ES2292742T3 - Preparacion de calibrantes y su aplicacion a la cuantificacion de secuencias nucleotidicas de interes. - Google Patents
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Abstract
Kit de ensayo de una secuencia de ADN de interés que se someterá a ensayo, caracterizado porque comporta al menos una primera gama de diluciones de concentraciones conocidas de una construcción que comporta una secuencia de ADN correspondiente a la secuencia de ADN de interés que se someterá a ensayo, insertada en un vector y linealizada y una segunda gama de diluciones de concentraciones conocidas de una construcción que comporta una secuencia de un gen o de un ARN de gen ubicuo, insertada en un vector y linealizada, comportando además el medio de dilución ácidos nucleicos que no presentan homología con las secuencias de dichas construcciones.
Description
Preparación de calibrantes y su aplicación a la
cuantificación de secuencias nucleotídicas de interés.
La presente invención se refiere a la
preparación de calibrantes y a sus aplicaciones en la
cuantificación de secuencias nucleotídicas de interés.
La cuantificación de secuencias nucleotídicas de
interés puede realizarse según varios enfoques:
- por determinación de la sensibilidad mínima de
un experimento (PCR cualitativa)
- por uso de un competidor (PCR competitiva),
o,
- por PCR cuantitativa en tiempo real.
La PCR cualitativa está ligada a la
investigación de secuencias nucleotídicas. Se trata de constatar la
presencia o la ausencia de estas secuencias (técnica en punto
final). En consecuencia, no es posible ninguna cuantificación
precisa.
La PCR competitiva es una PCR cuantitativa que
usa un competidor quimérico plasmídico. Esta técnica supone que la
eficacia de la PCR es idéntica para el competidor y el transcrito
buscado, que son de tamaños diferentes. Por otra parte, esta
técnica usa una PCR anidada que aumenta enormemente el riesgo de
contaminación.
La PCR cuantitativa en tiempo real persigue
cuantificar por mediación de moléculas fluorescentes los ácidos
nucleicos de una muestra. Se trata de una técnica en tiempo real y
no en punto final. La medida se efectúa así durante la fase
exponencial de la PCR, lo que permite suponer un rendimiento de la
PCR del 100%. En el ámbito de la oncología, Marcucci y col. [1] han
sido los primeros en describir este procedimiento. Sin embargo, se
han constatado problemas de estabilidad en el curso de la
realización del procedimiento por los autores de la invención.
Además, el rendimiento de amplificación de la secuencia que se
someterá a ensayo del calibrante no alcanza el 100% y la expresión
media del gen ubicuo usado para la normalización del ensayo no
puede cuantificarse de manera correcta. Estas dificultades provocan
entonces una no reproducibilidad de los ensayos.
Otro problema que interviene en la
cuantificación de gen resulta de las variaciones consiguientes
observadas para un mismo ensayo efectuado por laboratorios
diferentes. Los resultados obtenidos parecen así dependientes del
operador, el ensayo y las condiciones en las que éste opera.
Los trabajos de los autores de la invención les
han llevado a poner a punto un procedimiento de cuantificación de
secuencias nucleotídicas de interés, de manera que se libere de
todos los parámetros exteriores que pueden inducir fluctuaciones en
los resultados de un ensayo y se obtenga así una reproducibilidad
perfecta de los resultados de este ensayo con independencia de cuál
sea el laboratorio en el que se ha realizado este ensayo.
La invención suministra así un kit de ensayo de
una secuencia de ADN de interés que se someterá a ensayo,
caracterizado porque comporta al menos una primera gama de dilución
de concentración conocida de una construcción (denominada
calibrante) que comporta una secuencia de ADN correspondiente a la
secuencia de ADN de interés que se someterá a ensayo, insertada en
un vector y linealizada, comportando además el medio de dilución
ácidos nucleicos que no presentan homología con las secuencias de
interés de dichas construcciones, y una segunda gama de diluciones
de concentraciones conocidas de una construcción que comporta una
secuencia de un gen o de un ARN de gen ubicuo, insertada en un
vector y linealizada.
Por el término calibrante, se refiere una
construcción que permite efectuar un ensayo cuantitativo.
La linealidad del calibrante es el parámetro
esencial que garantiza la reproducibilidad. En efecto, la
linealidad del calibrante permite mejorar considerablemente el
rendimiento de la PCR.
Se constituyen vectores apropiados por vectores
de clonación.
Preferentemente, el calibrante es completamente
artificial.
El protocolo de fabricación de un calibrante
completamente artificial se detalla en el ejemplo 1.
Esta característica permite evitar interferencia
en el ensayo que pudiera deberse a la complejidad de la materia
biológica.
Además, la secuencia de interés es de ADN.
En efecto, el uso del ADN permite una mejor
estabilidad en el tiempo del calibrante según la invención.
El vector usado para la preparación del
calibrante según la invención podrá ser ventajosamente un
plásmido.
\global\parskip0.950000\baselineskip
La segunda gama de dilución permitirá efectuar
una cuantificación correcta del gen o del transcrito de gen ubicuo
con el fin de normalizar el primer ensayo.
En particular, la similitud de las condiciones
de operación de los dos ensayos permitirá la exactitud de la
normalización.
Según un modo de realización preferido, el medio
de dilución de los kits según la invención es una solución
tampón.
La elección de la solución tampón permite
favorecer la estabilidad de los calibrantes durante su
almacenamiento y durante los ensayos.
La presencia de ácidos nucleicos en los medios
de las gamas de dilución permite reproducir artificialmente el
medio biológico de la muestra que se someterá a ensayo. Se trata en
efecto de efectuar el conjunto de los ensayos en condiciones
similares con el fin de obtener la mejor reproducibilidad.
