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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein transkriptionsbasiertes Vervielfältigungsverfahren
für die
Vervielfältigung
von DNS-Zielmolekülen.
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Nukleinsäureverstärkungsverfahren
werden im Gebiet der Molekularbiologie und rekombinanter DNS-Technologie
eingesetzt. Diese Verfahren werden eingesetzt, um die Anzahl der
Kopien einer speziellen Nukleinsäuresequenz
zu erhöhen,
welche in kleinen Mengen auftritt und häufig in einer Umgebung, in
der eine weitere Vielzahl von anderen Nukleinsäuresequenzen vorhanden sind,
sowohl RNS als auch DNS. Insbesondere werden Nukleinsäureverstärkungsverfahren
eingesetzt, um die Erfassung oder Quantifizierung von Nukleinsäuren zu
vereinfachen und sind daher wesentlich bei der Diagnose, beispielsweise
von Infektionskrankheiten, Erbkrankheiten und verschiedenen Arten
von Krebs. Nukleinsäureverstärkungsverfahren
haben auch ihre Anwendung in anderen Gebieten gefunden, wo Proben
untersucht werden, bei denen Nukleinsäure in minimalen Mengen vorhanden
sein kann, wie in der Forensik, der Archäologie oder um Vaterschaften
nachzuweisen.
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Verschiedene
Nukleinsäureverstärkungstechniken
sind bekannt, die auf verschiedenen Wirkungsmechanismen basieren.
Ein Verfahren für
die Verstärkung
von Nukleinsäure
ist als Polymerasekettenreaktion (PCR) bekannt und in den europäischen Patentanmeldungen
EP 0 200 362 und
EP 0 201 148 beschrieben. Die
PCR ist ein zyklischer Prozess, der ein doppelsträngiges DNS-Molekül als Zielmolekül hat. Jeder
Zyklus in dem PCR-Prozess beginnt mit der Trennung eines doppelsträngigen DNS-Targetmoleküls in zwei
komplementäre
Stränge.
Zu jedem Strang wird ein Primer angefügt und DNS-Polymerasen, die
vorhanden sind, werden diesen Primer entlang dem DNS-Strang weiter
erstrecken, an dem dieser angefügt
ist, und so werden zwei neue DNS-Duplexe erzeugt. Wenn die Reaktionsmischung
aufgeheizt wird, werden sich die Stränge der DNS-Duplexe wieder
trennen und ein neuer PCR-Zyklus kann beginnen. Daher erzeugt der
PCR-Prozess vielfache DNS-Kopien eines DNS-Zielmoleküls. Falls
einzelsträngige
RNS das gewünschte
Ziel für
die PCR ist, hat sie in doppelsträngie DNS durch reverse Transkriptase
gewandelt zu werden.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine andere Klasse von Nukleinsäureverstärkungsverfahren,
insbesondere die „transkriptionsbasierten
Verstärkungstechniken". Diese Techniken
umfassen die Transkription von multiplen RNS-Kopien aus einem Template
umfassend einen Promoter, der durch eine RNS-Polymerase erkannt
wird. Bei diesen Verfahren werden multiple RNS-Kopien von einem
DNS-Template transkribiert, welches eines funktionalen Promoter
umfasst, der durch die RNS-Polymerase erkannt wird. Die besagten
Kopien werden wieder als ein Ziel eingesetzt, von dem eine neue
Menge an DNS-Template erhalten werden kann usw.. Solche Verfahren
sind durch Gingeras et al. in WO 88/10315 und Burg et al. in WO
89/1050 beschrieben. Die isothermen transkriptionsbasierten Verstärkungstechniken
sind durch Davey et al. in
EP
0 323 828 (sich auf ein NASBA-Verfahren beziehend), durch
Gingeras et al. in
EP 0 373 960 und
durch Kacian et al. in
EP 0 408 294 beschrieben.
Transkriptionsbasierte Verstärkungsreaktionen
können
auch mit thermostabilen Enzymen durchgeführt werden. Transkriptionsbasierte
Verstärkungen
werden üblicherweise
bei einer Temperatur von ungefähr
41°C ausgeführt. Diese
thermostabilen Enzyme gestatten es, dass die Reaktion bei erhöhten Temperaturen
ausgeführt
wird. Solch ein thermostabiles Verfahren ist in der
EP 0 682 121 im Namen der Toyo Boseki
KK beschrieben.
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Die
Verfahren, wie sie in
EP 0 323
822 ,
EP 0 373 960 und
EP 0 408 295 beschrieben
worden sind, sind isothermale kontinuierliche Verfahren. Mit diesen
Verfahren sind vier Enzymaktivitäten
erforderlich, um die Verstärkung
zu erreichen: eine RNS-abhängige DNS-Polymeraseaktivität, eine
DNS-abhängige
DNS-Aktivität, eine
RNase-(H)-Aktivität
und eine RNS-Polymeraseaktivität. Einige
dieser Aktivitäten
können
in einem einzigen Enzym kombiniert werden, so dass üblicherweise
nur zwei bis drei Enzyme notwendig sind. Enzyme, die RNS-abhängige DNS-Polymeraseaktivitäten haben,
sind Enzyme, die DNS aus einem RNS-Template synthetisieren. Eine DNS-abhängige DNS-Polymerase
synthetisiert daher DNS aus einem DNS-Template. Bei den transkriptionsbasierten
Verstärkungsreaktionen
kann eine reverse Transkriptase wie AMV (für Avian Myoblastosis Virus)
oder MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse Transkriptase
eingesetzt werden. Solche Enzyme haben sowohl RNS- als auch DNS-abhängige DNS-Polymeraseaktivität aber auch
eine inhärente RNase-Aktivität. Zusätzlich kann
eine RNase zu der Reaktionsmischung einer transkriptionsbasierten
Verstärkungsreaktion
hinzugefügt
werden, wie E.coli RNase H.
