PT88168B - Metodo de amplificacao selectiva de sequencias alvo de polinucleotideo - Google Patents

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Description

TITULAR: BOARD OF TRUSTEES OF THE LELAND STANFORD JÚNIOR UNIVERSITY
EPÍGRAFE: MÉTODO DE AMPLIFICAÇAO SELECTIVA DE SEQUÊNCIAS
ALVO DE POLINUCLEOTÍDEO
MEMÓRIA DESCRITIVA >
Campo da Invenção
Esta invenção está relacionada com testes dia. gnósticos nos quais tem sido detectada a presença de um gene particular, quer para detecção do próprio gene ou pa. ra detecção do organismo que contém o gene, e está particularmente relacionada com técnicas nas quais o número de cópias do gene a ser detectado é enzimaticamente aumentado antes do processo de detecção. Além disso está relacionada com todos os processos que requerem a formação de muitas cópias de uma sequência específica de polinucleotídeo.
Antecedentes da Invenção
Têm sido desenvolvidos um número de testes diji gnósticos que se baseiam na detecção da presença de uma sequência particular de DNA ou de RNA, como uma indicação da presença de um analítico , por exemplo, uma bactéria, virus, ou defeito genético, numa amostra. Em alguns casos, o gene diagnóstico está presente em quantidades suficientes para ser directamente detectado, quer por hibridação, reacção com um anticorpo específico, ou por qualquer outro método. Contudo, se o gene em estudo está presen te numa pequena quantidade ou os antecedentes causados por sequências semelhantes presentes na amostra são suficientemente elevados, é difícil uma detecção segura e pre cisa do gene em alvo. Um resultado ambíguo não é satisf^ tório num teste diagnóstico.
Têm sido desenvolvidas várias técnicas para aumentar a sensibilidade e a especificidade deste tipo de processos diagnósticos. A amplificação do alvo pela cultura da célula, uma técnica eficiente mas demorada, tem sido desde há muito tempo o único método seguro. Outras técnicas aumentam a sensibilidade do sistema de detecção utilizando grupos sensíveis ligados ao padrão que combinará com o alvo. Exemplos de grupos sensíveis incluiriam moléculas radioactivas e fluorescentes. Os enz_i_ mas , tais como a peroxidase ou a fosfatase alcalina, un_i_ dos ao padrão, também melhoram a sensibilidade através da sua acção catalítica no substrato cromoforos. Também se pode obter maior sensibilidade através de uma amplificação dos grupos repórteres. Esta amplificação tem sido conseguida por interacções avidina-biotina, com rede de ácidos nucleicos, ou reprodução enzimática directa de um grupo repórter de RNA. Esta última técnica gera mais de 1.000.000 de.cópias de RNA em cerca de 12 minutos. Outra técnica amplifica a sequência alvo de ácido nucleico preferível aos grupos repórteres utilizados no sistema de detecção.
Um método de amplificação do ácido nucleico alvo é conhecido pela reacção em cadeia de polimerase ou técnica PCR, e tem sido desenvolvida para detectar os genes responsáveis por defeitos genéticos. Este método utiliza os iniciadores o 1igonuc1eotídeos específicos em ciclos repetidos de desnaturação do DNA alvo, enrolamento dos iniciadores em espiral, e extensão com uma polimerase de DNA.
A extensão dos produtos gerados a partir de um iniciador serve como sequências alvo adicionais para o outro inici_a dor. 0 grau de amplificação de uma sequência alvo é controlado pelo número de ciclos que são efectuados e é teoricamente calculado pela fórmula simples 2n, em que o n é o número de ciclos. Dado que a eficiência média por ciclo varia entre 65% a 85%, são necessários 25 ciclos para produzir 0,3 a 4,8 milhões de cópias da sequência alvo.
Apesar da reacção em cadeia da polimerase ser muito sensível e ser um método prometedor, há algumas limitações e desvantagens inerentes a esta técnica. Por exemplo, cada ciclo de reacção em cadeia da polimerase fornece, na melhor das hipóteses, apenas uma amplificação dupla, e assim é exigido um elevado número de ciclos (entre 20 e 30), para atingir uma amplificação substancial. Além disso, a desnaturação a alta temperatura que ocorre em cada ciclo PCR inactiva, geralmente, o enzima utilizado e, por isso, exige adições repetidas de enzimas dispe_n d i osos.
Consequentemente, as técnicas que aumentam a taxa de amplificação do gene (exigindo desse modo menos enzima e menos ciclos) seriam altamente vantajosas para todas as técnicas de diagnóstico que envolvem a detecção de uma sequência alvo específica de nucleotídeo, e qualquer outro processo que necessite de um número maior de polinucleotideos especificamente amplificados (RNA ou DNA)
Literatura Importante método PCR é descrito em muitas publicações, incluindo Saiki et a 1., Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis of sickle cell anemia, Science ( 1 985) 230:1350-1354;
Saiki et a 1., Analysis of enzymatically amplified beta-globin and HLA-DQ alpha DNA with allele-specific oligonucleotide probes, Nature (1986) 324:163-166; e Scharf et al., Direct cloning and sequence analysis of enzymaU cally amplified genomic sequences, Science (1986) 233: 1076-1078. Veja-se na publicação de Pedido de Patente Europeia N9.0 200 362 A2 (Pedido N?. 86302298-4), publica do em 10 de Dezembro de 1986 que reivindica prioridade
para três Pedidos de Patente norte americanos: N9 de Série 716,975, depositado em 28 de Março de 1985; N9 de Série 791,308, depositado em 10 de Outubro de 1985; e N9 de Série 828,144, depositado em 7 de Fevereiro de 1986.
Resumo da Invenção
A presente invenção fornece um método para rápida multiplicação (através de um ciclo enzimático) de um número de cópias de uma sequência alvo de polinucleotídeo, alternando dois processos que fazem cópias a partir de um padrão alvo. Numa primeira série de fases é produzido um polinucleotídeo intermediário de cadeia dupla incluindo um promotor seguido pela sequência alvo. 0 intermediário de cadeia dupla é então usado num segundo processo para preparar múltiplas cópias de RNA, utilizando uma polimera se de RNA que se une à região promotora do intermediário de cadeia dupla. Cada cópia de RNA pode ser então uti l_i_ zada como uma sequência alvo, para dar início a outro cj_ cio de amplificação preparando uma segunda (ou mais) colecção de intermediários contendo um promotor de cadeia dupla, utilizando a transcriptase inversa. Por isso, o processo de invenção fornece uma técnica que multiplica i n vitro o número de cópias de uma sequência alvo de poH nucleotídeo, presente numa amostra mais rápida do que nos processos anteriores. 0 método é aplicado numa incorporporação específica para um teste diagnóstico, para Toxoplasma gondii.