Preferentemente, el medio de dilución es una
solución tampón de pH superior o igual a 7.
Este pH permite garantizar una estabilidad
óptima de los calibrantes.
Según un modo de realización preferido, el ácido
nucleico introducido en los medios de dilución es ARN de E.
coli.
Preferentemente, el gen o transcrito de gen
ubicuo se elige entre el grupo compuesto por Abelson (ABL),
\beta-glucuronidasa (GUS) y
\beta-2-microglobulina (B2M).
Estos transcritos de gen ubicuo han sido
estudiados más en particular por los autores de la invención, si
bien están perfectamente caracterizados (ver la tabla 1 del ejemplo
2). Su uso permite así aumentar la reproducibilidad de un ensayo a
otro.
Los kits según la invención son particularmente
apropiados para el ensayo de genes de interés como
AMLI-ETO, E2A-PBX1,
BCR-ABL, MLL- AF4, TEL-AML1,
SIL-TAL, PML-RARA,
CBFb-MYH11. Por ello, de manera ventajosa, los kits
según la invención pueden comportar gamas de dilución de dichos
genes de interés.
Las secuencias y los valores de referencias de
estos transcritos de fusión se describen en el ejemplo 4.
Según un modo de realización preferido, las
gamas de calibrantes de los kits según la invención están
acondicionadas en forma liquida o liofilizada.
La invención cubre igualmente un procedimiento
de preparación de un kit de ensayo de una secuencia nucleotídica de
interés, caracterizado porque comporta las etapas siguientes:
- preparación de una construcción que comprende
un vector, según el procedimiento que comporta las etapas
siguientes:
- (i)
- inserción de una secuencia de ADN de interés que se someterá a ensayo en el vector, y,
- (ii)
- linealización de dicha construcción por una enzima de restricción seleccionada de manera que dicha enzima sólo reconoce un sitio de corte en el vector, en el exterior del inserto,
- realización de una gama de diluciones de
concentraciones conocidas de dicha construcción en un medio de pH
superior o igual a 7, que comporta ARN de E. coli, y,
- realización de una gama de diluciones de
concentraciones conocidas de una construcción que comporta una
secuencia de un gen o de un ARN de gen ubicuo, insertada en un
vector y linealizada.
Los calibrantes de los kits según la invención
permiten efectuar con precisión y reproducibilidad, la
cuantificación de toda clase de ácidos nucleicos en una muestra
para analizar, ventajosamente, ácidos nucleicos asociados a
patologías.
Más precisamente, los calibrantes de los kits
según la invención están particularmente adaptados a la
cuantificación de genes, de transcritos de fusión y más
particularmente a la cuantificación de transcritos de fusión
implicados en las leucemias.
La invención proporciona igualmente un
procedimiento de cuantificación de un ácido nucleico objetivo en
una muestra, caracterizado porque comporta las etapas
siguientes:
- ensayo por PCR cuantitativa y establecimiento
de una curva de calibrado con ayuda de la gama de dilución del
calibrante que lleva la secuencia nucleotidica objetivo,
\global\parskip1.000000\baselineskip
- ensayo por PCR cuantitativa y establecimiento
de una curva de calibrado con ayuda de la gama de dilución de una
construcción que comporta una secuencia de ADN que se someterá a
ensayo, insertada en un vector y linealizada, con dicha secuencia
de ADN correspondiente a la secuencia nucleotídica objetivo,
- ensayo por PCR cuantitativa y establecimiento
de una curva de calibrado con ayuda de la gama de diluciones de una
construcción que lleva la secuencia del gen o ARN de gen ubicuo,
insertada en un vector y linealizada,
- ensayo por PCR cuantitativa de la secuencia
objetivo y del gen o ARN de gen ubicuo en la muestra, con ayuda de
curvas de calibrado, y,
- cálculo del número de copias normalizado con
ayuda de la fórmula siguiente:
log (NCN) = log
TF - log
GU
en la que NCN es el número de
copias normalizado, TF, el número de copias de la secuencia
objetivo, y GU, el número de copias del gen o ARN ubicuo, siendo
realizados los ensayos preferentemente en
duplicado.
Este procedimiento se detalla ampliamente en el
ejemplo 2. Además, el ensayo efectuado en el ejemplo 3 permite
mostrar una puesta en aplicación de este procedimiento.
La invención propone finalmente un procedimiento
de diagnóstico de un paciente afectado por una leucemia que implica
un transcrito de fusión elegido entre E2A-PBX1,
MLL-AF4, TEL-AML1,
BCR-ABL(mBCR),
BCR-ABL(MBCR), SIL-TAL,
PML-RARA, CBFb-MYH11,
AMLI-ETO que comporta las etapas siguientes:
- puesta en marcha de un ensayo de dicho
transcrito realizado según el procedimiento de cuantificación según
la reivindicación 16, y,
- comparación del resultado con un valor de
referencia,
y su uso para apreciar la eficacia de un
tratamiento antileucémico.
\vskip1.000000\baselineskip
Se amplifica un transcrito de fusión
(MLL-AF4, por ejemplo) con los cebadores
correspondientes [2] a partir del ADNc obtenido de una línea celular
o de un paciente. El producto de PCR se inserta en un vector
adaptado (plásmido pCR II TOPO, por ejemplo) y después se clona en
una cepa bacteriana de E. coli competente para la
transformación.
Se extrae entonces el vector plasmídico según
los procedimientos clásicos [3] y se cuantifica por
espectrofotometría UV.
A continuación se linealiza este vector. La
enzima de restricción seleccionada para la linealización sólo debe
presentar un sitio de corte en el vector, en el exterior del
inserto.
