DE69830596T2

DE69830596T2 - Ein tumorsuppressor namens ts10q23.3

Info

Publication number: DE69830596T2
Application number: DE69830596T
Authority: DE
Inventors: Peter Steck; A. Mark PERSHOUSE; A. Samar JASSER; K. W. Yung; V. Sean TAVTIGIAN
Original assignee: Myriad Genetics Inc; University of Texas System
Current assignee: Myriad Genetics Inc; University of Texas System
Priority date: 1997-08-26
Filing date: 1998-08-26
Publication date: 2006-03-16
Anticipated expiration: 2018-08-27
Also published as: JP4454670B2; EP1012338A4; AU9120398A; JP2008263988A; DE69830596D1; WO1999010537A1; JP2010051330A; CA2301199C; ES2245039T3; CA2301199A1; ATE298003T1; EP1012338A1; JP4339506B2; EP1012338B1; JP2001514015A

Description

STAND DER TECHNIK
I. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Gebiete der Onkologie, Genetik und Molekularbiologie. Insbesondere betrifft die Erfindung die Identifizierung eines Tumorsuppressorgens auf dem menschlichen Chromosom 10. Defekte in diesem Gen sind mit der Entwicklung von Krebserkrankungen, wie beispielsweise Gliomen, verknüpft.
II. Stand der Technik
Die Onkogenese wurde von Foulds (1958) als ein aus mehreren Schritten bestehender, biologischer Prozess beschrieben, von dem inzwischen bekannt ist, dass er durch eine Ansammlung genetischer Schäden auftritt. Auf molekularer Ebene umfasst der aus mehreren Schritten bestehende Prozess der Tumorgenese die Störung sowohl positiver als auch negativer regulatorischer Effektoren (Weinberg, 1989). Von Vogelstein und Mitarbeiter (1990) haben postuliert, dass die molekulare Basis menschlicher Colonkarzinome eine Reihe von Onkogenen, Tumorsuppressorgenen und Reparaturgenen einschließt. In ähnlicher Weise sind Defekte, die zur Entwicklung des Retinoblastoms führen, mit einem anderen Tumorsuppressorgen verknüpft worden (Lee et al., 1987). Bei einer Reihe anderer Malignome wurden wiederum andere Onkogene und Tumorsuppressorgene identifiziert. Leider ist die Anzahl behandelbarer Krebserkrankungen noch immer gering und die Auswirkungen einer Krebserkrankung sind katastrophal – allein in den USA sind jährlich über eine halbe Million Todesfälle zu verzeichnen.
Ein Beispiel für die verheerende Natur einer Krebserkrankung sind Tumore, die aus Zellen der Abstammungslinie der Astrozyten entstehen und die zu den am häufigsten vorkommenden Primärtumoren des Zentralnervensystems zählen (Russell und Rubinstein, 1989). Die meisten dieser Tumoren treten bei Erwachsenen auf. Primäre Gehirntumoren sind darüber hinaus die häufigsten soliden Tumoren bei pädiatrischen Patienten und die zweithäufigste Todesursache bei Kindern unter 15 Jahren. 1994 wurden schätzungsweise 18.500 neue Fälle von primären Gehirntumoren diagnostiziert (Boring et al. 1994). Epidemiologische Studien zeigen, dass die Inzidenz von Gehirntumoren zunimmt und die dritthäufigste Ursache von Krebstod bei 18- bis 35-jährigen Patienten darstellt. Wegen ihrer Position innerhalb des Gehirns und der typischen Infiltration von Tumorzellen in das umliegende Gewebe ist ein erfolgreiches therapeutisches Eingreifen bei primären Gehirntumoren häufig beschränkt. Leider erliegen rund zwei Drittel dieser betroffenen Personen der Krankheit innerhalb von zwei Jahren. Die häufigsten Intrakranialtumoren bei Erwachsenen entstehen aus Zellen glialer Abstammung und treten mit einer ungefähren Frequenz von 48% als Glioblastoma multiforme (GBM), zu 21% als Astrozytome (A) (anaplastisch (AA) und geringen Grades) und zu 9% als Ependymome und Oligodendrogliome auf (Levin et al., 1993).
Genetische Studien haben mehrere Gene und ihre entsprechenden Protein-Produkte mit der Onkogenese primärer Gehirntumore in Verbindung gebracht. Zu den verschiedenen berichteten Veränderungen gehören: Amplifikation des Rezeptors für den epidermalen Wachstumsfaktor und eines seiner Liganden, des transformierenden Wachstumsfaktors alpha (Transforming Growth Factor alpha), N-myc; gli, verändertes Splicing und Expression von Rezeptoren für den Fibroblasten-Wachstumsfaktor und der Verlust der Funktion von p53, p16, Rb, der Neurofibromatosegene 1 und 2, DCC und putativer Tumorsuppressorgene auf Chromosom 4, 10, 17 (non-p53), 19, 22 und X (Wong et al. 1987; EI-Azouzi-et al., 1989; Nishi et al. 1991; James et al., 1988; Kamb et al. 1984; Henson et al. 1994; Yamaguchi et al. 1994; Bianchi et al. 1994; Ransom et al. 1992; Rasheed et al. 1992; Scheck und Coons, 1993; Von Demling et al. 1994; Rubio et al. 1994; Ritland et al., 1995).
Die häufigsten Veränderungen umfassten eine Amplifikation des EGF-Rezeptors (~40%), einen Verlust der Funktion von p53 (~50%), p16 (~50%), Rb(~30%) und Deletionen auf Chromosom 10 (> 90%). Außerdem korrelieren der Grad oder das Ausmaß der histologischen Malignität von Astrozytentumoren mit einer verstärkten Ansammlung genetischer Schäden, ähnlich wie beim Kolonkarzinom. Überdies scheinen einige Veränderungen relativ abstammungs- oder gradspezifisch zu sein. Zum Beispiel treten Verluste auf Chromosom 19q überwiegend bei Oligodendrogliomen auf, während Deletionen auf Chromosom 10 sowie eine Amplifikation und Mutation des EGF-Rezeptors hauptsächlich bei GBM vorkommen. Die Deletion einer vollständigen Kopie oder von Abschnitten von Chromosom 10 ist stark indiziert als häufigstes genetisches Ereignis in Verbindung mit der häufigsten Form eines primären Gehirntumors, GBM.
Zytogenetische Studien und später durchgeführte Alleldeletionsstudien bei GBM haben eindeutig häufige und weit reichende molekulargenetische Veränderungen in Verbindung mit Chromosom 10 aufgezeigt (Bigner et al., 1988; Ransom et al., 1992; Rasheed et al. 1992; James et al., 1988: Fujimoto et al. 1989; Fults et al., 1990, 1993; Karlbom et al., 1993; Rasheed et al., 1995; Sonoda et al., 1996; Albarosa et al., 1996). Zytogenetische Analysen haben die Veränderung von Chromosom 10 eindeutig als häufiges Ereignis bei GBM demonstriert, wobei die Veränderung bei 60% der Tumoren vorkam. Alleldeletionsstudien bei GBM haben ebenfalls sehr häufig auftretende Allel-Ungleichgewichte in Verbindung mit Chromosom 10 (90%) aufgezeigt. Die Verluste sind jedoch derart weitreichend und häufig, dass in diesen Analysen keine chromosomale Sublokalisation eines einheitlichen Verlustes zweifelsfrei definiert werden konnte.
Mehrere, kürzlich durchgeführte Studien haben die Region 10q25-26, insbesondere eine 17-cM-Region von D10S190 bis D10S216 impliziert. Durch Alleldeletionsanalyse anhand einer Reihe von Gliomen niedrigen und hohen Grades, die nur einen partiellen Verlust von Chromosom 10 aufwiesen, wurde eine telomere Region von D10S587 bis D10S216 impliziert (Rasheed et al., 1995). Diese Region (~ 1 cM) war bei 11 GMBs, 4 AAs, 1 A und 1 Oligodendrogliom nicht mehr vorhanden oder nicht-informativ, was die Lokalisierung einer Kandidatenregion andeutet. Die Studie zeigte außerdem, dass Deletionen auf Chromosom 10 in Gliomen niedrigen Grades vorkommen. Albarosa et al. (1996) legen auf der Basis einer kleinen Alleldeletion bei einem pädiatrischen Gehirntumor eine zentromere Kandidatenregion von Marker D10S221 bis D10S209 nahe. Steck und Saya haben anhand einer Reihe von GBM zwei häufige Deletionsbereiche, 10q26 und 10q24 (D10S192) vorgeschlagen.
Es ist außerdem impliziert worden, dass der kurze Arm von Chromosom 10 ein weiteres Tumorsuppressorgen enthält. Studien lieferten anfangs funktionelle Hinweise auf ein Tumorsuppressorgen auf 10p bei Gliomen (Steck et al., 1995), welches später für Prostatakrebs gezeigt wurde (Sanchez et al., 1995; Murakami et al., 1996). Letztere Studie implizierte eine Region von 11 cM zwischen D10S1172 und D10S527. Alleldeletionsstudien an Gliomen haben eine weit reichende Deletion auf 10p gezeigt, aber auch war keine feste Lokalisierung möglich (Karlbom et al., 1993; Kimmelman et al., 1996; diese Regionen auf Chromosom 10 sind in 1 unten gezeigt). Darüber hinaus ist gezeigt worden, dass auch die Amplifikation des EGF-Rezeptors fast ausschließlich bei Tumoren vorkommt, die Deletionen auf Chromosom 10 aufwesen, was auf eine mögliche Verknüpfung zwischen diesen genetischen Veränderungen hinweist (Von Deimling et al., 1992).
Deletionen auf dem langen Arm, vor allem 10q24, sind auch für Prostata-, Nieren- und Uteruskarzinome, kleinzelliges Bronchialkarzinom und endometriale Karzinome, Meningiome und bei akuten T-Zell-Leukämien festgestellt worden (Carter et al., 1990; Morita et al., 1991; Herbst et al., 1984; Jones et al., 1994; Rempel et al., 1993; Peiffer et al., 1995; Petersen et al., 1997). Kürzlich haben ausführliche Studien über Prostatakarzinome gezeigt, dass (1) der kurze und der lange Arm von Chromosom 10 Tumorsuppressorgene aufzuweisen scheinen und (2) sich das Suppressorgen des langen Arms im Übergangsbereich 10q23-24 befindet (Gray et al., 1995; Ittmann, 1996, Trybus et al., 1996). Der von diesen drei Gruppen identifizierte Bereich der häufigen Deletion befindet sich im Bereich von D10S215 als Zentrum und ist etwa 10 cM groß (1). Der Bereich überlappt mit unserer Kandidatenregion, aber innerhalb der Region ist für das Prostatakarzinom keine weitere Lokalisierung berichtet worden. Die mit Prostatakarzinom verknüpften Allelverluste scheinen auch nur bei etwa 30–40% der untersuchten Tumore vorzukommen. Darüber hinaus werden Deletionen bei Tumoren in einem fortgeschrittenerem Stadium beobachtet, ähnlich wie bei GBM, und könnten mit der Metastasierungsfähigkeit verknüpft sein (Nihei et al., 1995; Komiya et al., 1996). Die Kombination dieser Ergebnisse lässt den Schluss zu, dass die Region 10a23-24 bei mehreren Krebserkrankungen des Menschen eine Rolle spielt.
Die Unterschiede in der Lokalisierung der Kandidatenregionen lassen mehrere Möglichkeiten zu. Erstens ist es möglich, dass zwei oder mehr Tumorsuppressorgene auf 10q vorhanden sind. Zweitens beeinflussen möglicherweise nicht alle Deletionen den Tumorsuppressorgenlocus. Diese Alternativen schließen sich gegenseitig nicht aus. Letztere Möglichkeit wird dadurch gestützt, dass ein potenzielles latentes Zentromer auf 10q25 vorhanden sein könnte, was genetische Veränderungen, insbesondere Brüche, hervorrufen könnte (Vouillaire et al., 1993).
Trotz dieser Informationen bleibt die Identität des Gens (oder der Gene), die an der Tumorsuppression in Verbindung mit 10q23-24 beteiligt sind, unklar. Ohne Identifikation eines spezifischen Gens und der Ableitung des Proteins, für das es kodiert, ist es unmöglich, eine wirksame Therapie gegen dieses Produkt zu entwickeln. Es ist daher ein wichtiges Ziel, den Tumorsuppressor/die Tumorsuppressoren, die sich in dieser Region befinden, zu isolieren und ihre Struktur und Funktion zu bestimmen.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren des Diagnostizierens des Cowden-Syndroms bereit, welches die Schritte des Erhaltens einer Probe von einer Testperson und das Bestimmen der Expression eines funktionellen TS10q23.3-Genproduktes in Zellen der Probe umfasst. In besonders bevorzugten Ausführungsformen können die Zellen aus der Gruppe ausgewählt sein, die aus Brust-, Ovarial-, Schilddrüsen- und Endometriumzellen besteht. In anderen Ausführungsformen kann die Probe eine Gewebe- oder eine Flüssigkeitsprobe sein. In anderen Aspekten der Erfindung umfasst das Bestimmen das Testen hinsichtlich einer Nukleinsäure aus der Probe. In mehr bevorzugten Aspekten kann das Verfahren des Weiteren umfassen, die Probe Bedingungen auszusetzen, die geeignet sind, um die Nukleinsäure zu amplifizieren. In anderen Ausführungsformen kann das Verfahren des Weiteren den Schritt des Vergleichens der Expression von TS10q23.3 mit der Expression von TS10q23.3 bei Proben, die nicht vom Cowden-Syndrom stammen, umfassen. In speziellen Ausführungsformen besteht der Vergleich im Evaluieren des Levels der Expression von TS10q23.3. In spezielleren Ausführungsformen umfasst die Probe von Patienten mit Cowden-Syndrom eine Mutation in der Kodierungssequenz von TS10q23.3. Bei der Mutation kann es sich um eine Frameshift-Mutation, eine Deletionsmutation, eine Insertionsmutation oder eine Missense-Mutation handeln. In spezielleren Ausführungsformen befindet sich die Mutation in Exon 7. In anderen besonderen Ausführungsformen bewirkt die Mutation einen vorzeitigen Abbruch des TS10q23.3-Genproduktes. In anderen Ausführungsformen befindet sich die Deletionsmutation in Exon 8. In bestimmten Ausführungsformen befindet sich die Insertion in Exon 2. In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist die Mutation eine Insertion von AT an Base 791 von Exon 7. In anderen besonders bevorzugten Ausführungsformen ist die Mutation eine Insertion von drei Basenpaaren an Base 137 von Exon 2. Spezifischer kodiert die Insertion von drei Basenpaaren für ein ASN im TS10q23.3-Genprodukt.
In einem weiteren Aspekt ist außerdem ein Verfahren des Diagnostizierens eines Individuums mit einer Prädisposition für Brustkrebs vorgesehen, das die Schritte des Erhaltens einer Probe von einem Individuum und des Bestimmens der Expression eines funktionellen TS10q23.3-Genproduktes in Zellen der Probe umfasst. In besonderen Ausführungsformen können die Zellen aus der Gruppe ausgewählt sein, die aus Brustzellen, Ovarialzellen, Schilddrüsenzellen und Endometrialzellen besteht. In anderen Ausführungsformen ist die Probe eine Gewebeprobe oder eine Flüssigkeitsprobe. In einem besonders bevorzugten Aspekt umfasst das Verfahren des Weiteren den Schritt des Vergleichs der Expression von TS10q23.3 mit der Expression von TS10q23.3 in normalen Proben. In definierteren Aspekten umfasst die Probe eine Mutation in der Kodierungssequenz von TS10q23.3. Bei der Mutation kann es sich um eine Frameshift-Mutation, eine Deletionsmutation, eine Insertionsmutation oder eine Missense-Mutation handeln. In spezielleren Ausführungsformen befindet sich die Mutation in Exon 7. In anderen besonderen Ausführungsformen bewirkt die Mutation einen vorzeitigen Abbruch des TS10q23.3-Genproduktes. In anderen Ausführungsformen befindet sich die Deletionsmutation in Exon 8. In bestimmten Ausführungsformen befindet sich die Insertion in Exon 2. In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist die Mutation eine Insertion von AT an Base 791 von Exon 7.
In anderen besonders bevorzugten Ausführungsformen ist die Mutation eine Deletion von dreizehn Basenpaaren an Base 915 von Exon 8. In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Mutation eine Insertion von drei Basenpaaren an Base 137 von Exon 2. Spezifischer kodiert die Insertion von drei Basenpaaren für ein ASN im TS10q23.3-Genprodukt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die folgenden Zeichnungen bilden einen Teil der vorliegenden Patentschrift und sind enthalten, um bestimmte Aspekte der vorliegenden Erfindung ausführlicher aufzuzeigen. Die Erfindung wird durch Bezugnahme auf eine oder mehrere der Zeichnungen in Kombination mit der ausführlichen Beschreibung spezifischer hierin vorgestellter Ausführungsformen besser verständlich:
1 – Lokalisierung von Tumorsuppressor-Kandidatenloci auf dem menschlichen Chromosom 10. Verschiedene Loci auf dem menschlichen Chromosom 10 sind als mögliche Stellen mit Tumorsuppressoraktivität vorgeschlagen worden. Diese Stellen und die Reportergruppe sind dargestellt.
2 – Darstellung homozygoter Deletionen in Gliom-Zelllinien. Es wurden verschiedene Gliom-Zelllinien hinsichtlich des Vorhandenseins von Deletionen in beiden Kopien von Loci auf Chromosom 10 untersucht. Die Loci sind auf der senkrechten Achse und die Zelllinien auf der waagrechten Achse dargestellt. Die Gliom-Zelllinien D54, EFC-2, A172 und LG11 wurden auf Vorhandensein von Marker AFMA086WG9 (AFM086) untersucht. In Multiplex-Polymerasekettenreaktionsuntersuchungen wurde anhand einiger weiterer polymorpher Allele auf Chromosom 10 in unabhängigen Reaktionen gezeigt, dass der Marker deletiert war. Allel D1OS196 ist als Kontrolle für die PCR^TM-Reaktionen gezeigt. EFC-2-Zellen zeigten eine homozygote Deletion von 4 aufeinander folgenden Markern (siehe 2).
3 – Darstellung von Regionen auf Chromosom 10: Vorhandensein oder Abwesenheit von DNA-Mikrosatellitenmarkern in einem Hybridklon. Dargestellt sind Regionen des Vorhandenseins (gefüllte Kreise) oder der Abwesenheit (leere Kreise) von DNA auf Chromosom 10, die den für Chromosom 10 spezifischen, in A9-Zellen der Maus übertragenen Mikrosatellitenmarkern aus elf Subklonen des somatischen Zellhybridklons U251.N10.7 entsprechen. Die somatischen Zellhybride U251.N10.6 und U251.N10.8 sind vollständig supprimierte Klone, die in Weichagarose kein oder wenig Wachstum zeigen, während die Subklone U251.10.5A und C partiell supprimiert sind (Steck et al., 1995). Der Unterschied zwischen den vollständig supprimierten Klonen und den partiell supprimierten Klonen liefert eine funktionelle Lokalisierung des Tumorsuppressorgens. Die Regionen, die möglicherweise das Tumorsuppressorgen enthalten, sind durch die schraffierten Kästchen angezeigt. Das schraffierte Kästchen an 10q12.2 überlappt mit den homozygoten Deletionen und der durch Alleldeletionsanalyse implizierten Region (siehe 2 und 4).
4 – Deletionskarte von Chromosom 10 bei humanen Gliomen. Die von den Markern D10S551 bis D10S583 begrenzte Region befindet sich in einer 10-cM-Region. Die Mikrosatelliten sind in der Reihenfolge der wahrscheinlichsten Verknüpfung gezeigt und ihre ungefähre chromosomale Lage ist ausgehend von der Radiation-Hybrid-Karte von Gyapay et al., 1994 kartiert. In den durch Kästchen eingegrenzten Regionen des Tumors ist die Region auf Chromosom 10 dargestellt, die nicht an anaplastischen Astrozytomen und einem Gliom beteiligt ist. Die kritische Region, die von der homozygoten Deletionsanalyse definiert und von dieser Analyse nicht ausgeschlossen ist, wird durch den ausgefüllten Balken auf der rechten Seite gezeigt.
5 – Kartierung von BAC 106d16. Dargestellt ist die Kartierung des BAC mit der Bezeichnung 106d16 sowie der Nachweis der homozygoten Deletion durch Southern-Blotting. Gezeigt ist die partielle Restriktionskarte von 106d16. Die Darstellung des Blots zeigt die homozygote Deletion der Eco-Bande Nr. 14 (Mr etwa 11 kb) in EFC-2-Zellen.
6 – Kodierungssequenz und 5'- und 3'-flankierende Regionen von TS10q23.3. Die Kodierungsregion ist fett gedruckt, ebenso wie das erste im Leseraster befindliche Stop-Codon.
7 – Vorhergesagte Aminosäuresequenz des TS10q23.3-Produktes. Abkürzungen sind A, Alanin; C, Cystein; D, Asparaginsäure; E, Glutaminsäure; F; Phenylalanin; G, Glycin; H, Histidin; I, Isoleucin; K, Lysin; L, Leucin; M, Methionin; N, Asparagin; P; Prolin; Q, Glutamin; R, Arginin; S, Serin; T, Threonin; V, Valin; W, Tryptophan; Y, Tyrosin. Die Phosphatase-Konsensusstelle ist fett gedruckt, Tyrosinphosphorylierungsstellen sind kursiv gedruckt und unterstrichen.
8 – Deletionsanalyse von 10q12.2. Die Gliom-Zelllinie, bei der zu Anfang homozygote Deletionen in 10q23.3 gezeigt worden sind, wurde erneut hinsichtlich des Vorhandenseins des TS10g23.3-Gens analysiert. Das schattierte Oval zeigt an, dass die Genregion vorhanden ist; das leere Oval zeigt eine homozygote Deletion in der Genregion an. *zeigt eingeschlossene Exons an.
9 – Homologievergleich des humanen TS10q23.3 mit Homologen von Maus und Hund. Das ATG-Startcodon und die Aminosäure Methionin sind als die Start (1)-Position bezeichnet. Das Terminationscodon ist TGA (1210). Abweichungen zwischen den Sequenzen von Mensch und Maus oder Hund auf Genom- oder Aminosäureebene sind durch einen Stern in der verglichenen Sequenz dargestellt. Die Aminosäuresequenzen von Hund und Mensch sind identisch; die Maussequenz unterschied sich an Position 398, wobei die Maus ein Serin aufweist, Hund und Mensch dagegen ein Threonin.
10 – Sequenzen von Exons und umliegenden Intronregionen von TS10q23.3. Die Exons sind durch Großbuchstaben ab Position eins und die Introns mit Kleinbuchstaben angegeben: eine Ausnahme ist das erste Exon, bei dem das Startcodon bei Position eins beginnt und sich der Exon/Intron-3'-Übergang an Position 79/80 befindet. Die Kleinbuchstabenbezeichnung (Tabelle 5) entspricht der Nummerierung der in dieser Figur dargestellten Sequenz, ausgenommen das erste Exon. Die Mutationen bei U87 und U138 befinden sich am G-Rest des ersten Introns [G+1>T] nach dem Exon (respektive Exon 7 und 8). Die Punktmutation bei T98G befindet sich an Position 46 und die Punktmutation bei KE an Position 28 von Exon 2. Bei LnCap-Zellen handelt es sich bei der Mutation um eine Deletion von Base 16 und 17 im ersten Intron.
11A–G. – Analyse von Sekundärstrukturen in TS1023.3.- 11A: Hydrophilie-Plot; 11B: Oberflächenwahrscheinlichkeits-Plot; 11C: Flexibilitäts-Plot; 11D: Antigenitätsindex-Plot; 11E: Plot der amphiphilen Helix; 11F: Plot des amphiphilen Blattes; 11G: Sekundärstruktur-Plot.
12A–I. – Vergleich prognostizierter Merkmale in TS10q23.3 und den Punktmutanten T98G und KE. 12A: Hydrophilie-Plot von Rest 1–60 des Wildtyp-Polypeptids; 12B: Oberflächenwahrscheinlichkeits-Plot von Rest 1–60 des Wildtyp-Polypeptids; 12C: Sekundärstruktur-Plot von Rest 1–60 des Wildtyp-Polypeptids; 12D: Hydrophilie-Plot von Rest 1–60 der KE-Mutante; 12E: Oberflächenwahrscheinlichkeits-Plot von Rest 1–60 der KE-Mutante; 12F: Sekundärstruktur-Plot von Rest 1–60 der KE-Mutante; 12G: Hydrophilie-Plot von Rest 1–60 der T98G-Mutante; 12H: Oberflächenwahrscheinlichkeits-Plot von Rest 1–60 der T98G-Mutante; 12I: Sekundärstruktur-Plot von Rest 1–60 der T98G-Mutante. Die T98G-Mutation (Leu → Arg) an Rest 42 bewirkt den Verlust der vorgeschlagenen Helixsekundärstruktur von TS10q23.3. Die Mutation in KE an Rest 36 (Gly → Glu) würde die Länge der vorgeschlagenen Helixstruktur in dem Bereich signifikant verlängern. Beide Mutationen würden dieselbe Helixstruktur beeinflussen. Es würden auch kleinere Veränderungen der Hydrophilie und der Oberflächenwahrscheinlichkeit entstehen.
13A. Homozygote Deletion des TS10Q3.3-Gens in humanen Tumorzelllinien und TS10q23.3-mRNA-Expressionsniveaus in primären Glioblastomen. Gezeigt sind vier Zelllinien, Brustkarzinom TCL11A11, Melanom TCL11D7, Melanom TCL11D9 und Leukämie TCL10G9 (Kontrollprobe ohne homozygot deletiertes TS10Q3.3), jeweils untersucht durch PCR^TM-Amplifikation anhand der folgenden Muster (Sequence Tagged Sites): (1) TS10Q3.3 Exon1, (2) TS10Q23.3 Exon 2, (3) TS10Q23.3 Exon 3, (4) TS10Q23.3 Exon 4, (5) TS10Q23.3 Exon 5, (6) TS10Q23.3 Exon 6, (7) TS10Q23.3 Exon 7, (8) TS10Q23.3 Exon 8, (9) TS10Q23.3 Exon 9, (10) Kontroll-MKK4-Exon 8.
13B. Homozygote Deletion des TS10Q23.3-Gens in humanen Tumorzelllinien und TS10q23.3-mRNA-Expressionsniveaus in primären Glioblastomen. Schema der im TS10Q3.3-Gen der untersuchten TZL beobachteten homozygoten Deletionen. Ausgefüllte Kreise geben Exons wieder, die nicht homozygot deletiert sind, während unausgefüllte Kreise verlorene Exons kennzeichnen.
13C. Homozygote Deletion des TS10Q23.3-Gens in humanen Tumorzelllinien und TS10Q23.3-mRNA-Expressionsniveaus in primären Glioblastomen. Expression der TS10q23.3-Boten-RNA in humanem gesundem Gehirn und GBM-Proben, nachgewiesen durch RT-PCR^TM-Analyse. Gezeigt ist das 5'-terminale Amplikon von TS10Q23.3. Die gezeigten Bahnen umfassen ein Kontroll-Amplikon (C) aus cDNA des niedriggradigen Glioms PL-1 und sieben normale Präparate und Tumorpräparate. Sechs der 10 untersuchten GBM wurden auf Heterozygositätsverlust (LOH) in der Umgebung des TS10Q23.3-Locus und Veränderungen des TS10Q23.3-Gens untersucht. Alle sechs Proben zeigten Heterozygositätsverlust (LOH), aber es wurden keine Mutationen entdeckt, wenn die Erfinder ihre DNAs durch Sequenzierung untersuchten. Die Expressionsniveaus der GADPH-mRNA wurde als Kontrolle für äquivalente Template-Mengen und -Qualitäten verwendet.
13D. Homozygote Deletion des TS10Q23.3-Gens in humanen Tumorzelllinien und TS10Q23.3-mRNA-Expressionsniveaus in primären Glioblastomen. Verhältnis der RT-PCR^TM-Amplikon-Intensitäten von TS10Q23.3 zu GAPDH für jedes normale Präparat und GBM-Präparat.
14. Darstellung der putativen funkionellen Domänen von TS10Q23.3 und die Position identifizierter Veränderungen. Die N-terminale Hälfte von TS10Q23.3 ist homolog zu Phosphatasen sowie zu den Zytoskelettproteinen Tensin und Auxilin (brauner Kasten). Gezeigt sind auch die Positionen der Phosphatase-Kerndomäne (roter Kasten), drei potenzielle Tyrosinphosphorylierungsstellen (blaue Kästen) und zwei potenzielle Serinphosphorylierungsstellen (gelbe Kästen). Das PDZ-Motiv, ITKV, befindet sich am C-Terminus des Proteins. Gezeigt sind TS10Q23.3-Varianten, die von Steck et al., (1997), Li et al., (1997) und Liaw et al., (1997) identifiziert worden sind, sowie in dieser Studie festgestellte Veränderungen; Blaue Pfeile markieren Misssense-Substitutionen; schwarze Pfeile kennzeichnen Insertionen oder Deletion innerhalb des Leserasters; grüne Pfeile markieren potenzielle Splicing-Varianten und rote Pfeile geben Frameshift- oder Nonsense-Mutationen wieder, die zu Verkürzungen von TS10Q23.3 führen. Sternchen zeigen Keimbahnmutationen an, die bei Patienten mit Cowden-Syndrom festgestellt worden sind (Liaw et al., 1997), während die ausgefüllten Kreise Läsionen anzeigen, die bei zwei mutmaßlich unabhängigen DNA-Proben beobachtet worden sind.
15. Haplotyp-Konstruktion mit Markern auf Chromosom 10 bei vier Familien mit CS.
16. DNA-Sequenzierung von TS10Q23.3 bei einer Familie mit CS und Brustkrebs mit frühzeitigem Auftreten. Die betroffene Mutter (schwarzer Kreis) wies eine Insertion aus 2 Basenpaaren (AT) in Exon 5 auf, die bei ihrem nicht betroffenen Bruder (nicht ausgefülltes Quadrat) nicht vorhanden war. Ihre betroffene Tochter hat die AT-Insertion geerbt.
17. Exogene MMAC1-Proteinexpression. U87MG-Zellen wurden mit MMCB oder GFCB in den angezeigten Konzentrationen (Partikelzahl/ml) 24 Stunden lang infiziert, anschließend wurden sofort (nach 24 Std.) oder nach 24 Std. (48 Std.) Lysate hergestellt. Wie bei den Verfahren beschrieben wurden Western Blots durchgeführt. Auf der linken Seite sind Proteingrößenmarker gezeigt. Das MMAC1-Protein wanderte mit etwa 55 kD, was mit den Angaben von Li et al., 1997 übereinstimmt.
18D. FACS-Infektiositäts-Test. U87MG-Zellen wurden mit GFCB in den angegebenen Konzentrationen 24 Std. lang infiziert. Der Anteil an Zellen, die grün fluoreszierendes Protein exprimierten, wurde durchflusszytometrisch bestimmt. pn/ml: Adenoviruspartikelanzahl pro ml.
19A und 19B. Hemmung der in-vitro-Proliferation durch MMCB; 19A. ³H-Thymidin-Aufnahme. 19B. Untersuchung der Anzahl lebender Zellen. Fehlerbalken stellen Standardabweichungen (S.D.) dar (3 Wiederholungen). pn/ml: Adenoviruspartikelanzahl pro ml.
20. Bildung von Kolonien in Weichagar. U87MG-Zellen wurden mit GFCB, MMCB oder FTCB in den angegebenen Konzentrationen 24 Std. lang infiziert. Aufgetragen ist die durchschnittliche Anzahl an Kolonien ± S.D. pn/ml: Adenoviruspartikelanzahl pro ml.
SEQUENZÜBERBLICK
SEQ ID-Nr.: 1 = TS10q23.3-Gensequenz des Menschen (6 und 9); SEQ ID-Nr.: 2 = Humane TS10q23.3-Peptidsequenz der CDS von SEQ ID-Nr.: 1; SEQ ID-Nr.: 3 = Translation der Basen 3-119 von SEQ ID-Nr.: 1; SEQ ID-Nr.: 4 = Translation der Basen 123–242 of SEQ ID-Nr.:1; SEQ ID-Nr.: 5 = Translation der Basen 246–272 von SEQ ID-Nr.: 1; SEQ ID-Nr.: 6 = Translation der Basen 276–317 von SEQ ID-Nr.: 1; SEQ ID-Nr.: 7 = Translation der Basen 321–449 von SEQ ID-Nr.: 1; SEQ ID-Nr.: 8 = Translation der Basen 453–2243 of SEQ ID-Nr.: 1; SEQ ID-Nr.: 9 = TS10q23.3-Gensequenz der Maus (9); SEQ ID-Nr.: 10 = TS10q23.3-Peptidsequenz der CDS von SEQ ID-Nr.: 9; SEQ ID-Nr.: 11 = Translation der Basen 14–55 von SEQ ID-Nr.: 9; SEQ ID-Nr.:12 = Translation der Basen 59–166 von SEQ ID-Nr.: 9; SEQ ID-Nr.:13 = Translation der Basen 172–222 von SEQ ID-Nr.: 9; SEQ ID-Nr.:14 = Translation der Basen 223–273 von SEQ ID-Nr.: 9; SEQ ID-Nr.: 15 = Translation der Basen 283–1959 von SEQ ID Nr.: 9; SEQ ID-Nr.: 16 = TS10q23.3-Gensequenz des Hundes (9); SEQ ID-Nr.: 17 = TS10q23.3-Peptidsequenz des Hundes der CDS von SEQ ID-Nr.: 16; SEQ ID-Nr.: 18 = Translation der Basen 1–1290 von SEQ ID-Nr.: 16; SEQ ID Nr.:19 = Exon 1 (10); SEQ ID Nr.: 20 = Exon 2 (10); SEQ ID Nr.: 21 = Exon 3 (10); SEQ ID Nr.: 22 = Exon 4 (10); SEQ ID Nr.: 23 = Exon 5 (10); SEQ ID Nr.: 24 = Exon 6 (10); SEQ ID Nr.: 25 = Exon 7 (10); SEQ ID Nr.: 26 = Exon 8 (10); SEQ ID Nr: 27 = Exon 9 (10); SEQ ID Nr.: 28 = Ein Motiv aus Rest 88 bis 98; SEQ ID Nr: 29 = konservierte katalytische Domäne einer Proteintyrosinphosphatase (Denu et al., 1996); SEQ ID Nr.: 30 = Rest 1–60 des TS10q23.3-Wildtyp-Polypeptids (12A–12C); SEQ ID Nr: 31 = Rest 1–60 der T98G-Mutante des TS10q23.3-Polypeptids (12D–12F); SEQ ID Nr.: 32 = Rest 1–60 der KE-Mutante des TS10q23.3-Polypeptids (12G–12I); SEQ ID Nr.: 33 = CA6.ex8.FB-Primer; SEQ ID Nr.: 34 = CA6.ex8.RQ-Primer; SEQ ID Nr.: 35: = CA6.ex8.FC-Primer; SEQ ID Nr.: 36 = CA6.ex8.RR-Primer; SEQ ID Nr.: 37 = Geschachtelter (nested) Primer zum Erhalt von Exon 8 des sekundären Amplikons FB-RQ; SEQ ID Nr.: 38 = = Geschachtelter (nested) Primer zum Erhalt von Exon 9 des sekundären Amplikons FB-RR; SEQ ID Nr.: 39 = M5'F-Primer; SEQ ID Nr.: 40 = M5' R-Primer; SEQ ID Nr.: 41 = M3'F-Primer; SEQ ID Nr.: 42: = F3'R-Primer; SEQ ID Nr.: 43 = Primer im ersten Durchgang der PCR^TM mit humanem fetalen Gehirn; SEQ ID Nr.: 44 = Primer im ersten Durchgang der PCR^TM mit humanem fetalen Gehirn; SEQ ID Nr.: 45 = Primer im zweiten Durchgang der PCR^TM mit humanem fetalen Gehirn; SEQ ID Nr.: 46 = Primer im zweiten Durchgang der PCR^TM mit humanem fetalen Gehirn; SEQ ID Nr.: 47 = Primer zur Herstellung eines spezifischen 303-bp-Produktes aus dem Pseudogen und nicht aus TS10q23; SEQ ID Nr.: 48 = Primer zur Herstellung eines spezifischen 303-bp-Produktes aus dem Pseudogen und nicht aus TS10q23; SEQ ID Nr.: 49 = MMACI-Proteinsequenz der Maus; SEQ ID Nr.: 50 = Peptidsequenz; SEQ ID Nr.: 51 = Translation der Basen 321–1034 von SEQ ID Nr.: 1; SEQ ID Nr.: 52 = Translation der Basen 169–750 von SEQ ID Nr.: 9; SEQ ID Nr.: 53 = Translation der Basen 1–108 von SEQ ID Nr.: 16; SEQ ID Nr.: 54 = MMACI-Gensequenz des Hundes; SEQ ID Nr.: 55 = MMAC 1-Proteinsequenz des Hundes der CDS von SEQ ID Nr.: 54; SEQ ID Nr.: 56 = MMAC-Gensequenz der Maus; SEQ ID Nr.: 57 = MMAC1-Proteinsequenz der Maus der CDS von SEQ ID Nr.: 56; SEQ ID Nr.: 58 = Primer MAC1.6f mit Übereinstimmung mit Sequenzen in MMAC1-Exon 2; SEQ ID-Nr.: 59 = Primer MAC1,6r mit Übereinstimmung mit Sequenzen in MMAC1-Exon 5; SEQ ID Nr.: 60 = Translation der Basen 1–54 von SEQ ID Nr.: 56; SEQ ID Nr.: 61 = Translation der Basen 58–96 von SEQ ID Nr.: 56; SEQ ID Nr.: 62 = Translation der Basen 98–178 von SEQ ID Nr.: 56; SEQ ID Nr.: 63 = Translation der Basen 182–208 von SEQ ID Nr.: 56; SEQ ID Nr.:64 = Sequenz des humanen TS10q23.3-Pseudogens.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
I. Die vorliegende Erfindung
Wie oben angegeben, hat eine Reihe verschiedener Gruppen Hinweise auf eine Tumor supprimierende Aktivität in Verbindung mit der Region 10q des menschlichen Chromosoms 10 gezeigt. Trotz dieser in beträchtlichem Umfang vorliegenden Arbeiten ist die Identität des Gens oder der Gene, die für diese Aktivität verantwortlich sind, nicht bestimmt worden. Frühere Untersuchungen verwendeten einen funktionellen Ansatz, der den Transfer von Chromosomen oder chromosomaler Fragmente, die möglicherweise ein Tumorsuppressorgen oder Tumorsuppressorgene enthalten, in tumorigene Gliomzellen umfasst. Diese Arbeiten erlaubten die Definition der biologischen Aktivität eines putativen Tumorsuppressorgens oder putativer Tumorsuppressorgene und trugen zur Lokalisierung einer solchen Aktivität bei. Chromosom 2 und 10 wurden in U251-Gliomzellen und Chromosom 2 und 10 in LG-11-Zellen eingeführt. Die LG-11-Zellen haben erwiesenermaßen keine intakten Kopien von Chromosom 10 und später stellte sich heraus, dass sich die Bruchstelle an Position 10q24 befindet. Der Transfer von Chromosom 10 brachte Hybridzellen hervor, die einen Suppressor-Phänotyp hatten, einen Verlust der Tumorigenität aufwiesen (keine Tumorbildung) und die Fähigkeit verloren hatten, in Weichagarose zu wachsen (50- bis 100-facher Rückgang; Pershouse et al., 1993). Die exponentielle Wachstumsrate des Hybrids war ähnlich wie die der Herkunftszellen, obgleich die Sättigungsdichte der Hybridzellen signifikant (10- bis 20-fach) niedriger war als die der Herkunftszellen. Der Transfer von Chromosom 2 ergab Hybridzellen, die ähnlich wie die Herkunftszellen agierten.
Ein Ziel dieser Studien war es, das Suppressorgen auf Chromosom 10 durch Fragmentierung des Neomycin-markierten Chromosoms 10 zu lokalisieren und anschließend das fragmentierte Chromosom in Gliomzellen zu übertragen. Die Erfinder haben jedoch beobachtet, dass einige Hybridzellen spontan Chromosomen-Umordnungen unterliefen, um Hybridzellen zu ergeben, die nur verschiedene Regionen des eingeführten Chromosoms 10 zurückbehielten (Pershouse et al., 1993). Anstatt Fragmentierungsstudien durchzuführen, stellten die Erfinder Subklone der Hybride her und analysierten diese (Steck et al., 1995). Die Retention des eingeführten Chromosoms 10 oder seiner Fragmente wurde mittels informativer RFLP-Marker und FISH-Analyse verfolgt. Interessanterweise wurde nur das eingeführte Chromosom einer Umordnung unterzogen. Die Einführung einer vollständigen Kopie von Chromosom 10 bewirkte eine Hemmung der Transformationseigenschaft der Hybridzellen, in Weichagarose zu wachsen und in Nacktmäusen Tumore zu bilden.
Durch sofortige Analyse scheinen diese beiden Phänotypen nun partiell trennbar zu sein. Manche Subklone (U251.N10.5a-j), die einen Verlust eines überwiegenden Teils des langen Arms von Chromosom 10 zeigten, wuchsen in Weichagarose, bildeten jedoch keine Tumore in Nacktmäusen, was anzeigt, dass sich im verbleibenden Anteil des Chromosoms (10pter bis 10q11) ein Tumorsuppressorlocus befindet. Klone, die eine distale Region des langen Arms, 10q24 bis 10q26, behalten hatten, wuchsen dagegen weder in Weichagarose noch in Nacktmäusen (siehe 4). Dies deutet auf eine weitere phänotypische Suppressorregion in der distalen Region des Chromosoms hin. Der Mangel an weiterem Material in Verbindung mit Chromosom 10 würde außerdem nahe legen, dass das verbleibende Material von Chromosom 10 für den veränderten biologischen Phänotyp verantwortlich ist. Diese Ergebnisse implizieren das Vorhandensein zweier phänotypisch unabhängiger suppressiver Regionen auf Chromosom 10, die am Fortschreiten eines Glioms beteiligt sind (Steck et al., 1995).
Gemäß der vorliegenden Erfindung haben die Erfinder nun mehrere unabhängige Strategien verfolgt, um ein Tumorsuppressorgen mit der Bezeichnung TS10q23.3 zu lokalisieren, das bei Gliomen, Brustkrebs, Prostatakrebs und anderen Krebsarten eine Rolle spielt. Diese Ansätze, die ausführlicher in den folgenden Beispielen beschrieben sind, umfassen (i) Identifizierung einer homozygoten Deletion in einer Reihe von humanen Gliomzelllinien; (ii) Feststellen einer einheitlichen Region oder einheitlicher Regionen, die in Klonen mit unterdrückter Tumorigenität beibehalten wurde oder wurden; und (iii) Alleldeletionsstudien mit Gliomen verschiedenen Grades und entsprechenden Normalproben. Da das Gen zur Verfügung steht, ist es nun möglich, die von dem Gen kodierte Information zu untersuchen, um neuartige diagnostische und therapeutische Ansätze in Bezug auf menschliche Krebserkrankungen zu entwickeln.
II. Der Tumorsuppressor auf 10q23.3
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Tumorsuppressor identifiert worden, der von einem Gen auf dem Locus 10q23.3 kodiert wird und hier als TS10q23.3 bezeichnet wird. Dieses Molekül kann bei verschiedenen Krebsarten Tumorphänotypen unterdrücken. Beispiele anderer Tumorsuppressorgene sind p53, Rb und p16, um nur Einige zu nennen. Obwohl diese Moleküle strukturell unterschiedlich sind, bilden sie eine Gruppe funktionell verwandter Moleküle, zu denen auch TS10q23.3 gehört. Diese anderen Tumorsuppressoren, die nun untersucht werden, können in gleicher Weise verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft nicht nur das gesamte TS10q23.3-Molekül, sondern auch Fragmente des Polypeptids, das die tumorsupprimierende (oder andere) Aktivität beibehält oder nicht. Fragmente einschließlich des N-Terminus des Moleküls können durch gentechnologische Bearbeitung der Translations-Stopp-Stellen innerhalb der kodierenden Region erzeugt werden (wird nachfolgend erläutert). Alternativ kann die Behandlung des TS10q23.3-Moleküls mit proteolytischen Enzymen, bekannt als Proteasen, eine Vielzahl unterschiedlicher N-terminaler, C-terminaler und interner Fragmente hervorbringen. Beispiele von Fragmenten können aufeinander folgende Reste der in 7 und 9 gezeigten TS10q23.3-Sequenz mit einer Länge von 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 12, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400 oder mehr Aminosäuren umfassen. Diese Fragmente können nach bekannten Verfahren gereinigt werden, beispielsweise durch Präzipitation (z. B. Ammoniumsulfat), HPLC, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie (einschließlich Immunaffinitätschromatographie) oder verschiedene Größenauftrennungen (Sedimentation, Gelelektrophorese, Gelfiltration).
A. Strukturelle Merkmale des Polypeptids
Das Gen für TS10q23.3 kodiert für ein Polypeptid mit 403 Aminosäuren. Das vorausgesagte Molekulargewicht dieses Moleküls ist 47.122, was einen pI von 5,86 ergibt. Dieses Molekül kann daher mindestens als Standard in Assays verwendet werden, in denen Molekulargewicht und pI-Wert untersucht werden.
Eine Phosphatase-Konsensusstelle befindet sich an den Resten 122–131 und entspricht vollständig der Tyrosinphosphatase (PTP)-Konsensussequenz: [I/V]HCxAGxxR[S/T]G. Außerhalb der aktiven Domänen unterscheiden sich die Sequenzen erheblich. PTPs entstehen durch Phosphoenzym-Zwischenstufen. Die enzymatische Reaktion umfasst die Bildung von Phosphoryl-Cystein-Zwischenstufen nach einem nukleophilen Angriff des Thiolatanions von Cystein auf das Phosphoratom des Substrats. Die Reaktion kann als zweistufiger chemischer Prozess dargestellt werden: Phosphoryltransfer auf das Enzym, begleitet von einer schnellen Freisetzung des dephosphorylierten Produktes und Hydrolyse der Thiol-Phosphat-Zwischenstufe, begleitet von einer schnellen Freisetzung von Phosphat. Das Enzym bindet das Dianion des phosphathaltigen Substrats und reagiert damit, um den katalytisch kompetenten Komponentenkomplex zu bilden. Für einen Phosphoryltransfer auf das Enzym müssen am Enzym eine Asparaginsäure protoniert und das nukleophile Cystein deprotoniert werden (Thiolatanion). Außerdem befinden sich potenzielle Tyrisonphosphorylierungsstellen an Rest 233–240 und 308–315 und cAMR-Phosphorylierungsstellen befinden sich an Rest 128, 164, 223 und 335. Phosphatasen haben bekannterweise Kinasestellen und die Phosphataseaktivität dieser Enzyme kann durch Phosphorylierung an diesen Stellen moduliert werden, Proteinphosphatasen werden generell in zwei Kategorien unterteilt – Serin-/Threoninphosphatasen und Tyrosinphosphatasen. Bestimmte Tyrosinphosphatasen sind auch gegen Phosphoserin und Phosphothreonin aktiv.
Die Wechselwirkung zwischen Kinasen und Phosphatasen und die verschiedenen Phosphorylierungszustände von Polypeptiden sind wichtige Merkmale der Zellphysiologie. Kinasen und Phosphatasen arbeiten durch verschiedenartige Mechanismen bei unterschiedlichen Wegen in Zellen zusammen, die an der Signal-, Energiespeicherung- und Zellregulation beteiligt sind. Seit der Identifizierung einer intrinsischen Tyrosinkinasefunktion in dem transformierenden Protein src (Collett & Erickson, 1978) erwies sich die Rolle der Phosphorylierung, insbesondere an Tyrosinresten, als zentraler Vorgang bei der Kontrolle zellulärer Proliferation und der Induktion von Krebs (Hunter, 1991; Bishop, 1991). Die Rolle, die Proteinphosphatasen bei der Wachstumsregulation sowie bei vielen anderen biologischen und biochemischen Aktivitäten spielen, wurde mit dem Phosphorylierungsstatus biologisch wichtiger Moleküle in Zusammenhang gebracht (Cohen, 1994).
Ausgehend von seiner Sequenz scheint TS10q23.3 für eine Tyrosinphosphatase oder eine Phosphatase mit zweifacher Spezifität zu kodieren, die Homologie zu Zytoskelett-assoziierten Proteinen, dem Tensin des Huhns und bovinem Auxilin aufweist (Steck et al., 1997; Li et al., 1997). Die N-terminate Hälfte von TS10q23.3 ist daher zu mehreren Phosphatasen homolog und sein putatives Phosphatase-Kernmotiv befindet sich an den Resten 122–134 (Denu et al., 1996; Tonks und Neel, 1996). Die N-terminale Region von TS10q23.3 könnte daher enzymatische Aktivität und zelluläre Lokalisationsaktivität aufweisen. Der C-terminale Anteil von TS10q23.3 enthält drei potenzielle Tyrosinphosphatasestellen an Rest 240, 315 und 336. Ein gegebenenfalls phosphoryliertes Tyrosin 315 würde eine potenzielle SH2-Bindungsstelle darstellen, da sich drei Reste vom Tyrosin entfernt in C-terminaler Richtung ein Leucinrest befindet (Songyang et al., 1995). In der C-terminalen Hälfte von TS10q23.3 befinden sich zwei potenzielle Serinphosphorylierungsstellen. Serinrest 338 repräsentiert eine potenzielle Cal2+/Calmodulinabhängige Proteinkinase-II-Stelle, während Serin 355 eine potenzielle Caseinkinase-II-Stelle darstellt (Hardie und Hanks, 1995). Die letzten vier C-terminalen Aminosäuren, ITKV, repräsentieren eine potenzielle PDZ-Bindungsdomäne (Fanning und Anderson, 1996; Saras und Heldin, 1996). PDZ-Domänen finden sich in vielen verschiedenen intrazellulären Proteinen und es wird angenommen, dass sie Protein-Protein-Wechselwirkungen vermitteln, indem sie direkt an das C-terminale Ende von Zielproteinen binden.
