DE69835299T2

DE69835299T2 - Transkriptionsbasierende vervielfältigung von dopplesträngigen dns-zielmolekülen

Info

Publication number: DE69835299T2
Application number: DE69835299T
Authority: DE
Inventors: Bob Van Gemen; Dianne Arnoldina Margaretha Wilhelmi Van Strijp; Fredericke Adriana SCHUKKINK
Original assignee: Biomerieux BV
Current assignee: Biomerieux BV
Priority date: 1997-11-17
Filing date: 1998-11-11
Publication date: 2007-08-09
Anticipated expiration: 2018-11-12
Also published as: EP1032710B1; AU755395B2; EP1032710A1; CA2309625A1; DE69835299D1; ZA989950B; JP5009460B2; ES2268809T3; JP2001523469A; WO1999025868A1; ATE333516T1; AU1754799A; US6312928B1; CA2309625C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein transkriptionsbasiertes Vervielfältigungsverfahren für die Vervielfältigung von DNS-Zielmolekülen.
Nukleinsäureverstärkungsverfahren werden im Gebiet der Molekularbiologie und rekombinanter DNS-Technologie eingesetzt. Diese Verfahren werden eingesetzt, um die Anzahl der Kopien einer speziellen Nukleinsäuresequenz zu erhöhen, welche in kleinen Mengen auftritt und häufig in einer Umgebung, in der eine weitere Vielzahl von anderen Nukleinsäuresequenzen vorhanden sind, sowohl RNS als auch DNS. Insbesondere werden Nukleinsäureverstärkungsverfahren eingesetzt, um die Erfassung oder Quantifizierung von Nukleinsäuren zu vereinfachen und sind daher wesentlich bei der Diagnose, beispielsweise von Infektionskrankheiten, Erbkrankheiten und verschiedenen Arten von Krebs. Nukleinsäureverstärkungsverfahren haben auch ihre Anwendung in anderen Gebieten gefunden, wo Proben untersucht werden, bei denen Nukleinsäure in minimalen Mengen vorhanden sein kann, wie in der Forensik, der Archäologie oder um Vaterschaften nachzuweisen.
Verschiedene Nukleinsäureverstärkungstechniken sind bekannt, die auf verschiedenen Wirkungsmechanismen basieren. Ein Verfahren für die Verstärkung von Nukleinsäure ist als Polymerasekettenreaktion (PCR) bekannt und in den europäischen Patentanmeldungen EP 0 200 362 und EP 0 201 148 beschrieben. Die PCR ist ein zyklischer Prozess, der ein doppelsträngiges DNS-Molekül als Zielmolekül hat. Jeder Zyklus in dem PCR-Prozess beginnt mit der Trennung eines doppelsträngigen DNS-Targetmoleküls in zwei komplementäre Stränge. Zu jedem Strang wird ein Primer angefügt und DNS-Polymerasen, die vorhanden sind, werden diesen Primer entlang dem DNS-Strang weiter erstrecken, an dem dieser angefügt ist, und so werden zwei neue DNS-Duplexe erzeugt. Wenn die Reaktionsmischung aufgeheizt wird, werden sich die Stränge der DNS-Duplexe wieder trennen und ein neuer PCR-Zyklus kann beginnen. Daher erzeugt der PCR-Prozess vielfache DNS-Kopien eines DNS-Zielmoleküls. Falls einzelsträngige RNS das gewünschte Ziel für die PCR ist, hat sie in doppelsträngie DNS durch reverse Transkriptase gewandelt zu werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine andere Klasse von Nukleinsäureverstärkungsverfahren, insbesondere die „transkriptionsbasierten Verstärkungstechniken". Diese Techniken umfassen die Transkription von multiplen RNS-Kopien aus einem Template umfassend einen Promoter, der durch eine RNS-Polymerase erkannt wird. Bei diesen Verfahren werden multiple RNS-Kopien von einem DNS-Template transkribiert, welches eines funktionalen Promoter umfasst, der durch die RNS-Polymerase erkannt wird. Die besagten Kopien werden wieder als ein Ziel eingesetzt, von dem eine neue Menge an DNS-Template erhalten werden kann usw.. Solche Verfahren sind durch Gingeras et al. in WO 88/10315 und Burg et al. in WO 89/1050 beschrieben. Die isothermen transkriptionsbasierten Verstärkungstechniken sind durch Davey et al. in EP 0 323 828 (sich auf ein NASBA-Verfahren beziehend), durch Gingeras et al. in EP 0 373 960 und durch Kacian et al. in EP 0 408 294 beschrieben. Transkriptionsbasierte Verstärkungsreaktionen können auch mit thermostabilen Enzymen durchgeführt werden. Transkriptionsbasierte Verstärkungen werden üblicherweise bei einer Temperatur von ungefähr 41°C ausgeführt. Diese thermostabilen Enzyme gestatten es, dass die Reaktion bei erhöhten Temperaturen ausgeführt wird. Solch ein thermostabiles Verfahren ist in der EP 0 682 121 im Namen der Toyo Boseki KK beschrieben.
