CN109852686A - 一种外泌体miRNA的内参集及多内参联合标准定量法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种外泌体miRNA标准化的多内参联合定量的方法及其用途，具体包括以下步骤：(1)高通量miRNA测序数据的标准化处理；(2)利用变异系数和标准差筛选内参miRNAs；(3)数字PCR的测序引物设计；(4)miRNA的数字PCR检测；(5)多内参联合标准的R_score值计算。通过对大量取自健康的体检样本和不同程度疾病患者的样本进行研究，发现miR‑128‑3p,miR‑129‑5p,miR‑320a和Let‑7i‑5p或其组合能够作为血浆外泌体microRNA标准化的内参，具有极高的稳定性和准确度。本发明基于数字PCR方法，为生物体内外泌体miRNA的研究提供了一种有效且便捷的定量标准化检测，弥补目前外泌体中没有标准内参U6 snRNA的缺陷，对于全面深入外泌体microRNA的生物标志物筛选具有的重要意义。

Description

一种外泌体miRNA的内参集及多内参联合标准定量法

技术领域

本发明涉及生物信息技术、生物检测技术和分子生物学领域，具体涉及一种外泌体 miRNA的内参集及多内参联合标准定量法。

背景技术

二代测序技术的核心思想是边合成边测序，在生物学研究中有着广泛的应用，以能够一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。目前的small RNA测序就是基于二代测序手段对所建库的所有small RNA进行测序的手段，包含的small RNA主要有：miRNA，ncRNA，siRNA，snoRNA，piRNA等。建库之后，利用胶回收或者磁珠回收方式进行产物片段大小筛选，可以进一步将测序目标集中在miRNA数据上。利用二代测序工具进行质检、比对、提取可以对miRNA进行差异表达分析，获取所有样本的完整miRNA表达谱。该处理结果可以为后期的内参miRNA筛选提供数据依据。

外泌体(exosome)是一种特殊大小的由活细胞分泌的多泡体(multivesicularbody,MVB)，目前比较公认的说法是30-100nm的一种纳米级脂质双分子囊泡。其内部含有多种活性分子，如DNA、RNA和蛋白质等，在细胞信息交流、免疫应答和物质交换等多种生理反应中起着重要的作用。由于稳定的物理性质，相对完善的数据库支持和研究方法等原因，其中外泌体 microRNA颇受关注。通过近年来的研究证实，外泌体microRNA与疾病有着非常紧密的关系，如参与免疫疾病、病毒感染、神经退行性疾病传播、癌症发生和转移等。

目前的miRNA定量验证，分为两种，一种是加尾反转录法，一种是茎环反转录法。加尾反转录法是利用poly(A)聚合酶为成熟的miRNA加上poly(A)尾巴，然后用锚定引物进行反转录，最后使用与通过标签序列互补的反向引物对miRNA表达进行荧光定量PCR检测。茎环反转录法利用可以折叠成茎环结构的引物，通过与miRNA的3’端碱基互补进行反转录，生成cDNA第一链，进行荧光定量PCR检测。

数字PCR是一种绝对定量核酸分子的技术。当前核酸分子的定量有三种方法，紫外分光光度法基于核酸分子的吸光度来定量；实时荧光定量PCR(Real Time PCR)基于Ct值，Ct 值就是指可以检测到荧光值对应的循环数；数字PCR是最新的定量技术，基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量，是一种绝对定量的方法。相较于qPCR，数字PCR可让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。

数字PCR主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。它可对少量mRNA和miRNA的细微变化进行准确及重复性极佳的检测。

发明内容

本发明旨在提供一种外泌体内miRNA定量标准化的方法。本发明鉴于现有的外泌体内未发现标准内参U6snRNA的缺陷，所提供的方法不仅可以满足外泌体miRNA的定量标准化要求，更具有很好的重复性和普遍性。

本发明提供如下技术方案：一种微小核糖核酸(microRNA)或其对应的核酸序列或互补序列的用途，其中所述的microRNA选自下组：miR-128-3p,miR-129-5p,miR-320a和Let-7i-5p，或其组合，它们用作血浆外泌体microRNAs标准化的内参。

一种用于microRNA标准化的内参集，所述内参集包括选自下组2种、3种或4种microRNA所构成的组合：miR-128-3p,miR-129-5p,miR-320a和Let-7i-5p。miR-128-3p,miR-129-5p,miR-320a和Let-7i-5p的序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示。

进一步地，所述的内参集由miR-128-3p,miR-129-5p,miR-320a和Let-7i-5p这四种 microRNAs构成，或所述的内参集至少包含上述四种microRNAs。