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DNS-abhängige RNS-Polymerasen
synthetisieren vielfache RNS-Kopien
aus einem DNS-Template umfassend einen Promoter, der durch die RNS-Polymerase
erkannt wird. Beispiele von RNS-Polymerasen sind
Polymerasen aus E.coli und Bacteriophagen T7, T3 und SP6. Ein Beispiel
einer RNS-Polymerase, die üblicherweise
mit transkriptionsbasierten Verstärkungsverfahren eingesetzt
wird, ist T7 Polymerase. Daher würde
der Promoter, der in dem Template eingebaut ist, welches für das Transkribieren
von Vielfachkopien von RNS eingesetzt wird, dann der T7-Promoter
sein. Üblicherweise
ist das Template, welches den Promoter umfasst, von der Nukleinsäure beginnend
zu erzeugen, welches die Zielsequenz umfasst. Die besagte Nukleinsäure kann
in dem Ausgangsmaterial vorhanden sein, welches als Eingang für die Verstärkungsreaktion
eingesetzt wird. Die Nukleinsäure,
die in dem Ausgangsmaterial vorhanden ist, wird üblicherweise die Zielsequenz
als Teil einer viel längeren
Sequenz umfassen. Zusätzliche
Nukleinsäuresequenzen
können
sowohl auf dem 3'-
und dem 5'-Ende
der Zielsequenz vorhanden sein. Die Verstärkungsreaktion kann begonnen
werden durch das Zusammenbringen dieser Nukleinsäure aus dem Ausgangsmaterial,
wobei die geeigneten Enzyme zusammen die oben genannten Aktivitäten liefern
und mindestens ein aber üblicherweise
zwei Oligonukleotid(e). Mindestens eines dieser Oligonukleotide
sollte die Sequenz des Promoters umfassen.
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Die
transkriptionsbasierten Verstärkungsverfahren
sind insbesondere nützlich,
falls das Eingangsmaterial ein einfach-strängiges RNS ist, obwohl einfach
oder doppel-strängiges
DNS gleichfalls als Eingangsmaterial eingesetzt werden kann. Wenn
ein transkriptionsbasiertes Verstärkungsverfahren auf einer Probe
ausgeübt
wird, welche einzel-strängige
RNS (des "Plus-Sinnes") mit zusätzlichen
Sequenzen auf sowohl dem 3'-Ende
als auch dem 5'-Ende der Zielsequenz
umfasst, wird ein Paar von Oligonukleotiden, welche üblicherweise
mit den Verfahren wie im Stand der Technik beschrieben eingesetzt
wird, bestehen aus:
- – einem ersten Oligonukleotid
(üblicherweise
bezeichnet als ein "Promoter-Oligonukleotid"), welches fähig ist,
das 3'-Ende der
Zielsequenz zu hybridisieren, welches Oligonukleotid die Sequenz
eines Promoters hat (vorzugsweise des T7-Promoters) befestigt an
seinem 5'-Ende (der
hybrisierende Teil des besagten Oligonukleotids hat die entgegengesetzte
Polarität
wie das plus RNS-Material, welches als Eingangsmaterial verwendet worden
ist).
- – Ein
zweites Oligonukleotid ("Primer"), welches das 3'-Ende der Zielsequenz
umfasst (dieses Oligonukleotid hat dieselbe Polarität wie die
Plus-RNS).
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Wenn
solch ein Paar von Oligonukleotiden, zusammen mit allen Enzymen,
die die geeigneten Aktivitäten
haben, und eine ausreichende Versorgung der notwendigen Ribonukleotide
und Deoxy-Ribonukleotide zusammen
in einer Reaktionsmischung gegeben werden und unter geeigneten Bedingungen
gehalten werden (d.h. unter geeigneten Puffer-Bedinungen und bei
der geeigneten Temperatur) für
eine ausreichende Zeitdauer, wird eine isothermale kontinuierliche
Verstärkungsreaktion
beginnen. Die 1 zeigt einen vorgeschlagenen
Mechanismus für
einen Teil einer transkriptionsbasierten Verstärkungsreaktion nach dem Stand
der Technik. Der isothermale kontinuierliche Prozess der Verstärkung wird
in 1 als zyklischer Prozess dargestellt. Es ist jedoch
klar, dass alle Schritte dieses Prozesses zur selben Zeit stattfinden
werden, da alle Inhaltsstoffe in dem Reaktionsgefäss vorhanden
sind. Daher kann das Bild des Prozesses als eine bestimmte Sequenz
von Ereignissen gut für
ein besseres Verstehen eines möglichen
Mechanismus sein, welcher dem Verstärkungsprozess unterliegt, es
kann aber nicht ein reales Abbild von dem sein, was tatsächlich in
der Reaktionsmischung während
der Verstärkung
passiert. Der in der 1 dargestellte Kreis kann betrachtet
werden, dass er mit einer ersten Menge von einzelsträngiger RNS
beginnt. Die RNS, die in dem Kreis dargestellt ist, ist die RNS
des Minus-Sinnes. Daher wird sie fähig sein, mit dem Oligonukleotid
des Paares von oben erwähnten Oligonukleotiden
zu hybridisieren. Diese Minus-RNS wird normalerweise nicht als solche
in dem Ausgangsmaterial für
die Verstärkungsreaktion
vorhanden sein, wird aber beispielsweise von der Plus-RNS abgeleitet werden,
die in dem Ausgangsmaterial vorhanden ist, durch eine Reaktion mit
den Oligonukleotiden und Enzymen, wenn alle Inhaltsstoffe der Reaktionsmischung
zusammengebracht worden sind.
