukleinsäure in der Gegenwart des Effektors katalysiert, umfassend ein Aptamer, welches eine Bindungsstelle für den Effektor umfasst; b) ein Substrat für das Nukleinsäure-Enzym, umfassend ein erstes Polynukleotid; und c) Partikel, die ein zweites Polynukleotid umfassen, welches zumindest teilweise komplementär zum Substrat ist.
Sensorsystem gemäß Anspruch 1, wobei das Nukleinsäure-Enzym DNA ist.
Sensorsystem gemäß Anspruch 1, wobei der Effektor Adenosin ist.
Sensorsystem gemäß Anspruch 1, wobei der Effektor das Nukleinsäure-Enzym aktiviert.
Sensorsystem gemäß Anspruch 1, wobei der Effektor das Nukleinsäure-Enzym inhibiert.
Sensorsystem gemäß Anspruch 1, wobei die Partikel ein Material umfassen, das ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Metall-Kolloiden, Halbleiter-Kolloiden und Polystyrol-Latex-Partikeln.
Sensorsystem gemäß Anspruch 1, wobei der Effektor Anthrax ist, ein aus Anthrax abgeleitetes Molekül, Pocken, ein aus Pocken abgeleitetes Molekül; HIV, und ein aus HIV abgeleitetes Molekül, ein Antibiotikum oder Kokain.
Sensorsystem gemäß Anspruch 1, wobei das Nukleinsäure-Enzym aus der Gruppe ausgewählt wird, bestehend aus: sowohl SEQ ID NO: 5 als auch 6, sowohl SEQ ID NO.: 8 als auch 9, und SEQ ID NO: 1; und wobei das Substrat aus der Gruppe ausgewählt wird, bestehend aus: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 2.
Sensorsystem gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Sensorsystem zusätzlich Mg(II) umfasst.
Sensorsystem gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Partikel Goldpartikel sind.
Sensorsystem gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Partikel (c) Goldpartikel sind; und das System d) Mg(II) umfasst; und das Nukleinsäure-Enzym DNA umfasst.
Sensorsystem gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, weiterhin umfassend e) Pb(II).
Verfahren zum Detektieren eines Effektors, umfassend das Mischen des Sensorsystems gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche mit einer Probe.
Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei das Nukleinsäure-Enzym mit der Probe vor dem Mischen der anderen Bestandteile gemischt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 13, weiterhin umfassend das Erhitzen des Sensorsystems und der Probe auf eine Schmelztemperatur eines Aggregats, welches das erste und zweite Polynukleotid umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 13, weiterhin umfassend die Analyse der Probe auf eine Farbänderung hin.
Verfahren gemäß Anspruch 13, weiterhin umfassend das Analysieren der Probe auf ein Aggregat hin, welches die Partikel umfasst, wobei das Aggregat ein Präzipitat ist.
Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei die Probe eine Körperflüssigkeit umfasst.
Kit zum Detektieren eines Effektors, umfassend das Sensorsystem gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12.
Kit gemäß Anspruch 19, wobei das Substrat, die Partikel und das Nukleinsäure-Enzym in voneinander getrennten Behältnissen oder in einem einzigen Behältnis bereitgestellt werden.
Kit gemäß Anspruch 19, wobei das Substrat, die Partikel und das Nukleinsäure-Enzym als Aggregat bereitgestellt werden.
Kit gemäß Anspruch 19, weiterhin umfassend mindestens eine Lösung, die eine bekannte Konzentration des Effektors aufweist.
Kit gemäß Anspruch 19, weiterhin umfassend eine Farb-Tafel, in welcher die Farben eine Konzentration des Effektors anzeigen.