DE60222247T2

DE60222247T2 - Herstellung von kalibratoren und ihre verwendung zur quantifizierung von besonderen nukleotidsequenzen

Info

Publication number: DE60222247T2
Application number: DE60222247T
Authority: DE
Inventors: Jean Gabert; Emmanuel Beillard
Original assignee: Université de la Mediterranée; Universite de la Mediterranee; Universite de la Mediterranee Aix Marseille II
Current assignee: Université de la Mediterranée; Aix Marseille Universite; Universite de la Mediterranee
Priority date: 2001-03-15
Filing date: 2002-03-15
Publication date: 2008-05-08
Anticipated expiration: 2022-03-16
Also published as: DK1370653T3; ATE372380T1; EP1370653A1; WO2002074949A9; WO2002074949A1; EP1370653B1; JP2004524034A; EP1852504A1; PT1370653E; DE60222247D1; ES2292742T3; CY1108038T1; US20040161764A1; ATE510012T1; EP1852504B1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von Eichsubstanzen und ihre Anwendung bei der Quantifizierung von interessierenden Nucleotidsequenzen.
Die Quantifizierung von interessierenden Nucleotidsequenzen kann gemäß mehreren Ansätzen erfolgen:

– durch Bestimmung der minimalen Empfindlichkeit eines Experiments (qualitative PCR);
– durch Verwendung eines Kompetitors (kompetitive PCR); oder
– durch quantitative Echtzeit-PCR.

Die qualitative PCR betrifft die Suche nach Nucleotidsequenzen. Es handelt sich darum, die Anwesenheit oder Abwesenheit dieser Sequenzen festzustellen (Endpunkttechnik). Folglich ist keine genaue Quantifizierung möglich.
Die kompetitive PCR ist eine quantitative PCR, die sich einen plasmidischen chimärischen Kompetitor zu Nutze macht. Diese Technik setzt voraus, dass die Effektivität der PCR für den Kompetitor und das gesuchte Transcript, die unterschiedlicher Größe sind, identisch ist. Andererseits wird bei dieser Technik eine Nested-PCR verwendet, was die Gefahr einer Kontaminierung enorm steigert.
Die quantitative Echtzeit-PCR zielt darauf ab, die Nucleinsäuren einer Probe mittels fluoreszierender Moleküle zu quantifizieren. Es handelt sich um eine Echtzeittechnik und nicht um eine Endpunkttechnik. Die Messung erfolgt also während der exponentiellen Phase der PCR, was es erlaubt, eine Ausbeute der PCR von 100% anzunehmen. Auf dem Gebiet der Onkologie waren Marcucci et al. [1] die ersten, die dieses Verfahren beschrieben. Im Verlaufe der Realisierung des Verfahrens durch die Erfinder wurden jedoch Stabilitätsprobleme festgestellt. Außerdem erreicht die Amplifikationsausbeute der zu bestimmenden Sequenz der Eichsubstanz nicht 100%, und die mittlere Expression des ubiquitären Gens, das für die Normierung der Bestimmung verwendet wurde, kann nicht korrekt quantifiziert werden. Diese Schwierigkeiten führen also zur Nichtreproduzierbarkeit der Bestimmungen.
Ein weiteres Problem, das die Gen-Quantifizierung stört, resultiert aus Folgeschwankungen, die für dieselbe Bestimmung beobachtet wurden, wenn sie von verschiedenen Labors durchgeführt wurden. Die erhaltenen Ergebnisse scheinen also von der bestimmenden Person und von den Bedingungen, unter denen diese arbeitet, abzuhängen.
Aufgrund ihrer Arbeiten konnten die Erfinder ein Quantifizierungsverfahren für interessierende Nucleotidsequenzen entwickeln, mit dem sie sich von allen äußeren Parametern befreiten, die zu Schwankungen in den Ergebnissen einer Bestimmung führen können, und so eine vollkommene Reproduzierbarkeit der Ergebnisse dieser Bestimmung erhielten, unabhängig davon, in welchem Labor diese Bestimmung durchgeführt wurde.
Die Erfindung stellt also einen Kit zur Bestimmung einer zu bestimmenden interessierenden DNA-Sequenz bereit, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er wenigstens Folgendes umfasst: eine erste Verdünnungsreihe von bekannten Konzentrationen einer Konstruktion (Eichsubstanz genannt), die eine DNA-Sequenz, die der zu bestimmenden interessierenden DNA-Sequenz entspricht, umfasst und die in einen Vektor eingefügt und linearisiert ist, wobei das Verdünnungsmedium weiterhin Nucleinsäuren umfasst, die keine Homologie mit den interessierenden Sequenzen der Konstruktionen aufweisen, und eine zweite Verdünnungsreihe von bekannten Konzentrationen einer Konstruktion, die eine Sequenz eines ubiquitären Gens oder einer RNA eines ubiquitären Gens umfasst und die in einen Vektor eingefügt und linearisiert ist.
Der Ausdruck "Eichsubstanz" bedeutet eine Konstruktion, die es erlaubt, eine quantitative Bestimmung durchzuführen.
Die Linearität der Eichsubstanz ist der wesentliche Parameter, der die Reproduzierbarkeit garantiert. Tatsächlich erlaubt es die Linearität der Eichsubstanz, die Ausbeute der PCR beträchtlich zu verbessern.
Geeignete Vektoren sind Klonierungsvektoren.
Vorzugsweise ist die Eichsubstanz vollständig künstlich.
Die Vorschrift für die Herstellung einer vollständig künstlichen Eichsubstanz ist in Beispiel 1 ausführlich beschrieben.
Dieses Merkmal erlaubt es, jede Störung der Bestimmung aufgrund der Komplexität der biologischen Substanz zu vermeiden.
Außerdem handelt es sich bei der interessierenden Sequenz um DNA.
Tatsächlich erlaubt die Verwendung von DNA eine bessere Stabilität der Eichsubstanz gemäß der Erfindung über die Zeit.
Der für die Herstellung der Eichsubstanz gemäß der Erfindung verwendete Vektor könnte vorteilhafterweise ein Plasmid sein.
Die zweite Verdünnungsreihe ermöglicht die Durchführung einer korrekten Quantifizierung des ubiquitären Gens oder des Transcripts des ubiquitären Gens, um die erste Bestimmung zu normieren.
Insbesondere ermöglicht die Ähnlichkeit der Arbeitsbedingungen dieser beiden Bestimmungen die Genauigkeit der Normierung.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das Verdünnungsmedium der Kits gemäß der Erfindung eine Pufferlösung.
Die Wahl der Pufferlösung erlaubt es, die Stabilität der Eichsubstanzen während ihrer Lagerung und während der Bestimmungen zu begünstigen.
Die Anwesenheit von Nucleinsäuren in den Medien der Verdünnungsreihen erlaubt es, das biologische Medium der zu bestimmenden Probe künstlich nachzubilden. Es handelt sich tatsächlich darum, die Gesamtheit der Bestimmungen unter ähnlichen Bedingungen durchzuführen, um die beste Reproduzierbarkeit zu erhalten.
Vorzugsweise ist das Verdünnungsmedium eine Pufferlösung mit einem pH-Wert von größer oder gleich 7.
Dieser pH-Wert erlaubt es, eine optimale Stabilität der Eichsubstanzen zu garantieren.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Nucleinsäure, die in die Verdünnungsmedien eingeführt wird, um RNA von E. coli.
Vorzugsweise ist das ubiquitäre Gen oder die RNA des ubiquitären Gens aus der Gruppe ausgewählt, die aus dem Abelson-Gen (ABL), β-Glucuronidase (GUS) und β2-Mikroglobulin (B2M) besteht.
Diese Transcripte eines ubiquitären Gens wurden insbesondere von den Erfindern so gut untersucht, dass sie perfekt charakterisiert sind (siehe Tabelle 1 von Beispiel 2). Ihre Verwendung erlaubt es also, die Reproduzierbarkeit von einer Bestimmung zur nächsten zu steigern.
Die Kits gemäß der Erfindung sind insbesondere für die Bestimmung von interessierenden Genen wie AML1-ETO, E2A-PBX1, BCR-ABL, MLL-AF4, TEL-AML1, SIL-TAL, PML-RARA, CBFb-MYH11 geeignet. Daher können die Kits gemäß der Erfindung vorteilhafterweise die Verdünnungsbereiche dieser interessierenden Gene umfassen.
Die Sequenzen und die Referenzwerte dieser Fusionstranscripte sind in Beispiel 4 beschrieben.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform sind die Eichsubstanzreihen der Kits gemäß der Erfindung in flüssiger oder lyophilisierter Form konditioniert.
Die Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Herstellung eines Kits zur Bestimmung einer interessierenden Nucleotidsequenz, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es die folgenden Schritte umfasst:

– Herstellung einer Konstruktion, die einen Vektor umfasst, nach einem Verfahren, das die folgenden Schritte umfasst:
(i) Einfügen einer zu bestimmenden interessierenden DNA-Sequenz in den Vektor; und
(ii) Linearisieren der Konstruktion mit einem ausgewählten Restriktionsenzym, so dass das Enzym nur eine einzige Spaltstelle auf dem Vektor außerhalb der Einfügung erkennt;
– Herstellen einer Verdünnungsreihe von bekannten Konzentrationen der Konstruktion in einem Medium mit einem pH-Wert von größer oder gleich 7, das RNA von E. coli umfasst; und
– Herstellen einer Verdünnungsreihe von bekannten Konzentrationen einer Konstruktion, die eine Sequenz eines ubiquitären Gens oder einer RNA eines ubiquitären Gens umfasst und die in einen Vektor eingefügt und linearisiert ist.

Die Eichsubstanzen der Kits gemäß der Erfindung erlauben es, die Quantifizierung aller Arten von Nucleinsäuren in einer zu analysierenden Probe, vorteilhafterweise Nucleinsäuren, die mit Krankheiten verbunden sind, genau und reproduzierbar durchzuführen.
Genauer gesagt sind die Eichsubstanzen der Kits gemäß der Erfindung insbesondere für die Quantifizierung von Genen, Fusionstranscripten und insbesondere für die Quantifizierung von Fusionstranscripten, die an Leukämien beteiligt sind, geeignet.
Die Erfindung gibt auch ein Verfahren zur Quantifizierung einer Zielnucleinsäure in einer Probe an, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es die folgenden Schritte umfasst:

– Bestimmung der Eichsubstanz, die die Zielnucleotidsequenz trägt, durch quantitative PCR und Herstellen einer Eichkurve mit Hilfe der Verdünnungsreihe;
– Bestimmung einer Konstruktion, die eine zu bestimmende DNA-Sequenz umfasst und die in einen Vektor eingefügt und linearisiert ist, durch quantitative PCR und Herstellen einer Eichkurve mit Hilfe der Verdünnungsreihe, wobei die DNA-Sequenz der Zielnucleotidsequenz entspricht;
– Bestimmung einer Konstruktion, die die Sequenz des ubiquitären Gens oder der RNA des ubiquitären Gens umfasst und die in einen Vektor eingefügt und linearisiert ist, durch quantitative PCR und Herstellen einer Eichkurve mit Hilfe der Verdünnungsreihe;
– Bestimmung der Zielsequenz und des ubiquitären Gens oder der RNA des ubiquitären Gens durch quantitative PCR in der Probe mit Hilfe der Eichkurven; und
– Berechnung der normierten Zahl der Kopien mit Hilfe der folgenden Formel: log(NCN) = logTF – logGU,wobei NCN die normierte Zahl der Kopien ist; TF die Zahl der Kopien der Zielsequenz ist; und GU die Zahl der Kopien des ubiquitären Gens oder der ubiquitären RNA ist, wobei die Bestimmungen vorzugsweise doppelt durchgeführt werden.

Dieses Verfahren ist in Beispiel 2 ausführlicher beschrieben. Außerdem erlaubt es die in Beispiel 3 durchgeführte Bestimmung, eine Anwendung dieses Verfahrens aufzuzeigen.
Die Erfindung schlägt schließlich ein Diagnoseverfahren für einen Patienten vor, der unter einer Leukämie leidet, die ein Fusionstranscript impliziert, das aus E2A-PBX1, MLL-AF4, TEL-AML1, BCR-ABL(mBCR), BCR-ABL(MBCR), SIL-TAL, PML-RARA, CBFb-MYH11, AML1-ETO ausgewählt ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

– Durchführen einer Bestimmung des Transcripts nach dem Verfahren zur Quantifizierung gemäß Anspruch 16; und
– Vergleich des Ergebnisses mit einem Referenzwert;

Beispiel 1: Herstellung einer Eichsubstanz
I. Kurze Darlegung der verschiedenen Schritte der Arbeitsvorschrift
Ein Fusionstranscript (zum Beispiel MLL-AF4) wird mit entsprechenden Primern [2] ausgehend von cDNA aus einer Zelllinie oder von einem Patienten amplifiziert. Das PCR-Produkt wird in einen geeigneten Vektor (zum Beispiel das Plasmid pCR II TOPO) eingefügt, dann in einem transformationskompetenten E.-coli-Bakterienstamm kloniert.
Dann wird der Plasmidvektor nach klassischen Verfahren [3] extrahiert und durch UV-Spektrophotometrie quantifiziert.
Dieser Vektor wird dann linearisiert. Das für die Linearisierung ausgewählte Restriktionsenzym darf nur eine einzige Schnittstelle auf dem Vektor besitzen, und zwar außerhalb der Einfügung.
Unter Berücksichtigung der Größe des Vektors und der Einfügung wird die Größe der Plasmidkonstruktion berechnet (in Basenpaaren). Ihr Molekulargewicht wird für ein mittleres Nucleotidgewicht geschätzt. Dann wird die Zahl der Kopien bestimmt, die in einem gegebenen Gewicht an verdautem Plasmid vorhanden sind.
Danach wird eine Verdünnungsreihe hergestellt.
Dann ist der Plasmidstandard gebrauchsfertig.
II. Ausführliche Beschreibung der Vorschrift
A. Herstellung der in einen Klonierungsvektor einzufügenden DNA-Sequenzen
Die Herstellung der interessierenden Nucleotidsequenzen vor der Klonierung in einen Vektor erfolgt:

– entweder ausgehend von einer durch einen Schritt der reversen Transcription (RT) in cDNA umgewandelten RNA, gegebenenfalls gefolgt von der Synthese eines zweiten DNA-Strangs;
– oder direkt ausgehend von einer DNA.