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Viele
Abarten der obigen Präsentation
sind im Stand der Technik beschrieben worden. Von dem in
1 dargestellten
Reaktionsbild kann gesehen werden, dass das zweite Oligonukleotid
(wie oben beschrieben) als ein Primer dient, um die Synthese eines
Stranges von DNS komplementär
zur Minus-RNS zu primen. Das Oligonukleotid umfasst die Promoter-Sequenz,
die fähig
ist, sich an das 3'-Ende
des Erweiterungsproduktes des zweiten Oligonukleotids anzuhaften.
Der Promoter-Teil dieses Oligonukleotids dient als ein Template für die Verlängerung
des Erweiterungsproduktes des zweiten Oligonukleotids, um einen
doppelsträngigen
Promoter zu erzeugen. Das 3'-Ende
des Promoter-Oligonukleotids kann durch das Enzym erweitert werden,
welches DNS-abhängige
DNS-Polymeraseaktivität (reverse
Transkriptase) aufweist, aber dies ist nicht notwendig. Um die Funktion
als ein Template eines Oligonukleotids zu reflektieren, wird das
Enthalten einer Promotersequenz als ein "splice-template" in verschiedenen Dokumenten des Standes
der Technik bezeichnet, welche sich auf die transkriptionsbasierte
Verstärkung
beziehen (beispielsweise in der
EP
0 408 295 von Genprobe Inc.). Das 3'-Ende von solch einem "splice template" kann sogar blockiert
sein. In diesem Fall ist die Fähigkeit des "splice templates" dahingehend, als
ein Primer zu dienen, vollständig
eliminiert.
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1 gibt
einen Vorschlag für
ein Schema für
eine transkriptionsbasierte Verstärkung wider. Dieses Schema
umfasst die Synthese eines einzelsträngigen RNS-Transkripts. Wie
oben erwähnt,
kann das Ausgangsmaterial, welches die zu verstärkende Nukleinsäure enthält, nicht
die Nukleinsäure
in dieser bestimmten Form enthalten. Es wird nicht Minus-RNS einer
definierten Länge
enthalten. Dies ist der Grund, warum der vorgeschlagene Kreis der
Ereignisse, wie er in der
1 dargestellt
ist, wahrscheinlich vorangegangen wird von einer Abfolge von Ereignissen,
die von der Nukleinsäure
in dem Ausgangsmaterial zu dem ersten RNS-Transkriptionsschritt
führt.
Wie oben erwähnt,
sind transkriptionsbasierte Verstärkungsverfahren insbesondere nützlich für die Verstärkung, ausgehend
von einer einzelsträngigen
RNS. Eines der Oligonukleotide, dasjenige mit der Promoter-Sequenz, wird dann
wahrscheinlich an der einzelsträngigen
RNS andocken und durch das Enzym mit RNS-abhängiger RNS-Polymerase verlängert werden
(wie reverse Transkriptase). Ein DNS-RNS-Duplex wird so erhalten, wobei der RNS-Strang
davon durch die RNase H aufgeschlossen werden kann. Das andere Oligonukleotid
wird sich an den verbleibenden DNS-Strang anhaften und verlängert werden, unter
Einsatz dieses Strangs als ein Template. Somit kann ein doppelsträngiges DNS-Template,
umfassend einen funktionalen doppelsträngigen Promoter für die RNS-Polymerase
erzeugt werden, von dem der erste Transkriptionsschritt stattfinden
kann. Die so erhaltenen Transkripte können die vorgeschlagenen Reaktionsschemata
eingehen, wie sie in der
1 dargestellt sind. In der Praxis
wird die vollständige
Abfolge von Ereignissen, ausgehend von der einzelsträngigen RNS
in der Probe, stattfinden, sobald alle Inhaltsstoffe zusammengetan
werden und die Mischung auf eine geeignete Temperatur gebracht worden
ist, so dass alle Enzyme aktiv sind. Der Ausführende dieses Verfahrens muss
nicht tätig
werden, um jegliche dieser Schritte durchzuführen. Wenn jedoch ein transkriptionsbasiertes
Verstärkungsverfahren
mit Ausgangsmaterial durchzuführen wäre, welches
die Zielsequenz nur als doppelsträngige DNS umfassen würde, entweder
kreisförmig
oder linear, würde
der Fachmann es nicht erwarten, fähig zu sein, irgend etwas zu
verstärken,
ohne zuerst ein Verfahren durchführen
zu müssen,
beispielsweise ein chemisches Denaturierungsverfahren, wie es in
der
DE 42 38 699 beschrieben
worden ist, um einzelsträngige
Nukleinsäure
aus der doppelsträngigen
DNS zu erhalten, welche zuerst in dem Ausgangsmaterial vorhanden
ist. Er würde
nicht erwarten, dass jegliche dieser Oligonukleotide fähig wären, an
die DNS anzuhaften, da diese in einer doppelsträngigen Ausgestaltung vorliegen
würde. Ausgehend
von diesem Wissen des Fachmanns wäre das Logischste durchzuführende Vorgehen,
in Bezug auf transkriptionsbasierte Verstärkungsverfahren, die Stränge der
doppelsträngigen
DNS durch Anwenden einer erhöhten
