JP3205555B2 - 複製型ｒｎａのターゲット依存合成 - Google Patents

複製型ｒｎａのターゲット依存合成

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 バイオアッセイのための核酸ハイブリッド形成プロー
ブの利用は、周知である。Gillespie,D.and Spiegelma
n,S.,“Ａ Quantitative Assay for DNA−RNA Hyb
rids with DNA Immobilized on ａ Membrane",J.
Mol.Biol.12:829−842（1965）は、DNAのアッセイを目
的とする分野における初期の論文のひとつである。一般
に核酸ハイブリッド形成アッセイには、例えば二重鎖核
酸の試料の熔融などによる試料中の核酸ポリマー鎖の分
離、ニトロセルロース膜などの固体表面への分離核酸鎖
の固定、及び検出するべき独特の配列（“ターゲット”
配列）と相補的な検出可能なプローブ配列の導入、及び
プローブを相補的ターゲット配列とハイブリッド形成さ
せるための、適した緊縮の条件下における培養が含まれ
る。洗浄により非ハイブリッド形成プローブを除去し、
残ったプローブの量を下記に概略を示す多種類の方法の
ひとつにより検出する。
最近開発された核酸ハイブリッド形成アッセイは、第
１の検出可能ターゲット特異的プローブ、及びしばしば
“捕獲プローブ”と呼ばれる第２のプローブの２種類の
プローブの使用を含む。Ranki,M.,Palva,A.,Virtanen,
M.,Laaksonen,M.,and Soderlund,H.,“Sandwich Hybr
idization as ａ Convenient Method for the D
etection of Nucleic Acids in Crude Samples",
Gene 21:77−85（1983）;Syvanen,A.−C.,Laaksonen,
M.,and Soderlund,H.,“Fast Quantification of N
ucleic Acid Hybrids by Affinity−besed Hybrid
Collection",Nucleic Acids Res.14:5037−5048（1
986）。捕獲プローブは、好ましくは第１のプローブが
相補的である配列に近い領域においてターゲット配列と
相補的な核酸配列を含む。捕獲プローブは、固体表面に
結合することができる手段を備えている。捕獲プローブ
と試料核酸のハイブリッド形成は溶液中で行い、そこで
ハイブリッド形成が急速に起こり、得られたハイブリッ
ドは固体表面に結合することができる。そのような固体
表面への結合手段のひとつの例はビオチンである。Lang
er,P.R.,Waldrop,A.A.and Ward,D.C.,“Enzymatic Sy
nthesis of Biotin−labeled Polynucleotides:Nove
l Nucleic Acid Affinity Probes",Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 78:6633−6637（1981）。ビオチンを経て、
捕獲プローブは固体支持体に連結されたストレプタビジ
ンに結合する。
ターゲット特異的プローブの検出にいくつかの方法を
使用する。ひとつの方法は、検出可能なリポーター基を
プローブに結合することである。そのようなリポーター
基の例は、蛍光分子及び32P−標識リン酸塩基である。
これらのリポーター基に基づくプローブ検出には、一試
料当たり約100万ターゲットという感度に関する実際的
制限がある。
他の方法は、シグナル形成系をプローブに結合するこ
とである。例は、ペルオキシダーゼなどの酵素である。
酵素−標識プローブを発色性基質と共に培養し、プロー
ブの量の指標として発色を測定する。Leary,J.J.,Brega
ti,D.J.,and Ward,D.C.,“Rapid and Sensitive Co
lorimetric Method for Visualizing Biotin−Labe
led DNA Probes Hybridized to DNA or RNA Im
mobilized on Nitrocellulose:Bio−Blots",Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 80:4045−4049（1983）。この方法
は、プローブによって形成された検出可能な信号を増幅
し、ターゲット配列分子の検出の感度を増す。しかし実
際上、プローブの非特異的な結合により、放射活性標識
と比較して感度の改善が制限され、例えば大体一試料当
たり100,000ターゲット分子の感度である。
さらに検出の感度を改善する他の方法は、ターゲット
配列の増幅である。増幅はインビボで行うことができ
る。Hartley,J.L.,Berninger,M.,Jessee,J.A.,Bloom,F.
R.and Temple,G.S.,“Bioassay for Specific DNA
Sequence Using ａ Non−Radioactive Probe",Ge
ne 49:295−302（1986）参照。増幅は、“ポリメラー
ゼ連鎖反応”（PCR）と呼ばれる方法を用いてインビト
ロにも行うことができる。Saiki,R.K.,Scharf,S.,Faloo
na,F.,Mullis,K.B.,Horn,G.T.,Erlich,H.A.,and Arnhe
im,N.,“Enzymatic Amplification of Betaglobin
Genomic Sequences and Restriction Site Analys
is for Diagnosis of Sickle Cell Anemia"Scien
ce 230:1350−1354（1985）;Saiki,R.K.,Gelfand,D.
H.,Stoffel,S.,Scharf,S.J.,Higuchi,R.,Horn,G.T.,Mul
lis,K.B.,and Erlich,H.A.,“Primer−directed Enzy
matic amplification of DNA With ａ Thermosta
ble DNA Polymerase",Science 239:487−491（198
8）;Erlich,H.A.,Gelfand,D.H.,and saiki,R.K.,“Spe
cific DNA Amplification",Nature 331:461−462（1
989）;Guatelli,J.C.,et.al.,Clin.Microbiol.Rev.２
（２）:217−226（1988）；及びMullis等、欧州特許出
願公開200362及び201184（U.S.特許4,683,195及び4,68
3,202も参照）。PCR法では、ターゲット配列の最初のみ
に相補的なプローブを使用する。プローブは、ターゲッ
ト配列全体の酵素的複製のプライマーとして働く。複製
過程が繰り返され、複製の度にターゲット配列の数が倍
増し、例えば100万コピーなどの多数のターゲット配列
が生成される。増幅されたターゲットの数の検出には、
検出可能プローブを使用することができる。PCR法は非
常に感度が良いが、“誤りの正の信号”の数、すなわち
ターゲットの真のコピーではない配列の数に制限され
る。この方法は、一サイクルに少なくとも２種類の核酸
プローブ及び三反応段階を必要とする。
感度の改善のためのさらに別の方法は、RNA依存性RNA
ポリメラーゼにより指数的に複製されたRNAを用いてプ
ローブを標識する方法である。そのようなポリメラーゼ
の例は、バクテリオファージＱ−ベータのレプリカーゼ
である。Haruna,I.,and Spiegelman,S.,“Autocatalyt
ic Synthesis of ａ Viral RNA In Vitro",Scie
nce 150:884−886（1965）。他の例は、ブロムモザイ
クウィルス レプリカーゼである。March et al.,Pos
itive Strand RNA Viruses Alan R.Liss,New Yor
k（1987）。この方法では、RNA標識が、ポリメラーゼに
よるRNAコピーの指数的合成の鋳型として働き、それに
よりRNAの量が、最初に存在した量より莫大に増幅され
る。Chu.B.C.F.,Kramer,F.R.,and Orgel,L.E.,“Synth
esis of an Amplifiable Reporter RNA for Bio
assays",Nucleic Acids Res.14:5591−5603（1986）;
Lizardi,P.M.,Guerra,C.E.,Lomeli,H.,Tussie−Luna,I.