一种外泌体miRNA的多内参联合标准定量法，包括以下步骤：

将内参集中的n个内参基因和目的基因分别进行dd-PCR反应，然后通过以下公式获得该目的基因的表达值：

其中，R_score表示目的基因miRNA表达值与内参miRNAs表达值之和的比值；ddexp_test 基因miRNA表达值；ddexp_con表示内参miRNAs表达值。

本发明提供的外泌体miRNA标准化方法采用高通量测序技术和分子实验技术结合的方法，考虑了外泌体中没有标准内参U6snRNA的情况，通过多内参联合标准化，具有高特异性，高分辨率的特性，并且实现了外泌体内miRNA的定量检测。本发明对于外泌体miRNA的定量检测，差异化分析具有重要意义。

附图说明

图1为本发明一种外泌体miRNA的多内参联合标准定量法的二代测序挑选内参miRNAs 示意图：A-D分别为4个control miRNAs，灰白的线为其±95％CI并附上相应的值；

图2为本发明一种外泌体miRNA的多内参联合标准定量法的数字PCR结果示意图，改图检测的阳性拷贝为163copies/μl。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。本发明鉴用中国生工的miRNA第一链cDNA合成试剂盒(加尾法) 和美国伯乐公司的数字PCR试剂和仪器为例来进行操作演示，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

图1为miR-128-3p,miR-129-5p,miR-320a和Let-7i-5p二代测序结果图：从图中可以看出这4个miRNAs的表达在不同个体中，即使在正常人和癌症患者之间，表达都是相对高而稳定的，exp大于8，标准偏差小于5％，符合内参变量的特征。下面以四个内参组成的内参集为例对联合检测方法进行说明。

一种外泌体miRNA的多内参联合标准定量法方法，具体实施步骤如下：

(1)高通量miRNA测序数据的标准化处理

我们将得到的miRNAs数据比对到hg19的人类基因组上，然后利用miRbase下载的miRNA名称和序列，并对二代测序数据进行处理，利用全局比对法对其进行标准化，每个miRNA得到其对应的log2(RPM+1)值作为其表达值exp，具体的计算miRNA_i的方法如下：

RC_i表示miRNA_i的测序读段数(Read Counts)；n表示从miRbase中下载的总miRNAs 个数；RPM表示每一百万的比对数据中的读段数(Read counts per millionmapped reads)。

(2)利用变异系数和标准差进行内参miRNAs筛选

选择4个变异系数CV小于5％，标准偏差小于5％，且exp大于8的miRNA；如果满足条件的miRNA多于4个，就随机选择；如果满足条件的miRNA小于4个，则酌情放宽条件。内参miRNAs选择过程中，还可以借鉴其miRNA序列和测序结果中其isoform的情况，选择 miRNA序列比较单一且GC较平衡，来源于基因组一个位置的为最佳，isoform种类尽量少则最佳。

(3)数字PCR的测序引物设计

miRNA加尾法引物设计原则：引物长度为20-25bp，Tm值在60℃左右，GC含量为40％～60％。通常情况下，上游引物的序列与miRNA一致，只需将U替换成T，为平衡GC 含量和Tm值在引物的5’端添加或删减适当的碱基，一般不改变3‘端的序列。原则上上游引物序列与miRNA序列越一致，扩增效率很好。

miRNA茎环法引物设计原则：以经典茎环

(GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC)和hsa-miR-21-5p(UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA)为例。将hsa-miR-21-5p序列中的U改为T，最后6 位为(TGTTGA)，它的反向互补序列为(TCAACA)，将其加在经典茎环之后，形成特异 RT引物：5’GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAACA-3’。

该经典茎环的常用R端引为

CAGTGCAGGGTCCGAGGTATCGCAGGGTCCGAGGTATTC；然后上游引物为除去加到茎环上的序列之外的miRNA序列(TAGCTTATCAGACTGA),为平衡GC含量和Tm值在引物的5’端添加或删减适当的碱基，一般不改变3‘端的序列。

该说明书就以miRNA的加尾法为例，说明该方法的逆转录相关步骤：根据不同miRNA 序列设计特异性F端引物，配合选用的逆转录试剂盒使用R端引物；miRNA的茎环法验证时以试剂盒搭配的茎环结构链接miRNA最后6位碱基的反响互补序列为逆转录引物，以除去该6位碱基的碱基序列为F端引物，配合试剂盒的R端引物进行后续使用。

miRNA逆转录：

按照下表1的配比准备逆转录体系：

表1

miRNA逆转录混合液(2×)	10μl
		miRNA的逆转录酶混合液	2μl
microRNA	最大100ng
		无核酸酶去离子水	定容至20μl

37℃加热变性60分钟，然后85℃加热5分钟使酶失活，4℃保存。建议将100ng逆转录获得的cDNA反应液稀释50倍后使用，若放入miRNA不足100ng，酌情减少逆转录酶量和稀释倍数。