Die Verfahren, wie sie in EP 0 323 822 , EP 0 373 960 und EP 0 408 295 beschrieben worden sind, sind isothermale kontinuierliche Verfahren. Mit diesen Verfahren sind vier Enzymaktivitäten erforderlich, um die Verstärkung zu erreichen: eine RNS-abhängige DNS-Polymeraseaktivität, eine DNS-abhängige DNS-Aktivität, eine RNase-(H)-Aktivität und eine RNS-Polymeraseaktivität. Einige dieser Aktivitäten können in einem einzigen Enzym kombiniert werden, so dass üblicherweise nur zwei bis drei Enzyme notwendig sind. Enzyme, die RNS-abhängige DNS-Polymeraseaktivitäten haben, sind Enzyme, die DNS aus einem RNS-Template synthetisieren. Eine DNS-abhängige DNS-Polymerase synthetisiert daher DNS aus einem DNS-Template. Bei den transkriptionsbasierten Verstärkungsreaktionen kann eine reverse Transkriptase wie AMV (für Avian Myoblastosis Virus) oder MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse Transkriptase eingesetzt werden. Solche Enzyme haben sowohl RNS- als auch DNS-abhängige DNS-Polymeraseaktivität aber auch eine inhärente RNase-Aktivität. Zusätzlich kann eine RNase zu der Reaktionsmischung einer transkriptionsbasierten Verstärkungsreaktion hinzugefügt werden, wie E.coli RNase H.
DNS-abhängige RNS-Polymerasen synthetisieren vielfache RNS-Kopien aus einem DNS-Template umfassend einen Promoter, der durch die RNS-Polymerase erkannt wird. Beispiele von RNS-Polymerasen sind Polymerasen aus E.coli und Bacteriophagen T7, T3 und SP6. Ein Beispiel einer RNS-Polymerase, die üblicherweise mit transkriptionsbasierten Verstärkungsverfahren eingesetzt wird, ist T7 Polymerase. Daher würde der Promoter, der in dem Template eingebaut ist, welches für das Transkribieren von Vielfachkopien von RNS eingesetzt wird, dann der T7-Promoter sein. Üblicherweise ist das Template, welches den Promoter umfasst, von der Nukleinsäure beginnend zu erzeugen, welches die Zielsequenz umfasst. Die besagte Nukleinsäure kann in dem Ausgangsmaterial vorhanden sein, welches als Eingang für die Verstärkungsreaktion eingesetzt wird. Die Nukleinsäure, die in dem Ausgangsmaterial vorhanden ist, wird üblicherweise die Zielsequenz als Teil einer viel längeren Sequenz umfassen. Zusätzliche Nukleinsäuresequenzen können sowohl auf dem 3'- und dem 5'-Ende der Zielsequenz vorhanden sein. Die Verstärkungsreaktion kann begonnen werden durch das Zusammenbringen dieser Nukleinsäure aus dem Ausgangsmaterial, wobei die geeigneten Enzyme zusammen die oben genannten Aktivitäten liefern und mindestens ein aber üblicherweise zwei Oligonukleotid(e). Mindestens eines dieser Oligonukleotide sollte die Sequenz des Promoters umfassen.
Die transkriptionsbasierten Verstärkungsverfahren sind insbesondere nützlich, falls das Eingangsmaterial ein einfach-strängiges RNS ist, obwohl einfach oder doppel-strängiges DNS gleichfalls als Eingangsmaterial eingesetzt werden kann. Wenn ein transkriptionsbasiertes Verstärkungsverfahren auf einer Probe ausgeübt wird, welche einzel-strängige RNS (des "Plus-Sinnes") mit zusätzlichen Sequenzen auf sowohl dem 3'-Ende als auch dem 5'-Ende der Zielsequenz umfasst, wird ein Paar von Oligonukleotiden, welche üblicherweise mit den Verfahren wie im Stand der Technik beschrieben eingesetzt wird, bestehen aus:

– einem ersten Oligonukleotid (üblicherweise bezeichnet als ein "Promoter-Oligonukleotid"), welches fähig ist, das 3'-Ende der Zielsequenz zu hybridisieren, welches Oligonukleotid die Sequenz eines Promoters hat (vorzugsweise des T7-Promoters) befestigt an seinem 5'-Ende (der hybrisierende Teil des besagten Oligonukleotids hat die entgegengesetzte Polarität wie das plus RNS-Material, welches als Eingangsmaterial verwendet worden ist).
– Ein zweites Oligonukleotid ("Primer"), welches das 3'-Ende der Zielsequenz umfasst (dieses Oligonukleotid hat dieselbe Polarität wie die Plus-RNS).

Wenn solch ein Paar von Oligonukleotiden, zusammen mit allen Enzymen, die die geeigneten Aktivitäten haben, und eine ausreichende Versorgung der notwendigen Ribonukleotide und Deoxy-Ribonukleotide zusammen in einer Reaktionsmischung gegeben werden und unter geeigneten Bedingungen gehalten werden (d.h. unter geeigneten Puffer-Bedinungen und bei der geeigneten Temperatur) für eine ausreichende Zeitdauer, wird eine isothermale kontinuierliche Verstärkungsreaktion beginnen. Die 1 zeigt einen vorgeschlagenen Mechanismus für einen Teil einer transkriptionsbasierten Verstärkungsreaktion nach dem Stand der Technik. Der isothermale kontinuierliche Prozess der Verstärkung wird in 1 als zyklischer Prozess dargestellt. Es ist jedoch klar, dass alle Schritte dieses Prozesses zur selben Zeit stattfinden werden, da alle Inhaltsstoffe in dem Reaktionsgefäss vorhanden sind. Daher kann das Bild des Prozesses als eine bestimmte Sequenz von Ereignissen gut für ein besseres Verstehen eines möglichen Mechanismus sein, welcher dem Verstärkungsprozess unterliegt, es kann aber nicht ein reales Abbild von dem sein, was tatsächlich in der Reaktionsmischung während der Verstärkung passiert. Der in der 1 dargestellte Kreis kann betrachtet werden, dass er mit einer ersten Menge von einzelsträngiger RNS beginnt. Die RNS, die in dem Kreis dargestellt ist, ist die RNS des Minus-Sinnes. Daher wird sie fähig sein, mit dem Oligonukleotid des Paares von oben erwähnten Oligonukleotiden zu hybridisieren. Diese Minus-RNS wird normalerweise nicht als solche in dem Ausgangsmaterial für die Verstärkungsreaktion vorhanden sein, wird aber beispielsweise von der Plus-RNS abgeleitet werden, die in dem Ausgangsmaterial vorhanden ist, durch eine Reaktion mit den Oligonukleotiden und Enzymen, wenn alle Inhaltsstoffe der Reaktionsmischung zusammengebracht worden sind.