Die nach dem einen oder anderen dieser Verfahren erhaltenen DNA-Fragmente können dann durch PCR amplifiziert werden.
1. Herstellung von DNA-Sequenzen ausgehend von RNA
Die Ziel-DNA-Sequenzen werden zuerst durch Reverse Transcription (RT) einer Gesamt-RNA, ribosomalen RNA oder mRNA menschlichen, tierischen oder pflanzlichen Ursprungs von ein- oder mehrzelligen pro- oder eukaryontischen Organismen oder Viren hergestellt.
Die RT verläuft nach Vorschrift 1 [2] oder Vorschrift 2 der RT, die auf lange Fragmente angewendet wird.
– Vorschrift 1: RT BIOMED-1
Diese Vorschrift ist von Literaturstelle [2] inspiriert.
Die Reverse Transcription erfordert Primer. Diese können statistisch (N(6)) oder Oligo-dT(30) sein und gegebenenfalls eine zusätzliche Sequenz umfassen, die es erlaubt, eine verankerte PCR durchzuführen (zum Beispiel SEQ ID Nr. 1: 5'-CGT CGT CGT GAA TTC CTA GAT CTT CTA GAT ATG TT-3'). Die Primer können gegebenenfalls an ihren Enden für eine spätere Verwendung modifiziert sein.
Die Reverse Transcription erfolgt in zwei Schritten:
Denaturierung der RNA:
1 μg RNA in 8,5 μl Wasser wird gemäß dem folgenden Zyklus denaturiert: 10 min bei 70 °C, dann auf 20 °C Halten.
Synthese der cDNA:
Die denaturierte RNA wird mit 10,5 μl des folgenden Reaktionsgemischs gemischt: 5 × Puffer (4 μl), 10 mM dNTPNa (2 μl), 100 mM DTT (2 μl), 10 μM RT-Primer (1 μl), 40 E/μl RNase-Inhibitor (0,5 μl), 50 E/μl Reverse Transcriptase (2 μl). Die cDNA-Synthese erfolgt gemäß dem folgenden Zyklus: 10 min bei 20 °C, 45 min bei 42 °C, 3 min bei 99 °C, 4 °C unendlich. Diese Synthese wird gegebenenfalls mit modifizierten Nucleotiden durchgeführt.
– Vorschrift 2: RT, auf lange Fragmente angewendet
Die Reverse Transcription erfordert Reagentien, die die Bildung von cDNA großer Länge erlauben. Für diese Experimente wird der Kit Expand Reverse Transcriptase^® von Roche verwendet. Die verwendeten Primer sind statistische Primer (N(9)) oder Oligo-dT(30), die gegebenenfalls eine zusätzliche Sequenz umfassen, die es erlaubt, eine verankerte PCR durchzuführen, wie die oben beschriebene SEQ ID Nr. 1. Die Primer können gegebenenfalls an ihren Enden für eine spätere Verwendung modifiziert sein.
Die Reverse Transcription erfolgt in drei Schritten:
Denaturierung der RNA:
1 μg RNA in 8,5 μl Wasser wird gemäß dem folgenden Zyklus denaturiert: 10 min bei 70 °C, dann auf 20 °C Halten.
Synthese der cDNA:
Die denaturierte RNA wird mit 10,5 μl des folgenden Reaktionsgemischs gemischt: 5 × Puffer (4 μl), 10 mM dNTPNa (2 μl), 100 mM DTT (2 μl), 10 μM RT-Primer (1 μl), 40 E/μl RNase-Inhibitor (0,5 μl), 50 E/μl Expand RT (1 μl). Die cDNA-Synthese erfolgt gemäß dem folgenden Zyklus: 10 min bei 20 °C, 45 min bis 2 h bei 42 °C, 3 min bei 99 °C, 4 °C unendlich. Diese Synthese kann mit modifizierten Nucleotiden durchgeführt werden.
Behandlung mit RNase H:
2 μl RNase H (50 E/μl) werden zu 20 μl des obigen Gemischs gegeben und 10 min lang bei 42 °C inkubiert, und dann wird das Röhrchen wieder auf 20 °C gebracht. Dann wird alles auf 1/3 verdünnt, Endvolumen 60 μl.
2. DNA-Sequenzen
Die DNA-Sequenzen werden entweder direkt ausgehend von DNA oder durch Reverse Transcription ausgehend von RNA erhalten.
Wenn die Zielsequenzen direkt ausgehend von DNA erhalten werden, kann diese menschlichen, tierischen oder pflanzlichen Ursprungs sein, von ein- oder mehrzelligen pro- oder eukaryontischen Organismen oder Viren stammen, und zwar ausgehend von Intron-, Exon-, codierenden oder nichtcodierenden Sequenzen.
Da die Zielsequenzen ausgehend von RNA erhalten werden, wird diese gemäß dem vorigen Abschnitt behandelt, um einen ersten komplementären DNA-Strang zu erhalten.
Ein zweiter DNA-Strang kann nach Addition eines Schwanzes (Tailing) am 3'-Ende ausgehend von der durch RT erhaltenen Sequenz synthetisiert werden, indem man zum Beispiel gemäß Vorschrift 3 oder Ligierung mit einer vordefinierten Sequenz arbeitet, die an ihrem Ende gegebenenfalls eine Stelle enthält, die von einem Restriktionsenzym erkannt wird.
– Vorschrift 3: Tailing für die Synthese eines zweiten Stranges
Das Tailing erfolgt an dem durch Vorschrift 2 hergestellten Produkt auf der Grundlage der Literaturstelle [3].
Reinigung der cDNA:
Die Reinigung erfolgt an einer Sephadex-G50^®-Säule. Die cDNA wird anschließend in 50 μl Wasser oder Tris-EDTA (10 mM/1 mM) eluiert.
Das Tailing wird wie folgt durchgeführt:
In einem 24-μl-Volumen: steriles Wasser (9,5 μl), 1,25 μl Puffer (10×), 2,5 μl gegebenenfalls modifiziertes dCTP [2 mM], 0,75 μl MgCl₂ [50 mM], gereinigte cDNA (10 μl).
2 bis 3 Minuten lang bei 94 °C inkubieren. 1 min lang in Eis abkühlen.
TdT hinzufügen, homogenisieren und 15 min lang bei 37 °C inkubieren.
TdT 10 min lang bei 70 °C inaktivieren.
Sobald die DNA erhalten wurde (direkt oder indirekt, einzelsträngig oder nicht), können die Sequenzen gegebenenfalls mit PCR amplifiziert oder direkt in einen Vektor eingefügt werden.
Die PCR erfolgt ausgehend von einem Paar bekannter Primer (Literaturstelle 1) oder von gemäß der Erfindung definierten Primern (die an ihrem 5'-Ende gegebenenfalls eine Sequenz umfassen, die von einem Restriktionsenzym erkannt wird), was es erlaubt, das Target gemäß Vorschrift 4 für PCR-BIOMED-1 oder Vorschrift 5 für PCR von langen Fragmenten zu amplifizieren.
– Vorschrift 4: PCR BIOMED-1
Diese PCR-Vorschrift beruht auf der Literaturstelle [2].
Sie erlaubt es, die durch die Primer (A und B) der Literaturstelle [2] markierten interessierenden Sequenzen und insbesondere die Fusionsgene der Literaturstelle [2] oder ubiquitäre Gene zu amplifizieren. Diese Primer können gegebenenfalls an ihren Enden für eine spätere Verwendung modifiziert sein.
Der Amplifikationszyklus ist der Folgende: 3 min bei 94 °C, 35 × (30 s bei 94 °C, 30 s bei 65 °C, 1 min bei 72 °C), 16 °C unendlich. Er wird in Gegenwart von Taq-DNA-Polymerase^®, von gegebenenfalls modifizierten Nucleotiden und von 10 μl RT-Produkt oder 1 μl DNA durchgeführt. Die erhaltenen Fragmente sind kurz und können anschließend in geeigneten Vektoren kloniert werden.
– Vorschrift 5: PCR von langen Fragmenten (klassisch, verankert oder doppelt verankert)
Das Amplifikationsprogramm und die Taq-DNA-Polymerase^® erlauben es, mit spezifischen Primern Fragmente von wenigstens 5 kb zu erhalten. Die Amplifikation erfolgt mit dNTP, die gegebenenfalls durch modifizierte Nucleotide ersetzt sind.
Der Amplifikationszyklus ist der Folgende:
30 s bei 94 °C, 10 × (10 s bei 94 °C, 8 min bei 68 °C), 20 × (10 s bei 94 °C, 8 min bei 68 °C + 20 s pro Zyklus), 7 min bei 68 °C, 16 °C unendlich.
In einem 50-μl-PCR-Napf ist das Reaktionsgemisch das folgende:
RT- oder PCR-Produkt (10 μl), DEPC-H₂O (21 μl), 10 mM dNTP (2,5 μl), 100 μM Sense- oder Ankerprimer, der der obigen SEQ ID Nr. 1 entspricht (0,5 μl), 100 μM Antisense- oder Ankerprimer (0,5 μl), PCR-Puffer (5 μl), 3 mM MgCl₂ Endkonzentration, 3,5 E Taq-DNA-Polymerase^®. Der Anker entspricht irgendeiner definierten Sequenz, die hier angegebene Sequenz ist ein Beispiel, das Schnittstellen für Restriktionsenzyme umfasst.
Dieser Amplifikation kann gegebenenfalls eine zweite mit internen Primern folgen, um die Spezifität der Amplifikation zu erhöhen. Die Primer können gegebenenfalls an ihren Enden für eine spätere Verwendung modifiziert sein.
3. Reinigung der PCR-Produkte
Am Ende der Reinigung werden die Produkte zuerst auf Gel abgelagert, um die Größe und die relative Menge in Bezug auf einen Molekulargewichtsmarker bekannter Konzentration zu kontrollieren. Die Menge des Produkts wird in Bezug auf den Molekulargewichtsmarker geschätzt. In Gegenwart von mehreren Banden kann eine Isolierung der interessierenden Bande durch Ausschneiden der gesuchten Bande aus dem Gel und Extraktion der interessierenden DNA erfolgen.
Diese Produkte werden anschließend gegebenenfalls durch Fällung mit Ethanol gereinigt, dann in einem Volumen Tris-EDTA (10 mM/1 mM) wieder aufgenommen, um durch UV-Spektrophotometrie [3] oder durch Spektrofluorimetrie mit Hilfe eines interkalierenden fluoreszierenden Mittels bestimmt zu werden.
B. Klonierung der Sequenzen
Die hergestellten Produkte werden anschließend kloniert. Zu diesem Zweck werden sie in einen Klonierungsvektor eingefügt, dann in einen Wirtsorganismus menschlichen, tierischen, viralen oder pflanzlichen Ursprungs von ein- oder mehrzelligen pro- oder eukaryontischen Organismen übergeführt, um die interessierende Sequenz in großer Menge herzustellen.
1. Produktion der Sequenz in prokaryontischen oder viralen Organismen
Die interessierende Sequenz oder die interessierenden Sequenzen werden mit Hilfe einer Ligase oder einer Topoisomerase an der Klonierungsstelle mit dem Vektor ligiert. Der Plasmidvektor (BlueScript^® oder äquivalent), Phagen-(Lambda oder äquivalent), Cosmid-, Virusvektor oder auch YAC-(Hefen) oder BAC-Vektor, der die Einfügung enthält, wird in großer Menge amplifiziert, um extrahiert zu werden.