and Kraner,F.R.,“Exponential Amplification of
Recombinana−RNA Hybridization Probes",Bio/Tec
hnology ６:1197−1203（1988年10月）；欧州特許出願
266,399（EP出願87903131.8）。
リポーターRNAの複製は、RNAがプローブに結合してい
る間に起こることもできるし、又は複製型RNAを複製の
前にプローブから分離することもできる。RNAをプロー
ブに結合させるために多種類の化学的結合法を使用する
ことができる。U.S.特許4,786,600,Lizardi,P.and Kra
mer,F.に記載の通り、プローブ配列は複製型組み替えRN
Aの一部であることができる。この組み替えRNAは特異的
にターゲット配列とハイブリッド形成することができな
ければならず、適したRNA依存性RNAポリメラーゼによる
指数的複製の鋳型となる能力を保持していなければなら
ない。
しかし、実際にこの方法の感度は、プローブの非特異
的結合により制限される。非特異的に結合したプローブ
は、ターゲットに特異的にハイブリッド形成するプロー
ブと同様にリポーターRNAの複製を導く。非特異的に結
合したプローブにより形成された信号は、通常“バック
グラウンド”と呼ばれ、それが存在すると感度が減少す
る。
1988年９月30日出願の合衆国特許出願251,696、Lizar
d,P.et al.,に、プローブ配列のアロステリックな特徴
を利用してバックグラウンドの問題を最小にする方法が
記載されている。プローブの側面にならぶ５′及び３′
配列は相補的であるが、中心配列はターゲット配列と相
補的である。プローブがターゲット配列に特異的に結合
する時、プローブの並列する自己相補的配列は互いに離
れ１本鎖領域を形成し、それはプローブの中心配列とタ
ーゲット核酸の間に形成された二重鎖領域の側面に並
ぶ。他方、プローブが非特異的に結合すると、プローブ
の並列する自己相補的５′及び３′配列は二重のままで
ある。プローブ−ターゲット対の特異的検出は、側面に
並ぶ自己相補的５′及び３′配列が単鎖構造がどうかに
よる。
核酸プローブの非特異的結合に起因するバックグラウ
ンド信号を除去する又は減少させるための改良法によ
り、より感度の高いハイブリッド形成アッセイが可能に
なり、そのようなアッセイの理論的に最高の感度を達成
する助けとなる。
発明の要約 本発明は、複製型RNAリポーター系を用いた、核酸タ
ーゲット配列を検出するための改良法に関する。本発明
の方法においては、２種類のプローブが、複製型RNAの
合成の鋳型となるDNA配列を含むターゲット特異的遺伝
子を形成する別々のポリメラーゼ−媒介反応のためのプ
ライマーとして働く（ここではターゲット特異的ハイブ
リッド形成、及び相補的DNA合成反応におけるDNA重合の
開始というその二元的機能を示すために“プローブ−プ
ライマー”と呼ぶ）。DNA依存性RNAポリメラーゼによる
ターゲット特異的遺伝子の転写により複製型RNAが得ら
れ、それがRNA依存性RNAポリメラーゼにより指数的に増
幅される。遺伝子及び複製型RNAの合成は、プローブ−
プライマーとターゲット配列の特異的相互作用に厳密に
依存しているので増幅信号（RNA）の生成はターゲット
依存性であり、従ってバックグラウンド信号が減少す
る。
ターゲット特異的遺伝子は、２個の単鎖オリゴヌクレ
オチドプローブを用いて標準的遺伝子クローニング法に
より合成する。一般に第１のプローブ−プライマーは、
プロモーター配列及びターゲット配列の第１領域と相補
的な配列を含むDNAであり、第２のプローブ−プライマ
ーはターゲット配列の第２領域に対応する配列を含むDN
Aである。ターゲット配列の第２領域配列は、ターゲッ
ト配列の第１領域に近接しているが、必ずしも接しては
いない。プローブ−プライマーの少なくともひとつは、
複製型RNAの配列に対応するか、又は複製型RNAの転写の
鋳型となることができるDNAに結合している。この配列
の正確な性質は本発明の実施態様（本明細書では「具体
化」という場合あり）によって異なる。ひとつの具体化
においては、中断していない複製型RNAの合成の鋳型と
なるDNAが第２プーローブ−プライマーに結合してい
る。他の具体化においては、中断していない複製型RNA
の配列に対応するDNAが、第１プローブ−プライマー中
のプロモーター配列とターゲットの第１領域に相補的な
配列の間にある。他の具体化においては、複製型RNAの
一部の配列に対応するDNAが第１プローブ−プライマー
中のプロモーター配列とターゲットの第１領域に相補的
な配列の間にあり、複製型RNAの残り部分の合成の鋳型
となるDNAが第２プローブ−プライマー中にある。他の
具体化においては、リボザイム（またはリボチームとい
う）配列の合成の鋳型となることができるDNAが第２プ
ローブ−プライマーに挿入されており、ターゲット特異
的遺伝子の転写から複製型RNAを配列特異的に切り離
す、又はあらかじめ決められた配列を含む転写物の複製
性を破壊する。
各具体化において、第１プローブ−プライマーはター
ゲット配列の第１領域とハイブリッド形成し、その後少
なくともターゲット配列の第２領域を通ってターゲット
配列の鋳型上に伸長する。得られた伸長生成物をターゲ
ット配列から分離する。第２のプローブ−プライマーは
伸長生成物とハイブリッド形成し、伸長生成物の鋳型上
にプロモーター配列を通って延びる（逆平行方向に）。
この第２の伸長により、遺伝子の転写を指示することが
できる機能的二重鎖プロモーターを持つ二重鎖DNA（タ
ーゲット特異的遺伝子）が形成され、それにより複製型
RNAが生成される。その後遺伝子がDNA依存性RNAポリメ
ラーゼにより転写され、複製型RNAを与える。得られたR
NAをその後RNA依存性RNAポリメラーゼにより複製し、複
製型RNAをターゲット配列の存在又はその量の指標とし
て検出する。
図の簡単な説明 図１は、その５′末端にターゲット核酸配列のコピー
を含む複製型RNAのターゲット依存性合成の具体化を示
す。
図２は、その３′末端にターゲット核酸配列のコピー
を含む複製型RNAのターゲット依存性合成の具体化を示
す。
図３は、その中にターゲット核酸配列のコピーを含む
複製型組み替えRNAのターゲット依存性合成の具体化を
示す。
図４は、ターゲット核酸配列のコピー及び、５′配列
を複製型RNAから切り離すことができるリボチームを
５′末端に含む複製型RNAのターゲット依存性合成の具
体化を示す。
図５は、ターゲット核酸配列のコピーをその中に含
み、ターゲット核酸配列のコピーがあらかじめ決められ
た配列を含む場合は分裂して複製型RNAを破壊すること
ができるリボチームを３′末端に含む、複製型組み替え
RNAのターゲット依存性合成の具体化を示す。
発明の詳細な説明 本発明の核酸ハイブリッド形成アッセイは、複製型RN
A分子の特異的生成に基づいている。アッセイは、２種
類の一般的方法により行うことができ、ひとつは複製型
RNA分子中にターゲット核酸配列の挿入し、他方は挿入
しない。好ましい具体化において、ターゲット配列は二
重鎖DNAのターゲット依存性合成により、複製型RNAリポ
ーター中に挿入されない。この具体化は図１に示されて
いる。
この具体化において、２個のオリゴヌクレオチド プ
ローブ−プライマーを使用する。第１のプローブ−プラ
イマーは単鎖DNA分子であり、（５′から３′の方向
に）RNAポリメラーゼプロモーター配列（ｐ）及びター
ゲット配列の第１領域と相補的な配列（ａ）を含む。第
２のプローブ−プライマーは、単鎖DNA分子であり、
（３′から５′方向に）ターゲット配列の第１領域
（ａ′）に近接しているが必ずしも接してはいないター
ゲットの第２領域に対応する配列（ｃ′）、及び複製型
RNAの合成の鋳型となることができるDNA配列（ｍ′）を
含む。下記に示す通り、プローブ−プライマーは、２回
のプライマー−依存性伸長反応においてターゲット特異
的遺伝子を生成するために使用する。得られた人工の遺
伝子は、その後複製型RNAの合成の鋳型となることがで
きる。
第１のプローブ−プライマーにおいては、どんなプロ
モーター配列を使用することもできる。プロモーター配
列は一般に約20ヌクレオチドの長さである。好ましいプ
ロモーター配列は、バクテリオファージT7 RNAポリメ
ラーゼのための強いプロモーターである。他の適したプ
ロモーターには、バクテリオファージSp6及びT3、なら
びに大腸菌（Escherichia coli）lac及びtrpプロモー