Viele Abarten der obigen Präsentation sind im Stand der Technik beschrieben worden. Von dem in 1 dargestellten Reaktionsbild kann gesehen werden, dass das zweite Oligonukleotid (wie oben beschrieben) als ein Primer dient, um die Synthese eines Stranges von DNS komplementär zur Minus-RNS zu primen. Das Oligonukleotid umfasst die Promoter-Sequenz, die fähig ist, sich an das 3'-Ende des Erweiterungsproduktes des zweiten Oligonukleotids anzuhaften. Der Promoter-Teil dieses Oligonukleotids dient als ein Template für die Verlängerung des Erweiterungsproduktes des zweiten Oligonukleotids, um einen doppelsträngigen Promoter zu erzeugen. Das 3'-Ende des Promoter-Oligonukleotids kann durch das Enzym erweitert werden, welches DNS-abhängige DNS-Polymeraseaktivität (reverse Transkriptase) aufweist, aber dies ist nicht notwendig. Um die Funktion als ein Template eines Oligonukleotids zu reflektieren, wird das Enthalten einer Promotersequenz als ein "splice-template" in verschiedenen Dokumenten des Standes der Technik bezeichnet, welche sich auf die transkriptionsbasierte Verstärkung beziehen (beispielsweise in der EP 0 408 295 von Genprobe Inc.). Das 3'-Ende von solch einem "splice template" kann sogar blockiert sein. In diesem Fall ist die Fähigkeit des "splice templates" dahingehend, als ein Primer zu dienen, vollständig eliminiert.
1 gibt einen Vorschlag für ein Schema für eine transkriptionsbasierte Verstärkung wider. Dieses Schema umfasst die Synthese eines einzelsträngigen RNS-Transkripts. Wie oben erwähnt, kann das Ausgangsmaterial, welches die zu verstärkende Nukleinsäure enthält, nicht die Nukleinsäure in dieser bestimmten Form enthalten. Es wird nicht Minus-RNS einer definierten Länge enthalten. Dies ist der Grund, warum der vorgeschlagene Kreis der Ereignisse, wie er in der 1 dargestellt ist, wahrscheinlich vorangegangen wird von einer Abfolge von Ereignissen, die von der Nukleinsäure in dem Ausgangsmaterial zu dem ersten RNS-Transkriptionsschritt führt. Wie oben erwähnt, sind transkriptionsbasierte Verstärkungsverfahren insbesondere nützlich für die Verstärkung, ausgehend von einer einzelsträngigen RNS. Eines der Oligonukleotide, dasjenige mit der Promoter-Sequenz, wird dann wahrscheinlich an der einzelsträngigen RNS andocken und durch das Enzym mit RNS-abhängiger RNS-Polymerase verlängert werden (wie reverse Transkriptase). Ein DNS-RNS-Duplex wird so erhalten, wobei der RNS-Strang davon durch die RNase H aufgeschlossen werden kann. Das andere Oligonukleotid wird sich an den verbleibenden DNS-Strang anhaften und verlängert werden, unter Einsatz dieses Strangs als ein Template. Somit kann ein doppelsträngiges DNS-Template, umfassend einen funktionalen doppelsträngigen Promoter für die RNS-Polymerase erzeugt werden, von dem der erste Transkriptionsschritt stattfinden kann. Die so erhaltenen Transkripte können die vorgeschlagenen Reaktionsschemata eingehen, wie sie in der 1 dargestellt sind. In der Praxis wird die vollständige Abfolge von Ereignissen, ausgehend von der einzelsträngigen RNS in der Probe, stattfinden, sobald alle Inhaltsstoffe zusammengetan werden und die Mischung auf eine geeignete Temperatur gebracht worden ist, so dass alle Enzyme aktiv sind. Der Ausführende dieses Verfahrens muss nicht tätig werden, um jegliche dieser Schritte durchzuführen. Wenn jedoch ein transkriptionsbasiertes Verstärkungsverfahren mit Ausgangsmaterial durchzuführen wäre, welches die Zielsequenz nur als doppelsträngige DNS umfassen würde, entweder kreisförmig oder linear, würde der Fachmann es nicht erwarten, fähig zu sein, irgend etwas zu verstärken, ohne zuerst ein Verfahren durchführen zu müssen, beispielsweise ein chemisches Denaturierungsverfahren, wie es in der DE 42 38 699 beschrieben worden ist, um einzelsträngige Nukleinsäure aus der doppelsträngigen DNS zu erhalten, welche zuerst in dem Ausgangsmaterial vorhanden ist. Er würde nicht erwarten, dass jegliche dieser Oligonukleotide fähig wären, an die DNS anzuhaften, da diese in einer doppelsträngigen Ausgestaltung vorliegen würde. Ausgehend von diesem Wissen des Fachmanns wäre das Logischste durchzuführende Vorgehen, in Bezug auf transkriptionsbasierte Verstärkungsverfahren, die Stränge der doppelsträngigen DNS durch Anwenden einer erhöhten Temperatur (bis rauf auf 100°C) zu trennen, um die DNS zu trennen und eines der Oligonukleotide an einen der anderen Stränge anzuhaften. Die Enzyme, die mit bestehenden transkriptionsbasierten Verstärkungsverfahren eingesetzt werden, wären nicht fähig, solch einer hohen Temperatur zu widerstehen und können in solch einem Fall