Es sollte ferner erwähnt werden, dass die etwa 60 Aminosäuren des N-Terminus des Moleküls eine gewisse Homologie zu Tensin aufweisen, einem Zytoskelettprotein, das möglicherweise an Adhäsionsplaques beteiligt ist. Dies deutet darauf hin, dass TS10q23.3 an Zelloberflächenphänomenen beteiligt ist, beispielsweise an der Kontakthemmung, Invasion, Migration oder bei der Signalübertragung zwischen Zellen. TS10q23.3-Punktmutationen, die in bestimmten Tumorzelllinien identifiziert worden sind, betreffen vorgeschlagene Sekundärstrukturen in dieser Region.
B. Funktionelle Aspekte
Wenn die vorliegende Anmeldung die Funktion von TS10q23.3 oder „Wildtyp"-Aktivität betrifft, ist damit gemeint, dass das fragliche Molekül die Fähigkeit besitzt, die Transformation einer Zelle von einem normal regulierten Proliferationszustand zu einem malignen Zustand zu hemmen, d. h. einen Zustand, der mit jeglicher Art einer anomalen Wachstumsregulierung verbunden ist, oder die Transformation einer Zelle von einem anomalen Zustand zu einem hoch malignen Zustand zu hemmen, z. B., Metastasierung oder invasives Tumorwachstum zu verhindern. Andere Phänotypen, die als von dem normalen TS10q23.3-Genprodukt reguliert angesehen werden können, sind Angiogenese, Adhäsion, Migration, Signalübertragung zwischen Zellen, Zellwachstum, Zellproliferation, dichteabhängiges Wachstum, verankerungsabhängiges Wachstums und Andere. Anhand von Assays, die einem Fachmann bekannt sind, kann bestimmt werden, welche Moleküle diese Aktivität besitzen. Beispielsweise können durch den Transfer von Genen, die TS10q23.3 oder Varianten davon kodieren, in Zellen, die kein funktionelles TS10q23.3-Produkt haben und daher eine beeinträchtigte Wachstumskontrolle aufweisen, mittels Wachstumsunterdrückung solche Moleküle mit TS10q23.3-Funktion identifiziert werden.
Wie oben festgestellt, liegen Hinweise vor, dass es sich bei TS10q23.3 um eine Phosphatase handelt. Der Anteil des Proteins im Bereich der Reste 88–98 stimmt genau mit der konservierten katalytischen Domäne einer Proteintyrosinphosphatase überein. In dem Molekül befinden sich außerdem putative Kinaseziele, was ein weiteres Merkmal von Phosphatasen darstellt. Da andere Tumorsuppressoren mit dieser Art von Aktivität identifiziert worden sind, ist es wünschenswert, die Phosphatasefunktion der tumorsupprimierenden Rolle von TS10q23.3 zu bestimmen. Dies könnte sich auch als erfolgreicher Ansatz zur Entwicklung von Screening-Assays für die Abwesenheit einer TS10q23.3-Funktion oder bei der Entwicklung von Krebstherapien erweisen, beispielsweise durch gezielten Angriff der Phosphatasefunktion von TS10q23.3, durch gezieltes Targeting des Substrats, mit dem TS10q23.3 reagiert und/oder durch durch gezieltes Targeting der Kinase oder der Kinasen, die mit TS10q23.3 reagieren.
C. Varianten von TS10q23.3
Bei Aminosäuresequenzvarianten des Polypeptids kann es sich um Substitutions-, Insertions- oder Deletionsvarianten handeln. In Deletionsvarianten fehlen ein oder mehrere Reste des nativen Proteins, die für die Funktion oder immunogene Aktivität nicht essenziell sind; ein Beispiel dafür sind die oben beschriebenen Varianten, denen eine Transmembransequenz fehlt. Ein anderer, häufiger Typ einer Deletionsvariante ist eine Variante, der sekretorische Signalsequenzen fehlen oder Signalsequenzen, die ein Protein zur Bindung an einen bestimmten Teil einer Zelle steuern. Insertionsmutanten umfassen typischerweise die Addition von Material an einer nicht-terminalen Stelle im Polypeptid. Dazu gehört beispielsweise die Insertion eines immunreaktiven Epitops oder einfach eines einzelnen Restes. Terminale Additionen, die Fusionsproteine genannt werden, sind nachfolgend erläutert.
Substitutive Varianten enthalten typischerweise den Austausch einer Aminosäure durch eine Andere an einer oder mehreren Stellen innerhalb des Proteins und können so konzipiert sein, dass eine oder mehrere Eigenschaften des Polypeptids, beispielsweise Stabilität gegenüber proteolytischer Spaltung, ohne Verlust anderer Funktionen oder Eigenschaften moduliert werden. Substitutionen dieser Art sind vorzugsweise konservativ, das heißt, eine Aminosäure wird durch eine Andere mit ähnlicher Form und Ladung ersetzt. Konservative Substitutionen sind aus dem Stand der Technik gut bekannt und umfassen beispielsweise den Austausch von: Alanin durch Serin, Arginin durch Lysin, Asparagin durch Glutamin oder Histidin, Asparaginsäure durch Glutaminsäure, Cystein durch Serin, Glutamin durch Asparagin, Glutaminsäure durch Asparaginsäure, Glycin durch Prolin, Histidin durch Asparagin oder Glutamin, Isoleucin durch Leucin oder Valin, Leucin oder Valin oder Isoleucin, Lysin durch Arginin, Methionin durch Leucin oder Isoleucin, Phenylalanin durch Tyrosin, Leucin oder Methionin, Serin durch Threonin, Threonin durch Serin, Tryptophan durch Tyrosin, Tyrosin durch Tryptophan oder Phenylalanin und Valin durch Isoleucin oder Leucin.
In besonderen Aspekten wird erwogen, dass ein Fachmann Standardtechniken, die einem Fachmann gut bekannt sind, anwendet, um die Mutanten herzustellen. Speziell in Betracht gezogen sind N-terminale Deletionen, C-terminale Deletionen, interne Deletionen sowie zufällige (Random) Mutagenese und Punktmutagenese.
N-terminale und C-terminale Deletionen sind Formen einer Deletionsmutagenese, die beispielsweise das Vorhandensein einer geeigneten einzelnen Restriktionsschnittstelle in der Nähe der C- oder N-terminalen Region ausnutzt. Die DNA wird an dieser Stelle gespalten und die Schnittenden werden mit Nukleasen wie BAL31, Exonuklease III, DNase I und S1-Nuklease verdaut. Durch Wiedervereinigung der beiden Enden entsteht eine Reihe von DNAs mit Deletionen verschiedener Größe in der Umgebung der Restriktionsschnittstelle. Die von solchen Mutanten exprimierten Proteine können hinsichtlich ihrer Funktion bei der Apoptosehemmung und/oder als Chaperon getestet werden, wie im Verlauf der Patentbeschreibung beschrieben ist. Bei Mutanten mit internen Deletionen werden ähnliche Techniken angewandt, aber Mutanten mit interner Deletion werden hergestellt, indem zwei geeignet platzierte Restriktionsschnittstellen verwendet werden, was somit die Herstellung einer präzise definierten Deletion und die Wiedervereinigung der Enden wie oben erlaubt.
In Betracht gezogen sind auch Mutanten mit partieller Deletion. In solchen Fällen verwendet ein Fachmann ein Restriktionsenzym, das die DNA je nach Länge der Reaktionsdauer an zahlreichen Stellen schneidet („Frequent Cutter"). Durch Variation der Reaktionsbedingungen ist es daher möglich, eine Reihe von Mutanten verschiedener Größe herzustellen, die dann hinsichtlich ihrer Aktivität untersucht werden können.
Eine zufällige Insertionsmutation kann auch durchgeführt werden, indem die DNA-Sequenz beispielsweise mit einer DNase I geschnitten und eine Abfolge von Nukleotiden eingesetzt wird, die 3, 6, 9, 12. etc. Aminosäuren kodieren, und die Enden neu ligiert werden. Nachdem eine solche Mutation hergestellt worden ist, können die Mutanten hinsichtlich verschiedener Aktivitäten, die dem Wildtypprotein eigen sind, untersucht werden.
Sobald allgemeine Bereiche des Gens als für bestimmte Proteindomänen kodierend festgestellt worden sind, kann eine Punktmutagenese durchgeführt werden, um genau zu identifizieren, welche Aminosäurereste für bestimmte, mit TS10q23.3 verbundenen Aktivitäten wichtig sind. Ein Fachmann ist daher in der Lage, Einzelbasenveränderungen des DNA-Strangs herzustellen, die ein verändertes Codon und eine Missense-Mutation ergeben.
Es folgt eine Erörterung der Veränderung der Aminosäuren eines Proteins zur Erzeugung eines äquivalenten oder sogar verbesserten Moleküls der zweiten Generation. Beispielsweise können in einer Proteinstruktur bestimmte Aminosäuren durch andere Aminosäuren ersetzt werden, ohne dass interaktive Bindungskapazitäten an Strukturen, wie beispielsweise Antigenbindungsregionen von Antikörpern oder Bindungsstellen an Substratmolekülen, wesentlich verloren gehen. Da die biologische funktionelle Aktivität eines Proteins durch seine interaktiven Fähigkeiten und seine Art bestimmt wird, können in einer Proteinsequenz und in ihrer zugrunde liegenden DNA-Kodierungssequenz bestimmte Aminosäuresubstitutionen durchgeführt und dennoch ein Protein mit ähnlichen Eigenschaften erhalten werden. Es wird von den Erfindern daher in Betracht gezogen, dass in der DNA-Sequenz von Genen ohne wesentlichen Verlust ihrer biologischen Nützlichkeit oder Aktivität verschiedene Änderungen durchgeführt werden können, wie unten erläutert. Tabelle 1 zeigt die Codons, die bestimmte Aminosäuren kodieren.
Bei der Durchführung solcher Veränderungen kann der hydropathische Index von Aminosäuren berücksichtigt werden. Die Bedeutung des hydropathischen Aminosäureindex bei der Übertragung interaktiver biologischer Funktion auf ein Protein ist im Stand der Technik im Allgemeinen anerkannt (Kyte & Doolittle, 1982). Es ist anerkannt, dass die relative hydropathische Eigenschaft der Aminosäure zur Sekundärstruktur des resultierenden Proteins beiträgt, welche wiederum die Interaktion des Proteins mit anderen Molekülen wie beispielsweise Enzymen, Substraten, Rezeptoren, DNA, Antikörpern, Antigenen und dergleichen definiert.
Jeder Aminosäure ist wie folgt auf der Basis ihrer Hydrophobie und Ladungseigenschaften ein hydropathischer Index zugeordnet worden (Kyte & Doolittle, 1982): Isoleucin (+4,5), Valin (+4,2), Leucin (+3,8), Phenylalanin (+2,8), Cystein(Cystin (+2,5), Methionin (+1,9), Alanin (+1,8), Glycin (–0,4), Threonin (–0,7), Serin (–0,8), Tryptophan (–0,9), Tyrosin (–1,3), Prolin (–1,6), Histidin (–3,2), Glutamat (–3,5), Glutamin (–3,5), Aspartat (–3,5), Asparagin (–3,5), Lysin (–3,9) und Arginin (–4,5).
Es ist aus dem Stand der Technik bekannt, dass bestimmte Aminosäuren durch andere Aminosäuren mit ähnlichen hydropathischen Indizes oder Werten substituiert werden können und dennoch ein Protein mit ähnlicher biologischer Funktion ergeben, d. h. dennoch ein in seiner biologischen Funktion äquivalentes Protein. Bei der Durchführung solcher Veränderungen ist die Substitution von Aminosäuren, deren hydropathische Indizes im Bereich von ±2 liegen, bevorzugt, wobei solche, deren hydropathischer Index im Bereich von ±1 liegt, besonders bevorzugt sind und solche mit einem hydropathischen Index im Bereich von ±0,5 noch mehr bevorzugt sind.
Es ist aus dem Stand der Technik klar, dass ähnliche Aminosäuren wirksam auf der Basis ihrer Hydrophilie substituiert werden können. Das hierin durch Bezugnahme enthaltene US-Patent 4,554,101 stellt fest, dass die höchste lokale durchschnittliche Hydrophilie eines Proteins, bestimmt durch die Hydrophilie seiner benachbarten Aminosäuren, mit einer biologischen Eigenschaft des Proteins korreliert. Wie in US-Patent 4,554,101 ausführlich aufgeführt, sind Aminosäureresten folgende Hydrophiliewerte zugeordnet worden: Arginin (+3,0), Lysin (+3,0), Aspartat (+3,0 ± 1), Glutamat (+3,0 ± 1), Serin (+0,3), Asparagin (+0,2), Glutamin (+0,2), Glycin (0), Threonin (–0,4), Prolin (–0,5 ± 1), Alanin (–0,5), Histidin (–0,5), Cystein (–1,0), Methionin (–1,3), Valin (–1,5), Leucin (–1,8), Isoleucin (–1,8), Tyrosin (–2,3), Phenylalanin (–2,5) , Tryptophan (–3,4).
Eine Aminosäure kann durch eine andere mit ähnlichem Hydrophiliewert substituiert werden und dennoch ein biologisch äquivalentes und immunologisch äquivalentes Protein erhalten werden. Bei solchen Veränderungen ist die Substitution von Aminosäuren, deren Hydrophiliewerte im Bereich von +2 liegen, bevorzugt, wobei solche, deren Hydrophiliewert im Bereich von ±1 liegt, besonders bevorzugt sind und solche mit einem Hydrophiliewert im Bereich von ±0,5 noch mehr bevorzugt sind.
Wie oben ausgeführt, beruhen Aminosäuresubstitutionen im Allgemeinen auf der relativen Ähnlichkeit der Aminosäureseitenkettensubstituenten, beispielsweise ihrer Hydrophobie, Hydrophilie, Ladung, Größe und Dergleichen. Einem Fachmann sind beispielhafte Substitutionen, die verschiedene der vorherigen Merkmale in Betracht ziehen, gut bekannt und umfassen: Arginin und Lysin, Glutamat und Aspartat, Serin und Threonin, Glutamin und Asparagin sowie Valin, Leucin und Isoleucin.
Eine weitere Ausführungsform für die erfindungsgemäße Herstellung von Polypeptiden ist die Verwendung von Peptidmimetika. Mimetika sind peptidhaltige Moleküle, die Elemente einer Proteinsekundärstruktur nachahmen. Siehe beispielsweise Johnson et al., "Peptide Turn Mimetics" in BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY, Pezzuto et al., Hrsg., Chapman und Hall, New York (1993). Die Begründung der Verwendung von Peptidmimetika ist, dass das Peptidgerüst von Proteinen vorwiegend dazu dient, Aminosäureseitenketten so auszurichten, dass molekulare Wechselwirkungen, wie die von Antikörper und Antigen, erleichtert sind. Ein Peptidmimetikum soll molekulare Wechselwirkungen ermöglichen, die ähnlich sind wie beim natürlichen Molekül. Diese Prinzipien können in Verbindung mit den oben ausgeführten Prinzipien verwendet werden, um Moleküle der zweiten Generation technisch herzustellen, die viele der natürlichen Eigenschaften von TS10q23.3, jedoch mit veränderten und sogar verbesserten Merkmalen aufweisen.
D. Domänenaustausch
Wie in den Beispielen beschrieben, haben die vorliegenden Erfinder putative Homologe des humanen TS10q23.3-Gens in Maus und Hund identifiziert. Darüber hinaus sind in TS10q23.3 Mutationen identifiziert worden, von denen angenommen wird, dass sie seine Funktion verändern. Diese Studien sind aus mindestens zwei Gründen wichtig. Erstens begründen sie die Erwartung, dass in verwandten Arten wie der Ratte, dem Kaninchen, dem Affen, dem Gibbon, dem Schimpansen, dem Menschenaffen, dem Pavian, der Kuh, dem Schwein, dem Pferd, dem Schaf und der Katze noch weitere Homologe, Allelvarianten und Mutanten dieses Gens existieren. Nach Isolierung dieser Homologe, Varianten und Mutanten und in Verbindung mit anderen Analysen können bestimmte aktive oder funktionelle Domänen identifiziert werden. Zweitens wird dies einen Ausgangspunkt für weitere Mutationsanalysen des Moleküls liefern. Diese Informationen können beispielsweise durch Domänenaustausch untersucht werden.
Domänenaustausch umfasst die Erzeugung chimärer Moleküle anhand von unterschiedlichen, aber in diesem Fall verwandten Polypeptiden. Durch Vergleich der TS10q23.3-Sequenzen von Maus, Hund und Mensch mit der TS10q23.3-Sequenz anderer Arten und mit Mutanten und Allelvarianten dieser Polypeptide ist eine Vorhersage in Bezug auf die funktionell signifikanten Regionen dieser Moleküle möglich. Es ist damit möglich, anschließend verwandte Domänen dieser Moleküle auszutauschen, um die Bedeutung dieser Regionen für die Funktion von TS10q23.3 zu bestimmen. Diese Moleküle können insofern zusätzlichen Wert haben, als diese „Chimären" von natürlichen Molekülen unterscheidbar sind, obgleich sie dieselbe Funktion vermitteln.
Ausgehend von der Sequenzidentität der Sequenzen von Maus, Hund und Mensch auf Aminosäureebene kann abgeleitet werden, dass selbst kleine Veränderungen der Primärsequenz des Moleküls seine Funktion beeinflussen. Eine weitergehende Analyse von Mutationen und ihrem prognostizierten Effekt auf die Sekundärstruktur wird dieses Verständnis erweitern.
Ein weiterer struktureller Aspekt von TS10q23.3, der eine Begründung für die Domänenaustauschstudien liefert, sind die Tyrosinphosphatase-ähnliche Domäne und die putativen Tyrosinphosphorylierungsstellen. Diese Domäne kann durch andere Phosphatasedomänen substituiert werden, um die Spezifität dieser Funktion zu verändern. Diese Beobachtung rechtfertigt eine weitere Untersuchung der Homologie zwischen TS10q23.3 und anderen Phosphatasen.
E. Fusionsproteine
Eine spezielle Art einer Insertionsvariante ist das Fusionsprotein. Dieses Molekül weist in der Regel alle Abschnitte oder einen wesentlichen Abschnitt des nativen Moleküls auf, die bzw. der am N- oder C-Terminus mit einem vollständigen oder einem Abschnitt eines zweiten Polypeptids verknüpft ist oder die am N- oder C-Terminus mit einem vollständigen oder einem Abschnitt eines zweiten Polypeptids verknüpft sind. Fusionen weisen typischerweise zum Beispiel Führungssequenzen anderer Arten auf, um die rekombinante Expression eines Proteins in einem heterologen Wirt zu erlauben. Eine andere nützliche Fusion umfasst die Addition einer immunologisch aktiven Domäne wie beispielsweise eines Antikörperepitops, um die Reinigung des Fusionsproteins zu erleichtern. Der Einschluss einer Schnittstelle an oder in der Nähe der Verbindungsstelle erleichtert das Entfernen des externen Polypeptids nach der Reinigung. Weitere nützliche Funktionen umfassen das Verknüpfen funktioneller Domänen, wie beispielsweise aktive Zentren von Enzymen, Glykosylierungsdomänen, Signale für zelluläres Targeting oder Transmembranregionen.
Eine bestimmte Fusion, die von Interesse ist, würde ein Deletionskonstrukt enthalten, dem die Phosphatasebindungsstelle von TS10q23.3 fehlt, die aber andere Regionen enthält, die das Substratmolekül binden könnten. Eine Fusion an ein Polypeptid, das zur Reinigung des Substrat-TS10q23.3-Komplexes verwendet werden kann, hätte den Zweck, das Substrat zur Identifikation und Analyse zu isolieren.
Beispiele von Fusionsproteinexpressionssystemen umfassen das Glutathion-S-Transferase (GST)-System (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA), das Maltosebindungsproteinsystem (NEB, Beverley, MA, USA), das FLAG-System (IBI, New Haven, CT, USA) und das 6×His-System (Qiagen, Chatsworth, CA, USA).
Manche dieser Systeme produzieren rekombinante Polypeptide, die nur eine kleine Anzahl zusätzlicher Aminosäuren aufweisen, welche die antigene Eigenschaft des rekombinanten Polypeptids mit hoher Wahrscheinlichkeit nicht beeinflussen. Sowohl das FLAG-System als auch das 6×His-System fügen nur kurze Sequenzen hinzu, von denen bekannt ist, dass sie kaum antigen sind und die Faltung des Polypeptids zu seiner nativen Konformation nicht negativ beeinflussen.
In anderen Systemen ist es möglich, Fusionsproteinkonstrukte herzustellen, um die Immunogenität eines TS10q23.3-Fusionskonstruktes zu steigern. Fusionskonstrukte zur Steigerung der Immunogenität sind einem Fachmann gut bekannt, beispielsweise ist eine Fusion von TS10q23.3 mit einem Helferanigen wie beispielsweise hsp70 oder Peptidsequenzen wie der der Diphterietoxinkette oder einem Zytokin wie IL-2 für die Induktion einer Immunreaktion hilfreich. In anderen Ausführungsformen können Fusionskonstrukte hergestellt werden, welche das Targeting der mit TS10q23.3 verwandten Zusammensetzungen zu einem speziellen Ort oder einer bestimmten Stelle leiten. Die Fusion von TS10q23.3 oder eines Proteins des Typs TS10q23.3 mit einem Liganden ist beispielsweise ein effektives Mittel, um die Zusammensetzung an einen Ort zu leiten, an dem der Rezeptor für einen solchen Liganden exprimiert wird. So kann das TS10q23.3 oder die mit TS10q23.3 verwandte Zusammensetzung über eine rezeptorvermittelte Aufnahme in eine Zelle gelangen. Das TS10q23.3-Protein kann kovalent an einen Liganden angebracht oder mit ihm fusioniert sein. Dies kann als Mechanismus zur Abgabe in eine Zelle verwendet werden. Der Ligand, an dem das Protein angebracht ist, kann dann von einer rezeptortragenden Zelle aufgenommen werden.
Andere Fusionssysteme produzieren Polypeptidhybride, wenn es wünschenswert ist, den Fusionspartner von dem gewünschten Polypeptid abzuschneiden. In einer Ausführungsform ist der Fusionspartner mit dem rekombinanten TS10q23.3-Polypeptid durch eine Peptidsequenz verknüpft, die eine spezifische Erkennungsstelle für eine Protease enthält. Beispiele geeigneter Sequenzen sind solche, die von der Tabakätzvirusprotease (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA) oder Faktor Xa (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) erkannt werden.
F. Reinigung von Proteinen
Es ist wünschenswert, TS10q23.3 oder Varianten davon zu reinigen. Einem Fachmann sind Proteinreinigungstechniken gut bekannt. Diese Techniken umfassen in einer Stufe die grobe Fraktionierung des zellulären Milieus in Polypeptid- und Nicht-Polypeptidfraktionen. Nachdem das Polypeptid von anderen Proteinen getrennt ist, kann das Polypeptid von Interesse anhand chromatographischer und elektrophoretischer Techniken weiter gereinigt werden, um eine partielle oder vollständige Reinigung zu erzielen (bzw. eine Reinigung bis zur Homogenität). Analytische Verfahren, die sich besonders gut für die Herstellung eines reinen Peptids eignen, sind die Ionenaustauschchromatographie, die Ausschlusschromatographie, die Polyacrylamidgelelektrophorese und die isoelektrische Fokussierung. Ein besonders effizientes Verfahren der Reinigung von Peptiden ist die schnelle Proteinflüssigchromatographie oder sogar die HPLC.
Bestimmte Aspekte der vorliegenden Erfindung betreffen die Reinigung und in bestimmten Ausführungsformen die wesentliche Reinigung eines kodierten Proteins oder Peptids. Der Begriff „gereinigtes Protein oder Peptid", wie hierin verwendet, soll sich auf eine Zusammensetzung beziehen, die von anderen Bestandteilen isolierbar ist, wobei das Protein oder Peptid bis zu einer beliebigen Stufe relativ zu seinem natürlicherweise erzielbaren Zustand gereinigt wird. Ein gereinigtes Protein oder Peptid bezieht sich daher auch auf ein Protein oder Peptid außerhalb der Umgebung, in der es natürlicherweise vorkommt.
„Gereinigt" bezieht sich im Allgemeinen auf eine Protein- oder Peptidzusammensetzung, die einer Fraktionierung unterzogen worden ist, um verschiedene andere Bestandteile zu entfernen, und bei der diese Zusammensetzung im Wesentlichen ihre ausgedrückte biologische Aktivität beibehält. Wenn der Begriff „im Wesentlichen gereinigt" verwendet wird, bezieht sich diese Bezeichnung auf eine Zusammensetzung, in der das Protein oder Peptid den Hauptbestandteil der Zusammensetzung ausmacht, beispielsweise etwa 50%, etwa 60%, etwa 70%, etwa 80%, etwa 90%, etwa 95% oder mehr der Proteine in der Zusammensetzung darstellt.
Einem Fachmann sind angesichts der vorliegenden Offenbarung verschiedene Verfahren zur Quantifizierung des Grads der Reinigung des Proteins oder Peptids bekannt. Dazu gehört beispielsweise das Bestimmen der spezifischen Aktivität einer aktiven Fraktion oder die Ermittlung der Menge von Polypeptiden in einer Fraktion mittels SDS/PAGE-Analyse. Ein bevorzugtes Verfahren zum Ermitteln der Reinheit einer Fraktion ist es, die spezifische Aktivität der Fraktion zu berechnen, um sie mit der spezifischen Aktivität des ursprünglichen Extraktes zu vergleichen und so den Reinheitsgrad zu berechnen, der hierin durch eine „x-fache Reinigungszahl" ermittelt wird. Welche tatsächlichen Einheiten verwendet werden, um das Maß der Aktivität darzustellen, richtet sich natürlich nach der jeweiligen Assaytechnik, die nach der Reinigung ausgewählt wird, und danach, ob oder ob nicht das exprimierte Protein oder Polypeptid eine nachweisbare Aktivität aufweist.
Einem Fachmann sind verschiedene Techniken bekannt, die sich zur Anwendung bei der Proteinreinigung eignen. Dazu gehören beispielsweise das Ausfällen mit Ammoniumsulfat, PEG, Antikörpern und dergleichen oder durch Hitzedenaturierung, gefolgt von Zentrifugation, Chromatographieschritte wie beispielsweise Innenaustausch-, Gelfiltrations-, Umkehrphasen-, Hydroxyapatit- und Affinitätschromatographie, Isoelektrische Fokussierung, Gelelektrophorese und Kombinationen solcher und anderer Techniken. Wie aus dem Stand der Technik im Allgemeinen bekannt ist, wird angenommen, dass die Reihenfolge der Durchführung der verschiedenen Reinigungsschritte verändert werden kann oder dass bestimmte Schritte weggelassen werden können und dies dennoch ein geeignetes Verfahren für die Reinigung eines im Wesentlichen gereinigten Proteins oder Peptids hervorbringt.
Es besteht keine allgemeine Voraussetzung, dass das Protein oder Peptid immer in seinem am stärksten gereinigten Zustand bereit gestellt werden muss. Tatsächlich besteht die Überlegung, dass weniger im Wesentlichen gereinigte Produkte in bestimmten Ausführungsformen von Nutzen sind. Eine partielle Reinigung kann erreicht werden, indem weniger Reinigungsschritte in Kombination oder indem verschiedene Formen desselben allgemeinen Reinigungsschemas verwendet werden. Beispielsweise bewirkt eine Kationenaustausch-Säulenchromatographie mittels eines HPLC-Apparates im Allgemeinen eine stärkere „x-fache" Reinigung als die gleiche Technik, die ein Niedrigdruck-Chromatographiesystem verwendet. Verfahren, die einen niedrigeren Grad einer relativen Reinigung aufweisen, können im Hinblick auf die Gesamtwiedergewinnung des Proteinproduktes oder der Erhaltung der Aktivität eines Expressionsproteins Vorteile haben.
Es ist bekannt, dass die Migration eines Polypeptids bei unterschiedlichen Bedingungen der SDS/PAGE variieren kann, in einigen Fällen signifikant (Capaldi et al., 1977). Es wird daher anerkannt, dass die scheinbaren Molekulargewichte gereinigter oder partiell gereinigter Expressionsprodukte unter unterschiedlichen Elektrophoresebedingungen variieren können.
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) zeichnet sich durch eine sehr schnelle Auftrennung mit außerordentlicher Peakauflösung aus. Dies wird erreicht, indem sehr feine Teilchen und hoher Druck verwendet werden, um eine angemessene Durchflussrate aufrecht zu erhalten. Die Auftrennung kann innerhalb von Minuten oder höchstens einer Stunde erzielt werden. Darüber hinaus wird nur ein sehr kleines Probenvolumen benötigt, da die Teilchen so klein und dicht gepackt sind, dass das Totvolumen einen sehr geringen Anteil des Bettvolumens ausmacht. Auch die Konzentration der Probe braucht nicht sehr groß zu sein, da die Banden so schmal sind, dass die Probe nur sehr wenig verdünnt wird.
Die Gelchromatographie oder Molekularsiebchromatographie ist eine spezielle Art von Auftrennungschromatographie, die auf der Molekülgröße beruht. Die Gelchromatographie basiert auf der Theorie, dass die Säule, die mit winzigen Teilchen einer inerten Substanz hergestellt ist, die kleine Poren enthalten, größere Moleküle je nach Größe von kleineren Molekülen trennt, wenn diese durch oder um die Poren herum wandern. So lange wie das Material, aus dem die Teilchen bestehen, die Moleküle nicht adsorbiert, wird der Durchfluss ausschließlich von der Größe bestimmt. Die Elution von Molekülen aus der Säule erfolgt daher nach abnehmender Größe, so lange die Form relativ konstant ist. Die Gelchromatographie ist bei der Auftrennung von Molekülen unterschiedlicher Größe unübertroffen, da die Auftrennung von allen anderen Faktoren, wie pH-Wert, Ionenstärke, Temperatur, etc. unabhängig ist. Es gibt außerdem praktisch keine Adsorption, weniger Zonenverbreiterung, und das Elutionsvolumen ist auf einfache Weise mit dem Molekulargewicht verbunden.
Die Affinitätschromatographie ist ein chromatographisches Verfahren, das auf der spezifischen Affinität zwischen einer zu isolierenden Substanz und einem spezifisch an ihr bindenden Molekül beruht. Es handelt sich dabei um eine Wechselwirkung vom Typ Rezeptor-Ligand. Das Säulenmaterial wird synthetisiert, indem einer der Bindungspartner kovalent an eine unlösliche Matrix gekoppelt wird. Das Säulenmaterial ist anschließend in der Lage, die Substanz spezifisch aus der Lösung zu adsorbieren. Zu einer Elution kommt es, indem die Bedingungen so geändert werden, dass keine Bindung erfolgt (Änderung des pH-Wertes, der Ionenstärke, der Temperatur, etc.).
Die Lektin-Affinitätschromatographie ist eine besondere Art von Affinitätschromatographie, die bei der Reinigung von kohlenhydrathaltigen Verbindungen nützlich ist. Lektine sind eine Klasse von Substanzen, die an eine Vielzahl von Polysacchariden und Glykoproteine binden. Lektine sind in der Regel durch Zyanogenbromid an Agarose gekoppelt. An Sepharose gekoppeltes Concanavalin A war das erste verwendete Material dieser Art und wurde häufig bei der Isolierung von Polysacchariden und Glykoproteinen verwendet. Andere Lektine, die verwendet worden sind, sind Lektin aus Linsen, Weizenkeimagglutinin, das bei der Reinigung von N-Acetylglucosaminylresten benutzt wurde, sowie Lektin aus Helix pomatia. Lektine selbst werden durch Affinitätschromatographie mit Kohlenhydratliganden gereinigt. Laktose wurde verwendet, um Lektine aus Rizinussamen und Erdnüssen zu reinigen; Maltose diente der Extraktion von Lektinen aus Linsen und Jackbohnen; N-Acetyl-D-Galaktosamin wird zur Reinigung von Lektinen aus Sojabohnen benutzt; N-Acetylglucosaminyl bindet an Lektine aus Weizenkeimen; D-Galaktosamin wurde zur Gewinnung von Lektinen aus Muscheln verwendet und L-Fukose bindet an Lektine aus Lotus.
Die Matrix sollte eine Substanz sein, die selbst Moleküle nicht wesentlich bindet und die eine sehr weit gefasste chemische, physikalische und thermale Stabilität besitzt. Der Ligand sollte so gekoppelt sein, dass seine Bindungseigenschaften nicht beeinträchtigt werden. Der Ligand sollte außerdem eine relativ feste Bindung eingehen. Und es sollte möglich sein, die Substanz zu eluieren, ohne die Probe oder den Liganden zu zerstören. Eine der häufigsten Formen der Affinitätschromatographie ist die Immunaffinitätschromatographie. Die Herstellung von Antikörpern, die zur Verwendung in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung geeignet sind, ist unten erläutert.
G. Synthetische Peptide
Die vorliegende Erfindung beschreibt außerdem kleinere mit TS10q23.3 verwandte Peptide zur Verwendung in verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. Aufgrund ihrer relativ kleinen Größe, können die Peptide der Erfindung in Übereinstimmung mit herkömmlichen Techniken auch in Lösung oder auf einem festen Träger synthetisiert werden. Es sind verschiedene automatische Synthesegeräte kommerziell erhältlich und können in Übereinstimmung mit bekannten Protokollen verwendet werden. Siehe beispielsweise Steward und Young (1984), Tam et al., (1983), Merrifield (1986) und Barany und Merrifield (1979), jeweils hierin durch Bezugnahme enthalten. Kurze Peptidsequenzen oder Bibliotheken überlappender Peptide, in der Regel von etwa 6 bis zu etwa 35 bis 50 Aminosäuren, die den hierin beschriebenen ausgewählten Regionen entsprechen, können leicht synthetisiert und dann in Screening-Assays untersucht werden, die zur Identifizierung reaktiver Peptide konzipiert sind. Alternativ kann rekombinante DNA-Technologie angewandt werden, wobei eine Nukleotidsequenz, die ein Peptid der Erfindung kodiert, in einen Expressionsvektor eingesetzt wird, in eine geeignete Wirtszelle transformiert oder transfiziert und unter Bedingungen kultiviert wird, die für eine Expression geeignet sind.
US-Patent 4,554,101 (hierin durch Bezugnahme enthalten) lehrt auch die Identifizierung und Herstellung von Epitopen aus primären Aminosäuresequenzen auf der Basis der Hydrophilie. Durch die von Hopp offenbarten Verfahren wäre ein Fachmann in der Lage, Epitope aus der von einer beliebigen der hierin offenbarten DNA-Sequenzen kodierten Aminosäure zu identifizieren.
H. Antigenzusammensetzungen
Die vorliegende Erfindung sieht außerdem die Verwendung von TS10q23.3-Proteinen oder -Peptiden als Antigene für die Immunisierung von Tieren in Zusammenhang mit der Herstellung von Antikörpern vor. Es ist vorgesehen, dass entweder TS10q23.3 oder Abschnitte davon über Linker, Polylinker oder derivatisierte Aminosäuren an ein oder mehrere Mittel gekoppelt, bondiert, gebunden, konjugiert oder chemisch verknüpft werden. Dies kann derart durchgeführt werden, dass eine bispezifische oder multivalente Zusammensetzung oder Vakzine hergestellt wird. Es ist weiter vorgesehen, dass die bei der Herstellung dieser Zusammensetzungen verwendeten Verfahren einem Fachmann bekannt sind und für die Verabreichung an Tiere geeignet sind, d. h. pharmazeutisch annehmbar sind. Bevorzugte Mittel sind die Trägerstoffe Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH) oder Rinderserumalbumin (bovines Serumalbumin, BSA).
III. Nukleinsäuren
Die vorliegende Erfindung sieht in einer anderen Ausführungsform Gene vor, die TS10q23.3 kodieren. Es sind Gene für das TS10q23.3-Molekül des Menschen, des Hundes und der Maus identifiziert worden. Die vorliegende Erfindung ist in ihrem Umfang nicht auf diese Gene beschränkt, aber, ein durchschnittlicher Fachmann könnte anhand dieser Nukleinsäuren verwandte Homologe in verschiedenen anderen Arten (z. B. Ratte, Kaninchen, Affe, Gibbon, Schimpanse, Menschenaffe, Pavian, Kuh, Schwein, Pferd, Schaf, Katze und andere Arten) leicht identifizieren. Das Auffinden von Maus- und Hundhomologen dieses Gens macht es wahrscheinlich, dass andere Arten, die näher mit dem Menschen verwandt sind, ebenfalls ein Homolog aufweisen.
Darüber hinaus sollte klar sein, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die hierin offenbarten spezifischen Nukleinsäuren beschränkt ist. Wie unten erläutert, kann ein „TS10q23.3-Gen" eine Vielzahl unterschiedlicher Basen enthalten und dennoch ein entsprechendes Polypeptid hervorbringen, das funktionell, und in manchen Fällen strukturell, von den hierin offenbarten Genen von Mensch und Maus nicht unterscheidbar ist.
Gleichermaßen ist bei jeder Bezugnahme auf eine Nukleinsäure auch eine Wirtszelle gemeint, die diese Nukleinsäure enthält, und in einigen Fällen in der Lage ist, das Produkt dieser Nukleinsäure zu exprimieren. Abgesehen von therapeutischen Überlegungen könnten sich Zellen, die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung exprimieren, in Zusammenhang mit dem Screening auf Mittel, die die Funktion von TS10q23.3 induzieren, zurückhalten, inhibieren, unterstützen, damit in Wechselwirkung treten, blockieren, aufheben, stimulieren oder verstärken, als nützlich erweisen.
A. Für 10q23.3 kodierende Nukleinsäuren
Das in 6 und 9 offenbarte humane Gen und das in 9 offenbarte Maus-Gen sind TS10q23.3-Gene der vorliegenden Erfindung. Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung können ein vollständiges TS10q23.3-Gen, eine Domäne von TS10q23.3, die eine tumorsupprimierende Funktion oder Phosphatasefunktion exprimiert, oder ein beliebiges anderes Fragment der hierin ausgeführten TS10q23.3-Sequenzen kodieren. Die Nukleinsäure kann aus genomischer DNA abgeleitet sein, d. h. direkt aus dem Genom eines bestimmten Organismus kloniert sein. In bevorzugten Ausführungsformen würde die Nukleinsäure jedoch komplementäre DNA (cDNA) umfassen. In Betracht gezogen ist auch eine cDNA plus ein natürliches Intron oder ein von einem anderen Gen abgeleitetes Intron; solche technisch hergestellten Moleküle werden manchmal als „Minigene" bezeichnet. Diese und andere Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung können mindestens als Molekulargewichtsstandards beispielsweise bei der Gelelektrophorese verwendet werden.
Der Begriff „cDNA" soll sich auf DNA beziehen, die anhand von Boten-RNA (Messenger RNA oder mRNA) als Vorlage hergestellt wird. Die Verwendung einer cDNA hat gegenüber genomischer DNA oder DNA, die aus einer genomischen, nicht oder teilweise prozessierten RNA-Vorlage polymerisiert wird, den Vorteil, dass die cDNA überwiegend kodierende Sequenzen des entsprechenden Proteins enthält. Bisweilen ist die vollständige oder partielle genomische Sequenz bevorzugt, beispielsweise dann, wenn die nicht kodierenden Regionen für eine optimale Expression erforderlich sind oder wenn auf nicht kodierende Regionen, wie beispielsweise Introns, in einer Antisense-Strategie abgezielt wird.
Es wird auch in Betracht gezogen, dass ein gegebenes TS10q23.3 von einer bestimmten Art durch natürliche Varianten repräsentiert werden kann, die leicht unterschiedliche Nukleinsäuresequenzen aufweisen, aber dennoch dasselbe Protein kodieren (siehe Tabelle 1 unten).
Wie in dieser Anmeldung verwendet, bezieht sich der Begriff „eine Nukleinsäure, die für ein TS10q23.3 kodiert", auf ein Nukleinsäuremolekül, das ohne zelluläre Gesamtnukleinsäure isoliert worden ist. In bevorzugten Ausführungsformen betrifft die Erfindung eine Nukleinsäuresequenz, im Wesentlichen wie in 6 und 9 ausgeführt. Der Begriff „wie in 6 oder 9 ausgeführt" bedeutet, dass die Nukleinsäuresequenz im Wesentlichen einem Abschnitt von 6 oder 9 entspricht. Der Begriff „funktionell äquivalentes Codon" wird hierin verwendet, um sich auf Codons zu beziehen, die dieselbe Aminosäure kodieren, beispielsweise die sechs Codons für Arginin oder Serin (Tabelle 1 unten), und bezieht sich außerdem auf Codons, die biologisch äquivalente Aminosäuren kodieren, wie auf den folgenden Seiten erläutert ist.
Tabelle 1
Unter Berücksichtigung der Degeneration des genetischen Codes sind Sequenzen, deren Nukleinsäuren zu mindestens 50%, in der Regel zu etwa 60%, noch häufiger zu etwa 70%, am häufigsten zu etwa 80%, vorzugsweise zu mindestens etwa 90% und am meisten bevorzugt zu etwa 95% mit den Nukleotiden von 9 identisch sind, „wie in 9 ausgeführt". Sequenzen, die im Wesentlichen gleich sind wie die in 9 ausgeführten, können funktionell auch als Sequenzen definiert sein, die unter Standardbedingungen ein Nukleinsäuresegment hybridisieren können, welches das Komplement von 9 enthält.
Die DNA-Segmente der vorliegenden Erfindung umfassen solche, die biologisch funktionelle äquivalente TS10q23.3-Proteine und -Peptide enthalten, wie oben beschrieben. Solche Sequenzen können als Folge einer Codonredundanz und einer funktionellen Äquivalenz der Aminosäuren entstehen, von denen bekannt ist, dass sie in Nukleinsäuresequenzen und den davon kodierten Proteinen natürlicherweise auftreten. Alternativ können durch Anwendung rekombinanter DNA-Technologie funktionell äquivalente Proteine oder Peptide erzeugt werden, in denen die Proteinstruktur je nach Berücksichtigung der Eigenschaften der ausgetauschten Aminosäuren technisch geändert ist. Durch den Menschen konzipierte Änderungen können durch Anwendung von Techniken einer positionsgichteten (Site-Directed) Mutagenese eingeführt werden oder können zufällig eingeführt werden und später hinsichtlich der gewünschten Funktion untersucht werden, wie unten beschrieben ist.
B. Oligonukleotidsonden und -primer
Natürlich umfasst die vorliegende Erfindung auch DNA-Segmente, die zu der in 6 und 9 ausgeführten Sequenz komplementär oder im Wesentlichen komplementär sind. Nukleinsäuresequenzen, die „komplementär" sind, sind solche, die gemäß den Komplementaritäts-Standardregeln von Watson-Crick zu einer Basenpaarung fähig sind. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „komplementäre Sequenzen" Nukleinsäuresequenzen, die im Wesentlichen komplementär sind, wie durch denselben Nukleinsäurevergleich wie oben ausgeführt bestimmt wird, oder die so definiert sind, dass sie unter relativ stringenten Bedingungen, wie beispielsweise den hierin Beschriebenen, an die Nukleinsäuresegmente von 6 und 9 hybridisieren können. Solche Sequenzen können das vollständige TS10q23.3-Protein oder funktionelle oder nicht-funktionelle Fragmente davon kodieren.
Alternativ kann es sich bei den Hybridisierungssegmenten um kürzere Oligonukleotide handeln. Sequenzen mit einer Länge von 17 Basen sollten im Genom des Menschen nur einmal auftreten und sind daher ausreichend, um eine einmalige Zielsequenz zu spezifizieren. Obgleich kürzere Oligomere einfacher herzustellen sind und die Zugänglichkeit in vivo erhöhen, sind zahlreiche andere Faktoren an der Festlegung der Spezifität einer Hybridisierung beteiligt. Sowohl die Bindungsaffinität als auch die Sequenzspezifität eines Oligonukleotids zu seinem komplementären Ziel erhöhen sich mit zunehmender Länge. Es wird in Betracht gezogen, beispielhafte Oligonukleotide mit 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 oder mehr Basenpaaren zu verwenden, obgleich Andere in Betracht gezogen werden. Längere Polynukleotide, die 250, 500, 1000, 1212, 1500, 2000, 2500, 3000 oder 3431 Basen und länger kodieren, werden ebenfalls in Betracht gezogen. Solche Oligonukleotide können beispielsweise in Southern oder Northern Blots und als Primer in Amplifizierungsreaktionen verwendet werden.
Einem Fachmann sind geeignete Hybridisierungsbedingungen gut bekannt. In bestimmten Anwendungen, beispielsweise bei der Substitution von Aminosäuren durch positionsgerichtete Mutagenese, sind Bedingungen mit geringerer Stringenz erforderlich. Unter diesen Bedingungen kann auch dann eine Hybridisierung ablaufen, wenn die Sequenzen von Sonde und Zielstrang nicht perfekt komplementär sind, sondern an einer Position oder an mehreren Positionen nicht übereinstimmen. Die Stringenz der Bedingungen kann durch Erhöhung der Salzkonzentration und Verringerung der Temperatur verringert werden. Beispielsweise können Bedingungen mit mittlerer Stringenz durch etwa 0,1 bis 0,25 M NaCl bei Temperaturen von etwa 37°C bis etwa 55°C bereit gestellt werden, während Bedingungen mit niedriger Stringenz durch etwa 0,15 M bis etwa 0,9 M Salz bei Temperaturen zwischen etwa 20°C und etwa 55°C bereit gestellt werden kann. Hybridisierungsbedingungen können also einfach verändert werden und sind daher im Allgemeinen je nach den gewünschten Ergebnissen ein Verfahren der Wahl.
In anderen Ausführungsformen kann eine Hybridisierung unter Bedingungen von beispielsweise 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreitol, bei Temperaturen von etwa 20°C bis etwa 37°C erreicht werden. Andere verwendete Hybridisierungsbedingungen umfassen etwa 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 μM MgCl₂ bei Temperaturen im Bereich von etwa 40°C bis etwa 72°C. Es können auch Formamid und SDS verwendet werden, um die Hybridisierungsbedingungen zu verändern.
Sonden und Primer der vorliegenden Erfindung können auch bei der Suche nach Genen, die mit TS10q23.3 verwandt sind, oder spezieller nach Homologen von TS10q23.3 anderer Arten verwendet werden. Das Vorhandensein eines Maushomologs lässt den Schluss zu, dass in Arten, die näher und vielleicht entfernter verwandt sind als die Maus, andere Homologe des humanen TS10q23.3 entdeckt werden. Normalerweise ist die Ziel-DNA eine genomische oder cDNA-Bibliothek, obgleich ein Screening die Analyse von RNA-Molekülen beinhalten kann. Durch Variation der Stringenz der Hybridisierung und der Region der Sonde können unterschiedliche Homologiegrade entdeckt werden.
Ein weiterer Weg der Anwendung von Sonden und Primern der vorliegenden Erfindung ist die ortsgerichtete oder ortsspezifische Mutagenese. Ortsspezifische Mutagenese ist eine Technik, die sich für die Herstellung individueller Peptide oder biologisch funktioneller äquivalenter Proteine oder Peptide durch spezifische Mutagenese der zugrunde liegenden DNA eignet. Die Technik bietet darüber hinaus eine einfache Möglichkeit zur Herstellung und Testung von Sequenzvarianten, wobei eine oder mehrere der vorangehenden Überlegungen miteinbezogen werden, indem eine oder mehrere Nukleotidsequenzen in die DNA eingeführt werden. Ortsspezifische Mutagenese ermöglicht die Herstellung von Mutanten durch Verwendung spezifischer Oligonukleotidsequenzen, die die DNA-Sequenz der gewünschten Mutation kodieren, sowie eine ausreichende Zahl benachbarter Nukleotide, um eine Primersequenz ausreichender Größe und Sequenzkomplexität bereit zu stellen, um auf beiden Seiten der überbrückten Deletionsübergangsstelle einen stabilen Duplex zu bilden. Typischerweise ist ein Primer mit etwa 17 bis 25 Nukleotiden bevorzugt, wobei auf jeder Seite der Übergangsstelle der Sequenz etwa 5 bis 10 Reste verändert werden.
Bei der Technik wird typischerweise ein Bakteriophagenvektor verwendet, der sowohl in Einzelstrang- als auch in Doppelstrangform vorkommt. Zu den typischen Vektoren, die sich für die ortsspezifische Mutagenese eignen, gehören Vektoren wie der Phage M13. Diese Phagenvektoren sind kommerziell verfügbar und ihre Verwendung ist einem Fachmann im Allgemeinen gut bekannt. Auch doppelsträngige Plasmide werden bei der ortsspezifischen Mutagenese routinemäßig verwendet, was den Schritt der Übertragung des Gens von Interesse von einem Phagen in ein Plasmid beseitigt.
Im Allgemeinen wird eine ortsspezifische Mutagenese durchgeführt, indem zunächst ein einzelsträngiger Vektor erhalten oder die beiden Stränge eines doppelsträngigen Vektors durch Schmelzen getrennt werden, wobei der Vektor in seiner Sequenz eine DNA-Sequenz aufweist, die das gewünschte Protein kodiert. Es wird ein Oligonukleotidprimer synthetisch hergestellt, der die gewünschte mutierte Sequenz trägt. Der Primer wird dann an das einzelsträngige DNA-Präparat angeheftet, wobei der Grad der Nichtübereinstimmungen bei der Auswahl der Hybridisierungsbedingungen berücksichtigt wird, und DNA-polymerisierenden Enzymen, wie dem Klenow-Fragment der Polymerase I von E.coli unterzogen, um die Synthese des mutationstragenden Stranges abzuschließen. So bildet sich ein Heteroduplex, in dem ein Strang die ursprüngliche, nicht mutierte Sequenz kodiert und der zweite Strang die gewünschte Mutation trägt. Der Heteroduplexvektor wird dann verwendet, um geeignete Zellen wie beispielsweise E. coli-Zellen zu transformieren, und es werden Klone selektiert, die rekombinante Vektoren enthalten, welche die mutierte Sequenzanordnung tragen.
