ES2590263T3 - Composiciones y métodos para el diagnóstico de trastornos renales en un felino - Google Patents

Composiciones y métodos para el diagnóstico de trastornos renales en un felino Download PDF

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Abstract

Un método de diagnóstico de la existencia de un trastorno renal en un felino que comprende medir el nivel de expresión de proteína 2 secretada relacionada con frizzled en una muestra biológica del felino, en donde las diferencias en expresión de la proteína 2 secretada relacionada con frizzled en la muestra con relación a un valor de control para la expresión en una muestra de un animal normal indican la existencia de un trastorno renal.

Description

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DESCRIPCION
Composiciones y metodos para el diagnostico de trastornos renales en un felino Campo de la invencion
La presente invencion se relaciona con composiciones, materiales y metodos para el diagnostico y/o seguimiento de enfermedades renales y trastornos en felinos, incluyendo metodos para: diagnostico de, elaboracion y seguimiento de un plan de tratamiento para, y seguimiento del estado de, un trastorno renal caracterizado por una perdida anormal de funcion renal, insuficiencia renal, medicion de la filtracion glomerular reducida o glomerulonefritis, en un felino, mediante la medicion de expresion de genes seleccionados.
Listado de secuencias
La presente solicitud contiene una lista de secuencias que se ha presentado a traves de EFS-Web y se incorpora en este documento como referencia en su totalidad. Dicha copia ASCII, creada el 30 de marzo de 2010, es nombrada 8888POUS.txt y tiene 7,809 bytes de tamano.
Antecedentes de la invencion
La nefritis es un termino general para la inflamacion del rinon, que puede ser una enfermedad proliferativa o destructiva focal o difusa que implica el glomerulo, tubulo renal o el tejido intersticial del rinon (o conectivo). La nefritis puede progresar a traves de una serie de etapas que terminan en la enfermedad renal terminal o insuficiencia renal terminal. La forma mas comun de la nefritis es la glomerulonefritis.
La glomerulonefritis o nefritis glomerular ("GN") es una afeccion caracterizada por la inflamacion de los glomerulos o bucles capilares del rinon. La afeccion se presenta en forma aguda, subaguda y cronica y puede ser idiopatica o secundaria a una infeccion, enfermedad o exposition a una toxina.
La insuficiencia renal es la incapacidad del rinon para mantener sus funciones normales. Como resultado, los productos de desecho metabolicos y metabolitos se acumulan en la sangre. Estos productos de desecho y los metabolitos pueden afectar negativamente a sistemas mas corporales. Las perturbaciones en el mantenimiento de los equilibrios de fluidos y electrolitos son caracterlsticas de la insuficiencia renal.
La insuficiencia renal aguda puede ocurrir de repente debido a un traumatismo, infeccion, inflamacion o exposicion a sustancias nefrotoxicas. Esta afeccion puede dar lugar a la deshidratacion, hipotension y colapso circulatorio. La insuficiencia renal aguda frecuentemente es segregada en tres categorlas: (1) insuficiencia pre-renal, que se asocia con la disminucion del flujo sangulneo renal; (2) insuficiencia intrarrenal, que se asocia con isquemia y toxinas; y (3) insuficiencia post-renal, que resulta de la obstruction del flujo de orina.
La insuficiencia renal cronica implica una perdida progresiva de la funcion renal que eventualmente puede progresar a enfermedad o insuficiencia renal en fase terminal. Al inicio, la insuficiencia renal cronica comienza ya que la funcion renal disminuye, sin acumulacion apreciable de productos metabolicos de desecho en la sangre. A medida que la tasa de filtracion glomerular disminuye debido a la inflamacion, los productos de desecho comienzan a acumularse. La enfermedad progresa a uremia debido a la funcion renal baja, y altos niveles de productos finales de protelnas comienzan a acumularse y poner en peligro las funciones corporales. Las causas mas comunes de insuficiencia renal cronica incluyen: inflamacion, infeccion, obstruccion del tracto urinario y ciertas enfermedades y toxicidades sistemicas, incluyendo hipercalcemia, lupus eritematoso, diabetes mellitus e hipertension.
Enfermedad renal en fase terminal se caracteriza por insuficiencia renal cronica irreversible. Los niveles de nitrogeno ureico y creatinina en suero sangulneo siguen aumentando y la uremia resultante perjudica todos los sistemas corporales. El rinon puede sufrir la perdida permanente y casi completa de la funcion, del orden de 10% o menos de la funcion renal normal. Una de las causas de la enfermedad renal en fase terminal es glomerulonefritis. Otras causas incluyen los mencionados para la insuficiencia renal cronica.
Los glomerulos son uno de los componentes estructurales de la nefrona del rinon y se componen de pequenos vasos sangulneos descritos con frecuencia como un penacho o racimo capilar. La nefrona es la unidad estructural y funcional basica del rinon, que tambien se compone de una estructura conocida como un malpigio, o capsula de Bowman, al igual que comprende las arteriolas y los tubulos. La capsula de Bowman contiene los bucles de los glomerulos y los tubulos renales. Los glomerulos son capilares muy pequenos, por lo tanto, el flujo de sangre a traves de estos vasos es muy lento y moleculas en la sangre facilmente pueden llegar a ser depositadas en las paredes de estos tubos capilares minusculos. Los tubulos renales se componen de una membrana basal y revestimiento epitelial y sirven para secretar, recoger y conducir la orina.
Los glomerulos funcionan como un filtro dentro de la nefrona. Agua y pequenas moleculas en la sangre fluyen a traves del glomerulo y se filtran a traves de una estructura conocida como la membrana basal, que se forma por el
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glomerulo y la capsula de Bowman. El filtrado que comprende agua y pequenas moleculas pasa a traves del tubulo renal que se absorbe y se reabsorbe antes de ser finalmente convertido en la orina. La membrana basal se compone de poros de diversos tamanos, que sirven para filtrar pequenas moleculas y para impedir el paso a traves de la membrana basal de las moleculas mas grandes. La funcion especlfica de la nefrona es eliminar del plasma ciertos productos finales del metabolismo tales como acido urico, urea y creatinina, as! como exceso de electrolitos, por ejemplo, iones de sodio, cloruro y potasio. Por la reabsorcion de agua y electrolitos, la nefrona juega un papel importante en mantener el equilibrio normal de llquidos en el cuerpo.
La creatinina es un compuesto nitrogenado formado como resultado del metabolismo de la creatina. La creatina, a su vez, es una sustancia no proteica que se sintetiza en el cuerpo a partir de tres aminoacidos, arginina, glicina y metionina. La molecula se encuentra en el musculo en pequenas cantidades y, cuando se combina con fosfato como fosfocreatina, sirve como una forma de almacenamiento de fosfato de alta energla utilizada en diversos procesos metabolicos. La creatinina se absorbe en la sangre y en ultima instancia se excreta en la orina. Por lo tanto, una simple prueba de laboratorio para medir la creatinina en la sangre puede ser utilizada para determinar la funcion renal. La prueba se refiere con frecuencia como una prueba de depuracion de creatinina, que mide la cantidad de creatinina depurada del plasma en un rango de tiempo dado. Debido a que la creatinina se forma a partir de la fosfocreatina en cantidades relativamente constantes, un aumento en los niveles de creatinina en la sangre es indicativo de un mal funcionamiento del rinon, esto es, perdida de la funcion renal.
La glomerulonefritis puede surgir como resultado de un insulto biologico con el sistema inmunologico. Las sustancias extranas pueden adherirse a la membrana basal y causar una respuesta inmune que resulta en la produccion de anticuerpos. Estos anticuerpos pueden combinar con las sustancias extranas para causar complejos inmunes que se depositan en las paredes de los pequenos capilares glomerulares, lo que resulta en danos a la nefrona. Alternativamente, en algunos individuos el sistema inmune puede crear autoanticuerpos que son inmunoglobulinas que pueden atacar las celulas del rinon que resulta en una denominada respuesta autoinmune. Si se alteran las protelnas en el cuerpo, una respuesta de autoanticuerpos puede sobrevenir debido a que los autoanticuerpos reconocen las protelnas alteradas como no propio. Estos complejos de autoanticuerpo-protelna pueden igualmente ser depositados sobre la membrana basal del glomerulo causando una interrupcion del funcionamiento de la nefrona.
La glomerulonefritis es una causa comun de proteinuria en los felinos y puede ser o bien la forma idiopatica o secundaria de la afeccion. En la ultima situation, la afeccion se puede desarrollar enfermedades inflamatorias, secundarias a neoplasia, disfunciones endocrinas, infecciones o nefropatlas familiares. Al igual que en los seres humanos, la glomerulonefritis en felinos es a menudo mediada inmunologicamente, con la participation de inmunoglobulinas y factores de complemento en el cuerpo del animal. La lesion se produce dentro de los glomerulos del rinon que resulta en cambios morfologicos en los glomerulos. Eventualmente, la lesion es irreversible y da lugar a un mal funcionamiento de las nefronas.
La glomerulonefritis se caracteriza en la literatura cientlfica en un numero de formas diferentes en funcion de los cambios histopatologicos que tienen lugar. La glomerulonefritis membranosa implica el engrosamiento de la membrana basal glomerular. La glomerulonefritis proliferativa o mesangioproliferativa se caracteriza por la proliferation de celulas en la matriz mesangial. La glomerulonefritis membranoproliferativa implica una combination de los cambios anteriores. La glomeruloesclerosis se caracteriza por el aumento de formation de la matriz y cicatrization. En algunos casos hay cambios mlnimos en los glomerulos, y solo un ligero aumento en la proliferacion de celulas mesangiales.
Un numero de metodos han sido desarrollados para el estudio de la expresion diferencial de genes, por ejemplo, micromatrices de ADN, secuenciacion de etiqueta expresada (EST), analisis en serie de la expresion de genes (SAGE), hibridacion sustractiva, donation sustractiva y visualization diferencial (DD) de ARNm, PCR cebada arbitrariamente del ARN (RAP-PCR), PCR en tiempo real (RT-PCR), analisis de la diferencia representacional (RDA), electroforesis en gel bidimensional, espectrometrla de masas, y micromatriz de protelna basada en union de anticuerpos para las protelnas.
Debido a la complejidad de las rutas biologicas implicadas en la enfermedad renal y las interacciones moleculares inherentes y procesos de senalizacion intercelular, es muy deseable para entender a un nivel genetico las interacciones que se estan produciendo. La deteccion de genes desregulados en la fase inicial de perdida de la funcion renal en felinos es util en la comprension de la biologla de la enfermedad renal, especialmente glomerulonefritis sobre una base genomica. El hecho de que la desregulacion del gen se puede detectar en una fase inicial de desarrollo de la enfermedad en animales sometidos a lesion isquemica repetida es util en el diseno de metodos para el diagnostico de, y elaboration y seguimiento de un plan de tratamiento para, una perdida anormal de la funcion renal, insuficiencia renal, medicion de la filtration glomerular reducida o glomerulonefritis, en un felino.
Una comprension mas detallada de las rutas biologicas que participan a traves de perfiles de expresion de genes ayudara en el desarrollo de procedimientos de diagnostico, reactivos y kits de prueba, as! como farmaceutica saludable, intervenciones nutraceuticos y nutricionales (dieteticos) en las rutas de la enfermedad. Estos enfoques pueden permitir la detection temprana y potencialmente previenen o tratan la enfermedad renal subyacente,
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particularmente glomerulonefritis, as! como en el seguimiento del pronostico de la insuficiencia renal en fase inicial y glomerulonefritis, especialmente en felinos. Los genes desregulados implicados en la patologla de estos trastornos pueden servir como biomarcadores importantes para el diagnostico y, potencialmente, la prevencion o el tratamiento del trastorno y para optimizar la seleccion de las intervenciones nutricionales (dieteticas), farmaceuticas, y nutraceuticos apropiados.
El nivel de la expresion de genes y/o la determinacion del nivel de funcionamiento de un producto genico expresado en un felino se puede utilizar para seleccionar un agente apropiado para uso terapeutico o profilactico. Estos datos pueden ser empleados por el experto en la seleccion de farmacos apropiados como agentes para la prevencion o tratamiento de enfermedades renales en felinos a traves de perfiles de expresion de genes. Los datos de expresion de genes y el analisis tambien se pueden utilizar para seleccionar composiciones nutricionales, suplementos dieteticos, nutraceuticos y que tienen un efecto saludable sobre el rendimiento de rinon mediante la utilizacion de biomarcadores indicativos de un estado saludable de la funcion renal.
Solo el trabajo muy limitado que se ha hecho hasta la fecha en la deteccion del genoma de felino para perfiles de expresion de genes en relacion con el diagnostico de enfermedades en los felinos. No se han llevado a cabo ampliamente estudios realizados en poblaciones sanas de felinos frente a las poblaciones que tienen una enfermedad tal como enfermedad renal y perdida de la funcion renal como se describe en esta descripcion. Se dispone de pocos datos con respecto al perfil de expresion del genoma felino, especialmente con respecto al desarrollo de enfermedades renales en los felinos con el tiempo.
La insuficiencia renal es una causa principal de muerte en los felinos. Para tratar eficazmente la enfermedad renal, es importante abordar el problema a tiempo, antes de que el rinon este seriamente danado. En el momento que el sujeto esta mostrando signos de insuficiencia renal, el dano puede ser irreversible. Esto presenta un desaflo, ya que la enfermedad renal en su fase inicial puede no tener slntomas manifiestos. De acuerdo con lo anterior, existe una necesidad de mejores metodos para identificar a los animales en la fase inicial de la enfermedad renal, de modo que puedan ser tratados apropiadamente, por ejemplo, dandoles dietas apropiadas en el caso de afecciones idiopaticas, y/o el tratamiento de afecciones tales como infeccion o enfermedad autoinmune que puede estar contribuyendo al problema con el fin de ayudar a revertir o al menos retrasar e inhibir la progresion de la afeccion.
Antecedentes de la tecnica
Van Hoek et al, 2008, (Journal of Veterinary Internal Medicine, Vol. 23, No. 5, paginas 1031-1037) describe un inmunoensayo de la protelna de union de la retina urinaria como marcador putativo renal en gatos.
Polzin et al, 2000, (Journal of Felino Medicine and Surgery, Vol. 2, paginas 75-82) describe el manejo dietetico de la insuficiencia renal cronica felina.
Yamamura et al, 2010, (Molecular Cancer Therapeutics, Vol. 9, No. 6, paginas 1680-1687) describe las funciones oncogenicas de la protelna 2 secretada relacionada con frizzled en el cancer renal humano.
Esteve and Bovolenta, 2010, (The Tohoku Journal of Experimental Medicine, Vol. 221, No. 1, paginas 11-17) describe las ventajas y desventajas de expresion de Sfrp1 y Sfrp 2 en eventos patologicos.
Resumen de la invencion
En un aspecto, la presente invencion provee un metodo para diagnosticar la existencia de un trastorno renal en un felino que comprende medir el nivel de expresion de protelna 2 secretada relacionada con frizzled en una muestra biologica del felino, en donde las diferencias de expresion de protelna 2 secretada relacionada con frizzled en la muestra con relacion a un valor de control para la expresion en una muestra de un animal normal indican la existencia de un trastorno renal.
En un segundo aspecto, la presente invencion provee un uso de un kit en el metodo definido en este documento para el diagnostico de la existencia de un trastorno renal en un felino, en donde el kit comprende medios para medir la expresion de genes de la protelna 2 secretada relacionada con frizzled en una muestra biologica de un felino; e instrucciones para usar tales medios para medir la expresion de los uno o mas biomarcadores en una muestra biologica del felino y para diagnosticar la existencia de un trastorno renal en el felino.
En un tercer aspecto, la presente invencion provee un uso de una secuencia de nucleotidos correspondiente o complementaria a un gen de la protelna 2 secretada relacionada con frizzled de felino; opcionalmente en donde la secuencia de nucleotidos corresponde a o es complementaria a SEQ ID NO: 1; o de un anticuerpo para protelna 2 secretada relacionada con frizzled de felino; en un metodo como se define en este documento.
La presente descripcion provee ademas composiciones y metodos para: diagnostico de, elaboration y seguimiento de un plan de tratamiento para, y el seguimiento del estado de un trastorno renal que se caracteriza por una perdida anormal de funcion renal, insuficiencia renal, medicion de la filtration glomerular reducida o glomerulonefritis, en un
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felino, en donde el trastorno renal es detectable mediante la utilization de al menos un biomarcador relevante aislado y medido a partir de una muestra de ensayo biologica tomada de tal felino, en donde la expresion del biomarcador se correlaciona positiva o negativamente con la enfermedad. Un biomarcador relevante para la practica de las composiciones y metodos de la presente invention comprende un polinucleotido o protelna presente en dicha muestra de prueba biologica de tal felino. Una muestra de prueba biologica para la practica del metodo de la invencion puede comprender, por ejemplo, una muestra de tejido de un rinon de tal felino. Se seleccionaron los biomarcadores tambien sobre la base de ser secretados, por lo que se pueden detectar en el suero sangulneo o plasma, o en orina. De acuerdo con lo anterior, la muestra de prueba biologica tambien puede ser una muestra de un fluido biologico tomada de tal felino, por ejemplo sangre u orina.
La invencion se basa, en parte, en el descubrimiento de que determinados perfiles de expresion de genes en los felinos se correlacionan con un cambio en dicho animal de un proceso biologico normal a un anormal en el rinon que puede conducir a una disminucion de la funcion renal con el tiempo. Una correlation de un perfil de expresion de genes particular, con una disminucion de la funcion renal se puede predecir, detectar y diagnosticar en un felino sin hacer un diagnostico cllnico convencional basado en signos y slntomas cllnicos reconocidos en la tecnica de la enfermedad renal. Un perfil de expresion de genes alterado en un felino es, por lo tanto, un factor de prediction de una disminucion de la funcion renal, como de otro modo podrlan ser diagnosticados en un momento posterior por medio de mediciones reconocidas en la tecnica de la funcion renal. Tales mediciones reconocidas en la tecnica de la funcion renal por lo general pueden incluir, por ejemplo, una de las siguientes medidas: medicion de la filtration glomerular, medicion de depuration de creatinina, niveles de protelna en orina, niveles de creatinina en suero, niveles de creatinina en orina, niveles de nitrogeno ureico en sangre (BUN), marcacion metabolica con radioisotopos, obtencion de imagenes de los tejidos blandos, incluyendo ecografla, exploration de resonancia magnetica y/o tomografla computarizada. Los ensayos no invasivos, tales como creatinina serica y niveles de BUN por lo general muestran poca correlacion con la histopatologla del rinon y en general no serlan un factor de prediccion de los cambios futuros en el rinon.
La presente description provee, por ejemplo, metodos de medicion de la existencia de un trastorno renal caracterizado por una perdida anormal de la funcion renal, insuficiencia renal, medicion de la filtracion glomerular reducida o glomerulonefritis, implican la evaluation del nivel o actividad de la expresion de genes de al menos un gen de felino homologo o el producto de la traduction de dicho gen seleccionado del grupo que consiste en: protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2); protelna 5 de union al retinol (rbp5); lumican (LUM); decorina (DCN); cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12 (COL3A1); y metaloproteinasa de la matriz-2, -7 y -19 (MMP2, MMP7 y MMP19). En la presente invencion, el biomarcador es la protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2).
La invencion provee, por ejemplo, metodos de medicion de la existencia de un trastorno renal caracterizado por una perdida anormal de insuficiencia renal, medicion de la filtracion glomerular reducida o glomerulonefritis, implican la evaluacion del nivel o actividad de la expresion de genes de al menos un gen felino homologo o el producto de la traduccion de dicho gen seleccionado del grupo que consiste en: protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2) y protelna 5 de union al retinol (rbp5); y, opcionalmente, un segundo grupo de al menos un gen felino homologo o el producto de traduccion de tal gen seleccionado del grupo que consiste en: lumican (LUM); decorina (DCN); cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12 (COL3A1); y metaloproteinasa de la matriz-2, -7 y -19 (MMP2, MMP7 y MMP19). En la presente invencion, el biomarcador es la protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2). En una realization, la presente invencion abarca uno o mas genes o segmentos de genes ("genes" como se define en este documento) que son expresados diferencialmente en los animales anormales en comparacion con los animales normales. La invencion se basa en el descubrimiento de polinucleotidos que son expresados diferencialmente en los animales anormales en comparacion con los animales normales. Los genes fueron identificados mediante la comparacion de la expresion de genes en muestras de tejido tomadas de animales diagnosticados como anormales con genes en muestras de tejido de animales diagnosticados como normales, utilizando tecnologla de Affymetrix GeneChip®.
Los polinucleotidos y genes se identifican mediante la medicion de las diferencias en expresion de genes de muestras de tejidos tomadas de felinos diagnosticados como anormales y que tiene un trastorno renal con la expresion de genes en muestras de tejido de los felinos diagnosticados como normal. Los cambios en la expresion de genes se pueden determinar por cualquier metodo conocido por los expertos. Generalmente, los cambios en la expresion de genes se determinan mediante la medicion de la transcription (determinando la cantidad de ARNm producido por un gen) o la medicion de la traduccion (determinando la cantidad de protelna producida por un gen). La cantidad de ARN o protelna producida por un gen se puede determinar utilizando cualquier metodo conocido para los expertos para la cuantificacion de polinucleotidos y protelnas.
En general, la expresion de ARNm se determina utilizando la reaction en cadena de la polimerasa (PCR) (incluyendo, sin limitation, PCR con transcripcion inversa (RT-PCR) y PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR)) matrices de oligonucleotidos cortos o largos, matrices de ADNc, secuenciacion EST, transferencia de Northern, SAGE, MPSS, MS, matrices de perlas y otros metodos de hibridacion. Por lo general, el ARN es medido en forma de ARNm o ARNm transcrito inverso.
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La expresion de protelna o polipeptido se determina utilizando diversos ensayos y metodos colorimetricos y espectroscopicas tales como transferencias Western cuantitativas, ELISA, geles 2D, cromatografla de gases o llquidos, espectrometrla de masas, el ensayo de Lowry, el ensayo de Biuret, ensayos de fluorescencia, metodos turbidimetricos, el ensayo bicinconinico, tecnologla de chips de protelnas, absorbancia infrarroja, ninhidrina, el ensayo de Bradford, y la absorbancia ultravioleta.