Temperatur (bis rauf auf 100°C)
zu trennen, um die DNS zu trennen und eines der Oligonukleotide
an einen der anderen Stränge
anzuhaften. Die Enzyme, die mit bestehenden transkriptionsbasierten
Verstärkungsverfahren
eingesetzt werden, wären
nicht fähig,
solch einer hohen Temperatur zu widerstehen und können in
solch einem Fall nur hinzugefügt
werden, nachdem die DNS-Stränge
getrennt worden sind. Wenn eines der Oligonukleotide an einer einzelsträngigen DNS
anhaftet und sie verlängert,
wird wiederum doppelsträngige
DNS erzeugt und die Reaktionsmischung würde wieder einer erhöhten Temperatur
unterworfen werden müssen,
um die doppelsträngige
DNS in einzelne Stränge
wiederum aufzuschmelzen. Wiederum wird das Erhöhen der Temperatur die vorhandenen
Enzyme zerstören
und neue Enzyme sind beizufügen,
nachdem der Erhitzungsschritt angewandt worden ist. Das zweite Oligonukleotid
kann nun hinzugefügt
werden und sich an den Strang anhaften, der aus dem verlängerten
(Promoter) Oligonukleotid in dem ersten Schritt erzeugt worden ist,
wobei doppelsträngige
DNS-Templates erzeugt werden, die einen doppelsträngigen funktionalen
Promoter umfassen, von dem ein erster Schritt der RNS-Transkription
stattfinden kann. Die resultierenden RNS-Transkripts können entweder
in einen Kreis wie in der
1 eintreten
und der Prozess kann isothermal durchgeführt werden.
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Von
dem oben Stehenden her ist es klar, dass Beginnen eines transkriptionsbasierten
Verstärkungsverfahren
aus doppelsträngiger
DNS ein langwieriger schwerer Prozess sein kann. Es erfordert verschiedene spezifische
Aktionen, die von dem Benutzer durchgeführt werden müssen; die
Probe ist aufzuheizen und abzukühlen,
und dies wiederholt und Enzyme sind nach jedem Wärmebehandlungsschritt wieder
aufzufüllen.
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Alternativ
kann die doppelsträngige
DNS des Ausgangsmaterials in RNS vor dem Beginn der Verstärkung transkribiert
werden. Solch ein Extraschritt kann auf einem Enzym basieren, beispielsweise
E.coli RNS-Polymerase, welche die doppelsträngige DNS in RNS ohne Vorhandensein
einer Promoter-Sequenz transkribiert, auch bezeichnet als ein Polymerase-Bindungsort.
Solch ein Prozess der Extraschritte, um die Verstärkung der
doppelsträngigen
DNS durch verstärkungsbasierte
Verstärkungsverfahren
zu vereinfachen, ist in der PCT-Patentanmeldung WO 96/02668 beschrieben
worden. Die in diesem Verfahren beschriebenen Extraschritte umfassen
nicht die zusätzlichen
Behandlungsschritte, sondern auch den Einsatz von zusätzlichen
Inhaltsstoffen, d.h. E.coli RNS-Polymerase.
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Es
ist nun gefunden worden, dass in Fällen, wo die Probe doppelsträngige DNS
umfasst, ein transkriptionsbasiertes Verstärkungsverfahren angewandt werden
kann, welches im Wesentlichen isothermal ist und in grossen Mengen
von RNS-Transkripts resultiert, die die Sequenz der DNS umfassen.
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Mit
dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann ein isothermales transkriptionsbasiertes
Verstärkungsverfahren
vorgeschlagen werden für
die Verstärkung
von doppelsträngiger
DNS. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung für die Verstärkung von doppelsträngiger DNS
umfasst die Schritte des Kontaktierens der besagten doppelsträngigen DNS
mit
- – mindestens
einem Oligonukleotid umfassend eine Sequenz, die zu einem Teil des
ersten, der in der doppelsträngigen
DNS enthaltenen zwei DNS Stränge
komplementär
ist, wobei das besagte Oligonukleotid ferner die Sequenz eines Promotors
umfasst, die von einer RNS Polymerase erkannt wird;
- – einem
weiteren Oligonukleotid umfassend eine Sequenz, die zu einem Teil
des zweiten, in der doppelsträngigen
DNS enthaltenen Stranges komplementär ist;
- – einem
Enzym mit RNS-abhängiger
DNS Polymerase Aktivität;
- – einem
Enzym mit DNS-abhängiger
DNS Polymerase Aktivität;
- – einem
Enzym mit RNase H Aktivität;
- – einem
Enzym mit RNS Polymerase Aktivität;
und
das so entstandene Reaktionsgemisch unter geeigneten isothermen
Bedingungen für
eine ausreichende Zeitdauer, damit eine Transkriptions-basierte
Amplifikationsreaktion stattfindet, gehalten wird, ohne das Gemisch
jeglicher Hitzebehandlung auszusetzen, nachdem jegliches der Enzyme
dem Gemisch hinzugegeben wurde.
