CN110387399B

CN110387399B - 一种线性扩增双链dna的方法及应用

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Publication number: CN110387399B
Application number: CN201810361588.1A
Authority: CN
Inventors: 王力刚
Original assignee: Beijing Full Spectrum Medical Laboratory Laboratory Ltd
Current assignee: Beijing Full Spectrum Medical Laboratory Laboratory Ltd
Priority date: 2018-04-20
Filing date: 2018-04-20
Publication date: 2023-04-18
Anticipated expiration: 2038-04-20
Also published as: CN110387399A

Abstract

本发明的目的之一是提供一种线性扩增双链DNA的方法，使用该方法可以快速稳定的将目标DNA进行线性转录为RNA，以实现线性扩增，并通过逆转录方法转化为DNA文库。本发明的目的之二是提供一种肿瘤低频率突变检测的应用，使用该应用可以检测低于1%的低水平突变。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明提供了一种线性扩增双链DNA的方法，具体通过在双链DNA一端连接RNA聚合酶识别的启动子序列，继而使用RNA聚合酶扩增为大量RNA，并逆转录成DNA。

Description

一种线性扩增双链DNA的方法及应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种线性扩增双链DNA的方法及其应用。

背景技术

在自然界，基因突变是经常发生的，突变如果发生在与细胞增殖有关的基因，就可能导致细胞摆脱正常的生长控制，表现出恶性细胞的表型性状。许多致癌物都是致突变物。它们大多数能引起DNA的损伤。这些损伤可以修复，也可以导致细胞死亡。如果DNA的修复不正常，细胞虽可继续存活，但却成了潜在的癌细胞。

对肿瘤细胞突变的检测主要技术难点在于肿瘤突变的频率很低，尤其是当突变频率在低于1%时，容易由PCR扩增系统产生的误差导致检测不准确。

而针对这个技术难点，较为常见的方法有数字液滴PCR技术和深度测序技术。深度测序技术包括捕获测序与线性扩增和分子标签技术。数字液滴PCR技术是通过将每个DNA模板分散到单独的液滴中进行扩增检测，检测灵敏度高，准确性好，但是检测位点通量较少。捕获测序是通过设计目标区域的探针，针对性的捕获靶向区域；目前的线性扩增方法主要是将待检的DNA形成单链结构，通过接头、或环化酶的作用将单链DNA连接成环，此方法成环效率低，步骤繁琐，反应条件要求严格。分子标签技术是通过在PCR扩增中对原始模板初级产物添加唯一的标签序列，但是缺点也没明显，要合成含有百万种以上的分子标签的相同引物，价格昂贵，且在扩增中容易丢失不完整扩增子的DNA片段，导致检测信息丢失，扩增过程中因扩增偏好性，产物扩增水平不一致。

因此，寻找一种检测通量高，成功率高，检测准确，可靠、经济、快速的技术尤为重要

发明内容

本发明的目的之一是提供一种线性扩增双链DNA的方法，使用该方法可以快速稳定的将目标DNA进行线性转录为RNA，以实现线性扩增，并通过逆转录方法转化为DNA文库。

本发明的目的之二是提供一种肿瘤低频率突变检测的应用，使用该应用可以检测低于1%的低水平突变。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种线性扩增双链DNA的方法，具体通过在双链DNA一端连接RNA聚合酶识别的启动子序列，继而使用RNA聚合酶扩增为大量RNA，并逆转录成DNA。

进一步，所述的双链DNA末端为平末端，或特定的粘性末端，如3’A结构。

进一步，所述的RNA聚合酶识别的启动子序列可以为T7 RNA聚合酶启动子序列、T3RNA聚合酶启动子序列，SP6 RNA聚合酶启动子序列等。

进一步，所述的逆转录是指通过逆转录酶，及特异性通用引物，将扩增产生的RNA为模板转化为DNA序列。

进一步，所述的特异性通用引物为特定的核苷酸序列。

本发明的优点和有益效果：

本发明提供了一种线性扩增双链DNA的方法，使用该方法可以纠正因PCR扩增系统误差导致低水平突变检测不准确的问题，且扩增效率高，操作简单，成本低，便于应用于肿瘤突变DNA的检测，尤其是游离肿瘤DNA。

附图说明

图1是双链DNA线性扩增步骤示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook 等人，分子克隆：实验室手册（New York: Cold SpringHarborLaboratory Press, 1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 一种游离DNA中基因突变在illumina测序平台检测应用

1、血浆游离DNA的制备

使用血浆游离DNA提取试剂盒（天根，DP339）提取2mL血浆中的游离DNA，步骤如下：

1）取2mL血浆到15ml的离心管中加入40 µl Proteinase K溶液，涡旋混匀。

2）加入4ml的缓冲液GB ，轻轻颠倒混匀，56℃孵育10 min，并不时摇动样品。

3）加入4ml的乙醇（96-100%）。

4）将上一步所得溶液添加到一个吸附柱CR2中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm (~13,400×g)离心30 sec，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中，重复此步骤直至全部溶液添加完毕。

5）向吸附柱CR2中加入500 µl缓冲液GD，12,000 rpm (~13,400×g)离心30 sec，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中。

6）向吸附柱CR2中加入600 µl 漂洗液PW12,000 rpm (~13,400×g)离心30 sec，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中。

7）重复操作步骤6。

8）12,000 rpm (~13,400×g)离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CR2置于室温放置2-5 min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

9）将吸附柱CR2转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20 µl 洗脱缓冲液 TB，室温放置2-5 min，12,000 rpm(~13,400×g)离心2 min，将溶液收集到离心管中。