ターが含まれる。プローブ−プライマー配列は、核酸合
成に関する適した化学により合成することができ（例え
ばベータ−シアノエチルホスホルアミダイト化学）、又
は生物源から単離することができる。
一般にターゲット配列の領域に相補的であるか対応す
るプローブ−プライマー配列は、ターゲット配列に十分
類似しており、感知できる程の非特異的ハイブリッド形
成を含まずに、適した条件下で配列又はその相補体（本
明細書では「補体」という場合あり）とハイブリッド形
成することができる。
方法の第１段階で（図Ｉ）、第１プローブ−プライマ
ーがターゲット配列の第１領域（ａ′）とハイブリッド
形成する。（図中、ターゲットは領域ｂ′を含むが、こ
れはターゲット配列の第１領域（ａ′）とターゲット配
列の第２領域（ｃ′）が接していない場合を示す）。プ
ローブ−プライマーのハイブリッド形成に適した条件
は、同業者に周知である。その後ハイブリッド形成した
プローブ−プライマーを、ターゲット配列の第２領域
（ｃ′）を通ってターゲット配列の鋳型上に伸長し、伸
長生成物（ａ ｂ ｃ）を形成する。プローブ−プライ
マーは適したポリメラーゼによりそれ自身の伸長を開始
する。例えばOkayama and Berg,Mol.Cell.Biol.２:16
1−170（1982）参照。
ターゲット核酸がDNAであるかRNAであるかにより、そ
れぞれDNA依存性又はRNA依存性DNAポリメラーゼを用い
て、伸長生成物を合成する（図II）。第１プローブ−プ
ライマーの伸長部分を破線で示す。適したポリメラーゼ
の例には、大腸菌（E.coli）DNAポリメラーゼＩ、この
酵素のクレノウフラグメント、T4 DNAポリメラーゼ、T
aqポリメラーゼ及び逆転写酵素が含まれる。伸長反応
は、反応混合物試料に適したポリメラーゼ及びデオキシ
リボヌクレオシド三リン酸を加えることにより行う。反
応は標準の条件下で行うことができる。
その後新しく合成した伸長生成物をターゲット配列か
ら分離する。これは、核酸鎖を変性させるいかなる物理
的、化学的又は酵素的方法によっても行うことができ
る。好ましい方法は、核酸を一般に約80−105℃の温度
範囲に加熱する方法である。
鎖の分離後、第２のプローブ−プライマーを伸長生成
物とハイブリッド形成させる（図III）。第２のプロー
ブ−プライマーはターゲットの第２領域（ｃ′）に対応
する配列、及び複製型RNAの合成の鋳型となることがで
きるDNA配列（ｍ′）を含む。第２のプローブ−プライ
マーは、第１のプローブ−プライマーの伸長部分とｃに
おいて結合する。第２のプローブはプロモーター配列を
通って第１の伸長生成物の鋳型上で伸長し、プロモータ
ー補体（ｐ′）を形成する（図IV）。第２のプローブ−
プライマーの伸長部分を破線で示す。この結果、複製型
RNAの合成の鋳型となることができるDNAに結合したRNA
ポリメラーゼのための機能的プロモーターが合成され
る。プロモーターは、その補体と結合すると活性になり
二重鎖を製造する。Milligan,J.F.et al.,“Oligoribo
nucleotide Synthesis Using T7 RNA Polymerase
and Synthetic DNA Templates"Nucleic Acid Re
s.15:8783−8798（1987）参照。２個のプロモーター補
体の機能的結合は、ターゲットのその領域と正しく相互
作用する各プローブ−プライマーに厳密に依存する。従
って転写活性DNAを与える２個の鋳型依存性DNA伸長は、
そのターゲット配列へのプローブ−プライマーの連続的
ハイブリッド形成に厳密に依存する。
その後DNAは、RNAポリメラーゼのための新しく形成し
たプロモーターに依存して転写され、その５′末端にタ
ーゲット配列のコピーを持つ複製型RNAを含む転写生成
物を製造する（図Ｖ）。簡便に、転写のためのRNAポリ
メラーゼを第２のプローブ−プライマーの伸長に使用す
るDNAポリメラーゼと共に加えて、第２の伸長反応によ
るプロモーターの形成の直後に転写を起こすことができ
る。
転写のためのRNAポリメラーゼは、両立するプロモー
ター配列と関連して選ぶ。上記の通り好ましいRNAポリ
メラーゼはT7 RNAポリメラーゼである。
次の段階は、RNAをRNA依存性RNAポリメラーゼ（RNAレ
プリカーゼ）により複製する増幅反応である。レプリカ
ーゼの使用条件は、文献により周知である。例えばKram
er,F.R.,et al.J.Mol.Biol.89:719−736（1974）,Liza
rdi,P.M.et al.Bio/Technology ６:1197−1203（198
8）参照。
本発明の方法においては、いかなる複製型RNA及びそ
の相同RNA依存性RNAポリメラーゼを使用することもでき
る。好ましい複製型RNAは、指数的に複製されるバクテ
リオファージ Ｑ−ベータのRNA依存性RNAポリメラーゼ
（Ｑ−ベータ レプリカーゼ）のための鋳型である。特
に好ましいのは、ミディバリアント（midivariant）RNA
（MDV−１ RNA;Kacian,D.L.et al.Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 69:3038−3042（1972））又は変異株MDV−１ R
NA（Kramer,F.R.et al.同上）である。これらのRNAは
組み替え型で複製することができるという利点を有し、
下記の本発明の別の具体化を行うことができる。Miele,
E.A.et al.,J.Mol.Biol.171:281−295（1983）;U.S.特
許4,786,600参照。この文献による記載をここに引用す
る。MDV−１ RNAは３′又は５′伸長生成物を用いて複
製することができ、下記のさらに別の具体化のいくつか
を行うことができる。しかし３′又は５′伸長生成物は
複製の間にコピーすることができず、従ってターゲット
配列の増幅はないことを注意することが大切である。
複製型RNAの増幅のための好ましい具体化は、Ｑ−ベ
ータ レプリカーゼの使用であるが、他のRNAレプリカ
ーゼを用いて増幅反応を行うこともできる。他の有用な
レプリカーゼには、ブロムモザイクウィルスのレプリカ
ーゼなどの他のウィルス レプリカーゼが含まれる。
その後複製型RNAをターゲット配列の存在又はその量
の指標として検出する。RNAは多種類の方法により検出
することができる。例えば複製型RNAを、例えば複製型R
NAの３′末端に蛍光修飾ヌクレオチドを付与するT4 RN
Aリガーゼ触媒反応により蛍光性とすることができる。C
osstick et al.,Nucleic Acids Res.12,1791（198
4）参照。蛍光を与えることにより、標準の蛍光検出法
によりRNAを検出することができる。複製型RNAの検出に
使用することができる他の方法は、核酸に特異的に結合
するリポーター物質をRNAに結合させ、それによって与
えられる信号を検出する方法である。リポーター物質
は、RNAを複製した反応媒体中に加えることができ、又
はEOTEOLATM紙などの正電荷を帯びた担体としてRNAを単
離した媒体中に加えることもできる。そのようなリポー
ター物質には：“ステインオール”（Dahlberg et a
l.,J.Mol.Biol.41,139（1969）；メチレンブルー（Ding
man et al.,Biochemistry 7,659（1968）及びシルバ
ーステイン（Sammons et al.,Electrophoresis 2,13
5（1981）;Igloi,Anal.Biochem,134,184（1983）などの
発色染料；エチジウムブロミド又はプロピジウムヨーダ
イドなどのRNAに結合する蛍光化合物（Sharp et al.,
Biochemistry 12,3055（1973）;Bailey et al.,Ana
l.Biochem,70,75（1976））及びレプリカーゼによる複
製の鋳型となるRNAに特異的に結合する蛍光性化合物、
例えばＱ−ベータ レプリカーゼのウィルス サブユニ
ットと複合したフィコビリタンパク（Oi et al.,J.Ce
ll Biol.93,981（1982）;Stryer et al.,U.S.特許4,
520,110）が含まれる。
この具体化の変形において（図２）、第１のプローブ
−プライマーは、プロモーター配列（ｐ）、中断してい
ない複製型RNAに対応するDNA配列（ｍ）及びターゲット
配列の第１領域と相補的なDNA配列（ａ）を含む。第２
のプローブ−プライマーは、ターゲット配列の第２領域