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Das
Verfahren gemäss
der Erfindung ist insbesondere nützlich
für die
Verstärkung
von kleinen DNS-Molekülen,
beispielsweise Plasmid-DNS.
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Das
Verfahren ist insbesondere nützlich
für die
Erfassung von kleinen DNS-Molekülen
von pathogenen Microorganismen, was eine Diagnose ermöglicht.
Insbesondere können
die ringförmigen
HIV-1 DNS-Moleküle
durch dieses Verfahren entdeckt werden, die während der Replikation des HIV-1-Virus
ausgebildet werden. Die Feststellung von solchen ringförmigen HIV-1-DNS-Molekülen weisen
auf die aktive Replikation des Virus hin, was mit dem Fortschritt
der Krankheit korreliert werden kann, d.h. mit der Entwicklung von
AIDS. Bei einer anderen Anwendung kann das Verfahren eingesetzt
werden für
die Erfassung von Plasmid-DNS-Molekülen, die natürlich in
Chlamydien-Arten vorhanden sind. Die Chlamydien- Plasmide können gewisse Virulenzfaktoren
kodieren, was bedeutet, dass die Erfassung der Plasmide nicht nur
das Vorhandensein einer Chlamydien-Infektion aufzeigt, sondern auch
zeigt, dass die Chlamydien-Zellen, die die Infektion bewirken, gewisse Virulenzfaktoren
mit sich tragen.
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In
noch anderen Anwendungen kann das Verfahren eingesetzt werden für die Verstärkung von
genomischen Sequenzen nach teilweiser Degradation und Isolation
der DNS. Dies hat einen grossen Bereich von Anwendungen, von denen
viele mit der Erfassung und Identifikation von Mutationen genomischer
DNS verbunden werden können.
Diese Mutation kann mit der Diagnose von Krebs, Erbkrankheiten und
Veranlagung für
Krankheiten zugeordnet werden.
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Überraschend
kann transkriptionsbasierte Verstärkung von doppelsträngiger DNS
aus starten, ohne die Notwendigkeit, die DNS mit Restriktionsenzymen
zu behandeln, oder was wichtiger ist, die Stränge vorher durch Anwenden von
Hitze zutrennen. Alle Inhaltsstoffe, die üblicherweise bei isothermaler
transkriptionsbasierter Verstärkungsreaktion
benutzt werden, können
hier als Ausgangsmaterial eingesetzt werden, umfassend doppelsträngige DNS,
wie als ob es einzelsträngige
RNS wären.
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Die
mit dem Verfahren gemäss
der Erfindung benutzten Enzyme können
jegliche Enzyme sein, die im Stand der Technik als geeignete Enzyme
für die
transkriptionsbasierten Verstärkungsverfahren
bekannt sind, und die Reaktionsbedingungen sind im Wesentlichen
die gleichen wie für
transkriptionsbasierte Verstärkungsverfahren
des Standes der Technik, die üblicherweise
eingesetzt werden, um einzelsträngige
RNS zu verstärken.
Mit der vorliegenden Erfindung ist es nun gefunden worden, dass
im Wesentlichen dieselben Protokolle für die isothermale transkriptionsbasierte
Verstärkung
von doppelsträngiger
DNS eingesetzt werden können, selbst
obwohl, basierend auf dem Wissen der Mechanismen gemäss denen
die transkriptionsbasierten Verstärkungsreaktionen vermutungsgemäss ablaufen,
der Fachmann nicht dieses Verfahren als durchführbar angesehen hätte.
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Bei
einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
wird die DNS auf 65°C
in Gegenwart von Verstärkungs-Oligonukleotiden
aufgeheizt, aber nicht in Gegenwart von Verstärkungs-Enzymen. Die Enzyme
werden nur zu der Reaktion hinzugefügt, nachdem die Reaktionsmischung
auf die Inkubationstemperatur für
die Verstärkungsreaktion
abgekühlt
ist, d.h. 41°C.
Bei einem anderen Ausführungsbeispiel
des Verfahrens der vorliegenden Erfindung kann die DNS auf 100°C aufgeheizt
werden in Gegenwart von zwei Verstärkungs-Oligonukleotiden. Der Fachmann würde immer
noch nicht annehmen, dass dieses Verfahren aufgrund der Tatsache arbeitet,
dass nach der Oligonukleotid-Anhaftung und der Erweiterung der neu
hergestellte DNS-Strang von dem ursprünglichen DNS-Template-Strang
zu trennen ist, bevor das zweite Oligonukleotid anhaften und erweitert
werden kann. Bei diesem zweiten bevorzugten Ausführungsbeispiel mit nur einem
Wärmeschritt
werden die Enzyme nur zu der Reaktionsmischung hinzugefügt, nachdem
diese auf die Verstärkungs-Inkubationstemperatur
von 41°C
abgekühlt
ist.