Die empfangende Wirtszelle gehört vorteilhafterweise zu einem Escherichia-coli-Bakterienstamm, der mit einer physikalischen oder chemischen Methode transformationskompetent gemacht wurde. Der Klon (Vektor + Einfügung) kann auch in andere Bakterienstämme oder prokaryontische Organismen, zum Beispiel Hefen oder Insektenzellen, eingeführt werden. Die Extraktion des Vektors, der die Einfügung trägt, erfolgt nach klassischen Techniken [3].
2. Produktion der Sequenz in eukaryontischen Organismen
Die interessierende Sequenz oder die interessierenden Sequenzen werden mit Hilfe einer Ligase oder einer Topoisomerase an der Klonierungsstelle in Eukaryonten-Vektoren eingefügt, dann auf einzellige (zum Beispiel Saccharomyces sp. oder Candida sp.) oder mehrzellige eukaryontische Organismen oder auf immortalisierte humane, tierische oder pflanzliche Zelllinien übertragen.
3. Qualitative Kontrolle der Einfügung und Sequenzierung
Die Selektion des Organismus, der den Vektor trägt, erfolgt vorteilhafterweise nach üblichen Methoden [3], und die Anwesenheit der Einfügung wird durch PCR überprüft, indem man unspezifische Primer wählt, die auf den Vektor gezeichnet oder spezifisch für die Einfügung sind, wobei man insbesondere gemäß Vorschrift 4 der Beispiele arbeitet.
Die Sequenzierung des eingefügten Produkts wird durchgeführt, um die Anwesenheit von eventuellen Mutationen im klonierten Produkt und die Einfügungsrichtung des Produkts zu bestimmen. Die Sequenzierung erfolgt nach klassischen Techniken ausgehend von Universalprimern, die sich auf dem Klonierungsvektor befinden (zum Beispiel M13, Sp6 oder T7), oder ausgehend von Primern, die spezifisch für die Einfügung sind.
C. Quantifizierung des interessierenden Gens
Die Eichsubstanz kann das interessierende Gen (Einschub) unter verschiedenen Formen umfassen: doppel- oder einzelsträngige DNA, RNA.
1. Doppelsträngige DNA
Der Klonierungsvektor wird mit klassischen Extraktionstechniken (Sambrook) aus den Zellen extrahiert. Das Produkt wird in einer Tris/EDTA-Lösung (10 mM/1 mM, pH = 8) wieder aufgenommen und durch UV-Spektrophotometrie [3] oder durch Spektrofluorimetrie mit Hilfe eines interkalierenden Mittels quantifiziert.
Dann werden 20 μg dieses Produkts während einer Stunde bei 37 °C in 20 μl mit 10 E eines geeigneten Restriktionsenzyms (BamHI, HindIII oder anderes) verdaut, um den Vektor zu linearisieren.
Die Zahl der Kopien der interessierenden Sequenz oder ihres Äquivalents in Masseneinheiten wird anschließend bestimmt, indem man das Molekulargewicht des Vektors, die Größe der Einfügung und die Menge des klonierten Produkts in einem bestimmten Volumen berücksichtigt (Formel 1). PMC = (NTV + NTI)·PMN/N Formel 1wobei PM_C das Molekulargewicht (g) einer Vektorkopie ist, die 1 Einfügung trägt;
NTV die Zahl der Nucleotide des Vektors ist;
NTI die Zahl der Nucleotide der Einfügung ist;
PM_N das mittlere Molekulargewicht eines Nucleotids ist, nämlich 321,44 g; und
N die Avogadro-Zahl ist, nämlich 6,02·10²³.
2. Einzelsträngige DNA
Ausgehend vom linearisierten Vektor (siehe den vorangehenden Abschnitt), der die universellen Sequenzen M13F und M13R trägt, wird eine einzelsträngige DNA-Sequenz nach klassischen Vorschriften (Sambrook) hergestellt, indem man eine Polymerase (Typ Klenow oder Äquivalent) in Gegenwart des entsprechenden Primers verwendet, um den gewünschten Strang zu erhalten. Das Produkt wird anschließend auf Gel gereinigt, dann in einer Tris/EDTA-Lösung (10 mM/1 mM, pH = 8) wieder aufgenommen und durch UV-Spektrophotometrie [3] oder durch Spektrofluorimetrie mit Hilfe eines interkalierenden Mittels quantifiziert.
Die Zahl der Kopien der interessierenden Sequenz oder ihres Äquivalents in Masseneinheiten wird anschließend bestimmt, indem man die Größe der Einfügung und die Menge des Produkts in einem bestimmten Volumen berücksichtigt (Formel 1).
3. RNA
Um RNA herzustellen, macht man sich die Tatsache zu Nutze, dass der Klonierungsvektor (pCR II TOPO oder BlueScript), der die oben beschriebene interessierende Sequenz trägt, Promotoren für die RNA-Polymerasen SP6 oder T7 besitzt. Diese Polymerasen werden für die Herstellung von einzelsträngiger RNA ausgehend von Promotorstellen auf dem Vektor gemäß üblichen Vorschriften [3] verwendet. Die Wahl der Polymerase ist eine Funktion der Einfügungsrichtung der interessierenden Sequenz.
Dann wird die hergestellte RNA nach klassischen Isolierungstechniken [3] gereinigt. Dann wird sie durch UV-Spektrophotometrie [3] oder durch Spektrofluorimetrie mit Hilfe eines interkalierenden Mittels (Hoechst oder Interchim) bestimmt.
Schließlich wird die Zahl der Kopien der interessierenden Sequenz oder ihres Äquivalents in Masseneinheiten bestimmt, indem man das Molekulargewicht der Einfügung und die Menge des klonierten Produkts in einem bestimmten Volumen berücksichtigt (Formel 1).
D. Verdünnung der Präparate
Die interessierenden Sequenzen werden anschließend so verdünnt, dass man ihre genaue Menge in einem bestimmten Volumen kennt.
Das Endprodukt kann eine Probe oder eine Reihe von kaskadenartigen Verdünnungen der Probe sein, die eine einzige oder mehrere einzel- oder doppelsträngige RNA- und/oder DNA-Sequenzen umfasst, die von demselben Nucleinsäurefragment oder von verschiedenen Fragmenten getragen werden.
Die Menge kann in Form von Masseneinheiten der Referenzsequenz oder in absoluten Zahlen oder relativen Zahlen in Bezug auf eine zweite Sequenz, die ebenfalls in bekannter Menge im Präparat vorhanden ist, ausgedrückt werden. Analog kann ein Gemisch aus einer großen Zahl von Sequenzen in bekannter Menge in derselben Probe in derselben Weise hergestellt werden.
Das Endprodukt kann lyophilisiert sein oder in Lösung in einem geeigneten Lösungsmittel, das gegebenenfalls inerte oder aktiven Agentien umfasst, vorliegen.
1. Praktische Durchführung der DNA-Verdünnungen
Um DNA-Verdünnungen ausgehend von einer bekannten Menge einzel- oder doppelsträngiger DNA durchzuführen, führt man eine kaskadenartige Verdünnung auf jeweils ein Zehntel oder die Hälfte der Konzentration dieser Probe durch. Diese Verdünnungen werden in einer RNA (Verdünnungen durchgeführt in einer RNA menschlichen, tierischen oder pflanzlichen Ursprungs von ein- oder mehrzelligen pro- oder eukaryontischen Organismen oder Viren) oder einer DNA in Lösung in einem Tris/EDTA-Puffer (10 mM/1 mM, pH = 8) in Gegenwart von einer oder mehreren inerten Substanzen (Glycerin, Rinderserumalbumin, Milchpulver, Dextran, eukaryontische 16- und 23S-rRNA oder jedes andere stabilisierende chemische Produkt) durchgeführt.
2. Praktische Durchführung der RNA-Verdünnungen
Um RNA-Verdünnungen durchzuführen, verdünnt man eine bekannte Menge an RNA-Produkt kaskadenartig auf jeweils ein Zehntel oder die Hälfte der Konzentration. Diese Verdünnungen werden in einer RNA (menschlichen, tierischen oder pflanzlichen Ursprungs von ein- oder mehrzelligen pro- oder eukaryontischen Organismen oder Viren) oder einer DNA in Lösung in einem Tris/EDTA-Puffer (10 mM/1 mM, pH = 8) in Gegenwart von einer oder mehreren inerten Substanzen (Glycerin, Rinderserumalbumin, Milchpulver, Dextran oder jedes andere stabilisierende chemische Produkt) durchgeführt.
Zum Beispiel umfasst die erste Verdünnung, die 10^–1 genannt wird, 2·10⁹ Kopien des Plasmids pro Mikroliter Lösung, die ausgehend von einem Volumen V des verdünnten enzymatischen Verdaus in einem Endvolumen von 500 μl DEPC-Wasser erhalten wurden. Anschließend werden kaskadenartige Verdünnungen in einem Tris/EDTA-Puffer (10 mM/1 mM, pH = 8) realisiert, der 20 ng/μl 16S- und 23S-RNA von E. coli enthält, wobei man Endkonzentrationen von 200 000, 20 000, 2000, 200, 20 und 2 Kopien pro Mikroliter Lösung erhielt.
Dann schreitet man zur Kontrolle der Präparate fort.
E. Kontrolle der Präparate
1. Qualitative Kontrolle der Anwesenheit der Einfügung
Die qualitativen Kontrollen der Anwesenheit der Einfügung werden durchgeführt, um die Anwesenheit der gesuchten Einfügung im klonierten Produkt zu bestimmen. Das Erscheinungsbild der verstärkten Bande bzw. Banden auf Gel erlaubt es, die Qualität des Präparats zu beurteilen. Diese Kontrolle erfolgt durch PCR ausgehend von Universalprimern, die sich auf dem Klonierungsvektor befinden, oder ausgehend von Primern, die dazu dienten, das PCR-Fragment gemäß dem Amplifikationsprogramm BIOMED-1 herzustellen. Sie erfolgt direkt ausgehend von DNA-Proben oder nach RT (insbesondere gemäß Vorschrift 1 oder 2) ausgehend von den RNA-Proben.
2. Quantitative Kontrolle der Anwesenheit der Einfügung
Die quantitativen Kontrollen werden durchgeführt, um die Menge der interessierenden Sequenz oder des Vektors zu bestimmen. Diese Kontrolle kann durch PCR ausgehend von Universalprimern erfolgen, die sich auf dem Klonierungsvektor befinden, oder ausgehend von Primern, die dazu dienten, das PCR-Fragment gemäß dem Amplifikationsprogramm von Vorschrift 6 herzustellen.
– Vorschrift 6: Quantitative PCR des Typs Taqman^®
Der Amplifikationszyklus ist der folgende:
2 min bei 50 °C, 2 min bei 94 °C, 50 × (30 s bei 94 °C, 1 min bei 60 °C), 16 °C unendlich.
Die Zusammensetzung des Reaktionsgemischs ist die folgende:

– DNA- oder cDNA-Probe (100 ng DNA oder ihr Äquivalent);
– Sense- und Antisense-Primer, 300 nM Endkonzentration
– Nachweissonde Taqman^®, markiert mit Fluorophoren mit 200 nM Endkonzentration, oder ihr Äquivalent (fluoreszierendes Interkalationsmittel, zum Beispiel SYBR green^©), das den Nachweis des amplifizierten Produkts oder Reaktionsgemischs, das diese Bestandteile enthält, erlaubt;
– Reaktionsgemisch, das den PCR-Puffer, die Polymerase und jeden anderen Bestandteil, der die Quantifizierung erlaubt, enthält.

Die Kontrolle erfolgt direkt ausgehend von den DNA-Proben oder nach RT ausgehend von den RNA-Proben (insbesondere gemäß Vorschrift 1 oder 2). Die Quantifizierung kann auch durch die aktuellen Techniken zur Messung der Nucleotidsequenzen in Lösung oder auf festen Trägern aufgrund von Substanzen, die für die Quantifizierung geeignet sind, erfolgen.
Man wird beobachten, dass abgesehen von den Produkten, die ausgehend von einer direkten Verdünnung des Vektors (doppelsträngige DNA) in der Pufferlösung erhalten wurden, die Sequenzen des Vektors zu keiner Zeit das Endprodukt stören.
Beispiel 2: Quantifizierungsverfahren
Die Quantifizierung umfasst zwei Hauptschritte:

– Der erste Schritt besteht darin, das interessierende Gen zu bestimmen;
– Ziel des zweiten Schritts ist es, die durchgeführte Bestimmung zu normieren.