Los chips de genes permiten un estudio a gran escala de los procesos biologicos y la medicion de la actividad dentro de una celula en un cierto momento. El analisis de micromatrices permite contar las diferencias en los fenotipos sobre una base genetica a gran escala. La medicion real de los productos de expresion de genes es un indicador mas preciso de la funcion del gen que la determinacion de secuencias per se. El analisis de micromatrices se basa en la cuantificacion de la concentracion de transcrito de ARNm del gen en una celula en un momento dado. El AND se inmoviliza sobre un medio y el ARNm diana marcado se hibrida con sondas en la matriz. La union del ARNm marcado de las sondas se mide por analisis de laser. La medicion es un conteo de protones emitidos. El chip entero es escaneado y se obtiene la imagen digital. La imagen se procesa para localizar las sondas y para asignar mediciones de intensidad para cada sonda. De esta manera se pueden determinar los genes de expresion inducida o inhibida. El analisis permite al experto encontrar grupos de genes con similares perfiles de expresion y para determinar los tejidos con los perfiles de expresion similares. De esta manera, los genes que explican las diferencias observadas en las muestras de tejido pueden ser identificados.
Los chips de genes Affymetrix por lo general emplean sondas de 25bp y conjuntos de sondas de 11 a 20 sondas correspondientes a un gen particular o EST. El chip se construye con una sonda de apareamiento erroneo y apareamiento perfecto de 25bp cada una, siendo el primero perfectamente complementario a una region especlfica de un gen y el ultimo que tiene el 13° bp sustituido para hacer un apareamiento erroneo. Un algoritmo de resumen de la sonda se utiliza para determinar la correccion de fondo, normalizacion y resumen de la sonda, que es la conversion de los valores de la sonda a los valores de expresion de la sonda. RMA es uno de los algoritmos que se pueden utilizar para este proposito. El algoritmo lleva a cabo las dos ultimas etapas de analisis, normalizacion y resumen de las mediciones de intensidad de la sonda de nivel. Los valores de apareamiento perfecto, por lo tanto, son la correccion de fondo, normalizado y se resumen en un conjunto de mediciones de expresion.
Los datos en bruto se analizaron utilizando el software GeneSpring version 7.0 (GS) (Agilent Corporation) y validados utilizando el software de distribucion libre (RB) R-Bioconductor. Ambos paquetes de software se utilizan para calcular intensidades de la sonda de los archivos CEL generados por el instrumento de Affymetrix. Las llamadas Presente/Ausente/Marginal por sonda y los valores de P se calcularon utilizando el R-Bioconductor y el software GeneSpring por separado.
En general, la expresion diferencial de genes en animales anormales en comparacion con los animales normales se determina midiendo la expresion de al menos un gen. Preferiblemente, la expresion de dos o mas genes expresados diferencialmente se mide para proporcionar un patron de expresion de genes o perfil de la expresion de genes. Mas preferiblemente, la expresion de una pluralidad de genes expresados diferencialmente se mide para proporcionar information adicional para un patron o perfil de expresion de genes mas significativo.
La presente description provee una pluralidad de marcadores que juntos o por separado son o pueden ser utilizados como marcadores de la enfermedad renal. En aspectos especialmente utiles de la invention, una pluralidad de estos marcadores se puede seleccionar y su expresion de ARNm se puede medir simultaneamente para proporcionar perfiles de expresion para su uso en varios aspectos de la invencion descrita en esta solicitud. En un aspecto preferido de los presentes metodos y composiciones, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 marcadores se seleccionan del grupo que consiste en: protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID NO. 9); protelna 5 de union al retinol (rbp5) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No.: 10); lumican (LUM) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No.: 11); decorina (DCN) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No.: 12); cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12 (COL3A1) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No.: 13); metaloproteinasa de la matriz-2 (MMP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No.: 14); metaloproteinasa de la matriz-7 (MMP7, PUMP-1) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No.: 15); y metaloproteinasa de la matriz-19 (MMP19) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No.: 16) y se pueden utilizar para la determinacion de perfiles de expresion de genes empleados en la practica de los metodos descritos en este documento. Cada marcador puede ser particularmente unida a ciertos aspectos de la enfermedad renal. En la presente invencion, el biomarcador es la protelna 2 secretada relacionada con Frizzled (SFRP2).
La presente descripcion provee una pluralidad de marcadores que juntos o por separado son o pueden ser utilizados como marcadores de la enfermedad renal. En otro aspecto especialmente util de la descripcion, una pluralidad de estos marcadores se puede seleccionar y su expresion de ARNm se puede medir simultaneamente para proporcionar perfiles de expresion para su uso en diversos aspectos de los metodos descritos en esta solicitud. En un aspecto preferido de los presentes metodos y composiciones, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 marcadores se seleccionan del grupo que consiste en: protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID NO. 9) y protelna 5 de union al retinol (rbp5) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No.: 10); y, opcionalmente, un segundo grupo de al menos un polinucleotido
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seleccionado del grupo que consiste en: lumican (LUM) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No.: 11); decorina (DCN) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No.: 12); cadena del colageno alfa 1 (III), variante l2 (COL3A1) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No.: 13); metaloproteinasa de la matriz-2 (MMP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No.: 14); metaloproteinasa de la matriz -7 (MMP7, PUMP-1) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No.:
15) ; y metaloproteinasa de la matriz-19 (MMP 19) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No.:
16) y se pueden utilizar para la determination de perfiles de expresion de genes empleados en la practica de los metodos descritos en este documento. Cada marcador puede estar unido particularmente a ciertos aspectos de enfermedad renal. En la presente invention, el biomarcador es la protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2).
En otro aspecto, la description provee un dispositivo apropiado para detectar la expresion de una pluralidad de genes expresados diferencialmente en los felinos anormales en comparacion con los felinos normales. El dispositivo comprende un sustrato que tiene una pluralidad de las sondas de oligonucleotidos o polinucleotidos de la presente invencion fijado al sustrato en posiciones conocidas. El dispositivo es esencialmente una version inmovilizada de las sondas de oligonucleotidos o polinucleotidos descritos en este documento. El dispositivo es util para la detection rapida y especlfica de los genes y polinucleotidos y sus patrones y perfiles de expresion. Por lo general, tales sondas estan unidas a un sustrato o soporte solido similar y una muestra que contiene uno o mas polinucleotidos (por ejemplo, un gen, un producto de PCR, un producto de reaction en cadena de la ligasa (LCR), una secuencia de ADN que ha sido sintetizada utilizando tecnicas de amplification, o una mezcla de los mismos) se expone a las sondas de tal manera que el(los) polinucleotido(s) de la muestra puede hibridar con las sondas. Las sondas, el(los) polinucleotido(s) de la muestra, o ambos, se marcan, por lo general con un fluoroforo u otra etiqueta tal como estreptavidina, y detectado utilizando metodos conocidos para los expertos. Si el(los) polinucleotido(s) de la muestra esta(n) marcado(s), la hibridacion se puede detectar mediante la deteccion de la fluorescencia unida. Si las sondas se marcan, la hibridacion se detecta por lo general por inactivation de la etiqueta. Si tanto la sonda como el(los) polinucleotido(s) de la muestra se marcan, la hibridacion se detecta normalmente mediante el seguimiento de un cambio de color resultante de la proximidad de las dos etiquetas unidas. Una variedad de estrategias de etiquetado y etiquetas, se conoce para los expertos, en particular para las etiquetas fluorescentes. Preferiblemente, las sondas se inmovilizan en sustratos apropiados para la formation de una matriz (conocida por varios nombres, incluyendo micromatriz de ADN, chips de genes, biochip, chip de ADN, y matriz de genes) comparable a los conocidos en la tecnica.
Los metodos para determinar la cantidad o concentration de la protelna en una muestra son conocidos para los expertos. Tales metodos incluyen radioinmunoensayos, ensayos de union competitiva, analisis de transferencia Western, y ensayos ELISA. Para los metodos que utilizan anticuerpos, los anticuerpos policlonales y monoclonales son apropiados. Tales anticuerpos pueden ser inmunologicamente especlficos para una protelna, epltopo de protelna, o fragmento de protelna.
Algunas realizaciones de la invencion utilizan anticuerpos para la deteccion y cuantificacion de protelnas producidas mediante la expresion de los polinucleotidos de la presente invencion. Aunque las protelnas se pueden detectar mediante inmunoprecipitacion, separation por afinidad, analisis de transferencia Western, matrices de protelnas, y similares, un metodo preferido utiliza la tecnologla de ELISA en donde el anticuerpo se inmoviliza sobre un soporte solido y una protelna diana o peptido se expone al anticuerpo inmovilizado. Ya sea la sonda, o la diana, o ambas, se pueden marcar utilizando metodos conocidos.
En un aspecto adicional, la descripcion provee un metodo para la deteccion de la expresion diferencial de uno o mas genes expresados diferencialmente en los felinos anormales en comparacion con los felinos normales en una muestra. El metodo comprende (a) hibridacion de una combination que comprende una pluralidad de sondas de polinucleotidos que son expresadas diferencialmente en los felinos anormal en comparacion con los felinos normales con los polinucleotidos de la muestra para formar uno o mas complejos de hibridacion; (b) opcionalmente, la hibridacion de una combinacion que comprende una pluralidad de sondas de polinucleotidos que son expresados diferencialmente en los felinos anormales en comparacion con los felinos normales con polinucleotidos en un estandar para formar uno o mas complejos de hibridacion; (c) detectar los complejos de hibridacion de la muestra y, opcionalmente, el estandar de la etapa (b); y (d) comparar los complejos de hibridacion de la muestra con los complejos de hibridacion a partir de un estandar, en donde una diferencia en la cantidad de complejos de hibridacion entre el estandar y la muestra indica la expresion diferencial de genes expresados diferencialmente en los animales anormales en comparacion con los animales normales en la muestra .
La etapa (b) y parte de la etapa (c) son opcionales y se utilizan si se va a realizar una comparacion relativamente simultanea de dos o mas sistemas de prueba. Sin embargo, en una realization preferida, el estandar utilizado para la comparacion se basa en los datos obtenidos previamente utilizando el metodo.
Estas sondas se exponen a una muestra para formar complejos de hibridacion que se detectan y se comparan con los de un estandar. Las diferencias entre los complejos de hibridacion de la muestra y el estandar indican la expresion diferencial de polinucleotidos y por lo tanto los genes expresados diferencialmente en felinos anormales en comparacion con los felinos normales en la muestra. En un aspecto preferido, se hacen sondas para detectar
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especlficamente polinucleotidos o fragmentos de los mismos producidos por uno o mas de los genes o fragmentos de genes identificados por la presente invention. Los metodos para detectar complejos de hibridacion son conocidos para los expertos.
En otro aspecto, la description provee un metodo para la detection de la expresion diferencial de genes expresados diferencialmente en los felinos anormales en comparacion con los felinos normales en una muestra. El metodo comprende (a) hacer reaccionar una combination que comprende una pluralidad de sondas de polipeptidos con protelnas en la muestra en afecciones que permiten que se produzca la union especlfica entre las sondas y las protelnas, en donde las protelnas unidas por las sondas se expresan diferencialmente en un felino anormal en comparacion con un felino normal; (b) opcionalmente, hacer reaccionar una combinacion que comprende una pluralidad de sondas de polipeptidos con protelnas en un estandar en afecciones que permiten que se produzca la union especlfica entre las sondas y las protelnas, en donde las protelnas unidas por las sondas se expresan diferencialmente en un felino anormal en comparacion con un felino normal; (c) detectar la union especlfica en la muestra y, opcionalmente, el estandar de la etapa (b); y (d) comparar la union especlfica en la muestra con la de un estandar, en donde las diferencias entre la union especlfica en el estandar y la muestra indican la expresion diferencial de genes expresados diferencialmente en los felinos anormales en comparacion con los felinos normales en la muestra.
Estas sondas se exponen a una muestra para formar la union especlfica que se detecta y se compararon con las de un estandar. Las diferencias entre la union especlfica de la muestra y el estandar indican expresion diferencial de las protelnas y por lo tanto los genes expresados diferencialmente en los felinos anormales en comparacion con los felinos normales, particularmente genes asociados con anormalidad, en la muestra. En un aspecto preferido, se hacen sondas para detectar especlficamente protelnas o fragmentos de los mismos producidos por uno o mas de los genes o fragmentos de genes identificados por la presente invencion.
En una realization, el metodo comprende ademas la exposition del felino o muestra a una sustancia de ensayo antes de la reaction de los polipeptidos con las protelnas. A continuation, la comparacion es indicativa de si la sustancia de prueba altero la expresion de genes expresados diferencialmente en los felinos anormales en comparacion con los felinos normales, particularmente genes asociados con anormalidad, en la muestra.
Los animales diagnosticados por metodos de la presente invencion como que tienen un trastorno renal, por ejemplo, tal como la glomerulonefritis, se colocan preferiblemente en una dieta de protection renal. Las dietas de protection del rinon incluyen, por ejemplo, las dietas como se describen anteriormente y en WO 2006/119049 A2, WO 2006/071952, y los contenidos de las cuales se incorporan en este documento por referencia.
La descripcion provee de este modo, un metodo (Metodo 1) de diagnostico de la existencia de un trastorno renal en un felino que comprende medir el nivel de expresion del uno o mas biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en lumican (LUM); cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12 (COL3A1); decorina (DCN); protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2); protelna 5 de union al retinol (rbp5); MMP-2; MMP-7; y MMP-19, en una muestra biologica del felino, en donde diferencias en la expresion del uno o mas biomarcadores en la muestra respecto a un valor de control para la expresion en una muestra de un animal normal indican la existencia de un trastorno renal. En la presente invencion, el biomarcador es la protelna 2 secretada relacionada con Frizzled (SFRP2). A modo de ejemplo, se pueden utilizar cualquiera de los siguientes metodos:
1.1. Metodo 1, en donde se determina el nivel de expresion del uno o mas biomarcadores, mediante la medicion de la expresion de genes del uno o mas biomarcadores utilizando ya sea (i) una micromatriz de ADN que comprende uno o mas oligonucleotidos complementarios a ARNm o ADNc correspondiente a los uno o mas biomarcadores que se van a medir, o (ii) una reaccion en cadena de la polimerasa cuantitativa con cebadores de oligonucleotidos para ARNm o ADNc correspondientes a los uno o mas biomarcadores que se van a medir, por ejemplo,
a. El metodo precedente en donde la etapa de medicion de la expresion de genes del uno o mas biomarcadores comprende (i) aislar el ARN de la muestra de tejido, (ii) transcription inversa del ARN para obtener el ADNc correspondiente, (iii) aislar y fragmentar el ADNc as! obtenido, (iv) poner en contacto los fragmentos de ADNc con una micromatriz de ADN que comprende uno o mas oligonucleotidos complementarios a ADNc correspondientes a los uno o mas biomarcadores que se van a medir, y (v) detectar la hibridacion entre los fragmentos de ADNc y el uno o mas oligonucleotidos en la micromatriz de ADN .
b. El metodo precedente en donde los oligonucleotidos en la micromatriz de ADN comprenden una o mas sondas capaces de hibridarse con una o mas de SEQ ID NOS. 9-16.
c. El metodo precedente en donde los oligonucleotidos en la micromatriz de ADN comprenden una o mas sondas que comprenden secuencias seleccionadas de una o mas de SEQ ID NOS. 1-8.
d. Cualquiera de los metodos precedentes que implican la deteccion de hibridacion en donde la hibridacion entre los fragmentos de ADNc y el uno o mas oligonucleotidos en la micromatriz de ADN es en condiciones rigurosas.
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1.2. Metodo 1, en donde el nivel de expresion del biomarcador se detecta por un anticuerpo para la protelna expresada.
a. Metodo 1.2 en donde el biomarcador se detecta mediante un inmunoensayo seleccionado de un ensayo de union competitiva, un ensayo de union no competitiva, un radioinmunoensayo, un ensayo inmunoabsorbente con enzima ligada (ELISA), un ensayo de tipo sandwich, una reaccion de precipitina, un ensayo de inmunodifusion de difusion en gel, un ensayo de aglutinacion, un inmunoensayo fluorescente, inmunoensayo de quimioluminiscencia, inmunoensayo immunoPCR, un inmunoensayo de protelna A o protelna G y un ensayo de inmunoelectroforesis.
b. El metodo precedente que es un ensayo inmunoabsorbente con enzima ligada (ELISA).
c. Metodo 1.2, en donde el ensayo es un ensayo inmunocromatografico de flujo lateral.
d. Metodo 1.2, en donde la muestra biologica es sangre u orina.
1.3. Metodo 1, en donde el nivel de expresion del biomarcador se detecta por medicion de espectroscopia cuantitativa masa de la protelna expresada en la muestra biologica, por ejemplo, en donde la muestra biologica es sangre u orina.
1.4. Metodo 1, en donde el nivel de expresion del biomarcador se detecta por un aptamero que reconoce la protelna expresada.
a. Metodo 1.4, en donde el aptamero es un oligonucleotido.
b. Metodo 1.4, en donde el aptamero es un peptido.
c. Metodo 1.4, en donde la muestra biologica es sangre u orina.
1.5. Cualquiera de los metodos precedentes, en donde el nivel de expresion del uno o mas muestra biologica con relacion a un valor de control para la expresion en la muestra normal es por ejemplo, mayor de cinco veces, o menos de un medio.
1.6. Cualquiera de los metodos precedentes, en donde el nivel de expresion del uno o mas muestra biologicas es al menos una desviacion estandar mas alta o mas baja que la media de expresion de los biomarcadores en una muestra normal.
1.7. Cualquiera de los metodos precedentes, en donde el nivel de expresion del uno o mas biomarcadores en las muestras biologicas se normaliza respecto a la expresion de uno o mas genes conocidos por tener expresion relativamente constante.
1.8. Cualquiera de los metodos precedentes, en donde la muestra biologica es una muestra de tejido renal.
1.9. Cualquiera de los metodos precedentes, en donde la muestra biologica es sangre.
1.10. Cualquiera de los metodos precedentes, que comprende la deteccion de niveles de expresion de protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2) y/o protelna 5 de union al retinol (rbp5).
1.11. Cualquiera de los metodos precedentes, que comprende la deteccion de niveles de expresion de protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2) y/o protelna 5 de union al retinol (rbp5) y, opcionalmente, niveles de expresion de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en: lumican (LUM); decorina (DCN); cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12 (COL3A1)); metaloproteinasa de la matriz-2 (MMP2); metaloproteinasa de la matriz- 7 (MMP7); y metaloproteinasa de la matriz-19 (MMP19).
1.12. Cualquiera de los metodos precedentes, en donde el trastorno renal esta en una fase inicial, por ejemplo, en donde el felino tiene la funcion renal esencialmente normal, por ejemplo, segun se mide por una o mas de las siguientes: medicion de la filtracion glomerular normal, medicion de depuracion de creatinina, niveles de protelna en orina, niveles de creatinina en suero, niveles de creatinina urinaria, niveles de nitrogeno ureico en sangre (BUN), marcacion metabolica con radioisotopos, obtencion de imagenes de tejidos blandos, incluyendo ecografla, exploracion de resonancia magnetica y/o tomografla computarizada.
1.13. Cualquiera de los metodos precedentes, en donde el trastorno renal es un trastorno caracterizado por una perdida anormal de la funcion renal, insuficiencia renal, medicion de la filtracion glomerular reducida o glomerulonefritis.
1.14. Cualquiera de los metodos precedentes, en donde el trastorno renal es glomerulonefritis.
biomarcadores en la mayor de dos veces,
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1.15. Cualquiera de los metodos precedentes, en donde el trastorno renal esta indicado por una diferencia significativa en la expresion de uno o mas de los siguientes en relacion con los valores de expresion control (por ejemplo, en donde una "diferencia significativa" en el caso de aumento de la expresion es un incremento de al menos dos veces, y en el caso de disminucion de expresion es una disminucion de al menos 50%):
Incremento de la expresion de lumican;
Incremento de la expresion de la cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12;
Incremento de la expresion de la decorina;
Incremento de la expresion de la protelna 2 secretada relacionada con frizzled;
Reduccion de la expresion de la protelna 5 de union al retinol reducida;
Incremento de la expresion de MMP-2;
Incremento de la expresion de MMP-7; y/o Incremento de la expresion de MMP-19.
En una realizacion adicional, la invencion provee un metodo (metodo 2) de tratamiento, mejora, o retraso de la progresion de un trastorno renal en un felino en necesidad del mismo, que comprende el diagnostico de la existencia de un trastorno renal por ejemplo, utilizando el metodo 1, y siguientes, y el manejo de la afeccion, por ejemplo, por una dieta y/o medicacion. Por ejemplo, la invencion provee:
2.1. Metodo 2 que comprende proporcionar una dieta de proteccion renal como sustancialmente la dieta unica para un felino que tiene un trastorno renal como diagnosticado o diagnosticable por el metodo de cualquiera de los metodos 1, y siguientes.
2.2. Metodo 2 o 2.1, en donde el felino tiene la funcion renal esencialmente normal, por ejemplo, tal como se mide mediante uno o mas de los siguientes: medicion de la filtracion glomerular normal, medicion de depuracion de creatinina, niveles de protelna en orina, niveles de creatinina en suero, niveles de creatinina urinaria, niveles de nitrogeno ureico en sangre (BUN), marcacion metabolica con radioisotopos, obtencion de imagenes de tejidos blandos, incluyendo ecografla, exploracion de resonancia magnetica y/o tomografla computarizada.
2.3. Cualquiera de los metodos precedentes, en donde el felino tiene al menos cinco anos.
2.4. Cualquiera de los metodos precedentes, en donde el trastorno es un trastorno caracterizado por una perdida anormal de la funcion renal, insuficiencia renal, medicion de la filtracion glomerular reducida o glomerulonefritis.
2.5. Cualquiera de los metodos precedentes, en donde el trastorno renal es glomerulonefritis.
2.6. Cualquiera de los metodos precedentes, en donde el felino se ha identificado con la enfermedad renal.
2.7. Cualquiera de los metodos precedentes, en donde el felino se mantiene en la dieta de proteccion renal durante un periodo de al menos aproximadamente 6 meses.