に対応するDNA配列（ｃ′）を含む。第１のプローブ−
プロライマーをターゲット配列とハイブリッド形成させ
（図Ｉ）、その後DNAポリメラーゼを用いて伸長し、伸
長生成物（ｐ ｍ ａ ｂ c;図II）を製造する。伸長
生成物を分離し、第２のプローブ−プライマーを、第１
のプローブ−プライマーの伸長部分とハイブリッド形成
させる（図III）。その後第２のプローブ−プライマー
を、プロモーター配列と相補的な配列を含むようにDNA
依存性DNAポリメラーゼを用いて伸長する（図IV）。そ
の結果、複製型RNA分子のための鋳型に結合した機能的
プロモーターが形成される。転写により３′末端にター
ゲット配列のコピー（ａ ｂ ｃ）を持つ複製型RNA
（ｍ）が得られる。転写物をRNAレプリカーゼにより複
製して、ターゲット配列のコピーを含まない複製型RNA
を指数的に合成する。
本発明の他の具体化においては（図３に示す）、ター
ゲット配列を複製型RNAに挿入してターゲット配列のコ
ピーである配列を含む組み替えRNA分子を得るように、
人工遺伝子のターゲット依存合成を設計する。この具体
化には、第１及び第２プローブが異なる以外は前出の具
体化と同一の基本原理が含まれる。第１のプローブ−プ
ライマーDNAは、（５′から３′の方向に）ｉ）プロモ
ーター配列（ｐ）、ii）複製型RNAの一部（例えばMDV−
１（＋）RNAの５′領域の63ヌクレオチド）に対応するD
NA配列（ｘ）、及びiii）ターゲット配列の第１領域と
相補的な配列（ａ）を含む。第２のプローブ−プライマ
ーは、（３′から５′の方向に）ターゲット配列の第２
領域に対応する配列（ｃ′）、及び第１のプローブ−プ
ライマーに含まれていない複製型RNA配列の部分（例え
ばMDV−１（−）RNAの３′末端における157ヌクレオチ
ド）と相補的なDNA配列（ｙ′）を含む。上記の２回の
ハイブリッド形成及びプライマーの伸長の段階（図Ｉ−
IV）を行い、ターゲット領域のコピー（ａ ｂ ｃ）を
挿入して含む複製型組み替えRNAの合成の鋳型と結合し
た機能的プロモーターを含むDNA分子を得る。転写物をR
NAレプリカーゼと培養すると、全転写物が複製される。
本発明の他の具体化は、RNA転写物の特異的分裂を行
うことができるリボチームの使用を含む。リボチーム
は、RNA分子の他の部分と相互作用してそれを切断するR
NA分子の一部である。リボチーム配列は、あらかじめ決
められたRNA配列（リボチーム認識部位）を切断するよ
う設計することができる。Uhlenbeck,O.C.Nature 328:
590−600（1987）;Haseloff,J.and Gerlach,W.L.Natur
e 334:585−591（1988）。一般にリボチームの使用に
は、その後の培養又は緩衝液組成の変更は必要でない。
ひとつの具体化において（図４）、第１のプローブ−
プライマーは、（５′から３′の方向に）プロモーター
配列（ｐ）及びターゲット配列の第１領域と相補的なDN
A配列（ａ）を含む。第２のプローブ−プライマーは、
（３′から５′の方向に）ターゲットの第２領域に対応
するDNA配列（ｃ′）、リボチームの鋳型となることが
できるDNA配列（ｒ′）、リボチーム認識部位の鋳型と
なることができるDNA（ｓ′）、及び複製型RNAの鋳型と
なることができるDNA（ｍ′）を含む。リボチーム配列
はDNA中に存在するが、それは不活性である（リボチー
ムはRNAとしてのみ活性である）。２回のハイブリッド
形成及び伸長を行い（図Ｉ−IV）、得られた人工の遺伝
子を転写する。転写の過程でリボチーム認識部位が合成
された後、前に合成されたリボチームがリボチーム認識
部位におけるRNA転写物の分裂を触媒する。その結果、
複製型RNAは、複製を妨害する転写物の他の部分から切
断される。５′又は３′末端に長い伸長物を持つMDV−1
RNAは一般にＱ−ベータレプリカーゼの基質として良く
ないので、伸長物の除去により複製のためのより良い基
質が得られる。
リボチームを使用した精製により、ヌクレオチド配列
の異なる対立あるいは他の変異体（例えば突然変異）間
の区別が可能になる（図５）。この目的のために、第１
のプローブ−プライマーは、５′から３′の方向にプロ
モーター配列（ｐ）、複製型RNAの一部に対応するDNA配
列（ｘ）及びターゲット中の問題の領域に近接している
が必ずしも接してはいないターゲット配列の第１領域と
相補的な配列（ａ）を含む。第２のプローブ−プライマ
ーは、ターゲットの第２領域に対応する配列（ｃ′）、
及び第１プローブ−プライマーに含まれない複製型RNA
配列の補体であるDNA配列、スペーサー配列及びリボチ
ーム合成の鋳型となるDNA配列（ｒ′）を含む。
２回のハイブリッド形成及び伸長段階を行う（図Ｉ−
IV）。転写により、ターゲット領域のコピーを挿入して
含み、さらにその３′末端にリボチームを含み、スペー
サー領域によりRNAの他の部分から隔てられた複製型組
み替えRNAを得る。リボチームは、その配列がリボチー
ムの認識部位の場合、あらかじめ決められた問題の領域
と相互作用する。例えばリボチームの特異性は、あらか
じめ決められた特定の変異配列が存在する場合のみに挿
入領域内で複製型RNAの分裂が起こるような特異性であ
ることができる。この自己分裂により組み替えRNAの複
製性は完全に破壊される。Nishihara,T.et al.,J.Bioc
hem.93:669−674（1983）。この方法で、信号の生成
は、たったひとつのヌクレオチドによって変化し得るあ
らかじめ決められた特定の配列が存在するか又は存在し
ないかに依存するようになる。
スペーサーは、リボチームが自由に認識部位と相互作
用するのに十分な長さである。これは実験により決定す
ることができる。MDV−１ RNAの場合、スペーサーは典
型的に20−150ヌクレオチドの長さである。
方法の一種の型として、種々の核酸構築物のいずれか
を固相に固定するのが望ましい。例えばターゲット特異
的遺伝子を、第２のプライマー伸長反応の後に反応媒体
から分離するために、固相に固定することができる。こ
の目的のために、プローブ−プライマーを固相に結合す
るための要素を含むように設計することができる。これ
らの要素にはホモポリマー尾部及びビオチン分子が含ま
れる。
本発明の方法を行うための試薬は、集めてキットとす
ることができる。一般にキットは、それぞれの容器中に
以下の試薬を含む:a）上記の具体化のいずれかに従う第
１及び第２プローブ−プライマー、ｂ）プライマー伸長
のためのDNAポリメラーゼ及び４個のデオキシリボヌク
レオシド三リン酸、ｃ）ターゲット特異的遺伝子の転写
のためのDNA依存性RNAポリメラーゼ及び４個のリボヌク
レオシド三リン酸、ｄ）リポーターRNAの複製のためのR
NAレプリカーゼ、及びｅ）リポーターRNAの検出手段。R
NAターゲット配列の検出のためのキットは、第１のプラ
イマー伸長反応を行うためのRNA依存性DNAポメラーゼを
含むが、DNAターゲット配列の検出のためのキットは第
１のプライマー伸長反応を行うためのDNA依存性DNAポリ
メラーゼを含む。キットは又、適した参照標準、緩衝液
及び洗浄溶液を含むことができる。方法の型により、核
酸構築物（例えば人工遺伝子又は複製RNA、あるいは両
方）の固定のための固相担体などの、その他の成分を含
むこともできる。
本発明の方法は、どのようなターゲット核酸配列の検
出にも使用することができる。本方法は特異的遺伝子、
遺伝子片、又はRNA分子の検出に使用することができ
る。アッセイは、例えば組織、血液及び尿試料に関して
臨床的に有用であり、同様に食物工学、農業、及び生物
学的研究において有用である。精製された又は精製され
ていない、どのような核酸の供給源も試料として使用す
ることができる。核酸は単鎖であることも二重鎖である
こともできる。典型的に核酸は、生物の組織又は液体か
ら抽出する。これは、フェノール抽出などの標準的方法
で行うことができる。Lizardi,P.（1983）,Methods in
Enzymology 96:24−38。
調べるべき核酸が二重鎖の場合、ひとつが鋳型として
働くように、鎖を分離することが必要である。これは、
分離段階として、又はプライマー伸長生成物の合成と同
時に行うことができる。この鎖の分離は、熔融などの核
酸鎖の分離のためのいずれの適した方法によっても行う
ことができる。
本発明の方法は、複製型RNAを用いて得られる高度の
増幅を利用し、同時に簡単な複製型プローブを用いた場
合に伴うバックグラウンドの問題を除去する。本方法は
基本的にPCR法と異なる。PCR法においては、ターゲット