nur hinzugefügt werden, nachdem die DNS-Stränge getrennt worden sind. Wenn eines der Oligonukleotide an einer einzelsträngigen DNS anhaftet und sie verlängert, wird wiederum doppelsträngige DNS erzeugt und die Reaktionsmischung würde wieder einer erhöhten Temperatur unterworfen werden müssen, um die doppelsträngige DNS in einzelne Stränge wiederum aufzuschmelzen. Wiederum wird das Erhöhen der Temperatur die vorhandenen Enzyme zerstören und neue Enzyme sind beizufügen, nachdem der Erhitzungsschritt angewandt worden ist. Das zweite Oligonukleotid kann nun hinzugefügt werden und sich an den Strang anhaften, der aus dem verlängerten (Promoter) Oligonukleotid in dem ersten Schritt erzeugt worden ist, wobei doppelsträngige DNS-Templates erzeugt werden, die einen doppelsträngigen funktionalen Promoter umfassen, von dem ein erster Schritt der RNS-Transkription stattfinden kann. Die resultierenden RNS-Transkripts können entweder in einen Kreis wie in der 1 eintreten und der Prozess kann isothermal durchgeführt werden.
Von dem oben Stehenden her ist es klar, dass Beginnen eines transkriptionsbasierten Verstärkungsverfahren aus doppelsträngiger DNS ein langwieriger schwerer Prozess sein kann. Es erfordert verschiedene spezifische Aktionen, die von dem Benutzer durchgeführt werden müssen; die Probe ist aufzuheizen und abzukühlen, und dies wiederholt und Enzyme sind nach jedem Wärmebehandlungsschritt wieder aufzufüllen.
Alternativ kann die doppelsträngige DNS des Ausgangsmaterials in RNS vor dem Beginn der Verstärkung transkribiert werden. Solch ein Extraschritt kann auf einem Enzym basieren, beispielsweise E.coli RNS-Polymerase, welche die doppelsträngige DNS in RNS ohne Vorhandensein einer Promoter-Sequenz transkribiert, auch bezeichnet als ein Polymerase-Bindungsort. Solch ein Prozess der Extraschritte, um die Verstärkung der doppelsträngigen DNS durch verstärkungsbasierte Verstärkungsverfahren zu vereinfachen, ist in der PCT-Patentanmeldung WO 96/02668 beschrieben worden. Die in diesem Verfahren beschriebenen Extraschritte umfassen nicht die zusätzlichen Behandlungsschritte, sondern auch den Einsatz von zusätzlichen Inhaltsstoffen, d.h. E.coli RNS-Polymerase.
Es ist nun gefunden worden, dass in Fällen, wo die Probe doppelsträngige DNS umfasst, ein transkriptionsbasiertes Verstärkungsverfahren angewandt werden kann, welches im Wesentlichen isothermal ist und in grossen Mengen von RNS-Transkripts resultiert, die die Sequenz der DNS umfassen.
Mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann ein isothermales transkriptionsbasiertes Verstärkungsverfahren vorgeschlagen werden für die Verstärkung von doppelsträngiger DNS. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung für die Verstärkung von doppelsträngiger DNS umfasst die Schritte des Kontaktierens der besagten doppelsträngigen DNS mit

– mindestens einem Oligonukleotid umfassend eine Sequenz, die zu einem Teil des ersten, der in der doppelsträngigen DNS enthaltenen zwei DNS Stränge komplementär ist, wobei das besagte Oligonukleotid ferner die Sequenz eines Promotors umfasst, die von einer RNS Polymerase erkannt wird;
– einem weiteren Oligonukleotid umfassend eine Sequenz, die zu einem Teil des zweiten, in der doppelsträngigen DNS enthaltenen Stranges komplementär ist;
– einem Enzym mit RNS-abhängiger DNS Polymerase Aktivität;
– einem Enzym mit DNS-abhängiger DNS Polymerase Aktivität;
– einem Enzym mit RNase H Aktivität;
– einem Enzym mit RNS Polymerase Aktivität;

Das Verfahren gemäss der Erfindung ist insbesondere nützlich für die Verstärkung von kleinen DNS-Molekülen, beispielsweise Plasmid-DNS.
Das Verfahren ist insbesondere nützlich für die Erfassung von kleinen DNS-Molekülen von pathogenen Microorganismen, was eine Diagnose ermöglicht. Insbesondere können die ringförmigen HIV-1 DNS-Moleküle durch dieses Verfahren entdeckt werden, die während der Replikation des HIV-1-Virus ausgebildet werden. Die Feststellung von solchen ringförmigen HIV-1-DNS-Molekülen weisen auf die aktive Replikation des Virus hin, was mit dem Fortschritt der Krankheit korreliert werden kann, d.h. mit der Entwicklung von AIDS. Bei einer anderen Anwendung kann das Verfahren eingesetzt werden für die Erfassung von Plasmid-DNS-Molekülen, die natürlich in Chlamydien-Arten vorhanden sind. Die Chlamydien- Plasmide können gewisse Virulenzfaktoren kodieren, was bedeutet, dass die Erfassung der Plasmide nicht nur das Vorhandensein einer Chlamydien-Infektion aufzeigt, sondern auch zeigt, dass die Chlamydien-Zellen, die die Infektion bewirken, gewisse Virulenzfaktoren mit sich tragen.