2.8. Cualquiera de los metodos precedentes, en donde el felino se mantiene en la dieta de proteccion renal durante un perlodo que se inicia despues de la aparicion o el diagnostico inicial de la enfermedad renal y continuando durante sustancialmente el resto de la vida del felino.
2.9. Cualquiera de los metodos precedentes, en donde la dieta de proteccion renal comprende uno o mas de los siguientes: modificaciones en relacion con una dieta estandar de felino:
Reduccion del fosforo
Niveles reducidos de protelnas
Reduccion de sodio
Niveles elevados de acidos grasos omega-3 Niveles elevados de vitaminas del complejo B Incremento de antioxidantes.
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2.10. Cualquiera de los metodos precedentes, en donde la dieta de proteccion renal comprende desde aproximadamente 18% a aproximadamente 40% de proteina, desde aproximadamente 0.2% a aproximadamente 0.85% de fosforo, y desde aproximadamente 0.04% a aproximadamente 0.35% de sodio, en una base de materia seca.
2.11. Cualquiera de los metodos precedentes, en donde la dieta de proteccion renal provee desde aproximadamente
3.6 a aproximadamente 7.9 g/100 kcal ME de proteina, desde aproximadamente 0.04 a aproximadamente 0.17 g/100 kcal ME de fosforo, y desde aproximadamente 0.008 a aproximadamente 0.07 g/100 kcal ME de sodio.
2.12. Cualquiera de los metodos precedentes, en donde la dieta de proteccion renal comprende un alimento seco que comprenden proteina en una cantidad desde aproximadamente 5% a aproximadamente 40%, fosforo en una cantidad desde aproximadamente 0.01% a aproximadamente 2%, y sodio en una cantidad desde aproximadamente 0.01% a aproximadamente 2%, sobre una base “como alimentado”.
2.13. Cualquiera de los metodos precedentes, en donde la dieta de proteccion renal comprende un alimento hidratado que comprenden proteina en una cantidad desde aproximadamente 4% a aproximadamente 12%, fosforo en una cantidad desde aproximadamente 0.03% a aproximadamente 0.2%, y de sodio en una cantidad desde aproximadamente 0.03% a aproximadamente 0.2%, sobre una base “como alimentado”.
En un aspecto adicional, la descripcion provee reactivos, opcionalmente marcados, utiles en la deteccion del nivel de expresion del uno o mas biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en lumican; cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12; decorina; proteina 2 secretada relacionada con frizzled; proteina 5 de union al retinol; MMP-2; mMp-7; y MMP-19 en un felino, por ejemplo,
a. Los anticuerpos, por ejemplo anticuerpos monoclonales, anticuerpos de cadena sencilla, y fragmentos de anticuerpos funcionales, que reconocen proteinas felinas seleccionados del grupo que consiste en lumican; cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12; decorina; proteina 2 secretada relacionada con frizzled; proteina 5 de union al retinol; MMP-2; MMP-7; y MMP-19.
b. Los aptameros, por ejemplo acido nucleico o aptameros peptidicos, que reconocen las proteinas felinas seleccionadas del grupo que consiste en lumican; cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12; decorina; proteina 2 secretada relacionada con frizzled; proteina 5 de union al retinol; MMP-2; MMP-7; y MMP-19.
c. Proteina de felino aislada y purificada o recombinante seleccionada del grupo que consiste en lumican; cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12; decorina; proteina 2 secretada relacionada con frizzled; proteina 5 de union al retinol; MMP-2; MMP-7; y MMP-19.
d. Las sondas de oligonucleotido capaces de hibridar con un gen felino seleccionado del grupo que consiste en lumican; cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12; decorina; proteina 2 secretada relacionada con frizzled; proteina 5 de union al retinol; MMP-2; MMP-7; y MMP-19, por ejemplo, capaces de hibridarse a una o mas de SEQ ID NOS. 9-16, por ejemplo seleccionada de una o mas de SEQ ID NOS. 1-8.
En un aspecto adicional, la descripcion provee un kit (Kit 1) para el diagnostico, pronostico o seguimiento de un trastorno renal en un felino, que comprende
a. medio para medir la expresion de genes del uno o mas biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en lumican; cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12; decorina; proteina 2 secretada relacionada con frizzled; proteina 5 de union al retinol; MMP-2; MMP-7; y MMP-19 en una muestra biologica del felino, y
b. instrucciones de uso de tal medio para medir la expresion del uno o mas biomarcadores en una muestra biologica del felino y la evaluacion de la presencia de un proceso que conduce a un trastorno renal en el felino, por ejemplo,
1.1 Kit 1 en donde los medios para la medicion de los uno o mas biomarcadores es una o mas sondas de acido nucleico capaces de detectar la expresion de genes del uno o mas biomarcadores;
1.2 Kit 1.1, en donde las una o mas sondas de acido nucleico son capaces de hibridarse con una o mas de SEQ ID NOS. 9-16, por ejemplo, en condiciones rigurosas;
1.3 Kit 1.2 en donde las una o mas sondas de acido nucleico comprenden una secuencia o secuencias seleccionadas de una o mas de SEQ ID NOS. 1-8.
1.4 Cualquiera de los kits precedentes, que comprende una micromatriz de ADN que comprende una o mas sondas de acido nucleico capaces de detectar la expresion de genes del uno o mas biomarcadores.
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1.5 Kit 1, en donde el medio para la medicion de los uno o mas biomarcadores es uno o mas anticuerpos capaces de detectar la expresion de genes del uno o mas biomarcadores mediante el reconocimiento de la protelna expresada.
1.6 Kit 1.5 en formato ELISA que comprende anticuerpos capaces de detectar el uno o mas biomarcadores; protelna aislada, purificada o recombinante que corresponde a la protelna expresada; y solucion reguladora.
1.7 Kit 1, en donde el medio para la medicion de los uno o mas biomarcadores es uno o mas aptameros, por ejemplo, como se describe anteriormente, capaz de detectar la expresion de genes del uno o mas biomarcadores mediante el reconocimiento de la protelna expresada.
1.8 Cualquiera de los kits precedentes, en donde los uno o mas biomarcadores incluyen protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2) y/o protelna 5 de union al retinol (rbp5);
1.9 Cualquiera de los kits precedentes adaptados para su uso en cualquiera del Metodo 1 anterior y siguientes, o el metodo 2, y siguientes.
La description provee ademas el uso
de una secuencia de nucleotidos correspondiente o complementaria a un gen para lumican de felino; cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12; decorina; protelna 2 secretada relacionada con frizzled; protelna 5 de union al retinol; MMP-2; MMP-7; y MMP-19, por ejemplo, una secuencia de nucleotidos correspondiente o complementaria a cualquiera de SEQ ID NO 1-16, o
de un anticuerpo a una protelna seleccionada de felino lumican; cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12; decorina; protelna 2 secretada relacionada con frizzled; protelna 5 de union al retinol; MMP-2; MMP-7; y MMP-19, o
de un aptamero para una protelna seleccionada del lumican de felino; cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12; decorina; protelna 2 secretada relacionada con frizzled; protelna 5 de union al retinol; MMP-2; MMP-7; y MMP-19, o
lumican de felino aislada, purificada o recombinante; cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12; decorina; protelna 2 secretada relacionada con frizzled; protelna 5 de union al retinol; MMP-2; MMP-7; y MMP-19,
en un metodo de acuerdo con el Metodo 1, y siguientes, o Metodo 2 y siguientes, o
en la fabrication de un kit de acuerdo con el Kit 1, y siguientes.
Otras areas de aplicabilidad de la presente invention se haran evidentes a partir de la descripcion detallada proporcionada en lo sucesivo. Se debe entender que la descripcion y los ejemplos especlficos detallados, aunque indican la realization preferida de la invencion, estan destinadas para fines de ilustracion solamente y no pretenden limitar el alcance de la invencion.
Breve descripcion de los dibujos
La figura 1a es un grafico del nivel de cambio de la media geografica frente a la etapa de la glomerulonefritis de un sujeto felino para la expresion de genes de Canis familiaris similar al precursor lumican (proteoglicano sulfato de queratano lumican) ARNm.
La figura 1b es un grafico de la intensidad de RMA de la media geografica frente a la etapa de la glomerulonefritis de un sujeto felino para la expresion de genes de Canis familiaris similar al ARNm del precursor lumican (sulfato de queratano proteoglicano lumican).
La figura 2a es un grafico del nivel de cambio de la media geografica frente a la etapa de la glomerulonefritis de un sujeto felino para la expresion de genes de Equus caballus similar a ARNm del colageno alfa 1 (III).
La figura 2b es un grafico de la intensidad de RMA de la media geografica frente a la etapa de la glomerulonefritis de un sujeto felino para la expresion de genes de Equus caballus similar a colageno alfa 1 (III) ARNm.
La figura 3a es un grafico del nivel de cambio de la media geografica frente a la etapa de la glomerulonefritis de un sujeto felino para la expresion de ARNm de decorina del gen felino Canis lupus familiaris, felinos completos.
La figura 3b es un grafico de la intensidad de RMA de la media geografica frente a la etapa de la glomerulonefritis de un sujeto felino para la expresion de ARNm de decorina del gen felino Canis familiaris lupus, felinos completos.
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La figura 4a es un grafico de la intensidad del nivel de cambio de la media geografica frente a la etapa de la glomerulonefritis de un sujeto felino para la expresion de genes de ARNm de la protelna 2 secretada relacionada con frizzled de Canis familiaris lupus.
La figura 4b es un grafico de la RMA de la media geografica frente a la etapa de la glomerulonefritis de un sujeto felino para la expresion de genes del ARNm de la protelna 2 secretada relacionada con frizzled de Canis lupus familiaris.
La figura 5a es un grafico de nivel de cambio de la media geografica frente a la etapa de la glomerulonefritis de un
sujeto felino para la expresion de genes de ARNm de la metaloproteinasa de la matriz 2 del Canis familiaris.
La figura 5b es un grafico de la intensidad de RMA de la media geografica frente a la etapa de la glomerulonefritis de un sujeto felino para la expresion de genes de ARNm de la metaloproteinasa de la matriz 2 del Canis familiaris.
La figura 6a es un grafico del nivel de cambio de la media geografica frente a la etapa de la glomerulonefritis de un
sujeto felino para la expresion de ARNm PUMP-1 del gen Felis domesticus.
La figura 6b es un grafico de la intensidad de RMA de la media geografica frente a la etapa de la glomerulonefritis de un sujeto felino para la expresion de ARNm PUMP-1del gen de Felis domesticus.
La figura 7a es un grafico de las veces el cambio promedio geografica frente a la etapa de la glomerulonefritis de un sujeto felino para la expresion del ARNm del gen de Macaca mulatta.
La figura 7b es un grafico de la intensidad de RMA de la media geografica frente a la etapa de la glomerulonefritis de un sujeto felino para la expresion del ARNm del gen Macaca mulatta.
La figura 8a es un grafico del nivel de cambio de la media geografica frente a la etapa de la glomerulonefritis de un sujeto felino para la expresion de genes felino similar a protelna 5 de union al retinol Canis familiaris, celular.
La figura 8b es un grafico de la intensidad de RMA de la media geografica frente a la etapa de la glomerulonefritis de un sujeto felino para la expresion de genes similar a protelna 5 de union al retinol Canis familiaris celular.
Descripcion detallada de la invencion
La siguiente descripcion de las realizaciones preferidas es de naturaleza meramente ejemplar y de ningun modo pretenden limitar la invencion, su aplicacion o usos.
Ciertas definiciones
Como se utiliza en este documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario, por ejemplo, la referencia a "una variante" incluye una pluralidad de variantes. Ademas, los terminos definidos incluyen variaciones de los terminos utilizados en el contexto gramatical apropiado, por ejemplo, la expresion "se une especlficamente" incluye "union especlfica" y otras formas del termino. Del mismo modo, las palabras "comprenden", "comprende" y "que comprende" se deben interpretar inclusivamente en vez de exclusivamente.
El termino "anticuerpo" significa cualquier inmunoglobulina que se une a un antlgeno especlfico, incluyendo anticuerpos IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE. El termino incluye anticuerpos policlonales, monoclonales, monovalentes, humanizados, heteroconjugados, composiciones de anticuerpos con especificidad poliepitopica, quimericos, anticuerpos biespeclficos, diacuerpos, anticuerpos de cadena sencilla, y fragmentos de anticuerpos tales como Fab, Fab', F(ab')2, y Fv, u otros fragmentos de union a antlgeno.
El termino "matriz" significa una disposicion ordenada de al menos dos sondas en un sustrato. Al menos una de las sondas es un control o estandar y al menos una de las sondas es una sonda de diagnostico. La disposicion desde aproximadamente dos a aproximadamente 40,000 sondas sobre un sustrato asegura que la intensidad y el tamano de la senal de cada complejo marcado formado entre una sonda y un polinucleotido o polipeptido de la muestra es distinguible individualmente. La coleccion de moleculas depositadas en la matriz se puede preparar ya sea sintetica o biosinteticamente. La matriz puede tomar una variedad de formas, incluyendo bibliotecas de moleculas solubles, bibliotecas de compuestos atados a perlas de resina, chips de sllice u otros soportes solidos. La matriz de acido nucleico puede incluir las bibliotecas de acidos nucleicos que se pueden preparar mediante la deteccion de acidos nucleicos en esencialmente cualquier longitud (por ejemplo, desde 1 a aproximadamente 1,000 nucleotidos de longitud) sobre un sustrato. Una matriz de sondas de acido nucleico comprende preferiblemente acidos nucleicos unidos a un sustrato en ubicaciones conocidas. En otras realizaciones, el sistema puede incluir un soporte o sustrato solido, tal como una membrana, filtro, portaobjetos de microscopio, micropozos, tubos de muestra, perlas, matriz de perlas, o similares. El soporte solido puede estar hecho de diversos materiales, incluyendo papel, celulosa, nylon, poliestireno, policarbonato, plastico, vidrio, ceramica, acero inoxidable, o similares. El soporte solido puede tener
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preferiblemente una superficie rlgida o semirrlgida, y preferiblemente puede ser esferico (por ejemplo, perla) o sustancialmente plano (por ejemplo, superficie plana) con pozos apropiados, regiones elevadas, zanjas grabadas al agua fuerte, o similares. El soporte solido tambien puede incluir un gel o matriz en la que pueden estar incrustados acidos nucleicos.
El termino "biomarcadores" significa genes y productos genicos codificados por un gen de la invencion o un homologo de felino del mismo, especialmente un homologo de felino del mismo, en donde se ha determinado que el gen se ha expresado diferencialmente como resultado de una enfermedad, afeccion, trastorno o la administration de una sustancia, farmacos, nutriente o componente de la dieta o combinaciones de los mismos, y en donde dichos genes y productos de genes de la invencion se identifican en SEQ ID NOS .: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, y 16 o un gen homologo del mismo, incluyendo, sin limitation, un gen felino. Un biomarcador puede ser un polinucleotido, polipeptido, protelna, ARN, incluyendo un transcrito de ARN o su producto de traduction, ADN, ADNc, un metabolito de una o mas de las moleculas anteriores, o una variante util de cualquiera de las moleculas anteriores, la expresion diferencial de la que esta asociada con un trastorno renal, incluyendo, sin limitacion glomerulonefritis, y en donde la correlation de tal expresion diferencial en una muestra tomada de un animal de ensayo a una muestra tomada de un animal de control se puede utilizar en el diagnostico, pronostico, seguimiento o tratamiento de la afeccion, enfermedad o trastorno en un animal en necesidad del mismo. Ademas, un biomarcador puede ser utilizado generalmente para referirse a cualquier parte o segmento de dicho gen o protelna que se puede identificar o correlacionar con el gen o protelna de longitud completa, por ejemplo, en un ensayo u otro metodo de la invencion. La expresion de biomarcadores tambien se puede identificar mediante la detection de la traduccion biomarcador (esto es, deteccion de la protelna de biomarcadores en una muestra). Metodos apropiados para la deteccion de la protelna de biomarcadores incluyen cualquier metodo apropiado para detectar y/o medir protelnas a partir de un extracto celular o celula. Tales metodos incluyen, pero no se limitan a, inmunotransferencia (por ejemplo, transferencia Western), ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), inmunoprecipitacion, inmunohistoqulmica e inmunofluorescencia. Los metodos particularmente preferidos para la deteccion de protelnas incluyen cualquier ensayo de una sola celula, incluyendo ensayos de inmunohistoqulmica e inmunofluorescencia. Tales metodos son bien conocidos en la tecnica. Ademas, los anticuerpos contra algunos de los biomarcadores descritos en este documento son conocidos en la tecnica y se describen en la literatura publica, y metodos para su preparation son bien conocidos para el experto.
El termino "comparable" como se utiliza para comparar la expresion de una muestra de prueba a una muestra de control se entendera como indicios del caracter y la cantidad del producto y debera incluir, sin limitacion, los valores dentro de una desviacion estandar en torno al valor medio de la cual dicha comparacion se hace y los valores que abarcan la expresion diferencial entre la muestra de ensayo y muestra de control.
Los terminos "genes expresados diferencialmente", "expresion diferencial de genes", "expresion diferencial" o "expresado diferencialmente" y sus sinonimos, que se utilizan de manera intercambiable, se refieren a un gen cuya expresion se activa a un nivel mas alto o mas bajo en un sujeto que sufre de una enfermedad, afeccion, o trastorno, o como resultado de la que se administra una sustancia, farmaco, nutriente o componente de la dieta o combinaciones de los mismos, en relation con su expresion en un sujeto normal o de control. Los terminos tambien incluyen genes cuya expresion esta activada a un nivel mayor o menor en diferentes etapas de la misma enfermedad. Tambien se entiende que un gen expresado diferencialmente puede ser ya sea activado o inhibido al nivel de acido nucleico o al nivel protelna, o puede ser objeto de corte y empalme alternativo para dar como resultado un producto de polipeptido diferente. Tales diferencias pueden ser evidenciadas por un cambio en los niveles de ARNm, expresion superficial, secretion u otra partition de un polipeptido, por ejemplo. La expresion diferencial de genes puede incluir una comparacion de la expresion entre dos o mas genes o sus productos genicos, o una comparacion de las relaciones de la expresion entre dos o mas genes o sus productos genicos, o incluso una comparacion de dos productos procesados de manera diferente del mismo gen, que difieren entre sujetos normales y sujetos que padecen una enfermedad, afeccion, o trastorno, o como resultado de que se administre una sustancia, farmaco, nutriente o componente de la dieta o combinaciones de los mismos, o entre las diversas etapas de la misma enfermedad, afeccion, o trastorno, o como resultado de que se administren diferentes cantidades de una sustancia, farmacos, nutriente o componente dietetico o combinaciones de los mismos. La expresion diferencial incluye tantas diferencias cuantitativas, as! como cualitativas, en el patron de expresion temporal o celular en un gen o sus productos de expresion entre, por ejemplo, celulas, normales y enfermas, o entre celulas que han experimentado diferentes eventos de enfermedad o etapas de la enfermedad. Para el proposito de esta invencion, "expresion diferencial de genes" se considera que esta presente cuando existe al menos aproximadamente 2.0, 1.9, 1.8, 1.7, 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.2, 1.1 o 1.0 veces, preferiblemente al menos aproximadamente dos veces o mas, mas preferiblemente al menos aproximadamente 2.5, 3 o 4 o mas niveles de cambio en la cantidad de polinucleotidos transcritos o protelna traducida en una muestra.
El termino "veces" cuando se utiliza como una medida de la expresion diferencial de genes significa una cantidad de la expresion de genes en un felino que es un multiplo o una fraction de la expresion de genes en comparacion con la cantidad de expresion de genes en una comparacion de felino, por ejemplo, un felino que tiene una perdida de la funcion renal, insuficiencia renal, una medicion de filtration glomerular reducida o glomerulonefritis en comparacion con un animal que no demuestra dicha afeccion. Por ejemplo, un gen que se expresa 2 veces mas en el animal que en el animal de comparacion tiene una expresion diferencial de genes de 2 veces y un gen que se expresa de un
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medio mas en el animal que en el animal de comparacion tambien tiene una expresion diferencial de genes de 2 veces.
El termino "fragmento" significa (1) una secuencia de oligonucleotidos o polinucleotidos que es una parte de una secuencia completa y que tiene la misma o similar actividad para un uso particular como la secuencia de polinucleotido completa o (2) una secuencia de peptido o polipeptido que es una parte de una secuencia completa y que tiene la misma o similar actividad para un uso particular como la secuencia de polipeptido completo. Tales fragmentos pueden comprender cualquier numero de nucleotidos o aminoacidos considera apropiado para un uso particular. Generalmente, fragmentos de oligonucleotidos o polinucleotidos contienen al menos aproximadamente 10, 50, 100, o 1000 nucleotidos y fragmentos de polipeptidos contienen al menos alrededor de 4, 10, 20, o 50 aminoacidos consecutivos de la secuencia completa. El termino abarca variantes de polinucleotidos y polipeptidos de los fragmentos. Un polinucleotido, por ejemplo, puede estar disuelto, o fragmentado en, una pluralidad de segmentos.
Diversos metodos de fragmentacion de acidos nucleicos son bien conocidos en la tecnica. Estos metodos pueden ser, por ejemplo, ya sea qulmica o flsica en la naturaleza. La fragmentacion qulmica puede incluir degradacion parcial con una DNasa; despurinacion parcial con acido; el uso de enzimas de restriction; endonucleasas de intron codificada; metodos de escision basadas en el ADN, tales como triplex y metodos de formation de hlbridos, que se basan en la hibridacion especlfica de un segmento de acido nucleico para localizar un agente de escision a una ubicacion especlfica en la molecula de acido nucleico; u otras enzimas o compuestos que escinden el ADN en ubicaciones conocidas o desconocidas. Metodos de fragmentacion flsicos pueden implicar someter el ADN a una alta velocidad de cizallamiento. Las altas velocidades de cizallamiento se pueden producir, por ejemplo, moviendo el ADN a traves de una camara o canal con hoyos o espigas, o forzar la muestra de ADN a traves de un paso de flujo de tamano restringido, por ejemplo, una abertura que tiene una dimension de la section transversal en la escala del micron o submicrometrico. Otros metodos flsicos incluyen sonicacion y nebulizacion. Las combinaciones de metodos de fragmentacion flsicos y qulmicos pueden igualmente ser empleados tales como fragmentacion por el calor y la hidrolisis mediada por ion. Vease, por ejemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) ("Sambrook et al."), que se incorpora en este documento por referencia para todos los propositos. Estos metodos se pueden optimizar para digerir un acido nucleico en fragmentos de un rango de tamano seleccionado. Los rangos de tamano utiles pueden ser de 100, 200, 400, 700 o 1000 a 500, 800, 1500, 2000, 4000 o 10,000 pares de bases. Sin embargo, los rangos de gran tamano tales como 4000, 10,000 o 20,000 a 10,000, 20,000 o 500,000 pares de bases tambien pueden ser utiles.