Die Herstellung von Sequenzvarianten des ausgewählten Gens anhand einer ortsspezifischen Mutagenese ist als ein Mittel zur Herstellung potenziell nützlicher Arten vorgesehen und soll nicht einschränkend sein, da Sequenzvarianten von Genen noch auf andere Art und Weise erhalten werden können. Beispielsweise können rekombinante Vektoren, die das gewünschte Gen kodieren, mit mutagenen Mitteln wie Hydroxylamin behandelt werden, um Sequenzvarianten zu erhalten.
C. Antisense-Konstrukte
In manchen Fällen können mutante Tumorsuppressoren nicht nicht-funktionell sein. Sie können stattdessen abweichende Funktionen haben, die durch die Genersatztherapie nicht ausgeglichen werden können, selbst dann nicht, wenn das „Wildtyp"-Molekül in viel höheren Mengen exprimiert wird als das mutante Polypeptid. Antisense-Behandlungen sind eine Möglichkeit, dieser Situation zu begegnen. Antisense-Technologie kann auch verwendet werden, um die Funktion von TS10q23.3 während der Entwicklung von Zelllinien oder transgenen Mäusen für Forschungs-, Diagnose- und Analysezwecke auszuschalten („knock-out").
Bei der Antisense-Methodik wird die Tatsache genutzt, dass Nukleinsäuren dazu neigen, mit „komplementären" Sequenzen Paare zu bilden. Mit komplementär ist gemeint, dass Polynukleotide diejenigen sind, die entsprechend den Komplementaritäts-Standardregeln von Watson-Crick zu einer Basenpaarung fähig sind. Das heißt, dass die größeren Purine ein Paar mit den kleineren Pyrimidinen eingehen, um Kombinationen von Paaren wie Guanin und Cytosin (G:C) und Adenin und Thymin (A:T) im Falle von DNA oder Adenin und Uracil (A:U) im Falle von RNA zu bilden. Das Vorhandensein weniger häufiger Basen wie Inosin, 5-Methylcytosin, 6-Methyladenin, Hypoxanthin und Anderen in Hybridisierungssequenzen beeinflusst die Paarbildung nicht.
Das Targeting doppelsträngiger (ds) DNA mit Polynukleotiden führt zur Bildung einer Dreifachhelix; das Targeting von RNA führt zur Bildung einer Doppelhelix. Wenn Antisense-Polynukleotide in eine Zielzelle eingebracht werden, binden sie spezifisch an ihr Zielnukleotid und beeinflussen die Transkription sowie die Prozessierung, den Transport, die Translation und/oder die Stabilität von RNA. Antisense-RNA-Konstrukte oder DNA, die solche Antisense-RNAs kodiert, können verwendet werden, um Gentranskription oder Translation oder beides entweder in vitro oder in vivo in einer Wirtszelle zu hemmen, wie beispielsweise bei einem Wirtstier, einschließlich einem Menschen.
Es können Antisense-Konstrukte konzipiert werden, um an den Promotor und andere Steuerregionen, Exons, Introns oder selbst Exon-Intron-Übergangsstellen eines Gens zu binden. Es wird in Betracht gezogen, dass die effektivsten Antisense-Konstrukte Regionen umfassen, die komplementär zu Intron/Exon-Splice-Übergängen sind. Es wird daher vorgeschlagen, dass eine bevorzugte Ausführungsform ein Antisense-Konstrukt mit Komplementarität zu Regionen innerhalb von 50–200 Basen eines Intron/Exon-Splice-Übergangs enthält. Es wurde beobachtet, dass manche Exonsequenzen in dem Konstrukt enthalten sein können, ohne dessen Zielselektivität ernsthaft zu beeinflussen. Die Menge an enthaltenem Exonmaterial variiert je nach den jeweils verwendeten Exon- und Intronsequenzen. Es kann einfach getestet werden, ob zu viel Exon-DNA vorhanden ist, indem einfach die Konstrukte in vivo getestet werden um zu bestimmen, ob die normale zelluläre Funktion beeinflusst ist oder ob die Expression verwandter Gene mit komplementären Sequenzen beeinflusst ist.
Wie oben festgelegt, bedeuten „komplementäre" oder „antisense" Polynukleotidsequenzen solche, die im Wesentlichen über ihre gesamte Länge komplementär sind und sehr wenige Basennichtübereinstimmungen aufweisen. Sequenzen mit einer Länge von fünfzehn Basenpaaren können als komplementär bezeichnet werden, wenn sie an dreizehn oder vierzehn Positionen komplementäre Nukleotide aufweisen. Natürlich sind Sequenzen, die vollständig komplementär sind, Sequenzen, die über ihre gesamte Länge vollkommen komplementär sind und keine Basennichtübereinstimmungen aufweisen. Andere Sequenzen mit einem geringeren Homologiegrad werden ebenfalls in Betracht gezogen. Beispielsweise könnte ein Antisense-Konstrukt, das eingeschränkte Regionen hoher Homologie aufweist, aber auch eine nicht-homologe Region enthält (z. B. Ribozym, siehe unten), konzipiert werden. Diese Moleküle würden unter geeigneten Bedingungen an Zielsequenzen binden, obwohl sie eine Homologie von unter 50% haben.
Es könnte von Vorteil sein, Abschnitte genomischer DNA mit cDNA oder synthetischen Sequenzen zu kombinieren, um spezifische Konstrukte zu erzeugen. Beispielsweise muss ein genomischer Klon verwendet werden, wenn im fertigen Konstrukt ein Intron gewünscht ist. Die cDNA oder ein synthetisches Polynukleotid könnte praktischere Restriktionsschnittstellen für den verbleibenden Abschnitt des Konstruktes liefern und würde daher für den Rest der Sequenz verwendet werden.
D. Ribozyme
Ein weiterer Ansatz, der auf den „dominant negativen" mutanten Tumorsuppressor abzielt, erfolgt mittels Verwendung von Ribozymen. Obgleich Proteine traditionell zur Katalyse von Nukleinsäuren verwendet wurden, hat sich eine andere Klasse von Makromolekülen bei diesem Vorhaben als nützlich erwiesen. Ribozyme sind RNA-Protein-Komplexe, die Nukleinsäuren in positionsspezifischer Art schneiden. Ribozyme haben spezifische katalytische Domänen, die Endonukleaseaktivität aufweisen (Kim und Cook, 1987; Gerlach et al., 1987; Forster und Symons, 1987). Beispielsweise beschleunigt eine große Anzahl von Ribozymen Phosphoesterübertragungsreaktionen mit einem hohen Grad an Spezifität, wobei häufig nur einer von mehreren Phosphoestern in einem Oligonukleotidsubstrat gespalten wird (Cook et al., 1981; Michel und Westhof, 1990; Reinhold-Hurek und Shub, 1992). Diese Spezifität wurde der Voraussetzung zugeschrieben, dass das Substrat vor der chemischen Reaktion über spezifische Basenpaarungswechselwirkungen an die interne Führungssequenz („IGS") des Ribozyms bindet.
Ribozymkatalyse wurde überwiegend als Teil sequenzspezifischer Schnitt-/Ligationsreaktionen beobachtet, bei denen Nukleinsäuren beteiligt waren (Cook et al., 1981). Beispielsweise berichtet US-Patent Nr. 5.354.855, dass bestimmte Ribozyme als Endonukleasen wirken können und eine Sequenzspezifität aufweisen, die höher als die bekannter Ribonukleasen ist und fast der der DNA-Restriktionsenzyme entspricht. Sequenzspezifische, ribozymvermittelte Genexpressionshemmung kann daher für therapeutische Anwendungen besonders geeignet sein (Scanlon et al., 1991; Sarver et al., 1990). Kürzlich ist berichtet worden, dass Ribozyme in einigen Zelllinien, zu denen sie gegeben wurden, genetische Veränderungen ausgelöst haben; zu den veränderten Genen gehörten die Onkogene H-ras, c-fos und Gene von HIV. Die meisten dieser Arbeiten beinhalten die Modifikation einer Ziel-mRNA ausgehend von einem spezifischen mutierten Codon, das von einem spezifischen Ribozym geschnitten wird.
E. Vektoren für die Klovierung, Genübertragung und -expression
In bestimmten Ausführungsformen werden Expressionsvektoren verwendet, um das TS10q23.3-Polypeptidprodukt zu exprimieren, welches anschließend gereinigt und beispielsweise verwendet werden kann, um Tiere zu immunisieren, um Antiseren oder einen monoklonalen Antikörper zu erzeugen, mit denen weitere Studien durchgeführt werden können. In anderen Ausführungsformen werden die Expressionsvektoren bei einer Gentherapie verwendet. Expression erfordert, dass geeignete Signal in den Vektoren bereit gestellt werden, die zudem verschiedene regulatorische Elemente, wie beispielsweise Verstärker (Enhancer)/Promotoren aus den viralen und säugetierspezifischen Quellen umfassen, welche die Expression des Gens von Interesse in Wirtszellen antreiben. Es sind auch Elemente definiert, die zur Optimierung der Stabilität und Translationsfähigkeit in Wirtszellen konzipiert sind. Es sind auch die Bedingungen für die Verwendung einer Reihe dominanter Wirkstoffselektionsmarker zur Etablierung permanenter, stabiler, die Produkte exprimierender Zellklone vorgesehen, wie beispielsweise ein Element, der die Expression des Wirkstoffselektionsmarkers mit der Expression des Polypeptids verknüpft.
(i) Regulatorische Elemente
Promotoren.
In dieser gesamten Anmeldung soll der Begriff „Expressionskonstrukt" jede Art von genetischem Konstrukt einschließen, das eine Nukleinsäure enthält, die Genprodukte kodiert, in denen ein Teil oder die gesamte Nukleinsäure mit der Kodierungssequenz transkribiert werden kann. Das Transkript kann, muss aber nicht, zu einem Protein translatiert werden. In bestimmten Ausführungsformen umfasst Expression sowohl die Transkription eines Gens als auch die Translation von mRNA in ein Genprodukt. In anderen Ausführungsformen umfasst Expression nur die Transkription der Nukleinsäure, welche die Gene von Interesse kodiert.
Die Nukleinsäure, die ein Genprodukt kodiert, steht unter der Transkriptionskontrolle eines Promotors. Ein „Promotor" bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, die vom Syntheseapparat der Zelle oder einem eingeführten Syntheseapparat, der erforderlich ist, um die spezifische Transkription eines Gens einzuleiten, erkannt wird. Der Begriff „unter Transkriptionskontrolle" bedeutet, dass sich der Promotor in der korrekten Position und Ausrichtung in Bezug auf die Nukleinsäure befindet, um die Initiation der RNA-Polymerase und die Expression des Gens zu kontrollieren.
Der Begriff „Promotor" wird hier verwendet, um sich auf eine Gruppe von Transkriptionskontrollmodulen zu beziehen, die um die Initiationsstelle für die RNA-Polymerase II gruppiert sind. Viele Vorstellungen darüber, wie Promotoren organisiert sind, entstammt Analysen mehrerer viraler Promotoren, einschließlich denen für die HSV-Thymidinkinase (tk) und der frühen Transkriptionseinheiten (Early Transcription Units) von SV40. Diese Studien, die von neueren Arbeiten gestützt werden, haben gezeigt, dass Promotoren aus diskreten funktionellen Modulen zusammengesetzt sind, von denen ein Jedes aus etwa 7–20 bp DNA besteht und eine oder mehrere Erkennungsstellen für transkriptionelle Aktivator- und Repressorproteine enthalten.
Mindestens ein Modul in jedem Promotor dient dazu, die Startstelle zur RNA-Synthese festzulegen. Das beste bekannte Beispiel dafür ist die TATA-Box, aber in einigen Promotoren, denen eine TATA-Box fehlt, wie beispielsweise dem Promotor für das terminale Desoxynukleotidyltransferasegen der Säugetiere und dem Promotor für die späten (Late) Gene von SV40, trägt ein diskretes Element, das die Startstelle überlappt, dazu bei, den Ort der Initiation festzulegen.
Weitere Promotorelemente regeln die Häufigkeit der Transkriptionsinitiation. Typischweise befinden sich diese in der Region 30–110 bp stromaufwärts (upstream) der Startstelle, obgleich für eine Reihe von Promotoren kürzlich gezeigt wurde, dass sie auch funktionelle Elemente stromabwärts (downstream) der Startstelle aufweisen. Der Abstand zwischen Promotorelementen ist häufig flexibel, so dass die Promotorfunktion erhalten bleibt, wenn Elemente eingefügt oder relativ zueinander bewegt werden. Im tk-Promotor kann der Abstand zwischen Promotorelementen auf 50 bp erhöht werden, bevor die Aktivität beginnt abzunehmen. Es scheint, dass einzelne Elemente je nach Promotor entweder kooperativ oder unabhängig funktionieren können, um die Transkription zu aktivieren.
Es wird angenommen, dass es nicht wichtig ist, welcher Promotor jeweils zur Regelung der Expression einer Nukleinsäuresequenz von Interesse verwendet wird, so lange er in der Lage ist, die Expression der Nukleinsäure in der Zielzelle zu steuern. Handelt es sich bei der Zielzelle also um eine humane Zelle, ist es vorzuziehen, die kodierende Nukleinsäureregion neben einen und unter die Kontrolle eines Promotors zu setzen, der in einer humanen Zelle exprimiert werden kann. Allgemein ausgedrückt, kann ein solcher Promotor entweder einen humanen oder einen viralen Promotor umfassen.
In verschiedenen Ausführungsformen können der Promotor der Immediate-Early-Gene des humanen Zytomegalievirus (CMV), der SV40-Early-Promotor, der Long-Terminal-Repeat des Rous-Sarkom-Virus, der β-Actinpromotor, der Ratteninsulinpromotor und der Promotor der Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase verwendet werden, um eine starke Expression der kodierenden Sequenzen von Interesse zu erreichen. Die Verwendung anderer viraler oder von Säugetieren stammenden zellulärer Promotoren oder bakterieller Phagenpromotoren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, um eine Expression einer Kodierungssequenz von Interesse zu erreichen, wird ebenfalls in Betracht gezogen, vorausgesetzt, dass der Grad der Expression jeweils für einen gegebenen Zweck ausreichend ist. Durch Verwendung eines Promotors mit gut bekannten Eigenschaften können Grad und Muster der Expression des Proteins von Interesse nach Transfektion oder Transformation optimiert werden.
Die Auswahl eines Promotors, der als Reaktion auf bestimmte physiologische oder synthetische Signale reguliert wird, kann eine induzierbare Expression des Genproduktes erlauben. Wenn beispielsweise die Expression eines Transgens oder von Transgenen, wenn ein multizistronischer Vektor verwendet wird, für die Zellen, in denen der Vektor produziert wird, toxisch ist, kann es wünschenswert sein, die Expression eines oder mehrerer Transgene zu verhindern oder zu reduzieren. Beispiele von Transgenen, die für die Produzentenzelllinien toxisch sein können, sind proapoptotische Gene und Zytokingene. Wenn das transgene Produkt toxisch ist, stehen für die Produktion viraler Vektoren mehrere induzierbare Promotorsysteme zu Verfügung.
Eines dieser Systeme ist das Ecdysonsystem (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Dieses System ist so konzipiert, dass es eine regulierte Expression eines Gens von Interesse in Säugetierzellen erlaubt. Es besteht aus einem eng regulierten Expressionsmechanismus, der praktisch keine Basisexpression des Transgens, aber eine über 200-fache Induzierbarkeit zulässt. Das System beruht auf dem heterodimeren Ecdysonrezeptor von Drosophila, und wenn Ecdyson oder ein Analog wie beispielsweise Muristeron A an den Rezeptor bindet, aktiviert der Rezeptor einen Promotor, um die Expression des sich stromabwärts (downstream) befindenden Transgens einzuschalten. So werden hohe Mengen an mRNA-Transkripten erhalten. In diesem System werden beide Monomere des heterodimeren Rezeptors von einem Vektor konstitutiv exprimiert, wobei der Ecdyson-reaktive Promotor, der die Expression des Gens von Interesse antreibt, sich auf einem anderen Plasmid befindet. Die technische Kombination dieser Art von System mit dem Gentransfervektor von Interesse wäre daher sinnvoll. Cotransfektion von Plasmiden, die das Gen von Interesse enthalten, und der Rezeptormonomere in die Produzentenzelllinie würde dann die Produktion des Gentransfervektors ohne Expression eines potenziell toxischen Transgens erlauben. Die Expression des Transgens könnte zu einem geeigneten Zeitpunkt mit Ecdyson oder Muristeron A aktiviert werden.
Ein weiteres geeignetes, induzierbares System ist das Tet-Off^TM- oder Tet-On^TM-System (Clontech, Palo Alto, CA, USA), das ursprünglich von Gossen und Bujard entwickelt wurde (Gossen und Bujard, 1992; Gossen et al., 1995). Dieses System erlaubt ebenfalls einen hohen Grad an Genexpression, die als Reaktion auf Tetracyclin oder Tetracyclinderivate wie Doxycyclin reguliert werden kann. Im Tet-On^TM-System wird die Genexpression in Gegenwart von Doxycyclin eingeschaltet, während die Genexpression im Tet-Off^TM-System in Abwesenheit von Doxycyclin eingeschaltet wird. Diese Systeme beruhen auf zwei regulatorischen Elementen, die aus dem Tetracyclinresistenzoperon von E.coli abgeleitet sind, der Tetracyclinoperatorsequenz, an die der Tetracyclinrepressor bindet, und dem Tetracyclinrepressorprotein. Das Gen von Interesse wird in ein Plasmid hinter einen Promotor kloniert, in dem sich Tetracyclin-reaktive Elemente befinden. Ein zweites Plasmid enthält ein regulatorisches Element mit der Bezeichnung Tetracyclin-kontrollierter Transaktivator, der im Tet-Off^TM-System aus der VP16-Domäne des Herpes-Simplex-Virus und dem Wildtyp des Tetracyclinrepressors zusammengesetzt ist. So wird in Abwesenheit von Doxycyclin die Transkription konstitutiv eingeschaltet. Im Tet-On^TM-System ist der Tetracyclinrepressor nicht vom Wildtyp und aktiviert in Gegenwart von Doxycyclin die Transkription. Für die Produktion eines Gentherapievektors wäre das Tet-Off^TM-System vorzuziehen, so dass die Produzentenzelle in Gegenwart von Tetracyclin oder Doxycyclin gezüchtet und die Expression eines potenziell toxischen Transgens verhindert werden kann, aber die Genexpression konstitutiv eingeschaltet werden würde, wenn der Vektor in den Patienten eingeführt wird.
In manchen Fällen kann es wünschenswert sein, die Expression eines Transgens in einem Gentherapievektor zu regulieren. Beispielsweise können je nach dem gewünschten Grad der Expression unterschiedliche virale Promotoren mit verschieden starker Aktivität verwendet werden. In Säugetierzellen wird häufig der CMV-Immediate-Early-Promotor verwendet, um eine starke Aktivierung der Transkription zu vermitteln. Es sind auch modifizierte Versionen des CMV-Promotors, die weniger potent sind, verwendet worden, wenn ein geringerer Grad der Expression des Transgens erwünscht ist. Wenn die Expression eines Transgens in hämatopoietischen Zellen erwünscht ist, werden häufig retrovirale Promotoren wie die LTR-Sequenzen von MLV oder MMTV verwendet. Weitere virale Promotoren, die je nach dem gewünschten Effekt verwendet werden können, sind SV40, RSV, LTR, HIV-1- und HIV2-LTR, Adenoviruspromotoren wie beispielsweise aus der E1A-, E2A- oder MLP-Region, AAV LTR, Blumenkohlmosaikvirus, HSV-TK und Vogelsarkomvirus.
Gleichermaßen können gewebespezifische Promotoren verwendet werden, um eine Transkription in bestimmten Geweben oder Zellen zu bewirken, um damit eine potenzielle Toxizität oder unerwünschte Effekte auf Nicht-Zielgewebe zu reduzieren. Promotoren wie PSA, Probasin, Prostata-spezifische Phosphatase oder Prostata-spezifisches, glanduläres Kallikrein (hK2) können beispielsweise verwendet werden, um eine gezielte Genexpression in der Prostata zu bewirken. Gleichermaßen können für eine gezielte Genexpression in anderen Geweben die folgenden Promotoren verwendet werden (Tabelle 2).
Bei bestimmten Indikationen kann es wünschenswert sein, die Transkription zu bestimmten Zeitpunkten nach der Verabreichung des Gentherapievektors zu aktivieren. Dies kann mithilfe solcher Promotoren erfolgen, die durch ein Hormon oder Zytokin regulierbar sind. Bei Gentherapieanwendungen, in denen die Indikation ein Gonadengewebe ist, in dem spezifische Steroide produziert oder in das spezifische Steroide geleitet werden, kann beispielsweise die Verwendung von Promotoren vorteilhaft sein, die durch Androgene oder Estrogen regulierbar sind. Solche hormonregulierten Promotoren umfassen MMTV, MT-1, Ecdyson und RuBisco. Es wird erwartet, dass andere hormonregulierte Promotoren, wie die, welche auf Schilddrüsen-, Hypophysen- und Nebennierenhormone ansprechen, in der vorliegenden Erfindung nützlich sind. Zu den Promotoren, die auf Zytokine und Entzündungsproteine ansprechen und verwendet werden können, gehören K- und T-Kininogen (Kageyama et al., 1987), c-fos, TNF-alpha, C-reaktives Protein (Arcone et al., 1988), Haptoglobin (Oliviero et al., 1987), Serumamyloid A2, C/EBP-alpha, IL-1, IL-6 (Poli und Cortese, 1989), Komplement C3 (Wilson et al., 1990), IL-8, Alpha-1-Säureglykoprotein (Prowse und Baumann, 1988), Alpha-1-Antitrypsin, Lipoproteinlipase (Zechner et al., 1988), Angiotensinogen (Ron et al., 1991), Fibrinogen, c-jun (induzierbar durch Phorbolester und Retinolsäure), Metallothionein (induzierbar durch Schwermetall und Glucocorticoide), Stromelysin (induzierbar durch Phorbolester, Interleukin-1 und EGF), Alpha-2-Makroglobulin und Alpha-1-Antichymotrypsin.
Es ist vorgesehen, dass zellzyklusregulierbare Promotoren in der vorliegenden Erfindung nützlich sein könnten. Beispielsweise könnte in einem bizistronischen Gentherapievektor die Verwendung eines starken CMV-Promotors zur Aktivierung der Expression eines ersten Gens wie p16, das die Zellen in der G1-Phase anhält, von der Expression eines zweiten Gens wie p53 gefolgt sein unter der Kontrolle eines Promotors, der in der G1-Phase des Zellzyklus aktiv ist, wobei dadurch ein „zweiter Treffer" erzielt wird, welcher die Zelle in die Apotose treibt. Es können auch andere Promotoren, wie die verschiedener Cycline, PCNA, Galectin-3, E2F1, p53 und BRCA1 verwendet werden.
Tumorspezifische Promotoren, wie Osteocalcin, Hypoxie-responsives Element (HRE), MAGE-4, CEA, Alpha-Fetoprotein, GRP78/BiP und Tyrosinase können ebenfalls verwendet werden, um Genexpression in Tumorzellen zu regulieren. Andere Promotoren, die gemäß der vorliegenden Erfindung benutzt werden können, umfassen Lac-regulierbare, chemotherapieinduzierbare (z. B. MDR) und Hitze (Hyperthermie)-induzierbare Promotoren, strahlungsinduzierbare (z. B. EGR (Joki et al., 1995)), Alpha-Inhibin, RNA pol III tRNA met und andere Aminosäurepromotoren, U1 snRNA (Bartlett et al., 1996), MC-1, PGK, β-Aktin und α-Globin. In Walther und Stein (1996) sind viele andere Promotoren aufgeführt, die nützlich sein könnten.
Es ist geplant, dass jeder der obigen Promotoren alleine oder in Kombination mit einem Anderen je nach der erwünschten Wirkung gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich sein kann. Darüber soll diese Liste von Promotoren nicht erschöpfend oder einschränkend sein; ein Fachmann kennt andere Promotoren, die in Verbindung mit den hierin offenbarten Promotoren und Verfahren verwendet werden können.
Verstärker (Enhancer). Enhancer sind genetische Elemente, welche die Transkription von einem Promotor verstärken, der sich an einer entfernten Position auf demselben DNA-Molekül befindet. Enhancer sind weitgehend wie Promotoren organisiert. Das bedeutet, dass sie aus vielen einzelnen Elementen zusammengesetzt sind, von denen jedes an ein oder mehrere transkriptionelle Proteine bindet. Der grundlegende Unterschied zwischen Enhancern und Promotoren ist funktionsbedingt. Eine Enhancer-Region als Ganzes muss in der Lage sein, Transkription auf die Entfernung zu stimulieren; für eine Promotorregion oder ihre Bestandteilselemente muss dies nicht unbedingt zutreffen. Andererseits muss ein Promotor ein oder mehrere Elemente aufweisen, die eine direkte Initiierung der RNA-Synthese an einer bestimmten Stelle und in einer bestimmten Ausrichtung steuern, wohingegen Enhancer diese Spezifitäten nicht haben. Promotoren und Enhancer sind häufig überlappend und kontig, wobei es häufig scheint, als ob sie sehr ähnliche modulare Organisation aufweisen.
Unten befindet sich zusätzlich zu den oben aufgeführten gewebespezifischen Promotoren eine Liste von Promotoren, zellulären Promotoren/Enhancern und induzierbaren Promotoren/Enhancern, die in Kombination mit der Nukleinsäure verwendet werden können, die ein Gen von Interesse in einem Expressionskonstrukt kodieren (Tabelle 3 und Tabelle 4). Darüber hinaus könnte auch jede beliebige Promotor/Enhancer-Kombination (wie beispielsweise anhand der Datenbank EPDB (Eukaryotic Promotor Data Base)) verwendet werden, um die Expression des Gens anzutreiben. Eukaryontische Zellen können zytoplasmatische Transkription bestimmter bakterieller Promotoren unterstützen, wenn die geeignete bakterielle Polymerase bereitgestellt wird, entweder als Teil des Verabreichungskomplexes oder als ein zusätzliches genetisches Expressionskonstrukt.
TABELLE 3
TABELLE 4
Polyadenylierungssignale.
Wo ein cDNA-Insert eingesetzt wird, würde man typischerweise ein Polyadenylierungssignal einsetzen wollen, um eine ordnungsgemäße Polyadenylierung des Gentranskriptes zu bewirken. Es wird angenommen, dass die Art des Polyadenylierungssignals für die erfolgreiche Anwendung der Erfindung nicht von zentraler Bedeutung ist und dass jede solche Sequenz verwendet werden kann, beispielsweise das Polyadenylierungssignal des humanen oder bovinen Wachstumshormons oder von SV40. Als ein Element der Expressionskassette wird auch ein Terminator in Betracht gezogen. Diese Elemente können dazu dienen, die mRNA-Expression zu steigern und das Ablesen der genetischen Information der Kassette bis in andere Sequenzen hinein zu minimieren.
IRES.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wird die Verwendung interner Ribosomen-Eintrittsstellenelemente (internal ribosome entry site; IRES) erwogen, um multigene oder polyzistronische mRNAs zu erzeugen. IRES-Elemente sind in der Lage, das Ribosomen- Scanning-Modell der 5'-methylierten Cap-abhängigen Translation zu umgehen und beginnen die Translation an internen Stellen (Pelletier und Sonenberg, 1988). Es sind IRES-Elemente aus zwei Mitgliedern der Familie der Picornaviren (Poliovirus und Enzephalomyokarditis) (Pelletier und Sonenberg, 1988) sowie ein IRES aus einer Säugetier-mRNA (Macejak und Sarnow, 1991) beschrieben worden. IRES-Elemente können an heterologe offene Leseraster gekoppelt sein. Multiple offene Leseraster können gemeinsam transkribiert werden, wobei jeder von einem IRES getrennt ist, wodurch polyzistrone mRNA entsteht. Durch das IRES-Elements ist jedes offene Leseraster für Ribosomen zugänglich, um eine effektive Translation zu bewirken. Multiple Gene können mittels eines einzigen Promotors/Enhancers exprimiert werden, um eine einzelne mRNA zu transkribieren.
Jedes heterologe offene Leseraster kann mit IRES-Elementen verknüpft werden. Dazu gehören Gene für sezernierte Proteine, Proteine mit mehreren Untereinheiten, die von unabhängigen Genen kodiert werden, intrazelluläre oder membrangebundene Proteine und selektierbare Marker. Auf diese Art kann die simultane Expression mehrerer Proteine in einer Zelle mit einem einzigen Konstrukt und einem einzigen selektierbaren Marker technisch erreicht werden.
(ii) Selektierbare Marker
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung enthalten die Zellen Nukleinsäurekonstrukte der vorliegenden Erfindung. Eine Zelle kann in vitro oder in vivo identifiziert werden, indem in das Expressionskonstrukt ein Marker eingefügt wird. Solche Marker würden eine identifizierbare Veränderung der Zelle bewirken, was die einfache Identifizierung von Zellen, die das Expressionskonstrukt enthalten, erlaubt. In der Regel hilft das Einfügen eines Wirkstoffselektionsmarkers bei der Klonierung und der Selektion von Transformanden; beispielsweise sind Gene, die Resistenz gegen Neomycin, Puromycin, Hygromycin, DHFR, GPT, Zeoxin und Histidinol verleihen, nützliche selektierbare Marker. Alternativ können Enzyme wie die Thymidinkinase des Herpes-Simplex-Virus (tk) oder die Chloramphenicoltransferase (CAT) verwendet werden. Auch immunologische Marker können eingesetzt werden. Der verwendete selektierbare Marker ist unwichtig, so lange er simultan mit der Nukleinsäure, die ein Genprodukt kodiert, exprimiert werden kann. Weitere Beispiele selektierbarer Marker sind einem Fachmann gut bekannt.
(iii) Einführung von Expressionsvektoren
Es gibt eine Reihe von Möglichkeiten, Expressionsvektoren in Zellen einzuführen. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung umfasst das Expressionskonstrukt ein Virus oder ein technisch hergestelltes Konstrukt, das aus einem viralen Genom abgeleitet ist. Die Möglichkeit bestimmter Viren über rezeptorvermittelte Endozytose in Zellen zu gelangen, sich in das Genom der Wirtszelle zu integrieren und virale Gene stabil und effizient zu exprimieren, machten sie zu attraktiven Kandidaten für den Transfer fremder Gene in Säugetierzellen (Ridgeway, 1988; Nicolas und Rubenstein, 1988; Baichwal und Sugden, 1986; Temin, 1986). Die ersten Viren, die als Genvektoren verwendet worden sind, waren DNA-Viren, darunter die Papovaviren (Simianvirus 40, boviner Papillomavirus und Polyomvirus) (Ridgeway, 1988; Baichwal und Sugden, 1986) und Adenoviren (Ridgeway, 1988; Baichwal und Sugden, 1986). Diese haben eine vergleichsweise geringe Kapazität für Fremd-DNA-Sequenzen und ein eingeschränktes Wirtsspektrum. Darüber hinaus wecken ihr onkogenes Potenzial und ihre zytopathischen Effekte in permissiven Zellen Sicherheitsbedenken. Sie können lediglich bis zu 8 kb an genetischem Fremdmaterial aufnehmen, aber leicht in verschiedene Zelllinien und Labortiere eingeführt werden (Nicolas und Rubenstein, 1988; Temin, 1986). Der Vektor kann in der Lage sein, sich innerhalb der Zellen zu replizieren. Alternativ kann der Vektor replikationsdefizient sein und wird vor der Einführung in Helferzellen repliziert. Es sind geeignete Vektoren bekannt, beispielsweise wie in US-Patent 5.252.479 und der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 93/07282 und in US-Patent 5.691.198, 5.436.146 und 5,753,500 offenbart.
Adenoviren.
Eine der bevorzugten Verfahren für das Einführen in vivo umfasst die Verwendung eines Adenovirus-Expressionsvektors. „Adenovirus-Expressionsvektor" soll diejenigen Konstrukte umfassen, die Adenovirussequenzen enthalten, welche ausreichend sind, um (a) die Verpackung des Konstruktes zu unterstützen und (b) ein Antisense-Polynukleotid zu exprimieren, das darin kloniert ist. In diesem Zusammenhang erfordert die Expression nicht, dass das Genprodukt synthetisiert wird.
Der Expressionsvektor umfasst eine gentechnologisch hergestellte Form von Adenovirus. Die Kenntnis der genetischen Organisation von Adenovirus, einem Virus mit linearer doppelsträngiger DNA einer Länge von 36 kb, erlaubt die Substitution großer Stücke adenoviraler DNA durch Fremdsequenzen bis zu 7 kb (Grunhaus und Horwitz, 1992). Im Gegensatz zur retroviralen Infektion führt die adenovirale Infektion von Wirtszellen nicht zu einer chromosomalen Integration, da sich adenovirale DNA auf episomale Art ohne potenzielle Gentoxizität replizieren kann. Darüber hinaus sind Adenoviren strukturell stabil und es wurde keine Umorganisation des Genoms nach ausführlicher Amplifizierung festgestellt. Adenovirus kann praktisch alle epithelialen Zellen infizieren, unabhängig von deren Zellzyklusstadium. Bislang scheint eine adenovirale Infektion nur mit einer schwach ausgeprägten Erkrankung verknüpft zu sein, beispielsweise mit akuter respiratorischer Erkrankung beim Menschen.
Adenovirus ist aufgrund seines mittelgroßen Genoms, der Einfachheit der Manipulation, seines hohen Titers, des weiten Zielzellbereichs und der hohen Infektiosität zur Verwendung als Gentransfervektor besonders geeignet. Beide Enden des viralen Genoms enthalten umgekehrte Sequenzwiederholungen oder Inverted Repeats (ITRs) mit einer Länge von 100–200 Basenpaaren, bei denen es sich um cis-Elemente handelt, die für die Replikation und Verpackung der viralen DNA erforderlich sind. Die früh (Early, E) und spät (Late, L) exprimierten Regionen des Genoms enthalten verschiedene Transkriptionseinheiten, die sich durch den Beginn der Replikation der viralen DNA unterscheiden. Die E1-Region (E1A und E1B) kodiert Proteine, die für die Regulierung der Transkription des viralen Genoms und einiger zellulärer Gene verantwortlich sind. Die Expression der E2-Region (E2A und E2B) führt zur Synthese der Proteine für die Replikation der viralen DNA: Diese Proteine sind an der DNA-Replikation, der Expression der Late-Gene und dem Abschalten der Wirtszelle beteiligt (Renan, 1990). Die Produkte der Late-Gene, einschließlich der Mehrzahl der viralen Kapsidproteine, werden nur nach signifikanter Prozessierung eines einzelnen primären Transkriptes exprimiert, die vom starken späten (Major Late) Promotor (MLP) veranlasst wird. Der MLP((an Kartierungseinheit (map unit, m.u.) 16,8) ist während der späten Phase der Infektion besonders effizient, und alle mRNAs, deren Transkription von diesem Promotor veranlasst wird, besitzen eine 5'-dreigeteilte Leadersequenz (TPL), durch die sie zu bevorzugten mRNAs für die Translation werden.
In einem aktuellen System wird rekombinantes Adenovirus durch homologe Rekombination zwischen Shuttlevektor und Provirusvektor erzeugt. Aufgrund der möglichen Rekombination zwischen zwei proviralen Vektoren, kann bei diesem Prozess Wildtyp-Adenovirus entstehen. Es ist daher wichtig, einen einzelnen Virusklon aus einem einzelnen Plaque zu isolieren und seine Genomstruktur zu untersuchen.
Herstellung und Propagierung der derzeitigen Adenovirusvektoren, die replikationsdefizient sind, hängen von einer besonderen Helferzelllinie mit der Bezeichnung 293 ab, die aus humanen embryonalen Nierenzellen mit Ad5-DNA-Fragmenten transformiert wurde und E1-Proteine konstitutiv exprimiert (Graham et al., 1977). Da die E3-Region für das Adenovirusgenom entbehrlich ist (Jones und Shenk, 1978), tragen die derzeitigen Adenovirusvektoren mithilfe von 293-Zellen Fremd-DNA entweder in der E1-Region, der D3-Region oder in beiden Regionen (Graham und Prevec, 1991). Natürlicherweise kann Adenovirus rund 105% des Wildtypgenoms verpacken (Ghosh-Choudhury et al., 1987), was Kapazität für etwa 2 zusätzliche kb an DNA bietet. Zusammen mit den ungefähr 5,5 kb an DNA, die in den Regionen E1 und E3 ersetzt werden können, liegt die maximale Kapazität der derzeitigen Adenovirusvektoren bei unter 7,5 kb oder bei etwa 15% der Gesamtlänge des Vektors. Mehr als 80% des viralen Genoms von Adenovirus bleiben im Vektor-Gerüst und sind die Ursache vektorbedingter Zytotoxizität. Außerdem ist die Replikationsdefizienz des E1-deletierten Virus unvollständig. Beispielsweise wurde bei den derzeit erhältlichen Vektoren bei hoher MOI (Multiplicity of Infection) durchsickernde Expression viraler Gene beobachtet (Mulligan, 1993).
Helferzelllinien können aus humanen Zellen abgeleitet werden, beispielsweise aus humanen embryonalen Nierenzellen, Muskelzellen, hämatopoietischen Zellen oder anderen humanen embryonalen mesenchymalen oder epithelialen Zellen. Alternativ können die Helferzellen von den Zellen anderer Säugetierarten, die für humanes Adenovirus permissiv sind, abgeleitet werden. Zu diesen Zellen gehören beispielsweise Vero-Zellen oder andere embryonale mesenchymale oder epitheliale Zellen des Affen. Wie oben erwähnt, ist 293 die bevorzugte Helferzelllinie.
Kürzlich haben Racher et al., (1995) verbesserte Verfahren für die Kultivierung von 293-Zellen und die Propagierung von Adenovirus offenbart. In einem Format werden natürliche Zellaggregate gezüchtet, indem silikonisierte 1-Liter-Spinner-Flaschen (Techne, Cambridge, GB), die 100–200 ml Medium enthalten, mit einzelnen Zellen beimpft werden. Nach Rühren bei 40 Umdrehungen pro Minute wird mit Trypanblau ein Näherungswert der Lebensfähigkeit der Zellen bestimmt. In einem anderen Format werden Fibra-Cel-Mikroträger (Bibby Sterlin, Stone, GB) (5 g/l) wie folgt eingesetzt. Dem Träger (50 ml) in einer 250-ml-Erlenmayer-Flasche wird ein Zellinokulum, das in 5 ml Medium resuspendiert ist, zugegeben und 1 bis 4 Std. unter gelegentlichem Rühren stehen gelassen. Anschließend wird das Medium durch 50 ml frisches Medium ersetzt und mit Schütteln begonnen. Für die Virusproduktion wird den Zellen gestattet bis zu einer Konfluenz von 80% zu wachsen, wonach das Medium ausgewechselt (mit 25% des Endvolumens) und Adenovirus bei einer MOI von 0,05 zugegeben wird. Die Kulturen werden über Nacht stehen gelassen, wonach das Volumen auf 100% erhöht und das Schütteln weitere 72 Stunden fortgesetzt wird.
Abgesehen von der Maßgabe, dass der Adenovirusvektor replikationsdefekt oder zumindest konditionell defekt sein soll, dürfte die Art des Adenovirusvektors für die erfolgreiche Anwendung der Erfindung nicht ausschlaggebend sein. Das Adenovirus kann von einem der 42 verschiedenen bekannten Serotypen oder aus den Subgruppen A-F sein. Adenovirus Typ 5 aus Subgruppe C ist das bevorzugte Ausgangsmaterial, um den konditionellen replikationsdefekten Adenovirusvektor zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung zu erhalten. Dies liegt daran, dass Adenovirus Typ 5 ein humanes Adenovirus ist, über das umfangreiche biochemische und genetische Daten vorliegen und es traditionell für die meisten Konstruktionen verwendet worden ist, in denen Adenovirus als Vektor eingesetzt worden ist.
Wie oben ausgeführt, ist der typische Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung replikationsdefekt und hat keine adenovirale E1-Region. Es ist daher am praktischsten, das Polynukleotid, welches das Gen von Interesse kodiert, an der Position einzufügen, aus der die kodierenden E1-Sequenzen entfernt worden sind. Die Position der Insertion des Konstruktes in die Adenovirussequenzen ist jedoch für die Erfindung nicht ausschlaggebend. Das Polynukleotid, welches das Gen von Interesse kodiert, kann auch anstelle der deletierten E3-Region in E3-Austauschvektoren eingefügt werden, wie von Karlsson et al., (1984) beschrieben wurde, oder in die E4-Region, wobei eine Helferzelllinie oder ein Helfervirus den E4-Defekt ergänzt.
Adenovirus ist einfach zu züchten und zu manipulieren und weist in vitro und in vivo einen breiten Wirtsbereich auf. Diese Virusgruppe kann in hohen Titern erhalten werden, z. B. 10⁹–10¹¹ Plaque-bildende Einheiten pro ml, und ist hoch infektiös. Der Lebenszyklus von Adenovirus erfordert keine Integration in das Wirtszellgenom. Die von Adenvirusvektoren eingeführten Fremdgene liegen episomal vor und haben daher auf Wirtszellen geringe gentoxische Wirkung. In Studien einer Vakzinierung mit Wildtyp-Adenovirus wurden keine Nebenwirkungen berichtet (Couch et al., 1963; Top et al., 1971), was ihre Sicherheit und ihr therapeutisches Potenzial als Vektoren für einen Gentransfer in vivo zeigt.
Adenovirusvektoren sind zur Expression eukaryontischer Gene (Levrero et al., 1991; Gomez-Foix et al., 1992) und bei der Impfstoffentwicklung (Grunhaus und Horwitz, 1992; Graham und Prevec, 1991) verwendet worden. Kürzlich deuteten Tierstudien darauf hin, dass rekombinanter Adenovirus für die Gentherapie verwendet werden könnte (Stratfort-Perricaudet und Perricaudet, 1991; Stratfort-Perricaudet et al., 1990; Rich et al., 1993). Studien über die Verabreichung von rekombinantem Adenovirus an unterschiedliche Gewebe umfassen Luftröhreninstillation (Rosenfeld et al., 1991; Rosenfeld et al., 1992), Muskelinjektion (Ragot et al., 1993), periphere intravenöse Injektionen (Herz und Gerard, 1993) und stereotaktische Inokulation in das Gehirn (Le Gal La Salle et al., 1993).
Retroviren.
Die Retroviren sind eine Gruppe von RNA-Einzelstrang-Viren, die sich durch eine Fähigkeit der Konvertierung ihrer RNA zu doppelsträngiger DNA in infizierten Zellen durch einen Vorgang der reversen Transkription auszeichnen (Coffin, 1990). Die resultierende DNA integriert sich danach als Provirus stabil in die zellulären Chromosomen und steuert die Synthese viraler Proteine. Die Integration resultiert in der Beibehaltung der viralen Gensequenzen in der Empfängerzelle und deren Nachkommen. Das retrovirale Genom enthält drei Gene, gag, pol und env, die für Kapsidproteine, Polymeraseenzym und Hüllbestandteile kodieren. Eine Sequenz, die sich stromaufwärts (upstream) vom gag-Gen befindet, enthält ein Signal für die Verpackung des Genoms in Virionen. An den 5'- und 3'-Enden des viralen Genoms befinden sich zwei lange terminale Repeat (LTR)-Sequenzen. Diese enthalten starke Promotor- und Enhancersequenzen und werden auch für die Integration in das Wirtszellgenom benötigt (Coffin, 1990).
Zur Konstruktion eines retroviralen Vektors wird eine Nukleinsäure, die das Gen von Interesse kodiert, in das virale Genom an die Stelle bestimmter viraler Sequenzen eingesetzt, um ein replikationsdefektes Virus herzustellen. Für die Produktion von Virionen wird eine Verpackungszelllinie konstruiert, die gag-, pol- und env-Gene, aber keine LTR-Sequenz und Verpackungsbestandteile aufweist (Mann et al., 1983). Wenn ein rekombinantes Plasmid, das eine cDNA enthält, zusammen mit der retroviralen LRT-Sequenz und Verpackungssequenzen in diese Zelllinie eingeführt wird (durch Kalziumphosphatpräzipitation beispielsweise), erlaubt die Verpackungssequenz, dass das RNA-Transkript des rekombinanten Plasmids in virale Partikel verpackt wird, die dann in das Kulturmedium sezerniert werden (Nicolas und Rubenstein, 1988; Temin, 1986, Mann et al., 1983). Das Medium, das die rekombinanten Retroviren enthält, wird dann aufgefangen, wahlweise eingeengt und für den Gentransfer verwendet. Retrovirale Vektoren können sehr viele verschiedene Zelltypen infizieren. Integration und stabile Expression erfordert jedoch die Teilung von Wirtszellen (Paskind et al., 1975).
Kürzlich wurde ein neuartiger Ansatz auf der Basis der chemischen Modifikation eines Retrovirus durch die chemische Addition von Laktoseresten an die Virushülle entwickelt, der konzipiert ist, um ein spezifisches Targeting von Retrovirusvektoren zu ermöglichen. Diese Modifikation könnte die spezifische Infektion von Hepatozyten über Sialoglykoproteinrezeptoren ermöglichen.
Es wurde ein anderer Ansatz des Targeting von rekombinanten Retroviren konzipiert, bei dem biotinylierte Antikörper gegen ein retrovirales Hüllprotein und gegen einen spezifischen Zellrezeptor verwendet wurden. Die Antikörper wurden über die Biotinbestandteile mittels Streptavidin gekoppelt (Roux et al., 1989). Mit Antikörper gegen Klasse-I- und Klasse-II-Antigene des Haupthistokompatibilitätskomplexes zeigten sie mit einem ökotropen Virus in vitro die Infektion einer Vielzahl menschlicher Zellen, die diese Oberflächenantigene trugen (Roux et al., 1989).
Mit der Verwendung von Retrovirusvektoren in allen Spektren der vorliegenden Erfindung sind bestimmte Einschränkungen verbunden. Beispielsweise integrieren Retrovirusvektoren in der Regel an zufälligen Stellen im zellulären Genom. Dies kann zu einer Insertionsmutagenese durch Unterbrechung von Wirtsgenen oder durch die Insertion viraler Regulatorsequenzen führen, die mit der Funktion benachbarter Gene wechselwirken können (Varmus et al., 1981). Ein anderes Problem bei der Verwendung defekter Retrovirusvektoren ist das mögliche Auftreten replikationskompetenter Wildtypviren in den Verpackungszellen. Dies kann das Ergebnis von Rekombinationsereignissen sein, in denen die intakte Sequenz des rekombinanten Virus stromaufwärts (upstream) der in das Wirtszellgenom integrierten gag-, pol, env-Sequenz eingefügt wird. Es stehen mittlerweile jedoch neue Verpackungszelllinien zur Verfügung, die die Wahrscheinlichkeit einer Rekombination stark vermindern sollten (Markowitz et al., 1988; Hersdorffer et al., 1990).
Herpesvirus.
Da das Herpes-Simplex-Virus (HSV) neurotrop ist, hat es erhebliches Interesse an der Behandlung von Erkrankungen des Nervensystems geweckt. Darüber hinaus ist HSV durch seine Fähigkeit, sich nicht-teilende neuronale Zellen latent zu infizieren, ohne sich in Wirtszellenchromosomen zu integrieren oder den Metabolismus der Wirtszelle anderweitig zu verändern, sowie das Vorhandensein eines Promotors, der während der Latenzphase aktiv ist, ein attraktiver Vektor. Und obwohl sich viel Aufmerksamkeit auf die neurotropen Anwendungen von HSV konzentriert hat, lässt sich dieser Vektor angesichts seines weiten Wirtsbereiches auch für andere Gewebe anwenden.
Ein weiterer Faktor, der HSV zu einem attraktiven Vektor macht, ist die Größe und Organisation des Genoms. Da HSV groß ist, ist der Einbau mehrerer Gene oder Expressionskassetten weniger problematisch als in anderen kleineren viralen Systemen. Darüber hinaus ermöglicht die Verfügbarkeit unterschiedlicher viraler Kontrollsequenzen mit unterschiedlicher Leistung (in Bezug auf Zeit, Stärke, etc.) die Expression mehr als in anderen Systemen zu kontrollieren. Es ist außerdem von Vorteil, dass das Virus relativ wenig gesplicte mRNA aufweist, was die genetische Manipulation weiter vereinfacht.
HSV ist außerdem relativ einfach zu manipulieren und kann bis zu hohen Titern angezüchtet werden. Das Einführen (Delivery) ist daher ein geringeres Problem, sowohl in Bezug auf die Volumen, die erforderlich sind, um eine ausreichende MOI zu erzielen, als auch in Bezug auf einen verminderten Bedarf für wiederholte Dosierungen. Eine Übersicht über HSV als Gentherapievektor geben Glorioso et al., (1995).
HSV, die in die Subtypen 1 und 2 eingeteilt werden, sind Hüllviren, die zu den häufigsten Infektionserregern des Menschen gehören und die Millionen von Menschen weltweit infizieren. Das große komplexe doppelsträngige DNA-Genom kodiert für Dutzende unterschiedlicher Genprodukte, von denen einige von gesplicten Transkripten abstammen. Neben Virion- und Hüllstrukturbestandteilen kodiert das Virus für zahlreiche andere Proteine, darunter eine Protease, eine Ribonukleotidreduktase, eine DNA-Polymerase, ein ssDNA-Bindungsprotein, eine Helikase/Primase , eine DNA-abhängige ATPase, eine dUTPase und andere.