In noch anderen Anwendungen kann das Verfahren eingesetzt werden für die Verstärkung von genomischen Sequenzen nach teilweiser Degradation und Isolation der DNS. Dies hat einen grossen Bereich von Anwendungen, von denen viele mit der Erfassung und Identifikation von Mutationen genomischer DNS verbunden werden können. Diese Mutation kann mit der Diagnose von Krebs, Erbkrankheiten und Veranlagung für Krankheiten zugeordnet werden.
Überraschend kann transkriptionsbasierte Verstärkung von doppelsträngiger DNS aus starten, ohne die Notwendigkeit, die DNS mit Restriktionsenzymen zu behandeln, oder was wichtiger ist, die Stränge vorher durch Anwenden von Hitze zutrennen. Alle Inhaltsstoffe, die üblicherweise bei isothermaler transkriptionsbasierter Verstärkungsreaktion benutzt werden, können hier als Ausgangsmaterial eingesetzt werden, umfassend doppelsträngige DNS, wie als ob es einzelsträngige RNS wären.
Die mit dem Verfahren gemäss der Erfindung benutzten Enzyme können jegliche Enzyme sein, die im Stand der Technik als geeignete Enzyme für die transkriptionsbasierten Verstärkungsverfahren bekannt sind, und die Reaktionsbedingungen sind im Wesentlichen die gleichen wie für transkriptionsbasierte Verstärkungsverfahren des Standes der Technik, die üblicherweise eingesetzt werden, um einzelsträngige RNS zu verstärken. Mit der vorliegenden Erfindung ist es nun gefunden worden, dass im Wesentlichen dieselben Protokolle für die isothermale transkriptionsbasierte Verstärkung von doppelsträngiger DNS eingesetzt werden können, selbst obwohl, basierend auf dem Wissen der Mechanismen gemäss denen die transkriptionsbasierten Verstärkungsreaktionen vermutungsgemäss ablaufen, der Fachmann nicht dieses Verfahren als durchführbar angesehen hätte.
Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird die DNS auf 65°C in Gegenwart von Verstärkungs-Oligonukleotiden aufgeheizt, aber nicht in Gegenwart von Verstärkungs-Enzymen. Die Enzyme werden nur zu der Reaktion hinzugefügt, nachdem die Reaktionsmischung auf die Inkubationstemperatur für die Verstärkungsreaktion abgekühlt ist, d.h. 41°C. Bei einem anderen Ausführungsbeispiel des Verfahrens der vorliegenden Erfindung kann die DNS auf 100°C aufgeheizt werden in Gegenwart von zwei Verstärkungs-Oligonukleotiden. Der Fachmann würde immer noch nicht annehmen, dass dieses Verfahren aufgrund der Tatsache arbeitet, dass nach der Oligonukleotid-Anhaftung und der Erweiterung der neu hergestellte DNS-Strang von dem ursprünglichen DNS-Template-Strang zu trennen ist, bevor das zweite Oligonukleotid anhaften und erweitert werden kann. Bei diesem zweiten bevorzugten Ausführungsbeispiel mit nur einem Wärmeschritt werden die Enzyme nur zu der Reaktionsmischung hinzugefügt, nachdem diese auf die Verstärkungs-Inkubationstemperatur von 41°C abgekühlt ist.
Vorzugsweise werden zwei Oligonukleotide in dem Verfahren gemäss der Erfindung eingesetzt;

– ein erstes Oligonukleotid (üblicherweise als "promoter-primer" bezeichnet), welches fähig ist, eine spezifische Sequenz im ersten Strang der doppelsträngigen DNS zu hybridisieren, welches Oligonukleotid die Sequenz eines Promoters (beispielsweise des T7 Promoters), welches an seinem 5'-Ende befestigt ist, hat und
– ein zweites Oligonukleotid ("primer"), welches eine Sequenz umfasst, die in ausreichender Weise komplementär zu einer spezifischen Sequenz des zweiten Stranges der doppelsträngigen DNS ist. Die Sequenzen der Oligonukleotide sollten in solch einer Weise gewählt werden, dass sie nicht einander hybridisieren können.

Es ist überraschend, dass durch Kontaktieren der doppelsträngigen DNS mit den zwei Oligonukleotiden und den geeigneten Enzymen ein transkriptionsbasierter Verstärkungsprozess durchgeführt werden kann, wo keine Notwendigkeit besteht, verschiedene Strangseparationsschritte durchzuführen, um die zwei Stränge zu trennen, welche die doppelsträngige DNS ausmachen. Das Verfahren wird in vielfachen linearen RNS-Kopien resultieren, die die Zielsequenz umfassen, welche Teil der Sequenz der doppelsträngigen DNS ist.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN:
1: Reaktionsschema für transkriptionsbasierte Verstärkungen.
BEISPIELE:
Einleitung
Die folgenden Beispiele zeigen die Mechanismen und die Nützlichkeit der vorliegenden Erfindung. Sie sind nicht begrenzend und sollten nicht als solches verstanden werden. Die in den folgenden Beispielen benutzten Enzyme sind die AMV reverse Transkriptase (AMV für avian myeloblastosis virus), die T7 RNS-Polymerase und die E.coli RNase H. Andere Enzyme mit ähnlichen Aktivitäten und Enzyme von anderen Quellen können auch eingesetzt werden. Andere RNS-Polymerasen mit unterschiedlichen Promoter-Spezifizitäten können auch für den Einsatz geeignet sein.