Teniendo en cuenta el tamaño del vector y del
inserto, se calcula el tamaño de la construcción plasmídica (en
pares de base). Se estima su peso molecular para un peso medio de
nucleótidos. A continuación se determina el número de copias
presente en un peso dado de plásmido digerido.
A continuación se realiza una gama de
dilución.
Entonces, el patrón plasmídico está listo para
su empleo.
\vskip1.000000\baselineskip
La preparación de las secuencias nucleotídicas
de interés antes de la clonación en un vector se efectúa:
- bien a partir de un ARN transformado en ADNc
por una etapa de transcripción inversa (RT) seguida en su caso de
la síntesis de una segunda cadena de ADN,
- bien directamente a partir de un ADN.
A continuación, los fragmentos de ADN obtenidos
por uno u otro de los procedimientos pueden amplificarse por
PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias de ADN objetivo se preparan
primero por transcripción inversa (RT) de un ARN total, ribosómico
o mensajero de origen humano, animal o vegetal, de organismos pro- o
eucariotas, uni o pluricelulares, de virus.
La RT se desarrolla según el protocolo 1 [2] o
el protocolo 2 de RT aplicado a los fragmentos largos. Protocolo 1:
RT BIOMED-1
Este protocolo está inspirado en la referencia
[2].
La transcripción inversa necesita cebadores.
Estos pueden ser aleatorios (N(6)) u oligodT(30), lo
que comporta en su caso una secuencia adicional que permite
realizar una PCR anclada (por ejemplo, ID SEC. Nº 1: 5' CGT CGT CGT
GAA TTC CTA GAT CTT CTA GAT ATG TT 3'). Los cebadores pueden en su
caso modificarse a sus extremos para un uso ulterior.
La transcripción inversa se efectúa en dos
tiempos:
\vskip1.000000\baselineskip
Se desnaturaliza 1 \mug de ARN en 8,5 \mul
de agua según el ciclo siguiente: 10' a 70ºC, y después
mantenimiento a 20ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
El ARN desnaturalizado se mezcla con 10,5 \mul
de la mezcla de reacción siguiente: Tampón 5X (4 \mul),
dNTPNa-10 mM (2 RI), DTT-100 mM (2
\mul), cebador de RT 10 \muM (1 \mul),
RNasa-inh 40 U/\mul (0,5 \mul), transcriptasa
inversa 50 U/\muI (2 RI). La síntesis del ADNc se realiza según el
ciclo siguiente: 10' a 20ºC-45' a
42ºC-3' a 99ºC-4ºC infinito. Esta
síntesis se realiza, en su caso, con nucleótidos modificados.
Protocolo 2: RT aplicada a los fragmentos largos.
La transcripción inversa necesita reactivos que
permitan formar ADNc de gran tamaño. Para estas experimentaciones
se usa el kit Expand Reverse Transcriptase® de ROCHE. Los cebadores
usados son cebadores aleatorios (N(9)) u oligodT (30) que
comportan, en su caso, una secuencia adicional que permite realizar
una PCR anclada, como la ID SEC. Nº 1 descrita anteriormente. Los
cebadores pueden, en su caso, ser modificados en sus extremos para
un uso ulterior.
La transcripción inversa se efectúa en tres
tiempos:
\vskip1.000000\baselineskip
Se desnaturaliza 1 \mug de ARN en 8,5 \mul
de agua según el ciclo siguiente: 10' a 70ºC, y después
mantenimiento a 20ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
El ARN desnaturalizado se mezcla con 10,5 \mul
de la mezcla de reacción siguiente: Tampón 5X (4 \mul),
dNTPNa-10 mM (2 \mul), DTT-100 mM
(2 \mul), cebador de RT 10 12M (1 \mul),
RNasa-inh 40 U/\mul (0,5 \mul), Expand RT
50U/\mul (1 \mul). La síntesis del ADNc se realiza según el
ciclo siguiente: 10' a 20ºC-45' a 2 h a
42ºC-3' a 99ºC-4ºC infinito. Esta
síntesis puede realizarse con nucleótidos modificados.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añaden 2 \mul de RNasa H (50 U/\mul) a
los 20 \mul de la mezcla precedente, y se incuban 10' a 42ºC y
después se lleva el tubo a 20ºC. A continuación se diluye el
conjunto a 1/3, con volumen final 60 \mul.
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias de ADN se obtienen bien
directamente a partir de ADN o bien por transcripción inversa a
partir de ARN.
Si las secuencias objetivo se obtienen
directamente a partir de ADN, éste puede ser de origen humano,
animal o vegetal, provenir de organismos pro- o eucariotas, uni o
pluricelulares, de virus, a partir de secuencias intrónicas,
exónicas, codificantes o no codificantes.
Si las secuencias objetivo se obtienen a partir
de ARN, éste se trata según el párrafo precedente con el fin de
obtener una primera cadena de ADN complementario.
Una segunda cadena de ADN puede sintetizarse a
partir de la secuencia obtenida por RT después de adición de una
cola (tailing) en 3', actuando, por ejemplo, según el protocolo 3 o
de ligamiento con una secuencia predefinida que contiene en su caso
un sitio reconocido por una enzima de restricción en su extremo.
Protocolo 3: Adición de cola para la síntesis de una segunda
cadena.
La adición de cola se realiza en el producto
preparado por el protocolo 2 y basado en la referencia [3].
\vskip1.000000\baselineskip
La purificación se realiza en una columna de
Sephadex G50®. A continuación se eluye el ADNc en 50 \mul de agua
o de Tris-EDTA 10 mM/1 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
En un volumen de 24 \mul: de agua estéril (9,5
\muI), Tampón (10X) 1,25 \mul, dCTP modificado en su caso [2
mM] 2,5 \mul, MgCl_{2} [50 mM] (0,75 \mul), ADNc purificado
(10 \mul).