Breve Descrição do Desenho
A presente invenção será mais bem compreendida fazendo referência à seguinte descrição detalhada da invenção, quando considerada em conjunto com o desenho que faz parte da Memória Descritiva, no qual:
A Figura é um diagrama esquemático mostrando polinucleotídeos presentes em diferentes fases do método da invenção.
Descrição das Incorporações Especificas A presente invenção fornece um método para mu_l_ tiplicar o número de cópias de uma sequência alvo de p£
1inucleotídeo, e sendo, por isso, particu 1armente útil em testes diagnósticos que pretendem reconhecer sequências específicas de polinucleotídeo que estão presentes em pez quenas quantidades numa amostra. E Também útil em qualquer método que beneficie da origem rápida da sequência específica de polinucleotídeos.
A sequência alvo de polinucleotídeo pode ser apenas uma fracção de uma molécula maior ou pode apresentar-se inicialmente como uma molécula discreta, de forma a que a sequência específica constitua todo o ácido nucle_i_ co. Não é necessário que a sequência alvo a ser amplific_a da se apresente Inicialmente numa forma pura. Pode ser uma fracção menor de uma mistura complexa, como uma porção de uma sequência de ácido nucleico devido a um microorganismo particular, cujo organismo constitui apenas uma fracção menor de uma amostra biológica particular sob análise.
A mistura de reacção inicial contendo polinucleotídeos pode conter mais do que uma sequência alvo, se se pretender. Por isso, o presente processo é útil não apenas para produzir grandes quantidades de uma sequência alvo de po1inuc1eotídeo específica, mas também para amplificar simultâneamente mais do que uma sequência alvo diferente situada na mesma, ou em diferentes moléculas de po 1 inucleotídeo. Se se apresenta mais de uma sequência alvo, a única alteração exigida da presente invenção é a de fornecer iniciadores (abaixo referidos) para cada sequência alvo desejada.
Qualquer sequência alvo de polinucleotídeo específica pode ser amplificada pelo presente processo. Só é necessário que um número suficiente de nucleotídeos, em ambas as extremidades da sequência, seja conhecido em pormenor suficiente para que dois uniciadores oligonucleo tídeos possam ser preparados como abaixo se descreve.
Quanto maior fôr o conhecimento 'acerca das bases de ambas as extremidades da sequência, maior pode ser a especificidade dos iniciadores para a sequência alvo, e, por isso, maior a eficácia do processo. Compreender-se-á que a p_a lavra iniciador, aqui usada, pode referir-se a mais de um iniciador, sobretudo no caso em que há alguma ambiguidade na informação, no que respeita à sequência ou sequê£ cias terminais do alvo a serem amplificadas. Por exemplo, quando uma sequência de ácido nucleico é deduzida de uma sequência proteica .conhecida, um conjunto de iniciadores contendo sequências que representam todas as variações possíveis do codão, baseadas na degeneração do código genético, será usado para cada cadeia. Um iniciador deste conjunto será homólogo com a extremidade da sequência alvo.
método começa pela preparação de um intermediá. rio polinucleotídeo de cadeia dupla que contém a sequência alvo, e contém, adicionalmente, um promotor situado a montan te da sequência alvo. Este intermediário de cadeia dupla é preparado por uma série de fases usando pequenos oligonucle£ tídeos como sequências iniciadoras, e estendendo-se iniciadores utilizando a maior cadeia de po1inuc1eotídeo à qual o iniciador se une como padrão. A cadeia alvo complementar é obtida num estado de cadeia simples (se não estiver já nessa forma) e é hibridado para uma sequência oligonucleotídea contendo uma sequência promotora a montante de uma sequência de ligação complementar a uma região na cadeia complementar em, ou perto da extremidade 3' da região alvo na cadeia com plementar. A sequência de ligação neste iniciador é substancialmente equivalente a uma sequência na molécula alvo polinucleotídea onde se encontra 5', para a sequência alvo específica sendo copiada, ou sendo na extremidade 5' da se quência alvo. Este iniciador é utilizado para iniciar a síntese de uma molécula de DNA, usando uma polimerase de DNA (como a transcriptase inversa) do mesmo sentido que l__ i
a cadeia alvo original.
Um segundo ol igonucleotídeo é então hibridado para esta nova cadeia sintetizada. Este segundo iniciador o 1igonucleotídeo é complementar a uma região correspondente à extremidade 3' da molécula alvo. 0 número de nucleotídeos entre as regiões iniciadoras é, de preferência, inferior a 300, e mais preferivelmente inferior a 200, mas superior a 10 e, de preferência, mais de 15. Quando o segun do iniciador é estendido formam-se uma cópia da sequência alvo e do primeiro iniciador. Por isso o produto daí resultante contém a região promotora 5' para a sequência alvo, isto é, o objecto desta primeira parte do método da iri venção.
po1inuc1eotídeo de cadeia dupla contendo o pro motor intermediário é então utilizado como um padrão para uma polimerase de RNA dependente de DNA, capaz de se ligar à região promotora que foi criada no intermediário. 0 enzima de polimerase copia a sequência alvo, produzindo desse modo múltiplas cópias de RNA da sequência alvo a juzante do promotor. 0 número de cópias produzidas depende do promotor, da polimerase de RNA usada, e das condições da reacção mas são imediatamente produzidas 10 cópias, e podem-se pre parar 100 cópias ou mais, seleccionando promotores fortes, polimerases de RNA activas e condições da reacção favoráveis.