2、样本的检测

1）合成接头序列，并退火使序列1与序列2，序列3与序列4形成双链。序列如下：

caggtaatacgactcactatagggagacgctcttccgatctacggccagt（SEQ ID NO.1）

ctggccgtagatcggaagagcgtctccctatagtgagtcgtattacc（SEQ ID NO.2）

caggaattaaccctcactaaagggagacgctcttccgatctactatagggt（SEQ ID NO.3）

ccctatagtagatcggaagagcgtctccctttagtgagggttaattcc（SEQ ID NO.4）

合成逆转录引物：

caagcagaagacggcatacgagatatcgcagggtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctactataggg（SEQ ID NO.5）

合成二链合成引物：

aatgatacggcgaccaccgagatctacacactctgcaacactctttccctacacgacgctcttccgatctacggccagt（SEQ ID NO.6）

2）实验步骤：

A．线性扩增及建库

使用天根文库构建试剂盒连接模块进行连接接头，步骤如下：

1）取游离DNA20uL，加入10×ERA Buffer 5uL，5×ERA Enzyme Mix 10uL，补充15uL双蒸水。在PCR仪上20℃ 30分钟，65℃ 30分钟进行末端修复及加A。

2）加入5×Ligation Buffer 20uL，接头3uL，TIANSeq DNA Ligasex 17uL，补充17uL 双蒸水。在PCR仪上20℃ 30分钟进行连接。

3）将AMPure XP磁珠置于室温平衡。涡旋使磁珠充分悬浮，加入60 μl磁珠至100 μl的连接产物，充分吸打混匀。室温孵育5 min，将反应管置于磁力架上1～2 min。待磁珠完全贴壁后，用移液器吸弃上清。入200 μl 80%乙醇，轻轻震荡混匀，洗涤磁珠，并用磁力架回收磁珠，弃上清。重复200 μl 80%乙醇洗涤一次。开盖室温放置5～10 min至晾干。加入18 μl 纯水重悬磁珠，洗脱连接产物。

4）加入10×RNAPol Buffer 2uL，rNTP（25mM）0.4μL，T7 RNA聚合酶2uL，加入连接产物15.6uL，在PCR仪上37℃ 60分钟进行转录扩增，所得产物备用。

5）加入10×RTplus Buffer（300mM Tris-HCl，95mM DTT，750mM KCl） 4uL，dNTP（2.5mM each）8uL，逆转录引物（序列5）4uL，补充双蒸水3uL。在PCR仪上65℃ 5分钟，57℃ 1分钟，立即转移至冰上。

6）加入1uL MMLV逆转录酶，在PCR仪上42℃ 60分钟，75℃ 5分钟。

7）加入10×SS Buffer（300mM Tris-HCl，95mM DTT，750mM KCl） 5uL，dNTP（2.5mMeach）4uL，二链合成引物（序列6）4uL。在PCR仪上95℃ 1分钟，64℃ 1分钟，60℃ 1分钟，58℃ 1分钟，56℃ 1分钟，立即转移至冰上。

8）加入T4 DNA聚合酶1uL，DNA聚合酶I 2uL，在PCR仪上16℃ 120分钟。

B．捕获富集测序

（1）使用xGENPan-Cancerpanelv1.5（IDT）进行捕获富集文库，捕获后在Hiseq2500测序仪（illumina）上进行测序，平均测序深度2000×。

（2）测序结果进行数据分析，经过去重read是后，通过对比不同reads中相同的突变进行确定cfDNA的变异。表1为此样本在Hiseq2500平台的检测结果。

表1 ctDNA测序结果

基因名称	突变位点	突变频率
			EGFR	T790M	0.5%

序列表

<110> 北京全谱医学检验实验室有限公司

<120> 一种线性扩增双链DNA的方法及应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(artifical)

<400> 1

caggtaatac gactcactat agggagacgc tcttccgatc tacggccagt 50

<210> 2

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(artifical)

<400> 2

ctggccgtag atcggaagag cgtctcccta tagtgagtcg tattacc 47

<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(artifical)

<400> 3

caggaattaa ccctcactaa agggagacgc tcttccgatc tactataggg t 51

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(artifical)

<400> 4

ccctatagta gatcggaaga gcgtctccct ttagtgaggg ttaattcc 48

<210> 5

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(artifical)

<400> 5

caagcagaag acggcatacg agatatcgca gggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60

cgatctacta taggg 75

<210> 6

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列(artifical)

<400> 6

aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca ctctgcaaca ctctttccct acacgacgct 60

cttccgatct acggccagt 79

Claims

1.一种线性扩增双链DNA的方法，所述方法包括：

(a)对双链DNA进行末端修复及加A，

(b)将经历末端修复及加A的双链DNA的一端通过连接酶反应加上为双链的接头，

(c)使用RNA聚合酶扩增产生大量RNA，

(d)使用SEQ ID NO. 5所示的逆转录引物逆转录成DNA，

(e)使用SEQ ID NO. 6所示的二链合成引物扩增DNA，

其中，所述双链DNA为分离的游离DNA且长度在150bp至300bp之间，

所述为双链的接头由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列与SEQ ID NO.2所示序列的核苷酸序列退火形成，和由SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列与SEQ ID NO.4所示序列的核苷酸序列退火形成。

2.根据权利要求1所述的方法，双链DNA为具有平末端或粘性末端的DNA片段。

3.根据权利要求1所述的方法，RNA聚合酶选自：T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶。

4.根据权利要求1所述的方法，RNA聚合酶扩增为，RNA聚合酶以带有启动子片段的DNA序列为模板，重复合成RNA的过程。

5.根据权利要求1所述的方法，逆转录为使用逆转录酶以RNA为模板，使用特异性通用引物合成DNA的过程。

6.根据权利要求5所述的方法，逆转录酶选自：MMLV、AMV。