Die NASBA-Reaktionsbedingungen, die in den folgenden Beispielen eingesetzt werden, sind 40 mM Tris, pH-Wert 8.5, 42 mM KCl (oder in späteren Experimenten 70 mM KCl), 12 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 1 mM jeweils dNTP, 2 mM rATP, 2 mM rCTP, 2 mM rUTP, 1.5 mM rGTP, 0.5 mM ITP, 0.2 μM von jedem Oligonukleotid, 375 mM Sorbitol, 0.105 g/l BSA, 6.4 Einheiten AMV-RT, 32 Einheiten T7 RNS-Polymerase, 0.08 Einheiten E.coli RNase H und eine bestimmte Menge von Template in 20 μl Volumen. Die eingesetzten Oligonukleotid-Sequenzen sind beispielhaft und nicht als begrenzend über andere Sequenzen anzusehen, die für diese und andere Zielsequenzen eingesetzt werden können.
Beispiel 1
Um die Machbarkeit der DNS-Target-Verstärkung mit NASBA ohne Denaturierungsschritte mit hohen Temperaturen zu zeigen, sind die zwei folgenden Oligonukleotide in Kombination mit der oben beschriebenen NASBA-Reaktions-Inhaltsstoffen verbunden worden:
HIV-1 gag1 P1:
5' AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GTG CTA TGT CAC TTC CCC TTG-GTTCTC TCA 3'
HIV-1 gag1 P2:
5' AGT GGG GGG ACA TCA AGC AGC CAT GCA AA 3'
Der T7 Promoter-Teil des P1 ist in Kursivschrift angegeben. Dieser Primer zielt auf Teile des gag-Bereichs des HIV-1 Genoms für die Verstärkung. Als Eingang für die Verstärkungsplasmide ist DNS pUCp24 umfassend den gag-Bereich des HIV-1 Genoms in verschiedenen Eingangsmengen eingesetzt worden. Das Protokoll, welches eingesetzt worden ist, umfasste das Mischen der Zielplasmid DNS mit den Inhaltsstoffen, wie oben in der Einlei tung beschrieben, ausser für die Enzyme, Aufheizen auf 65°C, Abkühlen auf 41°C, Zusatz von Enzymen und Inkubation bei 41°C für 90 Minuten. Das verstärkte Material ist in einem Agarosegel der Elekrophorese unterworfen worden, auf ein Nylon-Filter geblotted worden und hybridisiert mit ³²P-markierter HIV-1 gag-Probe 5' GAA TGG GAT AGA GTG CAT CCA GTG CAT G 3'. Ein positives Ergebnis konnte mit einer Empfindlichkeit von 10⁵ Molekülen Eingang an Plasmid-DNS in der Verstärkung erhalten werden. Dieselben Ergebnisse konnten mit demselben Protokoll ohne die 65°C Inkubation erhalten werden.
Beispiel 2
Um die Machbarkeit der DNS-Target-Verstärkung mit NASBA ohne Denaturierungsschritte mit hohen Temperaturen zu zeigen, sind die zwei folgenden Oligonukleotide in Kombination mit den oben beschriebenen NRSBA-Reaktions-Inhaltsstoffen verbunden worden:
HPV16 P1:
5' AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GGA AAA ATA AAC TGT AAA TCA-TATTC 3'
HPV16 P2:
5' TTT GTT ACT GTG GTA GAT ACT AC 3'
Der T7 Promoter-Teil des P1 ist in Kursivschrift angegeben. Diese Primer zielen auf einen Teil des HPV16-Genoms für die Verstärkung. Als Eingang für die Verstärkung ist Plasmid DNS pHPV16, umfassend ein HPV16 Genom voller Länge, in verschiedenen Eingangsmengen eingesetzt worden. Das Protokoll, welches eingesetzt worden ist, bestand aus dem Mischen der Zielplasmid-DNS mit den oben in der Einleitung genannten Inhaltsstoffen, ausser den Enzymen, Aufheizen auf 65°C, Abkühlen auf 41°C, Hinzufügen von Enzymen und Inkubation bei 41°C über 90 Minuten. Das verstärkte Material ist in Agarosegel der Elektrophorese unterworfen worden, auf einem Nylonfilter geblottet worden und mit der ³²P-markierten HPV16 Probe 5' AGT ACA AAT ATG TCA TTA TGT GC 3' hybridisiert worden. Ein positives Ergebnis konnte mit einer Empfindlichkeit von 1 pg Eingang an Plasmid DNS in der Verstärkung gewonnen werden.