(4)miRNA的数字PCR检测

运用miRNA第一链cDNA合成试剂盒(加尾法)或miRNA第一链cDNA合成试剂盒(加尾法)来逆转录组织的miRNA。运用伯乐公司的数字PCR试剂进行数字PCR扩增，根据扩增完成后，阳性液滴与阴性液滴的比例，来计算其初始样本中miRNA的绝对表达值。数字 PCR的R端引物，建议配合逆转录试剂盒一起使用。

使用染料法配套的QX200^TM ddPCR^TM EvaGreen Supermix(美国伯乐)来测定血浆外泌体中miRNA的表达值。每个ddPCR反应液的体系为20μl，具体配比如表2：

表2

表1逆转录cDNA模版	1～8μl
		QX200 ddPCR EvaGreen Supermix(2x)	10μl
miRNA的F端引物(1μM)	1μl
		miRNA的R端引物(1μM)	1μl
无菌水	定容至20μl

由于混合液要移取到一次性液滴发生器管中，建议按1.1倍数配置混合液。将20μl混合液移取到一次性液滴发生器管中，每个样本的相应位置加入70μl液滴生成油，用QX200液滴生成器产生大约40μl的油包水液滴。将生成的40μl微滴移入96孔板中，用铝膜封好后，避光放置4℃保存。将混合液放入热循环仪中，进行如下反应：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，60℃退火加延伸1分钟，以上两步循环40次，然后4℃预冷5分钟，90℃使酶失活10分钟，最后设置在4℃保存以加强染料的稳定性。所有以上步骤的升降温速度保持在2℃/s，较慢升降温速度是为了保证油包水液滴升降温的一致性。

内参基因和目标基因miRNA绝对表达值读数，参照伯乐Q200的数字PCR仪配套的软件进行读数，原则上按照机器设定的阴性和阳性液滴分界读取表达值，特殊未给出阈值的情况下，按照相同引物空白对照样本的阴性液滴的阈值设定。

如图2所示，从图中可以看出该miRNA的ddPCR的绝对定量表达值为163copies/μl，依据图示，每个样本的每个miRNA(包括内参miRNAs和验证miRNAs)都有一个绝对定量的表达值，用于步骤5中R_score的计算；

(5)多内参联合标准的R_score值计算：按照步骤(4)根据4个control miRNAs和验证miRNA的绝对表达值，计算相应的R_score值。

采用高通量二代测序分析中，R_score的具体算法如下：

其中，R_score表示每个验证样本的miRNA表达值与内参miRNAs表达值之和的比值；ddexp_test表示每个验证样本的ddPCR上的绝对表达值；ddexp_con表示每个验证样本的4 个内参的ddPCR上的绝对表达值。

计算结果如下表所示：

样本	miR-con-sum	miR-test-1	miR-test-2	miR-test-1-R_score	miR-test-2-R_score
						A	375	20	35	0.053	0.093
B	358	25	20	0.07	0.056

由上可知，本发明提供的miRNA标准化方法模拟全局保准化方法矫正外泌体内miRNA 的表达，弥补了外泌体内没有U6snRNA的缺点，具有极强的创新性和实用性，为外泌体研究提供科学方法和实用手段。

序列表

<110> 浙江大学医学院附属妇产科医院

<120> 一种外泌体miRNA的内参集及多内参联合标准定量法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

ucacagugaa ccggucucuu u 21

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

cuuuuugcgg ucugggcuug c 21

<210> 3

<211> 22

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

aaaagcuggg uugagagggc ga 22

<210> 4

<211> 22

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

ugagguagua guuugugcug uu 22

Claims (4)

1.一种微小核糖核酸(microRNA)或其对应的核酸序列或互补序列的用途，其中所述的microRNA选自下组：miR-128-3p,miR-129-5p,miR-320a和Let-7i-5p，或其组合，其特征在于，它们用作血浆外泌体microRNAs标准化的内参。

2.一种用于microRNA标准化的内参集，其特征在于，所述内参集包括选自下组2种、3种或4种microRNA所构成的组合：miR-128-3p,miR-129-5p,miR-320a和Let-7i-5p。

3.如权利要求2所述的内参集，其特征在于，所述的内参集由miR-128-3p,miR-129-5p,miR-320a和Let-7i-5p这四种microRNAs构成，或所述的内参集至少包含上述四种microRNAs。

4.一种外泌体miRNA的多内参联合标准定量法，其特征在于，包括以下步骤：

将内参集中的n个内参基因和目的基因分别进行dd-PCR反应，然后通过以下公式获得该目的基因的表达值：

其中，R_score表示目的基因miRNA表达值与内参miRNAs表达值之和的比值；ddexp_test基因miRNA表达值；ddexp_con表示内参miRNAs表达值。