Incubar de 2 a 3 minutos a 94ºC. Enfriar 1 mn en
hielo.
Añadir la TdT, homogeneizar e incubar 15 mn a
37ºC.
Inactivar la TdT durante 10 mn a 70ºC.
Una vez obtenido el ADN (directa o
indirectamente, monocatenario o no), las secuencias pueden
amplificarse, en su caso, por PCR o insertarse directamente en un
vector.
La PCR se realiza a partir de un par de
cebadores conocidos (referencia 1) o de cebadores definidos según
la invención (que comporta en su caso en su extremo 5' una
secuencia reconocida por una enzima de restricción) que permite
amplificar el objetivo según el protocolo 4 de PCR
BIOMED-1 o el protocolo 5 de PCR de fragmentos
largos. Protocolo 4: PCR BIOMED-1.
Este protocolo de PCR se basa en la referencia
[2].
Permite amplificar las secuencias de interés
objetivo por los cebadores (A y B) de la referencia [2], y sobre
todo los genes de fusión de la referencia [2] o genes ubicuos.
Estos cebadores pueden, en su caso, modificarse en sus extremos
para un uso ulterior.
El ciclo de amplificación es el siguiente:
94ºC-3', 35 x (94ºC-30'',
65ºC-30'', 72ºC-1'),
16ºC-infinito. Se efectúa en presencia de Taq ADN
polimerasa®, de nucleótidos modificados, en su caso, y de 10 \mul
de producto de RT o de 1 \mul de ADN. Los fragmentos obtenidos
son de tamaño corto y pueden clonarse a continuación en vectores
adaptados. Protocolo 5: PCR de fragmento largo (clásica, anclada o
bianclada).
El programa de amplificación y la Taq ADN
polimerasa® permiten la obtención de fragmentos de al menos 5 kb
con cebadores específicos. La amplificación se realiza con dNTP
sustituidos en su caso por nucleótidos modificados.
El ciclo de amplificación es el siguiente:
94ºC-30'', 10 x (94ºC-10'',
68ºC-8'), 20 x (94ºC-10",
68ºC-8' + 20" por ciclo),
68ºC-7', 16ºC-infinito.
En un pocillo de PCR de 50 \mul, la mezcla de
reacción es la siguiente:
Producto de RT o de PCR (10 pi), H20 DEPC (21
\mul), dNTP-10 mM (2,5 \mul), Cebador sentido o
ancla correspondiente al ID SEC. Nº 1 anterior de 100 \muM (0,5
pi), Cebador antisentido o ancla de 100 \muM (0, 5 \mul), Tampón
de PCR (5 pi), MgCl_{2} a 3 mM final, Taq ADN polimerasa® 3,5U. El
ancla corresponde a toda secuencia definida, siendo la secuencia
dada aquí un ejemplo que comporta sitios de corte para enzimas de
restricción.
Esta amplificación puede seguirse, en su caso,
de una segunda con cebadores internos para aumentar la
especificidad de la amplificación. Los cebadores pueden, en su
caso, modificarse en sus extremos para un uso ulterior.
\vskip1.000000\baselineskip
Con fines de purificación, los productos se
depositan primero sobre gel para controlar el tamaño y la cantidad
relativa con respecto a un marcador de peso molecular de
concentración conocida. La cantidad del producto se estima con
respecto al marcador de peso molecular. En presencia de varias
bandas, puede realizarse un aislamiento de la banda de interés por
recorte en el gel de la banda buscada y extracción del ADN de
interés.
A continuación, estos productos se purifican, en
su caso, por precipitación en etanol, y después recuperación en un
volumen de Tris-EDTA 10 mM/1 mM para ser sometidos
a ensayo por espectrofotometría UV [3] o por espectrofluorimetría
con ayuda de un agente fluorescente de intercalación.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se clonan los productos
preparados. A este efecto, se insertan en un vector de clonación, y
después se transfieren a un organismo hospedador de origen humano,
animal, viral o vegetal, de organismos pro- o eucariotas, uni o
pluricelulares, con el fin de producir la secuencia de interés en
gran cantidad.
\vskip1.000000\baselineskip
La(s) secuencia(s) de interés se
liga(n) al vector mediante una ligasa o una topoisomerasa en
el sitio de clonación. El vector plasmídico (BlueScript® o
equivalente), fágico (Lambda o equivalente), cosmídico, viral o
incluso un vector YAC (levaduras) o BAC que contiene el inserto se
amplifica en gran cantidad para ser extraído.
La célula hospedadora receptora es
ventajosamente una cepa bacteriana Escherichia coli,
convertida en competente por transformación por un procedimiento
físico o químico. El clon (vector + inserto) puede introducirse en
otras cepas bacterianas u organismos procariotas, por ejemplo
levaduras o células de insecto. La extracción del vector portador
del inserto se realiza según las técnicas clásicas [3].
\vskip1.000000\baselineskip
La(s) secuencia(s) de interés se
inserta(n) en vectores eucariotas mediante una ligasa o una
topoisomerasa en el sitio de clonación, y después se
transfiere(n) a organismos eucariotas unicelulares (por
ejemplo, Saccharomyces sp o Candida sp),
pluricelulares o en líneas inmortalizadas humanas, animales o
vegetales.
\vskip1.000000\baselineskip
La selección del organismo portador del vector
se realiza ventajosamente según los procedimientos habituales [3] y
la presencia del inserto se verifica por PCR eligiendo cebadores no
específicos diseñados en el vector o específicos del inserto que
actúan en particular según el protocolo 4 de los ejemplos.