Cada cópia de RNA pode ser usada como um padrão para produzir cópias adicionais do alvo específico. A reacção com o segundo oligonucleotídeo utilizado acima, a ex tensão do iniciador para dar a sequência complementar, a reacção com o primeiro iniciador, e extensão do híbrido resultante, em ambas as direcções (o primeiro iniciador actuando como iniciador para produzir a cópia alvo e o ter minai 3' da cadeia complementar actuando como iniciador, de forma a fazer-se uma cópia da região promotora), produ7 zirão um intermediário contendo um promotor de cadeia dupla semelhante, acima descrito, que foi utilizado como um padrão para preparar cópias de RNA. Os ciclos de pr_o dução de RNA utilizando a polimerase de RNA dependente do promotor podem então ser repetidos. Se são produzidas apenas 10 cópias de RNA por ciclo, 3 ciclos produzirão um aumento de 1000 vezes no número das sequências alvo, presente no meio de reacção. Se são produzidas 100 cópias de RNA por padrão, um milhão de cópias da sequência alvo serão produzidas por 3 ciclos.
método, como acima descrito, supõe a presença de um alvo polinucleotídeo de cadeia dupla incluindo uma cadeia alvo e uma cadeia complementar à cadeia alvo, ou a presença de uma cadeia alvo complementar se o alvo inicial é polinucleotídeo de cadeia simples, tal como o RNA. Se o alvo é inicialmente de RNA ou DNA, de cadeia simples, a cadeia alvo complementar pode ser preparada de forma semelhante à acima descrita, utilizando um iniciador oligonucleotídeo. Por exemplo, o segundo iniciador oligonucleotídeo acima descrito é complementar a uma região correspondente à extremidade 3' da molécula alvo. Pode-se usar este segundo iniciador ol igonucleotídeo, ou um iniciador diferente complementar a uma região 3' diferente para a sequência alvo, para preparar a cadeia comple mentar usada na primeira fase do processo. Outra variante é começar com o iniciador -ol igonucleotídeo que é compleme_n tar ãcadeia alvo (é preferível ao seu complementar). 0 in_i_ ciador contendo a sequência promotora é então hibridado para a cadeia complementar que é estendida a partir do primeiro iniciador
Os iniciadores oligonucleotídeos são seleccionados para serem substancialmente complementares às diferentes cadeias de cada sequência específica a ser ampH ficada.Isto significa que os iniciadores têm de ser suficientemente complementares para hibridar com as suas respectivas cadeias.
Por isso, a sequência iniciadora não precisa de reflectir a sequência exacta do padrão ao qual está ligada. Por exemplo, um fragmento nucleotídeo não complementar pode estar ligado à extremidade 5' do iniciador, sendo o restante da sequência iniciadora complementar â cadeia padrão. Com certeza, como acima se descreveu, um tal fragmento nucleotídeo não complementar será uma sequência promotora exigida pela invenção. Contudo, mesmo quando não está presente uma sequência promotora, outros fragmentos núcleo tídeos não complementares podem ser unidos. Por exemplo, uma sequência que produz um local de clivagem duma endonuclease de restrição pode permitir a preparação de sequências alvo amplificadas, prontas a serem inseridas num plasmídeo. Alternativamente, bases não complementares podem ser intercaladas na sequências de ligação do inicia, dor, desde que a sequência iniciadora tenha complementarie dade suficiente com a sequência da cadeia a ser amplificada (ou com a sua cadeia complementar) para com ela hibridar e formar um padrão para síntese do produto de extensão.
Por exemplo, um nucleotídeo simples pode ser substituido num iniciador de tamanho moderado (ex: cerca de 15 núcleo tídeos), a fim de produzir um local específico de clivagem de endonuclease de restrição.
Se se quizer, as sequências promotoras podem ser incluídas em ambos os iniciadores para multiplicar mais o número de cópias produzidas por um ciclo completo.
funcionamento do método de invenção pode ser imediatamente visto com referência à Figura e à descrição que se segue, mais pormenorizada. A numenclatura padrão e a orientação são usadas para os po1inuc1eotídeos de cadeia simples e dupla esquemáticos, demonstrados na Figura e na descrição seguintes. A extremidade esquerda da cadeia superior dos pol inucleotídeos de cadeia dupla é a extremj. dade 5', e a extremidade direita da mesma cadeia é a extremidade 3' (indicada por setas). Desde que as cadeias complementares tenham orientações opostas, a cadeia infe rior apresenta-se na sua extremidade 3' à esquerda, e na sua extremidade 5' à direita. Para evitar confusões a cadeia inferior é mostrada nesta orientação, mesmo quando não se apresenta como parte de um polinucleotídeo de cadeia dupla. Segue-se a mesma regra para sequências re feridas no texto (incluindo as reivindicações), nas quais as várias sequências são identificadas por letras e núme ros. Nem todos os produtos de cada etapa do processo es. tão mostrados; apenas estão ilustrados os que são relevantes para esta invenção.
Na primeira linha da Figura pode ser vista uma molécula polinucleotídea alvo de cadeia dupla, incluindo uma série de regiões , definida nas condições das operações que serão levadas a cabo nesta molécula durante as etapas posteriores. Como se discutiu anteriormente é fe_i_ to um alvo de cadeia dupla para a fase inicial, se o alvo original é uma molécula RNA (ou DNA) de cadeia simples Na extremidade 5' do polinucleotídeo há um segmento identificado como X1 que não será copiado nas operações poste riores. Este é seguido por um segmento da sequência P1 que compreende uma parte da sequência de um iniciador, utilizado numa fase posterior. A sequência P1 é seguida por uma sequência alvo T, que é a sequência a ser copiada. Uma sequência P2 que se liga com um iniciador diferente está presente na extremidade 3' do T. Podem estar presentes nucleotídeos adicionais depois de P2, mas não são copiados. Estes nucleotídeos estão designados na Figura por X2. Nem X1 nem X2 são necessários para o funi cionamento da presente invenção, e por isso estão facultativamente presentes, variando do número zero até várias centenas ou mesmo milhares de nucleotídeos. “Prime é uma designação que indica a sequência complementar presente na cadeia oposta. A molécula alvo de cadeia dupla é desnaturada na presença de um iniciador oligonucleotídeo, e, então, as condições alteram-se para permitir o enrolamento em espiral do ol igonucleotídeo e do alvo, c_o mo demonstrado na linha 2.
A linha 2 da Figura mostra um primeiro inici_a dor oligonucleotídeo, PR-P1 de estrutura complexa, mas incluindo a sequência P1 na sua extremidade 3', hibridado para o segmento P1' da molécula alvo desnaturada. A porção 5' deste iniciador oligonucleotídeo, PR, contém uma sequência que pode, na sua forma de cadeia dupla com preender um promotor funcional para uma polimerase de RNA A sequência PR pode conter nucleotídeos adicionais sem afectar negativamente a invenção. 0 iniciador PR-P1 é estendido por um enzima apropriado (seja uma polimerase de DNA dependente de DNA, para um alvo de DNA, ou uma polimerase de DNA dependente de RNA, para um alvo RNA e/ou DNA), para fornecer uma cadeia PR-P1-T-P2-X2, como representada na linha 3 da Figura. A natureza da cadeia simples da região promotora está designada na Figura, pela falta de contacto entre as duas cadeias nesta região e no texto da seguinte forma:
PR^
P1--T--P2--X2 X1»-P1’-T’-P2’-X2’.