El termino "gen" o "genes" significa un segmento completo o parcial de ADN implicado en la production de un polipeptido, incluyendo regiones que preceden y siguen a la region codificante (llder y remolque) y secuencias intermedias (intrones) entre segmentos codificantes individuales (exones). El termino abarca cualquier secuencia de ADN que hibrida con el complemento de las secuencias de codification de genes.
El termino "homologo" significa (1) un polinucleotido, incluyendo polinucleotidos de la misma o diferentes especies de animales, que tienen mas del 30%, 50%, 70%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de similitud de secuencia con un polinucleotido y que tiene la misma o sustancialmente las mismas propiedades y la realization de la misma o sustancialmente la misma funcion que el polinucleotido completo, o que tiene la capacidad de hibridarse especlficamente a un polinucleotido en condiciones rigurosas o (2) un polipeptido, incluyendo polipeptidos de la misma o diferentes especies de animales, que tiene mas del 30%, 50%, 70%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de similitud de secuencia con un polipeptido identificados mediante la expresion de polinucleotidos y que tienen la misma o sustancialmente las mismas propiedades y la realizacion de la misma o sustancialmente la misma funcion que el polipeptido completo, o que tiene la capacidad de unirse especlficamente a un polipeptido identificado mediante la expresion de polinucleotidos. La similitud de secuencia de dos secuencias de polipeptidos o de dos secuencias de polinucleotidos se determina utilizando metodos conocidos para los expertos, por ejemplo, el algoritmo de Karlin and Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268 (1990)). Dicho algoritmo se incorpora en los programas NBLAST y XBlAsT de Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)). Para obtener los alineamientos gapped con fines de comparacion, Gapped BLAST se puede utilizar como se describe en Altschul et al. (Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se utilizan los parametros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Vease
http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
El termino "hibridacion" se refiere al proceso en el cual dos polinucleotidos de cadena sencilla se unen de forma no covalente para formar un polinucleotido de cadena doble estable. El termino "hibridacion" tambien puede referirse a la hibridacion de triple cadena. El polinucleotido de doble cadena resultante (por lo general) es un "hlbrido". La proportion de la poblacion de polinucleotidos que forman hlbridos estables se denomina en este documento como el "grado de hibridacion".
Las reacciones de hibridacion pueden ser realizadas en formatos de hibridacion absolutos o diferenciales. En el formato de hibridacion absoluta, los polinucleotidos derivados de una muestra se hibridan con las sondas en una matriz de acido nucleico. Las senales detectadas despues de la formacion de complejos de hibridacion se correlacionan con los niveles de polinucleotidos en la muestra. En el formato de hibridacion diferencial, los
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polinucleotidos derivados de dos muestras se marcan con diferentes unidades estructurales de marcacion. Se adiciona una mezcla de estos polinucleotidos marcados de forma diferente a una matriz de acido nucleico. La matriz de acido nucleico se examina a continuation, en condiciones en las que las emisiones de las dos etiquetas diferentes son detectables individualmente. En una realization, los fluoroforos Cy3 y Cy5 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.) se utilizan como las unidades estructurales de marcacion para el formato de hibridacion diferencial.
Las senales recogidas a partir de matrices de acidos nucleicos se pueden analizar utilizando software disponibles comercialmente, tales como los proporcionados por Affymetrix o Agilent Technologies. Los controles, tales como para la sensibilidad de exploration, marcacion de la sonda y cuantificacion de ADNc o ARNc, se incluyen preferiblemente en los experimentos de hibridacion. Las senales de hibridacion se pueden ampliar o normalizar antes de ser objeto de un analisis mas detallado. Por ejemplo, las senales de hibridacion para cada sonda individual pueden ser normalizadas para tener en cuenta las variaciones en las intensidades de hibridacion cuando se utiliza mas de una matriz en condiciones de ensayo similares. Las senales de hibridacion tambien se pueden normalizar utilizando las intensidades derivadas de los controles de normalization internos contenidos en cada matriz. Ademas, los genes con niveles de expresion relativamente consistentes a traves de las muestras se pueden utilizar para normalizar los niveles de expresion de otros genes. En una realizacion, las sondas para ciertos genes de mantenimiento se incluyen en una matriz de acido nucleico de la presente invencion. Estos genes son elegidos porque muestran niveles estables de expresion a traves de un conjunto diverso de tejidos. Las senales de hibridacion se pueden normalizar y/o escalar en base a los niveles de expresion de estos genes de mantenimiento.
El termino "complejo de hibridacion" significa un complejo que se forma entre los polinucleotidos de la muestra cuando las purinas de hidrogeno de un polinucleotido se unen con las pirimidinas del polinucleotido complementario, por ejemplo, 5'-A-G-T-C-3' pares de bases con 3'-TCAG-5'. El grado de complementariedad y el uso de analogos de nucleotidos afectan a la eficiencia y la rigurosidad de las reacciones de hibridacion.
El termino "sondas de hibridacion" incluye los acidos nucleicos (tales como oligonucleotidos) capaces de unirse de manera especlfica a la base a una cadena complementaria de acido nucleico. Tales sondas incluyen acidos nucleicos peptldicos, como se describe en Nielsen et al., Science 254:1497-1500 (1991), Nielsen Curr. Opin. Biotechnol., 10:71-75 (1999) y otros analogos de acido nucleico y mimeticos de acidos nucleicos. Vease la Patente de los Estados Unidos No. 6,156,501 presentada el 3 de Abril, 1996.
El termino "enfermedad renal" o "trastorno renal" o analogamente "enfermedad renal" o "trastorno renal" se destina a cubrir una perdida anormal aguda o cronica de la funcion renal, tal como insuficiencia renal, medicion de la filtration glomerular reducida y glomerulonefritis. La glomerulonefritis puede tomar la forma de glomerulonefritis membranosa que implica el engrosamiento de la membrana basal glomerular. Alternativamente, la glomerulonefritis puede tomar la forma de glomerulonefritis proliferativa o mesangioproliferativa, que se caracteriza por la proliferation de celulas en la matriz mesangial. Ademas, la glomerulonefritis puede tomar la forma de glomerulonefritis membranoproliferativa que implica una combination de los cambios anteriores. La glomeruloesclerosis es una forma grave de la glomerulonefritis. Los trastornos renal o enfermedad de rinon tambien incluyen nefritis, nefropatla, hiperfiltracion, microalbuminuria leves, albuminuria cllnica, nefropatla cllnica avanzada, insuficiencia renal cronica, lesiones de papila renal, necrosis tubular y nefropatla diabetica, todos como diferencialmente diagnosticado por los veterinarios con conocimientos ordinarios en el arte. El termino no pretende abarcar enfermedad poliqulstica del rinon de origen genetico.
Un felino con funcion renal normal es un felino que es asintomatico durante un trastorno renal y no presenta signos ni slntomas de un trastorno renal cllnico y no hay cambios en las mediciones de laboratorio cllnico de la funcion renal. La funcion renal normal se puede determinar por una o mas mediciones de, incluyendo, sin limitation, medicion de la filtracion glomerular, nivel de protelna en la orina, nivel de creatinina en sangre, nivel de creatinina en orina, depuration de creatinina y nitrogeno ureico en sangre.
La "secuencia de acido nucleico" significa un oligonucleotido, nucleotido o polinucleotido, y fragmentos o porciones de los mismos, y para ADN o ARN de origen genomico o sintetico que puede ser de una o de doble cadena, y representan la cadena sentido o antisentido.
El termino "polinucleotido" u "oligonucleotido" significa un pollmero de nucleotidos. El termino abarca moleculas de ADN y ARN (incluyendo ADNc y ARNm), ya sea de una o de doble cadena, y si es de una cadena, su secuencia complementaria, ya sea en forma lineal o circular. El termino tambien abarca fragmentos, variantes, homologos y alelos, segun sea apropiado para las secuencias que tienen la misma o sustancialmente las mismas propiedades y realizar la misma o sustancialmente la misma funcion que la secuencia original. Las secuencias pueden ser totalmente complementarias (sin falta de coincidencias) cuando se alinean o puede tener hasta aproximadamente un 30% de apareamiento erroneo de la secuencia. Preferiblemente, para los polinucleotidos, la cadena contiene desde aproximadamente 20 a 10,000 nucleotidos, mas preferiblemente desde aproximadamente 150 a 3,500 nucleotidos. Preferiblemente, para los oligonucleotidos, la cadena contiene desde aproximadamente 2 a 100 nucleotidos, mas preferiblemente desde aproximadamente 6 a 30 nucleotidos. El tamano exacto de un polinucleotido u oligonucleotido dependera de diversos factores y de la aplicacion particular y el uso del polinucleotido u oligonucleotido. El termino
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incluye los pollmeros de nucleotidos que se sintetizan y que estan aislados y purificados a partir de fuentes naturales. El termino "polinucleotido" incluye "oligonucleotido".
El termino "polipeptido", "peptido" o "protelna" significa un pollmero de aminoacidos. El termino abarca pollmeros de origen natural y de origen no natural (sinteticos) y pollmeros en los que mimeticos qulmicos artificiales son sustituidos por uno o mas aminoacidos. El termino tambien abarca fragmentos, variantes y homologos que tienen las mismas o sustancialmente las mismas propiedades y realizan la misma o sustancialmente la misma funcion que la secuencia original. El termino pollmeros abarca pollmeros de cualquier longitud, que contienen preferiblemente desde aproximadamente 2 a 1000 aminoacidos, mas preferiblemente desde aproximadamente 5 a 500 aminoacidos. El termino incluye pollmeros de aminoacidos que se sintetizan y que se alslan y purifican a partir de fuentes naturales.
El termino "sonda" significa (1) un oligonucleotido o polinucleotido, ya sea ARN o ADN, ya sea de origen natural como en una enzima de restriccion purificada digerida o producida sinteticamente, que es capaz de hibridar con o de hibridarse especlficamente con un polinucleotido con secuencias complementarias a la sonda o (2) un peptido o polipeptido capaz de unirse especlficamente a una protelna en particular o fragmento de protelna con la exclusion sustancial de otras protelnas o fragmentos de protelnas. Una sonda de oligonucleotido o polinucleotido puede ser de cadena sencilla o doble. La longitud exacta de la sonda dependera de muchos factores, incluyendo temperatura, fuente, y uso. Por ejemplo, para aplicaciones de diagnostico, dependiendo de la complejidad de la secuencia diana, una sonda de oligonucleotido contiene por lo general aproximadamente 10 a 100, 15 a 50, o 15 a 25 nucleotidos. En ciertas aplicaciones de diagnostico, una sonda de polinucleotido contiene alrededor de 100-1000, 300-600, nucleotidos, preferiblemente de aproximadamente 300 nucleotidos. Las sondas en este documento se seleccionan para ser "sustancialmente" complementarios a diferentes cadenas de una secuencia diana particular. Esto significa que las sondas deben ser suficientemente complementarios para hibridar especlficamente o hibridar con sus respectivas secuencias diana bajo un conjunto de afecciones predeterminadas. Por lo tanto, la secuencia de la sonda no necesita reflejar la secuencia complementaria exacta de la diana. Por ejemplo, un fragmento de nucleotidos no complementario puede estar unido al extremo 5' o 3' de la sonda, con el resto de la secuencia de la sonda siendo complementaria a la secuencia diana. Alternativamente, las bases no complementarias o secuencias mas largas pueden ser intercaladas en la sonda, siempre que la secuencia de la sonda tenga suficiente complementariedad con la secuencia del polinucleotido diana para hibridarse especlficamente con el polinucleotido diana. Una sonda de peptido o polipeptido puede ser cualquier molecula a la que la protelna o el peptido se une especlficamente, incluyendo ADN (para las protelnas de union al ADN), anticuerpos, receptores de membrana celular, peptidos, cofactores, lectinas, azucares, polisacaridos, celulas, membranas celulares, organulos y membranas de los organelos.
Los terminos "muestra" y "especimen" significan cualquier de tejido animal o fluido que contiene polinucleotidos, incluyendo celulas y otro tejido que contiene ADN y ARN. Los ejemplos incluyen: sangre, rinon, conectivo, epitelial, linfoide, musculo, nervioso, esputo, y similares. Una muestra puede ser solida o llquida y que puede contener ADN, ARN, ADNc, por ejemplo, llquido corporal tales como sangre u orina, celulas, preparaciones de celulas o fracciones solubles o allcuotas de los medios de los mismos, cromosomas, organulos, y similares.
El termino "unidos especlficamente" significa una interaccion especial y precisa entre dos moleculas que depende de su estructura, particularmente sus grupos laterales moleculares. Por ejemplo, la intercalacion de una protelna reguladora en el surco mayor de una molecula de ADN, los enlaces de hidrogeno a lo largo de la columna vertebral entre dos acidos nucleicos de cadena sencilla, o la union entre un epltopo de una protelna y un agonista, antagonista, o un anticuerpo.
El termino "hibrida especlficamente" significa una asociacion entre dos polinucleotidos de cadena sencilla de la secuencia suficientemente complementaria para permitir dicha hibridacion bajo condiciones predeterminadas utilizadas generalmente en la tecnica (a veces denominada "sustancialmente complementaria"). Por ejemplo, el termino puede referirse a la hibridacion de una sonda de polinucleotido con una secuencia sustancialmente complementaria contenida dentro de una molecula de ADN o aRn de cadena sencilla de acuerdo con un aspecto de la invencion, con la exclusion sustancial de la hibridacion de la sonda de polinucleotidos con polinucleotidos de cadena sencilla de secuencia no complementaria.
El termino "condiciones rigurosas" significa (1) hibridacion en 50% (vol/vol) de formamida con 0.1% de albumina de suero bovino, 0.1% de Ficoll, 0.1% de polivinilpirrolidona, solucion reguladora de fosfato de sodio 50 mM a pH 6.5 con NaCl 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42°C, (2) hibridacion en 50% de formamida, 5x SSC (0.75 M NaCl, citrato de sodio 0.075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6.8), 0.1% de pirofosfato de sodio, solucion de Denhardt 5x, ADN de esperma de salmon sonicado (50 mg/mL), 0.1% de SDS, y 10% de sulfato de dextrano a 42°C; con lavados a 42°C en 0.2 x SSC y 0.1% de SDS o lavados con NaCl 0.015 M, citrato de sodio 0.0015 M, Na2SO4 0.1% a 50°C o procedimientos reconocidos en la tecnica similares empleando baja fuerza ionica similar y agentes de lavado de alta temperatura y agentes de desnaturalizacion similares.
El termino "variaciones utiles" significa (1) para un polinucleotido, los complementos del polinucleotido; los homologos del polinucleotido y sus complementos; las variantes del polinucleotido, sus complementos, y sus
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homologos; y los fragmentos del polinucleotido, sus complementos, sus homologos, y sus variantes y (2) para un polipeptido, los homologos del polipeptido; las variantes del polipeptido y sus homologos; y los fragmentos del polinucleotido, sus homologos, y sus variantes.
El termino "variante" significa (1) una secuencia de polinucleotido que contiene cualquier sustitucion, variacion, modificacion, sustitucion, delecion o adicion de uno o mas nucleotidos desde o a una secuencia de polinucleotido y que tiene la misma o sustancialmente las mismas propiedades y realiza la misma o sustancialmente la misma funcion que la secuencia original y (2) una secuencia de polipeptido que contiene cualquier sustitucion, variacion, modificacion, sustitucion, delecion o adicion de uno o mas aminoacidos de o a una secuencia de polipeptido y que tiene la mismas o sustancialmente las mismas propiedades y realiza la misma o sustancialmente la misma funcion que la secuencia original. Por lo tanto, el termino incluye polimorfismos de nucleotido unico (SNP) y variantes alelicas e incluye sustituciones de aminoacidos conservativas y no conservativas en polipeptidos. El termino tambien abarca la derivatizacion qulmica de un polinucleotido o polipeptido y sustitucion de nucleotidos o aminoacidos con nucleotidos o aminoacidos que no se producen naturalmente, segun sea apropiado.
A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientlficos y cualquiera de los acronimos utilizados en este documento tienen los mismos significados como se entiende comunmente por un experto en el arte en el campo de la invencion.
Sondas
Las sondas utiles en la practica de los metodos definidos en este documento y que se utilizan en la identificacion de los biomarcadores felinos en las muestras felinas comprenden SEQ ID NOS: 1 a 8. Las secuencias de la sonda corresponden a los siguientes numeros de identificacion de sonda utilizada en el chip de gen felino patentado fabricado por Affymetrix, identificado como Affymetrix Feline GeneChip®, tal como se describe con mas detalle en esta especificacion.
HP04719_at corresponde a SEQ ID NO. 1, que es util en la hibridacion con un homologo de felino de la secuencia de ARNm del ARNm del gen canino Canis familiaris lupus para la protelna 2 secretada relacionada con frizzled putativa (gen sfrp2). La secuencia para el homologo de felino para que SEQ ID NO. 1 se hibride es SEQ ID. NO. 9. La sonda ID No. corresponde al numero de ID utilizado en el Affymetrix Felino GeneChip®. La secuencia de ARNm de canino correspondiente se identifica por el numero de acceso No. NM_001002987.1 en ID Gen: 475471.
HP12767_at corresponde a SEQ ID NO. 2, que es util en la hibridacion con un homologo de felino de la secuencia de ARNm de Canis familiaris similar a la protelna 5 de union a retinol; celular; transcrito variante 2. La secuencia para el homologo de felino a la cual SEQ ID NO. 2 hibrida es SEQ ID. NO. 10. La sonda ID No. corresponde al numero ID utilizado en el Affymetrix Feline GeneChip®. La secuencia de ARNm de canino correspondiente se identifica por LOC477706 y por secuencia de referencia NCBI: XM_848184.1.
HP04078_at corresponde a SEQ ID NO. 3, que es util en la hibridacion con el homologo de felino de la secuencia de ARNm del gen de Canis familiaris similar al precursor Lumican (Queratan apropiado proteoglicano lumican) (KSPG lumican). La secuencia de canino correspondiente se identifica por LOC 482599). La secuencia de ARNm de canino correspondiente se identifica por la secuencia de referencia NCBI: XM_539716.2 en Gen ID: 482599.
HP04079_at corresponde a SEQ ID NO. 4, que es util en la hibridacion con el homologo de felino de la secuencia de ARNm de decorina de Canis familiaris lupus (DCN). La secuencia de ARNm canino correspondiente se identifica como secuencia de referencia NCBI: NM_001003228.1 en Gen ID: 403904.
HP06873_at corresponde a SEQ ID NO. 5, que es util en la hibridacion con el homologo de felino de la secuencia de ARNm de Equus caballus similar al colageno; tipo III; alfa 1 (slndrome de Ehlers-Danlos tipo IV; dominante autosomico La secuencia de ARNm de equino correspondiente es identificado por la secuencia de referencia NCBI: XM_001917620 en Gen ID 100034123.
HP00944_at corresponde a SEQ ID NO. 6, que es util en la hibridacion con el homologo de felino de la secuencia de ARNm de matriz metaloproteinasa-2 (MMP-2) de Canis familiaris. La secuencia de ARNm canino correspondiente se identifica por la secuencia de referencia NCBI: XM_535300.2 en Gen ID: 403733.
HP09664_at corresponde a SEQ ID NO. 7, que es util en la hibridacion con la secuencia de ARNm de felino de la construccion sintetica del ARNm de Felis domesticus PUMP-1. Felino PUMP-1 se identifica como el No. de Acceso U04444.1.
HP00012_at corresponde a SEQ ID NO. 8, que es util en la hibridacion con el homologo de felino de la secuencia de ARNm del predicho: metaloproteinasa de la matriz 19 de Macaca mulatta; transcrito variante 1 (MMP19). El numero de secuencia de referencia NCBI es XM_001111542 en Gen ID 7100111.
Biomarcadores
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Los biomarcadores utiles en la practica de los metodos definidos en este documento son: protelna 2 secretada relacionada con frizzled (sFRP2); protelna 5 de union al retinol (rbp5); lumican (LUM); decorina (DCN); cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12 (COL3A1); y metaloproteinasa de la matriz-2, -7 y -19 (MMP2, MmP7 y MMP 19), como se describe mas completamente a continuacion y en las listas de secuencias adjuntas a la presente memoria. En la presente invencion, el biomarcador es la protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRp2).
SEQ ID NO. 9 corresponde a una secuencia de acido nucleico de felino homologa a ARNm de la protelna 2 secretada relacionada con frizzled de Canis familiaris. La secuencia canina es identificada por la secuencia de referencia NCBI: NM_001002987.1 y Gen ID: 475471. La secuencia de nucleotidos de longitud completa canina es de 1760 bp. El polipeptido canino correspondiente tiene la secuencia de referencia NCBI NP_001002987.1. La protelna 2 secretada relacionada con frizzled de canino (sFRP2) es un aminoacido 294. Los miembros de la familia de protelnas transmembrana 'frizzled' (FZ) son receptores para miembros de la familia Wnt, ligandos glicosilados ricos en cistelna implicados en una variedad de procesos celulares, incluyendo el control de la polaridad celular y transformacion maligna. Las protelnas secretadas relacionadas con Frizzled (SFRPs) parecen actuar como moduladores solubles de la senalizacion de Wnt al competir con los receptores de frizzled unidas a la membrana para la union de ligandos Wnt secretados.
SEQ ID NO. 10 corresponde a una secuencia de acido nucleico de felino homologa a Canis familiaris similar a ARNm de la protelna 5 de union al retinol, celular, transcrito variante 2 (LOC477706). La secuencia de canino se identifica por secuencia de referencia NCBI XM_848184.1. La secuencia de nucleotidos de longitud completa canina es 511 bp. El polipeptido canino correspondiente tiene secuencia de referencia NCBI XP_853277.1. rbp5 de canino es una protelna de 135 aminoacidos. Rbp5 pertenece a la familia de la lipocalina y se cree que es un portador para el retinol (vitamina A alcohol) intracelularmente.