Se realiza la secuenciación del producto
insertado para determinar la presencia de posibles mutaciones en el
producto clonado y el sentido de inserción del producto. La
secuenciación se realiza las tecnologías clásicas a partir de
cebadores universales situados en el vector de clonación (M13, Sp6 o
T7, por ejemplo) o a partir de cebadores específicos para el
inserto.
\vskip1.000000\baselineskip
El calibrante puede comportar el gen de interés
(inserto) en diferentes formas: ADN bi o monocatenario, ARN.
\vskip1.000000\baselineskip
El vector de clonación se extrae de las células
por las técnicas clásicas de extracción (SAMBROOK). El producto se
recoge en una solución de Tris-EDTA 10 mM/1 mM pH =
8, se cuantifica por espectrofotometría UV [3] o por
espectrofluorimetría con ayuda de un agente de intercalación.
Después se digieren 20 \mug de este producto
en 20 \mul durante una hora a 37ºC con 10 U de una enzima de
restricción apropiada (BamHI, HindiII, u otra) para linealizar el
vector. A continuación se determina el número de copias de la
secuencia de interés o su equivalente en unidad de masa teniendo en
cuenta el peso molecular del vector, el tamaño del inserto y la
cantidad del producto donado en un volumen determinado.
\newpage
(Fórmula
1)
Fórmula
1PM_{c} = (NTV + NTI) *
PM_{N}/N
en la
que
PM_{c} es el peso molecular (g) de una copia
de vector que lleva 1 inserto,
NTV, el número de nucleótidos del vector,
NTI, el número de nucleótidos del inserto,
PM_{N}, el peso molecular medio de un
nucleótido, es decir 321,44 g, y,
N, el número de Avogadro, es decir
6,02\cdot10^{23}.
\vskip1.000000\baselineskip
A partir del vector linealizado (ver el párrafo
precedente), portador de secuencias universales M13F y M13R, se
produce una secuencia de ADN monocatenario usando una polimerasa
(tipo KLENOW o equivalente) en presencia del cebador
correspondiente para obtener la cadena deseada, según los
protocolos clásicos (SAMBROOK). A continuación se purifica el
producto sobre gel y después se recoge en una solución de
Tris-EDTA 10 mM/1 mM pH = 8, se cuantifica por
espectrofotometría UV [3] o por espectrofluorimetria con ayuda de
un agente de inter-
calación.
calación.
A continuación se determina el número de copias
de la secuencia de interés o su equivalente en unidad de masa
teniendo en cuenta el tamaño del inserto y la cantidad del producto
en un volumen determinado (Fórmula 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Para preparar el ARN, se aprovecha el hecho de
que el vector de donación (pCR II TOPO o Blue Script) portador de
la secuencia de interés descrita anteriormente posee los promotores
para las ARN polimerasas SP6 o T7. Estas polimerasas se usan para
la producción de ARN monocatenario a partir de los sitios
promotores en el vector según los protocolos habituales [3]. La
elección de la polimerasa depende del sentido de inserción de la
secuencia de
interés.
interés.
Entonces se purifica el ARN producido según las
técnicas clásicas de aislamiento [3]. Después se somete a ensayo
por espectrofotometría UV [3] o por espectrofluorimetría con ayuda
de un agente de intercalación (Hoescht o Interchim).
Finalmente, se determina el número de copias de
la secuencia de interés o su equivalente en unidad de masa teniendo
en cuenta el peso molecular del inserto y la cantidad del producto
clonado en un volumen determinado (Fórmula 1).
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se diluyen las secuencias de
interés de manera que se conozca su cantidad exacta en un volumen
determinado.
El producto final puede ser una muestra o una
serie de diluciones en cascada de la muestra que comporta una sola
o varias secuencias de ARN y/o ADN mono o bicatenario, vehiculizado
por el mismo fragmento de ácido nucleico o por fragmentos
diferentes.
La cantidad puede expresarse en forma de unidad
de masa de la secuencia de referencia o en número absoluto o
relativo con respecto a una segunda secuencia igualmente presente
en cantidad conocida en la preparación. Por extensión, puede
prepararse una mezcla de un gran número de secuencia de cantidad
conocida en una misma muestra de la misma manera.
El producto final puede estar liofilizado o en
solución en un disolvente apropiado, que comporta en su caso
agentes inertes o activos.
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.930000\baselineskip
Para realizar diluciones de ADN, a partir de una
cantidad conocida de ADN mono o bicatenario, se efectúa una
dilución en cascada de 10 en 10 o de mitad en mitad de esta
muestra. Estas diluciones se efectúan en un ARN (diluciones
realizadas en un ARN de origen humano, animal o vegetal, de
organismos pro- o eucariotas, uni o pluricelulares, de virus) o un
ADN en solución en un tampón TRIS-EDTA 10 mM/1 mM
pH = 8 en presencia de una o varias sustancias inertes (glicerol,
albúmina de suero bovino, leche en polvo, dextrano, ARN ribosómico
eucariótico 16 y 23S, o cualquier otro producto químico
estabilizador).
\vskip1.000000\baselineskip
Para realizar diluciones de ARN, se diluye una
cantidad conocida de ARN producido en cascada de 10 en 10 o de
mitad en mitad. Estas diluciones se realizan en un ARN (de origen
humano, animal o vegetal, de organismos pro- o eucariotas, uni o
pluricelulares, de virus) o un ADN en solución en un tampón
TRIS-EDTA 10 mM/1 mM pH = 8 en presencia de una o
varias sustancias inertes (glicerol, albúmina de suero bovino,
leche en polvo, dextrano, o cualquier otro producto químico
estabilizador).