Este (e outro) iniciador da invenção é, de preferência, relativamente pequeno. Isto é, 50 ou menos nucleotídeos, a fim de permitir uma rápida hibridação (enrolamento em espiral) e cíclica, sobretudo com equipamento automático.
Depois da desnaturação do polinucleotídeo de cadeia dupla, mostrado na linha 3 da Figura, um segundo iniciador da sequência P21 é adiccionado à mistura sob condições de enrolamento em espiral, como se pode ver na linha 4. A sequência P2' é equivalente à sequência P21 previamente identificada e, ela própria, é complementar ao seqmento P2 de PR-P1-T-P2-X2.
A linha 5 da Figura mostra o produto obtido da
I extensão da sequência iniciadora P21 no padrão apresenta do. A região promotora, nesta fase, é agora de cadeia dupla, e por isso pode ser usada para se ligar a uma pol_i merase de RNA dependente de DNA. No texto, este intermediário de cadeia dupla está escrito:
PR--P1--T--P2--X2 PR*-P1’-T’-P2'
As cópias produzidas pela polimerase de RNA são mostradas na linha 5 da Figura. Os segmentos copiados, todos a juzante da região promotora, são designados por P1 -T -P2R ( o R escrito em cima indica uma cópia de DNA).
Esta molécula de RNA pode ser a mesma ou um pouco maior ou menor que P1-T-P2, desde que contenha toda a sequência PR-P1 no, e depois do nucleotídeo inicial que é copiado pela polimerase de RNA. Se a cadeia alvo RR R original é um alvo DNA de cadeia simples, P1 -T -P2 é o RNA equivalente ao DNA original mais qualquer porção de segmento PR contendo o promotor, copiado pela polimerase RNA, ou menos qualquer nucleotídeo não copiado pela polimerase.
Se as cópias de RNA se destinam a serem recicladas para amplificação adicional, repetem-se as fases previamente discutidas para a preparação do intermediário de DNA de cadeia dupla contendo o promotor. Não é necessário utilizar os mesmos segmentos P1 e P2 1 iniciadores, ou o mesmo segmento promotor PR, apesar de o PR-P1 e P21 já estarem disponíveis e poderem ser usados sem alteração Se se usarem outras sequências iniciadoras, as cópias resultantes serão um pouco menores ou maiores que as primei ras cópias, mas isto não afecta negativamente a invenção, a menos que haja alguma necessidade ou alguma intenção de reter a sequência P1-T-P2 original. 0 enrolamento em espiral inicial, com um iniciador P21, seguida pela extensão do iniciador, produz o produto representado na linha da Figura. A desnaturação do intermediário de cadeia dupla e o enrolamento em espiral com o iniciador PR-P1 produz o produto mostrado na linha 8. Este intermediário pode ser estendido em ambas as direcções, desde que a sequência P1 actue como um iniciador usando a cadeia complementar como um padrão, e que a cadeia complementar actue como um iniciador utilizando a sequência pr como um padrão.
Se os mesmos iniciadores são usados nesta fase como foram usados nas fases indicadas desde a linha 1 â linha 5, então o produto será semelhante ao apresentado na linha 5, apenas diferindo na extensão da cadeia superior. Isto não afectará nenhumas polimerizações de RNA subsequentes, como apenas a inferior. A cadeia padrão é usada pela polimerase de RNA. Se forem usadas sequências iniciadoras diferentes, a cadeia padrão resultante pode ser maior ou menor dependendo dos iniciadores usados.
Desde que pelo menos um dos iniciadores utilizados nesta fase tenha na sua extremidade 5' uma sequência representando um promotor para uma polimerase de RNA, o material resultante continua a estar apto para outras amplificações Consequentemente, o intermediário de DNA de cadeia dupla contendo o promotor, da linha 9 da Figura, pode ser usado com a polimerase de RNA dependente de DNA, para produzir, novamente, múltiplas cópias de RNA.
Quando os iniciadores inicialmente usados hibridam com sequências involuntárias na mistura DNA coç tendo a molécula alvo, podem-se obter vantagens utilizaç do iniciadores diferentes quando se repete o ciclo. Por exem pio, se um nucleotídeo alvo particular é detectado numa análise bruta contendo muitas sequências pol inucleotídeas, tal como quando é detectada uma infecção bacteriana ou pç rasítica num fluido humano ou numa amostra de tecido, a hibridação dos oligonucleotídeos iniciadores com o hospe deiro DNA pode resultar numa amplificação de sequências hospedeiras involuntárias. Desde que uma sequência promotora esteja presente no material antecedente amplifica, do, um aumento significativo na quantidade de uma sequência antecedente específica é observado juntamente com o aumento na sequência alvo. A fim de evitar este proble: ma, podem ser usados iniciadores e/ou promotores diferentes durante diferentes ciclos para evitar a amplificação dos antecedentes. Por exemplo, uma região de ligação dj_ ferente (P1x e/ou P2,x) que se encontra dentro da sequêji cia alvo perto ou sobreposta na região de ligação do inj_ ciador original pode ser usada no segundo ciclo. Embora, podendo estar ligado a outras sequências polinucleotídeas antecedentes cuja amplificação não é desejada, é improvável que o mesmo material antecedente seja amplifj. cado. Os iniciadores usados nas fases consequentes podem ser descritos como sendo um conjunto ordenado de inj_ ciadores, se esta incorporação da invenção for continuada, desde que sucessivos pares de iniciadores sejam encontrados mais juntos nas cadeias complementares da molécula alvo. Os segundos (e sucessivos) ciclos também podem usar uma região promotora diferente (por exemplo:
PR ) que une uma polimerase de RNA diferente. A degradação da primeira polimerase de RNA permanece em solução seguida pela introdução de uma segunda polimerase que se liga ao PRX multiplicará as cópias alvo mas não as cópias antecedentes, apesar de poder surgir um grupo adicional de cópias antecedentes. Adicionalmente, iniciadores dos primeiros ciclos, que podem estar presentes em excesso, podem ser retirados se se quizer. Técnicas apropriadas para a remoção de iniciadores baseiam-se em características que os distinguem do alvo, como o tamanho ou a exis^ tência de iniciadores, como o DNA de cadeia simples, quari do o alvo está presente como DNA de cadeia dupla ou RNA. Por exemplo, a cromatografia em gel retirará pequenos iniciadores de alvos maiores, enquanto nucleases ou anticorpos específicos retirarão iniciadores de alvos de cadeia dupla.