Beispiel 3
Um die Machbarkeit der DNS-Target-Verstärkung mit NASBA ohne Denaturierungsschritte mit hohen Temperaturen zu zeigen, sind die zwei folgenden Oligonukleotide in Kombination mit den oben beschriebenen NASBA-Reaktions-Inhaltsstoffen verbunden worden:
Chlamydia Trachomatis natürliches Plasmid P1:
5' AA T TCT AATACG ACT CAC TAT AGG GCA AGA GTA CAT CGG TCA ACG-A 3'
Chlamydia Trachomatis natürliches Plasmid P2:
5' TCA CAG CGG TTG CTC GAA GCA 3'
Der T7 Promoter-Teil des P1 ist in Kursivschrift angegeben. Diese Primer zielen auf Teil des Chlamydia Trachomatis natürlichen Plasmids für die Verstärkung. Als Eingangsmaterial für die Verstärkung sind Plasmidpräparationen aus Chlamydiatrachomatis in verschiedenen Eingangsmengen in Bezug auf die Menge an Chlamydia trachomatis ausbildenden Einheiten (IFU für Inclusion Forming Units) eingesetzt worden. Das Protokoll, welches eingesetzt worden ist, bestand aus dem Mischen der Zielplasmid-DNS mit den Inhaltsstoffen, wie oben in der Einleitung beschrieben worden ist, ausser den Enzymen, Aufheizen auf 65°C, Abkühlen auf 41°C, Hinzufügen von Enzymen und Inkubation bei 41°C über 90 Minuten. Das verstärkte Material ist in einem Agarosegel der Elektrophorese unterworfen worden, auf einen Nylonfilter geblottet und hybridisiert worden mit der ³²P-markierten Chlamydia trachomatis natürlichen Plasmid-Probe 5' CGT GCG GGG TTA TCT TAA AAG GGA T3'. Ein positives Ergebnis konnte mit einer Menge von Plasmid DNS in der Verstärkung entsprechend 0.01 IFU erhalten werden.
Beispiel 4
Um die Machbarkeit der DNS-Target-Verstärkung mit NASBA ohne Denaturierungsschritte mit hohen Temperaturen zu zeigen, sind die zwei folgenden Oligonukleotide in Kombination mit den oben beschriebenen NASBA-Reaktions-Inhaltsstoffen verbunden worden:
Gewebefaktor P1:
5' AAT TCT AATACG ACT CAC TAT AGG GAG GGA ATC ACT GCT TGA 3'
Gewebefaktor P2:
5' GAC CGT AGA AGA TGA ACG GA 3'
Der T7 Promoter-Teil des P1 ist in Kursivschrift angegeben. Diese Primer zielen auf ein Teil des menschlichen Gewebefaktorgens für die Verstärkung. Als Eingang für die Verstärkung ist Plasmid DNS pUC13-TF enthaltender Teil des Gewebefaktor-Gens in verschiedenen Eingangsmengen verwendet worden. Das Protokoll, welches eingesetzt worden ist, bestand aus dem Mischen der Zielplasmid-DNS mit den Inhaltsstoffen, die oben in der Einleitung beschrieben worden sind, mit Ausnahme der Enzyme, Aufheizen auf 65°C, Abkühlen auf 41°C, Hinzufügen der Enzyme und Inkubation bei 41°C für 90 Minuten. Das verstärkte Material ist in einem Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen worden, auf einem Nylon-Filter geblottet worden und mit der ³²P-markierten Gewebe faktor-Probe 5' GTT CAG GAA AGA AAA CAG CCA 3' hybridisiert worden. Ein positives Ergebnis konnte mit einer Empfindlichkeit von 10³ Molekülen als Eingang der Plasmid-DNS in der Verstärkung erhalten werden.
Beispiel 5
Um die Machbarkeit der DNS-Target-Verstärkung mit NASBA ohne Denaturierungsschritte mit hohen Temperaturen zu zeigen, sind die zwei folgenden Oligonukleotide in Kombination mit den oben beschriebenen NASBA-Reaktions-Inhaltsstoffen verbunden worden:
CD14 P1:
5' AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GGG ATC TCC ACC TCT ACT GCA 3'
CD14 P2:
5' GAA GCT AAA GCA CTT CCA 3'
Der T7 Promoter-Teil des P1 ist in Kursivschrift angegeben. Diese Primer zielen auf den Teil des menschlichen CD14-Gens für die Verstärkung. Als Eingabe für die Verstärkung ist Plasmid DNS pπH3M enthaltener Teil des CD14-Gens in verschiedenen Eingangsmengen eingesetzt worden. Das Protokoll, welches eingesetzt worden ist, bestand aus dem Mischen der Zielplasmid-DNS mit den Inhaltsstoffen, die in der obigen Einleitung beschrieben worden sind, ausser der Enzyme, Aufheizen auf 65°C, Abkühlen auf 41°C, Hinzufügen der Enzyme und Inkubation bei 41°C für 90 Minuten. Das verstärkte Material ist in einem Agarosegel der Elektrophorese unterzogen worden, auf einen Nylon-Filter geblottet worden, und mit der ³²P-markierten CD14 Probe 5' CCA TGG AGC GCG CGT CCT 3' hybridisiert worden. Ein positives Ergebnis konnte mit einer Empfindlichkeit von 10³ Molekülen an Eingangsmaterial der Plasmid-DNS in der Verstärkung erhalten werden.