Por ejemplo, la primera dilución, denominada
10-1, comportará 2,10^{9} copias del plásmido por
microlitro de solución, obtenida a partir de un volumen V de la
digestión enzimática diluida en un volumen final de 500 \mul de
agua DEPC. A continuación se realizan diluciones en cascada en un
tampón Tris-EDTA 10 mM/1 mM pH = 8 que contiene 20
ng/\mul de ARN 16S y 23S de E. coli para obtener
concentraciones finales de 200.000, 20.000, 2.000, 200, 20 y 2
copias por microlitro de solución.
A continuación se procede al control de las
preparaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Los controles cualitativos de la presencia del
inserto se realizan para determinar la presencia del inserto
buscado en el producto clonado. El aspecto de la(s)
banda(s) amplificada(s) sobre gel permite apreciar la
calidad de la preparación. Este control se efectúa por PCR a partir
de cebadores universales situados en el vector de clonación o a
partir de cebadores que han servido para producir el fragmento de
PCR según el programa de amplificación BIOMED-1. Se
efectúa de manera directa a partir de muestras de ADN o después de
RT (en particular según el protocolo 1 ó 2 a partir de muestras de
ARN).
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Los controles cuantitativos se realizan para
determinar la cantidad de secuencia de interés o de vector. Este
control puede efectuarse por PCR a partir de cebadores universales
situados en el vector de clonación o a partir de cebadores que han
servido para producir el fragmento de PCR según el programa de
amplificación del protocolo 6. Protocolo 6: PCR cuantitativa de
tipo Taqman®.
El ciclo de amplificación es el siguiente:
50ºC-2',
94ºC-2', 50 x (94ºC-30'',
60ºC-1'), 16ºC-infinito.
La composición de la mezcla de reacción es la
siguiente:
- Muestra de ADN o de ADNc (100 ng de ADN o su
equivalente)
- Cebadores sentido y antisentido 300 nM
final
- Sonda de revelado Taqman® marcada por
fluoróforos 200 nM final o su equivalente (agente de intercalación
fluorescente, SYBR green©, por ejemplo) que permite el revelado del
producto amplificado o mezcla de reacción que contiene estos
componentes,
- Mezcla de reacción que contiene el tampón de
PCR, la polimerasa, y cualquier otro componente que permite la
cuantificación.
El control se realiza de manera directa a partir
de muestras de ADN o después de RT a partir de muestras de ARN
(sobre todo según el Protocolo 1 o 2). La cuantificación puede
realizarse igualmente por las técnicas actuales de medida de las
secuencias nucleotídicas, en solución o en soportes sólidos gracias
a sustancias adaptadas a la cuantificación.
Se observará que, excepto los productos
obtenidos a partir de una dilución directa del vector (ADN
bicatenario) en la solución tampón, las secuencias del vector no
intervienen en ningún momento en el producto final.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La cuantificación comporta dos etapas
principales:
- la primera etapa consiste en someter a ensayo
el gen de interés,
- la segunda etapa tiene como finalidad
normalizar el ensayo efectuado.
La normalización se efectúa mediante el ensayo
de un gen denominado "ubicuo".
Todos los ensayos se efectúan por PCR
cuantitativa.
Para cada etapa, se establece una curva de
calibrado, con ayuda del calibrante según la invención, denominada
"curva estándar plasmídica". A continuación se efectúa el
ensayo del gen de interés y del gen ubicuo, presentes en la muestra.
A continuación se determinan los valores del ensayo por
interpolación, en la curva de calibrado.
Por "gen ubicuo", se entiende un gen de
referencia que sirve para normalizar los experimentos. Su
cuantificación es precisa y reproducible de un experimento a
otro.
Igualmente puede tratarse del transcrito del gen
ubicuo. Existen numerosos genes ubicuos
(\beta-globina, \beta-actina,
GAPDH o transcritos de genes como Abelson,
\beta-2-microglobulina o B2M,
\beta-glucuronidasa o GUS,
porfobilinogendesaminasa o PBGD, proteína de unión a Tata Box o TBP,
etc.) cuya expresión se conoce aproximadamente en las células del
cuerpo humano.
A modo de ejemplo, en la tabla siguiente se
describen los genes ubicuos preferidos, así como sus valores
experimentales:
\vskip1.000000\baselineskip
El gen ubicuo se elige en función de diversos
parámetros:
- en primer lugar es preciso que su expresión
sea estable en las condiciones experimentales,
- es preciso igualmente que su expresión esté en
correlación con la del objetivo en el curso del procedimiento de
degradación, es decir, que su expresión se mantenga en una relación
constante con la del objetivo.
El gen ubicuo se prepara según el mismo
procedimiento que el gen de interés. Se obtiene así una gama de
dilución de calibrantes que contiene el gen ubicuo.
El ensayo del "gen ubicuo" o de su
transcrito dará una información sobre la calidad del ensayo
efectuado. En efecto, el ensayo se efectúa por PCR cuantitativa, lo
que puede traducirse en una degradación del ADN o del ARN sometido
a ensayo, en particular en la muestra que representa un medio
complejo. Se supone que esta degradación del ADN o del ARN sometido
a ensayo se acompañará de una degradación similar, en las mismas
proporciones, del "gen o transcrito ubicuo". Si se conoce la
cantidad exacta de gen ubicuo determinado por la PCR, se puede
deducir la degradación de dicho gen y según el postulado enunciado
anteriormente, la del gen de interés que se someterá a ensayo en la
muestra.