Como um exemplo de utilização de, quer um co£ junto ordenado de iniciadores, ou de iniciadores difere_n tes com diferentes promotores, implica que num primeiro ciclo de amplificação a sequência alvo desejada seja mu_l_ tiplicada por um factor de cinquenta. Ao mesmo tempo, a ligação dos iniciadores a uma sequência antecedente dá-se de forma a que a sequência antecedente seja também mult_i_ plicada por um factor de cinquenta. Se o segundo ciclo de amplificação usa iniciadores ordenados, e se ocorre, outra vez, uma amplificação de cinquenta vezes, a sequência alvo será multiplicada por 2500, enquanto (na pior das hipóteses) haverá duas sequências antecedentes, cada uma multiplicada por cinquenta. Depois de três ciclos de iniciadores ordenados, o factor de multiplicação por alvo será de 125.000 com (na pior das hipóteses) três sequências antecedentes multiplicadas por cinquenta.
As fases individuais do método desta invenção são todas convencionais e podem ser levadas a cabo usando reagentes e técnicas conhecidos. Os únicos reagentes especia 1 mente designados são os iniciadores PR-P1 e P21. Contudo, estes segmentos podem ser imediatamente obtidos, ou por síntese total ou por isolamento das sequências desejadas de fontes naturais. A síntese total é mais facH mente praticada se as sequências P2 (e consequentemente a sua sequência complementar P2') e P1 forem identificadas na molécula alvo. A síntese total de segmentos DNA contendo sequências promotoras é prontamente concluída desde que as sequências promotoras tenham sido elas mesmas apresentadas. Se a sequência da molécula alvo não é conhecida, a molécula alvo pode ser segmentada por endonuc1eases de restrição ou outros processos e segmentos seleccionados para serem usados na invenção. A polimerase de RNA e a sua sequência promotora associada podem ser seleccionadas de várias fontes disponíveis destes com ponentes. Por exemplo, a polimerase de RNA T7 do bacteriófago T7 está disponível nos New England Biolabs. Ou15
Ή tras polimerases de RNA incluem SP6 do bacteriófago SP6, disponíveis nos New England Biolabs, ou K-12 de uma estirpe K-12 de _E. coli, que se encontra disponível no Sigman Chemical Compan.y, St. Louis, Missouri. Os promotores correspondentes podem ser isolados do organismo, a partir do qual a polimerase é obtida ou quimicamente sintetizada, onde é conhecida a sequência promotora.
Os outros reagentes bioquímicos usados no método da invenção incluiem um enzima capaz de estender sequências iniciadoras para formar polinucleotídeos de cadeia dupla. Tais enzimas incluem a transcriptase inversa e outras polimerases de DNA. Os enzimas particuiarmente preferidos são a transcriptase inversa AMV, do LifeScience Inc., ou a polimerase I (fragmento de Klenon), dos Bethesda Research Laboratories, Pharmacia, U.S. Biochemicals ou Biolabs.
As etapas individuais da presente invenção são facilmente adaptáveis ao automatismo. As reacções podem ser efectuadas num recipiente único, adicionando consequeji temente reagentes e alterando as condições, se necessário.
Geralmente as condições de desnaturação envolvem aumento de temperaturas, particuiarmente temperaturas que variam de 95°C a 100°C. 0 enrolamento em espiral e a extensão do iniciador dão-se a baixas temperaturas, tipicamente de 35°C a 50°C. Visto que muitas proteinas são desnaturadas juntamente com os polinucleotídeos nas elevadas temperaturas indicadas, podem ser adicionadas proteinas.adicionais se necessário. Outros reagentes presentes podem incluir tampões para ma_n ter a reacção no pH e condições iónicas apropriados, assim como trifosfatos mononuc1eotídeos (eventualmente rotulados ou modificados para fornecer um sinal detectável) a serem usados nas reacções de extensão.
Se se usarem temperaturas elevadas para desn_a turar polinucleotídeos de cadeia dupla, não há exigências )
.de separação dos reagentes ou soluções. Outras condições de desnaturação, tal como o uso de solventes, são menos desejadas por causa das etapas de separação acrescentadas, quando se passa das condições de enrolamento em espiral à desnaturação, e de volta às condições de enrolamento em espiral. Contudo, são conhecidas numerosas condições de desnaturação, enrolamento em espiral e extensão, e podem ser usadas se se pretender.
As múltiplas cópias das sequências alvo podem ser usadas de várias formas. Por exemplo, o método da invenção pode ser utilizado para preparar múltiplas cópias de um gene para se inserirem num plasmideo ou noutro alvo do processo de engenharia genética. Se utilizada num ensaio diagnóstico, para a sequência alvo, a etapa de detecção (hibridar com um padrão, reacção com um anticorpo ou com um ligando específico) pode ser realizada sem se isolar o alvo amplificado do meio de reacção, se os alvos padrão, anticorpo ou ligando estiverem na sequência T, i.e. não estiverem incluídos nas regiões iniciadoras ou promotoras. Pode-se seleccionar um alvo padrão nas regiões P1 e P2, mas é necessário a separação das cópias do gene alvo (p1-T-P2 ou P1R-TR-P2R) a fim de evitar a união ou interferência por moléculas iniciadoras. A ribose trifosfatos marcados (por exemplo, marcas radioactivos , marcas de biotina ou avidina) podem também ser usados nas etapas em que é produzido RNA. Outras aplicações adicionais dos produtos po 1 inuc 1 eotídeos gerados por esta inve_n ção incluiriam mutagénese, engenharia genética e clonagem, análise genética, terapia (terapia genética e quimioterapia), a produção de proteina (translacção in vitro e introdução em células), e quaisquer outros processos que beneficiam das múltiplas cópias das sequências polinucle^ tideas específicas. Por exemplo, podem ser produzidas moléculas reguladoras de RNA, em grandes quantidades.
Estando agora a invenção descrita na generali- 17 dade, será mais bem compreendida referindo os seguintes exemplos detalhados que são fornecidos apenas para ilustrar e não pretendendo limitar a invenção.