Beispiel 6
Um die Machbarkeit der DNS-Target-Verstärkung mit NASBA ohne Denaturierungsschritte mit hohen Temperaturen zu zeigen, sind die zwei folgenden Oligonukleotide in Kombination mit den oben beschriebenen NASBA-Reaktions-Inhaltsstoffen verbunden worden:
Actin P1:
5' AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GGG A(AG)G GGC C(CG)G (AC)CT-CGTC(AG)T ACT 3'
Actin P2:
5' ATC AT(TC) GC(ATC) CC(GTC) CC(GAT) GAG CGCA 3'
Der T7 Promoter-Teil der P1 ist in Kursivschrift angegeben. Nukleotide zwischen den Klammern bezeichnen eine "degenerierte" Position, wo jegliche der Nukleotide zwischen den Klammern auftreten können. Diese Primer zielen auf den Teil des menschlichen Actin-Gens für die Verstärkung. Als Eingangsmaterial für die Verstärkung ist vollständig menschliche genomische DNS (kommerziell erhältlich menschliche plazentale DNS), behandelt mit RNase A, bei 400 ng Eingangsmaterial eingesetzt worden. Das Protokoll, welches eingesetzt worden ist, bestand aus dem Mischen der menschlichen plazentalen genomischen DNS mit den Inhaltsstoffen, die oben in der Einleitung beschrieben worden sind, mit Ausnahme der Enzyme, Aufheizen auf 65°C, Abkühlen auf 41°C, Hinzufügen der Enzyme und Inkubation bei 41°C für 90 Minuten. Das verstärkte Material ist in einem Agarosegel der Elektrophorese unterzogen worden, auf einen Nylon-Filter geblottet worden und mit der ³²P-markierten Actin Probe 5' CTG TCC ACC TTC CAG CAG ATG TGG A3' hybridisiert worden. Ein positives Ergebnis konnte gezeigt werden, wenn menschliche genomische DNS als Eingangsmaterial für die Verstärkung eingesetzt worden ist.
Beispiel 7
Um die Machbarkeit der DNS-Target-Verstärkung mit NASBA ohne Denaturierungsschritte mit hohen Temperaturen zu zeigen, sind die zwei folgenden Oligonukleotide in Kombination mit den oben beschriebenen NASBA-Reaktions-Inhaltsstoffen verbunden worden:
CMV-Exon4 P1:
5' AAT TCT AAT ACT CAC TAT AGG GAG ATC CTC AAT GCG CTT CA 3'
CMV-Exon4 P2:
5' GCT TGT ATG ATG ACC ATG TA 3'
Der T7 Promoter-Teil des P1 ist in Kursivschrift angegeben. Diese Primer zielen auf den Teil des CMV-Genoms für die Verstärkung. Als Eingang für die Verstärkung wird Gesamt-DNS von CMV infizierten HEL-Zellen, behandelt mit RNase A, in einer Eingangsmenge eingesetzt, die 0.1 Zellen entspricht. Das Protokoll, welches eingesetzt worden ist, bestand aus dem Mischen der DNS mit den oben in der Einleitung beschriebenen Inhaltsstoffen, ausser den Enzymen, Aufheizen auf 65°C, Abkühlen auf 41°C, Hinzufügen von Enzymen und Inkubation bei 41°C für 90 Minuten. Das verstärkte Material ist in einem Agarosegel der Elektrophorese unterzogen worden, auf einen Nylon-Filter geblottet worden und mit der ³²P-markierten CMV-Probe 5' CTG CTA TGT CTT AGA GGA GA 3' hybridisiert worden. Ein positives Ergebnis konnte gezeigt werden bei Einsatz von DNS auf einer 0.1 Zellen-Äquivalenz als Eingangsmaterial für die Verstärkung.
Sequenz Listing

Claims

Verfahren zur Amplifikation von doppelsträngiger DNS mit einem Transkriptions-basierten Amplifikationsverfahren, worin die doppelsträngige DNS in Berührung gebracht wird mit: – mindestens einem Oligonukleotid umfassend eine Sequenz, die zu einem Teil des ersten, der in der doppelsträngigen DNS enthaltenen zwei DNS Stränge komplementär ist, wobei das besagte Oligonukleotid ferner die Sequenz eines Promotors umfasst, die von einer RNS Polymerase erkannt wird; – einem weiteren Oligonukleotid umfassend eine Sequenz, die zu einem Teil des zweiten, in der doppelsträngigen DNS enthaltenen Stranges komplementär ist; – einem Enzym mit RNS-abhängiger DNS Polymerase Aktivität; – einem Enzym mit DNS-abhängiger DNS Polymerase Aktivität; – einem Enzym mit RNase H Aktivität; – einem Enzym mit RNS Polymerase Aktivität; und das so entstandene Reaktionsgemisch unter geeigneten isothermen Bedingungen für eine ausreichende Zeitdauer, damit eine Transkriptions-basierte Amplifikationsreaktion stattfindet, gehalten wird, ohne das Gemisch jeglicher Hitzebehandlung auszusetzen, nachdem jegliches der Enzyme dem Gemisch hinzugegeben wurde.
Verfahren gemäss Anspruch 1, worin die DNS in Anwesenheit der Oligonukleotide einmal, jedoch vor der Zugabe der Enzyme, erhitzt wird.
Verfahren gemäss Anspruch 2, worin die DNS auf 65 Grad Celsius erhitzt wird.
Verfahren gemäss Anspruch 2, worin das Gemisch auf 100 Grad Celsius erhitzt wird.
Verfahren gemäss Anspruch 1, worin die doppelsträngige DNS eine Plasmid-DNS oder genomische DNS darstellt.
Verfahren gemäss Anspruch 5, worin die DNS genomische DNS, die partiell abgebaut wurde, darstellt.
Verfahren gemäss einem der vorangehenden Ansprüche, worin eine Reverse Transkriptase verwendet wird.
Verfahren gemäss Anspruch 7, worin die Reverse Transkriptase eine AMV Reverse Transkriptase ist.
Verfahren gemäss einem der vorangehenden Ansprüche, worin die Promotorsequenz die T7 Promotorsequenz darstellt und die verwendete RNS Polymerase T7 RNS Polymerase darstellt.
Verfahren gemäss einem der vorangehenden Ansprüche, worin ein separates RNase H Enzym verwendet wird.