Die Normierung erfolgt durch die Bestimmung eines Gens, das "ubiquitär" genannt wird.
Alle Bestimmungen erfolgen durch quantitative PCR.
Für jeden Schritt stellt man mit Hilfe der Eichsubstanz gemäß der Erfindung eine Eichkurve auf, die "Standardplasmidkurve" genannt wird. Dann wird die Bestimmung des interessierenden Gens und des ubiquitären Gens, die in der Probe vorhanden sind, durchgeführt. Anschließend werden die Werte der Bestimmung durch Interpolation auf der Eichkurve bestimmt.
A. Quantifizierung des ubiquitären Gens oder des Transcripts eines ubiquitären Gens in der Probe
Unter einem "ubiquitären Gen" versteht man ein Referenzgen, das dazu dient, die Experimente zu normieren. Seine Quantifizierung ist genau und von Experiment zu Experiment reproduzierbar.
Es kann sich auch um das Transcript des ubiquitären Gens handeln. Es gibt zahlreiche ubiquitären Gene (β-Globin, β-Actin, GAPDH oder Transcripte der Gene, wie Abelson-Gen, β2-Mikroglobulin oder B2M, β-Glucuronidase oder GUS, Porphobilinogen-Deaminase oder PBGD, Tata-Box-bindendes Protein oder TBP usw.), von denen man näherungsweise die Expression in den Zellen des menschlichen Körpers kennt.

Beispielhaft sind die bevorzugten ubiquitären Gene sowie ihre experimentellen Werte in der folgenden Tabelle beschrieben: Tabelle 1:

	N	mittlere 10^CN	Bereich
ABL alle Proben Leukämieprobe "normale" Proben	316 190 126	18071 13378 19953	1345–127643 1175–151356 1380–53703
B2M Leukämieprobe "normale" PB + PBSC "normales" Knochenmark	190 100 26	781628 1445440 1071519	9977–5370317 208929–6760829 28641–1927524
GUS Leukämieprobe "normale" PB + PBSC "normales" Knochenmark	190 52 74	40926 66069 21878	2944–344349 7177–195434 2630–70794

N: Zahl der Proben
mittlere 10^CN: mittlere Zahl der Kopien in einer Probe auf 100 ng Gesamt-RNA, die aus dieser Probe hervorgeht.
Bereich: Oberer und unterer Wert des Bereichs, der 95% der Proben umfasst.
PB: Peripheres Blut
PBSC: Stammzellen des peripheren Bluts

Das ubiquitäre Gen wird in Abhängigkeit von verschiedenen Parametern ausgewählt:

– In erster Linie muss seine Expression unter den experimentellen Bedingungen stabil sein;
– außerdem muss seine Expression im Verlauf des Abbauvorgangs mit derjenigen des Targets korrelieren, d.h. dass seine Expression in einem konstanten Verhältnis zu derjenigen des Targets bleibt.

Das ubiquitäre Gen wird nach demselben Verfahren hergestellt wie das interessierende Gen. So erhält man eine Verdünnungsreihe von Eichsubstanzen, die das ubiquitäre Gen enthalten.
Die Bestimmung des "ubiquitären Gens" oder seines Transcripts liefert eine Information über die Qualität der durchgeführten Bestimmung. Tatsächlich erfolgt die Bestimmung durch quantitative PCR, was einen Abbau der DNA oder RNA, die bestimmt wird, widerspiegeln kann, insbesondere in der Probe, die ein komplexes Medium darstellt. Es wird angenommen, dass dieser Abbau der DNA oder RNA, die bestimmt wird, mit einem ähnlichen Abbau des "ubiquitären Gens oder Transcripts" in denselben Verhältnissen einhergeht. Wenn man die genaue Menge des durch PCR bestimmten ubiquitären Gens kennt, kann man daraus auf den Abbau dieses Gens und gemäß dem oben aufgestellten Postulat auch auf den Abbau des interessierenden Gens, das in der Probe bestimmt werden soll, schließen.
Eine Plasmidstandardkurve wird an 3 logarithmischen Verdünnungen aufgestellt, die in demselben Experiment doppelt bestimmt werden. Die Lage des ersten und des zweiten Verdünnungspunkts wird in Bezug auf die beobachtete mittlere Expression des untersuchten Gens bestimmt. Die Zahl der Kopien, die in der betrachteten Probe vorhanden sind, wird durch Interpolation bestimmt.
Zum Beispiel beträgt die mittlere Expression des ubiquitären Gens ABL 20 000 Kopien pro 0,1 μg RNA-Äquivalent. Die erste Plasmidverdünnung wird so berechnet, dass sie 100 000 Kopien in 5 μl Lösung enthält. Die zweite und die dritte enthalten 10 000 bzw. 1000 Kopien in 5 μl Lösung. Auf diese Weise spiegelt sich jeder Abbau der RNA der Probe in einer geringeren Kopienzahl wider und liegt zwischen der zweiten und dritten Verdünnung.
B. Quantifizierung der interessierenden Sequenz
Eine Plasmidstandardkurve wird anhand von 4 bis 5 logarithmischen Verdünnungen aufgestellt, die in demselben Experiment doppelt bestimmt werden. Der erste Punkt des Bereichs entspricht 1 000 000 Kopien des Gens, und der letzte entspricht 10 Kopien. Die dazwischen liegenden Verdünnungen entsprechen 100 000, 1000 und (oder) 100 Kopien. Die Zahl der Kopien, die in der betrachteten Probe vorhanden sind, wird durch Interpolation bestimmt.
C. Darstellung der Ergebnisse
Die Amplifikation der PCR-Produkte folgt einem logarithmischen Gesetz. Die statistische Verteilung der Zahl der Kopien in einer Probe für eine wiederholte Bestimmung ist logarithmisch. Es ist also notwendig, die logarithmischen Werte zu betrachten, um die Normierungsrechnungen durchzuführen.
So folgt der erhaltene Wert für eine Probe, in der ein gegebenes interessierendes Gen, zum Beispiel ein Fusionstranscript (TF1 und TF2) und sein ubiquitäres Gen (GU1 und GU2) doppelt bestimmt wird, dem folgenden Ausdruck: log(NCN) = (logTF1 + logTF2)/2 – (logGU1 + logGU2)/2 + CN Formel 2wobei NCN die normierte Kopienzahl ist,
TF die Kopienzahl der Zielsequenz (zum Beispiel des Fusionstranscripts) ist,
GU die Kopienzahl des ubiquitären Gens oder des Transcripts des ubiquitären Gens ist,
CN (fakultativ) der Logarithmus der Medianzahl der Kopien ist, die für das betrachtete Gen beobachtet wird (zum Beispiel: für ABL ist CN = 4). Dies erlaubt es, das Ergebnis für 10 000 Kopien von ABL auszudrücken.
Der Ausdruck "log" bedeutet den dekadischen Logarithmus.
Die Ergebnisse können dann in abgeleiteten Einheiten angegeben werden: in Mol, Gramm oder ihren Derivaten.
Beispiel 3: Bestimmung eines Transcripts eines Targets in Bezug auf ein Referenztranscript

Man führt parallel die Amplifikation eines Fusionstranscripts (MLL-AF4) und eines ubiquitären Gens (ABL) durch quantitative PCR durch. Die Rohergebnisse der Maschine werden in die folgende Tabelle übertragen. Tabelle 2:

	MLL-A F4 (Ct)		ABL (Ct)
10^CN	Replikat 1	Replikat 2	Replikat 1	Replikat 2
Patient	27,9	28,1	26,98	27,02
Plasmid 10⁶ Kopien	19,35	19,26
Plasmid 10⁵ Kopien	22,84	22,85	23,46	23,55
Plasmid 10⁴ Kopien			27,43	27,09
Plasmid 10³ Kopien	30,42	30,59	30,3	30,5
Plasmid 10² Kopien	34,74	37,79
Plasmid 10¹ Kopien	37,17	40,18
Regressionsgerade	Ct = –3,88CN + 42,4		Ct = –3,43CN + 40,8
Ergebnisse Patient	CN = 3,71, das sind 5149 Kopien		CN = 4,01, das sind 10272 Kopien

Beispiel einer parallelen Amplifikation von 2 ABL- und MLL-AF4-Transcripten auf Plasmiden und einer Patientenprobe in der Diagnostik
Die von der Maschine ausgegebenen Rohwerte (Ct) der Plasmidverdünnungen werden verwendet, um die Regressionsgerade zu konstruieren, indem man auf der Abszisse den log der Kopienzahl und auf der Ordinate das Ct der Verdünnung aufträgt. Die entsprechenden Regressionsgeraden werden in Tabelle 2 übertragen.
Die entsprechende Kopienzahl wird durch Interpolation berechnet.
Unter Verwendung der Formel 2 wird das für den Patienten erhaltene Ergebnis berechnet gemäß: log(NCN) = 3,71 – 4,01 = –0,30und daraus
NCN = 10^(–0,30) = 0,501 MLL-AF4-Kopien pro Kopie des Referenztranscripts (ABL).
Beispiel 4: Bestimmung von Transcripten, die an Leukämien beteiligt sind
1. Präsentation der Transcripte
Die Fusionstranscripte ergeben sich durch die Fusion von zwei Genen.

Die folgende Tabelle gibt die Zugriffsnummern der Sequenzen der beiden Gene, die unter Bildung des beschriebenen Transcripts fusioniert wurden, in der Datenbank Genbank^® an. Tabelle 3:

Fusionstranscript	Zugriffs-Nr. Gen 1	Zugriffs-Nr. Gen 2
AML1-ETO	D43369	D14289
E2A-PBX1	M31222	M86546
BCR-ABL	X02596	X16416
MLL-AF4	L04284	L13773
TEL-AML1	U11732	D43369
SIL-TAL	M74558	S53245
PML-RARA	M73778	X06538
CBFb-MYH11	L20298	D10667

2. Bestimmung der Referenzwerte
Die Werte des Expressionsniveaus der hauptsächlichen Fusionstranscripte, die an Leukämien beteiligt sind, wurden bisher noch nie in ihrer Gesamtheit dargestellt.
Die folgenden Tabellen zeigen diese Werte. Sie können nach einer Bestimmung als Vergleichswert verwendet werden, da sie nach dem Quantifizierungsverfahren gemäß der Erfindung durchgeführt werden kann. Diese Bestimmungen können insbesondere der Diagnose dienen (zum Beispiel im Rahmen eines Diagnoseverfahrens) oder dazu, die Wirksamkeit einer Behandlung zu bewerten, die irgendeinen pathologischen Zustand betrifft, für den bei der Diagnose eine genische (Gen oder Transcript) Anomalie bewiesen wurde, die mit dem vorgeschlagenen Verfahren nachweisbar ist. Insbesondere erlauben die Bestimmungs- und Diagnoseverfahren gemäß der Erfindung eine Verfolgung von Leukämiebehandlungen.
Die Gesamtheit dieser Werte ist in 1 zusammengefasst. In dieser Figur bezieht sich TG auf die Fusionstranscripte, NCN auf die normierte Kopienzahl, LAL auf eine akute lymphoblastische Leukämie und LMC auf eine chronische myeloide Leukämie.
In den folgenden Tabellen ist ohne Ausnahme die normierte Kopienzahl des Fusionsgens auf eine Kopie des ABL-Gens, des GUS-Gens oder 100 Kopien B2M angegeben. Der Medianwert ist für einen Bereich definiert, der 95% der Werte abdeckt. Der Korrelationskoeffizient (Korrel.-Koeff.) ist vor der Normierung durch das ubiquitäre Gen definiert.

Zwischen den Ergebnissen, die anhand von Blutproben und Knochenmarksproben erhalten wurden, wurde kein statistisch signifikanter Unterschied festgestellt. Tabelle 4: Amplifikation der Gene ABL, B2M, GUS und E2A-PBX1 in der Zelllinie und bei Patienten in der Diagnose

Proben	Normierte Kopienzahl
Proben	E2A-PBX1/ABL	E2A-PBX1 × 100/B2M	E2A-PBX1/GUS
Zelllinie 697	5,0	33,9	9,0
Patienten
Knochenmark (n = 14)	7,6 [2,1–19,5]	44,6 [10,5–101,0]	8,9 [1,6–17,8]
Blut (n = 13)	9,4 [3,8–72,4]	42,7 [2,2–115,9]	13,6 [2,5–67,6]
Korrel.-Koeff.	0,83	0,62	0,66

Tabelle 5: Amplifikation der Gene ABL, B2M, GUS und MLL-AF4 in Zelllinien und bei Patienten in der Diagnose

Proben	Normierte Kopienzahl
Proben	MLL-AF4/ABL	MLL-AF4 × 100/B2M	MLL-AF4/GUS
Zelllinien
RS4; 11	0,35	4,4	0,29
MVA-11	0,56	9,3	0,63
ALL-PO	0,62	9,3	0,59
Patienten
Knochenmark (n = 14)	0,46 [0,09–0,98]	1,2 [0,07–8,3]	0,32 [0,04–0,65]
Blut (n = 13)	0,60 [0,16–0,91]	1,4 [0,32–2,9]	0,27 [0,09–0,58]
Korrel.-Koeff.	0,79	0,67	0,76

Tabelle 6: Amplifikation der Gene ABL, B2M, GUS und TEL-AML1 in der Zelllinie REH und bei Patienten in der Diagnose

Proben	Normierte Kopienzahl
Proben	TEL-AML1/ABL	TEL-AML1 × 100/B2M	TEL-AML1/GUS*
Zelllinie REH	3,2	27	2,5
Patienten
Knochenmark (n = 30)	4,45 [0,46–32,70]	23 [0,63–132]	3,19 [0,27–10,33]
Blut (n = 13)	4,71 [0,20–15,2]	12 [0,39–99]	2,63 [0,50–9,00]
Korrel.-Koeff.	0,66	0,42	0,66

* 12 Blutproben und 17 Knochenmarksproben wurden auf GUS getestet.

Proben	Normierte Kopienzahl
Proben	BCR-ABL(mBCR) × 100/B2M	BCR-ABL(mBCR)/GUS
Patienten
Knochenmark (n = 17)	2,69 [0,58–26,3]	1,48 [0,24–16,6]
Blut (n = 13)	3,16 [0,03–13,8]	1,62 [0,18–9,33]

Proben	Normierte Kopienzahl
Proben	BCR-ABL(MBCR) × 100/B2M	BCR-ABL(MBCR)/GUS
Zelllinie K562	2,24	0,66
Patienten
Knochenmark (n = 15)	0,95 [0,43–5,3]	0,12 [0,04–0,87]
Blut (n = 14)	2,8 [0,56–6,2]	0,22 [0,08–0,41]
Korrel.-Koeff.	0,63	0,76
Patienten Knochenmark und Blut (n = 17)	4,90 [0,14–19,5]	1,15 [0,03–3,89]
Korrel.-Koeff.	0,56	0,60