EXEMPLO
As técnicas da invenção foram avaliadas usando um gene cionado de Toxop1 asma gondi i, especificamente o gene antigene repetitivo trinta e cinco vezes identific_a do como gene B1. 0 gene indicado foi obtido de um patri_ mónio de DNA recombinado contendo suplementos de DNA genómico de T. gondi i (de uma estirpe RH). 0 património foi construido no vector de expressão lambda gt11 , e foi obtj_ do com antisera de um coelho imunizado. Os recombinados assim identificados foram subclonados e ainda caracterizai dos. 0 gene alvo usado nestes estudos foi detectado como parte de uma unidade 2.2 Kilobase-par (Kb) que é seguidamente repetida muitas vezes no genoma do T. gondi i. 0 mapa de identificação e de restrição deste gene tem sido publicado Boothroyd et a 1., Antigen and Tubulin Genes of Toxoplasma Gondi i11, em Molecular Strategies of Paras_i_ tic Invasion, de Ayabian et a 1, edições, UCLA Symposia, Vol. 42, pags 237-250, Alan Liss, Nova Iorque, 1987 ). A sequência nucleotídea de uma repetição completa tem sido determinada (mas não publicada). A porção da sequência relevante para este trabalho é abaixo reproduzida.
sistema de numeração utiliza medidas do local EcoRI, definindo a repetição no genoma. A sequência é apresentada como uma molécula de cadeia dupla, estando a cadeia superior na direcção 5'-3', da esquerda para a direita.
Os segmentos ol igonucleotídeos estam sublinhados na cadeia do mesmo sentido, e, por isso, da mesma sequência.
721
AAAAAATGTG GGAATGAAAG AGACGCTAAT GTGTTTGCAT AGGTTGCAGT CACTGACGAG TTTTTTACAC CCTTACTTTC TCTGCGATTA CACAAACGTA TCCAACGTCA GTGACTGCTC
OLIGO #0 OLIGO #1
781
CTCCCCTCTG CTGGCGAAAA GTGAAATTCA TGAGTATCTG TGCAACTTTG GTGTATTCGC GAGGGGAGAC GACCGCTTTT CACTTTAAGT ACTCATAGAC ACGTTGAAAC CACATAAGCG
OLIGO #2
841
AGATTGGTCG CCTGCAATCG ATAGTTGACC ACGAACGCTT TAAAGAACAG GAGAAGAAGA TCTAACCAGC GGACGTTAGC TATCAACTGG TGCTTGCGAA ATTTCTTGTC CTCTTCTTCT
OLIGO #3
Visto que o objectivo final da amplificação do gene era o do uso potencial do método num teste diagnóstico, o gene alvo foi testado para ver se se adaptava ao critério que persiste, necessário a um gene alvo para diagnóstico.
Isto significa que o gene alvo está presente em quase todas ou em todas as estirpes do parasita, não estando presente nos genomas de outros agentes infecciosos (especia_l_ mente nos que podem ser confundidos no diagnóstico), e não detectáveis no genoma do hospedeiro. Investigações preliminares mostram que o gene está presente em todas as estirpes do parasita testado e que não existe reactivida_ de cruzada com os genomas de outros organismos testados, incluindo os do hospedeiro humano.
Foi calculado um número de iniciadores para serem usados no método da invenção. Estes iniciadores são identificados por estarem sublinhados na sequência acima mencionada. Os iniciadores eram 20-40 nucleotídeos (incluindo a sequência promotora facultativa) em comprimento, mostrando homologia com a sequência alvo para enrolamento em espiral eficiente. Um resíduo de guanosina (G) ou citosina (C) estava presente na extremidade 3' de cada iniciador, para assegurar um emparelhamento de base eficaz, do qual poderia ocorrer a extensão. Os iniciadores foram seleccionados não excedendo os 150 pares de base entre os iniciadores complementares para cadeias opostas, de forma a que a extensão fosse eficiente e rápida. Os iniciadores foram ainda seleccionados por falta de capacidade para for mar estruturas de pares de base estáveis com outros iniciadores ou dentro de um iniciador simples que iria impedir o enrolamento em espiral de um iniciador, à sequência alvo. Ap_e sar de não ser essencial às fases de multiplicação, os iniciadores foram escolhidos.para flanquear os locais de restn ção convenientes, para facilitara clonagem e construção de p_a drões para o DNA interno amplificado (ex: um padrão específico para o produto amplificado, mas que não hibridaria para os iniciadores. 0 DNA interno amplificado é equivalente à secção T na descrição e reivindicações gerais.
As condições de reacção usadas para a origem do fragmento de cadeia dupla incluindo o promotor de po l_i_ merase de RNA T7 eram semelhantes às previamente descritas (Saiki et aI. , Nature ( 1 986 ) 324:163-166 ). 0 meio de reacção contido num volume de 100 p1, 10 mM de Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1,5 mM dNTPs, 1,5 |iM de iniciadores de oligonucleotídeos, e quantidades variáveis do alvo contendo DNA dependendo da experiência (de 0,15 pg a 1,0 pg).
Cada ciclo consistiu na desnaturação a 90°C durante 2 minutos (excepto para o primeiro ciclo, onde a desnaturação ocorreu durante 10 minutos), um rápido resfriamento no gelo seco por 5 segundos, uma rotação (para eliminar a condensação na parte superior do tubo), o enrolamento em espiral dos iniciadores a 35°C durante 2 minutos, a adição de duas unidades de fragmentos Klenow da polimerase I de E. coli, e a extensão a 35°C durante 2 minutos.
método da invenção foi ainda executado inclui£ do um promotor para a polimerase de RNA do bacteriófago T7 na extremidade 5' de um dos o 1igonuc 1 eotídeos alvo de gene específico (oligo #1 acima identificado). A sequência promotora T7 é TAATACGACTCACTATAGGG. Estes 20 nucleotídeos adicionais estavam incorporados nos produtos de DNA de cadeia dupla amplificados das fases iniciais para proporcionar produtos que são 20 bp maiores do que no caso de se utilizarem ol igonucleotídeos, os quais faltam nesta sequência. Por exemplo, o DNA amplificado usando oligos #1 e #2 é 117 bp, 20 bp maiores do que 97 bp do alvo incluindo a
Ή homologia em relação aos ol igonucleotídeos (e semelhança, com oligos #1 e #3, o produto foi 151 bp= 131 bp + 20 bp).