SEQ ID NO. 11 corresponde a una secuencia de acido nucleico de felino homologa a la pronosticada: ARNm del canis familiaris similar al precursor lumican (queratan sulfato proteoglicanos lumican) (LOC 482599). La secuencia canina es identificada por la secuencia de referencia NCBI M_539716.2. La secuencia de nucleotidos de canino de longitud completa es 2028 bp. El polipeptido de canino correspondiente tiene secuencia de referencia NCBI XP_539716.1 Canino lumican precursor (sulfato de queratano proteoglicano lumican) es una protelna de 338 aminoacidos. Lumican (LUM) es un proteoglicano sulfatado de matriz extracelular que interactua con protelnas que estan implicadas en el ensamblaje de la matriz tal como colageno de tipo I y de tipo VI. LUM esta implicado en la proliferacion celular y morfogenesis de tejidos. Se cree que Lumican desempena un papel importante en la regulacion del conjunto de fibras de colageno. La protelna es tambien un socio de union de TGF-beta.
SEQ ID NO. 12 corresponde a una secuencia de acido nucleico de felino homologa a ARNm de Decorina Canis familiaris lupus precursor, La secuencia se identifica por secuencia de referencia NCBI NM-001003228,1 en Gen ID 403904. La secuencia de nucleotidos de longitud complete de canino es 1470 bp. La secuencia de polipeptidos de canino correspondiente tiene la secuencia de referencia NCBI: NM_001003228.1. La decorina de canino precursor del polipeptido de canino correspondiente tiene secuencia de referencia NCBI NP_001003228.1. La decorina precursor de canino es una protelna de 360 aminoacidos. La protelna es un proteoglicano de la matriz celular pequena o pericellular estrechamente relacionado en estructura a protelna biglicano y es un componente del tejido conectivo. La decorina se une a fibrillas del colageno de tipo I, y juega un papel en el ensamblaje de la matriz. Contiene una cadena de glicosaminoglicano adjunto. Se cree que esta protelna es capaz de suprimir el crecimiento de diversas llneas celulares del tumor. Un numero de variantes del transcrito de corte y empalme alternativamente se han identificado en la literatura cientlfica para este gen.
SEQ ID NO. 13 corresponde a una secuencia de acido nucleico felino homologa al ARNm del colageno del Equus caballus, tipo III, alfa 1 (slndrome de Ehlers Danlos tipo IV, dominante autosomico) (COL3A1). La secuencia se identifica por secuencia de referencia NCBI XM_001917620.1 en Gen ID 100034123. La secuencia de nucleotidos de longitud completa de equino es 5492 bp. La secuencia de polipeptido de equino correspondiente tiene la secuencia de referencia NCBI: XP_001917655. Colageno de equino, tipo III, alfa 1 (slndrome de Ehlers Danlos tipo IV, dominante autosomico) (COL3A1) es una protelna de 1466 aminoacidos. El colageno de tipo III en humanos es un colageno que forma fibrillas que comprende 3 cadenas alfa-1 (III) y se expresa en embriones tempranos y durante la embriogenesis. En el adulto, el colageno de tipo III es un componente principal de la matriz extracelular en una variedad de organos internos y la piel. Las mutaciones en el gen COL3A1, que codifica procolageno tipo III, causan el slndrome de Ehlers-Danlos tipo IV, una enfermedad que conduce a la rotura aortica en la vida adulta temprana.
SEQ ID NO. 14 corresponde a una secuencia de acido nucleico de felino homologa para ARNm de metaloproteinasa de la matriz-2 (MMP-2), de Canis familiaris. La secuencia se identifica por secuencia de referencia NCBI XM_535300.2 en Gen ID 4037333. La secuencia de nucleotidos de longitud completa de canino es 2618 bp. La secuencia de polipeptido equino correspondiente tiene la secuencia de referencia NCBI: XP_535300.2. MMP-2 de canino es una protelna de 612 aminoacidos. Esta colagenasa tipo IV es un miembro de un grupo de las metaloproteasas de zinc secretadas que, en los mamlferos, degradan los colagenos de la matriz extracelular. MMP2 tiene tres repeticiones de dominios de fibronectina de tipo II insertados en el dominio catalltico; vease la minirevision
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de metaloproteinasas de la matriz proporcionada por Nagase et al., J. Biol. Chem., 1999, vol. 274 (31): 2149121494.
SEQ ID NO. 15 corresponde a una secuencia de acido nucleico de felino para ARNm de Felis domesticus PUMP-1, cds parcial. La secuencia se identifica como secuencia de referencia NCBI FDU04444 en GeneBank: U04444.1. La secuencia de nucleotidos de longitud completa de felino PUMP-1 es 1001 bp. La secuencia del polipeptido de longitud completa PUMP-1 se identifica como secuencia de GenBank: AAA18222.1. PUMP-1 de felino es una protelna de 262 aminoacidos.
SEQ ID NO 16 corresponde a una secuencia de acido nucleico de felino homologa a la pronosticada: ARNm de metaloproteinasa de la matriz 19 de Macaca mulatta, transcrito variante 1 (MMP-19). La secuencia de mono rhesus se identifica como secuencia de referencia NCBI: XM_001111542.1. La secuencia de nucleotidos del mono rhesus de longitud total es 2182 bp. La secuencia de polipeptido de longitud completa se identifica como XP_001111542.1. El mono rhesus MMP-19 es una protelna de 485 aminoacidos.
Se debe entender en relacion con la discusion de los aspectos de la descripcion que la presente divulgacion contempla ademas combinaciones de biomarcadores que comprenden los genes y sus productos de expresion que se seleccionan del grupo que consiste en: protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 9); protelna 5 de union al retinol (rbp5) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 10); lumican (LUM) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 11); decorina (DCN) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 12); cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12 (COL3A1) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 13); metaloproteinasa de la matriz-2 (MMP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 14); metaloproteinasa de la matriz-7 (MMP7, PUMP-1) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 15); y metaloproteinasa de la matriz-19 (MMP19) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 16). Aspectos de la descripcion contemplan la construccion de paneles de biomarcadores a partir de diversas combinaciones de los dos grupos de genes y sus productos de expresion.
En ciertas realizaciones de la presente invention, el felino puede tener una funcion renal normal, tal como se define por las mediciones cllnicas reconocidas en la tecnica, por ejemplo, medicion de la filtration glomerular, depuration de creatinina, niveles de protelna en orina, niveles de creatinina en sangre, niveles de creatinina en orina y/o niveles de nitrogeno ureico en sangre, y los metodos de la invencion pueden ser usados para predecir, detectar y diagnosticar en tal felino un cambio de un estado normal a un estado anormal que conduce a un trastorno renal caracterizado por una funcion renal reducida, insuficiencia renal, medicion de la filtracion glomerular reducida y glomerulonefritis.
En otro aspecto preferido, el metodo de la descripcion se puede practicar por el uso de una matriz que detecta los cambios de expresion de genes, o el nivel o actividad de uno o mas genes, o sus productos de expresion, seleccionados del grupo que consiste en: protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID NO. 9); protelna 5 de union al retinol (rbp5) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 10); lumican (LUM) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 11); decorina (DCN) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 12); cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12 (COL3A1) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 13); metaloproteinasa de la matriz-2 (MMP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 14); metaloproteinasa de la matriz-7 (MMP7, PUMP-1) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 15); y metaloproteinasa de la matriz-19 (MMP19) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 16). En un metodo, tal matriz es una micromatriz de ADN. El nivel de actividad o expresion de uno o mas genes se puede determinar midiendo el producto de expresion de tales genes que puede ser un polinucleotido o un polipeptido o protelna. En la presente invencion, el producto del gen o de la expresion de genes es la protelna 2 secretada relacionada con Frizzled (SFRP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID NO: 9).
En otro aspecto preferido, el metodo de la descripcion puede ser practicado por el uso de una matriz que detecta los cambios de expresion de genes, o el nivel o actividad de uno o mas genes, o sus productos de expresion, seleccionado del grupo que consiste en: protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID NO. 9) y protelna 5 de union al retinol (rbp5) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 10); y, opcionalmente, un segundo grupo de al menos un polinucleotido seleccionado del grupo que consiste en: lumican (LUM) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 11); decorina (DCN) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 12); cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12 (COL3A1) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 13); metaloproteinasa de la matriz-2 (MMP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 14); metaloproteinasa de la matriz-7 (MMP7, PUMP-1) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 15); y metaloproteinasa de la matriz-19 (MMP19) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 16). En un metodo, tal matriz es una micromatriz de ADN. El nivel de actividad o expresion de uno o mas genes se puede determinar midiendo el producto de expresion de tales genes que puede ser un polinucleotido o un polipeptido o protelna. En la presente invencion, el producto del gen o la expresion de genes es la protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID NO: 9).
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En un aspecto, la descripcion incluye poner en contacto una muestra de tejido o una muestra de llquido corporal con un agente que detecta en un felino uno o mas genes o el producto de expresion de dichos uno o mas genes seleccionados del grupo que consiste en: protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID NO. 9); protelna 5 de union al retinol (rbp5) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 10); lumican (LUM) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 11); decorina (DCN) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 12); cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12 (COL3A1) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 13); metaloproteinasa de la matriz- 2 (MMP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 14); metaloproteinasa de la matriz-7 (MMP7, PUMP-1) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 15); y metaloproteinasa de la matriz-19 (MMP19) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 16). El agente puede ser un anticuerpo o una sonda de acido nucleico utilizada junto con medios de ensayo convencional tales como inmovilizacion en una fase solida, pozos de microtitulacion, tubos, varillas de inmersion u otros medios convencionales. En la presente invention, el producto del gen o la expresion de genes es protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID NO: 9).
En otro aspecto, la descripcion incluye poner en contacto una muestra de tejido o una muestra de fluido corporal con un agente que detecta en un felino uno o mas genes o el producto de expresion de dichos uno o mas genes seleccionados del grupo que consiste en: protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID NO. 9) y protelna 5 de union al retinol (rbp5) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 10); y, opcionalmente, un segundo grupo de al menos un polinucleotido seleccionado del grupo que consiste en: lumican (LUM) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 11); decorina (DCN) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 12); cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12 (COL3A1) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 13); metaloproteinasa de la matriz-2 (MMP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 14); metaloproteinasa de la matriz-7 (MMP7, PUMP-1) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No.
15) ; y metaloproteinasa de la matriz-19 (MMP 19) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No.
16) . El agente puede ser un anticuerpo o una sonda de acido nucleico utilizada junto con medios del ensayo convencional tales como la inmovilizacion en una fase solida, pozos de microtitulacion, tubos, varillas de inmersion u otros medios convencionales. En la presente invencion, el producto del gen o la expresion de genes es la protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID NO: 9).
Otra realization del metodo de la invencion abarca el uso de medios de ensayo convencionales para determinar la expresion de genes en un felino, ya sea solo o en combination con exploraciones de matriz de expresion de genes que emplean polipeptidos y/o polinucleotidos, tales medios de ensayo convencional que comprenden uno o mas de ELISA, RIA, ensayos de inmunotransferencia, hibridacion in situ, analisis de transferencia Northern, analisis de transferencia Western y analisis de Luminex X-Map®.
Un aspecto adicional de la descripcion es que se relaciona con la identification de nuevos biomarcadores de un trastorno renal en felinos, as! como metodos de detection de un trastorno renal en dichos felinos basado en un patron caracterlstico de la expresion de genes de tales biomarcadores in vivo. Especlficamente, los metodos de la descripcion comprenden detectar la expresion diferencial, en comparacion con un nivel de expresion de control, de al menos un biomarcador, en una muestra corporal, preferiblemente una muestra de sangre, en donde la deteccion de la expresion diferencial de tales biomarcadores identifica especlficamente a felinos que tienen glomerulonefritis. Por lo tanto, estos metodos se basan en la deteccion de al menos un biomarcador que se expresa diferencialmente en un felino que tiene un trastorno renal en comparacion con las celulas de los animales normales o de control. Los biomarcadores son protelnas y/o acidos nucleicos que se expresan diferencialmente en un felino que tiene o propensos a desarrollar un trastorno renal anormal, en particular un trastorno renal. En un aspecto el patron de expresion de genes comprende al menos un transcrito de ARN o de su producto de traduction seleccionado de un grupo de al menos un gen o el producto de la traduccion de dicho gen seleccionado del grupo que consiste en: protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID NO. 9); protelna 5 de union al retinol (rbp5) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 10); lumican (LUM) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 11); decorina (DCN) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 12); cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12 (COL3A1) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 13); metaloproteinasa de la matriz-2 (MMP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 14); metaloproteinasa de la matriz-7 (MMP7, PUMP-1) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 15); y metaloproteinasa de la matriz-19 (MMP19) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 16). En una realizacion preferida, el diferencial es al menos aproximadamente una desviacion estandar alrededor de la media. En una realizacion mas preferida, el diferencial es al menos aproximadamente un diferencial de 2 pliegues. En la presente invencion, el producto del gen o la expresion de genes es la protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No: 9).
Un aspecto adicional de la descripcion es que se relaciona con la identificacion de nuevos biomarcadores de un trastorno renal en felinos, as! como metodos de deteccion de un trastorno renal en tales felinos basado en un patron caracterlstico de la expresion de genes de tales biomarcadores in vivo. En concreto, los metodos comprenden la deteccion de la expresion diferencial, en comparacion con un nivel de expresion de control, de al menos un
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biomarcador, en una muestra corporal, preferiblemente una muestra de sangre, en donde la detection de la expresion diferencial de tales biomarcadores identifica especlficamente a felinos que tienen glomerulonefritis. Por lo tanto, estos metodos se basan en la deteccion de al menos un biomarcador que se expresa diferencialmente en un felino que tiene un trastorno renal en comparacion con las celulas de los animales normales o de control. Los biomarcadores son protelnas y/o acidos nucleicos que se expresan diferencialmente en un felino que tiene o propensos a desarrollar un trastorno renal anormal, en particular un trastorno renal. En un aspecto el patron de expresion de genes comprende al menos un transcrito de ARN o su producto de traduction seleccionado de un primer grupo de al menos un gen o el producto de la traduccion de dicho gen seleccionado del grupo que consiste en: protelna 2 secretada relacionada con Frizzled (SFRP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID NO. 9) y protelna 5 de union al retinol (rbp5) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 10); y, opcionalmente, un segundo grupo de al menos un polinucleotido seleccionado del grupo que consiste en: lumican (LUM) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 11); decorina (DCN) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 12); cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12 (COL3A1) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 13); metaloproteinasa de la matriz-2 (MMP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 14); metaloproteinasa de la matriz-7 (MMP7, PUMP-1) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 15); y metaloproteinasa de la matriz-19 (MMP19) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 16). En un aspecto preferido, el diferencial es al menos aproximadamente una desviacion estandar alrededor de la media. En una realization mas preferida, el diferencial es al menos aproximadamente un diferencial de 2 pliegues. En la presente invention, el producto del gen o la expresion de genes es la protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID NO: 9).
Sin embargo, un aspecto adicional de la description se relaciona con: biomarcadores de glomerulonefritis en felinos que comprenden al menos un transcrito de ARN o de su producto de traduccion seleccionado del grupo que consiste en: protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID NO. 9); protelna 5 de union al retinol (rbp5) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 10); lumican (LUM) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 11); decorina (DCN) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 12); cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12 (COL3A1) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 13); metaloproteinasa de la matriz-2 (MMP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 14); metaloproteinasa de la matriz-7 (MMP7, PUMP-1) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 15); y metaloproteinasa de la matriz-19 (MMP19) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 16). En otra realizacion, el biomarcador o biomarcadores se utilizan para detectar la glomerulonefritis. En una realizacion preferida, el biomarcador o biomarcadores anteriores se utilizan para diferenciar las fases de glomerulonefritis en un felino. En la presente invencion, el producto del gen o la expresion de genes es la protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID NO: 9).
Sin embargo, un aspecto adicional de la descripcion se relaciona con: biomarcadores de glomerulonefritis en felinos que comprenden al menos un transcrito de ARN o de su producto de traduccion seleccionado del grupo que consiste en: protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID NO. 9) y protelna 5 de union al retinol (rbp5) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 10); y, opcionalmente, un segundo grupo de al menos un polinucleotido seleccionado del grupo que consiste en: lumican (LUM) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 11); decorina (DCN) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 12); cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12 (COL3A1) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 13); metaloproteinasa de la matriz-2 (MMP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 14); metaloproteinasa de la matriz-7 (MMP7, PUMP-1) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 15); y metaloproteinasa de la matriz-19 (MMP19) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 16). En otro aspecto el biomarcador o biomarcadores se utilizan para detectar la glomerulonefritis. En un aspecto preferido, el biomarcador o biomarcadores anterior se utilizan para diferenciar las fases de glomerulonefritis en un felino. En la presente invencion, el producto del gen o la expresion de genes es la protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID NO: 9).
En un aspecto adicional, la descripcion se relaciona con composiciones que comprenden una o mas sondas de acido nucleico que hibridan especlficamente con un acido nucleico, o fragmento de la misma, que codifica un biomarcador de la presente invencion seleccionado del grupo que consiste en: protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 9); protelna 5 de union al retinol (rbp5) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 10); lumican (LUM) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 11); decorina (DCN) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 12); cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12 (COL3A1) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 13); metaloproteinasa de la matriz-2 (MMP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 14); metaloproteinasa de la matriz-7 (MMP7, PUMP-1) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 15); y metaloproteinasa de la matriz-19 (MMP19) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 16). En la presente invencion, el producto del gen o la expresion de genes es la protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID NO: 9).
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En un aspecto adicional, la description se relaciona con composiciones que comprenden una o mas sondas de acido nucleico que hibridan especlficamente con un acido nucleico, o fragmento de la misma, que codifica un biomarcador de la presente invention seleccionada del grupo que consiste en: protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID NO. 9) y protelna 5 de union al retinol (rbp5) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 10); y, opcionalmente, un segundo grupo de al menos un polinucleotido seleccionado del grupo que consiste en: lumican (LUM) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 11); decorina (DCN) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 12); cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12 (COL3A1) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 13); metaloproteinasa de la matriz-2 (MMP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 14); metaloproteinasa de la matriz-7 (MMP7, PUMP-1) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 15); y metaloproteinasa de la matriz-19 (MMP19) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 16). En la presente invencion, el producto del gen o la expresion de genes es la protelna 2 secretada relacionada con Frizzled (SFRP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID NO: 9).
En un aspecto adicional, la descripcion se relaciona con composiciones que comprenden anticuerpos que se unen especlficamente a un polipeptido codificado por un gen que expresa un biomarcador de la presente invencion seleccionado del grupo que consiste en: protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID NO. 9); protelna 5 de union al retinol (rbp5) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 10); lumican (LUM) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 11); decorina (DCN) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 12); cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12 (COL3A1) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 13); metaloproteinasa de la matriz-2 (MMP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 14); metaloproteinasa de la matriz-7 (MMP7, PUMP-1) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 15); y metaloproteinasa de la matriz-19 (MMP19) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 16). En la presente invencion, el producto del gen o la expresion de genes es la protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID NO: 9).
En un aspecto adicional, la descripcion se relaciona con composiciones que comprenden anticuerpos que se unen especlficamente a un polipeptido codificado por un gen que expresa un biomarcador de la presente invencion seleccionado del grupo que consiste en: proteina 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID NO. 9) y proteina 5 de union al retinol (rbp5) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 10); y, opcionalmente, un segundo grupo de al menos un polinucleotido seleccionado del grupo que consiste en: lumican (LUM) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 11); decorina (DCN) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 12); cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12 (COL3A1) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 13); metaloproteinasa de la matriz-2 (MMP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 14); metaloproteinasa de la matriz-7 (MMP7, PUMP-1) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No.
15) ; y metaloproteinasa de la matriz-19 (MMP 19) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No.
16) . En la presente invencion, el producto del gen o la expresion de genes es la proteina 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID NO: 9).
Se contempla ademas en este documento que los metodos de la presente descripcion se pueden utilizar en combination con las tecnicas tradicionales de diagnostico que son capaces de detectar las caracteristicas fisicas y morfologicas de trastornos renales. Asi, por ejemplo, la caracterizacion de la expresion diferencial en los genes para el rinon en celulas obtenidas de una muestras de tejido o muestras de liquido corporal de un felino se pueden combinar con las tecnicas convencionales de diagnostico (por ejemplo, radiologicos) con el fin de corroborar un diagnostico de un trastorno renal en un felino, incluyendo, por ejemplo, la glomerulonefritis.
Un aspecto adicional de la descripcion es un metodo para el diagnostico y/o pronostico de trastorno renal en un felino, en donde el metodo comprende las etapas de: obtener al menos una muestra de tejido o una muestra de liquido corporal del animal; determinar la cantidad del uno o mas biomarcadores seleccionados de la Tabla 3 en dicha al menos una muestra o especimen procedentes del animal, en donde dicho biomarcador es un polipeptido, proteina, ARN, ADN, polinucleotido o metabolito del mismo.
Incluso otro aspecto de la descripcion es un kit para el diagnostico y/o pronostico de un trastorno renal en un felino, en particular para la realization del metodo para el diagnostico y/o pronostico de la glomerulonefritis en un felino en donde el metodo comprende las etapas de: obtener al menos una muestra de tejido o una muestra de liquido corporal del animal; determinar la cantidad del uno o mas biomarcadores seleccionados de la Tabla 3 en dicha al menos una muestra o especimen procedentes del animal, en donde dicho biomarcador es un polipeptido, proteina, ARN, ADN, polinucleotido o metabolito del mismo, y opcionalmente, que comprende ademas un detectable agente ligado a dicho biomarcador.