配列は多数回のプライマー伸長サイクルにより増幅され
る。本発明の方法では、ターゲット核酸そのものは増幅
されず、人工遺伝子の１個のコピーの合成に使用され
る。遺伝子の転写により複製型RNAが生成される。複製
型RNAの指数的な複製により増幅が行われる。増幅はタ
ーゲット特異的遺伝子の合成に厳密に依存している。こ
の厳しい依存性は、非特異的プローブ結合によるバック
グラウンド信号を減少させる。
本発明を以下の実施例によりさらに説明する。
実施例 実施例Ｉ 1.ターゲット核酸（この場合はRNA）を含む試料を、フ
ェノール抽出などの標準的核酸精製法により準備する
（Lizardi,1983,Methods in Enzymology 96:24−38参
照）。
2.エタノール沈澱の後、核酸試料を、40mMのトリス−HC
l（pH8.0）、10mMのMgCl2、5mMのジチオトレイトール
（DTT）、40mMのKCl、60μＭの各デオキシリボヌクレオ
シド三リン酸、50μg/mlの牛血清アルブミン、及び逆転
写酵素を含む溶液に溶解する。この溶液は、FIRST PRO
BE−PRIMERも含み、それは（５′末端から）:T7 RNAポ
リメラーゼ プロモーター配列、その次にターゲットの
第１領域と相補的なDNA配列を含む。試料を42℃にて1.5
分間培養して第１のDNA伸長生成物を合成する。Okayama
and Berg,1982,Mol.Cell.Biol.２:161−170）。
3.ターゲット核酸から第1DNA伸長生成物を放出させるた
めに、試料を90℃に30秒間加熱する。
4.SECOND PROBE−PRIMERを反応に加える。このプロー
ブ−プライマーは（３′末端から）：ターゲット配列の
第２領域に対応し、DNA伸長生成物とハイブリッド形成
するDNA配列、及びその次に複製型RNAの合成の鋳型とな
ることができ、組み替え配列であることもできる配列を
含む（Lizardi et al.,1988,Biotechnology,同上）。
DNAポリメラーゼ（クレノウフラグメント）を加え、試
料を42℃にて1.5分間培養し、第１のDNA伸長生成物の補
体を合成する。この段階により、ファージRNAポリメラ
ーゼプロモーター及び転写により複製型RNAを与えるこ
とができるDNAを含む遺伝子の合成が完了する。
5.T7 RNAポリメラーゼ及び400μＭの各リボヌクレオシ
ド三リン酸を試料に加える（これらの成分は段階４で加
えることもできる）。試料を37℃にて10分間培養し、人
工遺伝子の転写を起こす。人工遺伝子におけるSP6ファ
ージ プロモーターの利用はMelton et al.,1984,Nuc
leic Acids Research,12:7035−7056に記載されてい
る。
6.Q−ベータ レプリカーゼを反応に加え、前段階で製
造した転写生成物を複製する。
7.複製により生成したRNAの量を、放射活性ヌクレオチ
ドの挿入、又はエチジウムブロミドなどの蛍光染料によ
る染色などの周知の方法により測定する。
実施例II 本実施例と最初の実施例の差は、FIRST及びSECOND
プローブ−プライマーの組成である。
1.ターゲット核酸（この場合DNA）を含む試料を上記の
要領で準備する。
2.核酸試料を、40mMのトリス−MCl（pH8.0）、10mMのMg
Cl2、5mMのDTT、40mMのKCl、60μＭの各デオキシリボヌ
クレオシド三リン酸、50μg/mlのBSA、及びDNAポリメラ
ーゼＩのクレノウフラグメントを含む溶液に溶解する。
この溶液は、FIRST PROBE−PRIMERも含み、それは
（５′末端から）:T7 RNAポリメラーゼ プロモーター
配列、その次に複製型RNAの合成の鋳型となることがで
きるDNA配列、及び最後にターゲットの第１領域と相補
的なDNA配列を含む。試料を37℃にて1.5分間培養して第
１のDNA伸長生成物を合成する。
3.ターゲット鎖から第1DNA伸長生成物を放出させるため
に、試料を90℃に30秒間加熱する。
4.SECOND PROBE−PRIMERを反応に加える。このプロー
ブ−プライマーは（３′末端から）：ターゲット配列の
第２領域に対応し、DNA伸長生成物とハイブリッド形成
するDNA配列を含む。DNAポリメラーゼＩのクレノウフラ
グメントを加え、試料を37℃にて1.5分間培養し、第１
のDNA伸長生成物の補体を合成する。この段階により、
ファージRNAポリメラーゼプロモーター及び転写により
複製型RNAを与えることができるDNAを含む遺伝子の合成
が完了する。
5.T7 RNAポリメラーゼ及び400μＭの各リボヌクレオシ
ド三リン酸を試料に加える（これらの成分は段階４で加
えることもできる）。試料を37℃にて10分間培養し、人
工遺伝子の転写を起こす。
6.Q−ベータ レプリカーゼを反応に加え、前段階で製
造した転写生成物を複製する。
7.複製により生成したRNAの量を、放射活性ヌクレオチ
ドの挿入、又はエチジウムブロミドなどの蛍光染料によ
る染色などにより測定する。
実施例III この実施例では、FIRST及びSECONDプローブ−プライ
マーがやはり異なり、それぞれが複製型RNAの一部を合
成するための鋳型となることができる配列を含む。ター
ゲットのコピーは結局、複製型RNAリポーターの一部と
なり、複製により増幅される。
1.ターゲット核酸（この場合DNA）を含む試料を上記の
要領で準備する。
2.エタノール沈澱の後、核酸試料を、40mMのトリス−HC
l（pH8.0）、10mMのMgCl2、5mMのDTT、40mMのKCl、60μ
Ｍの各デオキシリボヌクレオシド三リン酸、50μg/mlの
BSA、及びDNAポリメラーゼのクレノウフラグメントを含
む溶液に溶解する。この溶液は、FIRST PROBE−PRIMER
も含み、それは（５′末端から）:T7 RNAポリメラーゼ
プロモーター配列、その次に複製型RNAの一部に対応
するDNA配列、及び最後にターゲットの第１領域と相補
的なDNA配列を含む。試料を42℃にて1.5分間培養して第
１のDNA伸長生成物を合成する。
3.ターゲット鎖から第1DNA伸長生成物を放出させるため
に、試料を90℃に30秒間加熱する。
4.SECOND PROBE−PRIMERを反応に加える。このプロー
ブ−プライマーは（３′末端から）：ターゲット配列の
第２領域に対応し、DNA伸長生成物とハイブリッド形成
するDNA配列、及びその次に複製型RNA配列中のFIRST P
ROBE−PRIMERに含まれていなかった残りの部分の合成の
鋳型となることができる配列を含む。DNAポリメラーゼ
のクレノウフラグメントを加え、試料を42℃にて1.5分
間培養し、第１のDNA伸長生成物の補体を合成する。こ
の段階により、ファージRNAポリメラーゼプロモーター
及び転写により複製型RNAを与えることができるDNAを含
む遺伝子の合成が完了する。合成の過程で、遺伝子にタ
ーゲット配列が挿入される。得られた人工遺伝子は、タ
ーゲット配列のコピーを含む組み替えRNAの合成の鋳型
となることができる。
5.T7 RNAポリメラーゼ及び400μＭの各リボヌクレオシ
ド三リン酸を試料に加える（これらの成分は段階４で加
えることもできる）。試料を37℃にて10分間培養し、人
工遺伝子の転写を起こす。
6.Q−ベータ レプリカーゼを反応に加え、前段階で製
造した転写生成物を複製する。
7.複製により生成したRNAの量を、放射活性ヌクレオチ
ドの挿入、又はエチジウムプロミドなどの蛍光染料によ
る染色などの周知の方法により測定する。
リボチームを含む方法 リボチームの使用を含む本方法は、参照文献で引用し
た、リボチームが作用できるような少しの修正を行って
実施例Ｉ−IIIに記載の方法で行うことができる。
本発明の主な態様は次のとおりである。
1.ターゲット核酸配列の検出法において、 a.プロモーター配列及びターゲット配列の第１領域と相
補的な配列を含む第１の単鎖オリゴデオキシヌクレオチ
ド プローブ−プライマーをターゲット配列の第１領域
とハイブリッド形成させ； b.プローブ−プライマーを、ターゲット配列の第１領域
と近接するが必ずしも接してはいないターゲット配列の
第２領域を通ってターゲット配列の鋳型上で伸長し、DN
A伸長生成物を製造し； c.DNA伸長生成物をターゲット配列から分離し； d.複製型RNAの製造の鋳型となることができるDNA配列、
及びターゲット配列の第２領域に対応する配列を含む第
２のオリゴデオキシヌクレオチド プローブ−プライマ
ー伸長生成物とハイブリッド形成させ； e.第２のプローブ−プライマーを伸長生成物の鋳型上で