Se establece una curva estándar plasmídica en 3
diluciones logarítmicas sometidas a ensayo en duplicado en el mismo
experimento. Se determina la posición del primer y el segundo punto
de dilución con respecto a la expresión media observada del gen
estudiado. El número de copias presentes en la muestra considerada
se determina por interpolación.
Por ejemplo, la expresión media del gen ubicuo
ABL es de 20.000 copias para 0,1 \mug de equivalente de ARN. Se
calcula la primera dilución de plásmido para que contenga 100.000
copias en 5 \mul de solución. La segunda y la tercera contendrán
respectivamente 10.000 y 1.000 copias en 5\mul de solución. De
esta forma, toda degradación del ARN de la muestra se traducirá en
un número de copias más bajo y se enmarcará en las diluciones
segunda y tercera.
\vskip1.000000\baselineskip
Se establece una curva estándar plasmídica en de
4 a 5 diluciones logarítmicas sometidas a ensayo en duplicado en el
mismo experimento. El primer punto de gama corresponde a 1.000.000
copias del gen y el último a 10 copias. Las diluciones intermedias
son de 100.000, 1.000 y (o) 100 copias. El número de copias
presentes en la muestra considerada se determina por
interpolación.
\vskip1.000000\baselineskip
La amplificación de los productos de PCR sigue
una ley geométrica. La distribución estadística del número de
copias en una muestra para un ensayo repetido es logarítmica. Por
tanto, es necesario considerar los valores logarítmicos para
efectuar los cálculos de normalización.
Así, para una muestra sometida a ensayo en
duplicado para un gen de interés dado, por ejemplo, un transcrito
de fusión (TF1 y TF2) y su gen ubicuo (GUI y GU2), el valor
obtenido sigue la expresión siguiente:
Fórmula 2log
(NCN) = (log TF1+log TF2)/2—(log GU1+log
GU2)/2+CN
en la
que
NCN es el número de copias normalizado,
TF, el número de copias de la secuencia objetivo
(por ejemplo, transcrito de fusión),
GU, el número de copias del gen o transcrito de
gen ubicuo,
CN (facultativo) es el logaritmo del número
medio de copias observado para el gen considerado (ej.: para ABL,
CN = 4).
Esto permite expresar el resultado para 10.000
copias de ABL.
Por el término "log", se refiere un
logaritmo decimal.
A continuación pueden comunicarse los resultados
en unidades derivadas: por número de moles, de gramos o sus
derivados.
Se realiza en paralelo la amplificación de un
transcrito de fusión (MLL-AF4) y de un gen ubicuo
(ABL) por PCR cuantitativa. Los resultados en bruto de la máquina
se reproducen en la tabla siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
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Ejemplo de amplificación en paralelo de 2
transcritos ABL y MLL-AF4 en plásmidos y una
muestra de paciente en diagnóstico.
Los valores en bruto (Ct) de las diluciones
plasmídicas dadas por la máquina se usan para construir la recta de
regresión colocando en abscisas el logaritmo del número de copias y
en ordenadas el Ct de la dilución. Las rectas de regresión
correspondientes se muestran en la tabla 2. El número de copias
correspondiente se calcula por interpolación.
Usando la fórmula 2, el resultado obtenido para
el paciente se calcula según:
log (NCN) =
3,71-4,01=
-0,30
en la
que
NCN = 10^{(-0,30)} = 0,501 copias de
MLL-AF4 por copia del transcrito de referencia
(ABL).
\vskip1.000000\baselineskip
Los transcritos de fusión se obtienen de la
fusión de dos genes.
La tabla mostrada a continuación suministra los
números de acceso al banco de datos Genbank®, habiéndose fusionado
secuencias de los dos genes para producir el transcrito
descrito.
Los valores de nivel de expresión de los
principales transcritos de fusión implicados en las leucemias no se
han presentado hasta ahora nunca en su globalidad.
Las tablas siguientes ilustran estos valores. Se
pueden usar como valor de comparación después de un ensayo,
pudiendo realizarse de acuerdo con el procedimiento de
cuantificación según la invención. Estos ensayos pueden destinarse
en particular en el diagnóstico (en el marco de un procedimiento de
diagnóstico, por ejemplo) o para apreciar la eficacia de un
tratamiento concerniente a cualquier estado patológico para el cual
se ha puesto de relieve como diagnóstico una anomalía génica (gen o
transcrito) detectable por el procedimiento propuesto. En
particular, los procedimientos de ensayos y de diagnóstico según la
invención permiten el seguimiento de tratamientos
antileucémicos.
El conjunto de estos valores se resume en la
figura 1. En esta figura, TG se refiere a los transcritos de
fusión, NCN, al número de copias normalizado, LAL, a una leucemia
aguda linfoblástica y LMC, a una leucemia mieloide crónica.
En las tablas siguientes, salvo excepción, el
número de copias normalizado del gen de fusión se da para una copia
del gen ABL, del gen GUS o 100 copias de B2M. El valor medio se
define para un intervalo que cubre el 95% de los valores. El
coeficiente de correlación (Coef. Correl.) se define antes de
normalización por el gen ubicuo.
No se ha constatado ninguna diferencia
estadisticamente significativa entre los resultados obtenidos en
las muestras de sangre y los de la médula.
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[1] Marcucci y col., "Detection of
minimal residual disease in patients with
AML1/ETO-associated acute myeloid leukemia using a
novel quantitative reverse transcripción polymerase chain reaction
assay", Leukemia, 1998,
12:1482-1489.
[2] Van Dongen y col., Report of the
European BIOMED 1 concerted Action, Leukemia,
1999.