Todavia otro aspecto de la descripcion es un reactivo para el diagnostico y/o pronostico de glomerulonefritis en un felino en particular para la realizacion del metodo para el diagnostico y/o pronostico de glomerulonefritis en un felino, en donde el metodo comprende las etapas de: obtener al menos una muestra de tejido o una muestra de liquido corporal del animal; determinar la cantidad del uno o mas biomarcadores seleccionados de la Tabla 3, en dicha al
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menos una muestra o especimen procedente de un felino, en donde dicho biomarcador es un polipeptido, protelna, ARN, ADN, polinucleotido o metabolito del mismo, y que comprende opcionalmente ademas un agente detectable unido a dicho biomarcador.
Un aspecto adicional de la description es un metodo para el diagnostico y/o pronostico del trastorno renal en un felino, en donde el metodo comprende las etapas de: obtener al menos una muestra de tejido o una muestra de llquido corporal del animal; determinar la cantidad del uno o mas biomarcadores seleccionados de las Tablas 3 y 4 en dicha al menos una muestra o especimen procedentes del animal, en donde dicho biomarcador es un polipeptido, protelna, ARN, ADN, polinucleotido o metabolito del mismo.
Incluso otro aspecto de la descripcion es un kit para el diagnostico y/o pronostico de un trastorno renal en un felino, en particular para la realization del metodo para el diagnostico y/o pronostico de la glomerulonefritis en un felino en donde el metodo comprende las etapas de: obtener al menos una muestra de tejido o una muestra de llquido corporal del animal; determinar la cantidad del uno o mas biomarcadores seleccionados de las Tablas 3 y 4 en dicha al menos una muestra o especimen procedentes del animal, en donde dicho biomarcador es un polipeptido, protelna, ARN, ADN, polinucleotido o metabolito del mismo, y opcionalmente, que comprende ademas un agente detectable unido a dicho biomarcador.
Todavla otro aspecto de la descripcion es un reactivo para el diagnostico y/o pronostico de la glomerulonefritis en un felino en particular para la realizacion del metodo para el diagnostico y/o pronostico de la glomerulonefritis en un felino, en donde el metodo comprende las etapas de: obtener al menos una muestra de tejido o una muestra de llquido corporal del animal; determinar la cantidad del uno o mas biomarcadores seleccionados de las Tablas 3 y 4 en dicha al menos una muestra o especimen procedente de un felino, en donde dicho biomarcador es un polipeptido, protelna, ARN, ADN, polinucleotido o metabolito del mismo, y opcionalmente, que comprende ademas un agente detectable unido a dicho biomarcador.
Otro aspecto de la descripcion es el uso de uno o mas polipeptidos, protelnas, ARN, ADN, polinucleotidos o metabolitos de los mismos seleccionados del grupo que consiste en: protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID NO. 9); protelna 5 de union al retinol (rbp5) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 10); lumican (LUM) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 11); decorina (DCN) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 12); cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12 (COL3A1) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 13); metaloproteinasa de la matriz-2 (MMP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 14); metaloproteinasa de la matriz-7 (MMP7, PUMP-1) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 15); y metaloproteinasa de la matriz-19 (MMP19) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 16) como un biomarcador para el diagnostico y/o pronostico de glomerulonefritis, en particular para formar un kit para el diagnostico o pronostico de glomerulonefritis en un felino. En la presente invention, el uno o mas polipeptidos, protelnas, ARN, ADN, polinucleotidos o metabolitos de los mismos, son protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID NO: 9).
Otro aspecto de la descripcion es el uso de uno o mas polipeptidos, protelnas, ARN, ADN, polinucleotidos o metabolitos de los mismos seleccionado del grupo que consiste en: protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 9) y protelna 5 de union al retinol (rbp5) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 10); y, opcionalmente, un segundo grupo de al menos un polinucleotido seleccionado del grupo que consiste en: lumican (LUM) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 11); decorina (DCN) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 12); cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12 (COL3A1) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 13); metaloproteinasa de la matriz-2 (MMP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 14); metaloproteinasa de la matriz-7 (MMP7, PUMP-1) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 15); y metaloproteinasa de la matriz- 19 (MMP19) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 16) como un biomarcador para el diagnostico y/o pronostico de glomerulonefritis, en particular para formar un kit para el diagnostico o pronostico de glomerulonefritis en un felino. En la presente invencion, el uno o mas polipeptidos, protelnas, ARN, ADN, polinucleotidos o metabolitos de los mismos, son protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID NO: 9).
Otro aspecto de la descripcion es el uso de uno o mas polipeptidos, protelnas, ARN, ADN, polinucleotidos o metabolitos de los mismos seleccionado del grupo que consiste en: protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID NO. 9); protelna 5 de union al retinol (rbp5) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 10); lumican (LUM) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 11); decorina (DCN) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 12); cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12 (COL3A1) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 13); metaloproteinasa de la matriz-2 (MMP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 14); metaloproteinasa de la matriz-7 (MMP7, PUMP-1) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 15); y metaloproteinasa de la matriz-19 (MMP19) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 16) como un biomarcador para el diagnostico y/o pronostico de un trastorno renal, en particular para formar un kit para el diagnostico o pronostico de un trastorno renal en un felino. En la presente invencion, el uno o mas polipeptidos,
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protelnas, ARN, ADN, polinucleotidos o metabolitos de los mismos, son protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID NO: 9).
Otro aspecto de la descripcion es el uso de uno o mas polipeptidos, protelnas, ARN, ADN, polinucleotidos o metabolitos de los mismos seleccionados del grupo que consiste en: protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID NO. 9) y protelna 5 de union al retinol (rbp5) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 10); y, opcionalmente, un segundo grupo de al menos un polinucleotido seleccionado del grupo que consiste en: lumican (LUM) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 11); decorina (DCN) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 12); cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12 (COL3A1) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 13); metaloproteinasa de la matriz-2 (MMP2) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 14); metaloproteinasa de la matriz-7 (MMP7, PUMP-1) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 15); y metaloproteinasa de la matriz-19 (MMP19) o un homologo de felino o fragmento de la misma (SEQ ID No. 16) como un biomarcador para el diagnostico y/o pronostico de un trastorno renal, en particular para formar un kit para el diagnostico o pronostico de un trastorno renal en un felino.
Incluso otro aspecto es tal kit, en donde los reactivos y equipos comprenden materiales de analisis de micromatriz de ADN incluyendo micromatriz de oligonucleotidos, micromatriz ADNc, y chip de gen focalizado, o una combinacion de los mismos.
Otros objetos, caracterlsticas y ventajas de la presente invencion seran facilmente evidentes para los expertos en la tecnica. A lo largo de esta divulgacion, diversos aspectos de esta invencion pueden ser presentados en un formato de rango. Se debe entender que la descripcion en formato de rango es meramente por conveniencia y brevedad, y no debe interpretarse como una limitacion inflexible sobre el alcance de la invencion. De acuerdo con lo anterior, la descripcion de un rango se debe considerar que ha revelado especlficamente todos los posibles subrangos, as! como valores numericos individuales dentro de ese rango. Por ejemplo, la descripcion de un rango tal como de 1 a 5 se debe considerar que se han descrito especlficamente subrangos tales como de 1 a 3, de 1 a 4.
La practica de la presente invencion puede emplear, a menos que se indique lo contrario, tecnicas convencionales y descripciones de la qulmica organica, tecnologla de pollmeros, biologla molecular (incluyendo tecnicas recombinantes), biologla celular, bioqulmica, e inmunologla, que estan dentro de la experiencia de la tecnica. Tales tecnicas convencionales incluyen la slntesis de pollmeros de matriz, hibridacion, ligamiento, y deteccion de la hibridacion utilizando una etiqueta. Ejemplos especlficos de las tecnicas apropiadas se pueden tener por referencia al ejemplo en este documento a continuacion. Sin embargo, otros procedimientos convencionales equivalentes pueden, por supuesto, tambien se pueden utilizar. Tales tecnicas y descripciones convencionales se pueden encontrar en los manuales estandar de laboratorio tales como: Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. 1-IV); Utilizando anticuerpos: A Laboratory Manual; Cells: A Laboratory Manual; Cebador PCR: A Laboratory Manual, and Molecular Cloning: A Laboratory Manual (todos de Cold Spring Harbor Laboratory Press); Stryer, L. (1995) Biochemistry (4th Ed.) Freeman, New York; Gait, "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach" 1984, IRL Press, London, Nelson and Cox (2000); Lehninger, Principles of Biochemistry 3rd Ed., W.H. Freeman Pub., New York, N.Y; and Berg et al. (2002) Biochemistry, 5th Ed., W.H. Freeman Pub., New York, N.Y., todos los cuales se incorporan en este documento en su totalidad como referencia para todos los propositos.
Las matrices de acido nucleico que son utiles en la presente invencion incluyen los que estan disponibles comercialmente de Affymetrix (Santa Clara, Calif.) bajo la marca comercial GeneChip®. Ejemplos de matrices se muestran en el sitio web de Affymetrix. com.
La presente invencion tambien contempla muchos usos para los pollmeros unidos a sustratos solidos. Estos usos incluyen el seguimiento de la expresion de genes, perfilado, analisis de bibliotecas, genotipado y diagnostico. Seguimiento de la expresion de genes y metodos de perfiles se pueden mostrar en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,800,992, 6,013,449, 6,020,135, 6,033,860, 6,040,138, 6,177,248, 6,309,822 y 6,344,316. Genotipificacion y usos, por lo tanto se muestran en U.S. Ser. No. 60/319,253, 10/013,598, y las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,856,092, 6,300,063, 5,858,659, 6,284,460, 6,361,947, 6,368;799 y 6,333,179. Otros usos estan incorporados en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,871,928, 5,902,723, 6,045,996, 5,541,061, y 6,197,506.
Los expertos en la tecnica reconoceran que los productos y metodos incorporados en la presente invencion se pueden aplicar a una variedad de sistemas, incluyendo sistemas de seguimiento de la expresion de genes disponibles comercialmente que implican matrices de sondas de acido nucleico, transferencias de membrana, micropozos, perlas y tubos de muestra, construidos con diversos materiales, utilizando diversos metodos conocidos en la tecnica. De acuerdo con lo anterior, la presente invencion no se limita a ningun entorno particular, y la siguiente descripcion de realizaciones especlficas de la presente invencion es solo con fines ilustrativos.
El sistema de seguimiento de la expresion de genes, en una realizacion preferida, puede comprender una matriz de sondas de acido nucleico (incluyendo una matriz de oligonucleotidos, una matriz de ADNc, una matriz de puntos, y similares), transferencia de membrana (tal como se utiliza en analisis de hibridacion tales como Northern, Southern,
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dot, y similares), o micropozos, tubos de muestra, perlas o fibras (o cualquier soporte solido que comprende acidos nucleicos unidos). Veanse las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,770,722, 5,744,305, 5,677,195, 5,445,934 y 6,040,193, que se incorporan en este documento por referencia. El sistema de seguimiento de la expresion de genes tambien puede comprender sondas de acido nucleico en solucion.
La presente invencion tambien contempla la preparacion de muestras que implica la amplificacion. Una muestra genomica puede ser amplificada por una variedad de mecanismos, algunos de los cuales pueden emplear PCR. Vease, por ejemplo, Tecnologla de PCR: Principios y Aplicaciones para la Amplificacion de ADN (Ed. H. A. Erlich, Freeman Press, NY, N.Y., 1992); Protocolos de pCr: A Guide to Methods and Applications (Eds. Innis, et al., Academic Press, San Diego, Calif., 1990); Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19, 4967 (1991); Eckert et al., PCR Methods and Applications 1, 17 (1991); PCR (Eds. McPherson et al., IRL Press, Oxford); y las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,683,202, 4,683,195, 4,800,159 4,965,188, y 5,333,675, y cada uno de los cuales se incorpora en este documento por referencia en su totalidad para todos los propositos. La muestra se puede amplificar en la matriz. Vease, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 6,300,070 y la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Serie No. 09/513,300, que se incorporan en este documento por referencia.
Otros metodos de amplificacion apropiados incluyen la reaccion en cadena de la ligasa (LCR) (por ejemplo, Wu and Wallace, Genomics 4, 560 (1989), Landegren et al., Science 241, 1077 (1988) y Barringer et al. Gen 89:117 (1990)), amplificacion de la transcripcion (Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173 (1989) y WO88/10315), replicacion de secuencia autosostenida (Guatelli et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87, 1874 (1990) y WO90/06995), amplificacion selectiva de secuencias de polinucleotidos diana (Patente de los Estados Unidos No. 6,410,276), reaccion en cadena de la polimerasa cebado de secuencia de consenso (CP-PCR) (Patente de los Estados Unidos No. 4,437,975), reaccion en cadena de la polimerasa cebada arbitrariamente (AP-PCR) (Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,413,909, 5,861,245) y amplificacion de secuencias basada en acidos nucleicos (NABSA). (Veanse, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,409,818,5,554,517 y 6,063,603, cada una de las cuales se incorpora en este documento por referencia). Otros metodos de amplificacion que pueden usarse se describen en, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,242,794, 5,494,810, 4,988,617, 6,344,316 cada una de las cuales se incorpora en este documento por referencia.
Los metodos adicionales de tecnicas y preparacion de muestras se describen en Dong et al., Genome Research 11, 1418 (2001), en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,361,947, 6,391,592 y la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Serie. Nos. 09/916,135, 09/920,491, 09/910,292 y 10/013,598.
El sistema de seguimiento de la expresion de genes de acuerdo con la presente invencion se puede utilizar para facilitar un analisis comparativo de expresion en diferentes celulas o tejidos, diferentes subpoblaciones de las mismas celulas o tejidos, diferentes estados fisiologicos de las mismas celulas o tejidos, distintas etapas de desarrollo de las mismas celulas o tejidos, o diferentes poblaciones de celulas del mismo tejido. En una realizacion preferida, los metodos de amplificacion proporcional de la presente invencion pueden proporcionar resultados reproducibles (esto es, dentro de unos margenes estadlsticamente significativos de error o grados de confianza) suficiente para facilitar la medicion diferencias cuantitativas, as! como cualitativas en las muestras ensayadas.
Los ensayos de hibridacion de polinucleotidos son bien conocidos en la tecnica. Los procedimientos y las condiciones de ensayo de hibridacion pueden variar dependiendo de la aplicacion y se seleccionan de acuerdo con los metodos de union generales conocidos incluyendo los mencionados en: Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed. Cold Spring Harbor, N.Y, 1989); Berger and Kimmel Methods in Enzymology, Vol. 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (Academic Press, Inc., San Diego, Calif., 1987); Young and Davis, P.N.A.S, 80: 1194 (1983). Metodos y aparatos para llevar a cabo reacciones de hibridacion repetida y controlados han sido descritos en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,871,928, 5,974,219, 6,045,996, 6,386,749 y 6,391,623 cada una de las cuales se incorporan en este documento como referencia. La deteccion de la senal de hibridacion entre ligandos en ciertas realizaciones preferidas. Veanse las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,143,854, 5,578,832, 5,631,734, 5,834,758, 5,936,324, 5,981,956, 6,025,601, 6,141.096, 6,185,030, 6,201,639, 6,218,803 y 6,225,625, en la Solicitud de la Patente de los Estados Unidos 60/364,731 y en la Solicitud PCT PCT/US99/06097 (publicado como WO99/47964), cada uno de los cuales tambien se incorpora por referencia en su totalidad para todos los propositos. Metodos y aparatos para la deteccion de senal y el tratamiento de los datos de intensidad se revelan en, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,143,854, 5,547,839, 5,578,832, 5,631,734, 5,800,992, 5,934,758; 5,856,092, 5,902,723, 5,936,324, 5,981,956, 6,025,601, 6,090,555, 6,141,096, 6,185,030, 6,201,639; 6,218,803; y 6,225,625, en la Solicitud de la Patente de los Estados Unidos 60/364,731 y en la Solicitud PCT PCT/US99/06097 (publicada como WO99/47964), cada uno de los cuales tambien se incorpora en este documento por referencia en su totalidad para todos los propositos.
La invencion no se limita a la metodologla particular, protocolos y reactivos descritos en este documento, ya que pueden variar. Ademas, la terminologla usada en este documento es para el proposito de describir solamente realizaciones particulares y no pretende limitar el alcance de la presente invencion.
Todas las patentes, solicitudes de patentes, publicaciones y otras referencias citadas o mencionadas en este documento se incorporan al presente por referencia en la medida permitida por la ley. La discusion de estas
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referencias pretende limitarse a resumir las afirmaciones hechas en el mismo. No se hace admision de que cualquiera de esas patentes, solicitudes de patentes, publicaciones o referencias, o cualquier parte del mismo, es la tecnica pertinente para la presente invention y el derecho de cuestionar la exactitud y pertinencia de dichas patentes, solicitudes de patentes, publicaciones y otras referencias esta reservado especlficamente.
Como se utiliza hasta el final, los rangos se utilizan como una forma abreviada para describir todos y cada valor que esta dentro del rango. Cualquier valor dentro del rango se puede seleccionar como el terminal del rango. Ademas, todas las referencias citadas en este documento se incorporan por referencia en su totalidad. En el caso de un conflicto en una definition en la presente divulgation y la de una referencia citada, la presente divulgation controla.
Ejemplos
Ejemplo 1: Clasificacion de los felinos con enfermedad renal cronica de acuerdo con las directrices de la Sociedad Internacional renal interes.
En los ejemplos que siguen, los felinos que presentan signos cllnicos de la enfermedad renal cronica se evaluaron frente a los animales que no presentan signos ni slntomas de la enfermedad renal cronica. Los diagnosticos patologicos de la enfermedad renal cronica se hicieron en base a los criterios establecidos en las Tablas 1 y 2 a continuation y de acuerdo con las directrices de la Sociedad Internacional de interes renal (IRIS).
La estadificacion de la enfermedad renal cronica (CDK) se lleva a cabo tras el diagnostico de CDK con el fin de facilitar el tratamiento y seguimiento apropiado del sujeto animal. La estadificacion se basa inicialmente en la creatinina en plasma en ayunas, evaluado en al menos dos ocasiones en el animal estable. Los felinos que muestran una funcion renal normal y sin signos cllnicos o slntomas de CKD se agruparon como felinos sin enfermedad. La etapa 1 en los felinos corresponde a las clasificaciones anteriores de la enfermedad renal temprana sin evidencia bioqulmica de CDK a insuficiencia renal, donde se detecta ninguna azotemia, pero donde la medicion de la filtration glomerular (GFR) se puede reducir y puede haber una pobre capacidad de concentration de los rinones. Etapa 2 corresponde a la clasificacion anterior de la insuficiencia renal temprana. En la etapa 2, se observa azotemia leve. Etapa 3 corresponde a la clasificacion anterior de la insuficiencia renal uremica, donde se detecta azotemia moderada. Los signos sistemicos de insuficiencia renal uremica pueden estar presentes tales como dolor de huesos, gastritis uremica, anemia y acidosis metabolica. Etapa 4 corresponde a insuficiencia renal terminal, que se caracteriza por azotemia grave y aumento de los signos cllnicos sistemicos de la crisis uremica.
La Tabla 1 identifica las cinco categorlas de los felinos estudiados, respectivamente. Se estudiaron un total de 42 felinos diagnosticados como que no tienen CDK. Un total de 14 felinos de la etapa 1 exhibio glomerulonefritis minima (GN). El numero de felinos estudiado que mostro estadios avanzados de CDK fue: Etapa 2 GN leve = 24; Etapa 3 GN moderada = 8 y Etapa 4 GN marcada = 13. Los niveles plasmaticos de creatinina para cada uno de los grupos de felinos se muestran en la Tabla 2 como niveles de la media y la mediana de creatinina en plasma para cada grupo de felinos.
Tabla 1: Estadificacion de los felinos
Estadificacion IRIS de CDK
Rango de creatinina en plasma mg/dl
Sin enfermedad
<1.6 con ninguna evidencia firme de la enfermedad
Etapa 1
<1.6 (<140 mmol/1) con evidencia de enfermedad. No azotemico. Algunas otras anomalias renales presentes (por ejemplo, la capacidad de concentracion inadecuada sin causa identificable no renal; palpation renal anormal y/o hallazgos de imagenes renales; proteinuria de origen renal; biopsia renal anormal
Etapa 2
1.6 a 2.8 (140-249 pmol/1) Azotemia renal leve. Signos cllnicos habituales leves o ausentes.
Etapa 3
2.9 a 5.0 (250-439 pmol/1) Azotemia renal moderada. Muchos signos cllnicos pueden estar presentes.
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Estadificacion IRIS de CDK
Rango de creatinina en plasma mg/dl
Etapa 4
>5.0 (>440 mmol/1) Azotemia renal grave. Muchos signos cllnicos extrarrenales presentes.
Tabla 2: Niveles de creatinina en plasma
Diagnostico patologico
Media de creatinina en plasma mg/dl Mediana de creatinina en plasma mg/dl
Sin enfermedad (n = 15)
1.3 1.0
GN minima (n = 4)
1.4 1.5
GN leve (n = 10)
2.4 1.8
GN Moderada (n = 20)
3.8 2.6
GN Marcada (n = 13)
7.1 7.1
Ejemplo 2: Criterios de seleccion de candidatos.
En los ejemplos que siguen a la presentacion de informes sobre los felinos para el cual los datos de expresion de genes se obtuvo mediante el analisis de micromatriz de ADN, se establecieron los criterios de seleccion con el fin de identificar ciertos genes y protelnas expresadas como marcadores biologicos apropiados de la enfermedad renal cronica, y, en consecuencia, la glomerulonefritis. Con el fin de ser identificado como un marcador biologicamente significativo de CDK, se determino el perfil de expresion de genes para exigir que: (1) el gen sea una protelna excretada; (2) debe haber un nivel de expresion diferencial entre animales normales evidenciando sin signos cllnicos o slntomas de glomerulonefritis y animales que acrediten signos mlnimo, leve, moderado o marcado (Etapa 1 a 4, respectivamente) de CKD de al menos 2 pliegues (expresion inducida o inhibida); (3) los niveles de expresion de genes se deben correlacionar con la progresion de la enfermedad de minima a leve, moderada y marcada (Etapas 1 a 4); y (4) hay al menos una desviacion estandar alrededor de la media entre los animales sin enfermedad y los animales moderados. El criterio de seleccion de este ultimo se basa en la observacion de que los chips de genes de micromatriz son dispositivos semicuantitativos y que analisis de multiples matrices (RMA) robustos a escala logarltmica se utilizan para la normalizacion de los datos.