伸長し、機能的二重鎖プロモーター、及び複製型RNAの
合成の鋳型となることができるDNAを含む二重鎖DNAを製
造し； f.DNAを転写して複製型RNAを製造し； g.RNAを複製し； h.ターゲット核酸配列の存在又は量の指標として、複製
されたRNAを検出する段階を含むことを特徴とする方
法。
2.第１項に記載の方法において、第１のプローブ−プラ
イマーのプロモーター配列がT7 RNAポリメラーゼ プ
ロモーターであることを特徴とする方法。
3.第１項に記載の方法において、第１及び第２のプロー
ブ−プライマーをDNAポリメラーゼにより伸長すること
を特徴とする方法。
4.第３項に記載の方法において、ターゲット核酸配列が
DNA配列であり、第１及び第２のプローブ−プライマー
をDNA依存性DNAポリメラーゼにより伸長することを特徴
とする方法。
5.第４項に記載の方法において、DNA依存性DNAポリメラ
ーゼが大腸菌（Escherichia coli）ポリメラーゼＩ又
はそのクレノウフラグメント、あるいはTaqポリメラー
ゼであることを特徴とする方法。
6.第３項に記載の方法において、ターゲット核酸配列が
RNAであり、第１プローブ−プライマーをRNA依存性DNA
ポリメラーゼにより伸長することを特徴とする方法。
7.第１項に記載の方法において、DNA伸長生成物を熱変
性によりターゲット配列から分離することを特徴とする
方法。
8.第１項に記載の方法において、転写段階をT7 RNAポ
リメラーゼ、T3 RNAポリメラーゼ又はSP6 RNAポリメ
ラーゼを用いて行うことを特徴とする方法。
9.第１項に記載の方法において、複製型RNAがRNA依存性
RNAポリメラーゼのための鋳型であることを特徴とする
方法。
10.第９項に記載の方法において、複製型RNAがバクテリ
オファージ Ｑ−ベータのレプリカーゼのための鋳型で
あることを特徴とする方法。
11.第10項に記載の方法において、複製型RNAがミディバ
リアントRNAであることを特徴とする方法。
12.第１項に記載の方法において、複製型RNAをエチジウ
ムブロミド又はプロピジウムヨーダイド染色により検出
することを特徴とする方法。
13.ターゲット核酸配列の検出法において、 a.プロモーター配列、複製型RNAに対応するDNA配列及び
ターゲット配列の第１領域と相補的なDNA配列を含む第
１の単鎖オリゴデオキシヌクレオチド プローブ−プラ
イマーをターゲット配列の第１領域とハイブリッド形成
させ； b.プローブ−プライマーを、ターゲット配列の第１領域
と近接するが必ずしも接してはいないターゲット配列の
第２領域を通ってターゲット配列の鋳型上で伸長し、DN
A伸長生成物を製造し； c.DNA伸長生成物をターゲット配列から分離し； d.ターゲット配列の第２領域に対応する配列を含む第２
のオリゴデオキシヌクレオチド プローブ−プライマー
を伸長生成物とハイブリッド形成させ； e.第２のプローブ−プライマーを伸長生成物の鋳型上で
伸長し、機能的二重鎖プロモーター、及び複製型RNAの
合成の鋳型となることができるDNAを含む二重鎖DNAを製
造し； f.DNAを転写して複製型RNAを製造し； g.RNAを複製し； h.ターゲット核酸配列の存在又は量の指標として、複製
されたRNAを検出する段階を含むことを特徴とする方
法。
14.第13項に記載の方法において、第１のプローブ−プ
ライマーのプロモーター配列がT7 RNAポリメラーゼ
プロモーターであることを特徴とする方法。
15.第13項に記載の方法において、第１及び第２のプロ
ーブ−プライマーをDNAポリメラーゼにより伸長するこ
とを特徴とする方法。
16.第13項に記載の方法において、ターゲット核酸配列
がDNA配列であり、第１及び第２のプローブ−プライマ
ーをDNA依存性DNAポリメラーゼにより伸長することを特
徴とする方法。
17.第16項に記載の方法において、DNA依存性DNAポリメ
ラーゼが大腸菌（Escherichia coli）ポリメラーゼＩ
又はそのクレノウフラグメント、あるいはTaqポリメラ
ーゼであることを特徴とする方法。
18.第13項に記載の方法において、伸長生成物を熱変性
によりターゲット配列から分離することを特徴とする方
法。
19.第13項に記載の方法において、転写段階をT7 RNAポ
リメラーゼ、T3 RNAポリメラーゼ又はSP6 RNAポリメ
ラーゼを用いて行うことを特徴とする方法。
20.第13項に記載の方法において、複製型RNAがRNA依存
性RNAポリメラーゼのための鋳型であることを特徴とす
る方法。
21.第20項に記載の方法において、複製型RNAがバクテリ
オファージ Ｑ−ベータのレプリカーゼのための鋳型で
あることを特徴とする方法。
22.第21項に記載の方法において、複製型RNAがミディバ
リアントRNAであることを特徴とする方法。
23.第13項に記載の方法において、複製型RNAをエチジウ
ムブロミド又はプロピジウムヨーダイド染色により検出
することを特徴とする方法。
24.ターゲット核酸配列の検出法において、 a.プロモーター配列、複製型RNAの一部に対応するDNA配
列及びターゲット配列の第１領域と相補的なDNA配列を
含む第１の単鎖オリゴデオキシヌクレオチド プローブ
−プライマーをターゲット配列の第１領域とハイブリッ
ド形成させ； b.プローブ−プライマーを、ターゲット配列の第１領域
と近接するが必ずしも接してはいないターゲット配列の
第２領域を通ってターゲット配列の鋳型上で伸長し、DN
A伸長生成物を製造し； c.DNA伸長生成物をターゲット配列から分離し； d.第１のプローブ−プライマーに含まれていなかった複
製型RNA配列の一部と相補的なDNA配列、及びターゲット
配列の第２領域に対応するDNA配列を含む第２のオリゴ
デオキシヌクレオチド プローブ−プライマーを伸長生
成物とハイブリッド形成させ； e.第２のプローブ−プライマーを伸長生成物の鋳型上で
伸長し、機能的二重鎖プロモーター、及びターゲット配
列のコピーを挿入して含む複製型RNAの合成の鋳型とな
ることができるDNAを含む二重鎖DNAを製造し； f.DNAを転写して複製型RNAを製造し； g.RNAを複製し； h.ターゲット核酸配列の存在又は量の指標として、複製
されたRNAを検出する段階を含むことを特徴とする方
法。
25.第24項に記載の方法において、第１のプローブ−プ
ライマーのプロモーター配列がT7 RNAポリメラーゼ
プロモーターであることを特徴とする方法。
26.第24項に記載の方法において、第１及び第２のプロ
ーブ−プライマーをDNAポリメラーゼにより伸長するこ
とを特徴とする方法。
27.第24項に記載の方法において、ターゲット核酸配列
がDNA配列であり、第１及び第２のプローブ−プライマ
ーをDNA依存性DNAポリメラーゼにより伸長することを特
徴とする方法。
28.第27項に記載の方法において、DNA依存性DNAポリメ
ラーゼが大腸菌（Escherichia coli）ポリメラーゼＩ
又はそのクレノウフラグメント、あるいはTeqポリメラ
ーゼであることを特徴とする方法。
29.第24項に記載の方法において、ターゲット核酸配列
がRNA配列であり、第１のプローブ−プライマーをRNA依
存性DNAポリメラーゼにより伸長することを特徴とする
方法。
30.第24項に記載の方法において、伸長生成物を熱変性
によりターゲット配列から分離することを特徴とする方
法。
31.第24項に記載の方法において、複製型RNAがRNA依存
性RNAポリメラーゼのための鋳型であることを特徴とす
る方法。
32.第31項に記載の方法において、複製型RNAがバクテリ
オファージ Ｑ−ベータのレプリカーゼのための鋳型で
あることを特徴とする方法。
33.第32項に記載の方法において、複製型RNAがミディバ
リアントRNAであることを特徴とする方法。
34.第33項に記載の方法において、第１のプローブがミ
ディバリアントRNAの５′部分に対応するDNAを含み、第
２のプローブがミディバリアントRNAの残った３′部分
の合成の鋳型となることができるDNAを含むことを特徴
とする方法。
35.第24項に記載の方法において、複製型RNAをエチジウ
ムブロミド又はプロピジウムヨーダイド染色により検出
することを特徴とする方法。
36.ターゲット核酸配列の検出法において、 a.プロモーター配列、及びターゲット配列の第１領域と
相補的な配列を含む第１の単鎖オリゴデオキシヌクレオ
チド プローブ−プライマーをターゲット配列の第１領
域とハイブリッド形成させ； b.プローブ−プライマーを、第１領域と近接するが必ず