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Vorzugsweise
werden zwei Oligonukleotide in dem Verfahren gemäss der Erfindung eingesetzt;
- – ein
erstes Oligonukleotid (üblicherweise
als "promoter-primer" bezeichnet), welches
fähig ist,
eine spezifische Sequenz im ersten Strang der doppelsträngigen DNS
zu hybridisieren, welches Oligonukleotid die Sequenz eines Promoters
(beispielsweise des T7 Promoters), welches an seinem 5'-Ende befestigt ist,
hat und
- – ein
zweites Oligonukleotid ("primer"), welches eine Sequenz
umfasst, die in ausreichender Weise komplementär zu einer spezifischen Sequenz
des zweiten Stranges der doppelsträngigen DNS ist. Die Sequenzen
der Oligonukleotide sollten in solch einer Weise gewählt werden,
dass sie nicht einander hybridisieren können.
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Es
ist überraschend,
dass durch Kontaktieren der doppelsträngigen DNS mit den zwei Oligonukleotiden
und den geeigneten Enzymen ein transkriptionsbasierter Verstärkungsprozess
durchgeführt
werden kann, wo keine Notwendigkeit besteht, verschiedene Strangseparationsschritte
durchzuführen,
um die zwei Stränge zu
trennen, welche die doppelsträngige
DNS ausmachen. Das Verfahren wird in vielfachen linearen RNS-Kopien
resultieren, die die Zielsequenz umfassen, welche Teil der Sequenz
der doppelsträngigen
DNS ist.
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BESCHREIBUNG DER FIGUREN:
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1:
Reaktionsschema für
transkriptionsbasierte Verstärkungen.
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BEISPIELE:
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Einleitung
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Die
folgenden Beispiele zeigen die Mechanismen und die Nützlichkeit
der vorliegenden Erfindung. Sie sind nicht begrenzend und sollten
nicht als solches verstanden werden. Die in den folgenden Beispielen
benutzten Enzyme sind die AMV reverse Transkriptase (AMV für avian
myeloblastosis virus), die T7 RNS-Polymerase und die E.coli RNase
H. Andere Enzyme mit ähnlichen
Aktivitäten
und Enzyme von anderen Quellen können
auch eingesetzt werden. Andere RNS-Polymerasen mit unterschiedlichen
Promoter-Spezifizitäten können auch
für den
Einsatz geeignet sein.
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Die
NASBA-Reaktionsbedingungen, die in den folgenden Beispielen eingesetzt
werden, sind 40 mM Tris, pH-Wert 8.5, 42 mM KCl (oder in späteren Experimenten
70 mM KCl), 12 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM jeweils
dNTP, 2 mM rATP, 2 mM rCTP, 2 mM rUTP, 1.5 mM rGTP, 0.5 mM ITP,
0.2 μM von
jedem Oligonukleotid, 375 mM Sorbitol, 0.105 g/l BSA, 6.4 Einheiten
AMV-RT, 32 Einheiten T7 RNS-Polymerase,
0.08 Einheiten E.coli RNase H und eine bestimmte Menge von Template
in 20 μl
Volumen. Die eingesetzten Oligonukleotid-Sequenzen sind beispielhaft
und nicht als begrenzend über
andere Sequenzen anzusehen, die für diese und andere Zielsequenzen
eingesetzt werden können.
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Beispiel 1
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Um
die Machbarkeit der DNS-Target-Verstärkung mit NASBA ohne Denaturierungsschritte
mit hohen Temperaturen zu zeigen, sind die zwei folgenden Oligonukleotide
in Kombination mit der oben beschriebenen NASBA-Reaktions-Inhaltsstoffen
verbunden worden:
HIV-1 gag1 P1:
5' AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GTG
CTA TGT CAC TTC CCC TTG-GTTCTC TCA 3'
HIV-1 gag1 P2:
5' AGT GGG GGG ACA
TCA AGC AGC CAT GCA AA 3'
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Der
T7 Promoter-Teil des P1 ist in Kursivschrift angegeben. Dieser Primer
zielt auf Teile des gag-Bereichs des HIV-1 Genoms für die Verstärkung. Als
Eingang für
die Verstärkungsplasmide
ist DNS pUCp24 umfassend den gag-Bereich des HIV-1 Genoms in verschiedenen
Eingangsmengen eingesetzt worden. Das Protokoll, welches eingesetzt
worden ist, umfasste das Mischen der Zielplasmid DNS mit den Inhaltsstoffen,
wie oben in der Einlei tung beschrieben, ausser für die Enzyme, Aufheizen auf
65°C, Abkühlen auf
41°C, Zusatz von
Enzymen und Inkubation bei 41°C
für 90
Minuten. Das verstärkte
Material ist in einem Agarosegel der Elekrophorese unterworfen worden,
auf ein Nylon-Filter geblotted worden und hybridisiert mit 32P-markierter HIV-1 gag-Probe 5' GAA TGG GAT AGA GTG CAT CCA GTG CAT
G 3'. Ein positives
Ergebnis konnte mit einer Empfindlichkeit von 105 Molekülen Eingang
an Plasmid-DNS in der Verstärkung
erhalten werden. Dieselben Ergebnisse konnten mit demselben Protokoll
ohne die 65°C
Inkubation erhalten werden.