HSV-Gene bilden mehrere Gruppen, deren Expression koordiniert reguliert und in der Art einer Kaskade sequenziell geordnet ist (Honess und Roizman, 1974; Honess und Roizman, 1975, Roizman und Sears, 1995). Die Expression von α-Genen, dem ersten Satz von Genen, die nach einer Infektion exprimiert werden, wird durch das Virionprotein Nummer 16 oder α-transduzierender Faktor verstärkt (Post et al., 1981; Batterson und Roizman, 1983; Campbell et al., 1983). Die Expression von β-Genen erfordert funktionelle α-Genprodukte, vor allem ICP4, das vom α4-Gen kodiert wird (DeLuca et al., 1985). Y Gene, eine heterogene Gruppe von Genen, die überwiegend strukturelle Virionproteine kodieren, erfordern für eine optimale Expression den Beginn viraler DNA-Synthese (Holland et al., 1980).
Entsprechend der Komplexität des Genoms ist der Lebenszyklus von HSV erheblich kompliziert. Außer dem lytischen Zyklus, der zur Synthese von Viruspartikeln und schließlich zum Zelltod führt, hat das Virus die Möglichkeit, in ein latentes Stadium einzutreten, in dem das Genom in neuralen Ganglien erhalten bleibt, bis einige bislang undefinierte Signale ein Wiedereintreten in den lytischen Zyklus auslösen. Es sind avirulente Varianten von HSV entwickelt worden und sind zur Verwendung in Verbindung mit Gentherapie einfach verfügbar (US-Patent 5.672.344).
Adeno-assoziiertes Virus. Seit kurzem hat sich das Adeno-assoziierte Virus (AAV) als eine mögliche Alternative zu den üblicherweise verwendeten retroviralen und adenoviralen Vektoren entwickelt. Während Studien mit Retrovirus- und Adenovirus-vermitteltem Gentransfer Bedenken hinsichtlich potenzieller onkogener Eigenschaften des Ersteren und immunogener Probleme in Verbindung mit Letzterem auslösen, ist AAV nicht mit solchen pathologischen Indikationen in Verbindung gebracht worden.
AAV besitzt darüber hinaus einige besondere Merkmale, die es wünschenswerter als die anderen Vektoren macht. Im Gegensatz zu Retroviren kann AAV nicht-teilende Zellen infizieren; Wildtyp-AAV wurde durch ortsspezifische Integration in Chromosom 19 menschlicher Zellen charakterisiert (Kotin und Berns, 1989; Kotin et al., 1990; Kotin et al., 1991; Samulski et al., 1991), und AAV besitzt außerdem anti-onkogene Eigenschaften (Ostrove et al., 1981; Berns und Giraud, 1996). Rekombinante AAV-Genome werden konstruiert, indem DNA-Sequenzen von Interesse molekular zwischen die AAV-ITRs kloniert werden, wodurch die gesamten kodierenden Sequenzen des AAV-Wildtypgenoms beseitigt werden. Die so produzierten AAV-Vektoren weisen also keine kodierenden Sequenzen des AAV-Wildtypgenoms auf, haben aber die Eigenschaft einer stabilen Chromosomenintegration und Expression der rekombinanten Gene nach Transduktion in vitro und in vivo beibehalten (Berns, 1990; Berns und Bohensky, 1987; Bertran et al., 1996; Kearns et al., 1996; Ponnazhagan et al., 1997a). Bis vor Kurzem wurde angenommen, dass AAV fast alle Zelltypen infiziert, und selbst Artenbarrieren überschreitet. Es wurde nun jedoch festgestellt, dass die AAV-Infektion rezeptorvermittelt ist (Ponnazhagan et al., 1996; Mizukami et al., 1996).
AAV verwendet eine lineare einzelsträngige DNA von etwa 4700 Basenpaaren. Das Genom wird von umgekehrten terminalen Sequenzwiederholungen oder Inverted Terminal Repeats (ITRs) flankiert. In dem Genom sind zwei Gene vorhanden, die eine Anzahl unterschiedlicher Genprodukte hervorbringen. Das erste, das cap-Gen, produziert drei verschiedene Virionproteine (VP), die als VP-1, VP-2 und VP-3 bezeichnet werden. Das zweite, das rep-Gen, kodiert vier nicht strukturelle Proteine (NP). Eines oder mehrere dieser rep-Genprodukte ist für die Transaktivierung der AAV-Transkription verantwortlich. Die Sequenz von AAV ist von Srivastava et al., (1993) und in US-Patent 5.252.479 (dessen gesamter Text hierin spezifisch durch Bezugnahme enthalten ist) bereitgestellt.
Die drei Promotoren in AAV sind nach ihrer Position in Kartierungseinheiten (Map Units) im Genom gekennzeichnet. Es sind von links nach rechts p5, p19 und p40. Durch Transkription entstehen sechs Transkripte, wobei jeweils zwei an jedem der drei Promotoren initiiert werden und aus jedem Paar eines gesplict wird. Bei jedem Transkript befindet sich die Splice-Stelle an der Position der Kartierungseinheiten 42–46. Die vier nicht strukturellen Proteine entstammen offensichtlich dem längeren Transkript, während die drei Virionproteine alle aus dem kleinsten Transkript abgeleitet sind.
AAV ist beim Menschen nicht mit einem pathologischen Zustand verbunden. Für eine effiziente Replikation erfordert AAV interessanterweise „Helfer"-Funktionen von Viren wie Herpes-Simplex-Virus I und II, Cytomegalovirus, Pseudorabies-Virus und natürlich Adenovirus. Der am besten charakterisierte Helfer ist Adenovirus, und es ist gezeigt worden, dass viele frühen (early) Funktionen dieses Virus die AAV-Replikation unterstützen. Es wird angenommen, dass eine schwache Expression von AAV-rep-Proteinen die Expression struktureller AAV-Gene in Schach hält, und dass die Infektion mit Helferviren diese Blockade beseitigt.
Vakzinia-Virus.
Vakzinia-Virusvektoren sind aufgrund der Einfachheit ihrer Herstellung, dem relativ hohen Grad an Expression, den man erhalten kann, dem weiten Wirtsbereich und der großen Kapazität zur Aufnahme von DNA extensiv verwendet worden. Vakzinia enthält ein Genom aus linearer doppelsträngiger DNA von etwa 186 kb, die eine ausgeprägte Präferenz von „A-T"-Paaren aufweist. Umgekehrte terminale Sequenzwiederholungen oder Inverted Terminal Repeats (ITRs) von etwa 10,5 kb flankieren das Genom. Die Mehrzahl der essenziellen Gene scheint sich in der Zentralregion zu befinden, welche bei Pockenviren am stärksten konserviert ist. Vakzinia-Viren enthalten rund 150 bis 200 offene Leseraster. Obgleich beide Stränge kodieren, kommt es selten zu einer weit reichenden Überlappung der Leseraster.
In das Genom des Vakzinia-Virus können mindestens 25 kb eingefügt werden (Smith und Moss, 1983). Prototypische Vakzinia-Vektoren enthalten Transgene, die über homologe Rekombination in das virale Thymidinkinasegen eingefügt worden sind. Vektoren werden auf der Basis eines tk-Phänotyps ausgewählt. Durch den Einschluss der untranslatierten Leadersequenz des Enzephalomyokarditisvirus wird die Expression gegenüber herkömmlichen Vektoren verstärkt, wobei das Transgen nach 24 Stunden 10% oder mehr der Proteine der infizierten Zelle ausmacht (Elroy-Stein et al., 1989).
Nicht-viraler Transfer.
Damit Sense- oder Antisense-Genkonstrukte exprimiert werden können, muss das Expressionskonstrukt in eine Zelle eingeführt werden. Dieses Einführen kann in vitro erreicht werden wie bei Laborverfahren zur Transformation von Zelllinien, oder in vivo oder ex vivo wie bei der Behandlung bestimmter Erkrankungsstadien. Ein Mechanismus für die Einführung besteht aus einer viralen Infektion, wobei das Expressionskonstrukt in einem infektiösen Viruspartikel verkapselt ist.
In der vorliegenden Erfindung werden auch einige nicht-virale Verfahren für den Transfer von Expressionskonstrukten in kultivierte Säugetierzellen in Betracht gezogen. Dazu gehören Kalziumphosphatpräzipitation (Graham und Van Der Eb, 1973; Chen und Okayama, 1987; Rippe et al., 1990), DEAE-Dextran (Gopal, 1985), Elektroporation (Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984), direkte Mikroinjektion (Harland und Weintraub, 1985), DNA-beladene Liposomen (Nicolau und Sene, 1982; Fraley et al., 1979) und Lipofectamin-DNA-Komplexe, Zellsonifikation (Fechheimer et al., 1987), Genbeschuss mit Hochgeschwindigkeits-Mikroprojektilen (Yang et al., 1990) und rezeptorvermittelte Transfektion (Wu und Wu, 1987; Wu und Wu, 1988). Einige dieser Techniken könnten erfolgreich für die Verwendung in vivo oder ex vivo adaptiert werden.
Wenn das Expressionskonstrukt in die Zelle eingeführt worden ist, wird die Nukleinsäure, die das Gen von Interesse kodiert, unter Umständen an verschiedenen Stellen positioniert und exprimiert. In bestimmten Ausführungsformen kann die Nukleinsäure, die das Gen kodiert, stabil in das Genom der Zelle integriert werden. Diese Integration kann über homologe Rekombination (Genaustausch) an der verwandten Position und in verwandter Ausrichtung erfolgen oder die Integration erfolgt an einer zufälligen, nicht spezifischen Position (Genaugmentation). In weiteren Ausführungsformen kann die Nukleinsäure in der Zelle stabil als ein gesondertes episomales Segment einer DNA erhalten bleiben. Solche Nukleinsäuresegmente oder „Episomen" kodieren Sequenzen, die ausreichend sind, um eine Erhaltung und Replikation unabhängig von oder synchronisiert mit dem Zellzyklus zu erlauben. Wie das Expressionskonstrukt in eine Zelle eingeführt wird und wo die Nukleinsäure in der Zelle bleibt, hängt von der Art des verwendeten Expressionskonstruktes ab.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann das Expressionskonstrukt einfach aus nackter rekombinanter DNA oder nackten rekombinanten Plasmiden bestehen. Der Transfer des Konstruktes kann durch jedes beliebige der oben erwähnten Verfahren erfolgen, das die Zellmembran physikalisch oder chemisch durchlässig macht: Dies eignet sich vor allem für den Transfer in vitro, lässt sich aber auch für den Gebrauch in vivo verwenden. Dubensky et al., (1984) injizierten Polyomvirus-DNA in Form von Kalziumphosphatpräzipitaten erfolgreich in Leber und Milz adulter und neugeborener Mäuse, wobei aktive virale Replikation und akute Infektion gezeigt wurden. Benvenisty und Neshif (1986) zeigten auch, dass eine direkte intraperitoneale Injektion von Kalziumphosphat-präzipitierten Plasmiden zu einer Expression der transfizierten Gene führt. Es könnte sein, dass DNA, die ein Gen von Interesse kodiert, auf ähnliche Weise in vivo übertragen werden kann und das Genprodukt exprimiert.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung zur Übertragung eines Expressionskonstruktes aus nackter DNA in Zellen kann Teilchenbeschuss umfassen. Dieses Verfahren beruht auf der Möglichkeit, DNA-beschichtete Mikroprojektile auf eine hohe Geschwindigkeit zu beschleunigen, wodurch sie die Zellmembran durchdringen und in die Zellen hinein gelangen können, ohne sie zu töten (Klein et al., 1987). Es sind mehrere Vorrichtungen zum Beschleunigen kleiner Teilchen entwickelt worden. Eine solche Vorrichtung basiert auf einer Hochspannungsentladung zur Erzeugung eines elektrischen Flusses, der wiederum die Antriebskraft liefert (Yang et al., 1990). Die verwendeten Mikroprojektile bestanden aus biologisch inerten Substanzen wie beispielsweise Tungsten oder Goldkügelchen.
Es sind ausgewählte Organe, einschließlich Leber, Haut und Muskelgewebe von Ratten und Mäusen in vivo bombardiert worden (Yang et al., 1990; Zelenin et al., 1991). Dies kann die chirurgische Freilegung des Gewebes oder der Zellen erforderlich machen, um jedes Gewebe, das zwischen der Pistole und dem Zielorgan liegt, zu beseitigen, d. h. eine ex vivo-Behandlung. Auch eine DNA, die ein bestimmtes Gen kodiert, kann durch dieses Verfahren eingeführt und dennoch in die vorliegende Erfindung eingebaut werden.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann das Expressionskonstrukt in einem Liposom eingeschlossen sein. Liposomen sind vesikuläre Strukturen, die durch eine Phospholipid-Doppelmembran und ein inneres wässriges Medium gekennzeichnet sind. Multilamellare Liposomen haben mehrere Lipidschichten, die durch wässriges Medium getrennt sind. Sie bilden sich spontan, wenn Phospholipide in einem Überschuss an wässriger Lösung suspendiert werden. Die Lipidbestandteile durchlaufen vor der Bildung geschlossener Strukturen eine Neuanordnung und schließen Wasser und aufgelöste lösliche Stoffe zwischen den Lipidschichten ein (Ghosh und Bachhawat, 1991). In Betracht gezogen werden auch Lipofectam-DNA-Komplexe.
Liposomen-vermitteltes Einführen von Nukleinsäuren und Expression von Fremd-DNA in vitro waren sehr erfolgreich. Wong et al., (1989) zeigten die Durchführbarkeit einer Liposomen-vermittelten Einführung und Expression von Fremd-DNA in kultivierte Zellen von Hühnerembryonen sowie in HeLa- und Hepatomzellen. Nicolau et al., (1987) gelang ein erfolgreicher Liposomen-vermittelter Gentransfer in Ratten nach intravenöser Injektion.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung können Komplexe aus Liposom und einem Hämagglutininvirus (HVJ) gebildet werden. Es wurde gezeigt, dass die Fusion mit der Zellmembran damit erleichtert und das Eintreten von in Liposomen verkapselter DNA in die Zelle gefördert wird (Kaneda et al., 1989). In anderen Ausführungsformen kann das Liposom komplexiert oder in Verbindung mit nukleären chromosomalen Nicht-Histonproteinen (HMG-1) verwendet werden (Kato et al., 1991). In weiteren Ausführungsformen kann das Liposom komplexiert oder in Verbindung mit HVJ und HMG-1 verwendet werden. Insofern, als solche Expressionskonstrukte erfolgreich beim Transfer und der Expression von Nukleinsäuren in vitro und in vivo eingesetzt worden sind, sind sie für die vorliegende Erfindung geeignet. Wenn in dem DNA-Konstrukt ein bakterieller Promotor verwendet wird, ist es außerdem wünschenswert, eine geeignete bakterielle Polymerase in das Liposom aufzunehmen.
Andere Expressionskonstrukte, die verwendet werden können, um eine Nukleinsäure, die ein bestimmtes Gen kodiert, in Zellen einzuführen, sind rezeptorvermittelte Einführungsvehikel. Diese nutzen die selektive Aufnahme von Makromolekülen durch rezeptorvermittelte Endozytose in fast alle eukaryontischen Zellen. Aufgrund der zelltypspezifischen Verteilung verschiedener Rezeptoren kann diese Art des Einführens hoch spezifisch sein (Wu und Wu, 1993).
Vehikel für rezeptorvermitteltes Gentargeting bestehen im Allgemeinen aus zwei Komponenten: einem Zellrezeptor-spezifischen Liganden und einem DNA-Bindungsmittel. Es sind mehrere Liganden für rezeptorvermittelten Gentransfer verwendet worden. Die am ausführlichsten charakterisierten Liganden sind Asialoorosomucoid (ASOR) (Wu und Wu, 1987) und Transferrin (Wagner et al., 1990). Kürzlich ist ein synthetisches Neoglykoprotein, das denselben Rezeptor wie ASOR erkennt, als Vehikel zum Einführen von Genen verwendet worden (Ferkol et al., 1993; Perales et al., 1994), und auch EGF (Epidermaler Wachstumsfaktor) wurde benutzt, um Gene in Plattenepithelkarzinomzellen einzuführen (Myers, EPO 0273085).
In anderen Ausführungsformen kann das Einführungsvehikel einen Liganden und ein Liposom umfassen. Nicolau et al., (1987) beispielsweise setzten Lactosyl-Ceramid ein, ein galaktoseterminales Asialogangliosid, das in Liposomen eingebaut war, und beobachteten eine Erhöhung der Aufnahme des Insulingens von Hepatozyten. Es ist daher möglich, dass auch eine Nukleinsäure, die ein bestimmtes Gen kodiert, durch eine beliebige Anzahl an Rezeptor-Ligand-Systemen mit oder ohne Liposomen spezifisch in einen Zelltyp wie Lungen-, Epithel- oder Tumorzellen eingeführt wird. Beispielsweise kann EGF (Epidermaler Wachstumsfaktor) in vielen Tumorzellen, die eine Hochregulierung des EGF-Rezeptors aufweisen, als Rezeptor für die vermittelte Einführung einer Nukleinsäure, die ein Gen kodiert, verwendet werden. Mannose kann eingesetzt werden, wenn das Ziel der Mannoserezeptor auf Leberzellen ist. Auch Antikörper gegen CDS (CLL), CD22 (Lymphom), CD25 (T-Zellleukämie) und MAA (Melanom) können als Targeting-Einheiten eingesetzt werden.
In bestimmten Ausführungsformen könnte ein Gentransfer einfacher unter ex vivo-Bedingungen durchgeführt werden. Ex-vivo-Gentherapie bezieht sich auf die Isolierung von Zellen aus einem Tier, das Einführen einer Nukleinsäure in die Zellen in vitro, und anschließende Rückführung der modifizierten Zellen in ein Tier. Dies kann die chirurgische Entnahme von Geweben/Organen aus einem Tier oder die Primärkultur von Zellen und Geweben umfassen.
Primäre Säugetierzellkulturen können auf verschiedene Art und Weise hergestellt werden. Damit die Zellen in vitro und während des Kontaktes mit dem Expressionskonstrukt lebensfähig bleiben, muss sichergestellt werden, dass die Zellen Kontakt mit Sauerstoff und Kohlendioxid und Nährstoffen im richtigen Verhältnis aufrecht erhalten, aber vor mikrobieller Kontamination geschützt sind. Zellkulturtechniken sind gut dokumentiert und hierin durch Bezugnahme enthalten (Freshner, 1992).
Eine Ausführungsform des Vorangehenden umfasst die Anwendung eines Gentransfers immortalisierter Zellen für die Produktion von Proteinen. Das Gen für das Protein von Interesse kann wie oben beschrieben in geeignete Wirtszellen überführt werden, gefolgt von einer Kultur der Zellen unter geeigneten Bedingungen. Auf diese Weise können Gene für praktisch jedes beliebige Polypeptid eingesetzt werden. Die Herstellung rekombinanter Expressionsvektoren und der darin enthaltenen Elemente ist oben erläutert. Alternativ kann es sich bei dem herzustellenden Protein um ein endogenes Protein handeln, das normalerweise von der fraglichen Zelle synthetisiert wird.
Beispiele geeigneter Säugetier-Wirtszelllinien sind Vero- und HeLa-Zellen und Zelllinien aus dem Eierstock des chinesischen Hamsters, W138-, BHK-, COS-7-, 293-, HepG2-, NIH3T3-, RIN- und MDCK-Zellen. Darüber hinaus kann ein Wirtszellstamm ausgewählt werden, der die Expression der eingefügten Sequenzen moduliert oder das Genprodukt auf die gewünschte Art und Weise modifiziert und prozessiert. Solche Modifikationen (z. B. Glykosylierung) und Prozessierung (z. B. Spaltung) von Proteinprodukten können für die Funktion des Proteins wichtig sein. Verschiedene Wirtszellen verfügen über charakteristische und spezifische Mechanismen für die posttranslationale Prozessierung und Modifikation von Proteinen. Es können geeignete Zelllinien oder Wirtssysteme gewählt werden, um die korrekte Modifikation und Prozessierung des exprimierten Fremdproteins sicherzustellen.
Es kann eine Reihe von Selektionssystemen verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, das HSV-Thymidinkinasegen in tk-Zellen, das Hpyoxanthin-Guaninphosphoribosyltransferasegen in hgptr^–-Zellen und das Adeninphosphoribosyltransferasegen in aprt^–-Zellen. Als Basis für die Selektion kann auch Antimetabolitenresistenz verwendet werden, beispielsweise das dhfr-Gen, das Resistenz gegen Dehydrofolsäurereduktase vermittelt, das gpt-Gen, das Resistenz gegen Mycophenolsäure vermittelt, das neo-Gen, das Resistenz gegen Aminoglykosid G418 vermittelt, und das hygro-Gen, das Resistenz gegen Hygromycin vermittelt.
Tierische Zellen lassen sich in vitro auf zweierlei Art und Weise propagieren: als nicht-ankerabhängige Zellen, die während der gesamten Kultur in Suspension wachsen, oder als ankerabhängige Zellen, welche die Haftung an ein solides Substrat benötigen um zu wachsen (d. h. ein Zellwachstum als einlagige Zellschicht, d. h. als Monolayertyp).
Nicht-ankerabhängige Kulturen oder Suspensionskulturen aus kontinuierlich etablierten Zelllinien sind das am häufigsten verwendete Mittel für die Produktion von Zellen und Zellprodukten in großem Maßstab. In Suspension kultivierte Zellen haben jedoch Einschränkungen, beispielsweise ein tumorigenes Potenzial und geringere Proteinproduktion als adhärente Zellen.
Suspensionskulturen von Säugetierzellen in großem Maßstab in Rührtanks ist ein gängiges Verfahren für die Herstellung rekombinanter Proteine. Weit verbreitet ist die Verwendung zweier Suspensionskulturreaktordesigns: Der Rührkesselreaktor und der Airlift-Reaktor. Die Rührtechnik wurde erfolgreich für die Produktion von Interferon im Maßstab von 8000 Liter eingesetzt. Die Zellen werden in einem Edelstahltank mit einem Verhältnis von Höhe zu Durchmesser von 1:1 oder 3:1 gezüchtet. Die Kultur wird in der Regel mit einem oder mehreren Rührwerken auf der Basis von Rührblattscheiben oder Propellern gemischt. Es sind Rührwerke beschrieben worden, die geringere Scherkräfte als Rührblätter bieten. Der Rührvorgang kann entweder direkt oder indirekt über magnetisch gekoppelte Motoren angetrieben werden. Indirekte Antriebe reduzieren das Risiko einer mikrobiellen Kontamination durch Dichtungen an Rührschäften.
Der Airlift-Reaktor, der ursprünglich ebenfalls für die mikrobielle Fermentation beschrieben und später für die Kultur von Säugetierzellen angepasst worden ist, beruht auf einem Gasstrom, um die Kultur zu mischen und mit Sauerstoff zu versorgen. Der Gasstrom gelangt in einen Steigrohrabschnitt des Reaktors und treibt die Zirkulation an. Gas tritt an der Oberfläche der Kultur aus, was bewirkt, dass dichtere Flüssigkeit ohne Gasbläschen nach unten in den Fallrohrabschnitt des Reaktors wandert. Der Hauptvorteil dieses Designs ist seine Einfachheit und das Entfallen der Notwendigkeit mechanischen Mischens. Das Verhältnis von Höhe zu Durchmesser ist typischerweise 10:1. Der Maßstab des Airlift-Reaktors kann relativ einfach vergrößert werden, er weist eine gute Masseübernagung von Gasen und im Allgemeinen relativ niedrige Scherkräfte auf.
Die Antikörper der vorliegenden Erfindung sind besonders für die Isolierung von Antigenen durch Immunpräzipitation geeignet. Immunpräzipitation umfasst die Trennung des Zielantigenbestandteils von einer komplexen Mischung und wird verwendet, um kleinste Mengen von Protein abzutrennen oder zu isolieren. Für die Isolierung von Membranproteinen müssen Zellen in Detergensmizellen aufgelöst werden. Nicht-ionische Salze sind bevorzugt, da andere Mittel wie Gallensalze bei saurem pH-Wert oder in Gegenwart bivalenter Kationen ausfallen. Antikörper und ihr Gebrauch werden unten ausführlicher erläutert.
III. Herstellung von Antikörpern mit Reaktivität gegen TS10q23.3
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen Antikörper, der gegen ein TS10q23.3-Molekül der vorliegenden Erfindung oder einen beliebigen Abschnitt davon immunreaktiv ist. Ein Antikörper kann ein polyklonaler oder monoklonaler Antikörper sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein Antikörper ein monoklonaler Antikörper. Mittel zur Herstellung und Charakterisierung von Antikörpern sind aus dem Stand der Technik gut bekannt (siehe z. B. Howell und Lane, 1988).
Kurz beschrieben, wird ein polyklonaler Antikörper hergestellt, indem ein Tier mit einem Immunogen immunisiert wird, das ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung umfasst, und als Antiserum von diesem immunisierten Tier gewonnen wird. Für die Produktion von Antiserum können viele verschiedene Tierarten verwendet werden. Ein Tier, das zur Produktion von Antiseren verwendet wird, ist typischerweise nicht menschlich, einschließlich Kaninchen, Mäuse, Ratten, Hamster, Schweine oder Pferde. Aufgrund des relativ großen Blutvolumens von Kaninchen, sind Kaninchen eine bevorzugte Wahl für die Produktion polyklonaler Antikörper.
Antikörper, sowohl polyklonale als auch monoklonale, die für Antigenisoformen spezifisch sind, können anhand herkömmlicher Immunisierungstechniken, die einem Fachmann im Allgemeinen bekannt sind, hergestellt werden. Eine Zusammensetzung, die antigene Epitope der Verbindungen der vorliegenden Erfindung enthält, kann verwendet werden, um eines oder mehrere Versuchstiere zu immunisieren, beispielsweise ein Kaninchen oder eine Maus, die dann spezifische Antikörper gegen die Verbindungen der vorliegenden Erfindung produzieren. Nach einem Zeitraum zur Bildung von Antikörpern können polyklonale Antiseren erhalten werden, indem dem Tier einfach Blut abgenommen und aus dem Vollblut Serumproben gewonnen werden. Die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung könnten sinnvolle Anwendung in immunchemischen Standardverfahren finden, wie beispielsweise in ELISA- und Western-Blot-Verfahren, und in immunhistochemischen Verfahren wie beispielsweise der Gewebefärbung, sowie in anderen Verfahren, die Antikörper verwenden, die spezifisch gegen in Zusammenhang mit TS10q23.3 stehende Antigenepitope einsetzen. Darüber hinaus könnten monoklonale Antikörper, die spezifisch gegen das jeweilige TS10q23.3 verschiedener Arten gerichtet sind, in anderen nützlichen Anwendungen Einsatz finden.
Im Allgemeinen können in verschiedenen Ausführungsformen sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper gegen TS10q23.3 verwendet werden. Beispielsweise können sie in Antikörper-Klonierungsprotokollen eingesetzt werden, um cDNAs oder Gene, die andere TS10q23.3 kodieren, zu erhalten. Sie können auch in Inhibierungsstudien verwendet werden, um die Effekte von in Zusammenhang mit TS10q23.3 stehenden Peptiden in Zellen oder Tieren zu analysieren. Anti-TS1Oq23.3-Antikörper eignen sich auch für Immunlokalisierungsstudien, um die Verteilung von TS10q23.3 während verschiedener zellulärer Ereignisse zu untersuchen, beispielsweise um die zelluläre oder gewebespezifische Verteilung von TS10q23.3-Polypeptiden in unterschiedlichen Stadien des Zellzyklus zu bestimmen. Eine besonders nützliche Anwendung solcher Antikörper ist bei der Reinigung nativer oder rekombinanter TS10q23.3, beispielsweise durch Verwendung einer Antikörperaffinitätssäule. Die Anwendung aller solcher immunologischer Techniken ist einem Fachmann angesichts der vorliegenden Offenbarung bekannt.
Mittel zum Herstellen und Charakterisieren von Antikörpern sind aus dem Stand der Technik gut bekannt (siehe z. B. Harlow und Lane, 1988; hierin durch Bezugnahme enthalten). Spezifischere Beispiele der Herstellung monoklonaler Antikörper sind in den Beispielen unten gegeben.
Wie aus dem Stand der Technik bekannt ist, kann eine gegebene Zusammensetzung in ihrer Immunogenität variieren. Es ist daher häufig erforderlich, das Immunsystem des Wirts zu stärken, was beispielsweise erreicht werden kann, indem ein Peptid- oder Polypeptidimmunogen an einen Träger gekoppelt wird. Beispielhafte und bevorzugte Träger sind Keyhole-Limpet-Hämozyanin (KLH) und Rinderserumalbumin (BSA). Andere Albumine wie beispielsweise Ovalbumin, Mausserumalbumin oder Kaninchenserumalbumin können auch als Träger verwendet werden. Mittel zum Konjugieren eines Polypeptids an ein Trägerprotein sind aus dem Stand der Technik bekannt und umfassen Glutaraldehyd, m-Maleimidobencoyl-N-hydroxysuccinimidester, Carbodiimid und bis-biazotisiertes Benzidin.
Wie aus dem Stand der Technik ebenso bekannt ist, kann die Immunogenität einer bestimmten immunogenen Zusammensetzung verstärkt werden, indem nicht-spezifische Stimulatoren der Immunantwort, die als Adjuvantien bekannt sind, verwendet werden. Beispielhafte und bevorzugte Adjuvantien umfassen das Freund-Adjuvans (ein unspezifischer Stimulator der Immunantwort, der abgetötetes Mycobacterium tuberculosis enthält), unvollständiges Freund-Adjuvans und Aluminiumhydroxydadjuvans.
Die Menge an immunogener Zusammensetzung, die bei der Produktion polyklonaler Antikörper verwendet wird, variiert je nach Art des Immunogens sowie des für die Immunisierung verwendeten Tieres. Die Verabreichung des Immunogens ist auf unterschiedliche Art und Weise möglich (subkutan, intramuskulär, intradermal, intravenös und intraperitoneal). Die Produktion polyklonaler Antikörper kann durch Abnahme von Blut von dem immunisierten Tier zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Immunisierung überwacht werden. Es kann auch eine zweite verstärkende so genannte „Booster"-Injektion gegeben werden. Der Vorgang der Verstärkung (Boosting) und der Titrierung wird wiederholt, bis ein geeigneter Titer erreicht ist. Wenn ein gewünschter Grad an Immunität erreicht ist, kann das immunisierte Tier ausgeblutet und das Serum isoliert und aufbewahrt werden und/oder das Tier kann verwendet werden, um mAbs herzustellen.
mAbs können leicht durch Anwendung gut bekannter Techniken hergestellt werden, wie beispielsweise die, die in US-Patent 4.196.265, das hierin durch Bezugnahme enthalten ist, veranschaulicht sind. Typischerweise umfasst diese Technik das Immunisieren eines geeigneten Tieres mit einer ausgewählten Immunogenzusammensetzung, z. B. einem gereinigten oder partiell gereinigtem TS10q23.3-Protein, -Polypeptid oder -Peptid oder Zelle, die TS10q23.3 in hohem Maß exprimiert. Die immunisierende Zusammensetzung wird derart verabreicht, dass sie Antikörper produzierende Zellen wirksam stimuliert. Nager wie Mäuse und Ratten sind bevorzugte Tiere, aber es ist auch die Verwendung von Kaninchen, und Zellen von Hypopachus variolosus möglich. Die Verwendung von Ratten könnte bestimmte Vorteile bieten (Goding, 1986), aber Mäuse sind bevorzugt, wobei die BALB/c-Maus die am meisten bevorzugte ist, da sie am häufigsten verwendet und im Allgemeinen einen höheren Prozentanteil stabiler Fusionen ergibt.
Nach der Immunisierung werden Zellen mit dem Potenzial zur Produktion von Antikörpern, speziell B-Lymphozyten (B-Zellen), zur Verwendung in den Protokoll zur Erzeugung von mAbs ausgewählt, Diese Zellen können aus Milz-, Tonsillen- oder Lymphknotenbiopsien oder aus einer peripheren Blutprobe erhalten werden. Milzzellen und periphere Blutzellen sind bevorzugt, Erstere, weil sie eine reichhaltige Quelle an Antikörper produzierenden Zellen sind, die sich im Stadium eines teilenden Plasmablasten befinden, und Letztere, weil peripheres Blut leicht zugänglich ist. Häufig wird eine Reihe von Tieren immunisiert und die Milz des Tiers, das den höchsten Antikörpertiter aufweist, wird entnommen und die Milzlymphozyten erhalten, indem die Milz mit einer Spritze homogenisiert wird. Eine Milz einer immunisierten Maus enthält rund 5 × 10⁷ bis 2 × 10⁸ Lymphozyten.
Die Antikörper produzierenden B-Lymphozyten des immunisierten Tieres werden anschließend mit Zellen einer unsterblichen Myelomzelle fusioniert, in der Regel von der gleichen Art wie das immunisierte Tier. Myelomzelllinien, die zur Verwendung in Hybridom produzierenden Fusionsverfahren geeignet sind, sind vorzugsweise nicht Antikörper produzierend, haben eine hohe Fusionseffizienz und Enzymmangelzustände, die es ihnen unmöglich machen, in bestimmten Selektionsmedien zu wachsen, welche das Wachstum von lediglich den gewünschten Fusionszellen (Hybridomen) unterstützen.
Es kann eine Beliebige aus einer Reihe von Hybridomzellen verwendet werden, wie sie einem Fachmann bekannt sind (Goding, 1986). Wenn das immunisierte Tier beispielsweise eine Maus ist, kann P3-X63/Ag8, P3-X63/Ag8.653, NS1/1.Ag41, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 und S194/5XX0 Bul verwendet werden; für Ratten kann R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F und 4B210 verwendet werden, und U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 und UC729-6 sind in Verbindung mit Zellfusionen geeignet.
Verfahren zum Erzeugen von Hybriden Antikörper produzierender Milz- oder Lymphknotenzellen und Myelomzellen umfassen in der Regel das Mischen somatischer Zellen mit Myelomzellen im Verhältnis von 2:1, obgleich das Verhältnis in Gegenwart eines Mittels oder von Mitteln (chemisch oder elektrisch), welche die Fusion von Zellmembranen fördern, von etwa 20:1 bis etwa 1:1 (respektive) variieren kann. Es sind Fusionsverfahren unter Verwendung von Sendai-Virus beschrieben worden (Köhler und Milstein, 1975, 1976) und solche, bei denen Polyethylenglycol (PEG), beispielsweise 37% (Vol./Vol.) verwendet wird (Gefter et al., 1977). Auch die Verwendung elektrisch induzierter Fusionsverfahren ist geeignet (Goding, 1986).
Fusionsverfahren bringen in der Regel lebensfähige Hybride in niedriger Häufigkeit hervor, d. h. etwa 1 × 10^–6 bis 1 × 10^–8. Dies stellt allerdings kein Problem dar, da die lebensfähigen fusionierten Hybride durch Kultivierung in einem Selektionsmedium von den nicht fusionierten Elternzellen (insbesondere den nicht fusionierten Myelomzellen, die sich normalerweise unendlich weiter teilen würden), differenziert sind. Das Selektionsmedium ist im Allgemeinen eines, das ein Mittel enthält, welches die de-novo-Synthese von Nukleotiden in dem Gewebekulturmedium blockiert. Beispielhafte und bevorzugte Mittel sind Aminopterin, Methotrexat und Azaserin. Aminopterin und Methotrexat blockieren die de-novo-Synthese von Purinen und Pyrimidinen, während Azaserin nur die Purinsynthese blockiert. Wenn Aminopterin und Methotrexat verwendet werden, wird das Medium mit Hypoxanthin und Thymidin als Nukleotidquelle supplementiert (HAT-Medium). Wenn Azaserin verwendet wird, wird das Medium mit Hypoxanthin supplementiert.
Das bevorzugte Selektionsmedium ist HAT. In HAT-Medium können nur Zellen überleben, die fähig sind, auf einen Nukleotid-Ausweich-Stoffwechselweg (Salvage Pathway) umzustellen. Den Myelomzellen fehlen wichtige Enzyme des Ausweich-Stoffwechselwegs, z. B. Hypoxanthinphosphoribosyltransferase (HPRT), und sie sind daher nicht überlebensfähig. Bei den B-Zellen ist dieser Stoffwechselweg aktiv, aber sie haben in Kultur eine eingeschränkte Lebensdauer und sterben in der Regel innerhalb von zwei Wochen. Die einzigen Zellen, die in dem Selektionsmedium überleben können, sind daher die aus Myelom- und B-Zellen gebildeten Hybride.
Diese Kultivierung liefert eine Population von Hybridomen, aus denen spezifische Hybridome ausgewählt werden. Die Auswahl von Hybridomen erfolgt typischerweise durch Kultivieren der Zellen mittels Einzelklonverdünnung in Mikrotiterplatten, gefolgt von einer Testung der einzelnen klonalen Überstände (nach etwa zwei bis drei Wochen) hinsichtlich der gewünschten Reaktivität. Der Test sollte empfindlich, einfach und schnell sein, wie beispielsweise Radioimmunassays, Enzymimmunassays, Zytotoxizitätsassays, Plaque-Assays, Punkt-Immun-Bindungs-Assays und dergleichen.
Die ausgewählten Hybridomas würden dann seriell verdünnt und zu einzelnen Antikörper produzierende Zelllinien kloniert werden, wobei die Klone anschließend unbegrenzt weiter propagiert werden können, um mAbs zu liefern. Die Zelllinien lassen sich auf zwei Arten für die Produktion von mAbs nutzen. Eine Probe des Hybridoms kann einem histokompatiblen Tier der Art, die zur Bereitstellung der somatischen Zellen und Myelomzellen für die ursprüngliche Fusion verwendet worden ist, injiziert werden (häufig in die Peritonealhöhle). Das injizierte Tier entwickelt Tumoren, welche den von dem fusionierten Zellhybrid produzierten spezifischen monoklonalen Antikörper sezernieren. Die Körperflüssigkeiten des Tiers, beispielsweise Serum oder Aszitesflüssigkeit, können dann entnommen werden, um mAbs in hoher Konzentration bereit zu stellen. Die einzelnen Zelllinien können auch in vitro kultiviert werden, wobei die mAbs natürlicherweise in das Zellkulturmedium sezerniert werden, aus dem sie in hoher Konzentration einfach gewonnen werden können. Die durch eines der beiden Verfahren hergestellten mAbs können anhand von Filtrations-, Zentrifugations- und verschiedenen Chromatographieverfahren, wie beispielsweise HPLC oder Affinitätschromatographie, gegebenenfalls weiter gereinigt werden.
Die einzelnen Zelllinien könnten auch in vitro kultiviert werden, wobei die mAbs natürlicherweise in das Zellkulturmedium sezerniert werden, aus dem sie in hoher Konzentration einfach gewonnen werden können.
Die durch eines der beiden Verfahren hergestellten mAbs können anhand von Filtrations-, Zentrifugations- und verschiedenen Chromatographieverfahren, wie beispielsweise HPLC oder Affinitätschromatographie, gegebenenfalls weiter gereinigt werden. Aus den gereinigten monoklonalen Antikörpern lassen sich durch Verfahren, die einen Verdau mit Enzymen wie Pepsin oder Papain und/oder durch Spaltung von Disulfidbrücken durch chemische Reduktion umfassen, Fragmente der monoklonalen Antikörper der Erfindung erhalten. Alternativ können monoklonale Antikörperfragmente, die von der vorliegenden Erfindung umfasst werden, mit einem automatisierten Peptidsynthesegerät synthetisiert werden.
Es wird auch in Betracht gezogen, dass ein molekularer Klonierungsansatz verwendet werden könnte, um monoklonale Antikörper herzustellen. Dazu werden kombinatorische Immunglobulin-Phagemid-Bibliotheken aus RNA hergestellt, die aus der Milz des immunisierten Tiers isoliert worden ist, und Phagemide, die geeignete Antikörper exprimieren, werden durch Panning ausgewählt, wobei Zellen, die das Antigen exprimieren, und Kontrollzellen verwendet werden, z. B. Normalzellen gegenüber Tumorzellen. Die Vorteile dieses Ansatzes gegenüber herkömmlichen Hybridomtechniken sind, dass etwa 10⁴-mal mehr Antikörper produziert und auf einmal getestet werden können und dass durch Kombination der H- und L-Ketten neue Spezifitäten entstehen, was die Chance zur Auffindung geeigneter Antikörper weiter erhöht.
Humanisierte monoklonale Antikörper sind Antikörper tierischer Abstammung, die anhand gentechnischer Verfahren modifiziert worden sind, um Gerüstsequenzen der konstanten Region und/oder der variablen Region durch humane Sequenzen zu ersetzen, während die ursprüngliche Antigenspezifität erhalten bleibt. Solche Antikörper werden normalerweise von Nagerantikörpern mit Spezifität gegen humane Antigene abgeleitet. Solche Antikörper eignen sich im Allgemeinen für therapeutische Anwendungen in vivo. Diese Strategie reduziert die Reaktion des Wirts auf den Fremdantikörper und erlaubt eine Selektion der humanen Effektorfunktionen.
Die Techniken zur Produktion humanisierter Immunglobuline sind einem Fachmann gut bekannt. US-Patent Nr. 5.693.762 offenbart beispielsweise Verfahren zur Herstellung und Zusammensetzungen von humanen Immunglobulinen, die eine oder mehrere Komplementaritätsbestimmende Regionen (CDRs) aufweisen. Bei Kombination mit einem intakten Antikörper sind die humanisierten Immunglobuline im Menschen im Wesentlichen nicht immunogen und behalten im Wesentlichen dieselbe Affinität zu dem Antigen, beispielsweise einem Protein oder einer anderen, Epitop-haltigen Verbindung, wie das Spenderimmunglobulin bei.
Andere US-Patente, die hierin durch Bezugnahme enthalten sind und welche die Produktion von Antikörpern lehren, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen US-Patent Nr. 5.565.332, das die Produktion chimärer Antikörper mittels eines kombinatorischen Ansatzes beschreibt; 4.816.567, das rekombinante Immunglobulinpräparationen beschreibt, und 4.867.973, das Konjugate aus Antikörper und therapeutischen Mitteln beschreibt.
US-Patent 5.565.332 beschreibt Verfahren für die Produktion von Antikörpern oder Antikörperfragmenten, welche dieselbe Bindungsspezifität wie ein Elternantikörper besitzen, aber verstärkte humane Merkmale aufweisen. Humanisierte Antikörper können durch das Chain-Shuffling-Verfahren, unter Umständen durch Anwendung von Phagendisplaytechnologie erhalten werden. Insofern als solche Verfahren in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, ist der gesamte Text von US-Patent Nr. 5.565.332 hierin durch Bezugnahme enthalten. Humane Antikörper können auch hergestellt werden, indem B-Zellen mit EBV transformiert und sezernierende Transformanden anschließend kloniert werden, wie von Hoon et al., (1993) beschrieben wurde.
Antikörperkonjugate, bei denen ein TS10q23.3-Antikörper mit einer nachweisbaren Markierung oder einem zytotoxischen Mittel verknüpft ist, stellen weitere Aspekte der Erfindung dar. Diagnostische Antikörperkonjugate können sowohl in der in-vitro-Diagnostik als auch in verschiedenen Immunassays und in der in-vivo-Diagnostik, beispielsweise bei Bildgebungstechnologien, verwendet werden.
Bestimmte Antikörperkonjugate umfassen solche, die hauptsächlich für die Verwendung in vitro bestimmt sind, wobei der Antikörper mit einem sekundären Bindungsliganden oder mit einem Enzym (einem Enzymetikett) verknüpft ist, der bzw. das bei Kontakt mit einem chromogenen Substrat ein Farbprodukt erzeugt. Beispiele geeigneter Enzyme umfassen Urease, alkalische Phosphatase, (Meerrettich)-Hydrogenphosphatase und Glukoseoxidase. Bevorzugte sekundäre Bindungsliganden sind Biotin- und Avidin- oder Streptavidinverbindungen. Der Gebrauch solcher Marker ist einem Fachmann gut bekannt und ist beispielsweise in US-Patent 3.817.837, 3.850.752, 3.939.350, 4.277.437, 4.275.149 und 4.366.241, die alle hierin durch Bezugnahme enthalten sind, beschrieben.
Radioaktiv markierte monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung können nach gut bekannten Verfahren aus dem Stand der Technik produziert werden. Beispielsweise können monoklonale Antikörper durch Kontakt mit Natrium- oder Kaliumiodid und einem chemischen Oxidationsmittel wie Natriumhypochlorit oder einem enzymatischen Oxidationsmittel wie Lactoperoxidase iodiert werden. Monoklonale Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung können durch Ligandenaustausch mit Technetium-^99m markiert werden, indem beispielsweise Pertechnat mit einer Zinnlösung reduziert wird, das reduzierte Technetium auf einer Sephadex-Säule cheliert wird und der Antikörper auf diese Säule aufgetragen wird, oder durch direkte Markierungstechniken, z. B. durch Inkubieren von Pertechnat, einem Reduktionsmittel wie SNCl₂, einer Pufferlösung wie Natriumkaliumphthalat-Lösung und dem Antikörper.
Intermediäre funktionelle Gruppen, die häufig verwendet werde, um Radioisotope, die als Metallionen vorliegen, an Antikörper zu binden, sind Diethylentetraaminpentaessigsäure (DTPA) und Ehylendiamintetraessigsäure (EDTA). Fluoreszenzmarker umfassen Rhodamin, Fluoreszeinisothiocyanat und Renographin.
IV. Diagnose von Krebs in Verbindung mit TS10q23.3
Die vorliegenden Erfinder haben festgestellt, dass Veränderungen in TS10q23.3 mit Malignomen verbunden sind. Daher können TS10q23.3 und die entsprechenden Gene als ein diagnostischer oder prgnostischer Indikator für Krebs verwendet werden. Spezifischer könnten Punktmutationen, Deletionen, Insertionen oder regulatorische Störungen in Verbindung mit TS10q23.3 Krebs verursachen oder die Entwicklung von Krebs fördern, Tumorprogression an einer primären Stelle verursachen oder fördern und/oder Metastasierung verursachen oder fördern. Andere Phänomene in Verbindung mit Malignomen, die von der Expression von TS10q23.3 beeinflusst sein könnten, umfassen Angiogenese und Gewebeinvasion.
A. Gendiagnose
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst ein Verfahren zum Nachweis von Variationen in der Expression von TS10q23.3 Dies kann auch die Bestimmung des Expressionsgrades von TS10q23.3 oder die Bestimmung spezifischer Veränderungen des exprimierten Produktes umfassen. Diese Art von Assay hat offenkundig Bedeutung bei der Diagnose damit in Zusammenhang stehender Krebsarten. Solche Krebsarten können Karzinome in Gehirn (Glioblastome, Medulloblastome, Astrozytome, Oligodendrogliome, Ependymome), Lunge, Leber, Milz, Niere, Bauchspeicheldrüse, Dünndarm, Blutzellen, Lymphknoten, Dickdarm, Brust, Endometrium, Magen, Prostata, Hoden, Ovar, Haut, Kopf und Hals, Speiseröhre, Knochenmark, Blut oder anderen- Geweben umfassen. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die Diagnose von Gliomen.
Die biologische Probe kann jedes beliebige Gewebe oder jede beliebige Flüssigkeit sein. Verschiedene Ausführungsformen umfassen Zellen von Haut, Muskeln, Faszie, Gehirn, Prostata, Brust, Endometrium, Lunge, Kopf & Hals, Bauchspeicheldrüse, Dünndarm, Blutzellen, Leber, Hoden, Eierstock, Dickdarm, Haut, Magen, Speiseröhre, Milz, Lymphknoten, Knochenmark oder Nieren. Andere Ausführungsformen umfassen Flüssigproben wie peripheres Blut, Lymphflüssigkeit, Aszites, seröse Flüssigkeit, pleurale Effusion, Sputum, Gehirn-Rückenmark-Flüssigkeit, Tränenflüssigkeit, Stuhl oder Urin.
Verwendete Nukleinsäure wird in Übereinstimmung mit Standardmethoden (Sambrook et al., 1989) aus Zellen isoliert, die in der biologischen Probe enthalten sind. Die Nukleinsäure kann genomische DNA oder fraktionierte oder zelluläre Gesamt-RNA sein. Wenn RNA verwendet wird, kann es wünschenswert sein, die RNA in eine komplementäre DNA umzuwandeln. In einer Ausführungsform handelt es sich bei der RNA um zelluläre Gesamt-RNA; in einer anderen Ausführungsform handelt es sich dabei um Poly-A-RNA. Die Nukleinsäure wird normalerweise amplifiziert.
Je nach Format wird die spezifische Nukleinsäure von Interesse in der Probe mittels Amplifikation direkt oder nach der Amplifikation mit einer zweiten bekannten Nukleinsäure identifiziert. Anschließend wird das identifizierte Produkt nachgewiesen. In bestimmten Anwendungen kann der Nachweis visuell erfolgen (z. B. durch Ethidiumbromidfärbung eines Gels). Alternativ kann der Nachweis die indirekte Identifizierung des Produktes über Chemilumineszenz, radioaktive Szintigraphie eines radioaktiven Markers oder eines fluoreszierenden Markers oder sogar über ein System umfassen, das elektrische oder thermische Impulssignale verwendet (Affymax Technologies; Bellus, 1994).
Nach dem Nachweis können die Ergebnisse, die bei einem bestimmten Patienten vorhanden sind, mit einer statistisch signifikanten Referenzgruppe normaler Patienten und Patienten mit Pathologien in Zusammenhang mit TS10q23.3 verglichen werden. Auf diese Art ist es möglich, die Menge oder Art des nachgewiesenen TS10q23.3 mit verschiedenen klinischen Stadien zu korrelieren.
Von den vorliegenden Erfindern sind verschiedene Arten von Defekten identifiziert worden. „(Ver)änderungen" sind daher so zu verstehen, als sie Deletionen, Insertionen, Punktmutationen und Duplikationen umfassen. Punktmutationen führen zu Stop-Codons, Frameshift-Mutationen oder Aminosäuresubstitutionen. Somatische Mutationen sind solche, die in Nichtkeimbahngeweben auftreten. Keimbahnmutationen können in jedem Gewebe auftreten und sind vererbt. Mutationen in und außerhalb der kodierenden Region können ebenfalls die Menge an produziertem TS10q23.3 beeinflussen, sowohl durch Veränderung der Transkription des Gens oder durch Destabilisierung oder anderweitige Veränderung der Prozessierung des Transkripts (mRNA) oder des Proteins.