Estas sequências adicionadas funcionaram como um promotor eficiente para a polimerase de RNA T7. As reacções de transcrição T7 in vitro rea1izaram-se de acordo com as instruções do fornecedor da polimerase de RNA T7. 0 padrão DNA foi retirado directamente das reacções acima descritas (que incorporavam a região promotora) sem trat_a mentos posteriores. Um autoradiograma de RNA T7 transcritos que são gerados in vitro confirmou que eram 17 núcleo tídeos mais pequenos que o padrão de DNA. Por outras palavras, o produto intermediário de DNA de cadeia dupla de 151 pares de base originou um RNA de 134 nt, 131 nt de se quências alvo e 3 nt (GGG) da sequência promotora T7. Pela incorporação Q32P] -UTP no RNA transcrito, um aumento de aproximadamente 3000 vezes na sensibilidade do produto amplificado de detecção foi obtido, se comparado com a coloração do brometo de etídio.
teste da invenção foi especificamente designado para dar uma elevada actividade específica, uma ba_i_ xa produção de RNA, não representando, por isso, um aumento máximo molar de sequências alvo originado de uma transcrição T7. Sabe-se, contudo, que sob elevadas condições de produção, a polimerase de RNA T7 produzirá de entre 50 e 100 moléculas de RNA por molécula padrão de DNA (Davanloo et a 1., Cloning and expression of the gene for the bacteriophage T7 RNA polymerase, Proc. Nat 1 . Acad.
Sei. USA ( 1984) EM: 2035-2039 ).
processo foi efectuado utilizando vários ciclos de amplificação T7RT demonstrados na Figura e acima descritos. Este processo é referido até aqui como a técn_i_ ca T7RT, por conveniência. Este processo tem várias vantagens sobre o anterior método PCR. Em primeiro lugar, a sequência alvo a ser amplificada pode ser, quer RNA como DNA,
o que é importante se o gene seleccionado está altamente expresso, desde que a transcriptase inversa AMV possa usar quer RNA ou DNA de cadeia simples, como um padrão.
Isto também é relevante para aplicações nas quais as sequências alvo são exclusivamente de RNA, como para a detecção do retrovirus. Em segundo lugar, a amplificação de cada ciclo completo, incluindo ambas as sequências, deve ser mais alta que com a técnica PCR (mais de 100 por cj. cio Dara T7RT, comparado comum máximo de 2 por ciclo para a técnica PCR), permitindo, assim, um número reduzido de ciclos (3 ciclos para uma amplificação de 10θ vezes para T7RT, contra, pelo menos, 20-25 para PCR) e o uso correspondente de uma menor quantidade de enzima. Em terceiro lugar, gra£ des quantidades de RNA podem ser produzidas para serem utilizadas em qualquer processo, quando o RNA é preferível ao DNA, como a translação em proteína, instabilidade quí mica, etc.
As investigações iniciais do método T7RT util iram os mesmos ol igonucleotídeos e sequências alvo, como des. crito nas secções anteriores. Como indica a Figura, são usados dois enzimas sucessivamente para cada ciclo: transcriptase inversa AMV, e polimerase de RNA T7. Fases repetidas de desnaturação, enrolamento em espiral e extensão são realizadas por alterações da temperatura da amostra (90-100°C para a desnaturação, 37-41°C para o enrolamento em espiral), e a adição do enzima a uma amostra contendo ácido nucleico a ser amplificado, um tampão adequado (indicado por fornecimentos de enzima), NTPs e dNTPs, excesso molar de iniciadores ol igonucleotídeos, e um inibidor de RNase.
Numa primeira experiência, o fragmento gene inicialmente sintetizado para conter uma sequência promotora (como acima descrito), foi usado para demonstrar a pratic_a bilidade do processo T7RT. Primeiro o substrato DNA foi transcrito pela polimerase de RNA T7, o que se esperava
I produzir um produto de RNA de 134 nt. Este material foi depois convertido de novo num DNA cadeia dupla, como se descreveu e mostrou na Figura uti 1 izando a transcriptase inversa AMV, na presença de dNTPs radio marcados. 0 pro duto maior de DNA esperado (e obtido) foi também 134 nt, com uma pequena quantidade de^material de 151 nt presente devido à presença contínua de fragmentos de gene que entram. Uma amostra de controlo foi tratada de forma se melhante excepto no facto de ser omitida a polimerase T7. Seguindo esta fase da transcriptase inversa, foi realiz_a do um segundo ciclo de amplificação directa por AMV RT, em cada amostra. Isto resultou na síntese de quantidades substanciais do produto de 151 nt , pela síntese do produto 134 nt utilizando oligo #1 (que tem o extra de 17 núcleo tídeos de promotor T7, na sua extremidade 5') como o inj_ ciador. Como o material de 134 nt era cerca de 10 vezes mais abundante (depois de um ciclo T7RT) do que o produto de 151 nt da reacção controlada, a amplificação T7 correspori deu à obtida por cerca de 4,5 ciclos do método PCR isolado. Esta amplificação foi conseguida sem optimizar o processo T7RT, para que se obtivessem maiores melhorias na eficácia e custo do método PCR.
Todas as publicações e Pedidos de patentes me_n cionados nesta Memória Descritiva são indicativos do grau de aptidão dos peritos no ramo, ao qual esta invenção diz respeito. Todas as publicações e Pedidos de patente estão aqui incorporados como referência â mesma extensão, como se cada publicação individual ou Pedido de patente fosse específica e individualmente indicado para ser incorporado como referência.
Estando agora a invenção totalmente descrita, será evidente para qualquer pessoa com conhecimentos do ramo que podem ser feitas muitas alterações e modificações sem nos afastarmos do espírito ou âmbito das reivindicações anexas.

Claims (15)

    REIVINDICAÇÕES
  1. (1) a hibridação duma molécula de polinucleotídeo de cadeia simples, de sequência X1'-P1'-T1-P21-X2 ', que é complementar a uma molécula alvo de sequência X1-P1-T-P2-X2, com um primeiro iniciador de sequência PR-P1 para formar:
    PR x
    P1
    X1 '-P 1 1 -T '-P21 -X21;
    (1) sequencialmente, a hibridação duma molécula alvo de polinucleotídeo de cadeia simples, sendo as sequências iniciadoras seguidas pela extensão dos tais iniciadores, e pela desnaturação, em que , pelo menos um desses iniciadores contém uma sequência pro motora para produzir um DNA intermediário de cadeia dupla, tendo uma sequência promotora a montante de uma sequência alvo, e (2) o aumento das cópias de RNA múltiplas, dessa sequêri cia alvo, a partir do dito intermediário, utilizando uma polímera, se de RNA capaz de ligar o dito promotor.