Proben	Normierte Kopienzahl
Proben	SIL-TAL/ABL	SIL-TAL/100B2M	SIL-TAL/GUS
Zelllinien
CEM	0,12	1,38	0,07
ALL1	0,11	0,79	0,09
Molt-15	0,10	0,27	0,06
Molt-16	0,08	0,45	0,11
HSB2	0,41	3,47	0,44
PF382	0,07	0,47	0,11
Patienten
Knochenmark (n = 10)	0,12 [0,02–0,23]	1,24 [0,03–4,86]	0,15 [0,02–0,44]
Blut (n = 10)	0,09 [0,02–0,21]	0,86 [0,05–3,28]	0,12 [0,01–0,26]

Proben	Normierte Kopienzahl
Proben	PML-RARA/ABL	PML-RARA × 100/B2M	PML-RARA/GUS
Patienten
Knochenmark (n = 14)	0,30 [0,09–1,82]	0,72 [0,19–3,18]	0,08 [0,02–0,56]
Blut (n = 9)	0,36 [0,11–0,78]	0,26 [0,07–0,60]	0,05 [0,02–0,13]
Korrel.-Koeff.	0,80	0,54	0,73

Proben	Normierte Kopienzahl
Proben	CBFb-MYH11/ABL	CBFb-MYH11 × 100/B2M	CBFb-MYH11/GUS
Zelllinie ME-1	0,90	4,64	0,40
Patienten (n = 14)	1,35 [0,13–14,8]	3,98 [1,45–447]	0,42 [0,07–4,57]
Korrel.-Koeff.	0,76	0,65	0,76

Proben	Normierte Kopienzahl
Proben	AML1-ETO/ABL	AML1-ETO × 100/B2M	AML1-ETO/GUS
Zelllinie KASUMI-1	5,46	80	1,42
Patient
Knochenmark (n = 8)	1,5 [0,26–3,0]	5,2 [0,26–11]	0,43 [0,054–1,5]
Blut (n = 13)	2,1 [0,17–5,9]	7,8 [0,21–170]	0,48 [0,027–2,7]
Korrel.-Koeff.	0,81	0,80	0,44

Literatur

[1] Marcucci et col., "Detection of minimal residual disease in patients with AML1/ETO-associated acute myeloid leukemia using a novel quantitative reverse transcription polymerase chain reaction assay", Leukemia, 1998, 12: 1482–1489.
[2] Van Dongen et col., Report of the European BIOMED 1 concerted Action, Leukemia, 1999.
[3] SAMBROOK et col., MOLECULAR CLONING a laboratory manual 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

Claims

Kit zur Bestimmung einer zu bestimmenden interessierenden DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, dass er wenigstens Folgendes umfasst: eine erste Verdünnungsreihe von bekannten Konzentrationen einer Konstruktion, die eine DNA-Sequenz, die der zu bestimmenden interessierenden DNA-Sequenz entspricht, umfasst und die in einen Vektor eingefügt und linearisiert ist, und eine zweite Verdünnungsreihe von bekannten Konzentrationen einer Konstruktion, die eine Sequenz eines ubiquitären Gens oder einer RNA eines ubiquitären Gens umfasst und die in einen Vektor eingefügt und linearisiert ist, wobei das Verdünnungsmedium weiterhin Nucleinsäuren umfasst, die keine Homologie mit den Sequenzen der Konstruktionen aufweisen.
Kit gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Konstruktion, die eine DNA-Sequenz, die der zu bestimmenden interessierenden DNA-Sequenz entspricht, umfasst, vollständig künstlich ist.
Kit gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor ein Plasmid ist.
Kit gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Verdünnungsmedium eine Pufferlösung ist.
Kit gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Pufferlösung einen pH-Wert von größer oder gleich 7 aufweist.
Kit gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Nucleinsäure, die keine Homologie mit den interessierenden Sequenzen aufweist, um RNA von E. coli handelt.
Kit gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das ubiquitäre Gen oder die RNA des ubiquitären Gens aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus ABL, GUS und B2M besteht.
Kit gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die zu bestimmende interessierende DNA-Sequenz ein interessierendes Gen ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus AML1-ETO, E2A-PBX1, BCR-ABL, MLL-AF4, TEL-AML1, SIL-TAL, PML-RARA, CBFb-MYH11 besteht.
Kit gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Verdünnungsreihen in flüssiger oder lyophilisierter Form konditioniert sind.
Verfahren zur Herstellung eines Kits zur Bestimmung einer interessierenden Nucleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst: – Herstellung einer Konstruktion, die einen Vektor umfasst, nach einem Verfahren, das die folgenden Schritte umfasst: (i) Einfügen einer zu bestimmenden interessierenden DNA-Sequenz in den Vektor; und (ii) Linearisieren der Konstruktion mit einem ausgewählten Restriktionsenzym, so dass das Enzym nur eine einzige Spaltstelle auf dem Vektor außerhalb der Einfügung erkennt; – Herstellen einer Verdünnungsreihe von bekannten Konzentrationen der Konstruktion in einem Medium mit einem pH-Wert von größer oder gleich 7, das RNA von E. coli umfasst; und – Herstellen einer Verdünnungsreihe von bekannten Konzentrationen einer Konstruktion, die eine Sequenz eines ubiquitären Gens oder einer RNA eines ubiquitären Gens umfasst und die in einen Vektor eingefügt und linearisiert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die in den Vektor eingefügte DNA-Sequenz aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus AML1-ETO, E2A-PBX1, BCR-ABL, MLL-AF4, TEL-AML1, SIL-TAL, PML-RARA, CBFb-MYH11 besteht.
Verwendung der Kits gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Quantifizierung von Nucleinsäuren in einer zu analysierenden Probe.
Verwendung gemäß Anspruch 12 zur Quantifizierung von Genen.
Verwendung gemäß Anspruch 12 zur Quantifizierung von Fusionstranscripten.
Verwendung gemäß Anspruch 14 zur Quantifizierung von Fusionstranscripten, die an Leukämien beteiligt sind.
Verfahren zur Quantifizierung einer Zielnucleinsäure in einer zu analysierenden Probe, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst: – Bestimmung einer Konstruktion, die eine zu bestimmende DNA-Sequenz umfasst und die in einen Vektor eingefügt und linearisiert ist, durch quantitative PCR und Herstellen einer Eichkurve mit Hilfe der Verdünnungsreihe, wobei die DNA-Sequenz der Zielnucleotidsequenz entspricht; – Bestimmung einer Konstruktion, die die Sequenz des ubiquitären Gens oder der RNA des ubiquitären Gens umfasst und die in einen Vektor eingefügt und linearisiert ist, durch quantitative PCR und Herstellen einer Eichkurve mit Hilfe der Verdünnungsreihe; – Bestimmung der Zielsequenz und des ubiquitären Gens oder der RNA des ubiquitären Gens durch quantitative PCR in der Probe mit Hilfe der Eichkurven; und – Berechnung der normierten Zahl der Kopien mit Hilfe der folgenden Formel: log(NCN) = logTF – logGU,wobei NCN die normierte Zahl der Kopien ist; TF die Zahl der Kopien der Zielsequenz ist; und GU die Zahl der Kopien des ubiquitären Gens oder der ubiquitären RNA ist, wobei die Bestimmungen vorzugsweise doppelt durchgeführt werden.
Diagnoseverfahren für einen Patienten, der unter einer Leukämie leidet, die ein Fusionstranscript impliziert, das aus E2A-PBX1, MLL-AF4, TEL-AML1, BCR-ABL(mBCR), BCR-ABL(MBCR), SIL-TAL, PML-RARA, CBFb-MYH11, AML1-ETO ausgewählt ist, umfassend die folgenden Schritte: – Durchführen einer Bestimmung des Transcripts nach dem Verfahren zur Quantifizierung gemäß Anspruch 16; und – Vergleich des Ergebnisses mit einem Referenzwert.
Verwendung des Verfahrens gemäß Anspruch 17 zur Bewertung der Wirksamkeit einer Leukämiebehandlung.