Un trabajador experto puede seleccionar entre una serie de algoritmos para el analisis de datos del chip de genes. Estos incluyen algoritmo estadlstico MASS, la sonda de estimacion de error de intensidad logarltmica (PLIER) y el analisis multi-chip robusto (RMA). Los algoritmos de procesamiento se discuten en detalle en las siguientes referencias: Li, C. Mo, 2001, Model-based analysis of oligonucleotide arrays: expression index computation and outlier detection, Proc. Acad. Sci., Vol. 98:31-36; Irizarry R.A. et al., Exploration, normalization and summaries of high density oligonucleotide array probe level data, Biostatistics, 2003, Vol. 4:249-264; Irizarry et al., Summaries of Affymetrix GeneChip probe level data, Nucleic Acid Res., 2003, Vol. 31(4): e15; and Fan, W., A et al., A class f models for analyzing GeneChip gene expression analysis array data, BMC Genomics, 2005, Vol. 16: 6-16; Zhou, L et al., An expression index for Affymetrix GeneChips based on the generalized logarithm, Bioinformatics, 2005, Vol. 21(21): 3983-3989 and Hein A.K. et al., BGX: a fully Bayesian integrated approach to the analysis of Affymetrix GeneChip data, Biostatistics, 2005, Vol. 6: 349-373.
Los datos en bruto en los siguientes ejemplos se analizaron utilizando el software GeneSpring version 7.0 (GS) (Agilent Corporation) y se validaron utilizando el software de distribucion libre R-Bioconductor (RB). Ambos paquetes de software se utilizan para calcular intensidades de la sonda de los archivos CEL generados por el instrumento Affymetrix. Las llamadas Ausente/Presente/marginal por sonda y los valores-p se calcularon utilizando el software R- Bioconductor y GeneSpring por separado.
Se determina que los datos de expresion de genes son ya sea de expresion "inducida" o "inhibida" para cualquier analisis dado. La decision de si un gen esta "inducido" o "inhibido" se basa en el nivel de cambio, que se calcula como la intensidad del tratamiento/intensidad control para cada sonda individual. El nivel de cambio se considera de expression inhibida si su valor es <1/2 y es inducida si es > 2.0. Tambien, una sonda se considera significativa para
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un examen mas detallado si se llama como presente en solo una de las condiciones que se comparan (tratamiento o control) y es "ausente" o "marginal" en la otra y el nivel de cambio es significativo de acuerdo con el software utilizado.
Ejemplo 3: Procedimientos de aislamiento de ARN.
Materiales y Metodos. Los siguientes procedimientos generales se pueden utilizar para aislar el ARN de muestras de tejidos de felinos y felinos para perfiles de expresion de genes que utilizan chips de genes, como se describe adicionalmente en los Ejemplos de esta descripcion. Sera evidente para una persona de experiencia ordinaria en el arte que estos procedimientos o modificaciones de la misma, como se reconoce en la tecnica, se puede aplicar para aislar ARN a partir de muestras de tejido o de llquido corporal para el analisis adicional de expresion de genes utilizando una variedad de procedimientos anallticos disponibles para una persona de experiencia ordinaria en el arte, en particular, tecnologlas de micromatriz.
El aislamiento de acido ribonucleico (ARN) a partir de tejido. Las muestras de tejido pueden ser recogidas, congelar en nitrogeno llquido, descongelar y, a continuacion, se molieron con un mortero y mano de mortero, se homogeneizaron y transfirieron a un matraz conico de 50 mL. La muestra de tejido homogeneizado se procesa a continuacion, utilizando un metodo de extraccion de ARN TRIzol® de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen) para producir ARN de buena calidad que despues se somete a un analisis genomico mas detallado.
Materiales: hielo, nitrogeno llquido, tejido felino congelado, reactivo de lisis TRIzol®, cloroformo mlnimo de 99%, alcohol isopropllico, etanol al 70% (preparado con etanol, absoluta y desionizado, agua libre de RNasa), RNasa Zap®, agua desionizada, RNA Storage Solution®, de Ambion.
Equipo: Ultra-Turrax T25 Potencia Homogeneizador, centrlfuga Beckman Coulter Allegra 25R, centrlfuga Eppendorf, forceps, escalpelos, superficie de corte duro, esto es, tabla de cortar, tubos de microcentrlfuga esteriles/libres RNasa DNasa de 1.5 mL, tubos de polipropileno esteriles desechables/libres de DNasa y RNasa de 50 mL, pipetas P1000, P200, P20, P10 y P2 Rainin Pipetman, puntas de pipeta de filtro para pipetas P1000, P200, P20, P10 y P2, esteriles/libres de DNasa y RNasa, y toallitas libres de pelusas.
Preparaciones: Preparar tubos de polipropileno de 50 mL con 4 mL de TRIzol® (un tubo para cada tejido seleccionado para el aislamiento de ARN).
Homogeneizacion de tejidos: Llenar un recipiente capaz de contener nitrogeno llquido con 3-4 cucharadas de nitrogeno llquido. Colocar un pedazo de tejido congelado de inmediato en el recipiente antes mencionado (el tejido debe ser aproximadamente del tamano de un guisante) y colocar el tejido en el tubo de polipropileno 50 mL marcado apropiado (que ya contiene 4 mL de TRIzol®). Comenzar inmediatamente la homogeneizacion utilizando el homogeneizador Ultra-Turrax T25 Power. Homogeneizar a la maxima configuration (6) durante 10-15 segundos. Enfriar la muestra en hielo durante otros 10-15 segundos y a continuacion repetir. Continuar hasta que el tejido sea totalmente homogeneizado y la solution esta turbia. Tras completar la homogeneizacion, la tapa del tubo de 50 mL y volver al hielo. Incubar los tejidos homogeneizados a temperatura ambiente durante 5 minutos antes de proceder con el procedimiento de aislamiento.
Ejemplo 4: Procedimientos de preparation de ARN.
Aislamiento de ARN: Los procedimientos indicados en las instrucciones de Invitrogen proporcionadas con el reactivo TRIzol® se siguio de manera general. Separar la muestra homogeneizada en cuatro allcuotas de 1 mL en cuatro tubos de microcentrlfuga de 1.5 mL. Adicionar 200uL de cloroformo a cada allcuota de 1 mL. Tapar los tubos, someterlos a vortex durante 15 segundos y despues agitar hacia arriba y abajo. El resultado debe ser un llquido lechoso de color rosa. Incubar los tubos a temperatura ambiente durante 2-3 minutos. Centrifugar los tubos durante 15 minutos a 14,000 rpm y 4°C. Transferir la fase acuosa (capa superior) a un tubo de microcentrlfuga de 1.54 mL. El volumen tlpico de la fase acuosa que debe ser transferido al nuevo tubo es aproximadamente 500 uL. Asegurese de no transferir cualquiera de las fases intermedias o inferiores. Precipitar el ARN a partir de solucion mediante la adicion de 500 uL de alcohol isopropllico a cada tubo de microcentrlfuga que contiene la capa acuosa. Agitar los tubos de arriba a abajo durante al menos 20 segundos. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 10 minutos. Centrifugar las muestras durante 10 minutos, 14,000 rpm a 4°C. Eliminar el sobrenadante cuidadosamente aspirando el llquido asegurandose de no perder el pellet. Adicionar 1 mL de etanol al 70% para lavar el pellet. Desalojar el pellet con un movimiento rapido del tubo (o dando golpecitos al tubo en la mesa de trabajo) y agitar para mezclar. Centrifugar durante 5 minutos, 8,200 rpm a 4°C. Eliminar el sobrenadante cuidadosamente aspirando el llquido asegurandose de no perder el pellet. Utilizando una toallita sin pelusa para absorber el exceso de etanol con cuidado para asegurarse de que el pellet esta seca. Volver a suspender cada pellet en 30 uL de solucion de almacenamiento de ARN. Mezclar suavemente con la pipeta hasta que el ARN regresa a la solucion y luego almacenar a -80 °C. Puede ser necesario someter al vortex la muestra durante unos pocos segundos a baja velocidad para facilitar la resuspension del ARN. Si es necesario, centrifugar las muestras, utilizando la microcentrlfuga, antes de la congelation.
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Limpieza del ARN: Se siguen los procedimientos expuestos en el Manual RNeasy® Mini.
Aislamiento del ARN de las celulas cultivadas en camaras OptiCell utilizando el Kit RNeasy Mini. Las celulas cultivadas a partir de llneas celulares de mamlferos se utilizan para aislar ARN de buena calidad que se usa entonces para el futuro analisis genomico en direccion 3'. Cualquier trabajo relacionado con el cultivo de las celulas que se debe hacer bajo estrictas condiciones de asepsia.
Reactivos: 10X de PBS, H2O desionizada, etanol absoluto, solucion de almacenamiento de ARN, (b-mercaptoetanol, RNasa Zap®, solucion reguladora RLT y solucion reguladora RW1 y solucion reguladora RPE (proporcionado en el kit RNeasy Mini).
Equipos/Materiales: Kit RNeasy Mini, columnas de centrifugacion Qiashredder, cuchillo OptiCell, jeringas esteriles de 20 mL, puntas de pipeta OptiCell, recogedor de celulas, pipeta P1000 Pipetman, Rainin, pipeta P200 Pipetman, Rainin, puntas de pipeta filtrada de 100-100 uL, puntas de pipeta filtrada de 1-200 uL, pipetas de transferencia esteriles, cubeta de solucion esteril de 55 mL, tubos esteriles para microcentrlfuga de 1.5 mL, y Eppendorf microcentrlfuga.
Soluciones: solucion reguladora RLT (solucion stock proporcionada en Kit RNeasy Mini); -Adicionar 100 uL de (b- mercaptoetanol por 10 mL de solucion reguladora RLT antes de comenzar el protocolo. Etanol al 70%: Hacer 50 mL de etanol al 70% mediante la adicion de 35 mL de etanol absoluto a 15 mL de desionizada, agua libre de RNasa 1X PBS: agua libre de RNasa. Filtrar la solucion utilizando un filtro de .22 um.
Procedimiento: Remover las celulas de la camara OptiCell (pasar una OptiCell a la vez). Comprobar las celulas bajo un microscopio para asegurar que las celulas estan vivas antes de aislar el ARN. Retirar y desechar el medio de cultivo celular. Utilizando el cuchillo OptiCell, cortar la membrana superior mostrando las celulas en la membrana inferior. Lavar la membrana a la que las celulas se unen tres veces con 1X PBS. Pipetear 600 uL de la solucion reguladora RLT (que contiene b-mercaptoetanol) en el centro de la membrana a la que se unen las celulas. Utilizando el recogedor de celulas, se extiende suavemente la solucion reguladora RLT sobre toda la superficie de la membrana, y luego se recoge el llquido en una esquina. Pipetear la totalidad del volumen de la solucion reguladora RLT y colocar en una columna de centrifugacion QlAshredder.
Aislamiento de ARN: Centrifugar las columnas de centrifugacion QlAshredder a 14,000 rpm durante 2 minutos. Descartar la columna de centrifugacion, pero mantener el tubo de recoleccion y su contenido. Adicionar 600 uL de etanol al 70% al tubo de recoleccion y se mezcla bien con la pipeta (volumen total ahora = 1.2 mL). Transferir 600 uL del lisado celular a una columna RNeasy mini y centrifugar durante 15 segundos a 14,000 rpm. Descartar el flujo a traves, pero mantener el tubo de recoleccion y la columna de centrifugacion. Transferir el volumen restante de lisado de celulas (~600 uL) a la columna de centrifugacion y repetir la centrifugacion. Descartar el flujo a traves, pero mantener el tubo de recoleccion y la columna de centrifugacion. Adicionar 700 uL de solucion reguladora RW1 a la columna de centrifugacion. Centrifugar durante 15 segundos a 14,000 rpm para lavar la columna. Descartar el flujo a traves y el tubo de recoleccion. Transferir la columna de centrifugacion a un nuevo tubo de recoleccion de 2 mL y adicionar 500 uL de solucion reguladora RPE a la columna. Centrifugar durante 15 segundos a 14,000 rpm. Descartar el flujo a traves, mantener el tubo de recoleccion/columna. Adicionar otros 500 uL de solucion reguladora RPE a la columna. Centrifugar durante 2 minutos a 14,000 rpm. Transferir la columna de centrifugacion a un tubo de recoleccion de 1.5 mL. Adicionar 30 uL de solucion de almacenamiento de ARN directamente a la membrana de silica gel y se centrifuga durante 1 minuto a 14,000 rpm para eluir el ARN. Almacenar el final de ARN a -70°C.
Ensayo RNA 6000 Nano. Utilizando el Agilent 2100 Bioanalyzer y Ensayo RNA 6000 Nano, analizar el ARN aislado de cultivos de celulas de mamlferos, linfocitos o tejidos de calidad.
Reactivos: matriz de gel RNA 6000 Nano, concentrado de tinte RNA 6000 Nano, Marcador RNA 6000 Nano, (todos los reactivos anteriores estan contenidos en el Kit de Ensayo RNA 6000 Nano, Agilent), RNA 6000 ladder, RNase Zap, y agua libre de RNasa, de Ambion.
Equipos/Otros Materiales: Estacion Agilent Chip Priming, Agilent, RNA 6000 chip, Agilent, limpiadores de electrodos, pipetas P2, P10, P200 y P1000 Rainin Pipetman, puntas de pipeta filtradas, libres de DNasa/RNasa, esteriles, tubos de microcentrlfuga de 1.5 mL, esteriles, vortex, mezclador vortex IKA, microcentrlfuga, y bloque de calentamiento.
Procedimiento: El procedimiento se da en la Guia de kit de reactivos, ensayo RNA 6000 Nano, edicion de noviembre de 2003, de Agilent Technologies. Los procedimientos se siguen como se indica en la Guia, con las siguientes modificaciones: Preparacion del gel, pg. 17- en lugar de separar el gel filtrado en alicuotas de 65 uL cada una, mantener el gel filtrado stock en el tubo de microcentrlfuga original y la alicuota de 65 uL segun sea necesario. Cargar el marcador RNA 6000 Nano, pg. 22- adicionar 1 uL de agua libre de RNasa (en lugar de marcador RNA 6000 Nano) a cada pozo de muestra que no contiene muestra. Esto no solo conserva la cantidad de marcador usado sino que tambien sirve como un control negativo para ver que ninguno de los reactivos esta contaminado, incluyendo el agua libre de RNasa. Cargar la escalera y muestras, pg. 23-calor desnaturaliza las muestras y ARN 6000 Ladder
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Ejemplo 5: Analisis de expresion de Affymetrix GeneChip.
La expresion de genes se analizo utilizando un Affymetrix Felino GeneChip® patentado. El ARN total se transcribio de forma inversa en ADNc. El ADNc se utiliza para generar ARNc que es fragmentado y utilizado como sondas para la hibridacion GeneChip. El chip de gen se lava y la senal de hibridacion se mide con un escaner de laser Affymetrix. Los datos de la hibridacion entonces son validados y normalizados para el analisis adicional de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Equipo: Eppendorf microcentrlfuga, tubos de microcentrlfuga esteriles/libres de DNasa y RNasa de 1.5 mL, tubos de polipropileno esteriles desechables/libres de DNasa y RNasa de 50 mL, pipetas P1000, P200, P20, P10 y P2 Rainin Pipetman, puntas de pipeta de filtro para pipetas P1000, P200, P20, P10 y P2, esteriles/libres de DNasa y RNasa, y Peltier Thermal Cycler PtC-200.
Procedimiento: seguir todos los procedimientos tal y como se describe en el Manual GeneChip Expression Analysis Technical (Affymetrix Derechos de Autor 1999-2003). Usar 5 microgramos de ARN total para la slntesis de ADNc de la primera cadena. Utilizar cualquiera Peltier Thermal Cycler PTC-200 o bloque de calentamiento para controlar la temperatura sobre las reacciones y desnaturalizacion de la sonda. El control de calidad se realiza utilizando chips de RNA NanoDrop con BioAnalyer 2100. Usar 100 Formato (Midi Array) para el chip del gen de felino.
Ejemplo 6: Expresion genica en felinos con insuficiencia renal cronica
Los estudios se llevaron a cabo de acuerdo con los ejemplos 1-5 anteriores utilizando los felinos que tienen diversas etapas de la enfermedad renal cronica para determinar las diferencias subyacentes de expresion de genes entre los felinos con funcion renal normal y felinos que tienen glomerulonefritis minima, leve, moderada y marcada correspondiente a Etapas 1 a 4 como se presentan en la Tabla 1. Los procedimientos como se describen en los ejemplos de esta descripcion se utilizaron para preparar muestras de tejido y llquido corporal a partir de 15 felinos que tienen funcion renal normal, 4 felinos que tienen un mlnimo de glomerulonefritis, 10 felinos que tiene glomerulonefritis leve, 20 felinos que tienen glomerulonefritis moderada y 13 felinos que tienen glomerulonefritis marcada, segun se determina por los niveles de creatinina en plasma presentados en la Tabla 2 y por la observacion cllnica.
Basandose en los datos de expresion de genes comparando los felinos con funcion renal normal frente a los felinos que tienen glomerulonefritis, como se define en los ejemplos anteriores, los cuatro genes que figuran en la Tabla 3 fueron identificados como que cumplen los criterios de seleccion del Ejemplo 2 como biomarcadores potenciales de trastornos renales cronicos en los felinos. Los genes incluyen lumican (LUM), cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12 (COL3A1), decorina (DCN), y protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2). Sinonimos humanos Analogos y ARNm y numeros de acceso de protelnas se enumeran en la Tabla 3 para cada gen. Cada una de las protelnas es una protelna secretada. Los datos de nivel de cambio geometrico, representados frente la etapa de la glomerulonefritis para cada uno de los cinco genes se presentan en las Figuras 1 a 4, respectivamente.
La Fig. la demuestra un nivel de cambio la media geometrica de 10 en felinos que tienen glomerulonefritis marcada sobre felinos normales para el producto de la expresion de genes lumican. La figura 1b presenta los datos de intensidad RMA de media geometrica representada frente a la etapa de la glomerulonefritis para cada uno de los animales ensayados.
Fig. 2a demuestra un nivel de cambio de la media geometrica de 10 en felinos que tienen glomerulonefritis marcada sobre felinos normales para el producto de la expresion de genes COL3A 1. La figura 2b presenta los datos de intensidad de RMA de media geometrica representada frente a la etapa de la glomerulonefritis para cada uno de los animales ensayados.
Fig. 3a demuestra un nivel de cambio de media geometrica de 4.3 en los felinos que tienen glomerulonefritis marcada sobre felinos normales para el producto de expresion de genes de decorina. La figura 3b presenta los datos de intensidad RMA de la media geometrica representada frente a la etapa de la glomerulonefritis para cada uno de los animales ensayados.
Fig. 4a demuestra un nivel de cambio de la media geometrica de 3.8 en los felinos que tienen glomerulonefritis marcada sobre felinos normales para el producto de la expresion de genes SFRP2. La figura 4b presenta los datos de intensidad RMA de la media geometrica representada frente a la etapa de la glomerulonefritis para cada uno de los animales ensayados.
Fig. 5a demuestra un nivel de cambio de la media geometrica de 10.3 en los felinos que tienen glomerulonefritis marcada sobre felinos normales para el producto de la expresion de genes de metaloproteinasa de la matriz -2. La
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figura 5b presenta los datos de intensidad RMA de la media geometrica representados frente a la etapa de la glomerulonefritis para cada uno de los animales ensayados.
Fig. 6a demuestra un nivel de cambio de la media geometrica de 23 en los felinos que tienen glomerulonefritis marcada sobre felinos normales para el producto de expresion de genes de metaloproteinasa de la matriz-7. La figura 6b presenta los datos de intensidad RMA de la media geometrica representados frente a la etapa de la glomerulonefritis para cada uno de los animales ensayados.
Fig. 7a demuestra un nivel de cambio de la media geometrica de 6.9 en los felinos que tienen glomerulonefritis marcada sobre felinos normales para el producto de la expresion de genes de metaloproteinasas de matriz-19. La figura 7b presenta los datos de intensidad RMA de la media geometrica representados frente a la etapa de glomerulonefritis para cada uno de los animales ensayados.
Fig. 8a demuestra un nivel de cambio de la media geometrica de 3.9 expresion inducida en los felinos que tienen glomerulonefritis marcada sobre felinos normales del producto de expresion de genes de la protelna 5 de union al retinol. La figura 8b presenta los datos de intensidad RMA de la media geometrica representados frente a la etapa de la glomerulonefritis para cada uno de los animales ensayados.
Aunque cualquiera de las composiciones, metodos, artlculos de fabricacion, u otros medios o materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento se pueden utilizar en la practica de la presente invencion, las composiciones preferidas, los metodos, artlculos de fabricacion, o por otros medios o materiales se describen en este documento.
En particular, la invencion como se describe en este documento provee las siguientes realizaciones:
1. Un metodo de diagnostico de la existencia de un trastorno renal en un felino que comprende medir el nivel de expresion del uno o mas biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en lumican; cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12; decorina; protelna 2 secretada relacionada con frizzled; protelna 5 de union al retinol; MMP-2; MMP-7; y MMP-19, en una muestra biologica del felino, en donde las diferencias en expresion del uno o mas biomarcadores en la muestra con relacion a un valor de control para la expresion en una muestra de un animal normal indican la existencia de un trastorno renal.
2. El metodo de la clausula 1, que comprende la deteccion de niveles de expresion de la protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2) y/o protelna 5 de union al retinol (rbp5) y, opcionalmente, niveles de expresion de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en: lumican (LUM); decorina (DCN); cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12 (COL3A1)); metaloproteinasa de la matriz-2 (MmP2); metaloproteinasa de la matriz-7 (MMP7, PUMP-1); y metaloproteinasa de la matriz-19 (MMP 19).
3. El metodo de la clausula 1 o la clausula 2, en donde el nivel de expresion del uno o mas biomarcadores se determina mediante la medicion de la expresion de genes del uno o mas biomarcadores utilizando ya sea (i) una micromatriz de ADN que comprende uno o mas oligonucleotidos complementarias a ARNm o ADNc correspondiente a los uno o mas biomarcadores que se va a medir, o (ii) una reaccion en cadena de la polimerasa cuantitativa con cebadores de oligonucleotidos para ARNm o ADNc correspondientes a los uno o mas biomarcadores que se van a medir.