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Beispiel 2
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Um
die Machbarkeit der DNS-Target-Verstärkung mit NASBA ohne Denaturierungsschritte
mit hohen Temperaturen zu zeigen, sind die zwei folgenden Oligonukleotide
in Kombination mit den oben beschriebenen NRSBA-Reaktions-Inhaltsstoffen
verbunden worden:
HPV16 P1:
5' AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GGA
AAA ATA AAC TGT AAA TCA-TATTC 3'
HPV16
P2:
5' TTT
GTT ACT GTG GTA GAT ACT AC 3'
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Der
T7 Promoter-Teil des P1 ist in Kursivschrift angegeben. Diese Primer
zielen auf einen Teil des HPV16-Genoms für die Verstärkung. Als Eingang für die Verstärkung ist
Plasmid DNS pHPV16, umfassend ein HPV16 Genom voller Länge, in
verschiedenen Eingangsmengen eingesetzt worden. Das Protokoll, welches
eingesetzt worden ist, bestand aus dem Mischen der Zielplasmid-DNS
mit den oben in der Einleitung genannten Inhaltsstoffen, ausser
den Enzymen, Aufheizen auf 65°C,
Abkühlen
auf 41°C,
Hinzufügen von
Enzymen und Inkubation bei 41°C über 90 Minuten.
Das verstärkte
Material ist in Agarosegel der Elektrophorese unterworfen worden,
auf einem Nylonfilter geblottet worden und mit der 32P-markierten
HPV16 Probe 5' AGT ACA
AAT ATG TCA TTA TGT GC 3' hybridisiert
worden. Ein positives Ergebnis konnte mit einer Empfindlichkeit
von 1 pg Eingang an Plasmid DNS in der Verstärkung gewonnen werden.
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Beispiel 3
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Um
die Machbarkeit der DNS-Target-Verstärkung mit NASBA ohne Denaturierungsschritte
mit hohen Temperaturen zu zeigen, sind die zwei folgenden Oligonukleotide
in Kombination mit den oben beschriebenen NASBA-Reaktions-Inhaltsstoffen
verbunden worden:
Chlamydia Trachomatis natürliches Plasmid P1:
5' AA T TCT AATACG
ACT CAC TAT AGG GCA AGA GTA CAT CGG TCA ACG-A 3'
Chlamydia Trachomatis natürliches
Plasmid P2:
5' TCA
CAG CGG TTG CTC GAA GCA 3'
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Der
T7 Promoter-Teil des P1 ist in Kursivschrift angegeben. Diese Primer
zielen auf Teil des Chlamydia Trachomatis natürlichen Plasmids für die Verstärkung. Als
Eingangsmaterial für
die Verstärkung
sind Plasmidpräparationen
aus Chlamydiatrachomatis in verschiedenen Eingangsmengen in Bezug
auf die Menge an Chlamydia trachomatis ausbildenden Einheiten (IFU
für Inclusion
Forming Units) eingesetzt worden. Das Protokoll, welches eingesetzt
worden ist, bestand aus dem Mischen der Zielplasmid-DNS mit den
Inhaltsstoffen, wie oben in der Einleitung beschrieben worden ist,
ausser den Enzymen, Aufheizen auf 65°C, Abkühlen auf 41°C, Hinzufügen von Enzymen und Inkubation
bei 41°C über 90 Minuten.
Das verstärkte
Material ist in einem Agarosegel der Elektrophorese unterworfen
worden, auf einen Nylonfilter geblottet und hybridisiert worden
mit der 32P-markierten Chlamydia trachomatis
natürlichen
Plasmid-Probe 5' CGT
GCG GGG TTA TCT TAA AAG GGA T3'.
Ein positives Ergebnis konnte mit einer Menge von Plasmid DNS in
der Verstärkung
entsprechend 0.01 IFU erhalten werden.
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Beispiel 4
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Um
die Machbarkeit der DNS-Target-Verstärkung mit NASBA ohne Denaturierungsschritte
mit hohen Temperaturen zu zeigen, sind die zwei folgenden Oligonukleotide
in Kombination mit den oben beschriebenen NASBA-Reaktions-Inhaltsstoffen
verbunden worden:
Gewebefaktor P1:
5' AAT TCT AATACG ACT CAC TAT AGG GAG
GGA ATC ACT GCT TGA 3'
Gewebefaktor
P2:
5' GAC
CGT AGA AGA TGA ACG GA 3'
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Der
T7 Promoter-Teil des P1 ist in Kursivschrift angegeben. Diese Primer
zielen auf ein Teil des menschlichen Gewebefaktorgens für die Verstärkung. Als
Eingang für
die Verstärkung
ist Plasmid DNS pUC13-TF enthaltender Teil des Gewebefaktor-Gens
in verschiedenen Eingangsmengen verwendet worden. Das Protokoll,
welches eingesetzt worden ist, bestand aus dem Mischen der Zielplasmid-DNS
mit den Inhaltsstoffen, die oben in der Einleitung beschrieben worden
sind, mit Ausnahme der Enzyme, Aufheizen auf 65°C, Abkühlen auf 41°C, Hinzufügen der Enzyme und Inkubation
bei 41°C
für 90
Minuten. Das verstärkte
Material ist in einem Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen
worden, auf einem Nylon-Filter geblottet worden und mit der 32P-markierten Gewebe faktor-Probe 5' GTT CAG GAA AGA
AAA CAG CCA 3' hybridisiert
worden. Ein positives Ergebnis konnte mit einer Empfindlichkeit
von 103 Molekülen als Eingang der Plasmid-DNS
in der Verstärkung
erhalten werden.