Eine Zelle unternimmt einen Schritt in Richtung einer onkogenen Transformation, wenn ein Allel eines Tumorsuppressorgens aufgrund der Vererbung einer Keimbahnläsion oder Akquisition einer somatischen Mutation inaktiviert wird. Die Inaktivierung des anderen Allels des Gens umfasst in der Regel eine somatische Mikromutation oder eine chromosomale Alleldeletion, die zu einem Verlust der Heterozygosität (LOH) führt. Alternativ können beide Kopien eines Tumorsuppressorgens durch homozygote Deletion verloren gehen.
Die ersten Schritte der Erfinder zur Identifizierung neuer Mutationen in TS10q23.3 waren, Primärtumoren und Tumorzelllinien (TZL) hinsichtlich eines Heterozygositätsverlustes (LOH) innerhalb dieser Region von 10q23 zu analysieren. Präparate von Primärtumoren und TZL wurden anhand von polymorphen kurzen Tandem-Sequenzwiederholungen (Short Tandem Repeats) auf Chromosom 10 in der Nähe des TS10q23.3-Locus untersucht (Tabelle 6). In dieser Reihe von Proben beobachteten die Erfinder einen Heterozygositätsverlust (LOH) in Präparaten von Primärtumoren mit Häufigkeiten zwischen 20% in Colonpräparaten bis zu 75% in Glioblastoma multiforme-Präparaten (GBM), bei einer LOH-Gesamthäufigkeit von ~49%. Für TZL mit einer Stichprobengrößen über neun variierte die Inzidenz eines Heterozygositätsverlustes (LOH) zwischen 28% (Colon) bis 82% (GBM) bei einer Gesamthäufigkeit von ~46%.
In Primärtumoren, die einen Heterozygositätsverlust (LOH) in der Umgebung des TS10q23.3-Locus aufwiesen, entdeckten die Erfinder eine Frameshift-Mutation bei Brustkarzinom, eine Nonsense-Mutation bei pädiatrischem GBM, eine Splice-Variante bei pädiatrischem GBM und eine Missense-Variante bei Melanom (Tabelle 7). Die Erfinder untersuchten auch TZL mit Heterozygositätsverlust (LOH) und identifizierten zehn homozygote Deletionen, die die kodierenden Regionen von TS10q23.3 beeinflussten (13A und 13B). Die homozygoten Deletionen waren in TZL von Astrozytomen, Blasenkarzinom, Brustkarzinom, Glioblastom, Lungenkarzinom, Melanom und Prostatakarzinom vorhanden. Während zwei der Zelllinien alle neun TS10q23.3-Exons verloren hatten, waren bei den anderen acht TZL unterschiedliche kodierende Abschnitte des Gens homozygot deletiert. Analyse der verbleibenden TZL ergab eine Frameshift-, eine Nonsense- und sieben nicht konservative Missense-Varianten (Tabelle 7). Diese bestimmten Mutationen könnten das Ziel von Oligonukleotiden sein, die speziell konzipiert sind, um diese Mutationen zu identifizieren, oder von Antikörpern, die diese Marker von Wildtyp-TS10q23.3 unterscheiden.
Es wird in Betracht gezogen, dass gemäß der vorliegenden Erfindung andere Mutationen in dem TS10q23.3-Gen identifiziert werden können. In dieser Hinsicht wird eine Vielzahl verschiedener Assays in Betracht gezogen, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH; US-Patent 5.633.365 und US-Patent 5.665.549, jeweils hierin durch Bezugnahme enthalten), direkte DNA-Sequenzierung, PFGE-Analyse, Southern oder Northern Blotting, Einzelstrang-Konformationsanalyse (SSCA), RNase-Protektionsassay, allelspezifische Oligonukleotide (ASO), Dotblot-Analyse, denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese (z. B. US-Patent 5.190.856, hierin durch Bezugnahme enthalten), RFLP (z. B. US-Patent 5.324.631, hierin durch Bezugnahme enthalten) und PCR^TM-SSCP.
(i) Primer und Sonden
Der Begriff Primer, wie hierin verwendet, soll jede Nukleinsäure umfassen, die in der Lage ist, die Synthese einer entstehenden Nukleinsäure in einem Template (Muster)-abhängigen Vorgang zu starten (zu primen). Primer sind typischerweise Oligonukleotide mit einer Länge zwischen zehn und zwanzig Basenpaaren, aber es können auch längere Sequenzen verwendet werden. Primer können in Einzel- oder Doppelstrangform bereit gestellt sein, obgleich die Einzelstrangform bevorzugt ist. Sonden sind anders definiert, obgleich ihre Funktion auch die eines Primers sein kann. Sonden binden an die Ziel-DNA oder -RNA und müssen nicht in einem Amplifikationsverfahren verwendet werden, sind aber dennoch in der Lage, als Primer zu wirken.
In bevorzugten Ausführungsformen sind die Sonden oder Primer mit radioaktiven Arten (³²P, ¹⁴C, ³⁵S, ³H oder anderen Markern), mit einem Fluorophor (Rhodamin, Fluoreszein) oder einem chemilumineszierenden Marker (Luziferase) markiert.
(ii) Template (Muster)-abhängige Amplifizierungsverfahren
Es ist eine Reihe von Template (Muster)-abhängigen Verfahren verfügbar, um die in einer gegebenen Template (Muster)-Probe vorhandenen Markersequenzen zu amplifizieren. Eines der am besten bekannten Amplifizierungsverfahren ist die Polymerasekettenreaktion (als PCR^TM bezeichnet, die in US-Patent Nr. 4.683.185, 4.683,202 und 4.800.159 und in Innis et al., 1990, die hierin jeweils in Gänze durch Bezugnahme enthalten sind, ausführlich beschrieben ist.
Kurz beschrieben, werden bei der PCR^TM zwei Primersequenzen hergestellt, die zu Regionen auf gegenüber liegenden komplementären Strängen der Markersequenz komplementär sind. Zu einer Reaktionsmischung werden Desoxynukleosidtriphosphate im Überschuss zugegeben, sowie eine DNA-Polymerase, z. B. Taq-Polymerase. Wenn die Markersequenz in einer Probe vorhanden ist, binden die Primer an den Marker und die Polymerase bewirkt anschließend die Verlängerung der Primer entlang der Markersequenz durch Hinzufügen von Nukleotiden. Indem die Temperatur der Reaktionsmischung erhöht und gesenkt wird, lösen sich die verlängerten Primer von dem Marker ab, um Reaktionsprodukte zu bilden. Überschüssige Primer binden an den Marker und an die Reaktionsprodukte, und der Vorgang wird wiederholt.
Zur Quantifizierung der Menge an amplifizierter mRNA kann ein Reverse-Transkriptase-PCR^TM-Amplifikationsverfahren durchgeführt werden. Verfahren der reversen Transkription von RNA in cDNA sind gut bekannt und in Sambrook et al., 1989 beschrieben. Alternative Verfahren für eine reverse Transkription verwenden thermostabile RNA-abhängige DNA-Polymerase. Diese Verfahren sind in WO 90/07641 beschrieben, das am 21.Dezember 1990 beantragt wurde. Verfahren der Polymerasekettenreaktion sind aus dem Stand der Technik gut bekannt.
Ein weiteres Verfahren für die Amplifizierung ist die Ligasekettenreaktion („LCR"), die in EPO Nr. 320 308 offenbart ist, das hierin in Gänze durch Bezugnahme enthalten ist. Bei der LCR werden zwei komplementäre Sondenpaare hergestellt, und in Gegenwart der Zielsequenz bindet jedes Paar derart an gegenüber liegende komplementäre Stränge des Ziels, dass sie anliegen. In Gegenwart einer Ligase werden die beiden Sondenpaare verknüpft, um eine einzelne Einheit zu bilden. Durch Temperaturzyklen wie bei der PCR^TM lösen sich die gebunden, ligierten Einheiten vom Ziel und dienen dann als „Zielsequenzen" für die Ligation überschüssiger Sondenpaare. US-Patent Nr. 4.883.750 beschreibt ein Verfahren zum Binden von Sondenpaaren an eine Zielsequenz, das der LCR gleicht.
Qbeta-Replikase, beschrieben in PCT-Anmeldung Nr. PCT/US87/00880, kann ebenfalls als weiteres Amplifikationsverfahren in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. In diesem Verfahren wird eine replikative Sequenz einer RNA, die eine Region aufweist, welche komplementär zu der eines Ziel ist, in Gegenwart einer RNA-Polymerase zu einer Probe gegeben. Die Polymerase kopiert die replikative Sequenz, die anschließend nachgewiesen werden kann.
Zur Amplifizierung von Nukleinsäuren in der vorliegenden Erfindung eignet sich auch ein isothermisches Amplifikationsverfahren, bei dem Restriktionsendonukleasen und Ligasen verwendet werden, um die Amplifizierung von Zielmolekülen zu erreichen, die Nukleotid-5'-[alpha-thio]-Triphosphate in einem Strang einer Restriktionsschnittstelle enthalten (Walker et al., 1992a). SDA (Strand Displacement Amplification) ist ein weiteres Verfahren zum Durchführen einer isothermischen Amplifizierung von Nukleinsäuren, das mehrere Zyklen einer Strangablösung und -synthese, d. h. Nick-Translation, enthält. Siehe US-Patent 5.270.184 und 5.455.166 und Walker et al. (1992b) hinsichtlich des SDA-Verfahrens und Spargo et al., (1996) hinsichtlich des thermophilen SDA-Verfahrens.
Das RCR-Verfahren (Repair Chain Reaction) umfasst das Anheften mehrerer Sonden im Verlauf einer Region, die amplifiziert werden soll, gefolgt von einer Reparaturreaktion, in der nur zwei der vier Basen vorhanden sind. Die anderen beiden Basen können als biotinylierte Derivate zugegeben werden, um den Nachweis zu erleichtert. Beim SDA-Verfahren wird eine ähnliche Strategie eingeschlagen. Zielspezifische Sequenzen können auch anhand einer zyklischen Sondenreaktion (Cyclic Probe Reaction, CPR) nachgewiesen werden. Beim CPR-Verfahren wird eine Sonde, die 3'- und 5'-Sequenzen unspezifischer DNA und eine Mittelsequenz spezifischer RNA enthält, an in einer Probe vorhandene DNA hybridisiert. Nach der Hybridisierung wird die Reaktion mit RNase H behandelt und die Produkte der Sonde als distinkte Produkte identifiziert, die nach dem Verdau freigesetzt werden. Das Originaltemplate (das Originalmuster) wird an eine andere Sonde des Zyklus angeheftet und die Reaktion wird wiederholt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können noch andere Amplifizierungsverfahren verwendet werden, die in der GB-Anmeldung Nr. 2 202 328 und in der PCT-Anmeldung Nr. PCT/US89/01025 beschrieben sind, von denen jede hierin in Gänze durch Bezugnahme enthalten ist. In ersterer Anmeldung werden „modifizierte" Primer in einer PCR^TM-ähnlichen, Template (Muster)- und enzymabhängigen Synthese verwendet. Die Primer können „durch Markieren mit einer Capture-Einheit (z. B. Biotin) und/oder einer Detektoreinheit (z. B. Enzym) modifiziert sein. In letzterer Anmeldung werden markierte Sonden im Überschuss zu einer Probe gegeben. In Gegenwart der Zielsequenz bindet die Sonde und wird katalytisch gespalten. Nach dem Spalten wird die Zielsequenz intakt freigesetzt, um von überschüssiger Sonde gebunden zu werden. Die Spaltung der markierten Sonde signalisiert das Vorhandensein der Zielsequenz.
Weitere Nukleinsäure-Amplifizierungsverfahren umfassen transkriptionsbasierte Amplifizierungssysteme (TAS), einschließlich nukleinsäuresequenzbasierte Amplifizierung (NASBA) und 3SR (Kwoh et al., 1989; Gingeras et al., PCT-Anmeldung WO 88/10315, hierin in Gänze durch Bezugnahme enthalten). Siehe auch US-Patent 5.409.818, Fahy et al., (1991) und Compton (1991) hinsichtlich 3SR-Verfahren und NASBA-Verfahren. Bei NASBA-Verfahren können die Nukleinsäuren durch Phenol/Chloroform-Standardextraktion, Hitzedenaturierung einer klinischen Probe, Behandlung mit Lysepuffer und Minispin-Säulen zur Isolierung von DNA und RNA oder Guanidiniumchloridextraktion von RNA für die Amplifizierung vorbereitet werden. Diese Amplifizierungstechniken umfassen die Anheftung eines Primers mit zielspezifischen Sequenzen. Nach der Polymerisierung werden DNA/RNA-Hybride mit RNase H verdaut, während doppelsträngige DNA-Moleküle erneut hitzedenaturiert werden. In jedem Fall wird aus der einzelsträngigen DNA durch Addition des zweiten zielspezifischen Primers, gefolgt von Polymerisierung, ein vollständiger Doppelstrang. Die doppelsträngigen DNA-Moleküle werden dann von einer RNA-Polymerase wie T7 oder SP6 multiplikativ transkribiert. In einer isothermischen zyklischen Reaktion werden die RNAs in einzelsträngige DNA revers transkribiert, welche dann in doppelsträngige DNA umgewandelt wird und dann noch einmal mit einer RNA-Polymerase wie T7 oder SP6 transkribiert wird. Die resultierenden Produkte, verkürzt oder vollständig, zeigen zielspezifische Sequenzen an.
Davy et al., EPO Nr. 329/822 (hierin Gänze durch Bezugnahme enthalten) offenbaren ein Nukleinsäureamplifizierungsverfahren, das das zyklische Synthetisieren einsträngiger RNA („ssRNA"), ssDNA und doppelsträngiger DNA („dsDNA") umfasst, welche gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Die ssRNA ist ein Template (Muster) für ein erstes Primeroligonukleotid, das durch eine Reverse Transkriptase (RNA-abhängige DNA-Polymerase) verlängert wird. Die RNA wird anschließend aus dem resultierenden DNA:RNA-Duplex durch die Wirkung von Ribonuklease H (RNase H, eine RNase mit Spezifität für RNA als Duplex mit DNA oder RNA) entfernt. Die resultierende ssDNA ist ein Template (Muster) für einen zweiten Primer, der 5' zu seiner zum Template (Muster) homologen Sequenz außerdem die Sequenzen eines RNA-Polymerase-Promotors (als Beispiel T7-RNA-Polymerase) enthält. Dieser Primer wird dann von der DNA-Polymerase (als Beispiel das große „Klenow"-Fragment der DNA-Polymerase I von E.coli) verlängert, woraus ein doppelsträngiges DNA-Molekül („sdDNA") mit einer Sequenz resultiert, die identisch zu der der ursprünglichen RNA zwischen den Primern ist und an einem Ende außerdem eine Promotorsequenz aufweist. Diese Promotorsequenz kann von der geeigneten RNA-Polymerase verwendet werden, um viele RNA-Kopien der DNA herzustellen. Diese Kopien können dann wieder in den Zyklus eintreten, was zu einer sehr schnellen Amplifizierung führt. Bei geeigneter Wahl der Enzyme kann diese Amplifizierung isotherm durchgeführt werden, ohne dass in jedem Zyklus Enzyme zugegeben werden müssen. Aufgrund der zyklischen Natur dieses Vorgangs kann die Startsequenz wahlweise die Form einer DNA oder RNA aufweisen.
Miller et al., PCT-Anmeldung WO 89/06700 (hierin in Gänze durch Bezugnahme enthalten) offenbaren ein Nukleinsäuresequenzampilfizierungsschema auf der Basis der Hybridisierung einer Promotor/Primer-Sequenz mit einer einzelsträngigen Ziel-DNA („ssDNA"), gefolgt von Transkription vieler RNA-Kopien der Sequenz. Dieses Schema ist nicht zyklisch, d. h. neue Templates (Muster) werden nicht aus den resultierenden RNA-Transkripten hergestellt. Weitere Amplifizierungsverfahren umfassen „RACE" und „einseitige PCT^TM" (Frohman, 1990; Ohara et al., 1989, jeweils hierin in Gänze durch Bezugnahme enthalten).
In dem Amplifizierungsschritt der vorliegenden Erfindung können auch Verfahren verwendet werden, die auf einer Ligation von zwei (oder mehreren) Oligonukleotiden in Gegenwart von Nukleinsäure mit der Sequenz des resultierenden „Di-Oligonukleotids" beruhen, wodurch das Di-Oligonukleotid amplifiziert wird (Wu et al., 1989; hierin in Gänze durch Bezugnahme enthalten).
(iii) Southern/Northern Blotting
Blottingtechniken sind einem Fachmann gut bekannt. Southern Blotting umfasst die Verwendung von DNA als Ziel, während beim Northern Blotting RNA als ein Ziel verwendet wird. Jedes Verfahren liefert unterschiedliche Arten von Information, obgleich das cDNA-Blotting in vielerlei Hinsicht zum Blotting von RNA-Arten analog ist.
Kurz beschrieben wird eine Sonde verwendet, um an DNA oder RNA-Arten spezifisch zu binden, die auf einer geeigneten Matrix, häufig ein Nitrozellulosefilter immobilisiert sind. Die unterschiedlichen Arten sollten räumlich getrennt sein, um eine Analyse zu erleichtern. Dies wird häufig durch Gelelektrophorese von Nukleinsäurearten, gefolgt vom „Blotting" auf den Filter, erreicht.
Anschließend wird das geblottete Zielmolekül mit einer Sonde (üblicherweise markiert) unter Bedingungen inkubiert, die eine Denaturierung und Rehybridisierung fördern. Da die Sonde Basenpaarungen mit dem Ziel bilden kann, bindet sie unter Renaturierungsbedingungen einen Abschnitt der Zielsequenz. Anschließend wird ungebundene Sonde entfernt und der Nachweis wie oben beschrieben durchgeführt.
(iv) Trennverfahren
In dem einen oder anderen Stadium ist es normalerweise wünschenswert, das Amplifikationsprodukt vom Template (Muster) und dem überschüssigen Primer zu trennen um zu bestimmen, ob eine spezifische Amplifikation stattgefunden hat. In einer Ausführungsform werden Amplifikationsprodukte durch Agarose-, Agaroseacrylamid- oder Polyacrylamidgelelektrophorese mittels Standardverfahren getrennt. Siehe Sambrook et al., 1989.
Alternativ können zur Durchführung einer Trennung chromatographische Techniken angewandt werden. Es gibt viele Chromatographiearten, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können: Adsorption, Partition, Ionenaustausch und Molekularsieb, und viele spezialisierte Techniken zu deren Anwendung, darunter Säulen-, Papier-, Dünnschicht- und Gaschromatographie (Freifelder, 1982).
(v) Nachweisverfahren
Zur Bestätigung der Amplifikation der Markersequenzen können Produkte visualisiert werden. Ein typisches Visualisierungsverfahren umfasst das Färben eines Gels mit Ethidiumbromid und Visualisierung unter UV-Licht. Wenn die Amplifizierungsprodukte integral mit radioaktiv oder fluorometrisch markierten Nukleotiden markiert sind, können die Amplifizierungsprodukte nach der Trennung alternativ einem Röntgenfilm ausgesetzt oder im geeigneten anregenden Spektrum visualisiert werden.
In einer Ausführungsform wird die Visualisierung indirekt erreicht. Nach der Auftrennung von Amplifizierungsprodukten wird eine markierte Nukleinsäuresonde in Kontakt mit der amplifizierten Markersequenz gebracht. Die Sonde ist vorzugsweise mit einem Chromophor konjugiert, kann aber auch radioaktiv markiert sein. In einer anderen Ausführungsform ist die Sonde mit einem Bindungspartner konjugiert, beispielsweise einem Antikörper oder Biotin und der andere Partner des Bindungspaars trägt eine nachweisbare Einheit.
In einer Ausführungsform erfolgt der Nachweis durch eine markierte Sonde. Die diesbezüglichen Techniken sind einem Fachmann gut bekannt und sind in vielen Standardbüchern über molekulare Protokolle enthalten. Siehe Sambrook et al., 1989.
Beispielsweise identifizieren ein Chromophor oder radioaktiv markierte Sonden oder Primer das Ziel während oder nach der Amplifizierung.
Ein Beispiel für das Vorangehende ist in US-Patent Nr. 5.279.721 beschrieben, das hierin durch Bezugnahme enthalten ist, welches einen Apparat und ein Verfahren für automatisierte Elektrophorese und Transfer von Nukleinsäuren offenbart. Der Apparat erlaubt Elektrophorese und Blotting ohne externe Manipulation des Gels und eignet sich ideal, um Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung durchzuführen.
Die oben beschriebenen Amplifizierungsprodukte können darüber hinaus einer Sequenzanalyse anhand von Sequenzanalyse-Standardtechniken unterzogen werden, um spezielle Arten von Variationen zu identifizieren. Mithilfe bestimmter Verfahren wird eine erschöpfende Analyse von Genen mittels Sequenzanalyse durchgeführt, bei der Primersätze verwendet werden, die für eine optimale Sequenzierung konzipiert sind (Pignon et al., 1994). Die vorliegende Erfindung sieht Verfahren vor, durch die beliebige oder alle dieser Analysearten angewandt werden können. Unter Verwendung der hierin offenbarten Sequenzen können Oligonukleotidprimer konzipiert werden, um die Amplifizierung von Sequenzen im gesamten TS10q23.3-Gen zu ermöglichen, das dann durch direkte Sequenzierung analysiert werden kann.
(vi) Kitbestandteile
Alle wichtigen Materialien und Reagenzien, die für Nachweis und Sequenzierung von TS10q23.3 und von Varianten davon benötigt werden, können gemeinsam in einem Kit zusammengestellt werden. Dieses umfasst im Allgemeinen im Voraus ausgewählte Primer und Sonden. Es können auch Enzyme enthalten sein, die zur Amplifizierung von Nukleinsäuren geeignet sind, einschließlich verschiedener Polymerasen (RT, Taq, Sequenase ^TM, etc.), Desoxynukleotide und Puffer, um die notwendige Reaktionsmischung für eine Amplifizierung bereit zu stellen. Solche Kits umfassen im Allgemeinen und in geeigneten Mitteln getrennte Behälter für jedes einzelne Reagens und Enzym sowie für jeden Primer oder für jede Sonde.
(vii) Design und theoretische Gesichtspunkte der relativen quantitativen RT-PCR^TM
Reverse Transkription (RT) von RNA zu cDNA, gefolgt von relativer quantitativer PCR^TM (RT-PCR^TM) lässt sich verwenden, um die relativen Konzentrationen spezifischer, aus Patienten isolierter mRNA-Arten zu bestimmen. Indem bestimmt wird, dass die Konzentration einer spezifischen mRNA-Art variiert, wird gezeigt, dass das Gen, welches die spezifische mRNA kodiert, differenziell exprimiert wird.
Bei der PCR^TM erhöht sich die Anzahl an Molekülen der amplifizierten Ziel-DNA mit jedem Reaktionszyklus um einen Faktor von nahezu zwei, bis einige Reagenzien limitierend werden. Danach geht die Amplifikationsrate immer mehr zurück, bis keine Erhöhung des amplifizierten Ziels zwischen den Zyklen mehr stattfindet. Wenn ein Schaubild aufgezeichnet wird, in dem die Zyklusnummer auf der X-Achse und der Logarithmus der Konzentration der amplifizierten Ziel-DNA auf der Y-Achse aufgetragen sind, bildet sich bei Verbinden der aufgetragenen Punkte eine Kurve mit charakteristischer Form. Beginnend mit dem ersten Zyklus ist die Steigung der Kurve positiv und konstant. Dies gilt als linearer Abschnitt der Kurve. Nachdem ein Reagens limitierend wird, beginnt die Steigung der Kurve abzunehmen und wird schließlich null. An diesem Punkt nähert sich die Konzentration der amplifizierten Ziel-DNA asymptotisch einem festen Wert an. Dies gilt als Plateau-Abschnitt der Kurve.
Die Konzentration der Ziel-DNA im linearen Abschnitt der PCR^TM-Amplifizierung ist direkt proportional zu der Startkonzentration der Ziel-DNA vor Reaktionsbeginn. Indem die Konzentration der amplifizierten Produkte der Ziel-DNA in PCR^TM-Reaktionen, welche dieselbe Anzahl von Zyklen abgeschlossen haben und sich in ihren linearen Bereichen befinden, bestimmt wird, ist es möglich, die relativen Konzentrationen der spezifischen Ziel-Sequenz in der ursprünglichen DNA-Mischung zu bestimmen. Wenn es sich bei den DNA-Mischungen um cDNAs handelt, die aus RNAs synthetisiert worden sind, die aus unterschiedlichen Geweben oder Zellen isoliert wurden, kann für die jeweiligen Gewebe oder Zellen die relative Häufigkeit der spezifischen mRNA, von der die Zielsequenz abstammt, bestimmt werden. Diese direkte Proportionalität zwischen der Konzentration der PCR^TM-Produkte und den relativen mRNA-Häufigkeiten tritt nur im linearen Bereich der PCR^TM-Reaktion auf.
Die Endkonzentration der Ziel-DNA im Plateau-Abschnitt der Kurve wird durch die Verfügbarkeit von Reagenzien in der Reaktionsmischung bestimmt und ist unabhängig von der ursprünglichen Konzentration an Ziel-DNA. Die erste Bedingung, die erfüllt sein muss, bevor die relativen Häufigkeiten einer mRNA-Art für eine Sammlung von RNA-Populationen durch RT-PCR^TM bestimmt werden kann, ist, dass die Konzentrationen der amplifizierten PCR^TM-Produkte geprüft werden müssen, wenn die PCR^TM-Reaktionen sich im linearen Abschnitt ihrer Kurven befinden.
Die zweite Bedingung, die erfüllt sein muss, damit in einem RT-PCR^TM-Experiment die relativen Häufigkeiten einer bestimmten mRNA-Art erfolgreich bestimmt werden kann, ist, dass relative Konzentrationen der amplifizierbaren cDNAs gegenüber einem unabhängigen Standard normalisiert werden müssen. Das Ziel eines RT-PCR^TM-Experimentes ist es, die Häufigkeit einer bestimmten mRNA-Art relativ zu der mittleren Häufigkeit aller in der Probe vorhandenen mRNA-Arten zu bestimmen. In den unten beschriebenen Experimenten wurden mRNAs für β-Aktin, Asparaginsynthetase und Lipocortin II als externe und interne Standards verwendet, mit denen die relative Häufigkeit anderer mRNAs verglichen werden.
Die meisten Protokolle für kompetitive PCR^TM verwenden interne PCR^TM-Standards, die ungefähr genauso häufig sind wie das Zielmolekül. Diese Strategien sind effektiv, wenn die Produkte der PCR^TM-Amplifizierungen während ihrer linearen Phasen geprüft werden. Werden die Produkte geprüft, wenn die Reaktionen in die Nähe der Plateau-Phase kommen, ist das weniger häufige Produkt relativ überrepräsentiert. Vergleiche relativer Häufigkeiten vieler verschiedener RNA-Proben, wie es beispielsweise bei der Untersuchung von RNA-Proben auf differenzielle Expression der Fall ist, werden so verzerrt, dass Unterschiede der relativen Häufigkeiten von RNAs geringer erscheinen, als sie tatsächlich sind. Dies ist kein signifikantes Problem, wenn der interne Standard viel häufiger ist als das Ziel. Wenn der interne Standard häufiger ist als das Ziel, kann zwischen RNA-Proben ein direkter linearer Vergleich vorgenommen werden.
Die obige Erläuterung beschreibt theoretische Gesichtspunkte eines RT-PCR^TM-Assays für Materialien klinischer Herkunft. Die Probleme, die mit klinischen Proben einhergehen, sind, dass sie von variabler Menge (was eine Normalisierung problematisch macht) und von variabler Qualität sind (was die Co-Amplifizierung einer zuverlässigen internen Kontrolle erforderlich macht, die vorzugsweise größer ist als das Ziel). Diese beiden Probleme werden überwunden, wenn die RT-PCR^TM als eine relative quantitative RT-PCR^TM mit einem internen Standard durchgeführt wird, bei welcher der interne Standard ein amplifizierbares cDNA-Fragment ist, das größer als das cDNA-Zielfragment ist, und bei der die Häufigkeit der mRNA, die für den internen Standard kodiert, ungefähr 5-100-fach größer ist als die der mRNA, die für das Ziel kodiert. Dieser Assay misst relative Häufigkeiten, keine absoluten Häufigkeiten der jeweiligen mRNA-Arten.
Es können andere Studien durchgeführt werden, in denen ein konventionellerer relativ quantitativer RT-PCR^TM-Assay mit einem externen Standard angewandt wird. Diese Assays prüfen die PCR^TM-Produkte im linearen Abschnitt ihrer Amplifizierungskurven. Die Anzahl an PCR^TM-Zyklen, die für die Prüfung optimal sind, muss für jedes cDNA-Zielfragment empirisch bestimmt werden. Darüber hinaus müssen die Reverse-Transkriptase-Produkte jeder RNA-Population, die aus den verschiedenen Gewebeproben isoliert worden ist, sorgfältig auf gleiche Konzentrationen amplifizierbarer cDNAs normalisiert werden. Dieser Gesichtspunkt ist sehr wichtig, da der Assay absolute mRNA-Häufigkeit misst. Absolute mRNA-Häufigkeit kann nur in normalisierten Proben als Maß einer differenziellen Genexpression herangezogen werden. Während eine empirische Bestimmung des linearen Bereichs der Amplifizierungskurve und eine Normalisierung von cDNA-Präparationen mühevolle und zeitaufwändige Vorgänge sind, sind die resultierenden RT-PCR^TM-Assays unter Umständen solchen, die vom relativen quantitativen RT-PCR^TM-Assay mit einem internen Standard abgeleitet sind, überlegen sein.
Ein Grund für diesen Vorteil ist, dass ohne den internen Standard/Kompetitor alle Reagenzien im linearen Bereich der Amplifizierungskurve in ein einzelnes PCR^TM-Produkt umgewandelt werden können, was die Empfindlichkeit des Assays erhöht. Ein anderer Grund ist, dass bei nur einem PCR^TM-Produkt die Darstellung des Produktes in einem Elektrophoresegel oder einem anderen Anzeigeverfahren weniger komplex wird, weniger Hintergrund aufweist und einfacher zu interpretieren ist.
(viii) Chip-Technologien
Von den vorliegenden Erfindern werden chipbasierte DNA-Technologien wie die von Hacia et al., (1996) und Shoemaker et al., (1996) beschriebenen spezifisch in Betracht gezogen Kurz beschrieben, umfassen diese Techniken quantitative Verfahren für das schnelle und genaue Analysieren einer großen Anzahl von Genen. Indem Gene mit Oligonukleotiden markiert oder feste Sondenanordnungen verwendet werden, lässt sich die Chip-Technologie anwenden, um Zielmoleküle als hochdichte Anordnungen zu isolieren und diese Moleküle auf der Basis von Hybridisierung zu testen. Siehe auch Pease et al., (1994), Fodor et al., (1991).
B. Immundiagnose
Antikörper der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um den TS10q23.3-Gehalt gesunder und erkrankter Gewebe durch Techniken wie ELISA-Verfahren und Western Blotting zu charakterisieren. Dies könnte sich als Prüftest für das Vorliegen oder Nichtvorliegen einer Malignität oder als Prädiktor einer zukünftigen Krebserkrankung erweisen.
Es wird die Verwendung von Antikörpern der vorliegenden Erfindung in einem ELISA-Assay in Betracht gezogen. Beispielsweise sind die Anti-TS10q23.3-Antikörper auf einer ausgewählten Fläche immobilisiert, vorzugsweise auf einer Fläche, die eine Proteinaffinität aufweist, wie beispielsweise die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte aus Polystyrol. Nachdem gewaschen wird, um unvollständig adsorbiertes Material zu entfernen, ist es wünschenswert, ein unspezifisches Protein an die Assayplatte zu binden oder die Assayplatte mit einem unspezifischen Protein zu beschichten, von dem bekannt ist, dass es im Hinblick auf die Testantiseren neutral ist, beispielsweise Rinderserumalbumin (BSA), Casein oder Trockenmilchlösungen. Dies erlaubt eine Blockierung unspezifischer Adsorptionsstellen auf der immobilisierenden Fläche und reduziert so den Hintergrund, der durch unspezifische Bindung von Antigen an die Fläche hervorgerufen wird.
Nach dem Binden von Antikörper an die Vertiefung, Beschichten mit einem nicht-reaktiven Material zur Reduzierung von Hintergrund und Waschen zum Entfernen ungebundenen Materials wird die immobilisierende Fläche mit der zu testenden Probe so in Kontakt gebracht, das sich Immunkomplexe (Antigen/Antikörper) bilden können.
Nach der Bildung spezifischer Immunkomplexe zwischen der Testprobe und dem gebundenen Antikörper und anschließendem Waschen kann das Vorkommen und selbst die Menge der gebildeten Immunkomplexe bestimmt werden, indem dieselben einem zweiten Antikörper mit Spezifität für TS10q23.3 ausgesetzt werden, der sich vom ersten Antikörper unterscheidet. Geeignete Bedingungen umfassen vorzugsweise das Verdünnen der Probe mit Verdünnungsmitteln wie BSA, bovinem Gammaglobulin (BGG) und phosphatgepufferter Salzlösung (PBS)/Tween^®. Diese zugegebenen Mittel unterstützen außerdem die Reduzierung des Hintergrunds. Die Antiserumschicht kann anschließend etwa 2 bis 4 Stunden inkubieren, bei Temperaturen, die vorzugsweise im Berech von etwa 25° bis etwa 27° C liegen. Nach der Inkubation wird die mit Antiserum kontaktierte Fläche gewaschen, um Material zu entfernen, das keine Immunkomplexe gebildet hat. Ein bevorzugtes Waschverfahren umfasst das Waschen mit einer Lösung wie PBS/Tween^® oder Boratpuffer.
Zur Bereitstellung eines Nachweismittels weist der sekundäre Antikörper vorzugsweise ein mit ihm verknüpftes Enzym auf, das bei Inkubation mit einem geeigneten chromogenen Substrat eine Farbentwicklung erzeugt. Es könnte beispielsweise erwünscht sein, die an den zweiten Antikörper gebundene Fläche eine Zeit lang und unter Bedingungen, welche die Entwicklung der Bildung von Immunkomplexen begünstigen, mit einem Unease- oder Peroxidase-konjugierten Anti-Human-IgG zu inkubieren (z. B. Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur in einer PBS-haltigen Lösung wie beispielsweise PBS/Tween^®).
Nach der Inkubation mit dem zweiten enzymmarkierten Antikörper und nach dem Waschen zum Entfernen von ungebundenem Material wird die Menge des Markers durch Inkubation mit einem chromogenen Substrat wie Harnstoff und Bromkresolviolett oder 2,2'-Azino-di-(3-ethyl-benzthiazolin)-sulfonsäure (ABTS) und H₂O₂ quantifiziert, wenn der Enzymmarker Peroxidase ist. Eine Quantifizierung wird anschließend erreicht, indem der Grad der Farbstoffbildung gemessen wird, z. B. indem ein Spektrophotometer mit Licht im sichtbaren Spektrum verwendet wird.
Das vorhergehende Format kann geändert werden, indem zuerst die Probe an die Assayplatte gebunden wird. Anschließend wird der Primärantikörper mit der Assayplatte inkubiert, gefolgt vom Nachweis gebundenen Primärantikörpers durch Verwendung eines markierten Sekundärantikörpers mit Spezifität für den Primärantikörper.
In der wissenschaftlichen Literatur sind die Schritte verschiedener anderer geeigneter Immunnachweisverfahren beschrieben worden, beispielsweise in Nakamura et al., (1987; hierin durch Bezugnahme enthalten). Im einfachsten und direktesten Sinn sind Immunassays Bindungsassays. Bestimmte bevorzugte Immunassays sind die verschiedenen Arten von RAdioimmunassays (RIA) und Immunobead-Capture-Assays. Besonders geeignet ist auch der immunhistochemische Nachweis anhand von Gewebeschnitten. Anerkannterweise ist der Nachweis jedoch nicht auf solche Techniken beschränkt, und Western Blotting, Dot Blotting, FACS-Analyse und dergleichen können in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Die Antikörperzusammensetzung der vorliegenden Erfindung findet umfassende Verwendung bei der Immunblotanalyse oder Western-Blot-Analyse. Die Antikörper können als hoch affine Primäneagenzien zur Identifizierung von Proteinen verwendet werden, die auf einer festen Trägermatrix immobilisiert sind, beispielsweise auf Nitrozellulose, Nylon oder Kombinationen davon. In Verbindung mit einer Immunpräzipitation, gefolgt von einer Gelelektrophorese, können sie als Einzelschrittreagenzien zur Anwendung beim Nachweis von Antigenen eingesetzt werden, gegen die beim Nachweis des Antigens verwendete Sekundärreagenzien einen unerwünschten Hintergrund verursachen. Zu den auf immunologischen Prinzipien basierenden Nachweismethoden zum Gebrauch in Verbindung mit Western Blotting gehören enzymatisch, radioaktiv oder fluoreszent markierte Sekundärantikörper gegen die Toxinhälfte gelten in dieser Hinsicht als von besonderem Nutzen. US-Patente, welche die Verwendung solcher Marker betreffen, umfassen 3.817.837, 3.850.752, 3.939.350, 3.996.345, 4.277.437, 4.275.149 und 4.366.241, die alle hierin durch Bezugnahme enthalten sind. Selbstverständlich können sich durch den Gebrauch eines sekundären Bindungsliganden wie beispielsweise einem Sekundärantikörper oder einer Biotin/Avidin-Ligandenbindungsanordnung, wie aus dem Stand der Technik bekannt ist, weitere Vorteile ergeben.
V. Verfahren zur Testung aktiver Verbindungen
Die vorliegende Erfindung zieht ferner die Verwendung von TS10q23.3 und aktiver Fragmente und von dafür kodierenden Nukleinsäuren bei der Testung von Verbindungen hinsichtlich einer Aktivität bei der Stimulierung der Aktivität von TS10q23.3, bei der Aufhebung des Mangels an TS10q23.3 oder bei der Blockierung der Wirkung eines mutanten TS10q23.3-Moleküls in Erwägung. Diese Assays können viele verschiedene Formate anwenden und können auf der Art von „Aktivität" beruhen, für welche der Test durchgeführt wird. In Betracht gezogene funktionelle „Ausgabeformen" umfassen das Binden an eine Verbindung, das Hemmen der Bindung an ein Substrat, einen Liganden oder einen anderen Bindungspartner durch eine Verbindung, Phosphataseaktivität, Anti-Phosphatase-Aktivität, Phosphorylierung von TS10q23.3, Dephosphorylierung von TS10q23.3, Hemmung oder Stimulation der Signalweiterleitung von Zelle zu Zelle, Wachstum, Metastasierung, Zellteilung, Zellmigration, Koloniebildung in Weichagar, Kontakthemmung, Invasivität, Angiogenese, Apoptose, Tumorprogression oder andere maligne Phänotypen.
Das Polypeptid der Erfindung kann auch zum Testen von Verbindungen verwendet werden, die als ein Ergebnis einer Technologie unter Verwendung einer kombinatorischen Bibliothek entwickelt worden sind. Die Technologie unter Verwendung einer kombinatorischen Bibliothek bietet eine effiziente Möglichkeit der Testung einer potenziell großen Anzahl unterschiedlicher Substanzen hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Modulierung der Aktivität eines Polypeptids. Solche Bibliotheken und ihre Verwendung sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Verwendung von Peptidbibliotheken ist bevorzugt. Siehe beispielsweise SO97/02048.
Kurz beschrieben, kann ein Verfahren zum Testen auf eine Substanz, welche die Aktivität eines Polypeptids moduliert, das Inkontaktbringen einer oder mehrerer Testsubstanzen mit dem Polypeptid in einem geeigneten Reaktionsmedium, das Testen der Aktivität des behandelten Polypeptids und das Vergleichen dieser Aktivität mit der Aktivität des Polypeptids in einem vergleichbaren Reaktionsmedium, das nicht mit der Testsubstanz oder den Testsubstanzen behandelt worden ist, umfassen. Ein Unterschied der Aktivität zwischen den behandelten und unbehandelten Polypeptiden zeigt einen modulierenden Effekt der relevanten Testsubstanz oder der relevanten Testsubstanzen an.
Vor einer Testung hinsichtlich einer Modulierung der Aktivität oder zusätzlich zu einer solchen Testung können Testsubstanzen hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Wechselwirkung mit dem Polypeptid geprüft werden, z. B. in einem Hefe-Zwei-Hybrid-System (z. B. Bartel et al., 1993, Fields und Song, 1989), Chevray und Nathans, 1992, Lee et al., 1995). Dieses System kann als grobes Auswahlwerkzeug vor der Testung einer Substanz auf ihre eigentliche Fähigkeit zur Modulierung der Aktivität des Polypeptids verwendet werden. Alternativ könnte das System verwendet werden, um Testsubstanzen auf Bindung an einen spezifischen KVLQT1- oder KCNE1-Bindungspartner zu testen oder um Mimetika des KVLQT1- oder KCNE1-Polypeptids zu finden.
Nach der Identifizierung einer Substanz, welche die Polypeptidaktivität moduliert oder beeinflusst, kann die Substanz weiter untersucht werden. Des Weiteren kann sie hergestellt und/oder bei der Zubereitung, d. h. Herstellung oder Formulierung, oder einer Zusammensetzung wie beispielsweise eines Medikamentes, einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder eines Arzneimittels verwendet werden. Diese können an Individuen verabreicht werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft also in verschiedenen Aspekten nicht nur eine Substanz, die in Übereinstimmung mit dem hierein Offenbarten anhand eines Nukleinsäuremoleküls als Modulator einer Polypeptidaktivität identifiziert worden ist, sondern auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, ein Medikament, ein Arzneimittel oder eine andere Zusammensetzung, die eine solche Substanz umfasst, ein Verfahren, das die Verabreichung einer solchen Zusammensetzung, die eine solche Substanz umfasst, umfasst. ein Verfahren, das die Verabreichung einer solchen Zusammensetzung an einen Patienten umfasst, z. B. zur Behandlung (die auch eine präventive Behandlung einschließen kann) von LQT, die Verwendung einer solchen Substanz bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur Verabreichung, z. B. zur Behandlung von LQT, und ein Verfahren zum Herstellen einer pharmazeutischen Zusammensetzung umfassend das Mischen solch einer Substanz mit einem pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten, Vehikel oder Trägerstoff und wahlweise anderen Inhaltsstoffen.
A. In-Vitro-Assays
In einer Ausführungsform soll die Erfindung zum Testen von Verbindungen verwendet werden, die an das TS10q23.3-Molekül oder Fragmente davon bindet. Das Polypeptid oder Fragment kann entweder frei in Lösung, an einen Träger fixiert, in einer Zelle oder auf der Oberfläche einer Zelle exprimiert sein. Entweder das Polypeptid oder die Verbindung können markiert sein, was eine Feststellung der Bindung erlaubt.
In einer anderen Ausführungsform kann der Assay die Hemmung der Bindung von TS10q23.3 an ein natürliches oder künstliches Substrat oder an natürliche oder künstliche Bindungspartner messen. Es können kompetitive Bindungsassays durchgeführt werden, in denen eines der Mittel (TS10q23.3, Bindungspartner oder Verbindung) markiert ist. In der Regel ist das Polypeptid markiert. Mann kann die Menge an freiem Marker gegenüber der Menge an gebundenem Marker messen, um eine Bindung oder eine Hemmung der Bindung festzustellen.
Eine andere Technik zum Testung von Verbindungen mit hohem Durchsatz ist in WO 84/03564 beschrieben. Eine große Anzahl von kleinen Peptidtestverbindungen wird auf einem festen Substrat wie Kunststoffstiften oder einer anderen Fläche synthetisiert. Die Peptidtestverbindungen werden mit TS10q23.3 umgesetzt und gewaschen. Gebundenes Polypeptid wird anhand verschiedener Verfahren nachgewiesen.
Gereinigtes TS10q23.3 kann direkt auf Platten beschichtet werden, die in den zuvor erwähnten Arzneimittelprüftechniken verwendet werden. Nicht neutralisierende Antikörper gegen das Polypeptid können jedoch verwendet werden, um das Polypeptid an einer festen Phase zu immobilisieren. Außerdem können Fusionsproteine mit einer reaktiven Region (vorzugsweise einer terminalen Region) verwendet werden, um die aktive Region von TS10q23.3 mit einer Festphase zu verknüpfen.
Er können verschiedene Zelllinien mit Wildtyp oder natürlichen oder gentechnisch eingeführten Mutationen in TS10q23.3 verwendet werden, um verschiedene funktionelle Attribute von TS10q23.3 zu untersuchen und wie eine Kandidatenverbindung diese Attribute beeinflusst. Verfahren zum gentechnischen Einführen von Mutationen sind an anderer Stelle in diesem Dokument beschrieben, wie auch natürlich auftretende Mutationen in TS10q23.3, die zu Malignomen führen, zu Malignomen beitragen und/oder Malignome auf andere Art und Weise verursachen. In solchen Assays würde die Verbindung in Anbetracht ihrer biologischen Natur geeignet formuliert sein und mit einer Zielzelle in Kontakt gebracht. Je nach Assay kann eine Kultur erforderlich sein. Die Zelle kann anschließend mittels einer Reihe unterschiedlicher physiologischer Assays untersucht werden. Alternativ kann eine molekulare Analyse durchgeführt werden, in welcher die Funktion von TS10q23.3 oder verwandter Pfade untersucht werden kann. Dies kann Assays umfassen, wie beispielsweise solche zur Testung von Proteinexpression, Enzymfunktion, Substratnutzung, Phosphorylierungszustand verschiedener Moleküle, einschließlich TS10q23.3, cAMP-Mengen, mRNA-Expression (einschließlich differentielles Display oder Gesamt-RNA oder polyA-RNA) und Anderen.
B. In-Vivo-Assays
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung verschiedener Tiermodelle. Hier bietet die Identität zwischen humanem und murinem TS10q23.3 eine hervorragende Möglichkeit, die Funktion von TS10q23.3 in einem vollständigen Tiersystem zu untersuchen, in dem es normalerweise exprimiert wird. Es können durch Entwicklung oder Isolierung mutanter Zelllinien, die kein normales TS10q23.3 exprimieren können, Krebsmodelle in Mäusen erzeugt werden, die für Krebserkrankungen beim Menschen und anderen Säugetieren hoch prädiktiv sind. Diese Modelle können die orthotopische oder systemische Verabreichung von Tumorzellen anwenden, um primäre und/oder metastatische Krebserkrankungen nachzuahmen. Alternativ kann Krebs in Tieren ausgelöst werden, indem Mittel bereitgestellt werden, von denen bekannt ist, dass sie für bestimmte Ereignisse in Zusammenhang mit maligner Transformation und/oder Tumorprogression verantwortlich sind. Schließlich können transgene Tiere (unten erläutert), denen Wildtyp-TS10q23.3 fehlt, als Modelle für Krebsentwicklung und -behandlung verwendet werden.
Behandlung von Tieren mit Testverbindungen umfasst die Verabreichung der Verbindung in geeigneter Form an das Tier. Die Verabreichung kann auf jedem Weg erfolgen, der für klinische oder nicht klinische Zwecke genutzt werden kann, einschließlich, aber nicht ausschließlich, oral, nasal, bukkal, rektal, vaginal oder topisch. Alternativ kann die Verabreichung durch intratracheale Instillation, bronchiale Instillation, intradermale, subkutane, intramuskuläre, intraperitoneale oder intravenöse Injektion erfolgen. Speziell in Erwägung gezogen werden intravenöse Injektion, regionale Verabreichung über Blut- und Lymphversorgung und intratumorale Injektion.
Die Bestimmung der Wirksamkeit einer Verbindung in vivo kann viele verschiedene Kriterien einschließen. Solche Kriterien umfassen Überleben, Verminderung der Tumorlast oder Tumormasse, Stillstand oder Verlangsamung der Tumorprogression, Eliminierung von Tumoren, Inhibition oder Prävention von Metastasierung, erhöhter Aktivitätsgrad, Verbesserung der Immuneffektorfunktion und verbesserte Nahrungsaufnahme, sind aber nicht darauf beschränkt.
C. Rationales Wirkstoffdesign
Das Ziel des rationalen Wirkstoffdesigns ist es, strukturelle Analoga biologisch aktiver Polypeptide oder Verbindungen, mit denen sie wechselwirken (Agonisten, Antagonisten, Inhibitoren, Bindungspartner, etc.), herzustellen. Durch Erzeugung solcher Analoga ist es möglich, Wirkstoffe zu schaffen, die aktiver oder stabiler als die natürlichen Moleküle sind, die unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber Veränderungen sind oder die die Funktion verschiedener anderer Moleküle beeinflussen können. In einem Ansatz würde eine dreidimensionale Struktur für TS10q23.3 oder ein Fragment davon erzeugt werden. Dies könnte durch Röntgenkristallographie, Computer-Modellierung oder eine Kombination beider Ansätze erreicht werden. Ein alternativer Ansatz, das „Alanin-Scan"-Verfahren, umfasst den zufallsbasierten Austausch von Resten im gesamten Molekül durch Alanin, wobei im Anschluss die resultierende Wirkung auf die Funktion bestimmt wird.
Es ist außerdem möglich, einen TS10q23.3-spezifischen Antikörper zu isolieren, der durch einen funktionellen Assays ausgewählt worden ist, und dann seine Kristallstruktur aufzuklären. Im Prinzip ergibt dieser Ansatz ein Pharmakophor, auf dessen Basis späteres Wirkstoffdesign erfolgen kann. Es ist möglich, Proteinkristallographie ganz zu umgehen, indem Anti-Idiotyp-Antikörper gegen einen funktionellen, pharmakologisch aktiven Antikörper erzeugt werden. Als Spiegelbild eines Spiegelbildes wäre die Bindungsstelle eines Anti-Idiotyp-Antikörpers ein Analog des ursprünglichen Antigens. Der Anti-Idiotyp-Antikörper könnte dann verwendet werden, um Peptide aus Banken chemisch oder biologisch produzierter Peptide zu identifizieren und zu isolieren. Ausgewählte Peptide würden dann als der Pharmakophor dienen. Anti-Idiotyp-Antikörper können erzeugt werden, indem die hierin für die Produktion von Antikörpern beschriebenen Verfahren verwendet werden, wobei ein Antikörper als das Antigen eingesetzt wird.