4. El metodo de la clausula 3, en donde la etapa de medicion de la expresion de genes del uno o mas biomarcadores comprende (i) aislar el ARN de la muestra de tejido, (ii) transcripcion inversa del ARN para obtener el ADNc correspondiente, (iii) aislar y fragmentar el ADNc as! obtenido, (iv) poner en contacto los fragmentos de ADNc con una micromatriz de ADN que comprende uno o mas oligonucleotidos complementarios a ADNc correspondientes a los uno o mas biomarcadores que se van a medir, y (v) detectar la hibridacion entre los fragmentos de ADNc y los uno o mas oligonucleotidos en la micromatriz de ADN.
5. El metodo de la clausula 4, en donde los oligonucleotidos en la micromatriz de ADN comprenden una o mas sondas capaces de hibridarse a una o mas de SEQ ID NOS. 9-16.
6. El metodo de la clausula 5, en donde los oligonucleotidos en la micromatriz de ADN comprenden una o mas sondas que comprenden secuencias seleccionadas de una o mas de SEQ ID NOS. 1-8.
7. El metodo de cualquier clausula anterior, en donde el nivel de expresion del biomarcador se detecta por un anticuerpo a la protelna expresada.
8. El metodo de la clausula 7, en donde el biomarcador se detecta mediante un inmunoensayo seleccionado de un ensayo de union competitiva, un ensayo de union no competitiva, un radioinmunoensayo, un ensayo inmunoabsorbente con enzima ligada (ELISA), un ensayo de tipo sandwich, una reaccion de precipitina, un ensayo de inmunodifusion de difusion en gel, un ensayo de aglutinacion, un inmunoensayo fluorescente, inmunoensayo de
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quimioluminiscencia, inmunoensayo immunoPCR, un inmunoensayo de protelna A o protelna G y un ensayo de inmunoelectroforesis.
9. El metodo de una cualquiera de las clausulas 1-6, en donde el nivel de expresion del biomarcador se detecta midiendo la cantidad de protelna en la muestra utilizando espectroscopia de masas cuantitativo.
10. El metodo de una cualquiera de las clausulas 1-6, en donde el nivel de expresion del biomarcador se detecta por un aptamero que reconoce la protelna expresada.
11. El metodo de cualquiera clausula anterior, en donde la muestra biologica es sangre o una muestra de tejido renal.
12. El metodo de cualquiera clausula anterior que comprende detectar los niveles de expresion de protelna 2 secretada relacionada con frizzled(SFRP2) y/o protelna 5 de union al retinol (rbp5).
13. El metodo de cualquiera clausula anterior, en donde el felino tiene la funcion renal esencialmente normal, tal como se mide mediante uno o mas de los siguientes: medicion normal de la filtracion glomerular, medicion de depuracion de creatinina, niveles de protelna en orina, niveles de creatinina en suero, niveles de creatinina urinaria, niveles de nitrogeno ureico en sangre (BUN), marcacion metabolica con radioisotopos, obtencion de imagenes de tejidos blandos, incluyendo ecografla, exploration de resonancia magnetica y/o tomografla computarizada.
14. El metodo de cualquiera clausula anterior, en donde el trastorno renal es un trastorno caracterizado por una perdida anormal de funcion renal, insuficiencia renal, medicion de la filtracion glomerular reducida o glomerulonefritis.
15. El metodo de cualquier clausula anterior, en donde el trastorno renal es glomerulonefritis.
16. El metodo de cualquiera clausula anterior, en donde la existencia de un trastorno renal esta indicada por una diferencia significativa en la expresion de uno o mas de los siguientes en relation con los valores de control de expresion en donde una "diferencia significativa" en el caso de aumento de la expresion es un aumento de al menos dos veces y en el caso de disminucion de expresion es una disminucion de al menos 50%:
a. Incremento de la expresaion de lumican;
b. Incremento de la expresion de la cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12;
c. Incremento de la expresion de la decorina;
d. Incremento de la expresion de la protelna 2 secretada relacionada con frizzled;
e. Expresion de la protelna 5 de union al retinol reducida;
f. Incremento de la expresion de MMP-2;
g. Incremento de la expresion de MMP-7; y/o
h. Incremento de la expresion de MMP-19.
17. Un metodo para tratar, mejorar, o retrasar la progresion de un trastorno renal caracterizado por una perdida anormal de la funcion renal, insuficiencia renal, medicion de la filtracion glomerular reducida o glomerulonefritis en un felino, que comprenden el diagnostico de la existencia de un trastorno renal por el metodo de cualquier clausula anterior y la gestion del trastorno por dieta y/o medication de protection del rinon.
18. El metodo de la clausula 17, en donde la etapa de la gestion del trastorno comprende proporcionar una dieta de proteccion del rinon como sustancialmente la dieta unica para el felino.
19. El metodo de la clausula 17 o la clausula 18, en donde la dieta de proteccion renal comprende una o mas de las siguientes modificaciones con relacion a una dieta estandar del felino:
a. Reduction del fosforo
b. Niveles reducidos de protelnas
c. Reduccion de sodio
d. Niveles elevados de acidos grasos omega-3
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e. Niveles elevados de vitaminas del complejo B
f. Incremento de antioxidantes.
20. El metodo de una cualquiera de las clausulas 17-19, en donde la dieta de proteccion renal comprende desde aproximadamente 18% a aproximadamente 40% de protelna, desde aproximadamente 0.2% a aproximadamente 0.85% de fosforo, y desde aproximadamente 0.04% a aproximadamente 0.35% de sodio, en una base de materia seca.
21. Un kit para uso en el metodo de cualquiera de las clausulas anteriores para diagnosticar la existencia de un trastorno renal en un felino que comprende medios para la medicion de la expresion de genes del uno o mas biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en lumican; cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12; decorina; protelna 2 secretada relacionada con frizzled; protelna 5 de union al retinol; MMP-2; MMP-7; y MMP-19 en una muestra biologica de un felino; e instrucciones para usar tales medios para medir la expresion de los uno o mas biomarcadores en una muestra biologica del felino y para diagnosticar la existencia de un trastorno renal en el felino.
22. El kit de acuerdo con la clausula 21, en donde el medio para la medicion de los uno o mas biomarcadores es una o mas sondas de acido nucleico capaces de detectar la expresion de genes del uno o mas biomarcadores.
23. El kit de acuerdo con la clausula 22, en donde la una o mas sondas de acido nucleico son capaces de hibridarse con una o mas de SEQ ID NOS. 9-16.
24. El kit de acuerdo con la clausula 23, en donde la una o mas sondas de acido nucleico comprenden una secuencia o secuencias seleccionadas de una o mas de SEQ ID NOS. 1-8.
25. El kit de acuerdo con cualquiera de las clausulas 21-24 que comprenden una micromatriz de ADN que comprende una o mas sondas de acido nucleico capaces de detectar la expresion de genes del uno o mas biomarcadores.
26. El kit de acuerdo con cualquiera de las clausulas 21-25 en donde el medio para la medicion de los uno o mas biomarcadores es uno o mas anticuerpos o aptameros capaces de detectar el uno o mas biomarcadores.
27. El kit de acuerdo con la clausula 26 en el formato ELISA que comprende uno o mas anticuerpos capaces de detectar el uno o mas biomarcadores, protelna aislada correspondiente al biomarcador para servir como un estandar, y solucion reguladora.
28. El kit de acuerdo con cualquiera de las clausulas 19-27 en donde los uno o mas biomarcadores incluyen protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2) y/o protelna 5 de union al retinol (rbp5).
29. Uso de una secuencia de nucleotidos correspondiente o complementaria a un gen para lumican de felino; cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12; decorina; protelna 2 secretada relacionada con frizzled; protelna 5 de union al retinol; MMP-2; MMP-7; y MMP-19, por ejemplo, una secuencia de nucleotidos correspondiente o complementaria a cualquiera de las SEQ ID NO 1-16, o de un anticuerpo para lumican de felino; cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12; decorina; protelna 2 secretada relacionada con frizzled; protelna 5 de union al retinol; MMP-2; MMP-7; y MMP-19, en un metodo de acuerdo con cualquiera de las clausulas 1-20, o en la fabricacion de un kit de acuerdo con cualquiera de las clausulas 21-28.
Tabla 3: Lista de biomarcadores
Gen
Slmbolo felino Sinonimos humanos Sinonimos homologos Descripcion del gen ARNm Protelna
Lumican
LUM LDC; SLRR2D Canino LUM Similar a Lumican precursor XM_539716.2 ID Gen: 482599 XP_ 539716.1
Gen
Slmbolo felino Sinonimos humanos Sinonimos homologos Descripcion del gen ARNm Protelna
Gen
Slmbolo felino Sinonimos humanos Sinonimos homologos Descripcion del gen ARNm Protelna
Cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12
COL3A1 EDS4A; FLJ34534 Equino COL3A1 Colageno de tipo III, alfa 1 (slndrome de Ehlers Danlos IV, dominante autosomico) XM_001917620.1. ID Gen:100034123 XP_001917655
Decorina
DCN CSCD; DSPG2; PG40; PGII; PGS2; SLRR1B Canino DCN Decorina NM_001003228.1. ID Gen: 403904 NP_001003228.1
SFRP2
SFRP2
FRP-2; SARP1; SDF-5 Canino Sfrp2 Protelna 2 secretada relacionada con frizzled NM_001002987.1 ID Gen: 475471 NP_001002987.1
Tabla 4: Lista de biomarcadores
Gen
Slmbolo felino Sinonimos humanos Sinonimos homologos Descripcion del gen ARNm Protelna
Protelna 5 de union al retinol
Rbp5 Rbp-5 Canino Rbp5 Protelna 5 de union al retinol, celular XM_848184.1 LOC477706 XP_853277.1
MMP-2
MMP2 MMP2 Canino Metaloproteinasa de matriz 2 (gelatinasa A, gelatinasa de 72kDa, colagenasa de tipo IV de 92kDa) XM_535300.2 ID Gen: 4037333 XP_535300.2
MMP-7
MMP7 MMP7 PUMP-1 Felino PUMP-1 Metaloproteinasa de matriz 7 FDU04444 GeneBank U04444.1 AAA18222.1
MMP-19
MMP19 MMP19 Macaca Mulatta MMP19 Metaloproteinasa de matriz 19 XM_001111542.1 XP_001111542.1
5 LISTADO DE SECUENCIAS
<110> AL-MURRANI, SAMEER WALEED GAO, XIANGMING MALLADI, SUKHASWAMI
<120> Composiciones y metodos para el diagnostico y tratamiento de trastornos renales en un felino
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<130> 8888P-00-US <140>
<141 >
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 25 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Sonda de slntesis <400> 1
atcaccgcac gagttcttca aataa 25 <210>2 <211> 25 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Sonda de slntesis <400> 2
aggtgctgag ggtcttgact accac 25 <210>3 <211> 25 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Sonda de slntesis <400> 3
atttcaagcg tttcagtggg ctgca 25 <210>4 <211> 25 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Sonda de slntesis <400>4
atacatccag gttgtctacc ttcat 25 <210>5 <211> 25 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Sonda de slntesis <400> 5
atgccagtcc tgtgaatgtt ccacg 25 <210>6 <211> 25 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Sonda de slntesis <400> 6
agacctacat ctttgctgga gacaa 25 <210>7 <211> 25 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Sonda de slntesis <400> 7
atcgcccggc gagagcttga aattc 25 <210>8 <211> 25 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripcion de la Secuencia Artificial: Sonda de slntesis <400>8
atgcagctct ctattggcct ttcaa 25 <210>9
5 <211> 534
<212> ADN
<213> Felis domesticus <400> 9
aaceceaeee agatcatgta gaaatgttta gtttttaaat. agctcgcttt agtgttgaat ttgtttfctct gtttggtttg ggtcagctgt tgcsaatagc ttcattttte satgtggccc ataaagctgg ctgtfcatctc aacatgtctc ttcaaattca cttgtacttt caccccctca cacttccacg tagagtactt ccatctctaa fctcaaataaa gggccaaaag acagatttca caaacacttt tctatctaat tctgcaaact 10 <210> 10 <211> 331 <212> ADN
<213> Felis domesticus <400> 10
aactaataaa
atcatgaata tbtttatgaa 60
agctacaacc
gtgacttggg tctgatattt 120
ttttcacttt
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aaactgttgt
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agcttacccg ctaa 534
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agtcagttcc agatacagcg tctctcccte cagccagtgt ctccagcctc ggttggggac 60

ctcccctttc tgcacacata ctagetgcbc ctcctcccag gttactatgg tetggrca-ttt 120

tcgtccatcc acgatcctta gatcttcttc aaaetcaact cccacatcga attccagaat 130

gtagttgcgg aaggtgctga gggtcttgac taccacgtgg ttgccetgat ggfccaatetc 240

cttgtctggc t-tgaccagca gcgctatett ccgcaaggcc atgcggaatg tt-tagggett 300

gcaag-taagg gbbtcatgtt cttebgccaa a 331
<210> 11 <211> 411 <212> ADN
<213> Felis domesticus <400> 11
tggatctcca gcttacgcac
aacaagataa cgaagcttgg ctccttcgat ggactggtas 60
acctgaaatfe
□gtccacGtc caacacaate aactgaaaga ggatgetgt-t teagetgett 120
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<210> 12 5 <211> 458
<212>ADN
<213> Felis domesticus <400> 12
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<211> 535 <212> ADN
<213> Felis domesticus <400> 13
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aaatgccagt ccbgtgaatg titccac-gtaa gaaatggtgg ataga-tctg gtgcbgagaa ISO

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<213> Felis domesticus <400> 14
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atcagcgttc
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<210> 15 <211> 527 <212> ADN
<213> Felis domesticus <400> 15
tgaatgaacg tgfcgctctcc ccgaagttcc tacaattcct ggstttctct gatatcgccc gctcegtagg tggggtacat gacagagtcg tggccaagtt catgggttgc aacagccagg cagegct^gt cct-catcgaa gtgggcgtct tgggccagtg tgcctcctgg tccgtcaaat aagccaatc* cgatatcggg aattcccagc ttgctccaca tattc&aggc ct-ttgccact cgagtgtatg atatgatcct gtaggtgacc <210> 16 <211> 511 <212>ADN
5 <213> Felis domesticus
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ttgatttact tctctttcca 60
ggcgagagct
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tcccctt 527
<400> 16
gaaacctaga tgetgctgtc fcactctcctc gaacacaatg gattcacttc tttaagggag 60 acaaggtgtg gcgctatatt aatttcaaga tgtctcctgg ctttcccaag aagctgaata 120 gggtagaccc ccacctggat gcagctatct attggccttt caataaaaag gtgttcctct 100 ttaagggetc egggtactgg eagtgggacg agetggeeeg aaetgacttc agccactacc 240 ctaaaccaat caagggattg tttacaggag tgccagacca gccctctgct gctatgggtt 300 ggcgggatgg ccatgtctac fcfccttcaagg gtaaacagta atggagcctc aaccagcagc 360 ttcgagLaca gaaaggatat accagagata ctgeccacaa ttggatgcac tgtcataacc 420 agacctcaaa caatactcca ttgggtgggg acsccactcc ttcagggect gacaactcaa 480 ccataggaac aaactttgga tacocttcct c 511

Claims (14)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo de diagnostico de la existencia de un trastorno renal en un felino que comprende medir el nivel de expresion de protelna 2 secretada relacionada con frizzled en una muestra biologica del felino, en donde las diferencias en expresion de la protelna 2 secretada relacionada con frizzled en la muestra con relacion a un valor de control para la expresion en una muestra de un animal normal indican la existencia de un trastorno renal.
  2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende ademas la deteccion de niveles de expresion de union a retinol protelna 5 (rbp5) y, opcionalmente, niveles de expresion de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en: lumican (LUM); decorina (DCN); cadena del colageno alfa 1 (III), variante 12 (COL3A1)); metaloproteinasa de la matriz-2 (MMP2); metaloproteinasa de la matriz-7 (MMP7, PUMP-1); y metaloproteinasa de la matriz-19 (MMP19).
  3. 3. El metodo de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en donde el nivel de expresion de protelna 2 secretada relacionada con frizzled se determina midiendo la expresion de genes de la protelna 2 secretada relacionada con frizzled utilizando ya sea (i) una micromatriz de ADN que comprende uno o mas oligonucleotidos complementarios a ARNm o ADNc correspondientes a la protelna 2 secretada relacionada con frizzled, o (ii) una reaccion en cadena de la polimerasa cuantitativa con cebadores de oligonucleotidos para ARNm o ADNc correspondientes a la protelna 2 secretada relacionada con frizzled que se va a medir.
  4. 4. El metodo de la reivindicacion 3, en donde la etapa de medicion de la expresion de genes de la protelna 2 secretada relacionada con frizzled comprende (i) aislar el ARN de la muestra de tejido, (ii) transcripcion inversa del ARN para obtener el ADNc correspondiente, (iii) aislar y fragmentar el ADNc obtenido de este modo, (iv) poner en contacto los fragmentos de ADNc con una micromatriz de ADN que comprende uno o mas oligonucleotidos complementarios a ADNc correspondientes a protelna 2 secretada relacionada con frizzled, y (v) detectar la hibridacion entre los fragmentos de ADNc y los uno o mas oligonucleotidos en la micromatriz de ADN,
    preferiblemente en donde los oligonucleotidos en la micromatriz de ADN comprenden una o mas sondas capaces de hibridarse con la SEQ ID NO. 9, y mas preferiblemente, en donde los oligonucleotidos en la micromatriz de ADN comprenden una o mas sondas que comprenden SEQ ID NO. 1.
  5. 5. El metodo de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en donde el nivel de expresion de protelna 2 secretada relacionada con frizzled se detecta mediante un anticuerpo a la protelna expresada, y, opcionalmente, en donde la protelna 2 secretada relacionada con frizzled se detecta mediante un inmunoensayo seleccionado entre un ensayo de union competitiva, un ensayo de union no competitiva, un radioinmunoensayo, un ensayo inmunoabsorbente con enzima ligada (ELISA), un ensayo de tipo sandwich, una reaccion de precipitina, un ensayo de inmunodifusion de difusion en gel, un ensayo de aglutinacion, un inmunoensayo fluorescente, inmunoensayo de quimioluminiscencia, inmunoensayo immunoPCR, un inmunoensayo de protelna A o protelna G y un ensayo de inmunoelectroforesis.
  6. 6. El metodo de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en donde el nivel de expresion de protelna 2 secretada relacionada con frizzled se detecta mediante la medicion de la cantidad de protelna en la muestra utilizando espectroscopia de masas cuantitativa, o en donde el nivel de expresion de protelna 2 secretada relacionada con frizzled se detecta por un aptamero que reconoce la protelna expresada.
  7. 7. El metodo de cualquier reivindicacion precedente, en donde la muestra biologica es sangre o una muestra de tejido renal, y opcionalmente, en donde el metodo comprende la deteccion de niveles de expresion de la protelna 2 secretada relacionada con frizzled (SFRP2) y protelna 5 de union al retinol (rbp5).
  8. 8. El metodo de cualquier reivindicacion precedente, en donde el felino tiene la funcion renal esencialmente normal, como se mide mediante uno o mas de los siguientes: medicion de filtracion glomerular normal, medicion de depuracion de creatinina, niveles de protelna en orina, niveles de creatinina en suero, niveles de creatinina urinaria, niveles de nitrogeno ureico en sangre (BUN), marcacion metabolica con radioisotopo, obtencion de imagenes de tejidos blandos, incluyendo ecografla, exploracion de resonancia magnetica y/o tomografla computarizada, y opcionalmente, en donde el trastorno renal es un trastorno caracterizado por una perdida anormal de la funcion renal, insuficiencia renal, medicion de la filtracion glomerular reducida o glomerulonefritis, preferiblemente, en donde el trastorno renal es glomerulonefritis.
  9. 9. El metodo de cualquier reivindicacion precedente, en donde la existencia de un trastorno renal esta indicada por una diferencia significativa en la expresion de protelna 2 secretada relacionada con frizzled en relacion con los valores de expresion control en donde una "diferencia significativa" es un aumento de al menos dos veces.
  10. 10. Uso de un kit en el metodo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes para el diagnostico de la existencia de un trastorno renal en un felino, en donde el kit comprende medios para medir la expresion de genes de la protelna 2 secretada relacionada con frizzled en una muestra biologica de un felino; e instrucciones para usar tales medios para medir la expresion de los uno o mas biomarcadores en una muestra biologica del felino y para diagnosticar la existencia de un trastorno renal en el felino.
  11. 11. El uso de acuerdo con la reivindicacion 10, en donde los medios para medir la protelna 2 secretada relacionada con frizzled es una o mas sondas de acido nucleico capaces de detectar la expresion de genes de la protelna 2 secretada relacionada con frizzled,
    preferiblemente en donde la una o mas sondas de acido nucleico son capaces de hibridarse con la SEQ ID NO: 9, y 5 mas preferiblemente en donde las una o mas sondas de acido nucleico comprenden SEQ ID NO. 1.
  12. 12. El uso de acuerdo con la reivindicacion 10 o la reivindicacion 11, en donde el kit comprende una micromatriz de ADN que comprende una o mas sondas de acido nucleico capaces de detectar la expresion de genes de la protelna 2 secretada relacionada con frizzled.
  13. 13. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en donde los medios para medir la protelna 2 10 secretada relacionada con frizzled es uno o mas anticuerpos o aptameros capaces de detectar la protelna 2
    secretada relacionada con frizzled.
  14. 14. El uso de acuerdo con la reivindicacion 13, en el formato ELISA que comprende uno o mas anticuerpos capaces de detectar la protelna 2 secretada relacionada con frizzled, protelna aislada correspondiente a la protelna 2 secretada relacionada con frizzled para servir como un estandar, y solucion reguladora.
    15 15. Uso de una secuencia de nucleotidos correspondiente o complementaria a un gen de la protelna 2 secretada
    relacionada con frizzled de felino; opcionalmente en donde la secuencia de nucleotidos corresponde a o es complementaria a SEQ ID NO: 1; o de un anticuerpo para la protelna 2 secretada relacionada con frizzled de felino; en un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y 7 a 9.
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