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Beispiel 5
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Um
die Machbarkeit der DNS-Target-Verstärkung mit NASBA ohne Denaturierungsschritte
mit hohen Temperaturen zu zeigen, sind die zwei folgenden Oligonukleotide
in Kombination mit den oben beschriebenen NASBA-Reaktions-Inhaltsstoffen
verbunden worden:
CD14 P1:
5' AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GGG
ATC TCC ACC TCT ACT GCA 3'
CD14
P2:
5' GAA
GCT AAA GCA CTT CCA 3'
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Der
T7 Promoter-Teil des P1 ist in Kursivschrift angegeben. Diese Primer
zielen auf den Teil des menschlichen CD14-Gens für die Verstärkung. Als Eingabe für die Verstärkung ist
Plasmid DNS pπH3M
enthaltener Teil des CD14-Gens in verschiedenen Eingangsmengen eingesetzt
worden. Das Protokoll, welches eingesetzt worden ist, bestand aus
dem Mischen der Zielplasmid-DNS mit den Inhaltsstoffen, die in der
obigen Einleitung beschrieben worden sind, ausser der Enzyme, Aufheizen
auf 65°C,
Abkühlen
auf 41°C,
Hinzufügen der
Enzyme und Inkubation bei 41°C
für 90
Minuten. Das verstärkte
Material ist in einem Agarosegel der Elektrophorese unterzogen worden,
auf einen Nylon-Filter geblottet worden, und mit der 32P-markierten
CD14 Probe 5' CCA
TGG AGC GCG CGT CCT 3' hybridisiert
worden. Ein positives Ergebnis konnte mit einer Empfindlichkeit
von 103 Molekülen an Eingangsmaterial der Plasmid-DNS
in der Verstärkung
erhalten werden.
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Beispiel 6
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Um
die Machbarkeit der DNS-Target-Verstärkung mit NASBA ohne Denaturierungsschritte
mit hohen Temperaturen zu zeigen, sind die zwei folgenden Oligonukleotide
in Kombination mit den oben beschriebenen NASBA-Reaktions-Inhaltsstoffen
verbunden worden:
Actin P1:
5' AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GGG
A(AG)G GGC C(CG)G (AC)CT-CGTC(AG)T ACT 3'
Actin P2:
5' ATC AT(TC) GC(ATC)
CC(GTC) CC(GAT) GAG CGCA 3'
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Der
T7 Promoter-Teil der P1 ist in Kursivschrift angegeben. Nukleotide
zwischen den Klammern bezeichnen eine "degenerierte" Position, wo jegliche der Nukleotide
zwischen den Klammern auftreten können. Diese Primer zielen auf
den Teil des menschlichen Actin-Gens für die Verstärkung. Als Eingangsmaterial
für die
Verstärkung
ist vollständig
menschliche genomische DNS (kommerziell erhältlich menschliche plazentale DNS),
behandelt mit RNase A, bei 400 ng Eingangsmaterial eingesetzt worden.
Das Protokoll, welches eingesetzt worden ist, bestand aus dem Mischen
der menschlichen plazentalen genomischen DNS mit den Inhaltsstoffen,
die oben in der Einleitung beschrieben worden sind, mit Ausnahme
der Enzyme, Aufheizen auf 65°C, Abkühlen auf
41°C, Hinzufügen der
Enzyme und Inkubation bei 41°C
für 90
Minuten. Das verstärkte
Material ist in einem Agarosegel der Elektrophorese unterzogen worden,
auf einen Nylon-Filter geblottet worden und mit der 32P-markierten
Actin Probe 5' CTG
TCC ACC TTC CAG CAG ATG TGG A3' hybridisiert
worden. Ein positives Ergebnis konnte gezeigt werden, wenn menschliche
genomische DNS als Eingangsmaterial für die Verstärkung eingesetzt worden ist.
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Beispiel 7
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Um
die Machbarkeit der DNS-Target-Verstärkung mit NASBA ohne Denaturierungsschritte
mit hohen Temperaturen zu zeigen, sind die zwei folgenden Oligonukleotide
in Kombination mit den oben beschriebenen NASBA-Reaktions-Inhaltsstoffen
verbunden worden:
CMV-Exon4 P1:
5' AAT TCT AAT ACT CAC TAT AGG GAG ATC
CTC AAT GCG CTT CA 3'
CMV-Exon4
P2:
5' GCT
TGT ATG ATG ACC ATG TA 3'
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Der
T7 Promoter-Teil des P1 ist in Kursivschrift angegeben. Diese Primer
zielen auf den Teil des CMV-Genoms für die Verstärkung. Als Eingang für die Verstärkung wird
Gesamt-DNS von CMV infizierten HEL-Zellen, behandelt mit RNase A,
in einer Eingangsmenge eingesetzt, die 0.1 Zellen entspricht. Das
Protokoll, welches eingesetzt worden ist, bestand aus dem Mischen
der DNS mit den oben in der Einleitung beschriebenen Inhaltsstoffen,
ausser den Enzymen, Aufheizen auf 65°C, Abkühlen auf 41°C, Hinzufügen von Enzymen und Inkubation
bei 41°C
für 90
Minuten. Das verstärkte
Material ist in einem Agarosegel der Elektrophorese unterzogen worden,
auf einen Nylon-Filter geblottet worden und mit der 32P-markierten
CMV-Probe 5' CTG
CTA TGT CTT AGA GGA GA 3' hybridisiert
worden. Ein positives Ergebnis konnte gezeigt werden bei Einsatz
von DNS auf einer 0.1 Zellen-Äquivalenz
als Eingangsmaterial für
die Verstärkung.
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