しも接してはいないターゲット配列の第２領域を通って
ターゲット配列の鋳型上で伸長し、DNA伸長生成物を製
造し； c.DNA伸長生成物をターゲット配列から分離し； d.i）ターゲット配列の第２領域に対応するDNA配列、i
i）リボチームの合成の鋳型となることができるDNA、ii
i）リボチーム認識部位の合成の鋳型となることができ
るDNA配列、及びiv）複製型RNAの合成の鋳型となること
ができるDNA配列をこの順で含む第２のオリゴデオキシ
ヌクレオチド プローブ−プライマーを伸長生成物とハ
イブリッド形成させ； e.第２のプローブ−プライマーを伸長生成物の鋳型上で
伸長し、機能的二重鎖プロモーター、及びリボチーム、
リボチーム認識部位、ならびにその５′末端にてターゲ
ット配列のコピーを含む複製型RNAの合成の鋳型となる
ことができるDNAを含む二重鎖DNA伸長生成物を製造し； f.DNAを転写し、転写物を認識部位にて切断して複製型R
NAを放出することができる機能的リボチーム、リボチー
ム認識部位及び複製型RNAを含むRNA転写物を製造し； g.RNAを複製し； h.ターゲット核酸配列の存在又は量の指標として、複製
されたRNAを検出する段階を含むことを特徴とする方
法。
37.第36項に記載の方法において、第１のプローブ−プ
ライマーのプロモーター配列がT7 RNAポリメラーゼ
プロモーターであることを特徴とする方法。
38.第36項に記載の方法において、第１及び第２のプロ
ーブ−プライマーをDNAポリメラーゼにより伸長するこ
とを特徴とする方法。
39.第38項に記載の方法において、ターゲット核酸配列
がDNA配列であり、第１及び第２のプローブ−プライマ
ーをDNA依存性DNAポリメラーゼにより伸長することを特
徴とする方法。
40.第39項に記載の方法において、DNA依存性DNAポリメ
ラーゼが大腸菌（Escherichia coli）ポリメラーゼＩ
又はそのクレノウフラグメント、あるいはTaqポリメラ
ーゼであることを特徴とする方法。
41.第36項に記載の方法において、ターゲット核酸配列
がRNA配列であり、第１のプローブ−プライマーをRNA依
存性DNAポリメラーゼにより伸長することを特徴とする
方法。
42.第36項に記載の方法において、伸長生成物を熱変性
によりターゲット配列から分離することを特徴とする方
法。
43.第36項に記載の方法において、転写段階をT7 ポリ
メラーゼ、T3 RNAポリメラーゼ又はSP6 RNAポリメラ
ーゼを用いて行うことを特徴とする方法。
44.第36項に記載の方法において、複製型RNAがRNA依存
性RNAポリメラーゼのための鋳型であることを特徴とす
る方法。
45.第44項に記載の方法において、複製型RNAがバクテリ
オファージ Ｑ−ベータのレプリカーゼのための鋳型で
あることを特徴とする方法。
46.第45項に記載の方法において、複製型RNAがミディバ
リアントRNAであることを特徴とする方法。
47.第36項に記載の方法において、複製型RNAをエチジウ
ムブロミド又はプロピジウムヨーダイド染色により検出
することを特徴とする方法。
48.ターゲット核酸配列の検出法において、 a.プロモーター配列、複製型RNAの一部に対応するDNA配
列及びターゲット配列の第１領域と相補的な配列を含む
第１の単鎖オリゴデオキシヌクレオチド プローブ−プ
ライマーをターゲット配列に近接する第１領域とハイブ
リッド形成させ； b.プローブ−プライマーを、第１領域と近接するが必ず
しも接してはいないターゲット配列の第２領域を通って
伸長し、DNA伸長生成物を製造し； c.DNA伸長生成物をターゲット配列から分離し； d.ターゲット配列の第２領域に対応するDNA配列、、複
製型RNAの残りの部分の合成の鋳型となることができるD
NA配列、及びあらかじめ決められたRNA配列と結合して
それを切断することができるリボチームの合成の鋳型と
なることができるDNA配列を含む第２のオリゴデオキシ
ヌクレオチド プローブ−プライマーを伸長生成物とハ
イブリッド形成させ； e.第２のプローブ−プライマーを伸長生成物の鋳型上で
伸長し、機能的二重鎖プロモーター、及びターゲット配
列のコピーを挿入して含み、３′末端にリボチームを含
む複製型RNAの合成の鋳型となることができるDNAを含む
二重鎖DNAを製造し； f.DNAを転写し、ターゲット配列のコピー中にあらかじ
め決められた配列を含む場合リボチームによって切断す
ることができる複製型組み替えRNAを製造し； g.RNAを複製し； h.ターゲット核酸配列の存在又は量の指標として、複製
されたRNAを検出する段階を含むことを特徴とする方
法。
49.第48項に記載の方法において、ターゲット配列のコ
ピー中のあらかじめ決められた配列が対立変異株である
ことを特徴とする方法。
50.第48項に記載の方法において、第１のプローブ−プ
ライマーのプロモーター配列がT7 RNAポリメラーゼ
プロモーターであることを特徴とする方法。
51.第48項に記載の方法において、第１及び第２のプロ
ーブ−プライマーをDNAポリメラーゼにより伸長するこ
とを特徴とする方法。
52.第51項に記載の方法において、ターゲット核酸配列
がDNA配列であり、第１及び第２のプローブ−プライマ
ーをDNA依存性DNAポリメラーゼにより伸長することを特
徴とする方法。
53.第50項に記載の方法において、DNA依存性DNAポリメ
ラーゼが大腸菌（Escherichia coli）ポリメラーゼＩ
又はそのクレノウフラグメント、あるいはTaqポリメラ
ーゼであることを特徴とする方法。
54.第46項に記載の方法において、ターゲット核酸配列
がRNA配列であり、第１のプローブ−プライマーをRNA依
存性DNAポリメラーゼにより伸長することを特徴とする
方法。
55.第46項に記載の方法において、DNA伸長生成物を熱変
性によりターゲット配列から分離することを特徴とする
方法。
56.第48項に記載の方法において、転写段階をT7ポリメ
ラーゼ、T3 RNAポリメラーゼ又はSP6 RNAポリメラー
ゼを用いて行うことを特徴とする方法。
57.第53項に記載の方法において、複製型RNAがRNA依存
性RNAポリメラーゼのための鋳型であることを特徴とす
る方法。
58.第54項に記載の方法において、複製型RNAがバクテリ
オファージ Ｑ−ベータのレプリカーゼのための鋳型で
あることを特徴とする方法。
59.第45項に記載の方法において、複製型RNAがミディバ
リアントRNAであることを特徴とする方法。
60.第36項に記載の方法において、複製型RNAをエチジウ
ムブロミド又はプロピジウムヨーダイド染色により検出
することを特徴とする方法。
61.ターゲット核酸配列の検出に使用するオリゴデオキ
シヌクレオチドの組み合わせにおいて： a.プロモーター配列及びターゲット ヌクレオチド配列
の第１領域と相補的な配列を含む第１のオリゴデオキシ
ヌクレオチド；及び b.複製型RNAの製造の鋳型となることができるDNA配列、
及びターゲット配列の第１領域と近接するが必ずしも接
してはいないターゲット配列の第２領域に対応するDNA
配列を含む第２のオリゴデオキシヌクレオチドを含むこ
とを特徴とする組み合わせ。
62.第61項に記載のオリゴデオキシヌクレオチドの組み
合わせにおいて、プロモーターがT7 RNAポリメラーゼ
のためのプロモーターであることを特徴とする組み合わ
せ。
63.第61項に記載のオリゴヌクレオチドの組み合わせに
おいて、複製型RNAがバクテリオファージ Ｑ−ベータ
のレプリカーゼのための鋳型であることを特徴とする組
み合わせ。
64.ターゲット核酸配列の検出に使用するオリゴデオキ
シヌクレオチドの組み合わせにおいて： a.プロモーター配列、複製型RNAに対応するDNA配列、及
びターゲット ヌクレオチド配列の第１領域と相補的な
配列を含む第１のオリゴデオキシヌクレオチド；及び b.ターゲット ヌクレオチド配列の第２領域に対応する
DNA配列を含む第２のオリゴデオキシヌクレオチドを含
むことを特徴とする組み合わせ。
65.第64項に記載のオリゴデオキシヌクレオチドの組み
合わせにおいて、プロモーターがT7 RNAポリメラーゼ
のためのプロモーターであることを特徴とする組み合わ
せ。
66.第65項に記載のオリゴデオキシヌクレオチドの組み
合わせにおいて、複製型RNAがバクテリオファージ Ｑ
−ベータのレプリカーゼのための鋳型であることを特徴
とする組み合わせ。
67.ターゲット核酸配列の検出に使用するオリゴデオキ