Es können somit Wirkstoffe konzipiert werden, die verbesserte TS10q23.3-Aktivität aufweisen, oder die als Stimulatoren, Inhibitoren, Agonisten, Antagonisten von TS10q23.3 oder von Molekülen, die von der Funktion von TS10q23.3 beeinflusst werden, wirken. Durch die Verfügbarkeit von klonierten TS10q23.3-Sequenzen können ausreichende Mengen von TS10q23.3 produziert werden, um kristallographische Studien durchzuführen. Darüber hinaus erlaubt die Kenntnis der Polypeptidsequenzen eine rechnerunterstützte Vorhersage von Struktur-Funktions-Zusammenhängen.
Eine Substanz, die als ein Modulator einer Polypeptidfunktion identifiziert wird, kann von ihrer Art her ein Peptid oder ein Nichtpeptid sein. Für viele pharmazeutische Anwendungen in vivo sind kleine Nicht-Peptid-Moleküle bevorzugt. Entsprechend kann ein Mimetikum oder ein Imitator der Substanz (vor allem, wenn es sich um ein Peptid handelt) für die pharmazeutische Anwendung konzipiert werden.
Das Design von Mimetika einer bekannten pharmazeutisch aktiven Verbindung ist ein bekannter Ansatz für die Entwicklung von Pharmazeutika auf der Basis einer Leitverbindung.
Dies kann wünschenswert sein, wenn die aktive Verbindung schwierig oder kostspielig zu synthetisieren ist oder wenn sie für ein bestimmtes Verabreichungsverfahren ungeeignet ist, z. B. sind reine Peptidasen ungeeignete aktive Mittel für orale Zusammensetzungen, da sie dazu neigen, von Proteasen im Verdauungskanal schnell abgebaut zu werden. Design, Synthese und Testung von Mimetika werden im Allgemeinen verwendet, um eine zufallsbasierte Testung einer großen Anzahl von Molekülen hinsichtlich einer Zieleigenschaft zu vermeiden.
Das Design eines Mimetikums ausgehend von einer Verbindung mit einer bestimmten Zieleigenschaft erfolgt üblicherweise in mehreren Schritten. Zunächst werden die bestimmten Teile der Verbindung bestimmt, die bei der Festlegung der Zieleigenschaft ausschlaggebend und/oder wichtig sind. Im Fall eines Peptids kann dies erfolgen, indem systematisch die Aminosäurereste in dem Peptid variiert werden, z. B. indem jeder Rest abwechselnd substituiert wird. Häufig werden Alanin-Scans von Peptiden verwendet, um solche Peptidmotive zu redefinieren. Diese Teile oder Reste, welche die aktive Region der Verbindung ausmachen, sind als ihr „Pharmakophor" bekannt.
Wenn der Pharmakophor gefunden ist, wird anhand seiner physikalischen Eigenschaften, z. B. Stereochemie, Bindung, Größe und/oder Ladung, unter Verwendung von Daten aus einer Reihe von Quellen, z. B. spektroskopischen Techniken, Röntgenbeugungsdaten und NMR, ein Modell seiner Struktur erstellt. Bei diesem Vorgang der Modellerstellung können rechnerunterstützte Analyse, Kartierung von Ähnlichkeiten (welche ein Modell der Ladung und/oder des Volumens eines Pharmakophors anstelle der Bindung zwischen Atomen erstellen) und andere Techniken verwendet werden.
In einer Variante dieses Ansatzes wird ein Modell der dreidimensionalen Struktur des Liganden und seines Bindungspartners erstellt. Dies kann vor allem dann nützlich sein, wenn der Ligand und/oder sein Bindungspartner bei der Bindung eine Konformationsänderung durchlaufen, was es dem Modell ermöglicht, dieses beim Design des Mimetikums zu berücksichtigen.
Anschließend wird ein Template (Muster)-Molekül ausgewählt, auf das chemische Gruppen, die den Pharmakophor nachahmen, aufgesetzt werden können. Das Template(Muster)-Molekül und die darauf aufgesetzten chemischen Gruppen können praktischerweise so gewählt werden, dass das Mimetikum einfach zu synthetisieren ist, wahrscheinlich pharmazeutisch akzeptabel ist und in vivo nicht zerfällt, während die biologische Aktivität der Leitverbindung erhalten bleibt. Wenn das Mimetikum peptidbasiert ist, kann alternativ die Stabilität erhöht werden, indem das Peptid zyklisch gemacht wird, was seine Steifigkeit erhöht. Das Mimetikum oder die Mimetika, die durch diesen Ansatz gefunden werden, können dann analysiert werden um zu prüfen, ob oder in welchem Ausmaß sie die Zieleigenschaft aufweisen. Danach kann eine weitere Optimierung oder Modifikation durchgeführt werden, um schließlich eines oder mehrere endgültige Mimetika für die Testung in vivo oder für klinische Tests zu erhalten.
VI. Verfahren zum Behandeln von in Zusammenhang mit 10q23.3 stehenden Malignomen
Die vorliegende Erfindung umfasst in einer anderen Ausführungsform außerdem die Behandlung von Krebs. Die Arten von Krebserkrankungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt werden könnten, sind nur durch die Beteiligung von TS10q23.3 beschränkt. Mit Beteiligung ist gemeint, dass es nicht einmal eine Voraussetzung ist, dass TS10q23.3 mutiert oder anomal ist – die Überexpression dieses Tumorsuppressors kann faktisch andere Läsionen in der Zelle überwinden. Es wird daher in Betracht gezogen, eine breite Vielzahl von Tumoren mit einer TS10q23.3-Therapie zu behandeln, einschließlich Krebserkrankungen in Gehirn (Glioblastom, Astrozytom, Oligodendrogliom, Ependymome), Lunge, Leber, Milz, Niere, Lymphknoten, Bauchspeicheldrüse, Dünndarm, Blutzellen, Dickdarm, Magen, Brust, Endometrium, Prostata, Hoden, Eierstock, Kopf und Hals, Speiseröhre, Knochenmark, Blut oder andere Gewebe.
In vielen Fällen ist es nicht erforderlich, dass die Tumorzelle abgetötet wird oder ein normaler Zelltod oder eine „Apoptose" der Tumorzelle induziert wird. Um eine sinnvolle Behandlung zu erreichen, ist lediglich erforderlich, dass das Tumorwachstum bis zu einem gewissen Grad verlangsamt wird. Es kann jedoch sein, dass das Tumorwachstum vollständig blockiert oder eine gewisse Tumorregression erreicht wird. Es wird auch klinische Terminologie wie „Remission" und „Verringerung der Tumor"-Last in Betracht gezogen, wenn sie wie üblich gebraucht wird.
A. Genbasierte Therapien
Eine der therapeutischen Ausführungsformen, die von den vorliegenden Erfindern in Betracht gezogen werden, ist der Eingriff in die Ereignisse, die an der Tumorgenese einiger Krebserkrankungen beteiligt sind, auf molekularer Ebene. Speziell beabsichtigen die vorliegenden Erfinder, ein Expressionskonstrukt für eine Krebszelle bereit zu stellen, das dieser Zelle TS10q23.3 liefern kann. Aufgrund der Sequenzhomologie zwischen den Genen von Mensch, Maus und Hund könnte jede dieser Nukleinsäuren bei der Therapie von Menschen verwendet werden, genauso wie jede der oben erläuterten Gensequenzen, die dasselbe oder ein biologisch äquivalentes Polypeptid kodieren. Die ausführliche Diskussion von Expressionsvektoren und der hierin verwendeten genetischen Elemente ist in diesem Abschnitt durch Bezugnahme enthalten. Besonders bevorzugte Expressionsvektoren sind virale Vektoren, wie Adenovirus, Adeno-assoziiertes Virus, Herpesvirus, Vakziniavirus und Retrovirus. Außerdem bevorzugt ist ein liposomal verkapselter Expressionsvektor.
Einem Fachmann ist gut bekannt, wie ein Verfahren der Einführung von Genen (Gen-Delivery) in vivo und ex vivo angewandt wird. Für virale Vektoren wird man im Allgemeinen einen viralen Vektorstamm herstellen. Je nach Art des Virus und des zu erhaltenden Titers werden dem Patienten 1 × 10⁴, 1 × 10⁵, 1 × 10⁶, 1 × 10⁷, 1 × 10⁸, 1 × 10⁹, 1 × 10¹⁰, 1 × 10¹¹ oder 1 × 10¹² infektiöse Partikel verabreicht. Ähnliche Zahlen können für liposomale oder andere nichtvirale Formulierungen extrapoliert werden, indem relative Aufnahme-Effizienzen verglichen werden. Eine Formulierung als eine pharmazeutisch annehmbare Komposition ist unten erläutert.
Für verschiedene Tumortypen werden verschiedene Verabreichungswege in Betracht gezogen. Der Abschnitt unten, in dem es um Verabreichungswege geht, enthält eine ausführliche Liste an möglichen Verabreichungswegen. Eine systemische Verabreichung wird praktisch für jeden Tumor in Betracht gezogen. Dies würde sich vor allem für das Angreifen von mikroskopischem oder metastatischem Krebs als wichtig erweisen. Wo eine diskrete Tumormasse identifiziert werden kann, können viele verschiedene direkte, lokale und regionale Ansätze ergriffen werden. Beispielsweise kann der Expressionsvektor direkt in den Tumor injiziert werden. Ein Tumorbett kann vor, während oder nach einer Resektion behandelt werden. Nach einer Resektion würde der Vektor im Allgemeinen über einen Katheter verabreicht werden, der nach der Operation an Ort und Stelle verbleibt. Es könnte die Tumorvaskulatur verwendet werden, um den Vektor in den Tumor einzuführen, indem in eine zuführende Vene oder eine Arterie injiziert wird. Es könnte auch der Weg über eine distalere Blutzufuhr verwendet werden.
In einer anderen Ausführungsform wird eine Gentherapie ex vivo in Betracht gezogen. Dieser Ansatz ist besonders geeignet für die Behandlung von Krebserkrankungen in Verbindung mit Knochenmark, ist aber nicht beschränkt darauf. In einer ex-vivo-Ausführungsform werden dem Patienten Zellen entnommen und außerhalb des Körpers für mindestens eine Zeit lang erhalten. Während dieses Zeitraums wird eine Therapie verabreicht, nach der die Zellen wieder in den Patienten verbracht werden; Hoffentlich alle Tumorzelle in der Probe wurden dabei abgetötet. Ein autologes Knochenmarktransplantat (ABMT) ist ein Beispiel einer Gentherapie ex vivo. Die Idee hinter einem ABMT ist im Grunde, dass der Patient als sein eigener Knochenmarkspender fungiert. Damit kann dem Patienten eine normalerweise tödliche Dosis an Strahlung oder Chemotherapie verabreicht werden, um die Tumorzellen abzutöten, und das Knochenmark mit den eigenen Zellen des Patienten neu besiedelt werden, die ex vivo erhalten (und möglicherweise expandiert) worden sind. Da Knochenmark häufig mit Tumorzellen kontaminiert ist, ist es wünschenswert, diese Zellen aus dem Knochenmark zu beseitigen. Die Verwendung von Gentherapie, um dieses Ziel zu erreichen, ist eine weitere Art und Weise, wie TS10q23.3 gemäß der vorliegenden Erfindung genutzt werden könnte.
Bei der Ausübung der Gentherapieverfahren der vorliegenden Erfindung können Gentransfersysteme nützlich sein, die aus dem Stand der Technik bekannt sind. Dazu gehören virale und nicht-virale Transferverfahren. Eine Reihe von Viren ist als Gentransfervektoren oder als Basis für reparierende Gentransfervektoren verwendet worden, darunter Papovaviren, (z. B. SV40, Madzak et al.,1992), Adenovirus (Berkner, 1992; Berkner et al., 1988; Gorziglia und Kapikian, 1992; Quantin et al., 1992; Rosenfeld et al., 1992; Wilkinson und Akrigg, 1992; Stratford-Perricaudet et al., 1990; Schneider et al., 1998), Vakziniavirus (Moss, 1992; Moss, 1996), Adenoassoziiertes Virus (Muzyczka, 1992; Ohi et al., 1990; Russen und Hirata, 1998), Herpes-Viren, einschließlich HSV und EBV (Margolskee, 1992; Johnson et al., 1992; Fink et al., 1992; Breakefield und Geller, 1987; Freese et al., 1990; Fink et al., 1996), Lentiviren (Naldini et al., 1996), Sindbis- und Semliki-Forest-Virus (Berglund et al., 1993) und Retroviren des Vogels (Bandyopadhyay und Temin, 1984; Petropoulos et al., 1992), der Maus (Miller, 1992; Miller et al., 1985; Sorge et al., 1984; Mann und Baltimore, 1985; Miller et al., 1988) und des Menschen (Shimada et al., 1991; Helseth et al., 1990; Page et al., 1990; Buchschacher und Panganiban, 1992).
Nicht-virale Gentransferverfahren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, umfassen chemische Techniken wie Kalziumphosphat-Copräzipitation (Graham und van der Eb, 1973; Pellicer et al., 1980), mechanische Techniken, wie beispielsweise Mikroinjektion (Anderson et al., 1980; Gordon et al., 1980; Brinster et al., 1981; Costantini und Lacy, 1981), Membranfusions-vermittelter Transfer über Liposomen (FeIgner et al., 1987; Wang und Huang, 1989; Kaneda et al., 1989; Stewart et al., 1992; Nabel et al., 1990; Lim et al., 1991) und direkte DNA-Aufnahme und rezeptorvermittelter DNA-Transfer (Wolff et al., 1990; Wu et al., 1991; Zenke et al., 1990; Wu et al., 1989; Wolff et al., 1991; Wagner et al., 1990; Wagner et al., 1991; Cotten et al., 1990; Curiel et al., 1992; Curiel et al., 1991). Virusvermittelter Gentransfer kann durch Verwendung einer liposomalen Verabreichung mit einem direkten in-vivo-Gentransfer kombiniert werden, was es ermöglicht, dass die viralen Vektoren zu den Tumorzellen und nicht in die umliegenden, sich nicht teilenden Zellen geleitet werden. Alternativ kann die Zelllinie, die den retroviralen Vektor produziert, in Tumoren injiziert werden (Culver et al., 1992). Die Injektion von Produzentenzellen würde dann eine kontinuierliche Quelle von Vektorpartikeln bereitstellen. Diese Technik ist für die Verwendung am Menschen bei inoperablen Gehirntumoren zugelassen.
In einem Ansatz, der biologische und physikalische Gentransferverfahren kombiniert, wird eine Plasmid-DNA beliebiger Größe mit einem Polylysin-konjugierten Antikörper kombiniert, der spezifisch gegen das Adenovirushexonprotein gerichtet ist, und der resultierende Komplex wird an einen Adenovirusvektor gebunden. Der trimolekulare Komplex wird dann verwendet, um Zellen zu infizieren. Der Adenovirusvektor erlaubt eine effiziente Bindung, Internalisierung und Degradation des Endosoms, bevor die gekoppelte DNA geschädigt wird. Zu anderen Techniken für die Verabreichung von Adenovirus-basierten Vektoren siehe Schneider et al., (1998) und US-Patent Nr. 5.691.198m 5.747.469, 5.436.146 und 5.753.500.
Es ist gezeigt worden, dass Liposom/DNA-Komplexe in der Lage sind, einen direkten Gentransfer in vivo zu vermitteln. Während der Vorgang des Gentransfers in Liposomenstandardpräparationen unspezifisch ist, wurden eine lokalisierte Aufnahme in vivo und Expression bei Tumorablagerungen berichtet, beispielsweise direkt nach einer Verabreichung in situ (Nabel, 1992).
Expressionsvektoren in Zusammenhang mit Gentherapie sollten solche Konstrukte enthalten, die Sequenzen aufweisen, welche ausreichend sind, um ein Polynukleotid zu exprimieren, das dort hinein kloniert worden ist. In viralen Expressionsvektoren enthält das Konstrukt virale Sequenzen, die ausreichend sind, um eine Verpackung des Konstruktes zu unterstützen. Wenn das Polynukleotid ein Antisense-Polynukleotid oder ein Ribozym kodiert, wird durch die Expression das Antisense-Polynukleotid oder -Ribozym produziert. In diesem Zusammenhang erfordert eine Expression daher nicht, dass ein Proteinprodukt synthetisiert wird. Zusätzlich zu dem in den Expressionsvektor klonierten Polynukleotid enthält der Vektor auch einen Promotor, der in eukaryontischen Zellen funktional ist. Die klonierte Polynukleotidsequenz steht unter der Kontrolle dieses Promotors. Geeignete eukaryontische Promotoren umfassen solche, die oben beschrieben sind. Der Expressionsvektor kann auch Sequenzen, wie beispielsweise selektierbare Marker und andere hierin beschriebene Sequenzen, umfassen.
B. Immuntherapien
Immuntherapien beruhen im Allgemeinen auf der Verwendung von Immuneffektorzellen und -molekülen, um Krebszellen gezielt anzugreifen und zu zerstören. Der Immuneffektor kann beispielsweise ein Antikörper sein, der für einen Marker auf der Oberfläche einer Tumorzelle spezifisch ist. Der Antikörper kann alleine als ein Effektor der Therapie wirken oder er kann andere Zellen hinzuziehen, um die Zelle zu töten. Der Antikörper kann auch mit einem Arzneimittel oder Toxin konjugiert sein (chemotherapeutisch, Radionuklid, Ricin-A-Kette, Choleratoxin, Pertussis-Toxin, etc.) und nur als Mittel zum Targeting dienen. Alternativ kann der Effektor ein Lymphozyt sein, der ein Oberflächenmolekül trägt, welches entweder direkt oder indirekt mit einem Tumorzellziel interagiert. Die verschiedenen Effektorzellen umfassen zytotoxische T-Zellen und NK-Zellen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es unwahrscheinlich, dass TS10q23.3 ein Ziel für einen Immuneffektor darstellen könnte, da es (i) wahrscheinlich nicht an der Oberfläche der Zelle exprimiert ist und (ii) das Vorhandensein, nicht das Nichtvorhandensein, von TS10q23.3 mit dem normalen Zustand verbunden ist. Es ist aber möglich, dass bestimmte mutante Formen von TS10q23.3 ein Ziel einer Immuntherapie darstellen können, bei der entweder Antikörper, Antikörperkonjugate oder Immuneffektorzellen verwendet werden.
Ein wahrscheinlicheres Szenario ist, dass eine Immuntherapie als Teil einer kombinierten Therapie in Verbindung mit einer auf TS10q23.3 abzielenden Gentherapie verwendet wird. Der allgemeine Ansatz für eine kombinierte Therapie ist unten erläutert. Im Allgemeinen muss die Tumorzelle einen Marker tragen, der als Ziel dienen kann, d. h. auf der Mehrzahl anderer Zellen nicht vorhanden ist. Es existieren viele Tumormarker und jeder davon könnte sich für ein Targeting in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eignen. Gängige Tumormarker umfassen Karzinoembryonales Antigen, Prostata-spezifisches Antigen, Tumor-assoziiertes Harnantigen, fetales Antigen, Tyrosinase (p97), gp68, TAG-72, HMFG, Sialyl-Lewis-Antigen, MucA, MucB, PLAP, Östrogenrezeptor, Lamininrezeptor, erb B und p155.
Immunkonjugate.
Die Erfindung sieht ferner Immuntoxine vor, bei denen ein Antikörper, der an einen Krebsmarker bindet, beispielsweise an ein mutantes TS10q23.3, mit einem zytotoxischen Mittel verknüpft ist. Immuntoxintechnologie ist relativ weit fortgeschritten und einem Fachmann gut bekannt. Immuntoxine sind Mittel, in denen der Antikörperbestandteil mit einem anderen Mittel verknüpft ist, insbesondere mit einem zytotoxischen oder anderweitig antizellulären Mittel, das die Fähigkeit besitzt, das Wachstum oder die Zellteilung zu unterdrücken oder die Zelle zu töten.
Wie hierin verwendet, werden die Begriffe „Toxin" und „Toxineinheit" verwendet, um sich auf jedes zytotoxische oder anderweitig antizelluläre Mittel zu beziehen, das eine solche tödliche oder suppressive Eigenschaft aufweist. Toxine sind also pharmakologische Mittel, die mit einem Antikörper konjugiert sein und einer Zelle in aktiver Form verabreicht werden können, wo sie eine erhebliche schädigende Wirkung ausüben.
Die Herstellung von Immuntoxinen ist aus dem Stand der Technik im Allgemeinen gut bekannt (siehe z.B. US-Patent 4.340.535, das hierin durch Bezugnahme enthalten ist). Es ist außerdem bekannt, dass auf Fab'-Fragmenten basierende Immuntoxine im Allgemeinen bessere Gewebe durchdringende Eigenschaft haben als IgG-basierte Immuntoxine, während IgG-basierte Immuntoxine typischerweise bessere Bindungsfähigkeiten aufweisen und aus dem Blut langsamer entfernt werden als ihre Fab'-Gegenstücke.
Beispielhafte antizelluläre Mittel umfassen chemotherapeutische Mittel, Radioisotope sowie Zytotoxine. Beispiele für chemotherapeutische Mittel sind Hormone wie Steroide, Antimetabolite wie Cytosinarabinosid, Fluoruracil, Methotrexat oder Aminopterin, Anthracyclin, Mitomycin C, Vincaalkaloide, Demecolcin, Etoposid, Mithramycin oder alkylierende Mittel wie Chlorambucil oder Melphalan.
Bevorzugte Immuntoxine enthalten häufig ein von Pflanzen, Pilzen oder Bakterien abgeleitetes Toxin, wie beispielsweise ein A-Ketten-Toxin, ein Ribosom inaktivierendes Protein, α-Sarcin, Aspergillin, Restirictocin, eine Ribonuklease, Diphtherie-Toxin oder Pseudomonas-Exotoxin, um nur einige Beispiele zu nennen. Die Verwendung von Toxin-Antikörper-Konstrukten sowie deren Anbringung an Antikörper sind aus dem Stand der Technik über Immuntoxine gut bekannt. Natürlich können auch Kombinationen der verschiedenen Toxine an ein Antikörpermolekül gekoppelt werden, wodurch eine variable oder sogar verstärkte Zytotoxizität ermöglicht wird.
Eine Art von Toxin zur Anbringungen von Antikörpern ist Ricin, wobei die deglykosylierte Ricin-A-Kette besonders bevorzugt ist. Wie hierin verwendet, soll ich der Begriff „Ricin" auf Ricin beziehen, das aus natürlichen Quellen und mit rekombinanten Mitteln hergestellt ist. Einem Fachmann sind verschiedene „rekombinante" oder „gentechnisch hergestellte" Formen des Ricinmoleküls bekannt, von denen alle gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
Die deglykosylierte Ricin-A-Kette (dgA) ist aufgrund ihrer extremen Potenz und längeren Halbwertszeit bevorzugt, sowie deshalb, weil sie in klinisch erforderlichem Reinheitsgrad und erforderlicher Menge kostengünstig hergestellt werden kann (kommerziell von Inland Laboratories, Austin, TX, USA verfügbar). Auch eine verkürzte Ricin-A-Kette, von der die 30 N-terminalen Aminosäuren durch Nagase (Sigma) entfernt worden sind, kann verwendet werden.
Verknüpfen oder Koppeln einer oder mehrerer Toxinhälften an einen Antikörper kann durch verschiedene Mechanismen erreicht werden, beispielsweise durch kovalente Bindung, Affinitätsbindung, Interkalierung, koordinative Bindung und Komplexbildung. Bevorzugte Bindungsverfahren sind solche, die kovalente Bindung umfassen, wie beispielsweise durch Verwendung von chemischen Vernetzungsmitteln, natürlichen Peptiden oder Disulfidbrücken.
Die kovalente Bindung kann entweder durch direkte Kondensation vorhandener Seitenketten oder durch Einbau externer Überbrückungsmoleküle erreicht werden. Viele bivalente oder polyvalente Mittel sind beim Koppeln von Proteinmolekülen an andere Proteine, Peptide oder Aminfunktionen geeignet. Beispiele von Kopplungsmitteln sind Carbodiimide, Diisocyanate, Glutaraldehyd, Diazobenzole und Hexamethylendiamine. Diese Liste soll die verschiedenen Kopplungsmittel, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, nicht erschöpfend wiedergeben, sondern die gängigeren Kopplungsmittel, die verwendet werden können, exemplarisch wiedergeben.
In bevorzugten Ausführungsformen wird in Betracht gezogen, dass gewünscht sein könnte, zuerst den Antikörper zu derivatisieren und dann den Toxinbestandteil an das derivatisierte Produkt anzubringen. Wie hierin verwendet, wird der Begriff „derivatisiert" werden, um die chemische Modifikation des Antikörpersubstrates mit einem geeigneten Vernetzungsmittel zu beschreiben. Beispiele für Vernetzungsmittel zur Verwendung auf diese Art umfassen die Disulfidbrücken enthaltenden Linker SPDP (N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat) und SMPT (4-Succinimidyl-oxycarbonyl-α-methyl-α(2-pyridyldithio)toluol).
Biologisch lösbare Bindungen sind bei der Umsetzung eines klinisch aktiven Immuntoxins in die Praxis insofern wichtig, als es möglich sein muss, dass die Toxineinheit von dem Antikörper freigesetzt wird, nachdem er in die Zielzelle gelangt ist. Es sind zahlreiche Arten von Verknüpfungskonstrukten bekannt, einschließlich einfach direkte Disulfidbrückenbildung zwischen Sulihydrylgruppen, die an Aminosäuren wie Cystein vorhanden sind oder anderweitig in entsprechende Proteinstrukturen eingeführt wurden, und Disulfidverknüpfungen anhand verfügbarer oder künstlich hergestellter Linkereinheiten.
Es sind zahlreiche Arten von Disulfidbrücken enthaltenden Linkern bekannt, die erfolgreich verwendet werden können, um Toxineinheiten an Antikörper zu konjugieren, während bestimmte Linker jedoch bevorzugt sind; so sind beispielsweise sterisch behinderte Disulfidbrückenlinker aufgrund ihrer höheren Stabilität in vivo bevorzugt, wodurch sie die Freisetzung der Toxineinheit vor der Bindung an den Wirkort verhindern. Ein besonders bevorzugtes Vernetzungsreagens ist SMPT, obgleich andere Linker wie SATA, SPDP und 2-Iminothiolan ebenfalls verwendet werden können.
Nach der Konjugation ist es wichtig, das Konjugat zu reinigen, um verunreinigende Stoffe wie beispielsweise unkonjugierte A-Kette oder Antikörper zu entfernen. Aufgrund der Möglichkeit einer erhöhten Toxizität ist es wichtig, unkonjugierte A-Kette zu entfernen. Darüber hinaus ist es wichtig, unkonjugierten Antikörper zu entfernen, um die Möglichkeit einer kompetitiven Bindung des Antigens an konjugierte und unkonjugierte Arten zu vermeiden. In jedem Fall gibt es eine Reihe von Reinigungstechniken, um Konjugate in ausreichendem Reinheitsgrad bereit zu stellen, um sie klinisch verwendet zu können.
Die am meisten bevorzugte Technik beinhaltet im Allgemeinen die Verwendung von Blue-Sepharose mit einem Gelfiltrations- oder Gelpermeationsschritt. Blue-Sepharose ist eine Säulenmatrix, die aus Cibacron Blue 3GA und Agarose zusammengesetzt ist und sich bei der Reinigung von Immunkonjugaten als nützlich erwiesen hat. Die Verwendung von Blue-Sepharose kombiniert die Eigenschaften eines Ionenaustausches mit A-Ketten-Bindung, um eine gute Trennung konjugierter und unkonjugierter Bindungen zu liefern. Blue-Sepharose erlaubt die Beseitigung des freien (unkonjugierten) Antikörpers aus der Konjugatzubereitung. Es kann ein Chromatographieschritt des molekularen Ausschlusses verwendet werden, um das freie (unkonjugierte) Toxin (z. B. dgA) zu entfernen, indem entweder ein herkömmliches Gelfiltrationsverfahren oder eine HPLC (High Performance Liquid Chromatograhy) verwendet wird.
Nachdem ein ausreichend gereinigtes Konjugat hergestellt worden ist, wäre es im Allgemeinen wünschenswert, dieses in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung zuzubereiten, die parenteral verabreicht werden kann. Dies wird dadurch erreicht, indem für den letzten Reinigungsschritt ein Medium mit einer geeigneten pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet wird. Solche Formulierungen enthalten typischerweise pharmazeutische Puffer, zusammen mit Exzipienten, Stabilisatoren und dergleichen. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen sind steril, nicht-immunogen und nicht-pyrogen. Einzelheiten ihrer Zubereitung sind aus dem Stand der Technik gut bekannt und hierin weiter beschrieben. Endotoxinverunreinigung sollte minimal auf einem unbedenklichen Niveau gehalten werden, beispielsweise bei unter 0,5 ng/mg Protein.
Erfindungsgemäße geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen umfassen im Allgemeinen von etwa 10 bis etwa 100 mg des gewünschten Konjugates in einer Mischung mit einem annehmbaren pharmazeutischen Verdünnungsmittel oder Exzipienten, wie beispielsweise einer sterilen wässrigen Lösung, um in Bezug auf das Konjugat eine Endkonzentration von etwa 0,25 bis etwa 2,5 mg/ml zu erhalten.
Wie oben erwähnt, können die Antikörper der Erfindung mit einem oder mehreren chemotherapeutischen Mittel verknüpft werden, wie beispielsweise Anti-Tumor-Wirkstoffen, Zytokinen, Antimetaboliten, alkylierenden Mitteln, Hormonen, Nukleinsäuren und dergleichen, die so mittels des Antikörperkonjugates zielgerichtet zu einer TS10q23.3-exprimierenden Krebszelle geleitet werden können. Der Vorteil Antikörper-konjugierter Mittel gegenüber ihren nicht-Antikörper-konjugierten Gegenstücken ist die durch den Antikörper vermittelte höhere Selektivität.
Bei der Analyse der unterschiedlichen chemotherapeutischen und pharmakologischen Mittel, die für die Konjugation an einen Antikörper zur Verfügung stehen, würde man insbesondere solche in Betracht ziehen, von denen bereits gezeigt worden ist, dass sie erfolgreich mit Antikörpern konjugiert werden können und pharmakologisch wirken. Beispielhafte antineoplastische Mittel, die verwendet worden sind, umfassen Doxorubicin, Daunomycin, Methotrexat, Vinblastin. Darüber hinaus wurde auch die Anbringung anderer Mittel wie Neokarzinostatin, Macromycin, Trnimon und α-Amantin beschrieben. Die hierin präsentierten Listen geeigneter Mittel sind natürlich lediglich beispielhaft insofern, als die Technologie zum Anbringen pharmazeutischer Mittel an Antikörper für die spezifische Verabreichung an Gewebe gut etabliert ist.
Es wird daher im Allgemeinen angenommen, dass es möglich ist, jedes pharmakologische Mittel an Antikörper zu konjugieren, das eine primäre oder sekundäre Amingruppe, Hydrazid- oder Hydrazingruppe, Carboxylalkoholgruppe, Phosphatgruppe oder alkylierende Gruppe aufweist, die für die Bindung oder Vernetzung mit den Aminosäuren oder Kohlenhydratgruppen des Antikörper verfügbar ist. In Falle von Proteinstrukturen wird dies am einfachsten mit einem Vernetzungsmittel erreichet, wie oben für die Immuntoxine beschrieben. Eine Anbringung kann auch mit einer säurelabilen Acylhydrazon- oder cis-Aconitrylverknüpfung zwischen dem Wirkstoff und dem Antikörper erreichet werden oder indem ein Peptid Abstandshalter wie beispielsweise L-Leu-L-Ala-L-Leu-L-Ala zwischen der γ-Carbonylgruppe des Wirkstoffes und einer Aminosäure des Antikörpers verwendet wird.
C. Proteintherapie
Ein weiterer Therapieansatz ist die Bereitstellung von TS10q23.3-Polypeptid, aktiven Fragmenten, synthetischen Peptiden, Mimetika oder anderen Analoga davon an ein Individuum. Das Protein kann durch rekombinante Expressionsmittel produziert werden oder, falls es klein genug ist, von einem automatisierten Peptidsynthesegerät erzeugt werden. Formulierungen würden je nach Verabreichungsweg und Zweck ausgewählt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, liposomale Formulierungen und klassische pharmazeutische Zubereitungen.
D. Kombinierte Therapie mit Immuntherapie, klassischer Chemo- und Strahlentherapie
Tumorzellresistenz gegen DNA-schädigende Mittel stellt ein großes Problem in der klinischen Onkologie dar. Ein Ziel derzeitiger Krebsforschung ist es, Wege zu finden, um die Wirksamkeit von Chemo- und Strahlentherapie zu verbessern. Eine Möglichkeit ist die Kombination solcher traditioneller Therapien mit Gentherapie. Beispielsweise induzierte das Herpes-Simplex-Thymidinkinase (HS-tk)-Gen nach Verabreichung an Gehirntumoren mittels eines retroviralen Vektorsystems Empfindlichkeit gegenüber dem Antivirusmittel Ganciclovir (Culver et al., 1992). In Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird in Betracht gezogen, dass TS10q23.3-Substitutionstherapie auf ähnliche Weise in Verbindung mit einer chemo- oder strahlentherapeutischen Intervention verwendet werden könnte. Es könnte sich auch als wirksam erweisen, eine TS10q23.3-Gentherapie mit einer Immuntherapie zu kombinieren, wie oben beschrieben ist.
In der Regel würde man im Allgemeinen eine „Ziel"-Zelle mit einem TS10q23.3-Expressionskonstrukt und mindestens einem anderen Mittel in Kontakt bringen, um Zellen durch Anwendung der Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zu töten, Zellwachstum zu hemmen, Metastasierung zu hemmen, Angiogenese zu hemmen oder den malignen Phänotyp von Tumorzellen anderweitig umzukehren oder zu reduzieren. Diese Zusammensetzungen würden in einer kombinierten Menge bereitgestellt werden, die wirksam ist, um die Zelle zu töten oder die Proliferation der Zelle zu hemmen. Dieser Vorgang kann das Inkontaktbringen der Zellen mit dem Expressionskonstrukt und gleichzeitig mit dem Mittel/den Mitteln oder dem Faktor/den Faktoren umfassen. Dies kann erreicht werden, indem die Zelle mit einer einzigen Zusammensetzung oder pharmakologischen Formulierung in Kontakt gebracht wird, die beide Mittel enthält, oder indem die Zelle gleichzeitig mit zwei verschiedenen Zusammensetzungen oder Formulierungen in Kontakt gebracht wird, wobei eine Zusammensetzung das Expressionskonstrukt und die Andere das Mittel enthält.
Alternativ kann die Gentherapiebehandlung der Behandlung mit einem anderen Mittel in Abständen, die von Minuten zu Wochen reichen können, vorangehen oder folgen. In Ausführungsformen, in denen das andere Mittel und das Expressionskonstrukt separat auf die Zelle angewandt werden, würde man im Allgemeinen sicherstellen, dass zwischen dem Zeitpunkt jeder Verabreichung kein signifikanter Zeitraum verstreicht, so dass das Mittel und das Expressionskonstrukt dennoch in der Lage wären, einen vorteilhaften kombinierten Effekt auf die Zelle auszuüben. In solchen Fällen wird in Betracht gezogen, dass man die Zelle mit beiden Modalitäten in Kontakt bringt, wobei der Abstand zwischen den jeweiligen Modalitäten etwa 12–24 Stunden und mehr bevorzugt etwa 6–12 Stunden beträgt, wobei eine Verzögerungszeit von nur etwa 12 Stunden am meisten bevorzugt ist. In manchen Situationen kann es jedoch wünschenswert sein, den Zeitraum für die Behandlung wesentlich auszudehnen, wobei mehrere Tage (2, 3, 4, 5, 6 oder 7) oder mehrere Wochen (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8) zwischen den jeweiligen Verabreichungen liegen können.
Es ist auch vorstellbar, dass mehr als eine Verabreichung von entweder TS10q23.3 oder dem anderen Mittel erwünscht sind. Es können verschiedene Kombinationen verwendet werden, wobei TS10q23.3 „A" ist und das andere Mittel „B" ist, wie unten beispielhaft dargestellt.
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/B
A/A/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/A
A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B
Andere Kombinationen werden in Betracht gezogen. Auch hier müssen beide Mittel in einer kombinierten Menge, die ein Abtöten der Zelle bewirkt, an eine Zelle verabreicht werden, um ein Abtöten der Zelle zu erreichen.
Mittel oder Faktoren, die zur Verwendung in einer kombinierten Therapie geeignet sind, sind alle chemischen Verbindungen oder Behandlungsverfahren, die bei Anwendung auf eine Zelle eine Schädigung der DNA induzieren. Solche Mittel und Faktoren umfassen Strahlung und Wellen, die eine DNA-Schädigung induzieren, wie beispielsweise Gammastrahlung, Röntgenstrahlen, UV-Strahlung, Mikrowellen, elektronische Emissionen und dergleichen.
Verschiedene chemische Verbindungen, die auch as „chemotherapeutische Mittel" beschrieben sind, bewirken eine DNA-Schädigung, von denen alle in den hierin offenbarten Verfahren einer kombinierten Behandlung verwendet werden könnten. Chemotherapeutische Mittel, die verwendet werden können, umfassen z. B. Adriamycin, 5-Fluoruracil (5FU), Etoposid (VP-16), Camptothecin, Actinomycin-D, Mitomycin C, Cisplatin (CDDP) und sogar Wasserstoffperoxid. Die Erfindung umfasst auch die Verwendung einer Kombination von einem oder mehreren DNA-schädigenden Mitteln, sei es auf der Basis von Strahlung oder tatsächliche Verbindungen, beispielsweise die Verwendung von Röntgenstrahlen mit Cisplatin oder die Verwendung von Cisplatin mit Etoposid. In bestimmten Ausführungsformen ist die Verwendung von Cisplatin in Kombination mit einem TS10q23.3-Expressionskonstrukt als diese Verbindung besonders bevorzugt.
Bei der erfindungsgemäßen Behandlung von Krebs würden die Tumorzellen außer mit dem Expressionskonstrukt mit einem Mittel in Kontakt gebracht werden. Dies kann erreicht werden, indem die lokalisierte Tumorstelle mit Strahlung wie Röntgenstrahlen; UV-Licht, Gammastrahlen oder sogar Mikrowellen bestrahlt wird. Alternativ können die Tumorzellen mit dem Agent in Kontakt gebracht werden, indem eine therapeutisch wirksame Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung an ein Individuum verabreicht wird, die eine Verbindung wie Adriamycin, 5-Fluoruracil, Etoposid, Camptothecin, Actinomycin-D, Mitomycin C oder mehr bevorzugt Cisplatin umfasst. Das Mittel kann als eine kombinierte therapeutische Zusammensetzung oder ein Kit hergestellt und verwendet werden, indem es, wie oben beschrieben, mit einem TS10q23.3-Expressionskonstrukt kombiniert wird.
Es sind Mittel vorgesehen, die Nukleinsäuren, spezifisch DNA, direkt vernetzen, um die DNA-Schädigung zu erleichtern, was eine synergistische, antineoplastische Kombination mit TS10q23.3 bewirkt. Es können Mittel wie Cisplatin und andere DNA-alkylierende Mittel verwendet werden. Cisplatin ist häufig verwendet worden, um Krebs zu behandeln, wobei in klinischen Anwendungen wirksame Dosismengen von 20 mg/m² für 5 Tage alle drei Wochen für insgesamt drei Zyklen verwendet worden sind. Cisplatin wird nicht oral resorbiert und muss daher per Injektion intravenös, subkutan, intratumoral oder intraperitoneal verabreicht werden.
DNA-schädigende Mittel umfassen auch Verbindungen, die in die DNA-Replikation, Mitose und chromosomale Segregation eingreifen. Solche chemotherapeutischen Verbindungen umfassen Adriamycin, auch bekannt als Doxorubicin, Etoposid, Verapamil, Podophyllotoxin und dergleichen. Diese Verbindungen werden im klinischen Umfeld häufig für die Behandlung von Neoplasmen verwendet und durch Bolusinjektionen verabreicht, im Fall von Adriamycin im Bereich von 25–75 mg/m² intravenös in 21-tägigen Intervallen, bei Etoposid im Bereich von 35–50mg/m² intravenös oder in doppelter Dosis oral.
Mittel, welche die Synthese und Wiedergabegenauigkeit von Nukleinsäurevorläufern und Untereinheiten unterbrechen, führen ebenfalls zu DNA-Schädigung. Als solche wurde eine Reihe von Nukleinsäurevorläufern entwickelt. Besonders geeignet sind Mittel, die ausführliche Tests durchlaufen haben und einfach erhältlich sind. Als solche werden Mittel wie 5-Fluoruracil (5-FU) von neoplastischem Gewebe bevorzugt verwendet, was dieses Mittel für ein Targeting von neoplastischen Zellen besonders geeignet macht. Obgleich es relativ toxisch ist, ist 5-FU in einem weiten Bereich von Trägerstoffen einsetzbar einschließlich topisch, wobei jedoch die intravenöse Verabreichung in Dosismengen von 3 bis 15 mg/kg/Tag häufig verwendet wird.
Andere Faktoren, die eine DNA-Schädigung verursachen und häufig verwendet wurde, sind, was im Allgemeinen als Gammastrahlen, Röntgenstrahlen und/oder direkte Verabreichung von Radioisotopen an Tumorzellen bekannt ist. Andere Formen DNA-schädigender Faktoren werden ebenfalls in Betracht gezogen, wie beispielsweise Mikrowellen und UV-Strahlung. Es ist sehr wahrscheinlich, dass alle dieser Faktoren eine weit gefasste Schädigung von DNA bewirken, auf die Vorläufer von DNA, die Replikation und Reparatur von DNA und dem Zusammenbau und der Erhaltung von Chromosomen ausüben. Dosisbereiche für Röntgenstrahlen liegen bei täglichen Dosismengen von 50 bis 200 Röntgen für längere Zeiträume (3 bis 4 Wochen) bis hin zu Einzeldosismengen von 2000 bis 6000 Röntgen. Dosisbereiche für Radioisotope sind sehr unterschiedlich und richten sich nach der Halbwertszeit des Isotops, der Stärke und dem Typ der emittierten Strahlung und der Aufnahme von den neoplastischen Zellen.
Der erfahrene Fachmann sei auf „Remington's Pharmaceutical Sciences", 15. Auflage, Kapitel 33, insbesondere die Seiten 624–652 verwiesen. Je nach Zustand des behandelten Individuums wird es natürlich zu einer gewissen Variation der Dosis kommen. Die für die Verabreichung zuständige Person wird in jedem Fall die geeignete Dosis für das Individuum bestimmen. Für die Verabreichung an Menschen sollten Zubereitungen die Sterilitäts- und Pyrogenitätsstandards, die allgemeinen Sicherheits- und Reinheitsstandards erfüllen, wie sie vom FDA Office of Biologics Standards vorgeschrieben sind.
Die Erfinder schlagen vor, dass die regionale Verabreichung von TS10q23.3-Expressionskonstrukten an Patienten mit Krebserkrankungen, die in Verbindung mit 10q23.3 stehen, ein sehr effizientes Verfahren für die Verabreichung eines therapeutisch effektiven Gens darstellt, um der klinischen Krankheit entgegen zu wirken. In ähnlicher Weise kann in bestimmten Umständen, wenn eine weit reichende Metastasierung aufgetreten ist, die systemische Verabreichung von Expressionskonstrukt und/oder dem Mittel angemessen sein.
Außer der Kombination von Therapien, bei denen TS10q23.3 das Ziel ist, mit Chemo- und Strahlentherapien wird auch in Betracht gezogen, dass eine Kombination mit anderen Gentherapien vorteilhaft ist. Beispielsweise kann ein gleichzeitiges Targeting von TS10q23.3- und p53- oder p16-Mutationen eine verbesserte Anti-Krebs-Behandlung bewirken. Jedes andere in Verbindung mit einem Tumor stehende, vorstellbare Gen kann auf diese Weise angegriffen werden, beispielsweise p21, Rb, APC, DCC, NF-1, NF-2, BCRA2, p16, FHIT, WT-1, MEN-I, MEN-II, BRCA1, VHL, FCC, MCC, ras, myc, neu, raf, erb, src, fms, jun, trk, ret, gsp, hast, bcl und abl.
Es sollte auch darauf hingewiesen werden, dass sich jede der vorhergehenden Therapien auch für sich alleine bei der Behandlung eines TS10q23.3. als nützlich erweisen könnte. In dieser Hinsicht sollte die Bezugnahme auf Chemotherapien und Nicht-TS10q23.3-Gentherapie in Kombination als Überlegung verstanden werden, dass diese Ansätze auch getrennt angewandt werden können.
E. Formulierungen und Verabreichungswege an Patienten
Wenn klinische Anwendungen in Betracht gezogen werden, ist es erforderlich, pharmazeutische Zusammensetzungen – Expressionsvektoren, Virusstämme, Proteine, Antikörper und Wirkstoffe – in einer Form herzustellen, die sich für die beabsichtigte Anwendung eignet. Dies umfasst im Allgemeinen das Herstellen von Zusammensetzungen, die vollständig frei von Pyrogenen sind sowie von anderen Unreinheiten, die für Menschen oder Tiere schädlich sein könnten.
Es wäre im Allgemeinen wünschenswert, geeignete Salze und Puffer zu verwenden, um die Verabreichungsvektoren zu stabilisieren und eine Aufnahme durch Zielzellen zu ermöglichen. Puffer werden auch eingesetzt, wenn rekombinante Zellen in einen Patienten eingeführt werden. Wässrige Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen die Verabreichung einer wirksamen Menge des Vektors an Zellen, aufgelöst oder verteilt in einem pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff oder einem wässrigen Medium. Solche Zusammensetzungen werden auch als Inokula bezeichnet. Der Begriff „pharmazeutisch oder pharmakologisch annehmbar" bezieht sich auf molekulare Einheiten und Zusammensetzungen, die keine nachteiligen, allergischen oder andere unangemessene Reaktionen hervorbringen, wenn sie einem Tier oder einem Menschen verabreicht werden. Wie hierin verwendet, umfasst „pharmazeutisch annehmbarer Träger" jedes und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Beschichtungen, antibakterielle und fungizide Mittel, isotonische und absorptionsverzögernde Mittel und dergleichen. Die Verwendung solcher Medien und Mittel für pharmazeutisch aktive Substanzen ist aus dem Stand der Technik gut bekannt. Außer insofern, als ein herkömmliches Medium oder Mittel mit dem Vektor oder den Zellen der vorliegenden Erfindung nicht verträglich ist, wird seine Verwendung in therapeutischen Zusammensetzungen in Betracht gezogen. In die Zusammensetzungen können auch ergänzende aktive Inhaltsstoffe aufgenommen werden.
Die aktiven Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können klassische pharmazeutische Zubereitungen umfassen. Die Verabreichung dieser Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung erfolgt über einen beliebigen gängigen Weg, vorausgesetzt, das Zielgewebe ist über diesen Weg zugänglich. Dies umfasst den oralen, nasalen, bukkalen, rektalen, vaginalen oder topischen Weg. Alternativ kann die Verabreichung durch eine orthotopische, intradermale, subkutane, intramuskuläre, intraperitoneale oder intravenöse Injektion erfolgen. Solche Zusammensetzungen würden normalerweise als pharmazeutisch annehmbare Zusammensetzungen, die oben beschrieben sind, verabreicht werden.
Die aktiven Verbindungen können auch parenteral oder intraperitoneal verabreicht werden. Lösungen der aktiven Verbindungen als freie Base oder pharmakologisch annehmbaren Salzen können in Wasser hergestellt werden, das geeignet mit einem oberflächenaktiven Stoff wie Hydroxypropylcellulose gemischt ist. Dispersionen können auch in Glycerol, flüssigen Polyethylenglykolen und Mischungen davon und in Ölen hergestellt werden. Unter normalen Bedingungen der Aufbewahrung und Verwendung enthalten diese Zubereitungen ein Konservierungsmittel, um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern.
Die pharmazeutischen Formen, die zur Verwendung als Injektion geeignet sind, umfassen sterile wässrige Lösungen oder Dispersionen und sterile Pulver für die unvorbereitete Herstellung steriler injizierbarer Lösungen oder Dispersionen. In allen Fallen muss die Form steril und so flüssig sein, dass eine einfache Aufnahme in eine Spritze möglich ist. Sie muss unter den Herstellungs- und Aufbewahrungsbedingungen stabil sein und gegen die kontaminierende Wirkung von Mikroorganismen, beispielsweise Bakterien und Pilze konserviert sein. Der Träger kann ein Lösungsmittel oder ein Dispersionsmedium sein, das beispielsweise Wasser, Ethanol, Polyol (beispielsweise Glycerol, Propylenglycol und flüssiges Polyethylenglycol und dergleichen), geeignete Mischungen davon und pflanzliche Öle enthält. Die richtige Fluidität kann beispielsweise durch Verwendung einer Beschichtung wie Lecithin, durch Beibehaltung einer erforderliche Partikelgröße im Falle einer Dispersion und durch Verwendung von oberflächenaktiven Stoffen aufrechterhalten werden. Die Prävention der Wirkung von Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle und fungizide Mittel wie beispielsweise Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure, Thimerosal und dergleichen vermittelt werden. In vielen Fällen ist es bevorzugt, isotope Mittel, beispielsweise Zucker oder Natriumchlorid, einzuschließen. Verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann vermittelt werden, indem in den Zusammensetzungen Mittel verwendet werden, die eine Absorption verzögern, beispielsweise Aluminiummonostearat und Gelatine.