[3] SAMBROOK y col., MOLECULAR CLONING a
laboratory manual 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1989.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante pretende únicamente servir de ayuda al lector y no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto
el máximo cuidado para su elaboración, no pueden descartarse
errores u omisiones y la EPO declina toda responsabilidad a este
respecto.
\bulletMARCUCCI. Detection of minimal
residual disease in patients with
AMLI/ETO-associated acute myeloid leukemia using a
novel quantitative reverse transcripción polymerase chain reaction
assay. Leukemia, 1998, vol. 12,
1482-1489 [0134]
\bullet VAN DONGEN. Report of the
European BIOMED 1 concerted Action. Leukemia, 1999
[0134]
\bulletSAMBROOK. MOLECULAR CLONING.
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 [0134]
Claims (18)
-
\global\parskip0.950000\baselineskip
1. Kit de ensayo de una secuencia de ADN de interés que se someterá a ensayo, caracterizado porque comporta al menos una primera gama de diluciones de concentraciones conocidas de una construcción que comporta una secuencia de ADN correspondiente a la secuencia de ADN de interés que se someterá a ensayo, insertada en un vector y linealizada y una segunda gama de diluciones de concentraciones conocidas de una construcción que comporta una secuencia de un gen o de un ARN de gen ubicuo, insertada en un vector y linealizada, comportando además el medio de dilución ácidos nucleicos que no presentan homología con las secuencias de dichas construcciones. - 2. Kit según la reivindicación 1, caracterizado porque la construcción que comporta una secuencia de ADN correspondiente a la secuencia de ADN de interés que se someterá a ensayo es completamente artificial.
- 3. Kit según la reivindicación 1 6 2, caracterizado porque el vector es un plásmido.
- 4. Kit según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el medio de dilución es una solución tampón.
- 5. Kit según la reivindicación 4, caracterizado porque la solución tampón es de pH superior o igual a 7.
- 6. Kit según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el ácido nucleico que no presenta homología con las secuencias de interés es ARN de E. coli.
- 7. Kit según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el gen o el ARN de gen ubicuo se elige entre el grupo compuesto por ABL, GUS y B2M.
- 8. Kit según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la secuencia de ADN de interés que se someterá a ensayo es un gen de interés elegido entre el grupo compuesto por AMLI-ETO, E2A-PBX1, BCR-ABL, MLL-AF4, TEL-AML1, SIL-TAL, PML-RARA, CBFb-MYH11.
- 9. Kit según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque las gamas de diluciones están acondicionadas en forma líquida o liofilizada.
- 10. Procedimiento de preparación de un kit de ensayo de una secuencia nucleotídica de interés, caracterizada porque comporta las etapas siguientes:- preparación de una construcción que comprende un vector, según el procedimiento que comporta las etapas siguientes:
- (i)
- inserción de una secuencia de ADN de interés que se someterá a ensayo en el vector, y
- (ii)
- linealización de dicha construcción por una enzima de restricción seleccionada de manera que dicha enzima sólo reconoce un sitio de corte en el vector, en el exterior del inserto,
- realización de una gama de diluciones de concentraciones conocidas de dicha construcción en un medio de pH superior o igual a 7, que comporta del ARN de E. coli, y,- realización de una gama de diluciones de concentraciones conocidas de una construcción que comporta una secuencia de un gen o de un ARN de gen ubicuo, insertada en un vector y linealizada. - 11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque la secuencia de ADN insertada en el vector se elige entre el grupo compuesto por AMLI-ETO, E2A-PBX1, BCR-ABL, MLL-AF4, TEL- AML1, SIL-TAL, PML-RARA, CBFb-MYH11.
- 12. Uso de los kits según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para la cuantificación de ácidos nucleicos en una muestra para analizar.
- 13. Uso según la reivindicación 12 para la cuantificación de genes.
- 14. Uso según la reivindicación 12 para la cuantificación de transcritos de fusión.
- 15. Uso según la reivindicación 14 para la cuantificación de transcritos de fusión implicados en las leucemias.
- 16. Procedimiento de cuantificación de un ácido nucleico objetivo en una muestra para analizar, caracterizado porque comporta las etapas siguientes:- ensayo por PCR cuantitativa y establecimiento de una curva de calibrado con ayuda de la gama de diluciones de una construcción que comporta una secuencia de ADN que se someterá a ensayo, insertada en un vector y linealizada, con dicha secuencia de ADN correspondiente a la secuencia nucleotídica objetivo,- ensayo por PCR cuantitativa y establecimiento de una curva de calibrado con ayuda de la gama de diluciones de una construcción que lleva la secuencia del gen o ARN de gen ubicuo, insertada en un vector y linealizada,- ensayo por PCR cuantitativa de la secuencia objetivo y del gen o ARN de gen ubicuo en la muestra, con ayuda de curvas de calibrado, y,- cálculo del número de copias normalizado con ayuda de la fórmula siguiente:log (NCN) = log TF - log GUen la queNCN es el número de copias normalizado,TF el número de copias de la secuencia objetivo, yGU, el número de copias del gen o ARN ubicuo, estando realizados los ensayos preferentemente en duplicado.
- 17. Procedimiento de diagnóstico de un paciente afectado por una leucemia que implica un transcrito de fusión elegido entre E2A-PBX1, MLL-AF4, TEL-AML1, BCR-ABL(mBCR), BCR-ABL(MBCR), SIL-TAL, PML-RARA, CBFb-MYH11, AMLI-ETO que comporta las etapas siguientes:- puesta en marcha de un ensayo de dicho transcrito realizado según el procedimiento de cuantificación según la reivindicación 16, y,- comparación del resultado con un valor de referencia.
- 18. Uso del procedimiento según la reivindicación 17 para apreciar la eficacia de un tratamiento antileucémico.
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