シヌクレオチドの組み合わせにおいて： a.プロモーター配列、複製型RNAの一部に対応するDNA配
列、及びターゲット核酸配列の第１領域と相補的なDNA
配列を含む第１のオリゴデオキシヌクレオチド；及び b.複製型RNAの残りの部分の合成の鋳型となることがで
きる配列、及びターゲット核酸配列の第２領域に対応す
るDNA配列を含む第２のオリゴデオキシヌクレオチドを
含むことを特徴とする組み合わせ。
68.第67項に記載のオリゴデオキシヌクレオチドの組み
合わせにおいて、プロモーターがT7 RNAポリメラーゼ
のためのプロモーターであることを特徴とする組み合わ
せ。
69.第68項に記載のオリゴヌクレオチドの組み合わせに
おいて、複製型RNAがバクテリオファージ Ｑ−ベータ
のレプリカーゼのための鋳型であることを特徴とする組
み合わせ。
70.ターゲット核酸配列の検出に使用するオリゴデオキ
シヌクレオチドの組み合わせにおいて： a.プロモーター配列、及びターゲット核酸配列の第１領
域と相補的な配列を含む第１のオリゴデオキシヌクレオ
チド；及び b.i）ターゲット核酸配列の第２領域に対応するDNA配
列、ii）リボチームの合成の鋳型となることができるDN
A、iii）リボチーム認識部位の合成の鋳型となることが
できるDNA配列、及びiv）複製型RNAの合成の鋳型となる
ことができるDNA配列を含む第２のオリゴデオキシヌク
レオチドを含むことを特徴とする組み合わせ。
71.ターゲット核酸配列中のあらかじめ決められたヌク
レオチド配列の検出に使用するオリゴデオキシヌクレオ
チドの組み合わせにおいて： a.プロモーター配列、複製型RNAの一部に対応するDNA配
列、及びターゲット配列の第１領域と相補的な配列を含
む第１のオリゴデオキシヌクレオチド；及び b.複製型RNAの残り部分の合成の鋳型となることができ
るDNA配列、ターゲット配列の第２領域に対応するDNA配
列、あらかじめ決められたRNA配列を切断することがで
きるリボチームの合成の鋳型となることができるDNA配
列を含む第２のオリゴデオキシヌクレオチドを含むこと
を特徴とする組み合わせ。
72.ターゲット核酸の検出法において： a.それぞれターゲット核酸中の、近接しているが必ずし
も接してはいない異なる領域と特異的にハイブリッド形
成する配列を含む２種類のオリゴヌクレオチド プロー
ブ−プライマーを準備し、そのどちらか又は両方のプロ
ーブ−プライマーが、単独で又は両方で複製型RNAの合
成の鋳型となることができる配列を含み、プローブ−プ
ライマーの少なくともひとつがプロモーター又はプロモ
ーター補体配列を含み； b.プローブ−プライマーをターゲット核酸とハイブリッ
ド形成させ、プローブ−プライマーをターゲット核酸の
鋳型上で伸長して伸長生成物を製造し、 c.ターゲット核酸から伸長生成物を分離し； d.他のプローブ−プライマーを伸長生成物とハイブリッ
ド形成させ、第２のプローブ−プライマーを伸長生成物
の鋳型上で伸長し、複製型RNAの合成の鋳型となること
ができる配列に結合した機能的プロモーターを含む人工
の遺伝子を製造し； e.遺伝子を転写して複製型RNAを製造し； f.RNAを複製し； g.ターゲット核酸配列の存在又はその量の指標として、
複製したRNAを検出する段階から成ることを特徴とする
方法。
73.第15項に記載の方法において、ターゲット核酸配列
がRNAであり、第１のプローブ−プロモーターをRNA依存
性DNAポリメラーゼにより伸長することを特徴とする方
法。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 国際公開88／10315（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 15/09 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (14)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ターゲット核酸配列の検出法において、 a.プロモーター配列を含む５′部分及びターゲット配列
    の第１領域と相補的な配列を含む３′部分を持つ第１の
    単鎖オリゴデオキシヌクレオチド プローブ−プライマ
    ーをターゲット配列の第１領域とハイブリッド形成さ
    せ； b.プローブ−プライマーを、ターゲット配列の第１領域
    と近接するが必ずしも接してはいないターゲット配列の
    第２領域を通ってターゲット配列の鋳型上で伸長し、DN
    A伸長生成物を製造し； c.DNA伸長生成物をターゲット配列から分離し； d.複製型RNAの製造の鋳型となることができるDNA配列を
    含む５′部分及びDNA伸長生成物中に存在するターゲッ
    ト配列の第２領域の相補体と相補的な配列を含む３′部
    分を持つ第２のオリゴデオキシヌクレオチド プローブ
    −プライマーを該伸長生成物とハイブリッド形成させ； e.第２のプローブ−プライマーを該伸長生成物の鋳型上
    で伸長し、機能的二重鎖プロモーター、及び複製型RNA
    の合成の鋳型となることができるDNAを含む二重鎖DNAを
    製造し； f.DNAを転写して複製型RNAを製造し； g.RNAを複製し； h.ターゲット核酸配列の存在又は量の指標として、複製
    されたRNAを検出する段階を含むことを特徴とする方
    法。
  2. 【請求項２】第１のプローブ−プライマーのプロモータ
    ー配列がT7 RNAポリメラーゼ プロモーターである請
    求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】第１及び第２のプローブ−プライマーをDN
    Aポリメラーゼにより伸長する請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】ターゲット核酸配列がDNA配列であり、第
    １及び第２のプローブ−プライマーをDNA依存性DNAポリ
    メラーゼにより伸長する請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】DNA依存性DNAポリメラーゼが大腸菌（Esch
    erichia coli）ポリメラーゼＩ又はそのクレノウフラ
    グメント、あるいはTeqポリメラーゼである請求項４に
    記載の方法。
  6. 【請求項６】ターゲット核酸配列がRNAであり、第１プ
    ローブ−プライマーをRNA依存性DNAポリメラーゼにより
    伸長する請求項３に記載の方法。
  7. 【請求項７】DNA伸長生成物を熱変性によりターゲット
    配列から分離する請求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】転写段階をT7 RNAポリメラーゼ、T3 RNA
    ポリメラーゼ又はSP6 RNAポリメラーゼを用いて行う請
    求項１に記載の方法。
  9. 【請求項９】複製型RNAがRNA依存性RNAポリメラーゼの
    ための鋳型である請求項１に記載の方法。
  10. 【請求項１０】複製型RNAがバクテリオファージ Ｑ−
    ベータのレプリカーゼのための鋳型である請求項９に記
    載の方法。
  11. 【請求項１１】複製型RNAがミディバリアントRNAである
    請求項10に記載の方法。
  12. 【請求項１２】複製型RNAをエチジウムブロミド又はプ
    ロピジウムヨーダイド染色により検出する請求項１に記
    載の方法。 ことを特徴とする方法。
  13. 【請求項１３】オリゴデオキシヌクレオチドを組み合わ
    せ使用するターゲット核酸配列の検出用キットであっ
    て、 a.プロモーター配列を含む５′部分及びターゲット ヌ
    クレオチド配列の第１領域と相補的な配列を含む３′部
    分を持つ第１のオリゴデオキシヌクレオチド；並びに b.複製型RNAの製造の鋳型となることができるDNA配列を
    含む５′部分及びターゲット配列の第１領域と近接する
    が必ずしも接してはいないターゲット配列の第２領域の
    相補体と相補的なDNA配列を含む３′部分を持つ第２の
    オリゴデオキシヌクレオチドを含むことを特徴とするキ
    ット。
  14. 【請求項１４】プロモーターがT7 RNAポリメラーゼの
    ためのプロモーターである請求項13に記載のキット。
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