    1- Um método de multiplicação do número de cópias de uma sequência alvo de polinucleotídeo, num meio de reacção, caracterizado pelo facto de compreender:
  2. (2) a extensão duma cadeia complementar, para formar:
    PR
    P1--T--P2--X2 X1'_P1'_t1-P21-X2 1 , seguida da desnaturação, para formar uma primeira colecção de po1 inucleotídeos de cadeia simples;
    2- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracter/ zado pelo facto de compreender, além disso, (1) a preparação duma segunda colecção de intermediários DNA de cadeia dupla, possuindo uma sequência promotora, a montante, a partir da referida sequência alvo das ditas cópias de RNA, pela hibridação das ditas cópias de RNA, com as sequências iniciadoras estendidas e desnaturadas, e (2) o aumento das cópias de RNA múltiplas, a partir da dita segunda colecção de intermediários DNA de cadeia dupla.
  3. (3) a hibridação da dita primeira colecção de polinucle otídeos de cadeia simples, com um segundo iniciador de sequência P2 1 , para formar:
    PR-P1-T-P2-X2 Ρ21 ;
    3- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracter/ zado pelo facto da referida extensão compreender o contacto do d/ to meio de reacção com um enzima de transcriptase inversa.
  4. (4) a extensão duma cadeia complementar para formar:
    PR--P1--T--P2--X2 PR·-P1'-T’-P2' ; e
    4- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracter/ zado pelo facto do referido método compreender a hibridação da c_a deia invertida, duma molécula alvo de cadeia dupla, com um prime/ ro iniciador compreendendo uma sequência promotora, na sua extremidade 5', e uma sequência de ligação equivalente a uma sequência de cadeia não invertida 5', da molécula alvo, para a sequência a/ vo, a extensão duma primeira cadeia complementar, a partir do dito primeiro iniciador, utilizando a dita cadeia invertida como um padrão, desnaturada para formar uma primeira colecção de interme25 diários de po1inucleotídeo de cadeia simples, a hibridação da primeira colecção referida com um segundo iniciador que liga 3' à dita sequência alvo, na dita cadeia não invertida, a extensão duma cadeia complementar, a partir do segundo iniciador referido, utiH zando a dita primeira cadeia complementar como um padrão, para obter o dito intermediário de DNA de cadeia dupla, e o contacto do dito meio de reacção com uma polimerase de RNA capaz de ligar o d_i_ to promotor.
  5. (5) o aumento das cópias de RNA múltiplas de P1-T-P2,
    RR R tendo a fórmula P1 -T -P2 , utilizando uma polimerase de RNA capaz de ligar a região promotora de cadeia dupla
    PR
    PR1 ;
    em que:
    T é uma sequência alvo;
    T1 é uma sequência complementar a T;
    PR-P1 é um primeiro iniciador o 1igonuc1eotídeo , no qual PR compreende uma sequência promotora, e P1 é a sequência de ligação do primeiro iniciador referido;
    P11 é uma sequência complementar a P1;
    PR' é uma sequência complementar a PR;
    P21 é um segundo iniciador o 1igonuc1eotídeo ;
    P2 é uma sequência no alvo po1inuc1eotídeo , complementar a P2 ' ;
    X1 e X2 são sequências exteriores à sequência P1-T-P2, da referida molécula alvo, e podem, individualmente, estar presentes ou ausentes;
    X1 1 é uma sequência complementar a X1;
    Χ2' é uma sequência complementar a X2; e P1R-TR-P2R é uma molécula de RNA, em que P1R é uma
    R sequência equivalente a P1, T é uma sequência equivalente a T, e p
    P2 é uma sequência equivalente a P2.
    5- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracter^ zado pelo facto de compreender:
  6. (6) hibridação das cópias de RNA múltiplas referidas, da
    RR R fórmula P1 -T -P2 , com o dito segundo iniciador, para formar:
    P1R-TR-P2R P2 1 ;
    6- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 5, caracterizado pelo facto do referido método compreender, além disso, as fases de:
  7. 7- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 5, caracterç zado pelo facto da referida molécula alvo de po 1 i nuc 1 eot í deo de c_a deia simples ser RNA.
    (7) extensão duma cadeia complementar, para formar:
    PlR_TR-P2R P11-T1-P2 ', seguida da desnaturação para formar uma terceira colecção de poH nucleotídeos de cadeia simples;
  8. 8- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 5, caracterç zado pelo facto da dita molécula alvo de po1inuc1eotídeo de cadeia simples ser DNA.
    (8) hibridação da terceira colecção de po1inucleotídeos de cadeia simples referida, com o referido primeiro iniciador, p_a ra formar:
    PR
    P11-T1-P21;
  9. 9- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 5, caracter_i_ zado pelo facto da extensão compreender o contacto das sequências referidas, para que sejam estendidas com uma transcriptase inversa.
    (9) extensão das cadeias complementares, para formar:
    PR--P1--T--P2 PR 1-P1'-T'-P2' (10 ) repet ir a fase (5 ); e (11) facultativamente, repetir as fases (6)-(10), nas quais em cada ciclo de fases (6)-(10), cada PR-P1 e P21 de iniciador oligonucleotídeo representa o iniciador correspondente de um ciclo de fases precedente, ou um iniciador diferente do iniciador correspondente .
  10. 10- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 5, caracterç zado pelo facto da dita polimerase de RNA ser uma polimerase de
    RNA T7.
  11. 11- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto dos ditos iniciadores compreenderem sequências de ligação de 10 a 30 nucleotídeos, em comprimento.
  12. 12- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto dos ditos iniciadores estarem separados por menos de 200 pares de base.
  13. 13- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracte29 rizado pelo facto da dita sequência promotora se encontrar no ter minai 5' dum iniciador.
  14. 14- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto da referida moléclula alvo de polinucleotídeo, de cadeia simples, ser DNA, sendo a extensão efectuada utilizando se a transcriptase inversa, e estando os ditos iniciadores presen tes no dito intermediário, separados em não mais do que 150 pares de base.
  15. 15- Um método de detecção duma sequência alvo de polinucleotídeo, numa amostra, caracterizado pelo facto de compreender:
    a multiplicação do número de cópias da dita sequência alvo, de acordo com a reivindicação 1, e a detecção da presença dessas cópias multiplicadas.
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