Sterile injizierbare Lösungen werden hergestellt, indem die aktiven Verbindungen in der erforderlichen Menge dem geeigneten Lösungsmittel mit Verschiedenen der anderen Bestandteile, die oben aufgezählt sind, wie erforderlich hinzugefügt werden, gefolgt von Sterilfiltration. Dispersionen werden im Allgemeinen hergestellt, indem die verschiedenen sterilisierten aktiven Inhaltstoffe einem sterilen Vehikel zugefügt werden, welches das Dispersionsbasismedium und die erforderlichen anderen Bestandteile aus den oben Aufgezählten enthält. Im Falle steriler Pulver für die Zubereitung steriler injizierbarer Lösungen sind Vakuumtrocknungs- und Gefriertrocknungstechniken die bevorzugten Verfahren der Zubereitung, die ein Pulver des aktiven Inhaltsstoffes plus jedes weiteren gewünschten Inhaltsstoffes aus einer zuvor steril filtrierten Lösung davon ergibt.
Wie hierin verwendet, umfasst „pharmazeutisch annehmbarer Träger" jedes und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Beschichtungen, antibakterielle und fungizide Mittel, isotonische und resorptionsverzögernde Mittel und dergleichen. Die Verwendung solcher Medien und Mittel für pharmazeutisch aktive Substanzen ist aus dem Stand der Technik gut bekannt. Außer insofern, als ein herkömmliches Medium oder Mittel mit dem aktiven Inhaltsstoff nicht verträglich ist, wird seine Verwendung in therapeutischen Zusammensetzungen in Betracht gezogen. Den Zusammensetzungen können auch ergänzende aktive Inhaltsstoffe zugefügt werden.
Zur oralen Verabreichung können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung mit Exzipienten versehen sein und in Form nicht einnehmbarer Mundwässer oder Zahnpasten verwendet werden. Ein Mundwasser kann hergestellt werden, indem der aktive Inhaltsstoff in der erforderlichen Menge in einem geeigneten Lösungsmittel, wie beispielsweise eine Natriumboratlösung (Dobells Lösung), hinzugefügt wird. Alternativ kann der aktive Inhaltsstoff einer antiseptischen Waschlösung zugefügt werden, die Natriumborat, Glycerin und Kaliumbicarbonat enthält. Der aktive Inhaltsstoff kann auch in Zahnpasten verteilt sein, einschließlich: Gels, Pasten, Pulvern und Schlämmen. Der aktive Inhaltsstoff kann einer Zahnpasta, die Wasser, Bindemittel, Schleifmittel, Geschmacksstoffe, Schaumbilder und Befeuchtungsmittel enthalten kann, in einer therapeutisch wirksamen Menge zugegeben werden.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in einer neutralen Form oder als Salzform formuliert sein. Pharmazeutisch annehmbare Salze umfassen die Säureadditionssalze (gebildet mit freien Aminogruppen des Proteins) und welche, die mit anorganischen Säuren wie beispielsweise Salzsäure oder Phosphorsäure oder organischen Säuren wie Essigsäure, Oxasäure, Weinsäure, Mandelsäure und dergleichen gebildet sind. Salze, die mit den freien Carbonylgruppen gebildet sind, können auch von anorganischen Basen abstammen, wie beispielsweise Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Kalzium- oder Eisen(III)hydroxiden und solchen organischen Basen wie Isopropylamin, Trimethylamin, Histidin, Procain und dergleichen.
Nach der Formulierung werden Lösungen auf eine Weise verabreicht, die mit der Dosisformulierung kompatibel ist, und in einer solchen Menge, wie sie therapeutisch wirksam ist. Die Formulierungen werden in verschiedenen Dosisformen einfach verabreicht, beispielsweise als Injektionslösung, Wirkstofffreisetzungskapseln und dergleichen. Für eine parenterale Verabreichung in einer wässrigen Lösung beispielsweise sollte die Lösung geeignet gepuffert sein und das flüssige Verdünnungsmittel zunächst mit ausreichend Salzlösung oder Glukose isotonisch gemacht werden. Diese speziellen wässrigen Lösungen sind besonders für die intravenöse, intramuskuläre, subkutane und intraperitoneale Verabreichung geeignet. In diesem Zusammenhang sind einem Fachmann angesichts der vorliegenden Offenbarung sterile wässrige Medien bekannt. Eine Dosis könnte beispielsweise in 1 ml isotonischer NaCl-Lösung gelöst und entweder zu 1000 ml Hypodermoclysis-Flüssigkeit gegeben oder an der beabsichtigten Infusionsstelle injiziert werden (siehe beispielsweise „Remington's Pharmaceutical Sciences", 15. Auflage, Seite 1035–1038 und 1570–1580). Je nach Zustand des behandelten Individuums wird natürlich eine gewisse Variation der Dosismengen erforderlich sein. Die für die Verabreichung zuständige Person wird in jedem Fall die geeignete Dosis für das Individuum bestimmen. Für die Verabreichung an Menschen sollten Zubereitungen darüber hinaus die Sterilitäts- und Pyrogenitätsstandards, sowie die allgemeinen Sicherheits- und Reinheitsstandards erfüllen, wie sie vom FDA Office of Biologics Standards vorgeschrieben sind.
VII. Transgene Tiere/Knockout-Tiere
In einer Ausführungsform der Erfindung werden transgene Tiere hergestellt, die ein funktionelles Transgen enthalten, welches ein funktionelles TS10q23.3-Polypeptid oder Varianten davon kodiert. Transgene Tiere, die TS10q23.3-Transgene exprimieren, von solchen Tieren stammende rekombinante Zelllinien und transgene Embryos können bei Verfahren zum Testen auf und zur Identifizierung von Mitteln, die die Funktion von TS10q23.3 induzieren oder unterdrücken, nützlich sein. Transgene Tiere der vorliegenden Erfindung können auch als Modelle für die Untersuchung von Indikationen wie Krebserkrankungen verwendet werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein TS10q23.3-Transgen in einen nicht-menschlichen Wirt eingeführt, um ein transgenes Tier hervorzubringen, das ein humanes oder murines TS10q23.3-Gen exprimiert. Das transgene Tier wird hergestellt, indem das Transgen in das Genom derart integriert wird, dass das Transgen exprimiert werden kann. Verfahren zum Produzieren von transgenen Tieren sind im Allgemeinen von Wagner und Hoppe (US-Patent Nr. 4.873.191; welches hierin durch Bezugnahme enthalten ist), Brinster et al., 1985; welches hierin in Gänze durch Bezugnahme enthalten ist, und in „Manipulating the Mouse Embryo; A Laboratory Manual" 2. Auflage (Hrsg. Hogan, Beddington, Constantimi und Long, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1994; welches hierin in Gänze durch Bezugnahme enthalten ist) beschrieben.
Es kann wünschenswert sein, das endogene TS10q23.3 durch homologe Rekombination zwischen dem Transgen und dem endogenen Gen zu ersetzen; oder das endogene Gen kann durch Deletion eliminiert werden, wie bei der Herstellung von „Knockout"-Tieren. Typischerweise wird ein TS10q23.3-Gen, das von genomischen Sequenzen flankiert wird, durch Mikroinjektion in ein befruchtetes Ei überführt. Die mikroinjizierten Eier werden in ein weibliches Wirtstier implantiert und die Nachkommen werden auf Expression des Transgens getestet. Transgene Tiere können aus den befruchteten Eiern einer Reihe von Tieren hergestellt werden, darunter, jedoch nicht ausschließlich, aus Reptilien, Amphibien, Vögeln, Säugetieren und Fischen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden transgene Mäuse erzeugt, die TS10q23.3 überexprimieren oder eine mutante Form des Polypeptids exprimieren. Alternativ erlaubt die Abwesenheit von TS10q23.3 in „Knockout"-Mäusen die Untersuchung der Effekte, die ein Verlust von TS10q23.3-Protein auf eine Zelle in vivo hat. „Knockout"-Mäuse stellen außerdem ein Modell für die Entwicklung von Krebserkrankungen in Zusammenhang mit TS10q23.3 dar.
Verfahren zum Herstellen von Knockout-Tieren sind im Allgemeinen von Shastry (1995, 1998) und Osterrieder und Wolf (1998) beschrieben. Die Herstellung konditionierter Knockout-Tiere, bei denen das Gen aktiv ist, bis es zum gewünschten Zeitpunkt ausgeschaltet wird, ist allgemein beschrieben von Feil et al. (1996), Gagneten et al., (1997) und Lobe und Nagy (1998). Jede dieser Bezugsquellen ist hierin durch Bezugnahme enthalten.
Wie oben bemerkt, finden transgene Tiere und Zelllinien, die von solchen Tieren abstammen, Anwendung in bestimmten Testversuchen. Diesbezüglich können transgene Tiere und Zelllinien, die Wildtyp-TS10q23.3 oder mutantes TS10q23.3 exprimieren können, Testsubstanzen ausgesetzt werden. Diese Testsubstanzen können hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die Expression oder Funktion von Wildtyp-TS10q23.3 zu verstärken oder die Expression oder Funktion von mutantem TS10q23.3 zu vermindern, getestet werden.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele sind enthalten, um bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung aufzuzeigen. Einem Fachmann sollte klar sein, dass Techniken, die in den folgenden Beispielen offenbart sind, Techniken darstellen, bei denen die Erfinder entdeckt haben, dass sie in der praktischen Umsetzung der Erfindung gut funktionieren, und daher als bevorzugte Wege für deren praktische Umsetzung gelten können. Ein Fachmann sollte jedoch angesichts der vorliegenden Offenbarung anerkennen, dass in den spezifischen offenbarten Ausführungsformen viele Änderungen vorgenommen werden können und dennoch ein gleiches oder ähnliches Ergebnis erhalten wird, ohne vom Konzept, dem Geist und dem Umfang der Erfindung abzuweichen.
Insbesondere ist offensichtlich, dass die hierin beschriebenen Mittel durch bestimmte Mittel, die sowohl chemisch als auch physikalisch verwandt sind, ersetzt werden können, während dieselben oder ähnlichen Ergebnisse erzielt werden würden. Alle derartigen Substitutionen und Modifikationen, die einem Fachmann bekannt sind, sind in Geist, Umfang und Konzept der Erfindung, wie von den beigefügten Ansprüchen definiert, enthalten.
BEISPIEL 1
Homozygote Deletion in Gliomzelllinien
Die Erfinder haben DNA aus einer Reihe von 21 Gliomzelllinien und Primärkulturen sowie normale Zellen untersucht, um homozygote Deletionen von genomischem Material auf Chromosom 10 zu identifizieren. Die Auswahl der Marker erfolgte nach nach ihrer ungefähren Position an oder in der Nähe der zuvor implizierten Regionen (1). Die analysierten Zellen wurden in der Abteilung für Neuroonkologie UTMDACC hergestellt (LG11, EFC-2, PL-1, PC-1, JW, FG-2, FG-0, NG-1, PH-2, KE, PC-3 und D77), waren kommerziell erhältlich (U138, A172, U373, U87, U251, U118 und T98G) oder wurden von Mitarbeitern erhalten (13 Wochen, Astrozytom, D54-MG). Die Marker wurden von Research Genetics, Huntsville, AL, USA, erhalten, oder nach bekannten Sequenzen synthetisiert. Bei einer Zelllinie, EFC-2, ergab sich eine große homozygote Deletion in Zusammenhang mit vier Markern um D10S215 (2). Diese Deletion wurde auch im FISH-Verfahren anhand von YAC 746h6 beobachtet, welches in der Region liegt. Drei andere Zelllinien (D-54, A172 und LG11) zeigten ebenfalls homozygote Deletionen an AFM086, was stark darauf hinweist, dass die Region ein putatives Tumorsuppressorgen aufweist (2). Deletionen in PCR^TM-Reaktionen wurden in Gegenwart zweiter Primerpaare (gestaffelt) durchgeführt, um geeignete Amplifikationsbedingungen sicherzustellen. Alle Deletionen wurden mindestens in Dreifachreaktionen bestätigt. Dieselbe Region wurde auch in Verbindung mit Prostatakarzinom gebracht (Gray et al., 1995). Homozygote Deletionen in Zelllinien wurden auch verwendet, um einen Tumorsuppressorgenlocus an 3p21.2 bei kleinzelligem Lungenkarzinom zu definieren (Daly et al., 1993; Kok et al., 1994, Wei et al., 1996).
BEISPIEL 2
Retention von 10q-Loci in supprimierten Hybridzellen
Die zweite Strategie der Erfinder war es, die Regionen von Chromosom 10 zu untersuchen, die bei supprimierten Hybridklonen erhalten waren, aber in revertanten Klonen fehlten. Diese Analyse ging über die vorige Studie der Erfinder hinaus, wobei das Vorhandensein zweier Tumorsuppressorloci auc Chromosom 10 gezeigt und die erhaltenen Regionen analysiert wurden. Hybride, bei denen 10q gesamt oder in Abschnitten erhalten war, zeigten kein Wachstum in Weichagarose und Nacktmäusen („vollständig" supprimierte Klone), während Hybridzellen, die den größten Teil des eingesetztes Chromosoms 10q verloren hatten, in Weichagarose wuchsen, aber nicht-tumorigen waren („partiell" supprimierte Klone; Steck et al., 1995, 3 rechts). Zuvor wurde gezeigt, dass Originalklone U251N10.6, N10.7 und N10.8 nur Fragmente von 10q erhalten hatten (Pershouse et al., 1993; Steck et al., 1995). Anhand von weiteren informativen Mikrosatellitenmarkern wurden in allen drei supprimierten Klonen drei erhaltene Regionen identifiziert: eine 22-cM-Region von D10S219 bis D10S110, eine 14-cM-Region von D10S192 bis D10S187 und eine 18-cM-Region von D10S169 bis D10S1134 (3).
Zur Umgehung dieser Einschränkung wurde das ursprünglich übertragene Neomycinresistenz-markierte Chromosom 10 von Hybrid U251.N10.7 durch Mikrozellenvermittelten Chromosomentransfer in A9-Mauszellen überführt („rescued"). Damit sind alle humanen Mikrosatellitenmarker hinsichtlich des Vorhandenseins von Chromosom 10 informativ. Diese Analyse beruht darauf, dass alle „vollständig" supprimierten Subklone eine gemeinsame Region erhalten haben sollten und diese Region in den „partiell" supprimierten Subklonen deletiert ist. Ein weiterer Anstoß war, dass N10.7 in Bezug auf die Größe des erhaltenen Chromosoms 10 beträchtliche Heterogenität aufwies, wie anhand von FISH mit CHromosom-10-spezifischen Sonden festgestellt wurde. Außerdem wurden die für diese Übernagung („Rescue") verwendeten Hybride zuerst auf Weichagarosewachstum getestet und zeigten keine Koloniebildung. Alle Maushybride, die das übertragene humane Chromosom 10 enthielten, enthielten den kurzen Arm von Chromosom 10. Dieselbe Region war in den „partiell" supprimierten Klonen (N10.5a-j), die in Weichagarose wuchsen, erhalten (Steck et al., 1995), wodurch ausgeschlossen werden konnte, dass diese Region (10pter-10q11) das 10q-Tumorsuppressorgen enthält. Eine Untersuchung der erhaltenen Regionen von 10q zeigte beträchtliche Heterogenität (3). Die Mehrzahl der Klone zeigte entweder partielle oder extensive Deletionen von 10q23-26. Nur zwei Regionen waren in allen untersuchten Subklonen erhalten. Die am meisten zentromer gelegene, erhaltene Region umfasste die Marker D10S210 und D10S219. Diese Marker waren jedoch in den ursprünglichen Klonen N10.6 und/oder N10.8 nicht vorhanden, weshalb diese Region ausgeschlossen wurde (3). Die andere Region befand sich zentromer von D4S536, aber telomer von D10S215 (~4 cM). Die Marker AFM086 und D10S536 waren in allen untersuchten Klonen erhalten (Kastenbereich in 3). Diese Marker waren in den partiell supprimierten Klonen (N10.5a-j) nicht vorhanden. Diese Ergebnisse zeigten, dass eine gemeinsame Region in der Umgebung von AFM086 in allen Hybridzellen, die phänotypisch supprimiert sind, erhalten ist. Dieselbe Region ist bei mehreren Gliomzelllinien deletiert.
Diese Analyse hat mehrere Einschränkungen. Zunächst können die übertragenen („rescued") Klone nicht auf biologische Aktivität analysiert werden, weshalb alle Veränderungen auf Chromosom 10, die während oder nach dem Transfer aufgetreten sein könnten, nicht entdeckt werden konnten. Um diesem Einwand zu begegnen, wurde die Analyse der Erfinder durchgeführt, sobald die Klone geerntet werden konnten. Darüber hinaus könnte die Retention dieses Abschnitts des Chromosoms nur eine in vitro künstlich herbeigerufene Deletion „korrigieren". Folglich wurden Alleldeletionsstudien durchgeführt um festzustellen, ob diese Region bei Gliomen eine Rolle spielt. In dieser Analyse deutete sich außerdem eine alternative Region bei D10S1158 an, die bei allen Klonen außer einem (C7) erhalten war. Die erhaltene Region bei AFM086 zeigte jedoch auch homozygote Deletionen und wurde deshalb im Vergleich zu D10S1158 durch zwei alternative Verfahren impliziert. Interessanterweise ist außerdem anzumerken, dass es scheint, als bliebe die Tumorsuppressorgenregion vorzugsweise erhalten während der Rest von 10q fragmentiert wird.
BEISPIEL 3
Alleldeletionsanalyse von 10q
Mit DNA aus einer Reihe von 53 Gliompräparaten und entsprechenden Patientenlymphozyten wurde anhand von Mikrosatellitenmarkern für Chromosom 10 eine Alleldeletionsstudie durchgeführt. Diese Studie wurde unternommen um festzustellen, ob unsere kritische Region auch in Gliompräparaten eine Rolle spielt. Bei der Mehrzahl der aus GBM stammenden Präparate wurden extensive Deletionen beobachtet, wobei 30 von 38 GBM eine Deletion der meisten oder aller Chromosom-10-Marker aufwiesen. Wenn die Präparate aus anaplastischen Astrozytomen stammten, wurden weniger extensive Deletionen beobachtet, während in Astrozytomen und den meisten Oligodendrogliomen Deletionen selten beobachtet wurden (4 und Daten nicht gezeigt). Die Mehrzahl der in dieser Analyse verwendeten Marker lag in der Region 10q23-26 (Gyapay et al., 1994). Ähnlich wie bei anderen Studien war es aufgrund der großen Deletionen in den meisten GBM-Proben nicht möglich, eine gemeinsame Region überzeugend aufzuzeigen (Fults et al., 1993; Rasheed et al., 1995).
Unter den untersuchten GBM-Präparaten ergab sich allerdings bei allen Tumorproben außer einer (Nr. 9; 4) Deletionen im Bereich der Region von D10S579 bis D10 S541. Darüber hinaus zeigte lediglich ein AA und keines der Astrozytome eine Deletion in der kritischen Region der Erfinder. Zwei Oligodendrogliome wiesen Deletionen in der kritischen Region auf, aber beide wurden als maligne diagnostiziert. Diese Studie liefert mehrere Möglichkeiten. Erstens treten die Deletionen, welche die kritische Region der Erfinder umfassten, überwiegend in GBM und nicht in Tumoren geringeren Grades auf. Dies würde darauf hinweisen, dass ein Verlust des Tumorsuppressorgens auf Chromosom 10q in der kritischen Region der Erfinder eine genetische Veränderung darstellt, die mit der Progression zu GBM zusammenhängt. Diese Hypothese wird dadurch gestützt, dass in diesen Präparaten keine gemeinsame Region identifiziert wurde, in der Deletionen an 10q vorhanden waren, obgleich in Tumoren geringeren Grades Deletionen an 10q auftreten. Diese Beobachtung würde wiederum den vorigen Vorschlag der Erfinder unterstützen, dass eine Deletion des Tumorsuppressorgens an 10q überwiegend mit GBM assoziiert ist und nicht alle Deletionen an 10q das Tumorsuppressorgen betreffen. Die Region D10S216 bis D10S587 wies extensive Deletionen auf, aber mehrere GBM hatten in dieser Region eine Heterozygosität bewahrt (Tumor Nr. 2, Nr. 9, Nr. 13, Nr. 26, 4). Wenn Tumoren geringen Grades aus der Studie ausgeschlossen werden, spielt darüber hinaus die Region der Erfinder in allen GBM eine Rolle. Diese Kombination von unabhängigen Ansätzen deutet stark darauf hin, dass sich in Region D10S512 bis D10S541, insbesondere bei AFM086, ein Tumorsuppressorgen befindet.
BEISPIEL 4
Kartierung der Tumorsuppressorgen-Kandidatenregion
Die kritische Region, welche die Erfinder identifiziert haben, befindet sich zentriert an AFM086 und wird von D10S215 und S10S451 eingegrenzt (2 und 8). Diese Region ist relativ klein und ist in mehreren YACs vorhanden (787d7, 746h8, 934d3). FISH-Farbgebung mit YAC 746h8 auf EFC-2-Metaphaseausstrichen zeigt, dass die homozygote Deletion in dem YAC vorhanden ist, da das YAC partiell beobachtet und auf beiden Seiten benachbarte YACs vorhanden waren. Es sind bakterielle artifizielle Chromosomen (BACs) oder PACs für alle Marker in der Region isoliert worden (8). Das BAC-Kontig der Region wurde aus Endsequenzen von BACs konstruiert, die in dieser Region kartiert worden sind. Es sind mehrere bemerkenswerte Merkmale identifiziert worden. Erstens wurden zwei überlappende BACs identifiziert worden (46b12 und 220) und verifizieren die genomische Integrität von 106d16. Zweitens wurde an einem Ende der BACs eine NotI-Schnittstelle identifiziert. Das Vorhandensein der NotI-Schnittstelle und ein paralleler Verdau mit SacII, EagI und BssIII weist auf das Vorhandensein einer CpG-Insel in 106d16 hin.
Die EcoRI-Fragmente von BAC 106d16 wurden verwendet, um das Ausmaß der homozygoten Deletionen in den Gliomzellen, bei denen zuvor gezeigt worden war, dass sie AFM086 homozygot deletiert haben, durch Southern Blotting zu untersuchen (2 und 5). Die rechte Seite (EcoRI-Fragment 14) enthält die mögliche CpG-Insel und ist in drei der vier Zelllinien vorhanden. Ein NotI/EcoRI-Fragment (Nr.3) wurde auf einem Southern Blot, der mehrere BACs und die Gliomzelllinie enthielt, als Sonde verwendet (2). Wenn Sonden von 46b12 verwendet wurden, wurden außer in EFC-2-Zellen keine Deletionen auf der telomeren Seite (rechte Seite) entdeckt. In den Zellen wurden jedoch in der von 106d16 definierten Region (~65 kb) weitere homozygote Deletionen beobachtet. Eine homozygote Deletion für Bande 3 wird für LG11- und EFC-2-Zellen beobachtet, aber nicht in den weiteren Gliomzellen oder normalen Kontrollen. 106d16 (Bande 12) war in allen Zellen vorhanden (EFC-2 weist eine Bande mit veränderter Migrationseigenschaft auf), was darauf hinweist, dass die homozygote Deletion vollständig im Bereich 106d16 enthalten ist.
BEISPIEL 5
Identifikation von exprimierten Genen in der kritischen Region
Es wurden EcoRI-Fragmente von BAC 106d16 hergestellt und durch Agarose-Gelelektrophorese nach Größe getrennt. Einzelne Banden oder Pools von Banden ähnlicher Größe wurden in pSPL3 (GIBCO, Gaithersburg, MD, USA) ligiert. Putative Exons wurden identifiziert, wie vom Hersteller beschrieben. Zwei Exons wurden korrekt in den Trapping-Vektor gesplict. Die Exons stammten aus Bandenpool 2, 3, 4, 5 und Bande 7. Die Sequenz der getrappten Exons wurde bestimmt und nach der bekannten Sequenz des Trapping-Vektors definiert. Anhand von BLAST-Recherchen in der Datenbank mit exprimierten Sequenzmarkern (dbEST) wurden fünf potenzielle exprimierte Sequenzmarker (Expressed Sequence Tags; ESTs) identifiziert. Zwei ESTs (gb/H92038, AA009519) enthielten entweder ein Exon oder beide Exons (wenn auch ein EST die falsche Ausrichtung hatte).
Aus den ESTs wurden Sequenzierprimer erstellt und verwendet, um putative Exon-Intron-Übergänge zu definieren, wobei BAC46b12 als Template („Muster") diente. Es wurden neun Exons identifiziert. Sequenzunterschiede zwischen den ESTs und dem genomischen Template („Muster") wurden korrigiert. Alle Exons waren in BAC46b12 vorhanden. Aus den Intronsequenzen neben den Exons wurden Primer erzeugt, um Amplikon-Einheiten für jedes Exon zu bilden. Zwei der Exons entsprachen dem getrappten Exon aus den BAC106d16-EcoRI-Sequenzen. Die Sequenz des Gens ist in 6 gezeigt. Die vorhergesagte Aminosäure-Sequenz war definiert durch Vorhandensein einer ATG-Startstelle, TGA- und TAA-Stopcodons im Leseraster, dem Vorhandensein multipler Stop-Codons in allen drei Leserastern an anderer Stelle in der Sequenz, neun Splice-Stellen und das Vorhandensein von Kozak-Signalen in der Nähe der Initiationsstelle. Die Sequenz von 403 Aminosäuren ist in 7 und 9 gezeigt. Das vorhergesagte Molekulargewicht beträgt 47.122 mit einem pI-Wert von 5,86.
Eine Sequenzhomologie mit mehreren Proteinmotiven zeigt eine mögliche funktionelle Rolle des Proteinproduktes an. Ein kritisches Motiv von Rest 88 bis 98 [IHCKAGKGRTG](SEQ ID Nr.: 28) stimmt genau mit der konservierten katalytischen Domäne einer Proteintyrosinphosphatase [(I/V)HCxAGxxR(S/T)G] (SEQ ID Nr.: 29; Denu et al., 1996) überein. Mehrere andere Motive wurden identifiziert, die mit der Phosphatasefunktion des Tumorsuppressorgens übereinstimmen würden.
Aus im Zufallsverfahren geprimter (Random Priming) DNA wurden Amplikons (PCR^TM-Produkte, die aus verschiedenen Regionen des Gens hergestellt worden sind) generiert. Die Sequenz der Amplikons entsprach der DNA-Sequenz. Nicht-überlappende Amplikons wurden als Sonden für Northern Blots mit normalem Gewebe aus verschiedenen Organen (Clontech, Palo Alto, USA; Multigewebeblots) eingesetzt. Alle Amplikons identifizierten auf den Northern Blots eine Hauptbande bei 5,5 bis 6 kb und mehrere kleinere Banden. Die mRNA war in allen untersuchten Geweben exprimiert (Herz, Gehirn, Plazenta, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere, Bauchspeicheldrüse, Milz, Thymus, Prostata, Hoden, Eierstock, Dünndarm, Dickdarm und periphere Blutlymphozyten).
BEISPIEL 6
Mutationsanalyse
Die Mutationsanalysen wurden anfangs mit zwei Strategien verfolgt. Erstens wurden die Gliomzelllinien, bei denen anfangs gezeigt wurde, dass sie homozygote Deletionen aufweisen, auf Vorhandensein des Kandidatengens analysiert. Wie in 8 gezeigt, wiesen alle Zelllinien mit einer Deletion von AFM086 homozygote Deletionen multipler Exons des Kandidatengens auf. Darüber hinaus traten die Deletionen in der Mitte des Gens auf, wodurch die Deletionsgrenzen (ähnliche Deletionen in allen Zelllinien) zwischen Exon 2 und 7 definiert wurden. Deletionen, die die Mitte des Gens betreffen, zeigen außerdem, dass das identifizierte Gen das Zielgen der Mutation darstellt.
Mit einer Reihe von Gliomzelllinien wurde außerdem eine vorläufige Analyse auf Sequenzmutationen durchgeführt. Mutationen und/oder Deletionen wurden in allen untersuchten Gliomzellinien, außer dreien, beobachtet (Tabelle 5). Die Basenzahl in der Tabelle bezieht sich auf das Exon, nicht die Gesamtsequenzen, d. h. die 98. Base von Exon 7 bei U251.
TABELLE 5 IDENTIFIZIERTE MUTATIONEN IN DEM KANDIDATENGEN
Deletionen von Exons wurden auch in LnCap, einer Prostatazelllinie, gefunden. Die Gliomzellen, die keine Mutation/Deletion zeigten, stammten von Tumoren geringen Grades (PC-3 und PH-2), bei denen keine Alleldeletion von Chromosom 10 erwartet und für diese Zellen beobachtet wurde. Bei den anderen Zellen (D77) handelte es sich um eine Primärzellkultur, und Chromosom 10 erwies sich als heterozygot zu einem 1-bp-Polyrnorphismus in dem Gen. Auch eine Brustkrebszelllinie zeigte eine Mutation. Diese erste Analyse unterstützt die Schlussfolgerung der Erfinder, dass der Verlust eines 10q-Tumorsuppressorgens einen kritischen molekularen Marker für Glioblastome und eine Progression der Krankheit darstellt.
BEISPIEL 7
Analyse von TS10q23.3-Mutanten in Krebspräparaten und Tumorzelllinien
In einer ausführlicheren Studie berichten die Erfinder das Auftreten von TS10q23.3-Mutationen in 342 Präparaten von Primärtumoren und 164 Tumorzelllinien (TZL) verschiedener Krebstypen, die auf dem gesamten TS10q23.3-Locus einen scheinbaren Verlust der Heterozygosität (LOH) aufweisen. Unter den 75 TZL, die auf dem gesamten TS10q23.3-Locus einen scheinbaren Heterozygositätsverlust (Loss of Heterozygosity, LOH) aufweisen, fanden die Erfinder zehn homozygote Deletionen, die kodierende Abschnitt von TS10q23.3 entfernten, sowie eine Frameshift-, eine Nonsense- und sieben Missense-Varianten. Dagegen entdeckten die Erfinder unter 84 Primärtumoren, die auf Heterozygositätsverlust (LOH) voranalysiert worden waren, nur eine Frameshift-Läsion, eine Nonsense-Mutation, eine Splice-Variante und eine Missense-Variante. Interessanterweise erwies sich die Expression von TS10q23.3 bei hochgradigen Glioblastomen im Vergleich zu normalem Gehirngewebe als signifikant reduziert.
Verfahren
OH-Analyse:
Aus gefrorenen Präparaten oder entparaffinierten Schnitten wurde genomische Gesamt-DNA gereinigt. Genomische Gesamt-DNA aus Krebszelllinien wurde mit dem Easy-DNA-Kit (Invitrogen, San Diego, CA, USA) gereinigt. Die LOH-Analyse wurde durchgeführt, wie zuvor beschrieben (Teng et al., 1996; Steck et al., 1995). Folgende polymorphen STR-Marker (Short Terminal Repeats) wurden in dieser Studie verwendet: D10S1687 (Heterozygositätsindex, H.I. = 0,81; Ldb (Collins et al., 1996), Position von p-Telomer nach Radiation Hybrid Mapping, R. L. = 85 Mb), D10S579 (H.I. = 0,59; R. L. = 86,4 Mb), D10S541 (H.I. = 0,78; R. L. = 86,5 Mb), AFM280WE1 (H.I. = nicht bestimmt; R. L. = 87 Mb), AFMA114XB1 (H.I. = 0,70; R. L. = 91,9 Mb) und D10S1753 (H.I. = 0,74; R. L. = 92,48 Mb), TS10q23.3 wie definiert durch AFM086WE1 befindet sich an Position 86,5 Mb. In Präparaten von Primärtumoren wurde der Heterozygositätsverlust (LOH) in den meisten Fällen bestimmt, indem STR-Marker-Amplikons, die aus Tumor-DNA und normaler DNA jedes getesteten Individuums hergestellt worden sind, quantitativ verglichen wurden. Im Falle von TZL und einigen Primärtumoren wurde der LOG auf der Basis der kombinierten scheinbaren Hemizygosität von AFMA114XB1, D10S541 und D10S1753 bestimmt; die Wahrscheinlichkeit, dass alle drei dieser STR-Marker in einer gegebenen Probe homozygot sind, ist kleiner als 0,017.
Analyse auf homozygote Deletion:
Mit den genomischen DNAs aus den Zelllinien als Template („Muster") wurden gestaffelte PCR^TM-Amplifikationen entweder mit TaqPlus (Stratagene, La Jolla, CA, USA) oder AmpliTaqGold (Perkin Elmer, Foster City, CA, USA) durchgeführt. Die Primer, die zur Herstellung von TS10q23.3- und MMK4-Amplikons verwendet wurden, sowie die verwendeten PCR^TM-Bedingungen sind unten beschrieben. Zwanzig Mikroliter der Sekundärreaktionen wurden auf 2-3%igen Nu Sieve (FMC Bioproducts)-Agarosegelen fraktioniert und danach visualisiert.
Mutationsanalyse:
Die Erfinder führten gestaffelte PCR^TM-Amplifikationen mit genomischer DNA von Tumorpräparaten oder TZL durch und testeten die resultierenden Amplikons auf Sequenzvarianten gemäß der Verfahren von Steck et al., (1997) mit mehreren Modifikationen. Zuerst wurde Exon 6 mit einem einzelnen sekundären Amplikon anhand des Exon-6-FB-RR-Primerpaars getestet. Als Zweites wurde das Exon nach einer primären Amplifikation von Exon 8 unter Verwendung von FA-RP-Primern als zwei sekundäre Amplikons mit den folgenden FB-RQ- und FC-RR-Primern getestet:
CA6.ex8.FB GTTTTCCCAGTCACGACGAGGTGACAGATTTTCTTTTTTA (SEQ ID Nr.: 33)
CA6.ex8.RQ AGGAAACAGCTATGACCATTCGGTTGGCTTTGTCTTTA (SEQ ID Nr.: 34)
CA6.ex8.FC GTTTTCCCAGTCACGACGCATTTGCAGTATAGAGCGT (SEQ ID Nr.: 35)
CA6.ex8.RR AGGAAACAGCTATGACCATAGCTGTACTCCTAGAATTA (SEQ ID Nr.: 36)
Drittens, da Mononukleotiddurchläufe in bestimmten Introns schlechtes Dye-Primer-Sequencing verursachten, erhielten die Erfinder Dye-Terminator-Sequenzdaten über die sekundären Amplikons Exon 8 FB-RQ und Exon 9 FB-RR, indem respektive die gestaffelten Primer 5'-TTTTTTTTTAGGACAAAATGTTTC-3' (SEQ ID Nr.: 37) und 5'-AATTCAGACTTTTGTAATTTGTG-3' (SEQ ID Nr.: 38) verwendet wurden. Die Erfinder erhielten eine mehr als 90%ige Abdeckung der kodierenden Sequenz von TS10q23.3 für alle analysierten Proben; alle Mutationen wurde durch Sequenzierung eines neu amplifizierten Produktes bestätigt.
RT-PCR^TM-Expression:
Aus Gefrierschnitten von 10 normalen Geweben und 10 hoch normalen Geweben und 10 Präparaten hochgradiger Glioblastome wurde Boten-RNA (Messenger RNA) isoliert. Die Gefrierschnitte (jeweils 20, 5 μm) wurden geschnitten und verwendet, um mRNA zu isolieren (Micro-Fast Track; Invitrogen, San Diego, CA, USA). Aufeinander folgende Schnitte wurden histologisch untersucht und es wurde gezeigt, dass die Schnitte überwiegend normale Zellen oder Tumorzellen enthielten. Normale Schnitte wurden aus Regionen erhalten, die im normalen Verlauf therapeutischer Kraniotomien tumorfrei waren. Komplementäre DNA wurde durch Verwendung von Superscript II und Primern zur Amplifizierung von TS10q23.3 von –28 bis 347 oder 345 bis 1232 der kodierenden Region hergestellt. Die verwendeten Primer waren:
M5'F: TCCTTTTTCTTCAGCCACAG (SEQ ID Nr.: 39)
M5'R: ATTGCTGCAACATGATTGTC (SEQ ID Nr.: 40);
M3'F: TGACAATCATGTTGCAGCA (SEQ ID Nr.: 41);
F3'R: TTTATTTTCATGGTGTTTTATCC (SEQ ID Nr.: 42).
Die PCR^TM-Bedingungen waren ähnlich wie die zuvor beschriebenen, außer, dass der Anheftungsschritt bei 53°C durchgeführt wurde.
Charakterisierung eines TS10q23.3-Pseudogens:
sAus einer cDNA-Bibliothek aus humanem fetalem Gehirn wurden DNA-Fragmente amplifiziert, indem Pfu-Polymerase und eine gestaffelte PCR^TM-Strategie verwendet wurden. Die Anfangsreaktion mit χ μl enthielt 100 ng cDNA. Das in der ersten Runde der Amplifikation verwendete Primerpaar war CTTCAGCCACAGGCTCCCAGAC (SEQ ID Nr.: 43) und GGTGTTTTATCCCTCTTG (SEQ ID Nr.: 44), wonach die Reaktion 20-fach verdünnt und mit den Primern CGGGATCCATGACAGCCATCATCAAAGAGATC (SEQ ID Nr.: 45) und CGGAATTCTCAGACTTTTGTAATTG (SEQ ID Nr.: 46) reamplifiziert wurde. Die verwendeten PCR^TM-Bedingungen umfassten einen anfänglichen Denaturierungsschritt bei 94°C für 5 Minuten, gefolgt von 30 Zyklen bei 94°C für 45 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden und 72°C für 1 Minute. Zur Bestimmung der chromosomalen Position dieses Pseudogens führten die Erfinder ein Radiation Hybrid Mapping anhand des Genebridge 4 Panels (Genome Systems) und des folgenden Primerpaars durch, das ein spezifisches 303-bp-Produkt des Pseudogens, aber nicht von TS10q23.3 erzeugte: ATCCTCAGTTTGTGGTCTGC (SEQ ID Nr.: 47) und GAGCGTGCAGATAATGACAA (SEQ ID Nr.: 48). Anhand dieser STS stellten die Erfinder fest, dass sich das Pseudogen bei etwa 160 cM auf Chromosom 9 befand. Darüber hinaus isolierten die Erfinder zwei bakterielle artifizielle Klone (BACs), 145c22 und 188122, die dieses Pseudogen tragen, und bestätigten seine genomische DNA-Sequenz. Ein Vergleich der Kodierungssequenz von TS10q23.3 mit der des Pseudogens ergab die folgenden Basenunterschiede: T2G, C89T, T202C, T242C, G248A, A258G, G397A, A405T, G407A, T531C, T544G, C556G, A672G, C700T, A705G, C720T, C900T und A942G. Die Nukleotidsequenz für das humane TS10q23.3-Pseudogen ist in SEQ ID Nr.: 64 ausgeführt.
Da TS10q23.3 ein Tumorsuppressorgen zu kodieren scheint, war der erste Schritt der Erfinder zur Identifizierung neuer Mutationen in diesem Gen die Voranalyse von Primärtumoren und TZL hinsichtlich eines Heterozygositätsverlustes (LOH) in dieser Region von 10q23. Insgesamt wurden 342 Präparate von Primärtumoren und 164 TZL anhand von polymorphen kurzen Tandem-Repeat-Markern auf Chromosom 10, die sich in der Nähe des TS10q23.3-Locus befinden, untersucht (Tabelle 6). In dieser Probenreihe beobachteten die Erfinder in Präparaten von Primärtumoren einen Heterozygositätsverlust (LOH) im Bereich von 20% bei Darmpräparaten bis zu 75% bei Glioblastoma multiforme (GBM), wobei die LOH-Gesamthäufigkeit ~49% betrug. Bei TZL mit Probengrößen über neun variierte die LOH-Inzidenz von 28% (Darm) bis 82% (GBM) mit einer Gesamthäufigkeit von ~46%.
TABELLE 6 LOH-ANALYSE VON TUMORPRÄPARATEN UND TUMORZELLLINIEN

¹Der wurde nur für Probengrößen über neun berechnet.
²Proben, die erfolgreich amplifiziert und sequenziert wurden (> 90% der Kodierungssequenz wurde untersucht).
³Die Anzahl an Nicht-LOH-Proben, die sequenziert wurde, ist in Klammer gezeigt. Bestimmte Primärtumor-DNAs, besonders aus Pankreaskarzinomen und endometrialen Karzinomen, wurden aus Mikroparaffinschnitten isoliert und konnten aufgrund schlechter Template-Qualität nicht zu > 90% sequenziert werden.
⁴Alle untersuchten TZL zeigten einen scheinbaren Heterozygositätsverlust (LOH). TZL mit homozygoten Deletionen im kodierenden Abschnitt von TS10q23.3 wurden nicht durch Sequenzierung untersucht.
⁵Diese Gesamtwerte beinhalten Proben, die zuvor von Steck et al. (1997) berichtet worden sind.
⁶Fünf dieser Kolonproben bestanden aus Krebserkrankungen, die in die Leber metastasiert hatten, wenn auch die Lebermetastasen keinen Heterozygositätsverlust (LOH) zeigten.
⁷Die Prostatazelllinie NCIH660 (TCL10F4) wurde von Li et al. (1997) charakterisiert und zeigte eine homozygote Deletion von Exon 2–9 von TS10q23.3.
⁸Diese Präparate metastasierter Tumore stammten aus Adenokarzinomen, einem Sarkom, einem Nierenzellkarzinom und einem Melanom. Die Metastaseläsionen befanden sich in der Lunge, außer bei dem Melanom, wo sie sich in der Leiste befanden.
⁹Von diesen 137 durch Sequenzierung analysierten Präparaten sind 45 bereits bekannt (Steck et al., 1997), 8 zeigten keinen Heterozygositätsverlust (LOH) und 84 zeigten einen Heterozygositätsverlust (LOH).

Für die Suche nach kodierenden Varianten von TS10q23.3 in Primärtumoren sequenzierten die Erfinder Amplikons, die aus den Exons und flankierenden Splice-Übergangsstellen dieses Gens bestanden, das aus Tumor-DNAs mit Heterozygositätsverlust (LOH) amplifiziert wurde. Ein Vorbehalt dieses Ansatzes ist, dass er keine regulatorischen Mutationen identifizieren kann, die das Expressionsniveau dieses Gens beeinflussen. Darüber hinaus schließt diese Analyse die Möglichkeit aus, mutante Homozygote und gemischte Heterozygote zu finden, aber die Inzidenz dieser Art von Mutanten ist vermutlich gering. Zuvor hatten die Erfinder berichtet, dass die Inzidenz von TS10q23.3-Kodierungsvarianten bei Glioblastomen bei 6/26 (23%), bei Brustkarzinomen bei 2/14 (14%) und bei Nierenkarzinomen bei 1/4 lag (Steck et al., 1997). In dieser Studie entdeckten die Erfinder unter 84 Primärtumoren mit Heterozygositätsverlust (LOH) im Bereich des TS10q23.3-Locus eine Frameshift-Mutation (Brustkarzinom), eine Nonsense-Mutation (pädiatrisches GBM), eine Splice-Variante (pädiatrisches GBM) und eine Missense-Variante (Melanom, Tabelle 7).
TABELLE 7 TS10q23.3-Varianten in Primärtumoren und Tumorzelllinien

¹Präparate von Primärtumoren.
²Analyse korrespondierender normaler DNA zeigte, dass die TS10q23.3-Mutation dieser Probe eines primären Brusttumors somatisch ist. Eine ähnliche Analyse der TS10q23.3-Veränderungen in den anderen drei Präparaten von Primärtumoren war nicht möglich, da keine korrespondierenden normalen DNAs verfügbar waren. Die Erfinder stellten jedoch fest, dass alle neun Mutationen bei Primärtumoren, die zuvor von Steck et al. (1997) beobachtet worden sind, somatisch entstanden.

Außer Primärtumoren untersuchten die Erfinder einer Reihe von Tumorzelllinien auf Veränderungen im TS10q23.3-Gen. Diese TZL erlaubten es den Erfindern, Krebstypen zu untersuchen, die in der Reihe der analysierten Primärtumoren nicht vertreten waren, einschließlich Leukämie, Lymphom, Neuroblastom, Retinoblastom und Blasen-, Hoden- und Uteruskarzinome. Unter den 75 TZL mit Heterozygositätsverlust (LOH) identifizierten die Erfinder zehn homozygote Deletionen, welche die Kodierungsregionen von TS10q23.3 betrafen (13A und 13B). Die homozygoten Deletionen waren vorhanden in TZL von Astrozytomen (1/1), Blasenkarzinom (1/3), Brustkarzinom (1/14), Glioblastom (2/8), Lungenkarzinom (1/7), Melanom (4/7) und Prostatakarzinom (1/2). Während zwei der Zelllinien alle neun TS10q23.3-Exons verloren hatten, zeigten die übrigen 8 TZL eine homozygote Deletion verschiedener Kodierungsabschnitte des Gens. Eine Analyse der verbleibenden 65 TZL ergab eine Frameshift-, eine Nonsense- und sieben nicht konservative Missense-Varianten (Tabelle 7).
Aufgrund der relativ geringen Häufigkeit beobachteter TS10q23.3-Mutationen in Primärtumoren im Vergleich zu TTL untersuchten die Erfinder die Expression von TS10q23.3 in einer Reihe von zehn GBM und zehn normalen Präparaten. Alle Normalproben zeigten eine Expression von TS10q23.3, während keine der GBM-Proben eine signifikante Expression dieser mRNA aufwies (13C und 13D). In bestimmten Proben wurden nach längerer Exposition schwache Signale beobachtet, wenn auch die Erfinder nicht unterscheiden konnten, ob dieses Signal auf eine Kontamination der Schnitte durch normale Zellen oder eine niedrige TS10q23.3-Expression in den Tumorzellen zurückzuführen war. Diese Beobachtung deutet allerdings an, dass die veränderte Expression von TS10q23.3 bei der Tumorentstehung dieser GBM eine Rolle spielen könnte. Die Mechanismen oder der Mechanismus der Hemmung der TS10q23.3-Expression und des TS10q23.3-Expressionsniveaus in anderen Arten von Primärtumoren wird derzeit untersucht.
Die Erfinder haben eine lange Reihe von Primärtumoren und TZL, die hinsichtlich eines Heterozygositätsverlustes (LOH) voranalysiert worden sind, auf Veränderungen von TS10q23.3 untersucht. In dieser Reihe von 84 Primärtumoren entdeckten die Erfinder nur vier mögliche inaktivierende TS10q23.3-Mutationen. Zusammen mit den früheren Befunden der Erfinder (Steck et al., 1997) zeigten damit 8/31 (26%) der primären Glioblastome, 3/31 (10%) der primären Brusttumore, 1/8 (13%) der primären Nierentumore und 1/11 (9%) der primären Melanome Veränderungen von TS10q23.3. Interessanterweise wiesen zwei der fünf pädiatrischen GBM Veränderungen von TS10q23.3 auf, die zur Expression eines nicht funktionellen Proteins führen dürften, was darauf hinweist, dass eine weitergehende Analyse der Rolle von TS10q23.3 bei dieser Kinderkrankheit angebracht ist. In der Reihe von 75 TZL beobachteten die Erfinder insgesamt 19 putative inaktivierende TS10q23.3-Mutationen.
Die tatsächliche Inzidenz von TS10q23.3-Mutationen in den verschiedenen Krebstypen liegt wahrscheinlich zwischen der bei Primärumoren und der bei TZL beobachteten Häufigkeit. Die Befunde der Erfinder zeigen, dass TZL im Vergleich zu Primärtumoren eine signifikant höhere Inzidenz von Mutationen in TS10q23.3 aufweisen (Tabelle 6). Eine ähnliche Beobachtung wurde von Spruck et al. für Mutationen von p16 bei Blasenkrebs berichtet (Spruck III et al., 1994). Diese Diskrepanz ist vermutlich auf eine oder mehrere der folgenden Möglichkeit zurückzuführen. Erstens könnten Tumorzellen bestimmte Kombinationen genetischer Läsionen, die in vivo erworben worden sind, benötigen, um in vitro erfolgreich kultiviert werden zu können. Zweitens könnten Mutationsereignisse in TS10q23.3 während der Passagierung von TZL in vitro einen Wachstumsvorteil mit sich bringen oder klonale Selektion bewirken. Drittens deutet die wesentlich reduzierte Expression von TS10q23.3, wie sie bei 10/10 Präparaten primärer GBM beobachtet wurde, darauf hin, dass bestimmte Tumore möglicherweise keine Kodierungsmutationen in diesem Gen aufweisen, sondern stattdessen eine kleine Menge an funktionellem TS10q23.3 exprimieren. Und viertens könnte die Kontamination mit normalen Zellen und Heterogenität der Präparate von Primärtumoren die Feststellung homozygoter Deletionen, einem Mutationsmechanismen, der bei einer signifikanten Anzahl von TZL am TS10q23.3-Locus beobachtet wurde, verhindern. In Kontrollexperimenten wurde festgestellt, dass das Vorhandensein von lediglich 5% kontaminierender DNA aus Normalgewebe in den Tumorproben die Identifikation homozygoter Deletionen durch diese Verfahren verhindert. Das Vorhandensein homozygoter Deletionen mit Einfluss auf T510q23.3 in Primärtumoren könnte daher in der Analyse der Erfinder leicht unterschätzt worden sein und erfordert alternative Ansätze zur Evaluierung ihres Auftretens. Eine weitere Komplikation ist allerdings das Vorhandensein eines scheinbar ungesplicten TS10q23.3-Pseudogens auf Chromosom 9q; die Kodierungssequenz von TS10q23.3 weicht an 16/1209 Basen von diesem putativen Pseudogen ab (siehe „Verfahren").
Eine Zusammenstellung von TS10q23.3-Veränderungen zeigt, dass das Spektrum der Varianten sehr divers ist (14). Alle identifizierten nicht-konservativen Missense-Substitutionen befinden sich im N-terminalen Abschnitt von TS10q23.3 innerhalb seiner putativen Phosphatasedomäne. Die Läsionen, die zu einer Verkürzung von TS10q23.3 führen, sind dagegen im gesamten Gen verteilt. Wenn alle verkürzten Formen von TS10q23.3 nicht-funktional sind, weisen die Daten darauf hin, dass die carboxyterminale Region von TS10q23.3 für die Expression des aktiven Proteins essenziell ist. Dies stimmt mit der Ansicht überein, dass die potenziellen Phosphorylierungsstellen und das PDZ-Motiv für die Funktion von TS10q23.3 wichtig sind. Alternativ könnten die Sequenzen der C-terminalen Region dieses Proteins für eine korrekte Faltung erforderlich sein. Interessanterweise wurden die einzigen, bislang berichteten Keimbahnmutationen von TS10q23.3 bei Individuen mit Cowden-Syndrom festgestellt (Liaw et al., 1997); alle anderen charakterisierten TS10q23.3-Varianten aus Primärtumoren sind somatisch entstanden (Tabelle 7). Die Diversität der beobachteten Veränderungen von TS10q23.3 lassen den Schluss zu, dass in der Bevölkerung viele verschiedene Läsionen dieses Gens vorhanden sind. Insgesamt legen die Daten nahe, dass TS10q23.3 ein Tumorsuppressor ist, der bei der Entstehung vieler Arten von Krebserkrankungen eine wesentliche Rolle spielt.
BEISPIEL 8
Rolle von TS10q23.3-Mutationen bei Brustkrebs mit frühzeitiger Manifestation; kausativ in Verbindung mit Cowden-Syndrom und ausgeschlossen in brca1-negativen Fällen Verfahren
Klinisches Material:
Nach Einholung des informierten Einverständnisses wurden Personen mit Cowden-Syndrom Blutproben abgenommen. Ein Aliquot wurde zur DNA-Extraktion verwendet, während aus einer zweiten Probe mononukleäre periphere Blutzellen gereinigt und verwendet wurden, um eine EBV-transformierte lmyphoblastoide Zelllinie zu erzeugen. Die Diagnose von CS erfolgte nach den CS-Diagnosekriterien des International Cowden's Consortium (Nelen et al., 1996). Bei Personen mit Brustkrebs mit frühzeitiger Manifestation bestand die Stichprobe aus 63 Frauen, die mit unter 35 Jahren Brustkrebs entwickelten (Durchschnittsalter bei der Diagnosestellung ist 27,7 Jahre), bei denen CS klinisch diagnostiziert wurden und bei denen zuvor gezeigt wurde, dass sie keine eindeutig nachteiligen BRCA1-Mutationen trugen (Frauen in der Stichprobe trugen Missense-Polymorphismen unbekannter Signifikanz). Diese Frauen bildeten eine Untergruppe einer Stichprobe von 798 nicht verwandten Personen aus 20 Partnereinrichtungen, die aus Familien ausgewählt wurden, bei denen allgemein ein erhöhtes Risiko für BRCA1-Mutationen vorlag. Die meisten Familien wurden gewählt, da mehrere Fälle von Brustkrebs vorlagen, der Brustkrebs im frühen Alter diagnostiziert wurde und eine Inzidenz von Ovarialkrebs vorhanden war; diese Zustände sind bereits früher mit Keimbahnmutationen von BRCA1 in Verbindung gebracht worden. Einige der Familien erstreckten sich bis zu Verwandten zweiten Grades. Alle Proben aus Einrichtungen in den Vereinigten Staaten stammten von Personen, die an Forschungsstudien über die Genetik von Brustkrebs teilnahmen. Alle Proben aus Einrichtungen außerhalb der Vereinigten Staaten wurden in Übereinstimmung mit den geltenden Richtlinien in Bezug auf Forschung am Menschen erhalten, die von den entsprechenden Behörden, die für die Einrichtungen zuständig waren, aufgestellt wurden. In die Stichprobe wurde nur ein Vertreter jeder Familie eingeschlossen, und es wurden keine Familien eingeschlossen, bei denen bekannterweise eine genetische Verknüpfung zu BRCA1 vorliegt. Es handelt sich hierbei um eine heterogene Probe, die eine Diversität unter Patienten wiedergibt, welche in Kliniken als Hochrisikopersonen vorstellig wurden, im Gegensatz zu einer kontrollierten Stichprobennahme bei Familien- oder Populationsstudien. Dies veranlasste die Erfinder, bei ihren Analysen Proben zu verwenden, die nicht erfordern, dass die Probenhäufigkeit von Untergruppen die Häufigkeit in der allgemeinen Population wiedergibt. Die Erfinder können daher beispielsweise die Wahrscheinlichkeit prüfen, dass eine Frau, bei der im Alter von 30 Jahren Brustkrebs diagnostiziert wird, eine schädliche Mutation von BRCA1 oder TS10q23.3 (auch als MMAC1) aufweist, aber die Erfinder können keine Schätzung der Häufigkeit solche Frauen in der allgemeinen Bevölkerung vornehmen. Von den Proben, die in der TS10q23.3-Studie verwendet wurden, wurden alle identifizierenden Merkmale entfernt.
DNA-Extraktion:
Nach Erhalt des informierten Einverständnisse wurde die genomische DNA der Patienten aus Vollblut oder lymphoblastoiden Zelllinien unter Verwendung des Q1Amp Blut Maxi Kits extrahiert. Die Konzentration wurde durch OD₂₅₀ gemessen, und die Reinheit wurde anhand des Verhältnisses von OD₂₆₀/OD₂₈₀ bestimmt.
Genotypbestimmung:
Primerpaare für den Locus auf Chromosom 10 wurden von Research Genetics erhalten. Der Vorwärtsstrangprimer wurde in Gegenwart von ³²P-γATP und Polynukleotidkinase endständig markiert. PCR^TM-Reaktionen wurden in einem Reaktionsgesamtvolumen von 30 Mikrolitern durchgeführt. Die Reaktionen bestanden aus 10 mM eines jeden Primers, 200 mM Desoxynukleotiden, 1,5 Einheiten Taq-DNA-Polymerase und 50 ng genomischer DNA. Die durchgeführte PCR^TM bestand aus 35 Zyklen mit 45 Sekunden Denaturierung bei 94°C, 45 Sekunden Anheftung bei 55°C und 1 Minute Verlängerung bei 72°C. Am Schluss fand eine zusätzliche Verlängerungsphase von 10 Minuten statt. Die PCR^TM-Reaktionen wurden durch Zugabe von 20 Mikrolitern Stopp-Lösung (95% Formamid, 1 mM EDTA, 0,25% Bromphenolblau, 0,25% Xylolcyanol) angehalten. Anschließend wurden die Reaktionen 5 Minuten lang bei 94°C denaturiert und die Produkte wurden auf einem 8%igen denaturierenden Polyacrylamidgel aufgetrennt. Die Allelgrößen wurden durch Vergleich mit dem SequaMark (Research Genomics) bestimmt, der als Größenstandard auf den Gelen vorhanden war.
Kopplungsanalyse:
Anhand von MLINK wurde eine Zweipunkt-Kopplungsanalyse durchgeführt. Personen unter 20 Jahren wurden als unbekannt eingestuft. Die Häufigkeit des Krankheitsgens wurde überall auf 0,000001 gesetzt und die Markerallelhäufigkeiten wurden mit ILINK geschätzt. Sowohl MLINK als auch ILINK stammen aus dem LINKAGE-Paket, Version 5.2 (Lathtop et al., 1984). Die Rekonstruktion der wahrscheinlichsten Haplotypen in Familie D erfolgte mit GENEHUNTER (Kruglyak et al., 1996). Stammbäume wurden mit Cyrillic Version 2.02 gezeichnet.
Ergebnisse
Beim Cowden-Syndrom (CS) (Lloyd und Dermis, 1963) oder multiplen Hamartomsyndrom (Weary et al., 1972) handelt es sich um eine autosomal dominante Erkrankung, die mit der Entwicklung von Hamartomen und gutartigen Tumoren in unterschiedlichen Geweben in Verbindung steht, darunter der Haut, der Schilddrüse, der Brust, dem Darm und dem Gehirn. Es ist darauf hingewiesen worden, dass für Frauen mit CS ein erhöhtes Brustkrebsrisiko besteht (Brownstein et al., 1978), und, wie bei anderen Anfälligkeitssyndromen, scheinen sie Brustkrebs in einem frühen Alter zu entwickeln. CS ist außerdem mit einer spezifischen Hautläsion, dem Trichilemmom (Tumor des follikulären Infundibulums), verbunden, und deshalb ist dieses Brustkrebsanfälligkeitssyndrom am Vorhandensein eines kutanen Biomarkers erkennbar (Brownstein et al., 1977, 1978). Die Erfinder haben die klinischen und pathologischen Befunde in diesem Syndrom ausführlich untersucht und gezeigt, dass das Durchschnittsalter der Präsentation mit malignem Brustkrebs bei CS 46 Jahre beträgt, wobei der Altersbereich der Präsentation mit Brustkrebs bei betroffenen Frauen bei 33 bis 73 Jahren liegt. Darüber hinaus lag bei nur sehr wenigen der Frauen mit CS eine Familiengeschichte mit Brustkrebs vor. Interessanterweise scheint es für Männer mit CS kein erhöhtes Risiko zur Entwicklung von Brustkrebs zu geben (Brownstein et al., 1978). Die Erfinder haben auch gezeigt, dass Frauen mit CS sehr häufige, gutartige Brusterkrankungen entwickeln und häufig vor der Entwicklung von Brustkrebs mehrere Brustbiopsien durchgeführt worden sind. Eine Krankengeschichte mit Hautkrankheit und gutartiger Brusterkrankung kann daher eine Identifizierung betroffener Personen vor der Entwicklung von Brustkrebs bei dieser Hochrisikopopulation ermöglichen.
Es ist bereits zuvor gezeigt worden, dass sich auf Chromosom 10 ein Locus für CS befindet (Nelen et al., 1996). In dieser Studie wurden insgesamt 12 Familien untersucht, was zur Identifizierung des für das Cowden-Syndrom kritischen Intervalls zwischen Marker D10S215 und D10S564 führte. Bestimmte betroffene Personen in diesen Familien hatten CS und Lhermette-Duclos-Krankheit (LDD) (Nelen et al., 1996; Liaw et al., 1997), eine seltene Gehirnerkrankung, die durch ein dysplastisches Gangliozytom des Zerebellums gekennzeichnet ist (Albrecht et al., 1992). Die Feinkartierung dieses Bereichs führte zur Verfeinerung dieses ersten Ergebnisses (Liaw et al., 1997), was darauf hinweist, dass sich das CS-Gen zwischen Marker D10S215 und D10S541 befindet. In der jüngeren Vergangenheit wurde gezeigt, dass betroffene Personen in vier Familien mit CS Keimbahnmutationen (Liaw et al., 1997) in einem als PTEN bezeichneten Gen (Li et al.,1997), TS10q23.3 (Steck et al., 1997) oder TEP1 (Li et al., 1997) aufweisen, welches sich im für das Cowden-Syndrom kritischen Intervall auf Chromosom 10 befindet. Interessanterweise enthält das vorhergesagte TS10q23.3-Protein Sequenzmotive mit signifikanter Homologie zu der katalytischen Domäne von Proteinphosphatasen und zu den Zytoskelettproteinen Tensin und Auxillin (Li et al., 1997, Steck et al., 1997). Darüber hinaus sind in humanen Tumoren oder Tumorzelllinien der Brust, des Gehirns, der Prostata und der Nieren Mutationen der Kodierungsregion von TS10q23.3 beobachtet worden (Li et al., 1997, Steck et al., 1997). Obwohl die Funktion dieses Gens unbekannt ist, ist es wahrscheinlich, dass TS10q23.3 bei der Regulierung der Zellproliferation eine Rolle spielt und dass der Verlust seiner Funktion bei der Entwicklung humaner Tumor von Bedeutung ist.
Kopplungsanalyse und Mutationsanalyse bei CS-Sippen
Zur Erweiterung der Beobachtungen, die auf einen CS-Locus auf Chromosom 10 hinweisen, führten die Erfinder eine Zweipunkt-Kopplungsanalyse anhand von fünf Markern im für das Cowden-Syndrom kritischen Intervall bei vier Familien mit klinisch erwiesenem CS durch (Nelen et al., 1996). Alle Familien wurden ausführlich untersucht und die Diagnose dieses Syndroms erfolgte nach den CS-Diagnosekriterien des International Cowden's Consortium (Nelen et al., 1996). Zwei kleine Familien zeigten positive LOD-Werte, was eine Kopplung mit drei Loci auf Chromosom 10 nicht ausschließen konnte (siehe Familie A und B, Tabelle 8). Zwei andere Familien mit klinischen Befunden, die mit den oben beschriebenen identisch waren, zeigten für einige der Marker in dieser Region signifikant negative LOD-Werte (Familie C und D, Tabelle 8). Auch ein Heterogenitätstest wurde durchgeführt, der nicht-signifikante Ergebnisse lieferte. Diese Befunde wurden durch die Konstruktion der Haplotypen unterstützt (15). Insbesondere gibt Person 2 aus Familie C den vom nicht-betroffenen Vater geerbten Haplotyp an beide betroffene Kinder weiter. In Familie D schließlich haben Person 2 und 20 einen Haplotyp geerbt, der sich von dem ihrer betroffenen Verwandten unterscheidet.
TABELLE 8 Zweipunktanalyse von CS-Familien mit CA-Wiederholungsmarkern
TABELLE 9
Anhand eines auf PCR^TM und Sequenzierung basierenden Ansatzes haben die Erfinder in 16 betroffenen Personen aus diesen 4 Familien die 9 Exons und damit verbundenen Splice-Übergänge von TS10q23.3 untersucht, wobei die beschriebenen Primer verwendet wurden (Steck et al., 1997). Interessanterweise hatten 4 dieser 16 Personen Brustkrebs und 2 der 4 hatten Brustkrebs vor dem 40. Lebensjahr. Die Erfinder konnten in der Kodierungssequenz dieser 16 Personen aus diesen 4 Familien mit den klassischen Anzeichen und Symptomen von CS keine Mutationen feststellen.
Mutationsanalyse bei Personen mit CS
Die Erfinder haben einen Satz von 31 Personen aus 23 Familien mit CS analysiert, deren Verwandte nicht in den Kopplungsstudien der Erfinder verwendet worden sind. Von den 31 Personen waren 13 verwandte Personen aus 5 Familien. Insgesamt wurden also 23 nicht verwandte Probanden getestet. Eine einzelne betroffene weibliche Person (Walton et al., 1986) zeigte eine Frameshift-Mutation in Exon 7 der Kodierungssequenz (siehe 16). Spezifischer zeigten die Erfinder eine AT-Insertion nach Nukleotid 791 (791insAT), was zu einem Frameshift und zu einem stromabwärts (downstream) liegenden vorzeitigen Abbruchcodon führte. Interessanterweise entwickelte diese Frau einen im Mammogramm negativen Brustkrebs im Alter von 36 Jahren, der zum Zeitpunkt einer prophylaktischen Mastektomie entdeckt wurde (Walton et al., 1986). Die Probandin hatte einen nicht betroffenen Bruder und eine betroffene Tochter. Direkte Sequenzierung von Exon 7 in diesen Personen zeigte das Vorhandensein der identischen Mutation in der betroffenen Tochter (16) und das Nichtvorhandensein der Mutation in dem nicht betroffenen Bruder. Bei der Analyse einer zweiten Person mit CS und Brustkrebs mit frühzeitiger Manifestation (im Alter von 33 Jahren) zeigten die Erfinder eine Insertion von drei Basen in Exon 2 (137ins3), die zur Insertion einer Aminosäure (Asn) führte. Bei einer anderen Frau mit beidseitigem Brustkrebs und Endometrialkrebs identifizierten die Erfinder schließlich eine Frameshift-Deletion von 13 Basenpaaren in Exon 8 (915del12). Diese Daten zeigen 3 mutante Allele von TS10q23.3, die mit CS (Liaw et al., 1997) und insbesondere mit CS und Brustkrebs (Brownstein et al., 1978) verknüpft sind. Bei 27 Personen aus 20 Familien entdeckten die Erfinder jedoch keine Mutationen in den Kodierungssequenzen von TS10q23.3. In dieser Population hatten 7 dieser Personen Brustkrebs, wenn auch jede dieser Frauen Brustkrebs im Alter über 40 Jahren entwickelte. Durch Kombination der Familiendaten und die dieser Personen entdeckten die Erfinder daher Kodierungssequenzmutationen bei 4 Personen aus 3 CS-Familien, entdeckten jedoch keine Veränderungen der Kodierungssequenz (d. h. Missense- oder Silent-Varianten, d. h. Varianten ohne Phänotyp) in 43 weiteren Personen aus 24 Familien mit CS.
Mutationsanalyse bei Frauen mit Brustkrebs mit frühzeitiger Manifestation
Vielen weist auf die Existenz eines genetischen Mechanismus hin, der die Bildung eines Brusttumors bei Brustkrebs mit früher Manifestation (Entwicklung von Brustkrebs vor dem Alter von 40 Jahren) reguliert (Claus et al., 1990). Da CS auf autosomal dominante Art vererbt wird, könnten die genetischen Mechanismen, welche die Entwicklung von Brustkrebs bei dieser Population regulieren, auch eine Rolle bei der Entwicklung von Brustkrebs mit früher Manifestation spielen. Da die Erfinder TS10q23.3-Keimbahnmutationen in CS in Verbindung mit Brustkrebs mit früher Manifestation entdeckt haben und Mutationen in diesem Gen bei Brusttumoren und Brusttumorzelllinien mit relativ großer Häufigkeit auftreten (Steck et al., 1997, Li et al., 1997), wollten die Erfinder die Rolle von TS10q23.3-Keimbahnmutationen bei Brustkrebs mit früher Manifestation weiter untersuchen. Um einen Stichprobensatz zu erhalten, in dem TS10q23.3-Keimbahnmutationen mit größerer Häufigkeit vorkommen, sequenzierten die Erfinder das Gen bei 63 Frauen, die Brustkrebs vor dem Alter von 35 Jahren entwickelt hatten (Durchschnittsalter bei der Diagnosestellung war 27,7 Jahre), bei denen offensichtlich keine klinische Diagnose von CS vorlag und bei denen zuvor gezeigt worden war, dass sie eindeutig keine nachteilige Mutationen in BRCA1 aufweisen (5 Frauen in der Stichprobe trugen Polymorphismen unbekannter Signifikanz). In den 9 Exons von TS10q23.3 in dieser Stichprobe wurden keine Veränderungen der Kodierungssequenz entdeckt. Wenn dagegen dieselben Kriterien zum Mutationsnachweis und zur Mutationsanalyse auf einen in ähnlich definierten Satz von nicht-Ashkenazi-stämmigen Personen mit Brustkrebs angewandt werden würden (ohne Ausschluss von BRCA1-Trägern), würden die Erfinder erwarten, 7 nachteilige Mutationen und 5 Missense-Polymorphismen unbekannter Signifikant bei BRCA1 zu entdecken. Darüber hinaus haben die Erfinder abgesehen von den oben beschriebenen 4 CS-Patienten mit TS10q23.3-Keimbahnmutationen in über 200 Keimbahnchromosomen keine Sequenzpolymorphismen in der Kodierungssequenz dieses Gens festgestellt und tatsächlich nur einen Sequenzunterschied (silent, still) zwischen den Sequenzen von Mensch und Schimpanse gefunden. Wenn die Häufigkeit von Varianten der Kodierungssequenz und der proximalen Splice-Übergangssequenzen bei TS10q23.3 in der Population, aus der diese Stichprobe entnommen wurde, bei 5% liegen würde, hätten die Erfinder eine Chance von 95%, eine oder mehrere solcher Varianten zu entdecken.
Diskussion
Das Cowden-Syndrom nimmt unter den autosomal dominant vererbten genetischen Syndromen insofern eine Sonderstellung ein, als es die Anfälligkeit zur Entwicklung von Brustkrebs erhöht und einen besonderen Biomarker auf der Haut aufweist, das Trichilemmom (Brownstein et al., 1997; 1978). Darüber hinaus liegt bei Frauen mit CS häufig eine Krankengeschicht mit mehreren Brustbiopsien aufgrund gutartiger Brusterkrankung vor der Entwicklung von Brustkrebs vor. Die meisten dieser Frauen weisen keine Familiengeschichte von Brustkrebs auf. Bislang ist die Verbindung zwischen CS und weiblichem Brustkrebs die am besten beschriebene Verbindung zwischen CS und der Anfälligkeit für eine organspezifische Krebserkrankung (Brownstein et al., 1977). Andere Organsysteme, wie beispielsweise die Schilddrüse, scheinen bei solchen Personen Krebs mit erhöhter Häufigkeit zu entwickeln. Im Vergleich zu anderen Syndromen mit Anfälligkeit für autosomalen Brustkrebs. wie beispielsweise dem in Verbindung mit Mutationen in BRCA1 (Ford et al., 1995), ist die Entwicklung von Ovarialkrebs in diesem Syndrom relativ selten. CS hat mit diesen Syndromen gemeinsam, dass sich der Brustkrebs in einem frühen Alter manifestiert und die Wahrscheinlichkeit eines zweiseitigen Brustkrebses erhöht ist. Frühere Beobachtungen zeigten eine Kopplung von CS mit Chromosom 10q22-23 (Nelen et al., 1996). Darüber hinaus ist inzwischen offenkundig, dass CS bei Personen mit Mutationen in einem Gen (Liaw et al., 1997), das unter der Bezeichnung PTEN bekannt ist (Li et al., 1997), TS10q23.3 (Steck et al., 1997) oder TEP1 (Li et al., 1997), die in für da Cowden-Syndrom kritischen Intervall auf Chromosom 10 gefunden wurden, verknüpft ist (Liaw et al., 1997),
In den hier berichteten Beobachtungen identifizierten die Erfinder drei neue Keimbahnmutationen in der Kodierungssequenz von TS10q23.3 in Verbindung mit CS und vor allem bei Personen mit CS und Brustkrebs. Bei zwei verwandten Personen mit CS beschrieben die Erfinder eine Frameshift-Mutation in Exon 7, die zu einem vorzeitigen Terminationscodon führt und die bei einer betroffenen Mutter und ihrer betroffenen Tochter identisch ist. Diese TS10q23.3-Mutation scheint mit Brustkrebs mit frühzeitiger Manifestation verknüpft zu sein, da eine der beiden betroffenen Personen Brustkrebs im Alter von 36 Jahren entwickelte. Bei einer dritten betroffenen Person identifizierten die Erfinder eine Deletion von 13 Basenpaaren in Exon 8. Diese Person entwickelte Brustkrebs zwar nicht in einem frühen Alter, hatte aber eine Krankengeschichte von beidseitigem Brustkrebs. Außerdem entwickelte sie während der Behandlung mit Tamoxifen Endometrialkrebs. In Anbetracht dessen, dass Endometrialkrebs mit CS (Starink et al., 1986) und der Verwendung von Tamoxifen (Fornander et al., 1989) in Verbindung gebracht wurde, ist der Beitrag beider Risikofaktoren zur Krankheitsentwicklung bei dieser Frau unbekannt. Dies eröffnet aber die Möglichkeit, dass die Unterpopulation von Frauen, die während der Behandlung mit Tamoxifen Endometrialkrebs entwickeln, CS und/oder Mutationen in TS10q23.3 aufweisen könnten. Schließlich haben die Erfinder bei einer anderen Frau, die im Alter von 33 Jahren Brustkrebs entwickelte, eine Insertion von 3 Basen in Exon 2 identifiziert.
In dem von den Erfindern analysierten Satz von Personen mit CS haben die Erfinder in 4 Personen aus 3 Familien TS10q23.3-Keimbahnmutationen entdeckt, aber in den verbleibenden 43 Personen aus 24 nicht verwandten Familien keine Veränderungen der Kodierungssequenz festgestellt. Diese Daten unterstützen die eingeschränkten Kopplungsdaten der Erfinder und deuten an, dass nicht bei allen CS-Familien eine Verknüpfung zu dem auf Chromosom 10 identifizierten Locus vorhanden ist. Während die von den Erfordern durchgeführten Studien nicht ausschließen, dass Mutationen in den 5'-regulatorischen Regionen oder in der 3'-untranslatierten Region von TS10q23.3- oder andere Mechanismen, die das Expressionsniveau verändern, beispielsweise Silencing durch Methylierung, mit CS in Verbindung stehen, unterstützen sowohl die Kopplungsdaten als auch die Ergebnisse der DNA-Sequenzierung die Vorstellung, dass CS genetisch heterogen ist. Tuberöse Sklerose, eine andere autosomal dominante Erkrankung, die mit der Bildung von Hamartomen in der Haut und anderen Organen verknüpft ist, erwies sich als genetisch heterogen mit unterschiedlichen Loci auf Chromosom 9q34 (Haines et al., 1991) und Chromosom 16p13.3 (Kandt et al., 1992). Die Ergebnisse der Erfinder deuten an, dass dies auch für CS zutreffen könnte. Warum dies im Rahmen der ersten Beobachtungen nicht gezeigt werden konnte, ist unklar, könnte aber auf den ethnischen Hintergrund der ersten untersuchten Familien zurückzuführen sein (Nelen et al., 1996, Liaw et al., 1997). Darüber hinaus präsentierten Bestimmte dieser Personen mit CS und Lhermette-Duclos-Krankheit, welche die Erfinder nie bei einem CS-Probanden oder in einer CS-Familie gesehen haben (Nelen et al., 1996, Liaw et al., 1997).
Vieles weist auf das Vorhandensein eines genetischen Mechanismus hin, der die Bildung eines Brusttumors bei Brustkrebs mit frühzeitiger Manifestation reguliert (Claus et al., 1990). Tatsächlich wurde Brustkrebs mit fühzeitiger Manifestation mit Mutationen in BRCA1 (Miki et al., 1994) und BRCA2 (Wooster et al., 1995) in Verbindung gebracht. Es besteht eine Verknüpfung zwischen CS und Brustkrebs mit frühzeitiger Manifestation, und bei dem Krebs handelt es sich in der Regel um ein duktales Karzinom ( eBrownsteint al., 1977, Brownstein et al., 1978). Rachel Cowden, nach der dieses Syndrom bekannt ist, verstarb offensichtlich im Alter von 31 Jahren an Brustkrebs (Lloyd und Dennis, 1963, Brownstein et al., 1978). Wie hierin beschrieben, haben die Erfinder TS10q23.3-Mutationen bei 2 Personen mit CS mit Brustkrebs mit frühzeitiger Manifestation sowie bei 1 Person mit beidseitigem Brustkrebs identifiziert. Wenn die Erfinder allerdings bei einer Untergruppe von Frauen mit Brustkrebs mit frühzeitiger Manifestation ohne Anzeichen von CS und zuvor gezeigten Wildtyp-Sequenzen von BRCA1 nach TS10q23.3-Keimbahnmutationen suchten, konnten die Erfinder keine Sequenzvarianten entdecken. Diese Daten weisen darauf hin, dass Keimbahnmutationen in TS10q23.3 in zumindest dieser Unterpopulation von Fällen mit Brustkrebs mit frühzeitiger Manifestation selten auftreten.
BEISPIEL 9
Suppression der Tumorigenität von Glioblastomzellen durch Adenovirus-vermittelten MMAC1/PTEN-Gentransfer
Es wurden weitere Studien konzipiert, um die Funktion von MMAC1/PTEN als Tumorsuppressor weiter zu untersuchen. Es wurde ein replikationsdefektes Adenovirus (MMCB) konstruiert, um MMAC1 effizient und transient in Tumorzellen zu transduzieren. Die in diesem Beispiel vorgestellten Daten unterstützen eine Tumorsuppressionsaktivität von MMAC1/PTEN in vivo und deuten an, dass in-vivo-Gentranser mit diesem rekombinanten adenoviralen Vektor bei der Krebs-Gentherape nützlich sein wird.
Material und Verfahren
Zelllinien:
Die MMAC1-mutierte Glioblastom-Zelllinie U87MG wurde von der American Type Culture Collection (ATCC) erhalten. Die Zellen wurden in Kulturmedium (DME/10% FBS/1% L-Glutamin) in einer befeuchteten Atmosphäre mit 7% CO₂ bei 37°C gehalten. Embryonale Nierenzellen 293 wurden ebenfalls von ATCC erhalten und in DME-Kulturmedium gezüchtet, das mit 10% FBS angereichert war.
RT-PCR Analyse:
Aus U87MG-Zellen (Tri Reagent, Molecular Research Center) wurde nach den Anleitungen des Herstellers Gesamt-RNA isoliert. RNA wurde unter Verwendung von MuLV-RNA (RNA PCR Kit, Perkin-Elmer), Random-Hexamer und anderen Kitreagenzien revers transkribiert, gefolgt von PCR unter Verwendung der Primer MAC1.6f (5'-CTG CAG AAA GAC TTG AAG GCG TA-3', SEQ ID Nr.: 58) und MAC1.6r (5'-GCC CCG ATG TAA TAA ATA TGC AC-3') (SEQ ID Nr.: 59), die Sequenzen in den MMAC1-Exons 2 und 5 entsprachen. Die Amplifizierungsbedingungen waren Denaturierung bei 95°C für 1 Minute, anschließend (95°C, 15 s; 55°C, 30 s) für 25 Zyklen, dann 72°C für 5 Minuten. Die erwartete Größe des Normalproduktes war 317 bp. Die anomale Bande von U87MG wurde aus einem Agarosegel ausgeschnitten, gereinigt (UltraClean, Mo Bio Labs) und mit einem automatischen Sequenziersystem (ABI 373A, Perkin Elmer) direkt sequenziert.
Viren:
Ein rekombinantes Adenovirus, das Wildtyp p53 (FTBC) enthielt, wurde wie zuvor beschrieben (Wills et al., 1994) konstruiert. Das Genom dieses Vektors weist Deletionen der E1- und E3-Region und des Protein-IX-Gens auf und exprimiert sein Transgen unter der Kontrolle des Immediate-Early-Promotors/Enhancers des humanen Zytomegalievirus (CMV). Der MMAC1/PTEN-Vektor MMCB wurde auf genau dieselbe Art und Weise konstruiert, außer, dass p53 durch eine cDNA, die MMAC1 in voller Länge kodiert (Steck et al., 1997), ersetzt wurde. Der Kontrollvektor GFCB wurde so konstruiert, dass er MMCB entsprach, mit Ausnahme seines Transgens, verstärktem grün fluoreszierenden Protein (Clontech). Es wurde ein weiterer passender Kontrollvektor, ZZCB, ohne ein Transgen konstruiert. Der BGCA-Kontrollvektor, der LacZ von E.coli, angetrieben durch den CMV-Promotor, exprimiert, wurde aufgrund der Einschränkungen in Bezug auf die Verpackungsgröße in ein Genom mit partieller E4-Deletion in Ergänzung zur Deletion von E1, E3 und Protein IX konstruiert (Wang et al., 1997). Alle Viren wurden in 293-Zellen gezüchtet und durch DEAE-Säulenchromatographie wie beschrieben (Huyghe et al., 1995) gereinigt. Viruspartikelkonzentrationen wurden durch Resource Q HPLC (Shabram et al., 1997) bestimmt und die Primärstruktur aller Transgene wurde durch automatisiertes Sequenzieren viraler DNA verifiziert.
Immunnachweis von MMAC1-Protein:
Zellmonolayer wurden 24 Std. lang mit GFCB oder MMCB mit einer unterschiedlichen Anzahl an Viruspartikeln pro Milliliter Wachstumsmedium (pn/ml) infiziert. Virushaltige Lösungen wurden nach 24 Std. entfernt und die Zellen wurden zu diesem Zeitpunkt entweder geerntet oder mit Wachstumsmedium gefüttert und zu späteren Zeitpunkten geerntet. Das Ernten der Zellen erfolgte durch Abschaben in kalte phosphatgepufferte Salzlösung (PBS), Zentrifugation und erneutes Waschen in kaltem PBS, anschließendes Gefrieren-Auftauen und Resuspendieren in Lysepuffer [50 mM MOPS, pH 7,0, 150 mM NaCl, 1 % NP-40, 5% Glycerol, 0,4 mM EDTA und ergänzt durch 1 mM DTT und IX Complete Protease Inhibitor Cocktail (Boehringer Mannheim)]. Zelllysate wurde durch Zentrifugation bei 10.000 × g für 15 Minuten geklärt und die Überstände auf Proteingehalt normalisiert. Die Proben wurden durch SDS-PAGE in vorgegossenen 8%igen TRIS-Glycin-Gelen (Novex) aufgetrennt, anschließend auf Poly(vinylidendifluorid)-Membranen (Immobilon-P) für ein Western Blotting überführt. Die Membranen wurden mit TBST blockiert, das 5% Magermilch enthielt, und dann mit einem polyklonalen Anti-MMAC1-Kaninchenantikörper (BL74), gefolgt von Esel-Anti-Kaninchen-IgG, konjugiert mit Meerrettichperoxidase (Amersham), geblottet. MMAC1 wurde durch Chemilumineszenz (HCL Kit, Pierce) anhand von Kodak XAR-5-Film nachgeweisen.
FACS-Assay zur Bestimmung der Infektiosität:
U87MG-Zellen wurden mit 2 × 10⁵ Zellen/Vertiefung in Platten mit 6 Vertiefungen ausplattiert und über Nacht inkubiert, anschließend 24 Stunden lang mit GFCB in Konzentrationen zwischen 1 × 10⁵ bis 1 × 10⁹ Partikeln/ml infiziert. Die Zellen wurden durch Trypsinierung geerntet und durchflusszytometrisch (Becton Dickinson FACScan) hinsichtlich grüner Fluoreszenz (Peaknachweis bei 525 nm, Filter FL-I) analysiert. Zellen wurden hinsichtlich ihrer Grösse („forward scatter", FSC) und Granularität („side scatter", SSC) eingegrenzt und ein Schwellenwert für die Fluoreszenzintensität wurde derart eingerichtet, dass ~99% der nicht infizierten Zellen negativ waren. Anschließend wurde der Prozentanteil von GFCB-infizierten Zellen, deren Fluoreszenz diesen Schwellenwert übertraf, ermittelt, was eine Mindestschätzung des Prozentanteils infizierter Zellen darstellte.
³H-Thymidineinbautest:
Zellen wurden mit 5 × 103 Zellen/Vertiefung in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Costar) ausplattiert und über Nacht inkubiert. Verdünnungen von ZZCB, GFCB und FTCB und MMCB in Medium im Bereich von 5 × 106 bis 1 × 109 Partikel/ml wurden in dreifacher Ausführung zu den Zellmonolayern gegeben und anschließend 24 Std. inkubiert. Virushaltige Lösungen wurden 24 Stunden nach der Infektion entfernt und für weitere 24 Stunden durch neues Gewebekulturmedium ersetzt. 4 Stunden vor dem Ernten wurden die Zellen mit 1 μCi ³H-Thymidin pro Vertiefung behandelt. Zellen wurden auf Glasfaserfilter geerntet und der Einbau von ³H-Thymidin wurde mit Flüssigszintillation (Top Count, Packard) bestimmt. Die Ergebnisse sind als Prozentanteil pufferbehandelter Kontrollen aufgetragen (Mittelwert ± SD).
Zellzahl/Testung auf Lebensfähigkeit:
Subkonfluente Monolayer von U87MG-Zellen wurden in dreifacher Ausführung mit MMCB oder GFCB-Adenovirus in verschiedenen Konzentrationen für 24 Stunden infiziert, wonach Überstände für weitere 48 Stunden mit frischem Gewebekulturmedium ersetzt wurden. Zellen wurden anschließend durch Trypsinierung geerntet und lebensfähige Zellen wurden im Trypanblauausschlussverfahren mit einem Hämozytometer gezählt.
Testung auf Koloniebildung in Weichagar:
U87MG-Zellen, die wie oben 24 Stunden lang mit 5 × 10⁶, 5 × 10⁷ oder 5 × 10⁸ Partikeln/Füllung infiziert wurden, wurden in Gewebekulturmedium, das 0,35% Agar enthielt, suspendiert und in dreifacher Ausführung auf 0,7%igem Agar in 35-mm-Gewebekulturvertiefungen geschichtet. Die Kulturen wurden in einer befeuchteten Atmosphäre, die 7% CO₂ enthielt, bei 37°C mit darüber liegendem Gewebekulturmedium inkubiert, das alle fünf Tage ausgetauscht wurde. Das Koloniewachstum wurde 14 Tage nach der Infektion beurteilt.
Tumorigenitäts-Assay:
U87MG-Zellen wurden in einer Dichte von 1 × 10⁷ Zellen je T225-Flasche ausplattiert. Nach Inkubation über Nacht wurden die Zellmonolayer 24 Stunden lang mit 5 × 10⁷ oder 5 × 10⁸ Partikeln/ml der Adenoviren GFCB, FTCB, BGCA oder MMCB infiziert. Infizierte oder nicht infizierte Zellen wurden durch Trypsinierung geerntet, in Gegenwart von Trypan Blau gezählt und subkutan (5 × 10⁶ lebensfähige Zellen pro Flasche) in athymische weibliche nu/nu-Mäuse (Simonsen Labs) injiziert. Die Mäuse wurden nach 21 oder 30 Tagen auf Vorhandensein von Tumoren untersucht; Die dreidimensionalen Tumordurchmesser wurden mit Vernier-Messschiebern gemessen und die Tumorvolumen wurden als Produkt davon berechnet.
Ergebnisse und Diskussion
Die Auswahl humaner Glioblastomzellen U87MG (Ponten und Macintyre, 1968) für die Studie erfolgte auf der Basis ihrer bekannten MMAC1-Mutation (Steck et al., 1997), ihrer Fähigkeit zur Bildung von Kolonien in Weichagar und ihrer subkutanen Tumorigenität in Nacktmäusen. Durch Sequenzierung zeigte sich, dass in einem anomal kleinen RT-PCR-Produkt, das mit Primern in Exon 2 und 5 (siehe obiger Abschnitt „Verfahren" in Beispiel 9) aus U87MG-RNA erhalten wurden, Exon 3 fehlte, was der Mutation der Intron-3-Splice-Donorstelle (Steck et al., 1997) entsprach. Obgleich Exon 3 45 bp (15 Codons) enthält und ein Readthrough-Produkt (Produkt, bei dessen Transkription ein Stop-Codon überlesen wird) im Leseraster möglich ist, kodieren die fehlenden Reste eine konservierte Alphahelix im nativen Protein und ihr Verlust hob die wachstumshemmende Aktivität auf, wie von Fumari et al., (1997) gemessen wurden.
Das gereinigte rekombinante MMAC1-enthaltende Adenovirus (MMCB) wurde durch Western Blotting von Zelllysaten mit einem polyklonalen Kaninchenantikörper hinsichtlich der Expression des Transgens in U87MG-Zellen charakterisiert (17). In nicht infizierten oder mit Kontrollvirus infizierten Zellen wurde kein endogenes MMAC1-Protein festgestellt, wurde aber am Ende des 24-stündigen Infektionszeitraums sowie nach 48 Stunden, 72 Stunden und 96 Stunden in dosisabhängiger Art in MMCB-infizierten Zellen nachgewiesen (17). Diese Studie verifizierte die effiziente Transduktion und akute Expression von exogenem MMAC1-Protein in U87MG-Gliomzellen und validiert seinen Nachweis durch Western Blotting mit Antikörper BL74.
Die Infektiosität von U87MG-Zellen wurde anhand eines rekombinanten Adenovirus, das mit Ausnahme seines Transgens, das grün fluroeszierendes Protein kodierte, identisch zu MMCB war, quantitativ durch FACS-Analyse bestimmt, (18). Es wurde die erwartete sigmoide Infektiositätskurve erhalten, aus der geschätzt wurde, dass 85 – 90 % der Zellen 24 Stunden lang mit einer viralen Dosis von 5 × 10⁷ Partikeln/ml infiziert worden waren. Bemerkenswert ist, dass die hierin verwendeten Dosierungsparameter nicht auf der Plaque-bildenden Einheit oder ihrer Ableitung, der Multiplicity of Infection, beruhen. Zuvor ist gezeigt worden, dass die Konzentration und der Infektionszeitpunkt von Adenovirus die primären Determinanten einer Transduktion in vitro sind (Nyberg-Hoffman et al., 1997).
In-vitro-Proliferation von MMCB-infizierten gegenüber Kontroll-Ad-infizierten U87MG-Zellen wurde durch Einbau von ³H-Thymidin für eine Reihe vitaler Konzentrationen gemessen (19). Im Vergleich zu zwei Kontrolladenoviren (GFCB und ZZCB) wurde U87MG bei den meisten viralen Dosismengen differenziell inhibiert, wie bereits zuvor für einige Zelllinien festgestellt worden ist (Harris et al., 1995). Die Hemmung der DNA-Synthese durch MMCB war vergleichbar mit der durch adenoviralen p53-Gentransfer induzierten (FTCB, 19A).
Wachstumshemmung wurde in einem zweiten in-vitro-Assay bestätigt, indem lebensfähige Zellen 72 Stunden nach Start der Infektion gezählt wurden (19B). Zu diesem Zeitpunkt hatte MMCB die Zellzahlen im Vergleich zu GFCB in gleicher Dosis zu etwa 50% reduziert. Diese Hemmung war in ihrer Größenordnung mit der Hemmung vergleichbar, die bei der transienten Plasmidtransfektion beobachtet wird (Furnari et al., 1997). MMCB- und GFCB-infizierte Kulturen wiesen nach 72 Stunden ähnliche Lebensfähigkeitsraten, und morphologische Hinweise auf Zelltod auf, wie beispielsweise Zell-Blasenbildung („Blebbing") oder Kernfragmentierung, wurden bei Behandlung mit MMCB nicht beobachtet.
Die Effekte von MMAC1 auf ankerunabhängiges Wachstum wurden ebenfalls durch Koloniebildung in Weichagar nach Transduktion durch MMCB gegenüber GFCB oder FTCB bestimmt. Letzteres wurde eingeschlossen, um den Assay mit einem etablierten Tumorsuppressorgen zu validieren. Bei einer Dosis von 5 × 10⁷ Partikeln/ml für 24 Stunden wurde die Koloniebildung mit MMCB oder FTCB gegenüber der GFCB-Kontrolle um etwa 50% gehemmt, wohingegen bei 5 × 10⁸/ml MMCB oder FFCB eine Hemmung von >85% (relativ zu GFCB) erreicht werden konnte (20). In diesem in-vitro-Assay trat daher ein dosisabhängiger, genspezifischer Effekt von MMAC1 hervor.
Es sind zwei Tumorigenitäts-Assays durchgeführt worden, in denen 5 × 10⁶ MMCB-infizierte U87MG-Zellen pro Injektion verwendet und mit derselben Anzahl von Zellen, die von drei verschiedenen Kontroll-Ad infiziert wurden, verglichen wurden: GFCB (grün fluoreszierendes Protein zum Abgleich des ΔE1/ΔE3-Hintergrunds), FTCB (p53 zum Abgleich des ΔE1/ΔE3-Hintergrunds) und BGCA (LacZ für den ΔE1/ΔE3/ΔE4-Hintergrund) (Tabelle 10). Die Unterschiede zwischen Versuch 1 und 2 beinhalteten die Verwendung von zwei Dosisstufen gegenüber einer und die Beendigung nach 21 gegenüber 30 Tagen. Nach 21 oder 30 Tagen waren MMCB-infizierte U87-Zellen vollständig nicht-tumorigen, mit Ausnahme dreier sehr kleiner Tumore (~10 mm³) in der niedrigeren Dosisstufe in Versuch 1. Bei allen 39 Mäusen, die mit nicht-infizierten oder Kontroll-Ad-infizierten Zellen injiziert worden waren, bildeten sich Tumoren. Die Reportergen-enthaltenden Kontroll-Ads GFCB und BGCA wiesen gegenüber pufferbehandelten Zellen eine gewisse Aktivität hinsichtlich einer Reduzierung der durchschnittlichen Tumorgröße auf, ein unspezifischer „adenoviraler" Effekt, der von den Erfordern bereits zuvor bemerkt worden war (Will et al., 1994, Harris et al., 1995). Das p53-enthaltende Adenovirus hatte einen drastischeren Effekt auf die durchschnittliche Tumorgröße (~68 mm³), aber dennoch bildeten sich in 6 von 6 Mäusen Tumoren. Diese Ergebnisse stimmen mit den wachstumshemmenden Effekten eines p53-Adenovirus-Gentransfers in U87MG-Zellen überein, von denen an anderer Stelle berichtet wurde, auch wenn diese Zellen p53-Allele mit der Wildtypsequenz enthalten (Gomez-Manzani et al., 1996, Kock et al., 1996). Auf jeden Fall deuten diese Daten auf eine genspezifische Tumorsuppressionsaktivität von MMCB in U87MG-Zellen bei mäßigen Virusdosismengen hin.
Durch Verwendung eines rekombinanten adenoviralen Gentransfersystems wurde eine wachstumshemmende Wirkung von MMAC1/PTEN auf U87MG-Zellen in vitro gezeigt. Die Verwendung eines rekombinanten Adenovirus war hilfreich, um die technische Schwierigkeit der Untersuchung von Tumorzellen, die potenziell wachstumshemmende Proteine wie MMAC1 exprimieren, zu umgehen. In dem in-vivo-Assay wurde eine spezifische Tumorsuppressionsfunktion von MMAAC1 am deutlichsten festgestellt, was die Bedeutung des Tumorigenitätsassays bei der Bestimmung einer Tumorsuppressionsfunktion hervorhebt. Diese Daten weisen darauf hin, dass die MMAC1-Inaktivierung bei der Entstehung von Glioblastom-Tumoren eine Rolle spielt, und lassen weiter den Schluss zu, dass ein MMAC1/PTEN-Gentransfer in vivo als potenzieller Gentherapieansatz angesehen werden kann.
Während die Zusammensetzungen und Verfahren dieser Erfindung in Form von bevorzugten Ausführungsformen beschrieben worden sind, ist es für einen Fachmann offensichtlich, dass die Zusammensetzungen und/oder Verfahren und die Schritte oder der Ablauf von Schritten der hierin beschriebenen Verfahren variiert werden können, ohne vom Konzept, Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen. Insbesondere ist offensichtlich, dass bestimmte Mittel, die sowohl chemisch als auch physiologisch verwandt sind, als Ersatz für die hierin beschriebenen Mittel verwendet werden können, wobei dieselben oder ähnliche Ergebnisse erzielt werden würden. Alle derartigen Substitute und Modifikationen, die für einen Fachmann offensichtlich sind, gelten als im Geist, Umfang und Konzept der Erfindung enthalten, wie in den beigefügten Ansprüchen definiert ist.
BEZUGSQUELLEN
Insofern als sie exemplarische verfahrensbezogene oder andere Details in Ergänzung zu den hierin Ausgeführten bereitstellen, sind die folgenden Bezugsquellen hierin spezifisch durch Bezugnahme enthalten:

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SEQUENZLISTE

Claims

Verfahren zur Diagnose des Cowden-Syndroms, umfassend das Bestimmen der Anwesenheit einer Mutation in der codierenden Sequenz für den als TS10q23.3 bezeichneten Tumorsuppressor in Zellen einer Probe eines Individuums, wobei die Mutation ausgewählt ist aus: (a) einer Leseraster-Mutation, die durch eine Insertion von AT an Position 791 von Exon 7 entsteht; (b) einer Leseraster-Mutation, die durch eine Deletion von 13 Nucleotiden an Position 915–927 von Exon 8 entsteht; und (c) einer Insertions-Mutation, die durch eine Insertion von 3 Nucleotiden an Postion 137 von Exon 2 entsteht.
Verfahren zur Diagnose eines für Brustkrebs prädisponierten Individuums, umfassend das Bestimmen der Anwesenheit einer Mutation in der codierenden Sequenz für den als TS10q23.3 bezeichneten Tumorsuppressor in Zellen einer Probe des Individuums, wobei die Mutation ausgewählt ist aus: (a) einer Leseraster-Mutation, die durch eine Insertion von AT an Position 791 von Exon 7 entsteht; (b) einer Leseraster-Mutation, die durch eine Deletion von 13 Nucleotiden an Position 915–927 von Exon 8 entsteht; und (c) einer Insertions-Mutation, die durch eine Insertion von 3 Nucleotiden an Postion 137 von Exon 2 entsteht.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Zellen ausgewählt sind aus Brustzellen, Eierstockzellen, Schilddrüsenzellen und Endometriumzellen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Probe eine Gewebsprobe oder Flüssigprobe ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Bestimmen das Testen auf eine Nucleinsäure der Probe umfasst.
Verfahren nach Anspruch 5, weiterhin umfassend die Probe Bedingungen zu unterziehen, die geeignet sind, um die Nucleinsäure zu vervielfältigen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Bestimmen das Testen auf Proteine der Probe umfasst.
Verfahren nach Anspruch 7, weiterhin umfassend die Proteine der Probe einem ELISA zu unterziehen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Bestimmen ein Test ist, ausgewählt aus Sequenzierung, Wild-Typ-Oligonucleotidhybridisierung, Mutanten-Oligonucleotidhybridisierung, SSCP, PCR^TM und RNase-Schutz.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Test Wild-Typ oder Mutanten-Oligonucleotidhybridisierung ist und das Oligonucleotid für einen Array auf einem Chip oder Wafer beschaffen ist.
Isolierte Nucleinsäure, umfassend eine DNA, die eine Mutante des als TS10q23.3 bezeichneten Tumorsuppressors codiert, wobei die DNA eine Mutation umfasst, ausgewählt aus Teil (a) bis (c), wie in Anspruch 1 definiert.
Nucleinsäure nach Anspruch 11, wobei die codierende Sequenz für den mutanten Tumorsuppressor funktionell mit einem Promotor verbunden ist.
Oligonucleotidhybridisierungs-Sonde zum Nachweisen einer Mutation, wie in einem der Teile (a) bis (c) von Anspruch 1 definiert.
Oligonucleotidhybridisierungs-Sonde nach Anspruch 13, die für einen Array auf einem Chip oder Wafer beschaffen ist.